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Funktionelle und strukturelle Charakterisierung von SLC-Transportern in eukaryotischen Systemen
(2018)
Die evolutionäre Voraussetzung für die Entwicklung komplexer, differenzierter Organismen bildet die Separierung der Zelle in Reaktionsräume, die so genannte Kompartimentierung. Das Prinzip der Kompartimentierung ermöglicht zahlreiche lebensnotwendige, biochemische Prozesse, wie die Konservierung von Energie durch Protonengradienten in der Atmungskette oder parallele, gegenläufige Stoffwechselwege. Zelluläre Kompartimente werden häufig durch Biomembranen gebildet, welche aus einer zweilagigen Lipidschicht bestehen. Lipidmoleküle in einer Zelle sind meistens amphipathisch, das bedeutet, sie bestehen aus einer polaren, hydrophilen Kopfgruppe und einem unpolaren, hydrophopen Ende (Abbildung 1). Die Lipidzusammensetzung in einer Biomembran ist sehr divers und unterscheidet sich in verschiedenen Organismen und Organellen. Phosphoglyceride bilden den Hauptbestandteil der Lipidschicht. Phosphoglyceride besteht aus einem Glycerin Rückgrat, welches an dem C1- und C2-Atom mit zwei Fettsäuren verestert und an dem C3-Atom mit einem Phosphorsäurediester verbunden ist. ...
In dieser Arbeit wurde das Protein OR1 ausführlich charakterisiert und die Grundlage für weitere Studien an diesem Protein gelegt. Die Zielsetzung dieser Arbeit bestand primär in der biophysikalischen Analyse eines eukaryotischen Proteorhodopsins, da bislang keine Daten zu diesen vorlagen. Dieser Ansatz ist vergleichbar mit der Studie am BR ähnlichen Rhodopsin aus dem Pilz Leptosphaeria maculans (Waschuk et al. 2005). Auch wenn man aus den Eigenschaften von OR1 keine Signatur für eukaryotische PRs herausfiltern kann, so weist OR1 eine Reihe von Charakteristika auf, die es wert sind weiterbearbeitet zu werden. Zu den hervorzuhebenden Ergebnissen dieser Arbeit zählen:
(1) OR1 zeigte in der methylotrophen Hefe Pichia pastoris ein hohes Expressionsniveau weit über der gewohnten Ausbeute bei Membranproteinen.
(2) OR1 offenbarte sich als Proteorhodopsin mit BR ähnlichen Eigenschaften wie dem niedrigen pKs-Wert des Protonenakzeptors und damit guten Protonenpumpeigenschaften über einen großen pH-Bereich. Auch bindet OR1 keinen zweiten Chromophor, was die nahen Verwandten GR und XR hingegen tun.
(3) OR1 demonstriert, dass die Konfiguration des komplexen Gegenions von Proteorhodopsinen stark variiert und sich anscheinend flexibel den physiologischen Erfordernissen des jeweiligen Organismus anpasst. In diesem Zusammenhang spielt auch das konservierte Histidin eine Rolle, da es den primären Protonenakzeptor beeinflusst. Bei OR1 stellte sich heraus, dass das Histidin den pKs Wert der D100 Position nicht signifikant beeinflusst.
(4) OR1 wurde mit 13C und 15N Atomen erfolgreich markiert und das entwickelte Protokoll für die Rekonstitution bewährte sich. Die Proteoliposomen des Wildtyps gaben sehr gut aufgelöste Festkörper-NMR Spektren. In Zukunft sind somit ausführliche NMR Studien an OR1 möglich.
Hemoproteinoids related to contemporary porphyrin-dependent peroxidases were synthesized under simple conditions. The peroxidative activity of hematin increased by a factor of 50 if the hematin was bound to proteinoids whereas the catalatic activity of hematin decreased rather under the same conditions. The peroxidative activity of hemoproteinoids particularly increased with their lysine content whereas the catalatic activity especially decreased in proteinoids with high phenylalanine content. The isoelectric points of the lysine-rich peroxidic hemoproteinoids were about 8. Their relatively broad pH-activity optimum was about pH 7.0. The molecular weights were a little below 20 000. Hematin content and amino acid composition of the synthetic materials were varied greatly. The substrate specificity appeared as broad as that of biogenous peroxidases, e. g., horseradish peroxidase. Among the many substrates was NADH. The possible importance of the peroxidative oxidation of NADH-type coenzymes by primitive heterotrophic organisms or prebiological systems in an anaerobic environment is discussed.
Physikalische und thermische Kontrastierung führt bei Fixierung in Glutaraldehyd und Einbettung in Vestopal bei Parenchymzellen der Leber zu weitgehend ähnlichen Kontrastunterschieden auch bei Mitochondrien und den Membranen des Retikulums. Beide Verfahren wirken also weitgehend unspezifisch. Von den chemischen Verfahren liefert Uranylacetat im Cytoplasma ähnliche Kontrastverhältnisse wie die beiden genannten Verfahren. Das spezifische Verhalten des Uranylacetats kann z. B. an der Kontrastierung des Chromatins demonstriert werden. Sie bleibt aus, wenn die färbbare Substanz auf der Wasseroberfläche des Messertroges herausgewaschen wurde. Bleicitrat-Kontrastierung hat hier im Gegensatz zu Uranylacetat eine spezifische Wirkung nur auf RNS-haltige Zellbestandteile.
