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Der menschliche Körper ist permanent mechanischen Reizen in Form von Dehnung oder Druck ausgesetzt. Diese Stimuli können vielfältige zelluläre Prozesse induzieren. Dehnungsreize erhöhen die Zellproliferation in allen bisher untersuchten Zellspezies, inklusive Endothel- und Epithelzellen. Im Gegensatz dazu scheinen mechanische Druckbelastungen zu zellulärer Differenzierung zu führen. Die Relevanz dieser mechanischen Reize für die Physiologie und Pathophysiologie ist für viele Organe nachgewiesen worden. Jedoch gibt es bislang keine hinreichenden Untersuchungen, die belegen, dass mechanische Reize ebenso eine Rolle bei der Tumorproliferation spielen könnten. Im Fokus dieser Promotionsarbeit steht die Fragestellung, inwieweit die mechanischen Verhältnisse in Tumoren in einem funktionellen Zusammenhang mit der Tumorgenese stehen. Zur Klärung dieser Fragestellung ist ein Xenograft-Tumormodell etabliert worden, das es erlaubt in vivo-Untersuchungen an humanen epithelialen Tumoren durchzuführen. Um Erfahrungen aus vorherigen in vitro-Versuchen nutzen zu können, wurden humane epitheliale A431-Vulvakarzinom- und humane epitheliale A549-Lungenkarzinomzellen für das Tumormodell verwendet. Mit diesem Modell konnte erstmals in vivo gezeigt werden, dass solide humane Tumore einer permanenten mechanischen Dehnung ausgesetzt sind, die direkten Einfluss auf die Proliferation der Tumorzellen hat. Als zentraler Auslöser für die mechanische Dehnung der Tumorzellen konnte der erhöhte tumorinterstitielle Flüssigkeitsdruck (TIFP) identifiziert werden. Der Einfluss der mechanischen Dehnung auf die Proliferation der Tumorzellen wurde anhand der Phosphorylierung der extracellular regulated kinase 1/2 (ERK1/2) bzw. der Ki-67 Expression gezeigt. Durch die Punktion bzw. Drainage von Tumoren konnte der TIFP experimentell abgesenkt werden und in Folge dessen kam es zu einer reduzierten mechanischen Dehnung der Tumorzellen. In allen Versuchen war die Abnahme der mechanischen Dehnung von einer verringerten Phosphorylierung der ERK1/2 bzw. reduzierten Expression des Proliferationsmarkers Ki-67 begleitet. Der TIFP induziert aber nicht nur mechanische Dehnungsreize, sondern er stellt darüber hinaus eine physikalische Barriere für den effizienten Transport von Therapeutika in den Tumor dar. Der gegenüber dem umliegenden Gewebe erhöhte TIFP behindert den interstitiellen Transport und die Aufnahme von Molekülen aus dem Gefäßsystem in die Tumorzellen. Die Etablierung einer neuen experimentellen Technik zur Senkung des TIFP, durch i.v. Injektion von konzentriertem humanem Serumalbumin, führte zu einer signifikanten Verbesserung der Aufnahme und einer Verlängerung der Verweildauer von Makromolekülen/Therapeutika innerhalb von Tumoren. Des Weiteren konnten immunhistochemische Färbungen gegen lymphspezifische Marker in Gewebeproben von A431 und A549 Tumoren keinen direkten Zusammenhang zwischen Lympharchitektur und TIFP zeigen. Dies bedeutet, dass in den untersuchten Tumoren die Ausbildung des hohen TIFP eher auf eine erhöhte Rigidität der extrazellulären Matrix bzw. die hohe Permeabilität des tumorversorgenden vaskulären Gefäßsystems zurückzuführen ist. Parallel zu den in vivo-Untersuchungen durchgeführte in vitro-Versuche konnten Proteine identifizieren, die an der druckinduzierten p38 Signaltransduktionskaskade beteiligt sind. Diese Ergebnisse untermauern die bisherigen in vitro-Daten bzgl. der differentiellen Reaktionen von Zellen auf mechanische Druckreize. Abschließend lässt sich sagen, dass die Ergebnisse der in vivo-Versuche die Bedeutung und die klinische Relevanz des biophysikalischen Parameters TIFP hervorgehoben haben. Die Zukunft der Krebstherapie liegt nicht alleine in der Entwicklung neuer hochspezifischer Wirkstoffe, sondern auch in der Lösung des Transports der Wirkstoffe an den Zielort. Die vorgestellten Ergebnisse dieser Promotionsarbeit weisen eine beträchtliche klinische Relevanz auf, denn sie zeigen, dass die experimentelle Absenkung des TIFP zu einer verbesserten Aufnahme von Therapeutika beiträgt. Gleichzeitig wird die Proliferationsrate von Tumorzellen durch die reduzierte mechanische Dehnung signifikant verringert. Dieser Doppeleffekt könnte zu einer effizienteren Krebstherapie führen in Folge derer es zu einer verlängerten Überlebensrate sowie einer Verbesserung der Lebensqualität von Krebspatienten kommen könnte.
Many environmental chemicals are suspected of disturbing the human and animal endocrine system. These so-called endocrine disruptors can operate in many ways. The interaction of endocrine disruptive effects that eventually endanger human health is still unclear. However, one of the basic mecha-nisms of endocrine disruption is the inhibition of key enzymes in the hormone metabolism. In this study, we focused on the inhibitory potency of suspected endocrine disrupting compounds on aromatase (P450arom) and 5alpha-reductase (5alpha-Re) activities in human tissue and human cancer cells. Both enzymes are essential for the human sex steroid hormone metabolism. We were able to demonstrate that the organotin compounds tributyltin (TBT) and triphenyltin (TPT) are potent unspecific inhibitors of P450arom and 5alpha-Re activity. Prochloraz and fenarimol inhibited P450arom activity at low concentrations (IC50<2 µM), while 5alpha-Re activity was only impaired at higher concentrations (IC50>10 µM). While the human tissue assay proved to be more practical and sensitive as a screening tool for putative endocrine disruptors, the cell assay reflected partly the situation in vivo. In another experimental series, we investigated the inhibitory effect of TPT on P450arom, 5alpha-Re, 3beta-HSD type 2, 17beta-HSD type 1 and type 3 alone and in combination with the strong antioxidant dithioerythrithol (DTE). TPT inhibited unspecifically all enzymes that were tested. The experiments also showed that DTE is able to compensate the adverse effects of TPT, and that the effectiveness of the compensatory activity of DTE differs among the enzymes investigated. The suppressed 5alpha-Re activity could not be reactivated with DTE. Conceivably, cysteine residues that are responsible for the tertiary and quarternary structure of the enzyme are critical targets for TPT. A human sampling study was undertaken with the COMPRENDO partner in Gdansk. 60 Polish and 15 German blood samples were investigated for chemical residues and sex hormone concentrations. In addition, 15 placenta samples from Poland and Germany, respectively, were tested for chemical residues, P450arom activities and CYP19 mRNA contents. The chemical analysis was performed by the COMPRENDO partners in Milan (p,p´DDE), Orleans (TBT and TPT) and Ioannina (diuron, fenarimol, linuron und vinclozolin). The results showed that individual sex hormone concentrations in blood were not correlated with chemical body burden. The detected differences in sex hormone concentrations, specific aromatase activity and relative CYP19 mRNA content of Polish and German donors were presumably the result of other factors than the ones determined in this study. Another task of the EU-project was the investigation of the effects of chemical exposure of the aquatic model organisms Pimephales promelas, Rutilus rutilus and Xenopus laevis. We investigated the specific P450arom and 5alpha-Re activities in brain and gonads of the animals. During the qualitative investigation of the androgen metabolism in Xenopus laevis brain, 5alpha-reductase activity was discovered for the first time. In contrast to the inhibitory potency of TPT discovered in our enzyme assays, TPT exposure of aquatic model organisms had no observed effect on enzyme activity in the organs investigated, except for P450arom activities in female gonads of Pimephales promelas at 320 ng TPT/L. In this group, mean P450arom activities were elevated, possibly as a result of an overshooting upregulation due to the inhibition of P450arom by TPT. The exposure of Rutilus rutilus and Xenopus laevis to the effector substances methyltestosterone and letrozole resulted in slightly different mean enzyme activities compared to the control group. In conclusion, many of the tested pesticides are able to inhibit P450arom and 5alpha-Re, and thus might be of clinical relevance. However, results are not always coherent, and possible risks for human and wildlife health are therefore difficult to predict. Risk assessment will require large studies with an additional number of short and long term in vitro and in vivo assays. Any extrapolation to humans should be very meticulously performed.
Die Verbreitung westlicher Verhaltens- und Lebensmuster im Rahmen der Globalisierung führt zu einer dramatischen Zunahme des Typ 2 Diabetes. Eine schwerwiegende Komplikation der diabetischen Erkrankung ist die Wundheilungsstörung, deren molekulare Pathophysiologie noch weitgehend unverstanden ist. Voraussetzung für einen koordinierten Wundheilungsprozess ist die ausgewogene Interaktion wundheilungsrelevanter Faktoren, die eine Vielfalt an Signaltransduktionskaskaden induzieren und somit zu einem streng kontrollierten Heilungsprozess beitragen. Darüber hinaus scheint auch die Insulinsensitivität der Haut für den Heilungsverlauf eine essentielle Rolle zu spielen. Da die Proteinkinase B/Akt nicht nur ein zentrales Molekül der Insulin-Signaltransduktion ist, sondern als Knotenpunkt vieler Signalkaskaden im Mittelpunkt zellulärer Ereignisse steht, sollte in der vorliegenden Arbeit die Rolle und Funktion der Proteinkinase Akt in der kutanen Wundheilung untersucht werden. Sowohl in der Haut als auch im Wundgewebe konnte Akt1 als dominante Isoform identifiziert werden. Die Verletzung des Hautgewebes induzierte einen Anstieg der Akt1-Expression und -Phosphorylierung in der Epidermis akut heilender Wunden. Insbesondere die am Wundrand gelegenen Keratinozyten waren durch eine starke Expression der Akt1-Kinase gekennzeichnet. Die Phosphorylierung und somit Aktivierung der Akt1-Kinase stieg im Verlauf der Wundheilung stetig an und erreichte ihr Maximum in der Endphase des Heilungsprozesses. Begleitet wurde die Aktivierung dieser Kinase von einer Phosphorylierung des eIF4E-BP1 und einer starken VEGF-Sekretion. Dagegen konnte in diabetisch chronischem Wundgewebe weder eine Aktivierung der Akt1-Kinase noch eine Phosphorylierung des eIF4E-BP1 nachgewiesen werden, was mit einer deutlich verminderten VEGF-Sekretion einherging. Um nun zu untersuchen, ob im Prozess der Wundheilung die VEGF-Sekretion in einem funktionellen Zusammenhang zur Akt1-Aktivierung steht, wurde in vitro der Einfluss wundheilungsrelevanter Faktoren, wie EGF, einer Kombination proentzündlicher Zytokine oder Insulin auf die Aktivierung der Akt1-Kinase und VEGF-Biosynthese untersucht. Obwohl alle Faktoren sowohl eine Aktivierung der Akt1-Kinase als auch VEGF-Sekretion induzierten, wurde ausschließlich die Insulininduzierte VEGF-Biosynthese über den PI3-Kinase/Akt-Signalweg vermittelt. Die Regulation der Insulin-induzierten VEGF-Biosynthese erfolgte posttranskriptionell aus einem gleichbleibenden Pool an VEGF-mRNA über die Phosphorylierung des eIF4E-BP1. Durch die Überexpression einer konstitutiv aktiven Akt1-Mutante und die Verwendung des mTOR-Inhibitors Rapamycin konnte mTOR als Mediator der Akt1-vermittelten Phosphorylierung des eIF4E-BP1 und somit der VEGF-Biosynthese identifiziert werden. In vitro-Lokalisationsexperimente zeigten, dass eine vollständig phosphorylierte und somit aktive Akt1-Kinase nach Insulinstimulation im Zytoplasma lokalisiert ist - exakt dort, wo die Regulation der Translation stattfindet. Zusammenfassend weisen diese Ergebnisse darauf hin, dass Insulin im kutanen Heilungsverlauf die VEGF-Biosynthese posttranskriptionell über eine Akt1-vermittelte Phosphorylierung des eIF4E-BP1 induzieren kann. Eine ausbleibende Akt-Aktivierung in insulinresistenten Keratinozyten könnte somit zu einer verminderten VEGF Sekretion und folglich zu einer verzögerten Angiogenese in chronisch diabetischen Wunden beitragen.
Was passiert auf molekularer Ebene, wenn der Körper altert? Eine Antwort darauf lautet: Es häufen sich irreparable Schäden an Zellen, an Zellbestandteilen wie den Organellen, der DNA oder Eiweißen und anderen Molekülen. DassFehler passieren, ist unvermeidlich, denn jeder Stoffwechselvorgang birgt eine gewisse Störanfälligkeit in sich. Ein junger Organismus ist dank ausgefeilter Reparatursysteme in der Lage, Fehler zu korrigieren. Nimmt diese Fähigkeit mit dem Altern ab, so treten zwei Arten von Problemen mit besonders weitreichenden Folgen auf: Fehler bei der Replikation (dem Kopieren) der DNA und molekulare Schäden, die freie Radikale anrichten. So können Defekte der DNA einerseits die Entstehung von Tumoren verursachen, andererseits aber auch Alterungsprozesse beschleunigen.
In den hoch entwickelten Industriestaaten wird seit längerem eine dramatische Veränderung der Bevölkerungsstruktur beobachtet. Bei einer Erhöhung der Lebenserwartung und einer gleichzeitigen Abnahme der Geburtenrate verschiebt sich das Verhältnis von jungen zu alten Individuen immer mehr hin zu den Älteren. Längst wird von einem »Ergrauen« oder gar einer »Vergreisung« Europas gesprochen. Hieraus ergeben sich bereits heute schwerwiegende Probleme für die bestehenden Sozial- und Gesundheitssysteme. Diese drohen sich in der Zukunft dramatisch zu verschärfen. Eine Entlastung wird sicher nur dann erreicht werden können, wenn es gelingt, das Auftreten gesundheitlicher Beeinträchtigungen und Erkrankungen nachhaltig zu verhindern oder zumindest zu verzögern und damit eine Verbesserung der Lebensqualität in fortgeschrittenen Lebensabschnitten zu gewährleisten. Entscheidende Voraussetzung zum Erreichen dieser Ziele ist ein grundlegendes Verständnis der Mechanismen biologischen Alterns.
Ob das Alter ein Segen oder ein Fluch ist, darüber gehen seit der Antike die Meinungen auseinander, und es hat nicht an Versuchen gefehlt, für die doch unleugbaren Gebrechen und Gebresten die Gegenrechnung aufzumachen. Auf der einen Seite also Verfall des Körpers, Krankheit, Nachlassen oder Absterben der Sinnesvermögen und des fleischlichen Begehrens, auf der anderen Seite dafür aber Weisheit, Gelassenheit, Gemütsruhe, Abgeklärtheit, Milde, vielleicht Heiterkeit, da nichts mehr erreicht werden will. Prudentia – Klugheit – und Sophrosyne – Beherrschung der Begierden durch Vernunft und Besonnenheit – heißen die altersgemäßen Stichwörter, die vielleicht sogar Handlungsspielräume eröffnen, die den früheren Lebensaltern fehlten. ...
Maligne Gliome sind die häufigsten Neoplasien des Zentralen Nervensystems. Sie zählen zu den hypoxischsten Tumoren und entwickeln u.a. durch die Adaption an niedrige Sauerstoffbedingungen Apoptose-resistente Phänotypen. Darüber hinaus zeichnen sie sich durch schnelle Proliferation und ein diffuses, infiltratives Wachstum in das umliegende Neuropil aus, was eine vollständige Tumor-Resektion unmöglich macht. Entsprechend liegt die mediane Überlebenszeit nach der Diagnose trotz chirurgischen Eingriffs bei anaplastischen Astrozytomen (WHO Grad III) zwischen 18 und 20 Monaten und bei Glioblastomen (WHO Grad IV) zwischen 12 und 15 Monaten. Im ersten Abschnitt der vorliegenden Arbeit wurden 17 Gliomzelllinien in einem in vitro-Anoxiemodell auf ihre Hypoxie-Sensitivität hin untersucht. Dabei wurde eine hohe Variabilität hinsichtlich der Hypoxie-Toleranz festgestellt, sowie die Tendenz zu einer ausgeprägter Anpassung an niedrige Sauerstoffverhältnisse, begleitet von der Fähigkeit, das mitochondriale Membranpotential (delta psi m) aufrecht zu erhalten. Der durch Hypoxie induzierte Zelltod wurde als Caspase-unabhängig und Nekrose-ähnlich charakterisiert. Apoptose wurde hingegen auch in den Hypoxie-sensitiven Zelllinien nach 48 stündigem Sauerstoffentzug nur in sehr geringem Ausmaß beobachtet. Funktionelle Analysen mit den synthetischen BH3-Mimetika HA14-1 und BH3I 2’, die selektiv Bcl-2 bzw. Bcl xL/Bcl-2 inhibieren, lassen darauf schließen, dass die für Gliomzellen typische Bcl-2- und Bcl xL-Überexpression eine Blockade des mitochondrialen Signalwegs verursacht und so entscheidend zur Apoptose-Resistenz der Zellen beiträgt. Der Todesligand TRAIL, der selektiv in Tumorzellen Zelltod aktiviert, ist ein vielversprechender Kandidat für neue Apoptose-induzierende Krebstherapien. Da jedoch einige Krebszelltypen einschließlich maligner Gliome weitgehend gegen TRAIL resistent sind, richtet sich das Interesse verstärkt auf kombinatorische Therapieansätze, die Tumorzellen für TRAIL resensitivieren sollen. Nur zwei von sechs untersuchten Gliomzelllinien reagierten auf die Behandlung mit TRAIL, wobei eine Korrelation zwischen Hypoxie- und TRAIL-Resistenz deutlich wurde und die Hypothese einer ausgeprägten Kreuzresistenz stärkt. Ein Zusammenhang zwischen TRAIL-Sensitivität und TRAIL-Todes- bzw. –Decoy-Rezeptor-Expression konnte indes nicht hergestellt werden. Der Vergleich von konventionellen Therapienansätzen (Gamma-Bestrahlung) mit neuartigen Wirkstoffklassen (BH3-Mimetika und Proteasomeninhibitoren) zeigte, dass Gamma-Bestrahlung lediglich in TRAIL-sensitiven Zellen synergistisch mit TRAIL wirkte, während die BH3-Mimetika den TRAIL-induzierten Zelltod sowohl in TRAIL-sensitiven als auch –resistenten Zellen signifikant erhöhten. Diese Befunde legen nahe, dass die hohen Bcl-2- und Bcl xL-Proteinlevel verschiedene Signalwege hemmen, die an den Mitochondrien konvergieren und dadurch die Apoptose- bzw. Therapie-Resistenz maligner Gliome steigern. Der Einsatz der Proteasomeninhibitoren MG132 und Epoxomicin erwies sich vergleichsweise als am effizientesten: Beide Substanzen vervielfachten p53-unabhängig den TRAIL-induzierten Zelltod in TRAIL-sensitiven Gliomzellen und reaktivierten darüber hinaus potent die TRAIL-induzierte Apoptose in den TRAIL-resistenten Zelllinien. Microarray- und semi-quantitative RT-PCR-Analysen ergaben eine potente transkriptionelle Aktivierung des TRAIL-Rezeptors DR5 und der Stress-induzierten Transkriptionsfaktoren CHOP und c-Jun. Weitere Untersuchungen mit Hilfe von chemischen Inhibitoren und RNA-Interferenz zeigten, dass die CHOP-unabhängige, JNK/c-Jun-Signalwegs-vermittelte Aktivierung von DR5 eine maßgebliche Rolle bei der Proteasomeninhibitor-induzierten Sensitivierung von Gliomzellen für TRAIL spielt. Zusammengenommen legen die vorgelegten Befunde nahe, dass neue Ansätze basierend auf TRAIL oder agonistischen TRAIL-Rezeptor-Antikörpern in Kombination mit Proteasomeninhibitoren oder BH3-Mimetika vielversprechende Strategien zur Überwindung der Therapieresistenz maligner Gliome darstellen.
The rate of species extinctions due to anthropogenic activities has dramatically increased within the past few centuries (Dirzo & Raven, 2003; Novacek & Cleland, 2001). Although the mechanisms and ultimate causes leading to the extinction of species remain largely unclear (Frankham et al., 2002), five threats to global biodiversity have frequently been referred to as the most important: habitat destruction and fragmentation, global climate change, hunting and overuse of food resources, biological invasions and environmental pollution (Dudgeon et al., 2006; Lewis, 2006; Novacek & Cleland, 2001). Different research fields, as conservation biology, ecology and ecotoxicology, investigate the effects of these factors on organisms and found strong evidence for their negative impact on regional and global biodiversity.
In most cases, natural populations will be impacted not only by one threat, but rather a combination of them (Buckley & Roughgarden, 2004; Kappelle et al., 1999). Multiple environmental stress factors can have cumulative negative effects on the survival of populations (Sih et al., 2004). To understand, how natural populations respond to combinations of different stress factors is thus of crucial importance in order to understand our present and future impact on all scales of biodiversity (Warren et al., 2001).
The effects of anthropogenically introduced chemicals on organisms and ecosystems are investigated in the field of ecotoxicology. Research in this area has led to a large body of information concerning the impact of chemical stress on the fitness of model species in the laboratory. In contrast to this, there is an obvious lack of knowledge on the effects of contaminants on natural populations and communities (Bickham et al., 2000; Bourdeau et al., 1990). For instance, ecotoxicologists have just started to investigate the impact of environmental pollution on the genetic variability of natural populations (Bickham et al., 2000; Whitehead et al., 2003). Genetic variation provides the raw material for populations in order to adapt to changing environmental conditions and is thus the substrate for evolution and long-term survival of populations and species (Frankham, 2005). The amount of genetic variation in populations is positively correlated with the effective population size (Frankham, 1996). Habitat destruction and fragmentation has divided the ranges of many species into small and isolated refuges. Without migration from adjacent habitats, isolated populations will decrease in their level of genetic diversity through random loss of alleles (Hedrick, 2000). Frankham (1995) for instance, showed that 32 of the 37 endangered species (which occur in small populations per definition) of different animals and plant taxa display reduced levels of heterozygosity compared to closely related and more frequent species.
In strongly human impacted landscapes, both factors, environmental pollution and habitat destruction, can be expected to occur frequently together. It is thus of crucial importance to investigate the impact of reduced genetic diversity and inbreeding on the response to chemical stress. In addition, chemical exposure has frequently been discussed to have an impact on the extent of genetic variability in exposed populations (Guttman, 1994; Staton et al., 2001; van Straalen & Timmermans, 2002). However, evidence for this 'genetic erosion hypothesis' remained scarce to date, most likely because of the difficulty to single out the impact of pollution stress from a background of multiple factors which influence patterns of genetic variability in natural populations (Belfiore, 2001; Staton et al., 2001; van Straalen & Timmermans, 2002).
Präklinische Untersuchungen zur Gentherapie der HIV-Infektion mit dem retroviralen Vektor M87o
(2007)
Mit der Einführung der hochaktiven antiretroviralen Therapie (HAART) 1995 wandelte sich die HIV-Infektion in den Industrieländern von einer akut lebensbedrohlichen zu einer chronisch verlaufenden und scheinbar gut kontrollierten Erkrankung. Das Virus wird allerdings nie vollständig aus dem Körper eliminiert, sodass die Betroffenen zeitlebens Medikamente einnehmen müssen. Die Langzeit-Medikation wird häufig von schweren Nebenwirkungen begleitet, führt zur Selektion resistenter Viren und muss häufig umgestellt werden. Gentherapeutische Verfahren, die die CD4+ Zielzellen durch die Expression antiviraler Gene vor der Infektion durch HIV schützen („intrazelluläre Immunisierung“), stellen viel versprechende Therapiealternativen dar. Der in der Arbeitsgruppe von Laer entwickelte retrovirale Vektor M87o (EGELHOFER et al. 2004, EGELHOFER 2004) exprimiert das 46 Aminosäuren lange membran-verankerte Peptid C46, das in der Lage ist, die gp41-vermittelte Fusion von Virus- und Zellmembran zu inhibieren. In Zelllinien und primären Lymphozyten konnte gezeigt werden, dass M87o die Infektion durch unterschiedliche HIV-Isolate sehr effektiv verhindert. Im Rahmen vorklinischer Untersuchungen konnte in vitro gezeigt werden, dass die retrovirale Transduktion mit M87o das Transformationsrisiko und damit das Risiko der Entstehung von Neoplasien nicht steigert. An primären peripheren T-Zellen konnte zeigt werden, dass M87o die Zielzellen weder phänotypische noch funktionelle verändert. Für die Untersuchung der retroviralen Gentherapie im Rhesusaffenmodell wurde zunächst ein Gentransferprotokoll für periphere Affenlymphozyten entwickelt, mit dem in Vorversuchen Gentransferraten von ca. 50% erreicht werden konnten. Das Transduktionsprotokoll wurde anschließend im Rahmen einer präklinischen Studie zur Toxizität und Immunogenität der M87o-Gentherapie, bei der Herstellung zweier Studientransplantate angewandt. Beide Zellpräparate wurden den Versuchstieren transplantiert. Während des Eingriffs traten keine akuttoxischen Reaktionen auf. M87o+-Zellen konnten bis 140 Tage nach der Transplantation mittels PCR nachgewiesen werden. Immunologische Untersuchungen (Cytokinfärbung, Proliferationsassay, ELISPOT) ergaben keine Hinweise auf zelluläre oder humorale Immunreaktionen. M87o-spezifische Antikörper waren im Serum nicht nachweisbar. Für die Durchführung einer klinischen Studie zur Toxizität und Wirksamkeit (Phase I/II) an HIV-infizierten Probanden wurde ein Protokoll zur Produktion M87o-modifizierter T-Zellen (mindestens 5 × 108 M87o+ CD4-T-Zellen pro Spender) entwickelt. In die klinische Prüfung wurden Patienten aufgenommen, die nach multiplem Therapieversagen durch das Auftreten multiresistenter HIV eine CD4-Zellzahl von 50 bis 200 µl-1 Blut, sowie eine Viruslast von >5.000 Kopien ml-1 Blut aufwiesen. Im Versuchsmaßstab konnte ein Transduktionsprotokoll erarbeitet werden, mit dem im Mittel 46% der CD4+ T-Zellen mit M87o transduziert werden konnten. Innerhalb von 10 Tagen expandierte die Zellzahl im Mittel um den Faktor 153, wobei die HIV-Replikation vollständig inhibiert wurde. Das Protokoll wurde erfolgreich vom Versuchsmaßstab in den klinisch relevanten Produktionsmaßstab übersetzt. In drei Versuchsläufen wurde im Mittel eine Transduktionsrate von 29% erreicht und die Zellzahl um den Faktor 44 vermehrt. Der Anteil an CD3+/CD4+ Zellen an der Gesamtpopulation lag im Mittel bei 91%. Insgesamt konnten mit dem etablierten Protokoll durchschnittlich 2,3 × 109 CD3+/CD4+/M87o+ Zellen, bei gleichzeitig vollständiger Inhibition der HIV-Replikation, generiert werden. Im Rahmen einer klinischen Studie zur Toxizität und Wirksamkeit der M87o-Gentherapie wurden 10 Studientransplantate gemäß dem im Rahmen dieser Arbeit entwickelten Protokoll hergestellt. Alle Transplantate wurden am Universitäts-Krankenhaus Eppendorf in Hamburg transfundiert und von den Patienten sehr gut vertragen.
Shaped by some of the most dramatic tectonic events of the Cenozoic, the parts of southern and eastern Asia that have become known as the Oriental faunal region comprise vast areas of great geological complexity and ecological diversity. One of the four major groups of terrestrial elapid snakes in this region is the genus Bungarus. These nocturnal and predominantly ophiophagous snakes are widely known as kraits and are an important cause of snakebite mortality throughout their wide range that extends from Afghanistan to Vietnam and eastern China, and south to the Indonesian islands of Java and Bali. Although present on Borneo, kraits have not been found on any island of the Philippines, nor on Lesser Sunda Islands east of Bali. Despite their medical significance and the great importance of Bungarus toxins as tools in neuropharmacology, krait systematics and taxonomy have remained largely unstudied. Twelve species of Bungarus were recognized at the beginning of the present study. Many of these are rare in collections, and most aspects of their biology are unknown. While some species are highly distinct, most kraits are conservative morphologically, rendering molecular methods invaluable for the study of their diversity and biogeography. This study is the first to address the relationships within Bungarus and the historical biogeography of kraits based on molecular evidence. I inferred phylogeographic relationships based on analyses of new nucleotide sequences of the entire mitochondrial cytochrome b gene of 51 kraits and partial NADH dehydrogenase subunit 4 sequences of 40 kraits which I analyzed together with a representative sample of 32 published elapid and non-elapid outgroup taxa using Bayesian, maximum-likelihood, maximum-parsimony and neighbor-joining methods. I then used the recovered phylogeny to investigate the evolution of selected morphological characters and, together with collections-based geographical distribution information, in dispersal-vicariance analyses with models of variable taxonomic and biogeographic complexity. The phylogenetic analyses demonstrate that the current taxonomy of kraits does not adequately represent either the relationships or the genetic diversity in this genus. In contrast, I identified monophyletic groups that are congruent with recognized biogeographic units as well as extensive ecomorph evolution and morphologically cryptic speciation. The following additional conclusions are collectively supported by the mitochondrial phylogeny and morphological as well as biochemical synapomorphies: (1) Kraits are monophyletic with respect to the remaining taxa of the Elapidae; (2) Bungarus flaviceps and Bungarus bungaroides form the monophyletic sister clade of a clade formed by B. fasciatus, black-and-white-banded, and uniformly black taxa; (3) the remaining taxa are divisible into two sister clades, the South Asian species (Bungarus sindanus (Bungarus caeruleus, Bungarus ceylonicus)) vs. Himalayan, Burmese, Southeast and East Asian taxa; (4) within the latter, Burmese taxa form the sister clade to Southeast and East Asian taxa; (5) the widespread and medically significant species Bungarus candidus and Bungarus multicinctus are paraphyletic. The results of this study highlight the importance of vicariant geological events and sea level fluctuations for the cladogenesis of kraits. Events of particular importance in the evolution of kraits include the uplift of the Indo-Burman ranges (Arakan-Naga Hills) which separated black-and-white banded kraits in India and Southeast Asia, and the uplift of mountain ranges in Yunnan, China (e.g., the Gaoligong Shan), which coincided with lineage separation in two distantly related clades of kraits. Alternating dispersal and vicariance events due to Pleistocene climatic and sea level changes have caused complex phylogeographic patterns in kraits in Southeast Asia. Zones of contact between closely related evolutionary lineages of the B. candidus complex are identified in Thailand, Vietnam, and southern China (Hainan). Within this complex, two main clades are revealed. One includes populations from the Southeast Asian mainland and is in contact with B. multicinctus in southern China. The other consists of populations from Thailand, southern Vietnam, Java, and Bali. The phylogeny as well as genetic distances suggest a scenario in which a Pleistocene southward dispersal of B. candidus to Sumatra, Java, and Bali during times of low sea levels was temporarily interrupted by vicariant events (rising sea levels, especially flooding of the Malacca Strait between Sumatra and the Malay Peninsula, and of the Bali Strait between Java and Bali). In this context, the close phylogenetic relationship between haplotypes from southern Vietnam and those from Java and Bali suggests that "southern" B. candidus dispersed directly via colonization of the widely receded South Chinese Sea, and not by taking a detour via the Malay Peninsula and Thailand, which were already inhabited by other populations of B. candidus. Using these phylogenetic estimates as the framework for a study on the diversity and evolution of krait venom components, I applied biochemical and molecular genetic approaches to identify and quantify polypeptide and protein toxins in krait venom, focusing on the distribution and molecular evolution of alpha-bungarotoxin, an irreversible competitive antagonist of nicotinic acetylcholine receptors with an exceptionally high applied significance as a receptor probe. I was specifically interested in the medically relevant question of intraspecific and interspecific variability in toxin diversity, and whether receptor-binding postsynaptic toxins evolve at rates different from those of presynaptic neurotoxins like beta-bungarotoxin, which act by destroying the nerve terminal and are believed to exhibit hypervariable functional diversification due to an accelerated mode of molecular evolution. In the context of this question, I isolated and purified the major lethal neurotoxins from B. candidus venoms by sequential steps of liquid chromatography for structural and functional characterization studies. Cloning and sequence analysis of toxin-coding genomic DNAs showed that the gene encoding the alpha-bungarotoxin alanine-31 variant, originally isolated from B. multicinctus venom, is widely present and highly conserved in multiple populations of B. candidus and is expressed as the principal postsynaptic neurotoxin at least in Javan B. candidus. In addition to the widespread presence of genomic DNAs encoding the alpha-bungarotoxin alanine-31 variant, the present study also revealed the partial genes of three novel alpha-bungarotoxin isoforms in addition to the previously known alanine-31 and valine-31 variants, all of which share an invariant exon 3 coding region. While alpha-bungarotoxin is the principal postsynaptic neurotoxin of Taiwanese B. multicinctus and Javan B. candidus, the main postsynaptic neurotoxin of Thai B. candidus both by quantity and lethality was a novel polypeptide of similar toxicity with a mass of 8030 Da and 73 amino acid residues, whose characterization at the genetic and protein levels revealed a novel subgroup of krait neurotoxins, here named alpha-delta-bungarotoxins and represented by four sequences from Bungarus caeruleus and B. candidus. alpha-delta-Bungarotoxins share high sequence homology with alpha-bungarotoxins but the purified, 8030 Da alpha-delta-bungarotoxin-1 exhibits only reversible, low affinity binding to nicotinic receptors and high site-selectivity for the acetylcholine binding site at the alpha-delta-subunit interface of the receptor. These properties render alpha-delta-bungarotoxin not only the first snake long-chain neurotoxin with reversible binding and binding-site selectivity, but also an exciting natural tool with which to address structure-function relationships at the subunit interfaces of the human receptor. The results of comparisons of the number of non-synonymous nucleotide substitutions per nonsynonymous site (dN) to the number of synonymous nucleotide substitutions per synonymous site (dS) strongly suggest that positive selection is acting on exon 2 of the alpha-bungarotoxin and probably also of the alpha-delta-bungarotoxin genes. In addition, the numbers of nucleotide substitutions per site of intron (dI) compared to the dS value of the toxin-coding exon regions provide strong evidence for accelerated molecular evolution in exon 2 of alpha-delta-bungarotoxins —whose value of dI is only one-eighth of the value of dS—whereas the hypothesis of accelerated evolution is rejected for 13 unique genomic DNAs encoding five alpha-bungarotoxin isoforms from B. candidus and B. multicinctus....
Das Epsilon-Proteobakterium Wolinella succinogenes wächst unter anaeroben Bedingungen durch Nitrit-Atmung. Als Elektronendonoren werden Formiat oder Wasserstoff verwendet. Die terminale Reduktase der Elektronentransportkette von Formiat zu Nitrit ist der Cytochrom C-Nitrit-Reduktase-Komplex (NrfHA), welcher die Reduktion von Nitrit zu Ammonium katalysiert. Menachinon dient als Redoxmediator. Die katalytische Untereinheit NrfA ist ein Pentahäm Cytochrom c, dessen Struktur bekannt ist. Die Häm c-Gruppe im aktiven Zentrum von NrfA wird über ein ungewöhnliches CXXCK-Motiv kovalent gebunden, während die übrigen vier Häm c-Gruppen über konventionelle CXXCH-Motive gebunden werden. Der Lysin-Rest des CXXCK-Motivs ist der axiale Ligand des Häm-Eisens der Häm-Gruppe im katalytischen Zentrum. Die Untereinheit NrfH ist ein membranständiges Tetcahäm-Cytochrom C, das den Elektronentransport von Menachinol zu NrfA katalysiert. Im Nitrit-Reduktase-Operon nrfHAIJ wird das Nrfl-Protein kodiert, das ähnlich zu verschiedenen Cytochrom c-Biogenese Proteinen (Ccsl und CcsA) anderer Organismen ist. Ziel dieser Arbeit war die Konstruktion und Charakterisierung von Mutanten, in denen der Lysin-Rest des CXXCK-Motivs (K134) von NrfA ausgetauscht wurde oder konservierte Aminosäure-Reste am katalytischen des NrfAProteins ausgetauscht wurden. Weiterhin wurden Mutanten konstruiert und charakterisiert, in denen das nrfl-Gen inaktiviert wurde. Folgende Ergebnisse wurden erhalten: Es wurde eine Mutante konstruiert (W. succinogenes K134H), in der das CXXCK-Motiv im aktiven Zentrum von NrfA in ein konventionelles CXXCH-Motiv gewandelt wurde. Die spezifische Nitrit-Reduktase-Aktivität, gemessen mit reduziertem Benzylviologen als Elektronendonor, betrug maximal 40% der Aktivität des Wildstammes. Die Elektronentransport-Aktivität von Formiat zu Nitrit betrug 6% der Aktivität des Wildstamms. Durch MALDI-Massenspektroskopie wurde gezeigt, dass das NrfA-Protein aus dieser Mutante, ebenso wie das Protein aus dem Wildstamm, fünf Häm-Gruppen enthielt. In W. succinogenes Mutanten, in denen der Lysin-Rest 134 gegen Leucin oder Glutamin ausgetauscht wurde, ließ sich das Nrf-Protein durch Western-Blot-Analysen nicht mehr nachweisen. 2. In W. succinogenes R114L, Y21 8F, H277L wurden konservierte Aminosäure-Reste in NrfA ausgetauscht, die nach dem postulierten Mechanismus der Nitrit-Reduktion an der heterolytischen Spaltung der ersten N-O-Bindung des Nitrits beteiligt sind. Alle diese Mutanten wachsen nicht durch Nitrit-Atmung. W. succinogenes H277L und R114L besitzen keine Nitrit-Reduktase-Aktivität, obwohl das NrfA-Protein in allen Mutanten nachweisbar war. Die Elektronentransport-Akivität von Formiat zu Nitrit in W. succinogenes Y218F betrug 6% im Vergleich zum Wildstamm und die Nitrit-Reduktase-Aktivität betrug 14% gegenüber dem Wildstamm. Aus der Struktur von W. succinogenes NrfA ist ersichtlich, dass der Glutamin-Rest 276 Teil eines Substrat-Kanals ist, der von der Oberfläche des NrfA-Proteins zur Häm-Gruppe im aktiven Zentrum führt (Einsle et al. 2000). in W. succinogenes Q276E wurde der Glutamin-Rest gegen einen negativ geladenen Glutamat-Rest ausgetauscht. W. succinogenes Q276E wächst nicht durch Nitrit-Atmung. Die Elektronentransport-Aktivität von Formiat zu Nitrit betrug in dieser Mutante 6% im Vergleich zum Wildstamm. Die Nitrit-Reduktase-Aktivität war gegenüber dem Wildstamm um 90% erniedrigt. 3. In der Mutante W. succinogenes stopl wurde das nrfl-Gen durch Einführen von zwei Stop-Codons an den Positionen 47 und 48 inaktiviert. Diese Mutante wächst nicht durch Nitrit-Atmung und besitzt keine Nitrit-Reduktase-Aktivität. Im NrfA-Protein aus W.succinogenes stopl fehlte die über das CXXCK-Motiv ligandierte Häm-Gruppe im aktiven Zentrum, während die übrigen über konventionelle CXXCH-Motive ligandierten Häm-Gruppen vorhanden waren. 4. Die Mutante W. succinogenes Kl34H/stopl, in der das stopl-Gen inaktiviert war und das CXXCK-Motiv in ein fünftes CXXCH-Motiv geändert wurde, entsprach in ihren Eigenschaften dem Stamm W. succinogenes K134H. Daraus ist zu folgern, dass das Nrfl-Protein speziell am Einbau der Häm-Gruppe am CXXCK-Motiv in NrfA beteiligt ist, während Nrfl für den Einbau an CXXCH-Motiven entbehrlich ist. Nrfl ist vermutlich eine spezielle Häm-Lyase, die den Lysin-Rest des CXXCK-Motivs erkennt. 5. Campylobacter jejuni kodiert ein NrfA-Protein, das fünf CXXCH-Motive anstelle von einem CXXCK-Motiv und vier CXXCH-Motiven enthält. In C. jejuni wird die vermutliche Häm-Gruppe des aktiven Zentrums von einem CMNCH-Motiv ligandiert, während in W. succinogenes die Bindung an einem CWTCK-Motiv erfolgt. In den Mutanten W. succinogenes CMNCK und W. succinogenes CMNCH wurde das Häm-Bindemotiv im aktiven Zentrum von NrfA dem von C. jejuni angeglichen. Keine der beiden Mutanten wuchs durch Nitrit-Atmung. W. succinogenes CMNCK katalysierte den Elektronentransport von Formiat zu Nitrit mit 6% der Aktivität des Wildstamms. Die Nitrit-Reduktase-Aktivität betrug unter 3% im Vergleich zum Wildstamm. In W. succinogenes CMNCH war das NrfA-Protein durch Western-Blot-Analysen nicht nachzuweisen. 6. Um die Präparation des NrfA-Proteins und des NrfHA-Komplexes zu erleichtern und um die Präparation der Untereinheit NrfH zu ermögiichen, wurden W, succinogenes Mutanten konstruiert, die einen Hexa-Histidin-Tag an NrfA oder einen Strep-Tag II am N- oder C-terminus von NrfH tragen. Es war aber nicht möglich, den Nitrit-Reduktase-Komplex oder einzelne Untereinheiten durch entsprechende Affinitätschromatographien anzureichern.
Durch die Forschung der letzten Jahre wurde zunehmend deutlich, dass die Tumorumgebung einen starken Einfluss auf Wachstum und Progression eines Tumors ausübt. Ein Schlüsselereignis ist dabei die veränderte Expression von Wachstumsfaktoren und deren Rezeptoren im Tumor selbst oder im Tumor-Stroma und somit eine Veränderung in der Interaktion zwischen Tumor- und Stroma-Zellen. Eine solche de novo Expression der hämatopoetischen Wachstumsfaktoren G-CSF und GM-CSF konnte in der Tumorprogression humaner Plattenepithelkarzinome der Haut ausschließlich im Tumorgewebe hochgradig maligner, schnell und invasiv wachsender und metastasierender Tumore mit einer ausgeprägten Vaskularisierung nachgewiesen werden (Mueller & Fusenig 1999). Um die Wirkung von G-CSF und GM-CSF getrennt analysieren zu können, wurde eine benigne Keratinozyten-Zelllinie, die die Rezeptoren für G-CSF und GM-CSF exprimiert, nicht jedoch die Faktoren selbst, mit G-CSF oder GM-CSF transfiziert. Die Konsequenz der Faktorexpression wurde in je 2 transfizierten Zelllinien in vitro und in vivo analysiert. Beide Faktoren wirkten autokrin stimulierend auf die Tumorzell-Proliferation und Migration in vitro. Darüber hinaus induzierte GM-CSF die Expression von IL-6 in Tumorzellen, welches dann wiederum die Expression von GM-CSF verstärkte. Untersuchungen der transfizierten Zelllinien in vivo demonstrierten einen deutlichen Beitrag von G-CSF und GM-CSF zur Tumormalignisierung. So ergab die subkutane Injektion der G-CSF exprimierenden Zellen in die Nacktmaus nach einer Latenzzeit von 50 Tagen schnell und invasiv wachsende Tumore mit ausgeprägter Vaskularisierung, während GM-CSF exprimierende Zellen nur ein transientes Tumorwachstum zeigten. Subkutane Injektion von Gemischen der G-CSF mit den GM-CSF transfizierten Zellen demonstrierten eine frühere Häufung der Tumorbildung in Abhängigkeit von der Höhe der GM-CSF Produktion durch die eingesetzte Zelllinie. Die in vivo Progression mittels Rekultivierung von Tumorgewebe der mit G-CSF transfizierten Zellen resultierte in Zellen, die ein sehr schnelles und aggressives Tumorwachstum ohne Latenz zeigten. Diese Progression war assoziiert mit einer de novo Expression von GM-CSF, was auf einen synergistischen Effekt beider Faktoren hinweist. Für die Progressions fördernde Wirkung von G-CSF und GM-CSF spielt neben der autokrinen Stimulation der Tumorzellen vor allem die parakrine Beeinflussung des Tumor-Stromas eine Rolle. Die Analyse der Kinetik der Tumor-Stroma Interaktionen im Oberflächentransplantat ergab eine deutlich schnellere und stärkere, zum Tumor hin gerichtete permanente Angiogenese in den G-CSF exprimierenden Zellen. Diese setzte in den durch in vivo Passage entstandenen, G-CSF und GM-CSF positiven Zellen deutlich früher ein. Die Faktor negativen parentalen Zellen und die mit GM-CSF transfizierten Zellen wiesen dagegen nur eine transiente Angiogenese auf. Die Rekrutierung neutrophiler Granulozyten in die Tumorumgebung war bei allen transfizierten Zelllinien beschleunigt, blieb jedoch bei GM-CSF exprimierenden Zellen wie auch bei den parentalen und Kontroll transfizierten Zellen transient, während G-CSF exprimierende und G-CSF und GM-CSF ko-exprimierende Zellen eine anhaltende Rekrutierung zeigten. Die Analyse der Kinetik der Makrophagen-Rekrutierung ergab eine deutliche Beschleunigung nur in den GM-CSF exprimierenden und den G-CSF und GM-CSF ko-exprimierenden Zellen. Die sehr frühe Gegenwart von Makrophagen in Transplantaten der GM-CSF positiven Zellen ohne die Präsenz von Granulozyten deutet im Zusammenhang mit der sehr unregelmäßigen und blasigen Epithelbildung und dem nur transienten Tumorwachstum dieser Zellen nach subkutaner Injektion auf eine durch Makrophagen ausgeübte frühe Anti-Tumor Immunität hin. Als Schlüsselenzyme der Tumorinvasion und Angiogenese wurde weiterhin die Expression Matrix degradierender Enzyme, der Matrix Metalloproteinasen, in Tumor und Stroma untersucht. Dabei konnte mit zunehmender Tumorprogression eine ansteigende Expression von MMP-2 in Tumoren, von MMP-13 in Tumor und Stroma und von MMP-3 und MMP-9 im Tumor-Stroma in direkter Nähe zum Tumor festgestellt werden, wobei die Proteasen eine der Tumor-Invasion vorangehende Deposition am Rand invasiver Bereiche des Tumors zeigten. Ein Teil der stromalen (murinen) MMP-9 positiven Zellen konnte über Immunfluoreszenz-Färbungen als neutrophile Granulozyten identifiziert werden. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass die Ko-Expression von G-CSF, GM-CSF und ihren Rezeptoren in humanen Plattenepithelkarzinomen der Haut einen wesentlichen Beitrag zur Tumorprogression zu einem hochmalignen Tumor-Phänotyp leistet. Dies geschieht zum einen durch eine autokrine Stimulation von Proliferation und Migration der Tumorzellen. Zum anderen stimulieren diese Faktoren parakrin die Induktion einer Tumor fördernden stromalen Umgebung und tragen so zu verstärktem Tumorwachstum und Invasion bei.
