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Zwischen Anfang 1787 und Ende 1789 erscheint in der Zeitschrift Thalia Schillers Roman "Der Geisterseher", der zunächst zeigt, wie die nüchterne Vernunft über scheinbar rätselhafte Geschehnisse triumphiert; er kann aber auch Ausgangspunkt sein, um Schiller mit drängenden Fragen zur Relevanz der Geisteswissenschaften zu konfrontieren, zumal dieser als Professor selbst über einen Wissenschaftlertypus nachgedacht hat, der ständig darum bemüht ist (und bemüht sein muss), die Bedingungen zu erfüllen, unter denen er sein Amt angetreten hat, der – wie es heißt – "beim Eintritt in seine akademische Laufbahn keine wichtigere Angelegenheit" hat, "als die Wissenschaften, die er Brotstudien nennt, von allen übrigen, die den Geist nur als Geist vergnügen, auf das sorgfältigste abzusondern".
Astrozytome WHO Grad III und Glioblastome WHO Grad IV gehören zu der Gruppe der hochmalignen Hirntumoren. Diese hochmalignen Gliome haben insgesamt eine schlechte Prognose. Therapiestrategien sind eine möglichst ausgedehnte chirurgische Resektion des Tumors, sowie darauf folgend eine Strahlentherapie, am besten in Kombination mit einer Chemotherapie. Die kombinierte Radiochemotherapie mit Temodal konnte in dieser Studie zeigen, dass sich das mediane Gesamtüberleben im Vergleich zur Literatur um mindestens 3 Monate verbessert hat, in einer Untergruppe sogar um 6 Monate. Der Vorteil der Therapie mit Temodal ist aber nicht nur das längere mediane Gesamtüberleben und das längere progressionsfreie Überleben, sondern auch die geringere Toxizität im Vergleich zu anderen Chemotherapeutika. Die Therapie mit Temodal gibt den Patienten ein Stück Lebensqualität zurück, da die Patienten das Medikament zu Hause einnehmen können. Die Patienten können meist ambulant bestrahlt werden und müssen nur selten für einige Tage hospitalisiert werden bei höhergradigen Hämatotoxizitäten und können dann wieder zurück zu ihrer Familie. Auch das Allgemeinbefinden wird durch die Therapie mit Temodal weitestgehend nicht gestört, da die möglicherweise auftretende Übelkeit gut mit Antiemetika kontrolliert werden kann. Meist ist die Übelkeit Ausdruck eines Hirnödems, welches mit Steroiden behandelt wird. Dies ist nicht nur ein Vorteil für die Patienten, sondern reduziert auch die Kosten durch das Ausbleiben der stationären Behandlung. Diese retrospektive Studie konnte auch ganz deutlich zeigen, dass die älteren Patienten (>= 70 Jahre) auch von einer kombinierten Radiochemotherapie mit Temodal profitieren. Im Vergleich mit den aufgetreten Toxizitäten zeigen sich die älteren Patienten gleichwertig bzw. leicht im Vorteil gegenüber den jüngeren Patienten. Es besteht somit kein Grund den älteren Patienten diese Therapie der kombinierten Radiochemotherapie mit Temodal vorzuenthalten. Die Resultate der retrospektiven Studie legen nahe, dass alle erwachsenen Patienten mit der Diagnose eines Astrozytoms WHO Grad III und/oder Glioblastomes WHO Grad IV, sowie Gliomrezidives von einer kombinierten Radiochemotherapie mit Temodal, beziehungsweise Temodal in höherer Dosis bei Rezidiv als Monotherapie, ungeachtet ihres Alters, Karnofsky-Index oder Resektionsstatus profitieren können. Zukünftige Therapieregime mit Chemotherapie, immunmodulatorische - Zielsubstanzen (z.B. Vascular Endothelial Growth Factor (VEGF) neutralisierende Antikörper) oder anderen Therapieansätzen zur Therapie dieser hochmalignen Hirntumore, sollten sich mit diesen Auswertungen im medianen Gesamtüberleben, medianen progressionsfreien Überleben, Toxizität, Durchführbarkeit und vor allem Lebensqualität der Patienten messen können.