Some quantitative data about the carbon-metabolism in Saccharomyces-cells of different ploidy were determined. The amount of carbon, necessary for the formation of a cell, proved to be proportional to the degree of ploidy of the cells. For the duplication of a diploid cell 6,7·10-11g glucose were used. In comparison with respiratory deficient cells the simultaneous utilization of fermentation and respiration metabolism in respiration sufficient cells leads to a decrease of the cell cycle duration, however, the energy needed for the formation of a cell is not decreased. The rate of cell multiplication has a maximum at about 30 °C for all classes of ploidy. Certain assumptions about the utilization of the carbon source were confirmed by experiments with 14C marked glucose.
In weiteren Versuchen wurden Streptokokken der Gruppe A und C dem in der I. Mitteilung beschriebenen Trennungsgang unterworfen. Es gelang dabei, aus diesen Streptokokken ein Nucleoprotein zu isolieren, das in bezug auf seine elektrophoretischen Eigenschaften, Farbreaktionen, UV-Absorptionskurve, Zuckeranalyse mit dem aus menschlichen und tierischen Organen gewonnenen Nucleoprotein identisch ist.
Das aufgefundene Ribonucleoprotein besitzt die Eigenschaft eines Vollantigens. Die durchgeführten Immunisierungsversuche ergaben eine Artspezifität des Antigens. Eine Organspezifität war nicht nachweisbar. Erste Lokalisierungsversuche mit Hilfe der Immunfluoreszenz-Methode ergaben in der Niere eine besondere Anreicherung des Nucleoproteins in den Glomerulokapseln.
Zusammenfassend läßt sich sagen, daß im menschlichen Serum ein Serumprotein vorhanden ist, welches das aus menschlichem Gewebe gewonnene Nucleoprotein spezifisch bindet. Zur Zeit sind Untersuchungen im Gang. den Serumgehalt des Nucleoproteins und des spezifisch bindenden Serumproteins bei verschiedenen Erkrankungen des Bindegewebsapparates quantitativ zu erfassen.
Das in der I. Mitteilung beschriebene Nucleoprotein führt bei Zugabe zu Tropokollagen-Lösungen zur Bildung von kollagenen Fibrillen. Die Fibrillen-bildende Potenz des Nucleoproteins ist sehr groß. Die gebildeten Fibrillen zeigen eine sehr gute Feinstruktur und weisen eine 640 Å Hauptperiodik auf. Es ist zu vermuten, daß dem ubiquitär im Organismus vorkommenden Nucleoprotein eine bedeutende oder gar ausschlaggebende Rolle bei der Bildung von kollagenen Fibrillen aus Tropokollagen im Organismus zukommt.
Es wird auf die Mannigfaltigkeit der Kontraste hingewiesen, die sich bei mit Aldehyden fixiertem, in Vestopal W oder Durcupan ACM eingebettetem Gewebe durch gesteuerte Elektronenbestrahlung erreichen läßt. Voraussetzung für einen einwandfreien Vergleich von Kontrasten bei z. B. verschieden gefärbten Schnitten ist daher eine Bestrahlung, die zu ausreichend definierten Objektveränderungen führt. Brauchbar in diesem Sinne ist eine Bestrahlung, die zum maximalen „reinen Strahlenverlust“ führt, bei der aber thermische Substanzverluste vermieden werden. Der Negativkontrast von Chromatin und Nucleolen und die offenbar physikalisch bedingte Färbbarkeit der nucleinsäurehaltigen Zellbestandteile mittels der „negative-staining“-Methode werden diskutiert.
Bei der UV-Bestrahlung (2537 Å) des Zn-Insulins beobachtet man für kleinere Dosen (bis 10 Einstein/Mol) eine direkte Korrelation zwischen der Inaktivierung und der Photoreduktion einer der drei Disulfidbrücken. Mit steigender Dosis wird die Quantenausbeute für die Reduktion der Disulfidbrücken (Bildung von SH-Gruppen) sehr klein, dagegen führen dann andere Prozesse zunehmend zur photochemischen Zerstörung der Disulfidbrücken. Für größere Strahlendosen (über 100 Einstein/Mol) ergibt die Extrapolation, daß für die völlige Inaktivierung des Insulins sämtliche drei Cystinreste zerstört werden müssen. Von den übrigen Aminosäuren wird durch Dosen um 100 Einstein/Mol nur der Tyrosin-Anteil signifikant vermindert. Mit steigender Strahlendosis ändert sich — wahrscheinlich infolge von Konformationsänderungen der Polypeptidketten — die Photosensibilität der Aminosäuren.
