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Meeting Abstract Es wurde eine zellbasierte Wundauflage mit Keratinozyten und Fibroblasten auf Basis einer kommerziellen Wundauflage (Matriderm, Collagen/Elastin-Matrix) generiert, um damit großflächige Verbrennungswunden behandeln zu können. Zunächst wurde die Expansion der Keratinozyten optimiert und die Zeit für die Anzüchtung minimiert. Ausgangsmaterial waren 1–2 cm2 Spalthaut vom Patienten. Epidermis und Dermis wurden nach einer enzymatischen Behandlung mit Thermolysin voneinander getrennt. Aus den beiden Hautkompartimenten wurden durch Trypsin- und Kollagenase I-Behandlung Keratinozyten und Fibroblasten isoliert, welche in Kollagen I-beschichteten Zellkulturflaschen expandiert wurden. Nach 10 Tagen wurden die Fibroblasten auf 100 cm2 Matriderm aufgebracht. Nach einwöchiger submerser Kultivierung wurden die Keratinozyten ausgesät. Eine Woche später wurde die Matrix an die Luft-Flüssigkeitsgrenze angehoben, um die epidermale Differenzierung einzuleiten. Nach 16 Tagen wurde das Hautäquivalent fixiert und immunhistologisch sowie elektronen-mikroskopisch begutachtet. Die Histologie zeigte eine regelgerechte Stratifizierung des epidermalen Anteils. Immunhistologisch ließ sich eine Basalmembran mit Collagen IV und Laminin 5 nachweisen. Proliferative Zellen, nachgewiesen mit KI-67 befanden sich lediglich in der basalen Region der Epidermis. Desmoglein, sowie die Differenzierungsmarker Involucrin und CK 10 wurden suprabasal nachgewiesen. Elektronenmikroskopisch waren die Basalmembran sowie die Zell-Zell-Verbindungen in Form von Desmosmen zu erkennen. Späte Differenzierungsmerkmale, wie granuläre Strukturen und verdickte Zellmembranen, fanden sich im Str. granulosum und Str. corneum. Die Studie zeigt, dass man aus Matriderm eine zellbasierte Wundauflage herstellen kann, die verglichen mit dem Ausgangsmaterial um den Faktor 50–100 vergrößert ist und deren Aufbau normaler Haut weitgehend entspricht.
Fragestellung Intoleranzreaktionen auf nicht-steroidale Antiphlogistika sind häufig und basieren auf der Hemmung des Enzyms Cyclooxygenase-1 (COX-1), wohingegen deren therapeutische Effekte auf einer COX-2 Hemmung beruhen. In dieser Studie wurde die Verträglichkeit des selektiven COX-2 Inhibitors Celecoxib bei Patienten mit Intoleranzreaktionen auf nicht-steroidale Antiphlogistika untersucht. Methodik Bei 77 Patienten (24 Männer, 53 Frauen) mit Intoleranzreaktionen auf nicht-steroidale Antiphlogistika wurden standardisierte Hauttestungen (Prick, Scratch, Epikutantestung) sowie anschließend orale fraktionierte Placebo-kontrollierte einfach blinde Expositionstestungen unter Einschluß von Celecoxib (maximale Einzeldosis 200mg, kumukative Tagesdosis 350mg) durchgeführt. Ergebnisse 21 Patienten wiesen anamnestisch lediglich Hautsymptome (Urtikaria) auf, 25 Patienten nur eine Atemwegssymptomatik (Asthma), bei 18 Patienten traten Haut- und Atemwegssymptome auf, und bei 13 Patienten war es zu einem anaphylaktischen Schock gekommen. Azetylsalizylsäure war in 38 Fällen ein Auslöser der Beschwerden. In 46 Fällen verursachten mehrere nicht-steroidale Antiphlogistika chemisch unterschiedlicher Gruppen die Symptomatik. Die orale Expositionstestung mit Celecoxib verlief bei allen 77 Patienten unauffällig. Schlußfolgerung Vor dem Hintergrund der hohen Inzidenz von Intoleranzreaktionen gegen nicht-steroidale Antiphlogistika stellt der Einsatz selektiver COX-2 Inhibitoren eine therapeutische Alternative sowie eine geeignete Maßnahme zur Prävention entsprechender Reaktionen dar.
Tiere und Menschen sind für das tägliche Überleben auf eine schnelle Bewertung und flexible Nutzung verschiedenster Umweltreize angewiesen. So nutzen Vögel, wie viele andere Tiere, sowohl den Magnetsinn als auch die Geometrie der Umgebung und Landmarken, um sich im Raum zu orientieren. Auch erfolgt eine schnelle und komplexe Auswertung des visuellen Inputs, beispielsweise, um bei der Futtersuche selektiv Futterkörner finden zu können. Unklar ist bislang, wie Raum- und Objektinformation in den beiden Hirnhälften verarbeitet werden und wie die Aufgabenteilung zwischen den Hemisphären aussieht. Zur Klärung dieser Thematik soll die vorliegende Arbeit beitragen, wobei die Versuche so angelegt wurden, dass mögliche, grundlegende Verarbeitungsstrategien unter zwei Gesichtspunkten betrachtet werden konnten: Zum einen wurden den Tieren prinzipiell unterschiedliche Aufgaben präsentiert, um über verschiedene Bereiche auf dem Gebiet der Raum- und Objektverarbeitung hinweg vergleichen zu können. Zum anderen wurde mit den beiden zurzeit wichtigsten Vogelmodellen gearbeitet, der Brieftaube (Columba livia) und dem Haushuhnküken (Gallus gallus). Dies erlaubt einerseits den Vergleich eigener Ergebnisse mit anderen Befunden innerhalb derselben Art, während andererseits auch Parallelen und Unterschiede zwischen verschiedenen Arten betrachtet werden können. Vögel eignen sich hierbei aufgrund ihrer Anatomie besonders gut für die Erforschung von Hemisphärenunterschieden. Durch ein nahezu vollständiges Überkreuzen der Sehnerven und das Fehlen eines Corpus callosum oder anderer funktionell entsprechender Strukturen zum Informationsaustausch zwischen den Hirnhälften wird der visuelle Input eines Auges überwiegend in der gegenüberliegenden Hirnhälfte verarbeitet. Lateralisation kann daher sehr leicht durch Abdecken eines Auges untersucht werden. Bei Brieftauben wurde die Repräsentation von Geometrie und Landmarken untersucht (Kapitel 2). Die Tiere lernten hierbei, das Zentrum einer quadratischen Arena mithilfe rein geometrischer Hinweise oder mittels einer Kombination von Geometrie und Landmarken zu finden. Durch Verändern der verfügbaren Informationsart wurde untersucht, welche Informationen die Tauben zum Lokalisieren des Zentrums nutzten. Die Ergebnisse zeigen mit einer beidseitigen Verarbeitung ein qualitativ anderes Muster der Repräsentation von Rauminformationen als bislang bei anderen Arten, wie z.B. dem Haushuhnküken, beschrieben. Ferner hing der relative Gebrauch von Geometrie und Landmarken in starkem Maße von der vorherigen Erfahrung der Tauben ab. In einer weiteren Studie wurde die Verarbeitung von Magnetkompassinformation bei Brieftauben untersucht (Kapitel 3). Hierbei wurde erstmals erfolgreich ein Versuchsdesign zur Laboruntersuchung entwickelt. Auch bei dieser Raumkognitionsaufgabe wurde ein Unterschied zu der bei anderen Arten gefundenen linkshemisphärischen Spezialisierung zugunsten einer Verarbeitung sowohl in der linken