In der vorliegenden Arbeit sollte das basolaterale Targeting des Transmembranproteins shrew-1 in polarisierten Epithelzellen analysiert werden. Es konnte gezeigt werden, dass die cytoplasmatische Domäne von shrew-1 mehrere spezifische basolaterale Sortingmotive enthält. Die Funktionalität dieser Motive wurde anhand Mutationsanalysen von Schlüsselaminosäuren untersucht. Substitution dieser Aminosäuren führt zu einer apikalen Lokalisation von shrew-1 in polarisierten MDCK Zellen. Durch Analyse der Proteinverteilung von shrew-1 Varianten in polarisierten LLC-PK1 Zellen wurde deutlich, dass das Sorting von shrew-1 in die basolaterale Plasmamembran ein AP-1B-abhängiger Prozess ist. Außerdem konnte mittels Coimmunopräzipitation eine Interaktion zwischen shrew-1 und der Untereinheit my1B aus dem Adapterproteinkomplex AP-1B nachgewiesen werden. Untersuchungen des Targetings von shrew-1 Varianten in polarisierten MDCK und LLCPK1 Zellen mit Hilfe der Transzytoseexperimente zeigten, dass die apikal lokalisierte Mutante shrew-1-NTD5 auf dem Weg zur apikalen Membranregion, trotz fehlender Sortinginformation, die basolaterale Plasmamembran durchquert. Durch Inhibition der Membranfusion mittels Tanninsäure konnte zusätzlich gezeigt werden, dass die Passage der basolateralen Plasmamembran für das Targeting von sowohl shrew-1 als auch von shrew-1-NTD5 essentiell ist. Die Beobachtungen des Turnovers von shrew-1 in der Plasmamembran von lebenden Zellen zeigten, dass shrew-1 aktiv endozytiert wird und dass nachfolgend ein Recycling des Proteins zur Plasmamembran stattfindet. Anhand der durchgeführten Untersuchungen lässt sich zusammenfassend ein Targetingmodell für shrew-1 in polarisierten Epithelzellen aufstellen, das ein postendozytotisches Sorting beschreibt: Dabei wird shrew-1 zunächst in Post-Golgi-Carriern auf unbekanntem Weg zur basolateralen Plasmamembran gebracht, wo seine unmittelbare Internalisierung und ein Weitertransport zum Recyclingendosom stattfinden. Der im Recyclingendosom lokalisierte und am Sorting beteiligte Adapterproteinkomplex AP-1B vermittelt dann den Rücktransport von shrew-1 zur basolateralen Plasmamembran.
Organismen besitzen die Fähigkeit sich Temperaturerniedrigungen anzupassen, wobei über die molekularen Mechanismen der Kälteadaptation wenig bekannt ist. Für die Untersuchung dieser Mechanismen stellt die Bäckerhefe Saccharomyces cerevisiae ein ausgezeichnetes Modellsystem aufgrund der einfachen Struktur und der Möglichkeit zur genetischen Manipulation dar. In dieser Arbeit wurde die transkriptionelle Antwort von S. cerevisiae auf Kälte mit Hilfe von DNA Chips (6330 ORFs) charakterisiert, wobei Proben von Hefekulturen mit einer Inkubationsdauer von 10 und 30 min, 2, 12 und 60 h bei 10°C verwendet wurden. 634 Gene reagierten mit einer signifikanten Expressionsänderungen auf den Kälteeinfluss, wobei zwei distinkte Phasen, definiert als frühe und späte Kälteantwort, identifiziert wurden. Vergleiche der Kälteantwort mit Expressionsdaten verschiedener Umweltstressbedingungen ergaben differentielle Expressionsmuster. Im Vergleich zu anderen Stressreaktionen zeigten Gene der frühen Kälteantwort entweder ein entgegengesetztes Expressionsmuster (“inverser Hitzeschockeffekt”) oder keine transkriptionelle Reaktion. Dieser Effekt kehrte sich während der späten Kälteantwort in eine allgemeine Stressantwort um. Messungen des Trehalose- und Glykogengehalts sowie Studien mit einer in der Stressinduktion beeinträchtigten Doppelmutante Δmsn2/Δmsn4 bei 10°C zeigten, dass die allgemeine Stressantwort ein Teil der späten Kälteantwort ist. Dagegen deuten die Daten der frühen Kälteantwort auf eine Kälte-spezifische Reaktion hin, wobei Anpassung der Membranfluidität sowie RNA-Modifikation eine essentielle Rolle spielen. Im Zusammenhang mit der Untersuchung der Kälteanpassung in S. cerevisiae wurde der ORF YBR255W mit unbekannter Funktion, dessen Deletion einen Kälte-sensitiven Wachstumsdefekt besitzt, auf molekular-biologischer und biochemischer Ebene charakterisiert. Die transkriptionelle Reaktion einer Δybr255w-Mutante bei Kälte (10ºC) wurde mit den Expressionsdaten des Wildtyps verglichen und zeigte starke Veränderungen während der frühen Kälteantwort, wobei nach 2 Stunden der größte Expressionsunterschied zum Wildtyp beobachtet wurde. 65% der Gene der frühen Kälteantwort zeigten YBR255Wabhängige Veränderungen, darunter Gene des Zellzyklus, des Zellwachstums und der Zelldifferenzierung. Interaktionsstudien auf genetischer und Proteinebene ergaben, dass Ybr255p mit einer Komponente des „Mitotic Exit Network“ und Komponenten des PKC1-Wegs interagiert. Die Überexpression von Ybr225p zeigte drastische Veränderungen der Zellmorphologie, wie sie ebenfalls für Mutanten des „Mitotic Exit Network“ beschrieben sind. Zusammengenommen mit der transkriptionellen Reaktion der Δybr255w-Mutante auf Kälte deuten diese Ergebnisse auf eine essentielle Rolle von Ybr255p im Zellzyklus bei Kälte hin.
The heat stress (hs) response is universal to all organisms. As the cell senses increase in temperature, heat stress transcription factors (Hsfs) are activated to upregulate the expression of a number of genes encoding heat stress proteins (Hsp) which act as molecular chaperones to protect cells against heat damages. In higher plants, the phenomenon seems to be unusually complex both at the level of Hsfs and Hsps (e.g., 21 Hsf encoding genes in Arabidopsis and at least 17 in tomato). Upon prolonged hs, another characteristic property of plant cells is the assembly of large cytosolic aggregates called heat stress granules (HSG), which are composed of Hsps, HsfA2, RNA and RNA-binding proteins. The present work was aimed to understand plant hs response using tomato as a model system. To study the function of tomato Hsfs in their native system, we generated transgenic tomato lines altered in expression of HsfA1, HsfA2, and HsfB1. Tomato plants with 10-fold overexpression of HsfA1 (OE plants) were characterised by integration of a single HsfA1 expression cassette, whereas the plants harbouring a tandem inverted repeat (IR) of the cassette showed cosuppression of HsfA1 (CS plants). The lack of HsfA1 expression in CS plants results from posttranscriptional gene silencing connected with the formation of small interfering RNA (siRNA). Under normal growth conditions, major developmental features were similar for wild-type (WT), OE and CS plants. However, in contrast to the former two, CS plants and fruits were extremely sensitive to elevated temperature because hs-induced synthesis of major chaperones and Hsfs was strongly reduced or lacking. Despite the complexity of the plant Hsf family, the function of tomato HsfA1 is unique as master regulator of induced thermotolerance. On the other hand, maintenance of essential chaperones in CS plants during seed development suggests involvement of other Hsfs and/or transcription factor(s). HsfB1 and HsfA2 transgenic tomato plants, unaffected in thermotolerance, further supported the function of HsfA1 as the major factor regulating hs-inducible genes. Hs87 independent phenotypes of plants with altered expression of HsfB1 indicates developmental role of this Hsf. Using transient reporter assays with mesophyll protoplasts from WT tomato, we demonstrated that plasmids encoding Hsfs A1, A2 and A3 were well expressed which could function as activators for reporter gene expression. However, in protoplasts derived from CS plants, plasmids encoding HsfA2 and HsfA3 were normally expressed but even higher amounts of HsfA1 expression plasmids were completely silenced. Therefore, silencing of HsfA1 in CS plants was also reproduced in its mesophyll protoplasts. Lacking thermotolerance in CS protoplasts could be restored after transformation with expression plasmids encoding functionally equivalent HsfA2 or HsfA3 resulting in (i) expression of chaperones, (ii) survival of the cells at otherwise lethal temperature, (iii) thermoprotection of firefly luciferase, and (iv) assembly of heat stress granules (HSGs). The strong silencing caused by an IR in CS plants opened the possibility of a broad use of RNAi for gene knock-down also in the transient system of mesophyll protoplasts. Using this technology, we attempted to dissect essential components of thermotolerance and HSG assembly. We demonstrated the previously reported function of chaperones such as Hsp70 and Hsp101, and could discriminate the in vivo chaperone functions of different isoforms of Hsp20 and Hsp70 proteins. Hsp17-CI, Hsp70 (hs-inducible isoforms), and Hsp101 are absolutely essential chaperones for thermotolerance in plants. Furthermore, the results also show that despite Hsp17-CI and -CII being major components of HSG complexes, they are dispensable for assembly of these complexes. Based on these results, it is proposed that in the transient protoplast system an approach with gene-specific IRs can be used to discriminate functions of closely related isoforms among protein-families and to dissect complex protein networks.
In der vorliegenden Arbeit wurde das Insektenzellen /Baculovirus-System für die heterologe Expression der NTPDase6 etabliert. Nach der Herstellung und Selektion des NTPDase6-positiven Baculovirus wurden drei Insektenzelllinien hinsichtlich der optimalen Expressions-bedingungen für die NTPDase6 analysiert. In Sf9(+Serum)-, Sf9(-Serum)- und High FiveTM-Zellen wurde eine Expression und Sekretion des aktiven Enzyms nachgewiesen. Ferner konnte durch die Analyse mit PNGaseF eine partielle N-Glykosilierung experimentell gezeigt werden. Die Aktivität im Kulturüberstand übertraf generell die Aktivität in der löslichen Zellfraktion. Die höchste GDPase-Aktivität war mit 22,96 nmol Pi /(106 Zellen x min) nach 6 Tagen im Kulturüberstand der SF9(-Serum)-Zellen zu verzeichnen. Nachdem die Erntequelle sowie der Erntezeitpunkt feststanden, wurden in den folgenden Experimenten verschiedene chromatographische Verfahren für eine Reinigung der NTPDase6 analysiert. Eine Bindung der NTPDase6 konnte für die Chromatographie mit Con A-Sepharose 4B, Q Sepharose Fast Flow, Reactive Red 120-Agarose, Reactive Green 19-Agarose, Cibacron Blue 3GA-Agarose und die Reactive Brown 10-Agarose verzeichnet werden. Hingegen wurde eine nur partielle Bindung der NTPDase6 für die Reactive Yellow 86-Agarose, Reactive Blue 4-Agarose und die Ni2+-NTA-Agarose nachgewiesen. Nicht oder kaum NTPDase6-bindend waren die CM Cellulose, GDP-Agarose, Protino Ni-TED und BD TALON. Ebenfalls analysiert wurde die Größenausschluss-Chromatographie mit Sephacryl S-100 HR unter verschiedenen Bedingungen. Für das finale Reinigungsschema wurde die Con A-Sepharose 4B-Chromato-graphie aufgrund der geringen Kosten und des großen Volumens als erster Reinigungsschritt eingesetzt. Als zweite Phase der sequentiellen Reinigung wurde die Cibacron Blue 3GA-Agarose ausgewählt, da in der Pilotstudie über die Reaktivfarbstoffe mit diesem Material die höchste Elution der GDPase-Aktivität beobachtet werden konnte. Für den dritten Schritt wurde aufgrund der hohen Trennschärfe die Ni2+-NTA-Agarose verwendet. Insgesamt wurde mit diesen drei Schritten eine 180 fache, partielle Reinigung der NTPDase6 erreicht. Es erwies sich, dass die erhaltene Proteinmenge für die geplanten Röntgenstrukturanalyse und die Elektronenspin-Resonanz-Spektroskopie nicht ausreichte. Als weitere Möglichkeit für die Untersuchung des angereicherten Enzyms stand die MALDI-TOF-Analyse zur Verfügung. In diesen Untersuchungen wurde die Aminosäuresequenz zu 43,9 % verifiziert und es ergaben sich Hinweise darauf, dass die potenzielle N256-Glykosilierungssstelle bei der heterologen Expression in Insektenzellen nicht genutzt wird. Weiterhin wurden die potenziellen N-terminale Signalpeptide und Spaltstellen der NTPDase6 in silico mit Hilfe des SignalP 3.0-Algorithmus analysiert. Diese Untersuchungen ergaben putative Spaltstellen an den Aminosäurepositionen L25 und A40 mit einer Wahrscheinlichkeit von 37 % und 7 %. Mit Triton X-114-Separationen wurde ferner nachgewiesen, dass 60,7 % der NTPDase6 in der Zelle in löslicher Form und 39,3 % in membrangebundener Form vorliegen. Die hier erbrachten Nachweise einer putativen N-terminalen Spaltstelle und der intrazellulären Spaltung des hydrophoben Signalpeptides deuten darauf hin, dass es sich bei der Sekretion des Proteins um einen physiologischen Vorgang handelt. Es ist wahrscheinlich, dass die gleichzeitige Lokalisation des Enzyms im Golgi-Apparat und im Kulturüberstand einen physiologisch relevanten Mechanismus darstellt und das Enzym extra- sowie intra-zellulär für die Hydrolyse von 5’-Nukleosid-Diphosphaten verantwortlich ist. Im zweiten Teil der Arbeit wurde die Lokalisation der NTPDase6 in vivo untersucht. Dazu wurden NTPDase6-Antikörper hergestellt und mit Hilfe von Immunoblots sowie in der Immunzytologie charakterisiert. Es konnte gezeigt werden, dass die NTPDase6-Antikörper nur in der Immunzytologie verwendet werden können. Zur Untersuchung der zellspezifischen Expression der NTDPase6 wurden anschließend immunhistologische Analysen am adulten Rattengehirn durchgeführt. Markierte Zellen präsentierten sich z.B. im gesamten Kortex des Gehirns, im Gyrus dentatus des Hippokampus, im Corpus striatum und im Septum. Die markierten Zellen zeigten eine organelläre Fluoreszenz im Bereich des Zellkerns, die eine Markierung von Golgi-Stapeln vermuten lässt. Nur in Zellen mit einem großen Nukleus, bei welchen es sich um große Nervenzellen handeln dürfte, konnte die beschriebene Fluoreszenz nachgewiesen werden. Diese Markierungen als NTPDase6-spezifisch zu beurteilen ist jedoch schwierig, da die Präimmunkontrollen eine schwache, organelläre Fluoreszenz im Bereich des Zellkerns von Zellen mit einem großen Nukleus aufwiesen. Insgesammt liefern die Untersuchungen einen neuen Beitrag zum Verständnis der Struktur und der Prozessierung der NTPDase6 sowie ein Verfahren zur heterologen Expression und zur anschließenden partiellen Aufreinigung des Enzyms.
Traditionell-morphologisch begründete Hypothesen zur Großphylogenie der Metazoa sind im Verlauf der letzten Jahre durch molekularbiologische Untersuchungen grundsätzlich in Frage gestellt worden. Die molekularbiologisch begründete Metazoen-Großphylogenie wird seit einem Übersichtsartikel von ADOUTTE et al. (2000) meist als „New Animal Phylogeny“ bezeichnet (kurz: NAP); sie beinhaltet eine Restrukturierung des Stammbaumes (kladogenetischer Aspekt) und die Infragestellung einer morphologischen Komplexitätssteigerung nach dem Schema acoelomat-pseudocoelomat-coelomat (anagenetischer Aspekt). Hinsichtlich der Kladogenese steht die Neueinteilung der Bilateria in drei Superphyla Deuterostomia, Ecdysozoa und Lophotrochozoa im Vordergrund; die Genealogie innerhalb dieser drei Großgruppen ist aber z.Z. relativ schlecht aufgelöst, so daß sich Vergleichsmöglichkeiten mit morphologischen Vorgängermodellen schnell erschöpfen. Aus diesem Grunde wird in vorliegender Arbeit der anagenetische Aspekt als Ausgangspunkt für eine umfassende morphologische Interpretation der molekularbiologischen Resultate gewählt. Momentan wird auf molekularsystematischer und vergleichend-entwicklungsgenetischer Basis davon ausgegangen, daß die frühesten Bilaterier eine acoelomate Organisation aufwiesen, von hier aus eine relativ komplexe, polymer-coelomate Organisation erwarben, welche dann aber in zahlreichen Bilaterierlinien sekundär reduziert wurde. Die ursprünglich acoelomate Organisation wird rezent nur durch eine sehr isolierte Linie, die Acoela (ggf. auch Nemertodermatida) vertreten, während alle anderen Bilaterier von einem polymer-coelomaten „Urbilaterier“ abstammen sollen. In vorliegender Arbeit wird die Auffassung vertreten, daß die morphologische Deutung eines solchen anagenetischen Szenarios am ehesten anhand der Hydroskelett-Theorie von W. F. GUTMANN (1972 et mult.), sowie späteren auf diesem Entwurf aufbauenden Arbeiten (insbesondere der Gallertoid-Hypothese, BONIK et al. 1976) möglich ist, d.h. auf konstruktionsmorphologischer Grundlage. Um den Nachweis einer weitgehenden Übereinstimmung von NAP und Gallertoid-Hydroskelett-Theorie zu führen, werden für 36 Metazoenbaupläne (4 Nonbilaterier, 32 Bilaterier) aktuelle molekularphylogenetische Befunde den jeweiligen konstruktionsmorphologischen Interpretationen gegenübergestellt. Für die vier Nonbilateria-Linien ergibt sich eine Vereinbarkeit auf kladogenetischer Ebene insbesondere dann, wenn die Placozoa vor den Porifera abzweigen (z.Z. aufgrund von mtDNADaten anzunehmen); auf anagenetischer Ebene aufgrund von Studien, welche die „Diploblastica/ Triploblastica“-Unterteilung in Frage stellen (Mesoderm-Problem). Für die Bilateria ist u.a. festzuhalten, daß im Rahmen der Hydroskelett-Theorie kein Schwestergruppenverhältnis Annelida + Arthropoda angenommen wurde, so daß die umstrittene neue Großgruppe Ecdysozoa unproblematisch ist: Ecdysozoa werden durch Ableitung der „Aschelminthen“ von polymeren Vorformen einer Deutung zugänglich. Die Molekularsystematik der Annelida, aber auch der Deuterostomia ist mit konstruktionsmorphologischen Interpretationen vereinbar, bei den Deuterostomia v.a. der hochderivierte Status der Pterobranchia und Tunicata. Als kennzeichnendste Übereinstimmung ist die Einordnung der Tentaculata als hochabgeleitete Protostomier hervorzuheben, was sowohl als „Grundstein“ der NAP gilt (HALANYCH et al. 1995) als auch eine sehr spezifische Position der Hydroskelett-Theorie darstellt. Es wird gefolgert, daß die Gallertoid- Hydroskelett-Theorie zentrale Resultate der NAP besser zu integrieren vermag als andere Entwürfe. Konsequenzen für merkmalsmorphologische Deutungen werden aufgezeigt.
Background Cryptic species are two or more distinct but morphologically similar species that were classified as a single species. During the past two decades we observed an exponential growth of publications on cryptic species. Recently published reviews have demonstrated cryptic species have profound consequences on many biological disciplines. It has been proposed that their distribution is non-random across taxa and biomes. Results We analysed a literature database for the taxonomic and biogeographical distribution of cryptic animal species reports. Results from regression analysis indicate that cryptic species are almost evenly distributed among major metazoan taxa and biogeographical regions when corrected for species richness and study intensity. Conclusion This indicates that morphological stasis represents an evolutionary constant and that cryptic metazoan diversity does predictably affect estimates of earth´s animal diversity. Our findings have direct theoretical and practical consequences for a number of prevailing biological questions with regard to global biodiversity estimates, conservation efforts and global taxonomic initiatives.
Isolation des Carotinoidbiosynthese Genclusters aus Flavobacterium spec P99-3. Das isolierte Gencluster von 15 kb Größe zeigt 7 offene Leseraster, die auf Grund ihrer Sequenzhomologie Carotinoidgenen zugeordnet werden können oder anhand von Komplementationen in einem heterologen Expressionssystem in E. coli mit anschließender HPLC-Analayse eine eindeutige Funktion im Biosysnthesewegs des selten vorkommenden Myxols zugeordnet werden kann.
Obwohl für eine Vielzahl von Chemikalien Ergebnisse aus Standardtest vorliegen, gibt es relativ wenige Erkenntnisse über generationsübergreifende Substanzeffekte und die Auswirkungen von Chemikalien auf die genetische Diversität. Im Rahmen der vorliegenden Dissertation werden generationsübergreifende Effekte des Modellschadstoffes Tributylzinn (TBT) bei drei subakuten Konzentrationen (4,46; 6,69 und 8,93 mikro g Sn/kg TG) auf Life-Cycle-Parameter und genetische Diversität der Zuckmücke Chironomus riparius untersucht. Dabei wird eine genetisch variable (GEN+) und eine genetisch verarmte (GEN-) Populationen betrachtet. Darüber hinaus wird das Anpassungspotential an den Stressor TBT abgeschätzt. Die genetische Variabilität von C. riparius wird mittels neu entwickelter Mikrosatellitenmarker bestimmt. Dabei werden geringfügige Längenunterschiede zwischen hochvariablen DNA-Fragmenten detektiert. Weiterhin werden Abweichungen vom Hardy-Weinberg-Gleichgewicht bestimmt. Für die Ermittlung von potentiellen Anpassungsprozessen an den Stressor TBT werden nach ausgewählten Generationen akute und chronische Anpassungstest durchgeführt. Um der Fragestellung nachzugehen, ob eine TBT-Vorexposition zu einer veränderten Sensitivität gegenüber einem Zweitstressor führt, werden Experimente mit Cadmium durchgeführt. Auch in den Zweitstressorstudien wird der Multigenerationsansatz gewählt, und es werden Life-Cycle-Experimente über drei weitere Generationen durchgeführt. Für die Experimente werden die mit 4,46 und 8,93 mikro g Sn/kg TG vorexponierten Tiere anschließend nach unterschiedlicher Generationenzahl einer umweltrelevanten Cadmiumkonzentration (1,2 mg/kg TG) ausgesetzt. Im Verlauf der Multigenerationsstudie mit 4,46 mikro g Sn/kg TG werden in beiden Populationen signifikante Effekte auf die Entwicklung und Reproduktion beobachtet. In den ersten Generationen ist der Schlupfzeitpunkt der Larven bei TBT-Exposition signifikant (p < 0,05, t-Test) verzögert. Die Reproduktion scheint ebenso ein sensitiver Parameter zu sein, wobei die Weibchen der genetisch variableren Population signifikant (p < 0,05, t-Test) größere Gelege in den späteren Generationen produzieren. Die niedrige TBT-Konzentration hat in beiden Populationen keinen signifikanten Effekt auf die durchschnittliche Populationswachstumsrate. In den letzten Generationen der Studie wird für die genetisch variablere Population eine Veränderung des Lebenszyklus festgestellt, wobei die Weibchen eine erhöhte Reproduktionsleistung aufweisen. Es werden keine Effekte auf die Heterozygotie festgestellt. Allerdings treten in beiden Populationen zahlreiche Abweichungen vom Hardy-Weinberg-Gleichgewicht auf. Weiterhin werden signifikante (Pearson-Korrelation, p < 0,05) Effekte der genetischen Diversität auf zahlreiche Life-Cycle-Parameter (Gelegeanzahl pro Weibchen, Gelegegröße) ermittelt. In den chronischen und akuten Anpassungsexperimenten gibt es deutliche Hinweise auf Adaptationsprozesse gegenüber dem Stressor TBT. In der TBT-Studie mit 8,93 mikro g Sn/kg TG werden in beiden Populationen signifikante Effekte auf zahlreiche Life-Cycle-Parameter festgestellt, wobei die Entwicklung und Reproduktion der Tiere negativ beeinflusst wird. Darüber hinaus werden in der genetisch variableren Population signifikante (p < 0,05, X2-Test) Effekte von TBT auf die genetische Diversität beobachtet. Diese nimmt im Verlauf der Studie ab. Nach der vierten Generation gibt es in der genetisch variableren Population Hinweise auf Anpassungsprozesse, die allerdings in den letzten Generationen nicht mehr nachzuweisen sind. Ähnlich wie in der ersten Multigenerationsstudie wird auch in dieser Studie ein signifikant (Pearson-Korrelation, p < 0,05) positiver Zusammenhang zwischen der genetischen Diversität und der Populationswachstumsrate bei TBT-Exposition festgestellt. In den Zweitstressorexperimenten wird der Effekt der Vorbelastung bei der genetisch variableren Population deutlich. Die mit 8,93 mikro g Sn/kg TG über neun Generationen exponierte Population reagiert dabei empfindlicher auf den Stressorwechsel als die dazugehörige Referenzpopulation. Innerhalb der Multigenerationsstudien werden zahlreiche Effekte der Organozinnverbindung TBT auf Life-Cycle-Parameter und die genetische Diversität von C. riparius deutlich. Diese Dissertation zeigt die hohe Bedeutung von Mehrgenerationenstudien für die Abschätzung und Bewertung eines Risikopotentials von Schadstoffen.
Ahnenforschung unter sozialen Amöben : die morphologische Taxonomie muss umgeschrieben werden
(2007)
Seit fast 150 Jahren forschen Wissenschaftler aus aller Welt über den faszinierenden Wechsel zwischen Einzelligkeit und Vielzelligkeit im Lebenszyklus der »zellulären Schleimpilze«. Diese Forschung war bisher so erfolgreich, dass einem Vertreter der zellulären Schleimpilze, Dictyostelium discoideum, vom US-amerikanischen Gesundheitsministerium National Institutes of Health (NIH) ganz offiziell der Status eines Modellorganismus für biomedizinische Forschung verliehen wurde. Obwohl wir inzwischen glauben, viel über die »sozialen Amöben«, die sich bei Nahrungsmangel von Einzellern zu einem vielzelligen Verband zusammenlagern, gelernt zu haben, basiert unser Wissen doch fast ausschließlich auf Arbeiten mit der einen Art D. discoideum. Man kennt allerdings heute mehr als 100 Arten sozialer Amöben. Alle bilden multizelluläre Fruchtkörper aus, die aus Stielen und Sporenpaketen bestehen. Bisher ging man davon aus, dass die Spezies mit azellulären Stielen in ihren Fruchtkörpern phylogenetische Vorläufer der Vertreter mit zellulären Stielen sind, und dass die Vertreter mit verzweigten Fruchtkörpern näher mit sich selbst als mit den anderen sozialen Amöben verwandt sind. Diese Hypothesen wurden nun durch aktuelle molekulargenetische Analysen widerlegt.
Expeditionen ins Pilzreich Panamas : Pionierarbeit in einer der artenreichsten Regionen unserer Erde
(2007)
Als Bindeglied zwischen Nord- und Südamerika ist Panama ein »Biodiversitäts-Hotspot« – es beherbergt eine außerordentlich hohe Artenvielfalt an Pflanzen, Tieren und Pilzen. Pilze übernehmen in tropischen Ökosystemen wichtige Aufgaben: Sie zersetzen totes organisches Material, helfen den Pflanzen bei der Aufnahme von Wasser und Mineralstoffen aus dem Boden, und sie leisten sogar als Parasiten einen Beitrag zum Erhalt einer großen Artenvielfalt. Aufgrund einzelner Stichproben wissen wir, dass die Anzahl der Pilzarten in den Tropen diejenige der Pflanzen um ein Vielfaches übertrifft. Doch während für Panama zirka 9500 verschiedene Arten von Gefäßpflanzen bekannt sind, zählt eine im Rahmen unserer Arbeit erstellte Checkliste der Pilze nur zirka 1800 Arten. Das zeigt, dass für die Erforschung der Pilze noch umfangreiche Pionierarbeit geleistet werden muss. Zwischen 2003 und 2006 geschah dies im Rahmen einer Universitätspartnerschaft der Universität Frankfurt mit der Universidad Autónoma de Chiriquí, die durch den Deutschen Akademischen Austauschdienst (DAAD) gefördert wurde. Im Zentrum eines Projekts der Deutschen Forschungsgemeinschaft (DFG) steht die Erforschung der Vielfalt und Ökologie pflanzenparasitischer Pilze. Des Weiteren untersucht unsere Arbeitsgruppe Pilze an Insekten sowie an menschlichen Haut- und Nagelläsionen.
Im Jahr 1991 trat das Abkommen zur Erhaltung der in Europa und den außereuropäischen Arealstaaten vorkommenden Populationen der Arten der Säugerordnung Chiroptera in Kraft (EUROBATS: The Agreement on the Conservation of Populations of European Bats). Zuvor waren die Säuger allgemein schon in dem „Übereinkommen zur Erhaltung der wandernden wildlebenden Tierarten“ in Anhang II (Oktober 1985) aufgelistet. Auch in der Liste der in Deutschland vorkommenden Arten der Anhänge II, IV und V der FFH-Richtlinie (92/43/EWG) sind alle einheimischen Fledermausarten (Anhang II und IV) erwähnt. Für die Erhaltung der Fledermäuse ist der Schutz wichtiger „Stätten“ (z. B. Zwischenquartiere, Winterschlafquartiere, Wochenstubenquartiere) unumgänglich. Die Erhaltung und der Schutz, sowohl der Quartiere als auch der Futterplätze, vor Beschädigung oder Beunruhigung sind nach diesem Abkommen sicherzustellen. Diese Arbeit über die Stoffwechseldaten soll klarstellen, wie wichtig der Schutz der Fledermausquartiere - vor allem im Winter – ist. Der Energieverbrauch und die Anpassung der einheimischen Arten an Umgebungstemperaturen (Ta) soll mit Messwerten untermauert und mit der tropischen Art Carollia perspicillata verglichen werden. Weiterhin ist es Ziel dieser Arbeit, einen alternativen Versuchsaufbau zu entwickeln, der die Berechnung der Stoffwechselrate (SWR) ohne das Fangen der Tiere ermöglichen soll. Mit Hilfe einer IR-Kamera sollen Bilder von der Körperoberflächentemperaturverteilung und gleichzeitig Stoffwechselmessungen gemacht werden. Da die Körpertemperatur (Tb) und die SWR bei den einheimischen Fledermausarten direkt voneinander abhängig sind (HANUS 1959), könnte diese Methode hier angewandt werden. Nach der Erstellung einer Datenbank (SWR/IR-Bild) kann dann nur durch die IR-Bilder Rückschlüsse auf die SWR gezogen werden. Bei nordamerikanischen Arten konnte bestimmt werden, dass mindestens 75 % der Energiereserven, die eine Fledermaus für den Winterschlaf zur Verfügung hat, während der Aufwachphasen verbraucht werden (THOMAS et al. 1990). Eine Störung im Winterquartier führt zum Erwachen der Tiere. Nach einem Aufwachvorgang sind die Abstände des Wiedererwachens zunächst kürzer. Je kürzer die Fledermäuse im Torpor sind, desto schneller wachen sie auf. Dies verstärkt die Aufwachwahrscheinlichkeit und die damit verbundene Kettenreaktion, je öfter die Störungen auftreten (THOMAS et al. l.c.). Dies führt zu einem zusätzlichen Energieverbrauch. Der Einfluss einer Störung ist noch bis zu 8 h später in einem Winterquartier durch erhöhte Flugaktivität zu bemerken (THOMAS 1995). Dies lässt sich daraus erklären, dass die Tiere, die aufgewacht sind und aktiv sind, andere Fledermäuse durch ihre Aktivität aufwecken (Berührung, Wärme, Reproduktionsverhalten etc.). Dies soll nun auch für einheimische Arten überprüft werden. Aus den vorliegenden Erkenntnissen und den eigenen Messergebnissen sollen dann folgende weitere Fragen beantwortet werden: - Warum besteht die Notwendigkeit die Winterquartiere vor Störungen zu schützen? Welche tatsächliche Bedeutung haben Störungen im Winterquartier auf die Energetik der Fledermäuse? - Wie viel Energie verbrauchen die Fledermäuse im Sommer in Abhängigkeit von der Ta? - Gibt es Unterschiede zwischen der SWR der tropischen Art Carollia perspicillata und den einheimischen Arten? Die Vergleichbarkeit der Ergebnisse ist durch identische Messbedingungen gewährleistet. - Lassen sich aus den SWR unterschiedliche Abhängigkeiten (Körpermasse (bm), Ta etc.) ableiten? - Hat die Nahrung den erwarteten Einfluss auf den RQ-Wert? Die Stoffwechseldaten sind deshalb so wichtig, da man damit zeigen könnte, welch extremer Ressourcenverlust für die Fledermaus mit einer Störung verbunden ist. Die Notwendigkeit des Schutzes der Fledermäuse vor Störungen im Quartier, sowohl der Sommer-, als auch die Winterquartiere, wäre dann mit Messdaten belegt. Die Unterschiede in der Abhängigkeit der SWR von der Ta, der bm, der Ernährungsform und der Tb sowohl im Wachzustand als auch im Torpor, soll für verschiedene Arten geklärt werden.
Die Verarbeitung von Informationen im zentralen Nervensystem beruht auf dem Zusammenspiel von erregender und hemmender Neurotransmission. Die Übertragung von Signalen zwischen Neuronen erfolgt chemisch über die Ausschüttung von Neurotransmittern an spezialisierten Kontaktstellen, den Synapsen. Glyzin und gamma-Aminobuttersäure (GABA) sind die bedeutendsten inhibitorischen Neurotransmitter im zentralen Nervensystem von Säugern, welche Rezeptoren vom Glyzin- (GlyR) und GABAA-Typ (GABAAR) aktivieren. Diese ligandengesteuerten Ionenkanäle sind in postsynaptischen Membranen angereichert und mit intrazellulären Proteinen assoziiert. Die Rekrutierung der Rezeptoren in postsynaptischen Domänen ist ein an das zytoplasmatisch lokalisierte Protein Gephyrin gekoppelter Prozess. So bindet Gephyrin spezifisch an die intrazelluläre Domäne der beta-Untereinheit des GlyR (GlyR beta) und bildet für die Verankerung des Rezeptors ein gerüstartiges Netzwerk unterhalb der synaptischen Membran. Die gezielte Inaktivierung des Gephyrin-Gens führt in Mäusen zu einem postnatal letalen Phänotyp und zu dem Verlust der synaptischen Anreicherung des GlyR und bestimmter GABAA-Rezeptoren auf zellulärer Ebene. Gephyrin ist ein 93 kDa großes Protein, das nicht nur im zentralen Nervensystem (ZNS), sondern auch in anderen Organen wie Leber und Niere exprimiert wird, in denen es an der Synthese des Molybdän-Kofaktors von Oxido-Reduktasen beteiligt ist. Das Gephyrin-Protein wird durch 30 Exons codiert, von denen zehn als sogenannte Kassetten alternativ gespleißt werden können. Die bestuntersuchte Spleißvariante besitzt 736 Aminosäuren und ist in eine N- und eine C-terminale Domäne (Aminosäuren 1-181 bzw. 318-736) sowie eine zentrale Linker-Domäne unterteilt. Die N- und die C-terminalen Bereiche von Gephyrin sind den Proteinen MogA und MoeA aus E. coli homolog und werden daher auch als G-Domäne (N-terminal) bzw. E-Domäne (C-terminal) bezeichnet. In kristallographischen Untersuchungen wurde gezeigt, dass die G- und E-Domänen zur Tri- bzw. Dimerisierung befähigt sind. Diese speziellen Oligomerisierungseigenschaften der beiden Gephyrindomänen bilden wahrscheinlich die Grundlage für die Entstehung von Gephyrin-Clustern sowie eines hexagonalen Gephyrin-Gerüstes. Dieses Gerüst stellt den Verknüpfungspunkt zwischen Rezeptoren und dem Zytoskelett dar und ermöglicht somit die effiziente Clusterbildung und die zielgerichtete Anordnung einer großen Anzahl inhibitorischer Rezeptoren. In der vorliegenden Arbeit sollten die Rolle dieser beiden Domänen bei der Bildung membranassoziierter Gephyrinaggregate und die molekularen Mechanismen der Clusterbildung des Gephyrinmoleküls untersucht werden. Zu diesem Zweck wurden durch zielgerichtete Mutagenese unterschiedliche Gephyrin-Mutanten hergestellt, um die Fähigkeit der Oligomerisierung der G- und E-Domäne gezielt zu modifizieren. Dadurch sollte die Bedeutung der Oligomerisierung hinsichtlich der Aggregat- bzw. Clusterbildung untersucht werden. Außerdem sollten die Wechselwirkungen zwischen Gephyrin und anderen Proteinen und deren Einfluss auf die synaptische Lokalisation analysiert werden. Für diese Untersuchungen wurden auf der Basis von Röntgenstruktur-Daten spezifische Aminosäurereste an den bei der Oligomerisierung beteiligten Kontaktstellen ausgetauscht. In der G-Domäne wurden zu diesem Zweck vier separate Aminosäuren des Trimer-Interface durch Arginin ersetzt (GephRRRR). Analog hierzu wurden in der EDomäne einzelne Aminosäuren durch Arginin bzw. Glutamat substituiert (GephRER), um dadurch eine Dimersierung zu verhindern. Für die Kassette C5’ wird angenommen, dass deren Vorhandensein die Interaktion zwischen Gephyrin und GlyR beeinträchtigt, wodurch GlyR aus GABAergenen Synapsen ausgeschlossen wird. Daher wurde der Einfluss dieser Gephyrin-Spleißvariante (GephC5’), die zu einer Peptidinsertion innerhalb der G-Domäne führt, und einer Gephyrin-Mutante (Gephmut), die den Verlust der Wechselwirkung mit dem GlyR bedingt, auf die Aggregatbildung von Gephyrinoligomeren untersucht. Bei dem Konstrukt Gephmut wurden, basierend auf Daten von Röntgenstrukturuntersuchungen, neun Aminosäuren (713-721) am Cterminalen Ende der E-Domäne durch den homologen Bereich des bakteriellen MoeA Proteins aus E. coli ersetzt. Zunächst wurden die einzelnen isolierten Domänen mittels Gelfiltration hinsichtlich ihres Oligomerisierungsverhaltens untersucht. Die Mutationen wurden hierzu in verkürzte Proteine eingeführt, bei denen nur die G- bzw. die E-Domäne exprimiert wurden. Diese Konstrukte wurden daher als GRRRR, GC5’ bzw. ERER und Emut bezeichnet. Bei diesen zeigte sich, dass die G-Domäne des Gephyrin-Wildtyps zu trimeren Proteinkomplexen oligomerisiert. Im Gegensatz hierzu war die Mutante GRRRR nicht in der Lage, Trimere zu bilden. Das Einfügen der C5’-Kassette führte ebenfalls zu einer Störung der Trimerisierung. Gelfiltrationsexperimente mit der E-Domäne ergaben, dass die mutierte Domäne ERER, im Gegensatz zum Wildtyp-Konstrukt, keine Dimere ausbildet. Bisherige Studien haben jedoch gezeigt, dass das Emut Polypeptid zur Dimerisierung befähigt ist. Das Oligomerisierungsverhalten des kompletten Gephyrin-Proteins wurde mittels blauer nativer Gelelektrophorese (BN-PAGE) analysiert. Für die hier beschriebenen Untersuchungen mit BN-PAGE wurde rekombinantes Gephyrin in Xenopus laevis Oozyten heterolog exprimiert. Die Analyse ergab, dass Wildtyp Gephyrin nativ als Hexamer vorliegt, welches durch ansteigende Konzentrationen des Detergenzes Natriumdodecylsulfat (SDS) in Trimere, Dimere und Monomere zerfällt. Sowohl GephRRRR und GephC5’ liegen nativ fast ausschließlich als Dimere vor, während GephRER nur trimere Aggregate formt. Die entsprechende Doppelmutante mit Mutationen in Gund E-Domäne war wie erwartet nur noch als Monomer existent. Die als Kontrolle eingesetzte Glyzinrezeptor-Bindungsmutante Gephmut bildete, ebenso wie der Wildtyp, Hexamere aus. Daraus folgt, dass die Oligomere der G- bzw E-Domäne Zwischenprodukte der Hexamerbildung darstellen. Die Analyse der Oligomerisierungseigenschaften der Mutanten wurde nachfolgend in humanen embryonalen Nierenzellen (HEK 293T) untersucht. Nach heterologer Expression von Wildtyp Gephyrin in HEK 293T-Zellen formen sich große, charakteristische Gephyrinaggregate. Die Oligomerisierungs-Mutanten GephRRRR, GephRER und GephC5’ aggregierten jedoch nicht, sondern waren diffus im Zytoplasma verteilt. Die wiederum als Kontrolle eingesetzte Bindungsmutante Gephmut hingegen wies eine normale Aggregation auf. Diese Ergebnisse bestätigen die grundlegende Rolle der Oligomerisierung von G- und E- Domänen für die Aggregatbildung von Gephyrin. Mittels GST-Pulldown und Kolokalisationsanalysen in HEK Zellen wurde die Wechselwirkung der Gephyrinmutanten mit der GlyR beta, dem Motorkomplexprotein Dynein light chain-1 (Dlc-1) und dem Guanin-Nukleotid-Austauschfaktor Collybistin (Cb) untersucht. Beide Ansätze weisen darauf hin, dass die Trimerisierung der G-Domäne an der Interaktion von Gephyrin mit Dlc-1 und die Dimerisierung der E-Domäne bei der Bindung an GlyR beta und Cb beteiligt ist. Die Mutante Gephmut zeigte in beiden Fällen einen totalen Verlust der Bindungsfähigkeit sowohl an das GlyR beta Bindungsmotiv als auch an Cb. Der Einbau der C5’ Kassette in Gephyrin scheint jedoch nicht dessen Bindung an den GlyR zu beeinflussen. Für die Analyse der Clusterbildung und des zielgerichteten Transports in Neuronen wurden Wildtyp und mutiertes Gephyrin in hippocampalen und spinalen Primärkulturen der Ratte exprimiert. Zur Überprüfung einer synaptischen Lokalisation wurde Gephyrin gemeinsam mit dem vesikulären inhibitorischen Aminosäure-Transporter (VIAAT), einem präsynaptischen Marker-Protein, detektiert. In beiden Kulturen wies Gephyrin eine punktartige Verteilung in den Neuriten auf und wurde gezielt an Synapsen angereichert. Im Kontrast dazu zeigten alle Oligomerisierungsmutanten, GephRRRR, GephC5’ und GephRER keine Ausbildung von Clustern sondern eine diffuse Verteilung im Zellkörper und in Dendriten. Das Konstrukt Gephmut wies jedoch Clusterbildung und eine punktförmige Verteilung auf. Diese Daten belegen, dass die Oligomerisierung der G- wie auch der E-Domänen für die Clusterbildung und synaptische Lokalisation von Gephyrin unerlässlich ist. Die Wechselwirkung mit dem GlyR und/oder Collybistin ist ebenfalls für die Anreicherung in der Synapse erforderlich, nicht jedoch für die Bildung der Gephyrin-Cluster. Die dargestellten Ergebnisse belegen die Rolle der spezifischen Oligomerisierungseigenschaften der G- und E-Domäne für die Ausbildung des hexagonalen Gephyringerüstes und dessen grundlegende Bedeutung für die spezifische Anreicherung von Gephyrin an inhibitorischen Synapsen in Neuronen.
