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Bestimmung der Lösungsstruktur von Rinder-Adrenodoxin durch Auswertung hochaufgelöster NMR-Spektren
(2001)
Ziel dieser Arbeit war die Bestimmung der Strukturen von RinderAdrenodoxin im oxidierten und im reduzierten Zustand. Die rekombinante Form dieses Elektronentransportproteins aus 128 Aminosäuren und dem [2Fe2S]EisenSchwefel Cluster mit einer Molmasse von 14,4 kDa wurde in E. coli exprimiert. Die hergestellten Proben wurden entweder mit 15 N oder 15 N, 13 Cangereichert, was den Einsatz einer breiten Palette heteronuklearer NMRExperimente ermöglichte. Nach der Zuordnung individueller Werte der chemischen Verschiebung für die NMRaktiven Kerne konnten durch 15 N und 13 Ceditierte dreidimensionale NOESYExperimente 1800 strukturrelevante Interprotonenabstände qualitativ bestimmt werden. Insgesamt konnten 70 Prozent der Resonanzen der NMR aktiven Kerne der jeweiligen Proteinzustände zugeordnet werden. Bedingt durch den paramagnetischen Einfluß des EisenSchwefelClusters waren durch enorme Linienbreiten und sehr schnelle T 1 Relaxationszeiten 30 Prozent der zu erwartenden Signale des Proteins nicht detektierbar. Zusätzlich konnten durch die Anwendung eines ct( 15 N, 1 H)HSQC Experiments weitere 18 Abstandsparameter von Amidprotonen im Einflußbereich des EisenSchwefelCluster, die aber gerade noch detektiert werden konnten, zu dem jeweiligen näheren Eisenkern gewonnen werden. Für die Strukturrechnung mußte der EisenSchwefelCluster künstlich mit der Aminosäure C46 verbunden werden, da das Programm DYANA keine Eisen Atome erkennt. Anschließend wurde dieser 'künstliche' Aminosäurerest neu benannt (CYSC). Diese neue Aminosäure wurde dann nach Energieminimierung in die DYANA Bausteinbibliothek eingebracht. Es zeigte sich, daß der EisenSchwefelCluster die Struktur wie eine 'Klammer' zusammenhält. Ohne die Einbindung des EisenSchwefelCluster kommt es nach der Strukturrechnung zu keiner Struktur, sondern zu einem ungeordneten 'Knäuel'. Bei der Interpretation der Strukturensembles wurde deutlich, daß Rinder Adrenodoxin ein relativ rigides Protein ist. Scheinbar hohe flexible Bereiche im Protein mußten korreliert werden mit den Bereichen des Proteins, die aufgrund von fehlenden Zuordnungen nicht gut genug definiert werden konnten. Es ist somit nicht definitiv zu bestimmen, woher diese Abweichung in den Strukturen herrührt. Allerdings wurde bei der Betrachtung von Aminosäureresten in der Wechselwirkungsdomäne deutlich, daß an den Positionen der Aminosäurereste D72, E73, D76 und D79 es zu Bewegungen beim Übergang aus dem oxidierten in den reduzierten Zustand kommen muß, da speziell die Aminosäurereste D72 und E73 ihre Position dramatisch verändern. Entsprechende Änderungen der Werte der X1 Diederwinkeleinstellungen wurden beobachtet und lokale Ramachandran Diagramme ergeben sich aus den Rechnungen. Weiterhin konnte gezeigt werden, daß im reduzierten Zustand S112 mit einer T 1 Relaxationszeit von 62,5 ms im Einflußbereich des EisenSchwefelCluster liegen könnte. Ein Hinweis darauf ist auch die Änderung der Geometrie des C Terminus, da im oxidierten Zustand dieser gerade vom Proteinkörper wegweist, während im reduzierten Zustand das Cterminale Ende sich in Richtung Proteinkörper biegt. Bisher wurde angenommen, daß dem CTerminus keine funktionelle Rolle zukommt. Die Struktur des Adrenodoxins wurde nach der Distanzgeometrierechnung unter Berücksichtigung aller experimenteller Daten erhalten. RinderAdrenodoxin ist klassifiziert als ein (alpha beta)Protein welches 22% betaFaltblatt, 17% alphaHelix und 6% 3 10 Helix besitzt. Für den oxidierten und den reduzierten Zustand konnten jeweils 5 betaFaltblätter und 4 Helices identifiziert werden. Beim oxidierten Zustand erstrecken sich die 5 betaFaltblätter auf die Aminosäurereste 812, 1822, 5759, 8889 und 103106, während beim reduzierten Adrenodoxin sie sich auf die Aminosäurereste 612, 2124, 5758, 8889 und 103106 erstrecken. Die 4 identifizierten Helices erstrecken sich im oxidierten Zustand auf die Reste 2935, 6466, 7229 und 98100. Die 4 Helices für den reduzierten Zustand werden durch die Reste 3336, 6164, 7275 und 98100 charakterisiert. Der EisenSchwefelCluster ist kovalent an die vier CysteinReste 46, 52, 55 und 92 gebunden. Mit einem mittleren globalen RMSDWert der Rückgratatome zur Mittelstruktur für das oxidierte Adrenodoxin von 0,94 Å und für das reduzierte Andrenodoxin von 1,53 Å sind die Anforderungen an relativ gut aufgelöste Strukturen erfüllt. Die hier bestimmten Strukturen entsprechen in ihrer Güte einer Kristallstruktur mit der Auflösung von 2.0 Å (Programm PROCHECK) für den reduzierten und den oxidierten Zustand von RinderAdrenodoxin und sind somit zufriedenstellend aufgelöst.
Human epidermal-type fatty acid binding protein (E-FABP) belongs to a family of intracellular non-enzymatic 14-15 kDa lipid binding proteins (LBP) that specifically bind and facilitate the transport of fatty acids, bile acids or retinoids. Their functions have also been associated with fatty acid signalling, cell growth, regulation and differentiation. As a contribution to better understand the structure-function relationship of this protein, the features of its solution structure determined by NMR spectroscopy are reported here. Both unlabeled and 15N-enriched samples of recombinant human E-FABP were used for multidimensional high-resolution NMR. The sequential backbone as well as side-chain resonance assignments have been completed. They are reported here and are also available at the BioMagResBank under the accession number BMRB-5083. The presence of six cysteines in the amino acid sequence of human E-FABP is highly unusual for LBPs. Four of the six cysteines are unique to the E-FABPs: C43, C47, C67 and C87. In the three-dimensional structure of E-FABP, two cysteine pairs (C67/C87 and C120/C127) were identified by X-ray analysis to be close enough to allow disulfide bridge formation, but a S-S bond was actually found only between C120 and C127 [Hohoff et al., 1999]. Since the exclusion of a disulfide bridge between C67 and C87 improved the Rfree factor of the crystallographic model, the existence of a covalent bond between these two side- chains was considered unlikely. This agrees with the NMR data, where SCH resonances have been observed for the cysteine residues C43, C67 (tentative assignment) and C87, thus excluding the possibility of a second disulfide bridge in solution. Based on the NOE and hydrogen exchange data, an ensemble of 20 energy-minimized conformers representing the solution structure of human E-FABP complexed with stearic acid has been obtained. The analysis of homonuclear 2D NOESY and 15N-edited 3D NOESY spectra led to a total of 2926 NOE-derived distance constraints. Furthermore, 37 slow- exchanging backbone amide protons were identified to be part of the hydrogen-bonding network in the >-sheet and subsequently converted into 74 additional distance constraints. Finally, the disulfide bridge between C120 and C127 was defined by 3 upper and 3 lower distance bounds. The structure calculation program DYANA regarded 998 of these constraints as irrelevant, i.e., they did not restrict the distance between two protons. Out of the remaining 2008 non-trivial distance constraints, 371 were intraresidual (i = j), 508 sequential (|i - j| = 1), 233 medium-range (1 < |i - j| £ 4), and 896 long-range (|i - j| > 4) NOEs. The protein mainly consists of 10 antiparallel -strands forming a >-barrel structure with a large internal cavity. The three-dimensional solution structure of human E-FABP has been determined with a root-mean-square deviation of 0.92 ± 0.11 Å and 1.46 ± 0.10 Å for the backbone and heavy atoms, respectively, excluding the terminal residues. Without the portal region (i.e., for residues 4-26, 40-56, 63-75 and 83-134; the portal region apparently represents the only opening in the protein surface through which the fatty acid ligand can enter and exit the internal binding cavity), an average backbone RMSD of 0.85 ± 0.10 Å was obtained, thus reflecting the higher conformational dispersion in the portal region. Superposition with the X-ray structure of human E-FABP (excluding the terminal residues) yielded average backbone RMSD values of 1.00 ± 0.07 Å for the entire residue range and 0.98 ± 0.06 Å without the portal region. This indicates a close similarity of the crystallographic and the solution structures. The structure coordinates have been deposited at the RCSB data bank under PDB ID code 1JJJ. The measurement of 15N relaxation experiments (T1, T2 and heteronuclear NOE) at three different fields (500, 600 and 800 MHz) provided information on the internal dynamics of the protein backbone. Nearly all non-terminal backbone amide groups showed order parameters S2 > 0.8, with an average value of 0.88 ± 0.04, suggesting a uniformly low backbone mobility in the nanosecond-to-picosecond time range throughout the entire protein sequence. Moreover, hydrogen/deuterium exchange experiments indicated a direct correlation between the stability of the hydrogen-bonding network in the >-sheet structure and the conformational exchange (Rex) in the millisecond-to-microsecond time range. The features of E-FABP backbone dynamics elaborated here differ from those of the phylogenetically closely related heart-type FABP and the more distantly related ileal lipid binding protein. The results on protein dynamics obtained in this work allow to conclude that the different LBP family members E-FABP, H-FABP and ILBP are characterized by varying stabilities in the protein backbone structures. Hydrogen/deuterium exchange experiments displayed significant differences in the chemical exchange with the solvent for the backbone amide protons belonging to the hydrogen-bonding network in the >-sheets. The >-barrel structure of H- FABP appears to be the most rigid, with exchange processes presumably slower than the millisecond-to-microsecond time range. ILBP, on the other hand, shows the fastest hydrogen exchange as well as a significant number of exchange parameters (Rex), implying a decreased stability in the >-sheet structure. E-FABP, finally, appears to rank between these two proteins based on the hydrogen/deuterium exchange, with Rex terms in the >-strands indicating millisecond-to-microsecond exchange processes like in ILBP.
Rattanpalmen, die kletternden Vertreter der Unterfamilie Calamoideae, sind ein Charakteristikum aller südostasiatischen Regenwälder. Etwa 600 Arten sind gegenwärtig bekannt, ihr Verbreitungsgebiet erstreckt sich von Afrika bis in den Pazifik, mit einem deutlichen Schwerpunkt in Südostasien. Neben seiner ökologischen Rolle ist Rattan das wichtigste kommerzielle Produkt der Wälder Südostasiens nach dem Holz selbst. Da bisher fast der gesamte Bedarf aus den natürlichen Beständen entnommen wurde, werden vor allem die qualitativ hochwertigsten Arten zunehmend seltener und gelten zum Teil bereits als gefährdete Arten. Bereits 1980 wurden in Malaysia die ersten Versuche gestartet, Rattan in großem Umfang in Pflanzungen anzubauen, wobei Pflanzungen in Gummiplantagen eine besonders attraktive Lösung bieten. Mit der Anlage von Pflanzungen ist aber auch mit einer geänderten Schädlingssituation zu rechnen, die früher oder später zu Schädlingsproblemen führen wird. Zur Beurteilung derartiger Entwicklungen ist aber eine möglichst umfassende Kenntnis der natürlichen Verhältnisse, der potentiellen Schadinsekten sowie natürlicher Schutzfaktoren unabdingbar. Gemessen an der Bedeutung von Rattan, ist der Kenntnisstand über seine Ökologie und speziell der mit ihm assoziierten Insektenfauna ausgesprochen gering. Ziel des vorliegenden Projektes war es, eine möglichst breite Datenbasis über die mit Rattan assoziierte herbivore Insektenfauna zu erarbeiten, wobei Calamus manan als wichtigste kommerzielle Art in Malaysia den Schwerpunkt bildet, und durch den Vergleich verschiedener Pflanzungen und des natürlichen Habitats Entwicklungstendenzen aufzuzeigen. Diese Studie wurde auf der Halbinsel Malaysia durchgeführt, Untersuchungsgebiete für Calamus manan waren eine Pflanzung unter Gummibäumen in Kg. Bongsu, Perak, eine Versuchspflanzung in Sekundärwald in Sg. Buloh, Selangor, eine Dorfpflanzung in Sekundärwuchs in Ulu Gombak, Selangor, sowie das natürliche Habitat, ebenfalls in Ulu Gombak. Pflanzungen von Calamus caesius wurden in Sg. Buloh und der Dorfpflanzung in Ulu Gombak bearbeitet, im natürlichen Habitat in Ulu Gombak wurden des weiteren die Rattanarten Calamus scipionum, C. ornatus, C. insignis und Korthalsia rigida untersucht sowie als Vergleichsart die stammbildende Palme Caryota mitis. Über zwei Untersuchungsperioden von zusammen 20 Monaten wurde die markierten Versuchspflanzen monatlich auf herbivore Insekten untersucht sowie Wachstumsdaten erhoben. Die Wachstumsraten zeigten große Unterschiede sowohl zwischen den einzelnen Pflanzen eines Plots als auch zwischen den verschiedenen Plots. Der mittlere jährliche Blattzuwachs für Calamus manan betrug in den Pflanzungen 4,914,2 Blätter, im natürlichen Habitat dagegen nur 1,6. Die Wachstumsraten für Calamus caesius betrugen 10,2 und 12,0 Blätter/Jahr, die im natürlichen Habitat untersuchten Pflanzen legten im Mittel zwischen 0,8 und 2,2 Blätter pro Jahr an. Die festgestellten Blattzuwachsraten umspannen damit fast die gesamte Bandbreite der in der Literatur für Palmen berichteten Blattzuwachsraten von 0,5 bei Arenga obtusifolia bis 14,428,8 bei Elaeis guineensis. Gute Korrelationen zwischen Blattzuwachs und allen aufgenommenen Größenparametern sind für alle bearbeiteten Calamus mananPflanzungen und Calamus caesius in Sg. Buloh gegeben, Wachstumsleistung und verschiedene Größendimensionen der Pflanze zeigen sich hier eng gekoppelt. Die festgestellten Schäden am jüngsten Blatt betrugen im Mittel der Plots zwischen 5,33 % und 12,20 % entfernte Blattfläche. Da die Schäden in 10%-Klassen abgeschätzt wurden, sind die Unterschiede zwischen den Plots als geringfügig anzusehen, sie entsprechen der allgemeinen Beobachtung, daß Schäden durch herbivore Insekten üblicherweise unter 10 % liegen. Verschiedene Schadenstypen wurden identifiziert, wobei hohe Schäden eines Typs fast immer mit einem geringen Anteil an den Gesamtaufnahmen und ein hoher Anteil mit geringen Schäden verbunden ist. Für alle Calamus manan-Pflanzungen, mit Ausnahme der Dorfpflanzung, bestehen signifikante negative Korrelationen zwischen Blattschäden und Pflanzenhöhe, teilweise auch mit dem Blattzuwachs. Ebenso bestehen signifikante negative Korrelationen für die Blattschäden an Calamus caesius mit den Wachstumsraten der zweiten Beobachtungsperiode. Da Literaturangaben zufolge das Wachstum von Palmen sehr tolerant gegenüber Blattflächenreduktionen ist und die meisten gefundenen Herbivoren eher eine Präferenz für größere Pflanzen zeigen, werden diese Korrelationen dahin gehend interpretiert, daß schneller wachsende Individuen weniger Schäden akkumulieren als langsamer wachsende. Im Verlauf dieser Studie wurden etwa 106 Arten auf verschiedensten Palmen festgestellt, davon 60 Arten auf den markierten Palmen der Plots. 51 Arten wurden auf der Hauptuntersuchungsart Calamus manan nachgewiesen. Wie die Zeit-Arten-Beziehung zeigt, ist die Fauna sicher noch nicht vollständig erfaßt. Dem gegenüber stehen 16 Arten, die bisher in der Literatur für die Halbinsel Malaysia berichtet wurden. Insgesamt gefunden wurden in den Plots 5557 Individuen aller Stadien, 79,6 % davon Lepidoptera, 18,0 % Coleoptera und 2,4 % Orthoptera. Bedeutendste Gruppe waren die Hesperiiden mit 56,3 %, gefolgt von den Oecophoridae mit 18,3 % und den Hispinae (Chrysomelidae) mit 17,9 %. Eine ähnliche Faunenzusammensetzung aus Hispinae, Hesperiidae und Psychidae wurde in Pflanzungen von Metroxylon sagu festgestellt; im Gegensatz dazu steht die Ölpalmenfauna in Südostasien, deren wichtigste Vertreter den Familien Psychidae und Limacodidae angehören. In den Plots wurden 11 Arten von Hesperiiden gefunden, weitere 15 Arten wurden außerhalb der Plots und an anderen Palmen gefunden. Häufigste Hesperiide und häufigster Fund überhaupt war mit 1336 Exemplaren Salanoemia sala. Sie stellt 24,0 % aller Funde bzw. 42,7 % aller Hesperiidae und war in 8 der 13 Plots, darunter alle Calamus manan-Plots, vertreten. Über die Biologie dieser Art war bisher nichts bekannt. Wie fast alle Hesperiidenlarven legen die Larven von S. sala Schutzbauten an. Exemplarisch für andere Hesperiiden wird hier die Larvenbiologie dieser Art dargestellt und diskutiert. Ein starker Populationsanstieg in allen drei Kg.-Bongsu-Plots während eines Monats markiert diese Art als potentielle Problemart. Lotongus calathus trat nur in einem einzigen Plot, in Sg. Buloh, auf, stellt mit 30,6 % aller Hesperiidenfunde aber dennoch die zweithäufigste Art. Die Larvenbiologie dieser Art ist insofern einmalig, als die Larven in Symbiose mit einer häufigen Ameisenart, Dolichoderus thoracicus, leben. Die Larven stellen mit ihren Blattrollen Nistraum zur Verfügung, während die Ameisen offensichtlich Schutz gewähren. Dies erlaubt es L. calathus, eine sehr viel höhere Population aufzubauen als alle anderen Hesperiiden in diesem Plot zusammen. Das Zusammenkommen der Symbiosepartner scheint unter natürlichen Bedingungen ein relativ seltenes Ereignis zu sein, das durch die Anlage der Calamus manan-Pflanzung eine große Förderung erhielt. Als weitere regelmäßig an Calamus manan vorkommende Hesperiiden wurden Quedara monteithi, Gangara thyrsis und Erionota hiraca identifiziert. Die beiden erstgenannten sind bereits in der Literatur von Rattan beschrieben, Auflistungen der Arten E. thrax oder E. torus in der Literatur sind mit hoher Wahrscheinlichkeit E. hiraca zuzuschreiben. Eine noch unbeschriebene Art der Gattung Zela wurde nur wenige Male an Calamus manan gefunden, sie neigt jedoch zu Massenbefall und ist daher als weitere Problemart anzusehen. Korthalsia rigida besaß mit Acerbas martini eine eigene Hesperiidenart, ebenso Caryota mitis mit Plastingia naga. Letztere ist nahe mit Salanoemia sala verwandt und besitzt eine sehr ähnliche Larvenbiologie. Die Nymphalidae stellen nur 2,6 % der Gesamtfunde, sind damit aber dritthäufigste Lepidopterenfamilie. In den Untersuchungsplots wurden sechs verschiedene Arten gefunden, zwei Satyrinae und vier Amathusiini. Wichtigste Art war Amathusia ochraceofusca, die fast die Hälfte aller Nymphaliden stellt. Sie trat an Calamus manan in Kg. Bongsu und Sg. Buloh auf, ihre Larven leben, wie die meisten Amathusiini, gesellig. Weitere wichtige Funde waren die beiden Satyrinen Elymnias panthera und Coelites epiminthia, die ebenfalls in den Calamus manan-Pflanzungen auftraten. Während E. hypermnestra, die in dieser Studie nicht an Rattan gefunden wurde, ein bekannter Palmenschädling ist, war die Larvenbiologie von E. panthera ebenso wie von C. epiminthia bisher unbekannt. Die Familie Oecophoridae, vertreten durch eine einzige, bisher noch unidentifizierte Art, stellt mit 18,3 % der Gesamtfunde sowohl die zweithäufigste Art als auch Gruppierung. Sie trat in allen Pflanzungen sowie an Calamus manan und C. scipionum im natürlichen Habitat auf. Analog zu den Hesperiiden legen die Larven Schutzbauten an, die hier aber aus einem durchsichtigen Seidengewebe bestehen. Ein starker Populationsanstieg während der Beobachtungszeit markiert auch diese Art als potentielle Problemart. Andere Arten von geringerer Bedeutung waren die Notodontide Ambadra sp. sowie die beiden Limacodidae Olona gateri und Thosea vetusta. Eine Art der Gattung Batrachedra, die als Schädling der Infloreszenzen von Kokospalmen bekannt ist, wurde exklusiv auf Caryota mitis gefunden, die von ihr verursachten Schäden sind das vorherrschende Schadensbild dieser Palme. Nach den Hesperiiden und der Oecophoride stellt die Unterfamilie Hispinae der Chrysomelidae die dritte bedeutende Herbivorengruppe an Rattanpalmen dar. Auf sie entfallen 17,9 % der Gesamtfunde. Larven und Adulte besiedeln dieselben Wirtspflanzen, wobei die Larven fast ausschließlich auf den jungen, noch nicht vollständig aufgefalteten Blättern zu finden sind. Octodonta nipae stellt ein Drittel aller Hispinae, die Art wurde nur auf Calamus manan in Kg. Bongsu und der Dorfpflanzung gefunden. O. nipae lebt gesellig und scheint eine starke Förderung durch Blätter zu erfahren, die durch Schlingpflanzen im Unterwuchs am Auffalten gehindert werden. Pistosia spp. und Callispa spp. waren mit vier bzw. 12 Morphospezies vertreten und kamen in jeweils 12 der 13 Plots vor. Curculionidenlarven, die nicht aufgezogen werden konnten, kamen in einer Reihe von Pflanzen vor. Ihr Anteil ist eher unbedeutend, da ihr Auftreten aber meist den Tod der ganzen Pflanze bedeutet, stellen sie ebenfalls potentielle Problemarten dar. Cerambycidenlarven, die zwischen Blattscheide und Stamm minieren, wurden ebenfalls nur sehr selten gefunden, vor allem da sie ältere Pflanzen bevorzugen. Ihre Fraßspuren vermindern den Marktwert der geernteten Stämme, sie sind aus ökonomischer Sicht daher momentan einer der bedeutendsten Schädlinge. Eine Reihe von Orthopteren der Familien Acrididae und Chorotypidae wurden vor allem in den Pflanzungen unter Gummibäumen in Kg. Bongsu gefunden. Sie dürften polyphag sein und wohl vor allem an den Pflanzen des Unterwuchses fressen. Bestimmendes Element aller Calamus manan-Plots sind die vier Hesperiiden Salanoemia sala, Quedara monteithi, Erionota hiraca und Gangara thyrsis, dazu die Oecophoride und Pistosia sp. 2. Sg. Buloh erhält durch die massive Präsenz der Hesperiide Lotongus calathus eine Sonderstellung Die Artenzahlen der Plots liegen zwischen 13 und 24, wobei in den artenärmeren Plots relativ viele Funde an unmarkierten Pflanzen dazukommen, so daß die vollständigen Artenzahlen ähnlich liegen dürften. Die Gesamtfundzahlen nehmen mit abnehmender Natürlichkeit des Systems von 0,82 Funden/Pflanze im natürlichen Habitat bis 18,4 in einer der Pflanzungen unter Gummibäumen zu, der Diversitätsindex nimmt in der entsprechenden Richtung ab. Sg. Buloh fällt hierbei, wie bereits erwähnt, mit 25,24 Funden pro Pflanze und dem niedrigsten aller Diversitätsindizes aus der Reihe. Clusteranalysen, basierend auf den reinen Artenlisten, gruppieren die Plots in etwa entsprechend der Natürlichkeit. Clusteranalysen auf Basis von Arten und Abundanzen stellen den Sg.-Buloh- Plot abseits der anderen, die drei Kg.-Bongsu- Plots werden zusammengruppiert, ebenso die Pflanzung und das natürliche Habitat in Ulu Gombak. Die beiden Calamus caesius-Plots sind einander in Artenzahlen, Abundanzen und Diversitätsindex ähnlicher als die C. manan-Plots untereinander. Vergleiche mit den entsprechenden C. manan-Plots in denselben Lokalitäten ergeben weder eine eindeutige Gruppierung nach den Pflanzenarten noch nach den Lokalitäten. Die Fauna an Calamus caesius in Sg. Buloh war durch die Hesperiide Zela zeus und die Oecophoride dominiert. Beide Arten sind auch in der Dorfpflanzung in Ulu Gombak zumindest prinzipiell vorhanden, hier ist jedoch keine Art dominant. Im natürlichen Habitat war die Fauna von Korthalsia rigida durch die Hesperiide Acerbas martini dominiert, Caryota mitis durch die Hesperiide Plastingia naga und durch Batrachedra sp. Die verschiedenen Calamus-Arten wiesen keine dominanten Arten auf. In den Clusteranalysen zeigten die Plots im natürlichen Habitat wenig Beziehungen zueinander. Ausblick Insgesamt sind von den 106 Arten dieser Studie 88 Arten auf Rattan gefunden worden, maximal 11 davon waren bisher von Rattan bekannt. Eindeutig dominiert wird die mit Rattan assoziierte Fauna durch die Ordnung Lepidoptera, insbesondere von den Hesperiiden. Unter den Foliovoren wurden drei der Hesperiiden und die Oecophoride als potentielle Problemarten identifiziert. Allerdings liegen die festgestellten Fundzahlen noch unter allen für andere kommerziell interessante Palmen aufgestellten Schwellenwerten, die für Rattan vermutlich ohnehin höher angesetzt werden müßten.
