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Degenerationsvorgänge am Innenohr und experimentelle Untersuchungen über Protektionsmöglichkeiten
(2000)
Hörverluste durch Innenohrschäden gelten beim Menschen und anderen Säugetieren als irreversibel. Deshalb wird es von vielen Wissenschaftlern versucht, eine Regeneration im Innenohr der Säugetiere zu induzieren oder das Ohr pharmakologisch vor Schädigung zu schützen. Ziel dieser Arbeit war es zu untersuchen, ob neurotrophe Wachstumsfaktoren Meerschweinchen vor experimentell ausgelösten Innenohrschäden schützen können. Als erstes wurde in dieser Arbeit ein Tiermodell zur akuten und frequenzspezifischen Hörschädigung entwickelt. Meerschweinchen wurden Kanamycin und Ethakrynsäure intravenös infundiert. Es wurde festgestellt, daß die erwünschten frequenzspezifischen Hörverluste durch 266 mg/kg Kanamycin kombiniert mit 30 mg/kg Ethakrynsäure reproduzierbar induziert werden konnten. Die Hörschwellen und ihre Verluste wurden anhand der Summenaktionspotentiale vom Hörnerv bestimmt. Anschließend wurde an Meerschweinchen eine Methode zur chronischen Applikation von Wachstumsfaktoren ausgearbeitet. Es wurden drei implantierbare Applikationssysteme getestet, das Mikrodosiersystem (MDS) aus der Tübinger HNO-Klinik, die wiederbefüllbaren ESOX-Pumpen und osmotische ALZET-Pumpen. Durch die osmotischen ALZET-Mikropumpen konnten neurotrophe Faktoren über einen Zeitraum von mehreren Wochen kontinuierlich und zuverlässig appliziert werden. Diese Pumpen wurden in Meerschweinchen implantiert und lieferten eine Lösung mit der Testsubstanz oder eine Kontrollösung, die an das runde Fenster der Cochlea oder in die Zerebrospinalflüssigkeit abgegeben wurden. Im dritten Teil der Arbeit wurden die beiden entwickelten Methoden miteinander kombiniert. Damit war es möglich zu testen, ob der durch die Mikropumpen applizierte neurotrophische Faktor-3 (NT-3) die durch Ototoxika ausgelösten Schwellenverluste vermindert, Argumente für die Wahl von NT-3 waren, daß NT-3 in vitro bereits eine starke protektive Wirkung an den Neuronen des Spiralganglions erwiesen hatte (Marzella et al., 1997). Außerdem sind Rezeptoren für NT-3 auch bei adulten Tieren in den cochleären Haarzellen vorhanden. Die physiologische Wirkung von NT-3 war aber in vivo noch nicht untersucht worden. Zu Beginn der Experimente wurden die Tiere mit Mikropumpen implantiert, die über 14 Tage eine NT-3-haltige oder Kontrollösung applizierten. Vier Tage nach Implantation der Pumpen wurden die Meerschweinchen durch die Infusion der oben genannten ototoxischen Arzneimitteln vertäubt. Die Hörschwellen wurden kurz bevor und über 32 Tage nach der Vertäubung gemessen. Die Hörschwellen der mit NT-3 behandelten Tiere wurden mit den Hörschwellen der Kontrolltiere verglichen. Durch die Infusion von Kanamycin und Ethakrynäure wurden bei Meerschweinchen Hörverluste in der Größenordnung von 40 dB induziert. Bei der Gabe von NT-3 an die rechten Cochleae wurden diese ototoxisch ausgelösten Schwellenverluste um 9 dB vermindert, und dies nicht nur auf der behandelten, sondern auch auf der kontralateralen Seite. Diese Befunde deuteten darauf hin. daß bei der lokalen Gabe die neurotrophen Faktoren auf systemischem Wege auch andere Seite erreichen und dort eine Wirkung ausüben. Ähnliche Effekte wurden auch bei lokaler Gabe von einem anderen neurotrophen Faktor, Glial cell line-derived neurotrophic factor (GDNF), beoobachtet (Shoji et al., 2000). Die kontralaterale Wirkung war hier aber schwächer (3 dB), als die ipsilaterale (5 dB). Die ins Ohr implantierten Pumpen verursachten per se Hörverluste von etwa 5 dB. NT-3 verminderte auch diese Hörverlustedurchschnittlich um 4 dB. In einer weiteren Versuchsreihe wurde der systemische Effekt von NT-3 geprüft. Dafür wurde NT-3 nicht lokal an das runde Fenster der Cochlea, sondern in die Zerebrospinalflüssigkeit appliziert. Die ototoxisch ausgelösten Hörverluste konnten durch den systemisch gegebenen NT-3 um 5 dB verringert werden. Relativ zu den ototoxisch ausgelösten Hörverlusten in der Größenordnung von 40 dB war die Protektion durch systemisch (5 dB) oder lokal (9 dB) applizierten NT-3 gering. Die stärkste otoprotektive Wirkung durch Wachstumsfaktoren, von 12-18 dB, wurde bis jetzt durch gentechnisch in die Cochlea eingebrachten GDNF erreicht (Yagi et al., 1999). Der Schutzeffekt durch den lokal am Ohr gegebenen GNDF (5 dB, Shoji et al., 2000) war aber geringer, als der vom identisch verabreichten NT-3 (9 dB, diese Arbeit, s. auch Sudavicius et al., 2000). Wenn durch gentechnische Art des Verabreichens die Wirkung von NT-3 im gleichen Maße potenziert werden sollte, wie es bei GDNF der Fall ist, wäre die protektive Wirkung von NT-3 stärker als die von GDNF.
Im Rahmen der vorliegenden Dissertation wurde die Rolle des Transkriptionsfaktors Meis2 als Ko-Faktor in der Entwicklung des anterioren Neuralrohrs untersucht. Hierbei gaben funktionelle Untersuchungen durch Fehl- und Überexpressionsstudien mittels in ovo Mikroelektroporation im Hühnchenembryo, Aufschluss über eine besondere Rolle von Meis2 bei der Spezifizierung und Entwicklung des Tectum opticums. Überdies führten bio-chemische Untersuchungen zur Identifizierung neuer, bislang noch nicht beschriebener Interaktionspartner von Meis2 im sich entwickelnden optischen Tektum und in den Anlagen der Augen. Diese Untersuchungen geben einen weiteren Einblick in die Funktionsweise von Meis2 als Ko-Transkriptionsfaktor. Zusammengefasst lieferten die Untersuchungen der vorliegenden Arbeit folgende Erkenntnisse: I) Im Mittelhirn ist Meis2-Expression unter den bislang beschriebenen Regulatoren der Mittelhirnentwicklung einzigartig: es ist von Beginn an nicht dynamisch und kennzeichnet ausschließlich die dorsalen Alarplatten des Mittelhirns, den Bereich des zukünftigen optischen Tektums (Kapitel 3.1). Diese Expression unterliegt einer strikten negativen Regulation durch sezernierte Moleküle und Transkriptionsfaktoren der benachbarten Regionen des Neuralrohrs (Kapitel 3.2). II) Meis2 ist für tektale Entwicklung erforderlich: Die Überexpression des dominant negativ wirkenden Konstruktes Meis2EnR störte die Entwicklung tektumspezifischer Strukturen sowohl in der frühen als auch in der späteren Entwicklung (Kapitel 3.3.1 und 3.3.2). Zudem kam es zur Unterdrückung der tektalen Gene ephrinB1 und Dbx1 (Kapitel 3.3.3 und 3.3.4). III) Meis2 ist für tektale Entwicklung ausreichend: Die Fehlexpression von Meis2 führte zur Induktion und Entwicklung ektopischer tektaler Strukturen im Dienzephalon (Kapitel 3.3.5). Dabei führte Meis2 bereits 24 h nach Fehlexpression zur Transdifferenzierung des dienzephalischen in mesenzephalisches Zellschicksal, veränderte jedoch nicht das Schick-sal des metenzephalischen Gewebes (Kapitel 3.3.7). IV) Bei der Induktion tektaler Strukturen ist Meis2 nicht Bestandteil des regulatorischen Netzwerks des Mittel-Hinterhirn Organisators (MHO), eines sekundären Organisators, welcher die Entwicklung der Mittel-Hinterhirn Region steuert (Kapitel 3.3.8). V) Meis2 bildet jedoch im Mittelhirn in vivo Komplexe mit Otx2, einem Schlüsselmolekül zur Spezifizierung des anterioren Neuralrohrs (Kapitel 3.4.1 - 3.4.3). VI) Meis2 kann in vitro durch Bindung an Otx2 einer Grg4/Tle4-vermittelten Unter-drückung der transkriptionellen Aktivität von Otx2 entgegenwirken (Kapitel 3.4.4). Otx2 kann, wie bereits in Arbeiten anderer Labors beschrieben, kontext-abhängig entweder als transkriptioneller Repressor oder Aktivator wirken. Die in dieser Arbeit dargestellten Ergebnisse zeigen daher einen möglichen molekularen Mechanismus auf, wie durch zeitlich und räumlich kontrollierte Bindung eines Ko-Aktivators an Otx2 dessen transkrip-tionelle Aktivität wieder hergestellt werden kann. Die Ergebnisse dieser Arbeit beschreiben zum ersten Mal einen Transkriptionsfaktor, der unabhängig vom regulatorischen Netzwerk des MHO, die Entwicklung des optischen Tektums induziert. Sie liefern somit ein neuartiges mögliches Modell zur Spezifizierung anteriorer Hirnstrukturen: Die Induktion tektaler Entwicklung erfolgt nach Etablierung der Mittel-Hinterhirn Region durch Meis2, einem tektumspezifischen Ko-Faktor von Otx2. VII) Meis2 bildet, im sich entwickelnden Mittelhirn, auch Komplexe mit den beiden Regulatoren der Tektumentwicklung Pax3 und Pax7 (Kapitel 3.4.5). VIII) Außerdem konnten im Rahmen dieser Arbeit zwei weitere mögliche Interaktions-partner von Meis2 in den Anlagen der Augen identifiziert werden: Pax6, einem „master control gene“ der Augenentwicklung (Kapitel 3.4.6) und das Enzym Parp-1 (Kapitel 3.4.7), einem weit verbreiteten und vielseitigen Regulator der Genexpression. Diese Ergebnisse liefern Hinweise auf weitere wichtige Funktionen des Ko-Transkriptions-faktors Meis2 in der Entwicklung des anterioren Zentralnervensystems.
