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Exported proteases of Helicobacter pylori (H. pylori) are potentially involved in pathogen-associated disorders leading to gastric inflammation and neoplasia. By comprehensive sequence screening of the H. pylori proteome for predicted secreted proteases, we retrieved several candidate genes. We detected caseinolytic activities of several such proteases, which are released independently from the H. pylori type IV secretion system encoded by the cag pathogenicity island (cagPAI). Among these, we found the predicted serine protease HtrA (Hp1019), which was previously identified in the bacterial secretome of H. pylori. Importantly, we further found that the H. pylori genes hp1018 and hp1019 represent a single gene likely coding for an exported protein. Here, we directly verified proteolytic activity of HtrA in vitro and identified the HtrA protease in zymograms by mass spectrometry. Overexpressed and purified HtrA exhibited pronounced proteolytic activity, which is inactivated after mutation of Ser205 to alanine in the predicted active center of HtrA. These data demonstrate that H. pylori secretes HtrA as an active protease, which might represent a novel candidate target for therapeutic intervention strategies.
Background: Adrenal chromaffin cells and sympathetic neurons both originate from the neural crest, yet signals that trigger chromaffin development remain elusive. Bone morphogenetic proteins (BMPs) emanating from the dorsal aorta are important signals for the induction of a sympathoadrenal catecholaminergic cell fate. Results: We report here that BMP-4 is also expressed by adrenal cortical cells throughout chick embryonic development, suggesting a putative role in chromaffin cell development. Moreover, bone morphogenetic protein receptor IA is expressed by both cortical and chromaffin cells. Inhibiting BMP-4 with noggin prevents the increase in the number of tyrosine hydroxylase positive cells in adrenal explants without affecting cell proliferation. Hence, adrenal BMP-4 is likely to induce tyrosine hydroxylase in sympathoadrenal progenitors. To investigate whether persistent BMP-4 exposure is able to induce chromaffin traits in sympathetic ganglia, we locally grafted BMP-4 overexpressing cells next to sympathetic ganglia. Embryonic day 8 chick sympathetic ganglia, in addition to principal neurons, contain about 25% chromaffin-like cells. Ectopic BMP-4 did not increase this proportion, yet numbers and sizes of "chromaffin" granules were significantly increased. Conclusions: BMP-4 may serve to promote specific chromaffin traits, but is not sufficient to convert sympathetic neurons into a chromaffin phenotype.
CAP (c-Cbl assoziiertes Protein) ist ein Adapterprotein, welches zusammen mit ArgBP2 und Vinexin die SoHo-Protein-Familie bildet. Es besitzt in seinem N-terminalen Bereich eine SoHo-Domäne und im C-Terminus drei SH3-Domänen, über welche es mit einer Vielzahl von Proteinen interagieren kann. CAP spielt bei verschiedenen Signaltransduktionsvorgängen und der Reorganisation des Aktinzytoskelettes eine Rolle. So wurde ihm eine Funktion im PI3-Kinase-unabhängigen Insulinsignalweg zugeschrieben. In Zell-Zell-Kontakten ist CAP zusammen mit Nectin und Afadin Bestandteil des NAPSystems, welches parallel zu Cadherin-Catenin-Adhäsionen existiert. In Fokalkontakten bindet CAP an FAK, Paxillin und Vinculin, welche wichtig für die Regulation der Zell-Matrix-Adhäsionen sind. In der vorliegenden Arbeit sollte die Funktion von CAP bei der Assoziation mit dem Aktinzytoskelett näher untersucht werden. Es wurde gezeigt, daß die Kolokalisation von CAP mit Vinculin und Aktin dynamisch und vom Ausbreitungsgrad der Zelle und dem Expressionsniveau des Proteins abhängig ist. Ohne funktionelle SH3-Domänen lokalisiert CAP nicht mehr in Fokalkontakten, kann aber bei Überexpression noch eine Ausbildung von Streßfasern induzieren. Die Funktionalität der zweiten und der dritten SH3-Domäne von CAP ist für die Zelladhäsion von Epithelzellen von Bedeutung, da Konstrukte, die in konservierten Aminosäuren der Domänen mutiert worden sind, eine verringerte Zellausbreitung aufweisen. CAP wurde zudem als ein Interaktionspartner und Substrat der Tyrosinkinasen c-Abl und c-Src charakterisiert. Die Assoziation mit den Kinasen wird dabei vor allem über den C-Terminus von CAP vermittelt, und CAP kann direkt mit der Src-Kinase interagieren. CAP wird von c-Abl überwiegend an Tyrosin 360, und von c-Src bevorzugt an Tyrosin 326 phosphoryliert. Diese Tyrosine liegen innerhalb bekannter Konsensus-Motive der Kinasen. Phosphorylierungsdefiziente CAP-Konstrukte sind noch dazu in der Lage, mit Vinculin und Aktin zu kolokalisieren. Tyrosin 326 hat jedoch einen Einfluß auf die Zellausbreitung auf Fibronektin, da ein in dieser Aminosäure mutiertes Konstrukt einen Defekt hierbei aufweist. Den genauen Mechanismus, über welchen CAP seinen Einfluß auf die Zell-Matrix-Adhäsion ausübt, ist noch ungeklärt. Durch die hier erstmals aufgezeigte Phosphorylierung des Adapterproteins erweitern sich dessen Interaktionsmöglichkeiten durch mögliche Bindungen an SH2-Domänen-enthaltende Proteine. CAP könnte als Bindeglied zwischen c-Abl und c-Src und weiteren zytoskelettalen Komponenten dazu beitragen, die Kinasen an Fokalkontakten zu verankern und ihnen neue Substrate zuzuführen. Die Interaktion mit CAP könnte dabei die Aktivität der Kinasen erhöhen. Weiterführende Studien werden die in diesem Signalweg nachgeschalteten Komponenten untersuchen und auch eine putative Rolle der Phosphorylierung von CAP in den bereits bekannten zellulären Zusammenhängen wie dem Insulinsignalweg näher beleuchten.
Spectroscopic responses of the potentiometric probe 2-(4-(dimethylamino)styryl)-1-methylpyridinium iodide (DASPMI) were investigated in living cells by means of a time- and space-correlated single photon counting technique. Spatially resolved fluorescence decays from single mitochondria or only a very few organelles of XTH2 cells exhibited three-exponential decay kinetics. Based on DASPMI photophysics in a variety of solvents, these lifetimes were attributed to the fluorescence from the locally excited state, intramolecular charge transfer state, and twisted intramolecular charge transfer state. A considerable variation in lifetimes among mitochondria of different morphologies and within single cells was evident, corresponding to high physiological variations within single cells. Considerable shortening of the short lifetime component ({tau}1) under a high-membrane-potential condition, such as in the presence of ATP and/or substrate, was similar to quenching and a dramatic decrease of lifetime in polar solvents. Under these conditions {tau}2 and {tau}3 increased with decreasing contribution. Inhibiting respiration by cyanide resulted in a notable increase in the mean lifetime and a decrease in mitochondrial fluorescence. Increased DASPMI fluorescence under conditions that elevate the mitochondrial membrane potential has been attributed to uptake according to Nernst distributions, delocalization of {pi}-electrons, quenching processes of the methyl pyridinium moiety, and restricted torsional dynamics at the mitochondrial inner membrane. Accordingly, determination of anisotropy in DASPMI-stained mitochondria in living cells revealed a dependence of anisotropy on the membrane potential. The direct influence of the local electric field on the transition dipole moment of the probe and its torsional dynamics monitor changes in mitochondrial energy status within living cells.
