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Die bei der Photosynthese verwendete Lichtenergie wird zu einem großen Anteil von Lichtsammlersystemen bereitgestellt. In der pflanzlichen Photosynthese wird unterschieden zwischen Lichtsammlersytem I (light harvesting complex I, LHC-I), assoziiert mit Photosystem I (PS-I) und Lichtsammlersystem II (light harvesting complex II, LHC-II), assoziiert mit Photosystem II (PS-II). LHC-II ist der häufigste Protein-Pigment Komplex der Chloroplasten und bindet bis zu 50% aller Chlorophylle in der Thylakoidmembran. Der Protein-Pigment Komplex LHC-II hat vier, teils miteinander verwandte Funktionen in der Photosynthese. I) Die Sammlung und Weiterleitung von Lichtenergie, II) Stabilisierung der Granastapel, III) Ausgleich der Anregungsenergie von PS-I und PS-II, IV) Schutz der Photosynthese vor Überanregung mittels nichtphotochemischer Eliminierung von Anregungsenergie (NPQ). In der Pflanze bildet LHC-II Trimere in verschiedenen Kombinationen dreier Isoformen (Lhcb1, Lhcb2 und Lhcb3), wobei Lhcb1 mit 70-90% den Hauptteil des LHC-II stellt. Jedes Monomer bindet 8 verschiedene Co-Faktoren in unterschiedlichen Mengen, die ca. 30% seiner Masse ausmachen. Die drei Isoformen des LHC-II sind in allen Pflanzen stark konserviert. Die funktionelle Bedeutung der Isoformen ist jedoch weitestgehend unklar. Dies liegt vor allem an der schwierigen Isolierung reiner Isoformen aus Pflanzenmaterial. Im ersten Teil dieser Arbeit wurden deshalb alle drei Isoformen rekombinant hergestellt und mit getrennt isolierten Lipiden und photosynthetischen Pigmenten in ihre native Form gefaltet. Die anschließende biochemische und spektroskopische Charakterisierung zeigte einen hohen Grad an Homologie zwischen den drei Isoformen, wobei Lhcb3 die größten Unterschiede aufwies (Standfuss und Kühlbrandt 2004). Die wahrscheinlichsten Funktionen für Lhcb1 und Lhcb2 ist die Anpassung der Photosynthese an variierende Lichtbedingungen. LHC-II Heterotrimere mit Lhcb3 Anteil könnten an der Weiterleitung von Lichtenergie von der Haupt Lhcb1/Lhcb2 Antenne zum PS-II Reaktionszentrum beteiligt sein. Für die Erforschung des LHC-II war das mittels Cryo-Elektronenmikroskopie an 2D Kristallen erstellte atomare Modell des Komplexes von enormer Bedeutung. Ein tiefes Verständnis der Funktionen des LHC-II benötigt jedoch eine Struktur von höherer Auflösung, welche mit 2D Kristallen nur schwer zu erreichen ist. Im Verlauf der Arbeit wurden deshalb mehr als 100000 3D Kristallisationsexperimente durchgeführt, wodurch die Kristallisation von aus Erbsenblättern isoliertem und in vitro gefaltetem LHC-II gelang. Die 3D Kristalle aus nativem Material zeigten einen für die röntgenkristallographische Strukturaufklärung ausreichenden Ordnungsgrad und führten zu einer Struktur des LHC-II bei 2.5 Å Auflösung (Standfuss et al., eingereicht). Die Struktur zeigt 223 der 232 Aminosäuren und die Position und Orientierung von 4 Carotinoiden (2 Luteine, 1 Neoxanthin und 1 Violaxanthin), 14 Chlorophyllen (8 Chl a und 6 Chl b) und zwei Lipiden (PG und DGDG) pro Monomer. Diese Informationen sind essentiell für das Verständnis des Energietransfers innerhalb des LHC-II und zu den Photoreaktionszentren und sollten zusammen mit der großen Anzahl von spektroskopischen Untersuchungen eine zukünftige detaillierte Modellierung dieser ultraschnellen und extrem effizienten Energietransfer Prozesse ermöglichen. Auf Basis der Ladungsverteilung der stromalen Seite des Komplexes konnte ein Modell für die Beteiligung des LHC-II an der Stapelung von Grana in Chloroplasten erstellt werden. Dieses liefert außerdem eine plausible Erklärung für den mittels Phosphorylierung des N-Terminus gesteuerten Ausgleich von Anregungsenergie zwischen PS-I und PS-II. Die 2.5 Å Struktur des LHC-II zeigt schließlich einen einfachen aber effektiven Mechanismus zur Optimierung und Schutz des Photosyntheseapparates mittels NPQ. Dieser benötigt keine Strukturänderungen des LHC-II oder der restlichen Lichtsammelantenne und beruht auf der reversiblen Bindung der Xanthophylle Violaxanthin und Zeaxanthin an LHC-II. Diese Arbeit liefert damit Beiträge zu allen Funktionen des LHC-II Komplexes und hilft damit grundlegende Regulationsmechanismen und die Bereitstellung von solarer Energie für die pflanzliche Photosynthese zu verstehen.
In der vorliegenden Arbeit wurden die Struktur und die Dynamik von Oligosacchariden und DNAs untersucht. Bezogen auf Oligosaccharide wurde die Struktur von Raffinose und Saccharose mittels dipolarer Kopplungen präzisiert. Des weiteren wurde ein N–Glykan isoliert und chemisch modifiziert. An diesem N–Glykan wurde eine chemische Modifikation mit einer Tyrosin–Boc–Schutzgruppe durchgeführt, so dass das Glykan keine Mutarotation mehr zeigt, wodurch es möglich wurde, dipolare Kopplungen zu messen, die für Strukturrechnungen eingesetzt werden können; verschiedene Orientierungsmedien wurden ausprobiert. Des weiteren wurde das N–Glykan über einen Biphenyllinker an einen paramagnetischen Tag gekoppelt, wodurch ebenfalls eine Vorzugsorientierung im Magnetfeld erreicht wird. Bezogen auf die DNAs wurden vor allem Rhodamin–markierte DNA–Duplexe untersucht. Die verwendeten Farbstoffe sind Tetramethylrodamin und Rhodamin 6G. Die Modifikation befand sich stets am 5’–Ende. Hierbei wurde gefunden, dass der Farbstoff haupsächlich als quasi weiteres Basenpaar auf der DNA aufliegt. Für diesen gestackten Farbstoff wurden, abhängig von der Sequenz, entweder zwei oder vier mögliche Konformationen gefunden. Bei den Sequenzen, bei denen der Farbstoff nur in zwei Konformation vorliegt, wurden Strukturrechnungen durchgeführt. Zudem zeigte sich in den NMR–Spektren aller Sequenzen eine deutliche Dimerisierung, die temperatur-, farbstoff– und sequenzabhängig ist. Weiterhin wurde eine konzentrationsabhängige Dynamik gefunden. Die aus den NMR–Messungen erhaltenen Ergebnisse wurden mit Resultaten aus Fluoreszenzmessungen verglichen, wobei sich eine hervorragende Übereinstimmung zeigte. Des weiteren wurde die Struktur von DNA–Duplexen untersucht, die mit dem Fluoreszenzfarbstoff 9–Amino–6–chloro–2–methoxyacridin (ACMA) modifiziert worden sind. Hierbei handelt es sich nicht um eine endständige Modifikation, sondern um eine interne Modifikation. Auch hier wurden verschiedene Sequenzen untersucht. Bei allen Sequenzen interkalierte das ACMA. Mit einer Sequenz wurde eine Strukturrechnung durchgeführt. Als Gegenbase zum ACMA wurde in allen betrachteten Sequenzen ein Adenin gewählt. Strukturell wurde gefunden, dass die Gegenbase durch die Interkalation des ACMAs mit der DNA eine extrahelikale Position einnimmt. Es wurde auch versucht, dipolare Kopplungen zu messen. Zu diesem Zweck wurden verschiedene Orientierungsmedien ausprobiert. Ebenfalls probiert wurde, dipolare Kopplungen durch das Autoalignment der DNA im Magnetfeld zu erhalten. Auch im Falle der mit ACMA markierten DNA wurden die NMR–spektroskopischen Ergebnisse mit den Ergebnissen aus Fluoreszenzmessungen verglichen, wobei sich ebenfalls eine gute Übereinstimmung zeigte. Ferner wurden NMR–spektroskopische Untersuchungen an mit nichtnatürlichen Nukleinsäuren modifizierten DNAs durchgeführt. Als nichtnatürliche Nukleinsäuren wurden Inosin, 2–Aminopurin, Deazaadenin, Deazaguanin sowie Bromoguanin verwendet. Die NMR–spektroskopischen Messungen wurden erfolgreich durchgeführt. Um die erhaltenen Daten abschließend interpretieren zu können, sind noch DFT–Rechnungen erforderlich, die im Rahmen einer anderen Dissertation durchgeführt werden.
