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mRNA-Abbau ist ein essentieller Prozess der Genexpression, der den Zellen ermöglicht, die Qualität und die Quantität der mRNA zu kontrollieren. Besonders unter Stressbedingungen könnte der mRNA-Abbau eine bedeutende Rolle neben der Speicherung von mRNAs sowie der Regulation der Proteinhomöostase zum Schutz vor schädigenden Einflüssen spielen. Studien mit Hefen und Säugerzellen zeigten, dass dem 5'-3'mRNA-Abbau ein wichtige Rolle sowohl unter normalen Bedingungen als auch unter Stressbedingungen zukommt und dieser in zytoplasmatischen Processing bodies (P-bodies) stattfindet. Im Rahmen dieser Arbeit sollten Erkenntnisse über den 5'-3'mRNA-Abbau erhalten werden. Im Vordergrund stand die Frage nach der Existenz von P-bodies in Arabidopsis thaliana und die Identifikation und Charakterisierung deren Komponenten. Weiterhin sollten Erkenntnisse über die Rolle der P-bodies unter Stressbedingungen gewonnen werden. Dabei sollten besonders Informationen über die Beziehungen zwischen den P-bodies und RNA Stressgranula (mRNA Speicherkompartimente) und Hitzestressgranula (Regulation der Proteinhomöostase) erhalten werden. Das komplette sequenzierte Genom von Arabidopsis thaliana eignete sich zur Identifikation von mRNA-Abbauproteine kodierender Gene. Unter Verwendung von Aminosäuresequenzen bereits bekannter mRNA-Abbauproteine aus Hefe und Säugerzellen konnten Homologe für die Decappingproteine Dcp1 und Dcp2 sowie für die Proteine LSm1,2,5,8 als Untereinheiten des LSm1-7 Komplexes, welcher an der Regulation der Decappingreaktion beteiligt ist, identifiziert werden. Über Hefe-Zwei-Hybrid Analysen konnten anschließend Protein-Protein-Interaktionen zwischen den untersuchten Proteinen identifiziert werden. Weiterhin konnte unter Einsatz der BIFC-Analyse gezeigt werden, dass die Interaktionen zwischen den untersuchten Proteinen hauptsächlich in zytoplasmatischen Strukturen stattfanden. Aufbauend auf diesen Befunden wurde ein Antikörper gegen Dcp1 als Marker für die zytoplasmatischen Strukturen erstellt. Dieser ermöglichte erstmals die Detektion der endogenen Strukturen in Arabidopsis thaliana. Die weitere Charakterisierung über Immunofluoreszenzanalysen zeigten, dass diese P-bodies sind. Wie die P-bodies anderer Organismen sind sie hochdynamisch und benötigen untranslatierte mRNA für die Assemblierung. Die Größe und Anzahl der P-bodies hängt dabei vom Verhältniss des Zuflusses von mRNA und der mRNA-Abbaurate ab. Weiterhin konnte beobachtet werden, das die P-bodies besonders groß unter Stressbedingungen sind und deuten eine wichtige Funktion des mRNA-Abbaus unter Stress an. Dies führte zu der Frage nach der Beziehung der P-bodies zu RNA Stressgranula, die der Speicherung von mRNA unter Stressbedingungen dienen, sowie zu Hitzestressgranula, die an der Aufrechterhaltung der Proteinhomöostase beteiligt sind. Durch Kolokalisationsanalysen mit Markern der RNA Stressgranula, der Hitzestressgranula und der P-bodies konnte erstmals gezeigt werden, dass es sich um voneinander unabhängige Mikrokompartimente handelt, und dass unter Stressbedingungen die zellulären Prozesse mRNA-Abbau, mRNA-Speicherung und Aufrechterhaltung der Proteinhomöostase auf einzelne Mikrkompartimente beschränkt sind. Allerdings konnte zwischen P-bodies und RNA Stressgranula häufig eine räumliche Nähe beobachtet werden. Dies deutet auf einen Austausch von Komponenten zwischen diesen Strukturen hin. Zusammen zeigen die erhaltenen Ergebnisse, dass die identifizierten Proteine Komponenten des 5'-3'mRNA-Abbaus darstellen, und dass der 5'-3'mRNA-Abbau in Pflanzen auch in P-bodies stattfindet. Die Identifizierung und Charakterisierung der pflanzlichen P-bodies bildet eine Grundlage für zukünftige Untersuchungen. Vor allem die massive Bildung von P-bodies unter Stressbedingungen und die Interaktion der P-bodies mit RNA Stressgranula zeigen neue Aspekte der pflanzlichen Hitzestressantwort auf.