In der Neurochirurgie sind temporäre externe Ableitungen von Liquor cerebrospinalis häufige Eingriffe zur Behandlung von Liquorabflußstörungen. Besonders bei externen Ableitungen besteht eine unmittelbare Kommunikation zwischen Liquorraum und Hautoberfläche. Infektionen durch den Katheterweg sind häufige Komplikationen. Ziel der vorliegenden Arbeit war es, die Wirksamkeit silberhaltiger EVD Katheter in vivo zu objektivieren. Dazu wurde die Infektionshäufigkeit konventioneller unbeschichteter EVD Katheter mit dem seit 2004 eingeführten antimikrobiellen silberhaltigen EVD Katheter verglichen. Mit einer statistischen Erfassung der Infektionsparameter aller Patienten die im Studienzeitraum eine externe Ventrikel-Drainage erhielten, wurde überprüft ob eine signifikante bzw. klinisch relevante Senkung der Infektionshäufigkeit vorlag. Hierzu wurden 231 Patienten in der Klinik für Neurochirurgie der Johann Wolfgang Goethe-Universitätsklinik retrospektiv untersucht. Von 231 Patienten wurden nach Anwendung der Ausschlußkriterien 164 in die statistische Analyse aufgenommen. In der Studiengruppe mit silberhaltigen EVD Kathetern befanden sich 74 Patienten, 90 in der Kontrollgruppe. In beiden Patientenkollektiven bestanden keine statistisch relevanten Unterschiede bezüglich der klinischen Charakteristika. Besonders die Verteilung von Antibiotika und Glukokortikoiden war annähernd gleich in beiden Gruppen. In unserer Studie ist der Einsatz silberhaltiger EVD Katheter zur Behandlung chronischer oder akuter Liquorabflußstörungen hinsichtlich des primären Endpunktes positive Liquorkulturen, Katheterkolonisierungen oder erhöhten Zellzahlen im Liquor, mit einer statistisch signifikanten Abnahme der Häufigkeit von positiven Infektionsparametern gegenüber herkömmlichen EVD Kathetern assoziiert (18,9 verglichen mit 33,7%; p=0,04 Chi-Quadrat-Test). Da externe Ventrikeldrainagen die Eintrittspforte für fakultativ pathogene Keime sein können, ist die Anwendung silberhaltiger EVD Katheter im Sinne einer lokalen Infektionsbarriere sinnvoll. Das Risiko katheterassoziierter Infektionen bei neurochirurgischen Patienten kann so gesenkt werden.
Die Haarzellen des Innenohrs setzen durch Schallreize ausgelöste Schwingungen der Basilarmembran in elektrische Impulse um, die über Nerven an das Gehirn geleitet werden und dort nach komplexer neuronaler Verarbeitung die Hörwahrnehmung auslösen. Gleichzeitig erhalten die äußeren Haarzellen über absteigende Nervenverbindungen, die olivo-cochleären Neurone, auch Informationen vom Gehirn, durch die ihre Empfindlichkeit verändert werden kann. Über die Mechanismen dieser efferenten Beeinflussung der Reizverarbeitung im Innenohr ist noch wenig bekannt und auch ihre biologische Funktion ist noch nicht geklärt. Diskutiert wird eine Rolle bei der Verbesserung des Signal-Hintergrundrausch-Verhältnisses und im Zusammenhang mit selektiver Aufmerksamkeit, durch die relevante Anteile der akustischen Umwelt gezielt „herausgehört“ werden können. Ziel dieser Promotionsarbeit ist die Untersuchung der efferenten Beeinflussung der Vorgänge im Innenohr mithilfe der nicht-invasiven Messung von akustischen Beiprodukten der aktiven Reizverstärkung durch die äußeren Haarzellen, den otoakustischen Emissionen. Bei dieser Methode werden mit einem empfindlichen Mikrophon im Gehörgang Schallereignisse aufgenommen, die das Ohr selbst produziert. Die olivo-cochleären Efferenzen können experimentell durch Applikation von Rausch-Stimuli auf dem kontralateralen Ohr aktiviert werden und ihre Wirkung auf die Empfindlichkeit des Innenohrs anhand der Veränderungen der otoakustischen Emissionen auf dem anderen, ipsilateralen Ohr gemessen werden. In Messungen unterschiedlicher Typen von otoakustischen Emissionen am Menschen und an der Mongolischen Wüstenrennmaus konnten deutliche Veränderungen der otoakustischen Emissionen bei gleichzeitiger Beschallung des kontralateralen Ohrs gezeigt werden, die als Modulation der Haarzelleigenschaften und Beeinflussung der cochleären Verstärkung durch Aktivierung der absteigenden Nervenbahnen interpretiert werden können: Spontane otoakustische Emissionen (SOAE), die ohne jegliche akustische Stimulation vom Innenohr generiert werden, zeigten bei kontralateraler akustischer Stimulation eine Verminderung ihres Pegels und eine Erhöhung ihrer Frequenz. Die Pegelverminderung deutet auf eine Dämpfung der cochleären Verstärkungsmechanismen und die Frequenzerhöhung auf eine Erhöhung der Steifigkeit im Corti-Organ und hierdurch veränderte Resonanzeigenschaften nach Aktivierung der efferenten Neurone hin. Distorsionsprodukt-otoakustische Emissionen (DPOAE), die bei Stimulation mit zwei Reintönen (f1 und f2) in Folge der nichtlinearen Verstärkung durch