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The TATA Box Binding Protein (TBP) is a 20 kD protein that is essential and universally conserved in eucarya and archaea. Especially among archaea, organisms can be found that live below 0°C as well as organisms that grow above 100°C. The archaeal TBPs show a high sequence identity and a similar structure consisting of α-helices and β-sheets that are arranged in a saddle-shape 2-symmetric fold. In previous studies, we have characterized the thermal stability of thermophilic and mesophilic archaeal TBPs by infrared spectroscopy and showed the correlation between the transition temperature (Tm) and the optimal growth temperature (OGT) of the respective donor organism. In this study, a “new” mutant TBP has been constructed, produced, purified and analyzed for a deeper understanding of the molecular mechanisms of thermoadaptation. The β-sheet part of the mutant consists of the TBP from Methanothermobacter thermoautotrophicus (OGT 65°C, MtTBP65) whose α-helices have been exchanged by those of Methanosarcina mazei (OGT 37°C, MmTBP37). The Hybrid-TBP irreversibly aggregates after thermal unfolding just like MmTBP37 and MtTBP65, but the Tm lies between that of MmTBP37 and MtTBP65 indicating that the interaction between the α-helical and β-sheet part of the TBP is crucial for the thermal stability. The temperature stability is probably encoded in the variable α-helices that interact with the highly conserved and DNA binding β-sheets.
The Opisthobranchia comprise highly specialized marine gastropods and have therefore been subject to diverse investigations covering various biological disciplines. However, a robust phylogeny of these gastropods is still lacking and several subclades have only been rarely studied. Furthermore, crucial aspects for the evolution of Opisthobranchia have not been comparatively analysed. Therefore, the aim of the present thesis is to gain new insights into the phylogeny of the Opisthobranchia with special focus on certain critical groups (Pleurobranchomorpha, Acteonoidea) and to assess several crucial features of the evolution of the investigated clades. The combination of four different gene markers (18S rDNA, 28S rDNA, 16S rDNA and CO1) and modern molecular systematic analysis tools were used to construct phylogenetic hypotheses focussing on Opisthobranchia as a whole as well as Pleurobranchomorpha and Acteonoidea in more detail. Intriguing new aspects of phylogeny and evolution of Opisthobranchia were revealed. First of all, monophyly of Opisthobranchia is definitely rejected based on the present data, while monophyly of Euthyneura (comprising Opisthobranchia and Pulmonata) is supported. Monophyly of opisthobranch subclades is confirmed for Nudipleura (as well as its constituting groups Nudibranchia and Pleurobranchomorpha), Umbraculida, Pteropoda (as well as subclades Thecosomata and Gymnosomata) and Acochlidiacea, for Cephalaspidea (if Runcinacea is regarded as a separate clade) and for Sacoglossa (if Cylindrobulla is accepted as an Oxynoacea). Aplysiomorpha are rendered paraphyletic due to the position of Akera bullata, but this result needs further investigation and should be considered with caution. The Nudipleura are found as the first single offshoot of the Euthyneura implying an early evolutionary separation of the last common ancestor of this clade. The remaining taxa form two main clades, one comprising the opisthobranch subgroups Umbraculida, Cephalaspidea, Aplysiomorpha and Pteropoda, while the other contains the pulmonate taxa and the opisthobranch Sacoglossa and Acochlidiacea. The interrelationships within these clades remain largely unresolved due to low statistical support values. However, a possible sister group relationship of Acochlidiacea and Eupulmonata receives statistical support. Opisthobranchia display various highly specific adaptations to diverse food sources. However, evolution of these specialized traits has never been assessed at an analytical level. The current thesis reconstructs the evolution of dietary preferences with novel methodologies based on the newly proposed phylogenetic hypothesis. Reconstruction of dietary evolution revealed herbivory as the ancestral condition in Euthyneura implying that carnivory evolved at least five times independently in the diverse lineages. The first comprehensive molecular phylogenetic hypothesis of the Pleurobranchomorpha could not reveal monophyly of the two main subclades Pleurobranchaeidae and Pleurobranchidae. This is due to the position of a single taxon (Euselenops luniceps) which is assigned to the Pleurobranchaeidae based on morphology but clusters within Pleurobranchidae in the current hypothesis. Furthermore, the tribe Berthellini and the genus Berthella are rendered paraphyletic by the current analyses. The results of molecular systematic analyses were used to reconstruct historical biogeography of Pleurobranchomorpha. Four different methodological approaches were applied yielding ambiguous results for Pleurobranchomorpha. However, the Pleurobranchidae comprising about 80% of the extant Pleurobranchomorpha most probably derived from an Antarctic origin. Dating of the phylogenetic tree via molecular clock methods yielded divergence of Pleurobranchidae into the Antarctic Tomthompsonia antarctica and the remaining species in Early Oligocene. Afterwards the latter underwent rapid radiation during Oligocene and Early Miocene. This divergence event coincides with two major geological events in the Antarctic region. On the one hand, the onset of glaciation and on the other hand the opening of the Drake Passage with concurrent formation of an Antarctic circumpolar current (ACC). I suppose that these sudden and dramatic changes in climate and palaeogeography probably accounted for migration of the last common ancestor of Pleurobranchidae (besides Tomthompsonia) into warmer regions via the Drake Passage to the Western Atlantic and Eastern Pacific and via the South Tasman Rise to the Indo-West Pacific. Furthermore, the ACC may have triggered larval dispersal to the Eastern Atlantic. The phylogenetic position of Acteonoidea has been a matter of debate for decades and they have long been considered as basal opisthobranchs. Results of the present thesis rather support placement in “Lower Heterobranchia” as sister group of Rissoelloidea. The current division of Acteonoidea into three families has never been investigated by means of phylogenetic methods. Thus, this thesis provides the first comprehensive investigation of this clade challenging present division into three families. The results rather support division into two main clades with the monogeneric Bullinidae clustering within Aplustridae doubting its separate status. Additionally, Rictaxis punctocaelatus which has been assigned to Acteonidae clusters basal to Aplustridae rendering Acteonidae paraphyletic. Since information on morphology of R. punctocaelatus was lacking until now, I conducted the first detailed investigation on morphology and histology of this species in order to reassess the unexpected molecular systematic placement. Character tracing analyses revealed similarities with both acteonoidean families implying an intermediate position of this species which might be assigned to a separate family in the future. Furthermore, the common features of Acteonidae and Rictaxis (massive shell, small foot, anterior mantle cavity opening, and absence of oral gland) are possibly plesiomorphic for the whole Acteonoidea. In summary, the results of the present thesis provide valuable novel insights into the phylogeny and evolution of the Opisthobranchia by employing state-of-the-art approaches of molecular systematics and evolutionary reconstruction. Thus, diverse hypotheses on opisthobranch phylogeny and evolution were either supported or rejected as well as novel hypotheses proposed which offer the basis for further research on these extraordinary gastropods.
The magnetic field sensors enabling birds to extract orientational information from the Earth’s magnetic field have remained enigmatic. Our previously published results from homing pigeons have made us suggest that the iron containing sensory dendrites in the inner dermal lining of the upper beak are a candidate structure for such an avian magnetometer system. Here we show that similar structures occur in two species of migratory birds (garden warbler, Sylvia borin and European robin, Erithacus rubecula) and a non-migratory bird, the domestic chicken (Gallus gallus). In all these bird species, histological data have revealed dendrites of similar shape and size, all containing iron minerals within distinct subcellular compartments of nervous terminals of the median branch of the Nervus ophthalmicus. We also used microscopic X-ray absorption spectroscopy analyses to identify the involved iron minerals to be almost completely Fe III-oxides. Magnetite (Fe II/III) may also occur in these structures, but not as a major Fe constituent. Our data suggest that this complex dendritic system in the beak is a common feature of birds, and that it may form an essential sensory basis for the evolution of at least certain types of magnetic field guided behavior.
With the help of miniaturized GPS recorders I recorded 167 tracks of 48 individual pigeons during their flight from 6 different sites around Frankfurt. The experiments consisted of two main series of repeated releases from two sites 30 km north and south from the pigeons' home loft. From the site in the south the pigeons homed 12 times and from the site in the north 16 times. After the final release from these sites, the pigeons were released at 60 km distance from home. These additional sites were selected so that the pigeons would presumably fly over the previous release site with which they were highly familiar. After conclusion of the main series two additional releases were performed, one within the magnetic anomaly of the Vogelsberg and one in a magnetically quiet region. To make these releases comparable, both release sites were selected so that the distance from the home loft was 40 km. All data obtained during these experiments were subjected to a threefold analysis, mostly based on methods that I had developed by myself or adapted for this specific study. In the first step, data were analyzed traditionally, evaluating variables similar to those that can be found in current literature. I therefore calculated values that correspond to those obtained by visual observation, like virtual vanishing bearings and intervals after one minute and after 2.5 km. Additionally I calculated the efficiency of the flights and efficiencies for specific portions of each flight, to derive variables that describe the behavior after vanishing. In the second step, which served also as a preparation for the mathematical analysis, the flight of the pigeons was separated into distinctive phases of the flight by the so-called points of decision. The flight of the pigeon can usually be separated into an initial phase of flying about, a departure and/or final homing phase. In more complex cases, however, several points of decision and a multitude of intermediary phases can be defined. Yet, the initial phase, the departure phase and the final homing phase can be defined for all tracks and therefore have been selected as appropriate candidates for a thorough analysis. In the last step I employed the so-called method of time lag embedding to reconstruct the underlying navigational process of the pigeons' homing flight. This method is based on the principles of chaos theory and is regularly employed for the analysis of dynamic systems. Its application allows the reconstruction of the underlying processes from experimentally recorded data without any a priori knowledge of the underlying system itself. For these reconstructed systems I calculated characteristic properties which are unique for each system. These are the so-called correlation dimension, describing the complexity of the system, and the so-called largest Lyapunov exponent, describing its predictability. Based on the knowledge gathered from these reconstructions, I used a variation of the previous methods to identify navigational phases, by calculating the correlation dimension as a sliding mean over the complete track. From these data I then derived further characteristics of the underlying process, such as its precision and differences in complexity depending on the pigeon's current position. ...
Fucoxanthin chlorophyll proteins (Fcps), the light-harvesting antennas of heterokont algae, are encoded by a multigene family and are highly similar with respect to their molecular masses as well as to their pigmentation, making it difficult to purify single Fcps. In this study, a hexa-histidine tag was genetically added to the C-terminus of the FcpA protein of the pennate diatom Phaeodactylum tricornutum. A transgenic strain expressing the recombinant His-tagged FcpA protein in addition to the endogenous wild type Fcps was created. This strategy allowed, for the first time, the purification of a specific, stable trimeric Fcp complex. In addition, a pool of various trimeric Fcps was also purified from the wild-type cells using sucrose density gradient ultracentrifugation and gel filtration. In both the His-tagged and the wild-type Fcps, excitation energy coupling between fucoxanthin and chlorophyll a was intact and the existence of a chlorophyll a/fucoxanthin excitonic dimer was demonstrated using circular dichroism spectroscopy. Mass spectrometric analyses of the trimeric His-tagged complex indicated that it is composed of FcpA and FcpE polypeptides. It is confirmed here that a trimer is the basic organizational unit of Fcps in P. tricornutum. From circular dichroism spectra, it is proposed that the organization of the pigments on the polypeptide backbone of Fcps is a conserved feature in the case of chlorophyll a/c containing algae.
Proteins of the Omp85 family are conserved in all kingdoms of life. They mediate protein transport across or protein insertion into membranes and reside in the outer membranes of Gram-negative bacteria, mitochondria, and chloroplasts. Omp85 proteins contain a C-terminal transmembrane β-barrel and a soluble N terminus with a varying number of polypeptide-transport-associated or POTRA domains. Here we investigate Omp85 from the cyanobacterium Anabaena sp. PCC 7120. The crystallographic three-dimensional structure of the N-terminal region shows three POTRA domains, here named P1 to P3 from the N terminus. Molecular dynamics simulations revealed a hinge between P1 and P2 but in contrast show that P2 and P3 are fixed in orientation. The P2-P3 arrangement is identical as seen for the POTRA domains from proteobacterial FhaC, suggesting this orientation is a conserved feature. Furthermore, we define interfaces for protein-protein interaction in P1 and P2. P3 possesses an extended loop unique to cyanobacteria and plantae, which influences pore properties as shown by deletion. It now becomes clear how variations in structure of individual POTRA domains, as well as the different number of POTRA domains with both rigid and flexible connections make the N termini of Omp85 proteins versatile adaptors for a plentitude of functions.
Filamentous fungi are of great importance in ecology, agriculture, medicine, and biotechnology. Thus, it is not surprising that genomes for more than 100 filamentous fungi have been sequenced, most of them by Sanger sequencing. While next-generation sequencing techniques have revolutionized genome resequencing, e.g. for strain comparisons, genetic mapping, or transcriptome and ChIP analyses, de novo assembly of eukaryotic genomes still presents significant hurdles, because of their large size and stretches of repetitive sequences. Filamentous fungi contain few repetitive regions in their 30–90 Mb genomes and thus are suitable candidates to test de novo genome assembly from short sequence reads. Here, we present a high-quality draft sequence of the Sordaria macrospora genome that was obtained by a combination of Illumina/Solexa and Roche/454 sequencing. Paired-end Solexa sequencing of genomic DNA to 85-fold coverage and an additional 10-fold coverage by single-end 454 sequencing resulted in ~4 Gb of DNA sequence. Reads were assembled to a 40 Mb draft version (N50 of 117 kb) with the Velvet assembler. Comparative analysis with Neurospora genomes increased the N50 to 498 kb. The S. macrospora genome contains even fewer repeat regions than its closest sequenced relative, Neurospora crassa. Comparison with genomes of other fungi showed that S. macrospora, a model organism for morphogenesis and meiosis, harbors duplications of several genes involved in self/nonself-recognition. Furthermore, S. macrospora contains more polyketide biosynthesis genes than N. crassa. Phylogenetic analyses suggest that some of these genes may have been acquired by horizontal gene transfer from a distantly related ascomycete group. Our study shows that, for typical filamentous fungi, de novo assembly of genomes from short sequence reads alone is feasible, that a mixture of Solexa and 454 sequencing substantially improves the assembly, and that the resulting data can be used for comparative studies to address basic questions of fungal biology.
Development of a computational method for reaction-driven de novo design of druglike compounds
(2010)
A new method for computer-based de novo design of drug candidate structures is proposed. DOGS (Design of Genuine Structures) features a ligand-based strategy to suggest new molecular structures. The quality of designed compounds is assessed by a graph kernel method measuring the distance of designed molecules to a known reference ligand. Two graph representations of molecules (molecular graph and reduced graph) are implemented to feature different levels of abstraction from the molecular structure. A fully deterministic construction procedure explicitly designed to facilitate synthesizability of proposed structures is realized: DOGS uses readily available synthesis building blocks and established reaction schemes to assemble new molecules. This approach enables the software to propose not only the final compounds, but also to give suggestions for synthesis routes to generate them at the bench. The set of synthesis schemes comprises about 83 chemical reactions. Special focus was put on ring closure reactions forming drug-like substructures. The library of building blocks consists of about 25,000 readily available synthesis building blocks. DOGS builds up new structures in a stepwise process. Each virtual synthesis step adds a fragment to the growing molecule until a stop criterion (upper threshold for molecular mass or number of synthesis steps) is fulfilled. In a theoretical evaluation, a set of ~1,800 molecules proposed by DOGS is analyzed for critical properties of de novo designed compounds. The software is able to suggest drug-like molecules (79% violate less than two of Lipinski’s ‘rule of five’). In addition, a trained classifier for drug-likeness assigns a score >0.8 to 51% of the designed molecules (with 1.0 being the top score). In addition, most of the DOGS molecules are deemed to be synthesizable by a retro-synthesis descriptor (77% of molecules score in the top 10% of the decriptor’s value range). Calculated logP(o/w) values of constructed molecules resemble a unimodal distribution centred close to the mean of logP(o/w) values calculated for the reference compounds. A structural analysis of selected designs reveals that DOGS is capable of constructing molecules reflecting the overall topological arrangement of pharmacophoric features found in the reference ligands. At the same time, the DOGS designs represent innovative compounds being structurally distinct from the references. Synthesis routes for these examples are short and seem feasible in most cases. Some reaction steps might need modification by using protecting groups to avoid unwanted side reactions. Plausible bioisosters for known privileged fragments addressing the S1 pocket of trypsin were proposed by DOGS in a case study. Three of them can be found in known trypsin inhibitors as S1-adressing side chains. The software was also tested in two prospective case studies to design bioactive compounds. DOGS was applied to design ligands for human gamma-secretase and human histamine receptor subtype 4 (hH4R). Two selected designs for gamma-secretase were readily synthesizable as suggested by the software in one-step reactions. Both compounds represent inverse modulators of the target molecule. In a second case study, a ligand candidate selected for hH4R was synthesized exactly following the three-step synthesis plan suggested by DOGS. This compound showed low activity on the target structure. The concept of DOGS is able to deliver synthesizable and bioactive compounds. Suggested synthesis plans of selected compounds were readily pursuable. DOGS can therefore serve as a valuable idea generator for the design of new pharmacological active compounds.
Development of lentiviral vectors for the gene therapy of X-linked chronic granulomatous disease
(2010)
Es gibt eine Vielzahl von Erkrankungen, die auf einen einzelnen Gendefekt zurückzuführen sind (monogene Erkrankungen). Darunter befindet sich auch die Gruppe der primären Immundefizienzen (PIDs), von denen aktuell über 150 verschiedene Typen von der Weltgesundheitsorganisation registriert sind. In vielen fällen leiden betroffene Individuen unter einem stark erhöhten Infektionsrisiko durch bakterielle oder virale Pathogene, sowie den damit verbundenen schweren Symptomen - bis hin zum verfrühten Tod der Patienten. Meist können PIDs mit konventionellen Methoden präventiv behandelt werden. Dazu gehören zum Beispiel die regelmässige Gabe von Antibiotika, Antimykotika, Zytokinen oder Immunglobulinen. Der einzige zur Verfügung stehende kurative Behandlungsansatz beruht auf der Transplantation von hämatopoietischen Stammzellen (HSZT) eines gesunden und passenden Spenders. Häufig steht jedoch kein histokompatibler Spender zur Verfügung.
Für diese Patientengruppe hat sich die gentherapeutische Behandlung mit autologen hämatopoietischen Stammzellen als eine gute Option herausgestellt. Der Beweis hierfür wurde eindrucksvoll in klinischen Heilversuchen für zwei Formen des Schweren Kombinierten Immundefekts (X-SCID und ADA-SCID) geführt, einer Erkrankung die durch das vollständige Fehlen bzw. die nicht-Funktionalität der lymphoiden Immunzellen charakterisiert ist. Autologe hämatopoietische Stammzellen der Patienten wurden hier ex vivo mittels eines gamma-retroviralen Vektors mit einer funktionellen Kopie der defekten cDNA genetisch modifiziert und anschliessend zurück infundiert. In der Summe wurde bei über 30 Patienten eine deutliche Verbesserung des Gesundheitszustandes bis hin zur vollständigen Heilung erzielt. Bei einem vergleichbaren Ansatz wurden in Frankfurt, in einem Heilversuch für die septische Granulomatose (X-CGD), erstmals klinisch relevante Erfolge in der Gentherapie für einen Defekt in der myeloischen Linie von Immunzellen erzielt. Ursache der X-chromosomal gekoppelten Form der septischen Granulomatose sind Mutationen in dem Gen für gp91phox (CYBB), einer essentiellen Untereinheit des in Phagozyten benötigten NADPH-Oxidase Komplexes. In der Folge sind die Phagozyten dieser Patienten nicht mehr in der Lage, die für das Abtöten von Krankheitserregern nötigen reaktiven Sauerstoffspezies zu bilden. Ständig wiederkehrende schwere Infektionen mit sonst unproblematischen Erregern sind die Folge.