Weiterentwicklung und Evaluation eines drei-dimensionalen Hautmodelles zur pharmakologischen Testung
(2008)
The moderate halophile Halobacillus halophilus is the paradigm for chloride dependent growth in prokaryotes. Recent experiments shed light on the molecular basis of the chloride dependence that is reviewed here. In the presence of moderate salinities Halobacillus halophilus mainly accumulates glutamine and glutamate to adjust turgor. The transcription of glnA2 (encoding a glutamine synthetase) as well as the glutamine synthetase activity were identified as chloride dependent steps. Halobacillus halophilus switches its osmolyte strategy and produces proline as the main compatible solute at high salinities. Furthermore, Halobacillus halophilus also shifts its osmolyte strategy at the transition from the exponential to the stationary phase where proline is exchanged by ectoine. Glutamate was found as a second messenger" essential for proline production. This observation leads to a new model of sensing salinity by sensing the physico-chemical properties of different anions.
Die Grewioideae sind eine Unterfamilie der Malvaceae sensu Bayer et al. (1999). Sie umfassen mit 25 Gattungen und ca. 700 Arten einen Großteil der früheren Tiliaceae. Diese waren vor allem aufgrund der durchweg dithecischen Antheren und der oft zahlreichen, freien Stamina zu einer Familie zusammengefasst worden, auch wenn die enge Verwandtschaft mit den Sterculiaceae, Bombacaceae und Malvaceae bekannt war und die Abgrenzung dieser Familien untereinander oft als künstlich angesehen wurde. ... Insgesamt 45 Arten aus allen 25 Gattungen der Malvaceae-Grewioideae (sensu Bayer & Kubitzki 2003) wurden hinsichtlich ihrer Morphologie im Blüten-, Frucht- und vegetativen Bereich untersucht. Der Schwerpunkt lag dabei auf einer vergleichenden Bearbeitung der Blütenstruktur, für die neben morphologischen auch ontogenetische und anatomische Untersuchungen durchgeführt wurden. Die Ergebnisse waren Grundlage für eine Datenmatrix mit 55 Merkmalen, die ebenso wie DNA-Sequenzdaten (ndhF) für phylogenetische Analysen verwendet wurden. Die Analysen beider Datensätze ergeben eine Zweiteilung der Grewioideae. Auf der Basis der Ergebnisse wird vorgeschlagen, die Grewioideae in die zwei Triben Apeibeae und Grewieae zu unterteilen. Diese Gliederung widerspricht früheren Klassifikationen, ist aber durch strukturelle Merkmale gut gestützt. Die Apeibeae zeichnen sich durch hornförmige Verlängerungen der Sepalen-Spitze und stachelige Emergenzen auf der Fruchtoberfläche aus, Reduktionsformen sind durch Übergänge nachweisbar (Ausnahme: Glyphaea). Leitbündelstränge innerhalb der Fruchtwand verlaufen einzeln. Bestäubungsbiologisch relevante Nektarien, soweit vorhanden, befinden sich vor den Petalen auf einem Androgynophor. Das Androeceum entwickelt sich zentrifugal in einer unterschiedlichen Zahl einheitlicher Kreise. Den Grewieae fehlen Fortsätze der Sepalen-Spitzen sowie stachelige Emergenzen der Früchte. Sie sind durch Nektarien auf den Petalen charakterisiert (Ausnahme: Mollia). Ihre Fruchtwand weist einen geschlossenen Leitbündelmantel auf. Steinkerne oder dorsal geflügelte Fruchtfächer kommen vor. Das Androeceum entwickelt sich oft ungleichmäßig mit einer Förderung des antesepalen Sektors, bisweilen ausgehend von Komplexprimordien. Innerhalb