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Ziel der Arbeit war die Analyse von langen eukaryotischen Signalpeptiden, mit einer Länge von mindestens 40 Aminosäuren, und ihre Diskriminierung zu kurzen SP. Signalpeptide sind notwendig, um die im Cytosol translatierten Proteine zum Ort ihrer Funktion zu dirigieren. Sie spielen dadurch eine fundamentale Rolle bei der Entwicklung von Zellen. Signalpeptide weisen keine Sequenzhomologie, aber einen typischen, in drei Regionen gegliederten Aufbau (n-, h-, c-Region) auf. In den letzten Jahren wurden zunehmend Beispiele von Signalpeptiden gefunden, die neben dem Targeting zum endoplasmatischen Retikulum weitere Post-Targeting-Funktionen aufweisen. Auffällig ist hier die besondere Länge der Signalpeptide. Für die Analyse dieser langen Signalpeptide standen bis jetzt keine gezielt entwickelten Vorhersageprogramme zur Verfügung. Im Rahmen dieser Arbeit wurde diese Gruppe langer Signalpeptide untersucht und ein Modell zu deren interner Organisation entwickelt. Das entwickelte „NtraC“-Modell erweitert etablierte sequenzbasierte Ansätze für kurze SP um eine Sekundärstruktur-motivierte Perspektive für lange Sinalpeptide. Zuerst wird dabei ein Übergangsbereich (transition area, N„tra“C), der potentiell β-Turn bildende Aminosäuren enthält, identifiziert. Dieser dient im Modell zur Zerlegung des SP in zwei hinsichtlich ihrer Funktion unabhängige Domänen: eine N-terminale N-Domäne (‚N’traC) und eine C-terminale C-Domäne (Ntra‚C’). Diese mit bekannten Vorhersageprogrammen nicht identifizierbaren „kryptischen“ Domänen innerhalb der Signalpeptid-Sequenz können unterschiedliche Targeting-Kapazitäten aufweisen und entsprechen für sich genommen eigenständigen Protein-Targeting-Signalen. Im Fall einer ER-Targeting Kapazität z.B. weist eine Domäne für sich genommen eine n-, h-, und c-Region auf. 63% aller Vertebrata-Signalpeptide entsprechen der in dieser Arbeit vorgeschlagenen NtraC-Organisation. Eine basierend auf dem NtraC-Modell vorgeschlagene Architektur für die langen Signalpeptide von shrew-1 (43 Aminosäuren), DCBD2 (66 Aminosäuren) und RGMA (47 Aminosäuren) wurde vom Autor selbst in vitro überprüft. Für alle drei Proteine wurden eine N-Domäne mit mitochondrialer Targeting-Funktion und eine C-Domäne mit Signalpeptid-Funktion vorhergesagt. Die langen Signalpeptide der Proteine wurden bisher als reine ER-Targeting-Signale betrachtet. Die vorliegende Studie zeigt jedoch, dass in diesen langen Signalpeptiden multiple Targetingsignale kodiert sind. Die ER-Targeting-Kapazität der C-Domänen wurde durch SEAP-Assays überprüft, die mTP-Funktion der N-Domäne durch biochemische Aufreinigung von Mitochondrien. Die in silico-Vorhersagen konnten in vollem Umfang für alle drei Proteine in vitro bestätigt werden. Eine Untersuchung der semantischen Wolke aller Proteine mit NtraC-organisiertem Signalpeptid zeigte, dass eine NtraC-Organisation in mehr als 50% der Fälle im Zusammenhang mit Typ-I Transmembranproteinen auftritt. Auch die Proteine der hier experimentell untersuchten Signalpeptide von shrew-1, DCBD2, RGMA sind Typ-I Transmembranproteine. Des Weiteren weisen 15% aller langen Vertebrata-Signalpeptide eine Domänen-Kombination analog zu shrew-1, DCBD2 und RGMA auf. Der gefundene analoge Aufbau der langen Signalpeptide könnte somit funktionelle Gruppen von Proteinen zusammenführen, die bisher anderweitig nicht gruppiert werden konnten. Es konnte weiterhin gezeigt werden, dass bakterielle Autotransporter Gram-negativer Bakterien in Variation ebenfalls eine NtraC-Organisation in ihren Signalpeptiden aufweisen. Gleiches konnte für Gruppen langer viraler Signalpeptide gezeigt werden. Das NtraC-Modell ist somit nicht auf Vertebrata-Signalpeptide beschränkt. In der vorliegenden Arbeit wurde ein Modell zur Domänen-Architektur langer Signalpeptide entwickelt und erfolgreich angewendet: das NtraC-Modell. Ein Vorhersage-Algorithmus zur in silico-Untersuchung langer Signalpeptide wurde implementiert und in einer webbasierten Benutzeroberfläche öffentlich zugänglich gemacht. Das Modell trifft auf 63% der annotierten langen Vertebrata-Signalpeptide zu. Des Weiteren wurden, basierend auf dem NtraC-Modell, für die langen Signalpeptide von drei Proteinen (shrew-1, DCBD2, RGMA) in vitro-Versuche durchgeführt. Die erhaltenen in vitro-Ergebnisse unterstützen klar die These, dass lange Signalpeptide eine aus definierten Domänen bestehende Organisation aufweisen können.