Summary The basal transcription apparatus of archaea is well characterized. However, much less is known about the mechanisms of transcription termination and translation initation. Recently, experimental determination of the 5´-ends of ten transcripts from Pyrobaculum aerophilum revealed that these are devoid of a 5´-UTR. Bioinformatic analysis indicated that many transcripts of other archaeal species might also be leaderless. The´-ends and 3´-ends of 40 transcripts of two haloarchaeal species, Halobacterium salinarum and Haloferax volcanii, have been determined. They were used to characterize the lengths of 5´-UTRs and 3´-UTRs and to deduce consensus sequence-elements for transcription and translation. The experimental approach was complemented with a bioinformatics analysis of the H. salinarum genome sequence. Furthermore, the influence of selected 5´-UTRs and 3´-UTRs on transcript stability and translational efficiency in vivo was characterized using a newly established reporter gene system, gene fusions, and real-time PCR. Consensus sequences for basal promoter elements could be refined and a novel element was discovered. A consensus motif probably important for transcriptional termination was established. All 40 haloarchaeal transcripts analyzed had a 3´-UTR (average size 57 nt), and their 3´-ends were not posttranscriptionally modified. Experimental data and genome analyses revealed that the majority of haloarchaeal transcripts are leaderless, indicating that this is the predominant mode for translation initiation in haloarchaea. Surprisingly, the 5´-UTRs of most leadered transcripts did not contain a Shine-Dalgarno (SD) sequence. A genome analysis indicated that less than 10% of all genes are preceded by a SD sequence and even most proximal genes in operons lack a SD sequence. Seven different leadered transcripts devoid of a SD sequence were efficiently translated in vivo, including artificial 5´-UTRs of random sequences. Thus, an interaction of the 5´-UTRs of these leadered transcripts with the 16S rRNA could be excluded. Taken together, either a scanning mechanism similar to the mechanism of translation initiation operating in eukaryotes or a novel mechanism must operate on most leadered haloarchaeal transcripts. Author Summary Expression of the information encoded in the genome of an organism into its phenotype involves transcription of the DNA into messenger RNAs and translation of mRNAs into proteins. The textbook view is that an mRNA consists of an untranslated region (5´-UTR), an open reading frame encoding the protein, and another untranslated region (3´-UTR). We have determined the 5´-ends and the 3´-ends of 40 mRNAs of two haloarchaeal species and used this dataset to gain information about nucleotide elements important for transcription and translation. Two thirds of the mRNAs were devoid of a 5´-UTR, and therefore the major pathway for translation initiation in haloarchaea involves so-called leaderless transcripts. Very unexpectedly, most leadered mRNAs were found to be devoid of a sequence motif believed to be essential for translation initiation in bacteria and archaea (Shine-Dalgarno sequence). A bioinformatic genome analysis revealed that less than 10% of the genes contain a Shine-Dalgarno sequence. mRNAs lacking this motif were efficiently translated in vivo, including mRNAs with artificial 5´-UTRs of total random sequence. Thus, translation initiation on these mRNAs either involves a scanning mechanism similar to the mechanism operating in eukaryotes or a totally novel mechanism operating at least in haloarchaea.
The term cephalic sensory organ (CSO) is used for specialised structures in the head region of adult Opisthobranchia. These sensory organs show a high diversity in form and function, and the gross morphology of these organs differs considerably among taxa. They can be identified as cephalic shields, oral veils, Hancocks organs, lip organs, rhinophores or oral tentacles. Because of this extremely high diversity, the homology and the evolution of these organs have not been clarified yet. My intention was to use neuroanatomical data sets in order to find putative homologous CSOs. In this study, I will show data about immunohistochemical neurotransmitter content and cellular innervation patterns and their applicability as morphological characters for the homologisation of structures. I support earlier investigations that neurotransmitter content is often related to function. In contrast, axonal tracing patterns can be used to homologise nerves. Overall the aim of this study was to reconstruct the evolution of the CSOs of the Opisthobranchia, by projecting our neuroanatomical data sets onto a molecular phylogeny.
Beta-Barrel-Membranproteine der Omp85-Familie besitzen essentielle Funktionen in der Lipidbiogenese und der Proteinintegration und -assemblierung in der äußeren Membran von Gram-negativen Bakterien. Auch in endosymbiotisch erworbenen Organellen der Eukaryoten übernahmen Vertreter dieser Proteinfamilie wichtige Rollen, wie bei der Translokation von Vorstufenproteinen durch die äußere Hüllmembran von Chloroplasten und der Assemblierung von Proteinkomplexen in der äußeren Hüllmembran von Mitochondrien. Eine phylogenetische Analyse der bekannten Vertreter dieser Proteinfamilie wies auf eine Aufspaltung der Omp85-Familie in zwei Hauptzweige hin. Während der Toc75-Zweig aus plastidären und cyanobakteriellen Omp85-Proteinen besteht, bilden mitochondrielle Proteine sowie die Omp85-Vertreter der Proteobakterien eine zweite Unterfamilie, den Sam50-Zweig. In dieser Arbeit wurden die elektrophysiologischen Eigenschaften von pro- und eukaryotischen Vertretern beider Unterfamilien verglichen. Zu diesem Zweck wurde ein elektrophysiologischer Messstand konstruiert, mit dem diese Kanalproteine mittels der Lipid-Bilayer-Technik untersucht werden konnten. Die Analyse der experimentellen Daten der verwendeten Omp85-Proteine zeigte deutliche Gemeinsamkeiten der gesamten Proteinfamilie hinsichtlich ihrer Kationenselektivität. Hingegen ergab ein Vergleich der Kanalleitwerte signifikante Unterschiede zwischen beiden Unterfamilien. So lagen die aus den Leitwerten berechneten Porendurchmesser bei den Mitgliedern des Toc75-Zweigs um das Zwei- bis Dreifache über den für die Vertreter des Sam50-Zweigs bestimmten Werten. Topologievorhersagen ergaben, dass die Mitglieder der Omp85-Familie aus zwei Domänen aufgebaut sind. Durch die Analyse der elektrophysiologischen Eigenschaften von Teilkonstrukten, die aufgrund dieser Vorhersagen erstellt wurden, konnte gezeigt werden, dass die C-terminale Domäne die Porenregion des beta-Barrel-Proteins bildet. Die elektrophysiologischen Eigenschaften der Omp85-Proteine werden allerdings durch die N-terminale Domäne moduliert. Aufgrund der in dieser Arbeit erzielten elektrophysiologischen Ergebnisse und unter Berücksichtigung der phylogenetischen Analyse der Omp85-Familie konnte eine Hypothese zur evolutionären Entwicklung dieser sehr alten Proteinfamilie aufgestellt werden.