der Triben lassen sich teils neue, teils früher schon bekannte Gruppen erkennen; andere sind anhand der vorliegenden Daten nicht aufzulösen. Dies gilt insbesondere für die Verwandtschaft von Grewia, bei der die Gattungsgrenzen einer kritischen Revision bedürfen. Die Kartierung der morphologischen Merkmale auf den Konsensusbaum der DNA-Sequenzdaten ergab, dass insbesondere der Androgynophor innerhalb der Grewioideae mehrfach parallel entstanden ist und im Gegensatz zu früheren Klassifikationen nicht als Tribus-Merkmal herangezogen werden kann. Auf der Suche nach einem gemeinsamen Bauplan, der den stark unterschiedlichen Blütenstrukturen der Schwestergruppen Grewioideae und Byttnerioideae zugrunde liegen könnte, wurde insbesondere das Androeceum vergleichend untersucht. Bei beiden Unterfamilien findet man polystemone Androeceen, die bei den Byttnerioideae in staminodiale antesepale und fertile antepetale Sektoren differenziert sind. Dies wird in der Literatur oft als obdiplostemones Arrangement zweier Kreise interpretiert, von denen der fertile antepetale Teil dédoubliert. Bei den Grewioideae findet man keine derartige Differenzierung; sie sind in ihrer androecealen Struktur außerordentlich variabel. Die Befunde der Morphologie, Ontogenie und Anatomie widersprechen sich dabei jeweils dergestalt, dass eine theoretische Gliederung des polystemonen Androeceums in zwei Kreise kaum zu rechtfertigen ist. In diesem Zusammenhang wird die in der Literatur verbreitete Vorstellung einer sekundären Polyandrie kritisch beleuchtet. Für die untersuchte Gruppe wird ein Zusammenhang zwischen Bestäubungsbiologie und Blütenstruktur als nahe liegender angesehen, der zu unterschiedlichen Gruppenbildungen innerhalb polystemoner Androeceen führen kann. Während Petalen und Stamina bei den oft fliegenblütigen Byttnerioideae eine spezielle Funktionseinheit bilden, findet man bei den größtenteils bienenblütigen Grewioideae in Zusammenhang mit den Petalen oft Nektar. Die fertilen Stamina können den gesamten antesepalen und antepetalen Raum einnehmen. So stand an der Basis der Grewioideae möglicherweise der Wechsel der Bestäubergruppe und die Auflösung eines blütenbiologisch fixierten Musters, ein Vorgang, wie er innerhalb der Malvaceae mehrfach auf unterschiedliche Weise erfolgt sein könnte. Auch andere Gruppen weisen Blütenstrukturen mit vorwiegend freien Stamina und verborgenem Nektar in Zusammenhang mit Bienenbestäubung auf. Es mag diese blütenbiologisch bedingte Ähnlichkeit gewesen sein, die zur Vereinigung nicht näher verwandter Gruppen zur früheren Familie Tiliaceae geführt hat.
Im Vergleich zu der Vielzahl von Einzeluntersuchungen liegen nur für wenige Insektenarten (z.B. Manduca sexta: SHIELDS & HILDEBRANDT 1999 a, b; Drosophila: SHANBHAG et al. 1999, 2000) detaillierte Befunde zur Feinstruktur, Zahl und Topographie antennaler Sensillen vor. Die jetzt an Liris niger gewonnenen Daten bilden, zusammen mit solchen früherer Untersuchungen (GNATZY 1996, 2001; ANTON & GNATZY 1998; GNATZY & FERBER 1999) die Basis für derzeit laufende immuncytochemische und elektrophysiologische Arbeiten insbesondere am olfaktorischen System dieser solitären Grabwespenart. Dabei gilt unser Interesse dem ausgeprägten Sexualdimorphismus im antennalen Sensilleninventar, wie er im Verlauf dieser Untersuchungen nachgewiesen werden konnte.
