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Two distinct mechanisms contribute to the development of blood vessels: vasculogenesis, which is the de novo formation of vascular structures from progenitor cells, and angiogenesis, the formation of new blood vessels from pre-existing ones.
Angiogenesis is a highly ordered and carefully regulated multi-step process, during which the precise spatio-temporal interaction between endothelial and mural cells, i.e. smooth muscle cells and pericytes, is prerequisite for the formation of a functional blood vessel. The crosstalk between these two latter cell ty pes is mediated indirectly by various
secreted growth factors, and directly through cell-cell and cell-matrix interactions. The secretory epidermal growth factor-like protein 7 (EGFL7) has been implicated to
play an important role in the regulation of smooth muscle and endothelial cell recruitment and vascular tube formation. However, in-depth investigation of the underlying molecular mechanism has so far been hampered by the lack of functional recombinant EGFL7. In this study for the first time full length EGFL7 was successfully expressed as a His 6- tagged fusion protein from insect cells using the Baculovirus expression vector system. Recombinant EGFL7 was purified in a two-step protocol involving ion metal affinity chromatography and gel filtration. Furthermore, recombinant EGFL7 was
purified from human embryonic kidney EBN A 293 cells using a similar approach, allowing the production of high amounts of recombinant EGFL7 protein in its native state, with proper post-translational processing and full biological activity. Detailed analysis of the post-translational processing of recombinant EGFL7 and EGFL7-mutants revealed extensive proteolytic processing by protein convertases both at the N- and the C-terminus, the latter being prerequisite for EGFL7 secretion. Furthermore, secreted EGFL7 protein was shown to bind to the extracellular matrix and the responsible heparin-binding domain of EGFL7 was mapped to its N-terminal
portion. Purified recombinant EGFL7 protein was tested for its functionality using cell migration assays, cell proliferation studies and in vivo matrigel studies in mice. In the
modified Boyden chamber migration assay, recombinant EGFL7 proteins inhibited PDGF-BB-induced smooth muscle cell migration. Moreover, recombinant EGLF7 proteins strongly inhibited PDGF-BB-induced proliferation of smooth muscle cells, while it did not affect VEGF induced proliferation of endothelial cells. When applied in the in vivo matrigel plug assay, EGFL7 proteins induced a strong pro-angiogenic response, comparable with that of VEGF on an equimolar basis. Moreover, EGFL7 expression was strongly induced in endothelial cells in response to VEGF stimulation. These novel findings demonstrate the important function of EGFL7 in angiogenesis and are well in line with previous results. They demonstrate a cell specific action of EGFL7 on the different cell types involved in vessel formation, which is a prerequisite for a regulatory function in cell-to-cell crosstalk. Based on the results described here, the following model can be proposed: VEGF, a known strong initiator of angiogenesis, induces endothelial cell proliferation and migration, allowing the
escape from the comparatively rigid structure of a functional vessel to form an angiogenic sprout. At the same time VEGF induces the expression of EGFL7 in endothelial cells. EGFL7 is expressed, proc essed and secreted from these cells. While EGFL7 has no known effect on endothelial cells, it inhibits smooth muscle cell proliferation and migration, providing a mechanism to prevent pre-mature stabilization of the forming vessel. The availability of purified recombinant EGFL7 will be helpful in the detailed characterization of the underlying molecular mechanism of EGFL7 action, including the identification of the putative EGFL7 receptor, and will allow - together with knock-out experiments in mice - the exploration of the additional biological functions of EGFL7. Moreover, considering the strong pro-angiogenic effect of EGFL7 in vivo, it would be also of a great therapeutic interest to investigate its role in the development of tumor vasculature. The insights into these molecular mechanisms might provide a novel approach for the development of anti tumor therapies.
Das Hodgkin Lymphom besteht aus zwei verschiedenen Typen, dem klassischen Hodgkin Lymphom (cHL) mit einem Anteil von 95% und dem nodulären lymphozytenprädominanten Hodgkin Lymphom (NLPHL). Letzteres kann sehr unterschiedliche histopathologische Wachstumsmuster zeigen, die nach Fan et al. grob in ein typisches knotiges (Muster A) und in atypische diffuse Wachstumsmuster (Muster C und E) unterteilt werden können. Patienten mit einem NLPHL, das zum diffus wachsenden Subtyp zählt, präsentieren sich häufiger in klinisch fortgeschrittenen Stadien als jene Patienten mit einem NLPHL, das ein knotiges Wachstumsmuster zeigt. Im Gegensatz dazu präsentiert sich das T-Zell/Histiozytenreiche großzellige B-Zell Lymphom (THRLBCL) in einem fortgeschrittenen Stadium mit einer oftmals schlechten Prognose. NLPHL vom diffusen Typ weisen starke Ähnlichkeiten mit dem THRLBCL sowohl in Bezug auf Histomorphologie als auch klinische Eigenschaften auf und sind dadurch manchmal nur schwer voneinander zu unterscheiden.