Neben klaren gesundheitlichen Verbesserungen in der Mehrzahl der Patienten hatte diese Gentherapeutische Behandlungsstrategie in einigen Fällen auch klare Nebenwirkungen. In fünf von 20 Patienten mit X-SCID, sowie in beiden behandelten X-CGD Patienten, kam es infolge der Therapie zu hämatologischen Veränderungen, die in der Ausbildung eines myelodysplastischen Syndroms (bei X-CGD) und Leukämie (bei X-SCID) mündeten. In allen Fällen war die Ursache eine Hochregulierung von Proto-Onkogenen in der Nähe von g-retroviralen Integrationsstellen. Diese Probleme demonstrieren deutlich die unbedingte Notwendigkeit zur Verbesserung der verwendeten therapeutischen Vektoren.
In der vorliegenden Arbeit wurden lentivirale Vektoren mit myeloid-spezifischen Promotoren entwickelt und auf ihre Eignung für die Gentherapie der X-chromosomal gekoppelten septischen Granulomatose getestet. Lentivirale Vektoren besitzen ein stark verringertes Risiko für Insertionsmutagenese, sowie die exklusive Fähigkeit ruhende Zellen zu transduzieren. Die Verwendung von myeloid-spezifischen Promotoren für die Transgenexpression verringert die Wahrscheinlichkeit der Proto-Onkogen Aktivierung in unreifen Stamm- und Vorläuferzellen – einer Zellpopulation die besonders sensitiv für die in der Leukämieentstehung obligaten Schritte der Immortalisierung und Transformation ist. Gleichzeitig bleibt der volle therapeutische Nutzen erhalten, da das Transgen gp91phox nur in reifen myeloischen Zellen benötigt wird.
Die entwickelten lentiviralen Vektoren exprimieren eine kodonoptimierte gp91phox cDNA unter der Kontrolle des microRNA223-Promoters (223), des MRP8-Promotors (M) oder eines chimären Fusionspromoters bestehend aus den regulatorischen Bereichen des Cathepsin G und des cFes-Promotors (Chim). Zusätzlich wurde ein sogenanntes „ubiquitär aktives Chromatin-öffnendes Element“ (UCOE) in beiden Orientierungen vor den MRP8-Promotor kloniert, um eine erhöhte und stabile Langzeitexpression des Transgens zu erreichen. Ziel der Arbeit war die Selektion eines geeigneten Kandidaten für präklinische Versuchsreihen.
Die für die Evaluierung der Vektoren relevanten Parameter waren die Transgenexpressionslevel, die Spezifität der Expression für myeloische Zellen sowie die vermittelte funktionelle Rekonstitution der NADPH-Oxidase Aktivität. Die Fragestellungen der Langzeitexpression, der Anfälligkeit für CpG-Methylierung sowie der Genotoxizität der Vektoren wurden ebenfalls bearbeitet. Die Vektoren wurden in vitro in verschiedenen Zelllinien sowie in in vitro differenzierten primären murinen und humanen Blutstammzellen getestet. Die beiden besten Kandidaten (223 und Chim) wurden in vivo in Maustransplantationsexperimenten (Maus-Maus und humane Stammzellen in NOD/SCID-Mäuse) analysiert.
Die beiden lentiviralen Vektoren 223 und Chim eignen sich beide für eine effiziente Expression in myeloische Zellen, die zur funktionellen Rekonstitution der NADPH-Oxidase Aktivität in vitro und in vivo führen. Sie sind den bisher in klinischen Anwendungen verwendeten Vektoren in allen Parametern klar überlegen. Daher ist in zukünftigen klinischen Anwendungen ein verbesserter therapeutischer Nutzen für die Patienten sowie eine Verminderung des Risikos von Nebenwirkungen zu erwarten.
Die Bedeutung verschiedener CRASP-Proteine für die Komplementresistenz von Borrelia burgdorferi s.s.
(2010)
Die vorliegende Arbeit liefert einen wichtigen Beitrag zum Verständnis des molekularen Mechanismus der Immunevasion von B. burgdorferi s.s., insbesondere der Bedeutung einzelner CRASP-Proteine für die Komplementresistenz. Sie trägt dazu bei, die Relevanz dieser Proteine für die Pathogenese dieses Erregers zu untermauern. Im Rahmen dieser Arbeit gelang es, verschiedene Vektoren mit den ursprünglichen oder mutierten CRASP-kodierenden Genen cspA, cspZ, erpP und erpA aus B. burgdorferi s.s. zu generieren und diese in das CRASP-negative Isolat B. garinii G1 zu transformieren. Die Expression der speziesfremden Gene als auch der Transport der CRASP-Moleküle auf die Zelloberfläche von B. garinii G1 konnten nachgewiesen werden. Für die konstitutiv CRASP-1- oder CRASP-2-produzierenden Borrelienzellen konnte gezeigt werden, dass diese, auf der Zelloberfläche lokalisierten CRASP-Moleküle mit Faktor H und FHL-1 interagieren, die gebundenen Komplementregulatoren ihre funktionelle Aktivität zur C3b-Inaktivierung aufrechterhalten und die Zellen in Gegenwart von Komplement überleben. Damit wurde erstmals der Nachweis erbracht, dass beide CRASP-Moleküle unabhängig voneinander Schutz vor komplementvermittelter Lyse verleihen. Untersuchungen mit den veränderten CRASP-1-Molekülen ergaben, dass die Transformante G1/pCRASP-1 E147K eine verringerte Bindung von Faktor H und FHL-1 aufwies, welche sich jedoch nicht auf die Komplementresistenz der Zellen auswirkte. Im Gegensatz dazu führte eine Aminosäuresubstitution im C-Terminus des CRASP-1-Moleküls an Position 240 zum Verlust der Bindung von Faktor H und einer stark verminderten Bindung von FHL-1, so dass auch keine Kofaktoraktivität nachgewiesen werden konnte. Trotz des Bindungsverlustes beider Komplementregulatoren zeigte die Transformante G1/pCRASP-1 Y240A nur geringe Ablagerungen des lytischen, terminalen Komplementkomplexes (TCC) auf der Zelloberfläche und Wachstum in Gegenwart von aktiven Komplement. Mittels eines Hämolyse-Assays wurde schließlich festgestellt, dass CRASP-1 direkt mit Komponenten des Komplementsystems interagiert und dadurch die Assemblierung des TCC verhindert. Die Bedeutung der Aminosäuren an den Positionen 81, 139, 207 und 211 im CRASP-2-Molekül für die Faktor H / FHL-1-Bindung und die daraus resultierenden Auswirkungen auf die Komplementresistenz der Borrelien wurde gleichfalls nachgewiesen. Dabei wies insbesondere die Transformante G1/pCRASP-2 Y211A ein inhibiertes Wachstum in Humanserum und verstärkt Komplementablagerungen auf der Zelloberfläche auf, was auf den Verlust bzw. der sehr schwachen Bindung von FHL-1 und Faktor H zurückzuführen ist. Im Gegensatz zu den Transformanten, welche ein CRASP-2-Molekül mit nur einem Aminosäureaustausch produzierten, zeigten die Transformanten, deren CRASP-2-Molekül zwei Aminosäuresubstitutionen aufwies (G1/pCRASP-2 R139A-Y207A, G1/pCRASP-2 R139A-Y211A, G1/pCRASP-2 Y207A-Y211A) keine Bindung der beiden Regulatorproteine und keinen Schutz der Zellen vor der lytischen Wirkung von Komplement. Neue, unerwartete Erkenntnisse ergaben sich aus den Untersuchungen mit Borrelienzellen, welche das CRASP-3- oder CRASP-5-kodierende erpP- bzw. erpA-Gen enthielten. Obwohl gereinigtes als auch denaturiertes CRASP-3 und RASP-5 in der Lage war, Faktor H zu binden, wiesen die vitalen Zellen der Transformanten G1/pCRASP-3 und G1/pCRASP-5 keine Bindung von Faktor H und keinen Schutz der Zellen vor komplementvermittelter Lyse auf. Aus den durchgeführten Untersuchungen konnten für gereinigtes CRASP-3 und CRASP-5 als auch für die CRASP-3- und CRASP-5-produzierenden Transformanten neue Liganden, nämlich CFHR-2 und CFHR-5, aus Humanserum identifiziert werden. Zusammenfassend lassen sich folgende Aussagen hinsichtlich des molekularen Mechanismus der Komplementresistenz bei B. burgdorferi s.s. aus den erhobenen Daten dieser Arbeit mit transformierten Borrelienzellen formulieren: *Die Komplementresistenz der Borrelien wird durch die Faktor H- und FHL-1-bindenden Proteine CRASP-1 und CRASP-2, jedoch nicht durch CRASP-3 und CRASP-5 determiniert, *CRASP-1 als multifunktionelles Protein ist zusätzlich in der Lage, direkt mit Komplement zu interagieren, *Die C-terminalen Domänen von CRASP-1 und CRASP-2 sind für die Bindung der beiden Komplementregulatoren Faktor H und FHL-1 relevant, *CRASP-3 und CRASP-5 auf der Borrelienoberfläche lokalisiert, interagieren mit CFHR-1, CFHR-2 und CFHR-5, aber nicht mit Faktor H.
Die Chemokinrezeptoren CXCR3 und CXCR4 sowie deren spezifische Liganden, CXCL9, -10 und -11 bzw. CXCL12, sind in bedeutender Weise an den pathologischen Prozessen der Th1-/Th17-vermittelten (Typ1- und Typ17-T-Helferzelle) Autoimmunerkrankungen beteiligt. Die dabei auftretenden chronischen Entzündungen sind gekennzeichnet durch eine massive Infiltration von Th1-Gedächtniszellen. Ergebnisse sowohl von tierexperimentellen Studien als auch von in vitro Experimenten weisen deutlich auf eine spezifische Wechselwirkung zwischen den proentzündlichen CXCR3- und dem homöostatischen CXCR4-Liganden hin. Weiterführenden Ergebnisse zu der molekularen Wechselwirkung von CXCR3 und -4 wurden jedoch bislang nicht veröffentlicht. Die Untersuchungen dieser Dissertation konzentrierten sich auf die Kooperation der beiden Chemokinrezeptoren in murinen Th1-Gedächtniszellen. Dabei sollte insbesondere der potentielle Einfluss dieser Interaktion auf die einzelnen Teilprozesse der Extravasation der T-Lymphozyten in vitro analysiert werden. Eingesetzt wurden hierfür statische Chemotaxis- und dynamische Flusskammerexperimente, die zum einen sensitiv genug und zum anderen für einen hohen Probendurchsatz geeignet sein mussten. Die verwendeten Techniken wurden dazu im Rahmen der Dissertation etabliert und validiert. Zunächst musste die Präzision des statischen Migrationssytems mit einer hohen Standardabweichung von durchschnittlich ± 40% deutlich verbessert werden. Ein Wechsel auf ein Kammersystem der Firma Corning verringerte die Abweichung auf ± 25%, und sogar auf ± 9,9% bei einer optimierten Auswertung mittels Durchflusszytometrie. Als weitere Methode wurde ein dynamisches Flusskammersystem mit automatischer Videoanalyse zur Bestimmung der Geschwindigkeit von Zellen etabliert. Zur Validierung der neu entwickelten Analysesoftware Imagoquant® wurden identische Filmaufnahmen von Flusskammerexperimenten hinsichtlich Zellrollen und Zellgeschwindigkeit ausgewertet und mit den Ergebnissen von zwei etablierten Methoden, der Handzählung und einem halbautomatischen Tracking-Programm, verglichen. In der gesamten Validierung stimmten die Berechnungen von Imagoquant® mit Ergebnissen der verschiedenen Auswertemethoden qualitativ überein, wobei die Filme um ein Vielfaches (16- bzw. 20-fach) schneller analysiert werden konnten als mit den bisher verwendeten Methoden. Somit konnte erfolgreich eine computergestützte Analysemethode validiert und etabliert werden, die schnell und benutzerunabhängig arbeitet und folglich objektive Daten im Hochdurchsatz generiert. Die Untersuchungen in den statischen und dynamischen Migrationssystemen ergaben, dass die Stimulation von Th1-Zellen mit CXCL9 zu einer heterologen Desensitivierung verschiedener CXCL12-vermittelter Effekte führt. In statischen Migrationsexperimenten wurde sowohl durch eine synchrone als auch eine sequentielle Stimulation mit CXCL9 eine CXCL12-vermittelte Chemotaxis signifikant vermindert. Der auftretende Effekt war dabei lang anhaltend und konnte noch bei einer Stimulationsdauer von 20 h beobachtet werden, ohne an Intensität zu verlieren. Weitere funktionelle Experimente erfolgten in dynamischen Flusskammerexperimenten, um die desensitivierende Wirkung von CXCL9 auf CXCL12-abhängige Interaktionen der Adhäsionskaskade von Th1-Zellen zu untersuchen. In mit E-Selektin und ICAM-1 Fc-Chimära) beschichteten Flusskammern führte immobilisiertes CXCL12 zu vermehrtem integrinabhängigen Rollen, welches durch eine Vorinkubation der Th1-Zellen mit CXCL9 reduziert wurde. In Flusskammern mit murinen Endothelzellen bewirkte immobilisiertes CXCL12 eine rasche integrinabhängige Adhäsion der Zellen und verkürzte dadurch deren Rollphase signifikant. Eine Vorbehandlung der Zellen mit CXCL9 verminderte dagegen die CXCL12-vermittelte Adhäsion und führte damit zu längeren Rollphasen. Deutliche Effekte zeigte CXCL12 bezüglich einer gesteigerten intravasalen und transendothelialen Migrationsrate von T-Lymphozyten, die durch eine Vorstimulation mit CXCL9 aufgehoben wurden. Um die beteiligten Mechanismen dieser Desensitivierung zu entschlüsseln, wurde die Oberflächenexpression von CXCR3 und CXCR4 in dem Th1-Zellklon durchflusszytometrisch analysiert. Dabei zeigte sich, dass eine Stimulation mit CXCL9 neben der ligandenspezifischen Internalisierung von CXCR3 auch eine Kreuzregulation der CXCR4-Oberflächenexpression bewirkte. Im Weiteren wurde die Phosphorylierung bekannter Signalmoleküle der CXCR4-Signalwege analysiert. Eine Vorbehandlung der Zellen mit CXCL9 desensitivierte die CXCL12-induzierte Phosphorylierung von Akt signifikant und führte zu einer zeitlichen Modulation des Signals. Ferner verzögerte eine Vorbehandlung der Th1-Zellen mit CXCL9 das CXCL12-induzierte Calciumsignal erheblich, während dabei eine 3,5-fach höhere maximale Ca2+-Konzentration gemessen wurde. Ein abgeleiteter Mechanismus der CXCL9-abhängigen Desensitivierung von CXCR4-Signalwegen beeinflusst insbesondere die Signaltransduktion über den T-Zellrezeptor und dadurch auch die Regulation von Rac1. Des Weiteren führt CXCL9 zur Gi- oder ZAP-70-vermittelten Aktivierung der PKC, welche darauffolgend den CXCR4-Rezeptor phosphoryliert und damit zu dessen Internalisierung führt. Die in vitro beobachtete Desensitivierung verschiedener CXCL12/CXCR4-vermittelter Effekte durch CXCL9 wirkt potentiell in der in vivo Situation von Autoimmunerkrankungen auf unterschiedliche Weise proinflammatorisch. Zum einen wird die Mobilisierung von Th1-Zellen aus CXCL12 exprimierenden peripheren Gewebe gefördert und gleichzeitig verhindert, dass Th1-Zellen in nicht entzündetes peripheres Gewebe rekrutiert werden. Zum anderen wird im Entzündungsgebiet die Affinität der Th1-Zellen zu den CXCL12-exprimierenden Endothelzellen verringert und die Migration in tieferliegende Gebiete der Entzündung begünstigt. Ferner vermindern CXCR3-Liganden auch antiinflammatorische Effekte des CXCL12s, wie z.B. die Polarisierung der Th1-Zellen in regulatorische T-Zellen.
Das Neuroblastom ist ein Tumor, der sich von sympathoadrenergen Vorläuferzellen ableitet und die häufigste solide Krebsform im Kindesalter darstellt. Das breite klinische Spektrum dieses Tumors, das von spontaner Regression zu fataler Progression reicht, spiegelt die außerordentliche biologische und genetische Heterogenität dieses Tumors wider. Polyploidie und Genexpressionsanalysen werden auf klinischer Seite zur Risiko- und Therapieeinschätzung eingesetzt. Genomweite Screeninganalysen identifizierten den Transkriptionsfaktor Phox2b als erstes Prädispositionsgen für NB. Frühere Arbeiten haben gezeigt, dass Phox2b absolut essentiell für die Entstehung aller Ganglien des autonomen NS aus Neuralleistenzellen ist. Ziel der Untersuchungen dieser Arbeit war es, die Auswirkungen der NB-assoziierten Phox2b-Mutationen auf Proliferations- und Differenzierungsverhalten sympathoadrenerger Vorläuferzellen zu untersuchen. Hierzu wurden paravertebrale, sympathische Grenzstränge aus Huhnembryonen des Embryonaltags 7 präpariert, dissoziiert und mit Expressionsplasmiden für Phox2bwt und NB-Phox2b-Mutationen transfiziert. Nach zwei Tagen in Kultur wurden mit molekularbiologische Methoden Veränderungen des Proliferations-und Differenzierungsverhalten untersucht. Die Analyse des Proliferationsverhaltens transfizierter Neurone mit BrdU-Proliferationsassays und Phospho-Histon-3-Antikörpern offenbarte einen stark antiproliferativen Effekt des Phox2bwt-Proteins, den die untersuchten NB-Phox2b-Mutationen nicht aufwiesen. NB-Phox2b-Patienten sind heterozygot, d.h. Träger eines gesunden und eines mutierten Phox2b-Allels. Um die genetische Situation im NB-Patienten nachzuahmen, wurde mit spezifischen siRNAs das endogene Phox2b-Protein-Niveau herunter reguliert. NB-Phox2b-Mutationen mit mis- oder nonsense Mutation in der Homöodomäne zeigten unter Phox2b-Knockdown-Bedingungen einen proliferationsstimulierenden Effekt. Diese Experimente warfen die Frage auf, über welche Mechanismen Phox2b und NB-Phox2b-Mutationen Einfluss auf die Zellzykluskontrolle nehmen. Die quantitative Analyse der Expression bekannter Zellzyklusregulatoren wie Zyklin D1, D2 und D3 und der Zyklin-abhängigen Kinase-Inhibitoren p18, p21 und p57kip2 verlief ergebnislos. Die Überexpression des Zyklin-abhängigen Kinase-Inhibitors p27kip1 wirkte antiproliferativ auf Kulturen sympathoadrenerger Vorläuferzellen und das p27kip1-Epxressionsniveau korrelierte mit dem Phox2b-Proteinniveau. P27kip1 scheidet jedoch als alleiniger Vermittler des antiproliferativen Effekts von Phox2b aus, da die ebenfalls antiproliferativ wirkende Phox2-Homöodomäne keinen Einfluss auf das p27kip1-Expressionsniveau besitzt. Vielmehr wurde der bHLH-Transkriptionsfaktor Hand2 als Mediator der Proliferationseffekte von Phox2b identifiziert. Die Proliferation sympathoadrenerger Vorläuferzellen ist abhängig von der Hand2-Proteinmenge, und Hand2-Überexpression ist ausreichend, den antiproliferativen Effekt von Phox2b aufzuheben. Damit im Einklang geht der proliferationsstimulierende Effekt der Phox2bHDmut bei siRNA-vermitteltem Hand2-Knockdown verloren. Weiterhin führt Phox2b-Überexpression zu verringertem Hand2-Expressionsniveau und Phox2b-Knockdown zu vermehrter Hand2-Transkription. In Protein-Protein-Interaktionsexperimenten konnte eine direkte Bindung von Hand2 an Phox2bwt und die untersuchten NB-Phox2b-Mutanten nachgewiesen werden. Diese Ergebnisse zeigen, dass Hand2 in der Vermittlung der Phox2b-Proliferationseffekte auf transkriptioneller und posttranskriptioneller Ebene involviert ist. Der Wirkungsmechanismus dieser Phox2b-Varianten / Hand2-Komplexe konnte nicht endgültig geklärt werden und wird in Form verschiedener Modelle diskutiert. In NB-Patienten korreliert ein hohes Expressionsniveau von Differenzierungsmarkern mit mildem Krankheitsverlauf. Die Rolle von Phox2b als Schlüsselgen in der Entstehung und Differenzierung autonomer Neurone und die genetische Heterogenität des NB legen eine Funktion von NB-Phox2b-Mutationen auf den Differenzierungsstatus sympathoadrenerger Vorläuferzellen nahe. In quantitativen Analysen wurde die Expression von Phox2b-Zielgenen und in NB-Diagnostik involvierten Genen untersucht. Phox2bK155X, eine C-terminal trunkierte NB-Phox2b-Mutation, wirkte dominant-negativ auf die Expression der noradrenergen Markergene Th und Dbh, Tlx3 und die Neurotrophinrezeptoren trkA und p75, deren reduzierte Expression mit schlechter Prognose und damit aggressiven NB-Formen korreliert ist. Zusammenfassend konnte in dieser Arbeit gezeigt werden, das NB-Phox2b-Mutationen in sympathoadrenergen Vorläuferzellen, den potentiellen Tumorentstehungszellen des NB, proliferationsstimulierend wirken und zumindest die C-terminal trunkierte Phox2bK155X-Mutation zur Dedifferenzierung dieser Zellen führt. Hereditäre Mutationen in Phox2b könnten im Patienten nicht nur die terminale Differenzierung sympathischer Neurone stören, sondern auch durch eine verlängerte Phase der Neurogenese die Empfänglichkeit für weitere Tumor-initiierende Mutation erhöhen.