Anti-T-Lymphozyten-Globuline (ATG) sind Immunglobuline zur Anwendung am Menschen. Sie werden aus den Seren von Kaninchen oder Pferden gewonnen, die zuvor mit humanen Thymozyten oder einer etablierten humanen T-Zell-Linie immunisiert wurden. ATG besitzen ein sehr starkes immunsuppressives Potenzial. In der klinischen Anwendung werden sie überwiegend bei Organtransplantationen, Knochenmarktransplantationen und zur Behandlung einzelner Autoimmunerkrankungen, wie z. B. der aplastischen Anämie, eingesetzt. Wissenschaftliches Ziel der Arbeit war, einen umfangreichen Beitrag zur immunologischen Charakterisierung und Spezifizierung unterschiedlicher ATG-Präparate zu erbringen. Dies ist eine wesentliche Voraussetzung für die Entwicklung und Validierung experimenteller Methoden, sodass die bisher verwendeten Praktiken der Wirksamkeitsprüfung von ATG entsprechend dem Stand der Wissenschaft abgelöst und der Tierversuch (Affenhaut-Transplantationstest; Balner H et al., 1968) ersetzt werden können. Darüber hinaus wurde in diesem Zusammenhang der Entwurf einer Arzneibuch-Monografie für ATG vorgelegt. Der immunsuppressive Wirkmechanismus von ATG ist selbst nach 40 Jahren klinischer Erfahrung nicht eindeutig geklärt. Ihre Wirksamkeit vermitteln sie über ihre spezifische Bindung an Lymphozyten, woraus sich modellhaft vier Effekte unterscheiden lassen: Die Reihe der Fc-abhängigen zytotoxischen Mechanismen, eine von ATG ausgelöste Aktivierung, eine über Todesrezeptoren (z.B. Fas/Apo-1) von ATG direkt induzierte Apoptose sowie die Maskierung von Rezeptoren. Die zytotoxische Wirkung von ATG und die Induktion des programmierten Zelltodes (Apoptose) wurde am Durchflusszytometer (FACS) nach Färbung der toten Zellen bzw. durch den Nachweis von DNA-Fragmentierung analysiert. Der Einfluss von ATG auf die Lymphozyten-Aktivierung in vitro sowie auf die gemischte Lymphozyten-Reaktion (mixed lymphocyte reaction, MLR) wurde durch Messung der Lymphozyten-Proliferation anhand des Einbaus von radioaktiv markiertem Thymidin bestimmt. Biochemisch wurden die in ATG enthaltenen anti-Lymphozyten-Antikörper durch den sog. Kinase-Assay charakterisiert. In einer nicht radioaktiven Methode wurden Zelloberflächenmoleküle zunächst biotinyliert. Nach Lyse der Zellen wurden die Proteine mit ATG präzipitiert, gelelektrophoretisch aufgetrennt sowie mittels Streptavidin und Chemilumineszenz im Westernblot nachgewiesen. Für das Verständnis der klinischen Wirksamkeit von ATG ist die Aufklärung der molekularen Mechanismen der komplement-unabhängigen, zytotoxischen Wirkung von erheblicher Bedeutung, da die enorme zytolytische, aber auch die breite immunsuppressive Wirkung von ATG nicht allein durch die Fc-abhängige Zytotoxizität erklärt werden kann. ATG können bei bestimmten Zielzellen Fas-abhängige Apoptose auslösen; darüber hinaus sind ATG aber auch in der Lage, einen komplement-unabhängigen Zelltod in Fas-resistenten Zell-Linien und T-Zell-Klonen, die