Helicobacter pylori (H. pylori) ist ein gram-negatives, mikroaerophiles Bakterium. Es kolonisiert die menschliche Magenschleimhaut, wobei mehr als 50% der Menschheit befallen sind. Als Pathogen begünstigt es die Entstehung von Magengeschwüren und –krebs. Experimentelle Befunde deuten darauf hin, dass H. pylori während der Infektion Kontakt zu Membranproteinen der Wirtszellen aufnimmt, um ein Typ IV Sekretionssystem aufzubauen und den primären Virulenzfaktor CagA (Cytotoxin Associated Antigen A) in die Wirtszelle zu translokieren. Diese Integrine genannten Membranproteine werden bei polaren Epithelzellen allerdings bevorzugt basolateral expremiert. Außerdem können extrazellulär geschnittene E-Cadherinfragmente im Medium mit H. pylori infizierter Zellkulturen nachgewiesen werden. Beide Beobachtungen legen den Schluss nahe, dass eine Protease von H. pylori sekretiert wird und die Zell-Zell-Kontakte degradiert, um H. pylori den Zugang zur basolateralen Seite der Wirtszellen zu ermöglichen. Das vom Gen hp1019 des Stammes H. pylori 26695 codierte Protein HtrA konnte im Rahmen einer Kooperation mit dem Paul-Ehrlich-Institut in Langen im Überstand von H. pylori mit proteolytischer Aktivität nachgewiesen werden. Um den Einfluss dieser extrazellulären Protease auf die Infektion von Kulturzellen mir H. pylori zu untersuchen, sollte ein niedermolekularer Inhibitor für HtrA gefunden werden. Ein Homologiemodell als Grundlage für ein strukturbasiertes virtuelles Screening wurde berechnet, wobei die aktive Konformation der Protease DegP von Escherichia coli als Vorlage diente (PDB Identifikation 3cs0). Für einen neue, im Rahmen dieser Untersuchung entwickelten Methode wurde PocketPicker eingesetzt, um Größe und Form der die Bindetaschen auf der Proteinoberfläche vorherzusagen. Durch die komplementäre Projektion von Proteinatomtypen auf diese definierte Volumen kann so für eine von PocketPicker vorgesagte Bindetasche ein potentielles Pharmakophormodell berechnet und für Datenbanksuchen eingesetzt werden. In retrospektiven Studien konnte die Funktion dieser Berechungen für eine Auswahl an pharmakologisch wichtigen Proteinen aus verschiedenen Strukturklassen validiert werden. Dabei stellte sich vor allem eine Abhängigkeit der Güte der Modelle von der Güte der Vorhersage von PocketPicker heraus, was den Schluss zulässt, dass eine möglichst genaue Definition der Bindetasche für das Gelingen eines strukturbasierten virtuellen Screening unerlässlich ist. Für die Protease HtrA von H. pylori konnten erfolgreich drei strukturabgeleitete Pharmakophormodelle berechnet werden, wobei jeweils verschiedene von PocketPicker vorhergesagte Bindetaschen einbezogen wurden. Die Molekülkataloge der Firmen Asinex und Specs wurden nach Ähnlichkeit zu diesen Modellen sortiert und nach Begutachtung der jeweils ähnlichsten 100 Substanzen wurden 26 Substanzen ausgewählt und bestellt. In einem in vitro Assay mit der rekombinanten Protease HtrA inhibierten 6 Substanzen den Verdau eines rekombinanten Substrats. Die beste Verbindung erreichte in dem Assay eine maximale Inhibition von ca. 77 % bei einer mittleren inhibitorischen Konzentration bei halbmaximaler Inhibition (IC50) von ca. 26 µM.
Diffusion of inner membrane proteins is a prerequisite for correct functionality of mitochondria. The complicated structure of tubular, vesicular or flat cristae and their small connections to the inner boundary membrane impose constraints on the mobility of proteins making their diffusion a very complicated process. Therefore we investigate the molecular transport along the main mitochondrial axis using highly accurate computational methods. Diffusion is modeled on a curvilinear surface reproducing the shape of mitochondrial inner membrane (IM). Monte Carlo simulations are carried out for topologies resembling both tubular and lamellar cristae, for a range of physiologically viable crista sizes and densities. Geometrical confinement induces up to several-fold reduction in apparent mobility. IM surface curvature per se generates transient anomalous diffusion (TAD), while finite and stable values of projected diffusion coefficients are recovered in a quasi-normal regime for short- and long-time limits. In both these cases, a simple area-scaling law is found sufficient to explain limiting diffusion coefficients for permeable cristae junctions, while asymmetric reduction of the junction permeability leads to strong but predictable variations in molecular motion rate. A geometry-based model is given as an illustration for the time-dependence of diffusivity when IM has tubular topology. Implications for experimental observations of diffusion along mitochondria using methods of optical microscopy are drawn out: a non-homogenous power law is proposed as a suitable approach to TAD. The data demonstrate that if not taken into account appropriately, geometrical effects lead to significant misinterpretation of molecular mobility measurements in cellular curvilinear membranes.
Oscillating magnetic field disrupts magnetic orientation in Zebra finches, Taeniopygia guttata
(2009)
Background Zebra finches can be trained to use the geomagnetic field as a directional cue for short distance orientation. The physical mechanisms underlying the primary processes of magnetoreception are, however, largely unknown. Two hypotheses of how birds perceive magnetic information are mainly discussed, one dealing with modulation of radical pair processes in retinal structures, the other assuming that iron deposits in the upper beak of the birds are involved. Oscillating magnetic fields in the MHz range disturb radical pair mechanisms but do not affect magnetic particles. Thus, application of such oscillating fields in behavioral experiments can be used as a diagnostic tool to decide between the two alternatives. Methods In a setup that eliminates all directional cues except the geomagnetic field zebra finches were trained to search for food in the magnetic north/south axis. The birds were then tested for orientation performance in two magnetic conditions. In condition 1 the horizontal component of the geomagnetic field was shifted by 90 degrees using a helmholtz coil. In condition 2 a high frequently oscillating field (1.156 MHz) was applied in addition to the shifted field. Another group of birds was trained to solve the orientation task, but with visual landmarks as directional cue. The birds were then tested for their orientation performance in the same magnetic conditions as applied for the first experiment. Results The zebra finches could be trained successfully to orient in the geomagnetic field for food search in the north/south axis. They were also well oriented in test condition 1, with the magnetic field shifted horizontally by 90 degrees. In contrast, when the oscillating field was added the directional choices during food search were randomly distributed. Birds that were trained to visually guided orientation showed no difference of orientation performance in the two magnetic conditions.
Background Different iron transport systems evolved in Gram-negative bacteria during evolution. Most of the transport systems depend on outer membrane localized TonB-dependent transporters (TBDTs), a periplasma-facing TonB protein and a plasma membrane localized machinery (ExbBD). So far, iron chelators (siderophores), oligosaccharides and polypeptides have been identified as substrates of TBDTs. For iron transport, three uptake systems are defined: the lactoferrin/transferrin binding proteins, the porphyrin-dependent transporters and the siderophore-dependent transporters. However, for cyanobacteria almost nothing is known about possible TonB-dependent uptake systems for iron or other substrates. Results We have screened all publicly available eubacterial genomes for sequences representing (putative) TBDTs. Based on sequence similarity, we identified 195 clusters, where elements of one cluster may possibly recognize similar substrates. For Anabaena sp. PCC 7120 we identified 22 genes as putative TBDTs covering almost all known TBDT subclasses. This is a high number of TBDTs compared to other cyanobacteria. The expression of the 22 putative TBDTs individually depends on the presence of iron, copper or nitrogen. Conclusions We exemplified on TBDTs the power of CLANS-based classification, which demonstrates its importance for future application in systems biology. In addition, the tentative substrate assignment based on characterized proteins will stimulate the research of TBDTs in different species. For cyanobacteria, the atypical dependence of TBDT gene expression on different nutrition points to a yet unknown regulatory mechanism. In addition, we were able to clarify a hypothesis of the absence of TonB in cyanobacteria by the identification of according sequences.
Vasculogenesis as well as angiogenesis are important for postnatal development of blood vessels. Peripheral blood or bone marrow-derived endothelial precursor cells are used in clinical trials for therapeutic enhancement of postnatal neovascularization in patients suffering from coronary artery diseases. The vasculogenic potential of the precursor cell population depends on the appropriate retention of the infused cells to the ischemic tissue. However, cell-autonomous mechanisms regulating the attraction and retention of circulating cells in inflammatory tissue are not well understood. Caspases belong to a family of pro-apoptotic enzymes. Beyond cell death signals, caspase proteases additionally regulate non-apoptotic processes like cell morphology and migration in many cell types. The isoform Caspase-8 is essential for embryonal vasculogenesis in conditional knockout mice. In this study, we identified a novel apoptosis-unrelated role of Caspase-8 in circulating and bone marrow-derived cells for vascular repair. Caspase-8-specific inhibition abrogated the ex vivo formation of EPC from human peripheral blood. Moreover, Caspase-8 inhibition disables EPC migration and adhesion to different matrices and decreases the cell surface expression of the fibronectin receptor subunit integrin alpha 5 and the chemokine receptor CXCR4. In vitro and in vivo studies using bone marrow mononuclear cells derived from inducible Caspase-8- deficient mice revealed an essential role of Caspase-8 for EPC formation and neovascularization enhancing capacities of progenitor cells. Caspase-8 activity appears to be required for maintaining responses to matrix interaction and chemoattractants of EPC. Additional studies showed that the E3 ubiquitin ligase Cbl-b, a negative regulator of cell adhesion molecules including integrin alpha 5, is present in EPC at low protein levels under basal conditions, but markedly increases upon Caspase-8 inhibition. In vitro assays and overexpression studies in intact cells confirmed Caspase-8-dependent degradation of Cbl-b, providing a potential requirement for Caspase-8-regulated adhesion. Indeed, neovascularization of matrigel plugs was enhanced in mice lacking Cbl-b. Moreover, Cbl-b degradation in the presence of active Caspase-8 prevents the down-regulation of integrin alpha 5 and is associated with an enhanced vasculogenic activity of progenitor cells in hind limb ischemia. The identified upstream regulation of caspase-8 by cytokine IL-6 is only one possibility for fine-tuning the non-apoptotic enzymatic activity. In summary, this study shows a novel essential role of Caspase-8 for proper EPC adhesion-related signaling. Caspase-8 is involved in the function of adhesion molecules by regulation the E3 ubiquitin ligase Cbl-b. Strategies to improve survival of therapeutic injected progenitor cells by using caspase inhibitors should be addressed with caution. Because of the broad spectrum of activity of caspase-8, downstream targets of this caspase isoform and Cbl-b should be in more focus for therapeutic pretreatment to improve neovascularization of myocardial and ischemic tissue.
