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Plastids are complex plant organelles fulfilling essential physiological functions, such as photosynthesis and amino acid metabolism. The majority of proteins required for these functions are encoded in the nuclear genome and synthesized on cytosolic ribosomes as precursors, which are subsequently translocated across the outer and inner membrane of the organelle. Their targeting to the organelle is ensured by a so called transit peptide, which is specifically recognized by GTP-dependent receptors Toc159 and Toc34 at the cytosolic side of outer envelope. They cooperatively regulate the insertion of the precursor protein into the channel protein Toc75, thereby initiating the translocation process. Toc34 is regarded as the primary receptor, while Toc159 probably provides the driving force for the insertion. Precursor transfer is achieved by the physical interaction between both receptors in the GTP loaded state. One translocon unit, also called the Toc core complex, is formed by four molecules Toc34, four molecules Toc75 and one molecule Toc159. In the GDP-loaded state, Toc34 preferably forms homodimers, whose physiological function was investigated in the presented study. It could be shown that the dissociation of GDP and therefore the nucleotide exchange are inhibited by the homodimeric state of Toc34. Dissociation of the homodimer is induced by the recognition of a precursor protein, which renders the binding of GTP and subsequent interaction with Toc159 possible. Thus, the homodimeric conformation could reflect an inactive state of the translocon, preventing GTP consumption in the absence of a precursor protein. Both homodimerization as well as heterodimerization of the receptor are regulated by phosphorylation, which could be demonstrated by in vitro and in vivo approaches using atToc33 from Arabidopsis thaliana as a model system. Since the phosphorylated form of Toc34 cannot be assembled with the Toc core complex, it can be concluded that the interactions between GTPase domains not only regulate the transfer of precursor proteins, but also warrant the integrity of the translocon.
Methanosarcina acetivorans kann Kohlenmonoxid (CO) als Kohlenstoff- und Energiequelle nutzen. Als Endprodukte entstehen bei der Verwertung von CO neben Methan signifikante Mengen an Azetat und Formiat sowie Dimethylsulfid (DMS). In dieser Arbeit sollten verschiedene Aspekte dieses außergewöhnlichen CO-Stoffwechsels analysiert werden. Folgende Ergebnisse wurden erzielt: 1) Weder die Methanogenese, noch die Bildung eines der anderen Metaboliten wird durch hohe CO-Partialdrücke gehemmt. Inhibitorstudien mit BES belegen, dass die CO-Oxidation und die Bildung von Azetat, Formiat und DMS nicht an die Methanogenese gekoppelt sind. Inhibitorstudien legen nahe, dass die Methanogenese aus CO am Aufbau eines Na+-Gradienten beteiligt ist und das Vorhandensein eines vom Protonenpotential-abhängigen Schrittes. 2) Eine neue, kostengünstige Transformationsmethode mittels Polyethylenglykol (PEG) konnte für M. acetivorans etabliert werden. Die Transformationshäufigkeit betrug ca. 1,1 x 107 Transformanden/μg DNA und liegt damit im Bereich von der der bisher etablierten Liposomen-vermittelten Transformationsmethode. 3) Mutantenanalysen und physiologische Studien belegen eine Beteiligung der Mts-Proteine in der DMS-Bildung und DMS-Verwertung, da in ihrer Abwesenheit kein DMS aus CO gebildet, kein Methan aus DMS produziert wird, und M. acetivorans nicht mehr auf DMS als Energiequelle wachsen kann. Die Mts-Proteine sind für das carboxidotrophe Wachstum jedoch nicht essentiell. Immunologische Analysen belegen eine substratabhängige Regulation von MtsF und weisen auf genetische Interaktionen der einzelnen Loci oder der Isoformen selbst hin. 4) Die monofunktionellen CODH-Isoformen von M. acetivorans sind am carboxidotrophen Wachstum beteiligt, jedoch nicht essentiell. Die beiden Isoformen der bifunktionellen CODH/ACS sind funktionell, und wenigstens eine von ihnen ist für autotrophes als auch carboxidotrophes Wachstum notwendig. Eine mögliche posttranslationale Modifikation von Cdh1 weist auf unterschiedliche physiologische Funktion und/oder Lokalisation hin. 5) Die F420H2-Dehydrogenase ist essentiell für methylotrophes, nicht jedoch für carboxidotrophes Wachstum.
Pflanzliche Biomasse bietet sich hervorragend als billiges und in großen Mengen verfügbares Ausgangssubstrat für biotechnologische Fermentationsprozesse an. Für die Herstellung von Bioethanol ist die Hefe Saccharomyces cerevisiae der wichtigste Produktionsorganismus. Allerdings kann S. cerevisiae die in Biomasse in großer Menge enthaltenen Pentosen Xylose und Arabinose nicht verwerten. Für einen ökonomisch effizienten Fermentationsprozess ist es daher essentiell, das Substratspektrum der Hefe entsprechend zu erweitern. Im Rahmen dieser Arbeit ist es gelungen, den bereits in Hefe etablierten bakteriellen Arabinose-Stoffwechselweg signifikant zu verbessern. Genetische und physiologische Analysen ergaben, dass eines der heterolog produzierten Enzyme, die L-Arabinose-Isomerase aus Bacillus subtilis, einen limitierenden Schritt innerhalb des Stoffwechselweges darstellte. In einem genetischen Screening konnte ein aktiveres Isoenzym aus Bacillus licheniformis gefunden werden. Zusätzlich wurde der Codon-Gebrauch aller heterologen bakteriellen Gene dem Codon-Gebrauch der hoch-exprimierten glykolytischen Gene von S. cerevisiae angepasst. Mit diesem rationalen Ansatz konnte die Ethanolproduktivität aus Arabinose um mehr als 250% erhöht werden, der Ethanolertrag wurde um über 60% gesteigert. Dies stellte die erste erfolgreiche Verbesserung eines heterologen Stoffwechselwegs in S. cerevisiae über Codon-optimierte Gene dar. In einem breit angelegten Screening wurde zum ersten Mal eine prokaryontische Xylose-Isomerase gefunden, die in S. cerevisiae eine hohe Aktivität aufweist. Durch das Einbringen des xylA-Gens aus Clostridium phytofermentans in verschiedene Hefe-Stämme wurden diese in die Lage versetzt, Xylose als alleinige Kohlenstoffquelle zu nutzen. Zusätzlich konnte damit die Vergärung von Arabinose und Xylose in einem einzigen S. cerevisiae-Stamm kombiniert werden. Vorherige Versuche, einen Pentose-vergärenden Stamm zu konstruieren, der einen bakteriellen Arabinose-Stoffwechselweg mit dem eukaryontischen Xylose-Reduktase/Xylitol-Dehydrogenase-Weg kombinierte, scheiterten an der unspezifischen Umsetzung der Arabinose durch die Xylose-Reduktase zu dem nicht weiter verstoffwechselbaren Arabitol. Für einen industriellen Einsatz der rekombinanten Hefen war es unerlässlich, die Eigenschaften für die Pentose-Umsetzung in Industrie-relevante Hefe-Stämme zu übertragen. Durch die Etablierung von genetischen Methoden und Werkzeugen ist es in dieser Arbeit gelungen, Industrie-Stämme zu konstruieren, die in der Lage sind, Arabinose oder Xylose zu metabolisieren. Dabei wurden die heterologen Gene stabil in die Chromosomen der Stämme integriert. Diese wurden mit Hilfe von „Evolutionary Engineering“ so optimiert, dass sie die Pentose-Zucker als alleinige Kohlenstoffquellen zum Wachstum nutzen konnten. Fermentationsanalysen zeigten eine effiziente Umsetzung der Pentosen zu Ethanol in diesen Stämmen. Damit ist ein neuer Startpunkt für die Konstruktion von industriellen Pentose-fermentierenden Hefe-Stämmen markiert, der zukünftig effizientere Bioethanol-Produktion ermöglichen wird.
Höhere Eukaryoten stellen ein Ensemble von Zellen dar, die in Kompartimente unterteilt sind. Somit sind intra- und interzelluläre Transportprozesse entscheidend für das Überleben dieser Zellverbände. In meiner Arbeit habe ich Evolution und Struktur von Translokationskomplexen untersucht, um einige Aspekte dieser komplexen Systeme zu untersuchen. Eingangs befassten wir uns mit Rezeptorsystemen am Beispiel des Proteintransports. Mittels phylogenetischer Analysen fanden wir heraus, dass Pex5 nicht der Urahn der anderen untersuchten 3-TPR-Domänen ist, obwohl Pex5 in allen eukaryotischen Organismen vorkommt. Ein Vergleich der 3-TPR-Domänen mit der restlichen Sequenz des Rezeptorproteins ergab, dass die 3-TPR-Domänen eine langsamere Evolutionsgeschwindigkeit aufweisen, was für eine Evolutionseinschränkung durch Interaktionspartner spricht. Sec72 ist möglicherweise aus einer TPR1 (Hop) Domäne entstanden und eine Funktion als Hsp70-erkennende Komponente des Sec-Komplexes für den post-translationalen Import kann daraus abgeleitet werden. „Recycling“ von 3-TPR-Domänen anderer Proteine konnten wir durch unsere phylogenetische Analyse auch für die zweite 3-TPR-Domäne von Tom34 nachweisen, die mit CYP40/FKBP51/52 clustert. Darüber hinaus war es uns möglich, die plastidär bzw. mitochondriell lokalisierten Formen von Toc64 phylogenetisch zu unterscheiden. Durch Erzeugung von Homologiemodellen konnten organellspezifische Aminosäuren strukturell eingeordnet werden. Dabei stellten wir fest, dass sich fast alle Positionen, die sich in der Aminosäurekomposition unterscheiden, auf der konvexen Seite der 3-TPR-Domäne befinden. Molekulardynamische Simulationen zeigten zudem deutliche Veränderung der Hauptbewegungen der 3-TPR-Domänen nach Komplexierung mit dem Hsp90-C-Terminus. Bei Bindung des Liganden werden intramolekulare Wasserstoffbrücken sowohl auf der konvexen als auch konkaven Seite der 3-TPR-Domäne „umgeschaltet“. Diese Erkenntnisse führen zu zwei Hypothesen: 1.) die Organellspezifität der Rezeptoren wird durch die Interaktion mit anderen Komplexpartnern garantiert und 2.) die Änderungen des Wasserstoffbrückennetzwerkes auf der konvexen Seite nach Hsp90-Bindung führen zur Ausbildung der Bindungsstelle für die andere Komplexkomponente. Beide Hypothesen erklären die experimentellen Beobachtungen bezüglich der Rezeptoren und warum keine phylogenetischen Hinweise für die Existenz von Vorstufenprotein-spezifischen Hsp70/90-Proteinen gefunden werden konnten. Nach dem Rezeptor haben wir uns mit dem Translokationsprozess befasst. Wir konnten phylogenetisch zeigen, dass sich Omp85 aus Proteobakterien im Vergleich zu Cyanobakterien und Eukaryoten insbesondere durch andersartige POTRA Domänen auszeichnet und fanden zwei konservierte Motive in der Porenregion. Zudem konnten wir im Heterokontophyten P. tricornutum ein vollständiges Omp85 identifizieren (bipartite Signalsequenz, 2 POTRAs, Pore mit langen Schleifen). Die Aminosäuresequenz weicht teils deutlich von den bekannten Omp85-Proteinen ab, was die Entdeckung erschwerte. Wir haben damit geklärt, dass auch im Translokationsapparat von komplexen Plastiden ein b-Fassprotein der Omp85 Familie die Kerneinheit bildet. Ebenfalls zu den Protein-transportierenden b-Fassproteinen gehört TolC, das aber im Gegensatz zu Omp85 auch andere Substanzen, wie zum Beispiel Siderophore transportiert. Alr2887 ist das einzige TolC-ähnliche Protein aus Anabaena sp. PCC7120. Vergleichende Phänotypuntersuchungen weisen auf eine Interaktion eines ABC-Transporters (DevBCA Operon) mit Alr2887 hin. Die Distanz zwischen äußerer Membran und Plasmamembran ist in Anabaena doppelt so groß wie in E. coli. Entsprechend fanden wir im Adapterprotein DevB eine stark verlängerte dimere Doppelwendel, die das von TolC gebildete a-Fass im Periplasma bis hin zum ABC-Transporter in der Plasmamembran theoretisch fortsetzen kann. Da verschiedenste in Anabaena existierende ABC-Transporter TolC als Abflusskanal benötigen, nehmen wir an, dass Alr2887 ein Rundumtalent in Bezug auf die zu transportierenden Substrate darstellt. Dieses ist auch aufgrund der basalen Einordnung im phylogenetischen Baum zu vermuten; es könnte somit auch in den „Multi-Drug-Efflux“ involviert sein. Nicht nur ABC-Transporter, auch TonB-abhängige Transporter stehen in funktionellem Zusammenhang mit TolC. Wir haben Aminosäuresequenzen von ~4600 TBDTs aus Gram-negativen Bakterien und Cyanobakterien zusammengetragen und nach ihrer paarweisen Ähnlichkeit geclustert. Anhand experimentell charakterisierter TBDTs mit bekannten Substraten und TBDTs mit vorhergesagten Substraten konnten wir sehr vielen Clustern ein Substrat zuordnen, das die in ihnen zusammengefassten TBDTs aller Wahrscheinlichkeit nach importieren. Wir konnten ferner feststellen, dass es noch eine Menge weiterer Cluster mit unbekannten Substratspezifitäten gibt und unsere Analysen stimulieren somit die Arbeiten an diesem System im Allgemeinen und in Cyanobakterien im Besonderen.
Die anaerobe Atmung mit Nitrat und Nitrit als terminalen Elektronenakzeptoren bildet einen wichtigen Teil des biologischen Stickstoff-Zyklus. Beispiele sind Denitrifikation und respiratorische Nitrat-Ammonifikation, wobei in beiden Fällen in einem ersten Schritt Nitrat zu Nitrit reduziert wird. In der Denitrifikation entstehen dann verschiedene gasförmige Produkte (NO, N2O, N2), wogegen Nitrit in der Ammonifikation ohne die Freisetzung weiterer Zwischenprodukte direkt zu Ammonium reduziert wird. Während die terminalen Reduktasen dieser Atmungsketten gut untersucht sind, ist das Wissen über die Zusammensetzung kompletter Elektronentransportketten sowie die Interaktion einzelner Proteine als auch zwischen den Proteinen und Chinonen in der Membran begrenzt. Ziel dieser Arbeit war die Charakterisierung der membranständigen Chinol-Dehydrogenasen NapGH und NrfH in der respiratorischen Nitrat-Ammonifikation von Wolinella succinogenes. Dieses Epsilonproteobakterium ist ein etablierter Modellorganismus der anaeroben Atmung und wächst durch respiratorische Nitrat-Ammonifikation mit Formiat oder H2 als Elektronendonoren. Als terminale Reduktasen werden dabei die periplasmatische Nitratreduktase NapA und die Cytochom c-Nitritreduktase NrfA benötigt. Die Genomsequenz weist keine weiteren typischen Nitrat- und Nitritreduktasen auf, und napA- und nrfA-defiziente Mutanten sind nicht in der Lage durch Nitrat- bzw. Nitritatmung wachsen. Das Operon des Nap-Systems (napAGHBFLD) von W. succinogenes kodiert Proteine, die an der Nitrat-Reduktion durch Menachinol beteiligt sind (NapA, -B, -G und -H) und Proteine, die für die Reifung und Prozessierung von NapA benötigt werden (NapF, -L und –D). Im Gegensatz zu vielen anderen Bakterien läuft die Nitrat-Atmung unabhängig von einem NapC-ähnlichen Protein ab, das als membrangebundenes Tetrahäm-Cytochrom c für die Chinol-Oxidation zuständig ist und Elektronen über den Elektronenüberträger NapB an die terminale Reduktase NapA liefert. Zwar sind im Genom zwei NapC-Homologe kodiert (FccC und NrfH), doch die Deletion beider Gene hatte keinen Einfluss auf die Nitrat-Atmung. Es wurde vermutet, dass die Funktion von NapC in W. succinogenes stattdessen durch die beiden Fe/S-Cluster Proteine NapG und NapH übernommen wird. Die Reduktion von Nitrit zu Ammonium wird durch den NrfHA-Komplex katalysiert. Das Pentahäm-Cytochrom c NrfA bildet dabei die katalytische Untereinheit, die über das membranständige Tetrahäm-Cytochrom c auf der periplasmatischen Seite der Membran gebunden ist. NrfH gehört zur NapC/NirT-Familie und überträgt Elektronen von Menachinol auf NrfA. Mittels gerichteter Mutagenese von nrfH wurden in früheren Arbeiten bereits Aminosäure-Reste identifiziert, die essentiell für die Elektronentransportaktivität von Formiat zu Nitrit sind.
Crista junctions (CJs) are important for mitochondrial organization and function, but the molecular basis of their formation and architecture is obscure. We have identified and characterized a mitochondrial membrane protein in yeast, Fcj1 (formation of CJ protein 1), which is specifically enriched in CJs. Cells lacking Fcj1 lack CJs, exhibit concentric stacks of inner membrane in the mitochondrial matrix, and show increased levels of F1FO–ATP synthase (F1FO) supercomplexes. Overexpression of Fcj1 leads to increased CJ formation, branching of cristae, enlargement of CJ diameter, and reduced levels of F1FO supercomplexes. Impairment of F1FO oligomer formation by deletion of its subunits e/g (Su e/g) causes CJ diameter enlargement and reduction of cristae tip numbers and promotes cristae branching. Fcj1 and Su e/g genetically interact. We propose a model in which the antagonism between Fcj1 and Su e/g locally modulates the F1FO oligomeric state, thereby controlling membrane curvature of cristae to generate CJs and cristae tips.
Degenerationsvorgänge am Innenohr und experimentelle Untersuchungen über Protektionsmöglichkeiten
(2000)
Hörverluste durch Innenohrschäden gelten beim Menschen und anderen Säugetieren als irreversibel. Deshalb wird es von vielen Wissenschaftlern versucht, eine Regeneration im Innenohr der Säugetiere zu induzieren oder das Ohr pharmakologisch vor Schädigung zu schützen. Ziel dieser Arbeit war es zu untersuchen, ob neurotrophe Wachstumsfaktoren Meerschweinchen vor experimentell ausgelösten Innenohrschäden schützen können. Als erstes wurde in dieser Arbeit ein Tiermodell zur akuten und frequenzspezifischen Hörschädigung entwickelt. Meerschweinchen wurden Kanamycin und Ethakrynsäure intravenös infundiert. Es wurde festgestellt, daß die erwünschten frequenzspezifischen Hörverluste durch 266 mg/kg Kanamycin kombiniert mit 30 mg/kg Ethakrynsäure reproduzierbar induziert werden konnten. Die Hörschwellen und ihre Verluste wurden anhand der Summenaktionspotentiale vom Hörnerv bestimmt. Anschließend wurde an Meerschweinchen eine Methode zur chronischen Applikation von Wachstumsfaktoren ausgearbeitet. Es wurden drei implantierbare Applikationssysteme getestet, das Mikrodosiersystem (MDS) aus der Tübinger HNO-Klinik, die wiederbefüllbaren ESOX-Pumpen und osmotische ALZET-Pumpen. Durch die osmotischen ALZET-Mikropumpen konnten neurotrophe Faktoren über einen Zeitraum von mehreren Wochen kontinuierlich und zuverlässig appliziert werden. Diese Pumpen wurden in Meerschweinchen implantiert und lieferten eine Lösung mit der Testsubstanz oder eine Kontrollösung, die an das runde Fenster der Cochlea oder in die Zerebrospinalflüssigkeit abgegeben wurden. Im dritten Teil der Arbeit wurden die beiden entwickelten Methoden miteinander kombiniert. Damit war es möglich zu testen, ob der durch die Mikropumpen applizierte neurotrophische Faktor-3 (NT-3) die durch Ototoxika ausgelösten Schwellenverluste vermindert, Argumente für die Wahl von NT-3 waren, daß NT-3 in vitro bereits eine starke protektive Wirkung an den Neuronen des Spiralganglions erwiesen hatte (Marzella et al., 1997). Außerdem sind Rezeptoren für NT-3 auch bei adulten Tieren in den cochleären Haarzellen vorhanden. Die physiologische Wirkung von NT-3 war aber in vivo noch nicht untersucht worden. Zu Beginn der Experimente wurden die Tiere mit Mikropumpen implantiert, die über 14 Tage eine NT-3-haltige oder Kontrollösung applizierten. Vier Tage nach Implantation der Pumpen wurden die Meerschweinchen durch die Infusion der oben genannten ototoxischen Arzneimitteln vertäubt. Die Hörschwellen wurden kurz bevor und über 32 Tage nach der Vertäubung gemessen. Die Hörschwellen der mit NT-3 behandelten Tiere wurden mit den Hörschwellen der Kontrolltiere verglichen. Durch die Infusion von Kanamycin und Ethakrynäure wurden bei Meerschweinchen Hörverluste in der Größenordnung von 40 dB induziert. Bei der Gabe von NT-3 an die rechten Cochleae wurden diese ototoxisch ausgelösten Schwellenverluste um 9 dB vermindert, und dies nicht nur auf der behandelten, sondern auch auf der kontralateralen Seite. Diese Befunde deuteten darauf hin. daß bei der lokalen Gabe die neurotrophen Faktoren auf systemischem Wege auch andere Seite erreichen und dort eine Wirkung ausüben. Ähnliche Effekte wurden auch bei lokaler Gabe von einem anderen neurotrophen Faktor, Glial cell line-derived neurotrophic factor (GDNF), beoobachtet (Shoji et al., 2000). Die kontralaterale Wirkung war hier aber schwächer (3 dB), als die ipsilaterale (5 dB). Die ins Ohr implantierten Pumpen verursachten per se Hörverluste von etwa 5 dB. NT-3 verminderte auch diese Hörverlustedurchschnittlich um 4 dB. In einer weiteren Versuchsreihe wurde der systemische Effekt von NT-3 geprüft. Dafür wurde NT-3 nicht lokal an das runde Fenster der Cochlea, sondern in die Zerebrospinalflüssigkeit appliziert. Die ototoxisch ausgelösten Hörverluste konnten durch den systemisch gegebenen NT-3 um 5 dB verringert werden. Relativ zu den ototoxisch ausgelösten Hörverlusten in der Größenordnung von 40 dB war die Protektion durch systemisch (5 dB) oder lokal (9 dB) applizierten NT-3 gering. Die stärkste otoprotektive Wirkung durch Wachstumsfaktoren, von 12-18 dB, wurde bis jetzt durch gentechnisch in die Cochlea eingebrachten GDNF erreicht (Yagi et al., 1999). Der Schutzeffekt durch den lokal am Ohr gegebenen GNDF (5 dB, Shoji et al., 2000) war aber geringer, als der vom identisch verabreichten NT-3 (9 dB, diese Arbeit, s. auch Sudavicius et al., 2000). Wenn durch gentechnische Art des Verabreichens die Wirkung von NT-3 im gleichen Maße potenziert werden sollte, wie es bei GDNF der Fall ist, wäre die protektive Wirkung von NT-3 stärker als die von GDNF.