resistent gegenüber aktivierungsinduziertem Zelltod (AICD) sind, auszulösen. In Kompetitionsversuchen konnte gezeigt werden, dass ATG entsprechende Antikörper-Spezifitäten gegen das Molekül CD95 (Fas/Apo-1) enthalten. Ferner konnten wir nachweisen, dass die durch ATG initiierte Fas-abhängige Apoptose und/oder der AICD durch Fas-neutralisierende Antikörper inhibiert werden können, was auch von anderen Arbeitsgruppen gezeigt wurde (Genestier L et al., 1998). Die DNA-Fragmentierung, als Nachweis von Apoptose, lässt sich nach der ATG-Inkubation von Fas-sensitiven Zielzellen durch Inhibitoren der Caspase-1 (Z-VAD-FMK) komplett sowie durch Inhibitoren der Caspase-3 (Ac-DMQD-CHO) und -6 (Ac-VEID-CHO) teilweise inhibieren. Die zytotoxische Wirkung von ATG lässt sich jedoch nicht in gleichem Maße durch Inhibitoren der Caspase-1 reduzieren, wie bei einem Apoptose induzierenden mAk gegen Fas. Es wird deutlich, dass ATG eine breit gefächerte zytotoxische Wirkung auf verschiedene Zellpopulationen ausüben, die alle mehr oder weniger eine Rolle in der klinischen Wirksamkeit von ATG spielen können. ATG sind in der Lage, periphere blutmononukleäre Zellen (PBMC) zu aktivieren, wobei der Proliferationsindex in etwa dem eines Standardmitogens, wie z. B. Phytohämagglutinin (PHA), entspricht. Isolierte T-Lymphozyten werden ebenfalls aktiviert, zeigen jedoch eine geringere Proliferationsrate. In PHA-Blasten lassen sich schwache Veränderungen im Muster der Protein-Tyrosin-Phosphorylierung erkennen, wobei eine gewisse Ähnlichkeit im Bandenmuster sowie in der Intensität zwischen der Stimulation mit ATG und dem anti-CD2 mAk zu erkennen ist. Im Unterschied zu publizierten Studien konnte in dieser Arbeit kein spezifisch hemmender Effekt der ATG auf die MLR nachgewiesen werden. Aus den Untersuchungen zur Charakterisierung der ATG hat sich der komplement-abhängige Zytotoxizitätstest, gemessen am Durchflusszytometer, als die Methode herausgestellt, die, bezogen auf den Wirkmechanismus der ATG und im Hinblick auf eine Routineanwendung in der Chargenprüfung, am besten geeignet ist. Eine Evaluierung der Methode wurde im Rahmen eines Ringversuches, an dem sich sieben verschiedene Labore beteiligten, durchgeführt. Die mittlerweile gültige Arzneibuch-Monografie für ATG (Ph. Eur.: 1928) sieht diese in vitro Methode zur Wirksamkeitsprüfung von ATG vor, womit die Voraussetzungen zur Abschaffung des Affenhaut-Transplantationstests geschaffen wurden. Neben einer zellulären Charakterisierung der ATG konnte gezeigt werden, dass sich insbesondere biochemische Methoden, wie z. B. der Kinase-assay oder die Biotinylierung von Zelloberflächenmolekülen, sehr gut zur Identitätsprüfung von ATG eignen. Mit beiden Methoden ließen sich produktspezifische Bande nachweisen. Im Rahmen der Entwicklung von ATG sind diese Methoden geeignet, die Konsistenz der Chargenproduktion zu überprüfen, sodass auch hier Alternativen zum Tierversuch vorhanden sind.