This thesis deals with the analysis of “presolar” silicates and oxides by high resolution mass spectrometry and electron microscopy techniques. This “stardust” was identified by its extreme oxygen isotopic anomalies, which point to nucleosynthetic reactions in stellar interiors, in the carbonaceous chondrite Acfer 094. Isotopic, chemical and mineralogical studies on these stardust grains therefore allow the testing of astrophysical questions on Earth, which are otherwise only accessible by spectroscopy and theoretical models. The class of presolar silicates has been identified only six years ago in 2002, although it was known already from spectroscopic observations that silicates represent the most abundant type of dust in the galaxy. The development of the “NanoSIMS” was a crucial step in this respect, because this ion probe with its superior spatial resolution of only 50 nm allowed the detection of the typically 300 nm sized presolar silicates. A total of 142 presolar silicates and 20 presolar oxides were identified within Acfer 094, whose matrix therefore contains 163 ± 14 ppm presolar silicates and 26 ± 6 ppm presolar oxides. This is among the highest amounts reported so far for any primitive solar system material. The majority of detected stardust grains derive from asymptotic giant branch stars of 1 – 2.5 Msun and close-to-solar or slightly lower-than-solar metallicity. However, by measuring the Si isotopic compositions of some enigmatic grains, it could be shown that there is a sub-class of presolar silicates characterized by an extreme enrichment of 17O and a moderate enhancement of 30Si relative to solar, whose origins might be explained by formation in binary stellar systems. About 10% of all grains exhibit an enrichment in 18O and some of them also of 28Si relative to solar, which most likely point to an origin in type II supernova explosions. The Si isotopic measurements also allowed to quantify the effect of the s-process on the Si isotopes in low-mass asymptotic giant branch stars. The results agree well with theoretical predictions. The grains were furthermore characterized by SEM and the chemistries of about half of the grains were determined by Auger electron spectroscopy. The majority of grain morphologies are consistent with what is expected from condensation experiments. However, a lot of grains are altered by Fe-rich minerals, which are either of primary condensation or of secondary ISM or solar nebula origin. Furthermore, complex presolar grains consisting of refractory Al-rich grains attached to silicate material could be identified, which have been predicted by condensation theory and observational evidence. Nine presolar silicates were analyzed by combined NanoSIMS/TEM studies. The majority of grains are Mg-rich and amorphous, which is in contrast to astrophysical evidence, which mainly postulate crystalline Mg-rich and amorphous Fe-rich circumstellar condensates. However, the grains might have been rendered amorphous by secondary processes in the ISM or could have condensed under non-equilibrium, low-temperature conditions in the circumstellar outflow. The grains are more likely characterized by a variable, pyroxene-like chemistry, which could be a result of sputtering in the ISM, which preferentially removes Mg. The detected crystalline presolar silicates in this study and in other work are all olivines, whereas grains with a pyroxene stoichiometry are all amorphous except one. This supports astrophysical models which point to different formation pathways for these two types of grains and therefore different crystallinity. However, the relatively high Fe content of three detected presolar olivines in this study and in other work is in contrast to astrophysical evidence and theoretical considerations, which predict essentially Fe-free crystalline grains. It is therefore possible that the infrared spectra might also be compatible with less Mg-rich olivines. The only crystalline presolar silicate with a pyroxene-like stoichiometry is the unusual grain 1_07: although it is chemically enstatite, the electron diffraction pattern could only be indexed to silicate perovskite, which is stable above ~23 GPa. The discovery of a high-pressure phase of presolar origin shows that dust grains encountering interstellar shocks might not necessarily be completely destroyed. In astrophysical models it is in principle also possible that a fraction of larger grains might survive such a shock wave encounter as a high-pressure modification, which is supported by this discovery.