Im Rahmen der vorliegenden Dissertation wurde die Rolle des Transkriptionsfaktors Meis2 als Ko-Faktor in der Entwicklung des anterioren Neuralrohrs untersucht. Hierbei gaben funktionelle Untersuchungen durch Fehl- und Überexpressionsstudien mittels in ovo Mikroelektroporation im Hühnchenembryo, Aufschluss über eine besondere Rolle von Meis2 bei der Spezifizierung und Entwicklung des Tectum opticums. Überdies führten bio-chemische Untersuchungen zur Identifizierung neuer, bislang noch nicht beschriebener Interaktionspartner von Meis2 im sich entwickelnden optischen Tektum und in den Anlagen der Augen. Diese Untersuchungen geben einen weiteren Einblick in die Funktionsweise von Meis2 als Ko-Transkriptionsfaktor. Zusammengefasst lieferten die Untersuchungen der vorliegenden Arbeit folgende Erkenntnisse: I) Im Mittelhirn ist Meis2-Expression unter den bislang beschriebenen Regulatoren der Mittelhirnentwicklung einzigartig: es ist von Beginn an nicht dynamisch und kennzeichnet ausschließlich die dorsalen Alarplatten des Mittelhirns, den Bereich des zukünftigen optischen Tektums (Kapitel 3.1). Diese Expression unterliegt einer strikten negativen Regulation durch sezernierte Moleküle und Transkriptionsfaktoren der benachbarten Regionen des Neuralrohrs (Kapitel 3.2). II) Meis2 ist für tektale Entwicklung erforderlich: Die Überexpression des dominant negativ wirkenden Konstruktes Meis2EnR störte die Entwicklung tektumspezifischer Strukturen sowohl in der frühen als auch in der späteren Entwicklung (Kapitel 3.3.1 und 3.3.2). Zudem kam es zur Unterdrückung der tektalen Gene ephrinB1 und Dbx1 (Kapitel 3.3.3 und 3.3.4). III) Meis2 ist für tektale Entwicklung ausreichend: Die Fehlexpression von Meis2 führte zur Induktion und Entwicklung ektopischer tektaler Strukturen im Dienzephalon (Kapitel 3.3.5). Dabei führte Meis2 bereits 24 h nach Fehlexpression zur Transdifferenzierung des dienzephalischen in mesenzephalisches Zellschicksal, veränderte jedoch nicht das Schick-sal des metenzephalischen Gewebes (Kapitel 3.3.7). IV) Bei der Induktion tektaler Strukturen ist Meis2 nicht Bestandteil des regulatorischen Netzwerks des Mittel-Hinterhirn Organisators (MHO), eines sekundären Organisators, welcher die Entwicklung der Mittel-Hinterhirn Region steuert (Kapitel 3.3.8). V) Meis2 bildet jedoch im Mittelhirn in vivo Komplexe mit Otx2, einem Schlüsselmolekül zur Spezifizierung des anterioren Neuralrohrs (Kapitel 3.4.1 - 3.4.3). VI) Meis2 kann in vitro durch Bindung an Otx2 einer Grg4/Tle4-vermittelten Unter-drückung der transkriptionellen Aktivität von Otx2 entgegenwirken (Kapitel 3.4.4). Otx2 kann, wie bereits in Arbeiten anderer Labors beschrieben, kontext-abhängig entweder als transkriptioneller Repressor oder Aktivator wirken. Die in dieser Arbeit dargestellten Ergebnisse zeigen daher einen möglichen molekularen Mechanismus auf, wie durch zeitlich und räumlich kontrollierte Bindung eines Ko-Aktivators an Otx2 dessen transkrip-tionelle Aktivität wieder hergestellt werden kann. Die Ergebnisse dieser Arbeit beschreiben zum ersten Mal einen Transkriptionsfaktor, der unabhängig vom regulatorischen Netzwerk des MHO, die Entwicklung des optischen Tektums induziert. Sie liefern somit ein neuartiges mögliches Modell zur Spezifizierung anteriorer Hirnstrukturen: Die Induktion tektaler Entwicklung erfolgt nach Etablierung der Mittel-Hinterhirn Region durch Meis2, einem tektumspezifischen Ko-Faktor von Otx2. VII) Meis2 bildet, im sich entwickelnden Mittelhirn, auch Komplexe mit den beiden Regulatoren der Tektumentwicklung Pax3 und Pax7 (Kapitel 3.4.5). VIII) Außerdem konnten im Rahmen dieser Arbeit zwei weitere mögliche Interaktions-partner von Meis2 in den Anlagen der Augen identifiziert werden: Pax6, einem „master control gene“ der Augenentwicklung (Kapitel 3.4.6) und das Enzym Parp-1 (Kapitel 3.4.7), einem weit verbreiteten und vielseitigen Regulator der Genexpression. Diese Ergebnisse liefern Hinweise auf weitere wichtige Funktionen des Ko-Transkriptions-faktors Meis2 in der Entwicklung des anterioren Zentralnervensystems.
Helicobacter pylori (H. pylori) ist ein gram-negatives, mikroaerophiles Bakterium. Es kolonisiert die menschliche Magenschleimhaut, wobei mehr als 50% der Menschheit befallen sind. Als Pathogen begünstigt es die Entstehung von Magengeschwüren und –krebs. Experimentelle Befunde deuten darauf hin, dass H. pylori während der Infektion Kontakt zu Membranproteinen der Wirtszellen aufnimmt, um ein Typ IV Sekretionssystem aufzubauen und den primären Virulenzfaktor CagA (Cytotoxin Associated Antigen A) in die Wirtszelle zu translokieren. Diese Integrine genannten Membranproteine werden bei polaren Epithelzellen allerdings bevorzugt basolateral expremiert. Außerdem können extrazellulär geschnittene E-Cadherinfragmente im Medium mit H. pylori infizierter Zellkulturen nachgewiesen werden. Beide Beobachtungen legen den Schluss nahe, dass eine Protease von H. pylori sekretiert wird und die Zell-Zell-Kontakte degradiert, um H. pylori den Zugang zur basolateralen Seite der Wirtszellen zu ermöglichen. Das vom Gen hp1019 des Stammes H. pylori 26695 codierte Protein HtrA konnte im Rahmen einer Kooperation mit dem Paul-Ehrlich-Institut in Langen im Überstand von H. pylori mit proteolytischer Aktivität nachgewiesen werden. Um den Einfluss dieser extrazellulären Protease auf die Infektion von Kulturzellen mir H. pylori zu untersuchen, sollte ein niedermolekularer Inhibitor für HtrA gefunden werden. Ein Homologiemodell als Grundlage für ein strukturbasiertes virtuelles Screening wurde berechnet, wobei die aktive Konformation der Protease DegP von Escherichia coli als Vorlage diente (PDB Identifikation 3cs0). Für einen neue, im Rahmen dieser Untersuchung entwickelten Methode wurde PocketPicker eingesetzt, um Größe und Form der die Bindetaschen auf der Proteinoberfläche vorherzusagen. Durch die komplementäre Projektion von Proteinatomtypen auf diese definierte Volumen kann so für eine von PocketPicker vorgesagte Bindetasche ein potentielles Pharmakophormodell berechnet und für Datenbanksuchen eingesetzt werden. In retrospektiven Studien konnte die Funktion dieser Berechungen für eine Auswahl an pharmakologisch wichtigen Proteinen aus verschiedenen Strukturklassen validiert werden. Dabei stellte sich vor allem eine Abhängigkeit der Güte der Modelle von der Güte der Vorhersage von PocketPicker heraus, was den Schluss zulässt, dass eine möglichst genaue Definition der Bindetasche für das Gelingen eines strukturbasierten virtuellen Screening unerlässlich ist. Für die Protease HtrA von H. pylori konnten erfolgreich drei strukturabgeleitete Pharmakophormodelle berechnet werden, wobei jeweils verschiedene von PocketPicker vorhergesagte Bindetaschen einbezogen wurden. Die Molekülkataloge der Firmen Asinex und Specs wurden nach Ähnlichkeit zu diesen Modellen sortiert und nach Begutachtung der jeweils ähnlichsten 100 Substanzen wurden 26 Substanzen ausgewählt und bestellt. In einem in vitro Assay mit der rekombinanten Protease HtrA inhibierten 6 Substanzen den Verdau eines rekombinanten Substrats. Die beste Verbindung erreichte in dem Assay eine maximale Inhibition von ca. 77 % bei einer mittleren inhibitorischen Konzentration bei halbmaximaler Inhibition (IC50) von ca. 26 µM.
Diffusion of inner membrane proteins is a prerequisite for correct functionality of mitochondria. The complicated structure of tubular, vesicular or flat cristae and their small connections to the inner boundary membrane impose constraints on the mobility of proteins making their diffusion a very complicated process. Therefore we investigate the molecular transport along the main mitochondrial axis using highly accurate computational methods. Diffusion is modeled on a curvilinear surface reproducing the shape of mitochondrial inner membrane (IM). Monte Carlo simulations are carried out for topologies resembling both tubular and lamellar cristae, for a range of physiologically viable crista sizes and densities. Geometrical confinement induces up to several-fold reduction in apparent mobility. IM surface curvature per se generates transient anomalous diffusion (TAD), while finite and stable values of projected diffusion coefficients are recovered in a quasi-normal regime for short- and long-time limits. In both these cases, a simple area-scaling law is found sufficient to explain limiting diffusion coefficients for permeable cristae junctions, while asymmetric reduction of the junction permeability leads to strong but predictable variations in molecular motion rate. A geometry-based model is given as an illustration for the time-dependence of diffusivity when IM has tubular topology. Implications for experimental observations of diffusion along mitochondria using methods of optical microscopy are drawn out: a non-homogenous power law is proposed as a suitable approach to TAD. The data demonstrate that if not taken into account appropriately, geometrical effects lead to significant misinterpretation of molecular mobility measurements in cellular curvilinear membranes.
Oscillating magnetic field disrupts magnetic orientation in Zebra finches, Taeniopygia guttata
(2009)
Background Zebra finches can be trained to use the geomagnetic field as a directional cue for short distance orientation. The physical mechanisms underlying the primary processes of magnetoreception are, however, largely unknown. Two hypotheses of how birds perceive magnetic information are mainly discussed, one dealing with modulation of radical pair processes in retinal structures, the other assuming that iron deposits in the upper beak of the birds are involved. Oscillating magnetic fields in the MHz range disturb radical pair mechanisms but do not affect magnetic particles. Thus, application of such oscillating fields in behavioral experiments can be used as a diagnostic tool to decide between the two alternatives. Methods In a setup that eliminates all directional cues except the geomagnetic field zebra finches were trained to search for food in the magnetic north/south axis. The birds were then tested for orientation performance in two magnetic conditions. In condition 1 the horizontal component of the geomagnetic field was shifted by 90 degrees using a helmholtz coil. In condition 2 a high frequently oscillating field (1.156 MHz) was applied in addition to the shifted field. Another group of birds was trained to solve the orientation task, but with visual landmarks as directional cue. The birds were then tested for their orientation performance in the same magnetic conditions as applied for the first experiment. Results The zebra finches could be trained successfully to orient in the geomagnetic field for food search in the north/south axis. They were also well oriented in test condition 1, with the magnetic field shifted horizontally by 90 degrees. In contrast, when the oscillating field was added the directional choices during food search were randomly distributed. Birds that were trained to visually guided orientation showed no difference of orientation performance in the two magnetic conditions.
Background Different iron transport systems evolved in Gram-negative bacteria during evolution. Most of the transport systems depend on outer membrane localized TonB-dependent transporters (TBDTs), a periplasma-facing TonB protein and a plasma membrane localized machinery (ExbBD). So far, iron chelators (siderophores), oligosaccharides and polypeptides have been identified as substrates of TBDTs. For iron transport, three uptake systems are defined: the lactoferrin/transferrin binding proteins, the porphyrin-dependent transporters and the siderophore-dependent transporters. However, for cyanobacteria almost nothing is known about possible TonB-dependent uptake systems for iron or other substrates. Results We have screened all publicly available eubacterial genomes for sequences representing (putative) TBDTs. Based on sequence similarity, we identified 195 clusters, where elements of one cluster may possibly recognize similar substrates. For Anabaena sp. PCC 7120 we identified 22 genes as putative TBDTs covering almost all known TBDT subclasses. This is a high number of TBDTs compared to other cyanobacteria. The expression of the 22 putative TBDTs individually depends on the presence of iron, copper or nitrogen. Conclusions We exemplified on TBDTs the power of CLANS-based classification, which demonstrates its importance for future application in systems biology. In addition, the tentative substrate assignment based on characterized proteins will stimulate the research of TBDTs in different species. For cyanobacteria, the atypical dependence of TBDT gene expression on different nutrition points to a yet unknown regulatory mechanism. In addition, we were able to clarify a hypothesis of the absence of TonB in cyanobacteria by the identification of according sequences.
Vasculogenesis as well as angiogenesis are important for postnatal development of blood vessels. Peripheral blood or bone marrow-derived endothelial precursor cells are used in clinical trials for therapeutic enhancement of postnatal neovascularization in patients suffering from coronary artery diseases. The vasculogenic potential of the precursor cell population depends on the appropriate retention of the infused cells to the ischemic tissue. However, cell-autonomous mechanisms regulating the attraction and retention of circulating cells in inflammatory tissue are not well understood. Caspases belong to a family of pro-apoptotic enzymes. Beyond cell death signals, caspase proteases additionally regulate non-apoptotic processes like cell morphology and migration in many cell types. The isoform Caspase-8 is essential for embryonal vasculogenesis in conditional knockout mice. In this study, we identified a novel apoptosis-unrelated role of Caspase-8 in circulating and bone marrow-derived cells for vascular repair. Caspase-8-specific inhibition abrogated the ex vivo formation of EPC from human peripheral blood. Moreover, Caspase-8 inhibition disables EPC migration and adhesion to different matrices and decreases the cell surface expression of the fibronectin receptor subunit integrin alpha 5 and the chemokine receptor CXCR4. In vitro and in vivo studies using bone marrow mononuclear cells derived from inducible Caspase-8- deficient mice revealed an essential role of Caspase-8 for EPC formation and neovascularization enhancing capacities of progenitor cells. Caspase-8 activity appears to be required for maintaining responses to matrix interaction and chemoattractants of EPC. Additional studies showed that the E3 ubiquitin ligase Cbl-b, a negative regulator of cell adhesion molecules including integrin alpha 5, is present in EPC at low protein levels under basal conditions, but markedly increases upon Caspase-8 inhibition. In vitro assays and overexpression studies in intact cells confirmed Caspase-8-dependent degradation of Cbl-b, providing a potential requirement for Caspase-8-regulated adhesion. Indeed, neovascularization of matrigel plugs was enhanced in mice lacking Cbl-b. Moreover, Cbl-b degradation in the presence of active Caspase-8 prevents the down-regulation of integrin alpha 5 and is associated with an enhanced vasculogenic activity of progenitor cells in hind limb ischemia. The identified upstream regulation of caspase-8 by cytokine IL-6 is only one possibility for fine-tuning the non-apoptotic enzymatic activity. In summary, this study shows a novel essential role of Caspase-8 for proper EPC adhesion-related signaling. Caspase-8 is involved in the function of adhesion molecules by regulation the E3 ubiquitin ligase Cbl-b. Strategies to improve survival of therapeutic injected progenitor cells by using caspase inhibitors should be addressed with caution. Because of the broad spectrum of activity of caspase-8, downstream targets of this caspase isoform and Cbl-b should be in more focus for therapeutic pretreatment to improve neovascularization of myocardial and ischemic tissue.
Die Identifizierung neuartiger Verbindungsklassen für ein pharmakologisches Zielsystem ist eine fordernde Aufgabe für die frühe präklinische Forschung, insbesondere wenn bereits vorherige umfangreiche Studien durchgeführt und viele Leitstrukturserien gefunden wurden. In dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass Scaffold Hopping durch Methoden des Virtual Screenings auch für Systeme möglich ist, für die bereits eine Vielzahl von Referenzsubstanzen beschrieben ist und somit wenig freier chemischer Raum für Innovation zur Verfügung steht. Als Beispielsystem wurde die GlycinB-Bindungsstelle der NR1-Untereinheit des NMDA-Rezeptors betrachtet. Verschiedene zwei- und dreidimensionale Techniken des Virtual Screenings wurden einer umfangreichen retrospektiven Validierung unterworfen. Zur Durchführung der prospektiven Virtual-Screening-Studie wurde eine automatisierte in silico Plattform entwickelt, die 8,9 Millionen käufliche Substanzen aus 46 Substanzkatalogen von 33 verschiedenen Anbietern sammelte, um etwa 5 Millionen unterschiedliche Moleküle in zweidimensionaler Darstellung aufzuarbeiten. Diese Menge an Substanzen stellt den größten Teil der zurzeit kommerziell verfügbaren chemischen Verbindungen, also den „verfügbaren chemischen Raum“ dar. Anhand der retrospektiv validierten Virtual Screening Techniken konnten in einer prospektiven Suche 21 GlycinB-Antagonisten mit neuartigen, d.h. für GlycinB noch unbeschriebenen Scaffolds gefunden werden. Ausgehend von drei dieser Virtual Screening Hits wurden 53 weitere Verbindungen mit insgesamt fünf unterschiedlichen neuartigen Scaffolds und einem gemeinsamen Azo-Motiv identifiziert. Die Struktur-Wirkungsbeziehungen dieser fünf chemischen Serien wurden charakterisiert. Das Ergebnis dieser Arbeit zeigt eindeutig, dass es lohnend ist, alle vorhandenen Methoden auszuschöpfen, da sich die validierten Methoden komplementär zueinander verhielten und kein Virtual Screening Hit von mehr als einer Technik gefunden wurde. Die Flexibilität von Proteinen als Antwort auf die Bindung unterschiedlicher Liganden stellt ein bislang ungelöstes chemieinformatisches Problem dar, welches auch grundlegende pharmakologische Bedeutung hat. So verursachen z.B. bei NMDA/GlycinB agonistische Liganden eine Konformationsänderung des Rezeptors. Diese ruft dann eine direkte funktionale Antwort in Form der Öffnung des Ionenkanals hervor. Auch der Bindungsmodus der Antagonisten von GlycinB ist trotz Vorhandenseins von zwei Kristallstrukturen und mehreren Hundert zum Teil hochaffiner Referenzstrukturen zum großen Teil ungeklärt. Im zweiten Teil dieser Arbeit wurde ein auf Moleküldynamiksimulationen basierendes Verfahren entwickelt, welches flexible Aminosäurereste im Rezeptor und damit induzierbare Bewegungen des Proteinrückgrates bestimmt. Die so identifizierten Reste wurden dann in einem erweiterten Verfahren des Induced-Fit-Dockings als explizit flexibel betrachtet. Hierdurch war die Berechnung verschiedener Bindungsmodi von Antagonisten möglich, die aufgrund ihrer Form und Größe nicht in die verfügbaren Kristallstrukturen von GlycinB passten. Diese benötigten somit einen Induced-Fit-Effekt des Rezeptors, um eine Bindung einzugehen. Für die im ersten Teil dieser Arbeit identifizierten Azo-Liganden wurde auf Basis dieser Methode ein gemeinsamer Bindungsmodus vorgeschlagen. Ebenso konnte anhand der Methodik eine Aussage über die funktionale Auswirkung der Proteinflexibilität beim Übergang vom antagonistischen zum agonistischen Rezeptorzustand von GlycinB getroffen werden. Ein großes Problem aktueller Dockingverfahren ist die mangelnde Verfügbarkeit von Scoringfunktionen, welche die tatsächliche biologische Bindungsaffinität eines Liganden berechnen. Hier wurde ein Verfahren für das Zielsystem GlycinB gezeigt, welches aufgrund der Berechnung des thermodynamischen Entropie- und Enthalpiegewinns durch Verdrängung von hydrophob eingeschlossenen Wasser aus der Bindungsstelle durch den Liganden eine Aussage über dessen zu erwartende Bindungsaffinität trifft. Dieses neuartige Scoringsystem wurde auf die im Virtual Screening identifizierten Serie von Azo-Liganden angewandt und verfügte über eine im Vergleich zu klassischen Scoringfunktionen des Molecular Dockings verbesserte Vorhersagekraft der biologischen Bindungsaffinität.