Identifizierung und Charakterisierung von Liganden für Faktor VIII neutralisierende Antikörper
(2008)
Das Fehlen von funktionellem Blutgerinnungsfaktor VIII (FVIII) in Hämophilie A- (HA-) Patienten wird durch Substitution mit FVIII-Präparaten therapiert. Die wesentlichste gegenwärtige Komplikation der FVIII-Ersatz-Therapie besteht in dem Auftreten von FVIII neutralisierenden Antikörpern (Inhibitoren) gegenüber exogenem FVIII. Diese können mittels verschiedener, kostenintensiver Therapien zur Induktion einer Immuntoleranz (ITI) mit unterschiedlichem Erfolg eliminiert werden. Für Patienten mit persistierenden Inhibitoren bedeuten diese nicht nur eine drastische Verminderung der Lebensqualität sondern ein lebensbedrohliches Szenario. Eine Liganden-vermittelte Blockierung von neutralisierenden anti-FVIII Antikörpern sowie die zielgerichtete Ansteuerung des Rezeptors FVIII-spezifischer Gedächtnis-B-Zellen stellen mögliche Ansätze zur Verwirklichung antigenspezifischer ITI-Strategien für eine dauerhafte, vollständige Eliminierung von FVIII-Inhibitoren dar. Zu diesem Zweck wurden in dieser Arbeit durch Screening von phagenpräsentierten, randomisierten Peptidbibliotheken mit Inhibitor-positiven Patientenplasmen Peptidliganden selektioniert. Diese wiesen eine spezifische Bindung von anti-FVIII Antikörpern in den verwendten Plasmen auf. Durch den Einsatz entsprechender Software konnten AS-Konsensusmotive der Peptidsequenzen möglichen, konformationellen, funktionellen Inhibitorepitopen in der A2- sowie C2-Domäne von FVIII zugeordnet werden. Die von in silico-Analysen vorgegebene Domänenspezifität der anti-FVIII Antikörper wurde in Bindungsstudien mit rekombinant exprimierten FVIII-Domänen verfiziert. Die korrespondierenden, synthetischen Peptidliganden blockierten die IgG-Bindung an FVIII und regenerierten partiell dessen Aktivität im Plasma. Die Peptide stellten funktionelle Mimotope der möglichen Inhibitorepitope in der A2- und C2-Domäne dar. Da FVIII neutralisierende Antikörper zumeist Epitope in beiden Domänen erkennen, wurden die Mimotope kombiniert, was in einer noch effektiveren Blockierung von FVIII-Inhibitoren resultierte. Weiterhin wiesen Mimotopkombinationen Kreuzreaktivität mit anti-FVIII IgG in heterologen Patientenplasmen auf. Durch Fusion der Peptide an die Multimerisierungsdomäne der alpha-Kette des humanen C4-Bindeproteins konnten in Zellkultur heptamere Proteine generiert werden. Gegenüber den synthetischen Peptiden wiesen die Multimere aufgrund ihrer Multivalenz sowie der strukturellen Integrität eine deutlich verbesserte Blockierung von anti-FVIII IgG auf. Das Multimerisierungskonzept erlaubte ferner die Kombination unterschiedlicher Peptidliganden in einem Heteromultimer, was anhand der selektierten, funktionellen Mimotope für mögliche A2- und C2-Epitope getestet wurde. Weiterhin zeichneten sich die Inhibitor-spezifischen Multimere gegenüber den synthetischen Peptiden durch deutlich verlängerte Halbwerstzeiten aus. In Präparationen peripherer mononuklearer Zellen (PBMCs) von Patienten färbten synthetische Peptide sowie Fluoreszenz-markierter FVIII B-Zellsubpopulationen mit einem Gedächntis-B-Zell Phänotyp (CD19+IgG+). Gedächtnis-B-Zellen in PBMCs wurden polyklonal stimuliert. Im ELISPOT-Verfahren konnten Tetanusspezifische, jedoch keine FVIII-spezifischen Zellen, detektiert werden. Im Gegensatz zu den verwandten Kontrollen bewirkte eine Präinkubation der Zellen mit dem Peptid 12C6, welches an das toxische D-AS-Peptid (KLAKLAK)2 gekoppelt war, allerdings eine Reduktion von anti-FVIII IgG in den Überständen stimulierter Zellen.