Der zur Familie der ionotropen Glutamatrezeptoren gehörende N-Methyl-DAspartat (NMDA)-Rezeptor ist maßgeblich an der Weiterleitung erregender Signale zwischen Nervenzellen beteiligt. Er spielt sowohl physiologisch bei z.B. Vorgängen des Lernens oder der Gedächtnisbildung, als auch pathophysiologisch bei neurologischen Erkrankungen eine entscheidende Rolle. NMDA-Rezeptoren sind tetramere Membranproteine, welche aus den homologen NR1-, NR2A-NR2D- sowie NR3A- und NR3B-Untereinheiten aufgebaut sind. Die Untereinheiten sind modular aus jeweils vier verschiedenen Domänen aufgebaut, die spezifische Rollen beim Aufbau und der Funktion der Rezeptoren erfüllen. Konventionelle NR1/NR2-NMDA-Rezeptoren bestehen aus zwei Glyzin-bindenden NR1- und zwei Glutamat-bindenden NR2-Untereinheiten. Sie werden nur durch gleichzeitiges Binden der Agonisten Glutamat und Glyzin effizient aktiviert. Ziel der vorliegenden Arbeit war, den Einfluss der extrazellulären N-terminalen Domänen (NTDs) auf die Assemblierung, Funktion und allosterische Modulation von rekombinanten NR1/NR2 NMDA-Rezeptoren mittels biochemischer und elektrophysiologischer Methoden zu untersuchen. Deletionsexperimente zeigten, dass die NTDs von NR1- und NR2A- bzw. NR2B-Untereinheiten die hochaffine, allosterische Zn2+- und Ifenprodil-Hemmung bestimmen, nicht aber für die Bildung funktioneller Rezeptoren von Bedeutung sind. Die NR2-NTDs stellen zusätzlich eine entscheidende strukturelle Determinate für die unterschiedliche Glyzinaffinität von NR1/NR2A- und NR1/NR2B-Rezeptoren dar. Ein zweiter Aspekt war die funktionelle Charakterisierung von NMDA-Rezeptoren, welche aus NR1- und NR3-Untereinheiten aufgebaut sind. Diese exzitatorischen NR1/NR3-Rezeptoren werden ausschließlich durch den Neurotransmitter Glyzin aktiviert und generieren nur sehr kleine Agonistaktivierte Ströme im Vergleich zu NMDA-Rezeptoren vom NR1/NR2-Typ. Es wurde gefunden, dass die Glyzinbindung an die NR1- und NR3-Ligandenbindungsdomänen (LBDs) entgegengesetzte Wirkungen auf die Rezeptorfunktion zur Folge hat. Während die NR3-LBD essentiell für die Aktivierung des Rezeptors ist, bewirkt Glyzin über die NR1-LBD eine Hemmung der NR1/NR3-Rezeptoren. Das erklärt die geringe Effizienz der Rezeptoraktivierung durch Glyzin. Weiterhin zeigen die Ergebnisse zum ersten Mal, dass Zn2+ an diesen Rezeptoren als Agonist und positiver Modulator wirkt und in Kombination mit einem NR1-Antagonisten die Glyzin-aktivierten Ströme >120-fach in supralinearer Weise potenzieren kann. Mutationsanalysen ergaben, dass die NR1-LBD für die Zn2+-Aktivierung und –Potenzierung verantwortlich ist. Da die physiologische Rolle von NR1/NR3-Rezeptoren noch nicht eindeutig geklärt ist, könnte die supralineare Potenzierung eine Strategie darstellen, diesen unkonventionellen NMDA-Rezeptor in zukünftigen Untersuchungen besser zu detektieren und zu charakterisieren. Zusammenfassend liefern die in dieser Arbeit gewonnenen Erkenntnisse zu Struktur-Funktionsbeziehungen in NMDA-Rezeptoren auf Ebene der NTDs und LBDs einen wichtigen Beitrag für das Verständnis der Pharmakologie dieser Rezeptorfamilie. Diese Ergebnisse können für die Entwicklung neuer neurologischer Therapeutika genutzt werden.
Diese Arbeit befasst sich mit dem Philosophen Emmanuel Levinas und dem persischen Dichter Hafis, die als genuine Denker der Situation vorgestellt werden. Levinas und Hafis folgend, versucht die Autorin aufzuweisen, dass unser Sein immer ein In-Situation-sein ist. Das "In" zeigt dabei nicht ein "Innen" im Gegensatz zu einem "Außen" an. Hingegen ist der Mensch in Situationen sowohl Innen als auch Außen. Situation ist jedoch kein bestimmter Zustand des Seins des Menschen, sondern Weise des Daseins, im wie des Seins. Dieses In-sein schließlich wird von der Autorin, und hierin folgt sie explizite Emmanuel Levinas, übersetzt als Ausgesetztheit. Ausgesetztheit als solche ist Ur-Situation, Situation der Situation und somit ein anderer Ausdruck für das Beziehungs-sein. Das Beziehungssein aber hat sein Äußerstes in der Liebe. Liebe jedoch ist nicht deshalb unbedingt, weil sie eine bloße Steigerung des Lebensgefühls bedeutete, auf die der Mensch "aus ist". Liebe ist Grunderfahrung und als solche eine Bewegung, die sich von sich her übersteigert. Liebe bewahrt die Kontinuität des Lebens als Relatio. Denn Liebe "relativiert" nicht das "Böse des Schmerzes" aufgrund des Guten der Heiligkeit. Liebe ist Ertragen im Schmerz, Aufenthalt in der Heiligkeit. So situiert sie als reine Passivität und Empfänglichkeit stets "jenseits von Gut und Böse". Die Öffnung der Liebe, d.i. der Zugang zum Anderen, vollzieht sich durch das Weibliche. Die Autorin beschreibt Weiblichkeit als Konkretisierung des Eros, der mit Levinas und Hafis als Fruchtbarkeit vorgestellt wird, die schon "jenseits" der biologischen Bedeutung Sinn "hat". Mit der Explikation der von der Autorin entwickelten Figur "Schleier der Weiblichkeit" wird schließlich versucht, über die Referenzen Levinas und Hafis noch hinauszugehen. Im Schleier "symbolisiert" sich die Macht der Weiblichkeit, die zugleich "Passivität" und "Zärtlichkeit" ist. Der Schleier ist Ausdruck einer Weiblichkeit, die das Geheimnis des Seins als das Geheimnis des Antlitzes infiniert.