Die Identifizierung neuartiger Verbindungsklassen für ein pharmakologisches Zielsystem ist eine fordernde Aufgabe für die frühe präklinische Forschung, insbesondere wenn bereits vorherige umfangreiche Studien durchgeführt und viele Leitstrukturserien gefunden wurden. In dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass Scaffold Hopping durch Methoden des Virtual Screenings auch für Systeme möglich ist, für die bereits eine Vielzahl von Referenzsubstanzen beschrieben ist und somit wenig freier chemischer Raum für Innovation zur Verfügung steht. Als Beispielsystem wurde die GlycinB-Bindungsstelle der NR1-Untereinheit des NMDA-Rezeptors betrachtet. Verschiedene zwei- und dreidimensionale Techniken des Virtual Screenings wurden einer umfangreichen retrospektiven Validierung unterworfen. Zur Durchführung der prospektiven Virtual-Screening-Studie wurde eine automatisierte in silico Plattform entwickelt, die 8,9 Millionen käufliche Substanzen aus 46 Substanzkatalogen von 33 verschiedenen Anbietern sammelte, um etwa 5 Millionen unterschiedliche Moleküle in zweidimensionaler Darstellung aufzuarbeiten. Diese Menge an Substanzen stellt den größten Teil der zurzeit kommerziell verfügbaren chemischen Verbindungen, also den „verfügbaren chemischen Raum“ dar. Anhand der retrospektiv validierten Virtual Screening Techniken konnten in einer prospektiven Suche 21 GlycinB-Antagonisten mit neuartigen, d.h. für GlycinB noch unbeschriebenen Scaffolds gefunden werden. Ausgehend von drei dieser Virtual Screening Hits wurden 53 weitere Verbindungen mit insgesamt fünf unterschiedlichen neuartigen Scaffolds und einem gemeinsamen Azo-Motiv identifiziert. Die Struktur-Wirkungsbeziehungen dieser fünf chemischen Serien wurden charakterisiert. Das Ergebnis dieser Arbeit zeigt eindeutig, dass es lohnend ist, alle vorhandenen Methoden auszuschöpfen, da sich die validierten Methoden komplementär zueinander verhielten und kein Virtual Screening Hit von mehr als einer Technik gefunden wurde. Die Flexibilität von Proteinen als Antwort auf die Bindung unterschiedlicher Liganden stellt ein bislang ungelöstes chemieinformatisches Problem dar, welches auch grundlegende pharmakologische Bedeutung hat. So verursachen z.B. bei NMDA/GlycinB agonistische Liganden eine Konformationsänderung des Rezeptors. Diese ruft dann eine direkte funktionale Antwort in Form der Öffnung des Ionenkanals hervor. Auch der Bindungsmodus der Antagonisten von GlycinB ist trotz Vorhandenseins von zwei Kristallstrukturen und mehreren Hundert zum Teil hochaffiner Referenzstrukturen zum großen Teil ungeklärt. Im zweiten Teil dieser Arbeit wurde ein auf Moleküldynamiksimulationen basierendes Verfahren entwickelt, welches flexible Aminosäurereste im Rezeptor und damit induzierbare Bewegungen des Proteinrückgrates bestimmt. Die so identifizierten Reste wurden dann in einem erweiterten Verfahren des Induced-Fit-Dockings als explizit flexibel betrachtet. Hierdurch war die Berechnung verschiedener Bindungsmodi von Antagonisten möglich, die aufgrund ihrer Form und Größe nicht in die verfügbaren Kristallstrukturen von GlycinB passten. Diese benötigten somit einen Induced-Fit-Effekt des Rezeptors, um eine Bindung einzugehen. Für die im ersten Teil dieser Arbeit identifizierten Azo-Liganden wurde auf Basis dieser Methode ein gemeinsamer Bindungsmodus vorgeschlagen. Ebenso konnte anhand der Methodik eine Aussage über die funktionale Auswirkung der Proteinflexibilität beim Übergang vom antagonistischen zum agonistischen Rezeptorzustand von GlycinB getroffen werden. Ein großes Problem aktueller Dockingverfahren ist die mangelnde Verfügbarkeit von Scoringfunktionen, welche die tatsächliche biologische Bindungsaffinität eines Liganden berechnen. Hier wurde ein Verfahren für das Zielsystem GlycinB gezeigt, welches aufgrund der Berechnung des thermodynamischen Entropie- und Enthalpiegewinns durch Verdrängung von hydrophob eingeschlossenen Wasser aus der Bindungsstelle durch den Liganden eine Aussage über dessen zu erwartende Bindungsaffinität trifft. Dieses neuartige Scoringsystem wurde auf die im Virtual Screening identifizierten Serie von Azo-Liganden angewandt und verfügte über eine im Vergleich zu klassischen Scoringfunktionen des Molecular Dockings verbesserte Vorhersagekraft der biologischen Bindungsaffinität.
Im Rahmen dieser Arbeit wurden die 5´- und 3´-Enden 23 ausgewählter Transkripte des halophilen Archaeons Halobacterium salinarum bestimmt. Die Daten wurden dazu verwendet, die Längen der untranslatierten Bereiche zu ermitteln, Konsensussequenzen für die Transkriptionsinitiation und -termination abzuleiten und die Rolle haloarchaealer UTRs bei der Translationsinitiation und -regulation zu untersuchen. Der experimentelle Ansatz wurde mit einer bioinformatischen Analyse des Genoms von H. salinarum vervollständigt. Dabei konnten die Konsensussequenzen der basalen Promotorelemente genauer definiert werden und ein neues Promotorelement konnte entdeckt werden. Weiterhin wurde ein Konsensusmotiv gefunden, welches wahrscheinlich für die Termination der Transkription wichtig ist. Alle 23 analysierten Transkripte hatten eine 3´-UTR mit einer durchschnittlichen Länge von 48 Nukleotiden und ihre 3´-Enden waren nicht posttranskriptionell modifiziert. Die experimentellen Ergebnisse und bioinformatischen Daten ergaben, dass die Mehrheit der haloarchaealen Transkripte keine 5´-UTR besitzt. Die meisten Transkripte mit 5´-UTRs enthielten unerwarteterweise keine Shine-Dalgarno (SD)-Sequenz. Die Analyse des H. salinarum Genoms machte deutlich, dass weniger als 10% aller Gene eine SD Sequenz vorrausgeht und dass sogar bei Genen, die distal im Operon liegen, meistens keine SD-Sequenz zu finden ist. Weiterhin wurde der Einfluss einer ausgewählten 5´-UTR ohne SD-Sequenz und einer 3´-UTR auf die Transkriptstabilität und die Translationseffizienz untersucht. Das Transkript mit 5´ UTR ohne SD-Sequenz wurde in H. salinarum effizient translatiert. In einer Studie an H. volcanii konnte das Gleiche für verschiedene 5´ UTRs ohne SD-Sequenz in Verbindung mit einem Reportergen gezeigt werden (Brenneis et al., 2007). An diesen Transkripten kann die Translation also nicht über den „bakteriellen“ Mechansimus durch Basenpaarung mit dem 3´-Ende der 16S rRNA initiiert werden. Im weiteren Verlauf der Arbeit wurde untersucht, ob es sich bei dem Mechanismus der Translationsinitiation an Transkripten mit 5´-UTR ohne SD-Sequenz um einen Scanning-Mechanismus wie bei Eukaryonten oder um einen neuen Mechanismus handelt. Für die Experimente wurde das zuvor erwähnte Reportergensystem aus H. volcanii verwendet. Neben AUG wurden GUG und UUG effizient als Startkodons an einem Transkript mit 5´-UTR genutzt, wohingegen AUG das einzige funktionierende Startkodon bei einem Transkript ohne 5´-UTR war. Verschiedene Deletionsversionen der 20 Nukleotide langen 5´-UTR wurden im Gegensatz zur kompletten 5´-UTR nur sehr ineffizient translatiert. Das Einfügen zusätzlicher AUGs stromaufwärts des natürlichen Startkodons hatte keinen Einfluss auf die Translationseffizienz am internen AUG. Ein zusätzliches AUG am 5´-Ende im gleichen Leseraster des natürlichen AUGs führte zur gleichzeitigen Nutzung beider Startkodons auf derselben mRNA. Eine stabile Haarnadelstruktur am 5´-Ende inhibierte die Translation nur am ersten AUG und hatte keinen Einfluss auf die Translationseffizienz am internen AUG. Zusammenfassend konnte durch die erhaltenen Ergebnisse ausgeschlossen werden, dass der Mechanismus der Translationsinitiation an Transkripten mit 5´-UTR ohne SD-Sequenz ein Scanning-Mechansimus wie bei Eukaryonten ist. Neben der Translationsinitiation an Transkripten ohne 5´-UTR und an Transkripten mit SD-Sequenz existiert also noch ein dritter, bis jetzt unbekannter Mechansimus zur Translationsinitiation in Haloarchaea. In initialen Versuchen zur genaueren Charakterisierung der drei verschiedenen Translationsinitiationsmechanismen, wurden Konstrukte hergestellt, bei denen alle drei verschiedenen Startkodons auf einer mRNA vorhanden sind. Es wurden erste Hinweise darauf gefunden, dass Stressbedingungen einen Einfluss auf die unterschiedlichen Initiationsmechansimen haben. Anders als erwartet führte die Mutation einer natürlichen SD-Sequenz nicht zu einer verminderten Translationseffizienz am entsprechenden Startkodon. Die Bestimmung des 5´-Endes eines Transkripts mit in silico vorhergesagter SD-Sequenz offenbarte, dass das Transkript keine 5´-UTR und somit auch keine SD-Sequenz besaß. Beide Ergebnisse machen deutlich, dass SD-Sequenzen eine noch viel geringere Rolle bei der haloarchaealen Translationsinitiation spielen, als anhand der Sequenz und UTR Analysen angenommen werden konnte.