als auch in der rechten Hirnhälfte gefunden. Während die Tauben hierbei mit der rechten Hirnhälfte lediglich die richtige Achse wahrnahmen, erfassten sie mit der linken Hemisphäre die spezifische Richtung. Dies könnte die gefundene linkshemisphärische Überlegenheit im Freiland erklären. Erstmals bei Vögeln wurde beim Haushuhnküken in einem weiteren Versuch die hemisphärische Verarbeitung von Raumfrequenzinformation untersucht, die sowohl für die visuelle Raumorientierung als auch für das Objekterkennen von großer Bedeutung ist (Kapitel 4). Die Raumfrequenz ist hierbei allgemein als ein Maß für die Wiederholungen einer Struktur über eine bestimmte Strecke definiert und kann zur Charakterisierung beliebig komplexer Objekte verwendet werden. Die Küken wählten zwischen simultan dargebotenen Objekten, deren Oberflächen sich hinsichtlich ihrer Raumfrequenzen unterschieden. Die Ergebnisse weisen auf eine Spezialisierung der linken Hirnhälfte für hohe und der rechten Hirnhälfte für niedrige Raumfrequenzen hin. Aufgrund der Parallelen zu Befunden beim Menschen könnte dies auf eine gemeinsame Grundlage der Lateralisationsentwicklung bei Wirbeltieren hindeuten. Während sich die vorangehenden Studien der vorliegenden Arbeit mit Spezialisierungen der linken und rechten Hirnhälfte bei der Verarbeitung von Raum- und Objektinformation befassten, wurde in Kapitel 5 das Zusammenwirken von linker und rechter Hirnhälfte bei der selektiven Nahrungssuche untersucht. Hierbei konnte am Beispiel des Haushuhnkükens erstmals bei Vögeln Hemisphärenkooperation gezeigt werden, was als Hinweis darauf zu werten ist, dass eine bilaterale Repräsentation im Vogelhirn in komplexen Situationen, die eine rasche und effiziente Beurteilung des gesamten überschaubaren Bereichs erfordern, möglich ist. Insgesamt zeigen die Ergebnisse für mehrere wichtige Fragen der Lateralisationsforschung wie die Erfahrungsabhängigkeit, den Nachweis unterschiedlicher Lateralisationsmuster bei Brieftauben und Haushuhnküken in der geometrischen Orientierung oder die Kooperation der Hirnhemisphären, dass bisherige Ansichten über die Verarbeitung von Raum- und Objektinformation bei Vögeln einer kritischen Überarbeitung bedürfen.
Zusammenfassung (in German) Rostpilze sind obligate Parasiten auf vielen holzigen und krautigen Pflanzen und führen weltweit zu ernsten ökonomischen Schäden in der Landwirtschaft. Weltweit sind zurzeit sind ca. 100 Gattungen und 9000 Arten von Rostpilzen (Pucciniales, Basidiomycota) bekannt. Es gibt fünf verschiedene Entwicklungsstadien mit je eigener Morphologie: Spermogonium, Aecidium, Uredosporenlager, Teleutosporenlager und Basidium. Bei vielen Rostpilzen kommt es im Entwicklungsgang zu einem Wechsel zwischen zwei verschiedenen Wirtsarten. Die Spermogonien werden auf einem haploiden Myzel erzeugt, das sich nach der Infektion des Pflanzengewebes durch Basidiosporen entwickelt. In den Spermogonien entwickeln sich einzellige, monokaryotische, hyaline Spermatien, die in einem süßlichen Exudat ausgeschieden werden. Das Aecidium bildet einzellige, dikaryotische Aecidiosporen in Ketten. Bei der Keimung entwickeln sie dikaryotische Hyphen, welche entweder Uredosporen- oder Teleutosporenlager, aber nicht wieder Aecidien erzeugen. Die Uredosporen der Uredosporenlager dienen der Massenausbreitung, Infektion derselben Wirtsart und wiederholten Bildung neuer Uredosporenlager. Das Ornament der Uredosporen ist variabel: echinulat, verrucos, gestreift verrucos, zerfurcht, runzelig, labyrinthisch, pseudoreticulat oder reticulat. Teleutosporenlager und Teleutosporen sind das wichtigste Stadium für allgemeine Unterscheidungen und die Nomenklatur von Rostpilzen, da sie das sexuelle Stadium repräsentieren. Teleutosporen erzeugen Basidien und Basidiosporen. Teleutosporen sind morphologisch sehr variabel und präsentieren deshalb die nützlichsten zuverlässigen Eigenschaften zur Unterscheidung der Arten. Die Basidien entstehen größtenteils am distalen Ende der Teleutosporenzelle und sind transversal septiert. Die Basidiosporen sitzen auf Sterigmen auf den Basidienzellen und sind globos oder subglobos. Durch die hoch spezifische Abhängigkeit der Rostpilz-Arten von ihren Wirtspflanzen ist die Verbreitung der Rostpilze an die Verbreitung ihrer Wirte gebunden. Jedoch sind vollständige Lebens-Zyklen der Rostarten, mikromorphologische Details der oben genannten Stadien, Spektren der Wirtspflanzen und geographische Verbreitung unvollständig bekannt. Einige dieser offenen Fragen am Beispiel der Rostpilze Panamas zu beantworten ist das Ziel dieser Arbeit. Da für das relativ kleine Land Panama 9.500 Pflanzenarten bekannt sind, wird eine hohe Zahl an Rostpilzarten vermutet. Die Rostpilze Panamas wurden sporadisch von verschiedenen Mykologen studiert. Bis 2007 waren in Panama jedoch lediglich 25 Gattungen und 101 Arten von Rostpilzen bekannt. Für die vorliegende Arbeit wurden in den Jahren 2004 bis 2007 Rostpilze in Panama gesammelt, hauptsächlich in der Provinz Chiriquí im Westen Panamas. Insgesamt wurden 468 Belege geprüft, die 150 verschiedenen Arten von Rostpilzen entsprechen. 233 Belege wurden zwischen 2005 und 2007 im ppMP-Projekt (pflanzenparasitische Mikropilze Panamas) von M. Piepenbring, O. Perdomo, R. Mangelsdorff, T. Trampe und T. Hofmann gesammelt. 76 Belege wurden von M. Piepenbring zwischen 1998 und 2007 gesammelt. 1 Beleg wurde von R. Kirschner (2003) gesammelt. Zusätzlich wurden Belege aus Herbarien konsultiert, 30 Belege aus dem New York Botanical Garden (NYBG), 93 Belege aus den U.S. National Fungus Collections (BPI) und 35 Belege aus der Purdue University (PUR). In dieser Arbeit werden 30 Arten von Rostpilzen aus dem Westen Panamas detailliert beschrieben und durch rasterelektronenmikroskopische Aufnahmen und Zeichnungen illustriert. Zwei davon sind neue Arten: Puccinia urochloae auf Urochloa decumbes (Poaceae) und Uromyces melampodii auf Melampodium costaricense (Asteraceae). Puccinia urochloae unterscheidet sich von den bekannten Puccinia-Arten durch diorchidioide Teleutosporen, Teleutosporenmaße sowie Paraphysen und Uromyces melampodii von anderen Uromyces-Arten durch die Teleutosporenmaße und Wirtsgattung. 