Im Rahmen dieser Arbeit wurden die 5´- und 3´-Enden 23 ausgewählter Transkripte des halophilen Archaeons Halobacterium salinarum bestimmt. Die Daten wurden dazu verwendet, die Längen der untranslatierten Bereiche zu ermitteln, Konsensussequenzen für die Transkriptionsinitiation und -termination abzuleiten und die Rolle haloarchaealer UTRs bei der Translationsinitiation und -regulation zu untersuchen. Der experimentelle Ansatz wurde mit einer bioinformatischen Analyse des Genoms von H. salinarum vervollständigt. Dabei konnten die Konsensussequenzen der basalen Promotorelemente genauer definiert werden und ein neues Promotorelement konnte entdeckt werden. Weiterhin wurde ein Konsensusmotiv gefunden, welches wahrscheinlich für die Termination der Transkription wichtig ist. Alle 23 analysierten Transkripte hatten eine 3´-UTR mit einer durchschnittlichen Länge von 48 Nukleotiden und ihre 3´-Enden waren nicht posttranskriptionell modifiziert. Die experimentellen Ergebnisse und bioinformatischen Daten ergaben, dass die Mehrheit der haloarchaealen Transkripte keine 5´-UTR besitzt. Die meisten Transkripte mit 5´-UTRs enthielten unerwarteterweise keine Shine-Dalgarno (SD)-Sequenz. Die Analyse des H. salinarum Genoms machte deutlich, dass weniger als 10% aller Gene eine SD Sequenz vorrausgeht und dass sogar bei Genen, die distal im Operon liegen, meistens keine SD-Sequenz zu finden ist. Weiterhin wurde der Einfluss einer ausgewählten 5´-UTR ohne SD-Sequenz und einer 3´-UTR auf die Transkriptstabilität und die Translationseffizienz untersucht. Das Transkript mit 5´ UTR ohne SD-Sequenz wurde in H. salinarum effizient translatiert. In einer Studie an H. volcanii konnte das Gleiche für verschiedene 5´ UTRs ohne SD-Sequenz in Verbindung mit einem Reportergen gezeigt werden (Brenneis et al., 2007). An diesen Transkripten kann die Translation also nicht über den „bakteriellen“ Mechansimus durch Basenpaarung mit dem 3´-Ende der 16S rRNA initiiert werden. Im weiteren Verlauf der Arbeit wurde untersucht, ob es sich bei dem Mechanismus der Translationsinitiation an Transkripten mit 5´-UTR ohne SD-Sequenz um einen Scanning-Mechanismus wie bei Eukaryonten oder um einen neuen Mechanismus handelt. Für die Experimente wurde das zuvor erwähnte Reportergensystem aus H. volcanii verwendet. Neben AUG wurden GUG und UUG effizient als Startkodons an einem Transkript mit 5´-UTR genutzt, wohingegen AUG das einzige funktionierende Startkodon bei einem Transkript ohne 5´-UTR war. Verschiedene Deletionsversionen der 20 Nukleotide langen 5´-UTR wurden im Gegensatz zur kompletten 5´-UTR nur sehr ineffizient translatiert. Das Einfügen zusätzlicher AUGs stromaufwärts des natürlichen Startkodons hatte keinen Einfluss auf die Translationseffizienz am internen AUG. Ein zusätzliches AUG am 5´-Ende im gleichen Leseraster des natürlichen AUGs führte zur gleichzeitigen Nutzung beider Startkodons auf derselben mRNA. Eine stabile Haarnadelstruktur am 5´-Ende inhibierte die Translation nur am ersten AUG und hatte keinen Einfluss auf die Translationseffizienz am internen AUG. Zusammenfassend konnte durch die erhaltenen Ergebnisse ausgeschlossen werden, dass der Mechanismus der Translationsinitiation an Transkripten mit 5´-UTR ohne SD-Sequenz ein Scanning-Mechansimus wie bei Eukaryonten ist. Neben der Translationsinitiation an Transkripten ohne 5´-UTR und an Transkripten mit SD-Sequenz existiert also noch ein dritter, bis jetzt unbekannter Mechansimus zur Translationsinitiation in Haloarchaea. In initialen Versuchen zur genaueren Charakterisierung der drei verschiedenen Translationsinitiationsmechanismen, wurden Konstrukte hergestellt, bei denen alle drei verschiedenen Startkodons auf einer mRNA vorhanden sind. Es wurden erste Hinweise darauf gefunden, dass Stressbedingungen einen Einfluss auf die unterschiedlichen Initiationsmechansimen haben. Anders als erwartet führte die Mutation einer natürlichen SD-Sequenz nicht zu einer verminderten Translationseffizienz am entsprechenden Startkodon. Die Bestimmung des 5´-Endes eines Transkripts mit in silico vorhergesagter SD-Sequenz offenbarte, dass das Transkript keine 5´-UTR und somit auch keine SD-Sequenz besaß. Beide Ergebnisse machen deutlich, dass SD-Sequenzen eine noch viel geringere Rolle bei der haloarchaealen Translationsinitiation spielen, als anhand der Sequenz und UTR Analysen angenommen werden konnte.
Photosystem (PS) I is a huge membrane protein complex which coordinates around 200 co-factors. Upon light excitation a charge separation at the PS I reaction centre is induced which leads to an electron transport across the thylakoid membrane and the generation of redox equivalents needed for several biochemical reactions, e.g. the synthesis of sugars. For higher plants and cyanobacteria the crystal structure of PS I complexes were resolved to resolutions of 4.4 Å and 2.5 Å. Furthermore, supramolecular structures of PS I of eukaryotic algae, mainly of the green line, were obtained recently. However, up to now, no structure of diatoms is available yet. Diatoms are key players in global primary production and derived from a secondary endosymbiosis event. Their chloroplasts are surrounded by four envelope membranes and their thylakoids are evenly arranged in bands of three, i.e. no separation in grana and stroma regions is apparent. In this thesis a protocol was developed to isolate a functional PS I complex of diatoms which can be used for structural analysis by transmissional electron microscopy (TEM). A photosystem I-fucoxanthin chlorophyll protein (PS I-FCP) complex was isolated from the pennate diatom Phaeodactylum tricornutum by ion exchange chromatography. Spectroscopic analysis proved that bound Fcp polypeptides function as a light-harvesting complex. An active light energy transfer from Fcp associated pigments, Chl c and fucoxanthin, towards the PS I core was proven by fluorescence spectroscopy. Oxidised minus reduced difference spectroscopy evidenced the activity of the PS I reaction centre P700 and yielded a chlorophyll a/P700 ratio of approximately 200:1. These data indicate that the isolated PS I-FCP complex exceeds the PS I cores from cyanobacteria and higher plants in the numbers of chlorophyll a molecules. Because of the strict conservation of PS I cores among organisms the additional 100 chlorophyll a molecules must either be coordinated by Fcps or function as linker molecules between the Fcp antenna and the PS I core as shown for the PS I-LHC I complex of higher plants. To tell something about the structural organisation, the PS I-FCP complex was compared with its cyanobacterial and higher plant counterparts. Whereas cyanobacterial PS I cores aggregate to trimers, usually without associated antennae, higher plant PS I is a monomer and binds additionally two LHC I heterodimers. BN-PAGE and gel filtration experiments showed that also diatoms contain PS I monomers associated with Fcps as light-harvesting antenna. First TEM studies evidenced these observations. Negatively stained PS I-FCP particles had an increased size compared to PS I cores of other organisms. No PS I trimers or higher oligomers have been found. The calculated diameter and shape of the particles correspond to PS I-LHC I particles obtained from green algae, which also comprise of a higher number of LHC I polypeptides compared to the higher plant x-ray structure. Additionally, the analysis of polypeptides indicates that the PS I associated Fcps differ from the free Fcp pool and also from Fcps of a PS II enriched fraction. The assumption that diatoms harbour just one Fcp antenna that serve both Photosystems equally seems to be wrong. To further study the association of Fcps with the two Photosystems, both complexes plus the free FCP complexes were isolated from the centric diatom Cyclotella meneghiniana. Because of the availability of antibodies directed against specific Fcp polypeptides of Cyclotella the PS I-FCP complex of Phaeodactylum could not be used. A trimeric FCP complex, FCPa, and a higher FCP oligomer, FCPb, have already been described for C. meneghiniana. The latter is assumed to be composed of only Fcp5, whereas the FCPa contains Fcp2 and Fcp6. Biochemical and spectroscopical evidences revealed a different subset of associated Fcp polypeptides within the isolated photosystem complexes. Whereas the PS II associated Fcp antenna resembles FCPa, at least three different Fcp polypeptides are associated with PS I. By re-solubilisation of the PS I complex and a further purification step Fcp polypeptides were partially removed from PS I and both fractions were analysed again by biochemical and spectroscopical means, as well as by HPLC. Thereby Fcp4 and a so far undescribed 17 kDa Fcp were found to be strongly coupled to PS I, whereas another Fcp, presumably Fcp5, is only loosely bound to the PS I core. Thus an association of FCPb and PS I is assumed.
Quantitative analysis of snoRNA association with pre-ribosomes and release of snR30 by Rok1 helicase
(2008)
In yeast, three small nucleolar RNAs (snoRNAs) are essential for the processing of pre-ribosomal RNA—U3, U14 and snR30—whereas 72 non-essential snoRNAs direct site-specific modification of pre-rRNA. We applied a quantitative screen for alterations in the pre-ribosome association to all 75 yeast snoRNAs in strains depleted of eight putative helicases implicated in 40S subunit synthesis. For the modification-guide snoRNAs, we found no clear evidence for the involvement of these helicases in the association or dissociation of pre-ribosomes. However, the DEAD box helicase Rok1 was required specifically for the release of snR30. Point mutations in motif I, but not in motif III, of the helicase domain of Rok1 impaired the release of snR30, but this was less marked than in strains depleted of Rok1, and resulted in a dominant-negative growth phenotype. Dissociation of U3 and U14 from pre-ribosomes is also dependent on helicases, suggesting that release of the essential snoRNAs might differ mechanistically from release of the modification-guide snoRNAs. Keywords: ribosome biogenesis; RNA helicase; snoRNA
Genetic engineering of baker’s and wine yeasts using formaldehyde hyperresistance-mediating plasmids
(1997)
Yeast multi-copy vectors carrying the for maldehyde-resistance marker gene SFA have proved to be a valuable tool for research on industrially used strains of Saccharomyces cerevisiae. The genetics of these strains is often poorly understood, and for various reasons it is not possible to simply subject these strains to protocols of genetic engineering that have been established for laboratory strains of S. cerevisiae. We tested our vectors and protocols using 10 randomly picked baker’s and wine yeasts all of which could be transformed by a simple protocol with vectors conferring hyperresistance to formaldehyde. The application of formaldehyde as a selecting agent also offers the advantage of its biodegradation to CO2 during fermentation, i.e., the selecting agent will be consumed and therefore its removal during down-stream processing is not necessary. Thus, this vector provides an expression system which is simple to apply and inexpensive to use. Key words: · Yeast · Transformation · Hyperresistance to formaldehyde
Meeting Abstract Es wurde eine zellbasierte Wundauflage mit Keratinozyten und Fibroblasten auf Basis einer kommerziellen Wundauflage (Matriderm, Collagen/Elastin-Matrix) generiert, um damit großflächige Verbrennungswunden behandeln zu können. Zunächst wurde die Expansion der Keratinozyten optimiert und die Zeit für die Anzüchtung minimiert. Ausgangsmaterial waren 1–2 cm2 Spalthaut vom Patienten. Epidermis und Dermis wurden nach einer enzymatischen Behandlung mit Thermolysin voneinander getrennt. Aus den beiden Hautkompartimenten wurden durch Trypsin- und Kollagenase I-Behandlung Keratinozyten und Fibroblasten isoliert, welche in Kollagen I-beschichteten Zellkulturflaschen expandiert wurden. Nach 10 Tagen wurden die Fibroblasten auf 100 cm2 Matriderm aufgebracht. Nach einwöchiger submerser Kultivierung wurden die Keratinozyten ausgesät. Eine Woche später wurde die Matrix an die Luft-Flüssigkeitsgrenze angehoben, um die epidermale Differenzierung einzuleiten. Nach 16 Tagen wurde das Hautäquivalent fixiert und immunhistologisch sowie elektronen-mikroskopisch begutachtet. Die Histologie zeigte eine regelgerechte Stratifizierung des epidermalen Anteils. Immunhistologisch ließ sich eine Basalmembran mit Collagen IV und Laminin 5 nachweisen. Proliferative Zellen, nachgewiesen mit KI-67 befanden sich lediglich in der basalen Region der Epidermis. Desmoglein, sowie die Differenzierungsmarker Involucrin und CK 10 wurden suprabasal nachgewiesen. Elektronenmikroskopisch waren die Basalmembran sowie die Zell-Zell-Verbindungen in Form von Desmosmen zu erkennen. Späte Differenzierungsmerkmale, wie granuläre Strukturen und verdickte Zellmembranen, fanden sich im Str. granulosum und Str. corneum. Die Studie zeigt, dass man aus Matriderm eine zellbasierte Wundauflage herstellen kann, die verglichen mit dem Ausgangsmaterial um den Faktor 50–100 vergrößert ist und deren Aufbau normaler Haut weitgehend entspricht.
Fragestellung Intoleranzreaktionen auf nicht-steroidale Antiphlogistika sind häufig und basieren auf der Hemmung des Enzyms Cyclooxygenase-1 (COX-1), wohingegen deren therapeutische Effekte auf einer COX-2 Hemmung beruhen. In dieser Studie wurde die Verträglichkeit des selektiven COX-2 Inhibitors Celecoxib bei Patienten mit Intoleranzreaktionen auf nicht-steroidale Antiphlogistika untersucht. Methodik Bei 77 Patienten (24 Männer, 53 Frauen) mit Intoleranzreaktionen auf nicht-steroidale Antiphlogistika wurden standardisierte Hauttestungen (Prick, Scratch, Epikutantestung) sowie anschließend orale fraktionierte Placebo-kontrollierte einfach blinde Expositionstestungen unter Einschluß von Celecoxib (maximale Einzeldosis 200mg, kumukative Tagesdosis 350mg) durchgeführt. Ergebnisse 21 Patienten wiesen anamnestisch lediglich Hautsymptome (Urtikaria) auf, 25 Patienten nur eine Atemwegssymptomatik (Asthma), bei 18 Patienten traten Haut- und Atemwegssymptome auf, und bei 13 Patienten war es zu einem anaphylaktischen Schock gekommen. Azetylsalizylsäure war in 38 Fällen ein Auslöser der Beschwerden. In 46 Fällen verursachten mehrere nicht-steroidale Antiphlogistika chemisch unterschiedlicher Gruppen die Symptomatik. Die orale Expositionstestung mit Celecoxib verlief bei allen 77 Patienten unauffällig. Schlußfolgerung Vor dem Hintergrund der hohen Inzidenz von Intoleranzreaktionen gegen nicht-steroidale Antiphlogistika stellt der Einsatz selektiver COX-2 Inhibitoren eine therapeutische Alternative sowie eine geeignete Maßnahme zur Prävention entsprechender Reaktionen dar.
Tiere und Menschen sind für das tägliche Überleben auf eine schnelle Bewertung und flexible Nutzung verschiedenster Umweltreize angewiesen. So nutzen Vögel, wie viele andere Tiere, sowohl den Magnetsinn als auch die Geometrie der Umgebung und Landmarken, um sich im Raum zu orientieren. Auch erfolgt eine schnelle und komplexe Auswertung des visuellen Inputs, beispielsweise, um bei der Futtersuche selektiv Futterkörner finden zu können. Unklar ist bislang, wie Raum- und Objektinformation in den beiden Hirnhälften verarbeitet werden und wie die Aufgabenteilung zwischen den Hemisphären aussieht. Zur Klärung dieser Thematik soll die vorliegende Arbeit beitragen, wobei die Versuche so angelegt wurden, dass mögliche, grundlegende Verarbeitungsstrategien unter zwei Gesichtspunkten betrachtet werden konnten: Zum einen wurden den Tieren prinzipiell unterschiedliche Aufgaben präsentiert, um über verschiedene Bereiche auf dem Gebiet der Raum- und Objektverarbeitung hinweg vergleichen zu können. Zum anderen wurde mit den beiden zurzeit wichtigsten Vogelmodellen gearbeitet, der Brieftaube (Columba livia) und dem Haushuhnküken (Gallus gallus). Dies erlaubt einerseits den Vergleich eigener Ergebnisse mit anderen Befunden innerhalb derselben Art, während andererseits auch Parallelen und Unterschiede zwischen verschiedenen Arten betrachtet werden können. Vögel eignen sich hierbei aufgrund ihrer Anatomie besonders gut für die Erforschung von Hemisphärenunterschieden. Durch ein nahezu vollständiges Überkreuzen der Sehnerven und das Fehlen eines Corpus callosum oder anderer funktionell entsprechender Strukturen zum Informationsaustausch zwischen den Hirnhälften wird der visuelle Input eines Auges überwiegend in der gegenüberliegenden Hirnhälfte verarbeitet. Lateralisation kann daher sehr leicht durch Abdecken eines Auges untersucht werden. Bei Brieftauben wurde die Repräsentation von Geometrie und Landmarken untersucht (Kapitel 2). Die Tiere lernten hierbei, das Zentrum einer quadratischen Arena mithilfe rein geometrischer Hinweise oder mittels einer Kombination von Geometrie und Landmarken zu finden. Durch Verändern der verfügbaren Informationsart wurde untersucht, welche Informationen die Tauben zum Lokalisieren des Zentrums nutzten. Die Ergebnisse zeigen mit einer beidseitigen Verarbeitung ein qualitativ anderes Muster der Repräsentation von Rauminformationen als bislang bei anderen Arten, wie z.B. dem Haushuhnküken, beschrieben. Ferner hing der relative Gebrauch von Geometrie und Landmarken in starkem Maße von der vorherigen Erfahrung der Tauben ab. In einer weiteren Studie wurde die Verarbeitung von Magnetkompassinformation bei Brieftauben untersucht (Kapitel 3). Hierbei wurde erstmals erfolgreich ein Versuchsdesign zur Laboruntersuchung entwickelt. Auch bei dieser Raumkognitionsaufgabe wurde ein Unterschied zu der bei anderen Arten gefundenen linkshemisphärischen Spezialisierung zugunsten einer Verarbeitung sowohl in der linken als auch in der rechten Hirnhälfte gefunden. Während die Tauben hierbei mit der rechten Hirnhälfte lediglich die richtige Achse wahrnahmen, erfassten sie mit der linken Hemisphäre die spezifische Richtung. Dies könnte die gefundene linkshemisphärische Überlegenheit im Freiland erklären. Erstmals bei Vögeln wurde beim Haushuhnküken in einem weiteren Versuch die hemisphärische Verarbeitung von Raumfrequenzinformation untersucht, die sowohl für die visuelle Raumorientierung als auch für das Objekterkennen von großer Bedeutung ist (Kapitel 4). Die Raumfrequenz ist hierbei allgemein als ein Maß für die Wiederholungen einer Struktur über eine bestimmte Strecke definiert und kann zur Charakterisierung beliebig komplexer Objekte verwendet werden. Die Küken wählten zwischen simultan dargebotenen Objekten, deren Oberflächen sich hinsichtlich ihrer Raumfrequenzen unterschieden. Die Ergebnisse weisen auf eine Spezialisierung der linken Hirnhälfte für hohe und der rechten Hirnhälfte für niedrige Raumfrequenzen hin. Aufgrund der Parallelen zu Befunden beim Menschen könnte dies auf eine gemeinsame Grundlage der Lateralisationsentwicklung bei Wirbeltieren hindeuten. Während sich die vorangehenden Studien der vorliegenden Arbeit mit Spezialisierungen der linken und rechten Hirnhälfte bei der Verarbeitung von Raum- und Objektinformation befassten, wurde in Kapitel 5 das Zusammenwirken von linker und rechter Hirnhälfte bei der selektiven Nahrungssuche untersucht. Hierbei konnte am Beispiel des Haushuhnkükens erstmals bei Vögeln Hemisphärenkooperation gezeigt werden, was als Hinweis darauf zu werten ist, dass eine bilaterale Repräsentation im Vogelhirn in komplexen Situationen, die eine rasche und effiziente Beurteilung des gesamten überschaubaren Bereichs erfordern, möglich ist. Insgesamt zeigen die Ergebnisse für mehrere wichtige Fragen der Lateralisationsforschung wie die Erfahrungsabhängigkeit, den Nachweis unterschiedlicher Lateralisationsmuster bei Brieftauben und Haushuhnküken in der geometrischen Orientierung oder die Kooperation der Hirnhemisphären, dass bisherige Ansichten über die Verarbeitung von Raum- und Objektinformation bei Vögeln einer kritischen Überarbeitung bedürfen.