Das Wachstumsmuster eines Tumors hängt unter anderem von der Verteilung der Blutgefäße im Tumorgewebe ab. Viele aktuelle Studien weisen darauf hin, dass die Gefäßneubildung (Angiogenese) eine wichtige Rolle in der Entwicklung von hämatologischen Tumoren spielt. Durch diesen Prozess kann der Tumor zu ausreichend Sauerstoff und Nährstoffen gelangen, um invasiv zu wachsen und zu metastasieren. Die Gefäßdichte ist ein anerkannter Marker für die Auswertung von Gefäßneubildung in verschiedenen Tumoren.
Ein Ziel der Arbeit bestand darin, Parameter der Angiogenese, u.a. die Gefäßdichte und den queren Gefäßdurchmesser, in verschiedenen Subtypen des NLPHL und in THRLBCL im Hinblick auf eine mögliche Unterscheidbarkeit des diffusen NLPHL und des THRLBCL zu untersuchen sowie sie mit anderen Typen von malignen Lymphomen und reaktiven Lymphadenitiden (LA) zu vergleichen.
Von T-Lymphozyten ist bekannt, dass sie mit den Tumorzellen in Lymphomen in engem Kontakt stehen und einen nicht unerheblichen Anteil des Tumormikromilieus bilden. Die CD4+ Lymphozyten treten gewöhnlich über Gefäße, den hochendothelialen Venolen (HEVs), in den Lymphknoten ein.
Ein weiteres Ziel der Arbeit war es, eine mögliche Korrelation zwischen dem TLymphozyten-Zustrom und der Tumormorphologie in den betroffenen Lymphknoten zu untersuchen, um herauszufinden, ob dies die unterschiedliche Zusammensetzung im Mikromilieu der Lymphome erklären kann. Als Maß für den Zustrom wurde die Anzahl der intravaskulären T-Lymphozyten herangezogen. Zum Vergleich wurden weitere maligne Lymphome, die ein prominentes Tumormikromilieu besitzen, untersucht.
Im diffusen NLPHL und THRLBCL fanden wir eine niedrigere Gefäßdichte mit einer diffusen Blutgefäßverteilung. Im Gegensatz dazu zeigte das NLPHL mit einem typischen Wachstumsmuster, das cHL vom gemischtzelligen Typ (cHL MC) und das Angioimmunoblastische Lymphom (AITL) in den interfollikulären Arealen eine verstärkte Gefäßbildung. Es zeigte sich in allen Subtypen des NLPHL eine signifikant geringere Gefäßdichte, verglichen mit dem AITL oder den LA Fällen. LA wiesen insgesamt die höchste interfollikuläre Gefäßdichte auf. Das THRLBCL zeigte die niedrigste Gefäßdichte von allen malignen Lymphomen, die untersucht wurden, allerdings war der Vergleich von THRLBCL und den verschiedenen Subtypen des NLPHL nicht signifikant. Wir konnten zeigen, dass die diffusen Subtypen des NLPHL und das THRLBCL ein ähnliches Wachstumsmuster der Blutgefäße mit einer verminderten Gefäßdichte und nicht mehr identifizierbaren follikulären Bereichen vorweisen, im Gegensatz zu den beibehaltenen follikulären Mustern, die wir im typischen NLPHL fanden. Die Anzahl der intravaskulären T-Zellen war am höchsten im cHL MC sowie im typischen NLPHL. Signifikant geringer fielen die intravaskulären TLymphozyten-Werte im THRLBCL im Vergleich mit dem typischen NLPHL Muster A, C und dem cHL MC aus.
Da die LA Fälle eine hohe interfollikuläre Gefäßdichte und kleine Gefäßdurchmesser zeigten, kann man davon ausgehen, dass die Gefäße durch die schnell anschwellenden Keimzentren komprimiert wurden. In den atypischen NLPHL und THRLBCL Fällen lassen die geringe Gefäßdichte und relativ große Gefäßdurchmesser eine langsame Dehnung des Gefäßgerüstes des Lymphknotens annehmen. Die Resultate der T-Zell Quantifizierung legen den Schluss nahe, dass die relativ geringe Anzahl von intravaskulären T-Lymphozyten im THRLBCL zusammen mit einer geringen Gefäßdichte möglicherweise verantwortlich ist für die gewöhnlich relativ geringe Anzahl an T-Lymphozyten pro Fläche und hierdurch die hohe Anzahl an Makrophagen im Mikromilieu im THRLBCL hervorgerufen wird. Dies könnte im Zusammenhang stehen mit einer absolut verminderten T-Lymphozytenzahl im Blut oder einem reduzierten Eintritt der T-Lymphozyten in den Lymphknoten.