28 Arten werden erstmalig für Panama dokumentiert: für Aecidium psychotriae auf Psychotria cf. carthagenensis (Rubiaceae), für Coleosporium verbesinae auf Verbesina gigantea (Asteraceae), für Crossopsora byrsonimatis auf Byrsonima crassifolia (Malphigiaceae), für Crossopsora uleana auf Solanum trizygum (Solanaceae), für Puccinia cordiae auf Cordia alliodora (Boraginaceae), für Puccinia cyperi-tagetiformis auf Cyperus odoratus (Cyperaceae), für Puccinia enixa auf Baccharis cf. pedunculata, für Puccinia inaudita auf Wedelia inconstans (Asteraceae), für Puccinia psidii auf Syzygium jambos (Myrtaceae), für Puccinia sp. 1 auf Aulonemia patriae (Poaceae), für Puccinia sp. 2 auf Carex longii (Cyperaceae), für Pucciniosira dorata auf Triumfetta bogotensis (Malvaceae), für Uredo ficina auf Ficus sp. (Moraceae), für Uredo hydrocotyles auf Hydrocotyle mexicana (Apiaceae), für Uredo incomposita auf Eleocharis sp. (Cyperaceae), für Uredo jatrophicola auf Jatropha curcas (Euphorbiaceae), für Uredo kyllingiae auf Kyllinga cf. odorata (Cyperaceae), für Uredo melinidis auf Melinis minutiflora (Poaceae), für Uredo notata auf Byrsonima crassifolia (Malpighiaceae), für Uredo peperomiae auf Peperomia glabella (Piperaceae), für Uredo proeminens auf Euphorbia heterophylla and E. hyssopifolia (Euphorbiaceae), für Uredo rubescens auf Dorstenia contrajerva (Moraceae), für Uredo yucatanensis auf Mimosa albida (Fabaceae), für Uromyces bidenticola auf Bidens pilosa (Asteraceae), für Uromyces ictericus auf Iresine celosiae (Amaranthaceae), für Uromyces sp. 1 auf Struthanthus sp. (Loranthaceae) und für Uromyces trifolii-repentis auf Trifolium repens (Fabaceae). Die Zahl der für Panama bekannten Rostpilze erhöht sich mit dieser Arbeit von 101 auf 131 Arten. Für fünf andere Rostpilze werden weltweit neue Wirtsarten genannt: Cordia spinescens als Wirt von Alveolaria cordiae, Eupatorium odoratum als Wirt von Cionothrix praelonga, Xylopia grandiflora als Wirt von Dasyspora gregaria, Cyperus diffusus als Wirt von Puccinia subcoronata, und Calathea indecora als Wirt von Puccinia thaliae. Die Artenvielfalt von Pflanzen in den Tropen ist noch nicht vollständig bekannt, und man kann keine Voraussagen machen oder feststellen, ob ein Gebiet artenreicher ist als andere. Die bescheidene Dokumentation von Rost-Pilzen in Panama beruht auf einem Mangel an Inventuren im Gebiet. Die in Panama am häufigsten vertretenen Wirts-Familien sind die Asteraceae, Cyperaceae, Fabaceae und Poaceae. Die Asteraceae, mit 303 Arten die sechstgrößte Pflanzenfamilie in Panama, haben die größte Zahl der Wirtsarten von Rost-Pilzen in Panama mit 24 Rostarten, nämlich in den Gattungen Cionothrix, Coleosporium, Dietelia, Endophyllum, Puccinia und Uromyces. Die Fabaceae jedoch präsentieren die höchste Zahl der Rost-Gattungen in Panama (Ateloucada, Dicheirinia, Phakopsora, Puccinia, Uraecium, Uredo, Uromyces und Uropyxis) mit 23 Rostarten. Die Fabaceae sind mit einer Gesamtzahl von 487 Arten in Panama die zweitgrößte Pflanzenfamilie. In dieser Studie wurden rasterelektronenmikroskopische Beobachtungen der Morphologie und Ornamentierung von Sporen durchgeführt. Echinulate und verrucose Ornamentierung sind mit dem Lichtmikroskop bei gewissen Arten von Pilzen schwierig zu unterscheiden. Das beobachtete Ornament ist jeweils spezifisch für die Art. Die asexuell gebildeten Uredosporenlager und Uredosporen sind in der Regel das zahlenmäßig am häufigsten anzutreffende Entwicklungsstadium und seine Merkmale sind genügend unveränderlich und unterschieden, um sie taxonomisch zu verwenden. Die taxonomisch nützlichsten Eigenschaften von Uredosporen sind: die Form und Größe der Spore, die Farbe und Stärke der Sporen-Wand, ihre Oberflächenornamentierung, die Zahl und Verteilung der Keimporen. Die Anwesenheit von Paraphysen ist bei Rost-Pilzen taxonomisch nicht wichtig. In den beobachteten Belegen sind Paraphysen sowohl in Uredo- als auch in Teleutosporenlagern vorhanden, allerdings am häufigsten in Uredosporenlagern. Bestimmte Merkmale der Paraphysen können jedoch taxonomisch wichtig sein. In unserer Analyse fanden wir Arten mit pigmentierten Paraphysen bei Crossopsora uleana, Puccinia sp. 1, Uredo jatrophicola, Uredo yucatanensis und Uromyces melampodii. Crossopsora uleana hat verzweigte Paraphysen. Für die Identifikation der Rostpilze ist es notwendig und wesentlich, die Wirtspflanzen zu identifizieren. Dennoch können viele Pflanzenproben nicht leicht identifiziert werden, da viele steril sind, und in den meisten Fällen sind blühende oder fruchtenden Teile für die Pflanzenbestimmung wesentlich. Viele Rostpilzarten wurden in der Vergangenheit sehr knapp und unvollständig, mit irreführenden Angaben und ungenauen Wirtsdaten beschrieben. Rostpilze können im Feld leicht erkannt werden. Es gibt wenige Ausnahmen, die mit anderen pathogenen Pilzen verwechselt werden können. Solch ein Beispiel ist Stigmina anacardii, ein imperfekter Pilz mit oberflächlich ähnlicher Morphologie wie Rostpilze, aber mit Beziehung zu den Ascomycota. Basidien und Basidiosporen von Alveolaria cordiae werden erstmals illustriert und dokumentiert. Am Beispiel von Dasyspora gregaria konnte erstmals eine fein warzige Ornamentierung der Basidiosporen bei Rostpilzen aufgezeigt werden. Resumen (in Spanish) Especies de Pucciniales son hongos parásitos de plantas del grupo Basidiomycota. En esta tesis 30 especies de Pucciniales recientemente colectadas en el Oeste de Panama se presentan con descripciones detalladas, microscopia electrónica de barrido y dibujos. De estas, 2 son nuevas especies: Puccinia urochloae y Uromyces melampodii. Además, 28 especies se citan por primera vez para Panama: Aecidium psychotriae, Coleosporium verbesinae, Crossopsora byrsonimatis, Crossopsora uleana, Puccinia cordiae, Puccinia cyperi-tagetiformis, Puccinia enixa, Puccinia inaudita, Puccinia paupercula, Puccinia psidii, Puccinia sp. 1, Puccinia sp. 2, Pucciniosira dorata, Uredo ficina, Uredo hydrocotyles, Uredo incomposita, Uredo jatrophicola, Uredo kyllingiae, Uredo melinidis, Uredo notata, Uredo peperomiae, Uredo proeminens, Uredo rubescens, Uredo yucatanensis, Uromyces bidenticola, Uromyces ictericus, Uromyces sp. 1 y Uromyces trifolii-repentis. Asi el numero de especies de Pucciniales conocidas para Panama aumenta de 101 a 131. En 5 especies diferentes de hongos se descubrieron nuevas especies en plantas hospederas: Cordia spinescens para Alveolaria cordiae, Eupatorium odoratum para Cionothrix praelonga, Xylopia gradiflora para Dasyspora gregaria, Cyperus diffusus para Puccinia subcoronata, y Calathea indecora para Puccinia thaliae. La especie Dasyspora gregaria es reportada con basidiosporas finamente verrucosas por primera vez en royas y la especie Alveolaria cordiae, una especie pobremente conocida es reportada, descrita e ilustrada con detalles por primera vez sobre Cordia spinescens en Panama.