Zusammenfassung (in German) Rostpilze sind obligate Parasiten auf vielen holzigen und krautigen Pflanzen und führen weltweit zu ernsten ökonomischen Schäden in der Landwirtschaft. Weltweit sind zurzeit sind ca. 100 Gattungen und 9000 Arten von Rostpilzen (Pucciniales, Basidiomycota) bekannt. Es gibt fünf verschiedene Entwicklungsstadien mit je eigener Morphologie: Spermogonium, Aecidium, Uredosporenlager, Teleutosporenlager und Basidium. Bei vielen Rostpilzen kommt es im Entwicklungsgang zu einem Wechsel zwischen zwei verschiedenen Wirtsarten. Die Spermogonien werden auf einem haploiden Myzel erzeugt, das sich nach der Infektion des Pflanzengewebes durch Basidiosporen entwickelt. In den Spermogonien entwickeln sich einzellige, monokaryotische, hyaline Spermatien, die in einem süßlichen Exudat ausgeschieden werden. Das Aecidium bildet einzellige, dikaryotische Aecidiosporen in Ketten. Bei der Keimung entwickeln sie dikaryotische Hyphen, welche entweder Uredosporen- oder Teleutosporenlager, aber nicht wieder Aecidien erzeugen. Die Uredosporen der Uredosporenlager dienen der Massenausbreitung, Infektion derselben Wirtsart und wiederholten Bildung neuer Uredosporenlager. Das Ornament der Uredosporen ist variabel: echinulat, verrucos, gestreift verrucos, zerfurcht, runzelig, labyrinthisch, pseudoreticulat oder reticulat. Teleutosporenlager und Teleutosporen sind das wichtigste Stadium für allgemeine Unterscheidungen und die Nomenklatur von Rostpilzen, da sie das sexuelle Stadium repräsentieren. Teleutosporen erzeugen Basidien und Basidiosporen. Teleutosporen sind morphologisch sehr variabel und präsentieren deshalb die nützlichsten zuverlässigen Eigenschaften zur Unterscheidung der Arten. Die Basidien entstehen größtenteils am distalen Ende der Teleutosporenzelle und sind transversal septiert. Die Basidiosporen sitzen auf Sterigmen auf den Basidienzellen und sind globos oder subglobos. Durch die hoch spezifische Abhängigkeit der Rostpilz-Arten von ihren Wirtspflanzen ist die Verbreitung der Rostpilze an die Verbreitung ihrer Wirte gebunden. Jedoch sind vollständige Lebens-Zyklen der Rostarten, mikromorphologische Details der oben genannten Stadien, Spektren der Wirtspflanzen und geographische Verbreitung unvollständig bekannt. Einige dieser offenen Fragen am Beispiel der Rostpilze Panamas zu beantworten ist das Ziel dieser Arbeit. Da für das relativ kleine Land Panama 9.500 Pflanzenarten bekannt sind, wird eine hohe Zahl an Rostpilzarten vermutet. Die Rostpilze Panamas wurden sporadisch von verschiedenen Mykologen studiert. Bis 2007 waren in Panama jedoch lediglich 25 Gattungen und 101 Arten von Rostpilzen bekannt. Für die vorliegende Arbeit wurden in den Jahren 2004 bis 2007 Rostpilze in Panama gesammelt, hauptsächlich in der Provinz Chiriquí im Westen Panamas. Insgesamt wurden 468 Belege geprüft, die 150 verschiedenen Arten von Rostpilzen entsprechen. 233 Belege wurden zwischen 2005 und 2007 im ppMP-Projekt (pflanzenparasitische Mikropilze Panamas) von M. Piepenbring, O. Perdomo, R. Mangelsdorff, T. Trampe und T. Hofmann gesammelt. 76 Belege wurden von M. Piepenbring zwischen 1998 und 2007 gesammelt. 1 Beleg wurde von R. Kirschner (2003) gesammelt. Zusätzlich wurden Belege aus Herbarien konsultiert, 30 Belege aus dem New York Botanical Garden (NYBG), 93 Belege aus den U.S. National Fungus Collections (BPI) und 35 Belege aus der Purdue University (PUR). In dieser Arbeit werden 30 Arten von Rostpilzen aus dem Westen Panamas detailliert beschrieben und durch rasterelektronenmikroskopische Aufnahmen und Zeichnungen illustriert. Zwei davon sind neue Arten: Puccinia urochloae auf Urochloa decumbes (Poaceae) und Uromyces melampodii auf Melampodium costaricense (Asteraceae). Puccinia urochloae unterscheidet sich von den bekannten Puccinia-Arten durch diorchidioide Teleutosporen, Teleutosporenmaße sowie Paraphysen und Uromyces melampodii von anderen Uromyces-Arten durch die Teleutosporenmaße und Wirtsgattung. 28 Arten werden erstmalig für Panama dokumentiert: für Aecidium psychotriae auf Psychotria cf. carthagenensis (Rubiaceae), für Coleosporium verbesinae auf Verbesina gigantea (Asteraceae), für Crossopsora byrsonimatis auf Byrsonima crassifolia (Malphigiaceae), für Crossopsora uleana auf Solanum trizygum (Solanaceae), für Puccinia cordiae auf Cordia alliodora (Boraginaceae), für Puccinia cyperi-tagetiformis auf Cyperus odoratus (Cyperaceae), für Puccinia enixa auf Baccharis cf. pedunculata, für Puccinia inaudita auf Wedelia inconstans (Asteraceae), für Puccinia psidii auf Syzygium jambos (Myrtaceae), für Puccinia sp. 1 auf Aulonemia patriae (Poaceae), für Puccinia sp. 2 auf Carex longii (Cyperaceae), für Pucciniosira dorata auf Triumfetta bogotensis (Malvaceae), für Uredo ficina auf Ficus sp. (Moraceae), für Uredo hydrocotyles auf Hydrocotyle mexicana (Apiaceae), für Uredo incomposita auf Eleocharis sp. (Cyperaceae), für Uredo jatrophicola auf Jatropha curcas (Euphorbiaceae), für Uredo kyllingiae auf Kyllinga cf. odorata (Cyperaceae), für Uredo melinidis auf Melinis minutiflora (Poaceae), für Uredo notata auf Byrsonima crassifolia (Malpighiaceae), für Uredo peperomiae auf Peperomia glabella (Piperaceae), für Uredo proeminens auf Euphorbia heterophylla and E. hyssopifolia (Euphorbiaceae), für Uredo rubescens auf Dorstenia contrajerva (Moraceae), für Uredo yucatanensis auf Mimosa albida (Fabaceae), für Uromyces bidenticola auf Bidens pilosa (Asteraceae), für Uromyces ictericus auf Iresine celosiae (Amaranthaceae), für Uromyces sp. 1 auf Struthanthus sp. (Loranthaceae) und für Uromyces trifolii-repentis auf Trifolium repens (Fabaceae). Die Zahl der für Panama bekannten Rostpilze erhöht sich mit dieser Arbeit von 101 auf 131 Arten. Für fünf andere Rostpilze werden weltweit neue Wirtsarten genannt: Cordia spinescens als Wirt von Alveolaria cordiae, Eupatorium odoratum als Wirt von Cionothrix praelonga, Xylopia grandiflora als Wirt von Dasyspora gregaria, Cyperus diffusus als Wirt von Puccinia subcoronata, und Calathea indecora als Wirt von Puccinia thaliae. Die Artenvielfalt von Pflanzen in den Tropen ist noch nicht vollständig bekannt, und man kann keine Voraussagen machen oder feststellen, ob ein Gebiet artenreicher ist als andere. Die bescheidene Dokumentation von Rost-Pilzen in Panama beruht auf einem Mangel an Inventuren im Gebiet. Die in Panama am häufigsten vertretenen Wirts-Familien sind die Asteraceae, Cyperaceae, Fabaceae und Poaceae. Die Asteraceae, mit 303 Arten die sechstgrößte Pflanzenfamilie in Panama, haben die größte Zahl der Wirtsarten von Rost-Pilzen in Panama mit 24 Rostarten, nämlich in den Gattungen Cionothrix, Coleosporium, Dietelia, Endophyllum, Puccinia und Uromyces. Die Fabaceae jedoch präsentieren die höchste Zahl der Rost-Gattungen in Panama (Ateloucada, Dicheirinia, Phakopsora, Puccinia, Uraecium, Uredo, Uromyces und Uropyxis) mit 23 Rostarten. Die Fabaceae sind mit einer Gesamtzahl von 487 Arten in Panama die zweitgrößte Pflanzenfamilie. In dieser Studie wurden rasterelektronenmikroskopische Beobachtungen der Morphologie und Ornamentierung von Sporen durchgeführt. Echinulate und verrucose Ornamentierung sind mit dem Lichtmikroskop bei gewissen Arten von Pilzen schwierig zu unterscheiden. Das beobachtete Ornament ist jeweils spezifisch für die Art. Die asexuell gebildeten Uredosporenlager und Uredosporen sind in der Regel das zahlenmäßig am häufigsten anzutreffende Entwicklungsstadium und seine Merkmale sind genügend unveränderlich und unterschieden, um sie taxonomisch zu verwenden. Die taxonomisch nützlichsten Eigenschaften von Uredosporen sind: die Form und Größe der Spore, die Farbe und Stärke der Sporen-Wand, ihre Oberflächenornamentierung, die Zahl und Verteilung der Keimporen. Die Anwesenheit von Paraphysen ist bei Rost-Pilzen taxonomisch nicht wichtig. In den beobachteten Belegen sind Paraphysen sowohl in Uredo- als auch in Teleutosporenlagern vorhanden, allerdings am häufigsten in Uredosporenlagern. Bestimmte Merkmale der Paraphysen können jedoch taxonomisch wichtig sein. In unserer Analyse fanden wir Arten mit pigmentierten Paraphysen bei Crossopsora uleana, Puccinia sp. 1, Uredo jatrophicola, Uredo yucatanensis und Uromyces melampodii. Crossopsora uleana hat verzweigte Paraphysen. Für die Identifikation der Rostpilze ist es notwendig und wesentlich, die Wirtspflanzen zu identifizieren. Dennoch können viele Pflanzenproben nicht leicht identifiziert werden, da viele steril sind, und in den meisten Fällen sind blühende oder fruchtenden Teile für die Pflanzenbestimmung wesentlich. Viele Rostpilzarten wurden in der Vergangenheit sehr knapp und unvollständig, mit irreführenden Angaben und ungenauen Wirtsdaten beschrieben. Rostpilze können im Feld leicht erkannt werden. Es gibt wenige Ausnahmen, die mit anderen pathogenen Pilzen verwechselt werden können. Solch ein Beispiel ist Stigmina anacardii, ein imperfekter Pilz mit oberflächlich ähnlicher Morphologie wie Rostpilze, aber mit Beziehung zu den Ascomycota. Basidien und Basidiosporen von Alveolaria cordiae werden erstmals illustriert und dokumentiert. Am Beispiel von Dasyspora gregaria konnte erstmals eine fein warzige Ornamentierung der Basidiosporen bei Rostpilzen aufgezeigt werden. Resumen (in Spanish) Especies de Pucciniales son hongos parásitos de plantas del grupo Basidiomycota. En esta tesis 30 especies de Pucciniales recientemente colectadas en el Oeste de Panama se presentan con descripciones detalladas, microscopia electrónica de barrido y dibujos. De estas, 2 son nuevas especies: Puccinia urochloae y Uromyces melampodii. Además, 28 especies se citan por primera vez para Panama: Aecidium psychotriae, Coleosporium verbesinae, Crossopsora byrsonimatis, Crossopsora uleana, Puccinia cordiae, Puccinia cyperi-tagetiformis, Puccinia enixa, Puccinia inaudita, Puccinia paupercula, Puccinia psidii, Puccinia sp. 1, Puccinia sp. 2, Pucciniosira dorata, Uredo ficina, Uredo hydrocotyles, Uredo incomposita, Uredo jatrophicola, Uredo kyllingiae, Uredo melinidis, Uredo notata, Uredo peperomiae, Uredo proeminens, Uredo rubescens, Uredo yucatanensis, Uromyces bidenticola, Uromyces ictericus, Uromyces sp. 1 y Uromyces trifolii-repentis. Asi el numero de especies de Pucciniales conocidas para Panama aumenta de 101 a 131. En 5 especies diferentes de hongos se descubrieron nuevas especies en plantas hospederas: Cordia spinescens para Alveolaria cordiae, Eupatorium odoratum para Cionothrix praelonga, Xylopia gradiflora para Dasyspora gregaria, Cyperus diffusus para Puccinia subcoronata, y Calathea indecora para Puccinia thaliae. La especie Dasyspora gregaria es reportada con basidiosporas finamente verrucosas por primera vez en royas y la especie Alveolaria cordiae, una especie pobremente conocida es reportada, descrita e ilustrada con detalles por primera vez sobre Cordia spinescens en Panama.
Die maligne Transformation von Zellen beruht auf der Mutation von Genen, die entartete Zellen der regulierenden Wachstumskontrolle entziehen, ihre Versorgung sicher stellen und sie unempfindlich gegen apoptoseinduzierende Signale machen (Hanahan und Weinberg, 2000). Klassische Behandlungsmethoden wie Strahlen- und Chemotherapie wirken häufig über die Aktivierung apoptotischer Signalwege, die jedoch in behandlungsresistenten Tumorzellen blockiert sein können. Das selektive Einbringen proapoptotischer Proteine in Tumorzellen stellt daher eine vielversprechende Strategie zur Umgehung solcher Blockaden dar. In dieser Arbeit wurden tumorspezifische Antikörperfusionsproteine generiert, die humane Zelltod auslösende Proteine als Effektorfunktion enthalten. Das mitochondriale Protein „apoptosis inducing factor“ (AIF) wird durch diverse Apoptosesignale in das Zytoplasma freigesetzt. AIF leitet nach der Translokation in den Zellkern Chromatinkondensation und Degradation der nukleären DNA ein (Cande et al., 2004b). Zur selektiven Einschleusung von zytoplasmatischem AIF (AIF!100) in ErbB2 exprimierende Tumorzellen wurde es an das ErbB2-spezifische „single chain“ Antikörperfragment scFv(FRP5) fusioniert, welches von dem monoklonalen Antikörper FRP5 abgeleitet ist (Wels et al., 1992b). Daneben enthält ein zunächst generiertes AIF!100-DT183-378-5 Fusionsprotein eine Translokationsdomäne aus Diphtherietoxin (AA 183-378) als mögliche „endosome escape“ Aktivität. Diese Domäne sollte der Effektordomäne nach rezeptorvermittelter Aufnahme den Übergang in das Zytoplasma erlauben. Die Expression dieses Moleküls in E. coli und der Hefe Pichia pastoris führte jedoch nicht zu funktionellen AIF!100-DT183-378-5 Proteinen. Daher wurde für nachfolgende Arbeiten ein ähnliches AIF-Fusionsprotein (5-E-AIF!100) aus früheren Arbeiten unserer Gruppe eingesetzt und sein Wirkmechanismus eingehend untersucht. Im Gegensatz zu AIF!100-DT183-378-5 enthält 5-E-AIF!100 die Translokationsdomäne aus Pseudomonas Exotoxin A. Bakteriell exprimiertes, gereinigtes und renaturiertes 5-E-AIF!100 zeigte eine hohe Spezifität für ErbB2 exprimierende Tumorzellen. Im Gegensatz zu unfusioniertem AIF!100 induzierte 5-E-AIF!100 nach Mikroinjektion in das Zytoplasma der Zielzellen keine Apoptose. Dies deutet darauf hin, dass möglicherweise die N-terminale Antikörperdomäne die proapoptotische Aktivität der AIF-Domäne blockiert. Erst die rezeptorvermittelte Aufnahme von 5-E-AIF!100 in Anwesenheit von Chloroquin resultierte in einer hohen Zytotoxizität. Auf diesem Weg wird sehr wahrscheinlich durch proteolytische Spaltung der innerhalb der Translokationsdomäne vorhandenen Furin-Schnittstelle der N-terminale Bereich des Fusionsproteins entfernt. Die eigentliche Translokation der AIF-Domäne findet jedoch ohne die Zugabe endosomolytischer Reagenzien nicht statt, was für eine unzureichende Aktivität der Translokationsdomäne spricht. Die vollständige Entfernung der Translokationsdomäne führte dennoch zu einem AIF-Fusionsprotein, das weder in Abwesenheit noch in Gegenwart von Chloroquin zytotoxisch aktiv ist (Dälken, 2005). Somit ist die in der Translokationsdomäne enthaltene Furin- Schnittstelle sehr wahrscheinlich für die Aktivierung von 5-E-AIF!100 von entscheidender Bedeutung. Im Fall des natürlichen Exotoxin A ist zusätzlich zu der in 5-E-AIF!100 verwendeten Translokationsdomäne ein C-terminales ER-Retentionssignal für einen effizienten Übertritt der katalytisch aktiven Toxindomäne ins Zytoplasma notwendig (Jackson et al., 1999). Das Anfügen eines KDEL-Signals an den C-Terminus von 5-E-AIF!100 führte jedoch nicht zur Erhöhung der „endosome escape“ Aktivität der Translokationsdomäne. Die ladungsabhängige DNA-Bindungsaktivität von AIF ist für die proapoptotische Funktion des Proteins essentiell. Bindung an DNA wurde auch für 5-E-AIF!100 nachgewiesen, und konnte durch Vorinkubation mit negativ geladenem Heparin inhibiert werden. Die Komplexierung mit Heparin führte zu einer erheblichen Reduktion der zytotoxischen Aktivität von 5-E-AIF!100. Mit großer Wahrscheinlichkeit ist die Abschwächung der Zytotoxizität auf die intrazelluläre Inhibition der AIF/DNA-Interaktion zurückzuführen. Dies bestätigt, dass diese Wechselwirkung für die zelltodinduzierende Eigenschaft von 5-E-AIF!100 von Bedeutung ist. Die Freisetzung Immuntoxin-ähnlicher Proteine, die sich nach rezeptorvermittelter Aufnahme in endosomalen Kompartimenten finden, erfordert häufig die Zugabe endosomolytischer Reagenzien. Um eine von endosomolytischen Reagenzien unabhängige Zytotoxizität der Antikörperfusionsproteine zu erreichen, wurden in dieser Arbeit Möglichkeiten zur Umgehung dieser Abhängigkeit untersucht. Hierzu wurde die Natürliche Killerzelllinie NK-92 eingesetzt. Die Eliminierung von infizierten und transformierten Zellen durch NK-Zellen geschieht hauptsächlich über die Ausschüttung von zytotoxischen Granula, die das porenbildende Protein Perforin und verschiedene Serinproteasen wie Granzym B (GrB) enthalten (Atkinson et al., 1990; Smyth et al., 2001). Dabei ist Perforin für die zytosolische Translokation der Proteasen verantwortlich (Browne et al., 1999). Anhand des Modellproteins Granzym B-scFv(FRP5) (GrB-5) wurde untersucht, ob Antikörperfusionsproteine mit Hilfe von Perforin in das Zytoplasma der Zielzellen gelangen können. GrB-5 wurde in NK-92 Zellen unter Beibehaltung der Spezifität und enzymatischen Aktivität exprimiert. GrB-5 ist wie Wildtyp GrB in zytotoxischen Granula lokalisiert und wird nach der Degranulation sehr wahrscheinlich zusammen mit Perforin sekretiert. Freigesetztes GrB-5 zeigte Bindung an ErbB2 exprimierende Zellen. Zudem wiesen Überstände von aktivierten NK-92 Zellen, die GrB-5 und Perforin enthielten, im Vergleich zu Überständen von Kontrollzellen eine höhere Zytotoxizität gegenüber ErbB2-positiven Tumorzellen auf. Dies lässt darauf schließen, dass GrB-5 in Abwesenheit exogener endosomolytischer Reagenzien durch einen Perforin-vermittelten Mechanismus in die Zielzellen gelangen konnte. Weiterhin wurden NK-92 Zellen generiert, die den GrB-Inhibitor Protease Inhibitor-9 (PI-9) exprimieren. Diese Zellen zeigten im Vergleich zu parentalen Zellen eine höhere Zytotoxizität, die sich auf eine verbesserte Inaktivierung fehlgeleiteter, zytoplasmatischer GrB-Moleküle durch das ektopisch exprimierte PI-9 zurückführen lässt. NK-92-PI-9 Zellen könnten genutzt werden, um größere Mengen von GrB-Fusionsproteinen zu exprimieren, ohne dabei die Zellen durch die Erhöhung der zytoplasmatischen GrB-Konzentration zu gefährden. Die in dieser Arbeit gewonnenen Ergebnisse zeigen, dass AIF für den Einsatz als Effektorfunktion in Immuntoxin-ähnlichen Fusionsproteinen geeignet ist. Die Anwendung von NK-Zellen zur Expression und Sekretion tumorspezifischer Antikörperfusionsproteinen zusammen mit Perforin zeigt einen möglichen Lösungsweg für das generelle Aufnahmeproblem von Immuntoxin-ähnlichen Proteinen. Die erzielten Ergebnisse können nun für die weitere Optimierung humanisierter Antikörperfusionsproteine genutzt werden.