Background The cell cycle of all organisms includes mass increase by a factor of two, replication of the genetic material, segregation of the genome to different parts of the cell, and cell division into two daughter cells. It is tightly regulated and typically includes cell cycle-specific oscillations of the levels of transcripts, proteins, protein modifications, and signaling molecules. Until now cell cycle-specific transcriptome changes have been described for four eukaryotic species ranging from yeast to human, but only for two prokaryotic species. Similarly, oscillations of small signaling molecules have been identified in very few eukaryotic species, but not in any prokaryote. Results A synchronization procedure for the archaeon Halobacterium salinarum was optimized, so that nearly 100% of all cells divide in a time interval that is 1/4th of the generation time of exponentially growing cells. The method was used to characterize cell cycle-dependent transcriptome changes using a genome-wide DNA microarray. The transcript levels of 87 genes were found to be cell cycle-regulated, corresponding to 3% of all genes. They could be clustered into seven groups with different transcript level profiles. Cluster-specific sequence motifs were detected around the start of the genes that are predicted to be involved in cell cycle-specific transcriptional regulation. Notably, many cell cycle genes that have oscillating transcript levels in eukaryotes are not regulated on the transcriptional level in H. salinarum. Synchronized cultures were also used to identify putative small signaling molecules. H. salinarum was found to contain a basal cAMP concentration of 200 uM, considerably higher than that of yeast. The cAMP concentration is shortly induced directly prior to and after cell division, and thus cAMP probably is an important signal for cell cycle progression. Conclusions The analysis of cell cycle-specific transcriptome changes of H. salinarum allowed to identify a strategy of transcript level regulation that is different from all previously characterized species. The transcript levels of only 3% of all genes are regulated, a fraction that is considerably lower than has been reported for four eukaryotic species (6% - 28%) and for the bacterium C. crescentus (19%). It was shown that cAMP is present in significant concentrations in an archaeon, and the phylogenetic profile of the adenylate cyclase indicates that this signaling molecule is widely distributed in archaea. The occurrence of cell cycle-dependent oscillations of the cAMP concentration in an archaeon and in several eukaryotic species indicates that cAMP level changes might be a phylogenetically old signal for cell cycle progression.
Koalas are popular zoo animals, but difficult in husbandry. In addition to their specialised diet of eucalyptus leaves, they are prone to “stress” and disease. Particularly in European zoos, themonitoring of theirwell-being has high priority and they are protected from possible stressors. However, stress signs in koalas are vague and monitoring techniques like weighing might result in discomfort itself. Additionally, husbandry routines are planned according to keeper’s schedule, not to the endogenous rhythms of the koalas. Therefore it is necessary to investigate activity pattern in captive koalas and the signals influencing them. These signals have to be assessed on the strength and quality of their impact. A total of 17 koalas have been observed in three zoological gardens in Australia and Europe. Koalas kept in outdoor enclosures with little human contact (Koala Walkabout, Taronga Zoo, Sydney) showed a uniform activity pattern, which was clearly entrained by light. Activity levels were higher during the night, and there was a pronounced resting period in the morning which corresponds with low body temperature measured by Degabriele and Dawson (1979). Activity peaks were related to twilight and changed during the year related to day lengths. However, there was a clear influence from the introduction of fresh browse which resulted in a distinct feeding peak in the afternoon. With short day lengths, this stimulus competed with dusk. Activity patterns from koalas in indoor enclosures (Zoo Duisburg, Vienna Zoo) varied between individuals and in some cases lacked a detectable rhythm. Though activity peaks were related to light, entrainment to sunlight was weak. In winter, koalas reacted primarily to the artificial light, but some also showed activity peaks related to sunlight. Activity patterns in these koalas were less structured and differed severely from patterns expected according to literature. Activity was often related to the keeper’s presence and food introduction. Frequency of feeding bouts was considerably higher at Vienna Zoo compared to the other zoos and the bouts were shorter in duration. Time budgets of the koalas were within the range given in free-range studies. Feeding showed seasonal changes and was increased in lactating females. Koalas at Vinna Zoo had a high level of locomotor activity compared to the size of the enclosure. Koalas at Koala Walkabout were not used to handling, so they resisted the keeper. The koalas at the two European zoos were handled regularly and settled down quickly. However, handling took place in the morning; in most koalas, there was no activity prior to it. In Vienna, resting periods were interrupted daily due to weighing. Food introduction at KoalaWalkabout took place in the afternoon. It was preceded by locomotor activity and triggered a long feeding bout in the koalas. It is not clear, whether food had true Zeitgeber properties or masked the endogenous rhythm. In the two European zoos, food was introduced in the morning. The peaks related to this were smaller than those at Koala Walkabout. Activity was rarely observed prior to food introduction. The koalas at Koala Encounter, Taronga Zoo (Sydney),were regularly confronted with visitors, though no contact was allowed. Direct observation by the keepers did rarely show any stress signs. Activity patterns at night were strikingly similar to Koala Walkabout, but differed dramatically during the day. Food was introduced three times a day, which usually resulted in activity that interrupted a resting period. Generally, the koalas at Koala Encounter were more active than those at KoalaWalkabout. They also displayed a high level of locomotor activity, especially on the ground, which is an accepted sign of discomfort in koalas (Wood 1978; Zoological Society of San Diego 2001; Yusuf& Rosenthal unpublished data). In summary, this chronoethological study of the captive koalas showed that there are several problems with koala husbandry. Artificial light regimes for koalas are not sufficient for entrainment and result in unstructured activity pattern. This is especially the case in winter, when the day in Europe is artificially extended. Due to the mainly nocturnal behaviour of koalas, such an extension might not be necessary and therefore should be avoided. Handling in Europe took place during the physiological resting time of the koalas. Interruptions of resting times are considered as stressors (Wood 1978) and should be avoided. Handling in the afternoon would be more suitable for the koalas and triggered activity in the two koalas at Vienna Zoo. It is also arguable if daily weighing is necessary to monitor health in captive koalas or if the frequent interruption of resting countervail the advantages of constant monitoring. Frequent contact with visitors, evenwithout the so-called cuddling, has a considerable impact on activity patterns and time budget of koalas, even if no immediate stress signs are displayed. Such contact should therefore be reduced to a minimum and chronoethological observations of the koalas should be used. A study on koalas with direct visitor contact is also advisable to revise the current legislation on “koala cuddling”. Koalas frequently rested in living trees if they had access to it. Since no food-poisoning has been reported from koalas using living non-food trees, the provision of living trees with an appropriate canopy should be included in the husbandry guidelines. Increased locomotor activity has been shown to be related to conditions of discomfort or stress and possibly to oestrus. This is in accordance with literature (Wood 1978; Zoological Society of San Diego 2001). Further observation, combined with hormone analysis, are advisable to establish this parameter for evaluation of well-being. Chronoethology has proven to be useful for the evaluation of husbandry conditions and group dynamics. Different to other, traditional ethologicalmethods, it indicated problems and enabled me to advise more appropriate times for handling and food introduction. It is desirable that zoos already using 24-hour video observation include chronoethological aspects into their analysis.
Anhand einer osmotischen Auffschlussmethode für B. subtilis konnte ohne Zugabe von Detergenzien erreicht werden, dass die beiden Modifikationsproteine SpaB und SpaC in löslicher Form vorliegen. Demzufolge handelt es sich bei dem Subtilin-Synthetase-Komplex nicht um einen starren membranständigen Komplex, sondern um eine transiente Assoziation der SpaB/C-Proteine mit dem Transportprotein SpaT während der Modifikationsreaktion. Durch Interaktionsstudien mit heterolog produzierten Subtilinpräpropeptid (SubHAHis) konnte eine spezifische Interaktion mit dem löslichen SpaC-Protein gezeigt werden. Komplementationsversuche zeigten, dass der DspaC amyE::spaS-Stamm durch das SpaCsowie das EriC-, jedoch nicht durch das NisC-Protein komplementiert wird. Ebenfalls ist ein C-terminal verkürztes bzw. verlängertes SpaC-Protein nicht in der Lage ist, Subtilin richtig zu modifizieren. Mit Hilfe einer in vitro Mutagenese der ligandierenden Aminosäuren Cystein 303, Cystein 349 und Histidin 350 konnte gezeigt werden, dass das Zink-Ion des SpaC-Proteins an der katalytischen Reaktion beteiligt ist. Beim Ausschalten der Aminosäuren Histidin 212 und Tyrosin 304 konnte ebenfalls ein Ausfall der Subtilinproduktion beobachtet werden. Es wäre denkbar, dass beide Aminosäuren in einer Säure/Base-Reaktion bei der Subtilinmodifikation involviert sein könnten. Die Aminosäure Tryptophan 302 hingegen bildet mit dem C-terminalen ALL-Motiv des Proteins ein hydrophobes Cluster, was eine Rolle beider Elemente in Stabilisation des Reaktionszentrums und Substratbindung nahe legt. Für das SubHAHis konnte gezeigt werden, dass es von der Modifikationsmaschinerie akzeptiert und auch produziert wird, jedoch entsteht ebenfalls ein Heterodimer zwischen dem SubHAHis und den Modifikationsproteinen SpaB und SpaC, an dessen Formation der Hexa-Histidin-Tag maßgeblich beteiligt ist. Eine mögliche Heterodimerformation im Subtilinproduzenten ATCC 6633 konnte unter bestimmten Bedingungen ebenfalls nachgewiesen werden, was auf eine mögliche kovalente Zwischenstufe bei der Lanthioninbrückenbildung hinweist. Des Weiteren konnte durch in vitro Mutagenese-Studien gezeigt werden, dass die katalytische Reaktion des SpaC-Proteins an der Heterodimerformation beteiligt ist. Das SpaC-SubHAHis Heterodimer konnte erfolgreich angereichert und mittels Peptidmassenkartierung eindeutig als kovalentes Heterodimer zwischen den beiden Proteinen identifiziert werden. Diese Ergebnisse zeigen, dass bei der Modifikation des Subtilinpräpropeptids durch das SpaC-Protein eine transiente kovalente Bindung zwischen dem Präpropeptid und dem SpaCProtein ausgebildet wird. Die Bildung eines möglichen Heterodimers zwischen SpaC und dem Subtilinpräpropeptid konnte ebenfalls unter bestimmten Bedingungen beim Wildtyp nachgewiesen werden. Dieser Befund legt nahe, dass es sich bei der Heterodimerbildung um eine katalytische Zwischenstufe bei der Modifikation des Präpropeptids durch das SpaC handeln könnte, welches durch die Anwesenheit des Hexa-Hisitidin-Tags arretiert wird. Neben dem bekannten Subtilinproduzenten B. subtilis ATCC 6633 konnten weitere Stämme der W23-Untergruppe der Spezies B. subtilis als Subtilinproduzenten identifiziert werden, was impliziert, dass ein Merkmal der W23-Gruppe die Produktion von Subtilin ist und diese als Biomarker dienen könnte. Des Weiteren konnte beobachtet werden, dass ein um die Aminosäuren Glycin und Serin C-terminal verlängertes Subtilin (Subtilin-GS) eine gesteigerte Subtilin-Autoinduktion hervorruft. Durch die Zugabe von Mangan zu einer Subtilin-Produzierenden Kultur konnte ebenfalls gezeigt werden, dass das Mangan alleine einen steigernden Einfluss auf die Induktion des PspaB-Promotors besitzt, während eine gesteigerte Aktivität des PspaS-Promotors nur bei der gleichzeitigen Anwesenheit von Subtilin beobachtet werden konnte. Durch die gezielte Zugabe von Mangan und Subtilin-GS ist es dementsprechend möglich, eine erhöhte Autoinduktion und somit eine erhöhte Produktion an Subtilin zu erreichen.
Das aktuell diskutierte Modell der lichtabhängigen Magnetrezeption bei Vögeln beschreibt, dass die Richtung des Erdmagnetfelds durch Radikalpaarprozesse in spezialisierten Photorezeptoren wahrgenommen wird. Dabei werden Cryptochrome, eine Klasse photoaktiver Flavoproteine, als potentielle Kandidaten für das Radikalpaarmodell und damit als mögliches Magnetrezeptormolekül diskutiert. Verhaltensbiologische Experimente mit Zugvögeln zeigen, dass der Magnetrezeptionsprozess offensichtlich stark lateralisiert im rechten Auge stattfindet und dass dieser Prozess Licht aus dem blau-grünen Teil des Spektrums benötigt. Cryptochrome absorbieren Licht in diesem Bereich und besitzen darüber hinaus biochemische Eigenschaften, die für die Funktion des Radikalpaarmodells entscheidend sind. Vor dem Hintergrund dieser Überlegungen habe ich untersucht, ob Cryptochrom (CRY) in der Retina des Rotkehlchens, Erithacus rubecula, einem nachtziehenden Singvogel, zu finden ist. Mit molekulargenetischen Methoden konnte ich erstmals drei individuell exprimierte Cryptochrome aus der Rotkehlchenretina isolieren: Erithacus (e)-CRY1a, -CRY1b und -CRY2. Während eCRY1a und eCRY2 fast vollständig homolog zu Cryptochrom 1 und 2 in der Retina des Haushuhns sind, besitzt eCRY1b eine noch unbeschriebene C-terminale Domäne, die auf neue Proteinbindungseigenschaften und Interaktionspartner hindeutet. Die Identifizierung eines Kernlokalisierungssignals bei eCRY2 weist auf dessen Lokalisierung im Zellkern hin und macht seine Funktion als sensorischer Lichtrezeptor eher unwahrscheinlich. Ein mit Hilfe der Aminosäurensequenz erstelltes Proteinmodell von eCRY1 zeigt, dass dieser Typus zwei Cofaktoren besitzt: das katalytische Chromophor Flavinadenindinukleotid (FAD) und das lichtsammelnde Pterin Methenyltetrahydrofolat (MTHF). eCRY1a und eCRY1b sind Spleißprodukte des gleichen Gens; ihre C-terminalen Domänen sind auf unterschiedlichen Exonen codiert. eCRY1a und eCRY1b besitzen beide keine Membranbindedomäne und liegen zytosolisch vor. Weil jedoch laut Radikalpaartheorie die magnetosensitiven Rezeptoren zumindest im Moment der Photonenabsorption in einer bestimmten Anordnung und Raumrichtung vorliegen müssen, benötigen beide eCRY1-Varianten daher mindestens einen sphärisch fixierten Interaktionspartner. In meiner Arbeit diskutiere ich Opsine als mögliche Partner, da diese in den Aussensegmenten der Photorezeptoren stark geordnet und in konstanter Raumrichtung vorliegen. Die Genexpression von eCRY1a und eCRY1b unterscheidet sich sowohl zwischen den Augen als auch zwischen den CRY-Varianten. Im Mittel waren die Expressionswerte von eCRY1a in der Rotkehlchenretina fünf- bis zehnmal höher als die von eCRY1b. In der Dämmerung und nachts ist eCRY1a im linken Auge signifikant höher exprimiert als im rechten Auge. Im Gegensatz dazu ist die Expression von eCRY1b in beiden Augen gleich, zeigt jedoch einen signifikanten Anstieg zu Beginn des Zuges in der Dämmerung. Durch die unterschiedlichen Expressionsraten von eCRY1a und eCRY1b verschiebt sich zum Zeitpunkt der Richtungsentscheidung des Vogels in der Dämmerung das Verhältnis zwischen den beiden Cryptochrom1-Varianten im rechten Auge zugunsten von eCRY1b. Die Ergebnisse meiner Expressionsstudie deuten darauf hin, dass die in Verhaltensversuchen nachgewiesene Lateralisation des Magnetkompass bereits auf Rezeptorebene in der Retina beginnen könnte. mRNA in situ- als auch immunohistochemische Untersuchungen dieser Arbeit zeigen, dass bei Zugvögeln sowohl die mRNA als auch die Proteine beider eCRY1-Typen in den Innensegmenten der retinalen Photorezeptoren lokalisiert sind. Die räumliche Nachbarschaft zu Opsinen unterstützt die Annahme einer möglichen Interaktion zwischen diesen und Cryptochrom. Darüber hinaus lässt dieser Befund Spekulationen zu, dass die neuronale Verarbeitung der aus den Photorezeptoren stammenden magnetischen Richtungsinformation analog zum bildverarbeitenden Sehen stattfinden könnte. Modelle für eine mögliche Verschaltung und Signalverarbeitung der Cryptochromsignale werden in dieser Arbeit diskutiert. Insgesamt unterstützen die Befunde meiner Arbeit die im Radikalpaarmodell diskutierte Annahme, dass Cryptochrome eine entscheidende Rolle bei der Perzeption von magnetischer Kompassinformation bei Zugvögeln spielen und möglicherweise als Magnetrezeptormoleküle fungieren. Darüber hinaus könnten die Ergebnisse einen wichtigen Beitrag zu einem besseren Verständnis des Gesamtprozesses der Magnetrezeption bei Tieren leisten, und zwar von der Rezeptorzelle bis zur Verhaltensantwort. Meine Ergebnisse tragen möglicherweise auch dazu bei, die bekannten neurowissenschaftlichen und funktionell morphologischen mit den entsprechenden ethologischen Ergebnissen zu verknüpfen. Ich würde es sehr begrüßen, wenn meine Arbeit zu weiterführender Forschung auf diesem spannenden Gebiet anregt und zu einem besseren Verständnis der noch unbekannten Aspekte der Magnetrezeption beitrüge.
Tens of thousands of man-made chemicals are in regular use and discharged into the environment. Many of them are known to interfere with the hormonal systems in humans and wildlife. Given the complexity of endocrine systems, there are many ways in which endocrine-disrupting chemicals (EDCs) can affect the body’s signaling system, and this makes unraveling the mechanisms of action of these chemicals difficult. A major concern is that some of these EDCs appear to be biologically active at extremely low concentrations. There is growing evidence to indicate that the guiding principle of traditional toxicology that “the dose makes the poison” may not always be the case because some EDCs do not induce the classical dose–response relationships. The European Union project COMPRENDO (Comparative Research on Endocrine Disrupters—Phylogenetic Approach and Common Principles focussing on Androgenic/Antiandrogenic Compounds) therefore aims to develop an understanding of potential health problems posed by androgenic and antiandrogenic compounds (AACs) to wildlife and humans by focusing on the commonalities and differences in responses to AACs across the animal kingdom (from invertebrates to vertebrates).
Polyploidy is common in higher eukaryotes, especially in plants, but it is generally assumed that most prokaryotes contain a single copy of a circular chromosome and are therefore monoploid. We have used two independent methods to determine the genome copy number in halophilic archaea, 1) cell lysis in agarose blocks and Southern blot analysis, and 2) Real-Time quantitative PCR. Fast growing H. salinarum cells contain on average about 25 copies of the chromosome in exponential phase, and their ploidy is downregulated to 15 copies in early stationary phase. The chromosome copy number is identical in cultures with a twofold lower growth rate, in contrast to the results reported for several other prokaryotic species. Of three additional replicons of H. salinarum, two have a low copy number that is not growth-phase regulated, while one replicon even shows a higher degree of growth phase-dependent regulation than the main replicon. The genome copy number of H. volcanii is similarly high during exponential phase (on average 18 copies/cell), and it is also downregulated (to 10 copies) as the cells enter stationary phase. The variation of genome copy numbers in the population was addressed by fluorescence microscopy and by FACS analysis. These methods allowed us to verify the growth phase-dependent regulation of ploidy in H. salinarum, and they revealed that there is a wide variation in genome copy numbers in individual cells that is much larger in exponential than in stationary phase. Our results indicate that polyploidy might be more widespread in archaea (or even prokaryotes in general) than previously assumed. Moreover, the presence of so many genome copies in a prokaryote raises questions about the evolutionary significance of this strategy.
RNA-Interferenz (RNAi) erlangte eine herausragende Bedeutung zum Studium der Genfunktion, nachdem auch in Säugersystemen gezeigt wurde, daß durch Applikation von 21 nt langen siRNAs (small interfering RNAs) eine Sequenz-spezifische Degradierung der mRNA-Transkripte kognitiver Gene erreicht werden konnte. Im Gegensatz zur antisense-Technologie erwies sich die Wirkung von siRNA im Hinblick auf die Hemmung der Genexpression um ein Vielfaches potenter und hoch spezifisch. Für eine längerfristige Unterdrückung von Genen kristallisierte sich die Methode der Plasmid-Vektor-vermittelten intrazellulären Expression von shRNA (short hairpin RNA) heraus, welche transient oder stabil angewendet werden kann. Diese exprimierte shRNA wird intrazellulär enzymatisch zu wirksamer siRNA prozessiert, welche den eigentlichen Enzym-vermittelten RNAi-Mechanismus der Degradierung von mRNA-Transkripten kognitiver Gene auslöst. Die Anwendung von RNA-Polymerase III-abhängigen Promotoren für die stabile konstitutive Expression von shRNA stellte ein großes Problem für behandelte Zellen dar, wenn es sich bei dem zu unterdrückenden Zielgen um ein Gen mit essentiellen Funktionen für die Zelle handelte. Im Falle der Polo-like Kinase 1 (Plk1), einer in vielen Spezies hoch konservierten Serin/Threonin-Kinase mit essentiellen mitotischen Funktionen, bedeutete eine dauerhafte und stringente Unterdrückung einen veränderten Phänotyp beteiligter Zellen, welcher sich durch Defekte bei mitotischen Ereignissen bemerkbar machte. Plk1 ist in zahlreiche mitotische Prozesse, wie den Eintritt der Zellen in die Mitose, die Segregation der Chromosomen und die Aktivierung des APC/C (anaphase promoting complex / cyclosome), eingebunden. Darüber hinaus ist bekannt, daß Plk1 in nahezu allen Tumorarten überexprimiert vorliegt und die Prognose von Tumorwachstum und Metastasierungspotential über den Plk1-Gehalt definiert werden kann. Des weiteren bewirkte eine RNAi-vermittelte Unterdrückung der Plk1-Expression bei Tumorzellen eine Hemmung der Zellproliferation mit Auslösung der Apoptose. Hingegen konnte bei gesunden primären Zellen weder eine signifikante Hemmung der Proliferation noch die Auslösung der Apoptose beobachtet werden, was die große Bedeutung von Plk1 als Ansatzpunkt für eine Krebstherapie hervorhebt. Um die Funktion von Plk1 im Hinblick auf molekularbiologische Zusammenhänge besser studieren zu können, war es notwendig, den intrazellulären Plk1-Gehalt zu variieren. Im Rahmen dieser Promotionsarbeit wurden dazu induzierbare RNAi-Elemente entwickelt, mit deren Hilfe die intrazelluläre Plk1-Expression konditionell inhibiert werden konnte. Unter Verwendung des prokaryotischen Tet-Systems wurden auf Basis des RNA-Polymerase abhängigen H1-Promotors durch Insertion von einer oder zwei Operatorsequenzen (TetO) für den Tetrazyklin-Repressor (TetR) an verschiedene Orte innerhalb der Sequenz des H1-Promotors drei induzierbare Promotor-Derivate geschaffen. Die drei entwickelten H1-Promotor-Derivate wurden zur Expression von shRNA gegen Plk1 eingesetzt und in bezug auf die Auslösung der RNAi-Antwort getestet und untereinander verglichen. Zu diesem Zwecke wurde der endogene Plk1-Gehalt von HeLa-Tumorzellen auf Transkript- und auf Proteinebene bestimmt. Die Zellen wurden zuvor mit Plasmid-Vektoren für konstitutive TetR-Expression und jeweils einer der verschiedenen shRNA-Expressions-Kassetten ko-transfiziert. Als Kontrollen dienten dabei Wildtyp-H1-Promotoren, welche zur konstitutiven Expression von shRNA gegen Plk1 und einer unwirksamen Kontroll-shRNA eingesetzt wurden. Mit Hilfe des synthetischen Tetrazyklin-Analogons Doxyzyklin, welches einen potenten Aktivator für TetR darstellt, konnten die hergestellten Promotor-Derivate induziert werden, was durch einen reduzierten intrazellulären Plk1-Gehalt sichtbar wurde. Dabei fiel auf, daß alle drei Promotor-Typen unterschiedliche Eigenschaften im nichtinduzierten Zustand wie auch im induzierten Zustand unter Anwesenheit von Doxyzyklin aufwiesen. Für die Basalaktivität in Abwesenheit von Doxyzyklin (leakiness) war die relative Lage der TetO-Sequenz(en) innerhalb des Promotors verantwortlich. So veränderte die Insertion einer TetO-Sequenz in 3’-Richtung der TATA-Box die Eigenschaften des Wildtyp-H1-Promotors weniger als die Insertion einer TetO-Sequenz in 5’-Richtung der TATA-Box. Zum Studium von Plk1 als Zielgen in der Krebstherapie wurde das Proliferationsverhalten von HeLa-Tumorzellen als Antwort auf die Doxyzyklin-vermittelte Induktion der shRNAExpression unter Kontrolle eines der induzierbaren Promotoren ermittelt. Dabei konnte die Proliferation von Tumorzellen durch einen reduzierten Plk1-Gehalt, welcher durch die Doxyzyklin-induzierte Auslösung der RNAi-Antwort vermittelt wurde, erfolgreich inhibiert werden. Zur Überprüfung der Eignung entwickelter Systeme, Tumorwachstum in vivo inhibieren zu können, wurden die entwickelten RNAi-Kassetten in das Genom von TetRexprimierenden HeLa-Zellen integriert und so stabile Klone geschaffen. Stabile HeLa-Klone zur induzierbaren Expression von Plk1-spezifischer shRNA, wie auch zur induzierbaren Expression von einer Kontroll-shRNA, wurden in die gegenüberliegenden Flanken von immunsupprimierten Nacktmäusen inokuliert, um anhand von Xenograft-Modellen einen direkten Vergleich des Tumorwachstums unter gleichen äußeren Bedingungen zu ermöglichen. Einem Teil der Mäuse wurde Doxyzyklin ins Trinkwasser gegeben, während Kontrollmäuse kein Doxyzyklin verabreicht bekamen. Das Tumorwachstum von Xenograft-Tumoren, welche aus Klonen zur Expression von shRNA gegen Plk1 hervorgingen, konnte in Doxyzyklin-behandelten Mäusen um 53% auf 47% an Tag 51 nach Inokulierung der Zellen inhibiert werden. Tumoren nicht-induzierter Mäuse, sowie Tumoren aus induzierten Mäusen, welche Kontroll-shRNA exprimierten, wuchsen dagegen unverändert in gleichem Maße. Anhand der in dieser Arbeit entwickelten induzierbaren H1-Promotor-Derivate zur konditionellen Auslösung von RNAi wurden wertvolle genetische Werkzeuge geschaffen, welche für das Studium der Genfunktion eingesetzt werden können. Im Falle der Unterdrückung von Plk1 können mit ihrer Hilfe sowohl grundlegende molekularbiologische Zusammenhänge studiert als auch die Bewertung von Plk1 als Zielgen in der Krebstherapie bewertet werden. Im Gegensatz zu kürzlich entwickelten Kinase-Inhibitoren, welche auf Proteinebene gegen Plk1 gerichtet sind und aufgrund ihrer bislang nicht nachgewiesenen Spezifität verwandte Kinasen in ihrer Wirkungsweise beeinflussen könnten, ist eine RNAibasierte Strategie hoch spezifisch und verspricht eine große Relevanz für zukünftige therapeutische Ansätze. Vorraussetzung für erfolgversprechende RNAi-basierte Strategien ist eine hohe Konservierung der Sequenz beteiligter Zielgene. Im Falle von Plk1 konnte eine hohe Konservierung durch Sequenzanalyse der Plk1-Gene von 15 Mamma-Karzinomen, 11 Ovarial-Karzinomen und mehrerer Tumorzellinien bestätigt werden.
Synaptopodin is the founding member of a family of actin-associated proline-rich proteins. It is present in a subset of telencephalic dendritic spines, where it is tightly associated with the dendritic spine apparatus, a putative calcium store. Synaptopodin-deficient mice lack the spine apparatus and show deficits in long-term potentiation and spatial memory. Thus, synaptopodin appears to play a role in synaptic plasticity. In the present thesis, three major questions were addressed: (1) What is the distribution of synaptopodin and the spine apparatus in identified hippocampal neurons? (2) Is the distribution of synaptopodin affected by denervation? (3) Is synaptopodin involved in the regulation of denervation-induced spine loss? The major findings of this thesis are: (1) Immunohistochemistry in the hippocampus of wildtype and EGFP-transgenic mice revealed significant layer-specific differences in the prevalence of synaptopodin at the level of individual neurons. (2) Light and electron microscopic analysis also revealed the presence of synaptopodin in axon initial segments of cortical and hippocampal principal neurons. There, it was found to be an essential component of the cisternal organelle, a putative axonal homologue of the dendritic spine apparatus. (3) Immunohistochemistry in the rat fascia dentata before and following entorhinal deafferentation revealed changes in synaptopodin expression in denervated and non-denervated layers of the hippocampus, suggesting that the distribution of synaptopodin in hippocampal neurons is regulated by presynaptic signals. (4) The dynamics of denervation-induced spine plasticity were studied in vitro using confocal live imaging of organotypic entorhino-hippocampal slice cultures. Whereas spines were remarkably stable under control conditions, spine loss and spine formation were seen following denervation. No significant differences were observed between cultures from wildtype and synaptopodin-deficient mice, suggesting that synaptopodin is not involved in lesion-induced spine plasticity. (5) Finally, a set of transgenic mice expressing fluorescently tagged synaptopodin were generated to facilitate future experiments on the dynamics and function of synaptopodin. In summary, this thesis presents novel findings on (1) the subcellular distribution of synaptopodin in spines and the axon initial segment, (2) the molecular composition of the cisternal organelle, and (3) the dynamics of spines and the spine apparatus organelle following deafferentation in vivo and in vitro.
Since its recognition as an endothelium-derived relaxing factor, the control and consequences of nitric oxide (NO) production have been investigated intensely. We know now that NO is not simply a vasodilator or regulator of smooth muscle tone but is a potent anti-platelet agent, neuromodulator and regulator of gene expression. NO is synthesized from the amino acid Larginine by a family of enzymes termed NO synthases (NOS). The ‘endothelial’ (eNOS or NOS III) and ‘neuronal’ (nNOS, NOS I or bNOS) NOS isoforms, which were named after the tissues in which they were first identified, are expressed constitutively and are generally regulated by Ca2+/calmodulin (CaM). Endothelium-derived NO is thought to be responsible for maintaining the vasculature in an anti-atherosclerotic state and a decrease in the bioavailability of NO (a state generally referred to as endothelial dysfunction) results in “proatherosclerotic” alterations in vascular gene expression. Recently it has become clear that the activity of eNOS is largely determined by its association with regulatory proteins as well as by the phosphorylation of the enzyme on serine, threonine and possibly tyrosine residues. Moreover, the enzyme can be “uncoupled” i.e. transformed from a NO generating to a superoxide (O2-)-generating enzyme, which would be expected to attenuate vasodilator responses and enhance vascular inflammation. The aim of this thesis was to study the consequences of phosphorylation on specific serine, threonine and tyrosine residues on the activity and intracellular localisation of eNOS and in particular to determine whether a phospho-switch for eNOS uncoupling exists. eNOS is phosphorylated under basal conditions and its serine phosphorylation can be enhanced following cell stimulation with hemodynamic stimuli such as cyclic stretch and fluid shear stress as well as by hormonal stimuli such as histamine and bradykinin. Our group has previously demonstrated the importance of Ser1177 in the activation of eNOS and here I set out to determine the relative importance of phosphorylation on Ser633 and Ser114. By generating point mutants in which serine was replaced by either alanine (nonphosphorylatable mutants) or aspartate (phosphomimetic mutants) it was observed that the activity of the S633D and S114A eNOS mutants exhibited an 2-fold increase over the activity of the wild-type enzyme or either of the S633/634A or S114D eNOS mutants as determined by monitoring the conversion of L-arginine to L-citrulline. eNOS is basally phosphorylated on Thr495 and stimulation of endothelial cells with Ca2+-elevating agonists generally results in the transient dephosphorylation of this residue. The latter is essential to allow the binding of calmodulin to the enzyme and is the actually initiating step in the generation of NO. Correspondingly, the T495A eNOS mutant can be activated at lower Ca2+ and calmodulin concentrations than the T495D mutant. However, some eNOS mutants (T494A/S1177D and T495A) showed an enhanced ability to generate O2- in a NOS inhibitor-sensitive manner suggesting that the phosphorylation of the enzyme may also play a role in the uncoupling process. To determine the physiological relevance of eNOS dephosphorylation on Thr495 we assessed the consequences of treating cells with oxidised low-density lipoprotein (ox-LDL) on eNOS phosphorylation as well as on the eNOS-dependent generation of NO and O2-. Oxidised LDL concentration- and time-dependently decreased phosphorylation of eNOS on Thr495 and led to a concomitant decrease in cellular levels of cyclic GMP and an enhanced production of O2 - compared to cells treated with native LDL. Alterations in the activity of protein kinase C (PKC) were related to the change in eNOS Thr495 phosphorylation. There was not only the basal activity of PKCα inhibited by ox-LDL but the PKC activator phorbol-12-myristate-13-acetate also failed to elicit the phosphorylation of Thr495 in ox-LDL-treated endothelial cells. The dephosphorylation of eNOS on Thr495 in response to the addition of ox-LDL was not associated with an increase in the binding of calmodulin to eNOS, an association usually necessary for the activation of eNOS. Moreover, following treatment with ox-LDL for 24 hours eNOS was no longer detected at the plasma membrane but was redistributed to the cytosol indicating that ox-LDL may disrupt the eNOS signalling complex or signalosome. To date the role played by the tyrosine phosphorylation of eNOS in the regulation of its activity or intracellular association is controversial. However, during the preparation of this thesis we have been able to demonstrate a link between the tyrosine phosphorylation of eNO and the activation of the tyrosine kinases Src and PYK2. The application of fluid shear stress to endothelial cells resulted in the activation of Src and PYK2 as well as in the association of PYK2 with eNOS. Co-expression of eNOS and PYK2 led to the putative identification of Tyr657 as a potential modulatory site. Mutating eNOS at Tyr657 to Asp or Glu resulted in the localisation of the mutant eNOS predominantly in the cytoskeleton and also in a complete inactivation of the enzyme. The Y657F mutants, on the other hand, did not demonstrate any marked alteration in the activity when compared with the wild-type eNOS. However, the In conclusion, the results describe in this thesis indicate that eNOS is regulated by phosphorylation at multiple sites. Depending on the phosphorylation site involved phosphorylation can inhibit or activate NO production or even uncouple the enzyme so that it generates O2-. While the phosphor-status of eNOS on Ser114 and Ser633 influenced NO release they did not contribute to O2 - production and the dephosphorylation of Thr495 seems sufficient to uncouple eNOS. Cell treatment with ox-LDL, which is known to increase eNOS-derived O2- output was correlated with a dephosphorylation of Thr495 as well as a decrease in the activity of the kinase that phosphorylates this site i.e., PKCα. The phosphorylation status of all the eNOS serine and threonine residues studied however did not influence the ability of the enzyme to dimerise, indicating that contrary to previously published reports the eNOS dimer is highly stable in endothelial cells. The tyrosine phosphorylation of eNOS was not initially expected to play a determinant role in the regulation but rather to facilitate the docking of associated regulatory proteins. However, Tyr657 seems to play a critical role in the generation of NO as its mutation resulted in the generation of a completely inactive enzyme as well as in an apparent intracellular mislocalisation of the protein. The physiological relevance of these findings remain to be further elucidated.
Compared to all other organisms with 1 to 3 heat stress transcription factors (Hsfs) or Hsf-related factors, plants have extraordinarily large Hsf families with more than 20 Hsfs. Plant Hsfs are classified into three classes according to their oligomerization domains which is built of hydrophobic heptad repeats (HR) in two parts, HR-A and HR-B. Both parts may be immediately adjacent (class B), or they are separated by insertion of 21 (class A) and 7 amino acid residues (class C). In plant Hsf family, detailed investigations are so far limited to Hsfs A1a, A2, A3, A4d, A9, and B1. They strongly indicate functional diversification to be the main reason for the coexistence of multiple Hsfs. As an example the functional triad of HsfA1a, HsfA2, and HsfB1 is essential for all three phases of the hs response, (i) the triggering of the response by HsfA1a as master regulator, (ii) the maintenance and high efficiency of hs gene transcription by cooperation of HsfA1a with Hsfs A2 and B1, and finally, (iii) the restoration of house-keeping gene transcription during the recovery phase mediated by HsfB1 in cooperation with house-keeping transcription factors. The results presented in this thesis for Hsfs A4 and A5 open completely different aspects of functional diversification and cooperation of Hsfs. HsfA4 and HsfA5 homooligomerize and bind to corresponding HSE motifs. But in contrast to the highly active HsfA4, HsfA5 is completely inactive as transcriptional activator. Yeast two hybrid and GST pull-down techniques showed that both Hsfs have strong tendency for heterooligomerization. Using fluorescence microscopy the HsfA4/A5 heterooligomers were found to localize in the nucleus. These complexes are transcriptionally inactive due to the impairment of DNA binding. The repressor function of HsfA5 requires only its OD and no additional factors, e.g. a putative co-repressor recruited by the C-terminal domain, are involved. Evidently, the repressor effect mainly results from the interference with the oligomeric state of HsfA4b, which is essential for efficient DNA binding and activator functions. EST database search revealed that plants have a single HsfA5 and usually two A4-type Hsfs. Using bioinformatics tools, Hsfs A4 and A5 were found to be phylogenetically closely related and clearly distinct from the other members of the Hsf family. On the basis of RT-PCR and Microarray data the representatives of the A4/A5 group are well expressed in different plant tissues albeit at very different levels which change with the developmental stages and stress conditions In rice and Arabidopsis, HsfA4 functions as an anti-apoptotic factor for stress induced oxidative damages. Based on my results, I hypothesize that HsfA5 functions as a novel type of selective repressor, regulating the function of A4-type Hsfs in plants. Considering the high sequence conservation with in plant Hsf family, it is tempting to speculate that this role of Hsf4/A5 pair is a fundamental feature of the Hsf system in plants.
Die Rolle des cAMP/CREB-Signalwegs in der noradrenergen Differenzierung sympathischer Nervenzellen
(2006)
Um die sympathische Differenzierung in Abwesenheit von CREB zu untersuchen, wurden zunächst Embryonen von CREB-Null-Mäusen analysiert. In diesen Mäusen wiesen die sympathischen Ganglien an Embryonaltag E10,5 und E12 keine Unterschiede in der Differenzierung zu heterozygoten und wildtyp-Ganglien auf. Es wurde deshalb vermutet, dass die mit CREB interagierenden Transkriptionsfaktoren CREM und ATF1 den Verlust von CREB im sympathischen Ganglion funktionell kompensieren. Da Mäuse mit einem Knock-out von CREB und CREM bereits vor E10 sterben, konnte die Entwicklung sympathischer Ganglien in diesen Mäusen nicht weiter untersucht werden. Durch Immunfärbung gegen ATF1 in CREB-deletierten Mäusen und in situ-Hybridisierung gegen CREM und ATF1 wurde gezeigt, dass im Rumpf der CREB-KO-Maus keine drastische Hochregulation der Expression beider Gene stattfindet. Eine geringfügige Hochregulation konnte aber nicht ausgeschlossen werden kann. Um die cAMP/CREB-Signaltransduktion in Ganglienvorläuferzellen auszuschalten, und Kompensation durch CREM und ATF1 zu umgehen, wurden die dominant-negative Effektoren ACREB und PKA-R(I)mut verwendet. ACREB blockiert die Funktion von CREB, CREM und ATF1 (Ahn et al., 1998). Durch PKA-R(I)mut sollte die Aktivität von PKA inhibiert werden. Die Funktionalität beider Effektoren wurde in differenzierenden Zellkulturen bestätigt. Um in vivo geeignete Expression der Inhibitoren zu erzielen, wurden verschiedene Methoden des Gentransfers im Huhnembryo erprobt. Durch Infektion der Neuralplatte des Embryos mit Retroviruskonzentrat konnte frühe embryonale Expression der dominant-negativen Effektoren in Neurallleistenzellderivaten erzielt werden. Die Expression von ACREB im Embryo zeigte, dass CREB in der initialen adrenergen Differenzierung bis E4 erforderlich ist, die sympathischen Ganglien wiesen reduzierte adrenerge Genexpression auf. In späteren Embryonalstadien ist dieser Effekt nicht mehr nachzuweisen. Im Gegensatz zur Inhibition von CREB, hatte die Inhibition von PKA durch PKAR(I)mut keine Auswirkungen auf die Ganglienentwicklung in vivo. Durch pharmakologische Inhibition von PKA wurden kleinere Ganglien erzielt, ein selektiver Effekt auf die adrenerge Differenzierung wurde auch in diesem in vivo Experiment nicht beobachtet. Dies widerspricht den Hinweisen aus Zellkultur auf die selektive Funktion von PKA in der adrenergen Differenzierung. Der Befund, dass die Funktion von CREB in vivo auf die initiale adrenerge Differenzierung sympathischer Neurone beschränkt ist, und nicht für den Erhalt adrenerger Differenzierung erforderlich ist, wurde in vitro in differenzierten sympathischen Neuronen des Embryo bestätigt. ACREB und PKA-R(I)mut hatten keine bzw. nur geringe Auswirkungen auf den Anteil TH-positiver Neurone in Kulturen sympathischer Neurone aus Embryonen der Embryonaltage E7 und E12. Somit konnte erstmals in vivo eine physiologische Rolle für CREB in der Differenzierung sympathischer Neurone gezeigt werden: CREB ist für die initiale Expression von TH erforderlich.