Die maligne Transformation von Zellen beruht auf der Mutation von Genen, die entartete Zellen der regulierenden Wachstumskontrolle entziehen, ihre Versorgung sicher stellen und sie unempfindlich gegen apoptoseinduzierende Signale machen (Hanahan und Weinberg, 2000). Klassische Behandlungsmethoden wie Strahlen- und Chemotherapie wirken häufig über die Aktivierung apoptotischer Signalwege, die jedoch in behandlungsresistenten Tumorzellen blockiert sein können. Das selektive Einbringen proapoptotischer Proteine in Tumorzellen stellt daher eine vielversprechende Strategie zur Umgehung solcher Blockaden dar. In dieser Arbeit wurden tumorspezifische Antikörperfusionsproteine generiert, die humane Zelltod auslösende Proteine als Effektorfunktion enthalten. Das mitochondriale Protein „apoptosis inducing factor“ (AIF) wird durch diverse Apoptosesignale in das Zytoplasma freigesetzt. AIF leitet nach der Translokation in den Zellkern Chromatinkondensation und Degradation der nukleären DNA ein (Cande et al., 2004b). Zur selektiven Einschleusung von zytoplasmatischem AIF (AIF!100) in ErbB2 exprimierende Tumorzellen wurde es an das ErbB2-spezifische „single chain“ Antikörperfragment scFv(FRP5) fusioniert, welches von dem monoklonalen Antikörper FRP5 abgeleitet ist (Wels et al., 1992b). Daneben enthält ein zunächst generiertes AIF!100-DT183-378-5 Fusionsprotein eine Translokationsdomäne aus Diphtherietoxin (AA 183-378) als mögliche „endosome escape“ Aktivität. Diese Domäne sollte der Effektordomäne nach rezeptorvermittelter Aufnahme den Übergang in das Zytoplasma erlauben. Die Expression dieses Moleküls in E. coli und der Hefe Pichia pastoris führte jedoch nicht zu funktionellen AIF!100-DT183-378-5 Proteinen. Daher wurde für nachfolgende Arbeiten ein ähnliches AIF-Fusionsprotein (5-E-AIF!100) aus früheren Arbeiten unserer Gruppe eingesetzt und sein Wirkmechanismus eingehend untersucht. Im Gegensatz zu AIF!100-DT183-378-5 enthält 5-E-AIF!100 die Translokationsdomäne aus Pseudomonas Exotoxin A. Bakteriell exprimiertes, gereinigtes und renaturiertes 5-E-AIF!100 zeigte eine hohe Spezifität für ErbB2 exprimierende Tumorzellen. Im Gegensatz zu unfusioniertem AIF!100 induzierte 5-E-AIF!100 nach Mikroinjektion in das Zytoplasma der Zielzellen keine Apoptose. Dies deutet darauf hin, dass möglicherweise die N-terminale Antikörperdomäne die proapoptotische Aktivität der AIF-Domäne blockiert. Erst die rezeptorvermittelte Aufnahme von 5-E-AIF!100 in Anwesenheit von Chloroquin resultierte in einer hohen Zytotoxizität. Auf diesem Weg wird sehr wahrscheinlich durch proteolytische Spaltung der innerhalb der Translokationsdomäne vorhandenen Furin-Schnittstelle der N-terminale Bereich des Fusionsproteins entfernt. Die eigentliche Translokation der AIF-Domäne findet jedoch ohne die Zugabe endosomolytischer Reagenzien nicht statt, was für eine unzureichende Aktivität der Translokationsdomäne spricht. Die vollständige Entfernung der Translokationsdomäne führte dennoch zu einem AIF-Fusionsprotein, das weder in Abwesenheit noch in Gegenwart von Chloroquin zytotoxisch aktiv ist (Dälken, 2005). Somit ist die in der Translokationsdomäne enthaltene Furin- Schnittstelle sehr wahrscheinlich für die Aktivierung von 5-E-AIF!100 von entscheidender Bedeutung. Im Fall des natürlichen Exotoxin A ist zusätzlich zu der in 5-E-AIF!100 verwendeten Translokationsdomäne ein C-terminales ER-Retentionssignal für einen effizienten Übertritt der katalytisch aktiven Toxindomäne ins Zytoplasma notwendig (Jackson et al., 1999). Das Anfügen eines KDEL-Signals an den C-Terminus von 5-E-AIF!100 führte jedoch nicht zur Erhöhung der „endosome escape“ Aktivität der Translokationsdomäne. Die ladungsabhängige DNA-Bindungsaktivität von AIF ist für die proapoptotische Funktion des Proteins essentiell. Bindung an DNA wurde auch für 5-E-AIF!100 nachgewiesen, und konnte durch Vorinkubation mit negativ geladenem Heparin inhibiert werden. Die Komplexierung mit Heparin führte zu einer erheblichen Reduktion der zytotoxischen Aktivität von 5-E-AIF!100. Mit großer Wahrscheinlichkeit ist die Abschwächung der Zytotoxizität auf die intrazelluläre Inhibition der AIF/DNA-Interaktion zurückzuführen. Dies bestätigt, dass diese Wechselwirkung für die zelltodinduzierende Eigenschaft von 5-E-AIF!100 von Bedeutung ist. Die Freisetzung Immuntoxin-ähnlicher Proteine, die sich nach rezeptorvermittelter Aufnahme in endosomalen Kompartimenten finden, erfordert häufig die Zugabe endosomolytischer Reagenzien. Um eine von endosomolytischen Reagenzien unabhängige Zytotoxizität der Antikörperfusionsproteine zu erreichen, wurden in dieser Arbeit Möglichkeiten zur Umgehung dieser Abhängigkeit untersucht. Hierzu wurde die Natürliche Killerzelllinie NK-92 eingesetzt. Die Eliminierung von infizierten und transformierten Zellen durch NK-Zellen geschieht hauptsächlich über die Ausschüttung von zytotoxischen Granula, die das porenbildende Protein Perforin und verschiedene Serinproteasen wie Granzym B (GrB) enthalten (Atkinson et al., 1990; Smyth et al., 2001). Dabei ist Perforin für die zytosolische Translokation der Proteasen verantwortlich (Browne et al., 1999). Anhand des Modellproteins Granzym B-scFv(FRP5) (GrB-5) wurde untersucht, ob Antikörperfusionsproteine mit Hilfe von Perforin in das Zytoplasma der Zielzellen gelangen können. GrB-5 wurde in NK-92 Zellen unter Beibehaltung der Spezifität und enzymatischen Aktivität exprimiert. GrB-5 ist wie Wildtyp GrB in zytotoxischen Granula lokalisiert und wird nach der Degranulation sehr wahrscheinlich zusammen mit Perforin sekretiert. Freigesetztes GrB-5 zeigte Bindung an ErbB2 exprimierende Zellen. Zudem wiesen Überstände von aktivierten NK-92 Zellen, die GrB-5 und Perforin enthielten, im Vergleich zu Überständen von Kontrollzellen eine höhere