The present study was elaborated within the scope of the INTAFERE (Integrated Analysis of Mobile Organic Foreign Substances in Rivers) project which investigates the occurrence of xenobiotics in small freshwater streams with particular consideration of social impact factors. The aim of this study is to investigate the seasonal and spatial variance of organic micropollutants in small fresh water streams and to identify possible sources and sinks. Therefore four small freshwater river systems in Hesse, Germany, have been investigated with respect to common organic pollutants such as: the organophosphates tri-n-butyl phosphate (TBP), tris(2-butoxyethyl)phosphate (TBEP), tris(2-chloroethyl)phosphate (TCEP), tris(1-chloro-2-propyl)phosphate (TCPP), and tris(1,3-dichloro-2-propyl)phosphate (TDCPP), the synthetic musk fragrances 1,3,4,6,7,8-hexahydro-4,6,6,7,8,8-hexa-methylcyclopenta-[g]-2-benzopyran (HHCB) and 7-acetyl-1,1,3,4,4,6-hexamethyl-1,2,3,4-tetrahydronaphthalene (AHTN), the endocrine disruptors bisphenol A (BPA), 4-tert-octylphenol (OP) and the technical isomer mixture of 4-nonylphenol (NP), the herbicide terbutryn [2-(t-butylamino)-4-(ethylamino)-6-(methylthio)-s-triazine] as well as the insect repellent N,N-diethyl-m-toluamide (DEET). Water samples were collected in the time span from September 2003 to September 2006 at 26 sampling locations. The samples were extracted with solid phase extraction (SPE) and analyzed by coupled gas chromatography-mass spectrometry (GC-MS). For quantification the internal standard method was used. The results of the study showed an ubiquitous occurrence of organic pollutants in the fresh water streams of the study area. The organophosphates have been detected in 90 % of the water samples with mean concentrations of 502 ng/l (TCPP), 276 ng/l (TBP), 183 ng/l (TBEP), 118 ng/l (TCEP) and 117 ng/l (TDCPP). Sewage treatment plant (STP) effluents were identified as the dominating source for the chlorinated organophosphates as well as for the synthetic musk fragrances and the insect repellent DEET in the river systems. Consequently the highest concentrations were observed in the Schwarzbach system characterized by the highest proportion of waste water compared to the other river systems. Mean concentration levels of the synthetic musk fragrances HHCB and ATHN were 141 ng/l and 46 ng/l, respectively and 124 ng/l in case of DEET. The synthetic musk fragrances showed a clear seasonal trend with significantly lower concentrations in summer times compared to winter times, which is ascribed to stronger photodegradation and volatization during summer times. In contrast, mean DEET concentrations and loads were significantly higher in summer than in autumn, winter and spring, in parallel with the main insect season. The concentrations of the endocrine disruptors BPA, NP and OP in the river water samples ranged from <20 ng/l to 1927 ng/l, <10 ng/l to 770 ng/l, and <10 ng/l to 420 ng/l, respectively. Whereas OP was present in about 2/3 of the samples, NP and BPA could only be detected in 56% and 13% of the water samples, respectively. BPA levels exceeded in two samples the predicted no-effect concentration (PNEC) for water organisms. In case of NP, highest concentrations and loads were found in September 2003 and decreased significantly since then. In contrast, concentrations and loads of OP which serves in a similar application field remained nearly constant during the sampling period. The decrease of NP can be attributed to the implementation of the European Directive 2003/53/EG, which restricts the use of nonylphenols and nonylphenol ethoxylates since January 2005. However, at the end of the sampling period in September 2006, NP could still be detected at mean concentrations of 18 ng/l in the river waters of the sampling area. Furthermore, absence of NP in several samples from associated STP effluents indicate that the STPs cannot be the only sources for NP found in the river water. The herbicide terbutryn was present in the rivers during the whole sampling period from September 2003 to September 2006 despite a ban on its use as a herbicide from January 2004 on. Terbutryn levels ranged from < 4 ng/l to 5600 ng/l, showing a clear spatial pattern with high terbutryn concentrations in the Weschnitz and Modau river systems and significantly lower terbutryn levels in Schwarzbach and Winkelbach. Results from the analysis of two STP effluents discharging into the Weschnitz and the Modau, respectively, indicate that terbutryn enters the rivers from this source. Furthermore, terbutryn concentrations and loads showed a clear seasonal trend with significantly higher levels in summer and autumn. Obviously, the ban on agricultural use of terbutryn at the end of 2003 had no discernable influence on terbutryn concentration in the rivers because there was no trend of decreasing.
