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Viele Gruppen der Lebewesen, insbesondere Insekten breiten sich durch steigende Temperaturen zunehmend in Gebieten aus, in denen sie ursprünglich nicht vorkommen(Novikov und Vaulin 2014; Bebber 2015). Hierbei ist die steigende Temperatur in
verschiedenen Gebieten der Hauptfaktor für Expansionen dieser Arten in Richtung des nördlichen Polarkreises. Einige dieser Arten sind sehr tolerant für verschiedene Variablen und können damit ihr Verbreitungsgebiet deutlich nach Norden hin ausdehnen. Aufgrund steigender Temperaturen werden jedoch andere Arten in ihrem Verbreitungsgebiet eingeschränkt oder ihre Verbreitung verschiebt sich in nördliche Richtung (Ogden und Lindsay 2016; Lawler et al. 2009). Auch für die Verbreitung von Krankheiten spielen Temperaturen, Ausbreitungen oder Verbreitungsverschiebungen eine wichtige Rolle (Mordecai et al. 2019).
So können, durch die Etablierung der passenden Vektoren, bisher nur in wärmeren Gebieten auftretende Krankheiten zukünftig auch in unseren Breitengraden eingeschleppt und
verbreitet werden. Bremsen, invasive Stechmücken aber auch einheimische Mücken tragen alle ein Potential,verschiedenste Krankheitserreger zu verbreiten, auch wenn die Eignung als
Vektor für jede Art unterschiedlich groß ausfällt und manche Arten daher kaum beobachtet und untersucht werden. Mit dem Augenmerk auf sich ändernde Verbreitungsgebiete hinsichtlich zukünftigen klimatischen Veränderungen und sich wandelnden anthropogenen Einflüssen sollten jedoch auch Arten mit bisher geringem Vektorpotential mit in Beobachtungsprogramme aufgenommen werden.
Wir untersuchten in Projekt I auf kontinentaler Skala die Verbreitung von sechs verschiedenen Bremsenarten und konnten sowohl Rückschlüsse auf eine mangelhafte Beobachtung der
Arten ziehen als auch Artpräferenzen hinsichtlich der Landschaftsnutzung, Auswirkungen des Klimas auf die Verbreitung der Art und bisher unbekannte Toleranzen hinsichtlich tiefen Temperaturen und äußerst verkürzten Wärmeperioden aufdecken. Eine Größenordnung niedriger wurde in Projekt II, basierend auf aktuellen und Vergangenen Klimadaten, die zukünftige und aktuelle Verbreitung einer invasiven, sich zukünftig ausbreitenden Stechmückenart innerhalb Deutschlands modelliert. Durch bisherig im Untersuchungsgebiet nur begrenztes Auftreten konnten noch keine Rückschlüsse auf die unterschiedlichen Präferenzen für das Habitat gezogen werden, es können jedoch für zukünftige Berechnungen Habitatpräferenzen aus anderen Gebieten hinzugezogen werden um die Art und ihre fortschreitende Ausbreitung genauer zu beobachten. Auf der kleinsten untersuchten Ebene konnten in Projekt III innerhalb eines Mikrohabitates verschiedenste Rückschlüsse auf limitierende oder förderliche abiotische Faktoren, die teilweise bisherig nicht oder nur geringfügig beobachtet wurden, gezogen werden. Ebenfalls konnten Auswirkungen der umgebenden Landschaft auf die Abundanzen der Tiere beobachtet werden. Mithilfe von verschiedenen Modellen und in Abhängigkeit von Klimakarten, Landbedeckungsdaten und Landnutzung sowie Eigenschaften und Toleranzen der untersuchten Arten lassen sich in verschiedenen Größenordnungen geeignete Habitate von einheimischen sowie invasiven Arten identifizieren und zukünftige Verbreitungen effizient vorhersagen.
Insgesamt können, basierend auf all diesen Daten, dadurch für alle untersuchten Faktoren Modelle auf andere Gebiete übertragen werden um somit potentielle Verbreitungen dort
vorherzusagen. Auf unseren Daten basierend können so zum Beispiel Modellierungen für die potentielle Ausbreitung der untersuchten Tabaniden innerhalb anderer Kontinente berechnet werden und Monitoringprogramme können die Ergebnisse unserer Studie als Startpunkt aufgreifen, um durch Beprobung an modellierten Standorten die Korrektheit unserer Modelle zu überprüfen und sowohl Landschaftstypen als auch Artzusammensetzung aufzunehmen um das Modell zu bestätigen oder zu verbessern. Die Modellierung der invasiven Art Aedes albopictus bietet die Möglichkeit, diese Art in Zukunft innerhalb der möglichen Ausbreitungskorridore genauer zu beobachten um ihre fortschreitende Verbreitung zu
verifizieren oder eventuelle Änderungen des klimatischen Verlaufes mit einzubinden und das Modell anzupassen. Die Untersuchung des Mikrohabitats von Culex pipiens pipiens und Culex torrentium bietet, auch hinsichtlich anderer Arten in diesem Habitat, eine potente Methode, Vorhersagen für Artvorkommen innerhalb anderer Unterirdischen Objekte zu berechnen. Hier können, bei ausreichend großer Datenlage, eine Vielzahl von Faktoren in die Auswertung mit einfließen.