Photosystem (PS) I is a huge membrane protein complex which coordinates around 200 co-factors. Upon light excitation a charge separation at the PS I reaction centre is induced which leads to an electron transport across the thylakoid membrane and the generation of redox equivalents needed for several biochemical reactions, e.g. the synthesis of sugars. For higher plants and cyanobacteria the crystal structure of PS I complexes were resolved to resolutions of 4.4 Å and 2.5 Å. Furthermore, supramolecular structures of PS I of eukaryotic algae, mainly of the green line, were obtained recently. However, up to now, no structure of diatoms is available yet. Diatoms are key players in global primary production and derived from a secondary endosymbiosis event. Their chloroplasts are surrounded by four envelope membranes and their thylakoids are evenly arranged in bands of three, i.e. no separation in grana and stroma regions is apparent. In this thesis a protocol was developed to isolate a functional PS I complex of diatoms which can be used for structural analysis by transmissional electron microscopy (TEM). A photosystem I-fucoxanthin chlorophyll protein (PS I-FCP) complex was isolated from the pennate diatom Phaeodactylum tricornutum by ion exchange chromatography. Spectroscopic analysis proved that bound Fcp polypeptides function as a light-harvesting complex. An active light energy transfer from Fcp associated pigments, Chl c and fucoxanthin, towards the PS I core was proven by fluorescence spectroscopy. Oxidised minus reduced difference spectroscopy evidenced the activity of the PS I reaction centre P700 and yielded a chlorophyll a/P700 ratio of approximately 200:1. These data indicate that the isolated PS I-FCP complex exceeds the PS I cores from cyanobacteria and higher plants in the numbers of chlorophyll a molecules. Because of the strict conservation of PS I cores among organisms the additional 100 chlorophyll a molecules must either be coordinated by Fcps or function as linker molecules between the Fcp antenna and the PS I core as shown for the PS I-LHC I complex of higher plants. To tell something about the structural organisation, the PS I-FCP complex was compared with its cyanobacterial and higher plant counterparts. Whereas cyanobacterial PS I cores aggregate to trimers, usually without associated antennae, higher plant PS I is a monomer and binds additionally two LHC I heterodimers. BN-PAGE and gel filtration experiments showed that also diatoms contain PS I monomers associated with Fcps as light-harvesting antenna. First TEM studies evidenced these observations. Negatively stained PS I-FCP particles had an increased size compared to PS I cores of other organisms. No PS I trimers or higher oligomers have been found. The calculated diameter and shape of the particles correspond to PS I-LHC I particles obtained from green algae, which also comprise of a higher number of LHC I polypeptides compared to the higher plant x-ray structure. Additionally, the analysis of polypeptides indicates that the PS I associated Fcps differ from the free Fcp pool and also from Fcps of a PS II enriched fraction. The assumption that diatoms harbour just one Fcp antenna that serve both Photosystems equally seems to be wrong. To further study the association of Fcps with the two Photosystems, both complexes plus the free FCP complexes were isolated from the centric diatom Cyclotella meneghiniana. Because of the availability of antibodies directed against specific Fcp polypeptides of Cyclotella the PS I-FCP complex of Phaeodactylum could not be used. A trimeric FCP complex, FCPa, and a higher FCP oligomer, FCPb, have already been described for C. meneghiniana. The latter is assumed to be composed of only Fcp5, whereas the FCPa contains Fcp2 and Fcp6. Biochemical and spectroscopical evidences revealed a different subset of associated Fcp polypeptides within the isolated photosystem complexes. Whereas the PS II associated Fcp antenna resembles FCPa, at least three different Fcp polypeptides are associated with PS I. By re-solubilisation of the PS I complex and a further purification step Fcp polypeptides were partially removed from PS I and both fractions were analysed again by biochemical and spectroscopical means, as well as by HPLC. Thereby Fcp4 and a so far undescribed 17 kDa Fcp were found to be strongly coupled to PS I, whereas another Fcp, presumably Fcp5, is only loosely bound to the PS I core. Thus an association of FCPb and PS I is assumed.
Quantitative analysis of snoRNA association with pre-ribosomes and release of snR30 by Rok1 helicase
(2008)
In yeast, three small nucleolar RNAs (snoRNAs) are essential for the processing of pre-ribosomal RNA—U3, U14 and snR30—whereas 72 non-essential snoRNAs direct site-specific modification of pre-rRNA. We applied a quantitative screen for alterations in the pre-ribosome association to all 75 yeast snoRNAs in strains depleted of eight putative helicases implicated in 40S subunit synthesis. For the modification-guide snoRNAs, we found no clear evidence for the involvement of these helicases in the association or dissociation of pre-ribosomes. However, the DEAD box helicase Rok1 was required specifically for the release of snR30. Point mutations in motif I, but not in motif III, of the helicase domain of Rok1 impaired the release of snR30, but this was less marked than in strains depleted of Rok1, and resulted in a dominant-negative growth phenotype. Dissociation of U3 and U14 from pre-ribosomes is also dependent on helicases, suggesting that release of the essential snoRNAs might differ mechanistically from release of the modification-guide snoRNAs. Keywords: ribosome biogenesis; RNA helicase; snoRNA
Genetic engineering of baker’s and wine yeasts using formaldehyde hyperresistance-mediating plasmids
(1997)
Yeast multi-copy vectors carrying the for maldehyde-resistance marker gene SFA have proved to be a valuable tool for research on industrially used strains of Saccharomyces cerevisiae. The genetics of these strains is often poorly understood, and for various reasons it is not possible to simply subject these strains to protocols of genetic engineering that have been established for laboratory strains of S. cerevisiae. We tested our vectors and protocols using 10 randomly picked baker’s and wine yeasts all of which could be transformed by a simple protocol with vectors conferring hyperresistance to formaldehyde. The application of formaldehyde as a selecting agent also offers the advantage of its biodegradation to CO2 during fermentation, i.e., the selecting agent will be consumed and therefore its removal during down-stream processing is not necessary. Thus, this vector provides an expression system which is simple to apply and inexpensive to use. Key words: · Yeast · Transformation · Hyperresistance to formaldehyde
Meeting Abstract Es wurde eine zellbasierte Wundauflage mit Keratinozyten und Fibroblasten auf Basis einer kommerziellen Wundauflage (Matriderm, Collagen/Elastin-Matrix) generiert, um damit großflächige Verbrennungswunden behandeln zu können. Zunächst wurde die Expansion der Keratinozyten optimiert und die Zeit für die Anzüchtung minimiert. Ausgangsmaterial waren 1–2 cm2 Spalthaut vom Patienten. Epidermis und Dermis wurden nach einer enzymatischen Behandlung mit Thermolysin voneinander getrennt. Aus den beiden Hautkompartimenten wurden durch Trypsin- und Kollagenase I-Behandlung Keratinozyten und Fibroblasten isoliert, welche in Kollagen I-beschichteten Zellkulturflaschen expandiert wurden. Nach 10 Tagen wurden die Fibroblasten auf 100 cm2 Matriderm aufgebracht. Nach einwöchiger submerser Kultivierung wurden die Keratinozyten ausgesät. Eine Woche später wurde die Matrix an die Luft-Flüssigkeitsgrenze angehoben, um die epidermale Differenzierung einzuleiten. Nach 16 Tagen wurde das Hautäquivalent fixiert und immunhistologisch sowie elektronen-mikroskopisch begutachtet. Die Histologie zeigte eine regelgerechte Stratifizierung des epidermalen Anteils. Immunhistologisch ließ sich eine Basalmembran mit Collagen IV und Laminin 5 nachweisen. Proliferative Zellen, nachgewiesen mit KI-67 befanden sich lediglich in der basalen Region der Epidermis. Desmoglein, sowie die Differenzierungsmarker Involucrin und CK 10 wurden suprabasal nachgewiesen. Elektronenmikroskopisch waren die Basalmembran sowie die Zell-Zell-Verbindungen in Form von Desmosmen zu erkennen. Späte Differenzierungsmerkmale, wie granuläre Strukturen und verdickte Zellmembranen, fanden sich im Str. granulosum und Str. corneum. Die Studie zeigt, dass man aus Matriderm eine zellbasierte Wundauflage herstellen kann, die verglichen mit dem Ausgangsmaterial um den Faktor 50–100 vergrößert ist und deren Aufbau normaler Haut weitgehend entspricht.
Fragestellung Intoleranzreaktionen auf nicht-steroidale Antiphlogistika sind häufig und basieren auf der Hemmung des Enzyms Cyclooxygenase-1 (COX-1), wohingegen deren therapeutische Effekte auf einer COX-2 Hemmung beruhen. In dieser Studie wurde die Verträglichkeit des selektiven COX-2 Inhibitors Celecoxib bei Patienten mit Intoleranzreaktionen auf nicht-steroidale Antiphlogistika untersucht. Methodik Bei 77 Patienten (24 Männer, 53 Frauen) mit Intoleranzreaktionen auf nicht-steroidale Antiphlogistika wurden standardisierte Hauttestungen (Prick, Scratch, Epikutantestung) sowie anschließend orale fraktionierte Placebo-kontrollierte einfach blinde Expositionstestungen unter Einschluß von Celecoxib (maximale Einzeldosis 200mg, kumukative Tagesdosis 350mg) durchgeführt. Ergebnisse 21 Patienten wiesen anamnestisch lediglich Hautsymptome (Urtikaria) auf, 25 Patienten nur eine Atemwegssymptomatik (Asthma), bei 18 Patienten traten Haut- und Atemwegssymptome auf, und bei 13 Patienten war es zu einem anaphylaktischen Schock gekommen. Azetylsalizylsäure war in 38 Fällen ein Auslöser der Beschwerden. In 46 Fällen verursachten mehrere nicht-steroidale Antiphlogistika chemisch unterschiedlicher Gruppen die Symptomatik. Die orale Expositionstestung mit Celecoxib verlief bei allen 77 Patienten unauffällig. Schlußfolgerung Vor dem Hintergrund der hohen Inzidenz von Intoleranzreaktionen gegen nicht-steroidale Antiphlogistika stellt der Einsatz selektiver COX-2 Inhibitoren eine therapeutische Alternative sowie eine geeignete Maßnahme zur Prävention entsprechender Reaktionen dar.