Intrinsic response properties of auditory thalamic neurons in the Gerbil (Meriones unguiculatus)
(2007)
Neurons in the medial geniculate body (MGB) have the complex task of processing the auditory ascending information from the periphery and a more extensive descending input from the cortex. Differences in the pattern of afferent and efferent neuronal connections suggest that neurons in the ventral and dorsal divisions of the MGB take different roles in this complex task. The ventral MGB (vMGB) is the primary, tonotopic, division and the dorsal MGB (dMGB) is one of the higher order, nontonotopic divisions. The vMGB neurons are arranged tonotopically, have sharp tuning properties, and a short response delay to acoustic stimuli. The dMGB neurons are not tonotopically arranged, have broad tuning properties, and a long response delay to acoustical stimuli. These two populations of neurons, with inherently different tasks, may display differences in intrinsic physiological properties, e.g. the capacity to integrate information on a single cell level. Neurons of the ventral and dorsal divisions of the MGB offer an ideal system to explore and compare the intrinsic neuronal properties related to auditory processing. Coronal slices of 200 μm thicknesses were prepared from the thalamus of 4 - 5 week old gerbils. The current-clamp configuration of the patch-clamp technique was used to do experiments on the dorsal and ventral divisions of the medial geniculate body. Slices were subsequently Nissl stained to verify the location of recording. Recordings from the dorsal and ventral divisions exhibited differences in response to depolarizing current injections. The ventral division responded with significantly shorter first spike latency (vMGB = 41.50 ± 7.7, dMGB = 128.43 ± 16.28; (p < 0.01)) and rise time constant (vMGB = 6.95 ± 0.90, dMGB = 116.67 ± 0.13; (p < 0.01)) than the dMGB. Neurons in the dorsal division possessed a larger proportion of slowly accommodating neurons (rapidly accommodating: vMGB: 89%, dMGB: 64%), including a subpopulation of neurons that fired at resting membrane potential. Neurons in the vMGB are primarily responsible for relaying primary auditory input. Dorsal MGB neurons relay converging multimodal input. A comparative analysis with the primary auditory neurons, the Type I and Type II spiral ganglion neurons, reveals a similar pattern. Type I neurons relay primary auditory input and exhibit short first spike latencies and rise time constants. The Type II neurons relay converging input from many sources, while possessing significantly slower response properties and a greater subpopulation of slowly accommodating neurons. Hence, accommodation, first spike latency, and rise time constant are suggested to be a reflection of the amount of input that must be integrated before an action potential can be fired. More converging input correlates to slower accommodation, a longer first spike latency and rise time. Conversely, a greater capacity to derive discrete input is associated with rapid accommodation, along with a short first spike latency and rise time.
Funktionelle Charakterisierung von Peptidliganden für das komplexe HIV-1-RNA-Verpackungssignal PSI
(2008)
Im Laufe der vergangenen Jahre hat die Identifizierung von Peptidleitstrukturen in der Wirkstoffentwicklung zunehmend an Bedeutung gewonnen. Die Phage Display Technologie ist eine Methode, welche zur Selektion von inhibitorischen Peptiden weit verbreitet ist. Prinzipiell eignet sich dieser Ansatz auch für die Suche nach neuen Leitstrukturen für die Therapie der HIV-Infektion, welche in hochspezifische und -regulierte Schritte im HIV-Replikationszyklus eingreifen sollen. Bei der Verpackung viraler RNA in neu entstehende Virionen handelt es sich um einen Prozess, welcher auf der gezielten Erkennung der dreidimensionalen Struktur der PSI-Region am 5'-Ende ungespleißter, viraler RNA durch die NCp7-Domäne des Gagp55-Vorläuferproteins basiert. Darüber hinaus partizipiert das NCp7-Protein noch an der Reversen Transkription der HIV-RNA sowie an der Integration proviraler DNA und spielt somit eine zentrale Rolle im