Die durchgeführten Studien bestätigen die Notwendigkeit für verbesserte Monitoringkonzepte für alle vektorkompetenten Tiergruppen hinsichtlich der sich ändernden klimatischen Bedingungen, des globalen Handels und die sich wandelnde Nutzung der Landschaften durch den Menschen und darin begründete Veränderungen der Artenzusammensetzung eines Habitates, zeigen Möglichkeiten, diese Konzepte mit bisher
ungenutzten Daten aufzubauen und zu verbessern und können gleichzeitig zu deren Verbesserung herangezogen werden.
"Ästhetisch ist, was hilft"
(2017)
Weltweit werden etwa 17% aller Infektionskrankheiten von Vektoren auf den Menschen übertragen. Dabei dienen meist blutsaugende Arthropoden wie Stechmücken, Zecken oder Sandfliegen als Überträger von Bakterien, Viren oder einzelligen Parasiten. Zur letzteren Gruppe gehört auch der protozoische Erreger der Chagas-Krankheit Trypanosoma cruzi. Er wird von hämatophagen Triatominae, einer Unterfamilie der Raubwanzen (Hemiptera: Reduviidae) während der Blutmahlzeit an einem infizierten Säugerwirt aufgenommen, durchläuft komplexe Entwicklungsschritte im intestinalen Trakt der triatominen Insekten und wird anschließend über den Fäzes und Urin der Wanzen abgegeben. Die Infektion des nächsten Wirts erfolgt dann durch das versehentliche Einreiben der Erreger in die Stichwunde oder auf Schleimhäute. Auch eine Infektion über die orale Aufnahme von kontaminierter Nahrung, Mutter-Kind-Infektionen und die Übertragung durch Blutkonserven und Organtransplantate sind möglich. Die Chagas‑Krankheit, oder auch Amerikanische Trypanosomiasis, ist insbesondere in Mittel- und Südamerika verbreitet und betrifft nach Schätzungen der WHO 6 bis 7 Millionen Menschen. Infolge von globaler Immigration und erhöhtem Reiseverkehr treten jedoch in den letzten Jahrzehnten auch vermehrt Fälle in Europa, den USA, Kanada und den westlichen Pazifikstaaten auf. Da dort bislang geeignete Vektoren fehlen, kommt es außerhalb des lateinamerikanischen Kontinents nicht zu vektorübertragenen Infektionen. Dies könnte sich jedoch im Zuge des Klimawandels und einer voranschreitenden Globalisierung ändern, sollte der Ausbreitung der Chagas-Krankheit eine Ausbreitung ihrer triatominen Vektoren folgen.
Inwieweit Triatominae unter heutigen Bedingungen klimatisch geeignete Habitate außerhalb des amerikanischen Kontinents finden, wurde innerhalb des ersten Projekts der vorliegenden Dissertation untersucht. Dazu wurde mit Hilfe der ökologischen Nischenmodellierung und Vorkommensdaten verschiedener vektorkompetenter Raubwanzenarten sowie klimatischer Umweltvariablen die klimatische Eignung verschiedenster Lebensräume modelliert und global projiziert. Es zeigte sich, dass insbesondere tropische und subtropische Gebiete Afrikas sowie Ost- und Südostasiens zwischen 21° nördlicher Breite und 24° südlicher Breite für viele triatomine Vektorarten geeignete Bedingungen aufweisen. Auffällig ist dabei insbesondere die Art Triatoma rubrofasciata, welche nachweislich bereits in Südchina, Vietnam und weiteren Ländern Afrikas und Asiens gefunden wurde. Die Modellierung
offenbarte, dass weitere ausgedehnte Teile der Küstenregionen Afrikas und Südostasiens als für T. rubrofasciata klimatisch geeignet angesehen werden müssen. Eine weitere Ausbreitung dieser Art ist demnach äußerst wahrscheinlich und stellt bislang das größte Risiko autochthon übertragener Chagas-Infektionen außerhalb des amerikanischen Kontinents dar. Es konnten außerdem zwei triatomine Arten identifiziert werden, namentlich T. infestans und T. sordida, welche in gemäßigten Klimazonen geeignete Habitate finden. Zu diesen gehören beispielsweise Neuseeland und Teile Australiens, aber auch südeuropäische Länder wie Spanien, Italien, Griechenland und Portugal. Da mit einer Ausweitung der klimatisch geeigneten Gebiete infolge des sich verändernden Klimas zu rechnen ist, wäre ein Monitoring der Vektoren, wie es bereits in Südchina etabliert ist, aber insbesondere die Einführung der Meldepflicht für Amerikanische Trypanosomiasis in diesen Regionen sinnvoll. Die Ergebnisse der Studie zeigen deutlich, dass die bisher vernachlässigte Tropenkrankheit Chagas nicht allein ein Problem des lateinamerikanischen Kontinents ist, sondern deren Erforschung vielmehr weltweit Beachtung finden sollte.