Der T-Zell-Wachstumsfaktor Interleukin-2 (IL-2) wird von Antigen-stimulierten T-Zellen sezerniert und spielt eine wichtige Rolle bei der zellulären Immunantwort. Dabei tragen in aktivierten T-Zellen die MAPK-Signalwege, der Calcineurin/NF-AT-Signalweg und der NF-KB-Signalweg kooperativ zur IL-2-lnduktion bei. In den letzten Jahren wurden mehrere Hinweise gefunden, dass IL-2 möglicherweise bei der HIV- und SIV-Pathogenese eine Rolle spielt. Zwei Publikationen konnten bereits eine verstärkte IL-2-Sekretion HIV-1-infizierter T-Zellen nachweisen, die molekularen Mechanismen dieser IL-2-Induktion sind bisher allerdings kaum untersucht. In der vorliegenden Arbeit konnte gezeigt werden, dass das apathogene simiane Immundefizienzvirus der Afrikanischen Grünen Meerkatze (SIVagm3) in suboptimal stimulierten PBMC ebenfalls die Interleukin-2-Sekretion verstärken kann. In der humanen T-Zelllinie A3.01 wurde nach Transfektion des Volllängenplasmids des SIVagm3 eine bis zu 38-fach verstärkte transkriptionelle Aktivierung des IL-2-Promotors beobachtet. Die Untersuchung der beteiligten Signalwege zeigte, dass die MAP-Kinasen ERK, JNK/SAPK und p38 für die IL-2-Induktion durch SIVagm3 notwendig sind, während die Inhibition der Calcineurin-Aktivität durch das Immunsuppressivum Cyclosporin A keinen Einfluss hatte. In Übereinstimmung mit diesem Ergebnis zeigte die Analyse der Transkriptionsfaktorbindungsstellen des IL-2-Promotors keine Aktivierung der NF-AT-kontrollierten Genexpression durch SIVagm3, womit zum ersten Mal ein Calcineurin/NF-AT-unabhängiger Weg der IL-2-Induktion beschrieben wurde. Dagegen erhöhte SIVagm3 die transkriptionelle Aktivität des NF-KB-responsiven Elements und die Aktivität des CD28/AP-1-responsiven Elements, die auch bei der klassischen T-Zellaktivierung eine Rolle spielen. Eine Aktivierung der CD28/AP-1-kontrollierten Genexpression konnte auch durch Expression des viralen Transaktivator-Proteins Tat induziert werden, das in stimulierten Zellen in der Lage war, die IL-2-Expression zu verstärken. Die Beschränkung dieser Tat-Funktion auf stimulierte Zellen konnte aber nicht auf eine Phosphorylierung von SIVagm3-Tat durch die MAP-Kinasen ERK, JNK/SAPK oder p38 zurückgeführt werden. Weitere Analysen zeigten dagegen, dass SIVagm3-Tat durch die Cyclin-abhängige Proteinkinase 9 (CDK9) phosphoryliert wird, die mit Tat koimmunpräzipitiert. Darüberhinaus konnte eine weitere nicht-identifizierte Tat-assoziierte Kinase nachgewiesen werden, die SIVagm3-Tat ebenfalls phosphorylieren kann. Aktuelle Publikationen zeigen, dass das lentivirale Vif-Protein die Degradation von Apobec3G im Proteasom induziert, da dieser zelluläre Faktor die Infektiosität der entstehenden Viruspartikel stark reduziert. Die antivirale Funktion von Apobec3G, die in der Deaminierung der Minusstrang-DNA während der reversen Transkription besteht, ist bereits weitgehend aufgeklärt, aber über die Regulation von Apobec3G ist noch wenig bekannt. In dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass die Aktivierung der mitogenen Raf/MEK/ERK-Signalkaskade durch den Phorbolester TPA zu einer verstärkten Apobec3G-Expression führt. Dieser Effekt konnte durch den Proteinkinase C (PKC)-Inhibitor Staurosporin und den MEK-Inhibitor U0126 inhibiert werden, wodurch gezeigt wurde, dass die Aktivität der MAP-Kinase ERK für die Verstärkung der Apobec3G-Expression notwendig ist. Eine Phosphorylierung von Apobec3G durch ERK wurde im Kinase-Assay jedoch nicht beobachtet. Dagegen konnte durch radioaktive in-vivo-Markierung nachgewiesen werden, dass es sich bei Apobec3G nicht um ein Phosphoprotein handelt. Neben den Untersuchungen zur Regulation von Apobec3G, konnten neue Erkenntnisse zu den Apobec3G/Vif-Interaktionen gewonnen werden. Durch Koimmunpräzipitationsstudien wurde die physikalische Interaktion von Vif und Apobec3G nachgewiesen. Zudem konnte gezeigt werden, dass in Gegenwart von Vif der Einbau von Apobec3G in die Viruspartikel gehemmt wird. Damit wurden erste Hinweise gefunden, dass Vif neben der Induktion des proteolytischen Abbaus von Apobec3G weitere Strategien anwendet, um die Inkorporation des antiviralen Faktors zu verhindern.
In der vorliegenden Arbeit wurde nachgewiesen, dass bei Krebspatienten Tumorspezifische Gedächtnis T-Zellen im Verlauf einer Tumorerkrankung generiert und erhalten werden. Dies konnte sowohl für einen soliden Tumor, das Mammakarzinom, als auch für eine hämatologische Neoplasie, das Multiple Myelom, verifiziert werden. Dabei konnte zum ersten Mal belegt werden, dass im Verlauf einer MM-Erkrankung MUC-1 als autologes Tumor-assoziiertes Antigen immunologisch erkannt wird und zur Generierung von Gedächtnis T-Zellen mit einer Anreicherung im Knochenmark der Patienten führt. Weiterhin konnte eine Anreicherung TAA-spezifischer Gedächtnis T-Zellen innerhalb der EM Zellpopulation bei Mammakarzinom-Patientinnen demonstriert werden. Die Analyse der Funktionalität und Langlebigkeit von EM und CM T-Zellen im Hinblick auf ihre klinische Relevanz zeigte wesentliche Unterschiede zwischen beiden Gedächtniszell- Populationen. So war eine IFN-gamma Induktion und Proliferation in CM T-Zellen in stärkerem Ausmaß von einer zusätzlichen Costimulation abhängig verglichen zu EM T-Zellen. Außerdem fiel eine Apoptose-Induktion in CM stärker aus als in EM T-Zellen. Unterschiede in Funktion und Viabilität von CM und EM T-Zellen korrelierten dabei mit der Expression des Chemokinrezeptors CCR7. ELISpot-Analysen der Polarisierung induzierter TH-Antworten beim Mammakarzinom ergaben eine große Heterogenität zwischen den Patienten. So exhibierte ein Teil der Patienten dominante TH1-Antworten, während bei einem anderen Teil lediglich TH2- oder toleranzinduzierende IL-10-Antworten induziert werden konnten. Darüber hinaus traten auch gemischt-polarisierte TH-Antworten auf. Eine Analyse ausgewählter Zytokine resultierte in der Detektion immunsuppressiver und immunstimulatorischer Zytokine im Tumorgewebe, wobei die Zytokinprofile interindividuell stark schwankten und kein einheitliches Muster erkennen ließen. Interessanterweise bestand jedoch eine inverse Korrelation zwischen der Induktion einer TH1-Antwort im ELISpot und dem erhöhten Vorkommen immunsuppressiver Zytokine im autologen Tumorgewebe von Mammakarzinom-Patienten. Eine derartige Korrelation impliziert, dass das vorherrschende Milieu der Tumorumgebung bei einer tumorspezifischen Aktivierung einen Einfluss auf infiltrierende Dendritische Zellen und ihre nachfolgende Polarisierung von T-Zellantworten hat. Folglich könnte die Untersuchung eines breiten Spektrums an Zytokinen in der Tumor-Mikroumgebung zu relevanten Zeitpunkten einer Tumorentwicklung, einen wichtigen Beitrag zum Verständnis von Tumor-Immun Interaktionen liefern.