die äußeren Haarzellen entstehen, waren durch kontralaterale akustische Stimulation ebenfalls klar in ihrem Pegel beeinflusst. Die Effekte, sowohl auf SOAE als auch auf DPOAE, waren abhängig vom Pegel des kontralateralen Stimulus und traten bereits bei niedrigen kontralateralen Stimuluspegeln, deutlich unter der Schwelle des Mittelohrreflexes, auf. Durch ihren Zeitverlauf konnten die Effekte den in der Literatur beschriebenen efferenten Vorgängen zugeschrieben werden. Bei anhaltender akustischer Stimulation traten Adaptationsphänomene auf. Weiterhin zeigte sich in Experimenten mit kontralateralem Schmalbandrauschen und Reintönen, dass die efferente Modulation selektiv auf bestimmte Bereiche des tonotop organisierten Innenohrs zielt, also frequenzspezifisch agiert, wobei Reintöne mit Frequenzen, die etwas tiefer als die Stimulationsfrequenz lagen, die größten Effekte erzielten. Dies steht in guter Übereinstimmung zu anatomischen Daten. Besonders interessant an den DPOAE-Messungen war, dass das quadratische Distorsionsprodukt der Frequenz f2-f1 wesentlich empfindlicher reagierte als das kubische Distorsionsprodukt der Frequenz 2f1-f2. Bisher gibt es kaum Daten zu Veränderungen der f2-f1-DPOAE durch efferente Mechanismen. Die beiden DPOAE-Typen sind durch unterschiedliche Parameter der dem Verstärkungsprozess zu Grunde liegenden Transferfunktion beeinflusst, und die experimentell nachgewiesenen Unterschiede deuten darauf hin, dass die Aktivierung der olivo-cochleären Efferenzen ihre dämpfende Wirkung auf die Schallverarbeitung im Innenohr durch eine Verschiebung des Arbeitspunktes der Transfercharakteristik des cochleären Verstärkers entfaltet. Diese Hypothese wurde an der Wüstenrennmaus durch einen ergänzenden methodischen Ansatz unterstützt, bei dem zusätzlich zur Evozierung und Messung von DPOAE mit und ohne gleichzeitiger kontralateraler Aktivierung der Efferenzen ein sehr tieffrequenter „Bias“-Ton mit hohem Pegel appliziert wurde, der das Corti-Organ und damit den Arbeitspunkt des cochleären Verstärkers periodisch auslenkte. Diese Tieftonstimulation hatte eine sehr starke, von der Phase des Bias-Tons abhängige Modulation des f2-f1-Pegels zur Folge, während 2f1-f2 kaum beeinflusst wurde. Das Muster der f2-f1-Pegelmodulation änderte bei zusätzlicher kontralateraler Schallapplikation deutlich seinen Charakter. Entsprechende Veränderungen in den Verzerrungsmustern konnten mithilfe eines einfachen Modells zur DPOAE-Generation, das auf der Beschreibung des Verstärkungsmechanismus durch eine Boltzman-Funktion basierte, simuliert werden. Die Befunde der vorliegenden Arbeit zeigen, dass die Schallverstärkung im Innenohr durch efferente Mechanismen moduliert wird und dies anhand der nicht-invasiven Messung von otoakustischen Emissionen nachweisbar ist. Dabei deuten die Ergebnisse auf eine Verschiebung des Arbeitspunktes der Transfercharakteristik des cochleären Verstärkers als Mechanismus der olivo-cochleären Modulation der Reizverarbeitung im Innenohr hin.
In dieser Studie wurde ein Tiermodell mit chronischer erhöhter Scherspannung verwendet. Es wurde eine arteriovenöse Seit-zu-Seit-Anastomose zwischen der Arteria und Vena femoralis angelegt, eine Woche nachdem die Arteria femoralis proximal beidseits ligiert wurde. Auf diesem Weg entleerte sich ein großer Teil des Kollateralblutflußes in das venöse Niederdrucksystem, was zu einem erhöhten Fluß führte. Nach einer weiteren Woche wurde das Experiment nach Durchführung einer digitalen Subtraktionsangiographie beendet. Im Anschluß erfolgte die Präparation von Kollateralarterien, Muskel und Kontrollarterien von beiden Seiten. Mit den Gewebeproben wurden 2-dimensionale Polyacrylamid-Gelelektrophoresen, Western und Northern Blots durchgeführt. Im Vergleich zur nur ligierten Seite fand sich auf der Fistelseite eine signifikant erhöhte Zahl an angiographisch sichtbaren Kollateralgefäßen. Die 2- dimensionale Polyacrylamid-Gelelektrophorese zeigte etwa 1000 Spots, von denen fast 50 in ihrer Expression verändert waren; darunter war das auf die Aktindynamik und damit Zellbewegung einwirkende Cofilin, das starke Expressionsunterschiede zwischen Ligatur- und Fistelseite aufwies. Diese Ergebnisse wurden mittels den Blotverfahren bestätigt und die unterschiedliche Ausprägung der Isoformen Cofilin 1 und 2 ausgewertet. Dabei entspricht das erstere dem undifferenzierten Status und das zweite dem differenzierten Status der glatten Muskelzellen. Dieses Tiermodell demonstriert, daß anhaltende Scherkrafterhöhung einen anhaltenden arteriogenetischen Prozeß unterhält und daß Zellmigration eine wichtige Rolle in diesem spielt, was durch die Veränderungen in der Cofilinexpression während der Kollateralentwicklung deutlich wird.