So konzentrierten sich die folgenden Forschungsprojekte der Promotion verstärkt auf die Mechanismen, welche die Entwicklung und Transmission des Parasiten und die Interaktion mit seinen Vektoren betreffen. Von besonderem Interesse waren dabei die ökologischen Prozesse, welche bei der Kolonisation des Darmtrakts der Vektoren durch T. cruzi ablaufen und essentiell für die Proliferation und damit die Übertragung des Parasiten sind. Eine entscheidende Rolle spielen dabei die mit dem Vektor assoziierten Mikroorganismen und ihre funktionellen Fähigkeiten – zusammengefasst als Mikrobiom bezeichnet. Dieses erfüllt wichtige physiologische Funktionen des Insekts und kann beispielsweise das Immunsystem und die Detoxifikation beeinflussen. Um die Veränderungen der organismischen Zusammensetzung und der funktionellen Kapazitäten, welche die Infektion mit dem Pathogen im Darmtrakt der Vektoren auslösen, zu untersuchen, wurde ein metagenomischer Shotgun Sequenzierungsansatz gewählt. Die daraus resultierenden Datensätze wurden anschließend bioinformatisch ausgewertet und auf ihre mikrobielle Zusammensetzung und metabolischen Fähigkeiten hin untersucht. Es zeigte sich zunächst, dass das Bakterium Rhodococcus rhodnii, welches lange als alleiniger echter Symbiont des untersuchten Vektors Rhodnius prolixus galt, in seiner Funktionalität nicht einzigartig im Mikrobiom des Insekts ist. ...
Die Regulation des Zellzyklus wird durch Phosphorylierung und Dephosphorylierung gesteuert. Schlüsselenzyme sind dabei die Cdk/Cyclin-Komplexe. Für den Eintritt und das Durchlaufen der Mitose von besonderer Bedeutung ist die Polo-like Kinase 1 (Plk1). Zur Aufklärung Mitose-spezifischer Signalwege wurden in dieser Arbeit neue Interaktionspartner der Plk1 gesucht. Die Bedeutung dieser Interaktionen für Zellzyklus und Mitose sollten näher charakterisiert werden. In dieser Arbeit konnte gezeigt werden, daß Plk1 direkt mit humanem Cyclin B1, der regulatorischen Untereinheit des M-phase-promoting-factors (MPF), interagiert. Dabei konnte festgestellt werden, daß Plk1 in der Lage ist, Cyclin B1 innerhalb dessen cytoplasmic retention signals (CRS) am Ser-133 zu phosphorylieren. Ferner konnte gezeigt werden, daß die Phosphorylierung der CRS in einer synergistischen Weise durch Plk1 und MAPK (Erk2) stattfindet. Vorphosphorylierung der CRS durch MAPK an Ser-126 und Ser-128 führt nicht nur zu einer 3-4 fach stärkeren Phosphorylierung durch Plk1, sondern auch zur Entstehung neuer Phosphorylierungs-Stellen für Plk1. Die hier aufgeführten Daten zeigen, daß durch synergistische Phosphorylierung der CRS, an der Plk1 beteiligt ist, der rapide nukleäre Import des Cyclin B1/Cdk1-Komplexes in der Prophase gesteuert wird. Dieser rapide Import in den Kern ist Voraussetzung für die Auflösung der Kernmembran in der Prometaphase. Damit konnte gezeigt werden, daß Plk1 dazu beiträgt, den MPF in den Kern (zu seinen Substraten) zu bringen, um früh-mitotische Ereignisse zu induzieren. Mitotische Kinasen (wie MPF, aber auch MAPK) phosphorylieren ihre Substrate oft an Ser/Thr-Pro-Motiven. Sind diese Motive phosphoryliert (pSer/Thr-Pro), so können sie von Pin1, einer Peptidyl-Prolyl-cis/trans-Isomerase isomerisiert werden. In dieser Arbeit wurde gezeigt, daß Plk1 mit Pin1 interagiert. Dabei bindet Plk1 an die Protein-Interaktionsdomäne (WW-Domäne) von Pin1, ist aber gleichzeitig in der Lage, Pin1 innerhalb seiner katalytischen Domäne (PPIase Domäne) zu phosphorylieren. Es konnte gezeigt werden, daß das Ser-65 in Pin1 eine Phosphorylierungs-Stelle für Plk1 darstellt. Da bekannt war, daß Vortäuschung einer Phosphorylierung an Ser-16 oder Ser-67 die Pin1-Aktivität hemmt, wurde ein ähnlicher Effekt für Ser-65 erwartet. Jedoch führte die Vortäuschung der Phosphorylierung an Ser-65 nicht zu einer Reduktion der PPIase-Aktivität von Pin1. In dieser Arbeit konnte erstmals gezeigt werden, daß Pin1 über das Proteasom abgebaut wird. Die Vortäuschung der Ser-65-Phosphorylierung führt zur Stabilisierung des Pin1-Proteins. Damit ist Plk1 das erste bekannte Enzym, welches Pin1 durch Phosphorylierung stabilisiert.