Die Übergangsmetalle Vanadium und Niob wurden in einer neuartigen Thermowaage bzw. mit dem Rapid Thermal Processing (RTP) unter Verwendung von Ammoniak und Stickstoff als Prozessgas nitridiert. In der Thermowaage, die die in situ Aufzeichnung von Massenänderungen während der Reaktion möglich macht, wurde die Nitridierung hauptsächlich an pulverförmigen Proben durchgeführt. Es stellte sich heraus, dass sowohl Temperatur- und Druckerhöhung, als auch eine Verlängerung der Temperzeit zu größeren Massenzunahmen führten. Die Bildung der unterschiedlichen Nitridphasen war aber allein von der Temperatur während des Versuches und dem verwendeten Prozessgas abhängig. Die detektierten Massenzunahmen bei der Erhöhung von Temperzeit und Druck wurden nur von der vermehrten Einlagerung von Stickstoff bzw. Sauerstoff in das Metall verursacht, die keine neue Phasenbildung zur Folge hatte. Sauerstoff wurde in allen getemperten Proben gefunden, was die Untersuchung von dünnen Schichten in der Thermowaage verhinderte, da aufgrund des erhöhten Sauerstoffgehaltes die Schichten vollständig oxidierten. Der Sauerstoff wurde hauptsächlich von dem Glasreaktor geliefert. Ein dort abgelagerter Belag, der sich durch Korrosion der Edelstahlgasleitung gebildet hatte, wirkte vermutlich katalytisch. Aus diesem Grund war die Thermowaage in dieser Konfiguration nicht für Nitridierungsversuche geeignet und konnte ihren eigentlichen Zweck, die genaue Untersuchung des Reaktionsmechanismus mit Hilfe der Massenänderung und der anschließenden massenspektrometrischen Untersuchung des Prozessgases nach der Reaktion, nicht erfüllen. 200 nm und 500 nm Vanadium- und Niob-Schichten wurden im RTP nitridiert. Auch hier konnte man eine Bildung von Oxiden bzw. Oxynitriden beobachten, diese bildeten sich aber durch die Ausdiffusion von Sauerstoff aus dem Substrat in die Metallschicht, was anhand von SNMS- und TEM/EFTEM/EELS-Untersuchungen eindeutig belegt werden konnte. Um dieses Phänomen zu untersuchen wurden Schichten auch auf Saphir-Substrat, welches gegenüber der Ausdiffusion von Sauerstoff inert sein sollte, aufgebracht. Für die beiden verwendeten Metalle wurden unterschiedliche Ergebnisse gefunden. Während bei den Vanadium-Schichten nur aus dem SiO2-Substrat Sauerstoff ausdiffundierte, wurde dies bei den Niob-Schichten bei beiden Substraten festgestellt. Die Temperatur während der Versuche (V: 600 und 700°C; Nb: 800°C) scheint also auch einen Einfluss auf die Ausdiffusion von Sauerstoff zu haben. Dabei zeigt Saphir eine etwas größere Temperatur-Stabilität als SiO2. Ein Einfluss des Prozessgases auf die Reaktion an der Grenzfläche Metall/Substrat konnte nicht nachgewiesen werden. Zwar kam es bei der Verwendung von Wasserstoff zur Bildung von mehr und sauerstoffreicheren Phasen, was dafür spricht, dass die Substrate stärker angegriffen werden, aber auch beim Einsatz von Inert-Gas (N2) wurde eine Ausdiffusion von Sauerstoff aus den Substraten beobachtet. Allerdings wirkte sich die Schichtdicke der Probe auf die Ausdiffusion von Sauerstoff und die Bildung der Oxid-Phase aus. Da von der Oberfläche der Schicht eindiffundierender Stickstoff die Diffusion von Sauerstoff behindert, kann Sauerstoff mit zunehmender Schichtdicke weiter in das Metall vordringen. Bei dünneren Schichten wird er eher aufgestaut und es bilden sich Oxide mit höherem Sauerstoffgehalt. Ein Einfluss der unterschiedlichen Herstellungsverfahren (Elektronenstrahlverdampfung / Magnetronsputtern) für die Ausgangsschichten auf die Ausdiffusion von Sauerstoff aus dem Substrat konnte, trotz der größeren Kristallinität der gesputterten Proben, nicht nachgewiesen werden.
Der Einbau von Übergangsmetallionen in Polymerketten kann zu Materialien mit vielversprechenden optischen, elektronischen oder magnetischen Eigenschaften führen, wie sie auf der Basis konventioneller organischer Polymere nicht zu erzielen sind. Die für metallorganische Makromoleküle charakteristischen Eigenschaften resultieren vor allem aus der Vielfalt der Strukturtypen, die für Metallkomplexe auftreten, und in vielen Fällen aus kooperativen Effekten zwischen den Übergangsmetallzentren eines Polymerstranges. Gezieltes Materialdesign setzt daher neben einem grundlegenden Verständnis der Interaktion zwischen den Metallkomplexfragmenten die Fähigkeit voraus, diese durch geeignete Verknüpfungseinheiten so miteinander zu verbinden, dass Wechselwirkungen zwischen ihnen auftreten. Kooperative Phänomene lassen sich häufig bereits an kurzkettigen Oligomeren beobachten, die daher als Modellsysteme für die entsprechenden Polymere dienen. Vor diesem Hintergrund lag der Schwerpunkt der vorliegenden Arbeit auf der Synthese und Charakterisierung di- und trinuclearer Metallkomplexe. Darüber hinaus wurden aber auch entscheidende Fortschritte in Bezug auf die Synthese metallhaltiger Polymere auf der Basis ausgewählter Ferrocenderivate erzielt. Zur Darstellung der Zielverbindungen wurden sowohl etablierte Verknüpfungs-Konzepte genutzt als auch neue Syntheserouten entwickelt. Als wichtige Startverbindungen wurden die Ferrocenylborane FcBR2 und 1,1‘-fc(BR2)2 [Fc = (C5H5)Fe(C5H4), fc = Fe(C5H4)2, R = Br, H, CR‘3] eingesetzt, da sich deren Borylsubstituenten in vielfältiger Weise zur Verknüpfung der metallorganischen Bausteine nutzen lassen. Aufgrund der Lewis-sauren Eigenschaften der Borylsubstituenten können Ferrocenylborane mit difunktionellen organischen Lewis-Basen wie 4,4‘-Bipyridin oder Pyrazin zu Polymeren verknüpft werden. Um die Anzahl der Metallatome innerhalb derartiger Makromoleküle zu erhöhen, wurden im Rahmen dieser Arbeit erstmals metallorganische Lewis-Basen als Verknüpfungseinheiten eingesetzt. In dieser Hinsicht bieten sich 3,4-Dimethyl-1-phosphaferrocen und 3,3‘,4,4‘-Tetramethyl-1,1‘-diphosphaferrocen sowie Ferrocenyllithium und 1,1‘-Dilithioferrocen an, da in diesen Verbindungen das Lewis-basische Zentrum Bestandteil des Cyclopentadienylrings ist. Im Gegensatz zu Phosphaferrocenen bilden die starken Lewis-Basen Ferrocenyllithium und 1,1‘-Dilithioferrocen mit dem Ferrocenylboran FcBMe2 selbst in Lösung stabile Addukte (z. B. Fc2BMe2Li). Polymerisationsversuche mit den Edukten 1,1‘-(fcBMe2)2 und 1,1‘-Dilithioferrocen führen entgegen den Erwartungen jedoch nicht zu polymerem Material, sondern ergeben das borverbrückte [1.1]Ferrocenophan [{Fe-(C5H4)2}2{BMe2}2]Li2. Die Struktur von [{Fe-(C5H4)2}2{BMe2}2]Li2 im festen Zustand weist als hervorstechendstes Merkmal ein nacktes Lithium-Ion auf, das sich im Zentrum des Käfigs befindet. Dieses supramolekulare Aggregat ist auch in Lösung beständig. Werden jedoch beide Ferroceneinheiten oxidiert, verlässt das Li+-Ion den Makrozyklus, um nach vollständiger Reduktion von [{Fe-(C5H4)2}2{BMe2}2] wieder an seinen ursprünglichen Platz zurückzukehren. Komplementär zum Verknüpfungskonzept über dative Bor-Stickstoff-, Bor-Phosphor- und Bor-Kohlenstoff-Bindungen wurde im Rahmen dieser Arbeit eine Kondensationsreaktion erarbeitet, die auf einfachem Wege zu kovalent verknüpften di- und oligonuclearen Ferrocenkomplexen führt. Bei der Umsetzung von FcBBr2 mit HSiEt3 beobachtet man eine Dimerisierungsreaktion, die unter Bildung von Fc2BBr verläuft. Einer entsprechenden Reaktion lässt sich auch 1,1‘-fc(BBr2)2 unterziehen, womit sich ein Weg zu Poly(ferrocenylenen) eröffnet, in denen die Ferroceneinheiten über dreifach koordiniertes Bar verknüpft sind ([-fcB(R)-]n, R = Br). Weitere Wege zu ferrocenhaltigen Polymeren mit Bar im Polymerrückgrat wurden durch die erfolgreiche Synthese der Ferrocenylborane FcBH2 und 1,1‘-fc(BH2)2 eröffnet, die in Form ihrer Lewis-Säure-Base-Addukte mit Dimethylethylamin [FcBH2 . NMe2Et; 1,1‘-fc(BH2 . NMe2Et)2] oder Dimethylsulfid [FcBH2 . SMe2; 1,1‘-fc(BH2.SMe2)2] isoliert werden konnten. FcBH2 . NMe2Et und FcBH2 . SMe2 erwiesen sich als aktive und selektive Hydroborierungsreagenzien. Durch Umsetzung mit aromatischen Dialkinen werden dadurch konjugierte Polymere zugänglich, welche mit Polyolefinen verwandt sind, in denen einige der Kohlenstoffatome durch Boratome ersetzt wurden. Diese Materialien zeichnen sich durch ausgeprägt pi-Delokalisation aus, die sich über das Bor hinweg erstreckt, und weckten unser Interesse, da Oxidation der Ferrocenyl-Seitenketten eine elektrochemische Modifizierung der Ladungsdichte an den Borzentren erlauben sollte. Gleichzeitig ließen sich auf diese Weise paramagnetische Fe(III)-Ionen in unmittelbarer Nachbarschaft zu einem elektrisch leitfähigen Polymer generieren. Überdies erhält man Polymere des Typs [-fcB(R)-]n nicht nur über die Reaktion von 1,1‘-fc(BBr2)2 mit HSiEt3 (R = Br) sondern auch über die Kondensationsreaktion von 1,1‘-fc(BH2)2, die unter Abspaltung von BH3 verläuft (R = H).