Primäre Hirntumore des Zentralen Nervensystems (gehen aus Nervenzellen, Gliazellen, Hirnhäute (Meningen) und auch Hirngefäße aus. Das anaplastische Astrozytom, Oligodendrogliom und Oligoastrozytom (WHO-Grad III) und auch die bösartigste Form, das Glioblastoma multiforme (WHO-Grad IV) bilden den wesentlichen Anteil der astrozytären Tumoren. Bedingt durch die ungünstige Prognose für Patienten mit Glioblastomen bedarf es einer Optimierung der therapeutischen Maßnahmen. Die momentane Therapie besteht nach Konstitution des Patienten und der Lokalisation des Tumors meist aus der Operation mit angeschlossener Strahlen- und eventueller adjuvanten Chemotherapie. Die Prognose ist abhängig von verschiedenen Faktoren, wie der Ausbreitung und der Lokalisation des Tumors und hat sich in den letzten Jahren leider nur unwesentlich verbessert, da immer noch von einer medianen Überlebenszeit des Patienten zwischen 8 und 15 Monaten im Falle eines Glioblastoms ausgegangen werden kann. Die Entstehung und Progression von malignen Tumorerkrankungen sind eng mit Störungen und Defekten in Signalwegen, die das Zellüberleben und den Zelltod regulieren, verknüpft. Aberrationen, wie die Blockade von Tumorsuppressorgenen, oder die Aktivierung bzw. Überexpression von Onkogenen, führen zur veränderten Expression von Zelltod-inhibitorischen Genen wie den anti-apoptotischen Bcl-2 Familienmitgliedern, und letztendlich zu Abweichungen der normalen zellulären Homöostase. Veränderungen dieser Art bewirken, dass Tumorzellen die Fähigkeit erhalten, unkontrolliert zu proliferieren, infiltrativ zu wachsen und eine eigene Vaskularisierung zu initiieren. Tumorzellen besitzen eine erhöhte Apoptose- und Zelltodresistenz, die maßgeblich durch die stark erhöhte Expression von anti-apoptotischen Bcl-2-Proteinen gekennzeichnet ist. In der vorliegenden Arbeit stand daher die Fragestellung im Mittelpunkt, inwieweit anti-apoptotische Proteine der Bcl-2-Familie zur Resistenz von malignen Gliomzellen gegen die Apoptose und den autophagischen Zelltod beitragen und wie diese Mechanismen gezielt überwunden werden können. Die Blockade der vier Familienmitglieder der Bcl-2-Subfamilie (Bcl-2, Bcl-xL, Mcl-1, Bcl-w) wurde über den Einsatz von spezifischen Inhibitoren, den sogenannten BH3-Mimetika, vermittelt. BH3-Mimetika besitzen eine hohe Affinität zur Bindungstasche der Bcl-2-Proteine, wobei durch die Bindung eine Blockade des Proteins hervorgerufen wird. Die eingesetzten BH3-Mimetika haben unterschiedliche Bindungsprofile und können daher ein, zwei oder mehrere Proteine der Bcl-2-Familie inhibieren. Die verwendeten Inhibitoren BH3I-2, HA14-1 und ABT-737, die nur eine limitierte Wirkung auf den Zelltod von Gliomzellen entfalteten, sind allesamt nicht in der Lage, Mcl-1 zu blockieren. Deshalb wurde zusätzlich ein Pan-Bcl-2-Inhibitor, das (-)-Gossypol, verwendet. Dieser Inhibitor hemmt alle anti-apoptotischen Bcl-2-Familienmitglieder, und steigerte über die Inhibition und Degradation von Mcl-1 effizient den Zelltod von Gliomzellen. Dagegen zeigte die (-)-Gossypol-Behandlung in nicht transformierte Astrozytenkulturen keine zytotoxischen Effekte. Zusätzlich wurde nachgewiesen, dass durch das BH3-Mimetikum (-)-Gossypol ein autophagischer Zelltod induziert wird. Unter der Verwendung eines charakteristischen Markerproteins, dem LC3-Protein, konnte nach Induktion des nicht-apoptotischen, autophagischen Zelltodes durch (-)-Gossypol eine Translokation von GFP-LC3 in die Autophagosomen und Autolysosomen festgestellt werden. Viele Gliome weisen eine Methylierung des MGMT-Promotors auf, die es den Zellen erschwert, schnell DNA-Schäden zu reparieren. Aufgrund dieser Methylierung sind diese Tumoren sensitiv für eine Behandlung mit alkylierenden Substanzen (Temozolomid). Auf Grundlage dieser Beobachtungen wurden die kombinatorischen Effekte von BH3 Mimetika und Temozolomid in MGMT-positiven (U87) und MGMT-negativen (U343) Gliomzelllinien verglichen, wobei sich lediglich in MGMT-negativen U343-Gliomzellen signifikante, kombinierte Effekte ergaben. Dieser Zelltod war mit einer Potenzierung der Autophagie assoziiert, nicht jedoch mit einer Aktivierung von Caspasen und einer lysosomalen Dysfunktion. Die Depletion des endogenen Autophagieinhibitors mTOR bewirkte nach den Behandlungen mit (-)-Gossyol und TMZ einen zusätzlichen zytotoxischen Effekt. Im Gegensatz dazu wurde durch lentivirale RNA-Interferenz gegen die Autophagiegene ATG5 und Beclin1 eine potente Reduktion der zellulären Autophagie und des autophagischen Zelltodes erreicht. Insgesamt unterstreichen diese Daten die zentrale Rolle von Bcl-2 Proteinen für die Regulation der Autophagie und legen nahe, dass durch (-)-Gossypol und (-)-Gossypol in Kombination mit Temozlomid in Gliomzellen zytotoxische Autophagie induziert wird.
Mesenchymale Stammzellen (MSC) rücken in der regenerativen Medizin und im Tissue Engineering immer mehr in den Vordergrund. Im Gegensatz zu embryonalen Stammzellen bergen sie keine ethischen Probleme und sind leicht zu isolieren. Die ursprünglich aus Knochenmark gewonnenen MSC können inzwischen aus vielen verschiedenen Quellen wie Nabelschnurblut [Kern et al. 2006], Dentalgewebe [Huang et al., 2009], Plazenta [Huang et al., 2009], Haut [Salvolini et al., 2009] und aus Fettgewebe isoliert werden [Zuk et al., 2001]. Der Immunphänotyp variiert zwischen den aus verschiedenen Quellen gewonnenen MSC nur gering. Die Gewinnung aus Fettgewebe hat den Vorteil, dass eine minimal invasive Prozedur und eine hohe Ausbeute zusammenkommen. Die Stammzellen aus Fettgewebe (ASC) können in der Therapie eingesetzt werden und zu der Regeneration von Geweben nach Verletzungen beitragen [Wong et al., 2008; Poulsom et al., 2001]. Der genaue Mechanismus mit dem die Stammzellen wirken ist allerdings noch nicht geklärt. Sowohl die Integration der MSCs in das Gewebe als auch ein rein parakriner Einfluss wurden nachgewiesen. Klar ist nur, dass ein positiver Effekt von einer Therapie mit MSC ausgeht [Mizuno et al., 2009]. In vivo sind Zellen verschiedenen Einflüssen ausgesetzt, die den Zustand einer Zelle bestimmen. Lösliche Faktoren wie Wachstumsfaktoren, Hormone oder Vitamine wirken dabei ebenso wie die extrazelluläre Matrix und Zell-Zell-Kontakte auf die Zelle ein, die mit Wachstum, Zellform, Differenzierung oder Ähnlichem antwortet. In meiner Arbeit wurden daher drei unterschiedliche Ansätze für die in vitro Differenzierung von ASC in epitheliale Tubuluszellen untersucht: (1) die Wirkung von löslichen Faktoren, die dem Medium zugesetzt wurden, (2) der Einfluss der extrazellulären Matrix aus zum einen Tubuluszellen und zum anderen Matrigel und (3) die Co-Kultur, bei der auch direkter Zell-Zell-Kontakt untersucht wurde. Damit, und mit einer Kombination der einzelnen Bereiche, sollte das natürliche Umfeld der Tubuluszellen simuliert werden und epitheliale Differenzierung initiieren. Die Zugabe von ATRA, ActA und BMP-7 führte zu einer Differenzierung in die epitheliale Richtung, während die extrazelluläre Matrix aus Tubuluszellen nicht dafür ausreichte. Matrigel hingegen, konnte besonders in der Verbindung mit konditioniertem Medium eine Differenzierung induzieren. Die indirekte Co-Kultur über Membraneinsätze, über die u. a. der parakrine Einfluss der Tubuluszellen untersucht werden sollte, führte zu morphologischen Veränderungen der ASC, die aber nicht mit den hier verwendeten epithelialen Markern nachgewiesen werden konnte. Der direkte Zell-Zell-Kontakt zeigte eine Reduktion des Oberflächen Markers CD90 verbunden mit einer Erhöhung der Expression von CK18. Die Differenzierung von ASC in epitheliale Zellen ist also auf drei verschiedenen Wegen möglich. Zwischen verschiedenen Isolationen von ASC traten hohe Schwankungen bezüglich der Expression von Oberflächenmarkern und Proliferation auf, was auch einen Einfluss auf die Differenzierung haben könnte. Ein Grund dafür könnte die Heterogenität von ASC sein. Zur Reduzierung dieser wurden daher ein Waschschritt eine Stunde nach Kulturbeginn und eine immunomagnetische Isolation mit CD49a, CD90, CD105 oder CD271 durchgeführt. Die immunomagnetische Aufreinigung führte nur zu einer leichten Verbesserung der Heterogenität, aber zu einer sehr geringen Zellausbeute. Für den Waschschritt konnte gezeigt werden, dass die Expression der Stammzellmarker Nestin, oct4 und sall1 signifikant erhöht und Desmin und smA Expression reduziert wurden, was auf eine Reduktion der Heterogenität hindeutete. Der zusätzliche Waschschritt kann also schnell und unkompliziert die Heterogenität der ASC reduzieren. Die Differenzierung von ASC in epitheliale Tubuluszellen durch den Einfluss von Zell-Zell-Kontakten zeigt vielversprechende Ansätze und sollte weiter verfolgt werden. Eine verlängerte Kulturdauer sollte dabei angestrebt werden, da auch die adipogene Differenzierung zumeist erst nach 14 bis 21 Tagen nachweisbar war. Dafür müsste die Markierung mit CellTracker länger nachweisbar sein. Eine Inhibierung der Proliferation könnte die Grundlage dazu liefern. Um den Stand der Differenzierung in die epitheliale Richtung nachzuweisen, könnten andere epitheliale Marker, Ionenkanäle, die erst spät in den Tubuluszellen angelegt werden, und funktionelle Mechanismen untersucht werden. Das Zusammenspiel der verschiedenen Einflüsse auf die Zelle könnte ebenfalls noch genauer untersucht werden. Für die Regenerative Medizin ist es aus Gründen der GMP sinnvoller, die Zellen nur mit dem Zusatz an löslichen Faktoren zu differenzieren. Der Ansatz mit ATRA, ActA und BMP-7 scheint sehr vielversprechend zu sein und könnte in dieser Hinsicht weiter ausgebaut werden.
In prokaryotes, RNA thermometers regulate a number of heat shock and virulence genes. These temperature sensitive RNA elements are usually located in the 5'-untranslated regions of the regulated genes. They repress translation initiation by base pairing to the Shine–Dalgarno sequence at low temperatures. We investigated the thermodynamic stability of the temperature labile hairpin 2 of the Salmonella fourU RNA thermometer over a broad temperature range and determined free energy, enthalpy and entropy values for the base-pair opening of individual nucleobases by measuring the temperature dependence of the imino proton exchange rates via NMR spectroscopy. Exchange rates were analyzed for the wild-type (wt) RNA and the A8C mutant. The wt RNA was found to be stabilized by the extraordinarily stable G14–C25 base pair. The mismatch base pair in the wt RNA thermometer (A8–G31) is responsible for the smaller cooperativity of the unfolding transition in the wt RNA. Enthalpy and entropy values for the base-pair opening events exhibit linear correlation for both RNAs. The slopes of these correlations coincide with the melting points of the RNAs determined by CD spectroscopy. RNA unfolding occurs at a temperature where all nucleobases have equal thermodynamic stabilities. Our results are in agreement with a consecutive zipper-type unfolding mechanism in which the stacking interaction is responsible for the observed cooperativity. Furthermore, remote effects of the A8C mutation affecting the stability of nucleobase G14 could be identified. According to our analysis we deduce that this effect is most probably transduced via the hydration shell of the RNA.
Long-range tertiary interactions determine the three-dimensional structure of a number of metabolite-binding riboswitch RNA elements and were found to be important for their regulatory function. For the guanine-sensing riboswitch of the Bacillus subtilis xpt-pbuX operon, our previous NMR-spectroscopic studies indicated pre-formation of long-range tertiary contacts in the ligand-free state of its aptamer domain. Loss of the structural pre-organization in a mutant of this RNA (G37A/C61U) resulted in the requirement of Mg2+ for ligand binding. Here, we investigate structural and stability aspects of the wild-type aptamer domain (Gsw) and the G37A/C61U-mutant (Gswloop) of the guanine-sensing riboswitch and their Mg2+-induced folding characteristics to dissect the role of long-range tertiary interactions, the link between pre-formation of structural elements and ligand-binding properties and the functional stability. Destabilization of the long-range interactions as a result of the introduced mutations for Gswloop or the increase in temperature for both Gsw and Gswloop involves pronounced alterations of the conformational ensemble characteristics of the ligand-free state of the riboswitch. The increased flexibility of the conformational ensemble can, however, be compensated by Mg2+. We propose that reduction of conformational dynamics in remote regions of the riboswitch aptamer domain is the minimal pre-requisite to pre-organize the core region for specific ligand binding.
Feral cats (Felis catus), introduced into Australia with European settlers in the 19th century, colonized the entire Australian continent in less than 100 years, including the Australian arid zone which covers more than 70% of the continent. Feral cats are responsible for the decline and extinction of a number of native species and the failure of a number of reintroduction attempts, especially in the arid zone. Many ecological studies on feral cats have been conducted on home range size and movement patterns in different environments, abundance and diet, with the aim of gaining a better understanding about their successful invasion of the Australian continent. There are no physiological studies on the feral cat to date. However, there is evidence that there is a strong interrelation between physiology and abiotic factors such as climate. Thus, distribution, habitat, and dispersal of species can not fully be understood without background knowledge of physiology. This PhD aims to contribute to a better understanding of three physiological parameters: metabolism, body mass and body temperature patterns. These parameters may possibly identify physiological adaptation to different climate zones, seasonal conditions and island isolation.
Wastewater treatment plants (WWTPs) do not eliminate micropollutants completely and are thus important point sources for these substances. In particular, concerns about en-docrine disrupting compounds in WWTP effluents give rise to the implementation of advanced treatment steps for the elimination of trace organic contaminants. The present study investigated ozonation (O3) and activated carbon treatment (AC) at two WWTPs. For an ecotoxicological assessment at WWTP Regensdorf, conventionally treated wastewater, wastewater after ozonation, and ozonated wastewater after sand filtration were evaluated in parallel via the fish early life stage toxicity test (FELST) using rainbow trout (Oncorhynchus mykiss). Additionally, a comparative toxicity evalu-ation of ozonated and activated carbon treated effluents was performed at the pilot scale treatment plant in Neuss (WWTP Neuss). For this purpose, four invertebrate tests and one higher plant toxicity test were selected to assess potential biological effects on or-ganisms [Lemna minor growth inhibition test, chironomid toxicity test with Chironomus riparius, Lumbriculus variegatus toxicity test, comet assay with haemolymph of the zebra mussel (Dreissena polymorpha), reproduction test with Potamopyrgus antipo-darum]. All in vivo assays were performed on site at the treatment plants in flow-through test systems. Furthermore, the present study investigated the effects of ozona-tion and activated carbon treatment on endocrine activities [estrogenicity, anti-estrogenicity, androgenicity, anti-androgenicity, aryl-hydrocarbon receptor (AhR) agonistic activity] with yeast based bioassays using solid phase extracted water samples. To evaluate the removal of in vitro non-specific toxicity, a cytotoxicity assay using a rat cell line was applied. The FELST at WWTP Regensdorf revealed a considerable developmental retardation of test organisms exposed to ozonated WW. This was accompanied by a significant decrease in body weight and length compared to reference water, to the conventionally treated WW, and to the ozonated water after sand filtration. Hence sand filtration obvi-ously prevents from adverse ecotoxicological effects of ozonation. An additional test – starting with yolk-sac larvae – resulted in a significant reduction of vitellogenin levels in fish exposed to ozonated wastewater compared to fish reared in conventionally treat-ed wastewater. This demonstrates the effective removal of estrogenic activity by ozonation. At WWTP Neuss, the reproduction test with the mudsnail P. antipodarum exhibited a decreased reproductive output after advanced treatment compared to conventional treatment. This indicates an effective estrogenicity removal by ozonation and activated carbon treatment and is confirmed by results of the yeast estrogen screen with a reduc-tion of in vitro estrogenic activity by > 75%. The L. variegatus test revealed a signifi-cantly enhanced toxicity after ozonation compared to conventional treatment, whereas this effect was reduced following subsequent sand filtration. When ozonation was applied, a significantly increased genotoxicity was observed, detected with the comet assay using haemolymph of the zebra mussel. Again, this effect was removed by subsequent sand filtration to the level of conventional treatment. Activated carbon treatment even resulted in a significant reduction of genotoxicity. At both treatment plants, adverse effects after ozonation may have been a result of the formation of toxic oxidation by-products. However, sand filtration reduced toxication effects, indicating that these oxidation by-products are readily degradable or adsorbable. The results point out that, in any case, ozonation should not be applied without subsequent biologically active post treatment appropriate for oxidation by-products removal (e.g. sand filtration). However, only activated carbon achieved a toxicity reduction compared to the conventional treated wastewater. Thus, it cannot be excluded that po-tential beneficial effects due to ozonation might be masked by residual toxic oxidation by-products passing the sand filter or ozonation is not as effective in toxicity removal as PAC treatment. The yeast based assays with solid phase extracted samples revealed an effective endo-crine activity removal during ozonation and activated carbon filtration (estrogenicity: 77 – 99%, anti-androgenicity: 63 – 96%, AhR agonistic activity: 79 – 82%). The cyto-toxicity assay exhibited a 32% removal of non-specific toxicity after ozonation com-pared to conventional treatment. Ozonation in combination with sand filtration reduced cytotoxic effects by 49%, indicating that sand filtration contributes to the removal of toxicants. Activated carbon treatment was the most effective technology for cytotoxici-ty removal (61%). Sample evaporation reduced cytotoxic effects by 52% (after activated carbon treatment) to 73% (after ozonation), demonstrating that volatile substances contribute considerably to toxic effects, particularly after ozone treatment. These results confirm an effective removal or transformation of toxicants with receptor mediated mode of action and non-specific toxicants during both investigated treatment steps. However, due to the limited extractability, polar ozonation by-products were neglected for toxicity analysis, and hence non-specific toxicity after O3 is underestimated. In the long run, only on-site comparisons at WW receiving water bodies (e.g. communi-ty analysis of fish, macroinvertebrates, plants, microorganisms) – before and after up-grading WWTPs – allow drawing environmentally relevant conclusions regarding bene-fits and risks of advanced WW treatment methods. Conclusively, the benefits and possible negative impacts have to be carefully evaluated to prove that not more environmental impact will be induced than removed by advanced treatment technologies as each additional treatment requires considerable amounts of energy, resources, and infrastructure facilities. Accordingly, comprehensive sustainable approaches for pollution prevention and wastewater treatment (e.g. source control and source separation) are preferable compared to end-of-pipe treatment systems.