In südlichen Gefilden wächst so manches, was in Maßen genossen dem Wohlbefinden dient. Dies gilt nicht nur für Heilkräuter und Rotwein, sondern vermutlich auch für andere für den Mittelmeerraum typische Getränke und Speisen. Auf der Suche nach diesen "natürlichen Apotheken" erfassen Wissenschaftler aus Deutschland und sechs weiteren europäischen Ländern derzeit seltene Unterarten bewährter Nutzpflanzen wie Thymian, Olive, Wein und Orange. Sie erforschen, ob die seit Jahrhunderten überlieferten Schutzund Heilungskräfte der Gewächse einer wissenschaftlichen Prüfung standhalten und worauf sie beruhen. Die Frankfurter Gruppe um Prof. Dr. Walter Müller hat dabei insbesondere Stoffe im Blick, die das Nervensystem beeinflussen. Macht mediterrane Kost wirklich geistig fit?
Auf der Oberfläche von Erythrozyten, Thrombozyten und Neutrophilen befinden sich mehrere hundert verschiedene polymorphe, ungekoppelt vererbte Blutgruppenantigene. Dementsprechend birgt jede Bluttransfusion das Risiko einer Immunisierung gegen fremde Blutgruppenmerkmale. Auch während der Schwangerschaft können aufgrund väterlich vererbter Antigene Alloantikörper induziert werden. Deshalb muss das Blut vor jeder Transfusion oder während einer Schwangerschaft auf das Vorhandensein irregulärer erythrozytärer Antikörper untersucht werden. Dabei greifen die aktuellen diagnostischen Verfahren auf primäre, stabilisierte Testerythrozyten von Blutspendern zurück, deren relevante Blutgruppenantigene bekannt sind. Antikörperspezifitäten können anhand von Agglutinationsreaktionen der Testzellen mit dem zu untersuchenden Patientenplasma auf ein oder mehrere Antigene zurückgeführt werden. Ist jedoch ein Antikörper gegen ein häufiges, ein hochfrequentes oder ein nicht-polymorphes, ubiquitäres Antigen gerichtet, kann in Ermangelung Antigen-negativer Testzellen keine adäquate Diagnostik gewährleistet, die Verträglichkeit der Transfusion also nicht definitiv sichergestellt werden. Auch der medizinische Einsatz therapeutischer Antikörper, welche Antigene adressieren, die auch auf Erythrozyten exprimiert werden, führt zunehmend zu Problemen. Tests auf granulozytäre Antikörper sind mangelhaft bezüglich ihrer Robustheit, besitzen eine unzureichende Auflösung und sind zudem meist zeitaufwändig und daher teuer. Antikörper gegen humane Plättchenantigene spielen insbesondere in der Schwangerschaft eine Rolle; sie vermögen bei Neugeborenen thrombozytopenische Blutungen bis hin zu massiven Hirnblutungen zu verursachen, die zu schweren Entwicklungsstörungen führen können. Bisher erfolgt jedoch mangels geeigneter Reagenzien keine standardisierte pränatale Untersuchung auf thrombozytäre Antikörper. In dieser Arbeit wurde ein neuartiges Verfahren für die Identifikation und Differenzierung irregulärer Blutgruppenantikörper etabliert, welches auf gentechnisch hergestellten, xenogenen Testzellen basiert, die einzelne definierte humane Blutgruppenantigene auf ihrer Oberfläche präsentieren. Die nicht humanen Zellen co exprimieren Fluorochrome, anhand derer Antikörper-markierte Testzellen durchflusszytometrisch voneinander unterscheidbar sind. Weiterhin können die generierten Testzellen zur Depletion von Antikörpern aus polyagglutinierenden Plasmen unter Erhalt der anderen Antikörperspezifitäten verwendet werden. Diese Technologie könnte die konventionelle Diagnostik erheblich erleichtern und bietet zudem die Möglichkeit, therapeutische Antikörper (wie z. B. anti-CD38, anti CD47, etc.), die häufig zu Interferenzen mit der Routinediagnostik führen, spezifisch prädiagnostisch aus Patientenproben zu entfernen.