Kenntnisse über die dreidimensionale Struktur therapeutisch relevanter Zielproteine bieten wertvolle Informationen für den rationalen Wirkstoffentwurf. Die stetig wachsende Zahl aufgeklärter Kristallstrukturen von Proteinen ermöglicht eine qualitative und quantitative rechnergestützte Untersuchung von spezifischen Protein-Liganden Wechselwirkungen. Im Rahmen dieser Arbeit wurden neue Algorithmen für die Identifikation und den Ähnlichkeitsvergleich von Proteinbindetaschen und ihren Eigenschaften entwickelt und in dem Programm PocketomePicker zusammengefasst. Die Software gliedert sich in die Routinen PocketPicker, PocketShapelets und PocketGraph. Ferner wurde in dieser Arbeit die Methode ReverseLIQUID reimplementiert und im Rahmen einer Kooperation für das strukturbasierte Virtuelle Screening angewendet. Die genannten Methoden und ihre wissenschaftliche Anwendungen sollte hier zusammengefasst werden: Die Methode PocketPicker ermöglicht die Vorhersage potentieller Bindetaschen auf Proteinoberflächen. Diese Technik implementiert einen geometrischen Ansatz auf Basis „künstlicher Gitter“ zur Identifikation zusammenhängender vergrabener Bereiche der Proteinoberfläche als Orte möglicher Ligandenbindestellen. Die Methode erreicht eine korrekte Vorhersage der tatsächlichen Bindetasche für 73 % der Einträge eines repräsentativen Datensatzes von Proteinstrukturen. Für 90 % der Proteinstrukturen wird die tatsächlich Ligandenbindestelle unter den drei wahrscheinlichsten vorhergesagten Taschen gefunden. PocketPicker übertrifft die Vorhersagequalität anderer etablierter Algorithmen und ermöglicht Taschenidentifikationen auf apo-Strukturen ohne signifikante Einbußen des Vorhersageerfolges. Andere Verfahren weisen deutlich eingeschränkte Ergebnisse bei der Anwendung auf apo-Strukturen auf. PocketPicker erlaubt den alignmentfreien Ähnlichkeitsvergleich von Bindetaschenfor-men durch die Kodierung berechneter Bindevolumen als Korrelationsdeskriptoren. Dieser Ansatz wurde erfolgreich für Funktionsvorhersage von Bindetaschen aus Homologiemodellen von APOBEC3C und Glutamat Dehydrogenase des Malariaerregers Plasmodium falciparum angewendet. Diese beiden Projekte wurden in Zusammenarbeit mit Kollaborationspartnern durchgeführt. Zudem wurden PocketPicker Korrelationsdeskriptoren erfolgreich für die automatisierte Konformationsanalyse der enzymatischen Tasche von Aldose Reduktase angewendet. Für detaillierte Analysen der Form und der physikochemischen Eigenschaften von Proteinbindetaschen wurde in dieser Arbeit die Methode PocketShapelets entwickelt. Diese Technik ermöglicht strukturelle Alignments von extrahierten Bindevolumen durch Zerlegungen der Oberfläche von Proteinbindetaschen. Die Überlagerung gelingt durch die Identifikation strukturell ähnlicher Oberflächenkurvaturen zweier Taschen. PocketShapelets wurde erfolgreich zur Analyse funktioneller Ähnlichkeit von Bindetaschen verwendet, die auf Betrachtungen physikochemischer Eigenschaften basiert. Zur Analyse der topologischen Vielfalt von Bindetaschengeometrien wurde in dieser Arbeit die Methode PocketGraph entwickelt. Dieser Ansatz nutzt das Konzept des sog. „Wachsenden Neuronalen Gases“ aus dem Bereich des maschinellen Lernens für eine automatische Extraktion des strukturellen Aufbaus von Bindetaschen. Ferner ermöglicht diese Methode die Zerlegung einer Bindestelle in ihre Subtaschen. Die von PocketPicker charakterisierten Taschenvolumen bilden die Grundlage für die Methode ReverseLIQUID. Dieses Programm wurde in dieser Arbeit weiterentwickelt und im Rahmen einer Kooperation zur Identifikation eines Inhibitors der Serinprotease HtrA des Erregers Helicobacter pylori verwendet. Mit ReverseLIQUID konnte ein strukturbasiertes Pharmakophormodell für das Virtuelle Screening erstellt werden. Dieser Ansatz ermöglichte die Identifikation einer Substanz mit niedrig mikromolarer Affinität gegenüber der Zielstruktur.