EGFL7 regulates adult neural stem cell maintenance and differentiation by inhibition of Notch1
(2010)
In neurobiology the preexisting dogma on the unchangeability of the adult mammalian brain and its inability to give rise to new neurons has been challenged since the early nineties. Generally, it is now accepted that neurogenesis persists in adults. Progress in developmental and stem cell biology in recent years led to an increasing interest in regeneration-based treatment strategies for damaged tissue of the central nervous system. Thus, the enhancement of the endogenous potential of the brain to repair itself is potentially a feasible therapeutic strategy to treat various types of brain damage. Therefore, it is of great interest to understand the molecular mechanism that regulate adult neurogenesis. One of the prominent pathways suggested to be involved here is the Notch signaling cascade. Previously, it has been shown that various components of Notch signaling are expressed in the stem cell niche of the adult subventricular zone (SVZ) in vivo. Interestingly, a recent study demonstrated that the self-renewal potential of adult neural stem cells (NSCs) isolated from the SVZ depend on Notch signaling in vitro.
Recently, we identified a novel non-canonical Notch ligand termed epidermal growth factor-like domain 7 (EGFL7), which was originally described as a protein secreted by endothelial cells and functionally implicated in cellular responses of the vascular system such as cell migration and blood vessel formation. We were able to show that secreted EGFL7 binds to a region in Notch that is involved in ligand-mediated receptor activation, thus acting as an antagonist of Notch signaling.
The present study identifies neurons of the human and murine brain as a novel source of EGFL7, which suggests functions of EGFL7 in the neural system. Expression analyses by quantitative RT-PCR (qRT-PCR) revealed EGFL7 is down regulated in the adult SVZ, which suggests that endogenous EGFL7 may act as a Notch modulator of NSCs. We assessed the expression of Notch pathway components in adult NSCs isolated from the SVZ of adult mice and demonstrated that inhibition of Notch activity by the γ-secretase inhibitor DAPT reduced the self-renewal potential of NSCs. Accordingly, adenoviral-mediated expression of EGFL7 in vitro decreased Notch-specific signaling and reduced proliferation and self-renewal of NSCs. Conversely, activation of Notch by a constitutive active form of Notch (NICD) rescued the EGFL7-mediated reduction of NSC self-renewal verifying that this effect was directly linked to Notch signaling. Congruent to the reduced proliferation rate measured in vitro, induced expression of EGFL7 in vivo significantly reduced the number of Ki-67 positive cells within the SVZ upon cerebroventricular injection of EGFL7 adenovirus.
Expression analyses in the developing brain showed single EGFL7-positive cells within the marginal zone of the neocortex as measured by in situ hybridization. These cells might be Cajal-Retzius cells, specialized neurons, which specifically express Reelin, which is a protein of the extracellular matrix known to control neuronal migration and differentiation. Interstingly, we could show that Reelin and EGFL7 are expressed in a subtype of neurons of the adult mouse cortex. This implied an interaction of both proteins and was verified by co-immunoprecipitation assays, suggesting an additional role for EGFL7 in neuronal maintenance. QRT-PCR based expression analyses in vitro comparing differentiated and non-differentiated NSCs displayed an increase in EGFL7 expression during the differentiation process, which was paralled by reduced Notch signaling. NSCs differentiated on coverslips coated with EGFL7 differentiated into all three cell types - neurons, oligodendrocytes and astrocytes. EGFL7 favored the formation of neurons as compared to control comparable to the effect of the Notch-inhibitor DAPT. Furthermore, additional oligodendrocytes were formed. These cells displayed a mature morphology with distinct sprouts and branches in contrast to the small and round oligodendrocytes that formed on control coverslips, which resembled us of precursor cells. Neurons and oligodendrocytes were formed at the expense of astrocytes. Congruently to the effect observed in vitro, adenoviral-based expression of EGFL7 in the SVZ yielded a slight induction of neuronal differentiation in vivo. Taken together, these results show for the first time a previously unrecognized role for EGFL7 in the brain by modulation of the Notch pathway in adult NSCs, which changes the proliferation and differentiation potential of adult NSCs in vitro and in vivo.
Eisenhaltige kurze Nervenäste im Oberschnabel dienen offensichtlich ganz unterschiedlichen Vogelarten dazu, die Stärke des Erdmagnetfeldes zu messen und nicht nur seine Richtung wie ein Kompass zu bestimmen. Was die Frankfurter Neurobiologen Dr. Gerta Fleissner und ihr Mann Prof. Günther Fleissner bereits vor einigen Jahren bei Brieftauben entdeckten, können sie jetzt auch für andere Vogelarten belegen.
In dieser Arbeit sollte der Einfluss von Trockenstress auf die Photosyntheserate von einer repräsentativen C3-Art und dreier repräsentativer Arten unterschiedlicher C4-Subtypen vergleichend untersucht werden, wobei die drei Subtypen der C4-Photosynthese im Vordergrund standen. Anhand der ausgewählten Arten der Modell-Gattung Panicum (s.l.), P. bisulcatum (C3), P. bulbosum (NADP-ME), P. miliaceum (NAD-ME) und P. maximum (PCK), konnten die unterschiedlichen Stoffwechseltypen, an phylogenetisch nah verwandten Arten, auf Unterschiede in der physiologischen Antwort auf den abiotischen Stressfaktor Trockenheit untersucht werden. Hierfür wurden zwei verschiedene Arten der Trockenstressinduktion durchgeführt. Ein Vergleich der Arten in Hinblick auf Unterschiede in der Trockentoleranz erfolgte anhand von Hydrokulturversuchen mit PEG6000 als Osmotikum. In diesem Fall wurde der jeweilige Stress sehr schnell induziert und über die Dauer von 6 Tagen in unterschiedlichen Intensitäten konstant gehalten. Anhand der durchgeführten Gaswechselmessungen und Bestimmungen der Chlorophyllfluoreszenzparameter konnte eindeutig die C3-Art P. bisulcatum als die am sensitivsten auf Trockenstress reagierende Art identifiziert werden. Die drei C4-Arten lagen in ihrer physiologischen Antwort auf die unterschiedlichen Trockenstressintensitäten verhältnismäßig nah zusammen. Bei schwächerem osmotischen Stress zeigte aber P. miliaceum, der Vertreter des NAD-ME Subtyps, eindeutig die geringste Beeinflussung der untersuchten Photosyntheseparameter, was im Wesentlichen auch bei stärkerem osmotischen Stress bestätigt wurde. Zudem zeigte P. miliaceum bei 1400 ppm CO2 im Messgas im Vergleich zu den anderen getesteten Arten eine signifikant höhere Wassernutzungseffizienz, was die bessere Anpassung des NAD-ME Subtypen an osmotischen Stress unterstreicht. Bei dem Trockenstressexperiment in Erde stand die physiologische Maximalantwort auf den natürlicheren, verhältnismäßig langsam induzierten, aber letztendlich starken Trockenstress im Vordergrund. Hier wurde für jede Art untersucht, welche limitierenden Faktoren unter Trockenstress auf die Photosyntheserate wirken. Dafür wurde neben Gaswechsel- und Chlorophyllfluoreszenzmessungen mit der Bestimmung der In-vitro-Aktivitäten der Enzyme des C4-Zyklus, der Bestimmung der PEPC und RubisCO-Gehalte anhand von SDS-PAGE und Western-Blot-Analysen, und der Bestimmung des Deepoxidationsgrades des Xanthophyllzykluses ausgewählte Teilreaktionen der C4-Photosynthese genauer untersucht. Bei allen untersuchten C4- Arten konnte bei dem starken Trockenstress eine eindeutige nicht-stomatäre Limitierung der Photosyntheserate festgestellt werden. Bei der C3-Art P. bisulcatum sprechen die Ergebnisse für eine Mischung aus stomatären und nicht-stomatären Faktoren, die die Photosynthese unter Trockenstress limitieren. Hier konnte eine Abnahme des RubisCO-Gehalts unter Trockenstress beobachtet werden, was ein möglicher Faktor für eine nicht-stomatäre Limitierung der Photosyntheserate unter Trockenstress sein kann. Aufgrund der im Mittel reduzierten In-vitro-Aktivitäten der Enzyme des NADP-ME C4-Zyklus (PPDK, PEPC, NADP-MDH und NADP-ME) und einer Abnahme des PEPC- und RubisCOGehalts bei trockengestressten P. bulbosum im Vergleich zu der entsprechenden Kontrolle, konnte bei dem Vertreter des NADP-ME Subtyps die nicht-stomatäre Limitierung der Photosyntheserate auf eine generelle Abnahme der an der C4-Photosynthese beteiligten Enzyme zurückgeführt werden. Anhand der Bestimmung der In-vitro-Aktivitäten von P. maximum konnte gezeigt werden, dass die als Nebenweg beschriebene Decarboxylierung des CO2 über das NAD-ME in den BSZ, wahrscheinlich im gleichen Maße abläuft wie der von KANAI und EDWARDS (1999) beschriebene Hauptweg (Decarboxylierung in den BSZ durch die PCK). Die beobachtete nicht-stomatäre Limitierung der Photosyntheserate unter Trockenstress wurde auf eine mögliche Abnahme der In-vitro-Aktivitäten des sogenannten Nebenweges zurückgeführt. Bei P. miliaceum, dem repräsentativen Vertreter des NAD-ME Subtyps, zeigte keines der C4-Enzyme eine Abnahme der In-vitro-Aktivität, noch konnte eine Abnahme des RubisCO Gehalts unter Trockenstress im Vergleich zur Kontrolle beobachtet werden. Diese Beobachtung deutete auf eine In-Situ-Inhibierung eines der C4-Enzyme hin. Aus diesem Grund wurden in dieser Arbeit bei P. miliaceum weiterführende Untersuchungen zur posttranslationalen Regulation der PEPC durchgeführt. Obwohl die PEPC unter Trockenstress in phosphorylierter und somit aktiver Form vorliegt, konnte gezeigt werden, dass bei trockengestressten P. miliaceum eine In-Situ-Inhibition der PEPC aufgrund einer Feedback-Inhibition durch das unter Trockenstress in den MZ akkumulierende Transportmetabolit Aspartat wahrscheinlich ist und somit die Photosyntheserate limitieren kann.
Im ersten Teil der Arbeit wurde eine genetische Disposition für Vorhofflimmern (VHF) untersucht. Der Einzelnukleotidpolymorphismus ("single nucleotide polymorphism", SNP) 38G/S befindet sich im N-Terminus der ß-Untereinheit KCNE1. Diese ß-Untereinheit konstituiert gemeinsam mit der alpha-Untereinheit KCNQ1 die langsame Komponente des verzögerten Gleichrichterstromes, IKs. Die ß-Untereinheit hat hierbei eine modulierende Funktion. Frühere Studien beschäftigten sich hauptsächlich mit der transmembranären Domäne und dem C-Terminus. Über die Rolle des N-Terminus war bislang wenig bekannt. Das Ziel der vorliegenden Arbeit war es, die Aufgabe des N-Terminus bei der Modulation der alpha-Untereinheit zu identifizieren. Außerdem sollte festgestellt werden, welche Aminosäuren hierbei besonders von Bedeutung sind. Zu diesem Zweck wurden diverse Konstrukte synthetisiert. Für das Konstrukt delta1-38’ wurden die Aminosäuren 1-38 und damit der Großteil des N-Terminus entfernt. Das Konstrukt "linker" enthält anstelle des Glyzins oder Serins an Position 38 fünf Alanine. In der Nähe der von dem SNP betroffenen Aminosäure befinden sich des Weiteren drei Arginine, die mit jeweils einem Alanin substituiert wurden. Für alle Versuche diente die nicht VHF-assoziierte Variante des SNPs als Kontrolle. Alle Konstrukte konnten erfolgreich heterolog exprimiert werden und gleichermaßen mit der alpha-Untereinheit immunopräzipitiert werden. Die aus der Co-Transfektion von KCNQ1 und KCNE1 resultierende Stromdichte wurde mittels "Patch-clamp"-Technik untersucht. Im Vergleich zum Kontrollstrom (KCNQ1 + KCNE1-38S) waren die Ströme aller anderen Gruppen während De- und Repolarisation signifikant kleiner. Zellfraktionierung und konfokale Mikroskopie zeigten, dass im Vergleich zur Kontrolle alle anderen Konstrukte eine verminderte Plasmamembranlokalisation aufwiesen. Die Aufgabe des N-Terminus liegt offensichtlich im Transport beider Untereinheiten an die Plasmamembran und/oder der Verankerung dort. Sowohl die Aminosäure in Position 38 als auch die drei N-terminalen Arginine in der Nähe scheinen für den hier gesuchten Mechanismus von Bedeutung zu sein. Zukünftige Experimente könnten beispielsweise 3D-Simulationen der Proteinfaltung beinhalten, um die potentielle Membranverankerung weiter zu untersuchen. Der zweite Teil der Arbeit untersuchte erworbene elektrophysiologische Veränderungen im Rahmen von VHF am Beispiel der einwärts gleichrichtenden Kaliumströme IK1 und IKACh. Es sollten die zugrunde liegenden regulatorischen Mechanismen für die Heraufregulierung von IK1 und IKACh bei VHF untersucht werden. Alle Experimente wurden an humanem Gewebe des linken Vorhofs durchgeführt. Das Gewebe stammt von VHF-Patienten, die sich einer Mitralklappen-Operation unterzogen. Als Kontrolle wurde Gewebe von Patienten im Sinusrhythmus (SR) verwendet. Zunächst wurde untersucht, ob transkriptionelle und/oder posttranskriptionelle Veränderungen oder funktionelle Effekte der Heraufregulierung der Ströme zugrunde liegen. Entsprechend wurde die Proteinexpression mittels Western Blot quantifiziert. Die Quantifizierung der mRNA erfolgte per Realtime-PCR. Veränderungen für IK1 konnten sowohl auf mRNA- als auch auf translationaler Ebene beobachtet werden. Protein- und mRNA-Expression von Kir2.1, der zugrunde liegenden Proteinuntereinheit, waren bei VHF signifikant erhöht; die Expression der inhibitorischen miR-1 war reduziert. Die Bestimmung der Protein- und mRNA-Expression der zugrunde liegenden Proteinuntereinheiten für den Strom IKACh zeigte dagegen keinen Unterschied zwischen Gewebe von Patienten mit VHF und SR. Eine funktionelle Regulierung schien daher möglich. Die Expression der IKACh modulierenden Proteine Calmodulin und G alpha i-3 unter VHF zeigte jedoch keinen signifikanten Unterschied zu der SR-Gruppe. Es war eine Tendenz zur Reduktion des inhibierenden G alpha i-3 zu beobachten. Die Regulierung von IKACh,c bei VHF bleibt in zukünftigen Arbeiten zu untersuchen. Ein möglicher Versuch wäre, therapeutisch in die Regulation der Kir-Untereinheiten einzugreifen, um das VHF-unterstützende, elektrische "Remodeling" des IK1 zu verhindern.
In dieser Arbeit wurde ein Verfahren entwickelt, mit dem die Entfaltung von Proteinen simuliert werden kann. Anhand der Simulation kann die Schmelztemperatur bestimmt und damit die Thermostabilität einer Struktur untersucht werden. Außerdem ist die Untersuchung struktureller Veränderungen möglich, die während der Entfaltung auftreten und letztendlich zum globalen Zerfall der Struktur führen. Die Bereiche, von denen der globale Zerfall der Struktur ausgeht, können bestimmt werden. Es wurde untersucht, inwieweit diese Entfaltungsregionen Strukturbereiche darstellen, deren Mutation die thermische Stabilität der Struktur beeinflusst. Das entwickelte Verfahren basiert auf der Anwendung von Methoden aus der Rigiditätstheorie. Die thermische Entfaltung der Strukturen wird über das sukzessive Aufbrechen nichtkovalenter Wechselwirkungen in den Netzwerken simuliert. An-sätze aus der Perkolations- und Netzwerktheorie werden verwendet, um die Rigidität und Flexibilität in den Netzwerken während der Entfaltung zu untersuchen. Diese unter dem Begriff der Analyse statischer Netzwerke (constraint network analysis, CNA) zusammengefassten Methoden wurden im ersten Teil dieser Arbeit auf einen Datensatz homologer meso- und thermophiler Proteine angewendet. Dabei wurde untersucht, ob die thermophile Anpassung tatsächlich über eine Rigidisierung der Struktur erfolgt. Außerdem wurde die Theorie der korrespondierenden Zustände getestet, die besagt, dass bei der thermophilen Anpassung trotz globaler Rigidisierung für die Bioaktivität wichtige flexible Bereiche konserviert sind. Mit Hilfe der CNA wurden Entfaltungsregionen der Proteine aus dem Datensatz bestimmt und mit Strukturbereichen verglichen, in die thermostabilisierende Mutationen eingeführt wurden. Außerdem wurde untersucht, inwieweit vorhergesagt werden kann, ob eine möglicherweise thermostabilisierende Mutation die Aktivität negativ beeinflusst. Für zwei Drittel der thermophilen Proteine aus dem Datensatz konnte eine höhere Thermostabilität vorhergesagt werden als für das entsprechende mesophile Protein. Es konnte zudem gezeigt werden, dass die thermophile Anpassung dieser Proteine tatsächlich über eine Rigidisierung der Struktur erfolgt. Offensichtlich werden bei der Anwendung der CNA implizit alle möglichen Mechanismen der thermophilen Anpassung berücksichtigt. Die für zwei Paare meso- und thermophiler Proteine vorhergesagten Entfaltungsregionen stimmten sehr gut mit Bereichen überein, in die thermostabilisierende Mutationen eingeführt wurden. Damit wurde gezeigt, dass die CNA hilfreich zur Unterstützung des Protein Engineering ist, da die thermische Stabilität einer Struktur abgeschätzt werden kann, andererseits Hinweise darauf gegeben werden, in welchen Bereichen der Struktur thermostabilisierende Mutationen eingeführt werden können. Anhand des Vergleichs mikroskopischer Stabilitäten homologer Proteine konnte gezeigt werden, dass die CNA ein Abschätzen des Effekts einer thermostabilisierenden Mutation auf die Aktivität erlaubt, was wiederum für den Einsatz der CNA zur Unterstützung des Protein Engineering spricht. Im zweiten Teil dieser Arbeit wurde die CNA auf eine Serie von Phytasen unterschiedlicher Thermostabilitäten angewendet. Da es sich bei den Phytase-Strukturen um Homologie-modelle handelte, die nicht direkt mit der Analyse statischer Netzwerke untersucht werden konnten, wurde eine ensemblebasierte CNA etabliert. Dazu wurden kurze MD-Simulationen zur Verbesserung der homologiemodellierten Strukturen durchgeführt, aus denen dann ein konformationelles Strukturensemble extrahiert wurde. Aus den konformationellen Ensembles werden Thermostabilitäten vorhergesagt. Bei der Vorhersage der Thermostabilitäten ergab sich eine bemerkenswert gute Übereinstimmung mit experimentell bestimmten relativen Halbwertszeittemperaturen. Bereiche mit hoher Entfaltungsregionwahrscheinlichkeit stimmen gut mit Regionen überein, in denen thermostabilisierende Mutationen experimentell eingeführt wurden. Diese Ergebnisse offenbaren, dass mit der Entwicklung der ensemblebasierten CNA die methodischen Grundlagen für den Einsatz des Verfahrens zur Unterstützung des Protein Engineering von Phytasen geschaffen wurden.