Eine Reihe kurzer synthetischer Peptide, die auf verschiedenen Ebenen während des mehrstufigen Infektions-Prozesses HIV-1 hemmen konnten, wurden in unserer Gruppe über Phage-Display identifiziert. Diese Peptide hatten allerdings nur geringe Affinitäten zu gp120 und eine kurze Halbwertszeit. In der vorliegenden Arbeit wurden diese und andere HIV-1 „Entry“ hemmende Peptide über gentechnische Methoden in eukaryotischen Zellen exprimiert, um ihre Stabilität und antivirale Aktivität zu verbessern. Durch die angeknüpfte Multimerisierungsdomäne C4bp sind die therapeutischen Peptide groß genug, um von Zellen sekretiert zu werden. Die eukaryotisch sekretierten Multimere sind posttranslational modifiziert, besitzen eine höhere Stabilität und die Anzahl der funktionellen Valenzen ist erhöht. Außerdem bietet das System die Möglichkeit, auch Heteromultimere mit verschiedenen Teilstrukturen in einem Molekül zu kombinieren. Wir konnten zeigen, dass sich das C4bp-System zur Expression des Fusions-Inhibitorischen C46-Peptids in löslicher multimerer Form eignete, welches in monomerer Form nicht vollständig durch ER und den Golgi-Apparat geleitet und sekretiert werden konnte. Außerdem hatte multimeres C46 eine deutlich höhere Plasma-Halbwertszeit und wies eine höhere antivirale Aktivität gegenüber dem monomeren Peptid auf (Dervillez et al. 2006). In dieser Arbeit standen die hoch konservierten CD4i-Epitope von gp120, welche an die HIV Corezeptoren binden, als Target für die HIV-Inhibition im Mittelpunkt. Verschiedene Peptidliganden für diese Epitope, wie die zweite extrazelluläre Schleife und der N-Terminus des CCR5-Rezeptors, die sulfatierte CDR3-Domäne des E51-Antikörpers, sowie durch Phage Display gezielt selektionierte Peptide wurden in den C4bp-Expressionsvektor kloniert und nach Transfektion in 293T-Zellen als lösliche Multimere vom Überstand aufgereinigt und funktionell analysiert. Die Multimere waren sowohl in Protein-Protein-Interaktionsstudien als auch bei in vitro HIV-1 Neutralisationsversuchen funktionell aktiv. In den meisten Hemmversuchen war die HIV-1 Inhibition multimerer Peptide mindestens vergleichbar mit dem Fusionsinhibitor T20. Insbesondere im Hinblick auf eine in vivo Applikation ist zudem die verlängerte Halbwertszeit der Multimere im Plasma von Vorteil, da dadurch möglicherweise die Anzahl der Injektionen verringert werden könnte.
Prion diseases or transmissible spongiform encephalopathies (TSEs) are rare neurological disorders that may be of genetic or infectious origin, but most frequently occur sporadically in humans. Their outcome is invariably fatal. The infectious agent has been defined as prion (from proteinaceous infectious only) in 1992 by Stanley B. Prusiner and represent mainly, if not solely, an abnormal, protease-resistant isoform (PrPSc) of a cellular protein, the prion protein or PrPC. According to the “protein only” hypothesis, the prion is devoid of informational nucleic acids and consists of an “infectious” protein that is capable of converting the normal host protein PrPC into a likeness of itself. TSEs can be distinguished from other neurodegenerative diseases because of their infectivity and transmission capability. The only organ system in which severe histopathological damage can be demonstrated as a consequence of infection with prions is the nervous system. The communal lesions are neuronal loss, spongiosis and astrogliosis, accompanied by an intra- and extracellular accumulation of PrPSc, occasionally in form of amyloid plaques. Even if a strong activation of microglia and astrocytes occurs, no immunological response is usually detectable as consequence of prion infection. Despite the considerable attention for its involvement in TSEs, the physiological role of the cellular, nonpathogenic isoform of PrPC, has not yet been determined. In the last years, several putative cellular functions have been attributed to PrPC: its localization in “lipid rafts” is consistent with a possible role in cell adhesion, transmembrane signalling or as a recognition molecule. Furthermore, PrPC has been implicated in protection against oxidative stress, copper metabolism, apoptosis, cell proliferation and in the regeneration of blood precursors stem cells in the adult. It has also been shown that PrPC interacts with the neuronal cell adhesion molecule NCAM, promoting neurite outgrowth. However, both the PrPC-mediated effects and the role of PrPC-dependent pathways on neuronal differentiation are still not elucidated. First objective of this Ph.D thesis was the establishment of a novel in vitro cellular model for the study of the role of PrPC in neuronal differentiation and neurite outgrowth. Furthermore, an additional goal of this project was the indentification of the PrPC domains responsible for the induction of neuronal differentiation. A novel PrPC-depleted cell line (PrP0/0 ML) was derived from murine primary PrP-knockout neuronal cells by SV40 large T antigen-mediated immortalization. A temperature sensitive form of this oncogenic protein was used, allowing a temperature-mediated regulation of its expression. This cell line was then characterised for its growth potential, for the expression of specific cellular markers and for its ability to differentiate. It was found that, under culture conditions promoting the expression of the temperature-sensitive SV40 large T antigen, the cells expressed nestin, a specific marker of neuronal precursor cells. Therefore, the PrP0/0 ML cell line was identified as a potential neuronal stem cell line. In fact, under nonpermissive culture conditions when the expression of the temperature-sensitive SV40 large T antigen is downregulated, the PrP0/0 ML cells differentiated into neurons. Noteworthy, maintenance of the cells in conditions that promote cell differentiation induced a progressive reduction in the expression levels of nestin, an event that strongly correlated with the appearance of the specific neuronal markers MAP-2b and NeuN. In order to investigate the role of PrPC in the process of neuronal differentiation, the PrP0/0 ML cells were then reconstituted for the expression of either the full-length PrP or a N-terminal truncated PrPC form (PrPdel32-134). The differentiation potential of both reconstituted cell lines under nonpermissive culture conditions was then compared with that of the parenteral PrP0/0 ML cells. This in vitro study clearly highlights that PrPC expression in the PrP0/0 ML cell line accelerates neuronal differentiation and that the N-terminal domain of the prion protein is not necessary for this PrP-mediated function. Prion diseases like BSE, vCJK, Kuru and the majority of iatrogenic cases of CJK are caused by a peripheral infection. Infectious prions accumulate in the central and peripheral nervous system as well as in extracerebral tissues, such as the secondary lymphoid organs and muscles. The prion pathogenesis is a dynamic process which can be defined temporary and spatially in different phases: i) infection and peripheral replication, ii) neuroinvasion, transport of prions from the periphery to the central nervous system (CNS), and