Der Extrakt des indischen Weihrauchs (Boswellia serrata) ist eines der wenigen pflanzlichen Heilmittel, dem von der EMEA der Orphan Drug Status zur Behandlung des peritumoralen Hirnödems verliehen wurde. Boswellia serrata Extrakt und die Boswelliasäuren, die wirksamen Inhaltsstoffe des Weihrauchs, zeigten in zahlreichen in vitro-Untersuchungen antiinflammatorische und antitumorale Wirksamkeit. Diese Wirkungen konnten auch in mehreren klinischen Studien nachgewiesen werden. Untersuchungen zum pharmakokinetischen Verhalten der Boswelliasäuren zeigten, dass Weihrauch nur eine geringe orale Bioverfügbarkeit aufweist. Ziel der Arbeit war es daher, den Einfluss von Löslichkeit, Metabolismus und Permeabilität auf die Bioverfügbarkeit der Boswelliasäuren zu untersuchen. Weihrauchextrakte sind in wässrigen Medien schlecht löslich. In einer Rattenstudie wurde deshalb untersucht, inwieweit die verbesserte Löslichkeit des Extrakts in einer nanoskaligen Boswellia serrata Formulierung zu einer verbesserten Bioverfügbarkeit führt. Eine bestehende LC-MS-Methode zur Bestimmung von KBA und AKBA aus Plasma und Hirngewebe wurde optimiert und revalidiert. Zur Vervollständigung des pharmakokinetischen Profils wurden die KBA- und AKBA-Konzentrationen auch in der Leber der Ratten bestimmt. Die analytische Methode wurde hierfür nach den anerkannten FDA-Richtlinien erfolgreich validiert. Die Plasma- und Leberkonzentrationen waren jedoch bei den Ratten, die die nanoskalige Boswellia serrata Formulierung bekamen, in den ersten Stunden nach der oralen Verabreichung nicht signifikant höher als bei den Ratten, die den unbehandelten Extrakt erhielten. Die in dieser Arbeit durchgeführten Untersuchungen zur metabolischen Stabilität von KBA und AKBA in Rattenlebermikrosomen (RLM), Humanlebermikrosomen (HLM) und Rattenhepatozyten (RH) zeigten, dass KBA einer stark ausgeprägten hepatischen Metabolisierung unterliegt. AKBA hingegen erscheint metabolisch relativ stabil. Die Identifizierung der Metabolite ergab, dass Boswelliasäuren in RLM hauptsächlich Phase-I-Metabolite wie mono-, di-, und seltener auch trihydroxylierte Metabolite bilden. Von AaBA und AbBA konnten keine Metabolite detektiert werden. Das metabolische Profil von KBA und AKBA in RH war mit dem in RLM vergleichbar. In einer Rattenstudie konnten dann im Plasma und in der Leber jedoch nicht im Hirn der Ratten KBA-Metabolite nachgewiesen werden, während für AKBA in vivo keine Metabolite detektiert wurden. Phase-II-Metabolite konnten weder von KBA noch von AKBA nachgewiesen werden. Bisher war man davon ausgegangen, dass die niedrigen Plasmakonzentrationen von AKBA in vivo durch eine Deacetylierung zu KBA zustande kommen. Diese These konnte im Rahmen dieser Arbeit widerlegt werden. Im Caco-2-Zellmodell zeigte KBA eine mittlere Permeabilität. Es konnte gezeigt werden, dass KBA und AKBA offensichtlich keinem Efflux-Transport unterliegen. AKBA erwies sich sowohl in absorptiver und sekretorischer Richtung als auch bei 4° C als schlecht permeabel. Da KBA und AKBA die Aktivität des ABC-Transportproteins Pgp modulieren, wurde in dieser Arbeit überprüft, ob diese beiden Boswelliasäuren auch Substrate des Pgp sind. Die Permeation von KBA und AKBA war in Anwesenheit des Pgp-Inhibitors Verapamil jedoch nicht signifikant verändert, was darauf hindeutet, dass KBA und AKBA keine Pgp-Substrate sind. Die Ergebnisse dieser Arbeit bilden einen wichtigen Baustein zur weiteren Aufklärung des pharmakokinetischen Verhaltens von KBA und AKBA. So ist die begrenzte systemische Verfügbarkeit von KBA auf eine mittlere Absorption aus dem Gastrointestinaltrakt in Kombination mit der umfangreichen hepatischen Metabolisierung zurückzuführen. Die niedrigen systemischen Konzentrationen von AKBA hingegen liegen eher in der schlechten Absorption begründet. Auf der Basis der extensiven Metabolisierung von KBA und der schlechten Permeabilität von AKBA stellt sich im Allgemeinen die Frage nach dem tatsächlichen Wirkmechanismus von KBA und AKBA. In keiner pharmakokinetischen Studie konnten die in vitro pharmakologisch aktiven Konzentrationen dieser beiden Boswelliasäuren erzielt werden. Es ist daher nicht auszuschließen, dass auch andere Wirkmechanismen als die bisher beschriebenen existieren. Unter dem Gesichtspunkt möglicher Arzneimittelinteraktionen wurde die Wirkung von KBA und AKBA auf MRP2 und OATP1B3 in zwei zellbasierten Assays untersucht. Es konnte gezeigt werden, dass KBA und AKBA die Aktivität von MRP2 und OATP1B3 in Konzentrationen modulieren, welche im Rahmen dieser Arbeit in der Leber von Ratten nachgewiesen wurden. Da Weihrauchextrakt häufig in Comedikation verwendet wird, sollte im Hinblick auf die Arzneimittelsicherheit in Zukunft geprüft werden, ob es zu praxisrelevanten Arzneimittelinteraktionen mit klinisch relevanten MRP2- und OATP1B3-Substraten kommt.