Die indirekte Wirkung von Röntgenstrahlen einer Dosis von 0,08 bis 7.5 Millionen r auf eine 2 · 10-2-m. wäßrige Tryptophanlösung wurde mit Hilfe chemischer und physikalisch-chemischer Arbeitsmethoden (Hochspannungs-Elektrophorese) untersucht.
Der Einfluß der Dosis, Dosisleistung, Temperatur und die durch oxydierend wirkende Radikale (HO2) ausgelösten Reaktionsschritte bei Bestrahlung in Sauerstoffatmosphäre wurden in qualitativer Hinsicht geprüft.
Aus der Vielzahl der strahlenchemisch gebildeten Abbauprodukte konnten mit Sicherheit nachgewiesen werden: Glycin, α-Alanin, Asparaginsäure, Kynurenin, 3-Hydroxykynurenin, 3-Oxyanthranilsäure und Tryptamin.
Schließlich wurde versucht, die experimentell gewonnenen Ergebnisse mit Hilfe von Radikalwirkungen, die sich auf
a) Decarboxylierungen
b) und Veränderungen des Kohlenstoff-Gerüstes beziehen, zu deuten.
Bei B. cadaveris, die in einem an organischen Substanzen reichen Medium kultiviert wurden, nimmt der O2-Verbrauch pro Zeiteinheit bei Glucoseveratmung mit der Röntgenstrahlendosis ab, während bei Bakterien, die in einem Salzmedium gewachsen sind, die Atmung bis zu einer Dosis von 2 - 3 Mr erst ansteigt, um erst bei höheren Dosen abzufallen. Die Atmung wird erst bei Dosen in der Größenordnung von 1 Million r merklich beeinflußt.
Die Atmung der Bakterien ist damit unter den hier untersuchten Bedingungen noch strahlenresistenter als die Gewebeatmung von Säugetierzellen.
Um die von RAJEWSKY und WOLF aufgeworfene Frage nach dem Einfluß der DNS-Struktur auf die radiationschemische Veränderung der Basen zu untersuchen, wurde die DNS-Spirale bei einem Teil der Untersuchungen in dest. Wasser aufgelöst und mit Röntgenstrahlen bestrahlt. Es ergab sich eine Erhöhung der Strahlenempfindlichkeit der Basen, vor allem zu Beginn der Bestrahlung auf den Wert, den man bei der Bestrahlung der Monomerlösungen beobachtet. Bei Bestrahlung in 0,1 und 1-n. NaCl gelöster DNS sind dagegen die Basen gegen die Einwirkung der im Wasser gebildeten Radikale geschützt, solange sie innerhalb der intakten Spirale gebunden sind. Dieser strukturbedingte Schutzeffekt besteht nicht gegenüber der direkten Strahlenwirkung von UV-Licht. Dieses Ergebnis ist von strahlenbiologischem Interesse, da das Optimum der Strahlenwirkung auf den Mitoseablauf nach Arbeiten von CARLSON und GRAY in der frühen Prophase liegt17, also ebenfalls in einem Stadium, in dem die DNS-Spirale (vor der Verdoppelung) völlig aufgelöst ist. (Vgl. auch BACQ-ALEXANDER und FRITZ-NIGGLI.
Die von verschiedenen Autoren 2–8 experimentell bestimmten Kontrastdicken für Kohle stimmen nicht mit den heute of benutzten numerischen Werten aus der Lenz schen Theorie überein. Die Diskrepanz läßt sich beheben, wenn man zur Auswertung der Theorie einen anderen, schon von LENZ zur Diskussion gestellten Θ-Wert benutzt. Durch Experimente wird gezeigt, daß auch der Bereich, in dem das Exponentialgesetz nicht mehr gilt, gut durch eine aus der Lenz schen Theorie hergeleitete Formel dargestellt werden kann. Der Bereich, in dem das Exponentialgesetz verwandt werden darf, wird näher diskutiert.
Elektronenresonanz-Untersuchungen von Nachreaktionen in einem röntgenbestrahlten Faserprotein
(1962)
Es wurde das Leitfähigkeitsverhalten von reinem, lufthaltigem Wasser bei kontinuierlicher und impulsgetasteter Röntgenbestrahlung (60 kV8) untersucht. Hierbei ergaben sich zwei einander überlagerte Effekte: 1. Ein der Röntgen-Dosisleistung proportionaler irreversibler Leitfähigkeitsanstieg, der vermutlich auf eine Strahlenreaktion des gelösten CO2 zurückzuführen ist, 2. eine reversible Leitfähigkeitserhöhung während der Bestrahlung, die sich mit der Entstehung einer Ionenart mit einer mittleren Lebensdauer von ca. 0,15 sec erklären läßt. Es wird angenommen, daß es sich dabei um Radikalionen O2⊖ handelt, welche durch die Reaktion der als Strahlungsprodukt entstehenden Η-Radikale mit dem gelösten Sauerstoff gebildet werden. Ein möglicher chemischer Reaktionsmechanismus wird angegeben, der zu befriedigender quantitativer Übereinstimmung der Versuchsergebnisse mit Ausbeutewerten und Reaktionskonstanten aus der Literatur führt.