In dieser Arbeit wurde die Verteilung von Glykolyseenzymen in Kulturzellen unter normalen und die Glykolyse stimulierenden und hemmenden Bedingungen untersucht. Die Hauptfunktion, die der Strukturbindung und -Bildung von Glykolyseenzymen zugeschrieben wird, ist das so genannte metabolite-channelling bzw. substratechannelling, also die effiziente, lokale Bereitstellung von ATP. Im Mittelpunkt dieser Untersuchungen stand Aldolase (EC 4.1.2.13). Unter allen Bedingungen liegt Aldolase, wie die meisten anderen Glykolyseenzyme gleichzeitig sowohl in strukturgebundener, als auch in gelöster Form im Cytoplasma vor. Unter normalen Kulturbedingungen wurde die strukturgebunde Aldolase an Stressfasern sowie dem fibrillären Aktin-Netzwerk des Zellkortex vorgefunden. Diese Beobachtungen wurden an fixierten Zellen gemacht; an lebenden Zellen konnte die Bindung an Stressfasern durch Mikroinjektion fluorochromierter Aldolase direkt nachgewiesen werden. Ferner wurde beobachtet, dass Aldolase selbst, unabhängig vom Vorhandensein von Aktin in der Zelle netzwerkartige Strukturen bilden kann. Das Hinzufügen von Aldolase zu in vitro polymerisierten Aktinfilamenten führte zu einer Bündelung der Aktinfilamente, die wahrscheinlich auf eine quervernetzende Wirkung dieses Enzyms zurückzuführen ist. Durch Injektionen mit Gemischen unterschiedlich markierter Glykolyseenzyme konnte gezeigt werden, dass diese Enzyme auch in gelöster Form nicht völlig homogen in den Zellen verteilt sind. In Gegenwart hoher Substratkonzentrationen wurde entdeckt, dass Aldolase in großem Ausmaß an Intermediärfilamente gebunden wird. Da dieses Verhalten zwar unabhängig von der Präparationsmethode auftrat, in vitro durch Kosedimentation aber nicht bestätigt werden konnte, ist anzunehmen, dass neben dem Substrat weitere Faktoren bei diesem Phänomen eine Rolle spielen. Die Applikation von Insulin führte zu keinerlei mikroskopisch beobachtbaren Änderungen im Bindungsverhalten der Aldolase. Dennoch konnte eine geringe Steigerung der Aktivität in der unlöslichen Fraktion des Zellproteins nachgewiesen werden. Die Mikroinjektion unphysiologisch hoher Mengen von Aldolase führte zu einem drastischen Abbau von Aktinfilamenten und Stressfasern in den injizierten Zellen. Andere Glykolyseenzyme (GAPDH, PGM, LDH und TIM) zeigten dagegen keinerlei Wirkung. Der selbe Effekt ist bereits für PFK beschrieben worden, wo er durch eine starke Assoziation der PFK mit Gelsolin hervorgerufen wird. Der Wirkungsmechanismus bei der Aldolase ist dagegen bislang nicht bekannt. Durch die Inkubation fixierter Zellen mit fluorochromierter Aldolase wurden eine große Zahl freier Bindungsstellen an Mikrotubuli entdeckt. Allerdings konnten keine Bedingungen ermittelt werden, unter denen die intrazelluläre Aldolase an Mikrotubuli bindet. Weiterhin wurde ein Experiment entworfen, um die lokale Bereitstellung von Energie in Form von ATP und metabolite-channelling nachzuweisen. Dazu wurden Monolayerkulturen durch Hemmung von Atmung und Glykolyse ATP-entleert und durch Permeabilisierung alle löslichen Bestandteile freigesetzt. Die Gabe verschiedener ATP-Konzentrationen führte in diesem Fall zu einer Kontraktion der verbleibenden Zellbestandteile, wobei die Kontraktionsgeschwindigkeit abhängig von der gegebenen ATPKonzentration war. Durch die Gabe von FBP und ADP konnte diese Kontraktion ebenfalls ausgelöst werden, was für die Konversion von ADP zu ATP wodurch ein von FBP und den strukturgebundenen Enzymen unterhaltener glykolytischen FluSS und somit metabolite-channelling nachgewiesen wurde.
Background Identification and evaluation of surface binding-pockets and occluded cavities are initial steps in protein structure-based drug design. Characterizing the active site's shape as well as the distribution of surrounding residues plays an important role for a variety of applications such as automated ligand docking or in situ modeling. Comparing the shape similarity of binding site geometries of related proteins provides further insights into the mechanisms of ligand binding. Results We present PocketPicker, an automated grid-based technique for the prediction of protein binding pockets that specifies the shape of a potential binding-site with regard to its buriedness. The method was applied to a representative set of protein-ligand complexes and their corresponding apo-protein structures to evaluate the quality of binding-site predictions. The performance of the pocket detection routine was compared to results achieved with the existing methods CAST, LIGSITE, LIGSITEcs, PASS and SURFNET. Success rates PocketPicker were comparable to those of LIGSITEcs and outperformed the other tools. We introduce a descriptor that translates the arrangement of grid points delineating a detected binding-site into a correlation vector. We show that this shape descriptor is suited for comparative analyses of similar binding-site geometry by examining induced-fit phenomena in aldose reductase. This new method uses information derived from calculations of the buriedness of potential binding-sites. Conclusions The pocket prediction routine of PocketPicker is a useful tool for identification of potential protein binding-pockets. It produces a convenient representation of binding-site shapes including an intuitive description of their accessibility. The shape-descriptor for automated classification of binding-site geometries can be used as an additional tool complementing elaborate manual inspections.
Background The connection of the variable part of the heavy chain (VH) and and the variable part of the light chain (VL) by a peptide linker to form a consecutive polypeptide chain (single chain antibody, scFv) was a breakthrough for the functional production of antibody fragments in Escherichia coli. Being double the size of fragment variable (Fv) fragments and requiring assembly of two independent polypeptide chains, functional Fab fragments are usually produced with significantly lower yields in E. coli. An antibody design combining stability and assay compatibility of the fragment antigen binding (Fab) with high level bacterial expression of single chain Fv fragments would be desirable. The desired antibody fragment should be both suitable for expression as soluble antibody in E. coli and antibody phage display. Results Here, we demonstrate that the introduction of a polypeptide linker between the fragment difficult (Fd) and the light chain (LC), resulting in the formation of a single chain Fab fragment (scFab), can lead to improved production of functional molecules. We tested the impact of various linker designs and modifications of the constant regions on both phage display efficiency and the yield of soluble antibody fragments. A scFab variant without cysteins (scFabdeltaC) connecting the constant part 1 of the heavy chain (CH1) and the constant part of the light chain (CL) were best suited for phage display and production of soluble antibody fragments. Beside the expression system E.coli, the new antibody format was also expressed in Pichia pastoris. Monovalent and divalent fragments (DiFabodies) as well as multimers were characterised. Conclusion A new antibody design offers the generation of bivalent Fab derivates for antibody phage display and production of soluble antibody fragments. This antibody format is of particular value for high throughput proteome binder generation projects, due to the avidity effect and the possible use of common standard sera for detection.
Background The Radical Pair model proposes that magnetoreception is a light-dependent process. Under low monochromatic light from the short-wavelength part of the visual spectrum, migratory birds show orientation in their migratory direction. Under monochromatic light of higher intensity, however, they showed unusual preferences in other directions or axial preferences. To determine whether or not these responses are still controlled by the respective light regimes, European robins, Erithacus rubecula, were tested under UV, Blue, Turquoise and Green light at increasing intensities, with orientation in migratory direction serving as a criterion whether or not magnetoreception works in the normal way. Results Under low light with a quantal flux of 8 times 10 to 15 power quanta s-1 m-2, the birds were well oriented in their seasonally appropriate migratory direction under 424 nm Blue, 502 nm Turquoise and 565 nm Green light, indicating unimpaired magnetoreception. Under 373 nm UV of the same quantal flux, they were not oriented in migratory direction, showing a preference of the east-west axis instead, but they showed excellent orientation in migratory direction under UV of lower intensity. Intensities of above 36 times 10 to 15 power quanta s-1 m-2 of Blue, Turquoise and Green light elicited a variety of responses: disorientation, headings along the east-west axis, headings along the north-south axis or 'fixed' direction tendencies. These responses changed as the intensity was increased from 36 times 10 to the 15 power quanta s-1 m-2 to 54 and 72 times 10 to 15 power quanta s-1 m-2. Conclusion The specific manifestation of responses in directions other than migratory direction clearly depends on the ambient light regime. This implies that although mechanisms normally providing magnetic compass information seem disrupted, processes that are activated by light still control the behavior. It suggests complex interactions between different types of receptors, magnetic and visual. The nature of the receptors involved and details of their connections are not yet known; however, a role of the color cones in the processes mediating magnetic input is suggested.
Ziel dieser Arbeit ist es, einen Überblick über die Verhaltensweisen zoolebender Zwergschimpansen (Pan paniscus Schwarz 1929) zu geben. Dabei nimmt die Beschreibung des Sozialverhaltens eine zentrale Stellung ein. Dieser Aspekt ist von besonderem Interesse, weil die Zwergschimpansen oder Bonobos durch eine regelmäßige Überflutung großer Teile ihres Lebensraumes zu einer stärker arborealen Lebensweise gezwungen sind (s. HOFW 1975) als die zweite Schiopansenart, Pan troglodytes. Das läßt neben morphologischen auch ethologische Anpassungen an ein Baumleben erwarten, und zwar sowohl in Bereichen wie Lokomotion etc.. als auch in Bezug auf das Sozialverhalten. Gerade auf diesem Gebiet aber ist unser ohnehin bruchstückhaftes Wissen über die Ethologie des Bonobo besonders gering....
Arten von Aschersonia Mont. (Anamorphe von Hypocrella spp., Clavicipitaceae, Hypocreales, Sordariomycetidae, Askomycota) parasitieren Weiße Fliegen und Schildläuse. Petch (1921) stellte eine Monographie über Hypocrella und Aschersonia vor. Seit dieser Zeit wurden einige Arten neu beschrieben und vereinzelte Artkomplexe revidiert. Die vorgestellte Arbeit ist seit rund 80 Jahren das umfassendste Werk über die Gattung Aschersonia. Hierfür wurden Proben in Kuba, Malaysia, Mexico, Panama, Taiwan und Thailand gesammelt und z.T. kultiviert. Es werden 20 Arten detailliert vorgestellt und illustriert. Die Arten sind: A. acutispora, A. aurantiaca, A. australiensis, A. badia, A. basicystis, A. blumenaviensis, A. caespiticia [A. insperata, syn. nov.], A. columnifera, A. crenulata, A. duplex, A. hypocreoidea [A. goldiana, syn. nov.; A. confluens, syn. nov.], A. marginata, A. oxystoma, A. philippinensis, die Anamorphe von H. rhombispora, A. samoensis, A. taitensis [A. aleyrodis, syn. nov.; A. placenta, syn. nov.; A. tamurai, syn. nov.], die Anamorphe von H. tubulata, A. turbinata [A. coffeae, syn. nov.] und A. viridans. Hierzu wurden auch wichtige Merkmale wie Stromataform und Konidiengröße in situ und in vitro charakterisiert. Mit anderen gültigen Beschreibungen von Arten, die nicht untersucht werden konnten, gibt es 32 Arten. Zum ersten Mal wurden ausführliche Daten über die Wirtsinsekten sowie die Trägerpflanzen berücksichtigt. Erstmals wurde die Verbreitung der Aschersonia-Arten kritisch beleuchtet. Die Funde von A. acutispora, A. basicystis, A. hypocreoidea, A. oxystoma, A. turbinata und A. viridans sind Erstnachweise für Panama. Die Funde von A. australiensis, A. hypocreoidea, A. marginata und A. tubulata sind Erstnachweise für Taiwan. Zum ersten Mal wird für Arten der Gattung Aschersonia ein dichotomer Bestimmungsschlüssel vorgestellt. Es werden drei Hypothesen zur Phylogenie der Aschersonia spp. vorgestellt: 1. Die Stellung der Aschersonia spp. innerhalb der Clavicipitaceae basierend auf Sequenzdaten des LSU-Gens: Aschersonia bildet eine schwach unterstützte Paraphylie, dabei steht A. badia basaler als die übrigen Aschersonia-Arten. 2. Die Beziehung der Aschersonia spp. zueinander: A. badia und eng verwandte Arten parasitieren ausschließlich Weiße Fliegen und stehen basal. Arten einer zweiten Gruppe parasitieren Arten der Aleurodidae und Coccidae und Arten einer dritten Gruppe parasitieren ausschließlich Arten der Coccidae. 3. Eine phylogenetische Hypothese basierend auf Sequenzdaten der ITS: Es gibt noch zu wenig Sequenzen um eine eindeutige Aussage treffen zu können.
In der vorliegenden Arbeit wurden die Glukoneogenese und der Glyoxylat-Zyklus in den humanpathogenen Hefen Candida albicans und Candida glabrata untersucht und Komponenten dieser Stoffwechselwege charakterisiert. Durch Aktivitätsmessungen konnten Homologe der Enzyme von Glukoneogenese und Glyoxylat-Zyklus in C. glabrata nachgewiesen werden, und gezeigt werden, dass ihre Aktivität einer kohlenstoffquellen-abhängigen Regulation unterliegt. Die Gene der Enzyme des Glyoxylat-Zyklus wurden mittels funktioneller Komplementation in S. cerevisiae isoliert. In S. cerevisiae unterliegen die Enzyme aus C. glabrata derselben Regulation wie die nativen Enzyme aus S. cerevisiae, was darauf hindeutet, dass die aus S. cerevisiae bekannte Regulationskaskade zumindest teilweise in C. glabrata konserviert ist. In C. glabrata konnten ferner Homologe der Transkriptionsaktivatoren Cat8p und Sip4p identifiziert werden. Beide Proteine werden nur bei Wachstum auf nichtfermentierbaren Kohlenstoffquellen gebildet und sind dann im Zellkern lokalisiert. CgCat8p und CgSip4p sind in der Lage, in einem heterologen System die Expression der Gene des Glyoxylat-Zyklus von C. glabrata kohlenstoffabhängig zu aktivieren. Im Vergleich zu ihren S. cerevisiae Homologen, unter denen Cat8p den Hauptregulator darstellt, waren beide Proteine im gleichen Maße in der Lage, ihre Zielgene zu aktivieren. Dies deutet daraufhin, dass die Regulation der Glukoneogenese und des Glyoxylat-Zyklus in C. glabrata redundanter organisiert ist als in S. cerevisiae. Auch in C. albicans konnte ein Cat8p-Homolog identifiziert werden. Das CaCat8p ist in der Lage, in einem heterologen System die Expression der Gene der Glukoneogenese und des Glyoxylat-Zyklus von C. albicans kohlenstoffabhängig zu aktivieren. Die Cat8p-vermittelte Aktivierung erfolgt dabei zumindest teilweise über Sequenzen, die einen ähnlichen Konsensus aufweisen wie die UAS/CSRE des ScCat8p. Eine Deletion von CaCAT8 in C. albicans zeigt aber keinen sichtbaren Phänotyp, was auf die Existenz eines weiteren Aktivators hindeutet. Die Stoffwechselwege der Glukoneogenese und des Glyoxylat-Zyklus sind innerhalb der Hefen konserviert. Auffällig ist allerdings dass die humanpathogenen Hefen C. albicans und C. glabrata im Vergleich zu S. cerevisiae mehrere fast gleichberechtigte Aktivatoren dieser Stoffwechselwege besitzen. Das unterstreicht die Bedeutung, die diese Stoffwechselwege für diese Hefen haben.
Durch Beobachtungen individuell farbmarkierter Meisen und Kleiber an einer Futterstelle zwischen Sommer und Frühjahr konnte erstmals die Struktur gemischter Meisenschwärme und ihre Veränderung im Jahresverlauf systematisch analysiert werden. Nur im Winter bilden sich sehr kompakte Schwärme von durchschnittlich 27 Individuen, die sich schnell fortbewegen und nur zehn bis fünfzehn Minuten an der Futterstelle verweilen. Ihr Auftreten ist sowohl mit der Tageslänge als auch direkt mit der Temperatur korreliert. Eine Erniedrigung der Temperatur führt zu einem engeren Zusammenschluß der Individuen, vor allem auch verschiedener Arten. Dieses Verhalten ermöglicht eine effizientere Nahrungssuche, weil die Individuen von den Kenntnissen der übrigen Schwarmmitglieder über Nahrungsquellen profitieren und weil sie weniger Zeit zum Sichern aufwenden müssen. Die Schwarmgröße ist jedoch nicht temperaturabhängig. Sie wächst mit der Anzahl der Individuen, die an einem Tag die Futterstelle nutzen. Demnach erweitern die Individuen im Winter ihre Aktionsräume, vermutlich aufgrund des erhöhten Nahrungsbedarfs. Dadurch begegnen sich mehr Individuen bei der Nahrungssuche und bilden größere Schwärme. Die individuelle Zusammensetzung der Schwärme verändert sich dabei ständig. Es gibt keine Gruppen fester Zusammensetzung, die auch nur tage- oder stundenweise zusammen blieben. Während die Neigung der Individuen, sich anderen Meisen anzuschließen, im Winter sehr stark ist, spielen individuelle Bindungen für die Schwarmbildung offensichtlich keine Rolle. Dieser offenen Struktur der Schwärme entsprechend, wurde bei der Kohlmeise, die den größten Anteil an den gemischten Schwärmen hatte, nur eine schwach entwickelte, nicht strikt lineare Rangordnung gefunden. Lediglich das Männchen, in dessen Brutrevier die Futterstelle lag, war allen anderen Individuen eindeutig überlegen. Territorialität beeinflußte bei Männchen und Weibchen die Aggressivität. Männchen sind aggressiver als Weibchen, jedoch nicht immer dominanter, das Alter spielt für die Dominanz keine Rolle. Männchen sind um so dominanter, je schwerer sie sind. Männchen, die bis Ende Juli im Gebiet eintreffen oder im Vorjahr schon ansässig waren, sind dominanter als Männchen, die erst ab Oktober eintreffen. Bei jungen Männchen wird die Dominanz hauptsächlich von der Aggressivität bestimmt. Die einzige nachweisbare individuelle Bindung bei Kohlmeisen in Winterschwärmen ist die Paarbindung, die im Gegensatz zu bisherigen Vermutungen bereits ab Oktober besteht. Die Wahl von Freßkumpanen ist dennoch nicht völlig beliebig. Männchen meiden einander, und Weibchen ziehen andere Weibchen als Freßkumpaninnen vor, weil sie von Männchen vom Futter verdrängt werden könnten. Bei einander bereits bekannten Brutvögeln ist dies jedoch nicht festzustellen. Männchen, die sich gegenseitig einschätzen können, meiden einander nicht grundsätzlich. Auch verpaarte Weibchen meiden bekannte Männchen nicht. Sie profitieren vielleicht auch vom Status ihres Männchens. Sowohl die schwach ausgeprägte Rangordnung als auch das Fehlen individuell aneinander gebundener Gruppen bei Kohlmeisen widerspricht der einzigen systematischen Freilanduntersuchung zur Sozialstruktur der Kohlmeise, die in einer Population der japanischen Unterart P. m. minor feste Gruppen konstanter Zusammensetzung fand. Ein selektiver Vorteil von Gruppen konstanter Zusammensetzung ist nicht zu erkennen, da keine gemeinsamen Territorien verteidigt werden und sich Individuen verschiedener Gruppen frei mischen. Die zwischenartliche Dominanzstruktur in den gemischten Schwärmen war eindeutig. Kleiber, die sich einzeln oder paarweise Meisenschwärmen anschließen, dominieren alle Meisenarten, Kohlmeisen dominieren Blau- und Sumpfmeisen. Letztere sind allen anderen Arten unterlegen. Dementsprechend bevorzugen Sumpf- und Blaumeisen Artgenossen als Freßkumpane. Kohlmeisen ziehen jedoch die schwächeren Blaumeisen ihren eigenen Artgenossen vor. Dominante Arten profitieren von der gemeinsamen Nahrungssuche mit untergeordneten Arten, weil sich die Nahrungskonkurrenz, die mit der Schwarmbildung immer verbunden ist, auf sie weniger negativ auswirkt. Als schwächste Art bleiben die Sumpfmeisen innerhalb gemischter Schwärmen meist deutlich unter sich und mischen sich nur im Winter stärker mit anderen Arten. Durch den erhöhten Nahrungsbedarf und die stark herabgesetzte Aggressivität der Individuen in dieser Zeit übersteigt dann der Vorteil großer Schwärme für die Nahrungssuche den Nachteil der Konkurrenz auch für unterlegene Individuen.
The objective of this study is the avifauna of the North American Green River Formation. Five new Green River bird species as well as several new specimens of already known species are described. * Galliformes: Gallinuloides wyomingensis EASTMAN 1900 A second specimen of the galliform Gallinuloides wyomingensis could be identified. Gallinuloides wyomingensis resembles closely Paraortygoides MAYR 1999, which is known from Messel and the London Clay. The new specimen exhibits characters such as a cup-like cotyla scapularis of the coracoid that clearly indicate that Gallinuloides is a stem-group representative of galliforms. * Eurypygidae: Eoeurypyga olsoni gen. et sp. nov. Eoeurypyga is the only fossil representative of the Eurypygidae. Eoeurypyga and the modern sunbittern Eurypyga helias share the typical long bill, the caudally situated neck and the elongated vertebrae cervicales. Additional synapomorph characters were found. The new species indicates a North American origin for the Eurypygidae. * Messelornithidae: Messelornis nearctica HESSE 1992 The original description of Messelornis nearctica was based on a single specimen. Ten new specimens, described in this study, reveal additional information. Messelornis nearctica shows the same large intraspecific size range as Messelornis cristata HESSE 1988 from Messel, the type species of the genus. * Apodidae: Wyomingcypselus pohli gen. nov. sp. nov. Wyomingcypselus pohli is the first described fossil apodiform bird for North American. Due to characters of the wing, especially the position of the processus musculi extensor metacarpi radialis, Wyomingcypselus is referrred to the Apodidae. * Trogoniformes: unnamed species The Green River birds include a poorly preserved, but apparently heterodactyl specimen, which also resembles trogons in overall appearance. * Primobucconidae: Primobucco mcgrewi BRODKORB 1970 Originally, Primobucco mcgrewi was only known from a partial skeleton consisting of the right wing. Three new specimens could be referred to the species. Primobucco mcgrewi clearly exhibits an anisodactyl foot, which makes the assignment to the zygodactyl Bucconidae highly doubtful. Instead, Primobucco mcgrewi is referrred to the Coraciiformes s.s. Thus, Primobucconidae are the first New World representatives of stem-group Coraciiformes. * ?Leptosomidae: Plesiocathartes wyomingensis sp. nov. and Plesiocathartes major sp. nov. Plesiocathartes wyomingensis and Plesiocathartes major represent the first North American record for the genus. Both species exhibit the diagnostic characters for the Leptosomidae as listed by MAYR (2002a, b). * Primoscenidae: Eozygodactylus americanus gen. et sp. nov. and unnamed species Eozygodactylus americanus is the first North American member of this taxon. Both Eozygodactylus americanus and the unnamed species show the zygodactyl foot and the large processus intermetacarpalis of the carpometacarpus, which are typical for Primoscendiae. Due to differences mainly of the humerus, it was placed in a new genus. Besides the descriptionof new species, the avifauna of the Green River Formatin was studied and compared with the avifauna of Messel. The formations show a high concordance, more than 60 % of the Green River taxa also occur in Messel. Such a high concordance is also found for mammals. This is due to the existence of two landbridges, the Thule landbridge and the de Geer landbridge, between Europe and North America during the early Eocene.
Shrew-1 wurde bei der Suche invasivitätsassoziierter Gene mittels eines DDRT-PCR-Ansatzes aus invasiven Zellen isoliert. Wie computergestützte Analysen der Sequenz ergaben, wies das bis dahin unbekannte Protein keinerlei Ähnlichkeiten mit bereits bekannten Proteinen auf und homologe Proteine wurden bisher nur in Vertebraten gefunden. Expressionsanalysen mit einem GFP-markierten shrew-1 zeigten, dass es an der basolateralen Plasmamembran lokalisiert, wo es mit dem E-Cadherin vermittelten Adhäsions-Komplex kolokalisiert. Eine Integration in diesen Komplex geschieht höchstwahrscheinlich durch direkte Interaktion mit β-Catenin. Ein weiteres Molekül das als potenzieller Interaktionspartner von shrew-1 identifiziert wurde und das in der Literatur oft als Tumorsuppressor diskutiert wird, ist Caveolin-1. Ferner konnten Überexpressionexperimente bereits zeigen, dass shrew-1 die Invasivität von HT1080-Zellen erhöhen kann. Das Ziel dieser Arbeit war es, zum einen mit Hilfe des Hefe-Split-Ubiquitin-Systems eine Interaktion von shrew-1 und Caveolin-1 zu bestätigen und zum anderen neue Interaktionspartner zu identifizieren, die helfen könnten, die Rolle von shrew-1 in invasiven Vorgängen zu erklären. Um eine mögliche Verbindung von shrew-1 und einem neuen Interaktionspartner in Bezug auf die Zellinvasivität zu untersuchen, sollten sowohl shrew-1 als auch der potenzielle Interaktionspartner mittels RNAi ausgeschaltet werden. Mit Hilfe des Split-Ubiquitin-Systems war es möglich, die Interaktion zwischen shrew-1 und caveolin-1 zu bestätigen und zu zeigen, dass diese durch die zytoplasmatische Domäne von shrew-1 vermittelt wird. Weiterhin konnte CD147 als neuer Interaktionpartner identifiziert werden. Eine Interaktion beider Proteine konnte ferner mit Hilfe des Bimolekularen-Fluoreszens-Komplementations-Systems (BIFC), des Fluoreszens-Resonanz-Energie-Transfers (FRET) und Coimmunoprezipitationen bestätigt werden. Die Interaktion von shrew-1 und CD147 scheint allerdings abhängig vom zellulären Kontext zu sein, wie die FRET-Analysen vermuten lassen. So konnte nämlich mit diesen Analysen eine starke Interaktion in MCF7-Zellen gezeigt werden, wohingegen die Interaktion in MDCK-Zellen schwächer war. Einer der auffälligsten Unterschiede dieser beiden Zelllinien im Bezug auf diese Interaktion könnte sein, dass MCF7-Zellen im Gegensatz zu MDCK-Zellen kein Caveolin-1 exprimieren. Caveolin-1 konnte seinerseits als Interaktionspartner von shrew-1 mit Hilfe des Hefe-Split-Ubiquitin-Systems bestätigt werden und andererseits wurde von einer anderen Arbeitsgruppe eine Interaktion von CD147 mit Caveolin-1 publiziert. Um dies näher zu untersuchen, wurde Caveolin-1 in MCF7-Zellen exprimiert und die FRET-Analysen in diesen wiederholt. Wie vermutet kam es zu einer Reduktion der Interaktion in Caveolin-1 exprimierenden MCF7-Zellen. CD147 ist neben vielen anderen Funktionen auch maßgeblich an der Regulation von Matrix-Metalloproteinasen beteiligt und kann somit die Invasivität von Zellen beeinflussen. Um einen Einfluß von shrew-1 und CD147 auf die Invasivität zu untersuchen, wurden beide Proteine mittels RNAi in HeLa-Zellen ausgeschaltet. Nachdem ein negativer Einfluss dieses Ansatzes auf das Proliferationsverhalten der Zellen ausgeschlossen werden konnte, wurde ein möglicher Effekt auf die Invasivität der Zellen untersucht. Durch die Analyse in Matrigel-Invasionsassays konnte gezeigt werden, dass das unabhängige Ausschalten beider Proteine die Invasivität der Zellen auf 35-55% im Vergleich zu Kontrollzellen reduziert. Die Ergebnisse dieser Arbeit untermauern die Annahme, dass shrew-1 eine Rolle bei invasiven Vorgängen spielt und weisen darauf hin, dass dies möglicherweise durch eine Interaktion mit CD147 geschieht. Die Interaktion mit CD147 und damit eine mögliche Funktion von shrew-1 bei invasiven Vorgängen scheinen dabei abhängig vom zellulären Kontext zu sein.
Die halophilen Archaea Haloferax volcanii und Halobacterium salinarum haben sich aufgrund ihrer metabolischen Vielseitigkeit und der Verfügbarkeit vieler molekulargenetischer und biochemischer Techniken zu archaealen Modellorganismen für die Untersuchung zellulärer Prozesse entwickelt. In den vergangenen Jahren wurden eine Vielzahl prokaryaler Genome sequenziert, es zeigte sich jedoch, dass ca. 30% aller Gene keine Funktion zugeordnet werden kann. Die funktionelle Genomforschung zielt darauf, durch parallele genomweite Untersuchung der Genexpression die Funktion der Transkripte bzw. der Proteine aufzuklären. In der vorliegenden Arbeit wurden für beide halophilen Archaea genomweite Genexpressionsanalysen unter Verwendung der DNA-Mikroarray- Technologie etabliert. Aufgrund der derzeit nicht vorhandenen Genomsequenz wurde für die Untersuchung der Genexpression von H. volcanii der erste und bisher einzig beschriebene genomweite shotgun-DNA-Mikroarray konstruiert. Dazu wurde zunächst eine Genombibliothek mit einer durchschnittlichen Fragmentgröße von 1,5 kb hergestellt. Die Genombibliothek wurde anschließend in eine PCR-Produkt-Bibliothek umgewandelt, die dazu genutzt wurde, in einem hochdichten Raster zwei DNA-Mikroarrays herzustellen, einen 960-Sonden DNA-Mikroarray zur Etablierung und Optimierung der Methode und einen 2880-Sonden DNA-Mikroarray, der einer einfachen Genomabdeckung entspricht. Für den Vergleich der Genexpression nach einer Änderung der Kohlenstoffquelle wurden Zellen von H. volcanii einem Wechsel von Wachstum mit Aminosäuren zu Wachstum mit Glukose als alleiniger Kohlenstoff-Quelle unterzogen. Die Transkriptomänderungen vom Wechsel der Kohlenstoff-Quelle bis zum erneuten Beginn des exponentiellen Wachstums wurden zu fünf Zeitpunkten mit dem 2880-Sonden DNA-Mikroarray analysiert. Es wurden fünf verschiedene Klassen kinetisch gleichregulierter Gene gefunden, die entweder induziert, reprimiert oder transient induziert waren. Insgesamt wurden ca. 10% aller Gene zu mindestens einem Zeitpunkt mehr als 2,5 fach reguliert. Für Gene aller fünf Klassen wurden die Ergebnisse durch Northern-Analysen verifiziert. Die Identität der regulierten Gene wurde durch Sequenzierung der PCR-Produkte von beiden Enden ermittelt. Es wurde ein breites Spektrum an Genen identifiziert, deren Genprodukte für unterschiedliche funktionelle Kategorien wie Stoffwechselenzyme, ABC-Transporter, regulatorische Proteine und hypothetische Proteine usw. kodieren. Viele gleichregulierte Gene kodieren für Proteine gemeinsamer Funktion. Erwartete wie auch unerwartete Ergebnisse erlaubten Vorhersagen über den zentralen Metabolismus, die Transportkapazität und der zellulären Organisation bei Wachstum von H. volcanii auf Aminosäuren bzw. Glukose. Die Mikroarray-Analysen stehen im Einklang mit der Wachstumsrate und dem Ribosomengehalt von H. volcanii bei Wachstum auf den alternativen Kohlenstoffquellen. Die Ergebnisse dieser Arbeit zeigen, dass ein shotgun-DNA-Mikroarray mit einfacher Genomabdeckung die Charakterisierung der Regulation metabolischer Prozesse sowie die funktionelle Charakterisierung von Proteinen bzw. Proteinkomplexen erlaubt. Für Halobacterium salinarum, dessen Genomsequenz bekannt ist, wurde ein genomweiter genspezifischer DNA-Mikroarray konstruiert. Hierzu wurde jeder ORF des Genoms unter Verwendung von ORF-spezifischen Oligonukleotiden mittels PCR amplifiziert. Zur Etablierung dieses Systems wurden zunächst mit einem 200-Sonden DNA-Mikroarray exemplarisch Genexpressionsanalysen für zwei verschiedene Wachstumsbedingungen durchgeführt. Bei anaeroben Wachstum von H. salinarum durch fermentativen Argininabbau wurden im Vergleich zu aeroben Wachstum die für die Argininfermentation essentiellen Gene induziert. Dagegen wurden charakteristische Gene des aeroben Stoffwechsels reprimiert. Zur Untersuchung des Zellzyklusses von H. salinarum wurde der genomweite genspezifische DNAMikroarray verwendet. Um erstmals genomweit die zellzyklusspezifische Genexpression eines Archaeons zu analysieren, wurden Zellen von H. salinarum durch eine reversible Zellzyklusblockade mit Aphidicolin, einem DNA-Polymerase Inhibitor, synchronisiert. Vorläufige Transkriptomstudien mit einer synchron wachsenden H. salinarum-Kultur deuten an, dass die Transkription der Mehrzahl der Gene im Verlauf des Zellzyklusses nicht reguliert wird. Die Untersuchungen dieser Arbeit bilden die Grundlage für genomweite funktionelle Charakterisierungen haloarchaealer Genexpression und Regulationsprozesse.
Characterisation of cytosolic prion protein-mediated putative cytotoxicity in neuronal cell lines
(2006)
Prion diseases are a complex group of fatal neurodegenerative disorders with a broad host spectrum, which are characterised by strong neuronal cell loss, spongiform vacuolation and astrocytic proliferation. The molecular mechanisms of prion-mediated neurodegeneration are not yet fully understood. Recently, it has been proposed that neuronal cell death might be triggered by cytosolic accumulation of misfolded cellular prion protein (PrPC) due to impairment of proteasomal degradation. Cytosolic PrPC could result from either retro-translocation via the endoplasmatic reticulum-associated degradation system (ERAD) or abortive translocation of PrPC into the ER. Indeed, expression of cytosolic PrP (Cy-PrP) was shown to be neurotoxic both in vivo and in vitro. However, contradicting results on cytosolic PrP-mediated neurotoxicity in cultured cells have been reported. Cytosolic PrP–mediated cytotoxicity may play a central role in the pathogenesis of prion diseases. In order to investigate the molecular mechanisms of this process, a detailed analysis of N2a cells conditionally expressing cytosolic PrP (Cy-PrP) was performed in this study. The following results were obtained: First, Cy-PrP expression is not per se sufficient to trigger cytotoxicity in N2a cells independently of proteasome inhibition. Second, Cy-PrP is degraded with kinetics resembling the degradation of cell membrane-anchored full-length PM-PrP. In this process, the 20/26S proteasome was responsible for Cy-PrP degradation while the proteolysis of matured full length PM-PrP is not affected by the proteasomal system. Third, Cy-PrP accumulates in fine foci when expressed at high levels and co-localises with the cytosolic chaperone Hsc70 in EEA-1 positive endocytic vesicles. From these data it was proposed that the chaperone Hsc70 acts as a regulator for the controlled formation of amorphous Cy-PrP aggregates and their transport to endosomal vesicles. This Hsc70-dependent mechanism may confer protection to N2a cells against toxic accumulation of Cy-PrP in the cytosol.
Die Entwicklung neuer und die Adaption bestehender Methoden ist weiterhin eine der vordringlichsten Aufgaben der Forschung zur Bekämpfung der tödlichen Infektion mit dem HI-Virus. So wurde im ersten Teil dieser Arbeit untersucht, ob die Methode der Generierung MHC-unabhängiger Immunantworten gegen Oberflächenproteine, die bereits in der experimentellen Tumortherapie verwendet wird, für die HIV Therapie adaptiert werden kann. In dieser Arbeit war das HIV Hüllprotein Env das Zielmolekül. Der zweite Teil der Arbeit versucht, Erkenntnisse aus der HIV-Forschung für alternative Tumortherapieansätze am Beispiel des kutanen T-Zell Lymphoms zu verwenden. Der erste Teil beschäftigt sich mit der Verwendung des Hüllproteins Env von HIV als Zielstruktur für die Generierung MHC-unabhängiger Immunantworten gegen HIV-infizierte Zellen. Hierfür wurden CD4, 5-Helix sowie zwei Varianten von DC-SIGN als HIV Env-bindende Liganden als chimäre T Zell-Rezeptoren, zusammen mit Teilen von CD3 und CD28, in humanen Zellen exprimiert. Die Funktionalität der Konstrukte konnte gezeigt werden, ein therapeutischer Effekt in vitro war jedoch nicht nachweisbar. Der zweite Teil untersucht die Verwendung des HIV Hüllproteins als therapeutischem Gen zur Behandlung des kutanen T-Zell Lymphoms. Die Pseudotypisierung von MLV-basierenden Vektoren mit HIV Env ermöglicht das zielzellspezifische Eindringen der Vektoren in humane CD4-positive Zellen. Aus diesen Zellen besteht auch das kutane T Zell Lymphom (CTCL). MLV/HIV pseudotypisierte retrovirale Vektoren, die die 89.6P Variante des HIV Hüllproteins Env als therapeutisches Gen transportieren, wurden generiert und zunächst in vitro getestet. Das Wachstum von CTCL-Zellen konnte durch Zugabe dieser Vektorpartikel verhindert und die Zellzahl unter den Ausgangswert reduziert werden. Die Verwendung im Maus-Experiment zeigte einen vergleichbaren Erfolg wie die Verwendung der Herpes simplex Thymidinkinase, obwohl von syn Env nur etwa ein Viertel der Vektorpartikel appliziert wurde. Ein bystander-Effekt ließ sich damit also nachweisen. Die Verwendung chimärer T-Zell-Rezeptoren für MHC-unabhängige Immunantworten gegen HIV-Reservoirs im Körper ist ein vielversprechender Therapieansatz. Neben der Verwendung HIV Env-bindender zellulärer Proteine könnte das Spektrum möglicher Liganden durch die Verwendung Subtypen-übergreifender, nicht-inhibitorischer Antikörper, erweitert werden. Dies ist möglich, da für die Immunantwort lediglich die Bindung an das Hüllprotein notwendig ist. Zur Erhöhung des therapeutischen Effektes des retroviralen Gentransfers zur Therapie kutaner T-Zell Lymphome eignen sich hoch fusogene virale Hüllproteine, die auf diese Weise einen noch stärkeren bystander-Effekt ermöglichen. Die in dieser Arbeit beschriebenen Ergebnisse deuten darauf hin, dass dieser sehr groß sein muss, solange replikationsinkompetente Vektoren verwendet werden.
Die Ursache von Adipositas liegt im übermäßigen Wachstum von Fettgewebe, welches hauptsächlich aus Fettzellen, den Adipozyten, besteht. Die Zellen der stroma-vaskulären Fraktion, welche Vorläuferzellen, Makrophagen und Zellen des lokalen Gefäßnetzwerks enthält, sind außerdem an der Homöostase des Fettgewebes beteiligt. Insbesondere spielt das Gefäßsystem des Fettgewebes in Nagetieren eine wichtige Rolle im Fettgewebewachstum, da die Hemmung der Angiogenese in genetisch- und diät-induzierten fettleibigen Mäusen die Entstehung von Adipositas verhindert. Dennoch wurde das Gefäßsystem des menschlichen Fettgewebes bis heute nicht erforscht. Durch immuno-histochemische Analysen am subkutanen menschlichen Fettgewebe konnten wir zwei verschiedene Gefäßsysteme identifizieren: das vaskuläre Netzwerk des Bluts und das lymphatische vaskuläre Netzwerk. Während die Endothelzellen von beiden Gefäßsystemen die gemeinsamen Endothelzellmarker von Willebrand factor (vWf) und CD31 (PECAM, Platelet Endothelial Cell Adhesion Molecule) exprimierten, konnten die Endothelzellen der Blutgefäße an der Expression des Markers CD34 (Stamm/Blutgefäß-Endothel-Zell-Marker) und die Endothelzellen der Lymphgefäße an der Expression der beiden lymphatischen Marker Podoplanin und VEGFR3 (Vascular Endothelial Growth Factor Receptor 3) spezifisch erkannt werden. Ausschließlich für den Marker CD34-positive Zellen und in Rosetten angeordnete CD31-positive Zellen, welche als residente Makrophagen wurden auch charakterisiert. Um die beiden Gefäßsystemen des menschlichen Fettgewebes weiterhin zu erforschen, haben wir ein auf Immunoselektion basiertes Protokoll entwickelt. Es ermöglicht, Blut- (BEC) und lymphatische (LEC) Endothelzellen aber auch Makrophagen und CD34-positive Zellen spezifisch zu isolieren. Sowohl BEC als auch LEC exprimierten VEGFR1, VEGFR2, vWf und Notch4 und nehmen acetyliertes LDL auf. Darüber hinaus konnte in LEC die Expression von Genen, welche spezifisch für das Lymphgefäßsystem sind, wie Podoplanin, Reelin, VEGFR3, Desmoplakin, LYVE-1 nachgewiesen werden. Durch fluss-cytometrischen Analysen des Anzahls von BEC und LEC im Fettgewebe von Patienten mit unterschiedlichen Body Mass Indices (BMI) wurde entdeckt, dass Fettleibigkeit von einer Erweiterung des vaskulären Netzwerks des Bluts im Fettgewebe begleitet wird, jedoch nicht von einer Erweiterung des lymphatischen vaskulären Systems. Flusscytometrische Analysen belegen, dass es in der CD34-positive Stroma-Zellpopulation Zellen gibt, die den endothelialen Progenitor-Zellmarker CD133 und den primitiven Stammzellmarker ABCG2 exprimieren. Außerdem zeigten die CD34-positive Zellen eine signifikant stärkere Proliferation und Expression von Endothelzellmarkern wie CD31 und vWf, wenn dem Kulturmedium zuvor die Faktoren Vascular Endothelial Growth Factor A (VEGF A) und Insulin-Like Growth Factor-1 zugefügt worden waren. Wurden Mäusen mit Hinterbeinischämie CD34-positive Zellen in vivo injiziert, beteiligten sich diese Zellen an der Neovaskularisation des ischämischen Hinterbeins. Eine signifikante Zunahme des Blutflusses im ischämischen Bein, gekoppelt an einer erhöhten Kapillardichte im ischämischen Muskel und einer Integration der menschlichen Zellen in die Vaskulatur der Maus waren erkennbar. Diese Ergebnisse weisen darauf hin, dass es unter den CD34-positive Zellen eine Population von endothelialen Progenitorzellen gibt, die -bei geeigneter Stimulation- zu Endothelzellen differenzieren. Parallel dazu wurden die lokalen Faktoren untersucht, die potentiell an der Wachstumskontrolle, der Migration und der Organisation der ruhenden, aus dem Fettgewebe stammenden, BEC und LEC beteiligt waren. Sekrete der Adipozyten, jedoch nicht der CD34-positive Zellen, induzierten eine signifikante BEC- und LEC-Proliferation. Außerdem induzierte die Kombination von Leptin und VEGF A oder des basic Fibroblast Growth Factor eine signifikante Zunahme der BrdU-Inkorporation in BEC während Adiponectin, VEGF C und VEGF D bereits alleine konzentrationsabhängig die Proliferation von LEC induzierten. Leptin, und nicht Adiponectin, führte zu signifikant höherer BEC-Migration und Röhrenformung, während Adiponectin, und nicht Leptin, die LEC-Migration und -Organisation förderte. Dabei führte Leptin in BEC und Adiponectin in LEC zeitabhängig zu einer signifikanten Zunahme der Phosphorylierung der Kinase Akt. Diese Ergebnisse belegen, dass die beiden aus Adipozyten stammenden Adipokine Leptin und Adiponectin eine tragende Rolle in der Umverteilung von BEC bzw. LEC spielen. Im Rahmen der Adipositas steigt die Plasmakonzentration von Leptin an während die Plasmakonzentration von Adiponectin sinkt. Unsere Ergebnisse deuten daraufhin, dass Leptin als lokaler pro-angiogenetischer Faktor identifizieren und Adiponectin als neuer lymphangiogenetischer Faktor im menschlichen Fettgewebe beschreiben konnte. Demnach könnten Veränderungen, in der Adipositas, der Adipokinfreisetzung durch Adipozyten am Umbau des vaskulären Netzwerks des Bluts und am ausbleibenden Wachstum des lymphatischen vaskulären Systems innerhalb des Fettgewebes beteiligt sein. Schließlich belegen die vorliegenden Ergebnisse das Vorhandensein einer Progenitor-Zell-Population in der Stroma-Fraktion des menschlichen Fettgewebes. Diese Progenitor-Zellen sind in der Lage sich an der Neovaskularisation ischämischen Gewebes zu beteiligen. Diese Population könnte im Hinblick auf zelltherapeutische Strategien eine interessante Alternative zu Stammzellen aus dem Knochenmark darstellen.