Tiere und Menschen sind für das tägliche Überleben auf eine schnelle Bewertung und flexible Nutzung verschiedenster Umweltreize angewiesen. So nutzen Vögel, wie viele andere Tiere, sowohl den Magnetsinn als auch die Geometrie der Umgebung und Landmarken, um sich im Raum zu orientieren. Auch erfolgt eine schnelle und komplexe Auswertung des visuellen Inputs, beispielsweise, um bei der Futtersuche selektiv Futterkörner finden zu können. Unklar ist bislang, wie Raum- und Objektinformation in den beiden Hirnhälften verarbeitet werden und wie die Aufgabenteilung zwischen den Hemisphären aussieht. Zur Klärung dieser Thematik soll die vorliegende Arbeit beitragen, wobei die Versuche so angelegt wurden, dass mögliche, grundlegende Verarbeitungsstrategien unter zwei Gesichtspunkten betrachtet werden konnten: Zum einen wurden den Tieren prinzipiell unterschiedliche Aufgaben präsentiert, um über verschiedene Bereiche auf dem Gebiet der Raum- und Objektverarbeitung hinweg vergleichen zu können. Zum anderen wurde mit den beiden zurzeit wichtigsten Vogelmodellen gearbeitet, der Brieftaube (Columba livia) und dem Haushuhnküken (Gallus gallus). Dies erlaubt einerseits den Vergleich eigener Ergebnisse mit anderen Befunden innerhalb derselben Art, während andererseits auch Parallelen und Unterschiede zwischen verschiedenen Arten betrachtet werden können. Vögel eignen sich hierbei aufgrund ihrer Anatomie besonders gut für die Erforschung von Hemisphärenunterschieden. Durch ein nahezu vollständiges Überkreuzen der Sehnerven und das Fehlen eines Corpus callosum oder anderer funktionell entsprechender Strukturen zum Informationsaustausch zwischen den Hirnhälften wird der visuelle Input eines Auges überwiegend in der gegenüberliegenden Hirnhälfte verarbeitet. Lateralisation kann daher sehr leicht durch Abdecken eines Auges untersucht werden. Bei Brieftauben wurde die Repräsentation von Geometrie und Landmarken untersucht (Kapitel 2). Die Tiere lernten hierbei, das Zentrum einer quadratischen Arena mithilfe rein geometrischer Hinweise oder mittels einer Kombination von Geometrie und Landmarken zu finden. Durch Verändern der verfügbaren Informationsart wurde untersucht, welche Informationen die Tauben zum Lokalisieren des Zentrums nutzten. Die Ergebnisse zeigen mit einer beidseitigen Verarbeitung ein qualitativ anderes Muster der Repräsentation von Rauminformationen als bislang bei anderen Arten, wie z.B. dem Haushuhnküken, beschrieben. Ferner hing der relative Gebrauch von Geometrie und Landmarken in starkem Maße von der vorherigen Erfahrung der Tauben ab. In einer weiteren Studie wurde die Verarbeitung von Magnetkompassinformation bei Brieftauben untersucht (Kapitel 3). Hierbei wurde erstmals erfolgreich ein Versuchsdesign zur Laboruntersuchung entwickelt. Auch bei dieser Raumkognitionsaufgabe wurde ein Unterschied zu der bei anderen Arten gefundenen linkshemisphärischen Spezialisierung zugunsten einer Verarbeitung sowohl in der linken als auch in der rechten Hirnhälfte gefunden. Während die Tauben hierbei mit der rechten Hirnhälfte lediglich die richtige Achse wahrnahmen, erfassten sie mit der linken Hemisphäre die spezifische Richtung. Dies könnte die gefundene linkshemisphärische Überlegenheit im Freiland erklären. Erstmals bei Vögeln wurde beim Haushuhnküken in einem weiteren Versuch die hemisphärische Verarbeitung von Raumfrequenzinformation untersucht, die sowohl für die visuelle Raumorientierung als auch für das Objekterkennen von großer Bedeutung ist (Kapitel 4). Die Raumfrequenz ist hierbei allgemein als ein Maß für die Wiederholungen einer Struktur über eine bestimmte Strecke definiert und kann zur Charakterisierung beliebig komplexer Objekte verwendet werden. Die Küken wählten zwischen simultan dargebotenen Objekten, deren Oberflächen sich hinsichtlich ihrer Raumfrequenzen unterschieden. Die Ergebnisse weisen auf eine Spezialisierung der linken Hirnhälfte für hohe und der rechten Hirnhälfte für niedrige Raumfrequenzen hin. Aufgrund der Parallelen zu Befunden beim Menschen könnte dies auf eine gemeinsame Grundlage der Lateralisationsentwicklung bei Wirbeltieren hindeuten. Während sich die vorangehenden Studien der vorliegenden Arbeit mit Spezialisierungen der linken und rechten Hirnhälfte bei der Verarbeitung von Raum- und Objektinformation befassten, wurde in Kapitel 5 das Zusammenwirken von linker und rechter Hirnhälfte bei der selektiven Nahrungssuche untersucht. Hierbei konnte am Beispiel des Haushuhnkükens erstmals bei Vögeln Hemisphärenkooperation gezeigt werden, was als Hinweis darauf zu werten ist, dass eine bilaterale Repräsentation im Vogelhirn in komplexen Situationen, die eine rasche und effiziente Beurteilung des gesamten überschaubaren Bereichs erfordern, möglich ist. Insgesamt zeigen die Ergebnisse für mehrere wichtige Fragen der Lateralisationsforschung wie die Erfahrungsabhängigkeit, den Nachweis unterschiedlicher Lateralisationsmuster bei Brieftauben und Haushuhnküken in der geometrischen Orientierung oder die Kooperation der Hirnhemisphären, dass bisherige Ansichten über die Verarbeitung von Raum- und Objektinformation bei Vögeln einer kritischen Überarbeitung bedürfen.
Zusammenfassung (in German) Rostpilze sind obligate Parasiten auf vielen holzigen und krautigen Pflanzen und führen weltweit zu ernsten ökonomischen Schäden in der Landwirtschaft. Weltweit sind zurzeit sind ca. 100 Gattungen und 9000 Arten von Rostpilzen (Pucciniales, Basidiomycota) bekannt. Es gibt fünf verschiedene Entwicklungsstadien mit je eigener Morphologie: Spermogonium, Aecidium, Uredosporenlager, Teleutosporenlager und Basidium. Bei vielen Rostpilzen kommt es im Entwicklungsgang zu einem Wechsel zwischen zwei verschiedenen Wirtsarten. Die Spermogonien werden auf einem haploiden Myzel erzeugt, das sich nach der Infektion des Pflanzengewebes durch Basidiosporen entwickelt. In den Spermogonien entwickeln sich einzellige, monokaryotische, hyaline Spermatien, die in einem süßlichen Exudat ausgeschieden werden. Das Aecidium bildet einzellige, dikaryotische Aecidiosporen in Ketten. Bei der Keimung entwickeln sie dikaryotische Hyphen, welche entweder Uredosporen- oder Teleutosporenlager, aber nicht wieder Aecidien erzeugen. Die Uredosporen der Uredosporenlager dienen der Massenausbreitung, Infektion derselben Wirtsart und wiederholten Bildung neuer Uredosporenlager. Das Ornament der Uredosporen ist variabel: echinulat, verrucos, gestreift verrucos, zerfurcht, runzelig, labyrinthisch, pseudoreticulat oder reticulat. Teleutosporenlager und Teleutosporen sind das wichtigste Stadium für allgemeine Unterscheidungen und die Nomenklatur von Rostpilzen, da sie das sexuelle Stadium repräsentieren. Teleutosporen erzeugen Basidien und Basidiosporen. Teleutosporen sind morphologisch sehr variabel und präsentieren deshalb die nützlichsten zuverlässigen Eigenschaften zur Unterscheidung der Arten. Die Basidien entstehen größtenteils am distalen Ende der Teleutosporenzelle und sind transversal septiert. Die Basidiosporen sitzen auf Sterigmen auf den Basidienzellen und sind globos oder subglobos. Durch die hoch spezifische Abhängigkeit der Rostpilz-Arten von ihren Wirtspflanzen ist die Verbreitung der Rostpilze an die Verbreitung ihrer Wirte gebunden. Jedoch sind vollständige Lebens-Zyklen der Rostarten, mikromorphologische Details der oben genannten Stadien, Spektren der Wirtspflanzen und geographische Verbreitung unvollständig bekannt. Einige dieser offenen Fragen am Beispiel der Rostpilze Panamas zu beantworten ist das Ziel dieser Arbeit. Da für das relativ kleine Land Panama 9.500 Pflanzenarten bekannt sind, wird eine hohe Zahl an Rostpilzarten vermutet. Die Rostpilze Panamas wurden sporadisch von verschiedenen Mykologen studiert. Bis 2007 waren in Panama jedoch lediglich 25 Gattungen und 101 Arten von Rostpilzen bekannt. Für die vorliegende Arbeit wurden in den Jahren 2004 bis 2007 Rostpilze in Panama gesammelt, hauptsächlich in der Provinz Chiriquí im Westen Panamas. Insgesamt wurden 468 Belege geprüft, die 150 verschiedenen Arten von Rostpilzen entsprechen. 233 Belege wurden zwischen 2005 und 2007 im ppMP-Projekt (pflanzenparasitische Mikropilze Panamas) von M. Piepenbring, O. Perdomo, R. Mangelsdorff, T. Trampe und T. Hofmann gesammelt. 76 Belege wurden von M. Piepenbring zwischen 1998 und 2007 gesammelt. 1 Beleg wurde von R. Kirschner (2003) gesammelt. Zusätzlich wurden Belege aus Herbarien konsultiert, 30 Belege aus dem New York Botanical Garden (NYBG), 93 Belege aus den U.S. National Fungus Collections (BPI) und 35 Belege aus der Purdue University (PUR). In dieser Arbeit werden 30 Arten von Rostpilzen aus dem Westen Panamas detailliert beschrieben und durch rasterelektronenmikroskopische Aufnahmen und Zeichnungen illustriert. Zwei davon sind neue Arten: Puccinia urochloae auf Urochloa decumbes (Poaceae) und Uromyces melampodii auf Melampodium costaricense (Asteraceae). Puccinia urochloae unterscheidet sich von den bekannten Puccinia-Arten durch diorchidioide Teleutosporen, Teleutosporenmaße sowie Paraphysen und Uromyces melampodii von anderen Uromyces-Arten durch die Teleutosporenmaße und Wirtsgattung. 