Mit der nichtenzymatischen templatgesteuerten Oligomerisierung von RNA zu Selektionsexperimenten
(2004)
Die vorliegende Dissertation beruht auf der Nichtenzymatischen Templatgesteuerten Oligomerisierung von RNA. Dazu inkubiert man einen farbstoffmarkierten Primer mit komplementären Templaten und aktivierten Monomeren, den 2-Methyl-Phosphorimidazoliden. Die Verlängerung des Primers wurde durch Gelelektrophorese mit anschließender Detektion des Fluoreszenzfarbstoffs nachgewiesen. Eine erfolgreiche Primerverlängerung ist an viele Vorraussetzungen gebunden. Wichtig ist, dass der Duplex in der A-Konformation vorliegt. Deshalb ist es nötig, dass wenigstens der Primer oder das Templat aus RNA besteht. Von großem Vorteil ist, wenn die Basenpaare drei Wasserstoffbrücken ausbilden können. Auch die Stapelwechselwirkung ist ebenso wichtig für eine effiziente Kettenverlängerung, der Einbau von Purinen verläuft besser als der Einbau von Pyrimidinen. In der Arbeit konnte gezeigt werden, dass die Durchführung eines nichtenzymatischen PCR-artigen Experiments möglich ist. Das Verlängerungsprodukt der Hin-Reaktion wurde durch eine präparative Polyacrylamid Gelelektrophorese isoliert. Dieses diente dann als Templat für die Rückreaktion. Das Experiment aus Hin- und Rückreaktion bildete die Grundlage für ein Selektionsexperiment. Die Template wurden dafür um Zufallspositionen erweitert, die zwischen die Primerbindestellen eingefügt wurden. Nach mehrmaligem Durchlaufen des Zyklus aus Hin- und Rückreaktion sollte es sich zeigen, ob sich bestimmte Nucleotide in den Sequenzen angereichert haben. Zur Analyse wurde eine Methode basierend auf einer RP-HPLC entwickelt. Die vollverlängerten Produkte wurden mittels Gelelektrophorese isoliert und durch basische Hydrolyse in Monomere gespalten. Nach anschließender enzymatischer Dephosphorylierung konnte der Anteil der Nucleoside durch RP-HPLC bestimmt werden. Die erste erfolgreiche Anwendung fand diese Methode in der Analyse des Einbaus gegenüber T (U). Hier konkurrieren nämlich D (A) durch Watson/Crick-Paarung und G durch Wobble-Paarung um die Bindestelle. Aus diesem Grund bildeten sich bei Templaten aus C und T und der Inkubation nur mit G-Imidazolid allein die vollverlängerten Produkte zu einem hohen Anteil. Bei Reaktionen mit den Imidazoliden G und D konnte gezeigt werden, dass gegenüber T der Watson/Crick Partner D etwa dreimal häufiger eingebaut wurde als G. Eine weitere wichtige Grundlage für ein Selektionsexperiment bildete die Untersuchung, ob sich gegenüber Zufallspositionen überhaupt eine Kettenverlängerung feststellen lässt. Dazu wurde die Verlängerung unterschiedlicher Primer mit Templaten untersucht, die an einer oder mehreren Stellen Positionen aus [C/T] oder [A/C/G/T] enthielten. Es war deutlich zu sehen, dass die Verlängerung an solchen random-Sequenzen möglich ist. Die besten Ergebnisse wurden erzielt, wenn man entweder nur mit 2-MeImpG allein oder mit 2-MeImpG und 2-MeImpD inkubierte. Die Verwendung aller vier Imidazolide aus C, D, G und U führte zwar auch zu vollverlängerten Produkten, ihr Anteil war aber deutlich geringer. Eine andere wichtige Aufgabe dieser Dissertation war die Aufklärung der Ursache für die kritische Länge der Template. Es konnte gezeigt werden, dass die Bildung von G-Quadrupelsträngen nicht der Grund ist, der den reibungslosen Einbau an längeren "homoC" Templaten verhindert. Zusätze von NaCl oder LiCl beeinflussten die Effizienz dieser Reaktionen kaum. Gute Resultate wurden bei der Verlängerung an Homopyrimidin-Templaten, die aus C und T bestanden, erzielt. Das vollverlängerte Produkt bildete sich bei der Verwendung von 2-MeImpG und 2-MeImpD in hohen Ausbeuten. Interessante Resultate ergaben sich im Fall des Einbaus von C an "homoG" Templaten. Die besten Ergebnisse wurden erzielt, wenn völlig auf Na+-Ionen verzichtet wurde. Die Verwendung von Li-Imidazoliden, die auch in höherer Konzentration eingesetzt werden konnten, steigerte die Effizienz dieser Reaktionen deutlich. Durch das reduzierte stacking liefen alle Reaktionen allerdings langsamer und unvollständiger ab als beim Einbau von G an "homoC" Templaten. Die Stabilisierung des Duplexes durch stacking ist also entscheidend für erfolgreiche Primerverlängerungen. Überraschend schlechte Ergebnisse waren zu beobachten, wenn die Template gleichzeitig aus G und C aufgebaut waren. Die vollständig verlängerten Produkte wurden zu einem sehr geringen Anteil gebildet. Zusätzlich zum geringeren stacking der Pyrimidine, wurden Unregelmäßigkeiten in der Doppelhelixstruktur, die durch das abwechselnde Auftreten von Purinen und Pyrimidinen verursacht worden sind, als Ursache ausgemacht. Als neue Vorrausetzung für eine effiziente Kettenverlängerung hat sich also das Vorliegen einer regelmäßigen Doppelhelixstruktur herausgestellt.
Für bestimmte Gentherapiestrategien bieten sich retrovirale Vektoren auf Grund der stabilen Integration der von ihnen übertragenen genetische Information an. Mit bisher vorhandenen retro- und lentiviralen Vektorsystemen kann jedoch kein effizienter Gentransfer in ruhende primäre Zellen wie unstimulierte PBMC oder undifferenzierte Monozyten erreicht werden. Ziel dieser Arbeit war es daher, retrovirale Vektorsysteme zu etablieren, die naive primäre Zellen effizient transduzieren können. Zunächst wurden HIV-1-Vektoren mit den Hüllproteinen (Env) des amphotropen MLV, des MLV-Klons 10A1, des felinen endogenen Retrovirus RD114 und des VSV sowie einem modifizierten GaLV-Env pseudotypisiert, um ihre Eignung für die Transduktion von primären T-Lymphozyten zu untersuchen. Mit diesen Vektoren konnten primäre stimulierte humane T-Lymphozyten mit ähnlichen Transduktionsraten von ca. 20% transduziert werden. Im Gegensatz dazu wurden mit MLV-Vektoren, die mit den gleichen Hüllproteinen pseudotypisiert waren, bei gleichem Transduktionsprotokoll untereinander deutlich unterschiedliche Transduktionsraten zwischen 1 - 45% erreicht. Dieser unerwartete Unterschied ist möglicherweise auf eine längere, dabei untereinander ähnliche Halbwertszeit der HIV- 1-abgeleiteten Vektoren zurückzuführen. Unstimulierte PBMC konnten allerdings unabhängig vom verwendeten Hüllprotein weder von den MLV- noch von den HIV-1-abgeleiteten Vektoren transduziert werden. Demgegenüber hatte sich in meiner vorangegangenen Diplomarbeit die Transduzierbarkeit ruhender humaner Zellen durch Vektoren angedeutet, die von dem akut pathogenen simianen Immundefizienzvirus SIVsmmPBj1.9 abgeleitet waren. In der hier vorgestellten Arbeit zeigten die PBj-Vektoren, die nur im env-Gen eine Deletion aufwiesen, dass sie auch in der G0-Phase des Zellzyklus arretierte GHOST-Indikatorzellen oder diploide Fibroblasten effizient und unabhängig von dem zur Pseudotypisierung verwendeten Hüllprotein transduzieren können. Die korrespondierenden HIV-1-Vektoren waren dazu nicht in der Lage. Auch PBj- und HIV-1-Vektoren, die egfp als Markergen transferieren, zeigten das gleiche Transduktionsverhalten. Die egfp-transferierenden SIVsmmPBj-Vektoren konnten schließlich im Unterschied zu den entsprechenden HIV-1-Vektoren auch frisch isolierte primäre humane Monozyten sehr effizient transduzieren. Mit Nef-deletierten Mutanten wurde schließlich gezeigt, dass die beschriebenen Fähigkeiten PBj-abgeleiteter Vektoren nicht vom viralen Nef-Protein abhängen, obwohl dieses regulatorische Gen die pathogenen Eigenschaften und die Replikationsfähigkeit von SIVsmmPBj-Viren bestimmt. Für alle mit SIVsmmPBj-abgeleiteten Vektoren transduzierten Zellen konnte in der vorliegenden Arbeit ferner die chromosomale Integration des Transfervektors gezeigt werden. Schließlich gelang die Konstruktion eines ersten 3-Plasmid-Vektorsystems, mit dem transduktionsfähige Vektorpartikel generiert werden können. Mit SIVsmmPBj-abgeleiteten Vektoren steht somit ein neues retrovirales Vektorsystem zur Verfügung, mit dem auch ruhende primäre Zellen stabil genetisch modifiziert werden können. Durch die Erschließung dieser wichtigen Zielzellen werden die Perspektiven einer dauerhaften Gentherapie in vitro und in vivo beträchtlich erweitert.