Mitochondrien, Organellen der oxidativen Phosphorylierung, sind in vielfältiger Weise an Alterungsprozessen in unterschiedlichen Modellorganismen beteiligt. Viele Mechanismen und Faktoren, die das Altern beeinflussen, scheinen konserviert zu sein. In dem in dieser Arbeit untersuchten Ascomyzeten Podospora anserina treten z. B. altersabhängige Reorganisationen der mtDNA auf, die zu einem Verlust lebensnotwendiger Gene führen können. In Menschen wurden ebenfalls Umstrukturierungen des mitochondrialen Genoms in unterschiedlichen Geweben mit fortschreitendem Alter beschrieben. Umgekehrt treten manche Faktoren, die die Lebensspanne beeinflussen, nur in einigen Modellsystemen auf. Hierzu gehört z. B. die Induktion der alternativen Oxidase in vielen langlebigen P. anserina-Mutanten. Diese Modifikation in der Atmungskette kann in S. cerevisiae und Säugern nicht beobachtet werden, da diesen Organismen eine alternative terminale Oxidase der oxidativen Phosphorylierung fehlt. Der Fragestellung, wie die Atmungskette im Falle der exklusiven PaAOX-abhängigen Respiration in der unsterblichen Mutante ex1 hinsichtlich der Zusammensetzung und kinetischer Eigenschaften des Elektronentransports charakterisiert ist, wurde in der vorliegenden Arbeit nachgegangen. Über die funktionalen Eigenschaften der Mitochondrien hinaus ist auch die Morphologie dieser Organellen altersabhängiger Änderungen unterworfen. Hinsichtlich der Gestalt der Mitochondrien in verschiedenen Altersstadien ist nur sehr wenig bekannt. Bisher steht nur fest, dass der P. anserina-Wildstamm „S“ im mittelalten Stadium filamentöse Mitochondrien aufweist. Ob und in welchem Ausmaß es zu Veränderungen der mitochondrialen Morphologie während des Alterns im Wildstamm „s“ und der Mutante grisea kommt, wurde im Rahmen der vorliegenden Arbeit analysiert. In der vorliegenden Arbeit wurde darüber hinaus PaDnm1 als putativer mitochondrialer Teilungsfaktor charakterisiert. Insbesondere die Modulation der PaDnm1-Expression durch Überexpression bzw. Deletion soll zeigen, welchen Einfluss PaDnm1 auf die mitochondriale Morphologie und andere phänotypische Parameter wie z. B. die Lebensspanne hat. Die in dieser Arbeit durchgeführten Untersuchungen führten zu folgenden Ergebnissen: 1. Im Wildstamm „s“ wurde im Gegensatz zu ex1 durch enzymkinetische Analysen eine starke Interaktion der Komplexe I und III nachgewiesen. Ein Großteil der Komplexe I und III ist im Wildstamm „s“ in Form von Superkomplexen organisiert. In der Mutante ex1 liegen die Komplexe I und III dagegen hauptsächlich frei vor. Die spezifische Aktivität der Cytochrom-c-Reduktase ist in ex1 niedriger als im Wildstamm „s“. 2. Seneszente Isolate des Wildstammes „s“ und der PaDnm1::ble-Mutante weisen im Gegensatz zur Mutante grisea eine starke Freisetzung von Wasserstoffperoxid auf. 3. Juvenile und mittelalte Wildstamm „s“-Isolate enthalten überwiegend kurze, filamentöse Mitochondrien, die entlang der Hyphenachse im Cytoplasma orientiert sind. Im seneszenten Stadium kommt es zu einer starken mitochondrialen Fragmentierung. Der Übergang von einer filamentösen zu einer sphärischen Morphologie dieser Organellen tritt auch in Mutante grisea auf. In ex1-Hyphen sind hauptsächlich filamentöse Mitochondrien enthalten. Initiale Analysen zur mitochondrialen Feinstruktur zeigen, dass in Wildstamm „s“ und Mutante grisea eine lamellenartige Cristaestruktur erkennbar ist. In der Mutante ex1 hingegen erscheinen die Cristae ungeordneter und weniger zahlreich. 4. Die Mitochondrienfragmentierung im seneszenten Wildstamm „s“ korreliert mit einer Induktion der Transkription von PaDnm1. In Mutante grisea ist die PaDnm1-Transkriptmenge während des Alterns konstant, obwohl sich die mitochondriale Morphologie wie im Wildstamm „s“ verändert. Überexpression von PaDnm1 führt zur Mitochondrienfragmentierung während die gezielte Deletion dieses Gens eine starke Elongation der Mitochondrien zur Folge hat. PaDnm1 ist somit das erste in einem filamentösen Pilz charakterisierte Gen der mitochondrialen Teilungsmaschinerie. 5. PaDnm1::ble-Isolate zeigen im seneszenten Stadium mitochondriale Fragmentierung wie Wildstamm „s“ und Mutante grisea. Das mitochondriale Genom von PaDnm1::ble ist stabilisiert, d. h. die Bildung der seneszenzfördernden plDNA wird unterdrückt. Die mittlere Lebensspanne der PaDnm1::ble-Mutante ist deutlich (> Faktor 10) gegenüber der des Wild-stammes „s“ erhöht. Bemerkenswerterweise zeigt PaDnm1::ble im Gegensatz zu anderen langlebigen P. anserina-Mutanten nach der Sporenkeimung keine physiologischen Defekte: Wuchsrate, männliche und weibliche Fertilität, Myzelmorphologie und Mitochondrien-segregation während der Ascosporengenese sind nicht eingeschränkt. Allerdings weist PaDnm1::ble eine erhöhte Empfindlichkeit gegenüber Ammoniumazetat auf. Dies äußert sich in einer Inhibierung der Sporenkeimung und einer Verringerung der Wuchsrate bei Anzucht der Mutante auf AmAc-haltigem Medium.
Replizierende Murine Leukämieviren (MLV) können wertvolle Werkzeuge für die humane Krebsgentherapie werden, da sie das Transgen innerhalb des gewünschten Gewebes verteilen, ihr Genom stabil integrieren und einen natürlichen Tumortropismus aufweisen. In vorliegender Arbeit wurde ein System zur visuellen Analyse der MLV‐Replikation sowie der Virusbindung an Zielzellen mittels Einfügung fluoreszierender Proteine etabliert und als Werkzeug für dasDesign und die Optimierung dieser Viren als Gentherapievektoren benutzt. Zuerst wurde die Kodierungskapazität dieser Retroviren durch Aufteilen der viralen Gene auf zwei semireplikative Vektoren vergößert. Die Kopplung der Genome mit fluoreszierenden Proteinen ermöglichte ebenfalls in diesem Zusammenhang die Beobachtung der Repliktion aber auch die einfache Aufdeckung von Rekombinationsereignissen. Die Ergebnisse zeigten den Bedarf weiterer Optimierungen, stellten allerdings einen Vorreiter auf diesem Forschungsgebiet dar und zeigten das Potential dieses Systems auf (Sliva et al., 2004a). Zusätzlich zum natürlichen Tumortropismus sollte die Sicherheit von replizierenden Retroviren für die Tumortherapie erhöht werdn. Gezielte Veränderungen des ecotropen Hüllproteins zu EGFR‐exprimierenden Zellen mittels gerichteter Evolution sowie der Versuch, den Wirtstropismus des Env mit der Insertion des Liganden SDF‐1α auf humane CXCR4‐exprimierende Zellen auszuweiten, sind jedoch gescheitert. Diese Daten müssen sich in die Reihe der erfolglos gebliebenen Versuche, den Wirtstropismus des ecotropen Env auf humane Zellen auszuweiten, einreihen (Sliva et al., 2004b). Abschließend wurde shRNA als therapeutisches Effektormolekül erfolgreich mittels replikationskompetenter MLV in Zielzellen überragen, was zur deutlichen Herabsetzung des Proteinlevels des Zielproteins der siRNA führte (Sliva et al., 2006). Diese modifizierten Viren sind ein gutes Werkzeug zur einfachen in vitro Untersuchung von Genfunktionen, und könnten auch eine Erleichterung für die Untersuchung von Genfunktionen innerhalb von proliferierendem Tumorgewebe darstelln. Des Weiteren präsentieren die Ergebnisse und Beobachtungen dieser Arbeit einen großen Schritt in Richtung Anwendung dieser Virn für die humane Gentherapie. Denn gekoppelt mit z.B. einer tumorspezifischen Expression der shRNA‐Expressionskassette und der intelligenten Wahl der siRNA‐(Ziel)Sequenz, die nach Applikation zum Tod von malignen Tumorzellen führt, wären sie die perfekte Waffe gegen solide Tumoren.
Das Zytolysin ClyA von Escherichia coli ist der Prototyp einer neuartigen Familie von porenbildenden, bakteriellen Zytolysinen, welche in verschiedenen Vertretern der Enterobacteriaceae vorkommen. Es handelt sich bei diesem Toxin um ein Protein von 34 kDa, das hämolytische und zytotoxische Aktivität aufweist und das in Zellmembranen stabile Poren einführt, indem es sich zu ringförmigen ClyA-Oligomeren zusammenlagert. Die vorliegende Dissertation sollte einen Beitrag zur funktionalen Charakterisierung des ClyA-Proteins von E. coli K12 liefern. Insbesondere sollte die Bedeutung der N-terminalen Region für den Sekretionsmechanismus, für die hämolytische und porenbildende Aktivität, für die Interaktion mit Zielmembranen und für die Fähigkeit zur Oligomerisierung des Proteins analysiert werden. Im Rahmen dieser Arbeit wurden hierzu ClyA-Derivate mit spezifischen Mutationen innerhalb des N-terminalen Bereiches hergestellt und auf ihre Funktions-tüchtigkeit überprüft. Diese Untersuchungen gingen von den bestehenden Erkenntnissen aus, dass die Sekretion von ClyA über eine periplasmatische Zwischenstufe verläuft und keine N-terminale Prozessierung des Toxins erfolgt. Es wurde festgestellt, dass bereits kurze, sukzessive Deletionen innerhalb der beginnenden N-terminalen Region, wie die Deletion der Aminosäuren an Position zwei bis fünf (ClyA∆2-5) und sechs bis zehn (ClyA∆6-10), einen deutlich hemmenden Effekt auf den Transfer von ClyA über die zytoplasmatische Membran zur Folge hatte, welcher durch die Deletion der Aminosäuren an Position zwei bis zehn (ClyA∆2-10) weiter verstärkt wurde. Größere N-terminale Mutationen, wie die Deletionen der Aminosäuren an Position zwei bis fünfzehn (ClyA∆2-15) und zwei bis zwanzig (ClyA∆2-20) sowie interne Deletionen, die Aminosäuren jenseits von Aminosäureposition zehn betrafen (ClyA∆6-15, ClyA∆11-15, ClyA∆11-20, ClyA∆16-20), führten zur fast vollständigen Inhibierung (ClyA∆6-15) oder totalen Blockierung (ClyA∆11-15, ClyA∆11-20, ClyA∆16-20, ClyA∆2-20, ClyA∆2-15) des Transports von ClyA in den periplas-matischen Raum. Während die hämolytische Aktivität der ClyA-Mutanten ClyA∆2-5, ClyA∆6-10 und ClyA∆2-10 zwar abnahm, jedoch im Vergleich zu der des wildtypischen ClyA-Proteins noch verhältnismäßig hoch war, beeinflussten die weiteren Deletionen (ClyA∆6-15, ClyA∆11-15, ClyA∆11-20, ClyA∆16-20, ClyA∆2-15, ClyA∆2-20) die hämolytische Eigenschaft des Toxins ganz erheblich. So verursachten diese Mutationen eine massive Abnahme (ClyA∆6-15) bzw. einen kompletten Verlust (ClyA∆11-15, ClyA∆11-20, ClyA∆16-20, ClyA∆2-20, ClyA∆2-15) der zytolytischen Aktivität des ClyA-Proteins gegenüber Erythrozyten. Untersuchungen an künstlichen Lipidmembranen ergaben, dass die Deletion der Aminosäuren an Position zwei bis fünf, sechs bis zehn und zwei bis zehn die porenbildende Aktivität des ClyA-Proteins nur unwesentlich beeinträchtigt. Dagegen störte die Deletion der Aminosäuren an Position zwei bis fünfzehn und zwei bis zwanzig die porenbildende Eigenschaft von ClyA so tiefgreifend, dass keine (ClyA∆2-20) oder nur Transmembranporen mit extrem geringem Innendurchmesser (ClyA∆2-15) erzeugt wurden. Daneben spiegelten instabile Membranporen, die durch die ClyA-Mutanten ClyA∆6-15, ClyA∆11-15, ClyA∆11-20 und ClyA∆16-20 im künstlichen Lipid-Bilayer gebildet wurden, die negativen Auswirkungen dieser Mutationen auf die porenbildende Aktivität des Toxins wider. Die gesammelten Daten unterstreichen somit nicht nur die essentielle Bedeutung der N-terminalen Region des Zytolysins ClyA von E. coli K12 für den Transport in den periplasmatischen Raum, sondern auch für die hämolytische und porenbildende Eigenschaft des Toxins. Allerdings wurde die hämolytische und porenbildende Aktivität des ClyA-Proteins erst durch Mutationen ab Aminosäureposition zehn signifikant beeinträchtigt. Demgegenüber verdeutlichten Untersuchungen zum Bindungsverhalten an Zielzellen sowie Crosslinking-Experimente, dass die N-terminale Aminosäuresequenz von Position zwei bis zwanzig von ClyA weder für die Bindung an Erythrozyten noch für die Oligomerisierung des Toxins einen wesentlichen Faktor darstellt.
Soluble guanylyl cyclase (sGC) is a cytosolic enzyme producing the intracellular messenger cyclic guanosine monophosphate (cGMP) on activation with nitric oxide (NO) which leads to the activation of GMP dependent protein kinases and to vasodilation. NO signaling may be affected by altered expression of sGC subunits, as has been shown in different pathological and physiological conditions and developmental stages. The molecular mechanisms underlying altered sGC expression in these and other conditions have not yet been revealed. Gene expression can also be regulated at the level of mRNA through alterations in translational efficiency and in mRNA stability. HuR (Human R) is a ubiquitously expressed member of the embryonic lethal abnormal vision (ELAV) family of RNA-binding proteins. Among other RNAs, there has been recent evidence that the expression of sGC is subject to post-transcriptional regulation by HuR. It has been shown that chronic hypertension induces changes in HuR expression and activity, which account for decreased sGC expression and activity in the aorta of hypertensive rats. This thesis should study was performed in an effort to provide some insight to the transcriptional and post-transcriptional regulation of sGC expression in a mammal, the rat. We investigated rat sGC alpha-1 transcriptional regulation in rat lung fibroblast (RLF-6) cells. The 3000bp 5' upstream region of the alpha-1 sGC gene was isolated and analyzed for promoter activity by using luciferase reporter constructs- Alpha3000 (with -2794 bp), Alpha1100 (-1092 bp), Alpha350 (-346 bp) and Alpha200 (-200 bp). The promoter activity was the highest in the 200bp construct (about 6-fold higher than Alpha3000) suggesting that this fragment contains all the crucial elements necessary to support basal transcription of the alpha-1 sGC gene. Analysis of the 200 bp of the 5’ UTR of the alpha-1 gene was performed using the MATINSPECTOR V2.2 software for putative transcription factors. The constructs containing the deleted sites for NFY and Sp1 showed a significant decrease in constitutive promoter activity by almost 80% and 60% respectively, implying that these transcription factors are crucial elements in the basal expression of the of sGC alpha-1 subunit. Treatment of RLF-6 cells with genistein 50 microM and mithramycinA 100 nM, known to inhibit the NFY and Sp1 binding to DNA respectively, reflected the same effects. Furthermore the cGMP content of the cells was significantly reduced by both inhibitors, almost completely by genistein, and by about 40 % by mithramycinA. Electrophoretic mobility-shift assay (EMSA) clearly showed the formation of multiple complexes with the biotinylated ODN (decoy oligodeoxynucleotide) probes for NFY and Sp1 when incubated with RLF-6 nuclear extract. A “supershift” observed in the presence of antibodies to the individual transcription factors confirmed that these factors were present in the shifted band, indeed. NFY and Sp1 are instrumental in several physiological and pathophysiological effects mediated by several growth factors in smooth muscle cells. Thus the regulation of the promoter, in response to serum, was also analysed. 10% foetal calf serum led to decreased alpha-1 sGC level as shown by western blots performed with rat aorta. Decreased sGC alpha-1 mRNA expression was observed in RLF-6 cells and cultured rat aortic smooth muscle cells incubated with FCS for 24 hours. This decrease was reflected in the promoter activity in RLF-6 cells using both Alpha3000 and Alpha200 constructs confirming that the regulation took place at promoter level. EMSA performed with nuclear extracts from FCS treated RLF-6 cells led to diminished binding to NFY, but to an enhanced binding to Sp1 site. We concluded that the factors Sp1 and NFY (the sites overlapping) compete for binding, and in the presence of FCS, it is Sp1 that binds stronger, and hence results in diminishing promoter activity. In order to delineate the post-transcriptional regulation of sGC alpha-1 subunit, studies were performed to demonstrate the regulation of expression of the mRNA stabilizing protein HuR. It has been observed that exposure of isolated rat aortic segments to the activator of adenylyl cyclase, forskolin, strongly reduced sGC alpha-1/beta-1 and HuR protein and mRNA expression in a time-dependent and actinomycin D-sensitive fashion. Transcription factor decoy approach proved that the cAMP-induced down-regulation of HuR is mediated by the activation of AP-1. It has been established that HuR stabilises the sGC alpha-1 and beta-1 mRNA. However the pathway underlying this regulation remains unknown. In order to identify the mechanism of this regulation, we looked for HuR interacting proteins employing the yeast two hybrid assay. The enzyme of the polyamine catabolic pathway spermidine/spermine N1-acetyltransferase (SSAT) was found to interact with the hinge region of HuR. This interaction was confirmed by performing immunoprecipitation and GST-pulldown experiments. A direct effect of these proteins on each other’s biological activity was not visible as tested through the SSAT activity assay and HuR gel shift. It might be possible that SSAT-mediated modulation of local polyamine concentrations enhances/reduces HuR activity and sGC expression to affect cell proliferation. In summary, this study represents an analysis of the rat sGC alpha-1 promoter regulation in rat fibroblast cells and identifies NFY and Sp1 as important factors in sGC alpha-1 expression. It also gives first evidence of sGC regulation at the transcriptional level in response to an external stimulus, and proposes the possible mechanism. It also identifies SSAT as a HuR interacting protein. These might have implications in the various pathophysiological conditions where sGC plays an important role.
Background: Growth rate is central to the development of cells in all organisms. However, little is known about the impact of changing growth rates. We used continuous cultures to control growth rate and studied the transcriptional program of the model eukaryote Saccharomyces cerevisiae, with generation times varying between 2 and 35 hours.
Results: A total of 5930 transcripts were identified at the different growth rates studied. Consensus clustering of these revealed that half of all yeast genes are affected by the specific growth rate, and that the changes are similar to those found when cells are exposed to different types of stress (>80% overlap). Genes with decreased transcript levels in response to faster growth are largely of unknown function (>50%) whereas genes with increased transcript levels are involved in macromolecular biosynthesis such as those that encode ribosomal proteins. This group also covers most targets of the transcriptional activator RAP1, which is also known to be involved in replication. A positive correlation between the location of replication origins and the location of growth-regulated genes suggests a role for replication in growth rate regulation.
Conclusion: Our data show that the cellular growth rate has great influence on transcriptional regulation. This, in turn, implies that one should be cautious when comparing mutants with different growth rates. Our findings also indicate that much of the regulation is coordinated via the chromosomal location of the affected genes, which may be valuable information for the control of heterologous gene expression in metabolic engineering.
Length variations of repetitive sequences in different AT-rich loop-coding regions of mitochondrial 16S rDNA in two gastropod species were discovered during intraspecific haplotype surveys. Examination of the discrete length variation of the basic repeat unit in a phylogenetic framework led to the conclusion of a microsatellite-like mutational dynamic. The observations suggest that the presence of a repetitive sequence structure alone is sufficient to trigger this dynamic.
I analysed the importance of shell size, shell shape, habitat preferences and availability, experienced climate, active dispersal and influence of Pleistocene glaciations for the range sizes of 37 Western Palaearctic Helicidae s.l. species for which a phylogeny was available. In both cross-species and phylogenetically controlled analyses, the range sizes were positively correlated to climatic tolerance, shell size, active dispersal and influence of Pleistocene glaciations. In addition, range sizes increased significantly with latitude. Multiple regression suggested that, predominantly, the influence of Pleistocene glaciations, tolerance to large annual temperature ranges and shell size influenced the distributional range sizes. Habitat preference, range and availability, active dispersal and shell shape explained no additional variance. The results suggest that the processes influencing species range size of the Helicidae s.l. are mainly related to the climatic shifts after the Pleistocene.
Background Reliable taxonomic identification at the species level is the basis for many biological disciplines. In order to distinguish species, it is necessary that taxonomic characters allow for the separation of individuals into recognisable, homogeneous groups that differ from other such groups in a consistent way. We compared here the suitability and efficacy of traditionally used shell morphology and DNA-based methods to distinguish among species of the freshwater snail genus Radix (Basommatophora, Pulmonata). Results Morphometric analysis showed that shell shape was unsuitable to define homogeneous, recognisable entities, because the variation was continuous. On the other hand, the Molecularly defined Operational Taxonomic Units (MOTU), inferred from mitochondrial COI sequence variation, proved to be congruent with biological species, inferred from geographic distribution patterns, congruence with nuclear markers and crossing experiments. Moreover, it could be shown that the phenotypically plastic shell variation is mostly determined by the environmental conditions experienced. Conclusion Contrary to DNA-taxonomy, shell morphology was not suitable for delimiting and recognising species in Radix. As the situation encountered here seems to be widespread in invertebrates, we propose DNA-taxonomy as a reliable, comparable, and objective means for species identification in biological research.
ATP ist ein weit verbreitetes Signalmolekül im ZNS. Seine Hauptfunktionen betreffen die präsynaptische Modulation der Transmitterfreisetzung und die schnelle exzitatorische Transmission. Die Aktivierung ionotroper P2X-Rezeptoren durch ATP beinhaltet den Einstrom von Kalzium in die Zelle. Unter pathologischen Bedingungen, wie bei Epilepsie oder Ischämie, ist die ATP-Freisetzung erhöht und könnte einen neuronalen Zelltod induzieren. Eine anhaltender Aktivierung von NMDA-Rezeptoren und der dadurch erhöhte Einstrom von Kalzium in die Zelle stellt dabei den primären Effektor der Neurotoxizität dar. Dieses, als Exzitotoxizität bezeichnete Phänomen, ist an vielen neurologischen Krankheiten beteiligt. In der vorliegenden Arbeit wurde die Wirkung von ATP und anderen Purin- und Pyrimidin-Nukleotiden und von Adenosin auf die Überlebensrate von Neuronen bei induzierter Toxizität in hippokampalen Primärkulturen untersucht. Neurotoxizität wurde durch die Applikation der Glutamat-Rezeptor-Agonisten NMDA (30 μM) oder Kainat (300 μM) und durch Applikation von KCl (30 mM) induziert. Purin- und Pyrimidin-Nukleotide wurden in verschiedenen Konzentrationen von 10 μM – 1000 μM koappliziert. Nach 24 Stunden wurde die Überlebensrate der Neurone mit der Methode des Neuronen-spezifischen zellulären ELISA quantifiziert. Applikation von NMDA reduzierte den Anteil lebender Zellen auf 56 ± 3%. Der NMDARezeptor-Antagonist MK-801 verhinderte die NMDA-induzierte Toxizität. Die Koapplikation von ATP (0,01-1 mM) schwächte die zytotoxischen Wirkung von NMDA konzentrationsabhängig ab. Die Purine ITP und GTP zeigten ebenfalls eine protektive Wirkung und reduzierten die NMDA-induzierte Toxizität, wohingegen die Pyrimidin-Nukleotide UTP und CTP keinen protektive Wirkung zeigten. Weitere getestete P2-Rezeptor-Agonisten, wie ADP, AMP, Adenosin, α,β-meATP, 2MeSATP, das Dinukleotid Ap4A, α,β-meADP und BenzoylATP waren unwirksam. Der P2-Rezeptor-Antagonist Reactive Blue 2 (100 μM) inhibierte die Wirkung von ATP. Suramin und PPADS (100 μM) verhinderten die protektive Wirkung von ATP nicht. Applikation von Kainat reduzierte den Anteil lebender Zellen auf 37 ± 0,3%. Der Antagonist CNQX (100 μM) verhinderte die Kainat-induzierte Toxizität. Weder ATP noch GTP zeigten eine protektive Wirkung nach Kainat-induzierter Toxizität. Dies steht im Gegensatz zu ihrer protektiven Wirkung nach NMDA-vermittelter Toxizität. Applikation von KCl reduzierte den Anteil lebender Zellen auf 61 ± 4%. Die Purin- und Pyrimidin-Nukleotide (1 mM) zeigten bei K+-Depolarisation ein völlig anderes Wirkungsspektrum als bei Applikation von NMDA: GTP > ITP > ATP > ADP > CTP > α,β-meATP > UTP > AMP. 2MeSATP, α,β-meADP, Ap4A, BenzoylATP und Adenosin veränderten die Überlebensrate der Zellen nach KCl-induzierter Toxizität nicht. Weder Suramin noch PPADS (100 μM) inhibierten die protektive Wirkung von ATP. Diese Ergebnisse lassen vermuten, daß die protektive Wirkung von ATP, GTP und ITP weder P2- noch Adenosin-Rezeptor-vermittelt war. Zudem schienen sie spezifisch für eine NMDARezeptor-vermittelte Toxizität, da ATP und GTP nach Kainat-Applikation keine Wirkung erzielten und die alleinige Applikation der verwendeten P2-Rezeptor-Agonisten und Antagonisten (Kontrollen) keine Wirkung auf das Überleben von Neuronen hatte. Deshalb wurde eine direkte Inhibition des NMDA-Rezeptors durch ATP postuliert. In einer Kooperationsarbeit führte Dr. Bodo Laube vom Max-Planck-Institut für Hirnforschung in Frankfurt am Main elektrophysiologische Messungen an Oozyten und hippokampalen Neuronen zur Bestätigung dieser Hypothese durch. ATP inhibierte in Oozyten NMDA-induzierte Einwärtsströme kompetitiv durch Bindung an die NR2B-Rezeptor-Untereinheit. ITP, GTP, AMP waren an dieser rekombinanten NR1/NR2BRezeptorkombination ebenso effektiv, wohingegen UTP, CTP, ADP und Adenosin nur schwache inhibitorische Wirkungen zeigten. In kultivierten hippokampalen Neuronen inhibierte ATP auch NMDA-induzierte Ströme, nicht jedoch Kainat-induzierte Ströme. Die Expression der beiden NMDA-Rezeptor-Untereinheiten NR1 und NR2B wurde durch immunzytochemische Untersuchungen in den hippokampalen Neuronen bestätigt. Die Resultate zeigten, daß ATP direkt NMDA-Rezeptoren mit einer bestimmten Untereinheitenzusammensetzung inhibierten. Zusammenfassend zeigen die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit, daß ATP und andere Purinund Pyrimidin-Nukleotide durch Inhibition des NMDA-Rezeptors neuroprotektive Wirkungen vermitteln können. Dies ist eine neue Funktion von ATP zu der bereits beschriebenen direkten Aktivierung von postsynaptischen P2X-Rezeptoren und zu seiner Rolle als eine extrazelluläre Quelle des synaptischen Modulators Adenosin an glutamatergen Synapsen.
Das Y-Chromosom war, mit Ausnahme der Pseudoautosomalen Regionen, während der Genomevolution einer enormen Veränderung unterworfen, die zu einem weitesgehenden Verlust oder der Inaktivierung von Genen führte, die nicht in den Prozess der Geschlechtsdetermination bzw. –differenzierung, oder Spermatogenese involviert sind. Gleichzeitig kam es durch Amplifikation von funktionellen Kopien der Spermatogenesespezifischen Genen zu sog. amplifikonischen Genfamilien, die fast ausschliesslich im Testis exprimiert werden. TSPY (Testis Specific Protein Y-encoded) ist nach bisherigen Untersuchungen mit 35 Kopien, bestehend aus funktionellen Kopien und inaktiven Pseudogenen, die grösste und homogenste Protein-kodierende amplikonische Genfamilie auf dem Y-Chromosom und wurde im Rahmen dieser Arbeit genauer analysiert. Es wird unter normalen Bedingungen in den Spermatogonien des Testis exprimiert, aber es ist auch eine aberrante Expression in malignen Geweben, wie Gonadoblastom, Carcinoma in situ (CIS) des Testis oder in einer Fraktion von Prostatakarzinomen detektierbar. Aufgrund der Expression und der korrelierten Kopplungsanalyse wurde postuliert, dass es sich bei TSPY um ein Kandidatengen für den sog. Gonadoblastom-Locus auf dem Y-Chromosom (GBY) handelt. TSPY gehört ausserdem aufgrund einer evolutionär konservierten Domäne zur Familie der SET/NAP-Proteine. Andere Mitglieder dieser Familie sind z.B. in Proliferation, Zell-Zyklus-Regulation, Chromatin-Umbau und Kerntransport involviert. Durch die Analyse der TSPY-Transkription konnte anhand des LNCaP-Zellkultursystems die postulierte Androgen-abhängige TSPY-Transkription widerlegt werden. Zusätzlich wurden zwei TSPY-Transkripte unterschiedlicher Grösse und Transkriptionsraten detektiert, wobei das grössere Transkript TSPY-S stärker exprimiert wird als das kleinere Transkript TSPY-L. Ursache hierfür ist alternatives Splicing in Intron 4 des TSPY-Gens, das zur Expression der beiden Protein-Varianten mit unterschiedlichen C-Termini führt. Die durchgeführte Haplotyp-Analyse zur Identifizierung transkribierter TSPY-Gene konnte aufzeigen, dass das einzige funktionelle Gen des sog. TSPY minor Clusters (mit dem Haplotyp G-G-18) als einziges nicht alternativ gespliced wird und andererseits das häufigste TSPY-S Transkript (44 %) darstellt. Hierfür wird die Möglichkeit einer „locus-control-region“ diskutiert. Um Interaktionspartner von TSPY-S zu identifizieren und dadurch möglicherweise Hinweise auf die Funktion von TSPY zu erhalten, wurde das Hefe-Zwei-Hybrid-System eingesetzt. Vorversuche lokalisierten eine mögliche Transkriptions-Aktivierungsdomäne im N-Terminus von TSPY, weshalb eine N-terminale Deletion von TSPY-S, die einen grossen Teil der NAP Domäne und den C-Terminus enthält, als Köder eingesetzt wurde, um eine Testis-cDNABibliothek nach interagierenden Proteinen zu durchsuchen. Die Interaktion von TSPY mit den drei interessantesten Kandidaten hTid-1, dem menschlichen Homolog eines Tumor-Suppressor-Gens aus Drosophila, einem Mitglied der Ubiquitin-like-Proteinfamilie Ubiquilin 3 (UBQLN3), das aufgrund der Protein-Struktur eine Funktion bei der Regulation des Zellzyklus haben könnte und Isopetidase T (USP5), einer Ubiquitin-spezifische Protease, die an der proteasomalen Protein-Degradation beteiligt ist wurde durch Co-Transformation verifiziert und genauer analysiert. Immunhistochemische Experimente bestätigten die ausschliessliche zelluläre Lokalisation von TSPY in den Spermatogonien. Es konnten jedoch leichte entwicklungsspezifische Unterschiede gezeigt werden. In post-pubertärem und adulten Testis-Gewebe wird TSPY im Kern und Cytoplasma der mitotischen Spermatogonien exprimiert, aber in einem sehr grossen Anteil der ruhenden Spermatogonien im früh-kindlichen Testis (6 Monate) fehlt ein Kernsignal. Expression der EGFP (enhanced green fluorescent protein) -markierten Wildtyp cDNAs von TSPY-S und –L in HEK-293 Zellen bestätigte eine Protein-Lokalisation in Cytoplasma und Kern. Gezielte Deletion des C-Terminus der EGFP-TSPY-Fusionsproteine führte zur Degradation der Proteine, was die Bedeutung des variablen C-Terminus hervorhebt. Selektive Mutation einer mit den Computer vorhergesagten und durch einen Phosphorylierungs-Assay experimentell bestätigten CK2-Phosphorylierungs-Stelle im C-Terminus von TSPY-S verhinderte die Kern-Lokalisation, was darauf hindeutete, dass die C-terminale Phosphorylierung für die Lokalisation im Zellkern notwendig ist. Für TSPY-L konnte dieses Muster nicht bestätigt werden, da Mutationen im direkten C-Terminus von TSPY-L zur Protein-Degradation führten. Aufgrund der Datenlage wurde die Arbeitshypothese aufgestellt, dass TSPY im Cytoplasma durch CK2 phosphoryliert und in den Zellkern transportiert wird. Nach Androgen-Stimulus und Signal-Transduktion kommt es zur Kern-Lokalisation von CK2 und dadurch zur verstärkten Phosphorylierung von TSPY im Kern. Dort führt die Interaktion von TSPY mit den einzelnen identifizierten Proteinen zur Regulation des Zellzyklus und der mitotischen Proliferation der Spermatogonien, aber auch zur pathologischen Funktion von TSPY bei der Entstehung von Keimzelltumoren. Diese Arbeitshypothese müsste überprüft und verbessert werden, um die Funktion von TSPY bei der Proliferation der Spermatogonien und der Krebsentstehung aufzuklären.
The heat stress response is characterized by the presence of heat stress transcription factors (Hsfs) which mediate transcription of heat stress genes. In tomato (Lycopersicon peruvianum) cell cultures the simultaneous expression of four Hsfs, which are either constitutively (HsfA1 and HsfA3) or heat-stress inducible (HsfA2 and HsfB1) expressed, results in a complex network with dynamically changing cellular levels, intracellular localization and functional interactions. In order to examine the relevance of their multiplicity as well as to get more insights into the complexity of the plant heat stress response, the individual tomato Hsfs were investigated with respect to their protein interactions in vitro and in vivo. To this aim, I used pull-down assays as well as yeast assays to study the following aspects: 1. Oligomeric state of Hsfs: the results show that all class A Hsfs (HsfA1, HsfA2 and HsfA3) are trimeric proteins and interact with each other via the oligomerization (HR-A/B) domain. The similarity of their HRA/B regions allows formation of homo- and heterooligomeric complexes between all class A Hsfs. This special property was investigated by mutational studies with HsfA2 indicating that the linker and the HR-B regions are the minimal part required for Hsf/Hsf interactions. The conserved hydrophobic amino acid residues of the HR-B region are most important whereas the amino acid residues of the linker may provide higher flexibility to the HR-B region. Another investigated factor was HsfB1. HsfB1 is a member of class B Hsfs, which are characterized by an oligomerization domain without the 21 amino acid residues linker inserted between the HR-A and HR-B regions. It has a low activator potential and exists exclusively as dimer. HsfB1 can not physically interact with class A Hsfs. However, HsfB1 and HsfA1, binding to adjacent HSE sites, are assumed to cause strong synergistic effects in gene activation. 2. Potential HsfB1 interacting proteins: we searched for HsfB1 interacting proteins by using recombinant His-tagged proteins with HsfB1 as baits in pull-down assays. Histones H2A, H2B and H4 were identified by means of Peptide Mass Finger Printing and N-terminal sequencing analyses. The three histones represent the major proteins in tomato whole cell extracts retrieved by HsfB1. 3. HsfA2/small heat stress proteins (sHsps) interaction: pull-down and yeast two-hybrid assays were used to study the specific interaction of HsfA2 with tomato class II sHsp. This interaction occurs via the oligomerization domain of HsfA2. Other members of the plant Hsp20 family, including class I sHsp, do not interact with HsfA2. Heterooligomers of HsfA2 with class II sHsp may represent precursor forms of the plant higher molecular weight cytoplasmic complexes of heat stress granules, which form during heat stress. The findings presented in this thesis are a contribution to support the concept of a Hsfs network via protein-protein interactions. These data, together with information obtained from other studies, are used to propose a tentative model of the complex Hsfs network controlling the plant heat stress response.
Ein transgenes Mausmodell zur Untersuchung der Zink-vermittelten Modulation des Glyzinrezeptors
(2002)
Zink (Zn2+) ist ein im Zentralnervensystem der Säuger weitverbreitetes Metallion, das in kleinen synaptischen Vesikeln hoch angereichert wird. Zink-reiche Vesikel sind besonders gut dokumentiert in exzitatorischen Synapsen, z.B. im Hippocampus, sie werden jedoch auch in inhibitorischen Synapsen von Neuronen des Rückenmarks oder der Retina gefunden. Nach exozytotischer Freisetzung dieser Vesikel in den synaptischen Spalt können Zink-Konzentrationen von bis zu zehn mikromolar erreicht werden. In vitro hat Zink modulatorische Effekte auf eine Vielzahl von Neurotransmitter-Rezeptoren, so u.a. auf Glutamat-Rezeptoren vom AMPA-, NMDA-, oder Kainat-Typ, aber auch auf GABAA- und Glyzinrezeptoren (GlyR). Zink wurde daher als endogener Neuromodulator vorgeschlagen. Der modulatorische Effekt von Zink auf den GlyR ist biphasisch: Niedrige mikromolare Konzentrationen bewirken eine Potenzierung Glyzin-induzierter Ströme, höhere mikromolare Konzentrationen dagegen deren Inhibition. Dieser potenzierende Effekt von Zn2+ kann in transfizierten HEK 293 Zellen oder cRNA-injizierten Xenopus laevis Oozyten durch eine Punktmutation im N-terminalen Bereich des α1-Polypeptids aufgehoben werden (D80A (Lynch et al., 1998), oder D80G (Laube et al., 2000)). Ein revers-genetischer Ansatz wurde in der vorliegenden Arbeit benutzt, um Rückschlüsse auf die physiologische Relevanz der Potenzierung Glyzin-induzierter Ströme durch Zn2+ zu gewinnen: In einem „Knock-In“ Mausmodell wurde durch homologe Rekombination in ES-Zellen eine Mutation in der kodierenden Sequenz des GlyRα1-Genlocus eingeführt, die den o.g. AS Austausch (D80A) in der adulten ligandenbinden Untereinheit des GlyR bewirkt. Um die Veränderung des Genlocus zu minimieren war die als Selektionsmarker bei der Einführung der Mutation benötigte Neor-Kassette von zwei loxP-Sequenzen flankiert, und konnte so nach dem Nachweis des homologen Rekombinationsereignisses durch Wirkung der Cre-Rekombinase wieder entfernen werden. Nach Blastozysteninjektion homolog rekombinierter ES-Zellen zur Herstellung chimaerer Tiere und Keimbahntransmission der Mutation in einem Teil dieser Chimaeren konnten so Mauslinien mit zwei verschiedenen mutierten Allelen generiert werden: In zwei Linien wurde das intronisch miteingeführte Neor-Element bereits in ES-Zellen in vitro deletiert, wonach lediglich eine der loxP-Sequenzen verbleibt; in einer dritten Linie wurde der Selektionsmarker als intronische Insertion belassen. Während heterozygote Tiere aller drei Linien keinerlei offensichtliche Auffälligkeiten zeigen, findet sich bei homozygot-mutanten Tieren aller Linien ein mit der zweiten postnatalen Woche eintretender Phänotyp, dessen auffälligste Symptome eine verstärkte akustisch oder taktil induzierbare Schreckreaktion, ein erhöhter Muskeltonus, taktil induzierbarer Tremor und generalisierter Myoklonus sowie ein verlangsamtes Wiederaufrichten sind. Dieser Symtomkomplex ähnelt stark dem der spontanen Mutationen des GlyRs spasmodic, spastic oder oscillator und weist auf einen Verlust glyzinerger Inhibition als Ursache hin. Die verschiedenen Allele verursachen unterschiedlich starke Phänotypen: Das mutierte Allel, in welchem die Neor–Kassette deletiert ist, bewirkt einen schwachen Phänotyp, wohingegen das Verbleiben des intronischen Neor-Elements einen schwerwiegenderen Phänotyp zur Folge hat, und homozygote Tiere bis auf wenige Ausnahmen bis zur achten Lebenswoche sterben. Die Immunoblot-Analyse zeigt, daß bei homozygot mutanten Tieren dieser stärker betroffenen Linie ein partieller Verlust der Proteinexpression der GlyRα -Untereinheit auftritt. Dagegen ist in Tieren, in denen die Neor-Kassette deletiert ist, keine Verringerung der GlyRα-Expression durch Immunoblot nachweisbar. Der milde Phänotyp ist demnach am einfachsten durch den spezifischen pharmakologischen Effekt der Mutation, d. h. den Verlust der Zn2+-induzierten Potenzierung des GlyR, erklärbar. Hiermit wurde erstmals ein Hinweis daraufhin gewonnen, daß niedrige mikromolare Konzentrationen von Zn2+ für die physiologische Funktion des adulten GlyR notwendig sind. Darüberhinaus unterstreichen die Ergebnisse das Potential des GlyR als Ansatzpunkt zur Entwicklung neuer Muskel-relaxierender oder sedativer Substanzen, die - ähnlich der Wirkung von Zn2+ - einen potenzierenden Effekt auf die glyzinerge Inhibition haben.
Identification and characterization of TNFalpha responsive genes in human breast cancer cells
(2006)
One of the hallmarks of cancer is the escape of the transformed cells from apoptosis. Therefore, the identification of survival genes, allowing cancer cells to circumvent programmed cell death, could provide new diagnostic markers as well as targets for therapeutic intervention. A well known transcription factor regulating the balance between pro- and anti- apoptotic factors is NF-kappaB, which is strongly induced by tumor necrosis factor alpha (TNFalpha). When cells are stimulated by TNFalpha their response is biphasic with an initial NF-kappaB induction of survival genes which is overridden by the subsequent activation of initiator caspases triggering apoptosis. By combining gene trap mutagenesis with site specific recombination a strategy was developed, which enriches for genes induced by TNFalpha in the human breast cancer cell line MCF-7. The strategy relies on a one way gene expression switch based on Cre/loxP mediated recombination, which uncouples the expression of a marker gene from the trapped cellular promoter thereby enabling the recovery of genes that are only transiently induced by TNFalpha. The marker gene used in these experiments was a dominant negative variant of the TNFalpha-receptor associated protein FADD (dnFADD), which blocks the apoptotic branch of the TNFalpha induced signaling pathway. Initial experiments indicated that MCF-7 cells expressing high levels of dnFADD were insensitive to TNFalpha induced apoptosis and therefore suitable for the installment of a one way gene expression switch susceptible to Cre/loxP mediated recombination. A MCF-7 reporter clone harboring the recombinase dependent gene expression switch was infected with the gene trap retrovirus U3Cre, which inserts the Cre recombinase gene into a large collection of chromosomal sites. Insertion of Cre downstream of an active cellular promoter induces dnFADD expression from the gene expression switch enabling the cells to block TNFalpha triggered apoptosis. From a gene trap integration library containing approximately 2000000 unique proviral integrations, 69 unique TNFalpha inducible gene trap insertion sites were recovered in a two step selection procedure. Sequencing of the genomic regions adjacent to the insertion sites, which were obtained by inverse PCR (gene trap sequence tags, GTSTs), and data base analysis revealed that 42% of the GTSTs belonged to annotated genes, 13% to known cDNAs with open reading frames, 17% to Genscan predicted genes, 9% to ESTs, 9% to repetitive sequences and 10% to unannotated genomic sequence. Overall, 44% of the annotated genes recovered in this screen were directly or indirectly related to cancer, indicating that the gene trap strategy developed here is suitable for the identification of cancer relevant genes. Analysis of the expression patterns of the trapped and annotated genes in wild type cells revealed that 19 out of 24 genes were either up- or down- regulated by a factor of at least 1.45 by TNFalpha. A large fraction of the gene trap insertions were located upstream, in introns or in opposite orientation to annotated transcripts, indicating that the strategy efficiently recovers non-coding RNAs (ncRNAs). While the biological significance of these transcripts still needs to be elucidated, they fall into two main categories. The first category includes gene trap insertions upstream of genes, which could either represent regulatory RNAs interacting with promoter elements or transcripts driven by bidirectional promoters. The second includes inverse orientation gene trap insertions in introns of annotated genes suggesting the presence of natural antisense transcripts (NATs). Interestingly, more than 50% of all antisense integrations are located downstream of transcription start sites predicted by different algorithms supporting the existence of RNAs transcribed from the corresponding genomic regions. Intronic integrations on the coding strand could be derived from cryptic splicing, alternative promoter usage or additional, so far uncharacterized transcripts. Preliminary functional analysis of two genes recovered in this screen encoding the transcription factor ZFP67 and the FLJ14451 protein revealed that FLJ14451 but not ZFP67 inhibited anchorage independent growth in soft agar, suggesting that FLJ14451 might have some tumor suppressor functions. In summary, besides identifying a putative tumor suppressor protein, the present experiments have shown that gene trapping is useful in identifying non-coding transcripts in living cells and may turn out to be the method of choice in characterizing these transcripts whose functions are still largely unknown.