Das Leben aller Organismen wird grundlegend durch den tages- und jahreszeitlich bedingten Wechsel der Beleuchtungsverhältnisse geprägt. Die Anpassung der Stoffwechselprozesse und Verhaltensweisen an diese Oszillationen erfolgt nicht passiv, sondern wird durch eine innere Uhr gesteuert. Tageszeitliche Rhythmen, die auch ohne den Einfluss äußerer, periodisch verlaufender Umgebungsreize (Zeitgeber) ablaufen, werden als zirkadiane Rhythmen bezeichnet. Im Säugetier steuert ein endogener Rhythmusgenerator im Nucleus suprachiasmaticus (SCN) zirkadiane Rhythmen, indem er periphere Oszillatoren miteinander synchronisiert. Auf molekularer Ebene besteht dieser endogener Rhythmusgenerator aus Aktivatoren (BMAL1 und CLOCK/NPAS2) und Inhibitoren (PER1/2 und Cry1/2), die in Rückkopplungsschleifen die Grundlage für die Rhythmogenese steuern. Die Synchronisation dieses molekularen Uhrwerkes an die Umgebungszeit erfolgt durch Licht, das in der Retina wahrgenommen und an das SCN weitergeleitet wird. Die Signaltransduktionskaskaden nach einem Lichtpuls in der frühen und der späten Nacht unterscheiden sich dabei wesentlich: Ein Lichtpuls während der frühen Nacht führt zu einer erhöhten Freisetzung von Ca2+-Ionen über Ryanodin Rezeptoren (RYR), während ein Lichtpuls während der späten Nacht zu einer erhöhten Guanylylcyclase Aktivität führt. Um zu untersuchen, wie der endogene Rhythmusgenerator seinen Lichteingang reguliert, wurde die Licht-vermittelte Phasenverzögerung in BMAL1+/+- (profizienten) und BMAL1-/-- (defizienten) Mäusen untersucht. Die Befunde aus den in-situ Hybridisierungsstudien, RTQ-PCR und immunhistochemischen Untersuchungen dieser Arbeit zeigten, dass in BMAL1-/--Mäusen die Licht-induzierte mPer-Expression während der frühen Nacht selektiv beeinträchtigt ist. Zudem konnte gezeigt werden, dass die mRNA- und Proteinmengen von RYRs in BMAL1-/--Mäusen dramatisch reduziert waren. Ryr1:: und Ryr2::Luciferase-Reportersstudien zeigten darüber hinaus, dass die Ryr-Expression durch CLOCK/BMAL1 aktiviert und durch CRY1inhibiert werden kann. Diese Ergebnisse liefern den ersten Beweis dafür, dass der endogene Rhythmusgenerator des Säugers die Signalübertragung seines eigenen Lichteingangs regulieren kann. Weiterhin wurde in dieser Arbeit die ontogenetische Entwicklung des endogenen Rhythmusgenerators im SCN und in einem Melatonin-abhängigen peripheren Oszillator, der PT, untersucht und miteinander verglichen. Dazu wurden die Uhrengenproteine im fetalen (E18), postnatalen (P2 & P10) und adulten SCN und in der PT von C3H-Mäusen zu vier verschiedenen zirkadianen Zeitpunkten mittels Immunhistochemie untersucht. Die Anzahl immunreaktiver SCN-Zellen gegen alle untersuchten Uhrengenproteine (außer BMAL1) war im Fetus signifikant niedriger, als in der adulten Maus. Auch im SCN neonataler (P2) Mäuse erreichte die Anzahl immunreaktiver Zellen noch nicht das Niveau der adulten Maus. Erst 10 Tage nach der Geburt (P10) zeigen alle Uhrengenproteine im SCN ein adultes Verteilungsmuster. Offenbar reift das Uhrwerk im SCN von Mäusen graduell während der postnatalen Entwicklungsphase. Dabei besteht eine zeitliche Korrelation zwischen der Reifung des endogenen Rhythmusgenerators im SCN und der Ausbildung von inter-suprachiasmatischen und retino-suprachiaamatischen neuronalen Kontakten. Im Gegensatz zum SCN zeigte der Melatonin-abhängigen Oszilllator in der PT bereits im Fetus einen nahezu vollständig ausgeprägten Rhythmus der Uhrengenproteine. Da das fetale Pinealorgan noch nicht zur rhythmischen Melatonin-Synthese fähig ist, liegt es nahe, dass das mütterliche Melatonin die rhythmische Expression der Uhrengene in der fetalen PT reguliert. Wie in vitro Untersuchungen an PER2::LUCIFERASE-Mäusen zeigten, hat das mütterliche Melatonin offenbar auch einen modulierenden Einfluss auf den fetalen SCN. Bei diesen Mäusen konnte im fetalen und postnatalen SCN ein zirkadianer Rhythmus in der PER2-Synthese nachgewiesen werden, der eine relativ lange Periodenlänge aufwies und nach 3 Tagen zum Erliegen kam. Eine Stimulation mit Melatonin führte zu einer deutlichen Verkürzung der Periodenlänge im PER2-Rhythmus. Folglich scheint das mütterliche Melatonin eine wichtige Quelle für Informationen der Umgebungszeit im Fetus zu sein. Um die Uhrengenexpression während der Maus-Ontogenese in vitro auf zellulärer Ebene darzustellen, wurde in dieser Arbeit zudem ein vom murinen Per2-Promoter angetriebenes DsRed- Reportersystem etabliert und der Versuch begonnen, eine darauf basierende transgene Maus zu generieren.
Die vaskuläre NADPH-Oxidase ist eine wichtige Quelle für reaktive Sauerstoff-Spezies (ROS). Viele dieser Daten wurden unter Verwendung des Inhibitors Apocynin (4'-Hydroxy-3' methoxyacetophenon) erhoben, dessen Wirkungsweise jedoch nicht bekannt war. In dieser Arbeit wurde der Mechanismus der Hemmung der vaskulären NADPH-Oxidase näher untersucht, sowie nach weiteren Inhibitoren gesucht. In HEK293-Zellen wurden die NADPH-Oxidase-Isoformen Nox1, Nox2, Nox4, Duox1 oder Duox2 überexprimiert und die von den Zellen produzierten Radikale durch verstärkte Chemilumineszenz gemessen. Hierbei wurde festgestellt, dass Apocynin die Produktion von Superoxidanionen nicht hemmt, aber die Detektion von Wasserstoffperoxid- oder Hydroxylradikalen beeinflusst. Wenn die Radikale durch Xanthin/Xanthin-Oxidase oder nicht-enzymatische Systeme generiert wurden, beeinflusste Apocynin direkt die Peroxid-, aber nicht die Superoxid-Detektion. In Leukozyten ist Apocynin ein Pro-Pharmakon, das durch Myeloperoxidase (MPO) aktiviert werden kann. Dieser Prozess führt zur Bildung eines Apocyninradikals, das zu einem Dimer umgewandelt wird. Allerdings kann man aufgrund der hohen Reaktivität des Radikals nur das Dimer nachweisen. Endothelzellen und glatte Muskelzellen sind nicht in der Lage dieses Dimer zu bilden und können daher Apocynin nicht aktivieren. In Nox-überexprimierenden HEK293-Zellen konnte die Dimer-Bildung gezeigt werden, wenn MPO zugegeben wurde. Apocynin kann ohne MPO-Zugabe nur die NADPH-Oxidase in Leukozyten hemmen und wirkt in vaskulären Zellen als Antioxidans. Tatsächlich wurde in vaskulären glatten Muskelzellen die Aktivierung der redoxsensitiven Kinasen p38-MAP-Kinase, Akt und Erk1/2 durch Wasserstoffperoxid und durch den intrazellulären Radikal-Generator Menadion in Anwesenheit von Apocynin verhindert. Des Weiteren wurde untersucht, ob Cyclooxygenase 2 (COX-2), die eine ähnliche Peroxidase-Domäne wie MPO besitzt, mit Apocynin interagiert. Die COX-2-Aktivität wurde durch Apocynin gehemmt. In COX-2 überexprimierenden HEK293- Zellen wurden die Superoxidanion- sowie die Wasserstoffperoxid-Bildung durch Apocynin völlig gehemmt. Allerdings konnte durch die Peroxidaseaktivität von COX-2 Apocynin nicht aktiviert und somit kein Dimer nachgewiesen werden. Diese Beobachtung unterstützt ferner die unspezifische Natur der Nox-Hemmung durch Apocynin.Intravenös appliziertes Apocynin in Mäusen und Schweinen führte zu einer Aktivierung von Apocynin. In vivo wirkt Apocynin somit als möglicher Nox2-Inhibitor und als Antioxidans. Flavonoide, insbesondere die des Katechol-Typs, in dem der B-Ring monomethyliert ist, haben eine ähnliche Struktur wie Apocynin. Daher wurde in dieser Arbeit auch das Potenzial der Flavonoide Epicatechin, 3'-O-Methyl-Epicatechin, Procyanidin B2 und Isorhamnetin als Inhibitoren der NADPH-Oxidase analysiert. Nox-überexprimierende HEK293-Zellen (Nox1, Nox2 sowie Nox4) wurden mit verschiedenen Flavonoiden inkubiert und die ROS-Bildung mittels verstärkter Chemilumineszenz gemessen. Epicatechin und Procyanidin B2 hemmten die Radikal-Detektion der verschiedenen Nox-Isoformen in allen Detektionssystemen. Isorhamnetin hemmte die Radikal-Detektion durch Nox1 nur leicht, allerdings wurde die Bildung der Radikale durch Nox4 und Nox2 fast komplett blockiert. 3'-O-Methyl-Epicatechin wies die schwächste antioxidative Wirkung auf. Es hemmte zwar die Wasserstoffperoxidbildung, jedoch kaum die Nox1- und Nox2-abhängige Superoxidanion-Bildung. Keine der getesteten Substanzen konnte den „respiratorischen Burst“ in mit Phorbolmyristatacetat stimulierten Leukozyten blockieren. Diese Daten deuten darauf hin, dass Apocynin und Katechine potente Antioxidantien für Wasserstoffperoxid, aber keine spezifischen NADPH-Oxidase- Hemmer in vaskulären Systemen sind.
Central America is one of the world’s most herpetological diverse areas in relation to its size. Nicaragua is the largest country in this region and separates Nuclear from Lower Central America. It is one of the least herpetological explored countries in Central America and few studies dealing with the herpetofauna of a potion or the entire country have been published. I here update the checklist of the Nicaraguan herpetofauna, present taxonomic revisions of some difficult species complexes, compare the similarities of the composition of the herpetofaunal communities in the major forest formations present in the country within a zoogeographical context, and identify those species with a greater vulnerability risk in Nicaragua. Taxonomy The herpetofauna of Nicaragua currently consists of 244 species representing 134 genera and 42 families with 78 amphibian species representing 35 genera and 15 families, and 166 reptile species representing 99 genera and 27 families, which includes six marine species. Sixteen species (12 amphibians and four reptiles) are endemic to the country. Of the 12 endemic amphibian species, three are here described. In addition, five genera (Anotheca, Cerrophidion, Duellmanohyla, Isthmohyla, and Rhinobothryum) and two species (Rhadinea godmani and Urotheca decipiens) are known to occur both north and south of Nicaragua although there are no voucher specimens of these taxa to confirm their presence in country. I complete a bibliographic research updating the nomenclature changes and provide a brief herpetological history of Nicaragua, a recompilation of all species described upon Nicaraguan material and their current synonymy, the first time each species was recorded from the country, and a list of all recognized subspecies occurring in Nicaragua. I discuss the taxonomic uncertainties among the Nicaraguan populations of amphibians and reptiles and take further detailed taxonomic revisions on selected Nicaraguan species groups from the genera Anolis, Bolitoglossa, and Craugastor along their known distributional range. I describe five new species of herpetofauna (three of which are based on Nicaraguan material), redescribe five species of Anolis (three of which occur in Nicaragua), and provide voucher specimens of five other species for the first time in Nicaragua. In detail: • I studied the pholidosis, morphometrics as well as hemipenis and dewlap morphology in Anolis wermuthi, an anole endemic to the highlands of northern Nicaragua. I examine patterns of geographic variation using discriminant function analysis and discuss the characters that vary both individually and among populations. The results indicate that A. wermuthi is a single species with several disjunct, slightly divergent populations. I provide a standardized description, illustrations of the everted hemipenis of an adult topotype, the male and female dewlap, and a distribution map. I also provide brief descriptions of the localities where this species occurs and some ecological notes. • I studied the pholidosis, morphometrics as well as hemipenis morphology in the Central American anole species Anolis humilis, A. quaggulus, and A. uniformis. The three taxa are distinct in hemipenis morphology. However, very little differentiation in pholidotic and morphometric characters is documented. I document interspecific variation in several characters but with overlap of the documented ranges. A discriminant function analysis based on five pholidotic characters yielded a scatter diagram that showed large overlap between the clusters of the three taxa. I provide head scalation illustrations, an identification key, a distribution map, and standardized descriptions of the commonly distributed in Nicaragua A. quaggulus as well as of the other two species. • I describe two new species of anoles (genus Anolis) from Panama formerly referred to as Anolis limifrons. The two new species, Anolis apletophallus and Anolis cryptolimifrons, differ from A. limifrons by having a large bilobed hemipenis (small and unilobed in A. limifrons). The new species differ from each other in male dewlap size and coloration. I provide illustrations of the head scalation, everted hemipenis, and dewlap, an identification key, a distribution map, and standardized descriptions of the commonly distributed in Nicaragua A. limifrons and the two new species described herein. • I describe two new species of salamanders of Bolitoglossa from southern Nicaragua. Bolitoglossa indio is known from Río Indio in the lowlands of the Río San Juan area and Bolitoglossa insularis from the premontane slopes of Volcán Maderas on Ometepe Island. The two new species are of unknown affinities but both differ from their congeners in coloration. Bolitoglossa indio is most similar to B. mexicana and B. odonnelli from which differ by having both broad dorsolateral pale brown stripes not clearly delimited in outline. Bolitoglossa insularis is most similar to B. mombachoensis and B. striatula from which differ by the absence of dark or light defined stripes on dorsum and venter. • I describe a new species of frog of the genus Craugastor from Río San Juan, Nicaragua. The new species, Craugastor chingopetaca, is assigned to the fitzingeri group and differs from most Central American species of that group by the absence of a midgular pale stripe. Within the fitzingeri group it is most similar to C. crassidigitus and C. talamancae from which it differs in several morphological characteristics such as more extensive webbing, retuse disk covers on some digits, and relative toe length. • I provide voucher specimens of Cochranella spinosa, Kinosternon angustipons, Mesaspis moreletii, Cnemidophorus lemniscatus and Adelphicos quadrivirgatum for the first time in Nicaragua. I include descriptions, illustrations, and brief ecological notes for the five new country records. Zoogeography Based on the concept of ecological formations proposed by HOLDRIDGE (1967), nine forest formations are found in Nicaragua. Of the total number of terrestrial species of herpetofauna found in Nicaragua, 131 species (55.0%) occur in Lowland Wet Forest, 21 of which (8.8%) are restricted to this forest formation, 168 species (70.6%) occur in Lowland Moist Forest, 15 of which (6.3%) are restricted to this forest formation, 84 species (35.3%) occur in Lowland Dry Forest, four of which (1.7%) are restricted to this forest formation, 47 species (19.7%) occur in Lowland Arid Forest, with no species restricted to this forest formation, 59 species (24.8%) occur in Premontane Wet Forest, three of which (1.3%) are restricted to this forest formation, 116 species (48.7%) occur in Premontane Moist Forest, 10 of which (4.2%) are restricted to this forest formation, 51 (21.4%) species occur in Premontane Dry Forest, with no species restricted to this forest formation, 13 species (5.5%) occur in Lower Montane Wet Forest, two of which (0.8%) are restricted to this forest formation, and 50 species (21.0%) occur Lower Montane Moist Forest, seven of which (2.9%) are restricted to this forest formation. The Coefficient of Biogeographic Resemblance algorithm show a distinct composition of the herpetofauna from the isolated highlands of northeastern Nicaragua, which is characterized by a high proportion of endemic species. Two other clusters are evident when analyzing the herpetofaunal similarities among Nicaragua, the Pacific versant and the central mountains and the Atlantic lowlands. In addition, the Pacific lowlands are characterized by a relatively homogeneous composition of the herpetofauna. In contrast, many species have their northern limit of distribution in the Atlantic lowlands with the ranges of most of these species ending in southern Nicaragua. The central mountains constitute the southern limit of distribution of several highland species. In general, there is a greater contribution of reptile than amphibian species to the total herpetofauna present in each forest formation. This unbalance is slightly higher in the dry than in the moist parts of the country. The similarities in the composition of the reptiles between the different forests formations seem to be relatively distinct on an elevation factor, whereas in amphibians similarities might be better explained in correlation with humidity. The total amount of amphibian and reptile species in Nicaragua has a Middle American Element dominance and varies between amphibians and reptiles, with and a greater South American Element influence in anurans and a greater Old Northern Element influence in reptiles. In general, there is a greater percentage of species with a South American Element in extreme southeastern Nicaragua with a decreasing tendency towards northern Nicaragua. Taking in account the geography and geologic history of Nicaragua as well as the known Central American dispersal routes, I identify species of probable occurrence in Nicaragua as well as those places with a greater potential to hold undescribed endemic species. Conservation In Nicaragua, no amphibian or reptile populations are entirely free from anthropogenic impact. I determine the endangerment level of all Nicaraguan amphibian and reptile species using the IUCN categorizations and the Environmental Vulnerability Scores. Seventy-six species (31.9%) of Nicaraguan amphibians and terrestrial reptiles have high vulnerability, 118 (49.6%) medium vulnerability, and 44 (18.5%) low vulnerability. Eighteen species (7.4% of the total herpetofauna) are unknown from protected areas, including 13 high vulnerability species (three are endemic), four medium vulnerability species, and one low vulnerability species. To preserve the future of Nicaragua’s amphibians and reptiles, every species should reside in at least one protected area, the protected areas must be guarded, and monitoring programs are needed to detect changes in amphibian and reptile populations, prioritizing highly vulnerable species.
The reggie protein family consists of two homologous members, reggie-1 and reggie-2, also termed flotillin-2 and flotillin-1, respectively, that are ubiquitously expressed and evolutionarily well conserved, suggesting an important but so far ill-defined function. In various cell types, both reggies have been found to be constitutively associated with lipid rafts by means of acylation modifications and oligomerization. Lipid rafts are glycosphingolipid- and cholesterol-rich membrane microdomains which have been implicated in several cellular processes including membrane transport and signal transduction through growth factor receptors. However, the molecular details of these processes are still poorly understood. With the observation that reggies colocalize with activated glycosylphosphatidylinositolanchored proteins (GPI-APs) and Fyn kinase in rafts, a role for these proteins in signaling events has been suggested. In agreement with that, we have previously shown that reggie-1 becomes multiply tyrosine phosphorylated by Src kinases in response to epidermal growth factor (EGF) stimulation, pointing to a function for reggie-1 in growth factor signaling. Furthermore, overexpression of reggie-1 enhances spreading on fibronectin substrate in a tyrosine-dependent manner, thus revealing a role for reggie-1 in regulation of actin cytoskeleton through growth factor receptors. Due to the similarity shared by reggie proteins at amino acid level and to their ability to form hetero-oligomeric complexes, the first aim of this study was to analyze the putative tyrosine phosphorylation of reggie-2 in growth factor stimulated cells. Similarly to reggie-1, reggie-2 was found to be multiply tyrosine phosphorylated by Src kinase and to exist in a molecular complex with Src, with the degree of co-immunoprecipitation dependent on the activity of Src. Recent studies from us have also shown that administration of EGF results in the endocytosis of reggie-1 from the plasma membrane into endosomes, which is in line with a proposed role for reggies in membrane trafficking processes. In order to characterize in detail the endocytic mechanism that mediates the uptake of reggie-1, the dependency of reggie-1 endocytosis on clathrin and dynamin was investigated by means of overexpressing a variant form of Eps15 or a dominant negative form of dynamin-2. In either case the translocation of reggie-1 into endosomes in response to EGF was not affected, and this, together with the results that reggie-1 colocalized with cholera toxin (CTX) but not with transferrin receptor (TfnR) during EGF signaling, indicates that reggie-1 is taken up by means of a dynaminindependent, raft-mediated pathway. These findings are very well in line with recent data showing the pathway of entry into cells of reggie-2 as a raft-mediated endocytic pathway. The endocytosis of reggie-2 in response to EGF was also analyzed in this study. Similarly to reggie-1, in growth factor stimulated cells reggie-2 underwent a translocation from the plasma membrane to endosomes where the two reggies were found to colocalize with each other, suggesting that epidermal growth factor signaling might trigger the endocytosis of reggie oligomers. In addition, colocalization with both the late endosomal marker LAMP3/CD63 and epidermal growth factor receptor (EGFR) was detected, again indicating a function for reggies in signal transduction through growth factor receptors. EGFR has been reported to localize in rafts but, although this association is thought to be functional during EGF stimulation, how segregation of EGFR into rafts modulates its endocytosis and signaling is still under debate. Since reggie oligomers have recently been suggested to define a raft subtype, a further aim of this study was to investigate whether the depletion of reggies by means of small interfering RNA could interfere with the signaling and the trafficking through EGFR. Knockdown of reggie-2 resulted in an altered tyrosine phosphorylation of EGFR in response to EGF, while the degree of ubiquitination was not affected. Less efficient phosphorylation of tyrosine residues, especially of those which are docking sites for Grb2 and Shc, led in turn to an impaired activation of p38 and ERK1/2 MAPKs. Depletion of reggie-2 did not affect the early trafficking of activated EGFRs, with receptors being endocytosed and delivered to late endosomes as efficiently as in control cells. This would be in line with the normal degree of ubiquitination observed for EGFR, as ubiquitin moieties have been proposed to represent sorting tags that ensure receptor endocytosis into early endosomes and its proper intracellular trafficking. On the contrary, after prolonged EGF stimulation, depletion of reggie-2 resulted in a decreased downregulation of both receptor-bound ligand and EGFR, and in their accumulation in intracellular vesicles, thus pointing to a role for reggie-2 in the degradative pathway. Taken all together, these data ndicate that the association of EGFR with reggie-microdomains is likely to be important for proper receptor trafficking and signaling.