iii) neurodegeneration. In the last years, progresses in the elucidation of the peripheral prion pathogenesis were achieved. The identification of the cell types involved in the lymphoreticular prion replication phase and the recognition of the role of the peripheral nervous system in the process of prion spread from the periphery to the CNS have elucidated some of the cellular mechanisms that are involved in prion uptake, replication and propagation. However, relatively little information is available about the mechanism(s) underlying intercellular prion transfer and tissue-to tissue prion spread. Microvesicles (MVs) are submicron vesicles (0,03-1 microm.) with a single membrane and are shed from most eukaryotic cells undergoing activation or apoptosis. The segregation of specific proteins is followed by blebbing of the membrane surface, leading to the formation of MVs and their release in the extracellular environment. MVs can be also secreted upon fusion of multivesicular endosomes with the plasma membrane (exosomes). The secretion of MVs is the result of a complex cellular process involving changes in the metabolism of lipids and proteins. The functional role of MVs is still largely unknown. However, there is evidence showing that they are important modulators of cell-to-cell communication, participate in a variety of intracellular adhesion processes and are able to induce cellular response(s). The release of PrPC and infectious PrPSc by prion infected epithelial, neuroglial and neuronal cells in association with exosomes has recently been highlighted. Furthermore, it has been shown that exosomes can propagate prion infectivity both in vitro and in vivo, suggesting that PrPSc-bearing exosomes may provide a mechanism for intercellular transmission of infectious prions in addition to cell-to-cell contact. Second objective of this Ph.D thesis was to determine the possible role of plasma membrane-derived microvesicles in the propagation and transmission of prions. The release of MVs was first studied in different murine neuronal cell lines. Here it is shown for the first time that neurons also shed plasma membrane derived MVs, in addition to exosomes. Immunoelectron microscopy and immunoblot analyses clearly demonstrated the presence of PrPC on the membrane of MVs released from PrPC-expressing cells. Characterization of lipid rafts components in MVs highlighted the presence of the ganglioside GM2, the tyrosine kinase p59Fyn, flotillin-2 and the neuronal protein GAP-43. In order to investigate whether MVs are involved in the intercellular transmission of prions, MVs were first isolated from two prion infected murine neuronal cell lines, namely the Neuro-2a PK1 and the N2a58 cells, and then used for in vitro and in vivo infection assays. Immunoblot analyses after proteinase K treatment demonstrated the association of PrPSc with the secreted MVs. The PrPSc-bearing MVs were then used to perform infection experiments on noninfected cells. By the use of cell blot assay, a method that allows the detection of PrPSc-amplification and -accumulation in cultured cells, the kinetic of prion infection in the de novo infected cells was followed. Noteworthy, it was found that PrPSc-bearing MVs were capable to transmit prions in vitro and to stably infect the recipient cells. In order to investigate the role of MVs in the transmission of infectivity in vivo, PrPSc-bearing MVs as well as MVs isolated from noninfected cells (as negative control) were injected intracerebrally in PrPC-overexpressing indicator mice (tga20). The development of clinical disease was followed in a time-dependent manner. Clinical symptoms could be observed only in the group of indicator mice inoculated with the PrPSc-bearing MVs, which then succumbed to desease. These findings clearly demonstrated that MVs are biological carriers of both PrPSc and prion infectivity. MVs could therefore participate in vivo in the processes of intercellular prion transmission and propagation.
Julia Hansen hat zwischen März und Dezember 2006 Untersuchungen zu Funktion und Struktur der Okklusalflächen in der postcaninen Zahnreihe von Viverriden durchgeführt. Unter verschiedenen Ernährungsregimen bilden Höcker und Täler auf Zähnen, die sich im Gebiss gegenüber stehen, eine Funktionseinheit, mit der Schleichkatzen sowohl in der Lage sind, Früchte zu zerquetschen, als auch den Panzer von Insekten aufzuknacken. In ihrer Studie ist es Frau Hansen gelungen, konstruktive Unterschiede zwischen beiden Nutzungsweisen zu identifizieren. Diese Unterschiede hat sie an verschiedenen fossilen Einzelzähnen der Sammlung Koenigswald überprüft.
Die vorliegende Arbeit umfasst die Rekonstruktion der Körpermasse pleistozäner Cerviden in Java. Zunächst wird ein Rezentmodell erstellt, das den Zusammenhang zwischen Körpermasse und dem jeweiligen Messparameter aufzeigt. Die daraus resultierenden Regressionsgleichungen werden für die Rekonstruktion verwendet. Das fossile dentale und postcraniale Material wird vermessen und die Körpermasse für jedes einzelne Stück rekonstruiert. Die absoluten Werte werden in Körpermassenklassen eingeteilt, um einen Wert unabhängig vom physiologischen Zustand zu erhalten. Die Körpermassen werden, soweit möglich, getrennt nach Gattungen rekonstruiert. Ein Vergleich zeigt, dass es deutliche Unterschiede in der Körpermasse der Gattungen Axis und Muntiacus im Vergleich zu Cervus gibt. Bei der Einteilung in Klassen fällt auf, dass die Klassen 3a (10 kg bis 20 kg) und 3b (20 kg bis 50 kg) ausschließlich von Axis und zu einem kleinen Teil von Muntiacus besetzt werden. Die Klassen 4a und 4b ausschließlich von Cervus. Die einzige von Axis und Cervus besetzte Klasse ist 3c (50 kg bis 100 kg). Anhand dieser aus den Fossilien der Dubois Sammlung gewonnenen Erkenntnisse können nun die Fossilien der von Koenigswald Sammlung beurteilt werden, da diese nicht auf Gattungsniveau bestimmt sind. In beiden Sammlungen liegt der höchste Prozentsatz in der Klasse 3b. Daraus kann man schließen, dass sehr viele Tiere der Gattung Axis vorhanden sind. Die Gattung Cervus hingegen ist nur zu einem recht geringen Prozentsatz vertreten. Diese Verteilung spiegelt sich auch in der Untersuchung der Fundstellen wider. An nur drei der acht untersuchten Fundstellen wurden Tiere der Gattung Cervus gefunden. Ein Vergleich der Körpermassen ergibt keinen signifikanten Unterschied zwischen diesen. Innerhalb der Axis-Hirsche kann man einen Körpermassenunterschied erkennen, der jedoch nicht mit der geographischen Lage der Fundstellen begründet werden kann. Die Untersuchung der Fundstellen aufgrund ihrer Chronologie ergibt keinen signifikanten Unterschied zwischen den Faunenleveln Trinil H.K. und Kedung Brubus. Jedoch ist innerhalb der Faunenlevel eine deutliche Variationsbreite der Körpermasse zu erkennen, welche auf das an den einzelnen Fundstellen herrschende Habitat zurückgeführt werden kann. Die Zuordnung der bisher nicht datierten Fundstellen in die Faunenlevel ist alleine aufgrund der rekonstruierten Körpermassen nicht möglich, jedoch können erste Aussagen über das umgebende Habitat getroffen werden.