Die Beschäftigung mit Muskarinrezeptoren reicht bis in das vergangene Jahrhundert zurück als, in Folge der verschiedenen Wirkungen des Neurotransmitters Acetylcholin, einerseits Nikotin- und andererseits Muskarinrezeptoren sowie deren Subtypen entdeckt und charakterisiert werden konnten. Aufgrund der weiten Verbreitung von Muskarinrezeptoren innerhalb des zentralen und peripheren Nervensystems sowie in entsprechend innervierten Organen sind diese nach wie vor als Target für bestimmte klinische Indikationen von großem Interesse. Besonders im Bereich der chronisch obstruktiven Atemwegserkrankungen (COPD) sind Bronchodilatoren Mittel der Wahl. Obwohl die derzeitige Behandlungsstrategie im wesentlichen auf dem Einsatz des unselektiven muskarinischen Antagonisten Ipratropiumbromid, allein oder in Kombination mit einem kurzwirksamen b2-Sympathomimetikum, beruht, ist ihr Einsatz aufgrund der dabei auftretenden unerwünschten Nebenwirkungen limitiert. Neben M3- Rezeptoren findet man in der menschlichen Lunge auch präsynaptische M2- Rezeptoren, deren Blockade zu einem Anstieg der Acetylcholinfreisetzung führt. Demzufolge würde die Entwicklung eines hochselektiven und/oder langwirksamen muskarinischen M3-Rezeptorantagonisten einen großen Fortschritt für die Behandlung von Patienten mit COPD und auch Asthma bedeuten. Untersuchung der Stereoisomere des Glycopyrroniumbromids und der entsprechenden tertiären Analoga: Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurden sowohl die vier reinen Stereoisomere des Glycopyrroniumbromids als auch die entsprechenden vier tertiären Analoga untersucht. Bislang wird das Diastereomerengemisch (RS/SR), das als RobinulÒ im Handel ist, vorwiegend als Antisialagogum in der Prämedikation der Narkose oder als Spasmolytikum therapeutisch eingesetzt. Die molekulare Struktur des Glycopyrroniumbromids weist zwei Chiralitätszentren auf, woraus sich vier stereoisomere Verbindungen ergeben. Die pharmakologische Untersuchung sowohl der quartären als auch der korrespondierenden tertiären Isomere in den funktionellen Standardmodellen, Kaninchen-Vas-deferens für M1-Rezeptoren, linker Vorhof des Meerschweinchenherzens für M2-Rezeptoren und die Längsmuskulatur des Meerschweinchenileum für M3-Rezeptoren, ergab, dass sich alle Verbindungen an den untersuchten Muskarinrezeptorsubtypen als potente Antagonisten verhielten. Ihre Rezeptorselektivität war jedoch relativ gering, wobei im Allgemeinen die niedrigste Affinität zum M2-Rezeptor beobachtet wurde. Innerhalb der Stereoisomeren zeigten die (R/R')- und (S/R')-konfigurierten Verbindungen den stärksten, die (S/S')-konfigurierten Isomere hingegen den geringsten antagonistischen Effekt. Diese Ergebnisse konnten durch Radioligand- Bindungsstudien bestätigt werden. Bemerkenswert war jedoch, dass insbesondere am M3-Rezeptor eine extrem langsame Dissoziation der Substanzen vom Rezeptor festgestellt wurde. Verbunden mit der hohen Affinität und der in Bindungsstudien ermittelten Dissoziationshalbwertszeit von 120 min könnte das quartäre (R/R')-konfigurierte Stereoisomer des Glycopyrroniumbromids eine geeignete Alternative zur Behandlung der COPD darstellen: Die lange Halbwertszeit sollte eine Einmalgabe pro Tag erlauben und somit die Patientencompliance erhöhen, die hohe Affinität eine geringe Dosierung ermöglichen und die kinetische Selektivität' sowie die quartäre Struktur könnten zur Minimierung unerwünschter Nebenwirkungen führen. Aufgrund dieser Vorteile wurde die Substanz patentiert und der pharmazeutischen Industrie für weiterführende Untersuchungen zur Verfügung gestellt. Untersuchungen an der Längsmuskulatur des Meerschweinchenileum in Hinblick auf die Verteilung von P2-Rezeptoren: Aufgrund der Pionierarbeit, die Ende der 70er Jahre von Burnstock und seinen Mitarbeitern geleistet wurde, wandelte sich das Bild von ATP als einer Energiequelle der Zelle zu einem Neurotransmitter ubiquitären Vorkommens mit entsprechenden Zielstrukturen, den P2-Rezeptoren. Inzwischen ist allgemein anerkannt, dass zwischen metabotropen P2Y-Rezeptoren und ionotropen P2X- Rezeptoren unterschieden werden kann. Mit Hilfe von Klonierungstechniken konnte diese Klassifizierung validiert und außerdem eine Vielzahl unterschiedlicher Subtypen identifiziert werden. Bis heute wurden sieben P2X- (P2X1-7) und sechs P2Y- Rezeptorsubtypen (P2Y1, P2Y2, P2Y4, P2Y6, P2Y11, P2Y12) kloniert und pharmakologisch charakterisiert. Sie gelten unumstritten als Vertreter der P2-Rezeptorfamilie. Heute besteht eine der größten Herausforderungen auf diesem sich explosionsartig expandierendem Gebiet darin, die geklonten P2-Rezeptoren mit den verschiedenen physiologischen Antworten, die durch native P2-Rezeptoren vermittelt werden, in Einklang zu bringen. Da die Längsmuskulatur des Meerschweinchenileum ein bekanntes Modell, z.B. für Untersuchungen an Muskarinrezeptoren, darstellt, war das Ziel der vorliegenden Arbeit, dieses Modell in Bezug auf die Verteilung von P2-Rezeptoren hin zu untersuchen. Neben Agonisten, die eine Präferenz für entweder ionotrope (a,b-meATP) oder metabotrope (ADPbS) P2-Rezeptoren aufweisen, wurden im wesentlichen eine Reihe gut untersuchter Antagonisten mit zum Teil hoher Affinität für einen Rezeptorsubtyp für die funktionellen Untersuchungen verwendet. Die neuronale Lokalisation des P2X-Rezeptors konnte durch die komplette Aufhebung der durch a,b-meATP-vermittelten Kontraktionen nach Zugabe von TTX charakterisiert werden. Die ebenfalls fast vollständige Hemmung der Kontraktion nach Einsatz von Atropin wies auf einen indirekten, durch Acetylcholin vermittelten Effekt hin. Aufgrund dieser Beobachtungen wurden sämtliche Versuche mit P2-Antagonisten unter Zusatz von 70 µM Physostigmin in der Nährlösung durchgeführt. Die eingesetzten Antagonisten Suramin, NF023 und NF279 erwiesen sich als kompetitive Antagonisten, während PPADS neben der Rechtsverschiebung einen Maximumabfall der Agonistenkurven bewirkte. Ein Vergleich der funktionell ermittelten pA2-Werte mit den Wirkstärken an rekombinanten P2-Rezeptoren von Ratte und Mensch lässt vermuten, dass es sich hierbei um einen P2X3- Rezeptorsubtyp handelt, der über die Freisetzung von Acetylcholin eine Kontraktion der glatten Muskulatur über einen indirekten Mechanismus auslöst. Da sich P2X-Rezeptoruntereinheiten neben homomeren auch zu heteromeren, funktionell aktiven Kanälen vereinen können, könnte es sich bei dem vorliegenden soma-dendritischen P2X-Rezeptor aber auch um ein Heteromer handeln, bei dem der P2X3-Rezeptor den Phänotyp bestimmt. Solange noch keine eindeutige Identifizierung dieses Rezeptors speziesspezifisch auf molekularer Ebene erfolgt ist, sollte man deshalb die Bezeichnung P2X3(-ähnlicher)-Rezeptor verwenden. Es konnte gezeigt werden, dass eine Stimulation des präsynaptischen P2X3(- ähnlichen)-Rezeptors zur Ausschüttung von Acetylcholin führt, das wiederum postsynaptisch einen kontraktionsvermittelnden Muskarinrezeptor aktiviert. Um zu beweisen, dass es sich dabei um denselben Muskarinrezeptorsubtyp handelt, der bereits auf direktem Weg durch APE oder mittels EFS als M3-Rezeptor charakterisiert werden konnte, wurden die Affinitäten muskarinischer Antagonisten als Kriterien herangezogen. Die erhaltenen Korrelationen wiesen eindeutig darauf hin, dass dieser postsynaptisch im GPI lokalisierte Muskarinrezeptor dem nativen und rekombinanten, kontraktionsvermittelnden M3-Rezeptorsubtyp entspricht. Durch Zugabe von ADPbS konnten im GPI Kontraktionen ausgelöst werden, die allerdings mit TTX und Atropin nur zum Teil gehemmt wurden. Diese Beobachtungen führten zu der Erkenntnis, dass postsynaptisch P2Y-Rezeptoren lokalisiert sind. Ihre Subtypcharakterisierung erfolgte unter Zusatz von 0.3 µM Atropin in der Nährlösung, um den Einfluss der neuronalen P2X3-Rezeptoren zu unterbinden. Suramin, NF023 und NF279 zeigten wiederum einen kompetitiven Antagonismus gegen ADPbS, während PPADS auch hier eine Rechtsverschiebung mit Maximumdepression der Agonistenkurve hervorrief. Ein erneuter Vergleich mit beschriebenen Affinitätswerten von rekombinanten P2- Rezeptoren ließ den Schluss zu, dass der im GPI postsynaptisch gefundene P2Y- Rezeptor Eigenschaften des P2Y1-Rezeptorsubtyps aufweist. Eine Bestätigung dafür gaben außerdem die P2Y1-selektiven Bisphosphate A3P5P und MRS2179, obgleich sie geringere pIC50-Werte aufzeigten als in der Literatur beschrieben. Mit der Charakterisierung des neuronalen P2X3-Rezeptors und des postsynaptischen P2Y1-Rezeptors ist das GPI ein bisher einzigartiges funktionelles pharmakologisches Modell, in dem beide P2-Rezeptorsubtypen durch Einsatz des jeweiligen Agonisten, a,b-meATP oder ADPbS, pharmakologisch isoliert werden können. Charakterisierung von P2-Rezeptoren in der Längsmuskulatur des Rattenileum: Eine im Vergleich zum GPI gänzlich andere Situation zeigte sich im RI. Die getesteten P2-Agonisten ADPbS, a,b-meATP, a,b-meADP und ATPgS erzeugten Kontraktionen im untersuchten Gewebe, wobei sich a,b-meATP als effektivster Agonist erwies. Im Unterschied zum GPI führte eine wiederholte Gabe von a,b- meATP allerdings nicht zu einer Desensibilisierung des Rezeptors. Die durch Zugabe von TTX und Atropin erreichte Kontraktionshemmung lässt auf das Vorhandensein von sowohl prä- als auch postsynaptischen P2X-Rezeptoren schließen. Eine Trennung der durch diese Rezeptoren hervorgerufenen Effekte war im funktionellen Experiment jedoch nicht durchführbar. Keinerlei Effekt zeigte allerdings der Zusatz von TTX und Atropin auf die durch ADPbS ausgelösten Kontraktionen. Suramin, NF023 und PPADS erwiesen sich als sehr schwache Antagonisten an diesem Präparat. Auffällig war hingegen, dass die durch den Antagonisten verschobenen Kurven jeweils steiler und im Maximum höher waren als die Kontroll-Agonistenkurve. Man kann also hier nur spekulieren, dass durch die Antagonisten zunächst ein relaxationsvermittelnder Rezeptor geblockt wurde und in Folge nur noch der Effekt des kontraktionsvermittelnden Rezeptors sichtbar war. Obwohl Gewebe der Ratte häufig als funktionelle Modelle in der experimentellen Pharmakologie eingesetzt werden, konnten auf Grund fehlender subtypselektiver Agonisten und Antagonisten die kontraktionsvermittelnden P2-Rezeptorsubtypen im RI nicht identifiziert werden. Des weiteren zeigt ein Vergleich mit dem GPI, dass bedeutende Unterschiede bei der Verwendung gleichen Gewebes zweier verschiedener Spezies existieren können, die bei der vergleichenden Betrachtung von Affinitätswerten von Agonisten und Antagonisten zur Charakterisierung von Rezeptorsubtypen beachtet werden müssen.
In dieser Arbeit werden mit Hilfe von Röntgenstreuung Polymere untersucht, die auf molekularer Ebene eine lamellenartige Schichtstruktur aufweisen. Diese Ordnung wird bei hohen Temperaturen zerstört, das Polymer wandelt sich in eine homogene Schmelze um. Ziel dieser Arbeit ist es, die Ursachen dieser Phasenumwandlung, d.h. ihre treibenden Kräfte zu erforschen. Hierzu werden mehrere Polymere verschiedener Zusammensetzung untersucht und der Einfluss von mechanischem "Stress" auf die Phasenumwandlung überprüft. Die untersuchte Polymerklasse ist ein sogenanntes Diblockcopolymer , d.h. die Polymermoleküle bestehen aus jeweils zwei linearen Polymerkettenstücken verschiedener Polymersorten (hier: {\em Polystyrol} und {\em Polybutadien}), die "Kopf an Kopf" miteinander verbunden sind. Durch diese molekulare Verbindung ist eine Auftrennung auf makroskopischem Massstab, etwa vergleichbar der Entmischung von "Ol und Wasser, nicht möglich. Mikroskopisch kann das Polymer durch eine günstige Ausrichtung der Moleküle zueinander die Kontakte zwischen den Polystyrol- und Polybutadien-Teilketten minimieren. Diese Abnahme der Gesamt-Wechselwirkungsenergie führt zum Aufbau einer lamellaren Struktur und bedeutet gleichzeitig eine Absenkung der Entropie. Bei Erhöhung der Temperatur kann der entropische Beitrag zur freien Energie dominant werden, d.h. die Ordnung wird zerstört. Die Experimente wurden am Max-Planck-Institut für Polymerforschung in Mainz unter Betreuung von Herrn Prof. Dr. Manfred Stamm (inzwischen an der Universität Dresden) durchgeführt. Dort wurden die Polymere synthetisiert und eine vorhandene Röntgenkleinwinkelstreuanlage für die hier vorgestellten Messungen genutzt. Weiterhin wurde eine Scherapparatur so umgebaut, dass die gleichzeitige Messung von Scherung und Röntgenkleinwinkelstreuung im Time-Slicing-Verfahren möglich war. Im Rahmen dieser Arbeit wurde ein Röntgendetektor entwickelt, der die korrelierte Datenerfassung von Scherung und Röntgenstreuung im Zeitmassstab deutlich unter einer Sekunde ermöglicht. Die hier vorgestellten Experimente gliedern sich zum einen in statische Röntgenmessungen an verschiedenen Polymersystemen, welche die Temperaturabhängigkeit der inneren, molekularen Struktur untersucht, bei der Umwandlung von der lamellenartigen Schichtstruktur zur homogenen Schmelze und umgekehrt. Hierbei zeigen sich keine Hystereseeffekte und eine gute Übereinstimmung mit {\em MC-CMA}-Simulationen. Die einzelne Polymerkette wird beim Phasenübergang leicht gestreckt. Die beobachteten Phänomene werden durch feldtheoretische Modelle nicht vollständig wiedergegeben. Zum anderen wird der Einfluss von mechanischem "Stress" in Form einer oszillatorischen Verscherung auf diese Umwandlung und bei Temperaturen nahe dieser Umwandlung untersucht. Der anisotrope Aufbau der lamellenartigen Schichtstruktur bewirkt ein stark nichtlineares mechanisches Verhalten des Polymers, das mit dem Aufbau einer Vorzugsorientierung der Lamellen zur Richtung der Verscherung einher geht. Die Kinetik dieser Orientierungsphänomene wurde mit Hilfe der Röntgenkleinwinkelstreuung während der mechanischen Beanspruchung gemessen. Es ergibt sich innerhalb der Messungenauigkeit von 1-2\,K keine Erhöhung der Umwandlungstemperatur. Abhängig von den Scherparametern zeigen sich knapp unterhalb der Umwandlungstemperatur unterschiedliche Vorzugsorientierungen, deren zeitliche Abfolge irreversibel ist. Für das Auftreten der verschiedenen Vorzugsorientierungen zum Scherfeld werden verschiedene Parameter auf unterschiedlichen Größenskalen verantwortlich gemacht. Das komplexe Zusammenwirken dieser strukturellen Details kann durch die mechanische Beanspruchung "getestet" werden. Der Aufbau einer langreichweitigen Ordnung wird durch die externen Kräfte beschleunigt.
Hsp90 ist ein äußerst vielseitiges Protein, welches nicht strikt cytosolisch anzusiedeln ist. Es besitzt eine Vielzahl von Partnerproteinen zu denen stetig neue hinzukommen und deren Interaktionen längst nicht alle hinreichend untersucht und verstanden wurden. Worin der Unterschied in der Funktionalität von Hsp90 in Eukaryoten und HtpG in Prokaryoten besteht, das Hsp90 für Eukaryoten (auch einzellige) derart essentiell werden lässt, ist absolut unklar. Ein möglicher Grund könnte die Beteiligung von Hsp90 an Transportprozessen in und um den Zellkern darstellen. Der Einfluss von Hsp90 auf den Export von 60S rUE aus dem Zellkern konnte manifestiert werden. Die Einwirkung Hsp90 spezifischer Inhibitoren wie Geldanamycin, Radicicol und Novobiocin zeigten deutliche Effekte in den Transportmessungen sowohl in vitro als auch in vivo. Durch Coinjektionen von Novobiocin und Radicicol in die Oocyten von Xenopus laevis ließ sich der Export von 125J markierten 60S rUE aus dem Zellkern gegenüber den Kontrollen deutlich reduzieren. Damit konnte der mittel- oder unmittelbare Zusammenhang zwischen Hsp90 und dem Export von 60S rUE in vivo erneut bewiesen werden. Hsp90 besitzt mehrere potentielle Phosphorylierungsstellen für die Casein Kinase II. Untersuchungen zeigten, dass die Phosphorylierung von Hsp90 den Effekt auf den in vitro Export von 60S rUE aufzuheben vermag. Die Phosphorylierung von Hsp90 durch die CKII könnte somit eine potentielle Regulationsmöglichkeit von Hsp90 darstellen. Die Phosphorylierung von Hsp90 durch die CKII ließ sich durch die Zugabe von Radicicol deutlich reduzieren. Es ist durchaus möglich, dass die potentielle Phosphorylierungsstelle im Bereich der Bindungsstelle von Radicicol am N-Terminus von Hsp90 zu suchen ist, da auch die Phosphorylierung des N-terminalen Fragments über Radicicol beeinflusst werden konnte. Über Quervernetzungsversuche zwischen Hsp90 und isolierten Zellkernen, konnten Proteine der Kernmembran spezifisch markiert werden. Aufgrund der äußerst geringen Proteinausbeute war eine Analyse sehr schwierig. Lediglich eine Proteinbande konnte schließlich partiell N-terminal ansequenziert werden. Die ermittelten Sequenzen deuten auf ein zu scNup57p homologes Protein der Ratte hin, welches bisher jedoch noch nicht über eine der Proteindatenbanken ermittelbar ist. Transmissionselektronenmikrokopische Aufnahmen von isolierten Rattenleberzellkernen, welche mit einem Anti-Hsp90 Antikörper inkubiert wurden, konnten zeigen, dass Hsp90 neben Komponenten im Bereich des Kernporenkomplex auch an Bestandteile im Nukleoplasma bindet. Da aufgrund der in vitro Messungen bisher ein rein cytosolische Effekt von Hsp90 in Bezug auf den Export von 60S rUE vermutet wurde, könnte dieser Befund nahe legen, dass die Einflussnahme von Hsp90 auf den Transport von 60S rUE wesentlich früher bereits im Nukleoplasma oder in den Nukleoli einsetzen könnte. Wenn dies der Fall ist, könnte Hsp90 auch im Zusammenhang mit den ribosomalen Untereinheiten eine Begleiterfunktion zukommen, welche den Transport vom Ort der Biosynthese bis an die spätere Wirkungsstätte unter Aufrechterhaltung der Funktion gewährleistet. Hierfür könnte auch sprechen, dass Hsp90 mit den 60S rUE interagiert, wie es in Copräzipitationsversuchen gezeigt wurde. Zudem konnte Hsp90 gezielt über proteinäre Bestandteile im Transport befindlicher 60S rUE radioaktiv markiert werden. Es spricht demnach vieles dafür, dass Hsp90 unmittelbar in den Transportprozess der großen ribosomalen Untereinheiten eingreift, und hierbei der Effekt nicht lediglich in der Unterstützung bei der Translokation zu suchen wäre, sondern eventuell schon sehr viel früher im inneren des Nukleoplasmas.
Die enorme genetische Variabilität von HIV-1[14],[50] und die mangelnde Korrelation zwischen genetisch definierten Subtypen einerseits und antigener Variation[51]-[56] andererseits verhindern bisher die Entwicklung eines effizienten, breit neutralisierenden Impfstoffes. Neueren Ansätzen liegt daher das Konzept einer serologischen Klassifikation zu Grunde[61],[62], die verschiedene HIV-Subtypen nach ihrer serologischen Reaktivität und nicht nach ihrem genetischen Ursprung klassifiziert. Diese Ansätzen beruhten allerdings auf der Verwendung ausgewählter Consensus-Modellpeptide der immunodominanten V3-Region des viralen Hüllproteins gp120 und monoklonaler Antikörper weniger HIV-1-Subtypen[61]. Somit ist nicht auszuschließen, dass aus dem Einsatz weiterer Peptide und anderer Antikörper bislang unidentifizierte Serotypen resultieren. Es lag nahe, den ursprünglichen Ansatz auf eine wesentlich breitere Basis von Antikörpern und Peptiden zu stellen. Als Antikörperquelle kamen hierbei die polyklonalen Seren HIV-1-positiver Patienten in Betracht; man machte sich dabei das native HIV-spezifische Antikörperreservoir zu Nutze. Seitens der Peptide als Zielmoleküle einer Ermittlung serologischer Reaktivität bot sich ein kombinatorischer Zugang an. Ziel der vorliegenden Arbeit war demnach die Entwicklung eines immunologischen Testsystems für das Screening humaner HIV-positiver Seren gegen kombinatorisch erzeugte Peptide mit dem Hintergrund, einen minimalen Satz reaktiver Peptide zu identifizieren, die eine serologisch basierte Charakterisierung der Reaktivität verschiedener HIV-1-Subtypen erlaubt. Um Reaktivitätsmuster zwischen Seren verschiedener Subtypen ermitteln und ausschließlich signifikante, hochreaktive Sequenzen finden zu können, sollte dieses Assay zudem die Möglichkeit der mehrfachen Wiederholbarkeit mit derselben Peptidbibliothek bieten. Diese im Rahmen der vorliegenden Arbeit umgesetzten Ziele lassen sich somit wie folgt zusammenfassen: Entwicklung eines Verfahrens zur schnellen und eindeutigen massenspektrometrischen Sequenzierung von Peptiden aus kombinatorischen Bibliotheken, Entwicklung eines immunologischen Testsystems für das iterative Screening HIV-positiver Seren gegen festphasengebundene Peptide, Screening von Serenpools verschiedener genetisch bestimmter Subtypen von HIV-1 gegen eine kombinatorische Peptidbibliothek, die die genetische Variation der V3-Region von gp120 reflektiert, und Multivariate Analyse der gefundenen Peptidsequenzen mit dem Ziel einer serologischen Interpretation derselben. Das Verfahren zur schnellen und im Vergleich zum herkömmlichen Kettenabbauverfahren nach Edman weniger aufwändigen massenspektrometrischen Sequenzierung als reaktiv bestimmter Peptide basiert auf der adaptiven Einführung Kettenabbruch erzeugender Sequenzen während der Synthese der kombinatorischen Peptidbibliothek nach einer modifizierten One Bead One Peptide"-Synthese[118],[119]. Diese Codierung wird sequenztreu durch den Einsatz von Mischungen aus der Fmoc-geschützten Aminosäure, die für diese Sequenzposition vorgesehen ist, und ihres N-terminal permanent blockierten Derivats eingeführt. Das Programm Biblio optimiert das Codierungsmuster hinsichtlich minimaler Einführung von Terminationssequenzen und minimalem Einsatz Kettenabbruch erzeugender Reagenzien, um den Anteil des Hauptpeptids pro Bead nur so gering wie möglich zu vermindern. Eine MALDI-massenspektrometrische Analyse der Peptide eines betreffenden Beads liefert somit neben dem Signal des Hauptpeptids auch die Sequenz des Peptide codierenden Signale. Diese werden von Biblio zur gesuchten Peptidsequenz decodiert. Des weiteren konnte ein immunologisches Testsystem für das iterative Screening festphasengebundener Peptide entwickelt werden. Dieses beruht auf der Detektion der Bindung des Serumantikörpers an das Peptid durch einen Sekundärantikörper, der an den Primärantikörper bindet und mit einem fluoreszenten Farbstoff markiert ist. Eine Bindung ließ sich somit fluoreszenzmikroskopisch nachweisen. Um eine Wiederholbarkeit des Screenings zu gewährleisten, wurde die Peptidbibliothek mittels eines Epoxidharzklebstoffs auf der Probenunterlage fixiert. Eine Entfernung des Immunkomplexes gelingt durch mehrfache Behandlung mit pH 1. Eine 80640 Spezies umfassende Decapeptidbibliothek, die die genetische Variabilität der immunodominanten V3-Schleife der viralen Hüllproteins gp120 von HIV-1 wiedergibt, wurde gegen Serenpools verschiedener HIV-1-Subtypen gemäß diesem Verfahren iterativ gescreent. Insgesamt 36 Peptide konnten aufgrund ihrer intensiven Fluoreszenz als hochreaktiv erkannt werden; sie wurden mit MALDI-Massenspektroskopie und anschließender Decodierung durch Biblio sequenziert. Eine Auswahl von vier der 36 ermittelten Sequenzen erwies sich als ausreichend für eine Differenzierung der zugrunde liegenden HIV-1-Subtypen. Eine anschließende multivariate Analyse der gefundenen Sequenzen in bezug auf ihr Seroreaktivitätsmuster ermöglichte die Bestimmung neuer, konservierter Epitope der Bindung polyklonaler Serenantikörper von HIV-1 und die Identifikation der für diese Bindung kritischen Aminosäurepositionen der betrachteten Decapeptide. Diese Epitope könnten in nachfolgenden Studien auf ihre Bedeutung hinsichtlich ihres Neutralisationspotentials bezüglich primärer HIV-Isolate getestet werden. Das hier entwickelte Verfahren zum iterativen Screening codierter Peptidbibliotheken jedoch ist nicht auf das HIV-System beschränkt, es bietet vielmehr einen universellen Zugang zur reaktivitätsbasierten Evaluation festphasengebundener Substanzbibliotheken, die die volle genetische Variabilität ihrer biologischen Zielregion abbilden. Eine dieser Regionen könnte beispielsweise der Antigenrezeptor von B-Lymphocyten darstellen, der die B-Zellen durch Kontakt mit einem Antigen aktiviert. Diese regen die B-Zelle zur Proliferation und deren Nachkommen zur Differenzierung zu antikörpersezernierenden Zellen gegen diese Antigene an. Sie bilden damit ein interessantes Ziel, auf diesem Wege eine effektive Immunantwort hervorzurufen[146],[150].