In dieser Arbeit wurden potentielle Mitglieder des Proteinnetzwerks um Ataxin-2 untersucht, um Rückschlüsse auf die bisher unbekannte Funktion von Ataxin-2 machen zu können. Ataxin-2 ist das Krankheitsprotein der Spinozerebellären Ataxie Typ 2, einer Polyglutaminerkrankung, bei der die Expansion eines Polyglutamintraktes zur Degeneration von Purkinje-Neuronen führt. Da die Funktion von Ataxin-2 bisher nicht ermittelt werden konnte, sollte die Charakterisierung seiner Protein-Interaktoren es ermöglichen, Einblicke in seine Funktion zu gewinnen. Dazu wurden die drei Kandidaten „Similar to golgin-like“, TRAP und alpha-Actinin-1 untersucht, die alle drei mit Hilfe von Hefe-2-Hybrid Screens identifiziert worden waren. Im Fall von „Similar to golgin-like“, einem aus Genom und cDNA-Fragmenten hervorgesagten Protein unbewiesener Existenz, konnte eine mutationsabhängige Modulation der Bindungsstärke an Ataxin-2 im Hefe-2-Hybrid-System gezeigt werden, die sich allerdings mit rekombinanten Proteinen in Koimmunpräzipitationen in Säuger-Zellen nicht reproduzieren ließ. Beide Proteine kolokalisierten am ER, unabhängig von der Länge des pathogenen Polyglutamintraktes-2 in Ataxin. Gegen ein SIM-Peptid hergestellte Antikörper zeigten eine exklusive Expression im menschlichen Gehirn und wurden erfolgreich zum Nachweis eines endogenen Komplexes aus Ataxin-2 und SIM-IR im krankheitsrelevanten Gewebe eingesetzt. Allerdings war es nicht möglich, mittels 5’-RACE und 2D-Gel Massenspektrometrie die potentiellen Isoformen von SIM näher zu charakterisieren. Zur funktionellen Analyse von SIM wurden intrazelluläre Transportvorgänge am Golgi-Apparat untersucht, aber ein Einfluss von SIM / Ataxin-2 ließ sich nicht belegen. Im Fall des Interaktions-Kandidaten TRAP wurden Antikörper hergestellt und mit einem bereits publizierten polyklonalen Antikörper, der TRAP in rattus norvegicus erkennt, verglichen. Die Expressionsmuster zeigten eine identische Expression im Hirn und der Testis. Eine Kolokalisations-Studie wies sowohl TRAP als auch Ataxin-2 am ER nach. Allerdings erwiesen sich alle verwendeten Antikörper als ungeeignet für Immunpräzipitationen, so dass die physiologische Existenz des endogenen TRAP-Ataxin-2 Komplexes nicht bewiesen werden kann. Im Fall des Interaktor-Kandidaten alpha-Actinin-1 ließ sich die Interaktion mit Ataxin-2 sowohl für die endogenen Proteine in der zytosolischen Fraktion von Mausgehirnen als auch für die rekombinanten Proteine in Säuger-Zellen belegen. Beide Proteine konnten im Zytosol und zu kleineren Anteilen an der Plasmamembran kolokalisiert werden. Als verantwortliche Subdomänen im Fall von Ataxin-2 wurde der N-terminale Bereich des Proteins in der Nähe der pathogenen Expansion, im Fall von alpha-Actinin-1 die Aktin-bindende Domäne durch GST-pulldown Analysen identifiziert. Darauf aufbauend wurde in Patienten-Fibroblasten das Aktinzytoskelett und die Dynamik von alpha-Actinin-1 in Anwesenheit der Ataxin-2-Polyglutamin-Expansion untersucht, wobei allerdings kein Unterschied zu erkennen war. Anschließend an die Analyse des Zytoskeletts wurde ein möglicher Einfluss von Ataxin-2 und seiner Polyglutamin-Expansion auf die EGF-Rezeptorinternalisierung studiert, da eine Rolle von Ataxin-2 auf die Endozytose in parallelen Analysen der Arbeitsgruppe wahrscheinlich wurde. Hierzu wurden Säuger-Zellen mit alpha-Actinin-1 transfiziert und die Internalisierung mikroskopisch und mittels Analyse der ERK1/2 Aktivierung verfolgt. Ergänzt wurden die Experimente durch Analysen zur ERK1/2 Aktivierung in Patienten- und Kontroll-Fibroblasten. Entgegen den Erwartungen hatte die Überexpression von alpha-Actinin-1 keinen Einfluss auf die Internalisierung, und bei keinem der Ansätze zeigte sich eine signifikante Veränderung der ERK1/2 Aktivierung. Auch Transkriptombefunde aus SCA2-KO Gewebe, nach denen einzelne Gene des Zytoskeletts oder der Rezeptor-Endozytose ihre Expression ändern, ließen sich nicht mit Konsistenz validieren. Abschließend wurden Experimente zur subzellulären Lokalisation von Ataxin-2 durchgeführt, die eine Lokalisation am ER und nicht wie bisher berichtet am Golgi-Apparat sicherten und Ergebnisse zur Assoziation mit Polyribosomen bekräftigten. Obwohl somit bei allen drei Proteininteraktor-Kandidaten glaubwürdige Befunde für eine Ataxin-2 Bindung sprechen, ist derzeit eine funktionelle Analyse der Assoziationen nicht möglich und eine klare Definition der physiologischen Rolle von Ataxin-2 lässt sich aus diesen Daten nicht ableiten, wenn auch die prominente Lokalisation von Ataxin-2 am rauen endoplasmatischen Retikulum mit einem Einfluss von Ataxin-2 auf die ribosomale Translation und die Sekretion in Cisternen kompatibel ist.