Zytotoxizität gegenüber ErbB2-positiven Tumorzellen auf. Dies lässt darauf schließen, dass GrB-5 in Abwesenheit exogener endosomolytischer Reagenzien durch einen Perforin-vermittelten Mechanismus in die Zielzellen gelangen konnte. Weiterhin wurden NK-92 Zellen generiert, die den GrB-Inhibitor Protease Inhibitor-9 (PI-9) exprimieren. Diese Zellen zeigten im Vergleich zu parentalen Zellen eine höhere Zytotoxizität, die sich auf eine verbesserte Inaktivierung fehlgeleiteter, zytoplasmatischer GrB-Moleküle durch das ektopisch exprimierte PI-9 zurückführen lässt. NK-92-PI-9 Zellen könnten genutzt werden, um größere Mengen von GrB-Fusionsproteinen zu exprimieren, ohne dabei die Zellen durch die Erhöhung der zytoplasmatischen GrB-Konzentration zu gefährden. Die in dieser Arbeit gewonnenen Ergebnisse zeigen, dass AIF für den Einsatz als Effektorfunktion in Immuntoxin-ähnlichen Fusionsproteinen geeignet ist. Die Anwendung von NK-Zellen zur Expression und Sekretion tumorspezifischer Antikörperfusionsproteinen zusammen mit Perforin zeigt einen möglichen Lösungsweg für das generelle Aufnahmeproblem von Immuntoxin-ähnlichen Proteinen. Die erzielten Ergebnisse können nun für die weitere Optimierung humanisierter Antikörperfusionsproteine genutzt werden.
Das Leben aller Organismen wird grundlegend durch den tages- und jahreszeitlich bedingten Wechsel der Beleuchtungsverhältnisse geprägt. Die Anpassung der Stoffwechselprozesse und Verhaltensweisen an diese Oszillationen erfolgt nicht passiv, sondern wird durch eine innere Uhr gesteuert. Tageszeitliche Rhythmen, die auch ohne den Einfluss äußerer, periodisch verlaufender Umgebungsreize (Zeitgeber) ablaufen, werden als zirkadiane Rhythmen bezeichnet. Im Säugetier steuert ein endogener Rhythmusgenerator im Nucleus suprachiasmaticus (SCN) zirkadiane Rhythmen, indem er periphere Oszillatoren miteinander synchronisiert. Auf molekularer Ebene besteht dieser endogener Rhythmusgenerator aus Aktivatoren (BMAL1 und CLOCK/NPAS2) und Inhibitoren (PER1/2 und Cry1/2), die in Rückkopplungsschleifen die Grundlage für die Rhythmogenese steuern. Die Synchronisation dieses molekularen Uhrwerkes an die Umgebungszeit erfolgt durch Licht, das in der Retina wahrgenommen und an das SCN weitergeleitet wird. Die Signaltransduktionskaskaden nach einem Lichtpuls in der frühen und der späten Nacht unterscheiden sich dabei wesentlich: Ein Lichtpuls während der frühen Nacht führt zu einer erhöhten Freisetzung von Ca2+-Ionen über Ryanodin Rezeptoren (RYR), während ein Lichtpuls während der späten Nacht zu einer erhöhten Guanylylcyclase Aktivität führt. Um zu untersuchen, wie der endogene Rhythmusgenerator seinen Lichteingang reguliert, wurde die Licht-vermittelte Phasenverzögerung in BMAL1+/+- (profizienten) und BMAL1-/-- (defizienten) Mäusen untersucht. Die Befunde aus den in-situ Hybridisierungsstudien, RTQ-PCR und immunhistochemischen Untersuchungen dieser Arbeit zeigten, dass in BMAL1-/--Mäusen die Licht-induzierte mPer-Expression während der frühen Nacht selektiv beeinträchtigt ist. Zudem konnte gezeigt werden, dass die mRNA- und Proteinmengen von RYRs in BMAL1-/--Mäusen dramatisch reduziert waren. Ryr1:: und Ryr2::Luciferase-Reportersstudien zeigten darüber hinaus, dass die Ryr-Expression durch CLOCK/BMAL1 aktiviert und durch CRY1inhibiert werden kann. Diese Ergebnisse liefern den ersten Beweis dafür, dass der endogene Rhythmusgenerator des Säugers die Signalübertragung seines eigenen Lichteingangs regulieren kann. Weiterhin wurde in dieser Arbeit die ontogenetische Entwicklung des endogenen Rhythmusgenerators im SCN und in einem Melatonin-abhängigen peripheren Oszillator, der PT, untersucht und miteinander verglichen. Dazu wurden die Uhrengenproteine im fetalen (E18), postnatalen (P2 & P10) und adulten SCN und in der PT von C3H-Mäusen zu vier verschiedenen zirkadianen Zeitpunkten mittels Immunhistochemie untersucht. Die Anzahl immunreaktiver SCN-Zellen gegen alle untersuchten Uhrengenproteine (außer BMAL1) war im Fetus signifikant niedriger, als in der adulten Maus. Auch im SCN neonataler (P2) Mäuse erreichte die Anzahl immunreaktiver Zellen noch nicht das Niveau der adulten Maus. Erst 10 Tage nach der Geburt (P10) zeigen alle Uhrengenproteine im SCN ein adultes Verteilungsmuster. Offenbar reift das Uhrwerk im SCN von Mäusen graduell während der postnatalen Entwicklungsphase. Dabei besteht eine zeitliche Korrelation zwischen der Reifung des endogenen Rhythmusgenerators im SCN und der Ausbildung von inter-suprachiasmatischen und retino-suprachiaamatischen neuronalen Kontakten. Im Gegensatz zum SCN zeigte der Melatonin-abhängigen Oszilllator in der PT bereits im Fetus einen nahezu vollständig ausgeprägten Rhythmus der Uhrengenproteine. Da das fetale Pinealorgan noch nicht zur rhythmischen Melatonin-Synthese fähig ist, liegt es nahe, dass das mütterliche Melatonin die rhythmische Expression der Uhrengene in der fetalen PT reguliert. Wie in vitro Untersuchungen an PER2::LUCIFERASE-Mäusen zeigten, hat das mütterliche Melatonin offenbar auch einen modulierenden Einfluss auf den fetalen SCN. Bei diesen Mäusen konnte im fetalen und postnatalen SCN ein zirkadianer Rhythmus in der PER2-Synthese nachgewiesen werden, der eine relativ lange Periodenlänge aufwies und nach 3 Tagen zum Erliegen kam. Eine Stimulation mit Melatonin führte zu einer deutlichen Verkürzung der Periodenlänge im PER2-Rhythmus. Folglich scheint das mütterliche Melatonin eine wichtige Quelle für Informationen der Umgebungszeit im Fetus zu sein. Um die Uhrengenexpression während der Maus-Ontogenese in vitro auf zellulärer Ebene darzustellen, wurde in dieser Arbeit zudem ein vom murinen Per2-Promoter angetriebenes DsRed- Reportersystem etabliert und der Versuch begonnen, eine darauf basierende transgene Maus zu generieren.