Trotz der rasanten Weiterentwicklung moderner, nichtinvasiver, bildgebender Verfahren hat die Angiographie in DSA - Technik immer noch in der heutigen Zeit einen wichtigen Stellenwert bei der Abklärung und Behandlung der stenosierenden, arteriosklerotischen Gefäßerkrankungen, obwohl sie mit dem höchsten Behandlungsrisiko behaftet ist. Neben allgemeinen Komplikationen sind insbesondere die punktions- und katheterassoziierten Komplikationen zu nennen. In der vorliegenden Arbeit wurde das Risiko der klinisch stummen Hirnembolie anhand der MRT - Diffusionsbildgebung - Techniken nach transbrachialer Angiographie in der DSA -Technik bei ambulanten Patienten untersucht. Das Ziel dabei war nachzuweisen, dass die transbrachiale Angiographie eine sichere Methode darstellt. Hierzu wurden 200 Patienten, 144 Männer und 56 Frauen, in einer prospektiven Studie eingeschlossen. Die diffusionsgewichtete MRT - Untersuchung in Echoplanartechnik erfolgte mit Diffusionswichtungsfaktoren b = 0 s/mm² und b = 1000 s/mm² im kurzen zeitlichen Abstand jeweils vor und nach der Angiographie an einem 1,5 Tesla –MR - Scanner. Die diffusionsgewichtete MRT-Aufnahme ist eine sensitive Methode, mit der eine akute zerebrale Ischämie nachgewiesen werden kann. Eine akute zerebrale Ischämie erkennt man als ein signalreiches Areal auf den diffusionsgewichteten MRT - Aufnahmen durch Verminderung des scheinbaren Diffusionskoeffizienten ADC. Diese Verminderung des ADC wird durch ein zytotoxisches Hirnödem verursacht. Um eine Fehlinterpretationen durch „T2 shine-through-Effekt“ zu vermeiden, haben wir gleichzeitig T2-gewichtete Aufnahmen und nachverarbei¬tete, diffusionsgewichtete MRT - Aufnahmen (ADC-Karte) analysiert. Die ADC-Karte zeigt grauwertkodiert den ADC an, sie ist frei von überlagerten T2-Effekten. Vor der Angiographie wurden bei drei Patienten auf den diffusionsgewichteten MRT - Aufnahmen frische und alte Diffusionsstörungen im Gehirn festgestellt. Die Diffusionsuntersuchungen nach Angiographie zeigten bei keinem Patienten neu aufgetretene Diffusionsstörungen, dies auch unter Hinzuziehung der Auswertung nicht nur der b-Faktor 1000 DWI - Aufnahmen sondern auch unter dem Hinzuziehen der ADC-Karten und der T2-gewichteten Aufnahmen. Die Rate zerebrovaskulärer Komplikationen ist minimal, sie betrug in unserem Krankengut 0 %, wobei das 95 % Konfidenzintervall für die Wahrscheinlichkeit, dass bei 200 Patienten eine postangiographische, klinisch stumme Hirnembolie auftritt, von 0 % - 1.5 % ist. Das heißt man kann mit 95 % Sicherheit sagen, dass die Inzidenz einer Hirnembolie nicht größer als 1.5 % ist. Mehrere Studien haben bewiesen, dass die diffusionsgewichteten MRT-Sequenzen das sensitivste diagnostische Verfahren zur Erkennung von ischämischen Läsionen sind. Ferner können sie den objektiven und quantitativen Nachweis für Thromboembolien assoziert mit endovaskulären Katheterunter¬suchungen und interventionen erbringen. Die im dritten Gliederungspunkt der Zielsetzung gestellten Fragen können folgendermaßen beantwortet werden: • Die Rate der apparenten zerebrovaskulären Komplikationen nach transbrachialer Angiographie ist minimal, sie betrug in unserem Krankengut 0%. • Bei keinem Patienten trat im postangiographischen zerebralen Diffusionsbild eine neue Diffusionsstörung innerhalb des 3 Stundenfensters auf. Für die Häufigkeit von klinisch stummen Hirnembolien, die mit Hilfe der Diffusionsbildgebung aufgezeigt werden können, ergibt sich daraus ein Konfidenzintervall von 0 – 1,5%. • Unsere Ergebnisse zeigen im Bezug auf die zerebrovaskuläre Komplikationsrate bei den transbrachialen diagnostischen und therapeutischen Interventionen keinen Unterschied. • Insgesamt wurde keinerlei Abhängigkeit der zerebralen Komplikationen von der Prozedur, dem verwendeten Schleusen- und Kathetersdesign, der intravasalen Katheterverweildauer oder dem Punktionsort festgestellt. • Die Rate lokaler Komplikationen nach transbrachialer Angiographie in DSA-Technik beträgt bei entsprechender Erfahrung des Untersuchers weniger als 1 %. • Die Ergebnisse unserer Arbeit zeigen, dass die Katheterdiagnostik und -intervention über die Arteria brachialis als Zugangsort eine sichere Prozedur mit geringer Komplikationsrate ist. Dieser Zugangsweg kann daher uneingeschränkt für die Praxis empfohlen werden, da sie insbesondere im Kontext ambulanter Untersuchungen vergleichbar sicher, jedoch kostengünstiger als der transfemorale Zugangsweg ist.