Zur Evolution der Hirnmorphologie und Anpassungen an Extremhabitate im Taxon Poecilia (Teleostei)
(2020)
Diese Dissertation befasst sich mit den Auswirkungen kontrastierender Umweltbedingungen auf die Gehirnmorphologie von neotropischen Fischen der Gattung Poecilia, welche unterschiedlichen abiotischen sowie biotischen Stressoren ausgesetzt sind. Da das Gehirn der Teleostei ein energetisch kostspieliges Organ und viel plastischer ist als z. B. bei Säugetieren, stellt sich die Frage, wie die Gehirnanatomie durch divergierende ökologische Faktoren in verschiedenen Umgebungen geformt wird, die ´extreme´, ´ressourcenbeschränkte und günstige´ Umgebungen repräsentieren. Zur Beantwortung dieser Frage wurden intraspezifische Studien an freilebenden und Laborindividuen von Poecilia-Arten durchgeführt, um die evolutionäre und ökologische Formgebung des Gehirns besser verstehen zu lernen. Im ersten Teil der Arbeit wurden Gehirnvolumina verglichen zwischen reproduktiv isolierten Populationen des neotropischen Fisches Poecilia mexicana (Ntotal = 95), die in Dunkelheit leben (Cueva Luna Azufre), in einem nahegelegenen Oberflächenhabitat (El Azufre), welcher giftigen Schwefelwasserstoff enthält und einer Kombination aus beiden Stressoren Dunkelheit und H2S (Cueva del Azufre). In einer zweiten Studie wurde auf anatomische („konvergente“) Veränderungen im Teleost-Gehirn entlang eines natürlichen Gradienten von Sulfidkonzentrationen getestet. Hierfür wurden Gehirne (Ntotal = 100) von P. mexicana verglichen, die in drei Flusssystemen im Süden Mexikos unabhängig voneinander eine erhöhte Toleranz gegenüber Schwefelwasserstoff (H2S) entwickelt haben. Dazu gehörten eine phylogenetisch alte H2S-adaptierte Form (P. sulphuraria) und zwei P. mexicana Formen, welche frühere Stufen der Anpassung an H2S darstellen. Zur Überprüfung des Einflusses anderer abiotischer und biotischer Faktoren auf die Morphologie der Gehirnregionen wurde eine weitere Studie durchgeführt. Hierbei wurden die phänotypischen Variationen der Gehirnregionen und der Körpermorphologie von Poecilia vivipara-Populationen (Ntotal = 211) aus Lagunen des Restinga de Jurubatiba Nationalpark untersucht, die sich in abiotischen Umgebungsbedingungen, insbesondere in Salzgehalt, Wassertransparenz, Phosphat und Nitrat sowie biotischen Faktoren wie Prädatorendichte unterschieden. Die erste Studie zeigte lebensraumabhängige Unterschiede bei freilebenden Fischen. Bei Fischen, die in Dunkelheit ohne H2S (LA) oder in Oberflächenhabitaten mit H2S lebten, wurden vergrößerte telenzephale Lappen, kleinere Augen und optische Tekta gefunden. Fische aus der sulfidischen Höhle (CA) zeigten zusätzlich vergrößerte Corpus cerebelli. Der Vergleich mit den Gehirnen von Labor aufgezogenen weiblichen Fischen (Ntotal = 25) zeigt eine allgemeine Verringerung der Gehirngröße sowie eine geringe Abweichung der Gehirngröße zwischen Labor aufgezogenen und freilebenden Fischen. Auch in der zweiten Studie zeigten alle in H2S-haltigen Lebensräumen lebenden Fische kleinere Augen, ein kleineres optisches Tektum und ein kleineres Gehirnvolumen, jedoch größere Corpus cerebelli und Hypothalamusvolumen als Fische aus nicht-sulfidischen Lebensräumen. Flusssystem-spezifische Effekte wurden für die telenzephalen Lappen, das gesamte Gehirn und die Augengröße festgestellt, da die Geschlechter je nach Quelle des Flusssystems unterschiedlich auf das Vorhandensein von H2S reagierten. Die dritte Studie zeigt auch, dass andere Umwelteinflüsse bemerkenswerte Verschiebungen im Gehirn und in den Gehirnregionen verursachen können. Fische, die im Süßwasser leben, zeigten