Der Neocortex der Säugetiere weist charakteristische Schichtungen auf, und jede dieser Schichten enthält verschiedene Typen von Neuronen, die in stereotypen Mustern angeordnet sind. Die Ausbildung dieser geschichteten Struktur ist nur dann möglich, wenn korrekte Migration von Neuronen von proliferativen Zonen zu deren Endpositionen stattfindet. Die exakte Migration und Schichtung wird von Mutationen beeinflusst, die entweder die migratorische Fähigkeit der Neuronen beeinträchtigen, oder deren Fähigkeit, die Position zu erkennen, an der sie die Wanderung beenden sollten (Gupta et al., 2002, Rice et al., 2001, Walsh et al., 2000). In den letzten Jahren wurde das extrazelluläre Protein Reelin als wichtiger Faktor bekannt, der sich auf mehrere Schritte der neuronalen Migration und Schichtung in der Großhirnrinde auswirkt (zusammengefasst in (Tissir et al., 2003). Das sekretierte Glykoprotein Reelin kontrolliert die Migration der Neuronen durch die Bindung an zwei Lipoproteinrezeptoren, den Very-low-density lipoprotein Rezeptor (VLDLR) und den Apolipoprotein E Rezeptor 2 (ApoER2) (D'Arcangelo et al., 1999). Die Bindung von Reelin an ApoER2 und VLDLR ruft die Phosphorylierung von Disabled-1 (Dab1) (D'Arcangelo et al., 1999, Howell et al., 1997), einem Adapterprotein, das an die intrazelluläre Domäne der Rezeptoren bindet, hervor, indem sie Kinasen der Src-Familie (SFKs) aktiviert (Arnaud et al., 2003, Bock et al., 2003a). Außer der Bedeutung des Reelin-Signalwegs für die korrekte Entwicklung des Nervensystems und dem Wissen, dass die Unterbrechung dieses Signalwegs zu verschiedenen neurologischen Krankheiten wie Epilepsie, Schizophrenie und der Alzheimerkrankheit führt (Costa et al., 2002, Botella-Lopez et al., 2006, Herz et al., 2006), ist die molekulare Grundlage der Aktivierung dieses Signalwegs an der Zellmembran noch kaum charakterisiert. Da VLDLR und ApoER2 keine intrinsische Kinaseaktivität besitzen, wurde die Existenz eines Korezeptors für mindestens eine Dekade vermutet, und die genaue Natur dieses Korezeptors ist unbekannt. EphrinBs, Transmembranliganden für Eph-Rezeptoren, besitzen die Fähigkeit zur Signalgebung, die für synaptische Plastizität und Angiogenese durch Sprossung erforderlich ist, indem sie die Aktivität anderer Transmembranrezeptoren wie AMPAR beziehungsweise VEGFR2 beeinflussen (Sawamiphak et al., 2010b, Segura et al., 2007, Essmann et al., 2008). Darüber hinaus führt die Stimulation von cortikalen Neuronen in Kultur mit löslichen EphB-Rezeptoren zur Rekrutierung und Aktivierung von SFKs in Membranpatches, in denen sich ephrinB-Liganden befinden (Palmer et al., 2002). Deshalb nehmen wir an, dass ephrinB in vivo funktionell mit dem Reelin-Signalweg verbunden sein könnte. Der Fokus dieser Arbeit liegt darin, zu zeigen, dass das neuronale Wegweisermolekül ephrinB einen entscheidenden Korezeptor für die Reelin-Signalgebung während der Entwicklung geschichteter Strukturen im Gehirn darstellt. Um zu erforschen, ob ephrinB und die Reelin-Signalgebung in vivo genetisch interagieren, wurden zuerst Mäuse mit Compound-Mutationen hergestellt, die eine Nullmutation im Gen für ephrinB3 tragen und heterozygot für Reelin sind (rl/+; b3-/-). Reeler ist eine autosomal rezessive Mutation der Maus, die, wenn sie heterozygot auftritt, keinen offenkundigen Phänotyp aufweist (Caviness et al., 1972, Caviness et al., 1978). Wir zeigen, dass ephrinBs genetisch mit Reelin interagieren, da Mäuse mit Compound-Mutationen (rl/+; b3 -/-) und ephrinB1-, B2- und B3-Dreifach-Knockouts die verschiedenen Defekte in der Entwicklung phänokopieren, die im Neocortex, Hippocampus und Cerebellum der reeler-Mäuse beobachtet wurden. Eines der Kennzeichen des reeler-Phänotyps ist die gestörte Schichtung der Großhirnrinde mit einer Marginalzone (MZ), die eine äußerst große Zahl an Zellen enthält (Caviness, 1982). Sowohl die Compound-Mäuse als auch die Triple-ephrinB1B2B3-knockouts zeigten eine Zunahme der Zellzahl in der MZ. Um die cortikalen Defekte detailliert zu charakterisieren, wurde die Verteilung von postmitotischen migrierenden Neuronen im Cortex von rl/+; b3-/- Compound-Mäusen mit Hilfe von unterschiedlichen schichtenspezifischen Markern für früh (Tbr1) (Hevner et al., 2001) und spät entstandene (SatB2 and Brn1) (Britanova et al., 2008, McEvilly et al., 2002) Neuronen, analysiert . Unsere Untersuchungen ließen die veränderte cortikale Schichtung in den rl/+; b3-/- Compound-Mäusen erkennen. So befanden sich früh entstandene Neuronen in den oberen cortikalen Schichten und spät entstandene in den unteren cortikalen Schichten, was für eine outside-in-Schichtung spricht, wie man sie von reeler kennt. Interessanterweise ist eine der frühesten strukturellen Abnormalitäten, die man im reeler-Cortex erkennen kann, die Unfähigkeit, die Preplate, die reich an extrazellulärer Matrix ist, in die Marginalzone und die Subplate aufzuspalten (Sheppard et al., 1997). Zum Zeitpunkt E17.5 zeigten rl/+; b3-/- Compound-Mäuse eine beachtliche Anhäufung von Chondroitin-Sulfat-Proteoglykan (CSPG), einer Komponente der extrazellulären Matrix, im gesamten Neocortex mit einer ungeteilten Schicht an der Oberfläche, welche übermäßig viel CSPG enthielt und somit die abnorme Teilung der Preplate der reeler-Maus nachahmte. Um zu bestätigen, dass die beobachteten Effekte auf die Schichtung des Cortex der rl/+; b3-/- Compound-Mäuse als Folge der Beeinträchtigung der neuronalen Migration auftritt, wurden zusätzlich BrdU-Puls-Experimente durchgeführt. BrdU wird in sich teilende Vorläuferzellen eingebaut und spiegelt deshalb das migratorische Verhalten von neu entstandenen Neuronen zum Zeitpunkt der Injektion wieder. Schwangeren Weibchen wurde BrdU zu den Zeitpunkten E12.5, E15.5 und E17.5 injiziert und die Gehirne wurden am postnatalen Tag 20 ausgewertet. Die Verteilung der mit BrdU gekennzeichneten Neuronen zu verschiedenen Zeitpunkten der Entwicklung in der Großhirnrinde bestätigte unsere Untersuchungen, die mit Hilfe der schichtspezifischen Marker durchgeführt worden waren. Deshalb deuten unsere Ergebnisse an, dass die beobachteten Defekte in der Schichtung des Cortex tatsächlich eine Folge von beeinträchtigter neuronaler Migration sind. Es wurde beobachtet, dass auch geschichtete Strukturen im Hippocampus in den rl/+; b3-/- Compound-Mäusen verändert sind, was für einen Crosstalk zwischen ephrinB3 und Reelin auch während der Entwicklung des Hippocampus spricht. Die CA1-Region des Hippocampus zeigte eine lockere Verbindung der pyramidalen Zellschichten, welche zu einer signifikanten Erhöhung der Dicke dieser Region und zu einer Einwanderung von Pyramidalzellen in das Stratum oriens führte. Darüber hinaus haben die Anomalien in den dendritischen Verzweigungen von Pyramidalneuronen der CA1-Region, die in Richtung der Reelin-produzierenden Cajal-Retzius-Zellen im stratum locunosum moleculare projizieren, in den rl/+; b3-/- Compound-Mäusen eine auffallende Ähnlichkeit mit denen, die in reeler-Mutanten beobachtet wurden. Reelin fungiert auch als Differenzierungsfaktor und Positionierungssignal für radiale Gliazellen, die positiv für glial fibrillary acidic protein (GFAP) sind und ein Gerüst für die korrekte Migration von neu entstandenen Granularzellen, die auf das Netzwerk der Granularzellen im Gyrus dentatus zuwandern (Forster et al., 2002) bilden. In rl/+; b3-/- Compound-Mäusen ist dieses Gerüst aus radialen Gliazellen schwerwiegend beeinträchtigt, was ebenfalls zu einer lockeren Organisation der Granularzellen im Gyrus dentatus führt. Die Ataxie in reeler-Mäusen ist das Ergebnis einer schwerwiegenden Fehlorganisation im Cerebellum dieser Mutanten (Tissir et al., 2003). Interessanterweise wurden nur milde Defekte in den Granularzellen, die sich in der internen Granularschicht des Cerebellums von rl/+; b3-/- Compound-Mäusen angesammelt haben, und keine Defekte in der Migration und der Verzweigung der Purkinjezellschicht, festgestellt. Stattdessen ist ephrinB2 in den Purkinjezellen des Cerebellums stark exprimiert (Liebl et al., 2003) und obwohl keine bedeutenden Defekte der Migration dieser Zellen festgestellt wurden, zeigte die Untersuchung der Verzweigung der Purkinjezellen in b2-/- Mäusen eindeutige Defekte, die bereits in einfachen ephrinB2-Mutanten auftraten. Bedeutend ist, dass die Defekte in der Verzweigung bei rl/+; b2-/- Compound-Mäusen signifikant verstärkt waren, was darauf hindeutet, dass der Reelin-Signalweg im Cerebellum spezifisch ephrinB2 benötigt. Um Einblicke in den Mechanismus zu erhalten, wie ephrinB-Liganden den Crosstalk mit Reelin durchführen, um die korrekte Positionierung von Neuronen in den geschichteten Strukturen des Gehirns zu kontrollieren, wurde als nächstes die biochemische Interaktion dieser beiden Signalwege untersucht. In einer gerichteten proteomischen Untersuchung mit Hilfe der Tandem affinity purification-mass spectometry-Methode (Angrand et al., 2006) von Proteinen aus eine Neuroblastom-Zelllinie, die ephrinB binden, wurde Reelin als ein Protein, das mutmaßlich mit ephrinB interagiert, identifiziert. Zunächst bestätigten wir die Fähigkeit von Reelin, mit ephrinBs zu assoziieren mit Ko-Immunpräzipitation beider endogener Proteine aus Gehirnlysaten. Das extrazelluläre Protein Reelin zeigte eine starke Bindung an die extrazelluläre Domäne von ephrinB3 und auch von ephrinB2, was andeutet, dass beide ephrin-Liganden die Funktionen von Reelin in vivo beeinflussen könnten. Die Stimulierung von cortikalen Neuronen mit Reelin führt zu einer effektiven Tyrosin-Phosphorylierung des Adapters Dab1. Da die Stimulation von cortikalen Neuronen mit einer löslichen, vorgeclusterten Form von EphB-Rezeptoren zur Rekrutierung und Aktivierung von Src-Kinasen in ephrinB-Clustern führt (Palmer et al., 2002), nehmen wir an, dass ephrinBs Src-Kinasen in VLDLR- und ApoER2-Rezeptor-Clustern rekrutieren und aktivieren könnten. Aktivierte Src-Kinasen phosphorylieren dann wiederum das Adapterprotein Dab1, das an VLDLR und ApoER2 gebunden ist und initiieren die weitere Signalgebung. In Übereinstimmung damit ko-immunpräzipitiert phosphoryliertes Dab1 zum Zeitpunkt E16.5 mit ephrinBs, während die neuronale Migration und die Schichtung des Cortex stattfindet. Darüber hinaus konnten wir beobachten, dass ephrinB3, das durch EphB3-Fc aktiviert wurde, sowohl Reelin, als auch ApoER2 und VLDLR in ephrinB3-Membranpatches in cortikalen Neuronen anhäuft. Die Aktivierung von ephrinB-Liganden durch Stimulation von cortikalen Neuronen mit EphB3-Fc führt zur Rekrutierung und Phosphorylierung von Dab1 in ephrinB-Clustern. Als nächstes befassten wir uns mit der Notwendigkeit von der durch ephrinB vermittelten Rekrutierung und Aktivierung von Src-Kinasen für den Reelin-Signalweg, indem wir Loss-of-function-Studien sowohl in cortikalen Neuronen in Kultur als auch in vivo in Mäusen durchführten. Cortikale Neuronen, die aus ephrinB3- und ephrinB2-Knockouts isoliert wurden, zeigten eine signifikante Beeinträchtigung der durch Reelin vermittelten Phosphorylierung von Dab1 und die Phosphorylierungslevels von Dab1 in ephrinB3 Mausmutanten waren stark verringert, was andeutet, dass ephrinBs Korezeptoren, die notwendig für einwandfreie Signalgebung durch Reelin sind, darstellen. Um die Bedeutung von ephrinBs für die Kontrolle der Funktion von Reelin zu untersuchen, arrangierten wir eine Reihe von Rescue-Experimenten sowohl in Neuronenkulturen als auch während der neuronalen Migration im Cortex in vivo. Aus reeler-Mäusen isolierte cortikale Neuronen zeigten die erwartet verringerte Phosphorylierung von Dab1, die rückgängig gemacht werden konnte, indem die Neuronen mit exogenem Reelin stimuliert wurden. Noch bedeutender ist die Tatsache, dass die Phosphorylierung von Dab1 durch die alleinige Aktivierung von ephrinBs mit EphB wiederhergestellt werden konnte, was die Bedeutung der ephrinBs als Korezeptoren für die Aktivierung des Signalwegs über die Rezeptoren für Reelin, VLDLR und ApoER2, wiederspiegelt. Um die Rolle von ephrinBs als Korezeptoren für den Reelin-Signalweg während der neuronalen Migration in der Großhirnrinde zu unterstreichen, setzten wir ähnliche Rescue-Experimente in organotypischen Schnittkulturen an. In den Schnitten von reeler-Mäusen und Wildtyp-Wurfgeschwistern wurde die Migration von Neuronen, die durch Fc als Kontrolle und EphB3-Fc stimuliert wurde, nach drei Tagen in Kultur untersucht. Die reeler-Schnitte zeigten den typischen reeler-Phänotyp in der Großhirnrinde. In Übereinstimmung mit der Annahme einer wirksamen Regulation des Reelin-Signalwegs war die Aktivierung von eprhinB mit EphB-Rezeptoren in der Lage, die migratorischen Defekte in reeler-Schnitten aufzuheben. Zusammengefasst identifizieren unsere Ergebnisse ephrinBs als Korezeptoren für den Reelin-Signalweg, die für die Funktion von Reelin in der neuronalen Migration während der Entwicklung der geschichteten Strukturen der Großhirnrinde, dem Hippocampus und dem Cerebellum notwendig sind. Unsere genetischen Analysen von ephrinB-Mutanten zeigen gemeinsam mit starken biochemischen Untersuchungen, dass ephrinBs in vivo für zahlreiche Aktivitäten von Reelin erforderlich sind.