Background Multidirectional interactions in social (or communication) networks can have a profound effect on mate choice behavior. For example, Poecilia mexicana males show weaker expression of mating preferences when being observed by an audience male. It was suggested that this behavior is an adaptation to reduce sperm competition risk, which arises because commonly preferred female phenotypes will receive attention also by surrounding males, and/or because the audience male can copy the focal male's mate choice. Do P. mexicana males indeed respond to perceived sperm competition risk? We gave males a choice between two females and repeated the tests under one of the following conditions: (1) during the 2nd part of the tests an empty transparent cylinder was presented (control); (2) an audience male inside the cylinder observed the focal male throughout the 2nd part, or (3) the audience male was presented only before the tests, but could not eavesdrop during the actual choice tests (non-specific sperm competition risk treatments); (4) the focal male could see a rival male sexually interacting with the previously preferred, or (5) with the non-preferred female before the 2nd part of the tests (specific sperm competition risk treatments). Results When comparing the strength of individual male preferences between the 1st and 2nd part of the tests (before and after presentation of an audience), male preferences declined slightly also during the control treatment (1). However, the decrease in strength of male preferences was more than two-fold stronger in audience treatment (2), i.e., with non-specific sperm competition risk including the possibility for visual eavesdropping by the audience male. No audience effect was found in treatments (3) and (5), but a weak effect was also seen when the focal male had seen the previously preferred female sexually interact with a rival male (treatment 4; specific sperm competition risk). Conclusions When comparing the two 'non-specific sperm competition risk' treatments (2 and 3), a very strong effect was found only when the audience male could actually observe the focal male during mate choice in treatment (2). This suggests that focal males indeed attempt to conceal their mating preferences in the visual presence of other males so as to avoid mate choice copying. When there is no potential for eavesdropping [treatment (3)], non-specific specific sperm competition risk seems to play a minor or no role. Congruent with studies on other poeciliid species, our results also show that P. mexicana males respond to perceived specific sperm competition risk, and tend to share their mating effort more equally among females when the resource value of their previously preferred mate decreases (after mating with a rival male). However, this effect is comparatively weak.
Das Volumen von tierischen Zellen ist durch äußere und innere Einflüsse Veränderungen unterworfen. Um die zelluläre Homöostase zu gewährleisten und bedrohliche Volumenänderungen zu verhindern, verfügen die meisten Zellen daher über regulatorische Mechanismen zur Verringerung (regulatory volume decrease, RVD) oder Erhöhung (regulatory volume increase, RVI) des Zellvolumens. Darüber hinaus finden diese Mechanismen auch im Rahmen physiologischer Prozesse, wie z. B. der Zellbewegung oder der Proliferation Verwendung. Der RVD erfordert einen Sensor-Mechanismus, der die Veränderung des Zellvolumens registriert. Die nachfolgende Signaltransduktion führt zur Aktivierung von Transportmechanismen, die v. a. dem Export von K+- und Cl--Ionen, aber auch organischen Osmolyten, dienen und zum Ausstrom von Wasser aus der Zelle führen, bis das Sollvolumen erreicht ist. Bisher ist noch nicht sicher, welcher Mechanismus den RVD einleitet; in verschiedenen Geweben wurden Hinweise auf mehrere mögliche Kandidaten gefunden. In dieser Arbeit wurde der RVD von HaCaT-Zellen, einer humanen Keratinozyten-Zelllinie hinsichtlich der Beteiligung des Aktin-Zytoskeletts mit mikroskopischen, pharmakologischen und molekularbiologischen Methoden untersucht. HaCaT-Zellen schwellen in hypotonem Medium schnell an (30 s) und führen einen RVD durch, der nach ca. 5 min das Ausgangsvolumen wieder herstellt. Der RVD von HaCaT-Zellen ist vom Einstrom extrazellulärer Ca2+-Ionen abhängig. Dieser Einstrom erfolgt durch einen Kanal, der durch die Inhibitoren von stretch activated channels (SAC) Gd3+ und GsMTx-4, sowie den spezifischen Inhibitor des transient receptor potential vaniloid 4 (TRPV4), Rutheniumrot, gehemmt werden kann. TRPV4 wird in HaCaT-Zellen exprimiert. Der RVD und der damit verbundene Einstrom von Ca2+-Ionen, nicht aber das Anschwellen der Zellen werden durch den Abbau des Aktin-Zytoskeletts durch 2 μM Cytochalasin D (CD) gehemmt. Die Hemmung durch CD ist reversibel; nach dem Entfernen von CD bildet sich innerhalb von 30 min erneut ein Netzwerk von Aktinfilamenten aus. Ein zwei-stufiges Absenken der Osmolarität (jeweils ca. 20%), zunächst in Anwesenheit von CD führt zu einer Volumenzunahme, löst aber keinen RVD aus. Auch nach dem Entzug von CD bleibt das Volumen konstant erhöht. Erst das zweite Absenken löst eine Volumenregulation aus, allerdings nur bis zu dem Volumen, das nach dem Entfernen von CD etabliert war. Die mikroskopische Struktur des Aktin-Zytoskeletts von HaCaT-Zellen ändert sich während des RVD kaum. Durch die Messung der Fluoreszenz von gebundenem Rhodamin-Phalloidin konnte ein vorübergehender Anstieg der Menge von Aktinfilamenten (F-Aktin) während des RVD gezeigt werden. Ein quantitativer biochemischer Ansatz zeigt, dass die relative Menge des Triton- X-100-löslichen Anteils des Aktin-Zytoskeletts im gleichen Zeitraum zunimmt. Der RVD von HaCaT-Zellen hängt ebenfalls von der Geschwindigkeit der Osmolaritätsänderung ab; die langsame Verringerung der Osmolarität (≤ 5 mosM/min) führte zum Anschwellen, nicht aber zum RVD. Auf Basis der erzielten Ergebnisse wird ein Modell für den RVD von HaCaTZellen vorgeschlagen, bei dem der Anstieg des Zellvolumens zu einer Zunahme der mechanischen Spannung im kortikalen Zytoskelett führt. Dadurch wird – indirekt, etwa durch Phospholipase A2, oder direkt - TRPV4 aktiviert. Dies führt zu einem Einstrom von extrazellulären Ca2+-Ionen und über Ca2+-abhängige Aktin-bindende Proteine (z. B. Gelsolin) zu einer Reorganisation des Aktin-Zytoskeletts (Gel-Sol-Übergang) und verbunden damit zu einer Abnahme der mechanischen Spannung. Ca2+-Ionen und kurze Aktinfilamente aktivieren Transportmechanismen, die zum Ausstrom von K+- und Cl-- Ionen und einer Abnahme des Zellvolumens führen.
Kutane T-Zell-Lymphome (CTCL) stellen eine heterogene Gruppe von Lymphomen dar, die durch maligne, die Haut infiltrierende T-Zellen gekennzeichnet sind. Die häufigsten CTCL sind Mycosis Fungoides (MF) und die leukämische Variante das Sézary Syndrom (SS). Bei MF kommt es zur Ausbildung von sogenannten Patches, Plaques und kutanen Tumoren und in späteren Stadien kann es auch zu einem Befall des Blutes kommen. Bei SS handelt es sich um eines der aggressivsten CTCL, das durch das Auftreten von Erythroderma und einer hohen Zahl im Blut zirkulierender maligner Zellen gekennzeichnet ist. Die genauen molekularen Ursachen für die Entartung sind bis heute nicht aufgeklärt. Bestehende Therapien können nur die Symptome lindern, aber die Krankheit nicht vollständig heilen. Daher ist die Entwicklung neuer Therapien unerlässlich, was durch die Erforschung der molekularen Signalwege in den malignen Zellen möglich wird. So kann die Ursache der Entartung aufgeklärt werden und neue Angriffspunkte für Therapien identifiziert werden. Die Charakterisierung verschiedener CTCL Zelllinien in dieser Arbeit bestätigte den Phänotyp der Tumorzellen als aktivierte T-Helferzellen und lieferte auch Hinweise auf einen Phänotyp regulatorischer T-Zellen. Es konnte eine Aktivierung des NF-κB- und Interferon-Signalweges, AP-1- und cAMP-vermittelter Signalwege, sowie der MAPKinase p38 und STAT5 beobachtet werden. Diese Moleküle zeichnen sich daher als mögliche Angriffspunkte für die Entwicklung einer neuen Therapie ab. Der Nachweis einer VEGF Expression, sowie von RANTES und TIMP-1, lieferte Hinweise auf die Aktivierung Angiogenese-vermittelnder Signalwege. Die Charakterisierung des PI3K/Akt- und mTOR-Signalweges in CTCL durch Versuche mit dem mTOR Inhibitor Rapamycin bestätigte die Bedeutung von Angiogenese bei CTCL. Rapamycin zeigte sowohl in vitro als auch in vivo in einem Mausmodell für MF einen antitumoralen Effekt, was seine Anwendbarkeit als neues Therapeutikum für CTCL zeigt. Ein weiterer Ansatzpunkt ist der Apoptose Signalweg, der in CTCL gestört ist, wodurch es zu einer Resistenz gegenüber Apoptose-induzierender Stimuli kommt. Bei Versuchen mit dem Immunmodulator AS101 wurde die Produktion intrazellulärer freier Sauerstoffradikale (ROS) erhöht, wodurch Apoptose in den malignen Zellen induziert werden konnte. In vivo Versuche bestätigten einen antitumoralen Effekt von AS101 und identifizierten es als potentielles neues Therapeutikum für CTCL. Ziel bei der Entwicklung neuer Therapien ist es, eine möglichst spezifische Wirkung auf die Tumorzellen zu erhalten, wodurch Immuntherapien in den letzten Jahren immer mehr an Bedeutung gewannen. Daher wurden auch zwei immuntherapeutische Ansätze für eine Behandlung von CTCL untersucht. Zytotoxische T-Zellen mit einem chimären CD30-spezifischen T-Zellrezeptor (TCR) zeigen in vitro eine zytotoxische Aktivität gegen CTCL Zellen, der aber in vivo nicht bestätigt werden konnte. Ein weiterer unspezifischer immuntherapeutischer Ansatz basiert auf der Natürlichen Killer (NK) – Zelllinie NK-92, die alle Eigenschaften aktivierter NK-Zellen aufweist und eine generelle antitumorale Aktivität besitzt. Diese Zellen zeigten eine hohe zytotoxische Aktivität gegen CTCL Zellen, die unabhängig von den drei aktivierenden Rezeptoren NKp30, NKp46 und NKG2D ist. Die Versuche zeigten somit, dass sich NK-92 Zellen für eine Therapie von CTCL eignen. Zusammenfassend wurden Signalwege identifiziert, deren Inhibition einen therapeutischen Effekt erwarten lassen würden und zwei bereits für andere Indikationen zugelassene Substanzen als potentielle Therapeutika für CTCL identifiziert. Zusätzlich wurde auch ein Immuntherapeutikum in vitro als erfolgversprechend getestet.
This study focuses on structural features of a particular GPCR type, the family C GPCRs. Structure- and ligand-based approaches were adopted for prediction of novel mGluR5 binding ligand and their binding modes. The objectives of this study were: 1. An analysis of function and structural implication of amino acids in the TM region of family C GPCRs. 2. The prediction of the TM domain structure of mGluR5. 3. The discovery of novel selective allosteric modulators of mGluR5 by virtual screening. 4. The prediction of a ligand binding mode for the allosteric binding site in mGluR5. GPCRs are a super-family of structurally related proteins although their primary amino acid sequence can be diverse. Using sequence information a conservation analysis of family C GPCRs should be applied to reveal characteristic differences and similarities with respect function, folding and ligand binding. Using experimental data and conservation analysis the allosteric binding site of mGluR5 should be characterized regarding NAM and PAM and selective ligand binding. For further evaluation experimental knowledge about family A GPCRs as well as conservation between vertebrate rhodopsins was planned to be compared to results obtained for family C GPCRs (Section 4.1 Conservation analysis of family C GPCRs). Since no receptor structure is available for any family C GPCR, discussion of conserved sequence positions between family A and C GPCRs requires the prediction of a receptor structure for mGluR5 using a family A receptor as template. In order to predict the mGluR5 structure a sequence alignment to a GPCR template protein will have to be proposed and GPCR specific features considered in structure calculation (Section 4.1.4 Structure prediction of mGluR5). The obtained structure was intended to be involved in ligand binding mode prediction of newly discovered active molecules. For discovery of novel selective mGluR modulators several ligand-based virtual screening protocols were adapted and evaluated. Prediction models were derived for selection of possibly active molecules using a diverse collection of known mGluR binding ligands. For that purpose a data collection of known mGluR binding ligands should be established and this reference collection analyzed with respect to different ligand activity classes, NAM or PAM and selective modulators. The prediction of novel NAMs and PAMs using several combinations of 2D-, 3D-, pharmacophore or molecule shape encoding methods with machine learning techniques and similarity determining methods should be tested in a prospective manner (Section 4.2 Virtual screening for novel mGluR modulators). In collaboration with Merz Pharmaceuticals (Merz GmbH & Co. KGaA, Frankfurt am Main, Germany) the modulating effect of a few hundred molecules should be approved in a functional cell-based assay. With the objective to predict a binding mode of the discovered active molecules, molecule docking should be applied using the allosteric binding site of the modeled mGluR5 structure (Section 4.2.4 Modeling of binding modes). Predicted ligand binding modes are to be correlated to conservation profiles that had resulted from the sequence-based entropy analysis and information from mutation experiments, and shall be compared to known ligand binding poses from crystal structures of family A GPCRs.
The growth of blood vessels is crucial for organ growth in the embryo and repair of wounded tissues in the adult. An imbalance in this process contributes to numerous malignant, inflammatory, ischemic, infectious and immune disorders (Ferrara et al., 2003). Postnatal neovascularization occurs through the recruitment of progenitor cells and angiogenesis. Integrins are heterodimeric cell surface molecules and are the main receptors for extracellular matrix proteins. Regulation of integrin activation is crucial during embryonic development and during adult life. Dysregulation of integrin activity leads to severe diseases. In this study, we have demonstrated that Rap1, a small GTPase regulating integrin activity, and its GEF Epac1 are expressed in both EPC and endothelial cells. Moreover, the pharmacological activator of Epac activates the small GTPase Rap1 in progenitor cells. In parallel the angiogenic growth factors VEGF and bFGF activate Rap1 in endothelial cells. In addition, the regulation of Rap1 activity in EPC and in endothelial cells plays an important role in the regulation of migration and adhesion to matrix proteins, by regulating the activity of different integrins, a mechanism known as integrin inside‐out signaling. Furthermore, regulation of Rap1 activity affects probably indirectly through outside‐in signaling of integrins the activity of several and crucial proteins such PKB/Akt and focal adhesion kinase in endothelial cells. In line with these results, we have demonstrated that Rap1 activity affect angiogenesis, homing of EPC to ischemic tissues and thereby postnatal neovascularization. The understanding how Rap1 regulates integrin activity in endothelial cells is still not completely clear, for example we have demonstrated that the known effectors of Rap1 mediating the increase of integrin activity in T and B cells, such as RAPL and RIAM are, respectively, either not increasing integrin activity or not expressed in endothelial cells. We aim to find the effector of Rap1 promoting integrin activity in endothelial cells and how RAPL regulates integrin functions and angiogenesis. Moreover data from us and others using genetic models and generation of Rap1a or Rap1b deficient mice or deficient for Rap1a and Rap1b led to embryonic lethality suggesting that Rap1 is a key node protein during embryonic development. The development of conditionnal Rap1a/b endothelial/pericytes restricted deficient mice will help us to decipher more precisely the role of Rap1 during vascular development and angiogenesis.
Individuell markierte Siebenschläfer einer freilebenden Population wurden fünf Jahre lang während ihrer sommerlichen Aktivitätsphase beobachtet, um Erkenntnisse über die Zeitmuster der täglichen und saisonalen Aktivitäten, des Sozialverhaltens und des Winterschlafs zu erhalten. 1. Auf der Basis einer langjährigen Untersuchung an einer weitestgehend „geschlossenen“ und nahezu komplett erfassten Population und der täglichen Anwesenheitskontrolle von individuell mit Transpondern markierten Tieren können qualifizierte Aussagen über die relative Wirkung von exogenen Faktoren und endogenen Steuermechanismen auf Lebensprozesse des Siebenschläfers getroffen werden. 2. Mathematische Simulationen zeigen, wie unvollständig und damit unzulänglich Datensätze sind, wenn auf einer wöchentlichen oder gar nur monatlichen Erhebung beruhen. Soll die Populationsgröße als Maß für die ökologische Zustandsbewertung einer Population und für Prognosen bezüglich deren Entwicklung in den Folgejahren unter bestimmten Umweltbedingungen herangezogen werden, dann ist eine tägliche Kontrolle zur Fehlerminimierung notwendig. Erstmals wurde insbesondere auch nachgewiesen, dass die Populationsstruktur (Alter und Geschlecht der Tiere) und die Populationsdynamik ohne Berücksichtigung chronoethologischer Aspekte nicht angemessen erfasst werden können. 3. Für das „Modellsystem Siebenschläfer“ werden Kriterien zur Bestimmung der Populations-größe und -Struktur entwickelt und als mögliche Richtlinie für die adäquate Paradigmenwahl bei der Erstellung von mittelfristigen Prognosen formuliert. Die Tages- und Jahresrhythmik der Tiere, sowie deren Alter beeinflussen unter Feldbedingungen die Erfassbarkeit des Tierbestandes. Für die Abschätzung von Bestandsdichten muss deshalb der Zeitpunkt der Datenerhebung berücksichtigt werden. 4. Veränderungen des Nahrungsangebotes steuern bekanntermaßen die Gonadenreifung der Männchen und haben damit einen direkten Einfluss auf die Verpaarung der Siebenschläfer. Im Beobachtungsgebiet erfolgt gemäß dem etwa zweijährigen Fruchtbarkeitshythmus der Vegetation auch die Reproduktion der Siebenschläfer meist nur alle zwei Jahre. 5. Die langjährige Nachweisrate der individuell markierten Tiere zeigt an einer Freilandpopulation, dass die Lebenserwartung und auch das durchschnittlich erreichte Alter von Siebenschläfern höher sind als bisher erwartet. Die ersten beiden Überwinterungen stellen für Siebenschläfer eine deutliche „Überlebens-Hürde“ dar; dabei ist grundsätzlich das Gewicht der Tiere beim Eintritt in den Winterschlaf entscheidend für das Erreichen des nächsten Sommers. 6. Der solitär lebende Siebenschläfer findet sich auch nach dem Ende der Paarungszeit und der Auflösung des Geschwisterverbandes zu zeitlich begrenzten Schlafgemeinschaften zusam-men. Erstmals konnte nachgewiesen werden, dass Schlafgruppen in reproduktionsstarken Jahren nur während des Übergangs zwischen dem Winterschlaf und der Sommeraktivität, sowie in reproduktionsarmen Jahren während der gesamten aktiven Phase zur Thermoregu-lation gebildet werden. Vermutlich begünstigen verwandtschaftliche Beziehungen ebenso wie die Habitateigenschaften (wie z.B. das Höhlenangebot) die Bildung von Schlafgruppen. 7. Erstmals wurden an Siebenschläfern die Tagesrhythmik des Verhaltens unterschiedlich alter Tiere analysiert: Adulte Siebenschläfer sind generell nachtaktiv mit einer monophasischen Aktivitätsphase, die oft durch einen kurzen Schlaf („napping“) unterbrochen wird. Der Be-ginn der nächtlichen Aktivität ist synchron zur bürgerlichen Dämmerung. Unter der Kon trolle von streng endogenen Mechanismen, die offensichtlich einem Reifungsprozess unter-liegen, ändert sich der Zeitverlauf der Nachtaktivität mit dem Lebensalter: von einem zunächst polyphasischen Muster der Jungtiere im Brutkasten zu dem monophasischen Muster der adulten Siebenschläfer, sobald sich die Wurfgemeinschaft aufgelöst hat. 8. Bei ungünstigen Umgebungstemperaturen oder bei akutem Nahrungsmangel können die Siebenschläfer in Tageslethargie verfallen, die durch eine charakteristische Körperhaltung, selbst ohne Messung der Körpertemperatur, erkannt werden kann. Dieser Torpor kann wenige Stunden oder auch mehrere Tage andauern („Sommerschlaf“) und ist vermutlich mit ein Grund für die lückenhafte Anwesenheit der Tiere in den Nisthöhlen in reproduktions-schwachen Jahren, die parallel zu knappen Nahrungsressourcen auftreten. Die Lethargiephasen folgen keinem endogenen Zeitplan sondern opportunistisch den exogenen Bedingungen. 9. Das Zeitmuster des Winterschlafs beim Siebenschläfer wird generell in stärkerem Ausmaß von endogenen Programmen als von exogen einwirkenden Faktoren, wie z.B. klimatischen Parametern, kontrolliert. Der Zeitpunkt des Winterschlaf-Endes und somit der Beginn der frühsommerlichen Aktivitätsphase hängt dabei vom Alter und Geschlecht der Tiere nicht aber von Witterungsfaktoren wie der Umgebungstemperatur ab. 10. Die männlichen und weiblichen Jungtiere gehen mit dem durchschnittlich gleichen Körpergewicht in ihren ersten Winterschlaf. Es wurde zum ersten Mal nachgewiesen, dass die männlichen juvenilen Tiere dennoch den Winterschlaf etwa zwei Wochen früher als die Weibchen beenden. Da dieses Phänomen noch vor der Geschlechtsreife zu beobachten ist, liegt hier vermutlich ein endogenes Zeitprogramm vor. 11. Auch der Beginn des Winterschlafs scheint überwiegend endogenen Steuermechanismen zu unterliegen. Hier erfolgt jedoch, im Vergleich zum Winterschlaf-Ende, eine stärkere, alters- und geschlechtsspezifische Modulation durch exogene Faktoren (z.B. Nahrungsverfügbarkeit) und korreliert mit den vorhergehenden Reproduktionsvorgängen. 12. Es wird diskutiert, dass die komplexen endogenen Zeitprogramme, circadiane (Ta-ges)Uhren und circannuale (Jahres)Uhren, die kurze sommerliche Aktivitätsphase der Sie-benschläfer bestimmen. Sie sichern dadurch wie bei vielen anderen Tierarten, die in Habi-taten mit stark ausgeprägten periodischen saisonalen Änderungen in der Nahrungsverfüg-barkeit leben, die weitgehende Unabhängigkeit von kurzfristigen akuten Schwankungen der Umweltbedingungen. Die genetische Verankerung solcher biologischer Uhren könnte deshalb erst langfristig Auswirkungen des globalen Klimawandels widerspiegeln. Die indi-viduelle Variabilität dieser Zeitprogramme ermöglicht gleichwohl wenigstens Teilen der Population, Vorteile bei entsprechenden Umweltveränderungen wahrzunehmen.