NMDA-Rezeptoren sind als ionotrope Glutamatrezeptoren (iGluRs) an der Signalübertragung durch den wichtigen Neurotransmitter L-Glutamat beteiligt. Vor allem aufgrund ihrer Bedeutung für das Phänomen der neuronalen Plastizität sind NMDA-Rezeptoren außerordentlich gründlich untersucht worden. Dennoch sind auch heute noch zentrale Fragen zu ihrer Funktionsweise ungeklärt, darunter auch diejenige, wie auf molekularer Ebene die Umsetzung der Glutamatbindung in die Öffnung des Ionenkanals erfolgt. Publizierte Kristallstrukturen der Liganden-bindungsdomänen zweier iGluRs haben die Grundlage für ein Modell der ligandeninduzierten und der Kanalöffnung vorausgehenden Vorgänge in der Bindungsdomäne geschaffen. Diesem zufolge schließt sich die aus zwei Teildomänen bestehende Bindungsdomäne venusfliegenfallenartig um den Liganden und die dabei entstehende mechanische Spannung führt zur Öffnung des Ionenkanals. Dieses Modell wurde in der vorliegenden Arbeit überprüft. Hierzu wurden verschiedene in der Ligandenbindungsdomäne punktmutierte NR1/NR2A-Rezeptoren heterolog in Säugerzellen exprimiert und durch Glutamat hervorgerufene Gesamtzellströme elektrophysiologisch gemessen. Mittels kinetischer Auswertung wurden dann Aminosäurereste in der Bindungsdomäne identifiziert, die einen Beitrag zur Kanalöffnung leisten. Die notwendige Schnelligkeit der Ligandenzugabe wurde dabei durch dessen photochemische Freisetzung aus einer maskierten und dadurch inaktiven Vorstufe (caged compound) erreicht. Die Ergebnisse bestätigen das Modell der Kopplung der Kanalöffnung an das Schließen der Bindungsdomäne und erweitern das Verständnis der genauen zeitlichen Abfolge der ligandeninduzierten Konformationsänderungen in der Bindungsdomäne. Intramolekulare Wechselwirkungen zwischen den Teildomänen S1 und S2 spielen demnach erst relativ spät im Aktivierungsprozeß eine Rolle und dienen vor allem der Stabilisierung des geschlossenen Zustandes der Bindungsdomäne und damit des offenen Ionenkanals.
Isolierung und Charakterisierung der Atmungsketten-Superkomplexe aus Paracoccus denitrificans
(2004)
Isolierung von Atmungsketten-Superkomplexen aus Paracoccus denitrificans: Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurde ein Reinigungsprotokoll zur Präparation der Atmungskettenkomplexe I, III und IV des Gram-negativen, fakultativ anaeroben Bodenbakteriums Paracoccus denitrificans in Form eines NADH Oxidase Komplexes erstellt. Bisher konnten stabile Superkomplexe bakterielle Atmungskettenkomplexe nur in Gestalt einer Chinol Oxidase, bestehend aus den Komplexen III (Ubichinol:Cytochrom c Oxidoreduktase) und IV (Cytochrom c Oxidase), isoliert werden (Berry, et al., 1985). Jedoch enthielten diese Assemblierungen keinen Komplex I (NADH: Ubichinon Oxidoreduktase). Dies ist die erste chromatographische Isolierung eines kompletten "Respirasoms" aus Paracoccus denitrificans. Unter der Verwendung des milden Detergenz Digitonin zur Solubilisierung von Paracoccus denitrificans Membranen gefolgt von zwei chromatographischen Reinigungsschritten, der Hydroxylapatit-Chromatographie und der Gelfiltration, konnte eine NADH Oxidase, bestehend aus den Komplexen I, III und IV in einer 1:4:4 Stöchiometrie isoliert werden. Neben der Isolierung der NADH Oxidase konnten weitere kleine Superkomplexe identifiziert werden, die aus vier Komplex III und vier Komplex IV (III4IV4) sowie vier Komplex III und zwei Komplex IV (III4IV2) assoziiert waren. Charakterisierung der Superkomplexe aus Paracoccus denitrificans: Die isolierten Atmungskettenkomplexe wurden zur Charakterisierung bezüglich ihrer Funktion, enzymatischen Aktivität, Stöchiometrie und Untereinheiten-Zusammensetzung aus Paracoccus denitrificans Wildtyp-Membranen analysiert. Proben aller Präparationsstufen wurden parallel zur BN-Gelelektrophorese und für enzymatische Einzel- und kombinierte Aktivitäten der Komplexe I-IV eingesetzt. Mittels BN-Gelelektrophorese konnten die apparenten Massen der Komplexe bestimmt werden. Im folgenden denaturierenden SDS-Gel wurde die Untereinheiten-Zusammensetzung der Superkomplexe durch Immunodetektion mit Antikörpern gegen die Komplexe I, III, IV und Cytochrom c552 analysiert. Abschließend konnte nach der Gelfiltration festgestellt werden, das Komplex II eindeutig nicht Teil des Superkomplexes (I1III4IV4) war. Die Stöchiometrie des Superkomplexes a wurde mit Hilfe der fluorimetrischen Bestimmung von FMN (Flavin) als Marker für Komplex I und mittels Pyridin Hämochromogen Spektren für Häm a, b und c bestimmt. Da Komplex III physiologisch als Dimer vorliegt (Mayer et al. 2002), müsste die Stöchiometrie der funktionellen Einheit des Superkomplex a folgendermaßen lauten: I1 (III2)2 IV4. In diesem Fall diente der Vergleich der Wechselzahl einzelner Präparationsstufen als Maß der Verunreinigung der ergab, dass Fremdkomplexe mit Flavin und Cytochrom b im Ausgangsmaterial der Präparation vorhanden waren. Nur die Wechselzahl des Komplexes IV blieb während der Präparation konstant. Um den Gehalt an Komplex I und die Qualität der Präparation abzuschätzen, wurde das Verhältnis der HAR zu dNADH:DBQ Oxidoreduktase Aktivität in Membranen und isoliertem Superkomplex a bestimmt. Es war während der Präparation konstant. Die Bestimmung des Phospholipidgehalts aus isoliertem Superkomplex a im Vergleich zu P. denitrificans Membranen ergab eine Abnahme von 980 ± 80 nmol PL / mg Protein in Membranen auf 290 ± 10 nmol / mg Protein in isoliertem Superkomplex a, wohingegen der Ubichinongehalt von 2,7 ± 0,3 nmol / mg auf 6,7 ± 0,8 nmol / mg in isolierter Oxidase anstieg. Katalytische Aktivitäten von P. denitrificans Membranen des Parentalstamms und verschiedener Mutantenstämme zeigten, dass die Inaktivierung des Gens für fest gebundenes Cytochrom c552 die Bildung eines Superkomplexes nicht verhindern konnte, was ein Hinweis dafür ist, dass dieses Elektronen Carrier Protein nicht essentiell für die strukturelle Verbindung zwischen den Komplexen III und KIV ist. Komplex I Aktivität wurde ebenfalls in Membranen von Mutanten-Stämmen, denen Komplex III oder Komplex IV fehlte, gefunden. Jedoch enthielten diese Stämme keinen assemblierten Komplex I, sondern nur dissoziierte Untereinheiten des Komplexes. Trotz der Verwendung der selben Protokolle für die elektrophoretische Trennung und chromatographische Isolierung wie für Superkomplexe aus dem Wildtyp-Stamm, führte die Isolierung aus Mutantenstämmen, denen Komplex III oder IV fehlte, zum vollständigen Verlust der NADH:DBQ Oxidoreduktaseaktivität. Dies weist darauf hin, dass Paracoccus denitrificans Komplex I durch die Assemblierung in Form eines NADH Oxidase Superkomplex stabilisiert wird. Zusätzlich zum Substrat Channeling scheint die strukturelle Stabilisierung von Membran Protein Komplexen die Hauptaufgabe von respiratorischen Superkomplexen zu sein.