Im Gegensatz zu den Arbeiterinnen der sozial lebenden Wespen und Bienen sind alle Ameisen flügellos. Die Flügellosigkeit der Ameisenarbeiterinnen bedingt, dass selbst kleinste Räume in der Erde oder in Holz von Kolonien besiedelt werden können. Sie war eine wichtige Voraussetzung für ihre Vorherrschaft auf dem Boden. Die für bodennistende Arten als Baumaterial in Frage kommende Erde hat jedoch die Eigenschaft, dass z. B. starke Regenfälle die Stabilität der Bauwerke negativ beeinflussen können. Deshalb und weil Erde in den höheren Regionen des Laubdaches schwierig zu beschaffen ist, sind Erdnester für den Übergang zum Leben in den Baumkronen wenig geeignet. Höhlungen in verrottendem Holz stehen aufgrund der schnellen Zersetzung in den Tropen nur für einen relativ kurzen Zeitraum und wenig regelhaft zur Verfügung. Der dadurch vorherrschende Mangel an Nistraum im tropischen Regenwald ist möglicherweise der wichtigste Faktor der Koloniegrößeregelung bei Ameisen. Erst mit dem Übergang zu aktivem Freinestbau ist es den Ameisen gelungen, sich (i) unabhängig von natürlichen Höhlen zu machen und dadurch große Kolonien zu etablieren, (ii) den Kronenraum als Habitat dauerhaft zu erschließen, (iii) negativen Witterungseinflüssen entgegenzuwirken und (iv) vorhandene Nahrungsressourcen in diesem Stratum permanent zu nutzen. Die in der vorliegenden Arbeit untersuchten freinestbauenden Ameisen sind selbst in der Lage, additiv Nistraum zu schaffen. Die Vertreter dieser Gilde legen ihre Nester nicht in der Erde oder in natürlichen oder selbst ,ausgeräumten-- Hohlräumen von Bäumen an, sondern konstruieren aktiv frei in der Laubregion der Holzgewächse Nisträume bzw. Unterstände, indem sie Material zusammentragen oder herstellen, mit dem eine Abschottung des Brut- und Nahrungsraumes gegenüber der Umwelt erreicht wird. Die erfolgreiche Besiedlung der Kronenregion war den Ameisen nur durch veränderte Bautechniken und eine verbesserte und angepasste Materialverwendung möglich. Gegenstand der vorliegenden Dissertation war zunächst die Bestandsaufnahme der freinestbauenden Ameisen der Baumkronenregion südostasiatischer Regenwälder. Der erste Schritt einer Analyse der Freinestkonstruktionen von Ameisen bestand darin, die Vielfältigkeit der verwirklichten Nestformen zu erfassen und darzustellen, Gemeinsamkeiten und Unterschiede herauszuarbeiten und die beteiligten Ameisenarten zu identifizieren. Im zweiten Teil der Arbeit wurden intensiv die proximaten Mechanismen des aktiven Nest- und Pavillonbaus untersucht. Dazu wurden die einzelnen Schritte der Nestentwicklung für sieben Ameisenarten aus sechs Gattungen in allen Details dargestellt und zusammenfassend beschrieben. Es wurde ermittelt, welche Baumaterialien die verschiedenen Ameisen nutzen und wie diese Materialien verwendet werden. Zur Bestimmung der verschiedensten Nesttypen wurden neben architektonischen Unterschieden auch Differenzen in der Substratwahl, Materialbeschaffenheit und in der Funktion der Nestkonstruktionen berücksichtigt. Als weiteres Kriterium zur Klassifikation arborealer Nestanlagen diente die Verschiedenartigkeit der Materialbearbeitung und der Substratvorbereitungen durch die Ameisen. Einige dieser Nestcharakteristika sind quantitativer, andere qualitativer Natur. Im Verlauf der Untersuchung wurden 1767 Kolonien bearbeitet und eingeordnet. Davon konnten insgesamt 100 Arten bzw. Morphospezies bestimmt und als echte Freinestbauer im Sinne der vorher formulierten Definition charakterisiert werden. Die ermittelten Arten verteilten sich auf acht Gattungen aus den drei Unterfamilien Formicinae, Dolichoderinae und Myrmicinae. Diese drei Unterfamilien gelten als die am weitesten entwickelten Ameisen und dominieren in der Kroneregion tropischer Regenwälder. Auffallend an dieser höher entwickelten Gruppe von Ameisen ist die Tendenz, pflanzliche Produkte als Hauptnahrungsressource zu nutzen. Die artenreichste Gattung Polyrhachis (39 Arten) gehört der Unterfamilie Formicinae an; zusammen mit den Gattungen Camponotus (10) und Oecophylla (1) wurden allein 50 Arten aus dieser Unterfamilie gefunden. In der Gattung Camponotus konnten zwei Untergattungen (C. Karavaievia, C. Myrmotarsus) mit freinestbauenden Arten ermittelt werden. Mit 29 identifizierten Arten aus drei Gattungen stellten die Myrmicinae die zweitgrößte Unterfamilie, wobei allein 23 Arten auf die Gattung Crematogaster entfielen. In den beiden anderen Myrmicinen-Gattungen Monomorium (5 Arten) und Myrmicaria (1 Art) fanden sich nur vergleichsweise wenige Vertreter mit Freinestbau. Die dritte Unterfamilie, die Dolichoderinae, wird durch die Gattungen Dolichoderus und Technomyrmex mit zusammen 21 Arten repräsentiert. Die als Freinestbauer ermittelten Ameisenarten zeigen hinsichtlich ihrer Koloniestruktur und Nestorganisation einige nennenswerte Parallelen. Die Mehrzahl der Arten lebt in polydomen Kolonieverbänden, die ihre manchmal mehr als 200 Nestanlagen meist nur auf eine einzelne oder wenige Nestpflanzen verteilen. In den Gattungen Camponotus und Monomorium sind alle Arten polydom organisiert, bei Dolichoderus und Technomyrmex sind es 90 % und bei Crematogaster 70 %. Polydomie findet man auch bei Myrmicaria arachnoides und Oecophylla smaragdina. Als weitere Gemeinsamkeit fällt ins Auge, dass mit Ausnahme von Myrmicaria arachnoides und Polyrhachis spp. funktionell als Stallnester zu charakterisierende Nestkonstruktionen überwiegen. Insbesondere bei Technomyrmex (100 %), Dolichoderus (100 %), Camponotus (70 %), Crematogaster (82 %), aber auch bei Monomorium (100 %) und Oecophylla smaragdina besteht eine ausgeprägte Tendenz, die Honigtau liefernden Trophobionten und die Brut in denselben Bauten unterzubringen. Bei den meisten Arten besteht somit ein enger Zusammenhang zwischen Freinestbau und trophobiotischer Ernährungsweise. Diese enge räumliche Vereinigung von Nahrungs- und Nistressourcen bildet die Basis für die Entwicklung individuenreicher, konkurrenzstarker und ökologisch dominanter Ameisenarten in der Kronenregion. Insgesamt wurden 22 unterscheidbare Nesttypen ermittelt und in allen Einzelheiten dargestellt. Auf 47 Bildtafeln wurden dazu fotografisch und zeichnerisch die Charakteristika der verschiedenen Nesttypen hinsichtlich der Nestarchitektur und ethologischer Besonderheiten der beteiligten Ameisenarten abgebildet. Während die Anzahl der freinestbauenden Ameisenarten sicherlich nur annähernd erfasst werden konnte, ist bei der Darstellung der verschiedenen Nesttypen zu erwarten, dass die erfolgreichsten, auf der Basis ethoökologischer sowie material- und substrattechnischer Unterschiede ermittelten Erscheinungsformen aufgeklärt werden konnten. Die vorgenommene Unterteilung der Hauptkategorie ,Nestsubstrat-- in drei blattgebundene und zwei stammgebundene Unterkategorien zeigte, dass die zweifach geschützte und materialsparende Position zwischen Blättern, von zusammen 13 Arten aus den Gattungen Polyrhachis (6), Camponotus (Karavaievia) (2), Oecophylla (1) und Crematogaster (3) präferiert wurde. Nester auf der vergleichsweise ungeschützten Blattoberseite wurden nur von Arten der Gattung Polyrhachis gebaut. Die bevorzugte Position der Polyrhachis-Nester war auf der Blattunterseite, 67 % aller Polyrhachis Nester waren dort lokalisiert. Die Nester der Untergattung Camponotus (Karavaievia) waren zu 75 % und die von Technomyrmex, Monomorium und Myrmicaria gar zu 100 % auf der Blattunterseite angebracht. Zusammen betrachtet waren 64 % aller im Rahmen der vorliegenden Arbeit aufgenommenen Nestbauten auf der Unterseite einzelner Blätter zu finden. Von allen Nestbauten auf Stamm- und Astoberflächen waren 75 % von Crematogaster-Arten besiedelt. Diese Nestposition konnte ansonsten nur noch bei zwei Polyrhachis-Arten und bei der mit Epiphyten assoziierten Camponotus (Myrmotarsus) gefunden werden. Je nach Anteil der hauptsächlich verarbeiteten Baustoffe kann man in vier Nestmaterialtypen unterteilen: (i) Nester aus toten pflanzlichen Materialien, (ii) Pilznester, (iii) Seidennester und (iv) Wurzelnester (Ameisengärten). Am häufigsten vertreten waren die aus Larvalseide gefertigten Webenester der Gattungen Polyrhachis, Camponotus (Karavaievia) und Oecophylla; insgesamt 45 % aller Funde gehörten zu dieser Materialgruppe. Fremde Seide konnten neben drei Polyrhachis-Arten auch drei Arten aus der Gattung Dolichoderus verarbeiten. Bemerkenswert ist der hohe Anteil pilzbewachsener Nestbauten. In allen drei Unterfamilien fanden sich Arten, die zu unterschiedlichen Teilen Pilze in ihren Nestern hielten. In der Gattung Technomyrmex waren 70 % aller älteren Nester vollständig aus Pilzhyphen gebildet. Mehr als die Hälfte des Nestmaterials von Monomorium-Nestern bestand ebenfalls aus einem dichten Pilzmyzel. Pilze bildeten auch in den Nestern von einigen Arten der Gattungen Dolichoderus, Crematogaster und Camponotus (Myrmotarsus) die maßgebliche Materialkomponente. Folgt man der bisher verwendeten Begriffsdefinition, die arboreale Ameisennester in der Regel nach den hauptsächlich verwendeten Baumaterialien einteilt, so muss man zu den bislang bekannten Karton- und Seidennestern die dritte Gruppe der Pilznester hinzufügen. Die Wahl des jeweiligen Baumaterials wirkt sich direkt auf die angewandten Bearbeitungsmechanismen und die Art und Weise der Nestfixierung und Neststabilisierung aus. Die Vertreter der Myrmicinen-Gattungen Myrmicaria und Monomorium zeigten in der Materialnutzung sowie bei der Stabilisierung und Fixierung der Konstruktionen gattungsspezifische Eigenheiten. Die Festigung der Nestbauten werden über H- Brückenstabilisierung (Myrmicaria) und Trichomstabilisierung (Monomorium) erreicht. Pilzhyphenstabilisierte Nester bauen Vertreter der Gattungen Technomyrmex, Dolichoderus und Crematogaster. Wobei innerhalb der beiden letztgenannten Gattungen noch eine Reihe weiterer Fixierungsmechanismen auftreten können. Bei Dolichoderus und Crematogaster sind die Methoden der Materialverfestigung sehr vielfältig und haben jeweils eine große Radiation erfahren (Stabilisierung durch Fremdseide, Pilze, Wurzeln und Klebstoff). Den Camponotus-Arten war die Eroberung der Baumkronenregion mit Hilfe von wurzelstabilisierten Ameisengärten (C. (Myrmotarsus)) und mit der Verwendung klebriger Larvalseide (C. (Karavaievia)) möglich. Beschränkt auf Seide zur Nestfixierung sind die Arten der Gattungen Oecophylla und Polyrhachis. Das bestimmende Element in der Nestarchitektur von fast allen Ameisennestern ist die Bogenkammer oder der Bogengang. Die innere Architektur von Oecophylla-Nestern weicht praktisch als einzige von dieser weit verbreiteten ,Bogenkammer-Struktur-- ab. Bei allen anderen Ameisenarten sind die Nestkammern in der Höhendimension in etwa auf die Größe einer einzelnen Arbeiterin beschränkt. Wegen der kooperativen Zusammenarbeit vieler Arbeiterinnen bei Oecophylla wird die Korrelation von Kammerhöhe und Körpergröße in dieser Gattung aufgehoben. Morphologische Besonderheiten, die als Anpassung an das Leben in Freinestern gedeutet werden könnten, konnten in der vorliegenden Arbeit bei keiner der untersuchten Arten festgestellt werden. Bei Bienen, Wespen und bei den Termiten wird überwiegend eine modellierende Bearbeitungstechnik angewandt. Die körpereigenen, flüssig-adhäsiven Substanzen (Wachs, Sekret und Kot) werden dazu oft noch mit Wasser verdünnt. Auch viele Ameisenarten verarbeiten wassergetränktes Material, nur einige wenige Vertreter der Gattung Crematogaster versetzen es allerdings mit klebenden Sekreten. Die durch das Baumaterial und dessen Fixierung am Substrat vorgegebene Verschiedenartigkeit der Bearbeitungstechniken hat bei den Ameisen zu sehr komplexen Verhaltensweisen geführt. So zum Beispiel das gezielte Verzahnen von Blatthaaren und das Verbinden von Baustoffen ohne die Zugabe von Leim. Weiter bearbeiten Ameisen Materialien, indem sie sie mit Fäkalien und anderen nährstoffreichen Substanzen düngen und so das Wachstum von Pilzhyphen und Wurzelfasern aktiv lenken. Die Seidenweber zeigen mit dem Verspinnen noch eine zusätzliche Möglichkeit der Materialbearbeitung bei Ameisen. Im Vergleich mit anderen sozialen Insekten findet man innerhalb der Ameisen eine mehr generalisierte Bautechnik, die möglicherweise variabler und effizienter ist als die Spezialisierung auf nur eine Materialkomponente. Generell sind die Freinestbauer, anders als die weitgehend deterministisch eingenischten obligaten Pflanzenameisen, bei der Auswahl des Nistplatzes nicht auf vorgegebene Hohlraumstrukturen (Domatien etc.) ganz bestimmter Pflanzen angewiesen, sondern erhöhen ihre Beweglichkeit in der Nistplatzwahl durch die Auswahl vergleichsweise häufig zu findender Substrattypen und Nestmaterialien. Bei allen untersuchten Freinestbauern konnte keine Spezialisierung auf eine bestimmte Pflanzenart festgestellt werden. Stochastische Besiedlungsprozesse gewinnen damit in dieser Ameisengilde, im Vergleich mit den myrmekophytischen Ameisenarten, an Bedeutung. In der vorliegenden Dissertation konnte erstmalig experimentell gezeigt werden, dass die bislang nur aus der Neotropis bekannten Ameisengärten auch im paläotropischen Faunengebiet zu finden sind. Die erstaunlichen Ähnlichkeiten zwischen neotropischen und paläotropischen Ameisengarten-Assoziationen deuten darauf hin, dass es in den unterschiedlichen tropischen Gebieten zu einer konvergenten und parallelen Entwicklung von ähnlich präadaptierten Ameisen und Pflanzen gekommen ist. Freinestbau ist mehrfach unabhängig voneinander entstanden. Sehr wahrscheinlich stand bei vielen Ameisen die Sicherung von Trophobiosestellen am Anfang der Entwicklung. Denkbar ist ebenso, dass die Vergesellschaftung von Epiphyten und Ameisen bei einigen Gruppen die Basis für die Evolution von Freinestbau war. Die Fertigung ausgedehnter Schutzbauten außerhalb der Nester, wie man sie beispielsweise bei der Myrmicinen-Gattung Pheidole findet, könnte ebenfalls die Evolution von frei gestalteten Nestern initiiert haben. Insgesamt wird deutlich, dass Konkurrenzvermeidung und die Erweiterung des Nistraum- und Nahrungsspektrums die drei bestimmenden Faktoren in der Evolution des Nestbauverhaltens von Ameisen waren. Anders als bei Wespen und Termiten fehlt den Ameisen jegliche Prädisposition für die Produktion von liquiden Klebesubstanzen. Sie haben vielfältige Wege gefunden, Wasser zum Nest zu transportieren und damit ihren Möglichkeiten entsprechende Verarbeitungs- mechanismen anzuwenden. Die fehlende gemeinsame Prädisposition der Ameisen für eine dauerhafte Fixierung von Baumaterialien, wie sie für freie Nestkonstruktionen notwendig ist, hat viele verschiedene Lösungen hervorgebracht und ist einer der Gründe für die hohe Variabilität der Freinestbauten bei Ameisen. Die in der vorliegenden Arbeit gezeigte variable Nistbiologie hat einen wichtigen Einfluss auf die Abundanzstrukturen tropischer arborealer Arthropodengemeinschaften und ist in hohem Maße für den großen Erfolg der Ameisen in diesem Habitat verantwortlich.
Eine verteilte Infrastruktur für typ- und diensterweiterbare orthogonale digitale Bibliotheken
(2002)
Ziel dieser Arbeit war es, eine verteilte Infrastruktur zu entwickeln, die die Realisierung skalierbarer erweiterbarer orthogonaler Digitaler Bibliotheken erlaubt. Dabei sollte die Skalierbarkeit sowohl hinsichtlich der Zahl der unterstützten Anwender als auch hinsichtlich der Zahl der gespeicherten Dokumente gewährleistet sowie die Erweiterbarkeit um neue Typen und um neue Dienste sichergestellt werden. In einem ersten Schritt wurde ein Modell skalierbarer erweiterbarer orthogonaler Digitaler Bibliotheken entworfen, das die für Erweiterbarkeit und Orthogonalität notwendigen Elemente und Mechanismen identifiziert. Anhand dieses Modells erfolgte dann eine Untersuchung existierender Systeme zur Verarbeitung digitaler Dokumente im Hinblick auf ihre Eignung zur Realisierung einer skalierbaren, erweiterbaren, orthogonalen Digitalen Bibliothek. Resultat dieser Untersuchung war, daß in existierenden Systemen zur Verarbeitung digitaler Dokumente Erweiterbarkeit nur auf Kosten der Orthogonalität oder Skalierbarkeit unterstützt wird. Als Grund dafür wurde eine mangelnde Unterstützung der transparenten Erweiterung und Interpretation der Zuordnungsfunktion durch diese Systeme erkannt. Die Ursache dieses Mangels ist die unzureichende Benennung der Elemente der Zuordnungsfunktionen in den existierenden Systemen. Um eine Infrastruktur für Digitale Bibliotheken zu entwickeln, die die genannten Anforderungen erfüllt, wurden drei Maßnahmen getroffen: die Einführung einer systemweit eindeutigen Benennung der Elemente der Zuordnungsfunktion, der Entwurf eines Mechanismus zur transparenten Verteilung der Zuordnungsfunktion in der Digitalen Bibliothek und die Entwicklung eines Mechanismus zur transparenten Bereitstellung von Dokumentmethoden in den, an der Digitalen Bibliothek beteiligten Rechnerknoten. Die eindeutige Benennung wurde durch die Definition orthogonaler Operationen ermöglicht. Die Verteilung der Zuordnungsfunktion in der Digitalen Bibliothek konnte durch die Einführung von Metadokumenten erreicht werden. Das Konzept der Metadokumente basiert auf der Erkenntnis, daß die Komponenten der Digitalen Bibliothek nur die Teile der Zuordnungsfunktion benötigen, die sich auf die Dokumente beziehen, die sie bearbeiten. Diese dokumentspezifischen Teile der Zuordnungsfunktion erhält man durch Partitionieren der Zuordnungsfunktion entlang der Dimension der Dokumente. Die dokumentspezifischen Zuordnungsfunktionen werden dann zusammen mit dem Dokumentinhalt in Form eines Metadokuments zusammengefaßt. Aufgrund des Verzichts auf eine Typabbildung ist in jedem Metadokument die vollständige dokumentspezifische Zuordnungsfunktion gespeichert. Die Verteilung der Zuordnungsfunktion in der Digitalen Bibliothek ist damit allein durch den Transport des Dokumentinhalts in Form der Metadokumente möglich geworden. Die transparente Bereitstellung der Dokumentmethoden konnte durch Verwendung von mobilen Programmen zur Implementierung von Dokumentmethoden erreicht werden. Digitale Bibliotheken lassen sich so durch Erstellung eines entsprechenden Metadokuments durch den Dokumentautor transparent um neue Dokumenttypen erweitern. Es wurde gezeigt, wie auf der Basis dieser Infrastruktur eine Vielzahl verschiedener Dokumenttypen realisiert werden können. Dazu zählen Dokumente, die unterschiedliche Formen der Präsentation realisieren, sowie Dokumente zur verteilten Datenhaltung, zur Aggregation von Dokumenten und zur Realisierung zugriffsgeschützter und vertraulicher Dokumente. Die Erweiterung um neue Dienste wurde durch die Definition mobiler Dokumente ermöglicht, die die Verteilung neuer Dienstfunktionen innerhalb der Digitalen Bibliothek erlauben. Mobile Dokumente können, analog zu nicht mobilen Dokumenten, durch den Autor des Dokuments, in diesem Fall den Gestalter des Dienstes, transparent in die Digitale Bibliothek integriert werden. Zusammen mit der Möglichkeit zur Einführung neuer orthogonaler Operationen läßt sich dadurch das Dienstspektrum der Digitalen Bibliothek dynamisch erweitern. Die Elemente der Infrastruktur wurden unter der Verwendung standardisierter Protokolle und existierender Laufzeitumgebungen für interpretierte Sprachen realisiert. Auf der Basis dieser Realisierung wurden verschiedene Dokumente implementiert, anhand derer die Umsetzbarkeit der entwickelten Konzepte demonstriert werden konnte. Der Einsatz plattformunabhängiger Sprachen zur Implementierung von Dokumentmethoden ermöglicht eine Integration zukünftiger Plattformen in die Infrastruktur, ohne daß dazu eine Änderung der existierenden Dokumente und Methoden notwendig wird. In dieser Arbeit wurde eine Infrastruktur entworfen, auf deren Grundlage sich skalierbare erweiterbare orthogonale Digitale Bibliotheken realisieren lassen. Das resultierende System läßt sich durch die Dokumentautoren und Dienstgestalter transparent um neue Dokumenttypen und Dienste erweitern. Durch die konsequente Vermeidung zentraler Komponenten konnte die Skalierbarkeit des Systems in der Zahl der unterstützten Anwender sowie in der Zahl der verwalteten Dokumente sichergestellt werden. Ausgehend von den in dieser Arbeit entwickelten Konzepten können weitergehende Fragestellungen diskutiert werden. So kann die Möglichkeit zur einer engeren Integration der Präsentation aggregierter multimedialer Dokumente, wie sie z. B. im InformediaProjekt bei der synchronisierten Darstellung geographischer Regionen und darauf bezogener VideoDaten vorgenommen wird (vgl. [13]), untersucht werden. Eine Integration unterschiedlicher Dokumente im Präsentationsraum könnte durch die Definition einer orthogonalen MultimediaPresentOperation geschehen, die die Angabe von Koordinaten im Dokument und Präsentationsraum, wie sie z. B. in HyTime [64] möglich ist, zur Kontrolle der Präsentation erlaubt. In der vorliegenden Arbeit wurde der Schutz einzelner AusführungsServer gegen böswillige Dokumentmethoden behandelt. Mit der Möglichkeit zur Erstellung mobiler Dokumente verdient der Schutz des ServerVerbundes zur Begrenzung der Ressourcennutzung durch einen Initiator ebenfalls eine eingehendere Betrachtung. Hier könnten Konzepte aus Infrastrukturen für mobile Agenten, z. B. AgentTcl [42], angepaßt werden, z. B. die Kontingentierung der Ressourcennutzung auf den Rechnerknoten innerhalb einer administrativen Domäne und die Verwendung elektronischen Geldes zur Limitierung der Ressourcennutzung durch mobile Dokumente, die sich zwischen mehreren administrativen Domänen bewegen. Zur Effizienzsteigerung könnten Verfahren zur Übersetzung von plattformunabhängigem Zwischencode in nativen Code der Zielmaschine, wie sie beispielsweise in [33] beschrieben sind, eingesetzt werden. In diesem Zusammenhang sind geeignete Mittel für eine Durchsetzung der Sicherheitsanforderungen auszuwählen und ihr Einfluß auf den zu erwartenden PerformanceGewinn zu untersuchen.
Ziel dieser Arbeit war es, mit der Methode der NMR-Spektroskopie strukturelle und funktionelle Eigenschaften von Fettsäurebindungsproteinen zu untersuchen. NMR-Spektren von Proteinen mit hohem -Faltblattanteil, wie H-FABP, zeigen häufig eine große Dispersion mit einer typischen Verteilung tief- und hochfeldverschobener Signale. Es wurden 1D/2D 1H-NMR Spektren für den Wildtyp und mehrere Mutanten (F4E, F4S, F4S/W8E, W8E, F16E, F16S, K21I, F64S, L66G und E72S) des humanen H-FABP aufgenommen und so weit wie möglich zugeordnet. Auf diese Weise ließ sich bestimmen, ob die typische -Faßstruktur des Wildtyp bei den Mutanten noch intakt ist. Fast alle Mutanten wiesen eine Signalaufspaltung von 10,2 bis 0,4 ppm wie der Wildtyp auf, nur die W8- Mutanten W8E und F4S/W8E zeigen keine Struktur mehr. H-FABP zeigt in NMR-Spektren sogenannte Spinsystem-Heterogenitäten, die auf mehrere parallel existierende konformationelle Zustände zurückzuführen sind und im NMR- Zeitfenster ( < 200 ms) nicht untereinander austauschen. Diese Spinsystem-Heterogenitäten werden nicht direkt durch Liganden verursacht, da sie auch in delipidierten H-FABP-Spektren vorhanden sind. Noch sind sie abhängig von der Position der in räumlicher Nachbarschaft befindlichen Seitenkette des F57, da sie auch in den Spektren einer F57S-Mutante anwesend sind. Eine Relipidierung der H-FABP Proben mit unterschiedlichen Fettsäuren führte zu einer selektiven Bevorzugung einzelner Spinsysteme. So konnte gezeigt werden, daß die Ligandenbindung beim H-FABP nach einem ,,selected-fit" Mechanismus abläuft, bei dem je nach gebundenem Liganden (Palmitin-, Palmitolein-, Stearin- oder Ölsäure) unterschiedliche, schon vorher vorliegende Konformationen des Proteinrückgrates bevorzugt werden. Ein weiterer Teil der hier vorliegenden Arbeit war die Bestimmung der Lösungsstruktur des humanen B-FABP. Es wurde zur Strukturaufklärung die holo-Form des Proteins verwendetet, die ein Fettsäuregemisch endogener Fettsäuren enthielt. Durch den Einsatz mehrdimensionaler homonuklearer und 15N-editierter NMR-Experimente gelang es, nahezu alle 1H und 15N Resonanzen der Aminosäuren zuzuordnen. Lediglich für K37 konnten in den Spektren keine Signale gefunden werden. Nach einer automatisierten Zuordnung der aus den NOESY-Spektren gewonnenen Abstandsbeschränkungen wurde zur Verfeinerung der Lösungsstruktur des humanen B-FABP ein strukturgefilterter Iterationsprozeß durchlaufen. Mit 2490 Abstandsrandbedingungen zwischen Protonenpaaren sowie 106 stereospezifischen Zuordnungen wurden Torsionswinkeldynamikrechnungen mit abschließender Energieminimierung durchgeführt. Ein mittlerer globaler RMSD-Wert der Proteinrückgratatome von 0,85 ± 0,12 Å erfüllt die Ansprüche einer hochaufgelösten Struktur. Die Tertiärstruktur entspricht einem -Faß bzw. einer -Muschel. Sie besteht aus zehn antiparallelen -Faltblattsträngen und einer kurzen Helix-Turn-Helix Domäne. Die - Faltblattstränge bilden zwei nahezu orthogonale -Faltblätter von jeweils fünf Strängen. Die Lösungsstruktur ähnelt trotz teilweise niedriger Sequenzhomologie den bereits bekannten Strukturen der FABPs aus unterschiedlichsten Organismen. Eine sehr gute Übereinstimmung wurde im Vergleich mit der Lösungsstruktur des H-FABP beobachtet. Die enge Verwandtschaft beider zur Unterfamilie IV gehörenden Proteine äußert sich durch die hohe Sequenzhomologie (67%), die Ähnlichkeit der Konformation und Bindungsaffinität der Liganden, die helikale Konformation am N-Terminus (V1-F4) und ein vergleichbares Wasserstoffbrückennetzwerk innerhalb der Bindungstasche.
In dieser Arbeit, deren Hauptanliegen die Erstellung eines pflanzensoziologischen Systems war, wurde die Segetalvegetation der Sudanzone Westafrikas durch vegetationskundliche Aufnahmen erfasst. Zu den Aufnahmen wurden Bodenproben entnommen und Befragungen über die Anbaumethoden sowie Nutzung der Segetalarten durchgeführt. Um ein repräsentatives Bild der Segetalvegetation zu erreichen, wurden Regionen in Burkina Faso, Nigeria, Benin, Senegal und Mali zur Analyse ausgewählt, die in der Süd-, Nordsudanzone sowie in angrenzenden Gebieten der Sahelzone lagen. 601 Arten aus 70 Familien wurden identifiziert. Vier Familien, nämlich Poaceae, Leguminosae- Papilionaceae, Cyperaceae und Asteraceae dominieren in der Segetalflora und stellen die Hälfte der Arten, während die übrigen Familien, mit oft nur einem Vertreter, weniger repräsentiert sind. Corchorus tridens, Mitracarpus scaber und Leucas martinicensis, die drei häufigsten Segetalarten in der Sudanzone stammen jedoch nicht aus den vier oben genannten Familien. Die meisten Arten sind Therophyten und haben eine in den Tropen eingeschränkte Verbreitung. Es sind entweder pantropische (42 %), afrikanische Arten (32) oder paläeotropische Arten (20 %). Aus den 1120 Aufnahmen wurden 65 Gesellschaften beschrieben. Ein Vergleich dieser Gesellschaften führte zur Erarbeitung einer synoptischen Tabelle, deren Einheiten zur Herausarbeitung von pflanzensoziologischen Syntaxa dienten. Dabei wurden die bis dato beschriebenen Einheiten der Segetal- sowie Ruderalvegetation in den Tropen zum Vergleich einbezogen. Ein pflanzensoziologisches System der Segetalvegetation in der Sudanzone wurde erstellt. Zwei neue Klassen wurden definiert: die Leucetea martinicensis und die Caperonietea palustris. Die Leucetea martinicensis kommen auf den trockenen Böden vor und enthalten zwei Ordnungen: die Commelinietalia benghalensis auf gedüngten und die Polycarpeaetalia corymbosae auf ungedüngten Feldern. Die Commelinietalia benghalensis bestehen aus zwei Verbänden, dem Celosion trigynae und dem Tridaxion procumbentis. Der erste Verband ist sowohl in der Nord- als in der Südsudanzone anzutreffen, während der zweite nur in der Südsudanzone zu beobachten ist. Die Polycarpeaetalia corymbosae beinhalten drei Verbände: das Brachiarion distichophyllae, das Merremion tridentatae und das Jacquemontion tamnifoliae. Das Brachiarion distichophyllae kommt überall in der Sudanzone vor und bevorzugt die häufigen pisolithenreichen Böden. Das Merremion tridentatae ist auch in der gesamten Sudanzone verbreitet. Es ist überwiegend auf ausgesprochen sandigen Böden zu finden. Das Jacquemontion tamnifoliae hat einen eindeutigen Schwerpunkt in der Sahelzone und den Übergangsgebieten zur Sudanzone. Das ist der Verband, der auf den Hirsefeldern der Dünen in der Sahelzone wächst. Die Caperonietea palustris sind eine edaphisch stark geprägte Klasse. Sie wachsen auf den extrem tonreichen Vertisolen. Da diese eine Seltenheit in der Sudanzone sind, stellen die Caperonietea palustris eine ganz besondere Vegetation in der Sudanzone dar. Darin wurden zwei Assoziationen beschrieben: das Sorghetum arundinaceum und das Hygrophiletum auriculatae. Die Segetalvegetation auf den Reisfeldern in den Senken gehört zur neuen Ordnung Melochietalia corchorifoliae, die den Phragmitetea TÜXEN
Zum Schutz von Umwelt und Bevölkerung vor unerwünschten Nebenwirkungen wird vielfach der Einsatz von Chemikalien auf ein notwendiges Minimum reduziert. Gerade in der Trinkwasseraufbereitung muss deren Wirkung sorgfältig und zuverlässig kontrolliert werden, da es bei einer Unterdosierung leicht zur Kontamination mit Mikroorganismen kommt. Ein Verfahren mag zum Nachweis solcher Mikroorganismen als geeignet erscheinen, wenn es intakte Keime anzeigt. Gerade in vorbehandelten Proben können jedoch nach einer unvollständigen Desinfektion geschädigte Zellen enthalten sein, die sich unter günstigen Bedingungen erholen (Resuscitation), d. h. ihre Vermehrungsfähigkeit wiedererlangen und dadurch Infektionen auslösen können. Also sollten dafür verwendete Medien auch solche Erreger erfassen, da ansonsten falsch negative Ergebnisse die Folge sind. Im mehrstufigen Nachweis von Escherichia coli nach den Deutschen Einheitsverfahren zur Wasser, Abwasser und Schlammuntersuchung (DEV) wird eine Lactose-Pepton-Lösung als Primärkulturmedium beschrieben, die schon für das Membranfilter-Verfahren als nicht optimal eingestuft wurde. Diese Problematik hatte sich in der vorliegenden Arbeit auch für die Flüssig- keitsanreicherung, das zweite Verfahren nach den DEV, gezeigt. Als Ursache für die verminderten Angehraten im DEV-Medium konnte das darin in einer Kon- zentration von 20 µg/l enthaltene Bromkresolpurpur identifiziert werden. Um das Wachstum bestimmter Mikroorganismen anhand ihrer spezifischen Stoffwechselleistungen anzuzeigen, werden geeignete Substrate in Kombination mit entsprechenden pH-Indikatoren verwendet, zu denen auch das Bromkresolpurpur zählt. Für ungeschädigte Keime hatte letzteres im Vergleich mit anderen, Selektionsmitteln enthaltenden Nährmedien besser abgeschnitten und wurde als weniger giftig" bezeichnet. Bei den in dieser Arbeit untersuchten chlorungsvorgeschädigten Zellen bewirkte es eine signifikante Wachstumshemmung. Im Zuge der weiteren Untersuchungen konnte gezeigt werden, dass eine Verminderung der Bromkresolpurpur-Konzentration auf 10 µg/l nur noch bei einem Teil und auf 5 µg/l bei keinem der verwendeten Stämme mehr eine signifikante Veränderung der Angehrate bewirkte. Die Funktion als Farbindikator wurde dadurch nicht beeinträchtigt.
Oft wurden Aeromonas aus Trinkwassersystemen isoliert und ihre Eigenschaften beschrieben. Mit Hilfe der vorliegenden Arbeit wurden ihre Existenz und ihre Artendiversität in den Biofilmen von Trinkwasserverteilungssystemen in Nordrhein-Westfalen (Deutschland) näher beleuchtet. Hierzu wurden vermehrungsfähige Aeromonas-Arten aus Rohrinkrustationen und Belägen der Rohrinnenoberflächen von Grauguss- und PVC-Trinkwasserrohren isoliert und auf ihre phänotypischen Eigenschaften untersucht. Anhand zahlreicher biochemischer Tests wurden die isolierten Aeromonas-Arten in Unterarten und Biovare unterteilt und mittels Hierarchischer Clusteranalyse weiter klassifiziert. Insgesamt wurden aus fünf der 7 Proben Aeromonas isoliert. Für die Besiedlungsdichte wurden Werte zwischen 24 und 746 KBE/cm2 ermittelt. Eine Abhängigkeit zwischen dem Rohrmaterial (PVC, Grauguss) bzw. dem pH-Wert und der Kolonieanzahl von isolierten Aeromonas konnte nicht festgestellt werden. Während der warmen Jahreszeit wurde in den Belägen eine höhere Koloniezahl von Aeromonas ermittelt. 502 Aeromonas-Kolonien wurden weiter untersucht. Bei 94% der nachgewiesenen Aeromonas-Keime handelte es sich um Aeromonas hydrophila. Außerdem wurden Aeromonas caviae (5%) und Aeromonas sobria (1%) in den Belagssuspensionen identifiziert. Aeromonas caviae nahm in einem System sogar die dominante Rolle ein. Je Probe wurden 120 Aeromonas-Kolonien weiter klassifiziert. Dabei wurden teilweise 35 bzw. 64 Biovare mit unterschiedlichen biochemischen Eigenschaften identifiziert. Bei einigen Proben war die Unterteilung von Aeromonas-lsolaten in weitere Biovare kaum ausgeprägt. Die niedrige Besiedlungsrate und die hohe Anzahl von Biovaren schließen eine Massenvermehrung einzelner Aeromonas innerhalb des Biofilms aus. Vielmehr hat Aeromonas hier nur einen Überlebensraum gefunden. Die hohe Anzahl der Biovare ist auf eine zeitlich versetzte Besiedlung von Aeromonas in den Belagsinkrustationen zurückzuführen.