Alles für die Katz? : Bedrohung der Biodiversität Australiens und Maßnahmen zu ihrer Erhaltung
(2004)
Fachliche Exzellenz und Bildungsnotstand – diese beiden Extreme beherrschen gegenwärtig die Diskussion um Schul- und Hochschulausbildung. Die Universität Frankfurt stellt sich der Elitediskussion und setzt auf Fokussierung und Schwerpunktbildung. Studiengänge werden modifiziert, die Art und Vielfalt möglicher Abschlüsse internationalen Standards angepasst. Die Universität will und wird wettbewerbsfähig sein, auch im internationalen Vergleich. Darüber sprach Dr. Monika Mölders mit Prof. Dr. Günther Wess, Honorarprofessor der Universität Frankfurt, Forschungsleiter Europa von Aventis und Mitglied der Geschäftsführung der Aventis Pharma Deutschland GmbH.
Protein kinases are targets for drug development. Dysregulation of kinase activity leads to various diseases, e.g. cancer, inflammation, diabetes. Human polo-like kinase 1 (Plk1), a serine/threonine kinase, is a cancer-relevant gene and a potential drug target which attracts increasing attention in the field of cancer therapy. Plk1 is a key player in mitosis and modulates entry into mitosis and the spindle checkpoint at the meta-/anaphase transition. Plk1 overexpression is observed in various human tumors, and it is a negative prognostic factor for cancer patients. The same catalytical mechanism and the same co-substrate (ATP) lead to the problem of inhibitor selectivity. A strategy to solve this problem is represented by targeting the inactive conformation of kinases. Kinases undergo conformational changes between active and inactive conformation and thus an additional hydrophobic pocket is created in the inactive conformation where the surrounding amino acids are less conserved. A "homology model" of the inactive conformation of Plk1 was constructed, as the crystal structure in its inactive conformation is unknown. A crystal structure of Aurora A kinase served as template structure. With this homology model a receptor-based pharmacophore search was performed using SYBYL7.3 software. The raw hits were filtered using physico-chemical properties. The resulting hits were docked using Gold3.2 software, and 13 candidates for biological testing were manually selected. Three compounds of the 13 tested exhibit anti-proliferative effects in HeLa cancer cells. The most potent inhibitor, SBE13, was further tested in various other cancer cell lines of different origins and displayed EC50 values between 12 microM and 39 microM. Cancer cells incubated with SBE13 showed induction of apoptosis, detected by PARP (Poly-Adenosyl-Ribose-Polymerase) cleavage, caspase 9 activation and DAPI staining of apoptotic nuclei.
Die Haarzellen des Innenohrs setzen durch Schallreize ausgelöste Schwingungen der Basilarmembran in elektrische Impulse um, die über Nerven an das Gehirn geleitet werden und dort nach komplexer neuronaler Verarbeitung die Hörwahrnehmung auslösen. Gleichzeitig erhalten die äußeren Haarzellen über absteigende Nervenverbindungen, die olivo-cochleären Neurone, auch Informationen vom Gehirn, durch die ihre Empfindlichkeit verändert werden kann. Über die Mechanismen dieser efferenten Beeinflussung der Reizverarbeitung im Innenohr ist noch wenig bekannt und auch ihre biologische Funktion ist noch nicht geklärt. Diskutiert wird eine Rolle bei der Verbesserung des Signal-Hintergrundrausch-Verhältnisses und im Zusammenhang mit selektiver Aufmerksamkeit, durch die relevante Anteile der akustischen Umwelt gezielt „herausgehört“ werden können. Ziel dieser Promotionsarbeit ist die Untersuchung der efferenten Beeinflussung der Vorgänge im Innenohr mithilfe der nicht-invasiven Messung von akustischen Beiprodukten der aktiven Reizverstärkung durch die äußeren Haarzellen, den otoakustischen Emissionen. Bei dieser Methode werden mit einem empfindlichen Mikrophon im Gehörgang Schallereignisse aufgenommen, die das Ohr selbst produziert. Die olivo-cochleären Efferenzen können experimentell durch Applikation von Rausch-Stimuli auf dem kontralateralen Ohr aktiviert werden und ihre Wirkung auf die Empfindlichkeit des Innenohrs anhand der Veränderungen der otoakustischen Emissionen auf dem anderen, ipsilateralen Ohr gemessen werden. In Messungen unterschiedlicher Typen von otoakustischen Emissionen am Menschen und an der Mongolischen Wüstenrennmaus konnten deutliche Veränderungen der otoakustischen Emissionen bei gleichzeitiger Beschallung des kontralateralen Ohrs gezeigt werden, die als Modulation der Haarzelleigenschaften und Beeinflussung der cochleären Verstärkung durch Aktivierung der absteigenden Nervenbahnen interpretiert werden können: Spontane otoakustische Emissionen (SOAE), die ohne jegliche akustische Stimulation vom Innenohr generiert werden, zeigten bei kontralateraler akustischer Stimulation eine Verminderung ihres Pegels und eine Erhöhung ihrer Frequenz. Die Pegelverminderung deutet auf eine Dämpfung der cochleären Verstärkungsmechanismen und die Frequenzerhöhung auf eine Erhöhung der Steifigkeit im Corti-Organ und hierdurch veränderte Resonanzeigenschaften nach Aktivierung der efferenten Neurone hin. Distorsionsprodukt-otoakustische Emissionen (DPOAE), die bei Stimulation mit zwei Reintönen (f1 und f2) in Folge der nichtlinearen Verstärkung durch die äußeren Haarzellen entstehen, waren durch kontralaterale akustische Stimulation ebenfalls klar in ihrem Pegel beeinflusst. Die Effekte, sowohl auf SOAE als auch auf DPOAE, waren abhängig vom Pegel des kontralateralen Stimulus und traten bereits bei niedrigen kontralateralen Stimuluspegeln, deutlich unter der Schwelle des Mittelohrreflexes, auf. Durch ihren Zeitverlauf konnten die Effekte den in der Literatur beschriebenen efferenten Vorgängen zugeschrieben werden. Bei anhaltender akustischer Stimulation traten Adaptationsphänomene auf. Weiterhin zeigte sich in Experimenten mit kontralateralem Schmalbandrauschen und Reintönen, dass die efferente Modulation selektiv auf bestimmte Bereiche des tonotop organisierten Innenohrs zielt, also frequenzspezifisch agiert, wobei Reintöne mit Frequenzen, die etwas tiefer als die Stimulationsfrequenz lagen, die größten Effekte erzielten. Dies steht in guter Übereinstimmung zu anatomischen Daten. Besonders interessant an den DPOAE-Messungen war, dass das quadratische Distorsionsprodukt der Frequenz f2-f1 wesentlich empfindlicher reagierte als das kubische Distorsionsprodukt der Frequenz 2f1-f2. Bisher gibt es kaum Daten zu Veränderungen der f2-f1-DPOAE durch efferente Mechanismen. Die beiden DPOAE-Typen sind durch unterschiedliche Parameter der dem Verstärkungsprozess zu Grunde liegenden Transferfunktion beeinflusst, und die experimentell nachgewiesenen Unterschiede deuten darauf hin, dass die Aktivierung der olivo-cochleären Efferenzen ihre dämpfende Wirkung auf die Schallverarbeitung im Innenohr durch eine Verschiebung des Arbeitspunktes der Transfercharakteristik des cochleären Verstärkers entfaltet. Diese Hypothese wurde an der Wüstenrennmaus durch einen ergänzenden methodischen Ansatz unterstützt, bei dem zusätzlich zur Evozierung und Messung von DPOAE mit und ohne gleichzeitiger kontralateraler Aktivierung der Efferenzen ein sehr tieffrequenter „Bias“-Ton mit hohem Pegel appliziert wurde, der das Corti-Organ und damit den Arbeitspunkt des cochleären Verstärkers periodisch auslenkte. Diese Tieftonstimulation hatte eine sehr starke, von der Phase des Bias-Tons abhängige Modulation des f2-f1-Pegels zur Folge, während 2f1-f2 kaum beeinflusst wurde. Das Muster der f2-f1-Pegelmodulation änderte bei zusätzlicher kontralateraler Schallapplikation deutlich seinen Charakter. Entsprechende Veränderungen in den Verzerrungsmustern konnten mithilfe eines einfachen Modells zur DPOAE-Generation, das auf der Beschreibung des Verstärkungsmechanismus durch eine Boltzman-Funktion basierte, simuliert werden. Die Befunde der vorliegenden Arbeit zeigen, dass die Schallverstärkung im Innenohr durch efferente Mechanismen moduliert wird und dies anhand der nicht-invasiven Messung von otoakustischen Emissionen nachweisbar ist. Dabei deuten die Ergebnisse auf eine Verschiebung des Arbeitspunktes der Transfercharakteristik des cochleären Verstärkers als Mechanismus der olivo-cochleären Modulation der Reizverarbeitung im Innenohr hin.
Kenntnisse über die dreidimensionale Struktur therapeutisch relevanter Zielproteine bieten wertvolle Informationen für den rationalen Wirkstoffentwurf. Die stetig wachsende Zahl aufgeklärter Kristallstrukturen von Proteinen ermöglicht eine qualitative und quantitative rechnergestützte Untersuchung von spezifischen Protein-Liganden Wechselwirkungen. Im Rahmen dieser Arbeit wurden neue Algorithmen für die Identifikation und den Ähnlichkeitsvergleich von Proteinbindetaschen und ihren Eigenschaften entwickelt und in dem Programm PocketomePicker zusammengefasst. Die Software gliedert sich in die Routinen PocketPicker, PocketShapelets und PocketGraph. Ferner wurde in dieser Arbeit die Methode ReverseLIQUID reimplementiert und im Rahmen einer Kooperation für das strukturbasierte Virtuelle Screening angewendet. Die genannten Methoden und ihre wissenschaftliche Anwendungen sollte hier zusammengefasst werden: Die Methode PocketPicker ermöglicht die Vorhersage potentieller Bindetaschen auf Proteinoberflächen. Diese Technik implementiert einen geometrischen Ansatz auf Basis „künstlicher Gitter“ zur Identifikation zusammenhängender vergrabener Bereiche der Proteinoberfläche als Orte möglicher Ligandenbindestellen. Die Methode erreicht eine korrekte Vorhersage der tatsächlichen Bindetasche für 73 % der Einträge eines repräsentativen Datensatzes von Proteinstrukturen. Für 90 % der Proteinstrukturen wird die tatsächlich Ligandenbindestelle unter den drei wahrscheinlichsten vorhergesagten Taschen gefunden. PocketPicker übertrifft die Vorhersagequalität anderer etablierter Algorithmen und ermöglicht Taschenidentifikationen auf apo-Strukturen ohne signifikante Einbußen des Vorhersageerfolges. Andere Verfahren weisen deutlich eingeschränkte Ergebnisse bei der Anwendung auf apo-Strukturen auf. PocketPicker erlaubt den alignmentfreien Ähnlichkeitsvergleich von Bindetaschenfor-men durch die Kodierung berechneter Bindevolumen als Korrelationsdeskriptoren. Dieser Ansatz wurde erfolgreich für Funktionsvorhersage von Bindetaschen aus Homologiemodellen von APOBEC3C und Glutamat Dehydrogenase des Malariaerregers Plasmodium falciparum angewendet. Diese beiden Projekte wurden in Zusammenarbeit mit Kollaborationspartnern durchgeführt. Zudem wurden PocketPicker Korrelationsdeskriptoren erfolgreich für die automatisierte Konformationsanalyse der enzymatischen Tasche von Aldose Reduktase angewendet. Für detaillierte Analysen der Form und der physikochemischen Eigenschaften von Proteinbindetaschen wurde in dieser Arbeit die Methode PocketShapelets entwickelt. Diese Technik ermöglicht strukturelle Alignments von extrahierten Bindevolumen durch Zerlegungen der Oberfläche von Proteinbindetaschen. Die Überlagerung gelingt durch die Identifikation strukturell ähnlicher Oberflächenkurvaturen zweier Taschen. PocketShapelets wurde erfolgreich zur Analyse funktioneller Ähnlichkeit von Bindetaschen verwendet, die auf Betrachtungen physikochemischer Eigenschaften basiert. Zur Analyse der topologischen Vielfalt von Bindetaschengeometrien wurde in dieser Arbeit die Methode PocketGraph entwickelt. Dieser Ansatz nutzt das Konzept des sog. „Wachsenden Neuronalen Gases“ aus dem Bereich des maschinellen Lernens für eine automatische Extraktion des strukturellen Aufbaus von Bindetaschen. Ferner ermöglicht diese Methode die Zerlegung einer Bindestelle in ihre Subtaschen. Die von PocketPicker charakterisierten Taschenvolumen bilden die Grundlage für die Methode ReverseLIQUID. Dieses Programm wurde in dieser Arbeit weiterentwickelt und im Rahmen einer Kooperation zur Identifikation eines Inhibitors der Serinprotease HtrA des Erregers Helicobacter pylori verwendet. Mit ReverseLIQUID konnte ein strukturbasiertes Pharmakophormodell für das Virtuelle Screening erstellt werden. Dieser Ansatz ermöglichte die Identifikation einer Substanz mit niedrig mikromolarer Affinität gegenüber der Zielstruktur.
The C-module-binding factor (CbfA) is a multidomain protein that belongs to the family of jumonji-type (JmjC) transcription regulators. In the social amoeba Dictyostelium discoideum, CbfA regulates gene expression during the unicellular growth phase and multicellular development. CbfA and a related D. discoideum CbfA-like protein, CbfB, share a paralogous domain arrangement that includes the JmjC domain, presumably a chromatin-remodeling activity, and two zinc finger-like (ZF) motifs. On the other hand, the CbfA and CbfB proteins have completely different carboxy-terminal domains, suggesting that the plasticity of such domains may have contributed to the adaptation of the CbfA-like transcription factors to the rapid genome evolution in the dictyostelid clade. To support this hypothesis we performed DNA microarray and real-time RT-PCR measurements and found that CbfA regulates at least 160 genes during the vegetative growth of D. discoideum cells. Functional annotation of these genes revealed that CbfA predominantly controls the expression of gene products involved in housekeeping functions, such as carbohydrate, purine nucleoside/nucleotide, and amino acid metabolism. The CbfA protein displays two different mechanisms of gene regulation. The expression of one set of CbfA-dependent genes requires at least the JmjC/ZF domain of the CbfA protein and thus may depend on chromatin modulation. Regulation of the larger group of genes, however, does not depend on the entire CbfA protein and requires only the carboxy-terminal domain of CbfA (CbfA-CTD). An AT-hook motif located in CbfA-CTD, which is known to mediate DNA binding to A+T-rich sequences in vitro, contributed to CbfA-CTD-dependent gene regulatory functions in vivo.
Mammalian retinae have rod photoreceptors for night vision and cone photoreceptors for daylight and colour vision. For colour discrimination, most mammals possess two cone populations with two visual pigments (opsins) that have absorption maxima at short wavelengths (blue or ultraviolet light) and long wavelengths (green or red light). Microchiropteran bats, which use echolocation to navigate and forage in complete darkness, have long been considered to have pure rod retinae. Here we use opsin immunohistochemistry to show that two phyllostomid microbats, Glossophaga soricina and Carollia perspicillata, possess a significant population of cones and express two cone opsins, a shortwave-sensitive (S) opsin and a longwave-sensitive (L) opsin. A substantial population of cones expresses S opsin exclusively, whereas the other cones mostly coexpress L and S opsin. S opsin gene analysis suggests ultraviolet (UV, wavelengths <400 nm) sensitivity, and corneal electroretinogram recordings reveal an elevated sensitivity to UV light which is mediated by an S cone visual pigment. Therefore bats have retained the ancestral UV tuning of the S cone pigment. We conclude that bats have the prerequisite for daylight vision, dichromatic colour vision, and UV vision. For bats, the UV-sensitive cones may be advantageous for visual orientation at twilight, predator avoidance, and detection of UV-reflecting flowers for those that feed on nectar.
Drought and salt stress are the major constraint to increase yield in chickpea (Cicer arietinum). Improving drought and high-salinity tolerance is therefore of outmost importance for breeding. However, the complexity of these traits allowed only marginal progress. A solution to the current stagnation is expected from innovative molecular tools such as transcriptome analyses providing insight into stress-related gene activity, which combined with molecular markers and expression (e)QTL mapping, may accelerate knowledge-based breeding. SuperSAGE, an improved version of the serial analysis of gene expression (SAGE) technique, generating genome-wide, high-quality transcription profiles from any eukaryote, has been employed in the present study. The method produces 26bp long fragments (26bp tags) from defined positions in cDNAs, providing sufficient sequence information to unambiguously characterize the mRNAs. Further, SuperSAGE tags may be immediately used to produce microarrays and probes for real-time-PCR, thereby overcoming the lack of genomic tools in non-model organisms.
Many questions regarding gastropod phylogeny have not yet been answered like the molecular confirmation of the Heterobranchia concept based on morphological studies from Haszprunar (1985a; 1988). This taxon contains the “Lower Heterobranchia” with several “primitive” or “basal” members) and the Euthyneura (with the Opisthobranchia and Pulmonata). Phylogenetic relationships of subgroups within the Heterobranchia have not been satisfactorily resolved and monophyly of some taxa within the Heterobranchia (e.g. Opisthobranchia) is questionable. Moreover, most of the “Lower Heterobranchia” have not been included in former molecular studies. In order to resolve phylogenetic relationships within the Heterobranchia, I pursued a molecular systematic approach by sequencing and analysing a variety of genetic markers (including nuclear 28S rDNA + 18S rDNA and mitochondrial 16S rDNA + COI sequences). Maximum likelihood as well as Bayesian inference methods were used for phylogenetic reconstruction. The data were investigated a priori to tree reconstruction in order to find the most appropriate dataset for reconstructing heterobranch phylogeny. A variety of statistical tests (like Chi-Square-Test or Relative-Rate-Test) were applied and the substitution saturation was measured. The Relative-Rate-Test revealed the highest evolution rates within the “Lower Heterobranchia” (Omalogyra sp., Omalogyra fusca, Murchisonella sp., Ebala sp. and Architectonica perspectiva) and Opisthobranchia (Hyalocylis striata). Furthermore, many of the nucleotide positions show a high degree of substitution saturation. Additionally, bipartitions (splits) in the alignment were examined and visualized by split network analyses to estimate data quality. A high level of conflict indicated by many parallel edges of the same lengths could be observed in the neighbournet graphs. Moreover, several taxa with long terminal branches could be identified in all three datasets belonging to the Vetigastropoda, Caenogastropoda, “Lower Heterobranchia” or Opisthobranchia (Nudipleura). All phylogenetic analyses revealed a monophyletic Heterobranchia. Within the Heterobranchia several well supported clades could be resolved. However, the traditional classification based on morphological data could not be confirmed due to paraphyletic Euthyneura (because of the inclusion of the Pyramidellidae and Glacidorboidea) as well as paraphyletic Pulmonata and polyphyletic Opisthobranchia. Based on the phylogenetic inferred evolutionary trends regarding habitat colonisation or character complexes could be deduced. A case study was conducted in order to estimate divergence ages using a “relaxed” molecular clock approach with fossils as minimum age constraints. However, due to large 95% confidence intervals a precise dating of the nodes was not possible. Hence, the results are considered as preliminary. To test the plausibility of the newly obtained hypotheses, the results were evaluated a posteriori using a hypothesis test and secondary structures of the complete 18S rRNA and 28S rRNA. Secondary structure motifs were found within domain 43 and E23 2 &5 of the 18S rRNA as well as within domain E11 and G5_1 of the 28S rRNA, which contain phylogenetic signals to support various groups within the Heterobranchia. In addition, taxon specific motifs were found separating the Vetigastropoda from the Caenogastropoda and Heterobranchia, indicating a possible application of the secondary structure of 18S rRNA and 28S rRNA to reveal phylogenetic relationships at higher taxonomic levels such as Gastropoda or even Mollusca. The utility of the newly invented software RNAsalsa for the reconstruction of secondary structures was tested. The obtained structures were used to adjust evolutionary models specific to rRNA stem (paired basepairs) and loop (unpaired basepairs) regions with the intention of improving phylogenetic results. This approach proved unsuccessful. This molecular phylogenetic investigation provides the most comprehensive molecular study of Heterobranchia relationships to date. Substantial insights into the evolution and phylogeny of this enigmatic taxon have been gained.
Background: Molecular phylogenies are being published increasingly and many biologists rely on the most recent topologies. However, different phylogenetic trees often contain conflicting results and contradict significant background data. Not knowing how reliable traditional knowledge is, a crucial question concerns the quality of newly produced molecular data. The information content of DNA alignments is rarely discussed, as quality statements are mostly restricted to the statistical support of clades. Here we present a case study of a recently published mollusk phylogeny that contains surprising groupings, based on five genes and 108 species, and we apply new or rarely used tools for the analysis of the information content of alignments and for the filtering of noise (masking of random-like alignment regions, split decomposition, phylogenetic networks, quartet mapping). Results: The data are very fragmentary and contain contaminations. We show that that signal-like patterns in the data set are conflicting and partly not distinct and that the reported strong support for a "rather surprising result" (monoplacophorans and chitons form a monophylum Serialia) does not exist at the level of primary homologies. Split-decomposition, quartet mapping and neighbornet analyses reveal conflicting nucleotide patterns and lack of distinct phylogenetic signal for the deeper phylogeny of mollusks. Conclusion: Even though currently a majority of molecular phylogenies are being justified with reference to the 'statistical' support of clades in tree topologies, this confidence seems to be unfounded. Contradictions between phylogenies based on different analyses are already a strong indication of unnoticed pitfalls. The use of tree-independent tools for exploratory analyses of data quality are highly recommended. Concerning the new mollusk phylogeny more convincing evidence is needed.