eine verringerte Gesamthirngröße, telenzephale Lappen, Corpus cerebelli und Hypothalamusvolumen. Darüber hinaus zeigten Fische aus Salzwasserlagunen (hypersalin), ein verringertes Volumen des optischen Tektum, während telenzephale Lappen, Corpus cerebelli und Hypothalamusvolumen im Vergleich zu Süßwasserfischen vergrößert waren. Im Brackwasser lebende Fische wiesen im Vergleich zu Süß- und Salzwasserfischen die größten Gehirnregion-Volumen auf. Darüber hinaus zeigten die Ergebnisse über die Lagunen hinweg auch Unterschiede in der Morphologie der Kopf- und Augendurchmesser. Bei Augengröße, Kopfgröße, optischem Tektum Volumen, Hypothalamusvolumen und dem Gesamthirnvolumen wurde ein sexueller Dimorphismus beobachtet. Die dargestellten Ergebnisse verdeutlichen, dass die gefundenen Muster nahezu mit denen von H2S-Fischen identisch sind. Die ausgeprägten Unterschiede in den Hirnregionen zwischen freilebenden Fischen können als Teil der Mosaikentwicklung interpretiert werden. Die Ergebnisse der Laborpopulation zeigen jedoch eine hohe phänotypische Plastizität. Diese Studie unterstreicht damit die Bedeutung der Kombination der Untersuchung von freilebenden mit im Labor lebenden Individuen zur Beantwortung von Fragen der Gehirnentwicklung. Kleinere Augen und ein kleineres optisches Tektum, aber größere telenzephale Lappen wurden auch bei Fischen aus einem sulfidischen Oberflächenhabitat in der Nähe einer der Höhlen gefunden und sind den Ergebnissen zufolge das Resultat begrenzter Sehkraft in trüben sulfidischen Lebensräumen.
...
Mikroalgen wird aufgrund ihrer photoautotrophen Lebensweise, ihrer meist einfachen Anzucht und ihres schnellen Wachstums ein großes Potential als Produzenten verschiedener Stoffe, wie beispielsweise den Sekundärmetaboliten der Carotinoidbiosynthese, zugesprochen. Zur Produktion solcher Stoffe bedarf es der Aufklärung der in einem Biosyntheseweg operierenden Enzyme und ihrer zugehörigen Gene.
In dieser Arbeit sollte einerseits durch genetische Modifikation der Carotinoidbiosynthese der Fucoxanthingehalt erhöht und andererseits die Produktion von Astaxanthin in P. tricornutum erreicht werden. Bisher fehlen experimentelle Nachweise über die Funktion, Regulation und die limitierenden Eigenschaften daran beteiligter Gene und deren Enzyme. Um dem Ziel der Arbeit näher zu kommen, wurden zuerst potentiell an der Regulation der Carotinoidbiosynthese beteiligte Gene ausgewählt und deren Enzyme funktionell charakterisiert. Eines dieser Enzyme ist das Eingangsenzym der Carotinoidbiosynthese, die Phytoen-Synthase. Die entsprechend annotierte putative Sequenz (psy #Pt56881) wurde zur Analyse herangezogen. Nachdem im Rahmen dieser Arbeit über die Komplementation in einem dafür ausgerichteten E. coli Stamm der funktionelle Nachweis der Phytoen-Synthase erbracht werden konnte, wurde untersucht, ob die Phytoen-Synthase einer lichtabhängigen Expression unterliegt und somit die Carotinoidsynthese im WT von P. tricornutum limitiert. Durch die Inhibierung der Phytoen-Desaturase mittels Norflurazon konnte die verstärkte Akkumulation des Produktes der Phytoen-Synthase, Phytoen, bei einem Transfer der P. tricornutum-Kulturen von Schwach- in Starklicht gezeigt werden. Die Expression der Phytoen-Synthase von P. tricornutum wird demnach durch die Lichtbedingungen reguliert und limitiert auch die Carotinoidsynthese. Ein weiteres an der Carotinoidsynthese beteiligtes Enzym ist die Zeaxanthin-Epoxidase. Sie bietet zugleich eine Möglichkeit, an dieser Stelle die Carotinoidsynthese in Richtung Astaxanthinproduktion umzulenken. Für P. tricornutum sind drei potentielle