28 Arten werden erstmalig für Panama dokumentiert: für Aecidium psychotriae auf Psychotria cf. carthagenensis (Rubiaceae), für Coleosporium verbesinae auf Verbesina gigantea (Asteraceae), für Crossopsora byrsonimatis auf Byrsonima crassifolia (Malphigiaceae), für Crossopsora uleana auf Solanum trizygum (Solanaceae), für Puccinia cordiae auf Cordia alliodora (Boraginaceae), für Puccinia cyperi-tagetiformis auf Cyperus odoratus (Cyperaceae), für Puccinia enixa auf Baccharis cf. pedunculata, für Puccinia inaudita auf Wedelia inconstans (Asteraceae), für Puccinia psidii auf Syzygium jambos (Myrtaceae), für Puccinia sp. 1 auf Aulonemia patriae (Poaceae), für Puccinia sp. 2 auf Carex longii (Cyperaceae), für Pucciniosira dorata auf Triumfetta bogotensis (Malvaceae), für Uredo ficina auf Ficus sp. (Moraceae), für Uredo hydrocotyles auf Hydrocotyle mexicana (Apiaceae), für Uredo incomposita auf Eleocharis sp. (Cyperaceae), für Uredo jatrophicola auf Jatropha curcas (Euphorbiaceae), für Uredo kyllingiae auf Kyllinga cf. odorata (Cyperaceae), für Uredo melinidis auf Melinis minutiflora (Poaceae), für Uredo notata auf Byrsonima crassifolia (Malpighiaceae), für Uredo peperomiae auf Peperomia glabella (Piperaceae), für Uredo proeminens auf Euphorbia heterophylla and E. hyssopifolia (Euphorbiaceae), für Uredo rubescens auf Dorstenia contrajerva (Moraceae), für Uredo yucatanensis auf Mimosa albida (Fabaceae), für Uromyces bidenticola auf Bidens pilosa (Asteraceae), für Uromyces ictericus auf Iresine celosiae (Amaranthaceae), für Uromyces sp. 1 auf Struthanthus sp. (Loranthaceae) und für Uromyces trifolii-repentis auf Trifolium repens (Fabaceae). Die Zahl der für Panama bekannten Rostpilze erhöht sich mit dieser Arbeit von 101 auf 131 Arten. Für fünf andere Rostpilze werden weltweit neue Wirtsarten genannt: Cordia spinescens als Wirt von Alveolaria cordiae, Eupatorium odoratum als Wirt von Cionothrix praelonga, Xylopia grandiflora als Wirt von Dasyspora gregaria, Cyperus diffusus als Wirt von Puccinia subcoronata, und Calathea indecora als Wirt von Puccinia thaliae. Die Artenvielfalt von Pflanzen in den Tropen ist noch nicht vollständig bekannt, und man kann keine Voraussagen machen oder feststellen, ob ein Gebiet artenreicher ist als andere. Die bescheidene Dokumentation von Rost-Pilzen in Panama beruht auf einem Mangel an Inventuren im Gebiet. Die in Panama am häufigsten vertretenen Wirts-Familien sind die Asteraceae, Cyperaceae, Fabaceae und Poaceae. Die Asteraceae, mit 303 Arten die sechstgrößte Pflanzenfamilie in Panama, haben die größte Zahl der Wirtsarten von Rost-Pilzen in Panama mit 24 Rostarten, nämlich in den Gattungen Cionothrix, Coleosporium, Dietelia, Endophyllum, Puccinia und Uromyces. Die Fabaceae jedoch präsentieren die höchste Zahl der Rost-Gattungen in Panama (Ateloucada, Dicheirinia, Phakopsora, Puccinia, Uraecium, Uredo, Uromyces und Uropyxis) mit 23 Rostarten. Die Fabaceae sind mit einer Gesamtzahl von 487 Arten in Panama die zweitgrößte Pflanzenfamilie. In dieser Studie wurden rasterelektronenmikroskopische Beobachtungen der Morphologie und Ornamentierung von Sporen durchgeführt. Echinulate und verrucose Ornamentierung sind mit dem Lichtmikroskop bei gewissen Arten von Pilzen schwierig zu unterscheiden. Das beobachtete Ornament ist jeweils spezifisch für die Art. Die asexuell gebildeten Uredosporenlager und Uredosporen sind in der Regel das zahlenmäßig am häufigsten anzutreffende Entwicklungsstadium und seine Merkmale sind genügend unveränderlich und unterschieden, um sie taxonomisch zu verwenden. Die taxonomisch nützlichsten Eigenschaften von Uredosporen sind: die Form und Größe der Spore, die Farbe und Stärke der Sporen-Wand, ihre Oberflächenornamentierung, die Zahl und Verteilung der Keimporen. Die Anwesenheit von Paraphysen ist bei Rost-Pilzen taxonomisch nicht wichtig. In den beobachteten Belegen sind Paraphysen sowohl in Uredo- als auch in Teleutosporenlagern vorhanden, allerdings am häufigsten in Uredosporenlagern. Bestimmte Merkmale der Paraphysen können jedoch taxonomisch wichtig sein. In unserer Analyse fanden wir Arten mit pigmentierten Paraphysen bei Crossopsora uleana, Puccinia sp. 1, Uredo jatrophicola, Uredo yucatanensis und Uromyces melampodii. Crossopsora uleana hat verzweigte Paraphysen. Für die Identifikation der Rostpilze ist es notwendig und wesentlich, die Wirtspflanzen zu identifizieren. Dennoch können viele Pflanzenproben nicht leicht identifiziert werden, da viele steril sind, und in den meisten Fällen sind blühende oder fruchtenden Teile für die Pflanzenbestimmung wesentlich. Viele Rostpilzarten wurden in der Vergangenheit sehr knapp und unvollständig, mit irreführenden Angaben und ungenauen Wirtsdaten beschrieben. Rostpilze können im Feld leicht erkannt werden. Es gibt wenige Ausnahmen, die mit anderen pathogenen Pilzen verwechselt werden können. Solch ein Beispiel ist Stigmina anacardii, ein imperfekter Pilz mit oberflächlich ähnlicher Morphologie wie Rostpilze, aber mit Beziehung zu den Ascomycota. Basidien und Basidiosporen von Alveolaria cordiae werden erstmals illustriert und dokumentiert. Am Beispiel von Dasyspora gregaria konnte erstmals eine fein warzige Ornamentierung der Basidiosporen bei Rostpilzen aufgezeigt werden. Resumen (in Spanish) Especies de Pucciniales son hongos parásitos de plantas del grupo Basidiomycota. En esta tesis 30 especies de Pucciniales recientemente colectadas en el Oeste de Panama se presentan con descripciones detalladas, microscopia electrónica de barrido y dibujos. De estas, 2 son nuevas especies: Puccinia urochloae y Uromyces melampodii. Además, 28 especies se citan por primera vez para Panama: Aecidium psychotriae, Coleosporium verbesinae, Crossopsora byrsonimatis, Crossopsora uleana, Puccinia cordiae, Puccinia cyperi-tagetiformis, Puccinia enixa, Puccinia inaudita, Puccinia paupercula, Puccinia psidii, Puccinia sp. 1, Puccinia sp. 2, Pucciniosira dorata, Uredo ficina, Uredo hydrocotyles, Uredo incomposita, Uredo jatrophicola, Uredo kyllingiae, Uredo melinidis, Uredo notata, Uredo peperomiae, Uredo proeminens, Uredo rubescens, Uredo yucatanensis, Uromyces bidenticola, Uromyces ictericus, Uromyces sp. 1 y Uromyces trifolii-repentis. Asi el numero de especies de Pucciniales conocidas para Panama aumenta de 101 a 131. En 5 especies diferentes de hongos se descubrieron nuevas especies en plantas hospederas: Cordia spinescens para Alveolaria cordiae, Eupatorium odoratum para Cionothrix praelonga, Xylopia gradiflora para Dasyspora gregaria, Cyperus diffusus para Puccinia subcoronata, y Calathea indecora para Puccinia thaliae. La especie Dasyspora gregaria es reportada con basidiosporas finamente verrucosas por primera vez en royas y la especie Alveolaria cordiae, una especie pobremente conocida es reportada, descrita e ilustrada con detalles por primera vez sobre Cordia spinescens en Panama.
Die maligne Transformation von Zellen beruht auf der Mutation von Genen, die entartete Zellen der regulierenden Wachstumskontrolle entziehen, ihre Versorgung sicher stellen und sie unempfindlich gegen apoptoseinduzierende Signale machen (Hanahan und Weinberg, 2000). Klassische Behandlungsmethoden wie Strahlen- und Chemotherapie wirken häufig über die Aktivierung apoptotischer Signalwege, die jedoch in behandlungsresistenten Tumorzellen blockiert sein können. Das selektive Einbringen proapoptotischer Proteine in Tumorzellen stellt daher eine vielversprechende Strategie zur Umgehung solcher Blockaden dar. In dieser Arbeit wurden tumorspezifische Antikörperfusionsproteine generiert, die humane Zelltod auslösende Proteine als Effektorfunktion enthalten. Das mitochondriale Protein „apoptosis inducing factor“ (AIF) wird durch diverse Apoptosesignale in das Zytoplasma freigesetzt. AIF leitet nach der Translokation in den Zellkern Chromatinkondensation und Degradation der nukleären DNA ein (Cande et al., 2004b). Zur selektiven Einschleusung von zytoplasmatischem AIF (AIF!100) in ErbB2 exprimierende Tumorzellen wurde es an das ErbB2-spezifische „single chain“ Antikörperfragment scFv(FRP5) fusioniert, welches von dem monoklonalen Antikörper FRP5 abgeleitet ist (Wels et al., 1992b). Daneben enthält ein zunächst generiertes AIF!100-DT183-378-5 Fusionsprotein eine Translokationsdomäne aus Diphtherietoxin (AA 183-378) als mögliche „endosome escape“ Aktivität. Diese Domäne sollte der Effektordomäne nach rezeptorvermittelter Aufnahme den Übergang in das Zytoplasma erlauben. Die Expression dieses Moleküls in E. coli und der Hefe Pichia pastoris führte jedoch nicht zu funktionellen AIF!100-DT183-378-5 Proteinen. Daher wurde für nachfolgende Arbeiten ein ähnliches AIF-Fusionsprotein (5-E-AIF!100) aus früheren Arbeiten unserer Gruppe eingesetzt und sein Wirkmechanismus eingehend untersucht. Im Gegensatz zu AIF!100-DT183-378-5 enthält 5-E-AIF!100 die Translokationsdomäne aus Pseudomonas Exotoxin A. Bakteriell exprimiertes, gereinigtes und renaturiertes 5-E-AIF!100 zeigte eine hohe Spezifität für ErbB2 exprimierende Tumorzellen. Im Gegensatz zu unfusioniertem AIF!100 induzierte 5-E-AIF!100 nach Mikroinjektion in das Zytoplasma der Zielzellen keine Apoptose. Dies deutet darauf hin, dass möglicherweise die N-terminale Antikörperdomäne die proapoptotische Aktivität