Die vaskuläre NADPH-Oxidase ist eine wichtige Quelle für reaktive Sauerstoff-Spezies (ROS). Viele dieser Daten wurden unter Verwendung des Inhibitors Apocynin (4'-Hydroxy-3' methoxyacetophenon) erhoben, dessen Wirkungsweise jedoch nicht bekannt war. In dieser Arbeit wurde der Mechanismus der Hemmung der vaskulären NADPH-Oxidase näher untersucht, sowie nach weiteren Inhibitoren gesucht. In HEK293-Zellen wurden die NADPH-Oxidase-Isoformen Nox1, Nox2, Nox4, Duox1 oder Duox2 überexprimiert und die von den Zellen produzierten Radikale durch verstärkte Chemilumineszenz gemessen. Hierbei wurde festgestellt, dass Apocynin die Produktion von Superoxidanionen nicht hemmt, aber die Detektion von Wasserstoffperoxid- oder Hydroxylradikalen beeinflusst. Wenn die Radikale durch Xanthin/Xanthin-Oxidase oder nicht-enzymatische Systeme generiert wurden, beeinflusste Apocynin direkt die Peroxid-, aber nicht die Superoxid-Detektion. In Leukozyten ist Apocynin ein Pro-Pharmakon, das durch Myeloperoxidase (MPO) aktiviert werden kann. Dieser Prozess führt zur Bildung eines Apocyninradikals, das zu einem Dimer umgewandelt wird. Allerdings kann man aufgrund der hohen Reaktivität des Radikals nur das Dimer nachweisen. Endothelzellen und glatte Muskelzellen sind nicht in der Lage dieses Dimer zu bilden und können daher Apocynin nicht aktivieren. In Nox-überexprimierenden HEK293-Zellen konnte die Dimer-Bildung gezeigt werden, wenn MPO zugegeben wurde. Apocynin kann ohne MPO-Zugabe nur die NADPH-Oxidase in Leukozyten hemmen und wirkt in vaskulären Zellen als Antioxidans. Tatsächlich wurde in vaskulären glatten Muskelzellen die Aktivierung der redoxsensitiven Kinasen p38-MAP-Kinase, Akt und Erk1/2 durch Wasserstoffperoxid und durch den intrazellulären Radikal-Generator Menadion in Anwesenheit von Apocynin verhindert. Des Weiteren wurde untersucht, ob Cyclooxygenase 2 (COX-2), die eine ähnliche Peroxidase-Domäne wie MPO besitzt, mit Apocynin interagiert. Die COX-2-Aktivität wurde durch Apocynin gehemmt. In COX-2 überexprimierenden HEK293- Zellen wurden die Superoxidanion- sowie die Wasserstoffperoxid-Bildung durch Apocynin völlig gehemmt. Allerdings konnte durch die Peroxidaseaktivität von COX-2 Apocynin nicht aktiviert und somit kein Dimer nachgewiesen werden. Diese Beobachtung unterstützt ferner die unspezifische Natur der Nox-Hemmung durch Apocynin.Intravenös appliziertes Apocynin in Mäusen und Schweinen führte zu einer Aktivierung von Apocynin. In vivo wirkt Apocynin somit als möglicher Nox2-Inhibitor und als Antioxidans. Flavonoide, insbesondere die des Katechol-Typs, in dem der B-Ring monomethyliert ist, haben eine ähnliche Struktur wie Apocynin. Daher wurde in dieser Arbeit auch das Potenzial der Flavonoide Epicatechin, 3'-O-Methyl-Epicatechin, Procyanidin B2 und Isorhamnetin als Inhibitoren der NADPH-Oxidase analysiert. Nox-überexprimierende HEK293-Zellen (Nox1, Nox2 sowie Nox4) wurden mit verschiedenen Flavonoiden inkubiert und die ROS-Bildung mittels verstärkter Chemilumineszenz gemessen. Epicatechin und Procyanidin B2 hemmten die Radikal-Detektion der verschiedenen Nox-Isoformen in allen Detektionssystemen. Isorhamnetin hemmte die Radikal-Detektion durch Nox1 nur leicht, allerdings wurde die Bildung der Radikale durch Nox4 und Nox2 fast komplett blockiert. 3'-O-Methyl-Epicatechin wies die schwächste antioxidative Wirkung auf. Es hemmte zwar die Wasserstoffperoxidbildung, jedoch kaum die Nox1- und Nox2-abhängige Superoxidanion-Bildung. Keine der getesteten Substanzen konnte den „respiratorischen Burst“ in mit Phorbolmyristatacetat stimulierten Leukozyten blockieren. Diese Daten deuten darauf hin, dass Apocynin und Katechine potente Antioxidantien für Wasserstoffperoxid, aber keine spezifischen NADPH-Oxidase- Hemmer in vaskulären Systemen sind.