Gephyrin ist ein Protein mit strukturellen und enzymatischen Eigenschaften. Ein Aspekt der strukturellen Funktion ist die synaptische Verankerung inhibitorischer Rezeptoren an das Zytoskelett. Darüber hinaus besteht die Möglichkeit, dass ein Interaktionspartner von Gephyrin, Collybistin, die Organistion des Aktin-Zytoskeletts reguliert. Die enzymatische Funktion von Gephyrin besteht in der Synthese eines Kofaktors, welcher für die Aktivität von Molybdoenzymen notwendig ist. Das gezielte Ausschalten des für Gephyrin kodierenden Gens weist im Mausmodell einen letalen Phänotyp auf. Als Ursache hierfür kommen die fehlende synaptische Aggregation von Glyzin- und GABAA-Rezeptoren in neuronalem Gewebe, sowie die fehlende Aktivität von Molybdoenzymen in peripheren Organen in Frage. Da sowohl Molybdän-Kofaktor-Defizienzen beim Menschen, wie auch bestimmte Mutationen von Glyzin- und GABAA-Rezeptoren bei Mäusen letal sind, kann der beobachtete Phänotyp nicht eindeutig zugeordnet werden. Die vorliegende Arbeit verfolgt zwei Ziele. Das erste ist eine Einengung der Binderegion von Collybistin an Gephyrin. Dabei konnte diese durch immunzytochemische und biochemische Methoden auf wenige Aminosäuren genau beschrieben werden. Verschiedene Strukturvorhersageprogramme weisen auf eine helikale Struktur für diesen Sequenzabschnitt hin. Der Austausch der Aminosäuren R107, D108, R111 und E117 mit Alanin führt über den Verlust ionischer Ladungen zum Verlust der Bindungseigenschaft. Das zweite verfolgte Ziel ist die Einführung eines transgenen Konstrukts, welches nur die Molybdän-Kofaktor-Synthesefunktion wiederherstellen soll, in den genetischen Hintergrund der Gephyrin-„knock-out“ Maus. Ziel dieser Analyse ist die Herstellung eines Phänotyps, bei dem die inhibitorische Transmission in einer Weise gestört ist, welche Symptome der Molybdän-Kofaktor-Insufizienz ausschließt. So sollte die Ursache für die Letalität der Gephyrin-Mutation zugeordnet werden können. Dazu wurde das pflanzliche Gephyrin-Homolog Cnx1 in ein Expressionskonstrukt kloniert, und nach biochemischer, immunzytochemischer und funktioneller Analyse in heterologen Zellen in eine Wildtyp-Mauslinie injiziert. Diese wurde mit Geph-/--Mäusen gekreuzt und die daraus resultierenden homozygoten, transgenen Tiere analysiert. Diese Tiere sterben ebenso wie die Geph-/--Mäuse am Tag der Geburt. mRNA des Transgens konnte in Hirn und Leber nachgewiesen werden, das Protein allerdings nur in Hirnextrakten. Dementsprechend lag die Aktivität des für die Lebensfähigkeit von Säugetieren wichtigsten Molybdoenzyms, der Sulfitoxidase, in Leberextrakten nur bei 30%. Eine morphologische Untersuchung von Gehirnschnitten ergab keine Auffälligkeiten. Eine Immunhistochemische Analyse von Rückenmarkschnitten zeigte in Übereinstimmung mit Beobachtungen an Gephyrin-„knock out“-Mäusen diffus verteilte Glyzin-Rezeptoren. Somit wurde eine Maus mit beeinträchtigter inhibitorischer synaptischer Transmission und partiell wiederhergestellter Molybdän-Kofaktor Biosynthese hergestellt. Aufgrund der großen Schwankungsbreite der Aktivität der Sulfitoxidase in Leberextrakten verschiedener Geph-/- + cnx Tiere wäre ein Unterschied in der Lebenserwartung verschiedener Tiere zu erwarten gewesen, wenn die Defizienz dieses Molybdoenzyms die Ursache für den letalen Phänoyp gewesen wäre. Da die transgenen Tiere aber wie die Geph-/- Mäuse wenige Stunden nach der Geburt sterben, ist davon auszugehen, dass der beschriebene Phänotyp auf das Fehlen der strukturellen Eigenschaften von Gephyrin zurückzuführen ist, und nicht von einer durch Beeinträchtigung des Schwefelstoffwechsels hervorgerufene progressive Schädigung des ZNS.
Bisher konnte allein für den Magnetkompass der Vögel ein Mechanismus der Magnetperzeption identifiziert werden. In Verhaltensversuchen, die Zugorientierung als Kriterium einsetzten, ob Magnetrezeption ungestört abläuft oder nicht, konnte dieser Mechanismus analysiert werden. Die Experimente zeigten, dass der Magnetrezeptionsmechanismus lichtabhängig ist. Vögel die im blau bis grünen Teil des Spektrums in Orientierungstrichtern getestet wurden bevorzugten signifikant ihre der Jahreszeit entsprechende Zugrichtung. Führte man diese Tests mit längerwelligerem Licht durch, zeigten die Tiere Desorientierung. Durch die gezielte Manipulation des umgebenden Erdmagnetfeldes durch künstliche Felder, ergab sich ein Wirkprinzip des Magnetkompasses der Vögel, welches nichts mit dem der uns bekannten technischen Kompasse gemein hat. Die Tiere richten sich nicht nach der Polarität des Feldes, sondern detektieren vielmehr den Neigungsgrad und den Verlauf der magnetischen Feldlinien. Durch den Einsatz von Hochfrequenzfeldern als diagnostisches Werkzeug, konnte gezeigt werden, dass der Inklinationskompass der Vögel auf einem Radikalprozess basiert. Darüber hinaus konnte gezeigt werden, dass der Sitz des lichtabhängigen Magnetkompasses im rechten Auge lokalisiert ist. Unter bestimmten künstlichen Lichtbedingungen wurden von Rotkehlchen allerdings Verhaltensantworten gezeigt, die von der normalen Zugorientierung abwichen. In der vorliegenden Arbeit werden gerade jene Phänomene genauer analysiert, die in der Vergangenheit zu Nicht-Kompass-Antworten geführt haben. Die Intensitätserhöhung kurzwelliger Lichter hatte zu vermehrt axialem Verhalten geführt, eine Kombination aus langwelligem, gelben Licht mit einer kurzwelligen Komponente hatte zu Fixrichtungen geführt, d.h. die Vögel zeigten nicht mehr die saisontypische Zugumkehr. Auf biogenem Eisen (Magnetit) basierende Rezeptoren der Magnetfeld-wahrnehmung werden als zweites System der Perzeptionsmöglichkeit diskutiert, wobei ihnen im Zusammenhang mit dem ‚Kartensinn’ eher eine Intensitätssensibilität zugeschrieben wird. In der vorliegenden Arbeit wurden Versuche durchgeführt, die das komplexe Zusammenspiel unterschiedlicher Perzeptionsmechanismen des Erdmagnetfeldes untersuchen. Mischlichtbedingungen wurden daraufhin untersucht, ob sie einem radikalpaar-basierenden Inklinationskompass unterliegen, oder nicht. Für türkis-gelbes Mischlicht wird gezeigt, dass die eingeschlagene Fixrichtung nicht mit Hilfe eines Inklinationskompasses aufgesucht wird. Darüber hinaus beruht die Richtungswahl des getesteten Vogels nicht auf einem Radikalpaarmechanismus, ist aber abhängig vom vorliegenden Magnetfeld. Da Magnetit bei Vögeln in der Oberschnabelregion lokalisiert werden konnte, wurden Betäubungsversuche mit einem Lokalanästhetikum durchgeführt. Die Fixrichtung bricht zusammen und die Vögel zeigen desorientiertes Verhalten. Im Gegensatz dazu bleiben Vögel unter Grün und Weisslicht, Bedingungen wo ein Inklinationskompass zum Einsatz kommt, mit Oberschnabelbetäubung unbeeindruckt und suchen die jahreszeitlich passende Richtung auf. Für kurzwellige Lichter wird eine Intensitätsabhängigkeitsstudie durchgeführt, die analysiert ab wann Zugorientierung in Nicht-Kompass-Antworten umschlägt. Die Wellenlängenabhängigkeit der Intensitätssensitivität, die beobachtet wird, lässt auf die Beteiligung des optischen Systems schliessen. Deshalb wurden Versuche durchgeführt, die über die Lateralisation des Magnetkompasses hinaus die Rechtsdominanz des Rotkehlchenauges genauer untersucht haben. Mittels einer Brille, die die gleiche Lichtintensität auf beide Augen fallen ließ, aber in klare und unscharfe Wahrnehmung der Umgebung unterschied, konnte herausgefunden werden, dass über die reine Aktivierung von Licht hinaus Formensehen eine entscheidene Rolle zu spielen scheint. Versuche in absoluter Dunkelheit zeigen, dass von Rotkehlchen trotz der Abwesenheit von Licht signifikant eine Vorzugsrichtung aufgesucht wird, die keiner saisonalen Zugumkehr unterläuft. Die Fixrichtung beruht nicht auf einem Inklinationskompass und sie bricht nach Oberschnabelbetäubung zusammen. Alle bisher analysierten Nicht-Kompass-Antworten scheinen auf einem zweiten, magnetit-basierenden Mechanismus zu beruhen. Diese Rezeptoren scheinen neben Intensitätsinformationen des Erdmagnetfeldes auch Richtungsinformationen zu generieren. Die biologische Relevanz der ihnen unterliegenden Fixrichtungen bleibt allerdings ungeklärt.
Die Chemoresistenz von Tumoren ist ein schwerwiegendes Problem in der Krebstherapie. Insbesondere das maligne Melanom gilt aufgrund seiner ausgeprägten Therapieresistenz als nahezu unheilbar. Ein erster Schritt zur Verbesserung der Chemotherapie von Tumoren ist das Verständnis von Mechanismen, die der Resistenz zugrunde liegen. Für die Aufklärung der Mechanismen ist die Molekularbiologie des chemoresistenten Phänotyps von großem Interesse. Im Rahmen dieser Arbeit wurden Veränderungen im Transkriptionsmuster analysiert, die mit dem Erwerb von Chemoresistenz in Melanomzellinien einhergehen. Die Melanomzellinie MeWo wurde mit Abkömmlingen, die erworbene Resistenz gegen die DNA-schädigenden Agenzien Etoposid (MeWoEto1), Cisplatin (MeWoCis1) und Fotemustin (MeWoFote40) aufweisen, bezüglich ihres Transkriptionsmusters verglichen. Um zunächst eine möglichst große Anzahl von Genen in die Analyse einzubeziehen, wurden initiale Genexpressionsanalysen unter Verwendung des RZPD UniGene 1 Arrays durchgeführt. Dieses Array repräsentiert ca. 31.500 cDNA Sequenzen, die bei einer geschätzten Redundanz von 1,44 einer Anzahl von 21.875 verschiedenen Transkripten entsprechen. Geht man davon aus, dass der Mensch insgesamt über ca. 30.000 Gene verfügt, wurde durch die Verwendung dieses Arrays ein großer Teil aller humanen Gene untersucht. Unter definierten Selektionskriterien wurden 126 Gene ausgewählt, die als im chemoresistenten Phänotyp differentiell exprimiert angesehen wurden. Diese 126 Gene wurden mit 1.143 weiteren tumorassoziierten Genen für die Zusammenstellung und Produktion eines chemoresistenzspezifischen Kandidatengen-Arrays ausgewählt. In verifizierenden Analysen unter Verwendung des Kandidatengen-Arrays wurde eine differentielle Expression für 57 der initial selektierten Gene sowie für weitere 209 tumorassoziierte Gene festgestellt. Die in diesen Analysen angewandten Kriterien für die Definition differentieller Genexpression wurden in exemplarischen Northernblot-Analysen geprüft. Hier zeigte sich eine qualitative Übereinstimmung der Ergebnisse beider Methoden von 81,4%. Da zur Zeit noch keine Hochdurchsatz-Methoden für funktionelle Analysen zur Verfügung stehen, wurde versucht, den Kreis vielversprechender Kandidaten durch eine Integration von Ergebnissen anderer Experimente einzuengen. In Clusteranalysen zur Untersuchung von Verwandtschaftsgraden zwischen den resistenten Zellpopulationen zeigte die MeWoEto1-Zellinie eine vergleichsweise hohe Stabilität in ihrem Genexpressionsmuster über einen Zeitraum von ca. 2,5 Jahren, während MeWoCis1 und MeWoFote40 hier beträchtliche Schwankungen aufwiesen. Die Expressionsmuster der letzteren resistenten Linien zeigten zum spätesten analysierten Zeitpunkt Konvergenz, nachdem sie zunächst deutlich voneinander abwichen. Da die Wirkung sowohl von Cisplatin als auch von Fotemustin zur Bildung von DNA-Addukten führt, kann die Konvergenz als Ergebnis einer fortschreitenden Optimierung der Resistenz in beiden Linien gedeutet werden. Einzelne Gene wie z.B. PEPP2 und CRYAB, die konvergierend differentielle Expression zeigten, können demnach als vielversprechende Kandidaten für eine funktionelle Relevanz in der Resistenz gegen Cisplatin und Fotemustin betrachtet werden. Neben der Clusteranalyse wurden Ergebnisse von vergleichenden genomischen Hybridisierungen (CGH), der Untersuchung einer Deregulation von Kandidatengenen in mehreren der resistenten Linien oder nach Kurzzeitbehandlung von MeWo-Zellen mit den Zytostatika sowie Literaturdaten verwendet, um die Relevanz der differentiellen Expression für einzelne Gene zu validieren. Danach wurden unter anderen die apoptoserelevanten Gene CRYAB und STK17A sowie MPP1, AHCYL1, CYR61 und STMN3 als vielversprechende Kandidaten eingestuft. Ein weiteres bis dahin unbekanntes Gen aus der C2H2-Zinkfinger-Genfamilie, für das in initialen Analysen sowie in Northernblot und RT-PCR-Experimenten eine Überexpression in MeWoCis1 und MeWoEto1 nachgewiesen werden konnte, wurde bezüglich seiner mRNA-Sequenz vervollständigt und im Detail analysiert. Für dieses Gen konnte phänotyp- bzw. gewebespezifisches differentielles Spleissen sowie differentielle Polyadenylierung nachgewiesen werden. Das alternative Spleissen von Exon 3, dem aufgrund seiner ausgeprägten Homologie zu bereits charakterisierten KRAB A Domänen die Funktion der transkriptionalen Repression zugewiesen werden kann, könnte für ein phänotypspezifisches Transkriptionsprogramm verantwortlich sein. Ausgehend von insgesamt 267 differentiell exprimierten Genen konnte der Kreis vielversprechender Kandidaten durch die Integration von Daten aus anderen Experimenten auf ca. 20 Gene eingeengt werden. Unmittelbar im Anschluss and die Dissertation werden diese Gene in funktionellen Analysen bezüglich ihrer Relevanz für den chemoresistenten Phänotyp analysiert.
Studies in particular of the last decade showed that active neurogenesis continuously takes place in the subventricular zone (SVZ) of the lateral ventricles of the adult rodent brain. Neurogenesis in the SVZ leads to migration of neuroblasts within the rostral migratory stream (RMS) and mature neuron formation mainly in the olfactory bulb (OB). According to present understanding, glial cells with astrocytic properties represent the actual adult neural stem cells. The cell types representing the various cellular transition states leading to the formation of mature neurons as well as the mechanisms controlling adult neurogenesis and neuroblast migration are poorly understood. A previous study from this laboratory demonstrated that the ATP-hydrolyzing enzyme nucleoside triphosphate diphosphohydrolase 2 (NTPDase2) is associated with type B cells, the presumptive neural stem cells. NTPDase2 is a protein of the plasma membrane with its catalytic site facing the extracellular space. It hydrolyzes extracellular nucleoside triphosphates to their respective nucleoside diphosphates. This raises the possibility that the signaling pathway via extracellular nucleotides is involved in the control of adult neurogenesis. Neurons as well as glial cells express several subtypes of receptors (P2 receptors) that are responsive to the nucleotides ATP, ADP, UTP, or UDP. P2X receptors are ATP-gated Na+, K+ and Ca2+ permeable ion channels, P2Y receptors are coupled to trimeric G-proteins. In order to probe for a functional role of nucleotides in adult neurogenesis, the present study referred to an in vitro system (neurospheres). Neurospheres produced from isolates of the mouse SVZ and cultured in the presence of EGF and bFGF expressed the neural stem cell marker nestin and also GFAP, S100β, NTPDase2 and tissue non-specific alkaline phosphatase. Neurospheres generated from the cells of the subventricular zone were multipotenital. This was revealed by immunostaining of differentiated cells with markers for astrocytes, neurons and oligodendrocytes. The presence of ecto-nucleotidase was verified by analyzing the free phosphate released from nucleotides. The tissue non-specific form of alkaline phosphatase was the predominant enzyme. Both NTPDase2 and TNAP could be identified by immunocytochemistry and Western blotting. Hydrolysis was not observed for p-nitrophenyl thymidine monophosphate, a substrate of members of the ectonucleotide pyrophosphatase/phosphodiesterase family (NPP1 to NPP3). Since ecto-nucleotidases control the availability of extracellular nucleotide agonists, neurospheres were studied for the potential expression and functional role of nucleotide receptors. Neurospheres responded to extracellular nucleotides with a transient rise in Ca2+ (ATP = ADP > UTP). The rise in Ca2+ was due to P2Y receptors. The Ca2+ response was unaltered in the absence of extracellular Ca2+ and strongly reduced by thapsigargin, a blocker of internal Ca2+ stores. The P2Y1 antagonist MRS2179 strongly reduced the ATP- or ADP-induced increase in Ca2+, suggesting the involvement of a P2Y1 receptor. In addition, suramin and PPADS, non-selective antagonists for P2 receptors, inhibited most of the Ca2+ response. The agonistic activity of UTP and the lack of response to UDP implied the additional presence of a P2Y2 and/or a P2Y4 receptors and the absence of a functional P2Y6 receptor. RT-PCR experiments demonstrated that neurospheres expressed P2Y1 and P2Y2 receptors but not P2Y4 receptor. That the majority of the Ca2+ response to ATP was mediated via P2Y1 receptors was also confirmed by analysis of P2Y1 knockout mice and by application of the P2Y1 receptor-specific antagonist MRS2179. In addition, agonists of P2Y1 and P2Y2 receptors and low concentrations of adenosine augmented cell proliferation inspite of the presence of mitogenic growth factors. Neurosphere cell proliferation was attenuated after application of MRS2179 and in neurospheres from P2Y1 receptor knockout mice. These results infer a nucleotide receptor-mediated synergism that augments growth factor-mediated cell proliferation. Taken together these results suggest that P2Y-mediated nucleotidergic signalling is involved in neurosphere function and possibly also in adult neurogenesis in situ.
Die Ergebnisse der vorliegenden Dissertation beleuchten neue Aspekte der pflanzlichen Hitzestressantwort. Die Ergebnisse der experimentellen Arbeiten können erheblich die Planung und Durchführung zukünftiger Untersuchungen erleichtern, sowie das Verständnis der Regulation von Hitzestresstranskriptionsfaktoren als terminale Komponenten der zellulären Stressantwort verbessern. Zum ersten Mal wurde die Interaktion zwischen einem Hitzestresstranskriptionsfaktor und einem cytoplasmatischen Hitzestressprotein der Hsp20 Familie nachgewiesen. Die Aktivität des LpHsfA2 hängt von zahlreichen Faktoren ab, die den zellulären Zustand während und nach der Stressperiode widerspiegeln. Der bisher am besten verstandene Regulationsmechanismus, das Verhältnis des Kernimports im Vergleich zum Kernexport, welches stark durch die Heteroligomerisierung mit HsfA1 beeinflusst wird, wird durch den Einfluss von Hsp17.4-CII auf den Aggregationszustand und die Aktivität von HsfA2 erweitert. Nach massiver Akkumulierung von HsfA2 unter Hitzestressbedingungen führt die spezifische Interaktion mit Hsp17.4-CII zu einer reversiblen Inaktivierung des Transkriptionsfaktors und zu einer Bindung in hochmolekularen Komplexen. Die Interaktion ist hochspezifisch. Die nur durch wenige AS-Austausche charakterisierte Isoform Hsp17.3-CII bindet LpHsfA2 nicht. Im Gegensatz dazu ist der solubilisierende Einfluss der Hitzestressproteine der Klasse CI klassen-, nicht aber speziesspezifisch. Das Wechselspiel aus Inaktivierung durch Bindung an Hsp17.4-CII und anschliessende Resolubilisierung durch Hsp17-CI, sowie Kernimport nach erfolger Heterooligomerisierung mit HsfA1, führt zu einer fein abgestimmten Regulation der zellulären Lokalisation von HsfA2 und somit auch zur Modulation seiner Funktion als Transkriptionsaktivator. Die in der Arbeit gewählten experimentellen Bedingungen bewirken eine Aggregation von HsfA2 auch unter Kontrollbedingungen und ähneln der Situation in einer Pflanzenzelle während der Erholungsphase nur teilweise. In vivo wird der massiven Aggregation von HsfA2 und Hsp17.4-CII durch den Einfluss von HsfA1 und Hsp17-CI entgegengewirkt. Die gefundene in vitro Situation bietet somit ein wertvolles experimentelles Artefakt, um die Wechselwirkungen der Proteine während der Erholungsphase der Pflanze zu untersuchen und verstehen zu lernen. Aufgrund verschiedener experimenteller Hinweise kann davon ausgegangen werden, dass es sich bei der gezeigten spezifischen Interaktion nicht um ein auf die Gattung Lycopersicon beschränktes Phänomen handelt. In ersten Experimenten konnten Hinweise auf einen ähnlichen Regulationsmechanismus in A. thaliana gefunden werden (spezifische Interaktion zwischen AtHsfA2 und AtHsp17.7-CII). Allerdings zeigen die Ergebnisse der Experimente, in denen Proteine aus A. thaliana untersucht wurden, Abweichungen zu dem für die Tomatenproteine erarbeiteten Bild. Weitere Untersuchungen an Arabidopsis müssen hierzu durchgeführt werden, um Klarheit über den grundlegenden Regulationsmechanismus sowie speziesspezifische Besonderheiten zu bringen. Das aus den experimentellen Befunden resultierende Bild zeigt thermotolerante Tomatenzellen, in denen LpHsfA2 in einer transkriptionel inaktiven Form durch Bindung mit löslichem Hsp17.4- CII in Gegenwart von Hsp17-CI stabilisiert wird. Der Transkriptionsfaktor ist in diesem Zustand bereit für eine rasche Reaktivierung bei einem wiederkehrenden Hitzestress. Auch wenn mittlerweile die vier wichtigsten Regulatoren dieses Netzwerkes identifiziert werden konnten (LpHsfA1, LpHsfA2, LpHsp17.4-CII und LpHsp17-CI), kann nicht ausgeschlossen werden, dass weitere Faktoren beteiligt sind. Die Identifizierung solcher Faktoren, sowie weiterführende Arbeiten an Tomatenzellen, zum Beispiel durch Ausschalten einzelner Faktoren mit Hilfe von RNAi Konstrukten, wird in Zukunft helfen, noch mehr Details dieses interessanten Phänomens zu klären. Trotz der sehr guten Kenntnis der molekularen Eigenschaften der 21 AtHsf in Bezug auf ihre funktionellen Domänen wird erst das Verständnis der Art und Weise, wie diese Moleküle miteinander oder mit Co-Regulatoren interagieren und wie sie in die zellulären Regulationsnetzwerke eingebunden sind, zu einem Gesamtbild der Funktion der Hitzestresstranskriptionsfaktoren führen. Insbesondere gilt dies, seit die Analyse der Transkritionsprofile der AtHsf mit Hilfe von Micro-Array Analysen gezeigt haben, dass die Aufgaben der Hsf weit über die Regulation der Hitzestressantwort hinausgehen könnten. So könnten einige Vertreter der Hsf eine Rolle in der Pathogenabwehr spielen, bzw. im Laufe der Evolution ausschließlich entwicklungsspezifische Funktionen übernommen haben. Um die geschilderte Fragestellung effektiv zu bearbeiten, wurde in dieser Arbeit das Hefe-Zwei-Hybridsystem zur Charakterisierung der Interaktionseigenschaften der 21 AtHsf eingesetzt. Die zeitsparende Bearbeitung vieler Proben war hierbei ein Kernziel, das erfolgreich bearbeitet werden konnte: Die etablierte Hochdurchsatzmethode kann zukünftige Untersuchungen von Protein-Protein-Interaktionen stark beschleunigen. Die standardisierte Verwendung von Mikrotiterplatten und Mehrkanalpipetten in Kombination mit den etablierten Tranformations-, Analyse und PCR-Verfahren macht eine Bearbeitung großer Probenmengen möglich. Die Synthese dieser Technik mit der Kenntniss des gesamten Genoms von A. thaliana sowie der Fülle an Transkriptionsdaten einzelner Gene unter verschiedenen Umgebungsbedingungen stellt zukünftigen Untersuchungen ein potentes Instrumentarium ganz allgemeiner Art zur Verfügung. Im vorliegenden Fall wurde die etablierte YTH Methode dazu verwendet, Erkenntnisse über das Interaktionsverhalten der AtHsf untereinander zu gewinnen. Die Zusammenfassung aller auftretenden Interaktionen liefert für einige Gruppen von Hsf interessante Einsichten. In vielen Fällen (z.B. AtHsfA4/A5; AtHsfA1/A9) konnte für Vertreter eine Interaktion gezeigt werden, für die bereits physiologische Zusammenhänge bekannt sind. Das erstellte Interaktom kann dazu dienen, bereits bekannte Hsf-Hsf Interaktionen durch einen weiteren experimentellen Befund zu belegen, sowie bisher unbekannte Verbindungen aufzudecken. Zur Identifizierung unbekannter Interaktionspartner mussten zunächst geeignete Bibliotheken hergestellt werden. Mit Hilfe dieser Bibliotheken konnten zahlreiche putative Interaktionspartner identifiziert und durch das Interaktom bereits bekannte Interaktionspartner für fast alle Köder in den Bibliotheken gefunden werden. Dies bestätigt sowohl die gute Abdeckung der mRNA Population der Zellen, aus denen die Bibliotheken gewonnen wurden, als auch die Reproduzierbarkeit und Funktionalität des YTH Screenings. Die Tatsache, dass in der Population der putativen Interaktionspartner für AtHsf gehäuft Transkriptionsfaktoren auftreten, lässt auf die Art der Vernetzung der AtHsf in den Proteinnetzwerken schließen: Die Regulation der Zielgene erfolgt möglicherweise bevorzugt durch eine direkte Wechselwirkung von Transkriptionsfaktoren verschiedener Familien. Neben der Etablierung der Methoden zur beschleunigten Untersuchung zahlreicher Proben stellte auch die Standardisierung der experimentellen Folgeschritte einen wichtigen Aspekt dar, um eine reproduzierbare Aussage über die Relevanz einer Interaktion treffen zu können. Interessante Ansatzpunkte, sowie Vorschläge für weiterführende experimentelle Arbeiten sollen im Folgenden für die wichtigsten Klone thesenartig dargestellt werden: Ein möglicher Co-Regulator für AtHsfA5 Das mit Hilfe der AtHsfA5-CTD identifizierte unbekannte Protein, codiert durch den Lokus At5g01370, bietet einen Ansatzpunkt für eine gezielte Untersuchung der Rolle und Regulation des AtHsfA5. Die spezifische Interaktion zwischen HsfA5 und HsfA4, die sowohl in A. thaliana als auch in Tomate existiert, sowie das auffällige Fehlen einer hemmenden Aktivität von AtHsfA5 auf HsfA4 an den bisher untersuchten Reporterkonstrukten in Pflanzenzellen, zeichnen diesen TF als einen besonders interessanten Vertreter der AtHsf aus. Es muss wegen der Pflanzenspezifität des Hemmeffektes über die Existenz eines HsfA5 spezifischen Co-Repressors nachgedacht werden. In diesem Zusammenhang kann die Analyse des identifizierten Proteins helfen, einen solchen Regulator zu charakterisieren. Die im Rahmen dieser Arbeit dokumentierten Ergebnisse legen nahe, dass das von At5g01370 codierte Protein mit der NLS-Region von AtHsfA5 interagiert. Da die entscheidenden Experimente bisher nur in Hefe durchgeführt wurden, steht eine Reproduktion in einem pflanzlichen Expressionssystem für weiterführende Arbeiten im Vordergrund. Die Versuche, die Transkriptionseigenschaften von AtHsfA5 durch Co-Expression des unbekannten Proteins oder Co-Transformation eines RNAi induzierenden Plasmides zu beeinflussen, sind bisher mangels Kenntnis der Zielgene von AtHsfA5 fehlgeschlagen. Weitere Schritte bei der Bearbeitung dieser Fragestellung müssen demnach die Suche nach einem geeigneten Testsystem, sowie die experimentelle Bestätigung einer Interaktion beider Proteine in planta sein. Im Rahmen der Promotion wurde der Lokus des identifizierten Gens auf das Vorhandensein einer T-DNA Insertion hin überprüft. Eine entsprechende Linie existiert nicht, so dass transgene Pflanzen durch Transformation von Überexpressions- oder RNAi-Kassetten hergestellt werden müssten. Es ist nicht auszuschließen, dass schon die Deletion einer der beiden chromosomalen Kopien des Gens zu einem lethalen Phänotyp führt und daher keine T-DNA Insertionslinien existieren. In diesem Fall kann möglicherweise der Phänotyp einer Überexpressionspflanze Aufschlüsse über einen Zusammenhang der Funktion des unbekannten Proteins und der Rolle des AtHsfA5 liefern. AtHsfB2a interagiert mit AtDLC8 (At3g15930) Die Interaktion des Dynein Leichte Kette 8 Proteins (DLC8) mit AtHsfB2a bietet ebenfalls Ansätze für weitere Untersuchungen. Durch die mit Hilfe des Interaktoms identifizierte spezifische Interaktion zwischen AtHsfB2a und HsfB2b hebt sich diese Subgruppe der Klasse B der AtHsf von den übrigen Vertretern ab. Die im Ergebnisteil beschriebenen Befunde, vornehmlich aus Experimenten mit Säugersystemen, deuten eine regulatorische Rolle für DLC Proteine allgemein an (zum Beispiel beschrieben für die Interaktion zwischen dem TF Bim aus der Bcl2 Familie und DLC8 (Day et al., 2004)). Eine detaillierte Charakterisierung der im YTH gefundenen Interaktion zwischen DLC8 und AtHsfB2a könnte eine pflanzenspezifische, regulatorische Funktion der DLC Proteine zeigen, die losgelöst von den Transportfunktionen des Dynein Komplexes existiert. Das Fehlen geeigneter Reportersysteme für AHsfB2a stellt in diesem Zusammenhang ein großes Problem dar. Auch für den Lokus At3g15930 existieren keine TDNA Linien, obwohl der gesamte umgebende chromosomale Kontext zahlreiche Insertionen aufweist. Die Herstellung und Kultivierung von Überexpressions- oder „knock down“ Pflanzen für das DLC8 Protein muss zeigen, ob dieses in Verbindung mit HsfB2a essentielle Aufgaben während der Entwicklung bzw. bei der Stressabwehr von A. thaliana übernimmt. Interaktion von AtHsfA9 mit AtDr1 (At5g23090) Der mit Hilfe von AtHsfA9 identifizierte Klon AtDr1 stellt möglicherweise eine Verbindung zwischen den AtHsf und einem sehr allgemeinen Regulationsmechanismus in Pflanzen dar, über den bisher nur sehr wenig bekannt ist. Die meisten Repressoren, die aus nicht-pflanzlichen Systemen beschrieben wurden, üben ihre Funktion genspezifisch aus, d.h. sie binden entweder Promoter-spezifisch an die entsprechenden Zielgene oder an spezifische Bindungspartner. Einer der wenigen Repressoren, die eine generelle Funktion ausüben, ist Dr1. In Säugerzellen zum Beispiel verringert Dr1 die generelle Effektivität der RNA-Polymerase II. Da kürzlich die Existenz und Funktionalität der pflanzlichen Homologe von Dr1 in Reis bewiesen wurde, bietet die nun gefundene Verbindung mit der Gruppe der AtHsf einen viel versprechenden Ansatzpunkt. Allerdings war es im Rahmen der vorliegenden Arbeit nicht möglich, mit Hilfe geeigneter Reportersysteme eine Repression von Promotoren durch Dr1 zu zeigen. Die Etablierung eines solchen Systems (auch endogener chromosomaler Reportersysteme) steht daher im Vordergrund weiterer Untersuchungen. Im Rahmen der Arbeit konnten transgene T-DNA Insertionslinien des Lokus At5g23090 charakterisiert werden, sie liegen für weitere Untersuchungen bereit. Allen voran steht die Analyse des Transkriptionsniveaus verschiedener Zielgene in Wildtyppflanzen sowie in den beschriebenen Mutanten. Weitere Schritte sind die Herstellung und Analyse transgener Pflanzen, die veränderte Mengen an Dr1 und AtHsfA9 aufweisen. Neben der Identifizierung der Vernetzungen der AtHsf mit Dr1 als einem generellen Regulator der Genexpression kann eventuell auch die molekulare Wirkungsweise des Dr1 Repressors in Pflanzen mit Hilfe solcher Experimente entschlüsselt werden. AtHsfB1 interagiert mit AtbZip44 (At1g75390) Die aus den durchgeführten YTH Screenings resultierende wahrscheinlich wichtigste Vernetzung der AtHsf mit bisher unbekannten Co-Regulatoren stellt das Zusammenspiel der Hsf mit den bZip Transkriptionsfaktoren da. Die Kombination des inaktiven HsfB1 mit AtbZip44 führt zu einer verstärkten Aktivierung von Zielgenen, zu denen auch die Gene von HsfA3 und HsfC1 gehören. Obwohl eine direkte Interaktion beider Transkriptionsfaktoren für die synergistische Aktivierung nicht stattfindet, deutet die am Promoter von AtHsfC1 und AtHsfA3 gefundene Konstellation eine bisher unbekannte Rolle für AtHsfB1 an, die von der kürzlich beschriebenen Rolle von LpHsfB1 in Tomatenzellen abweicht. Die gefundenen experimentellen Ergebnisse lassen folgende Hypothese zu: AtHsfB1, der sowohl in Wurzel- als auch in Sprossgewebe unter zahlreichen Stressbedingungen induziert wird, bindet an Promotoren und besetzt dort spezifische Bindestellen, die klassischen HSE. Aufgrund fehlender Aktivatormotive führt diese Bindung zu keiner Aktivierung der Zielgene. Die Promotoren befinden sich jedoch nun in einem Zustand, in dem die Bindung weiterer Aktivatoren, im beschriebenen Fall AtbZip44, zu einer raschen und starken Aktivierung des Gens führt. Durch das Zusammenwirken von zwei unabhängig voneinander bindenden Transkriptionsfaktoren könnte ein erhöhtes Maß an Flexibilität und Sensitivität der Genregulation erreicht werden. Auch eine generelle induzierte Toleranz gegenüber Stress könnte durch die differentielle Expression von AtHsfB1 und weiteren Faktoren erklärt werden. In diesem Fall würde HsfB1 auch nach Beendigung eines Stresszustandes noch an den Promotoren wichtiger Zielgene gebunden bleiben, ohne diese unnötig zu aktivieren. Bei Wiederkehren der Stresssituation wäre eine rasche Reaktivierung durch Synergismen mit kurzlebigen, potenten Aktivatoren, wie zum Beispiel AtbZip44, möglich. Durch die Wechselwirkung von AtHsfB1 mit Vertretern verschiedener Familien von Transkriptionsfaktoren, möglicherweise auch Repressoren, kann so eine Vielzahl von Zielgenen reguliert werden. Die weitere Untersuchung des AtbZip44 erscheint aus zwei Gründen besonders lohnend: (1) AtbZip44 beeinflusst die Synthese der AS Prolin. Prolin stellt ein weit verbreitetes Osmolyt dar, welches als Hydroxyl-Radikal-Fänger fungiert, Plasmamembranen unter Stressbedingungen schützt sowie die Toleranz von Pflanzen gegenüber Frost und Hochsalzbedingungen erhöht. (2) Für AtHsfA5 wurde eine direkte Interaktion mit AtbZip44 in vitro gezeigt. Ob ein Komplex zwischen AtHsfA5 und AtbZip44 eine Transkription an geeigneten Reportern bewirkt, ist allerdings noch offen, und muss durch geeignete Experimente gezeigt werden. Neben umfangreichen Screeningarbeiten, der basalen Charakterisierung aller interessanten Klone und der Detailcharakterisierung der Interaktion zwischen AtHsfB1 und AtbZip44 konnten zusätzlich erste Vorarbeiten mit transgenen Pflanzen für die interessantesten Kandidaten durchgeführt werden. Als Ergebnis der Arbeit stehen somit einige vielversprechende Ansatzpunkte für weitere Studien zur Verfügung, ebenso die standardisierte Technik und die notwendigen konservierten Bibliotheken, um in kurzer Zeit Screenings mit weiteren Köderproteinen durchzuführen. Die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit tragen dazu bei, zukünftige Experimente besser zu planen, sowie die Rolle der Hsf als terminale Komponenten der pflanzlichen Stressantwort weiter zu entschlüsseln und zu verstehen. Die Entschlüsselung der Funktion aller Proteine eines Gesamtorganismus, deren posttranslationale Modifizierungen, die Möglichkeit stabiler sowie transienter Interaktionen mit anderen Proteinen und somit die Vernetzung aller Proteine zu einem Gesamtnetzwerk stellt die große Herausforderung des Zeitalters der „proteomics“ dar. Verliefen während der Entschlüsselung der Genome von Organismen die Informationen auf Nukleinsäureebene noch linear, so dass mit Hilfe eines hohen Automatisierungsgrades ein rascher Fortschritt erzielt werden konnte, so erfordert die so genannte „post-genomics“ Ära hohe finanzielle und personelle Investitionen. Die Nicht-Linearität der Proteinfunktionen, die durch Modifikationen und Wechslwirkungen beeinflusst werden, hat rasch gezeigt, dass ein komplexer Organismus nicht lediglich durch die Kenntnis der Summe seiner Gene verstanden werden kann. Das Zeitalter der „proteomics“ erfordert trotz potenter Hochdurchsatzmethoden und weit fortgeschrittener Computeranalysen mehr denn je ausgefeilte Testmethoden und eine individuelle Untersuchung einzelner Proteine und deren Wechselwirkungen, um schließlich die Kernfrage der Biologie, wie Leben funktioniert, beantworten zu können.
Active neurogenesis continuously takes place in the dentate gyrus of the adult mammalian brain. The dentate gyrus of the adult rodent hippocampus contains an astrocytelike cell population that is regarded as residual radial glia. These cells reside with their cell bodies in the subgranular layer (SGL). Radial processes traverse the granule cell layer (GCL) and form bushy ramifications in the inner molecular layer (IML). The residual radial glial cells apparently represent neuronal progenitor cells that can give rise to functionally integrated granule cells. To date the cellular and molecular events driving a subpopulation of these cells into neurogenesis as well as the cellular transition states are poorly understood. The present study shows, that in the mouse dentate gyrus, this cell type selectively expresses surfacelocated ATPhydrolyzing activity and is immunopositive for nucleoside triphosphate diphosphohydrolase 2 (NTPDase2). NTPDase2 is an ectoenzyme and hydrolyzes extracellular nucleoside triphosphates such as ATP or UTP to their respective nucleoside diphosphates. The enzyme becomes expressed in the hippocampus during late embryogenesis from E17 onwards, and is thus not involved in early brain development. Its embryonicpattern of expression mirrors dentate migration of neuroblasts and the formation of the primary and finally the tertiary dentate matrix. NTPDase2 is also expressed by a transient population of cortical radial glia from late embryonic development until postnatal day 5. NTPDase2 can be employed as a novel markerfor defining cellular transition states along the neurogenic pathway. It is associated with subpopulations of GFAP and nestinpositive cells. These intermediate filaments are typically expressed by the progenitor cells of the dentate gyrus. In addition there is a considerable overlap with doublecortinand PSANCAM positive cells. The expression of the microtubuleassociated protein doublecortin and of PSANCAM which are expressed by migrating neuroblasts is indicative of a transition of progenitors to a neural phenotype or an immature form of granule cell. NTPDase2 is no longer associated with young neurons and with maturegranule cells, as indicated by the lack of doubleimmunostaining for III tubulin and NeuN, respectively. Furthermore, β S100positive astrocytes do not express NTPDase2 validating that NTPDase2 is also not associated with later stages of gliogenesis. Experiments with the Sphase marker bromodeoxyuridine (BrdU) demonstrate that NTPDase2positive cell proliferate. Postmitotic BrdU-labeled cells preferentially acquire an NTPDase2positive phenotype. Many of these cells were also positive for GFAP. The contribution of BrdUlabeled cells positive for NTPDase2 increased with time from 2 h to 72 h, validating a strong association of NTPDase2 with proliferating cells of the dentate gyrus. The colocalization studies with various markers and the results of the experiments suggestthat NTPDase2 is associated with cell types of varying maturation states but not with mature neurons or astrocytes. Studies on the formation of neurospheres from the dentate gyrus validate previous data suggesting that the hippocampal progenitors have little capacity for self renewal in vitro. In situ hybridization results indicate the presence of one of the metabotropic purinergic receptor subtypes (the P2Y1 receptor) within the adult neurogenic regions, the dentate gyrus and the lateral walls of the lateral ventricles. A patchclamp analysis demonstrates the presence of functional ionotropic nucleotide receptor (P2X receptors) in progenitor cells expressing nestin promotordriven GFP. They suggest that the signaling pathway via extracellular nucleotides and nucleotide receptors may play a role in the control of adult hippocampal neurogenesis.
Das für die Phytoen-Desaturase (CrtI) aus Rubrivivax gelatinosus kodierende Gen konnte aus genomischer DNA amplifiziert und in unterschiedliche Expressionsvektoren kloniert werden. Die Funktion der Phytoen-Desaturase wurde in vivo durch Komplemetierung einer Phytoen bildenden E. coli-Transformante überprüft. Die heterologe Expression von crtIRg in E. coli, als lösliches und aktives Enzym mit einer molekularen Masse von 57 kDa, konnte nur mit dem Plasmid pPEUcrtIRg erreicht werden. Mittels in vitro Enzymtests konnten kinetische Parameter und der Kofaktor des Enzyms bestimmt werden. Der Km-Wert für das Substrat Phytoen lag bei 14,8 μM, der Vmax-Wert bei 5,2 nmol/h*mg CrtIRg. Für das Substrat Neurosporin konnte ein Km-Wert von 33 μM und ein Vmax-Wert von 0,6 nmol/h*mg CrtIRg ermitteltwerden. FAD steigerte als Kofaktor den Umsatz des Substrates um das 39-fache. Sowohl für die Phytoen-Desaturase aus Rvi. gelatinosus, als auch für die Phytoen-Desaturase aus Rba. sphaeroides konnte in vitro gezeigt werden, dass die Anzahl der an einem Carotinoidmolekül katalysierten Reaktionsschritte stark von der Enzym- bzw. Substratkonzentration abhängt. Bei einer hohen Phytoen- und einer niedrigen Enzymkonzentration wird fast nur Neurosporin gebildet (3 zusätzliche Doppelbindungen), während bei einer hohen Enzym- und einer niedrigen Phytoenkonzentration deutlich mehr Lycopin synthetisiert wird (4 zusätzliche Doppelbindungen). In den jeweiligen Organismen spielt die Konkurrenz der bakteriellen Phytoen-Desaturase mit dem sich in der Carotinoidbiosynthesekette anschließenden Enzym in Bezug auf die Anzahl der eingefügten Doppelbindungen eine wichtige Rolle. Dies konnte in Hemmstoffuntersuchungen am Beispiel zweier Xanthphyllomyces dendrohous-Mutanten gezeigt werden. Die Verringerung der aktiven CrtI-Menge in der Torulin-Mutante DQ1 förderte die Bildung von β-Carotin (nur 4 Desaturierungsschritte). Dagegen führte die Senkung der aktiven Lycopin-Zyklase-Menge in der β-Carotin-Mutante PR1-104 zur Förderung der durch CrtI katalysierten Reaktion mit der Folge, dass hauptsächlich Torulin gebildet wurde (5 Desaturierungsschritte). Mittels Error Prone PCR sowie dem E. coli-Stamm XL1-Red konnte das Gen crtI aus Rvi. gelatinosus mutagenisiert werden. Die erstellten Mutationsbibliotheken konnten in Phytoen bildenden E. coli-Transformanten exprimiert und Klone mit veränderten Phytoen-Desaturasen mittels Farbscreening identifiziert werden. Aus Klonen mit einem veränderten Lycopin/Neurosporin-Verhältnis wurde die DNA isoliert und crtI sequenziert. Dadurch konnten mutierte Gene ermittelt werden, deren modifizierte Expressionsprodukte entweder mehr Lycopin oder fast ausschließlich Neurosporin bildeten. Es zeigte sich, dass die Veränderung der Aminosäure an Position 208 einen starken Einfluss auf die Anzahl der eingefügten Doppelbindungen hat. Die Aminosäure befindet sich in einer membrangebundenen Helixstruktur bei der es sich vermutlich um einen direkt an der katalytischen Reaktion beteiligten Bereich handelt. Es konnte gezeigt werden, dass alle Mutationen, die die Anzahl der katalysierten Reaktionsschritte senkten, Leucin-Prolin-Austausche (oder umgekehrt) waren. Prolin (bzw. Leucin) veränderte in diesen Fällen die Sekundärstruktur des Proteins wodurch, die Funktion gestört wurde. Neben diesen strukturellen Veränderungen wurden Mutationen ermittelt, die zu einer verstärkten Expression der Phytoen-Desaturase führten, was eine erhöhte Lycopinbildung bewirkte. Es zeigte sich, dass bei einigen dieser Mutanten die Replikation der Plasmid-DNA erhöht war. Die starke Replikation ist wahrscheinlich auf eine Verarmung an beladenen tRNA Molekülen zurückzuführen. In ColE1-Plasmiden (pPEU) kann es zu einer unkontrollierten Replikation kommen, die auf Wechselwirkungen zwischen den Replikationsregulierenden Strukturen RNAI und RNAII mit den unbeladenen tRNA Molekülen zurückzuführen ist. Auf der Grundlage der erlangten Erkenntnisse und mittels Computer gestützter Analysen konnte ein Modell der Sekundärstruktur und der Membranassoziation des Enzyms erstellt werden.