The plastids of cryptophytes, haptophytes, and heterokontophytes (stramenopiles) (together once known as chromists) are surrounded by four membranes, reflecting the origin of these plastids through secondary endosymbiosis. They share this trait with apicomplexans, which are alveolates, the plastids of which have been suggested to stem from the same secondary symbiotic event and therefore form a phylogenetic clade, the chromalveolates. The chromists are quantitatively the most important eukaryotic contributors to primary production in marine ecosystems. The mechanisms of protein import across their four plastid membranes are still poorly understood. Components of an endoplasmic reticulum-associated degradation (ERAD) machinery in cryptophytes, partially encoded by the reduced genome of the secondary symbiont (the nucleomorph), are implicated in protein transport across the second outermost plastid membrane. Here, we show that the haptophyte Emiliania huxleyi, like cryptophytes, stramenopiles, and apicomplexans, possesses a nuclear-encoded symbiont-specific ERAD machinery (SELMA, symbiont-specific ERAD-like machinery) in addition to the host ERAD system, with targeting signals that are able to direct green fluorescent protein or yellow fluorescent protein to the predicted cellular localization in transformed cells of the stramenopile Phaeodactylum tricornutum. Phylogenies of the duplicated ERAD factors reveal that all SELMA components trace back to a red algal origin. In contrast, the host copies of cryptophytes and haptophytes associate with the green lineage to the exclusion of stramenopiles and alveolates. Although all chromalveolates with four membrane-bound plastids possess the SELMA system, this has apparently not arisen in a single endosymbiotic event. Thus, our data do not support the chromalveolate hypothesis. Key words: Emiliania huxleyi, secondary endosymbiosis, chromalveolate, hypothesis, complex plastid, plastid protein import, algal evolution
1. In dieser Arbeit konnten durch chemische Mutagenese drei Pigmentmutanten erzeugt werden, die entsprechend ihrer Pigmentierung in drei Kategorien eingeteilt wurden:hellorange (OC-Mutante), gelb (YC-Mutante) und weiß (WH-Mutante). 2. Durch MS- und NMR-Analysen konnte die Struktur des von H. halophilus produzierten Carotinoids als Methylglykosyl-3,4-dehydro-apo-8’-lycopenoat aufgeklärt werden. Zusätzlich wurden auch die von der OC-Mutante produzierten Carotinoide als Hydroxy-3,4-dehydro-apo-8’-lycopin und Methylhydroxy-3,4-dehydro-apo-8’- lycopinoat identifiziert. Bei allen Pigmenten handelt sich um 8’-Apoderivate mit einer asymmetrischen Anordnung der Methylgruppen. Diese Art von Carotinoiden konnte zuvor nur in dem marinen Isolat P. maritimus gefunden werden (Shindo et al., 2008) 3. Auf Basis der genetischen und biochemischen Daten hinsichtlich der Carotinoide in H. halophilus konnte ein neuartiger Biosyntheseweg postuliert werden. Dabei beginnt die Synthese des C30-Carotinoids nicht wie bei allen bekannten Pigmenten dieser Art mit der Kondensation von zwei C15-Körpern, sondern durch die Kondensation von einem C10- mit einem C20-Molekül. Durch anschließende Desaturierungen, Hydroxylierungen, Methylierungen und Glykosylierungen entsteht das in H. halophilus identifizierte Carotinoid Methylglykosyl-3,4-dehydro-apo-8’-lycopenoat. Dieser Biosyntheseweg ist bisher einzigartig. 4. Die Carotinoide in H. halophilus sind essentiell für den Schutz der Zellen vor oxidativen Schäden. Während das Wachstum des pigmentierten Wildtyps nur wenig durch die Zugabe von bis zu 150 μM Duroquinon beeinträchtigt wurde, wurde das Wachstum der farblosen Pigmentmutante WH schon ab einer Duroquinonkonzentration von 120 μM vollständig gehemmt. Auch durch in vitro-Versuche konnte die antioxidative Eigenschaft von Methylglykosyl-3,4-dehydro-apo-8’-lycopenoat und der Derivate Hydroxy-,4-dehydro-apo-8’-lycopin und Methylhydroxy-3,4-dehydro-apo-8’-lycopinoat bestätigt werden. Dabei war die Wirksamkeit des Carotinoids aus H. halophilus sogar besser als die der biotechnologisch genutzten Pigmente ß-Carotin und Astaxanthin. 5. Durch Wachstumsexperimente konnte gezeigt werden, dass die Carotinoide auch eine Rolle in der Salzadaptation des Bakteriums spielen. Bei niedrigen Salinitäten zeigten der Wildtyp und die farblose Pigmentmutante keine Unterschiede im Wachstum. Eine hohe NaCl-Konzentration von 3,0 M NaCl führte jedoch zu einem verlangsamten Wachstum der Carotinoidmutante WH. 6. Im Genom von H. halophilus konnten anhand von Sequenzvergleichen mit bereits bekannten Kompetenzproteinen aus B. subtilis eine Reihe von putativen Genen identifiziert werden, die dem Bakterium theoretisch die Fähigkeit zur Ausbildung einer natürlichen Kompetenz verleihen. 7. Um die Fähigkeit von H. halophilus zur natürlichen DNA-Aufnahme zu testen, wurde eine Methode entwickelt, durch die es möglich war, viele unterschiedliche Bedingungen zu analysieren. Als Donor-DNA wurde die chromosomale DNA einer Erythromycin-resistenten Mutante von H. halophilus eingesetzt, die innerhalb dieser Arbeit erzeugt wurde. Insgesamt konnten so über 3000 Ansätze getestet werden. Jedoch konnte bei keiner dieser Bedingungen eine natürliche Kompetenz von H. halophilus festgestellt werden. 8. Innerhalb dieser Arbeit ist es gelungen eine Methode zur effizienten Transformation von H. halophilus zu etablieren. Dabei erfolgte die DNA-Aufnahme durch eine PEGvermittelte Protoplastenfusion. Mit dieser Methode konnten für H. halophilus Transformationseffizienzen von 2-102 Transformanden/μg DNA erreicht werden. 9. Durch die Möglichkeit H. halophilus transformieren zu können, ist es in dieser Arbeit erstmalig gelungen, ein System zur markerlosen Deletion von Genen in H. halophilus zu etablieren. Dabei wurde in einem ersten Schritt ein nicht-replizierendes Plasmid, das den gewünschten mutierten Locus enthält, durch Protoplastenfusion in H. halophilus transformiert. Durch einfach homologe Rekombination konnte das Plasmid in das Genom integrieren. Die so erhaltenen Integranten wurden im zweiten Schritt unter nicht-selektiven Bedingungen für etwa 90 Generationen kultiviert. Hierbei kam es zu einer zweiten homologen Rekombination, wodurch das Plasmid wieder aus dem Genom geschnitten wurde (Segregation). Dies resultierte entweder in den Wildtyp-Locus oder in den gewünschten mutierten Locus. Potentielle Integranten wurden auf einen CmS-Phänotyp getestet und mit Hilfe von Southern-Blot-Analysen verifiziert. 10. Mit Hilfe des in dieser Arbeit etablierten Systems zur markerlosen Mutagenese von H. halophilus wurde eine pro-Mutante generiert, deren proHJA-Operon deletiert war. 11. Überraschenderweise konnte die Mutante immer noch Prolin synthetisieren und war demnach nicht prolinauxotroph. Jedoch war H. halophilus pro nicht mehr in der Lage, Prolin als ein kompatibles Solut zu synthetisieren. Trotzdem zeigte das Wachstum der Mutante unter Hochsalzbedingungen keine Beeinträchtigung. Dies konnte auf eine gesteigerte Akkumulation von Glutamat, Glutamin und Ectoin zurückgeführt werden, wodurch der Verlust von Prolin als Osmolyt kompensiert wurde. 12. Die Expression der Gene glnA2, gltA und ectA, die für Biosyntheseenzyme von Glutamin, Glutamat und Ectoin kodieren, ist in H. halophilus pro induziert. Dabei hatte die Salinität einen stärkeren Einfluss auf die relativen RNA-Mengen von glnA2 und ectA in der pro-Mutante als im Wildtyp. gltA zeigte keine salzabhängige Expression im Wildtyp, der mRNA-Level des Gens stieg jedoch in H. halophilus pro bei hohen Salinitäten um das Doppelte im Vergleich zu Niedrigsalzbedingungen an. 13. Für die Glutaminsynthetase, dem Enzym der Glutaminsynthese, konnte eine gesteigerte spezifische Aktivität nachgewiesen werden. Dabei erhöhte sich die Aktivität mit steigender Salinität, sie war jedoch immer 30 bis 50% höher als im Wildtyp. 14. In dieser Arbeit wurde ein möglicher Biosyntheseweg zur salzunabhängigen Prolinsynthese aufgestellt. Hierbei dient Ornithin als Ausgangsmolekül, das entweder durch eine Ornithin-Aminotransferase (RocD) und eine Pyrrolin-5-Carboxylat-Reduktase (ProC und ComER) oder direkt durch eine Ornithin-Cyclodeaminase (ArcB) zu Prolin umgesetzt wird. Für alle Enzyme konnten die entsprechenden Gene im Genom von H. halophilus identifiziert werden. 15. Vor dieser Arbeit konnte bereits gezeigt werden, dass Prolin das dominante kompatible Solut unter Hochsalzbedingungen ist. Dabei war die Expression des pro-Operons sowohl von der Salzkonzentration als auch vom Anion Chlorid abhängig. Es zeigte sich, dass auch die zelluläre Konzentration von ProJ salzabhängig war, mit einem Maximum bei 2,0 – 3,0 M NaCl. Zudem war der ProJ-Gehalt wachstumsphasenabhängig. Während das Enzym besonders in frühexponentiellen Zellen detektiert werden konnte, sank die zelluläre ProJ-Konzentration kontinuierlich in stationären Zellen. Nach einem Salzschock von 0,8 auf 2,0 M NaCl stieg die ProJMenge nach 2 h leicht an und sank nach 4 h wieder kontinuierlich. Der ProJ-Level war in Gegenwart von NaCl maximal, sank aber nur leicht um 25%, wenn die Zellen mit 2 M Na-Glutamat oder Na-Nitrat inkubiert wurden. Die Prolinbiosynthese in H. halophilus wird demnach auch auf Ebene der Translation und/oder der Proteinstabilität reguliert. 16. Die Aminosäure Prolin wird nicht nur als kompatibles Solut in H. halophilus synthetisiert, sondern kann auch als C- und Energiequelle und als Stickstoffquelle genutzt werden. 17. Liegt Prolin als alleinige C- und Energiequelle im Medium vor, erfolgt eine salzabhängige Akkumulation des Osmolyts in H. halophilus, während der zelluläre mRNA-Level der pro-Gene stark reduziert ist. Prolin wird demnach nicht nur als Cund Energiequelle aufgenommen, sondern auch als kompatibles Solut. 18. Im Genom von H. halophilus konnten zwei Gene, die für die potentiellen Na+/Prolin- Symporter 3541 und 1381 kodieren, identifiziert werden, deren mRNA-Level bei Wachstum auf Prolin induziert war. 19. Durch Aminosäuresequenzvergleiche konnten in dieser Arbeit im Genom von H. halophilus jeweils zwei Isogene gefunden werden, die für potentielle Prolindehydrogenasen (prodh1/prodh2) und Pyrrolin-5-Carboxylat-Dehydrogenasen (p5cdh1/p5cdh2) kodieren. Mittels reverser Transkription von mRNA und anschließender PCR-Analysen konnte gezeigt werden, dass prodh2 und p5cdh2 ein Operon bilden (put-Operon). Eine Quantifizierung der Transkriptmengen der Abbaugene prodh1/p5cdh1 und prodh2/p5cdh2 mittels quantitativer PCR in Zellen, die in Gegenwart von Prolin als alleiniger C- und Energiequelle oder Stickstoffquelle gezogen wurden, zeigten deutlich, dass unter diesen Bedingungen nur die Expression von prodh2/p5cdh2 induziert wurde. Wurden die Zellen in Gegenwart von Glukose als C- und Energiequelle gezogen, stieg die mRNA-Menge von prodh2/p5cdh2 unter Hochsalzbedingungen um den Faktor 10 – 20 im Vergleich zu Zellen, die bei niedrigen Salinitäten kultiviert wurden, an. Die mRNA-Menge des put- Operons war in Glukose-gewachsenen Zellen wachstumsphasenabhängig mit einem Maximum in der stationären Wachstumsphase. In Gegenwart von 1,0 M NaCl stieg die mRNA-Menge um das 20-Fache, in Gegenwart von 3,0 M NaCl um das Doppelte. 20. Mit Hilfe des Systems zur markerlosen Mutagenese in H. halophilus konnte eine glnA2-Mutante generiert und verfiziert werden. H. halophilus glnA2 zeigte keinen Wachstumsphänotyp bei Anzucht in Gegenwart von unterschiedlichen NaCl-Konzentrationen. Die Deletion von glnA2 führte zu einer Inhibierung der salzabhängigen Prolinbiosynthese, während der Glutamat- und Glutaminpool bei allen getesteten Salinitäten im Vergleich zum Wildtyp nicht verändert war. Der Verlust von Prolin als kompatibles Solut konnte teilweise durch einen Anstieg des Ectoinlevels kompensiert werden. Die zelluläre Transkriptmenge von glnA1 und ectA war in H. halophilus glnA2 stärker von der Salinität beeinflusst als im Wildtyp, während die salzabhängige Regulation der proH-Expression aufgehoben wurde. Im Gegensatz zum Wildtyp wurde die spezifische Aktivität der Glutaminsynthetase in H. halophilus glnA2 durch steigende NaCl-Konzentrationen inhibiert.
European pea crabs - taxonomy, morphology, and host-ecology (Crustacea: Brachyura: Pinnotheridae)
(2010)
Pinnotherids are small crabs symbiotic to a variety of invertebrates. The European species infest bivalves and sea squirts. Their way of life is parasitic and poses a threat to commercially exploited bivalves. While juveniles of both sexes still look very similar - being agile swimmers and partially free living - a metamorphosis takes place in the female after mating and results in a conspicuous sexual dimorphism. Thereafter, the female settles in its host definitely and is morphologically strongly adapted to the parasitic life phase. A very high reproductive output was demonstrated among several pea crab species infesting bivalves. Despite from that, hardly any information is present in the literature on the pinnotherids’ reproductive biology and the underlying morphology.
Due to their cryptic way of life, the sexual dimorphism, and the different morphotypes of the female, the taxonomy of the Pinnotheridae is a serious challenge. Two widely accepted species are recognized on European coasts: Pinnotheres pisum and Nepinnotheres pinnotheres. Pinnotheres pectunculi was so far only known from the bivalve Glycymeris glycymeris in its type locality Roscoff (France), while Pinnotheres ascidicola and Pinnotheres marioni were described as living exclusively in ascidians without careful comparison with the previously described species. In order to produce standardized comparative descriptions, pea crabs were collected and studied from different hosts and localities in the Northeast Atlantic and in the Mediterranean. Nepinnotheres pinnotheres and Pinnotheres pisum were redescribed with consideration to characters of female and male. According to our morphological analysis, Pinnotheres ascidicola and Pinnotheres marioni are junior synonyms of Nepinnotheres pinnotheres, whereas the status of Pinnotheres pectunculi as a valid species was ascertained. Important characters are the mouthparts, the male gonopods, and especially chelipeds that showed consistent characteristics among different crab stages of both sexes.
Based on our sampling, we estimated the host-range of the European species. Nepinnotheres pinnotheres lives in ascidians and in the pen shell Pinna nobilis. Pinnotheres pisum infests numerous bivalve species - Pinna nobilis included. For Pinnotheres pectunculi novel host records are presented, all from the bivalve family Veneridae. Furthermore, feeding of the Pinnotheres-species was observed. They use a setae comb ventrally on the claw to brush mucus (and the accumulated food particles) from the bivalve gills. Feeding strategies and host-ecology will be thoroughly discussed in consideration to other Pinnotheridae.
We investigated the reproductive systems of European pinnotherids by histological methods, scanning and transmission electron microscopy, and confocal laser scanning microscopy.
The Eubrachyura have internal fertilization: paired vaginas enlarge into storage structures, the spermathecae, which are connected to the ovaries by oviducts. Sperm is stored until the oocytes are mature and transported into the spermathecae, where fertilization takes place. In the investigated pinnotherids, the vagina is of the ‘concave pattern’. Musculature is attached alongside flexible parts of the vagina-wall to control the dimension of its lumen. The genital opening is closed by a muscular mobile operculum.
The spermatheca can be divided into two distinct regions by function and morphology. The ventral part includes the connection with vagina and oviduct and is regarded as the zone where fertilization takes place. It is lined with cuticle except where the oviduct enters the spermatheca by the ‘holocrine transfer tissue’. At ovulation, the oocytes have to pass through this multi-layered glandular epithelium, which has a holocrine mode secretion. The dorsal part of the spermatheca is lined by a highly secretory apocrine glandular epithelium, which was to date only found in fiddler crabs of the genus Uca.
The male internal reproductive system consists of paired testes and corresponding vasa deferentia. The sperm morphology of pinnotherids conforms to other thoracotremes, with slight differences between Nepinnotheres pinnotheres and Pinnotheres pisum. Spermatozoa become enveloped into spermatophores in the secretory proximal vas deferens. The medial vas deferens is strongly enlarged and stores spermatophores embedded in seminal plasma. The distal vas deferens holds tubular appendices, which extend into the ventral cephalothorax and slightly into the pleon. These appendices produce and store vast quantities of seminal plasma. The copulatory system of the Brachyura is formed by paired penes and two pairs of gonopods, which function in sperm transfer. In pinnotherids, the long first gonopods transfers the sperm mass to the female. It holds the ejaculatory canal inside, which opens proximally and distally. The second gonopod is solid, short and conical. During copulation, the penis and the second gonopod are inserted into the base of the tubular first gonopod. The second gonopod functions in the transport of the sperm mass inside the ejaculatory canal towards its distal opening. The specific shape of the second gonopod is strongly adapted for a sealing of the tubular first gonopod with longitudinal cuticle foldings that interlock inside the first gonopod. The presented results are discussed concerning their function in reproduction and in respect of the systematic account.
The role of secretion in sperm transfer, storage and fertilization among the Brachyura is still under debate. It is notable that structure and function of secretion are more complex in pinnotherids and probably more efficient than in other brachyuran crabs, which will be discussed, in view of the parasitic way of life and the high fecundity of pinnotherids.
Die wichtigste Aufgabe der mitotischen Spindel ist die genaue Segregation der duplizierten Chromosomen in der Mitose. Diese dynamische Struktur wird von sich teilenden Zellen gebildet, um die Bewegung der Chromosomen, das Markenzeichen der Mitose, zu dirigieren. Trotz aller Unterschiede in Form und Größe der Spindeln unterschiedlicher Zelltypen, haben alle eukaryontischen Spindeln fundamentale strukturelle Eigenschaften gemeinsam. Eine der wichtigsten Eigenschaften ist die bipolare Symmetrie. Innerhalb der Spindel sind unterschiedliche Klassen der Mikrotubuli vorhanden, die durch ihre Organisation und durch ihre dynamischen Eigenschaften unterteilt sind. Alle Klassen der Mikrotubuli zeigen dynamische Instabilität. Dennoch weisen die Kinetochor-Mikrotubuli und die Spindel-Mikrotubuli zusätzlich ein anderes Verhalten auf, das als polwärts gerichteter Mikrotubuli-Flux ("Poleward Microtubule Flux") bezeichnet wird. Dabei werden die Tubulin-Untereinheiten stetig an den Plus-Enden der Mikrotubuli eingefügt und dann zu den Minus-Enden getragen, wo sie abgebaut werden. Dieser polwärts gerichtete Mikrotubuli-Flux ist für die Segregation der Chromosomen von großer Bedeutung. Mehrere regulatorische Proteine der Mikrotubuli, einschließlich der destabilisierenden und der depolymerisierenden Proteine, steuern die Dynamik dieser Mikrotubuli, um eine fehlerfreie Bildung der Spindel und eine korrekte Segregation der Chromosomen gewährleisten zu können. Die Kinesin-13 Familie der Depolymerasen gehört zu den prominentesten Modulatoren der Dynamik der Mikrotubuli. Das am Besten charakterisierte und intensiv studierte Mitglied dieser Familie ist das Protein KIF2C/MCAK. Aufgrund der unterschiedlichen Lokalisationen von MCAK während der Mitose, an den Spindelpolen, an den Chromosomen-Armen, an den Centromeren/Kinetochoren, kann MCAK eine Reihe an wichtigen Funktionen erzielen. Allerdings bleibt die Korrektur von Kinetochor-Mikrotubuli Fehlverknüpfungen die wichtigste Aufgabe von MCAK während der Mitose. Diese wesentliche Funktion steht unter der Kontrolle von Aurora B. In dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass MCAK während der Mitose auch von einem wichtigen Komplex, dem Cyclin B1/CDK1 Komplex, reguliert wird. In der Tat steuert die Kinase CDK1 sowohl die Lokalisation als auch die katalytische Aktivität von MCAK. Mit Hilfe einer systematischen Reihe an Experimenten konnte nachgewiesen werden, dass MCAK sowohl in vitro als auch in vivo von CDK1 phosphoryliert wird. CDK1 phosphoryliert den katalytischen Bereich von MCAK genau am Threonin 537 und führt zu einer deutlichen Abnahme der Depolymerisierungsaktivität von MCAK in vitro und in humanen Zellen. Diese Inhibition erfolgt wahrscheinlich durch eine Reduzierung der Affinität von MCAK zu den Mikrotubuli-Enden. Die Expression der Phosphostatus-vortäuschenden Mutante T537E in HeLa-Zellen verursachte eine fehlerhafte Verteilung der Chromosomen in der Mitose. Die Chromosomen waren in Anwesenheit der T537E Mutante nicht mehr in der Lage, sich auf der Metaphaseplatte anzuordnen. Darüber hinaus führte die Expression von T537E zu einer signifikanten Reduzierung des centromerischen Abstandes, was auf eine Anhäufung von Kinetochor-Mikrotubuli Fehlverknüpfungen hindeutet. Ferner zeigt die Expression der nichtphosphorylierbaren Mutante T537A in den HeLa-Zellen eine verstärkte Lokalisation an den Spindelpolen, was zum Auftreten von erheblichen Spindel-Aberrationen führte. Basierend auf den Daten der vorliegenden Arbeit wurde ein Modell entwickelt, in dem die Phosphorylierung von MCAK durch CDK1 früh in der Mitose stattfinden muss, um einerseits MCAK zu inaktivieren und andererseits diese Depolymerase aus den Spindelpolen zu verdrängen. Beide Ereignisse sind für den Aufbau einer bipolaren Spindel unentbehrlich. Zu späteren Zeitpunkten der Mitose muss das Threonin 537 dephosphoryliert werden, um eine Reaktivierung von MCAK an den Centrosomen/Kinetochoren zu ermöglichen. Dies wird die Korrektur-Funktion für Kinetochor-Mikrotubuli Fehlverknüpfungen von MCAK wiederherstellen, was eine korrekte Anordnung der Chromosomen auf der Metaphaseplatte fördert.
Die Zelle repliziert ihre DNA während der S-Phase und segregiert sie dann später in der M Phase des Zellzykluses. Kommt es während dieser Prozesse zu DNA Schädigungen, arretiert die Zelle den Zellzyklus mit Hilfe spezifischer Kontrollmechanismen und versucht den Schaden zu beheben. Der DNA Kontrollpunkt wird bei DNA Schädigungen aktiviert, um mit Hilfe der DNA Reparatur den Schaden zu beheben und somit dafür zu sorgen, dass die DNA fehlerfrei repliziert werden kann. Der zweite Zellzyklus Kontrollpunkt, der Spindel Kontrollpunkt, stellt sicher, dass die Chromosomen während der M Phase unter gleicher Spannung innerhalb der Äquatorialplatte der Metaphase Spindel angeordnet sind. Kann in der Zeit, in der der Zellzyklus Kontrollpunkt aktiv ist, der Schaden nicht behoben werden, so wird Apoptose ausgelöst und die Zelle wird aus dem Zellverband entfernt. Krebszellen haben Strategien entwickelt, Zellzyklus Kontrollpunkte zu umgehen und darüber hinaus normalen Mechanismen der Apoptose zu entkommen. Die genauen molekularen Vorgänge der Deregulierung der Apoptose sind weitestgehend unaufgeklärt. Procaspase 8 ist ein wichtiges Schlüsselenzym des extrinsischen Apoptose Signalweges. Der extrinsische Signalweg wird extrazellulär über die Bindung von Liganden an ihre korrespondierenden Rezeptoren ausgelöst. In dieser Studie wird gezeigt, dass Procaspase 8 an Ser-387 in vitro als auch in vivo von Cdk1/Cyclin B1 phosphoryliert wird. Darüber hinaus zeigt diese Phosphorylierungsstelle die typische Struktur einer Bindungsstelle für Plk1, einer weiteren mitotischen Kinase. Die Interaktion von Procaspase 8 mit Cdk1/Cyclin B1 wird über die DE Domäne („death-effector-domain“ DED) von Procaspase 8 vermittelt. Wird Procaspase 8 an Ser 387 zu Alanin (S387A) mutiert, so wird die Phosphorylierung durch Cdk1/Cyclin B1 fast vollständig verhindert. Wird zudem diese Mutante (S387A) in humanen Krebszellen überexprimiert, so hemmt dies die Apoptose nach Stimulation des Fas Rezeptors. Wird umgekehrt Cyclin B1 mittels RNA Interferenz depletiert und dadurch Cdk1 nicht aktiviert, wird extrinsische Apoptose verstärkt. Diese Studie zeigt erstmals eine gezielte Inhibierung des extrinsischen Apoptose Signalweges durch mitotische Kinasen und schlägt ein Modell vor, in dem Serin/Threonin Kinasen extrinsische Apoptose inhibieren und somit der Tumorzelle ermöglichen, der Apoptose zu entkommen. Darüber hinaus wird ein neuartiger Mechanismus der Inhibition der autokatalytischen Spaltung von Procaspase 8 durch eine mitotische Kinase gezeigt.