Central America is one of the world’s most herpetological diverse areas in relation to its size. Nicaragua is the largest country in this region and separates Nuclear from Lower Central America. It is one of the least herpetological explored countries in Central America and few studies dealing with the herpetofauna of a potion or the entire country have been published. I here update the checklist of the Nicaraguan herpetofauna, present taxonomic revisions of some difficult species complexes, compare the similarities of the composition of the herpetofaunal communities in the major forest formations present in the country within a zoogeographical context, and identify those species with a greater vulnerability risk in Nicaragua. Taxonomy The herpetofauna of Nicaragua currently consists of 244 species representing 134 genera and 42 families with 78 amphibian species representing 35 genera and 15 families, and 166 reptile species representing 99 genera and 27 families, which includes six marine species. Sixteen species (12 amphibians and four reptiles) are endemic to the country. Of the 12 endemic amphibian species, three are here described. In addition, five genera (Anotheca, Cerrophidion, Duellmanohyla, Isthmohyla, and Rhinobothryum) and two species (Rhadinea godmani and Urotheca decipiens) are known to occur both north and south of Nicaragua although there are no voucher specimens of these taxa to confirm their presence in country. I complete a bibliographic research updating the nomenclature changes and provide a brief herpetological history of Nicaragua, a recompilation of all species described upon Nicaraguan material and their current synonymy, the first time each species was recorded from the country, and a list of all recognized subspecies occurring in Nicaragua. I discuss the taxonomic uncertainties among the Nicaraguan populations of amphibians and reptiles and take further detailed taxonomic revisions on selected Nicaraguan species groups from the genera Anolis, Bolitoglossa, and Craugastor along their known distributional range. I describe five new species of herpetofauna (three of which are based on Nicaraguan material), redescribe five species of Anolis (three of which occur in Nicaragua), and provide voucher specimens of five other species for the first time in Nicaragua. In detail: • I studied the pholidosis, morphometrics as well as hemipenis and dewlap morphology in Anolis wermuthi, an anole endemic to the highlands of northern Nicaragua. I examine patterns of geographic variation using discriminant function analysis and discuss the characters that vary both individually and among populations. The results indicate that A. wermuthi is a single species with several disjunct, slightly divergent populations. I provide a standardized description, illustrations of the everted hemipenis of an adult topotype, the male and female dewlap, and a distribution map. I also provide brief descriptions of the localities where this species occurs and some ecological notes. • I studied the pholidosis, morphometrics as well as hemipenis morphology in the Central American anole species Anolis humilis, A. quaggulus, and A. uniformis. The three taxa are distinct in hemipenis morphology. However, very little differentiation in pholidotic and morphometric characters is documented. I document interspecific variation in several characters but with overlap of the documented ranges. A discriminant function analysis based on five pholidotic characters yielded a scatter diagram that showed large overlap between the clusters of the three taxa. I provide head scalation illustrations, an identification key, a distribution map, and standardized descriptions of the commonly distributed in Nicaragua A. quaggulus as well as of the other two species. • I describe two new species of anoles (genus Anolis) from Panama formerly referred to as Anolis limifrons. The two new species, Anolis apletophallus and Anolis cryptolimifrons, differ from A. limifrons by having a large bilobed hemipenis (small and unilobed in A. limifrons). The new species differ from each other in male dewlap size and coloration. I provide illustrations of the head scalation, everted hemipenis, and dewlap, an identification key, a distribution map, and standardized descriptions of the commonly distributed in Nicaragua A. limifrons and the two new species described herein. • I describe two new species of salamanders of Bolitoglossa from southern Nicaragua. Bolitoglossa indio is known from Río Indio in the lowlands of the Río San Juan area and Bolitoglossa insularis from the premontane slopes of Volcán Maderas on Ometepe Island. The two new species are of unknown affinities but both differ from their congeners in coloration. Bolitoglossa indio is most similar to B. mexicana and B. odonnelli from which differ by having both broad dorsolateral pale brown stripes not clearly delimited in outline. Bolitoglossa insularis is most similar to B. mombachoensis and B. striatula from which differ by the absence of dark or light defined stripes on dorsum and venter. • I describe a new species of frog of the genus Craugastor from Río San Juan, Nicaragua. The new species, Craugastor chingopetaca, is assigned to the fitzingeri group and differs from most Central American species of that group by the absence of a midgular pale stripe. Within the fitzingeri group it is most similar to C. crassidigitus and C. talamancae from which it differs in several morphological characteristics such as more extensive webbing, retuse disk covers on some digits, and relative toe length. • I provide voucher specimens of Cochranella spinosa, Kinosternon angustipons, Mesaspis moreletii, Cnemidophorus lemniscatus and Adelphicos quadrivirgatum for the first time in Nicaragua. I include descriptions, illustrations, and brief ecological notes for the five new country records. Zoogeography Based on the concept of ecological formations proposed by HOLDRIDGE (1967), nine forest formations are found in Nicaragua. Of the total number of terrestrial species of herpetofauna found in Nicaragua, 131 species (55.0%) occur in Lowland Wet Forest, 21 of which (8.8%) are restricted to this forest formation, 168 species (70.6%) occur in Lowland Moist Forest, 15 of which (6.3%) are restricted to this forest formation, 84 species (35.3%) occur in Lowland Dry Forest, four of which (1.7%) are restricted to this forest formation, 47 species (19.7%) occur in Lowland Arid Forest, with no species restricted to this forest formation, 59 species (24.8%) occur in Premontane Wet Forest, three of which (1.3%) are restricted to this forest formation, 116 species (48.7%) occur in Premontane Moist Forest, 10 of which (4.2%) are restricted to this forest formation, 51 (21.4%) species occur in Premontane Dry Forest, with no species restricted to this forest formation, 13 species (5.5%) occur in Lower Montane Wet Forest, two of which (0.8%) are restricted to this forest formation, and 50 species (21.0%) occur Lower Montane Moist Forest, seven of which (2.9%) are restricted to this forest formation. The Coefficient of Biogeographic Resemblance algorithm show a distinct composition of the herpetofauna from the isolated highlands of northeastern Nicaragua, which is characterized by a high proportion of endemic species. Two other clusters are evident when analyzing the herpetofaunal similarities among Nicaragua, the Pacific versant and the central mountains and the Atlantic lowlands. In addition, the Pacific lowlands are characterized by a relatively homogeneous composition of the herpetofauna. In contrast, many species have their northern limit of distribution in the Atlantic lowlands with the ranges of most of these species ending in southern Nicaragua. The central mountains constitute the southern limit of distribution of several highland species. In general, there is a greater contribution of reptile than amphibian species to the total herpetofauna present in each forest formation. This unbalance is slightly higher in the dry than in the moist parts of the country. The similarities in the composition of the reptiles between the different forests formations seem to be relatively distinct on an elevation factor, whereas in amphibians similarities might be better explained in correlation with humidity. The total amount of amphibian and reptile species in Nicaragua has a Middle American Element dominance and varies between amphibians and reptiles, with and a greater South American Element influence in anurans and a greater Old Northern Element influence in reptiles. In general, there is a greater percentage of species with a South American Element in extreme southeastern Nicaragua with a decreasing tendency towards northern Nicaragua. Taking in account the geography and geologic history of Nicaragua as well as the known Central American dispersal routes, I identify species of probable occurrence in Nicaragua as well as those places with a greater potential to hold undescribed endemic species. Conservation In Nicaragua, no amphibian or reptile populations are entirely free from anthropogenic impact. I determine the endangerment level of all Nicaraguan amphibian and reptile species using the IUCN categorizations and the Environmental Vulnerability Scores. Seventy-six species (31.9%) of Nicaraguan amphibians and terrestrial reptiles have high vulnerability, 118 (49.6%) medium vulnerability, and 44 (18.5%) low vulnerability. Eighteen species (7.4% of the total herpetofauna) are unknown from protected areas, including 13 high vulnerability species (three are endemic), four medium vulnerability species, and one low vulnerability species. To preserve the future of Nicaragua’s amphibians and reptiles, every species should reside in at least one protected area, the protected areas must be guarded, and monitoring programs are needed to detect changes in amphibian and reptile populations, prioritizing highly vulnerable species.