Im Kontext wirtschaftlicher Entwicklungsbemühungen läßt sich mit dem Auftreten von Währungskrisen in den Emerging Markets in den 90er Jahren ein deutlich zu Tage tretender struktureller Wandel erkennen. Kennzeichnend für diese Entwicklung waren zum einen eine zunehmende Vulnerabilität der Volkswirtschaften und zum anderen eine steigende Volatilität internationaler Finanzanlagen. Diesen Phänomenen lagen im wesentlichen zwei Faktoren zu Grunde. Erstens waren die Währungssysteme, die in den 80er Jahren als Mittel der Inflationsbekämpfung und der wirtschaftlichen Stabilisierung etabliert wurden, aufgrund systeminhärenter Probleme und einer fortschreitenden Integration in die internationalen Finanz- und Kapitalmärkte den neuen Herausforderungen nicht mehr gewachsen. Zweitens führte die Öffnung der Kapitalmärkte in Verbindung mit einer weitreichenden Liberalisierung, Deregulierung und Privatisierung zu neuen Formen investiven privaten Kapitals, daß grundlegend anderen Investitionsentscheidungen unterlag als noch die Kapitalzuflüsse der 80er Jahre. Beide Faktoren führten im Verlauf der 90er Jahre zu einer Reihe spekulativer Währungsattacken in den Emerging Markets und einem grundlegenden Wandel in der Währungspolitik dieser Länder. Dieser Prozess ist auch in der heutigen Zeit noch nicht abgeschlossen. Somit können die Krisenszenarien der 90er Jahre auch als logische Konsequenz und Ausdruck einer notwendigen und teilweise überfälligen Reaktion auf strukturelle Veränderungen gewertet werden. In der vorliegenden Arbeit wird dieser Prozeß anhand der Erfahrungen Mexikos und der Pesokrise von 1994, die oftmals als erste Finanzkrise des 21. Jahrhunderts bezeichnet wurde, nachvollzogen und unter Berücksichtigung nachfolgender Krisenszenarien in Asien, Rußland und Brasilien bewertet.
In dieser Arbeit wurden die Periventrikuläre Leukomalazie und die Perinatale Telenzephale Leukoenzephalopathie analysiert. Aus neuropathologischer Sicht sind diese beiden Krankheitsbilder deutlich voneinander abgrenzbar. Die PVL zeigt nekrotische Veränderungen, Axonauftreibungen, Astrogliose, Gitterzellen und ausschließlich eine Begrenzung auf die weiße Marksubstanz. Da die Veränderungen so deutlich und massiv sind, sich gut durch bildgebende Verfahren darstellen und mit klinischer Symptomatik korrelieren lassen, hat die PVL in der Klinik die größere Bedeutung. Dies wird in Zukunft auch so bleiben, und durch die Verbesserung der bildgebenden Verfahren in Kombination mit indirekten diagnostischen Möglichkeiten (EEG, Doppler, Sehtests) wird die Erkennung der PVL eine immer größere Rolle spielen. Die Neuropathologie wird sich wohl in Zukunft mit der terminologischen Unterscheidung zurechtfinden und diese beiden Krankheitsbilder genauer voneinander differenzieren müssen. Da durch die Autopsie das Gehirn viel genauer untersucht werden kann als mit bildgebenden Verfahren, ist eine genauere Differenzierung der einzelnen Fälle möglich. Wie in dieser Arbeit zu sehen, sind die PVL-Fälle nicht so häufig anzutreffen, wie die als PTL bezeichnete Gliose mit hypertrophen Astrozyten, akut geschädigten Gliazellen oder Amphophilen Globuli, oder auch nur mit einer dieser vergleichsweise milden Veränderungen. Wie der Fall John J. NI: 7611 Kapitel 11.10 (PTL) veranschaulicht, können auch bei diesen relativ geringen Hirngewebsveränderungen klinische Auffälligkeiten vorliegen, die nicht durch konventionelle diagnostische Maßnahmen zu erklären und zu erkennen ist. Den in der Literatur erwähnten klinischen Studien gelang es nicht, die klinischen Symptome der PVL 100 %ig mit den morphologischen Veränderungen in Einklang zu bringen. Hierbei werden nur Wahrscheinlichkeiten angegeben (siehe Kapitel 6 Diagnostik und Kapitel 7 Klinik), die den Einzelfall vernachlässigen. Es können also auch mildere pathologische Veränderungen als eine PVL zu einer klinischen Symptomatik führen. Natürlich gilt das auch umgekehrt, denn nicht jede PVL-Läsion muß zur klinischen Auffälligkeit führen. Die Wahrscheinlichkeiten einer gut diagnostizierbaren PVL mit Zysten lassen darauf schließen, daß sich klinische Auffälligkeiten manifestieren. Die Klinik ist also recht uneinheitlich und läßt für den Neuropathologen keine Rückschlüsse auf die zugrundeliegende Erkrankung zu. Wie ja bereits in Kapitel 6.7 Klinische Untersuchung erwähnt, ist die Früherkennung der Symptome von Bedeutung, um rechtzeitig fördernde Maßnahme (Physiotherapie, Mund- Eßtherapie, Sprachtherapie, psychosoziale Betreuung, Funktionstraining und Hilfsmittelversorgung) einzuleiten. Dabei kann die Diagnostik mit den verschiedenen Mitteln die Erklärung der Symptome plausibel machen, aber sie sind nicht immer korrelierbar. Selbstverständlich ist dann die klinische Symptomatik von größerer Bedeutung als die bildgebenden Verfahren. Die PTL, wie sie von Leviton und Gilles (1983) definiert ist, zeigt sich für den Neuropathologen deutlicher als für den Kliniker. Auch wenn die Autoren einen Oberbegriff schaffen wollten, legen sie sich in ihrer eigenen Arbeit von 1983 erneut fest und beschreiben die Veränderungen mit hypertrophen Astrozyten und Amphophilen Globuli als die Perinatale Telenzephale Leukoenzephalopathie (Leviton
Kurz nachdem Jean Paul im Jahr 1796 den letzten Teil des Romanmanuskripts Blumen-, Frucht- und Dornenstücke oder Ehestand, Tod und Hochzeit des Armenadvokaten F. St. Siebenkäs an seinen Verleger abgeschickt hatte, brach er in die damalige Kulturhauptstadt Weimar auf. Dort traf er zum ersten Mal den von ihm mit Distanz bewunderten Goethe. Während dieser Besuch von Goethe selbst unkommentiert blieb, fand eine aus dem gleichen Jahr stammende Äußerung Jean Pauls eine um so größere Resonanz bei dem um sein Image besorgten Dichterfürsten. ...
In der vorliegenden Arbeit wurden die pharmakologischen und elektrophysiologischen Eigenschaften des Kaliumkanals KCNQ1 und des KCNQ1/MinK (IKs) untersucht. Hierzu wurden die Kanäle in Xenopus-laevis-Oozyten und der KCNQ1/MinK (IKs) in CHO-Zellen exprimiert und in Voltage-Clamp-Experimenten untersucht. Die Blockwirkung des Chromanol-293B-Razemates und die der beiden Enantiomere wurden am KCNQ1- und KCNQ1/MinK-Kanal untersucht. Eine Enantiomerenselektivität der Chromanol 293B-Enantiomere wurde nachgewiesen. Beide Enantiomere wirken abhängig vom Zustand der KCNQ1- und IKs-Kanäle. Das 3S,4R-293B blockierte nur geschlossene Kanäle, während das andere Enantiomer 3R,4S-293B auf geschlossene und auf geöffnete Kanäle wirkte. Als Grundlage dieser Aussagen wurden kinetische Analysen der Kanalkinetiken ohne Blocker und bei partieller Blockade der Kanäle durchgeführt. Die Inhibiton des IKs
Nachdem 1953 von Bates und Griffing [BAT53] der Beitrag der Elektron-Elektron Wechselwirkung neben der Kern-Elektron Wechselwirkung bei der Projektilionisation im Ion-Atom Stoß postuliert und im Rahmen einer 1. Bornschen Näherung beschrieben wurde, gelang in dieser Arbeit zum ersten Mal die ereignisweise Trennung beider Beiträge im Stoß von 3.6 MeV/u C 2 mit Helium durch ein kinematisch vollständiges Experiment, indem die Impulsvektoren des Projektilelektrons ~ p epro , des Targetelektrons ~p etar sowie des ionisierten Targets ~ p R koinzident zum ionisierten Projektil vermessen wurden. Wie sich überraschenderweise herausstellte kann einfach durch Vergleich der Absolutbeträge der Impulsvektoren des Targetelektrons und des Targetkerns für jeden einzelnen Stoß bestimmt werden, ob das Targetelektron "passiv" war und nur das Potenzial des Targetkerns abschirmte ((n-e) Wechselwirkung) oder ob das Targetelektron "aktiv" war und das Projektilelektron in einem Elektron-Elektron Stoß ionisierte ((e-e) Wechselwirkung). Im zweiten Fall bleibt der Targetkern passiv, kompensiert aber ebenfalls ereignisweise das Comptonprofil des ionisierenden Targetelektrons. Der Summenvektor ~q = ~p R ~p etar repräsentiert daher bei der (e-e) Wechselwirkung den korrekten Impuls übertrag des quasifreien Elektron. Die kinematisch vollständige Information über alle beteiligten Stoffteilchen erlaubt es, neben einem detaillierten Einblick in die korrelierte Vier-Teilchendynamik, den gesamten Datensatz nach (n-e) bzw. (e-e) Ereignissen zu sortieren. Die (e-e) Ergebnisse können des weiteren in das Projektilsystem transformiert und dort im Sinne einer Elektronenstoß-Ionisation durch das quasifreie Targetelektron, welches nun Projektil ist, interpretiert werden. Wegen des großen Raumwinkels von Omega = 2pi bis 4 pi für alle Reaktionsfragmente wird im Gegensatz zu klassischen (e,2e) Experimenten weder der Impulsübertrag q noch die Energie Eb des ionisierten Elektrons während der Messung festgehalten. D.h. die Ergebnisse sind im Rahmen der jeweiligen Akzeptanz über alle Impulsüberträge sowie über alle möglichen Energien und Emissionswinkel des ionisierten Elektrons integriert. Prinzipiell können jedoch Impulsübertrag, sowie Elektronenenergie beliebig vorgewählt werden, indem bei der Analyse der Daten entsprechende Fenster gesetzt werden. Die im experimentellen Datensatz enthaltene, vollständige Information erlaubt die Projektion in jeden beliebigen Unterraum. Bei hinreichender Statistik könnten sowohl der dreifach-, als auch jegliche nieder-differentielle Wirkungsquerschnitte aus dem Datensatz extrahiert werden. Aufgrund mangelnder Statistik in dieser ersten Messung stehen jedoch bei zu engen Projektionsfenstern zu wenige Ereignisse zur Verfügung, um signifikante Aussagen treffen zu können. Innerhalb von 12 Stunden effektiver Messzeit konnten 20.000 (e- e) Ereignisse detektiert werden. Realistische Prognosen unterstützen die Annahme, dass während einer weiteren Strahlzeit innerhalb einer Woche 250.000 Ereignisse gemessen werden könnten. Dadurch würde die Einteilung der Daten in kleine Untermengen des Impulsübertrages, vom optischen Limit bis hin zu extrem binären Stößen, bei Elektronenenergien des ionisierten Elektrons von einigen meV an der Kontinuumsschwelle bis hin zu 100 eV Kontinuumsenergie sowohl in koplanarer als auch nicht-koplanarer Geometrie ermöglicht. Ein weitaus asymmetrischeres Stoßsystem ist jedoch für zukünftige Experimente wünschenswert und geplant. Dies bedeutet entweder ein leichteres Target, oder ein schwereres Projektil. Auch angeregte Targetatomen mit Elektronen in hohen (Rydberg-) Zuständen wären denkbar. Die Näherung des Targetelektrons als quasi-freies Elektron wird besser, je kleiner seine Bindungsenergie gegenüber der Bindungsenergie des zu ionisierenden Elektrons ist: Zwar kann das Comptonprofil des quasifreien Elektrons ereignisweise korrigiert werden, es muss aber immer auch ein minimaler Impulsübertrag zur Ionisation des Targets aufgebracht werden. Dieser Unterschied zum (e,2e) mit einem freien Elektron wird jedoch erst vernachlässigbar, wenn die Bindungsenergie des Targetelektrons sehr klein ist gegenüber der des Projektilelektrons, d.h., wenn der Anteil der Targetionisation am Impulsübertrag vernachlässigbar klein ist. (Im hier vorliegenden Fall war das Kohlenstoffelektron jedoch nur ca. doppelt so fest gebunden wie das Heliumelektron.) Weiterhin ist anzunehmen, dass mit kleinerem Z eff des Targets und mit größerem mittleren Radius des Targetelektrons die (n-e) Wechselwirkung an Bedeutung verliert, da die (e-e) Wechselwirkung bei vergleichsweise größeren Stoßparametern stattfindet und der Wirkungsquerschnitt für (n-e) Prozesse mit Z eff skaliert. Diese Überlegungen werden durch Ctmc-Ergebnisse von Olson et al. unterstützt. In Abb. 7.1 werden daher Rechnungen für das Stoßsystem 3.6 MeV/u C 2 auf angeregtes Wasserstoff mit einem Elektron in der n=2 Schale abgebildet. Der Anteil der (n-e) Wechselwirkung ist so klein, dass eine Sortierung der Daten nicht mehr nötig ist: Die Projektilionisation wird nun von der (e-e) Wechselwirkung beherrscht. Im Besonderen sind die im vorangegangenen Kapitel diskutierten Einflüsse der Drei- bzw. Vier-Teilchendynamik offensichtlich bei diesem Stoßsystem gänzlich vernachlässigbar. Die Reduzierung des H-Kerns als "Zuschauer" und somit auch die Reduzierung des Stoßes auf eine (in 1. Ordnung) 2-Teilchen Wechselwirkung zwischen Targetelektron und Projektil scheint nahezu uneingeschränkt gerechtfertigt. In Zukunft werden am Esr der Gsi (weitaus) asymmetrischere Stoßsysteme, wie wasserstoffähnliches Uran auf Helium, zugänglich. Im Esr können derzeit ca. 5 mal 10 hoch 8 Projektile gespeichert, gleichmäßig im Ring verteilt (Gleichstrom-Modus) oder in 1 - 2 "Pakete" von ca. 2 ns Zeitlänge gepackt werden. Die Umlauffrequenz für ein Ionen-Paket oder für ein einzelnes Ion beträgt ca. 2 MHz. Im Gegensatz zu einem Experiment am Strahlrohrende des Unilac passiert ein Projektil, das nicht ionisiert wurde, nach 500ns erneut die Reaktionszone (das Target). Die dadurch erzielte Luminosität erlaubt die Messung von Reaktionen mit vergleichsweise kleinen Wirkungsquerschnitten, welche am Strahlrohrende nicht zugänglich sind. Durch eine elektrische Pulsung des Rückstoßionendetektors in Koinzidenz zur Projektilumladung sowie zum Projektil- und Targetelektron wird man sich in Zukunft von unerwünschten Rückstoßionen aus der reinen Targetionisation befreien können, sodass auch Stoßsysteme, bei denen Targetionisation mehrere Größenordnung wahrscheinlicher ist als die simultane Ionisation von Projektil und Target, zugänglich werden. Die Detektion des hochenergetischen Projektilelektrons wird am Esr jedoch nicht mehr - wie in dieser Arbeit beschrieben - auf dem gleichen Detektor wie das niederenergetische Targetelektron erfolgen können, da diese Geometrie nur eine Akzeptanz für das Projektilelektron bis v p ungefähr gleich 15 a.u. hat und die Impulsauflösung prinzipiell (systematisch) beschränkt ist. In Abhängigkeit vom Stoßsystem kann das Projektilelektron (mit Projektilgeschwindigkeit) am Esr Energien von einigen 100 keV haben. Daher wird in Zukunft die Detektion des Projektilelektrons durch ein 0 0 -Magnetspektrometer in Strahlrichtung hinter dem Reaktions-Mikroskop erfolgen. Da die beiden getrennten Nachweissysteme (Reaktions-Mikroskop, 0 0 -Spektrometer) dann auf die zu detektierende Elektronenenergie optimiert werden können, wird die Impulsauflösung beider Elektronen erheblich verbessert werden. Ein neues Reaktions-Mikroskop, welchen im Rahmen dieser Arbeit geplant und konstruiert wurde, sowie das 0 0 -Magnetspektrometer sind im Aufbau befindlich, und Teile sind bereits im Esr implementiert. Abb. 7.2 zeigt eine technische Zeichnung des Aufbaus. Zu erkennen ist das interne Gasjet-Target des Esr. Der Ionenstrahl durchkreuzt die Kammer von rechts nach links. Das benötigte homogene Magnetfeld zur Führung der Targetelektronen wird durch ein 2m Helmholtz-Spulenpaar realisiert. Die Projektilelektronen, welche in einem kleinen kinematischen Kegel um 0 0 mit Projektilgeschwindigkeit emittiert werden, werden nach dem Durchgang durch das Reaktions-Mikroskop im 0 0 -Spektrometer energie- und winkeldispersiv detektiert. Die Inbetriebnahme erfolgt voraussichtlich in 2002. Bis dahin sind weitere Messungen am Unilac der Gsi für dasselbe Stoßsystem, aber auch mit anderen Projektilen (unterschiedlichen Störungen) geplant. Auch Theoretiker wurden auf die Fragestellungen dieser Arbeit aufmerksam und es sind bereits verschiedene quantenmechanische Rechnungen in Vorbereitung, sodass hoffentlich in naher Zukunft mehrfach-differentielle Wirkungsquerschnitte zur Elektronenstoß-Ionisation von Ionen mit quantenmechanischen Rechnungen höherer Ordnungen quantitativ verglichen werden können.
Das hemmende Umfeld von Ganglienzellen in der Netzhaut des Auges Der Bereich auf der Netzhaut, aus dem Ganglienzellen Lichtsignale erhalten, wird rezeptives Feld genannt. Er umfaßt einen erregenden, zentralen Teil, das rezeptive Feldzentrum, und einen hemmenden, peripheren Teil, das Umfeld. Die antagonistische Organisation (erregendes Zentrum/hemmendes Umfeld) des rezeptiven Feldes verbessert die Signalverarbeitung, indem Kontraste verstärkt werden. Ziel der vorliegenden Arbeit war es, die Mechanismen der Umfeldhemmung an der isolierten, intakten Kaninchennetzhaut zu untersuchen. Das rezeptive Feldzentrum wird durch den erregenden Kontakt zwischen Photorezeptor Þ Bipolarzelle Þ Ganglienzelle erzeugt. Visuelle Stimulation des rezeptiven Feldzentrums erhöht die Entladungsrate (Anzahl der Aktionspotentiale pro Zeiteinheit) der Ganglienzelle. Die Erhöhung der Entladungsrate wird durch die Freisetzung des erregenden Transmitters Glutamat aus präsynaptischen Bipolarzellen bewirkt. Eine Belichtung des Umfeldes hat den entgegengesetzten Effekt: die Entladungsrate der Ganglienzelle wird verringert. Die Umfeldantwort der Ganglienzelle wird durch die laterale Hemmung in der OPL (äußere Synpsenschicht) und der IPL (innere Synapsenschicht) erzeugt. In der OPL wird die Signalübertragung von GABAergen Horizontalzellen moduliert, indem sie Photorezeptoren und/oder Bipolarzellen hemmen. In der IPL modulieren Amakrinzellen, die entweder GABAerg oder glyzinerg sein können, die Signalübertragung, indem sie Bipolarzellen und/oder Ganglienzellen hemmen. Die Entladungsrate von retinalen Ganglienzellen wird bei Belichtung des Umfeldes somit auf zwei Arten verringert: entweder werden präsynaptische Zellen (Photorezeptoren, Bipolarzellen) gehemmt oder die Ganglienzelle wird direkt durch Amakrinzellen gehemmt. Im ersten Fall schütten Bipolarzellen weniger Glutamat aus (indirekte laterale Hemmung), im zweiten Fall wird durch hemmende Neurotransmitter (GABA oder Glyzin) ein Einstrom von Chloridionen in die Dendriten der Ganglienzellen hervorgerufen (direkte laterale Hemmung). Es ist bisher noch unklar, zu welchem Anteil direkte und indirekte laterale Hemmung an der Umfeldantwort beteiligt sind. Weiterhin ist nicht bekannt, welche Neurotransmitterrezeptoren bei der Erzeugung des hemmenden Umfeldes eine Rolle spielen. Um dies zu untersuchen, wurden in der vorliegenden Arbeit lichtinduzierte, synaptische Ströme von retinalen Ganglienzellen an der isolierten, intakten Kaninchenetzhaut gemessen. Dabei wurde die Netzhaut von vorher eingeschläferten Kaninchen freipräpariert und anschließend in einer mit Sauerstoff angereicherten Extrazellulärlösung aufbewahrt. An diesem isolierten, intakten NetzhautPräparat (in vitro Retina) konnten bis zu acht Stunden Lichtantworten gemessen werden. Die lichtinduzierten Ströme wurden in der Ganzzellkonfiguration der PatchClampTechnik in der Spannungsklemme gemessen. Die Meßkammer mit der flach ausgebreiteten Netzhaut befand sich auf einem Mikroskoptisch. Das Mikroskop war mit einer InfrarotDifferentialinterferenzOptik (NomarskiOptik) ausgestattet und die Mikroelektroden konnten unter Sichtkontrolle mit Hilfe eines Mikromanipulators an die Zellkörper herangefahren werden. Kreisförmige und ringförmige Lichtmuster mit verschiedenen Durchmessern, wurden auf einem Computerbildschirm erzeugt und durch den Mikrsokopkondenser auf den Boden der Meßkammer projiziert. Erregende Ströme retinaler Ganglienzellen konnten isoliert werden, indem das Membranpotential der Zelle auf das Umkehrpotential für Chloridionen eingestellt wurde. Die erregenden Ströme wurden durch Belichtung des Umfeldes stark verringert. Dies wird durch die verminderte Freisetzung von Glutamat durch Bipolarzellen verursacht und ist ein Hinweise auf eine indirekte, laterale Hemmung der Ganglienzelle. Durch die Zugabe des GABARezeptorblockers Picrotoxinin in die Nährlösung (Badapplikation) konnte die Umfeldhemmung der meisten Ganglienzellen nahezu vollständig aufgehoben werden. Dieses Ergebnis zeigt, daß präsynaptische GABA A und GABA C Rezeptoren eine wichtige Rolle bei der Umfeldhemmung spielen. Direkte hemmende Chloridionenströme konnten isoliert werden, indem das Membranpotential der Zelle auf das Umkehrpotential für erregende Ströme eingestellt wurde. Durch Beleuchtung des Umfeldes wurden Chloridionenströme in Ganglienzellen ausgelöst. Dies ist ein Hinweis auf eine direkte, laterale Hemmung der Ganglienzelle durch Amakrinzellen, die zusätzlich zur indirekten Hemmung erfolgt. Bei Anwendung der Stromklemme der PatchClampTechnik konnte nachgewiesen werden, daß Chloridionenströme die Entladungsrate der Zelle beeinflussen. Durch die Badapplikation von Picrotoxinin und durch die Überströmung mit dem GABA A Rezeptorhemmer Bicucullin wurden die Chloridionenströme deutlich verringert. Durch den Glyzinrezeptorblocker Strychnin konnten die hemmenden Ströme nur bei wenigen Zellen verringert werden. Dies ist ein Hinweis auf eine direkte Hemmung der Ganglienzelle über GABA A Rezeptoren. In den meisten Ganglienzellen konnten direkte und indirekte Hemmung durch die Badapplikation von Tetrodotoxin verringert werden. Tetrodotoxin hemmt das Entstehen von Aktionspotentialen und das Ergebnis zeigt, daß 'widefield Amakrinzellen, die über Aktionspotentiale kommunizieren zur Umfeldhemmung beitragen. Bisherige Modelle gingen davon aus, daß Interaktionen zwischen Horizontalzellen, Photorezeptoren und Bipolarzellen in der OPL die Hauptursache für die Umfeldhemmung sind. Die vorliegende Arbeit hat gezeigt, daß Interaktionen zwischen Amakrinzellen, Bipolarzellen und Ganglienzellen wesentlich zur Umfeldhemmung beitragen. In der Netzhaut gibt es zwischen 12 und 15 Ganglienzelltypen, die auf unterschiedliche Mustermerkmale wie z. B. Farbe, Kontrast oder Bewegung reagieren. Alle bisher untersuchten Ganglienzelltypen verringern bei einer Reizung des Umfeldes ihre Entladungsrate. Ist bei allen Ganglienzelltypen der Beitrag von Horizontal und Amakrinzellen zur Umfeldhemmung sowie der Anteil von direkter und indirekter lateralen Hemmung gleich? Oder gibt es für jeden Ganglienzelltyp aufgrund seiner physiologischen und morphologischen Ausprägung verschiedene Mechanismen der lateralen Hemmung? Diese Fragen könnten durch die Entwicklung von Pharmaka, welche selektiv Horizontalzellen bzw. Amakrinzellen hemmen, untersucht werden. Die Anwendung dieser Substanzen könnte den Beitrag dieser Zellen zur Umfeldhemmung eines bestimmten Ganglienzelltyps nachweisen. Gleichzeitig könnte die indirekte Hemmung von retinalen Ganglienzellen durch intrazelluläre Applikation von Chloridionenkanalblockern viel genauer als bisher gemessen werden, da auf diese Weise erregende synaptische Ströme besser isoliert werden können. Durch die Kombination dieser beiden Methoden könnte für jeden Ganglienzelltyp der Netzhaut die zellulären und synaptischen Mechanismen der Umfeldhemmung detailliert beschrieben werden.