Today the structure of photosystem II, which is the enzyme responsible for the evolution of molecular oxygen by plants, algae and cyanobacteria, is known up to a resolution of about 3.0 Å in cyanobacteria (Loll et al., 2005). Photosystem II of higher plants, which shows some differences compared to the photosystem II of cyanobacteria, is not resolved in such high detail, yet (8-10 Å) (Rhee et al., 1998; Hankamer et al., 2001a). Therefore, the molecular structure of PSII of higher plants and its adjacent antenna complexes remains in the focus of the current research. One of the major problems when working with photosystem II is its relative instability during isolation. Together with the antenna proteins and several other proteins, some of which still have an unclear function, PSII forms a huge multi-protein-complex, which tends to fall apart during classical preparation methods. In order to achieve a faster and milder method of purification for PSII, four different His-tags have been added to one of the subunits of PSII. The gene targeted in this study is called psbE and codes for the α-chain of cytochrome b559, an integral part of PSII. The gene for PsbE is encoded in the chloroplast genome. The His-tags, which were employed in this work, consist of six or ten consecutive histidine aminoacid residues, which were fused to the N-terminus of the protein, either with or without a cleavage site for the protease “Factor Xa”. The N-terminus of PsbE is located on the more accessible stromal side of the thylakoid membrane. After inserting the psbE gene in a vector plasmid, in which the recognition site for the restriction endonuclease SacI had been eliminated, the different His-tags were generated by PCR with purposefully altered primers. In a final cloning step, a gene, which confers resistance to the antibiotics spectinomycin and streptomycin, was added to the DNA construct. Subsequently, the so-called biolistic transformation method (“gene gun”) was applied to introduce this genetically engineered plasmid DNA to Nicotiana tabacum chloroplasts (Bock & Hagemann, 2000). Through the processes of homologous recombination that take place in the chloroplast, the plastid encoded wildtype psbE gene was replaced by its His-tag containing counterparts. After several rounds of regenerating plants on antibiotic-containing medium, successful transformation was confirmed through PCR methods. By self fertilisation of fully regenerated plants, seeds were produced from tobacco strains, which carried only the mutated psbE gene. Plants cultivated from these seeds showed no distinctive phenotype under the chosen growth conditions, in respect to wildtype plants. The presence of the His-tag in this F1 generation was again confirmed with PCR methods. Measurements of oxygen evolution and pulse amplitude modulated fluorescence (PAM), carried out with preparations of wildtype and transgenic tobacco strains, revealed no differences for photochemical or non-photochemical quenching between both types. However, the oxygen evolution capacity of transgenic tobacco thylakoids compared to the wildtype was significantly reduced, although the chlorophyll content in relation to the leaf area was almost identical. This hints at a reduced amount of photosystem II complexes in the thylakoid membranes of transgenic tobacco. This alteration could be related to the mutation of cytochrome b559, because, amongst other functions, this subunit was shown to be important for the assembly of photosystem II (Morais et al., 1998). If solubilised thylakoid preparations of His-tagged plant strains were applied to a Ni-NTA column, photosystem II was selectively bound to the matrix. After washing away most of the contaminations, photosystem II core complexes could be eluted with imidazole-containing buffer. Photosystem II prepared in this way, displayed a drastic reduction of the peripheral light-harvesting complexes (LHCI & LHCII) and photo-system I reaction centres. This could be demonstrated by the loss of chlorophyll b and xanthophyll bands (LHCs) in absorption spectra, a small blue-shift of the chlorophyll a Qy absorption (PSI) and the respective band patterns in polyacrylamide gel electro-phoresis. The photosystem II complexes prepared in this way can now be put to use in different structural studies, like two-dimensional or three-dimensional crystallisation and spectroscopic measurements. Another photosynthetic pigment-protein complex of interest is the fucoxanthin-chlorophyll a/c-binding protein of diatoms, because eukaryotic algae, like diatoms, are important factors of oceanic ecosystems and account for a large part of marine biomass production. In order to facilitate ultra-fast time-resolved transient absorption spectroscopy and subsequent modelling of the kinetic traces, FCPs were prepared by sucrose-gradient ultra-centrifugation and their pigment stoichiometries determined by HPLC. Combining the spectroscopic data (Papagiannakis et al., 2005) with protein sequence alignments (Eppard & Rhiel, 1998) and the structure of the homologous higher plant LHCIIb (Kühlbrandt et al., 1994), a hypothetical model for the structure of FCP could be proposed (Fig. IV.3)
Mit der vorliegenden Arbeit wurde die Nutzbarkeit morphologischer und anatomischer Merkmale aus den Bereichen des Fruchtknotens und der Samenanlangen für die Systematik und Taxonomie der Bromelioideae (Bromeliaceae) untersucht. Hierzu wurden 30 Merkmale im Bereich des Fruchtknotens und der Samenanlagen definiert und anhand anatomischer Schnittpräparate die Verteilung der Merkmalsausprägungen an 102 Arten aus 28 (von 32) Gattungen der Unterfamilie Bromelioideae sowie zwei Vertretern der Unterfamilie Pitcairnioideae als Vergleichgruppe ermittelt. Allein 41 Taxa entstammten der größten und als polyphyletisch anzunehmenden Gattung Aechmea mit Vertretern aus allen sieben Untergattungen. Die Auswertung der Merkmalsverteilung erfolgte einerseits im Hinblick auf eine funktionale Deutung beobachteter Kopplungen bestimmter Strukturen im ökologischen Kontext und zum anderen unter taxonomischen Gesichtspunkten im Hinblick auf Beantwortung der Fragen, wieweit derzeitige Gattungsumgrenzungen von den hier untersuchten Merkmalen unterstützt werden, bzw. wie weit Anregungen zur Abänderung bestehender Konzepte abgeleitet werden können, welche Beziehungen zwischen den Untergattungen von Aechmea und anderen Gattungen der Bromelioideae bestehen und wodurch sich basale Linien der Bromelioideae von den abgeleiteten Formen der „Eu- Bromelioideae“ im Sinne von SCHULTE (2007) unterscheiden lassen. Um diese Fragen zu beantworten, wurden zwei unterschiedliche Ansätze kombiniert. Die Verteilung der Merkmalszustände wurde einerseits auf Topologien geplottet, die aus publizierte Phylogenien mit genetischen Merkmalen als Datenquelle beruhen. Desweiteren wurden neue Parsimonieanalysen durchgeführt a) auf der Grundlage einer morphologischen Datenmatrix mit den 30 selbst erhobenen Merkmalen aus dem Fruchtknoten- und Samenbereich, b) einer weiteren Matrix, in die fünf weitere selbst erhobene Merkmale aus dem floralen Bereich eingehen und schließlich c) einem Datensatz, in den zusätzlich acht aus der Literatur entnommene Angaben zur Morphologie und Ökologie der untersuchten Pflanzen eingingen. Die aus den molekularen Analysen von SCHULTE et al. (2005) hervorgehende Gliederung der Unterfamilie in eine paraphyletische Gruppe von basalen Linien und der von SCHULTE (2007) als „Eu-Bromelioideae“ bezeichneten monophyletischen Gruppe abgeleiteterer Gattungen findet eine deutliche Entsprechung in Merkmalen des Fruchtknotenbereichs und der Samenanlagen. Die untersuchten Vertreter der basalen Linien besitzen alle ± rechtwinklig von der Fruchtknotenachse abspreizende Samenanlagen, diese sind auf mehr als 70% der Fruchtknotenachse verteilt und die Mikropyle ist stets relativ lang ausgebildet (>100 micro m). Eine der Kerninnovationen der Eu-Bromelioiden scheint die Entwicklung des chalazalen Samenanhängsels als Hilfsinstrument bei der Besiedlung glatter Oberflächen gewesen zu sein. Diese Struktur findet sich nur bei Eu-Bromelioideae und ist stets bereits an der Samenanlage vorgebildet. Sekundär scheint dieses chalazale Anhängsel innerhalb der Eu-Bromelioideae allerdings auch immer wieder verloren gegangen zu sein. Die Umgrenzung der meisten Gattungen sowohl der basalen Linien als auch der Eu-Bromelioideae konnten in ihrer jetzigen Form anhand der Merkmale des Fruchtknotenbereichs und der Samenanlagen nachvollzogen werden. Eine Ausnahme hiervon stellt lediglich die hochgradig polyphyletische Gattung Aechmea s.l. dar. Für keine der untersuchten Gattungen konnten synapomorphe Merkmalszustände erkannt werden, vielmehr gibt es jeweils gattungsspezifische Kombinationen von Merkmalen. Die Ausprägungen der Einzelmerkmale dagegen sind stets auch in anderen Verwandschaftsgruppen zu beobachten. Die hier untersuchten Merkmale unterstreichen das für die Bromelioideae seit langem bekannte Phänomen eines extrem hohen Homoplasiegrades in nahezu allen morphologischen Strukturen. Selbst für den Fruchtknoten lassen sich klare Abhängigkeiten der Merkmalsausprägungen von ökologischen Selektionsfaktoren erkennen. Insbesondere scheinen funktionale Notwendigkeiten im Kontext der Nektarsekretion und der Bestäubungsökologie für die Merkmalsausprägung des Fruchtknotens eine wichtige Rolle zu spielen. Die Samenanlage ist zwar zum Zeitpunkt der Anthese noch nicht direkten Selektionsdrücken ausgesetzt, ihre Merkmale sind aber nur dann zu verstehen, wenn die Funktion hier bereits angelegter Strukturen (wie z.B. der chalazalen Samenanhängsel) im Kontext mit den reifen Samen gedeutet wird.
Entwicklung eines bioartifiziellen Nierentubuluskonstruktes auf Basis humaner Nierenepithelzellen
(2009)
Bei einem chronischen oder akuten Ausfall der Niere stehen im klinischen Alltag extrakorporale Nierenersatzverfahren, wie die Hämodialyse, Hämofiltration und Hämodiafiltration zur Verfügung. Die genannten medizinischen Verfahren bilden nur die physikalischen Prinzipien des Glomerulus ab und können die, über eine reine Stofftrennung hinausgehenden, im Besonderen die komplexen, physiologischen Funktionen des renalen Tubulussystems nicht nachbilden. Die mit dem Ausfall der Nierenfunktion verbundenen metabolischen und endokrinen Störungen werden somit nicht ausreichend korrigiert und sind Ursache der hohen Morbidität und Mortalität dieser Patientengruppe durch kardio-vaskuläre sowie inflammatorische Komplikationen. Mit der Anwendung des Tissue Engineerings, der Integration von Zellen bzw. Geweben und deren biologischer Funktionen in form- und funktionsgebende Substrate stünden für diese Problematik Methoden zur Verfügung, die fehlenden biologischen Funktionen der Tubulusepithelien der Niere in die bereits vorhandenen, modernen Nierenersatztherapien zu integrieren und den Patienten zur Verfügung zu stellen. Im Rahmen dieser Arbeit wurden Membranmaterialien, Kulturbedingungen wie Sauerstoffbedarf, Medienformulierungen und Strömungszustände identifiziert, Systeme und Methoden entwickelt, die es ermöglichen, ein BTK mit primären, humanen Tubuluszellen zu bilden und über mikroskopische Methoden den Differenzierungsstatus der Zellen innerhalb der Membrankapillaren zu erfassen. Der Sauerstoffbedarf distaler und proximaler Tubulusepithelzellen wurde unter verschiedenen Bedingungen ermittelt und führte zusammen mit einem Literaturvergleich sowie theoretischen Betrachtungen der maximalen Scherkräfte zur Auslegung der in vitro Perfusionsparameter des entwickelten Kultursystems. Es konnte ein klinisch etabliertes Membranmaterial identifiziert werden, welches den primären Zellen ohne vorherige Bioaktivierung als ein optimales Substrat dient und somit spätere Zulassungsverfahren für den klinischen Einsatz vereinfacht. Die Entwicklung eines serumarmen Mediums für die Kultur der primären Zellen stellte sich als wichtigster Schritt in der Übertragung der zuvor mit permanenten Zelllinien entwickelten Systeme und Methoden heraus. Mittels mikroskopischer Methoden (REM & CLSM) konnte die Differenzierung der verwendeten Tubulusepithelzellen innerhalb der Hohlfasermodule anhand spezifischer Marker nachgewiesen und somit der Erfolg der in dieser Arbeit entwickelten Systeme und Methoden dokumentiert werden. Trotz des Nachweises der prinzipiellen Machbarkeit im Labormaßstab, stellt die verwendete Zellquelle aufgrund der geringen Verfügbarkeit im Upscaling Prozess vom Labor hin zu einem klinischen Therapieverfahren, die größte Hürde dar. Aktuelle Entwicklungen bei der Identifizierung adulter Stammzellfraktionen der Niere, im Besonderen der Beitrag CD133+ Zellen bei der Tubulusregeneration wurden in dieser Arbeit aufgegriffen. Die Ergebnisse des durchgeführten CD133 Screenings der verwendeten Zellfraktionen zeigen, dass gerade die hochaufgereinigten, proximalen und distalen Fraktionen einen verminderten Anteil dieser potentiellen Stammzellfraktion enthalten. Weniger aufgereinigte Fraktionen könnten somit eine Alternative bei der zukünftigen Entwicklung von bioartifiziellen Tubuluskonstrukten darstellen.
Nicht zu vergessende Moleküle ... : flexibles "Networking" von Nervenzellen formt das Gedächtnis
(2009)
Ein funktionierendes Gedächtnis beruht darauf, dass die Kontakte zwischen den Milliarden Nervenzellen in unserem Gehirn sich ständig verändern und anpassen. Häufig verwendete Signalwege werden verstärkt und ausgebaut, wie eine Landstraße zu einer Schnellstraße. Weniger häufig benutze Signalwege können dagegen abgebaut werden. Die Signalübertragung verlangsamt sich wie der Verkehr auf einer lange nicht mehr instand gehaltenen Straße. Will man diese Prozesse auf molekularer Ebene verstehen, muss man die Synapsen näher betrachten. Das sind spezialisierte Kontaktstellen, die es den Nervenzellen ermöglichen, hochkomplexe Netzwerke, sogenannte Schaltkreise, zu knüpfen. Die Flexibilität dieser Schaltkreise ermöglicht es uns, Informationen zu verarbeiten und entsprechend zu reagieren. Inzwischen kennt man eine Fülle von Boten-Molekülen, Rezeptoren und Liganden, die diese Prozesse auf molekularer Ebene steuern.
Photosystem II (PSII) is a polypeptide-cofactor complex organised as a homodimeric multisubunit protein embedded in the thylakoid membrane. PSII monomers are heterooligomers related to each other by a pseudo-twofold axis perpendicular to the membrane plane (Loll et al. 2005). PSII acts as a photochemical enzyme that through the chlorophylls and the other cofactors catalyses photon capture and electron transfer from water to the plastoquinone pool with concomitant evolution of oxygen. Photon capture and charge separation take place in the PSII core which consists of the D1 and D2 proteins, the cytochrome b559 alpha- and beta-chains (PsbE and F subunits) and the chlorophyll a-binding antenna proteins CP43 and CP47 (Loll et al. 2005). The remaining polypeptides are low molecular mass proteins with not clearly understood fuctions; they include chloroplast-encoded (PsbH, I, J, K, L, M, N, T and Z) and nucleus-encoded (PsbR, S, W and X) proteins consisting of one to four transmembrane helices (Barber et al. 1997). The oxygen-evolving part of PSII consists of a Mn-Ca transition complex called Mn cluster or oxygen evolving complex that is situated on the luminal side of PSII. In higher plants it is stabilised by the PsbO (33 kDa), PsbP (23 kDa) and PsbQ (17 kDa) extrinsic subunits (Soursa et al. 2006; Ifuku et al. 2005). The structure and mechanisms related to the oxygen evolving complex of PSII are not completely clarified. Currently two high resolution structures from the cyanobacteria S. elongatus are available (Loll et al. 2005; Ferreira et al. 2004) Nevertheless structural information is not as well defined in green algae and higher plants as in cyanobacteria. In fact the 8Å structure available from spinach has too low resolution for addressing questions such as the structural and functional differences in respect to PSII from cyanobateria (Rhee et al. 1997).. Therefore it is obvious that for PSII from higher plants the main general questions are still open: is the structure of PSII from higher plants equivalent to the structures observed in cyanobacteria? Is the typical higher plants subunit PsbS stably or transiently bound to PSII? Finding an answer to these questions was the main focus of this work. In this work a simple and rapid protocol to isolate the oxygen-evolving photosystem II (PSII) core complex from Nicotiana tabacum was developed. A PSII having a His-tag extension made of six or ten consecutive histidine residues at the N-terminus of the PsbE subunit was purified by a single-step Ni2+ NTA-affinity column chromatography after solubilisation of the thylakoid membranes using different mild detergents. Characterization of the oxygen evolution and the subunit composition by immunoblotting and mass spectroscopy revealed that the His-tagging did not affect the functional integrity of the PSII reaction center. The final PSII core complex was purified in a single step from solubilised thylakoids in less than 14 hours getting a very pure sample in high amount. The isolated core complex was in a dimeric form as demonstrated by Blue Native PAGE, analytical gel filtration and single particles analysis; with a molecular mass of about 500 kDa, consisting of D1, D2, CP43, CP47, 33 kDa and low molecular weight proteins. The preparation retains a high rate of oxygen-evolving activity but showed different stabilities of the binding of the three extrinsic proteins. The subunit of 33 kDa was always present in the preparations with a constant amount, whereas the 23 and 17 kDa subunits were always in less and unconstant amounts. Nevertheless the oxygen evolution was not depending on the amount of the 23 and 17 kDa subunits. Furthermore the preparation showed a high oxygen-evolving activity of 1390 micromol/mg Chl·h-1 in presence of betaine, while its activity was 440-680 micromol/mg Chl·h-1 in its absence. The presence of 1.0 mol/L betaine during the isolation of PSII increased the preservation of the photochemical activity hence the oxygen evolution. It was inferred from these results that His-tagging does not affect the functional and structural integrity of the PSII core complex and that the “Histag strategy” is highly useful for biochemical, physicochemical and structural studies of higher plant PSII. PSII is directly involved in two essential processes, the efficient capture and funnelling of light energy to the reaction centre and the controlled dissipation of excess excitation energy. Those functions require structural and functional flexibility in order to be performed with high efficiency. Moreover light-harvesting proteins respond to an external signal, the thylakoid pH, to induce feedback control regulating those activities in every moment. This process called non-photochemical quenching (NPQ) is mainly depending on the xanthophyll cycle and the PsbS protein (Szabo et al. 2005). In this work several new evidences related with those two processes were found. The subunit PsbS is a polypeptide whose involvement in the NPQ processes is debated. Nevertheless, its position in the PSII complex and the mechanisms by which this subunit contributes to carry out the NPQ functions are not definitely known. In addition it is not sure if it is a pigment binding protein or not. Currently several lines of evidence indicate that this subunit is able to bind two molecules of zeaxanthin, one of the pigments involved in the xanthophyll cycle. In this work immunolabelling indicated that PsbS is tightly bound to the PSII core dimer, monomer and incomplete PSII particles as Reaction Centre-CP47 (RC-CP47). Furthermore qualitative HPLC indicates a complete absence of zeaxanthin in the sample and the presence of violaxanthin, another pigment involved in the xanthophyll cycle. The absence of zeaxanthin was expected considering that the plants were harvested after the dark period and that the particles were purified in complete dark (or in green light), whereas the presence of violaxanthin was unexpected considering that so far no evidence of violaxanthin bound to PSII cores devoid of LHC proteins was reported. Furthermore the amount of chlorophyll b was not relevant for suspecting this pigment bound to PsbS. Therefore we conclude that if PsbS is able to bind chlorophyll it has to be a chlorophyll a. The results indicate that PsbS could be able to bind not only zeaxanthin but also violaxanthin. The extrinsic subunit Psb27 was also found in this preparation. The presence and the amount of this subunit, reported to be involved in the repair of damaged PSII, was not constant and therefore behaving as the other two extrinsic proteins 23kDa (PsbP) and 17kDa (PsbQ). Electron crystallography studies on spinach PSII particles purified by differential solubilisation resulted in crystalline tubes with new unit cell constants. From data analysis a density map at 15Å resolution was obtained with a P22121 symmetry. However, at this resolution it cannot be said if the internal symmetry axis is related with the two-fold axis of the dimer or the pseudo two-fold axis of the monomer. In conclusion a method to isolate functional, pure PSII core complexes was developped. These samples, together with the improved 2d crystallisation protocol could lead to crystals with higher quality hence better resolution density maps in the future.
Wer hat nicht angesichts rauchender Schlote und verschmutzter Luft von Kraftwerken geträumt, die reinen Sauerstoff produzieren? Die Natur erbaut solche Kraftwerke täglich neu – in Pflanzen. Darin verwandelt der grüne Blattfarbstoff Chlorophyll Sonnenlicht und Kohlendioxid in Sauerstoff und Energie. Die komplexen Reaktionen laufen in mikroskopisch kleinen Maschinen – den Photosystemen – ab. Aber was haben Kraftwerke mit Kamelen zu tun? Wie auch bei den uns bekannten Kraftwerken gibt es in Pflanzen ein »Werksgelände«, die Chloroplasten. Sie besitzen einen Eingang, durch den zuweilen Moleküle passieren müssen, die so groß sind wie das sprichwörtliche Kamel, das durch ein Nadelöhr gehen soll.