Die vorliegende Arbeit umfasst die Rekonstruktion der Körpermasse pleistozäner Rhinocerotidae in Europa und Südost-Asien , hier speziell der Insel Java. Methodisch wird dieses Ziel durch lineare Regressionen nach Janis (1990) verfolgt. Zunächst wird ein Rezentmodell erstellt, das es ermöglicht Körpermasse mit verschiedenen Zahnparametern in Zusammenhang zu bringen. Die aus dem Rezentmodell resultierenden Regressionsgleichungen für jeden Zahn werden dann für die Rekonstruktion fossiler Körpermassen verwendet. Das fossile Zahnmaterial wurde vermessen und die Körpermassen für alle Zahnparameter errechnet. Um einen Vergleich mit veröffentlichten Werten zu ermöglichen, wurde die Körpermasse gleichfalls nach Legendre (1986) ermittelt, welcher eine Formel zur Körpermassenrekonstruktion entwickelte, die heute allgemein Verwendung findet. Um die oftmals sehr großen Schwankungen in der Körpermasse, verursacht durch Ernährungs- und Gesundheitszustand eines Tieres abzufedern, sind die absoluten Werte in Körpermassenklassen eingeteilt. Die ermittelten Körpermassen wurden dann in verschiedenen Zusammenhängen betrachtet und, soweit möglich , Aussagen über Gründe für Veranderungen oder Unterschiede zwischen Messstrecken, Zeiträumen, Habitaten oder auch Spezies genannt.
Die vorliegende Studie dient als Basis einer neuen, zuverlässigen Populationsschätzung von Wildschweinen (Sus scrofa). Nach dem hier entwickelten Feldprotokoll soll Wildschweinkot in ausreichenden Mengen, ausreichend guter Qualität und nicht-invasiv gewonnen werden. Die daraus gewonnen Gewebeproben dienen anschließend als DNS-Quelle für individuelle Erkennung und Markierung der beprobten Tiere. Durch Kenntnis des zum Kot gehörigen Tieres lässt sich ein Fang-Wiederfang-Verfahren simulieren. Ein Sammelverfahren, gegliedert in zwei identische Blöcke zu je sechs Tagen, kombiniert aus Strip-Transekt-Sampling (Buckland 2001) und Adaptive-Sampling (Thompson 1991) führte hierbei zum besten Resultat von 0,48 Funden je abgesuchten Kilometer und 1,04 Funden je aufgewendeter Stunde. Die Untersuchung fand auf einem bewaldeten etwa 40 km2 großen Areal im Pfälzerwald, südlich von Kaiserslautern - südliches Rheinland-Pfalz – statt. Im Rahmen der Untersuchung wurden 1605 km abgesucht und vier verschiedene Transektmodelle getestet. Insgesamt wurden hierbei 268 Kothaufen erfasst, die zusätzlich auf ihre physischen Eigenschaften (Kotgröße, Härtegrad, Konsistenz, Insektenbefall), Lage im Gelände (Verteilung auf Laub-, Nadel- und Mischwälder, sowie auf Geländeneigung, Exposition und Höhenlage) und räumliche Verteilung im Untersuchungsgebiet analysiert wurden. Die Untersuchungen fanden zu verschieden Jahreszeiten (Sommer, Herbst und Winter) statt. Als geeigneter Zeitraum für eine solche Kotsammlung hat sich der Winter herausgestellt, aufgrund der längeren Zersetzungszeit des Kots und der durch den Laubfall bedingten, besseren Sichtverhältnisse. Bei ausreichender Stichprobenzahl des Kots hat es sich zu dem ergeben, dass Rückschlüsse auf die Habitatnutzung des Schwarzwilds anhand der Kotverteilung machbar sind. Eine Interpretation der Populationsstruktur anhand der Kotgröße ist in Ansätzen erkennbar. Ein Vergleich mit den gängigen Bestandesschätzverfahren durch Jagdstrecken und Kotzählungen bestätigt die Tauglichkeit des Feldprotokolls zur Beschaffung von Wildschweinkotmengen, die der Population entsprechen. In zwei von vier Versuchsansätzen konnten entsprechende Kotmengen erfasst werden.