Die vorliegende Arbeit liefert einen Beitrag zum Verständnis der Rolle des RO x bei der troposphärischen Ozonbildung. Troposphärisches Ozon (O 3 ) spielt eine wichtige Rolle bei der Selbstreinigung der Atmosphäre. Andererseits führen erhöhte Ozonkonzentrationen zu gesundheitlichen Beeinträchtigungen beim Menschen und Schäden an Pflanzen und Umwelt. Die Anwesenheit von flüchtigen organischen Verbindungen (VOCs) führt zur Bildung von Peroxyradikalen (RO x ), die das normale photochemische Gleichgewicht zwischen Ozon und Stickoxiden zu Gunsten erhöhter OzonKonzentrationen verschieben. Im Rahmen der Arbeit wurde ein chemischer Verstärker zur Messung der GesamtPeroxyradikalkonzentration gebaut. RO x reagiert im Einlass des Gerätes mit hinzugefügtem NO und CO in einer Kettenreaktion und bildet dabei NO 2 . Dieses wird mit einem Luminoldetektor nachgewiesen. Der Detektor wird alle 2 Stunden kalibriert. Die Kettenlänge wird durch eine Kalibrierung des Gerätes mit HO 2 Radikalen bestimmt, die durch die Photolyse von H 2 O gebildet werden. Der Verstärkungsfaktor wurde in Bezug auf eine Querempfindlichkeit gegen Wasserdampf korrigiert. Die Messgenauigkeit ist etwa 70% bei 60% relativer Feuchte. Messungen am Taunus Observatorium auf dem Kleinen Feldberg in den Sommermonaten der beiden Jahre 1998 und 1999 werden vorgestellt. Die Ozon und RO x Konzentrationen sind gut miteinander korreliert. Allerdings ist die Tagestemperatur die für die Ozon und RO x Konzentrationen bei weitem wichtigste Einflussgröße und ist daher der beste Parameter zur statistischen Beschreibung von photochemischen Vorgängen. Auf der Grundlage der Messungen am Kleinen Feldberg wurde ein einfaches statistisches Modell zur Vorhersage des Ozonmaximums erstellt. Mit den Parametern Temperatur und Ozonkonzentration am Vortag konnte das statistische Modell bereits 80% der Variation der Ozonkonzentration erklären. Durch die Berücksichtigung der RO x Messungen am Vormittag konnte lediglich eine Verbesserung der erklärten Varianz um 0.5% erzielt werden. Um einen Hinweis auf den Einfluss anthropogener Emissionen zu bekommen, wurde der Wochengang von Ozon, RO x und NO x ebenfalls untersucht. Die Zunahme des Ozonmischungsverhältnisses am Wochenende bei gleichzeitigem Rückgang des Mischungsverhältnisses der Stickoxide wird damit erklärt, dass am Kleinen Feldberg eine VOClimitierte Situation vorgefunden wurde. Die Ozonbildungsrate auf Basis der Reaktion zwischen RO x und NO wurde für Tage mit einem Maximum der Globalstrahlung über 600 W m tdatensatz niedrig (r = 0,46). Die beobachtete Änderung des Ozonmischungsverhältnisses wurde mit dem berechneten mittleren Tagesgang der Ozonbildungsrate verglichen. Die Ozonbildungsrate lag um die Mittagszeit bei etwa 5 ppbv h Verlustprozesse zu erklären. Am Abend werden etwa 2 ppbv O 3 pro Stunde abgebaut. Im Rahmen einer Messkampagne im Juni/Juli 2000 am Meteorologischen Observatorium Hohenpeißenberg fanden Messungen der Konzentrationen von RO x , OH, einer Reihe von VOCs, und anderen relevanten Spurengasen statt. Die Messdaten werden mit Hilfe eines auf der Annahme des lokalen photostationären Gleichgewichts der Radikale basierenden Modells interpretiert. Die Modellergebnisse stimmten sehr gut mit den Messungen überein. Die Überschätzung der Konzentration an 2 Tagen wurde durch den Einfluss sauerstoffhaltiger VOCs erklärt. Das '' Recycling" der HO 2 Radikale (die Reaktion zwischen HO 2 und NO) ist die wichtigste Quelle für OH und die wichtigste Senke für RO x . Durch die erhöhte NOKonzentration am Vormittag wird HO 2 sehr schnell in OH umgewandelt, das wiederum für die VOCOxidation und RO x Bildung verantwortlich ist. Die wichtigste OHSenke und RO x Quelle ist die Oxidation von Isopren und den Terpenen. Um die Rolle der photochemischen Ozonbildung auf regionaler Skala zu untersuchen, wurden Ozonmessungen aus ganz Deutschland auf unterschiedlichen zeitlichen und räumlichen Skalen statistisch untersucht. Die Netto Änderungsrate der Ozonkonzentration war tagsüber an 3 nahe zusammenliegenden Stationen sehr ähnlich. Die OzonMessdaten von 277 deutschen Messstationen wurden mit den an einer Waldmessstelle nahe Königstein gemessenen Ozonwerten korreliert. Die Ozonmessungen in Königstein erklären 50% der Varianz der sommerlichen Ozonmessungen zwischen 11:00 und 16:00 MEZ an Stationen, die in einem Umkreis von etwa 250 km von Königstein liegen. Auf das ganze Jahr bezogen, liegt diese ''charakteristische Entfernung" bei etwa 350 km. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass die Prozesse, die einen wichtigen Einfluss auf die Ozonkonzentration ausüben, auf regionalen Skalen von einigen hundert Kilometern aktiv sind. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass die gemessenen RO x Konzentrationen mit den aufgrund der Oxidation der VOCs durch OH berechneten Konzentrationen konsistent sind. Obwohl die RO x Konzentationen für die chemische Modellierung von Bedeutung sind, tragen RO x Messungen nur wenig zu einer Verbesserung der Qualität von kurzfristigen statistischen Ozonprognosen bei. Keywords: Ozone, Troposphere, Peroxy Radicals, Free Radicals, Photochemistry, Chemical Amplifier
Der Einfluss von turbulenten Strömungen auf die Photodissoziation von CO in interstellaren Wolken
(2001)
Seit 1988 ist bekannt, dass die Photodissoziation von COMolekülen durch Linienabsorption von UVPhotonen stattfindet. Wie jede Linienabsorption ist damit auch die Photodissoziation von CO abhängig von Geschwindigkeitsfeldern innerhalb des absorbierenden Mediums. DopplerVerschiebung kann die Absorption in einen Frequenzbereich verschieben, in dem sich die lokale Intensität von der Intensität in der Linienmitte wesentlich unterscheidet. Jede Untersuchung, die sich mit der Bildung und Vernichtung von COMolekülen am Rand interstellarer Wolken beschäftigt, muss diese turbulenten Geschwindigkeitsfelder berücksichtigen. Da die Existenz von turbulenten Strömungen in interstellaren Molekülwolken unbestritten ist, wird in Untersuchungen üblicherweise der Dopplerparameter der Gaußschen Profilfunktion um eine Turbulenzgeschwindigkeit erweitert. Diese mikroturbulente Näherung ist die simpelste Möglichkeit zur Berücksichtigung von Turbulenz. In vorangegangenen Arbeiten (Albrecht, M.A., Kegel, W.H. (1987)), (Kegel, W.H., Piehler, G., Albrecht, M.A. (1993)), (Piehler, G., Kegel, W.H. (1995)) ist gezeigt worden, dass die Berücksichtigung eines turbulenten Geschwindigkeitsfeldes mit endlicher Korrelationslänge (Mesoturbulenz) jedoch wesentlich dazu beitragen kann, realistischere Linienprofile zu erhalten. Während in den letzten Jahren einiger Aufwand betrieben wurde, die Berechnung der chemischen und thermischen Struktur einer Molekülwolke zu verfeinern, ist der Modellierung des zugrundegelegten Strahlungstransports weniger Aufmerksamkeit gewidmet worden. Die Ergebnisse unserer Rechnungen zeigen, dass die Berück sichtigung eines mesoturbulenten Strahlungstransports den Verlauf der COHäufigkeit entlang des Sehstrahls wesentlich beeinflussen kann. Zusammengefasst haben wir folgende Ergebnisse erhalten: - Rechnungen mit einem EinzellinienModell zeigen den großen Einfluss von Korrelationslänge und Turbulenzgeschwindigkeit auf den Verlauf der Photodissoziationsrate und damit auch auf die resultierende COHäufigkeit. - Bei Mesoturbulenz werden die absorptionsrelevanten Linien schneller optisch dick als bei reiner Mikroturbulenz. Dadurch kann sich eine stabile Zone großer CODichte in Tiefen bilden, von denen bisher angenommen wurde, sie würden eine zu große UVIntensität aufweisen. - Rechnungen, die das volle UVSpektrum berücksichtigen, zeigen eine geringere Sensitivität der COHäufigkeit gegenüber Variationen der Turbulenzparameter als solche mit nur einer Linie. Trotzdem haben Korrelationslänge und Turbulenzgeschwindigkeit starken Einfluss auf die Tiefe, ab der eine stabile COHäufigkeit erreicht wird. - Im Vergleich zu Rechnungen mit einer parametrisierten Photodissoziationswahrscheinlichkeit fällt im mesoturbulenten Fall z CO wesentlich schneller ab. Das bedeutet, dass in größeren Tiefen der Wolke die Werte für z CO um einige Größenordnungen voneinander abweichen können. Für Größe und Isotopenverhältnis des Wolkenmodells kann das zu einer signifikanten Überschätzung der wahren Werte führen. - Das zugrundegelegte Modell der chemischen Reaktionen weist eine hohe Stabilität gegenüber Veränderungen der Turbulenzparameter auf. Auch wenn die COHäufigkeit davon relativ stark betroffen ist, wirken sich diese Veränderungen nur sehr langsam auf die chemische Gesamtstruktur der Wolke aus. - Die Anwendung unserer Ergebnisse auf Beobachtungen von NGC 2024 zeigen, dass sich die Werte, die man für Dichte und Größe der Region aus den Modellen ermittelt, stark von dem zugrundegelegten Strahlungstransportmodell abhängen. Folgerungen, die aufgrund einer zu einfachen Modellierung gemacht werden, sind somit mit einiger Vorsicht zu betrachten. Es zeigt sich, dass der numerische Aufwand, stochastische Strahlungstransportmodelle zu rechnen, durchaus gerechtfertigt ist. Möchte man die Bildung von CO Molekülen am Rand einer interstellaren Molekülwolke genauer verstehen, muss eine endliche Korrelationslänge berücksichtigt werden. Es macht wenig Sinn, immer detailliertere chemische Modelle zu entwickeln und die wichtigen Effekte mesoturbulenten Strahlungstransports zu vernachlässigen.
Informally, commitment schemes can be described by lockable steely boxes. In the commitment phase, the sender puts a message into the box, locks the box and hands it over to the receiver. On one hand, the receiver does not learn anything about the message. On the other hand, the sender cannot change the message in the box anymore. In the decommitment phase the sender gives the receiver the key, and the receiver then opens the box and retrieves the message. One application of such schemes are digital auctions where each participant places his secret bid into a box and submits it to the auctioneer. In this thesis we investigate trapdoor commitment schemes. Following the abstract viewpoint of lockable boxes, a trapdoor commitment is a box with a tiny secret door. If someone knows the secret door, then this person is still able to change the committed message in the box, even after the commitment phase. Such trapdoors turn out to be very useful for the design of secure cryptographic protocols involving commitment schemes. In the first part of the thesis, we formally introduce trapdoor commitments and extend the notion to identity-based trapdoors, where trapdoors can only be used in connection with certain identities. We then recall the most popular constructions of ordinary trapdoor protocols and present new solutions for identity-based trapdoors. In the second part of the thesis, we show the usefulness of trapdoors in commitment schemes. Deploying trapdoors we construct efficient non-malleable commitment schemes which basically guarantee indepency of commitments. Furthermore, applying (identity-based) trapdoor commitments we secure well-known identification protocols against a new kind of attack. And finally, by means of trapdoors, we show how to construct composable commitment schemes that can be securely executed as subprotocols within complex protocols.
In dieser Arbeit werden Darstellungen der Artinschen Zopfgruppen als Gruppen von Automorphismen der Homologie iterativ konstruierter äquivarianter Kettenkomplexe betrachtet. Es werden azyklische Komplexe freier Moduln bzw. freie Auflösungen der ganzen Zahlen für nichtpermutierte Artinsche Zopfgruppen konstruiert, die als iterierte semidirekte Produkte freier Gruppen darstellbar sind. Als Tensorprodukte der freien Auflösungen mit Moduln zu den fraglichen iterierten semidirekten Produkten freier Gruppen erhält man äquivariante Komplexe, deren von Eigenschaften der Koeffizientenmoduln abhängige Homologiegruppen bestimmt werden. Diese Homologiegruppen erlauben Automorphismendarstellungen der (permutierten) Artinschen Zopfgruppe, die gewissermaßen die Artinschen Darstellungen als Automorphismengruppen freier Gruppen iterieren und linearisieren. Insbesondere werden Darstellungen gewonnen, die die bekannten Burau- und Gassner-Darstellungen der Zopfgruppen verallgemeinern und die als Monodromiegruppen verallgemeinerter hypergeometrischer Integrale interpretiert werden können.
In den vergangenen Jahren wurden in der AntisenseTechnologie grundlegende Hürden genommen, die eine Arzneimittelentwicklung auf Nukleinsäurebasis ermöglichen. Hierzu zählt vor allem die Gewährleistung einer ausreichenden metabolischen Stabilität und die Synthese im technischen Maßstab. In zahlreichen klinischen Studien wurde der Wirksamkeitsnachweis am Menschen erbracht. Als sequenzspezifische Therapeutika zeichnen sich Antisense Oligonukleotide im Vergleich zu vielen anderen Wirkstoffen dadurch aus, daß sie spezifisch mit einer RNAZielsequenz hybridisieren, ohne dabei wichtige zelluläre Funktionen zu beeinträchtigen. Neben krankheitsauslösenden Genen können Antisense Oligonukleotide auch virale Gene blockieren und nach Aktivierung der Ribonuklease H hydrolysieren. Das erste Präparat auf Oligonukleotidbasis wurde 1998 zugelassen und hemmt erfolgreich die Vermehrung des Cytomegalievirus. Hepatitis C ist eine Virusinfektion, die momentan nur unzureichend therapiert werden kann. Seit Mitte der neunziger Jahre wird nach geeigneten Antisense Oligonukleotiden und Ribozymen gesucht, um die Heilungschancen bei einer chronischen HCVInfektion zu verbessern. Im Rahmen dieser Arbeit wurde durch experimentelles Screening eine potente Zielsequenz (tS13) im Bereich der internen ribosomalen Angriffsstelle (IRES) und des Startcodons für die Proteinbiosynthese des HCV gefunden (Nukleotide 326342 des HCV Genoms). Hierzu wurde die Sequenz eines bereits bekannten 23mer Antisense Oligonukleotids durch systematisches Verkürzen auf 17 Nukleotide reduziert, ohne in vitro an Inhibitionspotential einzubüßen. Erst weitere Verkürzungen führten zu einer deutlichen Abnahme der Antisense Wirkung. Eine Schwierigkeit bei der therapeutischen Anwendung von polyanionischen Antisense Oligonukleotiden ist deren begrenzte zelluläre Aufnahme. Wie in Kapitel 3 dargelegt, wurden bislang zahlreiche Methoden zur Verbesserung der Membrangängigkeit dieser Wirkstoffklasse entwickelt. Zur Evaluierung eines leberselektiven Transports (engl.: drug targeting) und zur Steigerung der hepatozellulären Aufnahme (engl.: cell uptake) wurde das antiviral wirkende 17mer Antisense Oligonukleotid tS13 mit Biomolekülen wie den Gallensäuren, die im enterohepatischen Kreislauf das Zielorgan Leber passieren, kovalent verknüpft. Die Kupplung erfolgte dabei über die für die zelluläre Aufnahme nicht essentielle 3aHydroxylgruppe der Cholsäure und Taurocholsäure. Die Gallensäuren wurden entsprechend geschützt, in die Phosphoramidite 22a/b und 27a/b überführt und im letzten Kupplungsschritt der Festphasensynthese an das 5
Hitzestress führt bei allen bisher untersuchten Organismen zu einer transienten Umprogrammierung des Transkriptions- und Translations-apparats. Bei diesem auch als Hitzestressantwort bezeichneten Prozess wird vorrangig eine neue Klasse von Proteinen exprimiert, die als Hitzestressproteine (Hsp) bezeichnet werden. Eine Schlüsselrolle in der Signaltransduktionskette der Hitzestressantwort spielen Hitzestresstrans-kriptionsfaktoren (Hsf). Hsf sind hochkonservierte, modular aufgebaute Proteine mit einer N-terminalen DNA-Bindungsdomäne (DBD), einer zentralen Oligomerisierungsdomäne (HR-A/B Region) und einer C-terminalen Aktivatordomäne (AD). Über ihre DBD sind oligomerisierte Hsf in der Lage an hochkonservierte Motive, sogenannte Hitzestresselemente (HSE), in der Promotorregion von Hsp zu binden und deren Transkription zu initiieren. In hitzegestressten Zellen von Lycopersicon peruvianum (Perutomate) können neben den konstitutiv exprimierten Hitzestresstranskriptionsfaktoren A1 und A3 die beiden stressinduzierten Vertreter HsfA2 und B1 nachgewiesen werden. In präinduzierten Zellen befindet sich HsfA2 trotz einer funktionellen Kernimportsequenz (NLS) überwiegend im Zytoplasma. Dieses Verhalten von HsfA2 wurde bisher durch eine konformationsbedingte Maskierung der NLS erklärt. Der Kotransport von HsfA2 in den Zellkern erfolgt in diesem Modell durch eine heterologe Interaktion mit HsfA1. Mit dem Ziel, die für den Transport und die Interaktion mit HsfA1 verantwortlichen Strukturelemente von HsfA2 näher zu untersuchen, wurden verschiedene Tomaten-Hsf sowohl in Tabakprotoplasten, als auch in CHO-K1 Zellen heterolog exprimiert. Hierbei konnte gezeigt werden, dass sich HsfA2 auch ohne die Interaktion mit HsfA1 im Zellkern anreicherte, wenn der Kernexportrezeptor Crm-1 mit dem Antibiotikum Leptomycin B (LMB) inhibiert wurde. HsfA2 wird demnach permanent zwischen Kern und Zytoplasma hin- und hertransportiert, wobei der Kernexportprozess dominiert. Die für den Export verantwortliche, leucinreiche Kernexportsequenz (NES) konnte am äussersten C-Terminus von HsfA2 identifiziert werden. HsfA2-Mutanten, bei denen dieser Sequenzabschnitt deletiert bzw. die Leucine durch Alanine substituiert wurden, waren überwiegend im Zellkern lokalisiert. Die Fusion der NES von HsfA2 an den ausschliesslich im Zellkern lokalisierten HsfB1 führte zum Export des Fusionsproteins ins Zytoplasma, was durch die Zugabe von LMB wieder umgekehrt wurde. Ferner konnte gezeigt werden, dass für die Interaktion mit HsfA1 und den Kotransport in den Zellkern die HR-A/B Region essentiell ist. Mit Hilfe eines Luciferasereporterassays konnte der Zusammenhang zwischen der Lokalisation von HsfA2 und dessen Transaktivierungspotential in CHO-K1 Zellen demonstriert werden. Hierbei stellte sich heraus, dass die im Zellkern lokalisierte NES-Mutante eine ca. 20-fach höhere Aktivität im Vergleich zum zytoplasmatisch lokalisierten Wildtyp hatte. Ebenso führte die LMB-bedingte Anreicherung von HsfA2 im Zellkern bereits nach 6 h zu einer messbaren Steigerung der Aktivität. Eine synergistische Aktivitätszunahme konnte, wie auch schon in Tabakprotoplasten beobachtet, bei gleichzeitiger Expression mit HsfA1 gemessen werden. In Hitzestressversuchen (41 °C) konnte gezeigt werden, dass HsfA2 in CHO-K1 Zellen selbst unter dem Einfluss von LMB nicht mehr in den Zellkern importiert wurde. Bei Zellen, die sich unter LMB-Einfluss bei 37°C von dem Hitzestress erholten, kam es jedoch bereits nach 15 min zu einer sichtbaren Translokation von HsfA2 in den Zellkern. Dieses Verhalten lässt Rückschlüsse auf eine mögliche, konformationsbedingte Maskierung der NLS unter Hitzestress zu. Insbesondere da die HsfA2-Mutante, bei der die HR-A/B-Region fehlte, sich auch unter Hitzestress im Zellkern anreicherte. Neben der löslichen Form im Zytoplasma kommt HsfA2 in Tomatenzellen unter Hitzestress auch in einer unlöslichen, strukturgebundenen Form vor. Diese als Hitzestressgranula (HSG) bezeichneten Komplexe bestehen überwiegend aus niedermolekularen (lmw)-Hsp. Es konnte gezeigt werden, dass die Koexpression von lmw-Hsp und HsfA2 unabhängig vom Expressionssystem zur Bildung zytoplasmatischer Aggregate führte, in denen beide Proteine nachweisbar waren. Hierbei konnte sowohl eine klassen- als auch eine artspezifische Interaktion von HsfA2 mit Klasse II lmw-Hsp aus Tomate beobachtet werden. Ferner konnte gezeigt werden, dass die HR-A/B Region für die Interaktion von HsA2 mit lmw-Hsp essentiell ist.
1. Die Arbeit soll den Beitrag von Ionenleitfähigkeiten an der Funktionsweise der Vogelhaarzelle weiter aufklären. 2. Dazu werden zwei Ionenkanalmodulatoren sowohl in die Scala media, wie auch in Scala tympani appliziert. Amilorid ist ein Blocker v.a. von Natriumabhängigen Ionleitfähigkeiten; Diazoxid ist ein Öffner ATPabhängiger Kaliumleitfähigkeiten. 3. Amilorid hat bei Applikation in die Scala media keinen Effekt auf das endocochleäre Potential. Diazoxid senkt das endocochleäre Potential nach Applikation in die Scala media signifikant um 2,42mV ± 2,31. Da Diazoxid auf die Aktivität auditorischer Neurone keinerlei Einfluß hat, muß davon ausgegangen werden, daß Diazoxid das EP durch Beeinflussung anderer Ionkanäle unabhängig von der Haarzelle absenkt. Mögliche Kandidaten sind Ionkanäle im Bereich des Tegmentum vasculosum, das für die Generation des EP mit verantwortlich ist. 4. Eine endolymphatische AmiloridApplikation erhöht frequenzabhängig und dosisabhängig die CAPSchwelle, wobei die Schwellenanhebung mit Anstieg der Frequenz steigt (gemessener Bereich 1252000Hz). Bis zu einer Frequenz von 400Hz hat Amilorid kaum einen Effekt auf das CAP, oberhalb 400Hz steigt die Schwelle mit einem Gradienten von 11 dB/Okt an. 5. Diazoxid hat bei Applikation in die Scala media keinen Einfluß auf das CAP. 6. Die endolymphatische Applikation von Amilorid erniedrigt die akustisch evozierte Entladungsrate und erhöht die spontane Entladungsrate afferenter Neurone aus dem Ganglion cochleare. Diese Veränderungen sind abhängig von der charakteristischen Frequenz und der applizierten Menge, wobei der Frequenzbereich der charakteristischen Frequenz der nicht reagierenden Einzelfaserableitungen. zwischen 126632 Hz lag, der der reagierenden zwischen 704 und 1200 Hz. 7. Bei den afferenten Neuronen, bei der die akustisch evozierte Aktivität nach endolymphatischer Applikation von Amilorid ansteigt, kommt es auch zu einer Veränderung der von der evozierten Aktivität abhängigen Parameter Q10dB, Tief und Hochfrequenzflanke und charakteristischer Frequenz. Die endolymphatische AmiloridKonzentration bei diesen Einzelfaserableitungen lag zwischen 91µM und 269 µM. 8. Die charakteristische Frequenz wird durch Amilorid erniedrigt, allerdings kommt dies durch eine stärkere Abnahme der evozierten Rate oberhalb der charakteristischen Frequenz zustande. 9. Die Gruppeneinteilung ist bis auf ein Neuron bei Veränderungen spontaner und akustisch evozierter Entladungsrate gleich. Bei einem kam es zu einem Anstieg der spontanen Entladungsrate, aber nicht zu einer Abnahme der akustisch evozierten Entladungsrate. Dies legt nahe, daß 1. die Veränderungen auf Beeinflussung unterschiedlicher Ionleitfähigkeiten beruht , und 2. die Ionleitfähigkeit, welche für die Veränderung der spontanen Entladungsrate verantwortlich ist, etwas sensibler für Amilorid ist, als jene, welche für die Veränderung der evozierten Entladungsrate verantwortlich ist. 10. Der Anstieg der evozierten Rate steht in guten Einklang mit den Ergebnissen von Jørgensen und Ohmori (1988), die zeigen konnten, daß Amilorid den mechanoelektrischen Transduktionskanal von Vogelhaarzellen mit einem IC 50 von 50µM blockiert. Der Anstieg der spontanen Entladungsrate kann mit einem Block des Transduktionskanals nicht erklärt werden. Es muß also noch eine andere Leitfähigkeit in dem Innenohr der Taube durch Amilorid blockiert werden. 11. Zusammen mit den Ergebnissen anderer Studien legen die Ergebnisse nahe, daß es sich hierbei um eine Ionleitfähigkeit im Bereich der apikalen Membran handeln muß. Mögliche Kandidaten wären Ca 2 Kanäle, welche an Ca 2 abhängigen Prozessen zur Regulierung der Ciliensteifigkeit bzw. Cilienmotilität beteiligt sind. 12. Diazoxid hat bei Applikation in die Scala media keinen Einfluß auf die Aktivität auditorischer Neurone. 13. Bei Applikation in die Scala tympani hat weder Amilorid noch Diazoxid Einfluß auf das CAP.
28 Kinder mit Pierre-Robin-Sequenz, die erstmals im Humangenetischen Institut der Universitätsklink in Frankfurt am Main im Alter von drei Monaten bis acht Jahre untersucht wurden, wurden im Alter von acht bis 16 Jahren nachuntersucht. Die Kinder wurden unterteilt in eine Gruppe mit isolierter und eine Gruppe mit syndromatischer PierreRobinSequenz. Sie wurden hinsichtlich ihrer physischen, psychomotorischen, audiologischen und sprachlichen Entwicklung untersucht. Die Gruppen unterschieden sich bezüglich des körperlichen Wachstums, der Häufigkeit von mentaler und sprachlicher Retardierung. Die Kinder mit syndromatischer PierreRobinSequenz waren durchschnittlich kleiner und leichter bei Geburt und im Verlauf. 19 % der Kinder mit syndromatischer Form waren kleinwüchsig. Eine mentale Retardierung fand sich nur in der Gruppe mit syndromatischer PierreRobinSequenz, in der 31 % betroffen waren. 8,3 % der Kinder mit isolierter Pierre-Robin-Sequenz waren in ihrer sprachlichen Entwicklung retardiert, während dies bei 38 % der Kinder mit syndromatischer Form der Fall war. Schwere Artikulationsstörungen, die zu einer sehr undeutlichen Aussprache führten, fanden sich bei 17 % der Kinder mit isolierter und bei 29 % der Kinder mit syndromatischer PierreRobinSequenz. Zwei Kinder mit syndromatischer PierreRobinSequenz hatten überhaupt keine Expressivsprache entwickelt. Es konnte ein Zusammenhang dieser Unterschiede in der Entwicklung mit der Schwere der respiratorischen und ernährungsbezogenen Probleme in den ersten beiden Lebensjahren gesehen werden. Respiratorische Probleme traten etwas häufiger in der Gruppe mit syndromatischer Pierre-Robin-Sequenz auf. Gemessen an der Häufigkeit und Dauer der Nahrungssondierung waren die Ernährungsprobleme ebenfalls deutlich ausgeprägter in der Gruppe mit syndromatischer Pierre-RobinSequenz. Eine Schallleitungsschwerhörigkeit fand sich insgesamt bei 39 % der 28 Probanden ohne wesentliche Unterschiede zwischen den beiden Gruppen. Eine Schallempfindungsschwerhörigkeit trat nur in der Gruppe der Patienten mit syndromatischer PierreRobinSequenz auf. Diese Ergebnisse waren vereinbar mit den Resultaten früherer Untersuchungen, die darauf hin deuteten, dass Kinder mit isolierter PierreRobinSequenz bei optimaler Therapie im Neugeborenen und Säuglingsalter eine gute Prognose bezüglich ihrer physischen und mentalen Entwicklung haben, während bei Vorliegen eines übergeordneten Syndroms häufiger mit Wachstumsdefiziten und mentaler Retardierung zu rechnen ist. Bezüglich der genetischen Beratung läßt sich feststellen, dass das Wiederholungsrisiko bei isolierter Pierre-Robin-Sequenz klein ist.
Wir haben Interaktion in der Kommunikationskomplexität untersucht und dabei die drei Modi probabilistische, (beschränkt) nichtdeterministische und quantenmechanische Kommunikation betrachtet. Bei allen drei Modi haben wir herausgefunden, dass Interaktion für Effzienz oft unerlässlich ist, im nichtdeterministischen Fall gibt es eine Abhängigkeit zwischen dem Einfluss der Interaktion und der erlaubten Anzahl der nichtdeterministischen Ratebits. Abgesehen von dem erreichten besseren Verständnis des Kommunikationsmodells haben wir verschiedene Anwendungen auf andere Berechnungsmodelle beschrieben, bei denen untere Schranken der Kommunikation zu unteren Schranken für andere Ressourcen in diesen Modellen geführt haben. Ein Beispiel eines kommunikations- und interaktionsbeschränkten Modells sind endliche Automaten, welche wir in allen drei Modi untersucht haben. Ein weiteres Beispiel sind Formeln, für die wir eine Verbindung zwischen Einweg Kommunikation und Formellänge herstellen konnten. Diese Verbindung führte zu unteren Schranken für probabilistische, nichtdeterministische und Quanten Formeln. Dabei sind die unteren Schranken für Quanten Formeln und probabilistische Formeln im wesentlichen gleich. Für monotone Schaltkreise haben wir gezeigt, wie nichtdeterministisches Raten die Tiefe drastisch reduzieren kann, und wie eine geringfügige Einschränkung der nichtdeterministischen Ratebits zu einer Tiefenhierarchie führt. Insgesamt lässt sich feststellen, dass die Schwäche interaktionsbeschränkter Kommunikation mathematisch nachvollziehbar ist. Außerdem scheint ein solches Verhalten in der Welt einfacher Berechnungsmodelle häufig aufzutreten. Oder anders gesagt, viele Berechnungsmodelle sind deshalb einfacher zu verstehen, weil sie durch interaktionsbeschränkte Kommunikation analysierbar sind.