The reggie protein family consists of two homologous members, reggie-1 and reggie-2, also termed flotillin-2 and flotillin-1, respectively, that are ubiquitously expressed and evolutionarily well conserved, suggesting an important but so far ill-defined function. In various cell types, both reggies have been found to be constitutively associated with lipid rafts by means of acylation modifications and oligomerization. Lipid rafts are glycosphingolipid- and cholesterol-rich membrane microdomains which have been implicated in several cellular processes including membrane transport and signal transduction through growth factor receptors. However, the molecular details of these processes are still poorly understood. With the observation that reggies colocalize with activated glycosylphosphatidylinositolanchored proteins (GPI-APs) and Fyn kinase in rafts, a role for these proteins in signaling events has been suggested. In agreement with that, we have previously shown that reggie-1 becomes multiply tyrosine phosphorylated by Src kinases in response to epidermal growth factor (EGF) stimulation, pointing to a function for reggie-1 in growth factor signaling. Furthermore, overexpression of reggie-1 enhances spreading on fibronectin substrate in a tyrosine-dependent manner, thus revealing a role for reggie-1 in regulation of actin cytoskeleton through growth factor receptors. Due to the similarity shared by reggie proteins at amino acid level and to their ability to form hetero-oligomeric complexes, the first aim of this study was to analyze the putative tyrosine phosphorylation of reggie-2 in growth factor stimulated cells. Similarly to reggie-1, reggie-2 was found to be multiply tyrosine phosphorylated by Src kinase and to exist in a molecular complex with Src, with the degree of co-immunoprecipitation dependent on the activity of Src. Recent studies from us have also shown that administration of EGF results in the endocytosis of reggie-1 from the plasma membrane into endosomes, which is in line with a proposed role for reggies in membrane trafficking processes. In order to characterize in detail the endocytic mechanism that mediates the uptake of reggie-1, the dependency of reggie-1 endocytosis on clathrin and dynamin was investigated by means of overexpressing a variant form of Eps15 or a dominant negative form of dynamin-2. In either case the translocation of reggie-1 into endosomes in response to EGF was not affected, and this, together with the results that reggie-1 colocalized with cholera toxin (CTX) but not with transferrin receptor (TfnR) during EGF signaling, indicates that reggie-1 is taken up by means of a dynaminindependent, raft-mediated pathway. These findings are very well in line with recent data showing the pathway of entry into cells of reggie-2 as a raft-mediated endocytic pathway. The endocytosis of reggie-2 in response to EGF was also analyzed in this study. Similarly to reggie-1, in growth factor stimulated cells reggie-2 underwent a translocation from the plasma membrane to endosomes where the two reggies were found to colocalize with each other, suggesting that epidermal growth factor signaling might trigger the endocytosis of reggie oligomers. In addition, colocalization with both the late endosomal marker LAMP3/CD63 and epidermal growth factor receptor (EGFR) was detected, again indicating a function for reggies in signal transduction through growth factor receptors. EGFR has been reported to localize in rafts but, although this association is thought to be functional during EGF stimulation, how segregation of EGFR into rafts modulates its endocytosis and signaling is still under debate. Since reggie oligomers have recently been suggested to define a raft subtype, a further aim of this study was to investigate whether the depletion of reggies by means of small interfering RNA could interfere with the signaling and the trafficking through EGFR. Knockdown of reggie-2 resulted in an altered tyrosine phosphorylation of EGFR in response to EGF, while the degree of ubiquitination was not affected. Less efficient phosphorylation of tyrosine residues, especially of those which are docking sites for Grb2 and Shc, led in turn to an impaired activation of p38 and ERK1/2 MAPKs. Depletion of reggie-2 did not affect the early trafficking of activated EGFRs, with receptors being endocytosed and delivered to late endosomes as efficiently as in control cells. This would be in line with the normal degree of ubiquitination observed for EGFR, as ubiquitin moieties have been proposed to represent sorting tags that ensure receptor endocytosis into early endosomes and its proper intracellular trafficking. On the contrary, after prolonged EGF stimulation, depletion of reggie-2 resulted in a decreased downregulation of both receptor-bound ligand and EGFR, and in their accumulation in intracellular vesicles, thus pointing to a role for reggie-2 in the degradative pathway. Taken all together, these data ndicate that the association of EGFR with reggie-microdomains is likely to be important for proper receptor trafficking and signaling.
Background Multidirectional interactions in social (or communication) networks can have a profound effect on mate choice behavior. For example, Poecilia mexicana males show weaker expression of mating preferences when being observed by an audience male. It was suggested that this behavior is an adaptation to reduce sperm competition risk, which arises because commonly preferred female phenotypes will receive attention also by surrounding males, and/or because the audience male can copy the focal male's mate choice. Do P. mexicana males indeed respond to perceived sperm competition risk? We gave males a choice between two females and repeated the tests under one of the following conditions: (1) during the 2nd part of the tests an empty transparent cylinder was presented (control); (2) an audience male inside the cylinder observed the focal male throughout the 2nd part, or (3) the audience male was presented only before the tests, but could not eavesdrop during the actual choice tests (non-specific sperm competition risk treatments); (4) the focal male could see a rival male sexually interacting with the previously preferred, or (5) with the non-preferred female before the 2nd part of the tests (specific sperm competition risk treatments). Results When comparing the strength of individual male preferences between the 1st and 2nd part of the tests (before and after presentation of an audience), male preferences declined slightly also during the control treatment (1). However, the decrease in strength of male preferences was more than two-fold stronger in audience treatment (2), i.e., with non-specific sperm competition risk including the possibility for visual eavesdropping by the audience male. No audience effect was found in treatments (3) and (5), but a weak effect was also seen when the focal male had seen the previously preferred female sexually interact with a rival male (treatment 4; specific sperm competition risk). Conclusions When comparing the two 'non-specific sperm competition risk' treatments (2 and 3), a very strong effect was found only when the audience male could actually observe the focal male during mate choice in treatment (2). This suggests that focal males indeed attempt to conceal their mating preferences in the visual presence of other males so as to avoid mate choice copying. When there is no potential for eavesdropping [treatment (3)], non-specific specific sperm competition risk seems to play a minor or no role. Congruent with studies on other poeciliid species, our results also show that P. mexicana males respond to perceived specific sperm competition risk, and tend to share their mating effort more equally among females when the resource value of their previously preferred mate decreases (after mating with a rival male). However, this effect is comparatively weak.