Der postoperative Infekt um ein alloplastisches Implantat stellt keine häufige jedoch schwerwiegende Komplikation dar. Bislang wurde der Infekt des Implantatlagers in aller Regel durch vorübergehende Entfernung des Implantates behandelt. Nach vollständiger Infektheilung unter antibiotischer Therapie erfolgte die Reimplantation. Für die Patientinnen bedeutet dies den Misserfolg der Operation und stellt eine erhebliche physische und psychische Belastung über mehrere Monate dar. Ein einzeitiger Implantatwechsel mit Spül-Saug-Drainage und antibiotischer Behandlung kann dagegen den Patientinnen den vorübergehenden Verlust des Implantates und die Risiken einer zweiten Operation ersparen. In der vorliegenden Studie wurde der Implantatlagerinfekt in 74 Fällen durch einen einzeitigen Implantatwechsel und anschließende antibiotische Spülungen über ein Drainagesystem behandelt. Unser Behandlungskonzept bestand aus einem Implantatwechsel mit Kapsulektomie und täglicher Instillation einer antibiotischen Lösung (Gentamycin oder Teicoplanin) über eine Spül-Saug-Drainage. Die Therapie dauerte in der Regel fünf Tage und wurde in 78,4% der Fälle von einer systemischen Antibiose begleitet. Dieses Vorgehen war in 89,2% der Behandlungen erfolgreich. Bei 10,8% der Patientinnen musste eine erneute Spül-Saug-Therapie durchgeführt werden. Ebenfalls in 10,8% der Fälle musste das Implantat entfernt werden. Die Diagnose des Infektes wurde klinisch gestellt. Vorwiegend waren grampositive Erreger an der Auslösung des Infektes beteiligt. In der Hälfte der untersuchten Fälle ließ sich kein Erreger durch Wundabstriche aus dem Implantatlager isolieren. Auch die laborchemischen Entzündungsparameter wiesen keine Korrelation zum Ausmaß des Infektes oder zur Erregerart auf. Entscheidender prognostischer Faktor war eine rasche operative Intervention innerhalb von drei Tagen nach klinischem Auftreten der Entzündung. Dies galt auch für hämatogene Spätinfekte. Als negative Indikatoren konnten ablative Verfahren mit schlechter Weichteildeckung des Implantates, strahlentherapeutische Behandlungen, Nikotinabusus und Infektionen mit Staph. aureus identifiziert werden. Beim initialen Versagen der Behandlung erwies sich eine erneute Durchführung der Spül- Saug-Therapie als mit hohem Prozentsatz erfolgreich. Ein ausgeheilter Implantatlagerinfekt in der Vorgeschichte sowie ein vorausgegangener Implantatwechsel aufgrund von Narbenkorrekturen oder Tumorrezidiv wirkten sich nicht nachteilig auf die Heilungsrate aus. Auch exponierte Implantate konnten nach entsprechender Defektdeckung mit gutem Ergebnis behandelt werden. Die Ausbildung einer Kapselfibrose Baker III und IV nach unserem standardisierten Therapiemodus entspricht der in der Literatur angegebenen Fibroserate bei blandem Verlauf eines Brustaufbaus mit Silikonimplantaten. Die Erregerart, Staph. aureus bzw. epidermidis spielte dabei eine große Rolle. Bei Behandlung von Spätinfekten oder bei erforderlicher Wiederholung der Spül-Saug- Therapie fand sich in unserer Studie keine erhöhte Kapselfibrosebildung. Die standardisierte Therapie der Implantatlagerinfekte bewies in der vorliegenden Studie ihre Wirksamkeit und Zuverlässigkeit. Bei 89,2% der behandelten Patientinnen konnte das ursprüngliche Rekonstruktionsergebnis der Brust durch operative Entfernung der infizierten fibrösen Kapsel, Implantatwechsel und topische antibiotische Spülung über fünf Tage erhalten werden. Das frühere therapeutische Konzept mit einer Entfernung des Implantates und einer sekundärer Wiedereinbringung nach einem mehrmonatigen Intervall ergibt laut Literaturresearche vergleichbare Ergebnisse. Bei geringer physischer und psychischer Belastung für die Patientinnen kann dieses neue Verfahren als Therapie der Wahl empfohlen werden.