The development of benthic foraminiferal assemblages during the past 6,000 yrs was investigated in Holocene sediment cores from three carbonate platforms (Turneffe Islands, Lighthouse Reef, and Glovers Reef) of Belize, Central America. Foraminiferal assemblages and their diversity were determined in different time periods to identify their dependence on environmental factors, such as lagoonal age, lagoonal depth, water circulation, substrate, bottom-water temperature, and salinity. Geochemical proxies (δ18O and δ13C), obtained from the common larger foraminifer Archaias angulatus were used to estimate Holocene seasonal BW-temperatures and climate variabilities. A total of 51 samples were taken from 12 vibracores for taxonomic determination and 10 to 15 subsamples of 32 tests of Archaias angulatus were used for stable oxygen and carbon isotope analyses. Based on cluster analyses, seven benthic foraminiferal assemblages are distinguished during the Holocene. The three platforms exhibit characteristic differences in benthic foraminiferal fauna and diversity, which are controlled by their respective environments during the last 6,000 yrs. Turneffe Islands has four benthic foraminiferal assemblages, which are typical for restricted lagoons with fluctuating salinity. Lighthouse Reef is inhabited by two benthic foraminifera associations, which are characteristic of high water exchange with the surrounding ocean and clear waters. Glovers Reef is characterized by two benthic foraminiferal assemblages, which occur in deeper lagoons with slow water circulation. In general, during the Holocene, the highest mean diversity, evenness, and richness of benthic foraminifera were found in the Turneffe Islands and the lowest occurred at Glovers Reef. The foraminiferal faunas of the Lighthouse and Glovers Reefs had been in a “Diversification Stage” since 6,000 yrs, whereas the foraminiferal fauna of the Turneffe Islands reflects the development from a “Colonisation” (~4,000 yrs BP) to a “Diversification Stage” (~2,000 yrs to present time). Lagoonal depth, water circulation, substrate, and BW-temperature have higher influence on foraminiferal diversity as compared to lagoonal size and age. The negative correlation between diversity and lagoonal depth is based on differences in light intensity and substrate. In contrast to Lighthouse Reef, the Turneffe Islands and Glovers Reef show decreasing diversity of benthic foraminifera with increasing lagoon depth, due to finer sediment, turbid waters and/or dense mangrove growth, which reduce the light intensity and the number of species. Water Circulation also affected the benthic foraminifera modes of living and their diversity during the last 6,000 yrs. Increasing abundances of infaunal taxa refer to restricted circulation and/or lower oxygen conditions, as assumed for the Turneffe Islands and Glovers Reef. Increasing abundances of epifaunal foraminifera, as observed in the Lighthouse Reef indicate better circulation and/or higher oxygen conditions. Holocene BW-temperature reconstructions based on δ18O of single Archaias angulatus tests do not correspond to typical Holocene climate models of the Caribbean. In the Belize area, mean BW-temperature trends indicate local climate variations. A decrease of δ13C values during the last 1,000 yrs could be related to the “Suess Effect”. The seasonal BW-temperature variations within single large benthic foraminifera tests correspond to present-day temperature fluctuations in the lagoons, and indicate higher temperatures in Summer and Autumn and lower temperatures in Winter and Spring.
Der Cytochrom bc1 Komplex spielt in der mitochondrialen Atmungskette eine zentrale Rolle, er ist am Aufbau des Protonengradienten über die innere Mitochondrien-Membran beteiligt. Die Funktionsweise dieses integralen Membranproteinkomplexes ist trotz mehrerer gelöster Strukturen noch nicht vollständig verstanden. Im Rahmen dieser Arbeit wurde der Komplex aus P. denitrificans untersucht und dabei mehrere Beiträge zu Struktur und Funktion dieses bakteriellen Modellsystems geleistet, wie z.B. seinem Oligomerenzustand in Detergenz-gelöster Form und zur Frage der Monomer:Monomer-Interaktion. Zur Strukturaufklärung des Cytochrom bc1 Komplexes aus P. denitrificans wurde ein chimärer Komplex zur Kristallisation eingesetzt, der in der Lage ist ein, Antikörper-Fragment zu binden, das bereits mit Erfolg zur Strukturbestimmung des Hefe-Komplexes verwendet wurde. Diese Experimente führten vermutlich wegen mangelnder Proteinstabilität nicht zum gewünschten Ergebnis. Eine zweite Mutante, bei der eine stark saure Domäne des Cyt c1 deletiert vorliegt (Δac Cytochrom bc1 Komplex), konnte jedoch erfolgreich kristallisiert und Diffraktionsmuster bis etwa 3,5 Ǻ erhalten werden. Die Kristalle weisen derzeit noch Inhomogenitäten, wahrscheinlich durch den Einfrierprozess, auf und werden gegenwärtig weiter optimiert. Im Rahmen dieser Arbeit konnte der lange diskutierte Oligomerenzustand des Cytochrom bc1 Komplexes aus P. denitrificans in solubilisiertem Zustand als Tetramer, beziehungsweise unter Einbeziehung struktureller und mechanistischer Daten und Überlegungen als Dimer eines Dimers, geklärt werden. Dies erfolgte durch eine für Membranproteine neue Form der Massenspektrometrie, die als LILBID-MS bezeichnet wird. Diese Daten konnten die bisher vorläufigen Beobachtungen aus BN-Gelelektrophorese und Gelfiltrationsversuchen eindeutig und unabhängig bestätigen. Darüber