Identifizierung potentieller Schlüsselgene für die Pathogenese des myelodysplastischen Syndroms
(2005)
Das Ziel der vorliegenden Arbeit war die Identifizierung von potentiellen Pathogeneserelevanten Genen in differenzierenden, hämatopoetischen Zellen von Patienten mit myelodysplastischem Syndrom. Grundlage für diese Arbeit war die Etablierung eines in vitro Systems zur Differenzierung primärer, hämatopoetischer Stammzellen. Durch globale Genexpressionsanalyse mit Oligonukleotid Mikroarrays sollten enexpressionsmuster gefunden werden, die die normale Hämatopoese charakterisieren und darüber hinaus zur Identifizierung relevanter Gene für die einzelnen Risikotypen des MDS beitragen. Die Ergebnisse können in Anlehnung an die einzelnen Fragestellungen (Kapitel 1.4.) wie folgt zusammengefasst werden: 1. Welche Gene werden im Verlauf der normalen hämatopoetischen Differenzierung angeschaltet? Bei der Differenzierung normaler hämatopoetischer Stammzellen werden im Verlauf der Erythro-, Granulo- und Megakaryopoese hochdifferentielle transkriptionelle Programme initiiert. Die Betrachtung von Genen mit einem sich kontinuierlich verändernden Expressionsniveau zeigte eine ansteigende Expression linienspezifischer Markergene mit zunehmender Differenzierung der Zellen. Darüberhinaus lassen sich differentielle Gene definieren, die für die einzelnen hämatopoetischen Linien und den Zeitpunkt der Expression im untersuchten Zeitrahmen spezifisch sind. Die Anzahl zellreihenübergreifender „Schlüsselgene“ im Verlauf der normalen hämatopoetischen Differenzierung ist stark begrenzt. Lediglich ein Gen (CD86) wird in allen drei hämatopoetischen Linien exprimiert. 2. Gibt es spezifische Genexpressionsmuster, die für die Differenzierung der unterschiedlichen hämatopoetischen Zellreihen charakteristisch sind? Mit Hilfe der „Class membership prediction“ konnte ein Set von 53 Genen identifiziert werden, deren Expression zu unterschiedlichen Zeitpunkten in den einzelnen hämatopoetischen Linien eine Klassifizierung der Einzelproben gemäß dem determinierenden Stimulus zulassen. Diese prädiktiven Gene haben ein spezifisches Expressionsmuster, das Zellen der Erythro-, Granulo- oder Megakaryopoese charakterisieren kann. 3. Ist eine Differenzierung von CD34+ Stammzellen im in vitro Modell möglich? Lassen sich normale Stammzellen und Stammzellen von Patienten mit MDS unterscheiden? Es wurde ein in vitro Modell zur Untersuchung von differenzierenden hämatopoetischen Stammzellen etabliert und eine liniendeterminierte Differenzierung normaler Stammzellen durch Morphologie und Immunophänotyp bestätigt. Die Untersuchungen zeigen, dass die Differenzierung und Proliferation in vitro differenzierter Zellen bei Patienten mit MDS im Vergleich zu normalen Zellen vermindert ist. Diese in vitro Daten korrelieren gut mit klinischen Befunden des MDS, wonach die veränderte Proliferation und Differenzierung der Stammzellen die Insuffizienz der Hämatopoese beim MDS nach sich zieht. 4. Gibt es Gene, welche die differenzierende myelodysplastische Stammzelle charakterisieren können ? Mittels globaler Genexpressionsanalyse differenzierender CD34+ Zellen ist es möglich, zwischen der Gruppe der low risk MDS, der Gruppe der high risk MDS sowie normalen CD34+ Zellen zu unterscheiden. Diese Ergebnisse könnten für die Einschätzung des Krankheitsrisikos beim MDS herangezogen werden. Die vergleichende Analyse der Genexpression in differenzierenden CD34+ Zellen von gesunden Spendern und MDS-Patienten zeigt, dass die Regulation der Differenzierung beim MDS bereits in CD34+ Zellen und nicht erst auf der Ebene späterer Entwicklungsstufen (wie bisher angenommen) gestört ist. Es konnten eine Reihe von Schlüsselgenen (z.B. DLK1, RAP1GA1, BNIP3L, API5), die in differenzierenden CD34+ Zellen differentiell exprimiert sind, gefunden werden. 5. Welchen Einfluss haben demethylierende und hyperacetylierende Substanzen auf die Genexpression hämatopoetischer Stammzellen? Nur eine relativ begrenzte Anzahl von Genen werden sowohl in normalen als auch in MDS-Zellen durch eine Behandlung mit Decitabine und SAHA induziert bzw. reprimiert. Diese Daten weisen darauf hin, dass die Induktion bzw. Repression der Genexpression in einer gerichteten und spezifischen Art und Weise erfolgen muss. Eine Induktion der Expression konnte in allen verwendeten Stammzelltypen nachvollzogen werden, was zeigt, dass die verwendeten demethylierenden und hyperacetylierenden Substanzen nicht ausschließlich tumorzellspezifisch wirken. Die verstärkte Suppression der Expression von Transkriptionsregulatoren in MDS-Zellen deutet darauf hin, dass eine Verbesserung der Hämatopoese in MDS-Patienten durch Behandlung mit Decitabine und SAHA möglicherweise primär durch die Blockierung von Signalkaskaden und nicht durch die Aktivierung von Tumorsuppressorgenen erreicht wird. 6. Unterscheiden sich die Genexpressionsprofile von low und high risk MDS-Zellen nach Behandlung mit Decitabine und Suberoylanilidhydroxaminsäure? Die veränderte Genexpression in high und low risk MDS-Zellen zeigen nach einer Behandlung mit Decitabine und SAHA unterschiedliche Profile. Die Anzahl von induzierten Genen in high risk MDS-Zellen ist höher als in low risk MDS-Zellen. Nur wenige Gene lassen sich in beiden Zelltypen induzieren (2 Gene). Der Effekt der Behandlung auf das Genexpressionslevel ausgewählter Gene zeigt einen graduellen Verlauf, wobei z.B. die Genexpression in normalen Zellen, hin zu Zellen von low risk MDS und schließlich zu high risk MDS-Zellen abnimmt (Methylierung). Diese Resultate lassen vermuten, dass in normalen und MDS-Zellen zwar die gleichen Gene durch eine Behandlung induziert werden, das Maß der Induktion aber vom Subtyp und möglicherweise von der Schädigung der Zelle abhängt. 7. Welche Hinweise zum Pathomechanismus des MDS können mit Hilfe globaler Genexpressionsanalysen gesammelt werden? Mit Hilfe der Genexpressionsanalysen konnte bestätigt werden, dass Zellen von MDSPatienten bereits auf Ebene der Stammzelle Defekte aufweisen und dass diese alterierten Stammzellen ein transkriptionelles Programm determinieren, das massive Alterationen zum transkriptionelles Programm normaler Zellen aufweist. Eine gestörte Expression essentieller linienspezifischer Markergene der Erythro-, Granulo- und Megakaryopoese konnte identifiziert werden und bestätigt die klinischen Befunde. Im Zuge dieser Untersuchungen sind darüber hinaus neue Kandidatengene, die an der Pathogenese des MDS beteiligt sein könnten erstmals durch eine massiv gestörte Expression im Vergleich zu normalen Zellen gefunden worden.
Molekulare Regulation der UDP-Zucker-Biosynthese Untersuchungen anhand der myo-Inositoxygenase
(2006)
Der Nukleotidzucker UDP-Glucuronsäure ist die prinzipielle Zuckervorstufe für UDP-Galacturonsäure, -Xylose, -Arabinose und –Apiose, welche alle in die Zellwandpolymere der pflanzlichen Zellwand einfließen. UDP-Glucuronsäure kann in Arabidopsis über zwei alternative, funktionelle Synthesewege gebildet werden, wobei entweder die UDP-Glucose-Dehydrogenase oder die myo-Inositoxygenase als Schlüsselenzym, welche den Kohlehydratfluss in Richtung Zellwandbiosynthese katalysiert, involviert ist. In dieser Arbeit wurden die Gene für die Enzymisoformen der Inositoxygenase (MIOX) aus Arabidopsis thaliana analysiert. Sie repräsentieren eine kleine Genfamilie bestehend aus vier Isoformen. Studien mittels Promotor::GUS-Konstrukten und RT-PCR zeigten, dass die Transkription der MIOX-Gene eine sehr transiente und organspezifische Genexpression ist. Die Isoformen MIOX1 und MIOX2 ließen sich in nahezu allen Geweben nachweisen wogegen die Isoformen MIOX4/5 nur in den generativen Geweben aufzufinden waren. Es konnte eine deutliche Präsenz aller vier MIOX-Isoformen in den generativen Geweben nachgewiesen werden und die Nukleotidzucker, die während der Samenentwicklung benötigt werden, scheinen überwiegend über die MIOX zur Verfügung gestellt zu werden. So zeigen T-DNA-Insertionslinien von ΔMIOX1 & 2 eine reduzierte Schleimhülle um die Samen und eine erhöhte Ausfallrate bei der Samenentwicklung auf. Ansonsten zeigen die untersuchten T-DNA-Insertionslinien einen ähnlichen Wuchs wie der Wildtyp auf. Auch konnten keine Unterschiede über die durchgeführten Zellwandanalysen, mittels GC-MS, MALDI und Dionex-HPLC verifiziert werden, was durch die Redundanz der MIOX- und UGD-Isoformen erklärt werden könnte. Nichtsdestotrotz konnte bei den Isoformen ΔMIOX1 & 2 eine dramatische Reduktion beim Einbau von 3H-Inosit in Zellwandpolymere von Keimlingen verzeichnet werden, was einen klaren Beweis für eine funktionelle MIOX liefert, da in diesem Gewebe diese beiden Isoformen die einzig aktiven sind. Außerdem konnten über Promotor-Deletions-Analysen potentielle cis-Elemente für die Promotoren von MIOX2 und MIOX4 aufgedeckt werden.
In der vorliegenden Arbeit konnte die β-Carotin-Ketolase aus dem Cyanobakterium Synechocystis PCC 6803 nach heterologer Expression in E. coli gereinigt und enzymatisch charakterisiert werden. Die Funktion der β-Carotin-Ketolase wurde in vivo durch Komplementierung von β- Carotin-produzierenden E. coli-Transformanten überprüft. Die β-Carotin-Ketolase agierte hier auch als Diketolase und synthetisierte sowohl Echinenon als auch Canthaxanthin. Untersuchungen der Substratspezifität der β-Carotin-Ketolase in vivo und in vitro ergaben, daß nur Carotinoide erkannt werden, die einen β-Iononring ohne Hydroxygruppe in Position C3 aufwiesen. So wurden die Carotinoide β-Carotin, Echinenon, β-Cryptoxanthin und α-Carotin als Substrate erkannt und zu Echinenon, Canthaxanthin, 3’-Hydroxyechinenon und 4-Keto-α-Carotin umgesetzt. Zeaxanthin, 3’-Hydroxyechinenon, 4-Ketozeaxanthin sind keine Substrate der β-Carotin-Ketolase. Die β-Carotin-Ketolase kann einen ε-Iononring, wie in α-Carotin, nicht modifizieren. Die β-Carotin-Ketolase mit einer apparenten Molmasse von 61 kDa wurde durch pPQE30crtO und pPEU30crtO als rekombinantes Polypeptid mit sechs N-terminalen Histidinen in E. coli heterolog exprimiert. Die kinetischen Parameter der β-Carotin-Ketolase konnten in in vitro-Enzymaktivitätstests bestimmt werden. Der KM-Wert für das Substrat β-Carotin lag bei 41,6 μM und der dazugehörende Vmax-Wert bei 1,318 μmol mg-1 h-1. Für das Substrat Echinenon wurde ein KM-Wert von 35,3 μM und ein Vmax-Wert von 0,339 μmol mg-1 h-1 ermittelt. Die Spezifität der β-Carotin-Ketolase war für β-Carotin dreimal höher als für Echinenon. Es konnte keine Kofaktorabhängigkeit nachgewiesen werden, aber eine starke Abhängigkeit der β-Carotin-Ketolase von molekularem Sauerstoff. Die Zugabe des Detergenz Nonidet P-40 in in vitro-Enzymaktivitätstests erhöhte die enzymatische Aktivität der β-Carotin-Ketolase deutlich. Durch die Metallionen-Affinitätschromatographie konnte das Enzym annährend zur Homogenität (93%) unter Erhalt seiner enzymatischen Aktivität gereinigt werden. Dabei blieb die enzymatische Aktivität der β-Carotin-Ketolase nicht nur erhalten, sondern steigerte sich im Vergleich zur Aktivität in der cytosolischen Fraktion um den Faktor 4,5. Die funktionelle Expression der β-Carotin-Ketolase in höheren Pflanzen Nicotiana tabacum, N. tabacum CrtZ Linie U3, N. glauca und Solanum tuberosum Baltica 47-18 erfolgte unter der Kontrolle des konstitutiven CaMV 35S-Promotors. Außer in der Transformante N. glauca CrtO schien die Integration der Ketolase in das Genom der Pflanzen und die Expression von CrtO die Fitness der Transformanten, gemessen am Chlorophyllgehalt und der photosynthetischen Effizienz, nicht negativ beeinflußt zu haben. Der Gesamtcarotinoidgehalt in den Blättern von N. tabacum CrtO und N. tabacum CrtZ Linie U3 CrtO änderte sich trotz der Integration des crtO-Gens kaum im Vergleich zu den Wildtypen. In Blättern von S. tuberosum Baltica 47-18 CrtO konnte eine leichte Erhöhung des Gesamtcarotinoidgehaltes beobachtet werden. Dagegen kann es in Blättern von N. glauca CrtO zu einer Verdoppelung des Carotinoidgehaltes bei gleichzeitig halbiertem Chlorophyllgehalt. In den Blättern akkumulierten Ketocarotinoide mit Anteilen von 5% in N. tabacum CrtO, 12% in S. tuberosum Baltica 47-18 CrtO, 18% in N. tabacum CrtZ Linie U3 CrtO und 16-33% in N. glauca CrtO. Die Anteile der synthetisierten Ketocarotinoide setzten sich in den Blättern von N. tabacum CrtO und N. tabacum CrtZ Linie U3 CrtO aus Echinenon, 3’-Hydroxyechinenon und Ketolutein zusammen, während in Blättern von N. glauca CrtO und S. tuberosum Baltica 47-18 CrtO Echinenon, 3’-Hydroxyechinenon und 4-Ketozeaxanthin enthalten waren. In Nektarien von N. tabacum CrtO und N. tabacum CrtZ Linie U3 CrtO wurde der Gesamtcarotinoidgehalt verdoppelt bis verdreifacht im Vergleich zu den Nektarien des entsprechenden Wildtyps. Es akkumulierten Echinenon, 3’-Hydroxyechinenon, 4-Ketozeaxanthin und Ketolutein. Dabei enthielten die Nektarien von N. tabacum CrtZ Linie U3 CrtO die meisten Ketocarotinoide. Die Nektarien von N. glauca CrtO enthielten deutlich weniger Ketocarotinoidanteile, obwohl der Gesamtcarotinoidgehalt fast dreimal so hoch ist wie in N. tabacum CrtO und N. tabacum CrtZ Linie U3 CrtO. Es akkumulierten nur Echinenon, 3’-Hydroxyechinenon und Ketolutein. Die anderen Blütenorgane von N. glauca CrtO wiesen deutlich höhere Anteile an Ketocarotinoiden auf, zeigten aber wie die Nektarien gegenüber dem Wildtyp keine deutlichen Unterschiede im Gesamtcarotinoidgehalt. Für die Synthese von Astaxanthin war eine Interaktion zwischen der β-Carotin-Hydroxylase und der β-Carotin-Ketolase von entscheidender Bedeutung. Die Akkumulation von „Intermediaten“ der Astaxanthin-Biosynthese in N. tabacum CrtO, N. tabacum CrtZ Linie U3 CrtO und N. glauca CrtO wies auf eine erfolgreiche Interaktion hin. Einzig in den Knollen der CrtO-Transformanten von S. tuberosum Baltica 47-18 konnte Astaxanthin mit einem Anteil von 2% am Gesamtcarotinoidgehalt nachgewiesen werden. Die Nektarien N. tabacum CrtZ Linie U3 CrtO erwiesen sich neben den Knollen als am besten für die Produktion von ketolierten und hydroxylierten Carotinoiden. Die Transformation von N. glauca mit einem Gen der Carotinoidbiosynthese wurde in der vorliegenden Arbeit erstmals durchgeführt, zeigte aber nicht die erwartete Produktion größerer Mengen an Ketocarotinoiden in Kronblättern. Außerdem ist es in der vorliegenden Arbeit erstmals gelungen, in der Kartoffelknolle durch die Einführung einer cyanobakteriellen β-Carotin-Ketolase die Biosynthese von Ketocarotinoiden zu etablieren, um das für die Ernährung wichtige Ketocarotinoid Astaxanthin zu akkumulieren.
Background The reciprocal (9;22) translocation fuses the bcr (breakpoint cluster region) gene on chromosome 22 to the abl (Abelson-leukemia-virus) gene on chromosome 9. Depending on the breakpoint on chromosome 22 (the Philadelphia chromosome – Ph+) the derivative 9+ encodes either the p40(ABL/BCR) fusion transcript, detectable in about 65% patients suffering from chronic myeloid leukemia, or the p96(ABL/BCR) fusion transcript, detectable in 100% of Ph+ acute lymphatic leukemia patients. The ABL/BCRs are N-terminally truncated BCR mutants. The fact that BCR contains Rho-GEF and Rac-GAP functions strongly suggest an important role in cytoskeleton modeling by regulating the activity of Rho-like GTPases, such as Rho, Rac and cdc42. We, therefore, compared the function of the ABL/BCR proteins with that of wild-type BCR. Methods We investigated the effects of BCR and ABL/BCRs i.) on the activation status of Rho, Rac and cdc42 in GTPase-activation assays; ii.) on the actin cytoskeleton by direct immunofluorescence; and iii) on cell motility by studying migration into a three-dimensional stroma spheroid model, adhesion on an endothelial cell layer under shear stress in a flow chamber model, and chemotaxis and endothelial transmigration in a transwell model with an SDF-1α gradient. Results Here we show that both ABL/BCRs lost fundamental functional features of BCR regarding the regulation of small Rho-like GTPases with negative consequences on cell motility, in particular on the capacity to adhere to endothelial cells. Conclusion Our data presented here describe for the first time an analysis of the biological function of the reciprocal t(9;22) ABL/BCR fusion proteins in comparison to their physiological counterpart BCR.
Das sympathische Nervensystem entsteht aus Vorläuferzellen der Neuralleiste, die an die dorsalen Aorta gelangen und dort die primären sympathischen Ganglien bilden. Der Entwicklungsverlauf dieser Zellen hängt von den Signalen ab, welche sie während ihrer Wanderung empfangen. Die Differenzierung der Vorläuferzellen wird an der dorsalen Aorta angeregt. Als Signalmoleküle dienen die BMPs, die von der dorsalen Aorta gebildet und sezerniert werden. Die BMPs induzieren in den Vorläuferzellen die Expression der Transkriptionsfaktoren Mash1, Phox2b, Hand2 und Phox2a, die notwendig für den weiteren Differenzierungsprozess sind. Diese Transkriptionsfaktoren steuern direkt oder indirekt die Expression der terminalen Differenzierungsgene TH, DBH, SCG10 und NF160. In der vorliegenden Arbeit wird gezeigt, dass die Zink-Finger-Transkriptionsfaktoren Gata2 und Gata3 ebenfalls eine essentielle Funktion in der Entwicklung sympathischer Neurone ausüben. Im Huhnembryo wird, im Gegensatz zur Situation in der Maus, in den sympathischen Vorläuferzellen nur Gata2 exprimiert. Gata2 wird nach den Transkriptionsfaktoren Mash1, Phox2b, Hand2 und Phox2a, jedoch vor den noradrenergen Markergenen TH und DBH exprimiert. Die Expression von Gata2 ist BMP-abhängig, wie durch BMPÜberexpression und BMP-Funktionsblockierung gezeigt wird. Die Überexpression von Mash1, Phox2b und Hand2 in Vorläuferzellen führt zur Expression von Gata2. In der Phox2b-Nullmutante sind Gata2 und Gata3 nicht exprimiert. Damit ist Gata2/3 unterhalb von Mash1, Phox2b und Hand2 in der BMP-induzieren Signalkaskade einzuordnen. Die Funktionsblockierung von Gata2 im Huhnembryo und die Eliminierung des Gata3-Gens in der Maus ergaben eine starke Reduktion in der Größe der sympathischen Ganglien. Zusätzlich war die Expression des noradrenergen Markergens TH stark reduziert. Die Überexpression von Gata2 in Neuralleistenvorläuferzellen führt vorwiegend zur Entstehung von Neuronen, die keine autonomen Eigenschaften aufweisen und TH-, Phox2b- und Mash1-negativ sind. Die vorliegenden Ergebnisse zeigen, dass Gata2 im Huhn und Gata3 in der Maus Mitglieder des regulatorischen Netzwerks von Transkriptionsfaktoren sind, das essentiell für die Entwicklung sympathischer Neurone ist. Die Funktion der Gata-Faktoren in der noradrenergen Differenzierung autonomer sympathischer Neurone scheint jedoch von der Interaktion mit Koregulatoren abhängig zu sein, die in sympathischen Vorläuferzellen vorhanden sind. In Vorläuferzellen, welche diese Kofaktoren nicht erhalten, induziert Gata2 nahezu ausschließlich nicht-adrenerge Neurone. Gata2 könnte mit Phox2a/b und Hand2 interagieren, oder mit anderen unbekannten Faktoren die in den sympathischen Vorläuferzellen exprimiert sind. Die Entwicklung sympathischer und parasympathischer Neurone wird von BMPs sowie von den Transkriptionsfaktoren Mash1 und Phox2b gesteuert. Der Differenzierungsprozess in sympathischen und parasympathischen Ganglien führt zu unterschiedlichen Transmitterphänotypen. Sympathische Ganglien bestehen vorwiegend aus noradrenergen, parasympathische Ganglien dagegen aus cholinergen Neuronen. Hand2 wird in sympathischen Neuronen und nicht in parasympathischen Ziliarneuronen exprimiert und gilt als Transkriptionsfaktor der den noradrenergen Transmitterphänotyp spezifiziert. In der vorliegenden Arbeit wird gezeigt, dass auch die Transkriptionsfaktoren Gata2/3 nicht in parasympathischen Ziliarganglien exprimiert werden. Die Expressionsanalysen an mehreren parasympathischen Ganglien zeigte jedoch, dass die Expression von Gata2/3- nicht vollständig mit der noradrenergen Genexpression korreliert. Die Analyse der Gata2/3- Expression im Locus ceoruleus, dem wichtigsten noradrenergen Zentrum im Gehirn ergab, dass Gata2 und Gata3 im LC des Huhnembryos nicht exprimiert werden. Die Expression von Gata2/3 hängt somit nicht zwingend mit den noradrenergen Phänotyp zusammen. Die selektive Funktion von Gata2/3 in der Entwicklung peripherer noradrenerger Neurone zeigt zudem, dass der noradrenerge Phänotyp in den peripheren und zentralen Neuronen unterschiedlich reguliert wird.
Der Einfluss von Stress auf einen Organismus führt zur Expression molekularer Chaperone unterschiedlichster Hitzestressprotein-(Hsp)-Familien, die die Zellen vor stressbedingten Schäden schützen. Mitglieder der Hsp2O-Familie (kurz small Hsps, sHsps) besitzen ein Molekulargewicht von 12-43 kDa und sind durch einen zentralen, evolutiv konservierten Bereich, der als alpha-Crystallin-Domäne (ACD) bezeichnet wird, gekennzeichnet. Diese besteht größtenteils aus beta-Strängen, während die flankierenden Bereiche hingegen variabel in Länge, Sequenz sowie Sekundärstrukturen sind. sHsps bilden mit Hilfe der Sekundärstrukturen oligomere Komplexe aus. Darüber hinaus besitzen sie eine ATP-unabhängige Chaperonaktivität und spielen beim Schutz thermosensitiver Proteine eine wichtige Rolle. In Pflanzenzellen führt ein anhaltender Hitzestress zur Ansammlung von sHsps zu so genannten Hitzestressgranula (HSGs), die sich wiederum zu größeren HSG-Komplexen (HSCs) organisieren. Eine mögliche Funktion von HSCs ist der Schutz zellulärer denaturierter Proteine vor einer irreversiblen Aggregation. Durch deren Bindung mittels sHsps und Eingliederung in den HSC-Verband werden die denaturierten Proteine in einem faltungskompetenten Zustand gehalten. Schließlich können die mit den HSCs assoziierten ATP-abhängigen Hsp-Maschinen (z.B. Hsp70/40, Hsp100) die sHsp-gebundenen Substrate renaturieren. Wie in der vorliegenden Arbeit dargestellt, weisen Pflanzen die höchste soweit bekannte Anzahl von sHsp-Genen auf. Die korrespondierenden Proteine werden anhand ihrer Primärsequenz und subzellulären Lokalisation in verschiedene Klassen eingeteilt: sHsps der Klassen CI und CI1 befinden sich im nucleo-cytoplasmatische Raum, sHsps der Klasse M in Mitochondrien, der Klasse P in den Plastiden und der Klasse ER im endoplasmatischen Reticulum sowie im Golgi-Apparat. Da das Genom von Arabidopsis thaliana das erste komplett sequenzierte pflanzliche Genom ist, eignete sich dieser Modelorganismus zur Identifikation aller sHsp kodierenden Gene. Der Einsatz von Protein- und Nukleotidsequenzen bereits bekannter pflanzlicher sHsps als Suchkriterium in der NCBI-Datenbank (BLASTP und BLASTN), ergab die ldentifikation 19 putativer sHsp kodierender Gene, von denen erstaunlicheweise 13 bislang noch nicht bekannt waren. Proteinsequenzvergleiche ergaben, dass 7 der neu entdeckten sHsps nicht den typischen Klassen zugehörig sind. Dies bildete den Ausgangspunkt für deren nähere Analyse und Charakterisierung im Rahmen des ,,Functional Genomics": (1) Lokalisationsstudien I: Myc-Epitop markierte sHsp-Konstrukte wurden transient in Tabak-Mesophyllprotoplasten transformiert. Über Lokalisationsstudien per lmmunfluoreszenz konnten diese Proteine in tatsächlich 7 neu definierte sHsp Klassen eingeteilt werden. Interessanteweise werden die Vertreter dieser neuen Klassen von jeweils nur einem Gen kodiert. Die Vertreter der Klassen CI11 bis CVII lokalisieren im nucleo-cytoplasmatischen Kompartiment. Ferner bewiesen die Kodetektionen von organellären Markerproteinen, dass Klasse MII sHsps in die Mitochondrien und Mitglieder der Klasse Po in die Peroxisomen transportiert werden. Dies stimmte überein mit der Vorhersage von organellären Signalsequenzen. (2) Lokalisationsstudien II: Frühere Studien zeigten, dass sHsps der Klassen CI und CII unter Hitzestressbedingungen HSCs ausbilden. Wahrscheinlich fungieren Klasse CII sHsps als Grundgerüst für die HSC-Bildung und rekrutieren sHsps der Klasse CI in diese Multichaperonkomplexe. Die Proteine (Myc-markiert) Hsp17.4-CIII, Hsp15.4-CIV, Hsp18.5-CVI und Hsp14.7-CVII wurden unter Hitzestressbedingungen in endogene HSCs von Tabak-Mesophyllprotoplasten eingegliedert. Dieses Phänomen bleibt auf die genannten sHsp Klassen beschränkt, da weder Hsp21.7-CV, noch die organellären Proteine Hsp26.5-MI1 sowie Hsp15.7-Po in HSCs detektiert wurden. (3) Das sHsp-lnteraktom: Im Gegensatz zu früheren Studien, konnte in der vorliegenden Arbeit eine lnteraktion zwischen sHsps verschiedener Klassen zum ersten Mal im Hefe-Zwei-Hybrid-System sowie über Pull-down und nativer SDS-Gelelektrophorese detektiert werden. Am Beispiel eines Klasse CIII sHsps wurde gezeigt, dass die lnteraktion mit sHsps anderer Klassen zu einer Heterooligomerisierung führt. Dies wiederum hat eine nachhaltige Beeinflussung der intrazellulären Lokalisation der sHsps zur Folge. (4) Darüber hinaus ist für sHsps der Klasse CIII typisch, dass sie aufgrund einer Kernlokalisationssequenz innerhalb der ACD in den Nukleus transportiert werden. Im Vergleich zu sHsps der Klassen CI und CII, die Oligomere Strukturen von 220-230 kDa ausbilden, assemblieren sHsp-Monomere der Klasse CIII zu hochmolekularen Komplexen im Bereich von 1 MDa. (5) Das sHsp-Transkriptom: Durch RT-PCR-Analysen und Auswertung der öffentlich zugänglichen Microarray-Daten des AtGenExpress Konsortiums, konnte die Expression aller sHsps kodierenden Gene im Arabidopsis Genom auf transkriptioneller Ebene analysiert werden. Es zeigte sich, dass neben Hitzestress auch der Einfluss anderer abiotischer Stressoren, wie U. a. oxidativer stress und UV-B Bestrahlung, zu einer Akkumulation von sHsp-Transkripten führt. Ferner werden einige sHsps in bestimmten Entwicklungsstufen bzw. Organen, wie z.B. Blüten, Blättern und Samen, unabhängig von Stresseinflüssen exprimiert. (6) Funktionelle Analysen: Ein seminatives in vitro Chaperontestsystem, in dem Luciferase als thermosensitives Modelsubstrat eingesetzt wird, wurde herangezogen, um ausgesuchte sHsps bezüglich ihrer möglichen Chaperonfunktion zu testen. In Abhängigkeit der rekombinant hergestellten Proteine Hsp18.5-CVI, Hsp26.5-MII und Hsp15.7-Po konnte eine verminderte Aggregation der Luciferase unter Hitzestresseinwirkung und eine darauf folgende erhöhte Renaturierung durch ATP-abhängige Chaperonmaschinen während einer Erholungsphase beobachtet werden. (7) Peroxisomale sHsps: Da nie zuvor über peroxisomale sHsps berichtet wurde, nahm Hsp15.7-Po eine besondere Rolle bei den Untersuchungen ein. Dieses Protein besitzt eine putative peroxisomale Lokalisationssequenz (PTS) am C-Terminus, bestehend aus der Abfolge der Aminosäurereste SKL (PTS1). Durch Hefe-Zwei-Hybrid-Studien und lmmunfluoreszenzanalysen (in Tabak-Mesophyllprotoplasten und Säugerzellen) sowie den Einsatz von Mutanten wurde demonstriert, dass die PTS1 tatsächlich für die lnteraktion von Hsp15.7-Po mit den TPR-Domänen des peroxisomalen Importrezeptors Pex5 und für die peroxisomale Lokalisation des sHsps verantwortlich ist. Ein Hefe-Zwei-Hybrid-Screening nach möglichen lnteraktionspartnern von Hsp15.7-Po lieferte den ersten Anhaltspunkt für die lnteraktion mit cytoplasmatischen sHsps (Hspl7.7-CII). Dies ließ sich durch Pull-down-Analysen bestätigten und auf Hsp17.6-CII erweitern. Diese Interaktionen beeinflussten jedoch nicht die subzelluläre Lokalisation der jeweiligen Proteine bei Koexpression in Tabak-Mesophyllprotoplasten. All die hier dargestellten Ergebnisse weisen auf diverse Funktionen der einzelnen neu identifizierten sHsps der unterschiedlichen Klassen hin und bilden die Grundlage für zukünftige, detaillierte in planta Untersuchungen, die hierdurch erleichtert werden können.
Im Gegensatz zu den Arbeiterinnen der sozial lebenden Wespen und Bienen sind alle Ameisen flügellos. Die Flügellosigkeit der Ameisenarbeiterinnen bedingt, dass selbst kleinste Räume in der Erde oder in Holz von Kolonien besiedelt werden können. Sie war eine wichtige Voraussetzung für ihre Vorherrschaft auf dem Boden. Die für bodennistende Arten als Baumaterial in Frage kommende Erde hat jedoch die Eigenschaft, dass z. B. starke Regenfälle die Stabilität der Bauwerke negativ beeinflussen können. Deshalb und weil Erde in den höheren Regionen des Laubdaches schwierig zu beschaffen ist, sind Erdnester für den Übergang zum Leben in den Baumkronen wenig geeignet. Höhlungen in verrottendem Holz stehen aufgrund der schnellen Zersetzung in den Tropen nur für einen relativ kurzen Zeitraum und wenig regelhaft zur Verfügung. Der dadurch vorherrschende Mangel an Nistraum im tropischen Regenwald ist möglicherweise der wichtigste Faktor der Koloniegrößeregelung bei Ameisen. Erst mit dem Übergang zu aktivem Freinestbau ist es den Ameisen gelungen, sich (i) unabhängig von natürlichen Höhlen zu machen und dadurch große Kolonien zu etablieren, (ii) den Kronenraum als Habitat dauerhaft zu erschließen, (iii) negativen Witterungseinflüssen entgegenzuwirken und (iv) vorhandene Nahrungsressourcen in diesem Stratum permanent zu nutzen. Die in der vorliegenden Arbeit untersuchten freinestbauenden Ameisen sind selbst in der Lage, additiv Nistraum zu schaffen. Die Vertreter dieser Gilde legen ihre Nester nicht in der Erde oder in natürlichen oder selbst ,ausgeräumten-- Hohlräumen von Bäumen an, sondern konstruieren aktiv frei in der Laubregion der Holzgewächse Nisträume bzw. Unterstände, indem sie Material zusammentragen oder herstellen, mit dem eine Abschottung des Brut- und Nahrungsraumes gegenüber der Umwelt erreicht wird. Die erfolgreiche Besiedlung der Kronenregion war den Ameisen nur durch veränderte Bautechniken und eine verbesserte und angepasste Materialverwendung möglich. Gegenstand der vorliegenden Dissertation war zunächst die Bestandsaufnahme der freinestbauenden Ameisen der Baumkronenregion südostasiatischer Regenwälder. Der erste Schritt einer Analyse der Freinestkonstruktionen von Ameisen bestand darin, die Vielfältigkeit der verwirklichten Nestformen zu erfassen und darzustellen, Gemeinsamkeiten und Unterschiede herauszuarbeiten und die beteiligten Ameisenarten zu identifizieren. Im zweiten Teil der Arbeit wurden intensiv die proximaten Mechanismen des aktiven Nest- und Pavillonbaus untersucht. Dazu wurden die einzelnen Schritte der Nestentwicklung für sieben Ameisenarten aus sechs Gattungen in allen Details dargestellt und zusammenfassend beschrieben. Es wurde ermittelt, welche Baumaterialien die verschiedenen Ameisen nutzen und wie diese Materialien verwendet werden. Zur Bestimmung der verschiedensten Nesttypen wurden neben architektonischen Unterschieden auch Differenzen in der Substratwahl, Materialbeschaffenheit und in der Funktion der Nestkonstruktionen berücksichtigt. Als weiteres Kriterium zur Klassifikation arborealer Nestanlagen diente die Verschiedenartigkeit der Materialbearbeitung und der Substratvorbereitungen durch die Ameisen. Einige dieser Nestcharakteristika sind quantitativer, andere qualitativer Natur. Im Verlauf der Untersuchung wurden 1767 Kolonien bearbeitet und eingeordnet. Davon konnten insgesamt 100 Arten bzw. Morphospezies bestimmt und als echte Freinestbauer im Sinne der vorher formulierten Definition charakterisiert werden. Die ermittelten Arten verteilten sich auf acht Gattungen aus den drei Unterfamilien Formicinae, Dolichoderinae und Myrmicinae. Diese drei Unterfamilien gelten als die am weitesten entwickelten Ameisen und dominieren in der Kroneregion tropischer Regenwälder. Auffallend an dieser höher entwickelten Gruppe von Ameisen ist die Tendenz, pflanzliche Produkte als Hauptnahrungsressource zu nutzen. Die artenreichste Gattung Polyrhachis (39 Arten) gehört der Unterfamilie Formicinae an; zusammen mit den Gattungen Camponotus (10) und Oecophylla (1) wurden allein 50 Arten aus dieser Unterfamilie gefunden. In der Gattung Camponotus konnten zwei Untergattungen (C. Karavaievia, C. Myrmotarsus) mit freinestbauenden Arten ermittelt werden. Mit 29 identifizierten Arten aus drei Gattungen stellten die Myrmicinae die zweitgrößte Unterfamilie, wobei allein 23 Arten auf die Gattung Crematogaster entfielen. In den beiden anderen Myrmicinen-Gattungen Monomorium (5 Arten) und Myrmicaria (1 Art) fanden sich nur vergleichsweise wenige Vertreter mit Freinestbau. Die dritte Unterfamilie, die Dolichoderinae, wird durch die Gattungen Dolichoderus und Technomyrmex mit zusammen 21 Arten repräsentiert. Die als Freinestbauer ermittelten Ameisenarten zeigen hinsichtlich ihrer Koloniestruktur und Nestorganisation einige nennenswerte Parallelen. Die Mehrzahl der Arten lebt in polydomen Kolonieverbänden, die ihre manchmal mehr als 200 Nestanlagen meist nur auf eine einzelne oder wenige Nestpflanzen verteilen. In den Gattungen Camponotus und Monomorium sind alle Arten polydom organisiert, bei Dolichoderus und Technomyrmex sind es 90 % und bei Crematogaster 70 %. Polydomie findet man auch bei Myrmicaria arachnoides und Oecophylla smaragdina. Als weitere Gemeinsamkeit fällt ins Auge, dass mit Ausnahme von Myrmicaria arachnoides und Polyrhachis spp. funktionell als Stallnester zu charakterisierende Nestkonstruktionen überwiegen. Insbesondere bei Technomyrmex (100 %), Dolichoderus (100 %), Camponotus (70 %), Crematogaster (82 %), aber auch bei Monomorium (100 %) und Oecophylla smaragdina besteht eine ausgeprägte Tendenz, die Honigtau liefernden Trophobionten und die Brut in denselben Bauten unterzubringen. Bei den meisten Arten besteht somit ein enger Zusammenhang zwischen Freinestbau und trophobiotischer Ernährungsweise. Diese enge räumliche Vereinigung von Nahrungs- und Nistressourcen bildet die Basis für die Entwicklung individuenreicher, konkurrenzstarker und ökologisch dominanter Ameisenarten in der Kronenregion. Insgesamt wurden 22 unterscheidbare Nesttypen ermittelt und in allen Einzelheiten dargestellt. Auf 47 Bildtafeln wurden dazu fotografisch und zeichnerisch die Charakteristika der verschiedenen Nesttypen hinsichtlich der Nestarchitektur und ethologischer Besonderheiten der beteiligten Ameisenarten abgebildet. Während die Anzahl der freinestbauenden Ameisenarten sicherlich nur annähernd erfasst werden konnte, ist bei der Darstellung der verschiedenen Nesttypen zu erwarten, dass die erfolgreichsten, auf der Basis ethoökologischer sowie material- und substrattechnischer Unterschiede ermittelten Erscheinungsformen aufgeklärt werden konnten. Die vorgenommene Unterteilung der Hauptkategorie ,Nestsubstrat-- in drei blattgebundene und zwei stammgebundene Unterkategorien zeigte, dass die zweifach geschützte und materialsparende Position zwischen Blättern, von zusammen 13 Arten aus den Gattungen Polyrhachis (6), Camponotus (Karavaievia) (2), Oecophylla (1) und Crematogaster (3) präferiert wurde. Nester auf der vergleichsweise ungeschützten Blattoberseite wurden nur von Arten der Gattung Polyrhachis gebaut. Die bevorzugte Position der Polyrhachis-Nester war auf der Blattunterseite, 67 % aller Polyrhachis Nester waren dort lokalisiert. Die Nester der Untergattung Camponotus (Karavaievia) waren zu 75 % und die von Technomyrmex, Monomorium und Myrmicaria gar zu 100 % auf der Blattunterseite angebracht. Zusammen betrachtet waren 64 % aller im Rahmen der vorliegenden Arbeit aufgenommenen Nestbauten auf der Unterseite einzelner Blätter zu finden. Von allen Nestbauten auf Stamm- und Astoberflächen waren 75 % von Crematogaster-Arten besiedelt. Diese Nestposition konnte ansonsten nur noch bei zwei Polyrhachis-Arten und bei der mit Epiphyten assoziierten Camponotus (Myrmotarsus) gefunden werden. Je nach Anteil der hauptsächlich verarbeiteten Baustoffe kann man in vier Nestmaterialtypen unterteilen: (i) Nester aus toten pflanzlichen Materialien, (ii) Pilznester, (iii) Seidennester und (iv) Wurzelnester (Ameisengärten). Am häufigsten vertreten waren die aus Larvalseide gefertigten Webenester der Gattungen Polyrhachis, Camponotus (Karavaievia) und Oecophylla; insgesamt 45 % aller Funde gehörten zu dieser Materialgruppe. Fremde Seide konnten neben drei Polyrhachis-Arten auch drei Arten aus der Gattung Dolichoderus verarbeiten. Bemerkenswert ist der hohe Anteil pilzbewachsener Nestbauten. In allen drei Unterfamilien fanden sich Arten, die zu unterschiedlichen Teilen Pilze in ihren Nestern hielten. In der Gattung Technomyrmex waren 70 % aller älteren Nester vollständig aus Pilzhyphen gebildet. Mehr als die Hälfte des Nestmaterials von Monomorium-Nestern bestand ebenfalls aus einem dichten Pilzmyzel. Pilze bildeten auch in den Nestern von einigen Arten der Gattungen Dolichoderus, Crematogaster und Camponotus (Myrmotarsus) die maßgebliche Materialkomponente. Folgt man der bisher verwendeten Begriffsdefinition, die arboreale Ameisennester in der Regel nach den hauptsächlich verwendeten Baumaterialien einteilt, so muss man zu den bislang bekannten Karton- und Seidennestern die dritte Gruppe der Pilznester hinzufügen. Die Wahl des jeweiligen Baumaterials wirkt sich direkt auf die angewandten Bearbeitungsmechanismen und die Art und Weise der Nestfixierung und Neststabilisierung aus. Die Vertreter der Myrmicinen-Gattungen Myrmicaria und Monomorium zeigten in der Materialnutzung sowie bei der Stabilisierung und Fixierung der Konstruktionen gattungsspezifische Eigenheiten. Die Festigung der Nestbauten werden über H- Brückenstabilisierung (Myrmicaria) und Trichomstabilisierung (Monomorium) erreicht. Pilzhyphenstabilisierte Nester bauen Vertreter der Gattungen Technomyrmex, Dolichoderus und Crematogaster. Wobei innerhalb der beiden letztgenannten Gattungen noch eine Reihe weiterer Fixierungsmechanismen auftreten können. Bei Dolichoderus und Crematogaster sind die Methoden der Materialverfestigung sehr vielfältig und haben jeweils eine große Radiation erfahren (Stabilisierung durch Fremdseide, Pilze, Wurzeln und Klebstoff). Den Camponotus-Arten war die Eroberung der Baumkronenregion mit Hilfe von wurzelstabilisierten Ameisengärten (C. (Myrmotarsus)) und mit der Verwendung klebriger Larvalseide (C. (Karavaievia)) möglich. Beschränkt auf Seide zur Nestfixierung sind die Arten der Gattungen Oecophylla und Polyrhachis. Das bestimmende Element in der Nestarchitektur von fast allen Ameisennestern ist die Bogenkammer oder der Bogengang. Die innere Architektur von Oecophylla-Nestern weicht praktisch als einzige von dieser weit verbreiteten ,Bogenkammer-Struktur-- ab. Bei allen anderen Ameisenarten sind die Nestkammern in der Höhendimension in etwa auf die Größe einer einzelnen Arbeiterin beschränkt. Wegen der kooperativen Zusammenarbeit vieler Arbeiterinnen bei Oecophylla wird die Korrelation von Kammerhöhe und Körpergröße in dieser Gattung aufgehoben. Morphologische Besonderheiten, die als Anpassung an das Leben in Freinestern gedeutet werden könnten, konnten in der vorliegenden Arbeit bei keiner der untersuchten Arten festgestellt werden. Bei Bienen, Wespen und bei den Termiten wird überwiegend eine modellierende Bearbeitungstechnik angewandt. Die körpereigenen, flüssig-adhäsiven Substanzen (Wachs, Sekret und Kot) werden dazu oft noch mit Wasser verdünnt. Auch viele Ameisenarten verarbeiten wassergetränktes Material, nur einige wenige Vertreter der Gattung Crematogaster versetzen es allerdings mit klebenden Sekreten. Die durch das Baumaterial und dessen Fixierung am Substrat vorgegebene Verschiedenartigkeit der Bearbeitungstechniken hat bei den Ameisen zu sehr komplexen Verhaltensweisen geführt. So zum Beispiel das gezielte Verzahnen von Blatthaaren und das Verbinden von Baustoffen ohne die Zugabe von Leim. Weiter bearbeiten Ameisen Materialien, indem sie sie mit Fäkalien und anderen nährstoffreichen Substanzen düngen und so das Wachstum von Pilzhyphen und Wurzelfasern aktiv lenken. Die Seidenweber zeigen mit dem Verspinnen noch eine zusätzliche Möglichkeit der Materialbearbeitung bei Ameisen. Im Vergleich mit anderen sozialen Insekten findet man innerhalb der Ameisen eine mehr generalisierte Bautechnik, die möglicherweise variabler und effizienter ist als die Spezialisierung auf nur eine Materialkomponente. Generell sind die Freinestbauer, anders als die weitgehend deterministisch eingenischten obligaten Pflanzenameisen, bei der Auswahl des Nistplatzes nicht auf vorgegebene Hohlraumstrukturen (Domatien etc.) ganz bestimmter Pflanzen angewiesen, sondern erhöhen ihre Beweglichkeit in der Nistplatzwahl durch die Auswahl vergleichsweise häufig zu findender Substrattypen und Nestmaterialien. Bei allen untersuchten Freinestbauern konnte keine Spezialisierung auf eine bestimmte Pflanzenart festgestellt werden. Stochastische Besiedlungsprozesse gewinnen damit in dieser Ameisengilde, im Vergleich mit den myrmekophytischen Ameisenarten, an Bedeutung. In der vorliegenden Dissertation konnte erstmalig experimentell gezeigt werden, dass die bislang nur aus der Neotropis bekannten Ameisengärten auch im paläotropischen Faunengebiet zu finden sind. Die erstaunlichen Ähnlichkeiten zwischen neotropischen und paläotropischen Ameisengarten-Assoziationen deuten darauf hin, dass es in den unterschiedlichen tropischen Gebieten zu einer konvergenten und parallelen Entwicklung von ähnlich präadaptierten Ameisen und Pflanzen gekommen ist. Freinestbau ist mehrfach unabhängig voneinander entstanden. Sehr wahrscheinlich stand bei vielen Ameisen die Sicherung von Trophobiosestellen am Anfang der Entwicklung. Denkbar ist ebenso, dass die Vergesellschaftung von Epiphyten und Ameisen bei einigen Gruppen die Basis für die Evolution von Freinestbau war. Die Fertigung ausgedehnter Schutzbauten außerhalb der Nester, wie man sie beispielsweise bei der Myrmicinen-Gattung Pheidole findet, könnte ebenfalls die Evolution von frei gestalteten Nestern initiiert haben. Insgesamt wird deutlich, dass Konkurrenzvermeidung und die Erweiterung des Nistraum- und Nahrungsspektrums die drei bestimmenden Faktoren in der Evolution des Nestbauverhaltens von Ameisen waren. Anders als bei Wespen und Termiten fehlt den Ameisen jegliche Prädisposition für die Produktion von liquiden Klebesubstanzen. Sie haben vielfältige Wege gefunden, Wasser zum Nest zu transportieren und damit ihren Möglichkeiten entsprechende Verarbeitungs- mechanismen anzuwenden. Die fehlende gemeinsame Prädisposition der Ameisen für eine dauerhafte Fixierung von Baumaterialien, wie sie für freie Nestkonstruktionen notwendig ist, hat viele verschiedene Lösungen hervorgebracht und ist einer der Gründe für die hohe Variabilität der Freinestbauten bei Ameisen. Die in der vorliegenden Arbeit gezeigte variable Nistbiologie hat einen wichtigen Einfluss auf die Abundanzstrukturen tropischer arborealer Arthropodengemeinschaften und ist in hohem Maße für den großen Erfolg der Ameisen in diesem Habitat verantwortlich.