Reggie-1 (flotillin-2) and reggie-2 (flotillin-1) are membrane microdomain proteins which are associated with the membrane by means of acylation. They influence different cellular signaling processes, such as neuronal, T-cell and insulin signaling. Upon stimulation of the EGF receptor, reggie-1 becomes phosphorylated and undergoes tyrosine 163 dependent translocation from the plasma membrane to endosomal compartments. In addition, reggie-1 was shown to influence actindependent processes. Reggie-2 has been demonstrated to affect caveolin- and clathrin-independent endocytosis. Both proteins form homo- and hetero-oligomers, but the function of these oligomers has remained elusive. Moreover, it has not been clarified if functions of reggie-1 are also influenced by reggie-2 and vice versa. The first aim of the study was to further investigate the interplay and the heterooligomerization of reggie proteins and their functional effects. Both reggie proteins were individually depleted by means of siRNA. In different siRNA systems and various cell lines, reggie-1 depleted cells showed reduced protein amounts of reggie-1 and reggie-2, but reggie-2 knock down cells still expressed reggie-1 protein. The decrease of reggie-2 in reggie-1 depleted cells was only detected at protein but not at mRNA level. Furthermore, reggie-2 expression could be rescued by expression of siRNA resistant wild type reggie-1-EGFP constructs, but not by the soluble myristoylation mutant G2A. This mutant was also not able to associate with endogenous reggie-1 or reggie-2, which demonstrates that membrane association of reggie-1 is necessary for hetero-oligomerization. In addition, fluorescence microscopy studies and membrane fractionations showed that correct localization of overexpressed reggie-2 was dependent on co-overexpressed reggie-1. Thus, hetero-oligomerization is crucial for membrane association of reggie-2 and for its protein stability or protein expression. Moreover, the binding of reggie-2 to reggie-1 required tyrosine 163 of reggie-1 which was previously shown to be important for endosomal translocation of reggie-1. Since reggie-2 was implicated to function in clathrin- and caveolin-independent endocytosis pathways, the effect of reggie-2 depletion on reggie-1 endocytosis was investigated. Indeed, reggie-1 was dependent on reggie-2 for endosomal localization and EGF-induced endocytosis. By FRET-FLIM analysis it could be shown that reggie heterooligomers are dynamic in size or conformation upon EGF stimulation. Thus, it can be concluded that reggie proteins are interdependent in different aspects, such as protein stability or expression, membrane association and subcellular localization. In addition, these results demonstrate that the hetero-oligomers are dynamic and reggie proteins influence each other in terms of function. A further aim was the characterization of reggie-1 and reggie-2 function in actindependent processes, where so far only reggie-1 was known to play a role. Depletion of either of the proteins reduced cell migration, cell spreading and the number of focal adhesions in steady state cells. Thus, also reggie-2 affects actin-dependent processes. Further investigation of the focal adhesions during cell spreading revealed that depletion of reggie-1 displayed different effects as compared to reggie-2 knock down. Reggie-1 depleted cells had elongated cell-matrix-adhesions and showed reduced activation of FAK and ERK2. On the other hand, depletion of reggie-2 resulted in a restricted localization of focal adhesion at the periphery of the cell and decreased ERK2 phosphorylation, but it did not affect FAK autophosphorylation. Hence, reggie proteins influence the regulation of cell-matrix-adhesions differently. A link between reggie proteins and focal adhesions is the actin cross-linking protein -actinin. The interaction of -actinin with reggie-1 could be verified by means of co-immunoprecipitations and FRET-FLIM analysis. Reggie-1 binds -actinin especially in membrane ruffles and in other locations where actin remodeling takes place. Moreover, -actinin showed a different localization pattern during cell spreading in reggie-1 depleted cells, as compared to the control cells. These results provide further insights into the function of both reggie proteins. Their interplay and hetero-oligomerization was shown to be crucial for their role in endocytosis. In addition, both reggie proteins influence actin-dependent processes and differentially affect focal adhesion regulation.
Stressorinduzierte ökotoxikologische Effekte und Genexpressionsveränderungen bei Chironomus riparius
(2008)
Die Effekte von Stressoren auf Chironomus riparius wurden im Lebenszyklustest und auf genomischer Ebene mit dem Ziel untersucht, ein auf einem DNA-Mikroarray („ChiroChip“) basierendes Screeningverfahren zu entwickeln. Die empfindlichsten Endpunkte der Lebenszyklustests waren die Mortalität, der Anteil fruchtbarer Eigelege, der mittlere Schlupfzeitpunkt der Weibchen sowie das Gewicht der Männchen. Temperaturveränderungen um ± 6°C gegenüber einer normalen Hälterungstemperatur von 20°C führten in allen Endpunkten zu hochsignifikanten Effekten. Eine LC10 konnte nur für die Salinität berechnet werden (0,66‰, KI: 0,26 − 1,68‰). Aufgrund der nicht-linearen Konzentrations-Wirkungs-Beziehungen konnte nur für den mittleren Schlupfzeitpunkt der Weibchen nach einer Exposition gegenüber Cadmium eine EC50 (0,53 mg/kg, KI: 0,29 − 0,97 mg/kg) bestimmt werden. In den Versuchen mit Methyltestosteron, Ethinylöstradiol, Carbamazepin, Fluoxetin, Blei und Tributylzinn (mit denen auch molekularbiologische Untersuchungen durchgeführt wurden) waren die empfindlichsten Endpunkte die Mortalität, der Anteil fruchtbarer Eigelege, der mittlere Schlupfzeitpunkt der Weibchen sowie die Populationswachstumsrate. Carbamazepin (CBZ) wirkte schlupfverzögernd bei den Weibchen. 10 mg CBZ/kg führte zu einer höheren Mortalität, weniger Eigelegen, die vermehrt unfruchtbar waren, sowie zu einer geringeren Populationswachstumsrate. Fluoxetin (FX) wirkte bei beiden Geschlechtern schlupfverzögernd. 0,9 mg FX/kg führte zu einer erhöhten Mortalität, weniger und vermehrt unfruchtbaren Eigelegen und einer geringeren Populationswachstumsrate. In der höchsten Konzentration (5,9 mg/kg) waren die Weibchen leichter als die Kontrolltiere. Tributylzinn (in µg Sn/kg angegeben) bewirkte eine höhere Mortalität und geringere Populationswachstumsrate bei 100 µg Sn/kg und führte zu einer Verzögerung im Schlupfverlauf bei den Weibchen. Bei 160 µg Sn/kg gab es weniger Eigelege, die vermehrt unfruchtbar waren. Die Männchen, die gegenüber Konzentrationen von 120 und 160 µg Sn/kg exponiert wurden, waren leichter als die Kontrolle. Expositionen gegenüber Blei (Pb) in Konzentrationen von 0,65 − 65 mg/kg führten bei 6,5 mg Pb/kg zu einer erhöhten Mortalität und zu mehr unfruchtbaren Gelegen. Bei 0,65 mg Pb/kg waren die Männchen leichter und bei 6,5 mg Pb/kg schwerer. Die Anzahl der fruchtbaren Gelege pro Weibchen war bei 3,25 und 6,5 mg Pb/kg geringer als in der Kontrolle. Die gegenüber 17alpha-Methyltestosteron (MET) exponierten Mücken hatten geringere Mortalitäten als in der Kontrolle und zeigten einen verfrühten Schlupf beider Geschlechter. Ab 27 µg MET/kg gab es weniger unfruchtbare Gelege, leichtere Männchen sowie erhöhte Populationswachstumsraten. 17alpha-Ethinylöstradiol (EE2) führte zu einem verfrühten Schlupf bei beiden Geschlechtern sowie zu erhöhten Populationswachstumsraten. Bei 9 µg EE2/kg gab es weniger unfruchtbare Gelege. Die Exposition von Chironomus-Larven gegenüber Methyltestosteron, Ethinylöstradiol, Fluoxetin, Carbamazepin, Tributylzinn und Blei führte zur differenziellen Expression von neun (Methyltestosteron) bis 49 (Carbamazepin) Genen. Bei der Untersuchung der exprimierten Proteine fällt auf, dass kaum bekannte Stressproteine (z.B. Glutathion-S-Transferase oder Cytochrom P450) differentiell reguliert wurden. Bei der Exposition wurden verschiedene Prozesse durch eine veränderte Genexpression beeinflusst. Eine Exposition gegenüber Methyltestosteron führte zu einer Beeinträchtigung von drei identifizierten biologischen Prozessen, während bei den anderen Substanzen sieben bis acht Prozesse beeinflusst waren. Die am häufigsten beeinflussten Prozesse waren der Protein- und der Energiemetabolismus. Der Sauerstofftransport ist ein Prozess, der bei allen Substanzen beeinflusst wurde, jedoch mit unterschiedlichen Anteilen. Bei einer Exposition gegenüber Methyltestosteron war der Anteil des Sauerstofftransports an den beteiligten Prozessen mit 84,6% am größten und mit 10,5% bei Fluoxetin am geringsten. Die veränderte Genexpression der Globine kann möglicherweise aufgrund der schadstoffspezifischen Veränderungen als Biomarker für das Monitoring von Freilandgewässern angewendet werden. Da Tubulin und Aktin häufig nach einer Exposition gegenüber Stressoren differenziell exprimiert wird (bei Tributylzinn und CBZ in der vorliegenden Arbeit und bei Antidepressiva und Östrogenen in anderen Studien) wären die beiden Proteine möglicherweise ebenfalls als Biomarker für Chemikalienstress geeignet. Vor der Verwendung des ChiroChips als Screeninginstrument für die Chemikalienuntersuchung und das Biomonitoring müssen noch Untersuchungen zur konzentrationsabhängigen Genexpression und zur Expression in unbehandelten Larven und weiteren Lebensstadien erfolgen. Des Weiteren müssen die vorliegenden Daten verifiziert und die Funktion der differentiell regulierten Gene vertieft untersucht werden.