der AIF-Domäne blockiert. Erst die rezeptorvermittelte Aufnahme von 5-E-AIF!100 in Anwesenheit von Chloroquin resultierte in einer hohen Zytotoxizität. Auf diesem Weg wird sehr wahrscheinlich durch proteolytische Spaltung der innerhalb der Translokationsdomäne vorhandenen Furin-Schnittstelle der N-terminale Bereich des Fusionsproteins entfernt. Die eigentliche Translokation der AIF-Domäne findet jedoch ohne die Zugabe endosomolytischer Reagenzien nicht statt, was für eine unzureichende Aktivität der Translokationsdomäne spricht. Die vollständige Entfernung der Translokationsdomäne führte dennoch zu einem AIF-Fusionsprotein, das weder in Abwesenheit noch in Gegenwart von Chloroquin zytotoxisch aktiv ist (Dälken, 2005). Somit ist die in der Translokationsdomäne enthaltene Furin- Schnittstelle sehr wahrscheinlich für die Aktivierung von 5-E-AIF!100 von entscheidender Bedeutung. Im Fall des natürlichen Exotoxin A ist zusätzlich zu der in 5-E-AIF!100 verwendeten Translokationsdomäne ein C-terminales ER-Retentionssignal für einen effizienten Übertritt der katalytisch aktiven Toxindomäne ins Zytoplasma notwendig (Jackson et al., 1999). Das Anfügen eines KDEL-Signals an den C-Terminus von 5-E-AIF!100 führte jedoch nicht zur Erhöhung der „endosome escape“ Aktivität der Translokationsdomäne. Die ladungsabhängige DNA-Bindungsaktivität von AIF ist für die proapoptotische Funktion des Proteins essentiell. Bindung an DNA wurde auch für 5-E-AIF!100 nachgewiesen, und konnte durch Vorinkubation mit negativ geladenem Heparin inhibiert werden. Die Komplexierung mit Heparin führte zu einer erheblichen Reduktion der zytotoxischen Aktivität von 5-E-AIF!100. Mit großer Wahrscheinlichkeit ist die Abschwächung der Zytotoxizität auf die intrazelluläre Inhibition der AIF/DNA-Interaktion zurückzuführen. Dies bestätigt, dass diese Wechselwirkung für die zelltodinduzierende Eigenschaft von 5-E-AIF!100 von Bedeutung ist. Die Freisetzung Immuntoxin-ähnlicher Proteine, die sich nach rezeptorvermittelter Aufnahme in endosomalen Kompartimenten finden, erfordert häufig die Zugabe endosomolytischer Reagenzien. Um eine von endosomolytischen Reagenzien unabhängige Zytotoxizität der Antikörperfusionsproteine zu erreichen, wurden in dieser Arbeit Möglichkeiten zur Umgehung dieser Abhängigkeit untersucht. Hierzu wurde die Natürliche Killerzelllinie NK-92 eingesetzt. Die Eliminierung von infizierten und transformierten Zellen durch NK-Zellen geschieht hauptsächlich über die Ausschüttung von zytotoxischen Granula, die das porenbildende Protein Perforin und verschiedene Serinproteasen wie Granzym B (GrB) enthalten (Atkinson et al., 1990; Smyth et al., 2001). Dabei ist Perforin für die zytosolische Translokation der Proteasen verantwortlich (Browne et al., 1999). Anhand des Modellproteins Granzym B-scFv(FRP5) (GrB-5) wurde untersucht, ob Antikörperfusionsproteine mit Hilfe von Perforin in das Zytoplasma der Zielzellen gelangen können. GrB-5 wurde in NK-92 Zellen unter Beibehaltung der Spezifität und enzymatischen Aktivität exprimiert. GrB-5 ist wie Wildtyp GrB in zytotoxischen Granula lokalisiert und wird nach der Degranulation sehr wahrscheinlich zusammen mit Perforin sekretiert. Freigesetztes GrB-5 zeigte Bindung an ErbB2 exprimierende Zellen. Zudem wiesen Überstände von aktivierten NK-92 Zellen, die GrB-5 und Perforin enthielten, im Vergleich zu Überständen von Kontrollzellen eine höhere Zytotoxizität gegenüber ErbB2-positiven Tumorzellen auf. Dies lässt darauf schließen, dass GrB-5 in Abwesenheit exogener endosomolytischer Reagenzien durch einen Perforin-vermittelten Mechanismus in die Zielzellen gelangen konnte. Weiterhin wurden NK-92 Zellen generiert, die den GrB-Inhibitor Protease Inhibitor-9 (PI-9) exprimieren. Diese Zellen zeigten im Vergleich zu parentalen Zellen eine höhere Zytotoxizität, die sich auf eine verbesserte Inaktivierung fehlgeleiteter, zytoplasmatischer GrB-Moleküle durch das ektopisch exprimierte PI-9 zurückführen lässt. NK-92-PI-9 Zellen könnten genutzt werden, um größere Mengen von GrB-Fusionsproteinen zu exprimieren, ohne dabei die Zellen durch die Erhöhung der zytoplasmatischen GrB-Konzentration zu gefährden. Die in dieser Arbeit gewonnenen Ergebnisse zeigen, dass AIF für den Einsatz als Effektorfunktion in Immuntoxin-ähnlichen Fusionsproteinen geeignet ist. Die Anwendung von NK-Zellen zur Expression und Sekretion tumorspezifischer Antikörperfusionsproteinen zusammen mit Perforin zeigt einen möglichen Lösungsweg für das generelle Aufnahmeproblem von Immuntoxin-ähnlichen Proteinen. Die erzielten Ergebnisse können nun für die weitere Optimierung humanisierter Antikörperfusionsproteine genutzt werden.
Das Leben aller Organismen wird grundlegend durch den tages- und jahreszeitlich bedingten Wechsel der Beleuchtungsverhältnisse geprägt. Die Anpassung der Stoffwechselprozesse und Verhaltensweisen an diese Oszillationen erfolgt nicht passiv, sondern wird durch eine innere Uhr gesteuert. Tageszeitliche Rhythmen, die auch ohne den Einfluss äußerer, periodisch verlaufender Umgebungsreize (Zeitgeber) ablaufen, werden als zirkadiane Rhythmen bezeichnet. Im Säugetier steuert ein endogener Rhythmusgenerator im Nucleus suprachiasmaticus (SCN) zirkadiane Rhythmen, indem er periphere Oszillatoren miteinander synchronisiert. Auf molekularer Ebene besteht dieser endogener Rhythmusgenerator aus Aktivatoren (BMAL1 und CLOCK/NPAS2) und Inhibitoren (PER1/2 und Cry1/2), die in Rückkopplungsschleifen die Grundlage für die Rhythmogenese steuern. Die Synchronisation dieses molekularen Uhrwerkes an die Umgebungszeit erfolgt durch Licht, das in der Retina wahrgenommen und an das SCN weitergeleitet wird. Die Signaltransduktionskaskaden nach einem Lichtpuls in der frühen und der späten Nacht unterscheiden sich dabei wesentlich: Ein Lichtpuls während der frühen Nacht führt zu einer erhöhten Freisetzung von Ca2+-Ionen über Ryanodin Rezeptoren (RYR), während ein Lichtpuls während der späten Nacht zu einer erhöhten Guanylylcyclase Aktivität führt. Um zu untersuchen, wie der endogene Rhythmusgenerator seinen Lichteingang reguliert, wurde die Licht-vermittelte Phasenverzögerung in BMAL1+/+- (profizienten) und BMAL1-/-- (defizienten) Mäusen untersucht. Die Befunde aus den in-situ Hybridisierungsstudien, RTQ-PCR und immunhistochemischen Untersuchungen dieser Arbeit zeigten, dass in BMAL1-/--Mäusen die Licht-induzierte mPer-Expression während der frühen Nacht selektiv beeinträchtigt ist. Zudem konnte gezeigt werden, dass die mRNA- und Proteinmengen von RYRs in BMAL1-/--Mäusen dramatisch reduziert waren. Ryr1:: und Ryr2::Luciferase-Reportersstudien zeigten darüber hinaus, dass die Ryr-Expression durch CLOCK/BMAL1 aktiviert und durch CRY1inhibiert werden kann. Diese Ergebnisse liefern den ersten Beweis dafür, dass der endogene Rhythmusgenerator des Säugers die Signalübertragung seines eigenen Lichteingangs regulieren kann. Weiterhin wurde in dieser Arbeit die ontogenetische Entwicklung des endogenen Rhythmusgenerators im SCN und in einem Melatonin-abhängigen peripheren Oszillator, der PT, untersucht und miteinander verglichen. Dazu wurden die Uhrengenproteine im fetalen (E18), postnatalen (P2 & P10) und adulten SCN und in der PT von C3H-Mäusen zu vier verschiedenen zirkadianen Zeitpunkten mittels Immunhistochemie untersucht. Die Anzahl immunreaktiver SCN-Zellen gegen alle untersuchten Uhrengenproteine (außer BMAL1) war im Fetus signifikant niedriger, als in der adulten Maus. Auch im SCN neonataler (P2) Mäuse erreichte die Anzahl immunreaktiver Zellen noch nicht das Niveau der adulten Maus. Erst 10 Tage nach der Geburt (P10) zeigen alle Uhrengenproteine im SCN ein adultes Verteilungsmuster. Offenbar reift das Uhrwerk im SCN von Mäusen graduell während der postnatalen Entwicklungsphase. Dabei besteht eine zeitliche Korrelation zwischen der Reifung des endogenen Rhythmusgenerators im SCN und der Ausbildung von inter-suprachiasmatischen und retino-suprachiaamatischen neuronalen Kontakten. Im Gegensatz zum SCN zeigte der Melatonin-abhängigen Oszilllator in der PT bereits im Fetus einen nahezu vollständig ausgeprägten Rhythmus der Uhrengenproteine. Da das fetale Pinealorgan noch nicht zur rhythmischen Melatonin-Synthese fähig ist, liegt es nahe, dass das mütterliche Melatonin die rhythmische Expression der Uhrengene in der fetalen PT reguliert. Wie in vitro Untersuchungen an PER2::LUCIFERASE-Mäusen zeigten, hat das mütterliche Melatonin offenbar auch einen modulierenden Einfluss auf den fetalen SCN. Bei diesen Mäusen konnte im fetalen und postnatalen SCN ein zirkadianer Rhythmus in der PER2-Synthese nachgewiesen werden, der eine relativ lange Periodenlänge aufwies und nach 3 Tagen zum Erliegen kam. Eine Stimulation mit Melatonin führte zu einer deutlichen Verkürzung der Periodenlänge im PER2-Rhythmus. Folglich scheint das mütterliche Melatonin eine wichtige Quelle für Informationen der Umgebungszeit im Fetus zu sein. Um die Uhrengenexpression während der Maus-Ontogenese in vitro auf zellulärer Ebene darzustellen, wurde in dieser Arbeit zudem ein vom murinen Per2-Promoter angetriebenes DsRed- Reportersystem etabliert und der Versuch begonnen, eine darauf basierende transgene Maus zu generieren.