In der vorliegenden Arbeit wurde ein neuer Algorithmus für die automatische Optimierung einer NMR-Zuweisung des back bones in gelabelten Proteinen und seine Implementierung vorgestellt. Der Algorithmus ermöglicht eine Zuweisungsstrategie, die sich näher an der manuellen Vorgehensweise orientiert als vergleichbare Implementierungen von Lukin (LUK 11 ) [Lukin97] oder Leutner (PASTA) [Leutner98], da er die Entscheidung über konkurrierende Protospinsysteminterpretationen in die globale Optimierung der Zuweisung verlegt und die Benutzer nicht zwingt, sich vorzeitig auf eine Interpretation pro Aminosäure und Peak zu beschränken. Der Algorithmus löst daher nicht nur das Reihenfolgenproblem für einen schon vorgegebenen Satz von Protospinsystemen, sondern auch das Auswahlproblem zwischen verschiedenen, sich widersprechenden, Interpretationen der gleichen Peakgruppe. Durch das zusätzliche Auswahlproblem erhöht sich die Komplexität der Optimierungsaufgabe, der Lösungsraum wächst daher um mehrere Größenordnungen. Dies verlängert die Laufzeit für den einfachen RANDOM Algorithmus gegenüber einem vergleichbaren Reihenfolgeproblem. Es wurden daher verschiedene Methoden untersucht, um die Laufzeit wieder zu reduzieren. Die erzielten Verbesserungen führen nicht nur zu einer besseren Konvergenz, sondern ermöglichen auch erstmals eine echte parallele Implementierung des Algorithmus. Die algorithmischen Verbesserungen sind die Reduktion des Protospinsystemcaches und der GENETISCHe Algorithmus. Zusätzlich wurde eine verbesserte Konfiguration zur Kontrolle der Suboptimierer gefunden. Die Implementierung der zugrundeliegenden Datenstrukturen ermöglicht die Umsetzung zusätzlicher Nebenbedingungen für die Positionen der Protospinsysteme innerhalb der Zuweisung. Ein Beispiel für die Nebenbedingungen sind die knotenlokalen Filter und die Strukturfilter aus Kapitel 2. Ihre Effizienz wird am besten durch die Aminosäuretypenerkennung demonstriert, die die Größe des Lösungsraumes um 168 Größenordnungen für Trigger reduziert. Dadurch verringert sich die Laufzeit des RANDOM Algorithmus bis zu einem Faktor von 132. Für PASTA wurde in [Leutner98] statt dessen der umgekehrte Effekt auf die Laufzeit festgestellt. In ihrer Implementierung verlängert sich die Laufzeit auf das Doppelte. Der Unterschied kann nur durch eine unterschiedliche Nutzung der Aminosäuretypenerkennung im Protospinsystempool erklärt werden. PASTA nutzt diese Information anscheinend nicht, um den Pool und damit den Lösungsraum zu reduzieren, sondern nur bei der Bewertung der Zuweisung. Diese Konfiguration kann in RANDOM näherungsweise nachvollzogen werden, wenn man im AS-Cache jeder Aminosäure jedes Protospinsystem zuweist. Die Bewertung der Aminosäuretypen und den Austausch zwischen Pool und Individuum kann man aber nicht abschalten. Ein möglicher Nachteil der Reduktion des AS-Caches mittels der Aminosäuretypenerkennung ist die Möglichkeit, daß Aminosäuren mit untypischen Frequenzen der falschen Aminosäure zugewiesen werden oder nicht in den Cache für die theoretische Aminosäure aufgenommen werden. Um eine falsche Zuweisung durch die Reduktion auszuschließen oder zu überprüfen, kann man zuerst mit einem AS-Cache mit Typenerkennung optimieren und das Ergebnis in einer zweiten Optimierung mit einem AS-Cache ohne Typenerkennung nachoptimieren. Diese Möglichkeit wurde bei der Zuweisung von Trigger demonstriert. Für Trigger konnte durch den Wechsel des Caches gezeigt werden, daß auch mit dem reduzierten Cache eine stabile Zuweisung gefunden wird, die der Zuweisung ohne Aminosäuretypenerkennung weitgehend entspricht. Die Zuweisungen unterscheiden sich in Aminosäuren mit unsicherer Typenzuweisung. In Trigger wird nur ein Protospinsystem (Phe66,Ile67) aufgrund der Typeninformation von der Position im AS-Cache ausgeschlossen, der es in der manuellen und der Zuweisung ohne Reduktion zugewiesen wurde. In anderen Fällen führt erst die Typeninformation zur richtigen Zuweisung (zB. Thr60,Ile61), während die Zuweisung ohne Typenerkennung eine Fehlzuweisung erzeugt. Man sollte daher immer beide Versionen berechnen und dann vergleichen, da eine manuelle Zuweisung beide Defekte aufweisen kann, weil sie die Zuweisungsregeln nicht so strikt optimiert, wie es ein automatischer Algorithmus kann. Für beide Algorithmen wurde der Parameterraum untersucht und eine sowohl optimale als auch robuste Konfiguration gesucht. Dabei wurde der Einfluß jedes Parameters des Algorithmus auf die Laufzeit bis zur Konvergenz zum globalen theoretischen Maximum bestimmt. Bei RANDOM waren hauptsächlich die Zusammensetzung des Aktionsprofils und die minimale und maximale Lebenszeit der veränderten Zustände, minTTL und maxTTL, für die Laufzeit entscheidend. Alle drei kontrollieren, welche Pfade durch den Lösungsraum ab einem Zustand erlaubt sind. Die gleiche Untersuchung wurde auch für die Parameter der zu berechnenden Probleme (Proteine) durchgeführt. Für den Datensatz wurde sowohl der Einfluß der Proteingröße, des maximalen CA Abstandes zwischen den Peaks der benachbarten Aminosäuren und der Aufbereitung des Protospinsystemcaches auf die Laufzeit, als auch der Einfluß eines unvollständigen Datensatzes auf die Konvergenz untersucht. Der Algorithmus zeigte sich dabei sehr robust gegen fehlende Peaks, da bis zu 45% der theoretischen Peaks fehlen können, ohne daß die Konvergenz zum theoretischen Optimum verloren geht. Unterhalb von 55% hängt die Übereinstimmung der gefundenen Lösung mit der theoretischen Lösung von der Zusammensetzung der gebildeten Protospinsystemfragmente ab. Proteingröße und maximaler CA Abstand haben dagegen großen Einfluß auf die Laufzeit. Während die Parametrisierung des RANDOM Algorithmus sich auf die Untersuchung des Wertebereichs der Kontrollparameter beschränken kann, muß die Parametrisierung des GENETISCHen Algorithmus auch die verschiedenen Crossover Operatoren und die Kontrolle der Suboptimierer umfassen. In Kapitel 3 wurden die verschiedene Crossover Algorithmen und unterschiedliche Konfigurationsvarianten für den Suboptimierer im GENETISCHen Algorithmus untersucht. Die aus der Literatur bekannten Crossover Operatoren waren dabei den spezialisierten G Operatoren unterlegen. Auch die Varianten elitär und statistisch, die keinen genetischen Austausch zwischen verschiedenen Individuen zulassen, waren den speziellen Operatoren immer unterlegen. Selbst kleine Anteile eines Genaustausches bewirkten eine Verbesserung der Laufzeit und die Qualität der Lösung. Dabei verbesserte sich besonders die Konvergenz durch den genetischen Austausch. Die speziellen G Operatoren übertragen nur die Differenz der Eltern statt, wie im klassischen Crossover, blind irgendeinen zusammenhängenden Bereich zu kopieren. Dadurch vermeiden sie es, hauptsächlich identische Bereiche zu kopieren, sondern übertragen nur Protospinsysteme, die sich in den Eltern unterscheiden. Außerdem wurde die Effizienz der speziellen Operatoren noch weiter gesteigert, indem die übertragenen Informationen mit Hilfe von Filtern gezielt auswählt wurden. Die übertragene Differenz wird dazu aufgrund ihrer Nachbarn und der Verknüpfung mit den Nachbarn ausgewählt. Mit unterschiedlichen Filtern wurden so Bereiche mit einem unterschiedlich hohen lokalen Optimierungsgrad für die Übertragung ausgesucht. Die Laufzeituntersuchungen in Kapitel 3 zeigen, daß es eine Grenze für die Effizienzsteigerung durch die Übertragung lokal voroptimierter Bereiche gibt. Während es beim Wechsel von unkoordinierten, punktförmigen Übertragungen (s1) zur Übertragung von kurzen Strecken aus benachbarten Protospinsystemen, mit oder ohne Verknüpfung (s2), noch zu einer geringen Verbesserung der Laufzeit und der Konvergenz kommt, führt die zusätzliche Koordinierung der übertragenen Nachbarn durch die Nebenbedingung der Verknüpfung in den s3 Algorithmen sogar zu einer geringen Verschlechterung der Laufzeit. Die Gründe für die Verschlechterung konnten nicht eindeutig nachgewiesen werden. Möglicherweise verringert sich die Anzahl der kopierbaren Bereiche durch die zusätzlichen Nebenbedingungen so sehr, daß nicht genügend unterschiedliche Differenzen für die Übertragung in die neuen Individuen gebildet werden. Die neuen Individuen erhalten dann hauptsächlich die gleichen neuen Gene. Dadurch kann es zu einer Verarmung des genetischen Pools, d.h. zum Verlust der genetischen Diversität in der Population kommen. Die neuen Individuen suchen dann identische Bereiche im Lösungsraum ab und nehmen dadurch die lokale Optimierung doppelt vor. Dadurch verschwendet diese Konfiguration CPU Zeit auf schon untersuchte Bereiche. Neben der direkten Übertragung zusammenhängender Bereiche gibt es noch einen weiteren Faktor der die spezialisierten Operatoren, gegenüber dem klassischen Crossover, verbessert. Die Differenzbildung im Crossover nimmt auf die Konkurrenz um die Peaks zwischen den Protospinsystemen keine Rücksicht. Dadurch befinden sich die neuen Individuen zuerst meist im illegalen Teil des Zustandsraumes S n . Nach dem Crossover wird daher ein Teil der ursprünglichen Protospinsysteme des neuen Individuums durch den Reparaturmechanismus gelöscht und dadurch schon optimierte Bereiche zerstört. Daher kommt dem Reparaturmechanismus für illegale Zustände die entscheidende Rolle zu, denn er erzwingt die Neuberechnung der Positionen, die vor dem Crossover durch einen Konkurrenten eines übertragenen Protospinsystems belegt waren. Die ehemaligen Zuweisungen in den zerstörten Bereichen sind dabei nur über die Resourcenkonkurrenz mit den im Crossover neu injizierten korreliert. Das Crossover mit Zerstörungen erweitert dadurch den erreichbaren Lösungsraum, statt ihn, wie beim klassischen Crossover, auf den Raum zwischen den Eltern einzuschränken! Die Zerstörungen sind für die Optimierung daher von Vorteil. Außerdem zeigte sich in Kapitel 3, daß für die speziellen Operatoren eine besondere Konfiguration des Suboptimierers besonders effizient ist, die den einzelnen Individuen nur die CPU-Zeit zuteilt, die sie, effizienter als ihre Konkurrenten, zu einer Verbesserung nutzen können. Diese Verteilung der Rechenzeit wird durch die sogenannte Ratenbegrenzung erreicht. Die veränderlichsten Individuen erhalten dabei die meiste Rechenzeit. Dies sind normalerweise die Individuen, die in einem der letzten genetischen Zyklen neu erzeugt wurden. Sobald ein Individuum in ein tiefes lokales Optimum, d.h. eine Sackgasse, geraten ist, erhält es weniger Rechenzeit, da seine Verbesserungsrate unter den Schwellwert sinkt. Dadurch darf man den einzelnen Individuen eine höhere maximale Laufzeit zuteilen, da sie sie nur nutzen können, wenn sie sich währenddessen verbessern. Die Kombination "ratenbegrenzt" mit Operator Gs2p2A verbraucht trotz des komplexeren Algorithmus weniger CPU-Zeit bei gesteigerter Konvergenzwahrscheinlichkeit und geringerer paralleler Laufzeit als jede andere Konfiguration. Sie ist damit die beste bekannte Konfiguration für GENETISCH. Im Praxistest in Kapitel 5 mit dem Proteinabschnitt Trigger M bestanden zwischen den automatischen Zuordnungen und der manuellen Zuweisung nur geringe Unterschiede. Die Unterschiede zwischen den Optimierungen mit unterschiedlichen Caches entstehen hauptsächlich in den Bereichen, die an einem Ende keinen verknüpften Nachbarn haben oder bei denen die manuelle Zuweisung unsicher ist, wie im Bereich 10 - 20. Durch die automatische Zuweisung konnte die manuelle Zuweisung sogar an einigen Stellen vervollständigt werden. Sie ist daher einer manuellen Zuweisung gleichwertig. Darüber hinaus entsteht bei der automatischen Zuweisung immer eine Dokumentation über die Verwendung der Peaks, so daß man ungenutzte Spinsysteme leichter finden kann. Der genetische Algorithmus kann optimal auf einem Netzwerkcluster implementiert werden, daher bietet sich ein echte parallele Implementierung an. GENETISCH braucht dabei keine besondere Hardware, wie Vektorrechner, shared memory oder besonders schnelle Netzwerkverbindungen, sondern kann auf einer Gruppe von normalen Rechnern mit einer üblichen Ethernet100 Netzwerkverbindung implementiert werden, da nur zum Austausch der Individuen, bzw. ihrer Differenz, eine Kommunikation zwischen den Rechnern notwendig ist. Dadurch kann die Kommunikation auf wenige KB alle paar Sekunden beschränkt bleiben. GENETISCH sollte außerdem leicht zu skalieren sein, da man die Anzahl der Individuen leicht an größere Probleme anpassen kann. Eine echte parallele Implementierung erlaubt daher sowohl die Rechenzeit für komplexere Problem auf wenige Minuten zu reduzieren als auch größere und mehrdeutigere Spektren zuzuweisen. Außerdem kann man die Wahl der Prozessparameter selbst auch dem selben Optimierungsprozeß unterwerfen, der bisher für die Optimierung der Zuweisung verwendet wurde. Dadurch sollte es möglich sein, die Optimierungsparameter, analog dem Profil der Abkühlung im simulated annealing, dynamisch an die Phase der Optimierung anzupassen und den Individuen immer die optimalsten Optimierungsparameter zu bieten, ohne diese vorher von Hand suchen zu müssen. Diese Veränderung erfordert aber eine große Anzahl an Individuen und damit die echte parallele Implementierung.
Der Cytochrom b6f Komplex vermittelt den Elektronentransport zwischen Photosystem II und Photosystem I und nimmt damit eine zentrale Rolle in der Photosynthese ein. Das im Rahmen dieser Arbeit erstellte Protokoll für die Präparation des Cytochrom b6f Komplexes aus Spinat ermöglichte eine reproduzierbare Reinigung von hochaktivem Enzym. Die spektroskopischen Daten stimmen mit den publizierten Daten für den Komplex überein. SDS-PAGE zeigte alle vier großen Untereinheiten sowie eine Bande der kleinen 4 kDa Untereinheiten. Die Präparation ist mit 450 ± 60 Elektronen pro Sekunde 10 - 15 mal aktiver als in bisherigen Veröffentlichungen für Präparationen aus Pflanzenblättern beschrieben und fast doppelt so aktiv wie die besten Präparationen aus Chlamydomonas reinhardtii. Die Zuverlässigkeit des Aktivitätstests konnte durch den Wechsel des Lösungsmittels für den Elektronendonor von Ethanol zu Dimethylsulfoxid erheblich verbessert werden. Die hohe Effizienz der Proteinreinigung und die hohe Aktivität des Komplexes stellen ideale Voraussetzungen für biophysikalische und strukturelle Studien dar. Versuche zur zweidimensionalen Kristallisation des Cytochrom b6f Komplexes erbrachten Kristalle mit verschiedenen Morphologien, die unterschiedlich gut geordnet waren. Eine Projektionsdichtekarte bis zu einer Auflösung von 20 Å von mehrschichtigen Kristallen zeigte strukturelle Übereinstimmungen, aber auch Unterschiede zu dem verwandten Komplex aus der einzelligen Alge C.reinhardtii. H -ATPase Plasmamembran H -ATPasen wandeln chemische Energie (in Form von ATP) in einen elektrochemischen Gradienten um, der als Energielieferant von sekundären Transportproteinen dient. Es ist gelungen, zweidimensionale Kristalle der heterolog exprimierten und mit einem His-tag ausgestatteten Plasmamembran H -ATPase AHA2 aus Arabidopsis thaliana zu erzeugen. Zwei verschiedene Methoden wurden dabei angewandt. Zum einen wurde das Protein wurde in Proteoliposomen rekonstituiert, und die so gewonnenen Vesikelkristalle resultierten in einer Projektionsdichtekarte mit einer Auflösung von 8 Å. In einer zweiten Methode wurde eine Technik, basierend auf dem Einsatz neu entwickelter, partiell fluorierter und funktionalisierter Lipide, angewandt. Einzelschichten dieser fluorierten Lipide auf der Oberfläche eines Tropfens erwiesen sich auch in Anwesenheit von Detergenz als stabil. Die funktionalisierte Ni2 -NTA-Kopfgruppe der fluorierten Lipide ermöglichte eine Bindung des Proteins über den His-tag. Nach Detergenzentzug bildeten sich in einer Lipiddoppelmembran eingebettete 2D-Kristalle mit einem Durchmesser von bis zu 10 (m, die für die Erstellung einer Projektionsdichtekarte bis 9 Å genutzt wurden. Die beiden elektronenkristallographisch erstellten Projektionskarten waren sehr ähnlich. Sie zeigten drei voneinander abgegrenzte Domänen, die in Zusammenhang mit einer vorliegenden Struktur der verwandten Ca2 -ATPase interpretiert werden konnten. Die Technik der Oberflächenkristallisation eröffnet neue Möglichkeiten für die Kristallisation von Membranproteinen. Kristallisationsexperimente können bei Proteinkonzentrationen von nur 50-150 (g/ml durchgeführt werden und sind für alle Membranproteine, die mit einem His-tag exprimiert werden können, anwendbar. Es wurde ein Homologiemodell der Plasmamembran H -ATPase aus Neurospora crassa in Anlehnung an die atomare Struktur der verwandten Ca2 -ATPase SERCA1 erstellt. Beide Enzyme liegen in unterschiedlichen Konformationen vor, die sie während des Reaktionszyklus durchlaufen. Es konnte gezeigt werden, dass es sich dabei offenbar um die Bewegung ganzer Domänen handelt. Dabei wurde klar, dass in einem solchen Fall schon 3D-Strukturen bei einer mittleren Auflösung von ca. 8 Å, wie sie mit Hilfe der Elektronenkristallographie verhältnismäßig einfach erreicht werden können, viel zum Verstehen von Reaktionszyklen beitragen können, die große Konformationsänderungen beinhalten.
Im Rahmen einer klinische Studie wurden bei Patienten mit Plattenepithelkarzinomen im Kopf/Halsbereich LymphozytenSubpopulationen phänotypisch und funktionell charakteri- siert sowie deren Aktivierungszustand anhand der Bestimmung des Interleukin2Titers und der Konzentration von löslichem Interleukin2Rezeptor a (sIL2Ra) im Plasma gemessen. Hierbei interessierte der Einfluß des Tumors bzw. der Therapieformen wie Operation, Che mo, Bestrahlungstherapie und kombinierte RadioChemotherapie auf diese immunologischen Parameter. Die Zusammensetzung der Populationen peripherer Blutlymphozyten wird durch die Größe und Malignität des Primärtumors sowie durch Lymphknotenmetastasen beeinflußt. In der An fangsphase, bei einer Tumormalignität G1, ist eine starke Reduzierung der LAKZellaktivität zu sehen, was mit suppressiven Faktoren, wie zum Beipiel ProstaglandinE2, abgesondert von Monozyten, in Verbindung gebracht werden könnte. Der Anteil CD3positiver Zellen ist im G3Stadium sehr stark erniedrigt und deutet auf eine Herunterregulierung der zu dem CD3 Komplex gehörenden eKette hin. Weiterhin war bei den HNOTumorpatienten der Anteil der CD4Lymphozyten auffällig erniedrigt, während die Zahl der doppeltpositiven CD4 CD8 Zellen sowie die HLADRWerte erhöht war. Einen Monat nach einem operativen Eingriff ließ sich eine starke Zunahme der CD25 Expression, besonders auf TLymphozyten erkennen. Die Chemotherapie mit Cisplatin, Fo linsäure, 5FU, Fortecortin eine sogenannte Polychemotherapie bewirkte eine starke Erhö hung der NKZellpopulation und eine höhere Expression des CD25Markers auf NKZellen sowie eine Zunahme der LAKZellfunktion. Die Veränderung der NKZellpopulation ist wahrscheinlich auf den Einsatz von Cisplatin und 5FU zurückzuführen. Die Bestrahlungsthe rapie bewirkte eine signifikante Abnahme der TLymphozyten, besonders der CD4T Helferzellen, bei gleichzeitiger Zunahme der CD4 CD8 positiven Zellen. BZellen sind gStrahlen sensitiv, so daß unter Bestrahlung ihr Anteil vermindert wird. Die Erhöhung der NKZellpopulation ist wahrscheinlich auf eine Radioresistenz dieser Lymphozytensubpopula tion zurückzuführen. Die RadioChemotherapie beinhaltet drei Zyklen mit einem Zytostatika gemisch: Cisplatin, 5FU, Folinsäure, Dexametason, Rescuvolin und Fortecortin und an schließender Behandlung mit gStrahlen. Die Daten der vorliegenden Studie zeigen deutlich, daß es unter dieser RadioChemotherapie zu einem signifikanten Abfall der CD3 und CD2positiven Zellen, besonders der zytotoxi schen TZellpopulation, sowie zu einer Erhöhung der CD25exprimierenden Zellen kommt. Die Beziehungen der Zellen untereinander sind unter Operation, Betrahlung und Radio Chemotherapie nicht verändert, die Chemotherapie verursacht jedoch vermutlich ein Un gleichgewicht zwischen THelferzellen und Makrophagen bezüglich der Vermehrung von NKZellen. Bei Patienten ohne Therapie kam es zu einer Abnahme der CD3positiven Zellen. Dies unterstützt die Hypothese der Herunterregulierung der eKette des CD3Komplexes unter Tumoreinwirkung. Die Ergebnisse zeigen weiter, daß die alleinige Bestimmung des Interleukin2 Proteins keine Auskunft über die Wirkung des Tumors auf die Sezernierung dieses Peptids bei einer Tumorlokalisation im Gaumen und Zungenbereich gibt. Erst im Verlauf der Erkrankung können Änderungen durch virale Infektionen und der Einfluß verschiedener Therapiemodali täten beobachtet werden. Die Konzentration von sIL2Ra verhielt sich proportional zur Tumorgröße. Dies unterstützt die Hypothese, daß dieser Rezeptor eher vom Tumor abstammt und nicht von den infiltrierten Lymphozyten. Die Konzentration von sIL2Ra im Plasma war abhängig von der Therapieart. Sie erreichte wesentlich höhere Werte bei Tumorpatienten im Vergleich zu den Probanden. Der niedrigste Spiegel bei Patienten fand sich bei Bestrahlungstherapie (Median = 840 U/ml), die höchsten Werte bei Patienten mit Chemotherapie (Median = 1400 U/ml). Infiltrierende CD3 Lymphozyten im Primärtumor, identifiziert mit einen Antikörper gegen die eKetten, sind im Vergleich zu metastasierten Lymphknoten signifikant erniedrigt. Unter suchungen der peripheren Blutlymphozyten bei Patienten mit Primärtumor ergaben eine signi fikante Erhöhung der CD3Populationen bei gleichzeitiger Erniedrigung des Anteils CD45 positiver Zellen. Es bestand für CD45positive Zellen ein signifikanter Zusammenhang zwi schen peripheren Blutlymphozyten und tumorinfiltrierenden Lymphozyten.
Thema der vorliegenden Arbeit war der Austausch der retroviralen Integrase von HSRV gegen die Integrase von HTLV1. Mit diesem Austausch sollte eine Steigerung der Integrationsrate von HSRV erreicht werden, um ihn als Vektor für die Gentherapie zu optimieren. Zunächst wurde dazu die HTLV1Integrase im Austausch gegen die HSRV Integrase in HSRV eingebracht. Dieses rekombinante Plasmid war jedoch replikationsdefizient und hatte nach der Transfektion in eukaryonte Zellen keinen Virustiter. Dies führte zu der Überlegung, auch die für die Erkennung des Virus durch die Integrase wichtigen ersten 15 Nukleotide der LTREnden von HSRV an die Sequenz von HTLV1 anzugleichen. Da auch der daraus resultierende Klon keine Infektiösität aufwies, konnte die Replikationsdefizienz eventuell weitreichendere Gründe haben als eine reine Integrationsdefizienz. Ein cisElement am CTerminus der HSRVIntegrase welches zur Stabilisierung und Verpackung der RNA in Partikel wichtige Funktionen hat, wurde daher in dem Klon mit der HTLV1Integrase regeneriert. Dazu wurde eine chimäre Integrase bestehend aus dem Nterminalen und dem Mittelteil der HTLV1Integrase mit dem Cterminalen Teil der HSRV Integrase fusioniert und in das HSRV Provirus mit und ohne die HTLV1LTREnden eingebracht. Da diese Klone ebenfalls nichtinfektiös waren, sollte Expressionsanalyse der rekombinanten Plasmide zur Klärung der Ursache ihrer Replikationsdefizienz beitragen. Als Kontrollen dienten dabei ein HSRVKlon ohne Integrase, ein HSRVKlon mit wiedereingeführter HSRVIntegrase und ein Konstrukt mit den HTLV1LTREnden aber mit der HSRVIntegrase. Die Untersuchung der chimären Klone ergab, daß virale genomische RNA zumindest kurze Zeit nach der Transfektion in den Zellen vorhanden war, aber eventuell nicht in Viruspartikel verpackt wurde, da vor der HTLV1Integrase ein weiteres ca. 114 Nt langes cisElement fehlte. Dieses fehlende cisElement war möglicherweise auch die Ursache für eine gestörte GagProzessierung der Klone in 293TZellen. Da Gag Prozessierung für den Zusammenbau intakter Viruspartikel essentiell ist, konnte hier ein Grund für die Replikationsdefizienz der chimären Klone liegen. Alle weiteren viralen Proteine wurden von den chimären Klonen exprimiert und normal prozessiert. Die virale Protease war also enzymatisch aktiv. Weiterhin wurde die korrekte Aktivität der reversen Transkriptase nachgewiesen. Durch eine Kotransfektion der chimären Plasmide mit dem HTLV1GagProtein sollte das im Preintegrationskompex vorkommende GagProtein für die øTLV1 Integrase ersetzt werden. Auch dieser Versuchsansatz erwies sich als ungeeignet, die Integration bzw. Replikation der chimären Klone zu verbessern. Durch die Einklonierung eines Resistenzgens in die viralen Klone sollten Zellen mit integrierter viraler DNA gezielt selektioniert werden. Das Resistenzgen wurde in drei der viralen Konstrukte eingebracht, in wtpHSRV13, in den Klon mit den HTLV1 LTREnden und der HTLV1Integrase sowie in das virale Plasmid mit den HTLV1 LTREnden und der chimären Integrase. Nach der Einzelzellselektion der mit wt Zeocin transfizierten BHKZellen hatte von sechs Klonen nur einer einen geringen Virustiter, dieser exprimierte als einziger virale Gene. Durch Southernblotanalyse dieser Einzelzellklone konnte die Anzahl der Integrate auf fünf bis acht pro Einzelzellklon ermittelt werden. Die Einzelzellklone aus der Transfektion mit den rekombinanten Klonen besaßen keine Infektiösität. Die Expression der viralen Gene war bei den Einzelzellklonen aus der Transfektion des Klons mit den HTLV1LTR Enden und der HTLV1Integrase nachweisbar.
Erstmals konnte eine zCarotinDesaturase einer höheren Pflanze nach heterologer Expression in E. coli in nativer Form gereinigt und enzymatisch charakterisiert werden. Dazu wurde die cDNA der CapsicumZDS in einen Expressionsvektor kloniert, der die ZDS als rekombinantes Polypeptid mit 6 Nterminalen Histidinen exprimierte. Dadurch konnte das Enzym in nur zwei Schritten über eine Kombination von Ammoniumsulfatfällung und MetallionenAffinitätschromatographie selektiv aus E. coli separiert werden. Die ZDS wurde ohne eine mutmaßliche Transitsequenz als ein Polypeptid von 59 kDa exprimiert. Das pH Optimum der ZDSAktivtität liegt bei 7,2 in der Nähe der rechnerisch ermittelten pIWertes von 7,4. Die ZDS führt zwei Desaturierungsschritte ausgehend von zCarotin zu Lycopin als ein monomeres Protein durch. Unter Verwendung des TwoHybridSystems, einer Gelelektrophorese unter nativen Bedingungen und einer Gelfiltration der nativen ZDS, konnte gezeigt werden, daß die ZDS als Monomer und als Dimer vorliegen kann. Die Dimerisierung der ZDS ist jedoch für deren enzymatischer Aktivität und für die Durchführung beider Desaturierungsschritte nicht notwendig. Für die Substratcarotinoide zCarotin und Neurosporin, wurden die Km Werte von 8,4 µM und 9,0 µM bestimmt. Die CapsicumZDS zeigt von ihrer Aminosäuresequenz her eine große Ähnlichkeit zu den cyanobakteriellen zCarotinDesaturasen und eine geringere Ähnlichkeit zu den pflanzlichen Phytoendesaturasen. Eine diskutierte phylogenetische Verwandtschaft der zCarotin und Phytoendesaturase aus höheren Pflanzen und Cyanobakterien wird durch die Verwendung des gleichen Kofaktors Plastochinon und durch die gemeinsame Hemmbarkeit mit den zCarotinDesaturaseHemmstoffen J852 und LS80707 unterstützt. Eine Kofaktoruntersuchung ergab, daß Plastochinon sowohl der Kofaktor der ZDS aus Capsicum, als auch der Phytoendesaturasen aus Gentiana lutea (gelber Entian), aus dem Cyanobakterium Synechococcus sp. PCC 7942, sowie der z CarotinDesaturase aus Synechocystis sp. PCC 6803 ist. Der Km Wert von Decyl Plastochinon wurde für die CapsicumZDS zu 0,4 µM bestimmt. Der Kofaktor der z CarotinDesaturase Plastochinon, sowie die Entdeckung einer plastidären terminalen Oxidase (Carol et al., 1999) ermöglicht die Entwicklung eines Modells der Übertragung der bei der Desaturierung von zCarotin gewonnenen Elektronen über Plastochinon auf Sauerstoff, wie es bereits für die pflanzliche Phytoendesaturase postuliert wurde (Carol
Das Chromanol 293B stellt die Leitsubstanz einer möglicherweise neuen Kategorie von KlasseIIIAntiarrhythmika dar. Im Herzen inhibiert es potent und spezifisch den Kaliumkanal I Ks , der an der Repolarisation der Membran bei Ablauf eines Aktionspotentials beteiligt ist. Er ist aus der AlphaUntereinheit KCNQ1 und der BetaUntereinheit MinK aufgebaut. Es bestehen deutliche biophysikalische Unterschiede zwischen den Strömen homomerer KCNQ1 und heteromerer I Ks (KCNQ1/MinK)Kanäle. Die Koexpression mit MinK verändert aber auch die Pharmakologie von KCNQ1. In der vorliegenden Arbeit trugen zwei unabhängige Lösungsansätze dazu bei, die Interaktion der beiden Untereinheiten molekular besser zu verstehen. Dabei wurden als Methoden die zielgerichtete Mutagenese, die Expression der WildTypProteine und der Mutanten in XenopusOozyten und deren elektrophysiologische Analyse angewendet. Im ersten Teil wurde die Bindungsstelle des I Ks Inhibitors 293B molekular identifiziert, während im zweiten Teil der Mechanismus der Inaktivierung der AlphaUntereinheit KCNQ1 untersucht wurde. In den beiden Ansätzen wurde ausgenutzt, dass die zu KCNQ1 eng verwandten KCNQ2 Kanäle weder sensitiv gegenüber 293B waren noch eine Inaktivierung zeigten. Die Expression von MinKMutanten, die alle veränderbaren Regionen des Proteins abdeckten, ergab, dass keine dieser Mutationen die Affinität des I Ks Kanals gegenüber 293B wesentlich beeinflusste. Das war erstaunlich, da homomere KCNQ1Kanäle durch das Chromanol 293B um den Faktor 45 schwächer zu blockieren sind als I Ks Kanäle und da zusätzlich gezeigt wurde, dass sich auch das Ausmaß der Stereoselektivität von 293B und anderer verwandter I Ks Inhibitoren in Bezug auf KCNQ1 und I Ks stark unterscheidet. Es konnte aus den Ergebnissen indirekt vermutet werden, dass MinK offensichtlich auf allosterische Art die Affinität des Inhibitors erhöht. Um einen Hinweis auf die I Ks Spezifität des Blocks durch 293B auch innerhalb der KCNQ Familie zu erhalten, wurde zunächst die Inhibition der verwandten KCNQ2 und KCNQ3Kanäle getestet, die sich als kaum signifikant erwies. In diesem Zusammenhang wurde auch ein neues Mitglied der KCNQFamilie kloniert, KCNQ5, das schwach sensitiv gegen 293B war, nicht im Herzen vorkommt aber wahrscheinlich zusammen mit KCNQ2/KCNQ3 zum neurona len MStrom beiträgt. Dies ergab Hinweise darauf, dass von anderen KCNQKanälen differente Proteinsequenzen die hohe Sensitivität des KCNQ1Kanals gegenüber 293B determinieren. Die Bindungsstelle an der AlphaUntereinheit KCNQ1 wurde anschließend durch KCNQ1/KCNQ2 Chimären auf die innere Porenregion eingegrenzt. Durch detaillierte Untersuchung mithilfe von Punktmutationen identifizierten wir Aminosäuren in der Transmembranregion S6 (I337) und der Porenschleife H5(V307), deren Austausch gegen die entsprechenden KCNQ2 Aminosäuren die Affinität von 293B zu KCNQ1 sowie zu I Ks Kanälen um den Faktor 420 herabsetzten. Durch Analogiemodellierung mithilfe der bekannten Kristallstruktur des KcsA Kaliumkanals konnte ein 3DModell der KCNQ1Porenregion erstellt werden, aus dem sich ergab, dass die Seitenketten der Aminosäure Isoleucin 337 in das Lumen der inneren Pore gerichtet sind. Aus dem Modell konnte weiterhin das Phenylalanin 340 als in das Lumen gerichtet identifiziert werden. Dieses Ergebnis konnte durch weitere MutageneseExperimente evaluiert werden, aus denen hervorging, dass Veränderungen an dieser und benachbarten Positionen die Sensitivität sowohl von KCNQ1 als auch von I Ks Kanälen gegenüber 293B um den Faktor 10100 verminderten. Das 293BMolekül konnte so in das Modell integriert werden, dass sich attraktive Interaktionen mit diesen beiden Resten (F340 und I337) ausbilden. Die innere Porenregion stellt auch für viele Inhibitoren anderer Kaliumkanäle eine wichtige Determinante für hohe Affinität dar. Die in H5 gelegene Aminosäure V307 schien nach dem Modell nicht an einer 293BInteraktion direkt beteiligt zu sein. Es fiel aber bei der Charakterisierung auf, dass das veränderte Protein nicht mehr inaktivierte. Daher sollte ein Zusammenhang zwischen dem 293B Wirkmechanismus und der intrinsischen KCNQ1Inaktivierung untersucht werden. Es wurden wiederum durch einen Chimärenansatz zunächst die Regionen identifiziert, die für eine KCNQ1Inaktivierung notwendig sind. Anschließend wurde nach punktuellem Austausch von KCNQ1Aminosäuren gegen analoge KCNQ2Reste für eine weitere Position im Transmembransegment S5 (G272) ein Verlust der Inaktivierung festgestellt. Die zweite nicht inaktivierende Mutante G272C war WildTypgleich 293Bempfindlich, woraus sich vermuten ließ, dass die schwache Empfindlichkeit gegenüber 293B und der Verlust der Inaktivierung der KCNQ1Mutante V307L nicht in Zusammenhang stehen. Die Ergebnisse machten aber molekular den Unterschied der KCNQ1Inaktivierung zu den beiden klassischen Inaktivierungsarten von Kaliumkanälen, N und CTyp, deutlich. Zuvor war dies nur anhand unterschiedlicher biophysikalischer Eigenschaften gezeigt worden. Das zuvor erstellte KCNQ1 Modell unterstützte die Resultate, da sich in ihm die beiden Regionen S5 und die Porenhelix H5 etwa auf Höhe der beiden Aminosäuren V307 und G272 kreuzen, was eine Interaktion dieser Regionen suggeriert. Zudem ist bei der ein LongQTSyndrom verursachenden KCNQ1Mutation L273F die mutierte Stelle unmittelbar neben dem Valinrest 307 lokalisiert. Diese besonders stark inaktivierende LQT1Mutante erhielt auch unter der Einwirkung von MinK eine nachweisbare Inaktivierung aufrecht. Da die KCNQ1Inaktivierung durch MinKKoexpression normalerweise aufgehoben wird, spricht dies für eine pathophysiologische Relevanz der KCNQ1Inaktivierung.