In der vorliegenden Arbeit wurden Sekundärmetabolite aus marinen Wirbellosen der Nordsee, arktischen und antarktischen Gewässern untersucht. Ausgehend von Untersuchungen zur marinen chemischen Ökologie von Haliclona viscosa und physiologischen Effekten auf die Kieme der Krabbe Carcinus maenas wurden verschiedene Alkaloide und Cholesterole isoliert (siehe Abbildung 25). Vier unbekannte Alkaloide konnten erstmalig aus Haliclona viscosa isoliert werden. Sie leiten sich von 3-Alkylpyridin-Alkaloiden ab, die für Schwämme der Gattung Haliclona charakteristisch sind. Die Strukturaufklärung erfolgte durch den Einsatz von NMRSpektroskopie und Massenspektrometrie. Die symmetrischen bzw. pseudo-symmetrischen Eigenschaften erschwerten im besonderen Maße die Strukturaufklärung. Die Isolation von Haliclamin C und D sowie Viscosalin ermöglichte es, daß für sie ökologische Funktionen nachgewiesen werden konnten [33, 34], die dem Schwamm Haliclona viscosa in seinem Habitat Vorteile im Kampf um das Überleben bringen. Viscosamin ist das erste natürlich vorkommende zyklische Trimer eines 3-Alkylpyridin-Alkaloids, daß aus einer marinen Umgebung stammt. Es schließt eine Lücke zwischen monomeren, dimeren und polymeren 3-Alkylpyridin-Alkaloiden. Aus dem bisher noch nicht chemisch untersuchten Borstenwurm Laetmonice producta, konnte Homarin isoliert werden [81-84]. Homarin zeigte einen bisher unbekannten physiologischen Effekt auf die Kieme eines potentiellen Räubers [35]. Ob Homarin aufgrund seiner physiologischen Wirkung den Borstenwurm vor z.B. räuberischen Krebstieren schützen kann, muß noch mit weiteren Versuchen geklärt werden. Enthält 3 Art. aus versch. Zeitschr.: 1 Christian A. Volk and Matthias Köck: Viscosamine: The First Naturally Occuring Trimeric 3-Alkyl Pyridinium Alkaloid ; 2 Christian A. Volk, Heike Lippert, Ellen Lichte, and Matthias Köck: Two New Haliclamines from the Arctic Sponge Haliclona viscosa, European Journal of Organic Chemistry 2004, im Druck ; 3 Christian A. Volk and Matthias Köck: Viscosaline: New 3-Alkyl Pyridinium Alkaloid from the Artic Sponge Haliclona viscosa, Organic & Biomolecular Chemistry 2004, im Druck
Im Laufe der letzten Jahre hat sich die Aufmerksamkeit auf die Entwicklung von neuen RNA-bindenden Molekülen gerichtet. Grund dafür waren neue Erkenntnisse über die strukturelle und funktionelle Komplexität der RNA. So spielen spezifische RNA-Protein-Wechselwirkungen eine essentielle Rolle bei regulatorischen Prozessen. Die Spezifität dieser Interaktionen wird durch die dreidimensionale RNA-Struktur bestimmt. Somit bieten diese Wechselwirkungen ein attraktives Angriffsziel für die Suche nach niedermolekularen Substanzen, die in die regulatorischen Prozesse pathogener Organismen eingreifen. So gibt es im Replikationszyklus des HI-Virus mehrere essentielle Schritte, die der Interaktion zwischen charakteristischen, viralen RNA-Strukturen und der viralen Proteine bedürfen. Ein prominentes Beispiel ist die Verpackung der viralen RNA. Es handelt sich um einen hochspezifischen Prozess, bei dem aus einer Vielzahl von zellulären, viralen, gespleißten und ungespleißten RNA-Fragmenten, spezifisch die virale genomische RNA in die neu entstehende Partikel verpackt wird. Die Spezifität der Verpackung basiert auf der Erkennung der dreidimensionalen ps-Verpackungsstruktur am 5´-Ende der ungespleißten, viralen RNA durch die NCp7-Domäne des p55Gag- Vorläuferproteins. Die NCp7-Domäne ist durch zwei Zinkfingermotive, die in allen Onko- und Lentiviren mit Ausnahme der Spumaviren konserviert sind, gekennzeichnet. Durch die zentrale Rolle im HIV-1 Replikationszyklus bietet die ps-NCp7-Interaktion ein potentielles Angriffziel für antivirale Interventionen. Das langfristige Ziel des Projektes war die Identifizierung von Peptidliganden für das HIV-1 ps-Signal mittels der Phage-Display-Methode, welche die Basis für die Entwicklung antiviraler Moleküle liefern sollen. Die Methode des Phage-Display basiert auf der Affinitätsselektion von Peptiden, die als Fusionsproteine mit dem Hüllprotein an der Oberfläche eines Bakteriophagen exprimiert werden. Sie wurde sehr erfolgreich für die Selektion von Peptidliganden für Antikörper oder andere Proteindomänen eingesetzt. Für RNA-Targets gibt es nur gelegentliche Hinweise. Im Vordergrund des Projektes standen strukturelle Erkennungsmerkmale der Ligand-RNAWechselwirkung. Zur Identifizierung von Peptidliganden für das ps-Verpackungssignal sowie deren Teilelement SL3, das ebenfalls Verpackungsaktivitäten aufweist, wurden kommerzielle Phagen-Banken mit zufälliger Aminosäuresequenz eingesetzt. Im Rahmen des ersten Teilabschnitts konnten Phagen selektiert werden, die spezifisch an die Targetstrukturen gebunden haben und die Grundlage für die Ableitung von Peptidmotiven bildeten. Insgesamt konnten neun Motive abgeleitet werden, darunter das tryptophanreiche HXWPWW-Motiv, das Aminosäurehomologien zum nativen Liganden, dem NCp7-Protein, zeigte. Die Spezifität zur Ziel-RNA wurde mittels ELISA, CD-Spektroskopie und Peptidfilter-Bindungsstudien analysiert. Für die tryptophanreichen Peptide wurde die Affinität zur ps- und SL3-RNA ermittelt. Sie lag für das HWWPWWPeptid bei ca. 25 ± 2µM zur ps-RNA und bei ca. 34 ± 2µM zur SL3, also deutlich unter der Affinität des NCp7 (ca. 30nM). Entsprechend ließ sich das HWWPWW-Peptid in einem Kompetitions-ELISA mit ps-RNA als Target durch das native p55Gag- und NCp7-Protein, jedoch nicht durch ein unrelevantes RNA-bindendes Protein, verdrängen. Anschließend wurden mittels der CDspektroskopischen Mutationsanalyse die Bindungseigenschaften der Peptide optimiert, so dass zwei weitere Liganden, das HWWAWW- und HAWPWWPeptid, als potentielle ps-Liganden ermittelt werden konnten. Im zweiten Teil der Arbeit erfolgte die funktionelle Analyse der identifizierten Peptide hinsichtlich ihrer inhibitorischen Eigenschaften. Dazu wurden in HR´YFP-Zellen Pseudoviren, die das verpackbare Konstrukt ps-Yfp, sowie HIV-1 Gag-Pol und das Env des VSV-G enthielten, in Gegenwart des ps-bindenden Peptides, das als Rfp-Vpr-Fusionprotein vorlag, generiert. Eine Hemmung der Peptide auf die Verpackung der viralen RNA sollte dadurch messbar sein, dass die produzierten Pseudoviren weniger von der verpackbaren ps-Yfp-RNA enthielten als die Kontrollviren, die in Gegenwart eines Kontrollpeptids generiert wurden. Die Menge der Virus-RNA in den Partikeln wurde mittels einer quantitativen PCR-Methode, der Real-time-PCR, bestimmt. Einen hemmenden Einfluss auf die Verpackung der ps-Yfp-RNA und somit eine Inhibition der ps-NCp7-Interaktion hatte das HWWAWW-Peptid. Durch den Einsatz von 3 µg der HWWAWW-Rfp-Vpr-Vektors konnte die RNA-Menge um das fast 4000-fache im Vergleich zum Kontrollansatz reduziert werden.