HIV-1 Replikationszyklus. In vorangegangenen Arbeiten konnten wir mittels der Phage Display Technologie Peptidliganden für die HIV-1 PSI-RNA selektieren, welche die PSI-RNA-NCp7-Interaktion hemmten und in Folge dessen die Verpackung viraler RNA verhindern sollten. Die Bindung der identifizierten tryptophanreichen Peptide an die PSI-RNA konnte zwar zum Teil in vitro mit NCp7 kompetitiert werden, jedoch wiesen die Peptide eine relativ geringe Affinität für die PSI-RNA auf. Im Vordergrund der vorliegenden Arbeit stand nach Optimierung der Affinität eine umfassende funktionelle Charakterisierung der Peptide hinsichtlich ihrer antiviralen Aktivität in vitro. Zunächst gelang es mittels Spot-Synthese-Membranen die Affinität der PSI-RNA-bindenden Peptide um etwa das 30-fache zu verbessern. Der KD-Wert des optimierten HKWPWW-Peptids lag bei 1,1 µM für ein Teilelement der PSI-RNA, das allein über Verpackungsaktivitäten verfügt. Die folgende Analyse der Bindungseigenschaften des HKWPWW-Peptids an die PSI-RNA über NMR und Fluoreszenz-Spektroskopie offenbarte, dass das Peptid über die hydrophoben Aminosäuren an eine charakteristische Schleifenregion in der Sekundärstruktur der PSI-RNA bindet, ähnlich wie der natürliche Ligand NCp7. Gestützt auf diese Ergebnisse, wurde im Hauptteil des Projekts untersucht, ob das HKWPWW-Peptid in der Lage ist, die Verpackung viraler RNA in HI-Virionen zu hemmen. Hierfür erfolgte die Etablierung diverser Testsysteme, welche die intrazelluläre Expression des Peptids ermöglichten. Die Expression von HKWPWW in Fusion mit RFP in Pseudoviren-produzierenden Zellen über transiente Transfektion führte in der höchsten getesteten DNA-Konzentration (2,5 µg) zu einer 95%igen Reduktion des infektiösen Titers. Dieser inhibitorische Effekt war spezifisch für lentivirale Pseudoviren, da die Produktion gammaretroviraler Pseudoviren nicht durch die Anwesenheit des Peptids beeinflusst wurde. Mittels einer stabilen HKWPWW-exprimierenden T-Zelllinie gelang es nachzuweisen, dass das Peptid sogar in der Lage ist, replikationskompetentes HIV über einen Zeitraum von fünf Tagen zu hemmen. Die Synthese des HKWPWW-Peptids in Fusion mit einer Proteintransduktionsdomäne ermöglichte die direkte Behandlung von HIV-infizierten Zellen und führte zu einer verminderten Freisetzung infektiöser HI-Viren in die Zellkulturüberstände. Dabei lagen die IC50- und IC90-Werte des HKWPWW-Peptids nach zweimaliger Peptidzugabe bei 5, 7 bzw. 28,6 µM. Eine in der Literatur oftmals beschriebene Beobachtung ist, dass bei einer reinen Hemmung der HIV-Verpackung Viren entstehen, welche keine virale RNA enthalten. Das Phänomen war in Anwesenheit des HKWPWW-Peptids wenig ausgeprägt wie Korrelationen von p24-Antigen-ELISA und die Quantifizierung viraler RNA in Viruspartikeln zeigten. Diese Gegebenheit sowie das Wissen über die mannigfaltigen Funktionen des NCp7-Proteins im HIV-Replikationszyklus ließen vermuten, dass HKWPWW noch zusätzlich andere Schritte im HIV-Replikationszyklus hemmen könnte. Unterstützt wurde diese Annahme dadurch, dass HKWPWW Ähnlichkeiten zu der hydrophoben Plattform von NCp7 aufweist, welche essentiell für die Verpackung viraler RNA sowie die Reverse Transkription ist. Damit in Einklang steht, das neben einer Bindung an die PSI-RNA auch eine schwächere Interaktion des HKWPWW-Peptids mit den viralen TAR- und PBS-Strukturen nachgewiesen werden konnte. Die auch beobachtete Hemmung der frühen HIV-Replikationsschritte durch HKWPWW könnte somit mit einer möglichen Hemmung der Transkription viraler Gene, der Reversen Transkription oder Integration erklärt werden. Jedoch zeigte die elektronenmikroskopische Analyse, dass nicht nur weniger Viren in Anwesenheit des HKWPWW-Peptids entstehen, sondern dass diese zum Teil einen weniger kondensierten Kern aufweisen. Dies kann als ein Anhaltspunkt angesehen werden, dass HKWPWW tatsächlich auch auf der Ebene der RNA-Verpackung bzw. der viralen Partikelentstehung einen hemmenden Effekt ausübt. Somit resultiert die beobachtete antivirale Aktivität des HKWPWW-Peptids vermutlich aus kombinierten inhibitorischen Effekten auf mehreren Ebenen der HIV-Replikation.