Channelrhodopsine sind blaulichtsensitive, Retinal-bindende Proteine aus der Grünalge Chlamydomonas reinhardtii. Channelrhodopsin 2 (ChR2) wurde als heptahelikaler, kationenselektiver Ionenkanal charakterisiert (Nagel et al., 2003). Wie die zur selben Proteinfamilie gehörende Protonenpumpe Bakteriorhodopsin (bR) wird ChR2 durch Licht aktiviert; allerdings wird hierbei ein passiver Strom ausgelöst, bei dem Kationen entsprechend ihres elektrochemischen Gradienten fließen. Aufgrund dieser Eigenschaft eignet sich ChR2 zur lichtinduzierten Depolarisation von Zellen und zur Auslösung von Aktionspotentialen in Neuronen, über deren Membran ein Konzentrationsgradient von Kationen anliegt (Boyden et al., 2005). Die Stimulation elektrischer Aktivität von ChR2-exprimierenden Neuronen im Hirngewebe von Mäusen, die ChR2 transgen exprimieren, kann beispielsweise genutzt werden, um die Konnektivität von Neuronen und Hirnbereichen zu untersuchen (z.B. Wang et al., 2007). Für diese und weitere Anwendungen war es interessant, ChR2 zelltyp- oder regionenspezifisch in Mäusen zu exprimieren. Zu diesem Zweck sollte ChR2/eGFP bicistronisch oder ChR2-YFP als Fusionsprotein unter einem ubiquitären Promotor exprimiert werden; die Expression sollte aber durch ein Stop-Element unterbunden werden, das von loxP-sites flankiert ist (unaktiviertes Transgen). Das Enzym Cre- Rekombinase entfernt durch Rekombination das Stop-Element an diesen Erkennungssequenzen, wodurch die ChR2-Expression ermöglicht werden sollte (aktiviertes Transgen). Die Cre-Rekombinase kann dabei sowohl viral als auch transgen unter zelltyp- und regionenspezifischen Promotoren exprimiert werden und damit die regionale Spezifität und den Zeitpunkt der ChR2-Expression bestimmen. Es wurden drei Mauslinien über Pronukleus-Injektionen erhalten, die den Reporter β-Galactosidase des unaktivierten Transgens exprimierten. Die Verpaarung von Mäusen dieser Linien mit Cre-Rekombinase-exprimierenden Mauslinien führte aber nur zu einer ineffizienten Aktivierung des Transgens, so dass ChR2-Expression einzig mittels RT-PCR nachgewiesen werden konnte. Nach viraler Expression der Cre-Rekombinase im Hippokampus konnte eine Aktivierung des ChR2-Transgens auch mittels Immunfluoreszenz gezeigt werden. Mangels GFP-Fluoreszenz waren die transgenen Linien aber nicht für gezielte elektrophysiologische Ableitungen verwendbar. In einem zweiten Ansatz wurden transgene Mäuse über embryonale Stammzellen (ES-Zellen) generiert. Bei diesem Ansatz wird eine geringere Kopienzahl des Transgens ins Genom integriert. In den ES-Zellen konnte durch transiente Cre-Rekombinase-Expression gezeigt werden, dass das Transgen effizient aktiviert werden konnte. Aus mehreren ES-Zell-Klonen wurden chimäre Mäuse erhalten, die zum jetzigen Zeitpunkt auf Keimbahntransmission getestet werden. Wie ChR2 einen Kationenkanal bildet und welche Transmembrandomänen und Aminosäuren daran beteiligt sind, ist unbekannt. Daher wurde im zweiten Teil dieser Arbeit untersucht, ob die Positionen E90, E97 und E101, welche in der zweiten Transmembranhelix untereinander zu liegen scheinen, Teil einer Ionenpore sein könnten. Um den Einfluss dieser Aminosäuren auf die Kationenleitung und/ oder – selektivität zu untersuchen, wurden diese Positionen substituiert und die resultierenden ChR2-Mutantenproteine in Xenopus laevis Oozyten exprimiert und elektrophysiologisch analysiert. Um Na+- bzw. Protonen-mediierte Ströme unterscheiden zu können, wurden Na+-haltige und Na+-freie Puffer verschiedener pH-Werte verwendet. Lichtinduzierte Ströme von ChR2E97A, ChR2E97Q, ChR2E97K und ChR2E101K waren im Vergleich zum Wildtyp stark reduziert, ausschließlich bei pH 4 zu detektieren und wohl hauptsächlich durch Protonen getragen. Die isofunktionale, aber ladungsneutrale Mutation ChR2E90Q zeigte nur geringe Unterschiede zum Wildtyp. Alaninsubstitution (E90A) als auch Ladungsinversion (E90K) führte zu starken Veränderungen des ChR2-Stroms im Vergleich zum Wildtyp. ChR2E90A zeigte im Vergleich zum Wildtyp reduzierte Protonenströme sowie einen erhöhten Natriumstrom, der durch Protonen inhibierbar war. Die Ladungsinversion ChR2E90K führte zu allgemein stark verminderten Leitfähigkeiten, lediglich bei pH 4 konnten noch Ströme gemessen werden. Die Ergebnisse sind der erste Hinweis auf eine Beteiligung von Glutamatresten an der Ionenleitfähigkeit in der Transmembranhelix 2 von ChR2.