In dieser Arbeit wurden potentielle Mitglieder des Proteinnetzwerks um Ataxin-2 untersucht, um Rückschlüsse auf die bisher unbekannte Funktion von Ataxin-2 machen zu können. Ataxin-2 ist das Krankheitsprotein der Spinozerebellären Ataxie Typ 2, einer Polyglutaminerkrankung, bei der die Expansion eines Polyglutamintraktes zur Degeneration von Purkinje-Neuronen führt. Da die Funktion von Ataxin-2 bisher nicht ermittelt werden konnte, sollte die Charakterisierung seiner Protein-Interaktoren es ermöglichen, Einblicke in seine Funktion zu gewinnen. Dazu wurden die drei Kandidaten „Similar to golgin-like“, TRAP und alpha-Actinin-1 untersucht, die alle drei mit Hilfe von Hefe-2-Hybrid Screens identifiziert worden waren. Im Fall von „Similar to golgin-like“, einem aus Genom und cDNA-Fragmenten hervorgesagten Protein unbewiesener Existenz, konnte eine mutationsabhängige Modulation der Bindungsstärke an Ataxin-2 im Hefe-2-Hybrid-System gezeigt werden, die sich allerdings mit rekombinanten Proteinen in Koimmunpräzipitationen in Säuger-Zellen nicht reproduzieren ließ. Beide Proteine kolokalisierten am ER, unabhängig von der Länge des pathogenen Polyglutamintraktes-2 in Ataxin. Gegen ein SIM-Peptid hergestellte Antikörper zeigten eine exklusive Expression im menschlichen Gehirn und wurden erfolgreich zum Nachweis eines endogenen Komplexes aus Ataxin-2 und SIM-IR im krankheitsrelevanten Gewebe eingesetzt. Allerdings war es nicht möglich, mittels 5’-RACE und 2D-Gel Massenspektrometrie die potentiellen Isoformen von SIM näher zu charakterisieren. Zur funktionellen Analyse von SIM wurden intrazelluläre Transportvorgänge am Golgi-Apparat untersucht, aber ein Einfluss von SIM / Ataxin-2 ließ sich nicht belegen. Im Fall des Interaktions-Kandidaten TRAP wurden Antikörper hergestellt und mit einem bereits publizierten polyklonalen Antikörper, der TRAP in rattus norvegicus erkennt, verglichen. Die Expressionsmuster zeigten eine identische Expression im Hirn und der Testis. Eine Kolokalisations-Studie wies sowohl TRAP als auch Ataxin-2 am ER nach. Allerdings erwiesen sich alle verwendeten Antikörper als ungeeignet für Immunpräzipitationen, so dass die physiologische Existenz des endogenen TRAP-Ataxin-2 Komplexes nicht bewiesen werden kann. Im Fall des Interaktor-Kandidaten alpha-Actinin-1 ließ sich die Interaktion mit Ataxin-2 sowohl für die endogenen Proteine in der zytosolischen Fraktion von Mausgehirnen als auch für die rekombinanten Proteine in Säuger-Zellen belegen. Beide Proteine konnten im Zytosol und zu kleineren Anteilen an der Plasmamembran kolokalisiert werden. Als verantwortliche Subdomänen im Fall von Ataxin-2 wurde der N-terminale Bereich des Proteins in der Nähe der pathogenen Expansion, im Fall von alpha-Actinin-1 die Aktin-bindende Domäne durch GST-pulldown Analysen identifiziert. Darauf aufbauend wurde in Patienten-Fibroblasten das Aktinzytoskelett und die Dynamik von alpha-Actinin-1 in Anwesenheit der Ataxin-2-Polyglutamin-Expansion untersucht, wobei allerdings kein Unterschied zu erkennen war. Anschließend an die Analyse des Zytoskeletts wurde ein möglicher Einfluss von Ataxin-2 und seiner Polyglutamin-Expansion auf die EGF-Rezeptorinternalisierung studiert, da eine Rolle von Ataxin-2 auf die Endozytose in parallelen Analysen der Arbeitsgruppe wahrscheinlich wurde. Hierzu wurden Säuger-Zellen mit alpha-Actinin-1 transfiziert und die Internalisierung mikroskopisch und mittels Analyse der ERK1/2 Aktivierung verfolgt. Ergänzt wurden die Experimente durch Analysen zur ERK1/2 Aktivierung in Patienten- und Kontroll-Fibroblasten. Entgegen den Erwartungen hatte die Überexpression von alpha-Actinin-1 keinen Einfluss auf die Internalisierung, und bei keinem der Ansätze zeigte sich eine signifikante Veränderung der ERK1/2 Aktivierung. Auch Transkriptombefunde aus SCA2-KO Gewebe, nach denen einzelne Gene des Zytoskeletts oder der Rezeptor-Endozytose ihre Expression ändern, ließen sich nicht mit Konsistenz validieren. Abschließend wurden Experimente zur subzellulären Lokalisation von Ataxin-2 durchgeführt, die eine Lokalisation am ER und nicht wie bisher berichtet am Golgi-Apparat sicherten und Ergebnisse zur Assoziation mit Polyribosomen bekräftigten. Obwohl somit bei allen drei Proteininteraktor-Kandidaten glaubwürdige Befunde für eine Ataxin-2 Bindung sprechen, ist derzeit eine funktionelle Analyse der Assoziationen nicht möglich und eine klare Definition der physiologischen Rolle von Ataxin-2 lässt sich aus diesen Daten nicht ableiten, wenn auch die prominente Lokalisation von Ataxin-2 am rauen endoplasmatischen Retikulum mit einem Einfluss von Ataxin-2 auf die ribosomale Translation und die Sekretion in Cisternen kompatibel ist.