Background: Falciparum Malaria, an infectious disease caused by the apicomplexan parasite Plasmodium falciparum, is among the leading causes of death and morbidity attributable to infectious diseases worldwide. In Gabon, Central Africa, one out of four inpatients have severe malarial anemia (SMA), a life-threatening complication if left untreated. Emerging drug resistant parasites might aggravate the situation. This case control study investigates biomarkers of enhanced hemolysis in hospitalized children with either SMA or mild malaria (MM). Methods and Findings: Ninety-one children were included, thereof 39 SMA patients. Strict inclusion criteria were chosen to exclude other causes of anemia. At diagnosis, erythrophagocytosis (a direct marker for extravascular hemolysis, EVH) was enhanced in SMA compared to MM patients (5.0 arbitrary units (AU) (interquartile range (IR): 2.2–9.6) vs. 2.1 AU (IR: 1.3–3.9), p<0.01). Furthermore, indirect markers for EVH, (i.e. serum neopterin levels, spleen size enlargement and monocyte pigment) were significantly increased in SMA patients. Markers for erythrocyte ageing, such as CD35 (complement receptor 1), CD55 (decay acceleration factor) and phosphatidylserine exposure (annexin-V-binding) were investigated by flow cytometry. In SMA patients, levels of CD35 and CD55 on the red blood cell surface were decreased and erythrocyte removal markers were increased when compared to MM or reconvalescent patients. Additionally, intravascular hemolysis (IVH) was quantified using several indirect markers (LDH, alpha-HBDH, haptoglobin and hemopexin), which all showed elevated IVH in SMA. The presence of both IVH and EVH predicted the need for blood transfusion during antimalarial treatment (odds ratio 61.5, 95% confidence interval (CI): 8.9–427). Interestingly, this subpopulation is characterized by a significantly lowered reticulocyte production index (RPI, p<0.05). Conclusions: Our results show the multifactorial pathophysiology of SMA, whereby EVH and IVH play a particularly important role. We propose a model where removal of infected and non-infected erythrocytes of all ages (including reticulocytes) by EVH and IVH is a main mechanism of SMA. Further studies are underway to investigate the mechanism and extent of reticulocyte removal to identify possible interventions to reduce the risk of SMA development.
We established a protocol of the SuperSAGE technology combined with next-generation sequencing, coined “High-Throughput (HT-) SuperSAGE”. SuperSAGE is a method of digital gene expression profiling that allows isolation of 26-bp tag fragments from expressed transcripts. In the present protocol, index (barcode) sequences are employed to discriminate tags from different samples. Such barcodes allow researchers to analyze digital tags from transcriptomes of many samples in a single sequencing run by simply pooling the libraries. Here, we demonstrated that HT-SuperSAGE provided highly sensitive, reproducible and accurate digital gene expression data. By increasing throughput for analysis in HT-SuperSAGE, various applications are foreseen and several examples are provided in the present study, including analyses of laser-microdissected cells, biological replicates and tag extraction using different anchoring enzymes.
The editorial board of Aging reviews research papers published in 2009,which they believe have or will have a significant impact on aging research.Among many others, the topics include genes that accelerate aging or incontrast promote longevity in model organisms, DNA damage responsesand telomeres, molecular mechanisms of life span extension by calorierestriction and pharmacologic interventions into aging. The emergingmessage in 2009 is that aging is not random but determined by agenetically-regulated longevity network and can be decelerated bothgenetically and pharmacologically.
This study presents the development and mapping of simple sequence repeat (SSR) and single nucleotide polymorphism (SNP) markers in chickpea. The mapping population is based on an inter-specific cross between domesticated and non-domesticated genotypes of chickpea (Cicer arietinum ICC 4958 × C. reticulatum PI 489777). This same population has been the focus of previous studies, permitting integration of new and legacy genetic markers into a single genetic map. We report a set of 311 novel SSR markers (designated ICCM—ICRISAT chickpea microsatellite), obtained from an SSR-enriched genomic library of ICC 4958. Screening of these SSR markers on a diverse panel of 48 chickpea accessions provided 147 polymorphic markers with 2–21 alleles and polymorphic information content value 0.04–0.92. Fifty-two of these markers were polymorphic between parental genotypes of the inter-specific population. We also analyzed 233 previously published (H-series) SSR markers that provided another set of 52 polymorphic markers. An additional 71 gene-based SNP markers were developed from transcript sequences that are highly conserved between chickpea and its near relative Medicago truncatula. By using these three approaches, 175 new marker loci along with 407 previously reported marker loci were integrated to yield an improved genetic map of chickpea. The integrated map contains 521 loci organized into eight linkage groups that span 2,602 cM, with an average inter-marker distance of 4.99 cM. Gene-based markers provide anchor points for comparing the genomes of Medicago and chickpea, and reveal extended synteny between these two species. The combined set of genetic markers and their integration into an improved genetic map should facilitate chickpea genetics and breeding, as well as translational studies between chickpea and Medicago.
Background: European robins, Erithacus rubecula, show two types of directional responses to the magnetic field: (1) compass orientation that is based on radical pair processes and lateralized in favor of the right eye and (2) so-called 'fixed direction' responses that originate in the magnetite-based receptors in the upper beak. Both responses are light-dependent. Lateralization of the 'fixed direction' responses would suggest an interaction between the two magnetoreception systems. Results: Robins were tested with either the right or the left eye covered or with both eyes uncovered for their orientation under different light conditions. With 502 nm turquoise light, the birds showed normal compass orientation, whereas they displayed an easterly 'fixed direction' response under a combination of 502 nm turquoise with 590 nm yellow light. Monocularly right-eyed birds with their left eye covered were oriented just as they were binocularly as controls: under turquoise in their northerly migratory direction, under turquoise-and-yellow towards east. The response of monocularly left-eyed birds differed: under turquoise light, they were disoriented, reflecting a lateralization of the magnetic compass system in favor of the right eye, whereas they continued to head eastward under turquoise-and-yellow light. Conclusion: 'Fixed direction' responses are not lateralized. Hence the interactions between the magnetite-receptors in the beak and the visual system do not seem to involve the magnetoreception system based on radical pair processes, but rather other, non-lateralized components of the visual system.
Project I: The progression of rod and cone degeneration in retinally degenerate (rd) mice ultimately results in a complete loss of photoreceptors and blindness. The inner retinal neurons survive and several recent studies using genetically targeted, light activated channels have made these neurons intrinsically light sensitive. We crossbred a transgenic mouse line expressing channelrhodopsin2 (ChR2) under the control of the Thy1 promoter with the Pde6b(rd1) mouse, a model for retinal degeneration (rd1/rd1). Approximately 30-40% of the ganglion cells of the offspring expressed ChR2. Extracellular recordings from ChR2-expressing ganglion cells in degenerated retinas revealed their intrinsic light sensitivity which was approximately 7 log U less sensitive than the scotopic threshold and approximately 2 log U less sensitive than photopic responses of normal mice. All ChR2-expressing ganglion cells were excited at light ON. The visual performance of rd1/rd1 mice and ChR2 rd1/rd1 mice was compared. Behavioral tests showed that both mouse strains had a pupil light reflex and they were able to discriminate light fields from dark fields in the visual water task. Cortical activity maps were recorded with optical imaging. The ChR2rd1/rd1 mice did not show a better visual performance than rd1/rd1 mice. In both strains the residual vision was correlated with the density of cones surviving in the peripheral retina. The expression of ChR2 under the control of the Thy1 promoter in retinal ganglion cells does not rescue vision. Project II: Lentiviral vectors are becoming the vector of choice for transgene delivery into cells due to their ability to infect non- dividing cells and stably integrate the gene into the genome of the host. Two different viral vector systems, namely HIV-1 and SIV and three different viral vectors PLECYT, PHRCMVChR2 of HIV-1 family and PBjChR2 of SIV were used in this study. The efficiency of the vectors was analyzed by applying them onto the retinal explants in culture and checking the transgene expression. The transgene in the PLECYT lentiviral vector was driven by the EF1A promoter. Upon administration of 5.2 X 106 infectious units of PLECYT viral vector suspension onto the retinal explant resulted in the transduction of retinal ganglion cells. Very few other retinal neurons were found transduced. In the case of PHRCMVChR2, approximately 5 X 105 TU/ml of the vector was used and resulted in the transduction of different neuronal subtypes. Many amacrine cells, ganglion cells and Müller cells were found expressing the transgene. For PBjChR2, 5.6 X104 TU/ml was used which resulted in Müller cell- specific transduction. Very few or no other retinal neurons were found transduced. This study demonstrates the transduction efficiency of different viral vectors on the retinal neurons in vitro. An interesting observation on these viral vectors is their altered tropism. The glycoprotein of the virus is critical for determining their tropism and in this study, all the viral vectors generated were pseudotyped with VSVG, which confers a broad non-specific spectrum of infection. However, analyzing the transgene expression, the viral vectors differ from one another and show remarkable difference in their transduction pattern. To list a few factors that might possibly responsible for the drastic transduction difference exerted by the viral vectors include; 1. Promoters used to drive the transgene expression. 2. HIV or SIV component of the vector in combination with the promoter 3. Titre of the vector used and 4. Other factors like pH and serum used in the study. Therefore optimizing the viral vectors and generating high titers would increase the efficiency and cell-type specific expression of the transgene.
Blut steht für Leben - und für den Tod. Das ist in der Medizin nicht anders als in der Mythologie. Vor wenigen Jahrzehnten war die Diagnose Blutkrebs noch ein sicheres Todesurteil. Heute werden viele Leukämiekranke geheilt. An der Goethe-Universität setzt ein Schwerpunkt für Lymphom- und Leukämieforschung deutschlandweit Akzente bei Forschung und Diagnostik.
While many different RNA aptamers have been identified that bind to a plethora of small molecules only very few are capable of acting as engineered riboswitches. Even for aptamers binding the same ligand large differences in their regulatory potential were observed. We address here the molecular basis for these differences by using a set of unrelated neomycin-binding aptamers. UV melting analyses showed that regulating aptamers are thermally stabilized to a significantly higher degree upon ligand binding than inactive ones. Regulating aptamers show high ligand-binding affinity in the low nanomolar range which is necessary but not sufficient for regulation. NMR data showed that a destabilized, open ground state accompanied by extensive structural changes upon ligand binding is important for regulation. In contrast, inactive aptamers are already pre-formed in the absence of the ligand. By a combination of genetic, biochemical and structural analyses, we identified a switching element responsible for destabilizing the ligand free state without compromising the bound form. Our results explain for the first time the molecular mechanism of an engineered riboswitch.
Gepaarte assoziative Magnetstimulation (PAS) kann im primären menschlichen Motorkortex (M1) sowohl langzeitpotenzierungs- (LTP) als auch langzeitdepressionsähnliche (LTD) Erregbarkeitsveränderungen hervorrufen. Dies kann durch die Untersuchung magnetisch evozierter Potentiale (MEP) erfasst werden. Dagegen ist wenig über die Auswirkungen von PAS auf willkürliche Aktivität des motorischen Kortex bekannt. Im ersten Experiment haben wir bewegungsabhängige kortikale Potentiale (MRCP) bei zehn gesunden Probanden im EEG registriert, um die willkürliche Aktivität im Motorkortex während der Vorbereitung zweier motorischer Aufgaben zu erfassen. Die Probanden mussten dabei entweder den Daumen abduzieren (Hauptmuskel: Musculus abductor pollicis brevis, APB) oder das Handgelenk strecken (Hauptmuskel: Musculus extensor carpi radialis, ECR). Die Amplituden der motorisch evozierten Potentiale im APB wurden dabei durch PASLTP gesteigert, durch PASLTD vermindert und blieben bei PAScontrol unverändert. Im Gegensatz dazu wurden sie im ECR durch keine PAS-Bedingungen verändert. PASLTP verminderte die Negativität der MRCP während des späten Bereitschaftspotentials (-500 bis 0 ms vor Bewegungsbeginn) nur in der APB-Aufgabe. Diese Veränderungen zeigten sich hauptsächlich über zentralen Elektroden kontralateral zur bewegten Hand. Dieser Effekt korrelierte negativ mit dem durch PASLTP induzierten MEP-Anstieg im APB. PASLTD und PAScontrol hatten dagegen keinen Einfluss auf die MRCP Amplituden. Unsere Ergebnisse deuten auf eine spezifische Wechselwirkung von PAS mit willkürlicher Aktivität im Motorkortex während der Vorbereitung motorischer Aufgaben hin. Dies könnte durch ein Zusammenspiel aus erhöhter Exzitabilität von M1 und einer unterbrochenen effektiven Konnektivität zwischen prämotorischen Arealen und M1 erklärt werden. Die Modulation des dorsolateralen prämotorischen Kortex (PMd) durch repetitive transkranielle Magnetstimulation (rTMS) verändert die kortikospinale Erregbarkeit in M1. Die Auswirkungen von PMd-rTMS auf vorbereitende Prozesse für willkürliche Bewegungsabläufe sind jedoch unklar. Contingent negative variation (CNV) repräsentiert im EEG kortikale Vorbereitungsprozesse äußerlich getriggerter Bewegungen während das Bereitschaftspotential (BP) Vorbereitungsprozesse intern getriggerter Bewegungen repräsentiert. Im zweiten Experiment wurden CNV und BP jeweils vor und nach PMd-rTMS untersucht. Das Experiment bestand aus drei CNV-Versuchsblöcken mit insgesamt 243 Durchgängen. Dabei mussten die Probanden auf visuelle Anweisung hin eine zwei-Item Finger-Bewegungssequenz durchführen. RTMS wurde sowohl mit 1 Hz als auch mit 5 Hz bei einer Intensität von 110% der aktiven motorischen Schwelle (AMT) unter individueller MR-Navigation appliziert. Die Erfassung des BP erfolgte während der Durchführung derselben motorischen Aufgaben, allerdings bekamen die Probanden keine Anweisungen. Die Durchschnittsamplituden der frühen und späten Komponente von CNV (CNV1:1500-500 ms vor dem Startsignal (S2); CNV: 500-0 ms vor S2) und der frühen und späten Komponente des BP (BP1: 1500-500 ms vor EMG Beginn; BP2: 500-0 ms vor EMG-Beginn) wurden quantitativ für 25 zentrale Elektrodenpositionen verglichen. CNV2 zeigte eine signifikante Bahnung über dem frontal-zentralen Bereich nach 1 Hz PMd-rTMS, blieb aber unverändert nach 5 Hz PMd-rTMS. CNV1, BP1 und BP2 blieben durch 1 Hz und 5 Hz PMd-rTMS unbeeinflusst. Diese Ergebnisse lassen vermuten, dass der dominante PMd eine wichtigere Rolle in der Vorbereitung extern getriggerter Bewegungen spielt, als dies bei intern getriggerten Bewegungen der Fall zu sein scheint. Die CNV2-Antwort könnte eine intensive Interaktion innerhalb des menschlichen motorischen Kontrollnetzwerks anzeigen, die möglicherweise auf kompensationsähnlichen Mechanismen beruht.
The eukaryotic glyoxalase system consists of two enzymatic components, glyoxalase I (lactoylglutathionelyase) and glyoxalase II (hydroxyacylglutathione hydrolase). These enzymes are dedicated to the removal of toxic alpha-oxoaldehydes like methylglyoxal (MG). MG is formed as a by-product of glycolysis and MG toxicity results from its damaging capability leading to modifications of proteins, lipids and nucleic acids. An efficient removal of MG appears to be essential to ensure cellular functionality and viability. Here we study the effects of the genetic modulation of genes encoding the components of the glyoxalase system in the filamentous ascomycete and aging model Podospora anserina. Overexpression of PaGlo1 leads to a lifespan reduction on glucose rich medium, probably due to depletion of reduced glutathione. Deletion of PaGlo1 leads to hypersensitivity against MG added to the growth medium. A beneficial effect on lifespan is observed when both PaGlo1 and PaGlo2 are overexpressed and the corresponding strains are grown on media containing increased glucose concentrations. Notably, the double mutant has a ‘healthy’ phenotype without physiological impairments. Moreover, PaGlo1/PaGlo2_OEx strains are not long-lived on media containing standard glucose concentrations suggesting a tight correlation between the efficiency and capacity to remove MG within the cell, the level of available glucose and lifespan. Overall, our results identify the up-regulation of both components of the glyoxalase system as an effective intervention to increase lifespan in P. anserina. Key words: Podospora anserina, aging, lifespan, glycation, glucose, methylglyoxal, advanced glycation end products
Die X-chromosomal gebundene chronische Granulomatose (X-CGD) ist eine seltene Erbkrankheit, bei der die NADPH-Oxidase der Phagozyten nicht funktionell ist. Der Grund hierfür liegt meist in Mutationen in der GP91phox Untereinheit der Phagozyten-Oxidase. Hierdurch treten lebensbedrohliche Bakterien- und Pilzinfektionen bei Patienten auf, was neben einer geringen Lebensqualität zu einer erheblich verkürzten Lebenserwartung führt. Eine Stammzelltransplantation eines gesunden Spenders ist bislang der einzige heilende Therapieansatz. Für X-CGD-Patienten, die keinen passen-den Spender zur Verfügung haben, stellt die genetische Modifikation autologer hämato-poetischer Stammzellen eine alternative Form der Therapie dar. Im Jahr 2004 wurden daher in einer präklinischen Phase I/II Studie in Frankfurt zwei X-CGD-Patienten gentherapeutisch behandelt. Hierbei wurden CD34+ Stammzellen ex vivo mit einem γ-retroviralen Vektor transduziert, der eine LTR-getriebene Expressionskassette für GP91phox trägt. Nach einer nicht-myeloablativen Konditionierung wurden die genetisch modifizierten Zellen der Patienten retransplantiert. Beide behandelten Patienten zeigten schon kurz nach Therapiebeginn eine deutliche Verminderung der Infektionsanfälligkeit und somit eine stark verbesserte Lebensqualität. Auf zellulärer Ebene konnte ein gutes Engraftment der modifizierten hämatopoetischen Stammzellen im Knochenmark beobachtet werden. In funktionellen Tests konnte die Bildung superoxidproduzierender Phagozyten für die Immunabwehr gezeigt werden. Das molekulare Monitoring beider Patienten hat jedoch über die Zeit eine Verringerung der Enzymaktivität in den Phagozyten (Superoxidproduktion) gezeigt, obwohl der Anteil genetisch modifizierter Zellen nicht geringer wurde. Im Rahmen der vorliegenden Arbeit konnte durch quantitative RT-PCR-Analysen proviraler mRNA-Transkripte, eine Korrelation zwischen dem Verlust der Enzymaktivität und reduzierter Transgen-expression gezeigt werden. Durch DNA-Analysen peripherer Blutproben beider Patienten konnte eine verstärkte Methylierung an der Promotor-CpG-Insel, welche die Transgen-expression reguliert, als Ursache identifiziert werden. Weiterführende klonale Untersuchungen genmodifizierter Kolonien aus dem Knochenmark der Patienten offenbarten einen direkten Zusammenhang zwischen der Abwesenheit von Transkription bzw. Superoxidbildung und der Methylierung dieser CpG-Insel im proviralen Promotor-bereich. Somit konnte zum ersten Mal ein epigenetisches Silencing bei Patienten nach einer Behandlung mit Gentherapie nachgewiesen werden. In weiteren Versuchen konnte die vollständig ausgebildete, spezifische Methylierung des SFFV-Promotors in transduzierten Knochenmarkzellen eines Patienten durch in vitro Behandlung mit einem Methyltransferase-Inhibitor (Aza-D) in Kombination mit einem Histondeacetylase-Inhibitor (TSA) bis zu 30% reduziert werden. Dieser Teilerfolg zeigt, dass eine klinisch relevante Reaktivierung der Transgenexpression, durch Umkehrung des Silencings am SFFV-Promotor, prinzipiell möglich ist. Das Phänomen der Abschaltung der Genexpression des γ-retroviralen Vektors in der Frankfurter Gentherapiestudie, hat ein Testsytem zur Evaluierung zukünftiger Gentherapie-Vektoren erfordert. Durch Monitoring proviraler Parameter (Kopien, Transgenexpression, Proteinexpression und Promotor-CpG-Methylierung), in der murinen embryonalen Stammzelllinie P19 konnte in dieser Arbeit ein prädiktiver Silencing-Assay erfolgreich etabliert werden. Mit Hilfe dieses Systems wurden vielversprechende Silencing-resistente Vektoren mit dem UCOE (Ubiquitous Chromatin Opening Element) identifiziert. Hierdurch wurden wichtige Grundlagen geschaffen, um zukünftige virale Vektorsysteme in Bezug auf ihre Langzeitexpression testen zu können. Zusätzlich zu der Inaktivierung der transduzierten Expressionskassette konnte in beiden Patienten ein klonales Auswachsen von Subklonen beobachtet werden, das letztendlich zu einem myelodisplastischen Syndrom bei beiden Patienten führte. Der virale Enhancer war im Gegensatz zum viralen Promotor niemals methyliert, wodurch seine transaktivierenden Eigenschaften unbeeinflusst blieben. Diese enhancervermittelte Aktivierung proliferationsfördernder Gene (Mds1-Evi1-Genlokus) konnte durch RT-PCR-Analysen zunächst in Mischpopulationen aus peripherem Blut der Patienten nach-gewiesen werden. Weiterführende klonale Analysen in Knochenmarkzellen zeigten den direkten Zusammenhang zwischen der transkriptionellen Aktivierung des Mds1-Evi1-Genlokus und den proviralen Insertionen. Somit konnte die Ursache für die therapie-assoziierte, klonale Dominanz in beiden X-CGD-Patienten aufgeklärt werden. In der Frankfurter Gentherapiestudie wurde erstmals ein klinischer Erfolg für X-CGD-Patienten erzielt. Durch intensives molekulares Monitoring konnte im Rahmen dieser Arbeit aufgedeckt werden, dass der eingesetzte γ-retrovirale Vektor über das Phänomen der Insertionsmutagenese hinaus, auch in Bezug auf die epigenetische Abschaltung der Transkription (Silencing), für zukünftige Studien modifiziert werden muss. Sicherheits-verbesserte Vektoren mit einer Resistenz gegenüber Silencing in murinen embryonalen Stammzellen konnten in dieser Arbeit charakterisiert werden. Mit diesen Genfähren könnte der angestrebte Langzeittherapieerfolg in Zukunft möglich werden.