Genkandidaten (zep1: #Pt45845; zep2: #Pt56488; zep3: #Pt56792) annotiert, welche ebenfalls im Rahmen dieser Arbeit funktionell charakterisiert wurden. Der funktionelle Nachweis erfolgte dabei ebenfalls mittels eines Komplementationsansatzes in einem damit neu etablierten Expressionssystem mit npq2-Mutanten aus der Modellpflanze A. thaliana. Die Analyse der Transformanden zeigte eine Epoxidase-Aktivität des Produktes aus zep2 und zep3. Das Enzym Zeaxanthin-Epoxidase 2 weist dabei eine andere Spezifität auf als die Zeaxanthin-Epoxidase 3, welche funktionell betrachtet der Zeaxanthin-Epoxidase aus A. thaliana am nächsten kommt. Die Zeaxanthin-Epoxidase 2 akzeptiert im Unterschied zu Zeaxanthin-Epoxidase 3 neben Zeaxanthin auch andere Substrate wie Lutein mit nur einem 3 Hydroxy-β-Iononring und stellt damit einen validen Kandidaten für die Umwandlung von Diatoxanthin in Diadinoxanthin in P. tricornutum dar. Obwohl die Transkriptanalysen ausreichende Mengen an RNA von zep1 in A. thaliana zeigen und anhand eines zusätzlichen mit der Sequenz für GFP markierten zep1-Konstruktes in WT-Protoplasten von A. thaliana der Import in den Chloroplasten und die Expression nachgewiesen werden konnte, weist die Zeaxanthin-Epoxidase 1 zumindest in den A. thaliana-Transformanden keine Epoxidase-Aktivität auf. Des Weiteren zeigt die diurnale Expression in P. tricornutum, dass die Regulation der Zeaxanthin-Epoxidasen an den Bedarf photoprotektiver Pigmente angepasst wird. Während die Regulation des Transkript-Levels von zep2 und zep3 nahezu parallel laufen und ein gemeinsames Maximum aufweisen, zeigt das Transkript-Level von zep1 ein anderes Maximum.
Die gewonnenen Erkenntnisse wurden dann zur Steigerung der Synthesekapazität mittels genetischer Modifikation des Carotinoidsyntheseweges in P. tricornutum angewendet. Durch das Einbringen zusätzlicher Genkopien der Phytoen-Synthase in P. tricornutum konnte dabei eine deutliche Steigerung des Fucoxanthingehalts unter Schwachlichtbedingungen erreicht werden. Gleichzeitig konnte durch weitere inhibitorische Versuche mittels Norflurazon beim Transfer von Schwach- zu Starklicht demonstriert werden, dass die Carotinoidsynthese durch die Kombination der genetischen Modifikation mit der Phytoen-Synthase und Starklicht per se weiterhin gesteigert werden kann. Zusammen mit den Transkriptanalysen zeigen die Pigmentanalysen, dass es einen nicht-linearen Zusammenhang zwischen RNA-Menge und gebildeter Phytoenmenge gibt, welcher durch eine zusätzliche Substratlimitierung der Phytoen-Synthase erklärt werden kann.
Bevor das Herunterregulieren der Zeaxanthin-Epoxidasen in P. tricornutum durchgeführt und damit ein verstärkter Fluss zur Astaxanthinbildung erreicht werden sollte, wurde das Potential von P. tricornutum zur Astaxanthinproduktion überprüft. Hierfür wurde die β-Carotin-Ketolase (bkt #CrAEA35045.1) aus C. reinhardtii einmal ohne und zusätzlich mit verschiedenen Präsequenzen fusioniert separat in P. tricornutum eingebracht. Astaxanthin konnte trotz Nutzung funktionell bestätigter Präsequenzen aus der Literatur nicht nachgewiesen werden. Die Versuche zeigen damit, dass hier noch weitere Untersuchungen nötig sind, um mittels eines geeigneten Transportsystems Fremd-Proteine in den Chloroplasten von P. tricornutum einzubringen. Das Ausbleiben der Astaxanthinproduktion konnte an dieser Stelle nicht hinreichend geklärt werden.
Insgesamt schaffen die Ergebnisse dieser Arbeit eine weitere Grundlage, um die Carotinoidbiosynthese in P. tricornutum besser zu verstehen und diese mittels genetischer Modifikationen biotechnologisch nutzbar zu machen.