Innerhalb des adaptiven Immunsystems spielt der Major Histocompatibility Complex (MHC)-Klasse I-Weg der Antigenpräsentation eine essenzielle Rolle bei der Erkennung und Zerstörung Virus-infizierter Zellen. Ein grundlegender Schritt innerhalb dieses Prozesses ist die Translokation endogener Peptide durch den transporter associated with antigen processing (TAP) in das ER-Lumen. Der TAP-Transporter ist zusammen mit verschiedenen Chaperonen und weiteren Faktoren in einem Peptidbeladungskomplex (PLC) assoziiert. Insbesondere Herpesviren, die durch eine lebenslange Persistenz im Wirt und wiederkehrende Reaktivierung unter Stresssituationen gekennzeichnet sind, interferieren direkt mit dem PLC und dem TAP-Transporter. Das varicellovirale Typ-I-Membranprotein UL49.5 inhibiert den TAP-Komplex, wobei das Protein des Rinderherpesvirus (Bovines Herpesvirus 1, BHV-1) zusätzlich die proteasomale Degradation verschiedener Komponenten des PLCs einleitet. Dieser Mechanismus wird durch die C-terminale Domäne des UL49.5-Proteins vermittelt und ist von keinem anderen Virusprotein bekannt. Welche Aminosäuren des Virusproteins jedoch für diese Inhibition und Degradation essenziell sind, wurde bisher nicht aufgeklärt. Ziel der vorliegenden Doktorarbeit war es, die Funktionsweise des BHV-1 UL49.5-Proteins zu verstehen und insbesondere zu analysieren, welche Bereiche des Proteins für die proteasomale Degradation des TAP-Komplexes verantwortlich sind. Das UL49.5-Protein wurde im Rahmen der vorliegenden Arbeit erfolgreich in Insektenzellen und in HeLa-Zellen exprimiert. Mittels Coimmunpräzipitation (Co-IP) wurde daraufhin die Bindung verschiedener UL49.5-Varianten an den TAP-Komplex analysiert. Unterstützt wurden diese Daten durch einen in vivo Interaktionsscreen (BiFC) und in vitro translatiertes UL49.5. Hierbei stellte sich heraus, dass das UL49.5-Protein in Abwesenheit sämtlicher Komponenten des Immunsystems an beide Untereinheiten des TAP-Transporters bindet. Die Bindung erfolgt sowohl an vollständige TAP-Untereinheiten als auch an den sogenannten coreTAP-Komplex, der nur die inneren sechs Transmembranhelices besitzt. Weiterhin wurden systematisch verkürzte UL49.5-Varianten generiert, um wichtige Reste für TAP-Inhibition und proteasomale Degradation zu identifizieren. Interessanterweise sind weder die N-terminale noch die C-terminale Domäne von UL49.5 für die Bindung an den TAP-Komplex zwingend notwendig. Die Bindung an den TAP-Transporter wird demnach über die Transmembrandomäne von UL49.5 vermittelt. Mit Hilfe von Peptidtransport-Analysen wurde die inhibitorische Aktivität verschiedener UL49.5-Mutanten eingehend untersucht. Zusätzlich wurde eine Untersuchung der MHC I-Oberflächenexpression in transient transfizierten HeLa-Zellen etabliert. In diesen Zellen wurde nach Sortierung eine drastisch reduzierte TAP-Konzentration nachgewiesen, die auf proteasomale Degradation des TAP-Komplexes zurückzuführen war. Die Untersuchung von C-terminal verkürzten UL49.5-Mutanten zeigte, dass die letzten zwei C-terminalen Aminosäuren essenziell für die Induktion der TAP-Degradation sind. Die C-terminale Domäne von UL49.5 konnte jedoch, nach Übertragung auf andere Proteine, keine proteasomale Degradation des TAP-Komplexes einleiten. Demnach ist ein weiterer Bereich des Proteins für diesen Prozess zwingend notwendig. Erstaunlicherweise waren auch N-terminal verkürzte UL49.5-Proteine deutlich in ihrer inhibitorischen Funktion beeinträchtigt. Bereits nach der Deletion von 10 N-terminalen Aminosäuren war das Protein nicht mehr in der Lage, eine proteasomale Degradation des TAP-Komplexes einzuleiten. Demnach spielt auch die ER-luminale Domäne von UL49.5 eine wichtige Rolle bei der UL49.5-induzierten TAP-Degradation. Somit wurde ein bisher noch nicht beschriebener neuartiger Inhibitionsmechanismus für das BHV-1 UL49.5-Protein entdeckt. Nach Bindung von UL49.5 über die Transmembrandomäne an beide Untereinheiten des TAP-Transporters scheint die ER-luminale Domäne von UL49.5 ein Signal über die ER-Membran an die zytoplasmatische Domäne zu übertragen, die dann die proteasomale Degradation des TAP-Komplexes einleitet. Es konnte im Rahmen dieser Doktorarbeit erstmals gezeigt werden, dass additive Effekte eines sehr kleinen Virusproteins auf zwei unterschiedlichen Seiten der ER-Membran zu einer proteasomalen Degradation eines sehr großen Membran-Komplexes führen.