Die vaskuläre NADPH-Oxidase ist eine wichtige Quelle für reaktive Sauerstoff-Spezies (ROS). Viele dieser Daten wurden unter Verwendung des Inhibitors Apocynin (4'-Hydroxy-3' methoxyacetophenon) erhoben, dessen Wirkungsweise jedoch nicht bekannt war. In dieser Arbeit wurde der Mechanismus der Hemmung der vaskulären NADPH-Oxidase näher untersucht, sowie nach weiteren Inhibitoren gesucht. In HEK293-Zellen wurden die NADPH-Oxidase-Isoformen Nox1, Nox2, Nox4, Duox1 oder Duox2 überexprimiert und die von den Zellen produzierten Radikale durch verstärkte Chemilumineszenz gemessen. Hierbei wurde festgestellt, dass Apocynin die Produktion von Superoxidanionen nicht hemmt, aber die Detektion von Wasserstoffperoxid- oder Hydroxylradikalen beeinflusst. Wenn die Radikale durch Xanthin/Xanthin-Oxidase oder nicht-enzymatische Systeme generiert wurden, beeinflusste Apocynin direkt die Peroxid-, aber nicht die Superoxid-Detektion. In Leukozyten ist Apocynin ein Pro-Pharmakon, das durch Myeloperoxidase (MPO) aktiviert werden kann. Dieser Prozess führt zur Bildung eines Apocyninradikals, das zu einem Dimer umgewandelt wird. Allerdings kann man aufgrund der hohen Reaktivität des Radikals nur das Dimer nachweisen. Endothelzellen und glatte Muskelzellen sind nicht in der Lage dieses Dimer zu bilden und können daher Apocynin nicht aktivieren. In Nox-überexprimierenden HEK293-Zellen konnte die Dimer-Bildung gezeigt werden, wenn MPO zugegeben wurde. Apocynin kann ohne MPO-Zugabe nur die NADPH-Oxidase in Leukozyten hemmen und wirkt in vaskulären Zellen als Antioxidans. Tatsächlich wurde in vaskulären glatten Muskelzellen die Aktivierung der redoxsensitiven Kinasen p38-MAP-Kinase, Akt und Erk1/2 durch Wasserstoffperoxid und durch den intrazellulären Radikal-Generator Menadion in Anwesenheit von Apocynin verhindert. Des Weiteren wurde untersucht, ob Cyclooxygenase 2 (COX-2), die eine ähnliche Peroxidase-Domäne wie MPO besitzt, mit Apocynin interagiert. Die COX-2-Aktivität wurde durch Apocynin gehemmt. In COX-2 überexprimierenden HEK293- Zellen wurden die Superoxidanion- sowie die Wasserstoffperoxid-Bildung durch Apocynin völlig gehemmt. Allerdings konnte durch die Peroxidaseaktivität von COX-2 Apocynin nicht aktiviert und somit kein Dimer nachgewiesen werden. Diese Beobachtung unterstützt ferner die unspezifische Natur der Nox-Hemmung durch Apocynin.Intravenös appliziertes Apocynin in Mäusen und Schweinen führte zu einer Aktivierung von Apocynin. In vivo wirkt Apocynin somit als möglicher Nox2-Inhibitor und als Antioxidans. Flavonoide, insbesondere die des Katechol-Typs, in dem der B-Ring monomethyliert ist, haben eine ähnliche Struktur wie Apocynin. Daher wurde in dieser Arbeit auch das Potenzial der Flavonoide Epicatechin, 3'-O-Methyl-Epicatechin, Procyanidin B2 und Isorhamnetin als Inhibitoren der NADPH-Oxidase analysiert. Nox-überexprimierende HEK293-Zellen (Nox1, Nox2 sowie Nox4) wurden mit verschiedenen Flavonoiden inkubiert und die ROS-Bildung mittels verstärkter Chemilumineszenz gemessen. Epicatechin und Procyanidin B2 hemmten die Radikal-Detektion der verschiedenen Nox-Isoformen in allen Detektionssystemen. Isorhamnetin hemmte die Radikal-Detektion durch Nox1 nur leicht, allerdings wurde die Bildung der Radikale durch Nox4 und Nox2 fast komplett blockiert. 3'-O-Methyl-Epicatechin wies die schwächste antioxidative Wirkung auf. Es hemmte zwar die Wasserstoffperoxidbildung, jedoch kaum die Nox1- und Nox2-abhängige Superoxidanion-Bildung. Keine der getesteten Substanzen konnte den „respiratorischen Burst“ in mit Phorbolmyristatacetat stimulierten Leukozyten blockieren. Diese Daten deuten darauf hin, dass Apocynin und Katechine potente Antioxidantien für Wasserstoffperoxid, aber keine spezifischen NADPH-Oxidase- Hemmer in vaskulären Systemen sind.
Central America is one of the world’s most herpetological diverse areas in relation to its size. Nicaragua is the largest country in this region and separates Nuclear from Lower Central America. It is one of the least herpetological explored countries in Central America and few studies dealing with the herpetofauna of a potion or the entire country have been published. I here update the checklist of the Nicaraguan herpetofauna, present taxonomic revisions of some difficult species complexes, compare the similarities of the composition of the herpetofaunal communities in the major forest formations present in the country within a zoogeographical context, and identify those species with a greater vulnerability risk in Nicaragua. Taxonomy The herpetofauna of Nicaragua currently consists of 244 species representing 134 genera and 42 families with 78 amphibian species representing 35 genera and 15 families, and 166 reptile species representing 99 genera and 27 families, which includes six marine species. Sixteen species (12 amphibians and four reptiles) are endemic to the country. Of the 12 endemic amphibian species, three are here described. In addition, five genera (Anotheca, Cerrophidion, Duellmanohyla, Isthmohyla, and Rhinobothryum) and two species (Rhadinea godmani and Urotheca decipiens) are known to occur both north and south of Nicaragua although there are no voucher specimens of these taxa to confirm their presence in country. I complete a bibliographic research updating the nomenclature changes and provide a brief herpetological history of Nicaragua, a recompilation of all species described upon Nicaraguan material and their current synonymy, the first time each species was recorded from the country, and a list of all recognized subspecies occurring in Nicaragua. I discuss the taxonomic uncertainties among the Nicaraguan populations of amphibians and reptiles and take further detailed taxonomic revisions on selected Nicaraguan species groups from the genera Anolis, Bolitoglossa, and Craugastor along their known distributional range. I describe five new species of herpetofauna (three of which are based on Nicaraguan material), redescribe five species of Anolis (three of which occur in Nicaragua), and provide voucher specimens of five other species for the first time in Nicaragua. In detail: • I studied the pholidosis, morphometrics as well as hemipenis and dewlap morphology in Anolis wermuthi, an anole endemic to the highlands of northern Nicaragua. I examine patterns of geographic variation using discriminant function analysis and discuss the characters that vary both individually and among populations. The results indicate that A. wermuthi is a single species with several disjunct, slightly divergent populations. I provide a standardized description, illustrations of the everted hemipenis of an adult topotype, the male and female dewlap, and a distribution map. I also provide brief descriptions of the localities where this species occurs and some ecological notes. • I studied the pholidosis, morphometrics as well as hemipenis morphology in the Central American anole species Anolis humilis, A. quaggulus, and A. uniformis. The three taxa are distinct in hemipenis morphology. However, very little differentiation in pholidotic and morphometric characters is documented. I document interspecific variation in several characters but with overlap of the documented ranges. A discriminant function analysis based on five pholidotic characters yielded a scatter diagram that showed large overlap between the clusters of the three taxa. I provide head scalation illustrations, an identification key, a distribution map, and standardized descriptions of the commonly distributed in Nicaragua A. quaggulus as well as of the other two species. • I describe two new species of anoles (genus Anolis) from Panama formerly referred to as Anolis limifrons. The two new species, Anolis apletophallus and Anolis cryptolimifrons, differ from A. limifrons by having a large bilobed hemipenis (small and unilobed in A. limifrons). The new species differ from each other in male dewlap size and coloration. I provide illustrations of the head scalation, everted hemipenis, and dewlap, an identification key, a distribution map, and standardized descriptions of the commonly distributed in Nicaragua A. limifrons and the two new species described herein. • I describe two new species of salamanders of Bolitoglossa from southern Nicaragua. Bolitoglossa indio is known from Río Indio in the lowlands of the Río San Juan area and Bolitoglossa insularis from the premontane slopes of Volcán Maderas on Ometepe Island. The two new species are of unknown affinities but both differ from their congeners in coloration. Bolitoglossa indio is most similar to B. mexicana and B. odonnelli from which differ by having both broad dorsolateral pale brown stripes not clearly delimited in outline. Bolitoglossa insularis is most similar to B. mombachoensis and B. striatula from which differ by the absence of dark or light defined stripes on dorsum and venter. • I describe a new species of frog of the genus Craugastor from Río San Juan, Nicaragua. The new species, Craugastor chingopetaca, is assigned to the fitzingeri group and differs from most Central American species of that group by the absence of a midgular pale stripe. Within the fitzingeri group it is most similar to C. crassidigitus and C. talamancae from which it differs in several morphological characteristics such as more extensive webbing, retuse disk covers on some digits, and relative toe length. • I provide voucher specimens of Cochranella spinosa, Kinosternon angustipons, Mesaspis moreletii, Cnemidophorus lemniscatus and Adelphicos quadrivirgatum for the first time in Nicaragua. I include descriptions, illustrations, and brief ecological notes for the five new country records. Zoogeography Based on the concept of ecological formations proposed by HOLDRIDGE (1967), nine forest formations are found in Nicaragua. Of the total number of terrestrial species of herpetofauna found in Nicaragua, 131 species (55.0%) occur in Lowland Wet Forest, 21 of which (8.8%) are restricted to this forest formation, 168 species (70.6%) occur in Lowland Moist Forest, 15 of which (6.3%) are restricted to this forest formation, 84 species (35.3%) occur in Lowland Dry Forest, four of which (1.7%) are restricted to this forest formation, 47 species (19.7%) occur in Lowland Arid Forest, with no species restricted to this forest formation, 59 species (24.8%) occur in Premontane Wet Forest, three of which (1.3%) are restricted to this forest formation, 116 species (48.7%) occur in Premontane Moist Forest, 10 of which (4.2%) are restricted to this forest formation, 51 (21.4%) species occur in Premontane Dry Forest, with no species restricted to this forest formation, 13 species (5.5%) occur in Lower Montane Wet Forest, two of which (0.8%) are restricted to this forest formation, and 50 species (21.0%) occur Lower Montane Moist Forest, seven of which (2.9%) are restricted to this forest formation. The Coefficient of Biogeographic Resemblance algorithm show a distinct composition of the herpetofauna from the isolated highlands of northeastern Nicaragua, which is characterized by a high proportion of endemic species. Two other clusters are evident when analyzing the herpetofaunal similarities among Nicaragua, the Pacific versant and the central mountains and the Atlantic lowlands. In addition, the Pacific lowlands are characterized by a relatively homogeneous composition of the herpetofauna. In contrast, many species have their northern limit of distribution in the Atlantic lowlands with the ranges of most of these species ending in southern Nicaragua. The central mountains constitute the southern limit of distribution of several highland species. In general, there is a greater contribution of reptile than amphibian species to the total herpetofauna present in each forest formation. This unbalance is slightly higher in the dry than in the moist parts of the country. The similarities in the composition of the reptiles between the different forests formations seem to be relatively distinct on an elevation factor, whereas in amphibians similarities might be better explained in correlation with humidity. The total amount of amphibian and reptile species in Nicaragua has a Middle American Element dominance and varies between amphibians and reptiles, with and a greater South American Element influence in anurans and a greater Old Northern Element influence in reptiles. In general, there is a greater percentage of species with a South American Element in extreme southeastern Nicaragua with a decreasing tendency towards northern Nicaragua. Taking in account the geography and geologic history of Nicaragua as well as the known Central American dispersal routes, I identify species of probable occurrence in Nicaragua as well as those places with a greater potential to hold undescribed endemic species. Conservation In Nicaragua, no amphibian or reptile populations are entirely free from anthropogenic impact. I determine the endangerment level of all Nicaraguan amphibian and reptile species using the IUCN categorizations and the Environmental Vulnerability Scores. Seventy-six species (31.9%) of Nicaraguan amphibians and terrestrial reptiles have high vulnerability, 118 (49.6%) medium vulnerability, and 44 (18.5%) low vulnerability. Eighteen species (7.4% of the total herpetofauna) are unknown from protected areas, including 13 high vulnerability species (three are endemic), four medium vulnerability species, and one low vulnerability species. To preserve the future of Nicaragua’s amphibians and reptiles, every species should reside in at least one protected area, the protected areas must be guarded, and monitoring programs are needed to detect changes in amphibian and reptile populations, prioritizing highly vulnerable species.