hinaus sollten noch Beiträge zur funktionellen Monomer:Monomer-Wechselwirkung geliefert werden. Hierfür wurde zunächst ein P. denitrificans Stamm erzeugt, der stabil zwei unterschiedliche fbc-Operons trägt und exprimiert: eine Wildtyp-Version mit Strep-tag und eine mit einem His-tag und einer inaktivierenden Mutation im Cyt b. Aus diesem Stamm sollte durch eine Tandem-Aufreinigung ein gemischter Cytochrom bc1 Komplex isoliert werden. Dies gelang nicht, wie in Westernblots, turnover und pre-steady-state Aktivitätsuntersuchungen gezeigt wurde, da sich der Komplex als Tetramer erwies und damit eine eindeutige Aufreinigung nicht möglich war. Die Lösung für dieses Problem liegt im Δac Cytochrom bc1 Komplex, der wie LILBID-MS Ergebnisse zeigten, lediglich als Dimer vorliegt; dazu müssen zukünftig die Affinitäts-tags und die inaktivierende Mutation auf diesen Komplex übertragen werden. Der zweite Beitrag zur Funktionsuntersuchung wurde anhand von Mutanten konservierter saurer Aminosäuren und von Tyrosinen im und um das QP-Zentrum geliefert, mit anschließenden Aktivitätsuntersuchungen, Inhibitor-Bindungstudien mit Stigmatellin und elektrochemisch-induzierten Redox-FTIR-Differenzspektren. Die Mutanten E295Q, E81Q und Y297Q zeigten eine verringerte Sensitivität für Stigmatellin. Die FTIR-Differenzspektren belegen, dass die Mutation der Positionen E295 und D278 die Signale für protonierte Seitengruppen verschieben. Die Mutation der Seitengruppen Y302, Y297, E81 und E295 beeinflussen direkt das oxidierte Chinon und das Proteinrückgrat. Die Bedeutung der lange diskutierten Seitengruppe E295 ließ sich als direkter Interaktionspartner mit dem Hydrochinon bestätigen. Die wichtige Rolle der Seitengruppen in Positionen E295 und Y302 konnte bestätigt werden. Darüber hinaus wurden die Seitengruppen D278 und E81 als wesentliche Wechselwirkungspartner für die Hydrochinon-Oxidation identifiziert. Die Seitengruppen des QP-Zentrums unterliegen durch das Wasserstoffbrückennetzwerk starken Wechselwirkungen, wodurch die Bindungstasche eine gewisse Toleranz gegenüber Veränderungen zeigt.
Cytochrome P450 epoxygenases of the 2C family (CYP2C) are highly expressed in the endothelium and metabolize arachidonic acid to different regioisomers of epoxyeicosatrienoic acids (EET). They have a number of roles in the regulation of vascular tone and homeostasis by activating different signal transduction pathways and have recently been reported to be involved in proliferation and angiogenesis. However, the exact mechanisms by which epoxygenases regulate angiogenesis are still unclear. Therefore, the initial aim of the present study was to characterize the relevance of major signalling molecules that are involved in angiogenesis and to investigate possible signalling pathways involved. Initially the effect of CYP2C9 overexpression on expression levels of EphB4, a tyrosine kinase that plays a role in a number of developmental processes, was investigated. EphB4 protein expression was increased in CYP2C9 overexpressing cells without any effects on expression levels of its ligand ephrinB2. To clarify whether EphB4 is a critical determinant of CYP2C9-induced angiogenesis, endothelial cell sprouting was assessed using a collagen gel-based in vitro angiogenesis assay. Following transfection with EphB4 antisense or scrambled oligonucleotides, capillary-like structures were clearly present after 24 hours in cells overexpressing CYP2C9, while EphB4 downregulation abolished CYP2C9-induced sprouting. In addition stimulation of human umbilical vein endothelial cells with VEGF resulted in an increase in CYP2C expression and a subsequent increase of 11,12-EET production; an effect that was abolished by the CYP epoxygenases inhibitor MSPPOH as well as when cells were infected with a dominant negative mutant of AMPK. In vivo 11,12-EET treatment increased EphB4 expression in mesenteric arteries as well as in Matrigel plugs; an effect that was abolished when plugs were impregnated at the same time with small interfering RNA (siRNA) for EphB4. Furthermore, impregnation of Matrigel plugs with VEGF resulted in endothelial cell and smooth muscle cell recruitment into a Matrigel plug and this effect was mediated by CYP2C9-derived EETs as it was prevented by 14,15-EEZE. When infiltration of EET impregnated plugs with endothelial cells and pericytes/smooth muscle cells in vivo was compared to the effects seen in VEGF treated plugs, it was apparent that only EET treatment resulted in the formation of tube like structures that were covered by smooth muscle cells. Therefore, the final aim of the study was to further define the consequences of EET signalling in vivo as well as to characterize its physiological relevance. This hypothesis could be assessed by isolectin injection through the tail-vein where isolectin was taken up only by the EET-impregnated plug. Moreover ultrasound measurements revealed accumulation of contrast agent in EET impregnated plugs compared to control plugs. Taken together our findings emphasize that CYP2C plays a crucial role in the vessel formation process by modulating the effects mediated by two important control elements of the angiogenic response, namely VEGF and EphB4. CYP2C-derived EETs not only participate as second messengers in the angiogenic response, but have the potential to influence much more than angiogenesis by enhancing smooth muscle cell/pericyte recruitment to endothelial cell tubes to promote vascular maturation.