Die Reinigung von Siliciumoberflächen verbraucht große Mengen von hochreinen und teueren Chemikalien. Komplexbildner dienen der Maskierung von Metallionen in den Reinigungschemikalien mit dem Ziel, die vorhandenen Reinigungsverfahren zu vereinfachen, den Reinigungsvorgang zu beschleunigen und Chemikalien und Kosten zu sparen. Zur Beurteilung, ob ein Komplexbildner für diese Anwendung geeignet ist, bedarf es eines analytischen Verfahrens zur Bestimmung seiner Stabilität in Halbleitersilicium-Reinigungsbädern. In der vorliegenden Arbeit sollte untersucht werden ob die HPLC für diese Aufgabe eingesetzt werden kann. Zusätzlich sollte versucht werden, über die Detektion und die Identifizierung von Zersetzungsprodukten Informationen über die Zersetzungsreaktion zu gewinnen. Es wurden Untersuchungen zur Komplexbildnerstabilität in verschiedenen Reinigungsbädern und in 30% H2O2 durchgeführt. Vier strukturell unterschiedliche Komplexbildner wurden untersucht. Pyrinan (N, N´, N´´-Tris (3-hydroxy-6-methyl-2-pyridylmethyl) 1, 4, 7-Triazacyclononan), ABS-BAMTPH (N,N’,N’’-tris [2-(N-hydroxycarbamoyl) propyl]-1,3,5-benzentricarboxamid), Tiron (Dinatrium-1,2-Dihydroxybenzen-3,5-Disulfonsäure) und die Pyridinone (3-Hydroxy-4(1H)-pyridinone). Bei den Pyridinonen handelte es sich um eine Gruppe von Komplexbildnern mit dem gleichen Grundgerüst, welches mit unterschiedlichen Substituenten verbunden war. Das Verhalten der Pyridinone in 30% H2O2 zeigt, dass es möglich ist mit relativ geringen Modifikationen der Molekülstruktur die Stabilität dieser Komplexbildner gegen Zersetzung zu steigern. Die auftretenden Zersetzungsprodukte wurden mit HPLC-MS untersucht. Die Beobachtung, dass in 30% H2O2 und in dem Reinigungsbad APM (H2O2/NH3/H2O-Gemisch) jeweils identische Zersetzungsprodukte auftraten deutet darauf hin, dass in beiden Fällen eine Oxidation durch H2O2 stattfindet. Die in 30% H2O2 beständigsten Komplexbildner waren ESEHP (Sulfoniumsubstituent) und BMHP (Alkylsubstituent). In APM war ECEHP am stabilsten (Carboxylsubstituent). Tiron wurde nur in 30% H2O2 untersucht. Seine Stabilität wird in dieser Lösung nur von 2 der 13 untersuchten Pyridinone, ESEHP und BMHP, übertroffen. Es wurden keine Zersetzungsprodukte detektiert. ABS-BAMTPH hingegen wurde nur in APM untersucht. In APM erwies sich ABS-BAMTPH als der am wenigsten stabile von allen untersuchten Komplexbildnern. Die Brauchbarkeit von ABS-BAMTPH wurde zusätzlich durch einen hohen Anteil an Nebenprodukten eingeschränkt, die bei der Synthese des Komplexbildners entstanden waren. Die Nebenprodukte konnten mittels HPLC-MS und Kenntnis des Syntheseweges identifiziert werden. Über die Zersetzungsreaktion(en) des Pyrinan konnte mit Hilfe von HPLC-MS und MS/MS eine Reihe von Informationen gewonnen werden. Eine Abfolge von Reaktionen wird zur Erklärung der beobachteten Zersetzung vorgeschlagen. Alle Reaktionen laufen an den 3 tertiären Amin-Stickstoffatomen des Pyrinans ab. Diese stellen den Schwachpunkt der Pyrinanstruktur dar. Die Bildung von Aminoxiden leitet die Zersetzung ein. Die Aminoxide reagieren über eine Meisenheimer-Umlagerung weiter. Eine komplexierende Wirkung der Zersetzungsprodukte kann aufgrund der beobachteten Stabilisierung des H2O2 gegen die durch Übergangsmetallionen katalysierte Disproportionierung angenommen werden. Die vorliegende Arbeit zeigt, das die HPLC zur Untersuchung der Stabilität von Komplexbildnern in Halbleiter-Reinigungschemikalien geeignet ist. Die HPLC-MS und die MS/MS lieferten zusätzliche Informationen über Zersetzungsprodukte und die stattfindenden Zersetzungsreaktionen. Die HPLC-MS ist darin den bisher in der Halbleiterindustrie für diese Fragestellung benutzten analytischen Methoden überlegen.
Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurden auf dem Gebiet reaktiver Silicium-Spezies folgende apparative und experimentelle Forschungsergebnisse erzielt: Zunächst wurde eine Hochtemperatur-Pyrolyse Anlage entworfen, die mit Hilfe von Hochvakuum-Bedingungen (p< 5x10 hoch -9 mbar) Verdünnungseffekte simuliert, um die in der Gasphase erzeugten Moleküle unter solchen Bedingungen zu studieren, bei denen sie keine Folgereaktionen mit weiteren Partnern eingehen können. In die Apparatur integriert wurde ein Ofen (Tmax ungefähr gleich 1200°C) für die Pyrolyse von Stoffgemischen sowie zur Analyse des erzeugten Molekularstrahls ein Quadrupol-Massenspektrometer (0-300 amu, EI-Quelle, SEV). Es wurden Precursoren synthetisiert, die durch Thermolyse infolge intramolekularer Umlagerungen und Abspaltungen definierter Abgangsgruppen Si=X-Doppelbindungen (X= O, S) ausbilden. Diese Precursoren und ihre Pyrolyseprodukte wurden sowohl in der neuen Anlage als auch mittels eines vorhandenen PE-Spektrometers charakterisiert. Parallel zu den Synthesen wurden quantenmechanische Berechnungen an den Produkten der Pyrolysereaktionen durchgeführt, um ihre Eigenschaften, wie z.B. die Orbitalenergien und ihre Strukturparameter, zu bestimmen. Die Ergebnisse sollten die Interpretation der spektroskopischen Untersuchungen (PE und MS) unterstützen. Im zweiten Teil der Arbeit wurden Fragestellungen bearbeitet, die in anderen Teilprojekten der Arbeitsgruppe von essentiellem Interesse sind. Dabei wurden Lösungen zu Fragestellungen der direkten Si-C-Knüpfung und von Silylen-Reaktionen erarbeitet. Eine Versuchsreihe, die durchgeführt wurde, beschäftigte sich mit den Hochtemperaturreaktionen von SiCl4 und SiF4. Die flüchtigen Ausgangssubstanzen wurden im Pyrolyseofen bei ansteigenden Temperaturen mit pulverförmigem elementarem Silicium oder SiO umgesetzt. Hierbei wurden die Bildungsbedingungen von Dihalogensilylenen in der Gasphase optimiert. In einer weiteren Fragestellung wurden die Thermolyseeigenschaften von Si und SiO untersucht. Beide Feststoffe können ab einer Temperatur von ca. 1000°C und einem Druck von 2x10 hoch -6 mbar atomar bzw. molekular in die Gasphase überführt werden. Dort reagieren sie mit Halogensilanen unter Bildung von Silylenen und Chlorsilanen. Weiterhin wurde eine Disproportionierung von SiO zu Silicium und SiO2 unter hohen Temperaturen beobachtet; konsequenterweise wird dabei Sauerstoff freigesetzt. Weiterhin wurde versucht, die Produkte der Halogensilan-Pyrolyse mit Oxidationsmitteln wie Ethylenoxid zur Reaktion zu bringen. Zuletzt wurden Hydrolyse-Versuche mit SiCl4/SiF4 bzw. :SiCl2/:SiF2 und Wasser untersucht.
Das humane Zytomegalievirus (HCMV) gehört zur Familie der beta-Herpesviridae. Bis zu 80% menschlichen Bevölkerung sind weltweit mit dem Virus infiziert. Nach einer meist asymptotischen Erstinfektion persistiert HCMV lebenslang in seinem Wirtsorganismus. Im Laufe der Evolution wurden von einigen Herpesviren verschiedene Strategien entwickelt, um der Antigenprozessierung und damit der zellulären Immunantwort zu entgehen. Das HCMV-Protein US6 blockiert die Antigenpräsentation via MHC I. US6 ist ein ER-ständiges Typ I Transmembranglykoprotein bestehend aus einer Signalsequenz, einer ER-luminalen Domäne, einer Transmembranhelix und einem kurzen zytoplasmatischen C-Terminus. US6 inhibiert den TAP-abhängigen Peptidtransport aus dem Zytoplasma in das ER-Lumen. Im Rahmen dieser Arbeit wurde die ER-luminale Domäne von US6 bestehend aus der Primärsequenz 20-146 heterolog in E. coli exprimiert und aus inclusion bodies rückgefaltet. Das rückgefaltete Protein erwies sich als Monomer (15,6 kDa). Die in der ER-luminalen Domäne befindlichen acht Cysteine bilden ein intramolekulares Netzwerk aus vier Disulfidbrücken. Zur Aufklärung des molekularen Inhibitionsmechanismus von US6(20-146) wurden verschiedene in vitro TAP-Funktions-Assays angewendet. Die Bindung von US6 an die ER-luminalen Bereiche von TAP blockiert die ATP-Bindung in den zytoplasmatischen NBD des Transporters. Die Peptid- und ADP-Bindung von TAP ist nicht beeinflusst, durch die Inhibition der ATP-Bindung wird jedoch die Peptid-induzierte ATP-Hydrolyse unterbunden. Für die Inhibitionsreaktion konnte ein halbmaximaler Inhibitionskoeffizient (IC50) von 1 µM ermittelt werden. Für die inhibitorische Aktivität von US6 sind die C-terminalen Aminosäuren 126-139 der ER-luminalen Domäne von US6 verantwortlich. Die innerhalb dieser Region befindlichen Aminosäuren Cys127, Cys129, D130, W134 und R138 wurden gegen Serin bzw. Alanin ersetzt. Dies hatte keine Auswirkung auf die Aktivität von US6(20-146). Auch ist der N-Terminus von US6 nicht essentiell für die Aktivität.