Teerfleckenpilze (Ascomycota, Phyllachorales) kommen weltweit vor, haben aber einen deutlichen Verbreitungsschwerpunkt in den Tropen. In dieser Studie wird die Diversität der Phyllachorales in Panama untersucht und taxonomische Grundlagenforschung durch molekulare Untersuchungen und ökologische Beobachtungen ergänzt. Arten der Phyllachorales bilden schwarz glänzende Flecken oder Krusten auf Blättern und Stängeln von Pflanzen. Die Fruchtkörper dieser Mikropilze sind meistens in das Wirtsgewebe eingesenkt, können aber auch oberflächlich angelegt sein. Die Größe der teerfleckenähnlichen Infektionen variiert zwischen 0,2 mm bis zu mehreren Zentimetern. Teerfleckenpilze mit eingesenkten Fruchtkörpern entwickeln in den meisten Fällen schildförmige, epidermale Deckstrukturen oberund/oder unterhalb der Perithecien. Die unitunicaten Asci können einen kleinen apikalen Ring besitzen, der sich in Jodlösung nicht blau färbt. Die hyaline Ascosporen sind meistens glatt und können von einer schleimigen Hülle umgeben sein. Die assoziierten Andromorphstadien sind durch fadenförmige Spermatien gekennzeichnet. Nur wenige morphologische Merkmale werden als verlässlich betrachtet und stehen für die Bestimmung von Arten zur Verfügung. Derzeit sind 1.226 Arten von Phyllachorales weltweit beschrieben. Puerto Rico gilt als eines der am besten untersuchten Länder in Bezug auf Teerfleckenpilze. Ungefähr 100 Arten sind derzeit von Puerto Rico bekannt, weitere Erstnachweise werden erwartet. Im Gegensatz dazu wurden in Panama bisher nur wenige mykologische Untersuchungen durchgeführt. Zwischen 1927 und 1991 wurden nur 39 Teerfleckenpilze nachgewiesen, obwohl die Landfläche Panamas achtmal größer ist als die von Puerto Rico und eine fast viermal höhere Pflanzendiversität aufweist. Aufgrund der Vielzahl potentieller neuer Wirtspflanzen in Panama und des von Teerfleckenpilzen bevorzugten tropischen Klimas wird eine weitaus höhere Anzahl an Arten der Phyllachorales erwartet. Zwischen 2005 und 2008 wurden mehreren Exkursionen in den Provinzen Bocas del Toro und Chiriquí durchgeführt, um die tatsächliche Diversität pflanzenparasitischer Mikropilze in Panama zu untersuchen. Über 1.000 Belege wurden von insgesamt vier Wissenschaftlern während 7 Sammelreisen von jeweils 2‐4 Wochen gesammelt. 185 Belege zeigen mehr oder weniger deutliche Symptome von Teerfleckenkrankheit und entsprechen 42 Arten der Phyllachorales, die bisher noch nicht für Panama bekannt sind. 81 Teerfleckenpilze aus Panama werden in dieser Arbeit mit detaillierten Beschreibungen, Zeichnungen und Fotos vorgestellt. Von den 66 bis zur Art bestimmten Phyllachorales werden 27 erstmalig für Panama, 19 für Zentralamerika und 3 für die Neue Welt genannt. Die Erstnachweise von Camarotella costaricensis, Coccodiella miconiicola, Ophiodothella galophila, Phyllachora amphibola, Ph. engleri und Ph. zanthoxylicola wurden bereits vorab publiziert. 21 Arten werden hier zum ersten Mal vorgestellt: Catacauma paramoense, Coccodiella miconiae, Ophiodothella cuervoi, Phyllachora acaciae subsp. pusaethae, Ph. acalyphae, Ph. araliarum, Ph. balansae, Ph. buddleiae, Ph. cynodontis, Ph. galavisii, Ph. gouaniae, Ph. leeae, Ph. meliosmae, Ph. microtheles, Ph. ocoteae, Ph. paraguaya, Ph. phyllanthophila var. phyllanthophila, Ph. puncta subsp. dalbergiicola, Ph. ruelliae, Ph. serjaniae und Ph. smilacicola. Zusätzlich konnte erstmals der Hyperparasit Perizomella inquinans auf Ph. ocoteae für Panama und der Teerfleckenpilz Ph. guazumae für Costa Rica nachgewiesen werden. Von den 15 bisher noch unbestimmten Teerfleckenpilzen sind 9 Arten der Gattungen Camarotella und Phyllachora wahrscheinlich neu für die Wissenschaft und 6 Arten müssen bis zur Bestimmung noch weiter untersucht werden. 10 Taxa wurden aufgrund von Synonymisierung, Zitierungsfehlern oder mangelhaftem Material ausgeschlossen. Für eine sichere Bestimmung der Arten aus Panama wurden alle weltweit bekannten Teerfleckenpilze auf nah verwandten Wirtspflanzen miteinander verglichen. Dazu wurden intensive Literaturrecherche und detaillierte lichtmikroskopische Studien durchgeführt. 190 Typen und autoritative Belege wurden zusätzlich aus 22 Herbarien weltweit ausgeliehen und untersucht. Dabei wurden einige Gruppen von Teerfleckenpilzen auf bestimmten Wirtsfamilien teilweise überarbeitet und Schlüssel für die Bestimmung der jeweiligen Arten erstellt. Ein Vergleich der charakteristischen Merkmale wird als tabellarische Übersicht in den Anmerkungen vorgestellt. Aufgrund der intensiven taxonomischen Arbeit konnten 7 neue Synonyme aufgedeckt werden. Catacauma contractum ist ein Synonym von Ph. gouaniae, Ph. clypeata von Ph. paraguaya, Ph. insueta von Ph. serjaniae, Ph. paulliniae von Ph. galavisii und Ph. swieteniae von Ph. balansae. Für Ph. roureae werden gleich zwei neue Synonyme vorgeschlagen, Ph. connari und Ph. panamensis. Einige der untersuchten Herbarbelege waren nur bruchstückhaft vorhanden oder in sehr schlechtem Zustand. Viele Belege konnten aufgrund mangelnder Informationen nicht gefunden oder wegen sehr langen Lieferungszeiten oder fehlender Kooperationen noch nicht untersucht werden. Die Erstbeschreibungen vieler Arten in der Literatur sind lückenhaft und für die wenigsten Arten sind Abbildungen vorhanden. Dadurch ist eine sichere Artbestimmung ohne Untersuchung des zugehörigen Herbarmaterials oft unmöglich. In dieser Arbeit werden alle 81 untersuchten Teerfleckenpilze mit detaillierten Beschreibungen, Zeichnungen und Fotografien dargestellt, um zukünftige Bestimmungsarbeiten zu erleichtern. 16 Teerfleckenpilze wurden im Rahmen dieser Arbeit zum ersten Mal illustriert: Catacauma paramoense, Ophiodothella cuervoi, O. galophila, Phyllachora acaciae var. enterolobii, Ph. acalyphae, Ph. araliarum, Ph. bonariensis, Ph. engleri, Ph. galavisii, Ph. leeae, Ph. meliosmae, Ph. ocoteae, Ph. ruelliae, Ph. smilacicola, Ph. verbesinae und Polystigma pusillum. Darüber hinaus wurden Ph. acaciae subsp. pusaethae, Ph. cecropiae, Ph. leptochloae, Ph. puncta subsp. dalbergiicola und Ph. weirii in ihrer Darstellung vervollständigt. Für einige Arten werden bislang unveröffentlichte morphologische Merkmale vorgestellt, z.B. chondroide Hyphen, Schleimhüllen oder Andromorphstadien, und die mögliche Verwendung dieser Merkmale zur Artabgrenzung diskutiert. Zusätzlich zu den morphologischen Merkmalen werden molekulare Daten hinzugezogen. Zu Beginn dieser Arbeit standen Sequenzen von nur acht verschiedenen Arten der Phyllachorales s.str. zur Verfügung, davon 3 aus der Gattung Phyllachora. Aufgrund der Tatsache, dass Arten der Phyllachorales auf lebendes Pflanzenmaterial angewiesen sind, ist es bisher noch nicht gelungen, diese Pilze in Kultur zu halten. Die Isolation von DNA‐Material aus eigenen Herbarbelegen oder von auf Silicagel getrockneten Proben erwies sich als wenig erfolgreich. Es war notwendig, das frisch gesammelte Material direkt vor Ort in Panama zu verarbeiten. Die Extraktion von reinem und geeignetem Pilzgewebe stellte sich aufgrund der sehr geringen Fruchtkörpergröße und der engen Anhaftung an das Pflanzengewebe als sehr mühsam dar. Trotzdem wurden 10 neue DNA‐Sequenzen, die jeweils für die kleine bzw. große ribosomale Untereinheit kodieren, von 7 Teerfleckenpilzen, Coccodiella miconiae, Coccodiella sp., Phyllachora engleri, Ph. graminis, Ph. leeae, Ph. ulei und Ph. zanthoxylicola, auf 10 verschiedenen Wirtspflanzen erfolgreich isoliert. Erste molekulare Untersuchungen mittels Maximum Likelihood, Maximum Parsimony und Bayesianischer Analyse eines kombinierten Datensatzes unterstützen die Zugehörigkeit der Phyllachorales zur Unterklasse Sordariomycetidae und deuten auf eine paraphyletische Entwicklung der Gattung Phyllachora hin. Die Typusart, Phyllachora graminis, könnte mit Arten der Gattung Coccodiella enger verwandt sein als mit anderen Arten der Gattung Phyllachora. Bisher fehlen aber noch entsprechende morphologische Merkmale die diese These unterstützen. Weitere Untersuchungen mit einem erweiterten Datensatz sollten unternommen werden. Aufgrund der biotrophen Lebensweise und der damit verbundenen engen Anpassung an die jeweilige Wirtspflanze wird eine hohe Spezifität der Teerfleckenpilze angenommen. Die Identifikation der Wirtspflanze bildet daher eine wichtige Grundlage bei der Bestimmung des Pilzes. Durch die Abwesenheit fertiler Strukturen, wie Blüten und Früchte, wurde eine eindeutige Bestimmung oft erschwert. Pflanzenspezialisten, Fachliteratur, Herbarmaterial und Internetdatenbanken wurden hinzugezogen, um eine möglichst genaue Bestimmung der Wirtspflanzen zu erreichen. Die 81 für Panama vorgestellten Teerfleckenpilze parasitierten auf ungefähr 93 verschiedenen Wirten aus 72 Gattungen und 43 Pflanzenfamilien. 73 Wirtspflanzen wurden bis zur Art bestimmt, 20 können mit Gattungsnamen angesprochen werden und sind von den bisher bestimmten Arten sicher verschieden. 5 Arten sind derzeit noch gänzlich unbestimmt. Von den 73 vollständig bestimmten Pflanzenarten werden 29 zum ersten Mal als Wirte für den entsprechenden Parasiten vorgestellt: Acalypha diversifolia für Phyllachora acalyphae, Anthurium concinnatum für Phyllachora engleri, Buddleja nitida für Phyllachora buddleiae, Cissus trianae für Phyllachora leeae, Croton draco und Croton hirtus für Phyllachora tragiae, Dalbergia brownei für Phyllachora puncta subsp. dalbergiicola, Dichanthelium acuminatum und Dichanthelium viscidellum für Phyllachora bonariensis Speg., Dicliptera iopus für Phyllachora ruelliae, Dioscorea trifida und Dioscorea urophylla für Phyllachora ulei, Entada polystachya für Phyllachora acaciae subsp. pusaethae, Inga punctata und Inga sierrae für Phyllachora amphibola, Luehea seemannii für Phyllachora paraguaya, Ocotea veraguensis für Phyllachora ocoteae, Oreopanax xalapensis für Phyllachora araliarum, Ossaea micrantha für Coccodiella miconiicola, Paspalum paniculatum und P. pilosum für Phyllachora paspalicola, Paullinia bracteosa für Phyllachora galavisii, Phyllanthus anisolobus für Phyllachora phyllanthophila var. phyllanthophila, Serjania atrolineata für Phyllachora serjaniicola, Serjania mexicana für Phyllachora serjaniae, Vaccinium floribundum für Catacauma paramoense und Ophiodothella cuervoi, Xylosma flexuosa für Trabutia xylosmae und Zanthoxylum melanostictum für Phyllachora zanthoxylicola. Teilweise wurden diese Erstnachweise schon vorab publiziert. Arten der Familien Fabaceae, Melastomataceae und Poaceae sind besonders häufig mit Teerfleckenpilzen infiziert und scheinen bevorzugte Wirtspflanzen für Arten der Phyllachorales zu sein. Für ökologische Studien wurden bestimmte Teerfleckenpilze an ausgesuchten Standorten wiederholt zu verschiedenen Jahreszeiten gesammelt und untersucht. Dabei zeigte sich, dass Arten der Ordnung Phyllachorales in zwei Habitaten besonders häufig anzutreffen sind: (1) in offenen, gestörten Gebieten mit Ruderalvegetation und deutlicher Trockenperiode sowie (2) in dichten, ungestörten Bergregenwäldern mit hoher relativer Luftfeuchtigkeit und kontinuierlichem Niederschlag. Eine hohe Pflanzendiversität korreliert nicht mit einer hohen Diversität an Teerfleckenpilzen. Vergleichende Untersuchungen zeigten, dass das Vorkommen von Arten der Phyllachorales wahrscheinlich stärker vom Vorkommen und der Dichte bevorzugter Wirtspflanzen abhängt als von ökologischen Faktoren wie z.B. Vegetationstyp, Höhenlage, relativer Lichtintensität, durchschnittlichem Jahresniederschlag oder jahreszeitlicher Temperaturentwicklung. Die in dieser Studie vorgestellten Teerfleckenpilze stammen aus nur 5 von 12 Provinzen Panamas: Bocas del Toro und Chiriquí im Westen sowie Colón, Kuna Yala und Panamá im Zentrum des Landes. Mithilfe einer Datenbank wurde eine Vielzahl verfügbarer Literaturdaten mit Internet‐Datensätzen ergänzt und daraus eine Verbreitungskarte von Arten der Phyllachorales in der Welt erstellt. Für viele Länder sind nur wenige oder gar keine Teerfleckenpilze bekannt. Das lückenhafte Vorkommen in Panama und anderen Ländern der Welt entspricht aber keinesfalls der natürlichen Verbreitung dieser Pilze, sondern gibt die unterschiedliche Intensität von Forschungsaktivitäten in Bezug auf die Teerfleckenpilze wieder. Weitere Erstnachweise und neue Arten der Ordnung Phyllachorales werden für Panama und die Welt erwartet, denn unser Wissenstand über diese Gruppe ist sehr lückenhaft und weite Gebiete sind bislang noch unzureichend untersucht.
Heparine sind die am häufigsten verwendeten Medikamente zur Kontrolle der Blutgerinnung. In hoher Dosierung werden sie in der Herzchirurgie eingesetzt, um Blutgerinnseln während einer Operation vorzubeugen. Ein am Institut für Biophysik entwickeltes Messverfahren erlaubt eine direkte und schnelle Messung des Heparinspiegels während des Eingriffs.
Background: Studies on the development of the nervous system and the musculature of invertebrates have become more sophisticated and numerous within the last decade and have proven to provide new insights into the evolutionary history of organisms. In order to provide new morphogenetic data on opisthobranch gastropods we investigated the neuromuscular development in the nudibranch Aeolidiella stephanieae Valdez, 2005 using immunocytochemistry as well as F-actin labelling in conjunction with confocal laser scanning microscopy (cLSM). Results: The ontogenetic development of Aeolidiella stephanieae can be subdivided into 8 stages, each recognisable by characteristic morphological and behavioural features as well as specific characters of the nervous system and the muscular system, respectively. The larval nervous system of A. stephanieae includes an apical organ, developing central ganglia, and peripheral neurons associated with the velum, foot and posterior, visceral part of the larva. The first serotonergic and FMRFamidergic neural structures appear in the apical organ that exhibits an array of three sensory, flask-shaped and two non-sensory, round neurons, which altogether disappear prior to metamorphosis. The postmetamorphic central nervous system (CNS) becomes concentrated, and the rhinophoral ganglia develop together with the anlage of the future rhinophores whereas oral tentacle ganglia are not found. The myogenesis in A. stephanieae begins with the larval retractor muscle followed by the accessory larval retractor muscle, the velar or prototroch muscles and the pedal retractors that all together degenerate during metamorphosis, and the adult muscle complex forms de novo. Conclusions: Aeolidiella stephanieae comprises features of the larval and postmetamorphic nervous as well as muscular system that represent the ground plan of the Mollusca or even the Trochozoa (e. g. presence of the prototrochal or velar muscle ring). On the one hand, A. stephanieae shows some features shared by all nudibranchs like the postmetamorphic condensation of the CNS, the possession of rhinophoral ganglia and the lack of oral tentacle ganglia as well as the de novo formation of the adult muscle complex. On the other hand, the structure and arrangement of the serotonergic apical organ is similar to other caenogastropod and opisthobranch gastropods supporting their sister group relationship.