Die Hämatopoese stellt den blutbildenden Prozeß dar, der den Menschen ein Leben lang mit Blutzellen versorgt und deren Ausgangspunkt eine kleine Zahl hämatopoetischer Stammzellen ist. Diese Stammzellen besitzen einerseits die Fähigkeit zur Selbsterneuerung und sind andererseits in der Lage, durch Proliferation und terminale Differenzierung Zellen verschiedener Linien hervorzubringen. Das biologische Hauptmerkmal der Stammzelle ist die Fähigkeit die Hämatopoese zu rekonstituieren, was klinisch bei der Stammzelltransplantation genutzt wird. Überwiegend werden dabei Knochenmark und peripheres Blut als Quelle für Stammzellen genutzt, die abhängig von der Zahl der transplantierten Zellen zur völligen Rekonstitution der Blutbildung führen. Für Patienten ohne passende Spender wurde das Nabelschnurblut als Alternative in Betracht gezogen. Trotz verschiedener Vorteile der Stammzellen aus Nabelschnurblut besteht der Hauptnachteil in der sehr limitierten Zahl der Zellen mit dem erhöhten Risiko eines Transplantatversagens. Aus diesem Grund wird die ex vivo Vermehrung dieser Stammzellen derzeit zunehmend untersucht. Erforderlich sind Bedingungen zur ausreichenden Vermehrung der Zellen unter Erhalt der Stammzelleigen schaften, die die klinische Anwendung möglich machen. Diese Bedingungen waren bisher nicht erfüllt. Hauptziel dieser Arbeit war es demnach Kulturbedingungen für die Expansion von Stammzellen aus Nabelschnurblut zu etablieren, die den klinischen Anforderungen einer Transplantation genügen. Dafür wurden sowohl die determinierten Vorläuferzellen untersucht, als auch die Fähigkeit der Stammzelle in vitro Langzeithämatopoese aufrecht zu erhalten und zur Repopulierung der NOD/SCIDMaus. Die Repopulierung ist ein spezifischer Prozeß (Homing), bei dem die Migration der Zellen aus der Blutbahn durch die Endothelzellschicht der Gefäße in die spezialisierten Nischen des Knochenmarks erfolgt. Da für die Amplifikation äußere Stimuli erforderlich sind, welche die biologischen Eigenschaften der Zellen modulieren, wurden die Eigenschaften der expandierten Zellen in verschiedenen in vitro Assays wie CFU und LTCIC untersucht, die derzeit als die besten Verfahren gelten, die hämatopoetische Stammzelle zu detektieren. Zur Untersuchung der Repopulierungsfähigkeit wurde das NOD/SCIDMausmodell etabliert, in dem der Aufbau einer humanen Hämatopoese im murinen Knochenmark gemessen wird, sowie ein neues in vitro Modell entwickelt, das Stromazellsphäroid, mit dessen Hilfe die Migrationsfähigkeit untersucht wurde. Mit der Kombination der auf primitive Stammzellen wirkenden Zytokine SCF, FL, TPO und IL3 gelang eine gute und ausreichende Vermehrung der ontogenetisch unreifen und der determinierten Progenitorzellen nach Kultivierung der Zellen über 7 Tage. Das beim Einsatz in der ex vivo Expansion umstrittene Zytokin IL3 führte hierbei nicht zum befürchteten Verlust der Repopulierungsfähigkeit der expandierten Zellen. Es sorgte vielmehr durch eine starke Vermehrung der Zellen für ein Engraftment der NOD/SCIDMaus, das dem durch frische unmanipulierte Nabelschnurblutzellen vergleichbar war. Von den getesteten Kultursystemen erwies sich die statische Kultivierung im Teflonbeutel als geeignet zur Vermehrung der primitiven Progenitoren, ohne die Repopulierungsfähigkeit der expandierten Zellen zu vermindern. Durch die Wahl eines serumfreien, klinisch anwendbaren Mediums gelang somit die Etablierung eines Kultursystems zur optimierten ex vivo Expansion früher Progenitor und Stammzellen aus Nabelschnurblut ohne Verlust der Repopulierungsfähigkeit für die klinische Anwendung. Das Homing in das Knochenmark ist ein selektiver aus mehreren Einzelschritten bestehender Prozeß unter Interaktion der Zellen mit Endothelzellen und dem Knochenmarkstroma, der durch eine Vielzahl verschiedener zusammenwirkender Adhäsionsmoleküle reguliert wird. Weitere Faktoren, die das Homing beeinflussen sind Zytokine oder Chemokine. Diese Stimuli wirken über verschiedene intrazelluläre Signalwege, von denen die RhoProteinfamilie der kleinen GTPasen eine bestimmende Rolle in der Migration zugedacht wird, sowie andere Bestandteile der intrazellulären Signaltransduktion, wie Kinasen und GProteine. Die Migration in das Sphäroidmodell ist ebenso ein selektiver und gerichteter Prozeß, bei dem neben den primären CD34 Zellen aus Nabelschnurblut auch andere humane hämatopoetische Zelllinien eine gerichtete Einwanderung zeigen. Durch Zugabe eines Inhibitors von G Proteinen, Pertussis Toxin (PT), und Hemmung der kleinen GTPasen durch spezifische Toxine aus Clostridien konnte eine reproduzierbare und deutliche Verringerung der Migration in das Sphäroid erreicht werden. Die Migration hämatopoetischer Zellen in das Sphäroid erfolgt also unter Beteiligung der kleinen GTPasen, sowie PT sensitiver GProteine. Blockierungsversuche zeigten unerwarteterweise keine funktionelle Beteiligung des ChemokinRezeptorpaares SDF1/CXCR4 und des Adhäsionsmoleküls VLA4 bei der Migra- tion in das Sphäroid. Welche weiteren Mechanismen für diese Migration bedingend sind erfordert weitergehende Untersuchungen. Durch die Kultivierung von hämatopoetischen Stammzellen aus Nabelschnurblut mit den Zytokinen SCF, FL, TPO und IL3 gelang eine ausreichende Vermehrung von frühen und determinierten Progenitorzellen unter Erhalt ihrer Stammzellfähigkeiten, so daß ein klinischer Einsatz möglich wird. Dabei ergab sich durch Untersuchung der Migrationsfähigkeit im Sphäroidmodell, daß beim Homing der Zellen die Aktivierung der kleinen GTPasen und eines Pertussis Toxinsensitiven GProteins beteiligt sind.
Schon kurz nach Änderung der Verordnung über das Leichenwesen und der Einführung des neuen Leichenschauscheines in Hessen am 15.4.1996 traten Schwierigkeiten auf, die zunächst auf die Umstellung zurückgeführt wurden. Nachdem auch einige Monate später die Klagen von vielfältiger Seite (Ärzte, Sanitäter, Bestatter, Kriminalpolizei) nicht nachließen, sollte untersucht werden, ob, warum und in welchem Umfang die Handhabung des neuen Leichenschauscheines solche Schwierigkeiten bereitet. Die Untersuchung basierte zum einen auf der Auswertung der Leichenschauscheinen der Verstorbenen, die im Zentrum der Rechtsmedizin in der Zeit von 1.1.31.3.1997 zur Verfügung standen (264 vertrauliche, 161 nichtvertrauliche Teile der Leichenschauscheine) zum anderen auf Interviews mit dem Standesamt, Gesundheitsamt, Kriminalpolizei, Verwaltung der Universitätsklinik und einem Bestatter. Als Gesamtergebnis kristallisierte sich heraus, dass der Leichenschauschein formale Mängel aufweist. Insbesondere die Angabe des Totauffindens ist mit dem Personenstandsgesetz nicht vereinbar, nach dem grundsätzlich die Todeszeit, bzw. der Todeszeitraum angegeben werden muss. Zum anderen war das Fehlen der Rubrik ''Natürlicher Tod'' einer der wesentlichen Mängel, weil häufig von Ärzten auch bei nichtnatürlichem Tod vergessen wurde, die entsprechende Rubrik zu signieren, so dass ohne Vorliegen des vertraulichen Teils der Standesbeamte von einem natürlichen Tod ausgehen musste. In einem Fall ist erst bei der zweiten Leichenschau im Krematorium der wirkliche Sachverhalt aufgeklärt worden, mit entsprechender Störung des Beerdigungsablaufes. Weiterhin ist der Leichenschauschein sehr unübersichtlich angelegt, indem gleiche Angaben sich an verschiedenen Stellen befinden, was dazu führt, dass sie häufig nicht, unvollständig oder falsch ausgefüllt werden. Auch die praktische Handhabung mit verschiedenen Briefumschlägen ohne eindeutige Kennzeichnung führte dazu, dass z.B. der nichtvertrauliche Teil mit in den für den vertraulichen Teil vorgesehenen Umschlag kurvertiert wurde und damit wiederum ein weiteres Herantreten an die Angehörigen notwendig war. Einer der größten Mängel ist darin zu sehen, dass darauf verzichtet wurde eine ''Vorläufige Todesbescheinigung'', wie es in anderen Bundesländern üblich ist, einzuführen. Das bedeutet, dass der Notarzt nach dem Einstellen der Wiederbelebungsmaßnahmen solange warten muss, bis sichere Todeszeichen aufgetreten sind. Dieses ist nicht nur unökonomisch, sondern häufig wegen eines neuen Einsatzes auch nicht durchführbar. Als Mangel ist auch das Fehlen der Warnhinweise (''Schrittmacher'') im vertraulichen Teil zu werten. Dadurch liegen wichtige Informationen dem die zweite Leichenschau bei Feuerbestattung durchführenden Arzt nicht vor. Bei dieser Sachlage scheint es unabdingbar eine Änderung des Leichenschauscheines und des Procedere herbeizuführen. Vorstellbar wäre ein einheitliches Formular der vertreibenden Verlage mit Schwärzungen an den Stellen, die von datenschutzrechtlichem Belang sind. Ferner sollten für sämtliche Formularblätter entsprechend gekennzeichnete Briefumschläge zur Verfügung stehen, so dass grundsätzlich bei jeder Leichenöffnung alle Formulare in einen gesonderten Umschlag kommen. Außerdem sollte noch einmal von gesetzgeberischer Seite überdacht werden, ob eine ''Vorläufige Todesbescheinigung'', wie sie sich in anderen Bundesländern bewährt hat, einzuführen. Letztlich wird auch darüber nachzudenken sein, wie die Qualität der ärztlichen Leichenschau zu verbessern ist. In erster Linie wird es eine Frage bei der Ausbildung der Medizinstudenten sein, die aber zu dieser Zeit die ''Ernsthaftigkeit'' dieser Tätigkeit noch nicht richtig einzuschätzen wissen. Außerdem wird es durch die Reduzierung der Leichenöffnungen und z.T. sehr emotional geführte Rechtsdiskussionen immer schwieriger den Arzt ''in praxi'' auszubilden. Zweifellos ist die Bereitschaft zur Fortbildung bei Ärzten, die die Leichenschau durchführen, später größer, aber hier ist kaum noch eine institutionalisierte, zeitaufwendige Fortbildung möglich. Letztlich muß auch darüber nachgedacht werden, inwieweit nicht vermeidbare Mängel bei der Leichenschau und bei dem Ausfüllen des Leichenschauscheines durch Verhängung von Bußgeldern sanktioniert werden sollte. Schließlich entstehen nicht nur anderen Institutionen (Standes, Gesundheitsamt, statistische Behörden) und Angehörigen durch Mängel bei der Leichenschau erhebliche Beschwernisse und Unkosten. Es kann auch einem Täter bei Verkennung einer Tötung Anlaß zu weiteren entsprechenden Taten geben.
TEIL I Die Bauentwicklung des Zahnärztlichen Universitäts-Institutes in Frankfurt am Main von 1960 bis zur Fertigstellung des Erweiterungsbaus im Jahr 1973 ( bearbeitet von: Thomas Kick ) Die vorliegende Arbeit reiht sich ein in die Gesamtdarstellung der Geschichte des Zahnärztlichen Universitäts- Institutes in Frankfurt am Main. In der Dissertation von Bald-Duch wird ein geschichtlicher Überblick von der Gründung der Heilanstalt Carolinum im Jahre 1890 bis zum Tode von Otto Loos am 1. April 1936 gegeben, die Arbeit von Roeloffs-Nuthmann umfasst die Darstellung des historischen Werdegangs des Zahnärztlichen Institutes in Frankfurt am Main während der nationalsozialistischen Herrschaft und der Nachkriegsjahre bis hin zum Zentrum für Zahn-, Mund- und Kieferheilkunde Carolinum. Diese Dissertation vervollständigt die Dokumentation der Entwicklung des Zahnärztlichen Universitäts-Institutes Carolinum für die Jahre 1960 bis 1986, wobei der Schwerpunkt der Darstellung auf die Bauentwicklung und dabei insbesondere auf die Planung und Errichtung des Neubaus des Zentrums der Zahn-, Mund- und Kiefer- heilkunde Carolinum gelegt wurde. Zu Beginn der sechziger Jahre wurden Verhandlungen zur Übernahme der Städtischen Universitätskliniken und der angeschlossenen Institute in Frankfurt am Main durch das Land Hessen aufgenommen. Davon betroffen war auch das Zahnärztliche Universitäts-Institut Carolinum, das in die Verwaltung der Universität übergehen sollte. Professor Flesch-Thebesius als Vorsitzender des Vorstandes der Freiherr Carl von Rothschild
Bislang ist unklar, warum Afrikanische Grüne Meerkatzen (AGM, Chlorocebus), die in ihrem natürlichen Habitat bis zu 50% mit SIVagm infiziert sind, zeitlebens keine Symptome einer Immundefizienz zeigen, d.h. eine Resistenz gegen AIDSähnliche Symptome besitzen. Im Rahmen dieser Doktorarbeit wurde in einer Studie die Immunantwort SIVagminfizierter AGM nach Immunstimulation mittels Tetanustoxoid untersucht. Ziel dieses Projekts war die Klärung der Frage, ob die Virusreplikation durch Stimulation des Immunsystem und damit einhergehend einer Vermehrung der Zielzellen von SIV, eine Änderung erfährt oder ob diese durch immunologische Kontrollmechanismen konstant bleibt. Untersucht wurde dazu eine Gruppe von vier natürlich SIVagminfizierten AGM, die zwei Jahre nach Basisimmunisierung mit Tetanustoxoid im Abstand von vier Wochen i.m. immunisiert wurden. Der Zeitpunkt der SIVInfektion lag vor der Basisimmunisierung. Wöchentlich fanden Blutentnahmen statt und es wurden immunologische und virologische Parameter bestimmt. Die gemessenen Lymphozytenwerte, die FACSDaten und die Lymphozytenproliferationskapazität ließen nach Tetanustoxoidgabe keine Änderung erkennen. Die Daten gaben keinen Hinweis darauf, daß die exogene Antigenspezifische Stimulation zu einer Proliferation der Gedächtniszellen geführt hätte. Es ist davon auszugehen, daß es während der Basisimmunisierung zu einer Proliferation von CD4 TZellen kam und diese nachfolgend infiziert bzw. eliminiert wurden. Somit waren keine Tetanusspezifischen Gedächtniszellen zum Zeitpunkt der Immunstimulation mehr existent. Um dieses Problem auszuschließen, müssten SIVagmnegative AGM eine Basisimmunisierung erhalten und erst anschließend dürfte eine Infektion mit SIVagm stattfinden. Aufgrund des Versuchsaufbaus kann keine Aussage darüber getroffen werden, ob eine Immunstimulation auf die Höhe der Virusbelastung Einfluß nimmt. Für das apathogene SIV/Primatensystem konnte im Vergleich mit AIDSsuszeptiblen SIV/PrimatenSystemen zwar keine deutlich stärkere humorale oder zelluläre Immunantwort gefunden werden, jedoch gibt es signifikante Unterschiede. AGM zeigen nur eine geringe Virusbelastung in den Lymphknoten und es konnte bislang in keinem natürlichen Wirt von SIV sog. ''VirusTrapping", daß heißt die Anheftung von Viruspartikeln auf der Oberfläche von Follikulär Dendritischen Zellen nachgewiesen werden. Es wurde auch nie, trotz chronischer Infektion, eine Strukturänderung des lymphatischen Gewebes gefunden. Ein weiterer kurioser Unterschied ist das Fehlen einer Immunantwort gegen natives GagProtein, obwohl es zu einer starken Immunantwort gegen das EnvProtein kommt. In der zweiten durchgeführten Studie im Rahmen dieser Doktorarbeit sollte, unter der Annahme, daß die obengenannten Phänomene miteinander assoziiert sind, folgende Hypothese untersucht werden: Aufgrund des Fehlens der GagAntikörper kommt es bei AGM nicht wie bei einer HIVInfektion zur Bildung von Immunkomplexen. Dementsprechend können keine Viruspartikel via Fc Rezeptor auf FDC gebunden werden. Nachfolgend findet deshalb auch keine verstärkte Apoptose der FDC bzw. Lyse der germinalen Zentren statt, und die Lymphknotenarchitektur bzw.struktur bleibt intakt. Zunächst sollte deshalb im folgenden Projekt eine humorale Immunantwort gegen das Kernprotein von SIV induziert werden. Nach mehrfacher Immunisierung mit affinitätschromatographisch gereinigtem GagProtein entwickelten alle untersuchten Tiere (Gruppe A) hohe AntikörperTiter. Nachfolgend wurden die Gagimmunisierte Gruppe und eine Kontrollgruppe (Gruppe B) experimentell infiziert. Die Negativkontrollgruppe (Gruppe C) blieb unbehandelt. In regelmäßigen Abständen erfolgten Blutbzw. Lymphknotenentnahmen. Ein wichtiger Teil dieses Projekts war die Etablierung einer quantitativen RTPCR zum Nachweis von SIVagmRNA. Bislang war es nicht möglich, die virale RNA zu quantifizieren und bei der chronischen, benignen SIVagmInfektion von AGM lag lange der Verdacht nahe, daß es aufgrund einer niedrigen Viruslast nicht zum Krankheitsausbruch kommt. Es konnte eine quantitative TaqmanRTPCR etabliert werden, mit der der spezifische Nachweis mit einer Sensitivität von 100 RNAKopien pro ml möglich ist. Die Tiere zeigten Plasmaund Proviruslasten in einer Höhe, die durchaus vergleichbar ist mit der Viruslast HIVinfizierter Menschen bzw. SIVmacinfizierter Rhesusaffen. Es kann somit ausgeschlossen werden, daß eine niedrige Viruslast der Grund für die Apathogenität ist. Die Viruslast in den Lymphknoten wurde immunhistochemisch untersucht. Die zuvor Gag immunisierten Tiere zeigten mehr infizierte Zellen, insbesondere im Bereich der Follikel, als Gruppe B. Diese Daten stimmten mit den Ergebnissen der InsituHybridisierung überein. Auch hier konnte mehr virale RNA in den Follikeln der GruppeA detektiert werden. Zwei der Tiere zeigten Anzeichen von VirusTrapping in den Keimzentren der Lymphknoten. Die histologischen Daten könnten darauf schließen lassen, daß die Existenz von GagAntikörpern auf die Viruslast in lymphatischem Gewebe Einfluß nimmt.
Im Rahmen dieser Arbeit wurden verschiedene Fluorbenzol- und Fluorbenzimidazol- Nukleoside synthetisiert. Mit 1´-Desoxy-1´-(4-fluor-1-N-benzimidazolyl)-beta-D-ribofuranose 32 handelt es sich um einen zum natürlichen Inosin isosteren Baustein. Die Carbonylsauerstoffe wurden durch Fluoratome und die Stickstoffatome des Sechsringes durch sp²-hybridisierte Kohlenstoffatome ersetzt. Mit den Bausteinen 1´-Desoxy-1´-(4,6-difluor-1- N-benzimidazolyl)-beta-D-ribofuranose 33 und 1´-Desoxy-1´-benzimidazolyl-beta-D-ribofuranose 37 wurden zwei weitere Benzimidazol-Nukleoside mit zwei Fluoratomen bzw. ohne Fluor synthetisiert. Als isosteren Baustein für das natürliche Uridin wurde 1´-Desoxy-1´-(2,4- difluorphenyl)-beta-D-ribofuranose 30 synthetisiert. Auch hier wurden die Carbonylsauerstoffe durch Fluoratome und die Stickstoffatome durch sp²-hybridisierte Kohlenstoffatome ersetzt. Um den Einfluß der Fluorsubstitution untersuchen zu können, wurden noch 1´-Desoxy-1´- (2,4,6-trifluorphenyl)-beta-D-ribofuranose 86, 1´-Desoxy-1´-(4-fluorphenyl)-beta-D-ribofuranose 34, 1´-Desoxy-1´-(3-fluorphenyl)-beta-D-ribofuranose 35, 1´-Desoxy-1´-(2-fluorphenyl)-beta-D- ribofuranose 36 und 1´-Desoxy-1´-phenyl-beta-D-ribofuranose 38 synthetisiert. Die einfach fluorierten Bausteine wurden so ausgewählt, daß das Fluoratom an jeder möglichen Position des Aromaten einmal vorkommt. Schließlich wurden noch Inosin 31 und 1-Desoxy-D- ribofuranose 39 als abasischer Baustein synthetisiert. Die Fluorbenzimidazole wurden ausgehend von den entsprechenden Fluoracetaniliden dargestellt. Die Glykosylierung erfolgte nach der Silyl-Hilbert-Johnson Reaktion mit anschließender Deacetylierung der Hydroxylfunktionen mit ammoniakalischem Methanol. Für die C-Glykosylierung der C-Nukleoside wurde 2,3,5-Tri-O-benzyl-ribono-gamma-lacton 85 benötigt. Dies wurde über vier Stufen aus D-Ribose dargestellt. Nach der C-Glykosylierung mit dem entsprechenden Fluorbrombenzol wurde den Nukleosiden die entstandene C1´- Hydroxylfunktion entfernt. Anschließend wurden die C-Nukleoside mit Palladiumhydroxid auf Kohle und Cyclohexen in einer Transfer-Katalyse entschützt. Die Ausnahme bildete 1´- Desoxy-1´-phenyl-beta-D-ribofuranose 38, das mit Bortribromid entschützt wurde. Der abasische Baustein 39 wurde aus 2,3,5-Tri-O-benzyl-ribofuranose 84 durch Dehydroxylierung und anschließender Entschützung gewonnen. Von allen Fluorbenzol-Nukleosiden gelang es Kristalle aus Wasser oder Methanol zu erhalten und röntgenkristallographisch zu untersuchen. Die Kristallpackungen zeigten eine sehr interessante Anordnung der Moleküle. Alle Fluorbenzol-Nukleoside mit Ausnahme von 1´- Desoxy-1´-(3-fluorphenyl)-beta-D-ribofuranose 35 zeigten nicht die für aromatische Systeme normale Fischgräten-Struktur, sondern eine Anordnung, in der sich die Moleküle gegenüberliegen. Die Kristallpackung besteht abwechselnd aus hydrophilen und lipophilen Schichten. Die hydrophilen Schichten bestehen aus den Zuckeruntereinheiten und die lipophilen aus den Fluoraromaten. Die Zucker sind durch Wasserstoffbrücken miteinander verbunden. Für die Orientierung der Moleküle zueinander sind aber die Fluoratome verantwortlich. In der Kristallpackung von 1´-Desoxy-1´-(4-fluorphenyl)-beta-D-ribofuranose 34 kann ein Fluor-Wasserstoff-Abstand von nur 230 pm detektiert werden. Dies ist deutlich kürzer als die Summe der van-der-Waals Radien von Fluor und Wasserstoff von 255 pm. Der Abstand wird zwischen dem Fluor des einen Nukleosids und einem Wasserstoff eines gegenüberliegenden Nukleosids gemessen. Der Abstand von 230 pm ist einer der kürzesten jemals in Kristallen gemessenen F-H Abstände des Typs C sp² -F...H-C sp² . Bedingt durch diesen kurzen Abstand kann von einer F...H Wasserstoffbrücke gesprochen werden. Auch in den Kristallstrukturen von 1´-Desoxy-1´-(2,4-difluorphenyl)-beta-D-ribofuranose 30 und 1´-Desoxy- 1´-(2-fluorphenyl)-beta-D-ribofuranose 36 werden Fluor-Wasserstoff-Abstände von 255 pm und damit genau der Summe der van-der-Waals Radien gefunden. Nur die Kristallstruktur von 1´- Desoxy-1´-(3-fluorphenyl)-beta-D-ribofuranose 35 zeigt keine F...H Wasserstoffbrücken. Diese Struktur weist auch als einzige eine Fischgräten-Struktur auf. Die Nukleoside wurden auf ihre Lipophilie hin untersucht. Zu diesem Zweck wurden Octanol-Wasser Verteilungskoeffizienten und HPLC-Retentionszeiten der einzelnen Nukleoside gemessen. Die fluorierten Nukleoside zeigten im Gegensatz zu den nichtfluorierten Nukleosiden eine deutlich größere Lipophilie. Die entschützten Nukleoside wurden nach Standardmethoden für RNA Bausteine in ihre Phosphoramidite überführt. Dabei stellte sich heraus, daß durch eine starke Wanderungstendenz der TBDMS-Gruppe in Richtung 3´-Hydroxylfunktion bei allen fluormodifizierten Nukleosiden das gewünschte 2´-geschützte Isomer nur in niedrigen Ausbeuten erhalten werden konnte. Es konnte gezeigt werden, daß bei Verwendung der neuen TOM-Schutzgruppe dieses Problem gelöst werden kann. Die erhaltenen Phosphoramiditbausteine wurden mittels der Phosphoramiditmethode an einem Syntheseautomaten in Ribonukleinsäure (RNA) eingebaut. Dazu wurden RNA Stränge aus zwölf Nukleotiden mit einer Modifikation in der Mitte synthetisiert und aufgereinigt. Um festzustellen, ob die modifizierten Bausteine Wasserstoffbrücken zu den natürlichen Nukleobasen ausbilden oder nicht, wurden sie mit allen vier natürlichen Basen gepaart und die erhaltenen 12mer RNA Duplexe mittels UV- und CD-Spektroskopie untersucht. Aus den erhaltenen Schmelzkurven wurden die Schmelzpunkte bestimmt und die thermodynamischen Daten errechnet. Dabei stellte sich heraus, daß mehrere der modifizierten Nukleoside kaum zwischen den natürlichen Nukleosiden differenzieren, d.h. das die erhaltenen Schmelzpunkte der RNA Duplexe sich kaum unterscheiden egal mit welcher natürlichen Base die modifizierten Basen gepaart sind. Als beste universelle Basen mit der geringsten Differenzierung und den geringsten Stabilitätsverlusten des resultierenden RNA Duplex haben sich 1´-Desoxy-1´-(2,4-difluorphenyl)-beta-D-ribofuranose (B) und 1´-Desoxy-1´-(4,6- difluor-1-N-benzimidazolyl)-beta-D-ribofuranose (E) herausgestellt. Für weitere Untersuchungen wurden die modifizierten Nukleoside gegeneinander und mit dem abasischen Baustein gepaart. Aus den erhaltenen Daten wurden die Beiträge der Solvatation und der Basenstapelungswechselwirkung aller modifizierten Nukleoside bestimmt. Es konnte gezeigt werden, daß ein Einbau einer modifizierten Nukleobase die RNA-Doppelhelix durch fehlende Wasserstoffbrücken zu den natürlichen Nukleobasen und durch geringere Solvatation destabilisiert. In Gegenzug wird die RNA-Doppelhelix durch verstärkte Basenstapelungswechselwirkungen der modifizierten Nukleobasen stabilisiert. Über alle Effekte betrachtet wird die Doppelhelix durch den Einbau einer der untersuchten Nukleoside destabilisiert. Letztendlich wurden Basenpaare aus zwei modifizierten Nukleotiden gebildet, und zwar immer aus einer Purin analogen und einer Pyrimidin analogen Nukleobase (z.B. 4- Fluorbenzimidazol (D) und 2,4-Difluorbenzol (B)). Aus den berechneten Beiträgen für Solvatation und Basenstapelungswechselwirkungen konnten die erwartenden Schmelzpunkte und freien Enthalpien (betaG 0 ) für diese Basenpaare errechnet werden. Im Falle des Benzimidazol (O)-Benzol (M) Basenpaares war dieser Wert mit dem gemessenen fast identisch (±0,1°C). Für das 4-Fluorbenzimidazol-(D)-2,4-Difluorbenzol-(B) und das 4,6- Difluorbenzimidazol-(E)-2,4-Difluorbenzol-(B) Basenpaar sind die gemessenen Werte allerdings um 0,6°C (0,4 kcal/mol) bzw. 0,9°C (0,6 kcal/mol) höher als die errechneten. Da sich diese Basenpaare von dem Benzimidazol-(O)-Benzol-(M) Basenpaar nur durch die Fluoratome unterscheiden, muß diese Stabilisierung der RNA Duplexe durch Wechselwirkungen des Fluors zustande kommen. Bei dieser Wechselwirkung zwischen zwei modifizierten Nukleobasen könnte es sich um F...H-Wasserstoffbrücken handeln, wie sie auch schon in den Kristallen von 1´-Desoxy-1´-(4-fluorphenyl)-beta-D-ribofuranose 34 und 1´- Desoxy-1´-(2,4-difluorphenyl)-beta-D-ribo-furanose 30 nachgewiesen werden konnten. Als Ausblick für zukünftige Arbeiten auf diesem Gebiet ausgehend von den in dieser Arbeit erhaltenen Ergebnisse werden folgende Untersuchungen angeregt: - Messung von Fluor-NMR-Spektren zur Untersuchung, ob es sich bei den ermittelten Duplex stabilisierenden Kräften um F...H Wasserstoffbrücken handelt. - Verifizierung der ermittelten Beiträge der Solvatation und der Basenstapelungswechsel- wirkungen durch Einbau der modifizierten Nukleoside in RNA einer anderen Sequenz. - Synthese der Triphosphate der fluormodifizierten Nukleoside mit enzymatischen Einbauversuchen. - Einbau der als universellen Basen erkannten Nukleoside in Ribozyme mit Test der Enzymselektivität und Enzymaktivität.