An den Folgen der HIV-Infektion sind bisher mehr als 15 Millionen Menschen gestorben und die Zahl der Neuinfektionen wächst ständig. Nach Einführung der hochaktiven antiretroviralen Kombinationstherapie (HAART) 1995 konnte die HIV-Replikation im Patienten unterdrückt und der Verlauf der Krankheit verzögert werden. Aber die Bildung resistenter HIV-Stämme während der Therapie und die hohe Toxizität der Medikamente limitieren diese Erfolge. Einen neuen Therapieansatz bietet die genetische Modifikation von T-Lymphozyten zur "intrazellulären Immunisierung" der Zielzellen von HIV. Dabei werden die Zellen mit einem retroviralen Vektor transduziert und exprimieren ein antivirales Gen, das sie vor der HIV-Infektion schützt. In Vorarbeiten der Arbeitsgruppe von Laer wurde der retrovirale Vektor M87- Ineo entwickelt, der die Expression des membranverankerten Fusionsinhibitors C36/T20 auf der Zelloberfläche ermöglicht. Durch das Peptid sind die Zielzellen effizient vor der Infektion mit HIV geschützt (Hildinger et al., 2001). Das therapeutische Gen von M87-Ineo besteht aus dem Signalpeptid von LNGFR für die Translokation in das ER, dem inhibitorischen Peptid C36/T20, das von HIV-1 gp41 abgleitet ist, einem flexiblen Linker sowie aus der Transmembrandomäne von LNGFR für die Verankerung in der Plasmamembran. In der vorliegenden Arbeit wurde dieser retrovirale Vektor erfolgreich für die klinische Applikation zur Gentherapie der HIV-Infektion optimiert. Ziel war es, die potentielle Immunogenität des exprimierten Peptides zu minimieren, die Expression zu erhöhen sowie der Resistenzbildung entgegenzuwirken. Der Linker im Basiskonstrukt M87-Ineo ist abgeleitet aus dem Gelenk des murinen Antikörpers von IgG2 und verleiht dem Hemmpeptid Flexibilität. Um die potentielle Immunogenität des exprimierten Peptides zu reduzieren, wurde der Linker des murinen Antikörpers IgG2 durch Gelenke ("Hinge") von humanen Antikörpern der IgG-Klasse ersetzt. Das Konstrukt mit der humanen "Hinge" von IgG2 exprimierte genauso hoch wie das Basiskonstrukt und hemmte mindestens so effizient die HIV-Replikation. Durch die N-terminale Verlängerung des C-Peptids um 10 Aminosäuren konnte das Risiko der Resistenzbildung minimiert werden. Das verlängerte C-Peptid war in der Lage, HIV-Hüllproteine zu hemmen, die gegen das C36/T20-Peptid resistent sind. Das optimierte Peptid von M87o bestand somit aus dem Membrananker von trunkiertem CD34, dem Linker von humanem IgG2 sowie aus dem verlängerten C-Peptid (C46). Weiterhin wurde ohne Verlust der Expression oder Hemmwirkung des membranverankerten C-Peptids ein RNAElement (RRE decoy) erfolgreich als weiteres Hemmprinzip in den Vektor eingefügt, um die Bildung resistenter HIV-Stämme zu unterbinden. Durch Einsatz eines optimierten Leaderelementes im retroviralen Vektor konnte die Expression des inhibitorischen Peptides mehr als verzehnfacht werden. Damit konnte das Peptid und dessen Hemmung erstmals auch in primären Zellen nachgewiesen werden. Der Vergleich zwischen dem Basiskonstrukt M87-Ineo und dem optimierten Konstrukt M87o-RRE-Ineo zeigte, dass die erhöhte Expression auch mit einer wesentlich verbesserten Hemmwirkung einherging. In Zell-Zellfusionsassays wurde außerdem nachgewiesen, dass die Wirkung des C-Peptids auf der Hemmung des Viruseintritts von HIV in die Zelle beruht. Für die klinische Applikation wurde der Vektor M87o-RRE konstruiert, der die optimalen Vektorelemente und Peptidmodule enthielt, aber aus dem das Neomycin-Resistenzgen entfernt wurde. Dies führte zu einer nochmals höheren Expression des C-Peptids sowie zur weiteren Verminderung der Immunogenität des retroviralen Vektors. Das Markergen wurde ohnehin nicht mehr benötigt, da die genetisch modifizierten Zellen aufgrund der hohen Transgenexpression einfach detektiert werden konnten. Der optimierte Vektor M87o-RRE hemmte die HIV-Replikation so effizient, dass bisher keine resistenten Stämme isoliert werden konnten. Bei Toxizitätsstudien in Maus und Rhesusmacaquen konnten keine Nebenwirkungen oder Immunogenität beobachtet werden. Durch die erfolgreiche Optimierung steht nun für die klinische Studie der Phase I der bestmögliche retrovirale Vektor zur Verfügung.
Der CD95 Ligand (CD95L, FasL) ist ein Mitglied der Tumor-Nekrose-Faktor(TNF)- Superfamilie und ist in der Lage, Apoptose oder -unter bestimmten Bedingungen- Proliferation in CD95 Rezeptor-positiven Zellen auszulösen. Zusätzlich überträgt der CD95 Ligand aber auch als Rezeptor Signale in die ligandentragende Zelle, ein Phänomen, das auch bei anderen TNF-Familienmitgliedern beobachtet und als "reverse signalling" bezeichnet wird. Diese reverse Signalübertragung bewirkt in T-Zellen ein costimulatorisches Signal, welches zur vollständigen Aktivierung nach Antigen-Erkennung durch den T-Zellrezeptor (TZR) benötigt wird und über bisher unbekannte Adaptorproteine stattfindet, die vermutlich an den intrazellulären Anteil des CD95L binden. Die zytoplasmatische CD95L-Domäne ist auf Primärsequenzebene stark konserviert und besitzt eine prolinreiche Proteininteraktionsdomäne sowie eine Casein Kinase I Phosphorylierungsstelle, welche sich auch im intrazellulären Bereich des membrangebundenen TNFalpha findet und bei diesem Protein für die reverse Signalübertragung essentiell ist. Eine weitere Funktion des CD95L ist der Transport des Liganden zu einem speziellen Typ von Lysosomen in NK- und zytotoxischen T-Zellen. Hierfür ist die prolinreiche Region in der CD95L-intrazellulären Domäne wichtig. In diesen sekretorischen Lysosomen wird der CD95L gespeichert, bis er nach einem TZR-vermittelten Signal an die Zelloberfläche transportiert wird und dort mit dem CD95 Rezeptor der Ziel- Zellen interagieren kann. In der vorliegenden Arbeit wurde zur Aufklärung der oben beschriebenen Funktionen des CD95 Liganden ein Hefe-2-Hybrid Screen mit der intrazellulären CD95L-Domäne als Köder durchgeführt. Mit dieser Methode war es möglich, mehrere potentielle Interaktionspartner zu identifizieren. Eines dieser Proteine, FBP11, wurde schon zuvor als "human fas ligand associated factor" in der Datenbank veröffentlicht. Der HMG-Box-Transkriptionsfaktor Lef- 1, das Formin-bindende Protein FBP11, das thymozytenspezifische Protein TARPP und das Adaptorprotein PSTPIP ("proline serine threonin phosphatase interacting protein")/ CD2BP1 ("CD2 binding protein") interagierten in vitro in einem GST-Pulldown-Experiment mit der intrazellulären Domäne des CD95 Liganden. Mit Hilfe von Co- Immunpräzipitationsstudien und Co-Lokalisierungsexperimenten konnte die Interaktion von überexprimiertem CD95L und PSTPIP auch in vivo bestätigt werden. Des Weiteren wurde in dieser Arbeit gezeigt, dass diese Interaktion über eine nicht näher eingegrenzte Aminosäuresequenz in der prolinreichen Region des CD95L mit der SH3-Domäne des PSTPIP-Proteins realisiert wird. Die Phosphatase PTP-PEST bindet an einen Bereich der PSTPIP-Coiled-coil-Domäne, und es besteht die Möglichkeit, dass CD95L, PSTPIP und PTPPEST in der Zelle als ternärer Komplex vorliegen, in welchem der Phosphorylierungsstatus von PSTPIP und CD95L durch PTP-PEST reguliert wird. Wie die gleichzeitige Expression von PSTPIP die Oberflächenexpression von CD95L beeinflusst, war ein weiterer Untersuchungsgegenstand dieser Arbeit. Es konnte festgestellt werden, dass bei Überexpression von PSTPIP weniger CD95L auf der Oberfläche nachgewiesen wird. Interessanterweise wurde auch weniger Apoptose durch den CD95L ausgelöst, sobald PSTPIP überexprimiert wurde. Neben den Untersuchungen zur Interaktion von CD95L und PSTPIP (sowie PTP-PEST) wurden auch funktionelle Studien zur reversen Signalübertragung des CD95L durchgeführt. Sowohl in CD4- als auch in CD8-einzelpositiven frisch isolierten Maus-T-Zellen wurde ein co-stimulatorisches Signal nach suboptimaler TZR-Stimulation über CD95L beobachtet, was sich in verstärkter Proliferation und erhöhter Expression von Aktivierungsmarkern wie CD25 äußerte. Außerdem führt die Stimulation des CD95 Liganden zu einer transienten p42/p44-MAPK-Phosphorylierung, die durch Co-Expression von PSTPIP jedoch nicht beeinflusst wird. Die MAPK-Signalkaskade führt zur Zellproliferation und könnte daher eine wichtige Rolle in der CD95L-vermittelten Co- Stimulation spielen. Im Rahmen dieser Arbeit konnte auch zum ersten Mal gezeigt werden, dass die Lokalisation des CD95L in Lipid Rafts (Mikrodomänen der Zellmembran) wichtig für dessen apoptoseauslösendes Potential ist, da die Behandlung CD95L-positiver Zellen mit Substanzen, die Cholesterol entfernen und so Rafts zerstören, zur Inhibition der Apoptoseinduktion führt. Die Lokalisation sowohl des CD95 Rezeptors als auch des CD95 Liganden in unterschiedlichen Kompartimenten der Zellmembran könnte beide Moleküle voneinander abschirmen und so autokrine Apoptosemechanismen verhindern. Dadurch wird eine weitere Möglichkeit der Regulation der durch CD95L induzierten Apoptose realisiert.