Ein zentrales Ergebnis dieser Studie war, dass viele Patienten ein hohes Maß an Lebens-qualität zeigten. Verglichen mit anderen hämatologisch-onkologischen Kollektiven lag die Lebensqualität der Patienten dieser Studie deutlich näher bei den Werten der gesunden Normalbevölkerung. Als signifikant negative Einflussfaktoren auf die verschiedenen Dimensionen der Lebensqualität zeigte sich die allogene Stammzelltransplantation und ein Alter > 55 Jahren. Stammzelltransplantierte und ältere Patienten waren nicht nur häufiger durch Begleiterkrankungen belastet, sondern auch signifikant stärker in ihrer körperlichen und Rollen-Funktion eingeschränkt. In beiden Gruppen fanden sich zudem eine signifikant stärkere Fatigue-Ausprägung und größere finanzielle Schwierigkeiten. Während die globale Lebensqualität älterer Patienten signifikant schlechter war, hatte die Stammzelltransplantation interessanterweise keinen negativen Einfluss auf die Lebensqualität. Die Lebensqualität von SZT-Patienten korreliert also anscheinend nicht zwingend mit einem schlechteren Gesundheitszustand. Der individuelle Umgang mit der Erkrankung (Coping), sowie neue Sinn- und Wertevorstellungen scheinen somit unabhängig vom Gesundheitszustand eine zentrale Rolle in der Bewertung der eigenen Lebensqualität zu spielen. Dies zeigte sich auch im gesamten Kollektiv, z.B. bei in Freitextkommentaren der Patienten. Die Erfahrung der potenziell tödlichen Erkrankung schien für viele Patienten den Blick auf die Gegenwart verändert zu haben (intensiveres Leben, kleine Ziele, stärkere Wahrnehmung von Glück, Erkennen von wichtig und unwichtig). Sehr viele Patienten waren der Meinung, dass das Verhältnis zu Freunden und Familie durch die Erkrankung an Bedeutung gewonnen habe. Als negativ wurde überwiegend die verminderte körperliche und vor allem geistige Leistungsfähigkeit genannt. Einige körperliche Einschränkungen wurden mit Spätfolgen der Leukämieerkrankung bzw. –therapie in Verbindung gebracht (z. B. Gelenknekrosen, Haarausfall). Andere Erkrankungen, wie z.B. Hypertonus, Diabetes und kardiopulmonale Erkrankungen konnten dagegen nicht im Zusammenhang mit der Erkrankung gebracht werden und waren - verglichen mit der Normalbevölkerung - auch nicht häufiger. Bei rund der Hälfte aller Patienten mit Kinderwunsch konnte dieser auch erfüllt werden. Allerdings galt dies nur für Patienten nach Chemotherapie. Patienten nach allogener Stammzelltransplantation waren nahezu alle infertil. Insgesamt zeigten die meisten Patienten trotz oft Schwerbehinderung ein hohes Maß an beruflicher Reintegration. Ein dauerhaft hoher Grad an Behinderung (> 50%) ging jedoch deutlich häufiger mit Arbeitslosigkeit oder (Früh-)Berentungen einher. Ein wichtiges Ziel für die Zukunft ist die systematische, prospektive Erfassung von Lebensqualität und medizinischen Spätfolgen bei Patienten mit akuter lymphatischer Leukämie im Rahmen der GMALL-Studien. Neben der Lebensqualität soll auch ein systematisches Nachsorgeprogramm - analog den bereits existierenden Programmen für Kinder (z. B. LESS ) entwickelt werden. Dabei sollte besonders die Gruppe der älteren Patienten > 55 Jahren, und die allogen stammzelltransplantierten Patienten berücksichtigt werden. Für prospektive Untersuchungen ist zudem eine gezielte Untersuchung der Fatigue-Symptomatik geplant. Für prospektive Studien ist es essenziell, die erhobenen Daten - insbesondere während der Therapie - zeitnah auszuwerten. So kann ein Verlauf erfasst werden und es besteht die Möglichkeit, bereits während Therapie Hilfsangebote - z. B. psychosoziale Unterstützung - anzubieten. Ebenso können die Daten zur Lebensqualität genutzt werden, um in Therapieentscheidungen - z. B. vor Transplantation - miteinbezogen zu werden. Patienten kann zudem ein realistischer Ausblick auf das Leben nach der Therapie gegeben werden.