Ziel der vorliegenden Dissertation war es, die initialen Bewegungsparameter von Ionen bei matrixunterstützter Laserdesorption zu bestimmen, um mit deren Kenntnis das Verständnis des Desorptions und Ionisationsprozesses bei MALDI zu verbessern. Die Etablierung einer Meßmethode der initialen Geschwindigkeit von Analytionen sowie die Überprüfung verschiedener experimenteller Parameter führten zur Bestimmung einer großen Zahl von Meßwerten der Startgeschwindigkeit von Ionen unterschiedlicher Masse, Ladung und Substanzklasse bei verschiedenen Matrizes und Präparationsbedingungen (siehe Kapitel 5 und 7). Durch Vergleich dieser Meßwerte ist eine Charakterisierung des Desorptions und Ionisationsprozesses bei MALDI möglich. Aufbauend auf diesen Untersuchungen der Startgeschwindigkeit von Ionen wurde ein Desorptions/Ionisationmodell für MALDI entwickelt (siehe Kapitel 6 und 8). Aus der festen Matrix/Analytpräparation werden durch den Laserimpuls oberhalb einer kritischen Laserbestrahlung geladene Bruchstücke ("Cluster") freigesetzt. Aus diesen Clustern resultiert nach Abdampfen von ungeladenenen Teilchen, wie zum Beispiel Matrixmolekülen, die Freisetzung von Ionen in der Gasphase. Hierbei kann das Modell der Clusterbildung sehr gut mit dem Desorptionsmodell nach Zhigilei (siehe Kapitel 2.4.1.5) verknüpft werden [Zhi97]. Die Cluster verschiedener Größe werden in der sich ausdehnenden Teilchenwolke transportiert. Sie bewegen sich mit der initialen Geschwindigkeit der expandierenden Teilchenwolke. Dieser Vorgang kann mit dem "Mitgerissen werden" der Biomoleküle (entrainment) [Bea91] bei MALDI korreliert werden: So wird beispielsweise beobachtet, daß die mittlere initiale Geschwindigkeit v 0 der Analytmoleküle im Mittel nie höher ist als die der Matrixmoleküle. Die Schwellbestrahlungsabhängigkeit der Ionisation kann weiterhin mit der Schwellbestrahlung der Ablation, d.h. der kollektiven Ablation von großen Partikeln aus der Matrix/Analytpräparation, wie sie von Zhigilei in molekulardynamischen Simulationen gefunden wurde, verknüpft werden. Desorption und Ionisation sind somit nicht getrennt voneinander zu betrachten, da während der Desorption die Freisetzung von Ionen erfolgt. Wenn Peptide und Proteine aus Clustern stammen, besitzen die freigesetzten Biomolekülionen die gleiche mittlere Analytionengeschwindigkeit wie die Matrixneutralen [Dre94]. Für kleine Oligosaccharide werden niedrigere Startgeschwindigkeiten detektiert als für Peptide und Proteine. Das kann darauf zurückgeführt werden, daß diese Ionen nicht als vorgeformte Ionen aus Clustern freigesetzt werden. Da die im Rahmen dieser Arbeit untersuchten neutralen Oligosaccharide kationisiert und (im wesentlichen) nicht protoniert im MALDIMassenspektrum auftreten und bei höheren Verzögerungszeiten eine verstärkte Kationisierung von Oligosacchariden zu beobachten ist, werden diese Teilchen voraussichtlich nach der Desorption in der Gasphase ionisiert (siehe Kapitel 7 und 8). Da Oligosaccharide in die Matrix DHB eingebaut werden, jedoch Kationen zur Ionisation nicht in den Matrixkristallen zur Verfügung stehen, ist anzunehmen, daß neutrale Oligosaccharide aus Clustern mit der gleichen Startgeschwindigkeit wie Peptide und Proteine in der desorbierten Teilchenwolke vorkommen; ihre Ionisation und damit ihre Detektion ist aufgrund der fehlenden Ladung jedoch nicht möglich. Die Ergebnisse der Startgeschwindigkeit von Ionen bei verschiedenen Präparationen verdeutlichen, daß Gasphasenionisation einer der möglichen Wege der Ionisation neben der Freisetzung von Analytionen aus geladenen Clustern ist. Da auch für Peptide und Proteine Kationisierung in der Gasphase auftreten kann, lassen sich auch langsame Molekülionenspezies experimentell feststellen, was mehrere initiale Geschwindigkeits komponenten und damit auch ein Ionensignal mit unterschiedlichen Komponenten der Startgeschwindigkeit zur Folge hat. Weiterhin sollte auch unterhalb der Schwelle des Analytionennachweises (und damit der kollektiven Ablationsschwelle gemäß dem breathing sphereModell) bei MALDI aufgrund von Verdampfung einzelner Moleküle gefolgt von Ionisation in der Gasphase ein Ionensignal feststellbar sein. Die beobachtete mittlere Startgeschwindigkeit von Analytionen wäre somit eine Mischung aus schnellen, aus Clustern stammenden, und aus langsamen, in der Gasphase ionisierten Teilchen. Eine Komponente kann als prompt ionisierte Komponente mit im wesentlichen massenunabhängiger, konstanter (hoher) initialer Geschwindigkeit verstanden werden. Die zweite Komponente kann durch verzögert auftretende Gasphasenionisation innerhalb des expandierenden Materials erklärt werden, wobei die Analytionen eine geringere Startgeschwindigkeit zeigen. Zusammenfassend (siehe Kapitel 8) wird eine kollektive Ablation von Partikeln und vorgeformten Ionen beim MALDIDesorptionsprozeß gefolgt von Sekundärreaktionen innerhalb der dichten Teilchenwolke in der Gasphase in der selvedgeRegion durch Ionen Molekülreaktionen vorgeschlagen, wie es bereits bei dem precursorModell für Sekundärionenmassenspektrometrie formuliert wurde [Sun88], [Pac85], [Ben83]. Bezogen auf die Auswahl potentieller Matrizes besitzt das Modell nach wie vor nur eine geringe "Voraussagekraft": Ob eine Substanz als Matrix geeignet ist oder ob sie einen hohen bzw. geringen Grad an metastabiler Fragmentierung für zum Beispiel Peptide oder Proteine zeigt, kann weiterhin nur experimentell bestimmt werden, wobei jedoch eine Charakterisierung mit Hilfe der Startgeschwindigkeit möglich ist. Der Zusammenhang eines ClusterDesorptions/Ionisationsmodells mit molekulardynamischen Simulationen nach Zhigilei ermöglicht jedoch eine Beschreibung vieler experimenteller Ergebnisse bei MALDI. Weiterführende Experimente sollen die Verifikation des "ClusterModells" der Ionisation zum Ziel haben. Hier ist insbesondere die Untersuchung des Ladungszustandes von Analytmolekülen in festen Matrix/Analytpräparationen von Bedeutung. Weitere Untersuchungen zur Spektrenqualität bei Matrizes, die keinen Einbau der Analytmoleküle in die Matrixkristalle zeigen, sowie eine eingehende Untersuchung der verschiedenen alternativen Präparationstechniken aus Kapitel 7 sind hierbei geplant.
In der vorliegenden Arbeit wurden neue Methoden für die hochauflösende NMR Spektroskopie entwickelt, um damit native und denaturierte Proteine charakterisieren zu können. Neue Mess- und Anwendungsmethoden für dipolare Kopplungen bilden den Schwerpunkt der Doktorarbeit. Durch die Verwendung von flüssigkristallinen Medien ist es in NMR in Lösung möglich geworden dipolare Kopplungen zu bestimmen. Durch die Projektionen der einzelnen so bestimmten Vektoren auf andere Vektoren im Protein, welche beliebig weit entfernt sein können, kann weitreichende Orientierungsinformationen für die Strukturrechnung von Biomakromolekülen genutzt werden. Dies ist an den Beispielen Ubiquitin, Triggerfaktor und Raffinose in der Arbeit dargestellt. Durch diese Orientierungsinformation kann man auch Teile von Proteinen, wie zum Beispiel Domänen, gegeneinander ausrichten oder die relative Orientierung von Sekundärstrukturelementen nutzen um eine 3D Homologiesuche durchzuführen. Auch dies ist in der Arbeit beschrieben. Die neuen Messmethoden erlauben erstmals die Bestimmung von 1H-1H dipolaren Kopplungen mit Größe und Vorzeichen (JHH-NOESY) und von allen drei dipolaren Kopplungen in einer Seitenkettenmethylgruppe (SPITZE-HSQC). Ein weiterer wichtiger Punkt war die Extraktion dynamischer Parameter aus dipolaren Kopplungen. Der Vektor, der die wechselwirkenden Dipole verbindet, wird von der Dynamik des Proteins beeinflusst. Dadurch ist eine Analyse der Dynamik auf einer Zeitskala bis ca. 10ms möglich (bisher nur bis in den Bereich von ns). Besonders µs Dynamik, welche vorher nicht mittels NMR Methoden sichtbar, kann so dargestellt werden. Aus den dipolaren Kopplungen, welche in 11 verschiedenen Orientierungsmedien gemessen wurden, konnten modellfreie dipolare Ordnungsparameter extrahiert werden. Erstmals konnte zwischen axialsymmetrischen und anisotropen Bewegungen der NH Vektoren unterschieden werden. Unsere experimentellen Daten zeigen, dass Ubiquitin auf einer Zeitskala oberhalb der Korrelationszeit ähnlich viel Bewegung zeigt wie unterhalb der Korrelationszeit. Der mittlere Ordnungsparameter sinkt von 0.8 für Bewegungen bis zur Korrelationszeit auf 0.6 für alle Bewegungszeiten. Auch sieht man, dass viele Bewegungen bis zu 60% Anisotropie beinhalten. TOCSY-Sequenzen sind wichtige Bausteine für Moleküle jeder Größenordnung. Hierfür wurden neue adiabatische TOCSY Sequenzen entwickelt, welche TOCSY Spektroskopie bei allen Magnetfeldern mit höherer Intensität erlauben. Wichtig ist auch noch die viel größere Robustheit gegen B1-Inhomogenitäten und Pulsmisskalibrierung. Dipolare TOCSY Sequenzen (MOCCA) erlauben besseren Transfer mittels den zuvor schon erwähnten dipolaren Kopplungen. Durch die Analyse denaturierter Proteine wollte man ein besseres Verständnis dieses Zustandes erzielen. Hierfür wurden Kopplungskonstanten, kreuzkorrelierte und autokorrelierte Raten und chemische Verschiebungen gemessen und mit einem Modell, dem sogenannten Random Coil Modell verglichen. Mit Hilfe dieser experimentellen Daten sieht man erstmals direkt, dass Proteine im denaturiertem Zustand den Winkel zwischen 60° ( -Helix) und 120° ( -Faltblatt) absuchen.
Die vorliegende Arbeit beschäftigt sich mit der Untersuchung von kleinen, nicht isotopenmarkierten Proteinen mit Hilfe der NMR-Spektroskopie. Ziel ist die Aufklärung der Struktur und der biologisch relevanten Wechselwirkung mit anderen Molekülen. Konkret wird die strukturelle Aufklärung der zweiten KunitzDomäne des Tissue Factor Pathway Inhibitor (TFPI), TFPI2 beschrieben. Dieses Molekül spielt eine wichtige Rolle bei der Blutgerinnung (Kapitel 2.2) in Säugetieren, in dem es bei kleinsten Verletzungen die Gerinnung unterbindet und so die Versorgung mit Sauerstoff und Nährstoffen des betroffenen Bezirks aufrecht erhält (Kapitel 2.3). Die untersuchte zweite Domäne des TFPI lagert sich direkt und spezifisch an ein zentrales Molekül der Gerinnungskaskade, den Faktor Xa, an. Neben dieser bio logischen Funktion trägt die Entdeckung des TFPI dazu bei, die strikte Trennung der Gerinnung in zwei voneinander unabhängige Reaktionswege bis zur Bildung des Fibrinpolymers aufzuheben. Zur Bestimmung der Struktur des unmarkierten Proteins wurden NMRSpektren aufgenommen. Neben den im Kapitel 3 beschriebenen Standardexperimenten wur den im Rahmen der Untersuchungen das TACSYExperiment in neuer Art und Weise genutzt (Kapitel 4.2), da die Probe ein ungünstige Relaxationseigenschaften auf wies. Mit dem entwickelten Experimenten ist ein neuer Ansatz zur Bestimmung von Kopplungskonstanten in nichtmarkierten Molekülen nun auch in solchen Proben möglich, da die Güte der abgelesenen Konstanten nicht mehr von der Signalbreite beeinflußt wird. Ausgehend von diesen Untersuchungen wurde ein neues Experiment zur Bestim mung von 3 J(HNH)Kopplungskonstanten entwickelt. Das SIAMTACSY (Kapitel 4.3), ermöglicht die Bestimmung der Kopplungskonstanten nach der DISCOMe thode, für die bislang die Aufnahme von wenigstens zwei Spektren mit unter schiedlichen Methoden nötig war, mit nur einem einzigen Spektrum. Beide Methoden, SIAM--TACSY als auch die in dieser Arbeit näher beschriebene Me thode, umgehen die Notwendigkeit der Aufnahme verschiedener Spektren mit un terschiedlichen Pulssequenzen und Aufnahmebedingungen. Während SIAM--TACSY mit nur einem Experiment auskommt, dessen Daten durch unterschiedliches Post-Processing alle Kopplungskonstanten liefern, müssen mit der in Kapitel 4.2.2 be schriebenen Methode mehrere Spektren desselben Typs aufgenommen werden. Im Verlauf der Arbeit wurden die Resonanzen von 52 von 58 Aminosäuren eindeu tig und vollständig zugeordnet (Kapitel 3.4). Die Spektren liefern die für die Struk turrechnungen notwendigen Parameter (Kapitel 5). Die berechnete Struktur basiert auf 762 DistanzRestraints, 20 DihedralWinkel des ProteinRückgrats und 15 Wasserstoffbrückenbindungen. Diese Parameter wurden zunächst in Distance-Geometry-Berechnungen (Kapitel 6.2) eingesetzt. Zur Verfeinerung der Struktur wurde in den späteren Rechnungen das SimulatedAnnealingVerfahren (Kapitel 6.1) genutzt. In einem iterativen Ver fahren werden die gewonnenen Strukturen -- es wurden immer 100 Strukturen gleichzeitig aus einem Parametersatz berechnet -- analysiert und die korrigierten und überprüften Parameter wieder in die Berechnungen eingesetzt (Kapitel 6.3). Die Struktur der zweiten Domäne des Tissue Factor Pathway Inhibitor ist durch dieses Verfahren sehr gut definiert, was sich in den Werten der Standardabwei chung für die 10 besten Strukturen für den Backbone (1,4 Å) niederschlägt (Kapitel 6.4). Die so bestimmte Struktur beweist die Annahme, daß es sich bei der zweiten Do mäne des TFPI auch strukturell um einen typischen KunitzInhibitor (Kapitel 2.1) handelt, was durch punktuelle Mutationen im Bereich der reactive site bereits funktionell bewiesen war. Die Stabilität der ProteaseInhibitoren gegenüber Verdau und Entfaltung begründet sich in der kompakten Struktur, die durch 3 Disul fidbrücken stabilisiert wird. Die sechs stets 1 gleichweit voneinander in der Sequenz entfernten Cysteine verbinden N und CTerminus (Cys5 -- Cys55 in der BPTI Numerierung), stabilisieren die reactive site (Cys14 -- Cys38) und binden das zentrale Faltblatt an den Rest des Moleküls. Die für KunitzInhibitoren typische Struktur ist im untersuchten Protein bewahrt; weniger gut definiert ist die in eini gen Inhibitoren dieses Typs zu findenden N-terminale AlphaHelix, sie ist in den Struk turen des TFPI2 lediglich angedeutet. Ein Vergleich der Struktur des TFPI2, so wie es in dieser Arbeit untersucht wurde, und der Struktur eines Homologen findet in Kapitel 6.4.3 statt. In dieser Arbeit wird gezeigt, daß die strukturelle Untersuchung des kleinen, un markierten Proteins erfolgreich durchgeführt werden kann. Die Struktur des phar makologisch interessanten Moleküls sollte ein Hilfsmittel bei der Auffindung von neuen, den körpereigenen ähnlichen und damit besser verträglichen Gerinnungs inhibitoren sein. Die neuen NMRMethoden bieten ein innovatives Werkzeug zur Gewinnung von skalaren Kopplungskonstanten mit hoher Effizienz und unter Umgehung der Probleme, die in COSYSpektren mit hohen Linienbreiten auftreten.
In der vorliegenden Doktorarbeit wurden die folgenden fünf biochemischen Fragestellungen zu Enzymen und deren Wechselwirkungen mit ihren Substraten mit NMR spektroskopischen Methoden untersucht: (1) Die spontane Bildungsrate von NCarboxymethanofuran (Carbamat) aus CO 2 und Methanofuran im Gleichgewicht und die Beeinflussung der Geschwindigkeit durch FormylmethanofuranDehydrogenase aus Methanosarcina barkeri wurden über 2D ProtonenaustauschSpektroskopie (EXSY) bestimmt. Mit Hilfe der berechneten Geschwindigkeitskonstanten und der bekannten physiologischen Konzentrationen von CO 2 und Methanofuran konnte erstmals gezeigt werden, daß die spontane Carbamatbildungsrate ausreicht, um die in vivoCO 2 Reduktionsraten in methanogenen Archaea erklären zu können. (2) Die Konformation von N 5 ,N 10 Methylentetrahydromethanopterin (Methylen H 4 MPT) in Anwesenheit und in Abwesenheit H 2 bildender MethylenH 4 MPTDehydrogenase aus Methanothermobacter marburgensis wurde über TransferNOEMessungen bestimmt. Es wurde nachgewiesen, daß die Bindung zu einer Konformationsänderung des Substrats führt, welche die ReSeitenStereospezifität des Enzyms erklären kann. (3) Die Stereospezifität des Hydridtransfers von MethylenH 4 MPT auf NADP , katalysiert von NADPabhängiger MethylenH 4 MPTDehydrogenase aus Methylobacterium extorquens AM1, wurde NMRspektroskopisch untersucht. In Übereinstimmung mit der unter (2) entwickelten Theorie zum Übergangszustand des Hydridtranfers wurde gefunden, daß auch der Transfer auf NADP ReSeitenspezifisch in Bezug auf MethylenH 4 MPT verläuft. Zusätzlich wurde gezeigt, daß das Enzym das Hydrid auf die ReSeite von NADPH überträgt. (4) Die spontane Rate der Kondensationsreaktion von Glutathion und Formaldehyd zu SHydroxymethylglutathion wurde mit EXSYMessungen bestimmt. In Zellextrakten des methylotrophen Proteobakteriums Paracoccus denitrificans wurde eine Enzymaktivität nachgewiesen, die diese Reaktion beschleunigt. Bislang wurde vermutet, daß es eine solche Enzymaktivität nicht gibt. Mit EXSYMessungen konnte nicht nur diese Enzymaktivität nachgewiesen werden, sondern es gelang auch das verantwortliche Enzym, das Glutathion abhängiges FormaldehydaktivierendesEnzym (Gfa) genannt wurde, erstmals zu reinigen und das kodierende Gen zu identifizieren. (5) Die Anzahl der UbichinonBindungsstellen des Cytochrom bc 1 Komplexes aus Bos bovis wurde bestimmt. Dafür wurde eine NMRMethode entwickelt, die es ermöglicht, Bindungsstudien von wasserunlöslichen Cofaktoren an membranständigen Proteinen durchzuführen. Über die Aufnahme und Integration von 1 H, 13 CHSQCSpektren unter Verwendung von HRMASNMR konnte die Konzentration des Ubichinons, das in der Proteoliposomenmembran frei beweglich ist, quantifiziert werden. Verdrängungsstudien mit spezifischen Inhibitoren ermöglichten es dann, durch den Vergleich der freigesetzten Ubichinonkonzentrationen relativ zu der Cytochrom bc 1 Komplexkonzentration nachzuweisen, daß insgesamt drei Ubichinone spezifisch an den Cytochrom bc 1 Komplex binden. Die Ergebnisse werden in 5 Abschnitten beschrieben. Im Anhang zu jedem Abschnitt finden sich die Abdrucke der bereits erschienenen Veröffentlichungen (Abschnitte 1 bis 3) und ein zur Veröffentlichung akzeptiertes Manuskript (Abschnitt 5). In der Einleitung werden die Möglichkeiten aufgezeigt, mit modernen NMRspektroskopischen Methoden Protein LigandWechselwirkung zu studieren. In der Diskussion werden anhand der Ergebnisse die Limitierung, aber auch das noch nicht ausgeschöpfte Potential dieser Methoden erläutert. Während der Doktorarbeit wurden auch Untersuchungen zu den katalytischen Eigenschaften einer energiekonservierenden Hydrogenase aus M. barkeri durchgeführt. Die daraus entstandene Publikation ist im Anhang zu finden.
Obwohl die Kristallstrukturen der CytochromcOxidase aus RinderherzMitochondrien und dem Bodenbakterium P. denitrificans bekannt sind und die Funktionsweise des Enzyms mit Hilfe zahlreicher Methoden bereits intensiv untersucht wurde, wird nach wie vor kontrovers diskutiert, an welcher Stelle im katalytischen Zyklus wieviele Protonen aufgenommen bzw. gepumpt werden und über welchen der beiden Protoneneintrittspfade dies geschieht. Ziel der vorliegenden Arbeit war es, diesen Fragestellungen mit Hilfe von elektrischen Messungen nachzugehen, um dann ein genaueres Bild von der mechanistischen Funktionsweise des Enzyms zu erhalten. Hierzu wurden Teilschritte des katalytischen Zyklus der CytochromcOxidase aus P. denitrificans genauer untersucht. Dies gelang durch Spannungsmessungen an der schwarzen Lipidmembran mit Ru II (2,2'bipyridyl) 3 Cl 2 (Rubpy) als lichtinduzierbarem Einelektronendonor. Es konnte gezeigt werden, daß ausgehend vom vollständig oxidierten Zustand O nach Lichtanregung ein Elektron von Rubpy auf die Oxidase übertragen und anschließend vom CuA zum Häm a mit einer Zeitkonstanten von » 20 µs transportiert wird. Zeitaufgelöste spektroskopi sche Messungen deuten darauf hin, daß das Elektron auf dem Häm a verbleibt. Die Reduktion dieses Kofaktors führt zu einer Protonenaufnahme über den KWeg mit einer Zeitkonstanten von » 175 µs. Nimmt man an, daß sich Häm a in der Mitte des Dielektrikums befindet (Hinkle und Mitchell, 1970), so deuten die relativen Amplituden der beiden Phasen an, daß etwa 0.8 Protonen aufgenommen werden, in sehr guter Übereinstimmung mit (Capitanio et al., 2000). Aus MehrfachblitzExperimenten unter anaeroben Bedingungen, ausgehend vom OZustand, konnten erste Erkenntnisse über den E ® R Übergang gewonnen werden, nämlich daß hierbei ein Prozeß mit einer Zeitkonstanten von ca. 1.1 ms auftritt und daß sowohl K als auch DWeg an diesem Teilschritt des katalytischen Zyklus beteiligt sind. Da mit der MehrfachblitzMethode aber immer ein Gemisch aus verschiedenen Zuständen entsteht, war es nicht möglich, quantitative Aussagen über die Zahl der transportierten Ladungen zu treffen. Aus diesem Grund wurde eine Möglichkeit gesucht, den EZustand in hoher Ausbeute mit ausreichender Stabilität herzustellen, um dann ein Elektron zu übertragen. Dies gelang durch Darstellung des OxoferrylZustandes F mit Hilfe von H 2 O 2 und anschließende Zweielektronenreduktion durch CO. Die Übertragung von einem Elektron auf den so gebildeten EZustand lieferte 3 Phasen im Spannungssignal mit Zeitkonstanten von » 25 µs, » 200 µs und » 1.5 ms. Die relativen Amplituden dieser Phasen und die Ergebnisse von K und DWegMutanten legen nahe, daß nach Aufnahme des 2. Elektrons vermutlich ein Proton über den KWeg aufgenommen und anschließend 1 Proton über den DWeg gepumpt wird. Es konnte somit zum ersten Mal gezeigt werden, daß bereits während des reduktiven Teils (O ® R) des katalytischen Zyklus ein Proton von der intrazellulären zur extrazellulären Seite transportiert wird und zwar ohne daß unmittelbar vorher die Sauerstoffreduktion stattgefunden haben muß. Erste Experimente zum P ® F Übergang lassen sich so deuten, daß mit Aufnahme des 3. Elektrons ein Proton zum binuklearen Zentrum transportiert und mindestens 1, wenn nicht gar 2 Protonen durch das Enzym gepumpt werden. Hier sind noch weitere Experimente nötig, um die genaue Zahl der transportierten Ladungen und die für die einzelnen Protonenbewegungen verwendeten Protoneneintrittspfade zu bestimmen. Messungen zum F ® O Übergang schließlich zeigten, daß nach dem CuA ® Häm a Elektro nentransfer mit einer Zeitkonstanten von ca. 25 µs vermutlich 1 Proton über den DWeg bis zu den Hämen transportiert (t » 270 µs) und anschließend ein Proton ebenfalls über den DWeg gepumpt wird (t » 1.5 ms). Aus den gewonnenen Daten wurde ein neuer Mechanismus für die Sauerstoffreduktion in der ParacoccusCOX entwickelt. Dieser beruht auf dem von Mitchell und Rich postulierten Elektroneutralitätsprinzip (Mitchell und Rich, 1994) und ist stark an das von Michel vorgeschlagene Modell (Michel, 1998; Michel, 1999) angelehnt. Zur Klärung der Fragen, ob sich bakterielles und RinderzEnzym eventuell in ihrem Mechanismus unterscheiden oder ob nicht eventuell ein Proton während des O ® E Übergangs gepumpt wird (allerdings nur, wenn unmittelbar vorher die Sauerstoffreduktion durchlaufen wurde), sind u.a. noch intensivere Untersuchungen des P ® F Teilschrittes notwendig. Im Rahmen dieser Arbeit wurden weiterhin 2 verschiedene Kobaltkomplexe auf ihre Eignung als lichtinduzierbare Sauerstoffdonatoren (cagedSauerstoff) für die COX untersucht. Hierbei stellte sich heraus, daß beide Verbindungen ungeeignet sind, da sie entweder instabil sind ((µsuperoxo)bis[pentaammincobalt(III)]) oder Nebenreaktionen mit dem Protein eingehen ((µperoxo)(µhydroxo)bis[bis(bipyridyl)cobalt(III)]). Abschließend wurde der Einfluß von Zn 2 Ionen auf elektrogene Schritte im katalytischen Zyklus genauer erforscht. Es wurde deutlich, daß Zn 2 bakterielle COX von beiden Seiten inhibieren kann, wobei die Bindestelle(n) auf der intrazellulären Seite im Gegensatz zur extrazellulären Seite hochaffin ist/sind. Die elektrischen Messungen deuten darauf hin, daß hierbei sowohl D als auch KWeg blockiert werden, wobei die exakte Position der Metallbindestelle(n) noch zu klären ist.