Im Rahmen dieser Arbeit wurden ausgewählte 5’- und 3’-untranslatierte Regionen (UTRs) von mRNAs aus H. volcanii bestimmt. Dieses Datenset wurde verwendet um (1) haloarchaeale UTRs zu charakterisieren, (2) Konsensuselemente für die Transkrikptionsinitiation und -termination zu verifizieren und (3) den Einfluss haloarchaealer UTRs auf die Initiation und Regulation der Translation zu untersuchen. Es konnte gezeigt werden, dass alle untersuchten Transkripte nichtprozessierte 3’-UTRs mit einer durchschnittlichen Länge von 45 Nukleotiden besitzen. Darüber hinaus konnte ein putatives Transkriptionsterminationssignal bestehend aus einem pentaU-Motiv mit vorausgehender Haarnadelstruktur identifiziert werden. Die Analysen der Regionen stromaufwärts der experimentell bestimmten Transkriptionsstarts führten zur Identifizierung dreier konservierter Promotor Elemente: Der TATA-Box, dem BRE-Element und einem neuen Element an Position -10/-11. Überraschenderweise bestand die TATA-Box nur aus vier konservierten Nukleotiden. Die Untersuchung der UTRs ergab, dass die größte Anteil der haloarchaealen Transkripte keine 5’-UTR besitzt. Falls eine 5’-UTR vorhanden ist, besitzen unerwarteterweise nur 15% der 5’-UTRs aus H. volcanii eine Shine-Dalgarno-Sequenz (SD-Sequenz). Es konnte jedoch gezeigt werden, dass verschiedene native und artifizielle 5’-UTRs ohne SD-Sequenz sehr effizient in vivo translatiert werden. Außerdem hat die Sekundärstruktur der 5’-UTR und die Position struktureller Elemente offenbar einen entscheidenden Einfluss auf die Translatierbarkeit von Transkripten. Die Insertion von Strukturelementen nahe des Startkodons führte zu einer vollkommenen Repression der Translation, während die proximale Insertion des Motivs an das 5’-Ende der 5’-UTR keinen Einfluss auf die Translationsseffizienz hatte. Zusammenfassend kann sowohl der eukaryotische Scanning-Mechanismus als auch die bakterielle Initiation der Translation über die SD-Sequenz für haloarchaeale Transkripte mit 5’-UTR ohne SD-Sequenz ausgeschlossen werden. Die im Rahmen dieser Arbeit durchgeführten Untersuchungen bilden die Grundlage für weitere Untersuchungen zur Identifizierung eines entsprechenden dritten Mechanismus zur Initiation der Translation in H. volcanii. Eine aktuelle Studie zur globalen Analyse der Translationsregulation zeigte, dass der Anteil translational regulierter Gene in H. volcanii genauso hoch ist wie bei Eukaryoten (Lange et al., 2007). Um die Rolle haloarchaealer UTRs bei der Regulation der Translation zu charakterisieren, wurden die UTRs zweier ausgewählter translationsregulierter Gene untersucht. Es stellte sich heraus, dass nur die Anwesenheit beider UTRs, 5’- und 3’-UTR, zu einer Wachstumsphasen-abhängigen Regulation der Translation führt. Dabei hat die 3’-UTR allein keinen Einfluss auf die Translationseffizienz, während die 5’-UTR die Translationseffizienz in beiden Wachstumsphasen reduziert. Es zeigte sich außerdem, dass die 3’-UTR für die „Richtung“ der Regulation auf Translationsebene verantwortlich ist und putative Strukturelemente möglicherweise in den Regulationsmechanismus involviert sind. Zusammengefasst ergibt sich folgendes Modell der Translationsregulation in H. volcanii: Strukturierte 5’-UTRs führen zu einer Herabsetzung der konstitutiven Translationseffizienz. Dies kann differentiell durch regulatorische Faktoren kompensiert werden, welche spezifische Elemente der 3’-UTR binden. Sowohl natürliche als auch artifizielle Aptamere und allosterische Ribozyme stellen effektive Werkzeuge zur exogen kontrollierten Genexpression dar. Daher wurde die Anwendbarkeit eines Tetracyclin-induzierbaren Aptamers und eines konstitutiven Hammerhead-Ribozyms in H. volcanii untersucht. Es stellte sich allerdings heraus, dass das Aptamer bereits ohne Tetracyclin starke inhibitorische Sekundärstrukturen ausbildet. Als Alternative wurden Reportergenfusionen mit einem selbstspaltenden Hammerhead-Ribozym konstruiert. Die selbstspaltende Aktivität des Hammerhead-Ribozyms in H. volcanii konnte erfolgreich in vivo demonstriert werden, was die Grundlage zur Entwicklung konditionaler Expressionssysteme basierend auf dem Hammerhead-Ribozym in H. volcanii bildet.
In a combined NMR/MD study, the temperature-dependent changes in the conformation of two members of the RNA YNMG-tetraloop motif (cUUCGg and uCACGg) have been investigated at temperatures of 298, 317 and 325 K. The two members have considerable different thermal stability and biological functions. In order to address these differences, the combined NMR/MD study was performed. The large temperature range represents a challenge for both, NMR relaxation analysis (consistent choice of effective bond length and CSA parameter) and all-atom MD simulation with explicit solvent (necessity to rescale the temperature). A convincing agreement of experiment and theory is found. Employing a principle component analysis of the MD trajectories, the conformational distribution of both hairpins at various temperatures is investigated. The ground state conformation and dynamics of the two tetraloops are indeed found to be very similar. Furthermore, both systems are initially destabilized by a loss of the stacking interactions between the first and the third nucleobase in the loop region. While the global fold is still preserved, this initiation of unfolding is already observed at 317 K for the uCACGg hairpin but at a significantly higher temperature for the cUUCGg hairpin.
Chloroplast function depends on the translocation of cytosolically synthesized precursor proteins into the organelle. The recognition and transfer of most precursor proteins across the outer membrane depend on a membrane inserted complex. Two receptor components of this complex, Toc34 and Toc159, are GTPases, which can be phosphorylated by kinases present in the hosting membrane. However, the physiological function of phosphorylation is not yet understood in detail. It is demonstrated that both receptors are phosphorylated within their G-domains. In vitro, the phosphorylation of Toc34 disrupts both homo- and heterodimerization of the G-domains as determined using a phospho-mimicking mutant. In endogenous membranes this mutation or phosphorylation of the wild-type receptor disturbs the association of Toc34, but not of Toc159 with the translocation pore. Therefore, phosphorylation serves as an inhibitor for the association of Toc34 with other components of the complex and phosphorylation can now be discussed as a mechanism to exchange different isoforms of Toc34 within this ensemble.