Hypoxie entsteht, wenn das Sauerstoffangebot bzw. die Sauerstoffversorgung unter ein Niveau sinkt, das benötigt wird, um physiologische O2-Drücke des betreffenden Gewebes aufrecht zu erhalten. Sinkt der Sauerstoff-Partialdruck, so werden adaptive Mechanismen aktiviert. Neben der Anpassung durch das kardiovaskuläre System werden auch verschiedene Gene aktiviert. Die Forschung der letzten Jahre hat gezeigt, dass Hypoxieinduzierte Genexpression insbesondere von zwei Transkriptionsfaktoren, HIF (hypoxia inducible factor) -1 und -2 , gesteuert wird. Man kennt über 70 Gene, die von HIF transaktiviert werden. Dabei handelt es sich um Modulatoren von Angiogenese und Vasodilatation, Erythropoese sowie der Umstellung des Stoffwechsels von oxidativer Phosphorylierung auf Glykolyse. Die Hypoxie-induzierbare Genexpression wird sowohl über eine Steigerung der Transaktivierungsaktivität als auch der Proteinmenge der HIF- -Untereinheiten reguliert. Die Regulation der HIF-Proteinmenge erfolgt über eine vom O2-Partialdruck abhängige Stabilisierung der -Untereinheit des Proteins. Unter normoxischen Bedingungen wird das Protein durch die Prolylhydroxylasen (PHD) O2-abhängig hydroxyliert, pVHL-vermittelt (VHL = von Hippel-Lindau), ubiquitiniert und proteosomal abgebaut. Unter hypoxischen Bedingungen dagegen wird das Protein stabilisiert, akkumuliert im Zellkern und bindet an eine spezifische Zielsequenz, das Hypoxia-responsive element oder HRE, imPromotor von Hypoxie-aktivierten Genen. Die PHDs gehören zu einer Familie von Eisen- und 2-Oxoglutarat-abhängigen Dioxygenasen. Neben diesen Faktoren wird eine Regulation von HIF durch Sauerstoffradikale (ROS, reactive oxygen species) in der Literatur sehr kontrovers diskutiert, da die Wirkung von ROS auf HIF sich unter Normoxie, Hypoxie oder dem Einfluss von Wachstumsfaktoren unterscheidet. Im Rahmen dieser Arbeit sollte die Frage, welche Rolle die PHDs bei der ROS-vermittelten HIF-Regulation spielen, beantwortet werden. Der zugrunde liegende Mechanismus wurde anhand von Glioblastom-Zelllinien untersucht. Die vorliegende Arbeit zeigt eine Stabilisierung von HIF nach Verringerung der ROS-Konzentration unter Normoxie. Eine Erhöhung der ROS-Konzentration führt dagegen zu einer dosisabhängigen Verminderung von HIF und der HIF-Targetgen-Expression. Es konnte eine direkte Abhängigkeit der Destabilisierung von VHL und den Prolylhydroxylasen gezeigt werden, da sowohl eine VHL-Defizienz als auch eine Mutation der Prolylreste oder eine Inhibition der PHDs zu einer Aufhebung des Effekts führen. Eine vergleichbare destabilisierende Wirkung auf HIF übt Ascorbat aus. Überraschenderweise führt sowohl die Zugabe von H2O2 mit seiner oxidativen Wirkung als auch die Zugabe des Reduktionsmittels Ascorbat zu einer Erhöhung des intrazellulären Fe2+-Gehaltes. Dieser Befund kann durch eine Aktivierung von Enzymen mit eisenreduzierenden Eigenschaften erklärt werden. Im Rahmen dieser Arbeit wurde die Proteinfamilie der Ferrireduktasen (FR) identifiziert und fünf Enzyme, die eine Homologie zur cytb561-Domäne aufweisen, kloniert. Eine detaillierte Charakterisierung zeigte, dass die Enzyme tatsächlich eine eisenreduzierende Aktivität aufweisen, die durch die exogene Zugabe von ROS noch erhöht wird. Eine Überexpression der FR führt zu einem erhöhten Abbau von HIF. Ein knock down mittels siRNA führt dagegen zu einer Akkumulation von HIF und die destabilisierende Wirkung von ROS ist nach einemknock down der FR deutlich reduziert. Aufgrund der in dieser Doktorarbeit gezeigten Daten kann folgendes Modell aufgestellt werden: Die primäre oxidative Wirkung von ROS führt vermutlich zu einer Aktivierung der Ferrireduktasen, die in Abhängigkeit von Ascorbat dann vermehrt Eisen reduzieren, so dass dies den PHDs als Substrat zur Verfügung steht. Der regulierende Einfluss auf HIF wird somit vermutlich über eine erhöhte Aktivität der Prolylhydroxylasen durch eine Erhöhung des intrazellulären Fe2+-Gehaltes vermittelt. Die erhobenen Daten deuten an, dass die Familie der Ferrireduktasen ein zentrales Bindeglied im O2-Sensing darstellt, das in Abhängigkeit von Redox-Signalen homeostatische Antworten auf Hypoxie moduliert.
Hitze-Stress-Transkriptionsfaktoren (Hsfs) stellen die zentralen regulatorischen Komponenten einer Signal-Transduktionskette dar, welche die Aktivierung von Hitze-Stress-induzierbaren Genen bewirken. Die Sequenzierung des Genoms von Arabidopsis thaliana (Arabidopsis) führte zu der Entdeckung von 21 Genen, die für putative Hsfs codieren. Aufgrund struktureller Charakteristika und phylogenetischer Analysen wurden die 21 Hsfs in die Klassen A, B und C aufgeteilt. Der Hauptteil der vorliegenden Arbeit beschäftigt sich mit der funktionellen Charakterisierung der Hsf Familie aus Arabidopsis. Um generelle Konzepte zur Funktion von pflanzlichen Hsfs als Aktivatoren zu unterstützen, wurden als Ausgangspunkt ausgewählte Hsfs aus Lycopersicon peruvianum (Tomate) zu detaillierten Analysen herangezogen. Hsfs besitzen, ähnlich anderen Transkriptions -aktivierenden Proteinen, eine modulare Struktur. In der vorliegenden Arbeit wurden funktionelle Module der 21 Arabidopsis Hsfs untersucht, die für den Oligomerisierungs-Zustand, die intrazelluläre Lokalisation sowie das Transkriptions-aktivierende Potential von Bedeutung sind. Essentiell für die Funktion von Klasse A Hsfs als Transkriptions-Aktivatoren sind kurze Peptidmotive, die durch aromatische und große hydrophobe Aminosäure-Seitenketten geprägt sind, die in einer sauren Umgebung eingebettet sind (AHA Motive: aromatic, large hydrophobic and acid amino acid residues). Es wurde mit GST pull-down Assays gezeigt, dass AHA Motive mit ausgewählten Transkriptions-Komplexen interagieren. Das generelle Konzept für AHA Motive als kohäsive Elemente zur Interaktion mit der Transkriptions- Maschinerie wurde durch Mutationsanalysen verifiziert, besonders detailliert am Beispiel von LpHsfA2 und LpHsfA1 aus Tomate in Reporter-Assays in Tabak-Protoplasten und Hefe als auch GST pull-down Experimenten gezeigt. Im Kontrast zu den Klasse A Hsfs besitzen Klasse B und C Hsfs keine AHA Motive. Diese zeigten auch keine eigene Aktivator-Funktion aber Experimente deuten darauf hin, daß sie Coregulatoren für Klasse A Hsfs darstellen. Es wurde gezeigt, dass diese pflanzliche Besonderheit bei Tomate als auch Arabidopsis existiert. Alle 21 Arabidopsis Hsfs wurden als Transkripte nachgewiesen, ihre Expression verhält sich sehr dynamisch in bezug auf Hitze-Stress als auch Entwicklungssignale. Die präsentierte funktionelle Charakterisierung der Hsf Familie von Arabidopsis gibt erste Einsichten in das komplexe Netzwerk der Hsfs und demonstriert bereits, dass im Vergleich zu anderen Organismen, wie z.B. Drosophila und Hefe mit einem Hsf und Säugern mit drei Hsfs, das komplexe pflanzliche Hsf System eine fein regulierte und effiziente Voraussetzung für Pflanzen darstellt, um schnell und vor allem erfolgreich auf Umwelteinflüsse zu reagieren, denen sie nicht entfliehen können.
The radiation-sensitive mutant pso4-1 of Saccharomyces cerevisiae shows a pleiotropic phenotype, including sensitivity to DNA cross-linking agents, nearly blocked sporulation and reduced mutability. We have cloned the putative yeast DNA repair gene PSO4 from a genomic library by complementation of the blocked UV-induced mutagenesis and of sporulation in diploids homozygous for pso4-1. Sequence analysis revealed that gene PSO4 consists of 1512 bp located upstream of UBI4 on chromosome XII and encodes a putative protein of 56.7 kDa. PSO4 is allelic to PRP19, a gene encoding a spliceosome-associated protein, but shares no significant homology with other yeast genes. Gene disruption with a destroyed reading frame of our PSO4 clone resulted in death of haploid cells, confirming the finding that PSO4/PRP19 is an essential gene. Thus, PSO4 is the third essential DNA repair gene found in the yeast S.cerevisiae.
Im Rahmen dieser Arbeit wurde die Vegetation der Savannenlandschaften der Sahelzone von Burkina Faso analysiert. Diese semiaride bis aride Region, die seit einigen Jahrzehnten von Landdegradation betroffen ist, ist als Untersuchungsgebiet u.a. deshalb besonders interessant, weil sie an einem Nutzungsübergang zwischen sesshafter Landwirtschaft und traditionell nomadischer Viehwirtschaft liegt. Im Vordergrund stand bei der Vegetationsanalyse ihre Klassifikation, die Frage nach der floristischen Struktur sowie dem aktuellen Zustand der Vegetation. Zu Beginn der Feldarbeiten wurde das Untersuchungsgebiet, das einen Niederschlagsgradienten von rund 200 mm umfasst, in geomorphologische Landschaftseinheiten (Inselberge, glacis, Niederungen, mares, Dünenzüge) stratifiziert. Innerhalb dieser Einheiten erfolgte die Vegetationsaufnahme mit Hilfe pflanzensoziologischer Aufnahmen. Die Arten der Gehölz- und Krautschicht wurden getrennt behandelt. Die Vegetationsaufnahmen wurden durch Strukturprofiltransekte in der brousse tigrée und Bodenuntersuchungen ergänzt. Auf verschiedenen Skalenebenen wurden die verschiedenen Vegetationsgesellschaften detailliert beschrieben und zu Standortfaktoren in Beziehung gesetzt. Außerdem wurden Vegetationsprofile zur Veranschaulichung der räumlichen Struktur der Vegetation abgeleitet. Bei der Analyse kamen auch computergestützte Methoden und statistische Verfahren (Tests der absichernden Statistik, Berechnung verschiedener Diversitätsindices, Ordinationsverfahren, numerische Klassifikation) zum Einsatz, um die Interpretation der Vegetationsstruktur zu unterstützen. Rund 320 Gefäßpflanzensippen aus 65 Familien konnten sicher bestimmt werden. Die artenreichste Familie sind die Poaceen. Insgesamt können 20 Gesellschaften der Gehölzschicht sowie 22 Gesellschaften der Krautschicht klassifiziert werden, die zur Mehrzahl weiter in Untereinheiten gegliedert sind. Innerhalb jeder Landschaftseinheit werden die Gesellschaften der Gehölzschicht, anschließend diejenigen der Krautschicht, vorgestellt. In der Regel sind sie in ihrer Verbreitung auf jeweils eine Landschaftseinheit beschränkt. Vor allem die Gesellschaften des glacis und der Niederungen besiedeln auch Habitate in Landschaftseinheiten außerhalb ihres Schwerpunktes. Daraus werden Schlüsse zum Ausbreitungsverhalten gezogen. In keinem Fall sind Einheiten der Krautschicht und der Gehölzschicht ausschließlich miteinander kombiniert; vielmehr sind Einheiten der Krautschicht jeweils mit mehreren Einheiten der Gehölzschicht kombiniert, was ihren selbständigen Charakter betont. Zehn Einheiten der Krautschicht sind überwiegend oder völlig gehölzfrei. Eine floristische Verwandtschaft besteht vor allem zwischen den Landschaftseinheiten glacis und Dünenzügen sowie zwischen mares, Niederungen und Dünenzügen; die Inselberge unterscheiden sich deutlich. Die Gehölzvegetation der Inselberge ist in Abhängigkeit von der menschlichen Nutzung in fünf Gesellschaften gegliedert. Während die Commiphora africana-Gesellschaft für wenig beeinflusste Bereiche typisch ist, hat die Combretum micranthum-Fragmentgesellschaft ihren Verbreitungsschwerpunkt in den intensiv genutzten Bereichen. Die Acacia raddiana-Zentralgesellschaft ist an den Unterhängen vertreten. Die Krautschicht der Inselberge gliedert sich in sechs, relativ artenreiche Gesellschaften mit Untereinheiten. Sie stellen zum Teil lokale Besonderheiten dar. Das räumliche Muster der Einheiten der Brachiaria lata-Gesellschaft lässt eine Abhängigkeit von der Art der Beweidung erkennen. Die Vegetation der Sandrampen wird oftmals von Einheiten gebildet, die ihren Verbreitungsschwerpunkt auf den Dünenzügen haben. Die Gehölzvegetation des glacis ist in drei relativ artenarme Gesellschaften gegliedert, die in Abhängigkeit der Lage zum lokalen Vorfluter zoniert und auch über das Untersuchungsgebiet hinaus weit verbreitet sind. Weite Bereiche des glacis sind völlig gehölzfrei. Die häufigste Gesellschaft ist die Acacia raddiana-Zentralgesellschaft. Die Ordination der Daten unterstützt die Klassifikation und zeigt Übergänge zwischen den Einheiten sowie Beziehungen zu den Standortparametern auf. Die Krautvegetation der glacis-Flächen ist relativ einheitlich; es gibt insgesamt nur zwei Gesellschaften. Der Anteil an Ruderalarten, Arten mit Pioniercharakter und solchen, die ihren Verbreitungsschwerpunkt auf Dünenzügen haben, ist relativ hoch. Bedeutendste Einheit ist die Tribulus terrestris-Untereinheit der Schoenefeldia gracilis-Gesellschaft, die eine weite ökologische Amplitude besitzt. Vor allem zu den Krautgesellschaften der Niederungen bestehen enge floristische und räumliche Beziehungen. Die krautigen Arten des glacis haben eine weite ökologische Amplitude. Es bestehen floristische Beziehungen zu Vegetationseinheiten der Sahara. Die Vegetation der mares und Niederungen hat die höchste β-Diversität. Die Gehölzvegetation der Niederungen ist in Abhängigkeit der Überflutungsdauer und -höhe zoniert und relativ struktur- und artenreich. In Galeriewäldern kommen sudanische Gehölzarten vor. Während von Viehherden stark frequentierte mares niedrige Gehölzdeckungen aufweisen oder komplett gehölzfrei sind, ist die Gehölzdeckung an den Ufern nur schwach besuchter mares geschlossen. Dies gilt auch für die artenreiche Krautvegetation. Insgesamt ist die Gehölzvegetation der Niederungen und mares in acht Gesellschaften gegliedert; die einzelnen Einheiten zeigen Übergänge miteinander. Die Krautvegetation der Niederungen enthält ebenfalls sudanische Arten. Sie lässt sich in drei Gesellschaften gliedern, die z.T. nur ein kleines Verbreitungsgebiet haben. Einige Uferabschnitte sind stark degradiert und vegetationslos. Die oftmals röhrichtartige Krautvegetation der mares ist ebenfalls in Abhängigkeit der Überflutungshöhe gegliedert, allerdings kommen an den einzelnen mares teilweise unterschiedliche Einheiten vor. Die Melochia corchorifolia-Gesellschaft steht im Mittelpunkt der Krautvegetation der mares, während die Brachiaria mutica-Gesellschaft für die nicht oder nur wenig überfluteten Bereiche typisch ist. Die Gehölzvegetation der Dünenzüge lässt sich im Untersuchungsgebiet in neun Gesellschaften gliedern. Diese gruppieren sich in einem artenreichen Block wenig beeinflusster Bereiche und in einem relativ artenarmen Block intensiv genutzter Dünenabschnitte. Bestände, die zur Pterocarpus lucens-Gesellschaft gestellt werden, bilden auf abgelegenen Dünenzügen kleine Wäldchen. In diese Gesellschaft werden auch die Bestände der brousse tigrée eingegliedert. Es sind in der Region nur noch wenige Flächen mit intakter brousse tigrée vorhanden. Anhand von zwei Strukturprofiltransekten wird ihre floristische und räumliche Struktur mit vier Zonen veranschaulicht. Pterocarpus lucens und Combretum micranthum sind die beiden dominanten Gehölzarten. Im Untersuchungsgebiet ist die Combretum glutinosum-Zentralgesellschaft weit verbreitet. Durch zwei Ordinationsdiagramme wird der ökologische Schwerpunkt wichtiger Dünenarten aufgezeigt. Die numerische Klassifikation lässt sich gut mit der manuellen Klassifikation in Übereinstimmung bringen. Die Krautvegetation der Dünen ist in sieben Gesellschaften mit vielen, z.T. relativ artenarmen Untereinheiten gegliedert, deren ökologische Bindung aufgrund eines starken, nivellierenden Beweidungseinflusses nicht immer geklärt werden kann. Es dominieren annuelle Arten; viele der Arten kommen in anderer Artenkombination auch in der Sudanzone vor. Daneben zeigt sich eine floristische Verwandtschaft zur Sahara. Unter Bäumen wächst die Achyranthes aspera-Gesellschaft. Krauteinheiten, die in anderen Landschaftseinheiten ihren Verbreitungsschwerpunkt haben, sind auf den Dünenzügen ebenfalls vorhanden, z.B. die Enteropogon prieurii-Gesellschaft der Inselberge und die Schoenefeldia gracilis-Gesellschaft des glacis. Es ist keine floristische Differenzierung entlang des Niederschlagsgradienten erkennbar. Hirsefelder sind mit Kulturbaumparks bestanden. Die Acacia raddiana-Zentralgesellschaft gewinnt auch auf den Dünenzügen an Bedeutung. Die Ergebnisse werden in Beziehung zu den in der Literatur vorhandenen, oftmals auf formationskundlichen Kriterien beruhenden Klassifikationen in Beziehung gesetzt. Je nach verwendetem Verfahren und Distanzmaß liefert die numerische Klassifikation unterschiedliche Ergebnisse, die sich nur zum Teil mit der Klassifikation in Deckung bringen lassen. Durch die Betrachtung der aktuellen Verjüngung, aus den Ergebnissen und ihrer Diskussion werden Aussagen über die aktuelle Vegetationsdynamik abgeleitet. Aktuelle Strukturveränderungen der Vegetation sind mit einem Landnutzungswandel verbunden. In erster Linie handelt es sich um Degradation, für die Beispiele auch aus der Literatur gegeben werden. Auf den Inselbergen gehen artenreiche Bestände zurück, gleichzeitig wandern Arten von den glacis-Flächen her ein. Auf dem glacis sind einerseits eine Artenverarmung, andererseits eine Verbuschung tiefliegender Bereiche sowie eine floristische Homogenisierung vieler Flächen zu beobachten, letzteres gilt auch für die Dünenzüge. An den mares und Niederungen findet ebenfalls eine floristische Verarmung statt, sudanische Arten sterben wie auch auf den Dünenzügen aus. Klimaungunst und vor allem Überbeweidung als mögliche Ursachen für den Vegetationswandel werden diskutiert.
Aus Fruktose-gezogenen Zellen von A. woodii, die in Gegenwart von Caffeat als Elektronenakzeptor gewachsen waren, wurde durch Behandlung mit Lysozym und anschliessendem French-Press-Aufschluß bei niedrigem Druck ein zellfreier Rohextrakt unter strikt anaeroben Bedingungen hergestellt. Dieser katalysierte eine H2-abhängige Caffeatreduktion mit Raten von 8,7 – 18,7 nmol/min x mg Protein. Die Aktivität war strikt ATP-abhängig. Nach einer Auftrennung des Rohextraktes in Cytoplasma- und Membranfraktion war die H2-abhängige Caffeatreduktion ausschliesslich in der cytoplasmatischen Fraktion lokalisiert. Die Zugabe von Membranen führte zu keiner Stimulierung der Aktivität. Die Membranfraktion selbst wies keine Caffeatreduktionsaktivität auf. Verschiedene Verbindungen wurden auf ihre Fähigkeit getestet, als artifizielle Elektronendonatoren für die Caffeatreduktion zu fungieren. TMPD, 1,5-Diphenylcarbazid und reduziertes Methylviologen konnten Caffeat nicht reduzieren. In Gegenwart von Phenylendiamin wurde in zellfreiem Rohextrakt und in der Cytoplasmafraktion Caffeatreduktionsaktivität beobachtet. In der Membranfraktion wurde dagegen keine Reduktion von Caffeat mit Phenylendiamin als Elektronendonor nachgewiesen. NADH + H+ konnte als physiologischer Elektronendonor für die Reduktion von Caffeat fungieren. Die NADH-abhängige Caffeatreduktion war ausschliesslich in der cytoplasmatischen Fraktion lokalisiert und strikt abhängig von ATP. Die Beobachtung, dass NADH + H+ als Elektronendonor für die Caffeareduktion fungieren kann, führte zu der Frage, wie im Zuge H2-abhängiger Caffeatreduktion NADH + H+ gebildet wird und welche Enzyme daran beteiligt sein könnten. NAD+-abhängige Hydrogenaseaktivität wurde an Membranen und im Cytoplasma nachgewiesen. Rund 70% der Aktivität waren in der löslichen Fraktion lokalisiert. Die Gegenwart einer Elektronendonor:NAD+-Oxidoreduktase in A. woodii wurde untersucht. Gewaschene Membranen vermittelten die Oxidation von NADH + H+ mit Kaliumhexacyanoferrat oder Benzylviologen als Elektronenakzeptor. Diese Beobachtung wurde als Hinweis auf eine NAD+-Reduktase gewertet, da solche Enzyme in der Regel reversibel sind. Eine Hydrogenase konnte hierfür ausgeschlossen werden, da die NADH-oxidierende Aktivität Sauerstoff-unempfindlich war. Die Aktivität des NADH-oxidierenden Enzyms konnte durch zugesetztes Na+ nicht stimuliert werden. In Analogie zu Na+-translozierenden NADH:Chinon-Reduktasen wurde die NADH-oxidierende Aktivität an gewaschenen Membranen aber durch Ag+ oder Cu2+ in mikromolaren Konzentrationen vollständig inhibiert. Membranen von A. woodii vermittelten die Reduktion von NAD+ mit reduzierten Ferredoxin als Elektronendonor. Ob diese Aktivität durch das gleiche membranständige Enzyme katalysiert wurde, das auch die NADH-Oxidation bewerkstelligte, konnte nicht geklärt werden. Die Ferredoxin-abhängige NAD+-Reduktion wurde durch micromolare Konzentrationen Ag+ vollständig inhibiert. Die Inihibition war aber wahrscheinlich unspezifischer Natur. Mittels vergleichender 2D-Gelelektrophorese wurden zwei Caffeat-induzierte Proteine identifiziert. Ein Vergleich der Peptidsequenzen, die durch ESI-MS/MS-Analyse der Proteine erhalten wurden, mit in Datenbanken hinterlegten Proteinsequenzen, ergab eine große Übereinstimmung zu der großen alpha- bzw. kleinen beta-Untereinheit von heterodimeren Elektronentransfer-Flavoproteinen (ETFP). Die Proteine wurden mit EtfA und EtfB bezeichnet. Anhand der Peptidsequenzen von EtfA und EtfB wurden degenerierte Oligonukleotide abgeleitet, die zur Amplifikation von Fragmenten der kodierenden Gene herangezogen wurden. Die Analyse der abgeleiteten Aminosäuresequenzen der erhaltenen PCR-Produkte untermauerte die Zuordnung von EtfA und EtfB als Untereinheiten eines ETFP. Die Fähigkeit zur Caffeatreduktion ist in A. woodii nicht konstitutiv vorhanden, sondern wird in erst durch Gegenwart des Phenylacrylats induziert. Die Spezifität dieser Induktion wurde untersucht. Suspensionen ruhender Zellen, die aus Caffeat-induzierten Zellen hergestellt worden waren, reduzierten neben Caffeat auch die Phenylacrylate Ferulat oder p-Cumarsäure mit H2 als Elektronendonor. Analoge Beoabachtungen wurden mit Ferulat-induzierten und p-Cumarsäure-induzierten Zellsuspensionen gemacht. Die Ergebnisse legen den Schluß nahe, dass in A. woodii die Reduktion von Phenylacrylaten durch ein induzierbares enzymatisches System bewerkstelligt wird. EtfA und EtfB wurden als MalE-Fusionsproteine dargestellt und gereinigt. Dagegen wurden Antiseren hergestellt. Immunologische Untersuchungen zeigten, dass die Produktion von EtfA und EtfB durch Gegenwart verschiedener Phenylacrylate induziert wird. Die Induktion war unabhängig vom Wachstumssubstrat. In Gegenwart von zu Phenylacrylaten ähnlichen Verbindungen erfolgte keine Induktion. Für EtfA und EtfB wurde eine Funktion als universeller Elektronenüberträger des Phenylacrylat-Reduktionssystems in A. woodii postuliert. Für die H2-abhängige Reduktion von Caffeat und anderer Phenylacrylate wurde die folgende Reaktionssequenz postuliert: die Oxidation des Elektronendonors H2 durch eine Hydrogenase geht einher mit der Bildung von reduziertem Ferredoxin. Dieses wird durch eine membranständige Ferredoxin-NAD+-Oxidoreduktase oxidiert, die den Transfer der Elektronen auf NAD+ mit der Translokation von Na+ koppelt. Ein aus EtfA und EtfB gebildetes ETFP fungiert dann als Elektronenüberträger zwischen NADH + H+ und einer löslichen Phenylacrylatreduktase.
Das Thema der vorliegenden Arbeit war die molekulargenetische Charakterisierung der Funktion der Glukosesensoren Snf3 und Rgt2 in der Hefe S. cerevisiae. Snf3 und Rgt2 gehören zur Familie der Hexosetransporter. Sie unterscheiden sich von ihnen jedoch in ihrer Funktion als Glukosesensoren wie auch durch ihre ungewöhnlich langen Cterminalen Domänen. Snf3 und Rgt2 sind integrale Membranproteine, die als Reaktion auf extrazelluläre Glukose Signale auslösen, die zur Expression bestimmter Hexosetransporter führt. Einige Komponenten, die an der Signaltranduktion beteiligt sind, wurden bereits identifiziert. Jedoch ist der genaue Mechanismus, der zur Expression der Hexostransporter führt, noch nicht vollständig aufgeklärt. Im ersten Teil dieser Arbeit wurden die Proteine Snf3, Rgt2, Mth1, Std1 und Rgt1 auf direkte Interaktionen untereinander getestet, um Einblicke in den molekularen Mechanismus der Signaltransduktion zu erhalten. Desweiteren sollte festgestellt werden, ob die Protein-Wechselwirkungen von der C-Quelle abhängig sind. Es konnte gezeigt werden, dass zwischen den Membranproteinen Rgt2 bzw. Snf3 und den löslichen Proteinen Mth1 bzw. Std1 Interaktionen in Abhängigkeit von Glukose stattfanden. Diese Ergebnisse unterstützen das von Moriya und Johnston aufgestellte, gegenwärtige Modell für eine glukoseinduzierte HXT Genexpression. Im zweiten Teil dieser Arbeit wurde geprüft, ob sich aus dem Glukosesensor Snf3 durch eine Aminosäuresubstitution ein bifunktionaler Sensor für Glukose und Galaktose erzeugen läßt. Dazu wurden die für den Galaktosetransport verantwortlichen Aminosäuren in den homologen Positionen von Snf3 ausgetauscht. Die Bestimmungen der Regulation des Snf3-kontrollierten HXT7 Promotors ergaben, dass das mutierte Snf3 Protein, wie das Wildtyp-Snf3 Protein, eine normale Glukosesensorfunktion ausübt aber keine Galaktosesensorfunktion vorzeigt.
Elche stellen eine Problemart in der Zootierhaltung dar. Sie erreichen im Zoo entgegen dem Trend, dass Tiere in Menschenobhut älter werden als ihre frei lebenden Artgenossen, meist weniger als die Hälfte des biologisch möglichen Alters. Besonders schwierig gestaltet sich die adäquate Fütterung, da die Tiere sehr stark von der Gabe frischer Laubäsung abhängen und die Fütterung mit Ersatzfuttermitteln, wie z.B. Heu, langfristig nicht erfolgsversprechend ist. Zudem sind die Tiere sehr anfällig für Parasiten und eine von Schafen übertragene Viruserkrankung (Bösartiges Katarrhalfieber). Ihr hoher Platzbedarf und das Problem der innerartlichen Aggression machen die Haltung dieser größten Hirschart zusätzlich kompliziert. In dieser Arbeit wird die Methode der Angewandten Chronoethologie in der Zootierhaltung vorgestellt, die sich die von der Inneren Uhr gesteuerten Verhaltensrhythmen einer Tierart zur Beurteilung ihres Wohlbefindens und ihrer Haltungsbedingungen in der künstlichen Zooumwelt zu Nutze macht. Der Besitz einer Inneren Uhr stellt in der hochgradig rhythmisch organisierten Umwelt einen Selektionsvorteil im Sinne einer frühzeitigen Anpassung an wiederkehrende Umweltbedingungen dar. Die Innere Uhr ist so alt wie das Leben selbst, genetisch fixiert, über Zeitgeberreize mit ihrer Umwelt synchronisiert und regelt die Lebensvorgänge von Organismen auf allen organisatorischen Ebenen, auch auf der Ebene des Verhaltens. Ist der normale Verhaltensrhythmus einer Tierart bzw. eines Individuums bekannt, ist es möglich, aus Abweichungen von der Norm auf Störungen des Organismus - auf Unwohlsein - zu schließen. Anhand des Vergleiches von drei Elchhaltungen mit jeweils zwei Tieren, die unter verschiedenen Bedingungen gehalten wurden, konnten mit Hilfe zeitgeraffter Videoaufzeichnung und dem Einsatz eines Speichertelemetriesystems die folgenden Faktoren als einflussreich auf das Verhaltensmuster von Elchen in Menschenobhut identifiziert werden. Die nächtliche Aufstauung von Elchen ist aufgrund des Raum- und Reizmangels in den Boxen ein erheblicher Eingriff in das natürliche, gleichmäßig über Tag und Nacht verteilte Verhaltensmuster der Tiere. Außerdem sind sie in ihrem Verhalten hochgradig vom täglichen Ablauf des Pflegeralltags im Zoo beeinflusst. Feste Fütterungszeiten können einen starken Zeilgeberreiz darstellen- den die Elche in den beiden naturferneren Haltungen stärker zu antizipieren scheinen als den Zeitgeber „Licht". Größe und vor allem Strukturierung des Außengeheges haben einen Einfluss auf dessen zeitliche und räumliche Nutzung. Abschüssige Gehegeteile können die unerwünschte Verhaltensweise Grasen fördern. In unseren mitteleuropäischen Breiten leiden die Elche im Sommer unter Hitzestress, was sich in verringerter Aktivität widerspiegelt. Ein hohes Besucheraufkommen kann die Tiere ebenfalls in ihrem Verhalten beeinflussen. Es hat sich jedoch gezeigt, dass sich der Elch schnell an die Zoogegebenheiten und viele Besucher gewöhnt. Durch den Vergleich der verschiedenen Haltungsbedingungen konnten in der vorliegen Arbeit Vorschläge zur Verbesserung der Haltung von Elchen in Menschenobhut und zu ihrem zeitlichen Management gemacht werden. Der Elch hat sich aufgrund des für Wiederkäuer typischen, sehr geregelten Verhaltensrhythmus aus alternierenden Aktivitäts- und Ruhephasen, der auch unter den verschiedenen Haltungsbedingungen prinzipiell bestehen bleibt, als sehr gut geeignetes Modelltier für die Anwendbarkeit der Methode der Angewandten Chronoethologie in der Zootierhaltung herausgestellt. Abweichungen von der Norm können leicht erkannt werden. Änderungen im Verhaltensmuster m Form erhöhter lokomotorischer Aktivität lassen bei den untersuchten Tieren auf Unwohlsein (Krankheit, Abweichungen von der täglichen Routine, unterbundenes Brunftverhalten) schließen und können im Sinne eines chronoethologischen Paradigmas als eine indikative Verhaltensweise gewertet werden. Das Ziel einer vollständig automatisierten Verhaltenserfassung- und Auswertung mittels Bewegungsmeldern soll im restringierten Raum der Elchbox in einem weiteren Projekt verwirklicht werden, um damit Tierpflegern, Zooveterinären und Verantwortlichen ein gut handhabbares Mittel zur objektiven und langfristigen Beurteilung des Wohlbefindens ihrer Schützlinge zur Verfügung stellen zu können.
Um die Biodiversität Burkina Fasos darzustellen und auszuwerten, wurden umfangreiche Diversitätsdaten aus Sammlungsbelegen, Vegetationsaufnahmen und Literatur zusammengestellt. Die eigene Datenerhebung während dreier Feldaufenthalte hat mit > 300 Vegetationsaufnahmen (einschließlich der Biodiversitätsobservatorien) und > 1200 Herbarbelegen dazu beigetragen. Die Verwendung von relationalen Datenbanken (Microsoft Access) und GIS ermöglichte eine umfassende Analyse dieser enormen Datenmengen (> 100 000 Verbreitungspunkte) unter Einbeziehung von weiteren Art- oder ortsgebundenen Informationen. Datenbankstrukturen und Prozeduren wurden zu einem großen Teil selbst entwickelt. Unregelmäßigkeiten in den Primärdaten konnten durch Artverbreitungsmodelle ausgeglichen werden, die rasterbasierte Umweltdaten verwenden, insbesondere Satellitenbilder, Klima- und Höhendaten. Für die zusammenfassenden Analysen (Artenreichtum nach Familie, Lebensform, Photosynthesetyp; turnover) mussten wiederum eigene Prozeduren entwickelt werden. Räumliche Muster der Biodiversität wurden im landesweiten Rahmen, wie auch lokal für die Regionen Oudalan und Gourma, dargestellt. Die Zusammenfassung der Flora nach taxonomischen und ökologischen Gruppen gewährt dabei Einblicke in ökologische Zusammenhänge und die Eignung einzelner Gruppen als Indikatoren. Deutlich zeigen sich die Veränderungen des Lebensformspektrums und des Artenreichtums sowohl auf Landesebene im Zusammenhang mit dem Makroklima als auch in einer detaillierten Analyse des Oudalan – wo der Einfluss von Boden und Relief deutlich wird. Die großräumigen Muster der Artenvielfalt sind hauptsächlich durch klimatische Faktoren geprägt, auch der menschliche Einfluss ist in Form verschiedener Nutzungsformen vom Klima abhängig und schwer davon zu trennen. Umso deutlicher werden die Folgen intensiver Landnutzung aber in den Detailstudien der nordsudanischen Biodiversitätsobservatorien und des sahelischen Wiederbegrünungsprojektes. Über die in diesem Rahmen dargestellten Ergebnisse hinaus ergeben sich insbesondere aus der umfassenden Datenbasis und der interdisziplinären Zusammenarbeit mit Fernerkundung und Ethnobotanik weitere vielversprechende Möglichkeiten. Unter anderem wird auf der Grundlage der Datenbanken und ergänzender Literaturrecherchen eine aktualisierte Checklist der Gefäßpflanzen Burkina Fasos erstellt und eine Revision der phytogeographischen Zonen für Burkina Faso ist geplant.
Unter humanbiologischen, geschichtlichen und soziokulturellen Aspekten wird eine umfangreiche Sammlung von Röntgen- und Patientenbildern des Annastifts Hannover (ehemals ”Krüppelheim“) aus der Zeit von Oktober 1908 bis September 1942 analysiert. Einige der häufigsten Erkrankungen dieser Sammlung (Hüftluxation, Infektionskrankheiten, Rachitis und Skoliose) werden beschrieben, ausgewertet und im Kontext der Epoche diskutiert. Dabei wird folgender Arbeitshypothese nachgegangen: Wenn das frühe 20. Jahrhundert als entscheidende Phase des Übergangs von einer hohen zu einer niedrigen Mortalität gilt, so müsste sich das auch in der Sammlung des Annastifts nachweisen lassen. Auch wäre zu erwarten, dass in der frühen Phase ein hoher Morbiditäsindex, welcher über die Anzahl von Harris-Linien ermittelt werden kann, festgestellt werden müsste. Patientenbilder (Fotografien) Von 6519 Patientenbildern konnten 6047 mit einer Diagnose erfasst werden. Für den Zeitraum Oktober 1908 bis 1.Oktober 1934 sind dies 3275 und für den Zeitraum 2. Oktober 1934 bis 1. September 1942 sind es 2772 Diagnosen. Die genannten Zeitrüume unterscheiden sich deutlich hinsichtlich der Häufigkeit der einzelnen Krankheitsbilder. Besonders auffällig: • Die Zahl fotografierter Patienten mit Infektionserkrankungen (u. a. Osteomyelitis und Tuberkulose) reduzierte sich im Untersuchungszeitraum. Maßgeblichen Einfluss hatten dafür vorteilhaftere Lebensbedingungen. Die therapeutischen Möglichkeiten waren zu dieser Zeit noch vergleichsweise gering. • Es wird eine Vervielfachung der Diagnosen Skoliose und Rundrücken in der Zeit des Nationalsozialismus’ beobachtet. Dass dies einen Anstieg der Pathologien widerspiegelt, ist unwahrscheinlich, eher zeigt es das besondere Augenmerk, welches im Nationalsozialismus der ”Haltung“ entgegengebracht wurde. Röntgenbilder Die 1894 Röntgenbilder stammen von 1063 Patienten, die zwischen dem 21. 07. 1909 und dem 18. 08. 1925 geröntgt wurden. Das Durchschnittsalter der Patienten lag bei zehn Jahren. In der Sammlung der Röntgenbilder gab es folgende Auffälligkeiten: • Der Anteil von Hüftluxationen lag bei über 21%. Dieser hohe Wert ist als Resultat einer fehlenden Frühdiagnose zu werten, so dass aufwendige orthopädische Behandlungen notwendig wurden. Mit Dr. Peter Bade stand dem Annastift ein anerkannter Spezialist auf dem Gebiet der Behandlung von Hüftluxationen vor, so dass das Annastift für diese Erkrankung als Schwerpunktklinik zu betrachten ist. • Bei dem Stressmarker ”Harris-Linien“ (in der Literatur auch meist als Wachstumsstillstandslinien“ bezeichnet) zeigt sich ein Paradoxon: Entgegen der Erwartung im Untersuchungszeitraum, aufgrund der zahlreichen und schweren Infektionserkrankungen und Hungersnöte, ein gehäuftes Auftreten der Harris-Linien als unspezifisches Zeichen von Stress vorzufinden, zeigten sich diese nur bei 15% der Patienten. Sie signalisieren mit der insgesamt geringen Anzahl einen vermeintlich niedrigen Morbiditäts-Index (= 0,32), welcher gemäß Literatur [z. B. Blanco et al. (1974); Nowak & Piontek (2002)] auf günstige Lebensbedingungen schließen ließe. Das Phänomen der Harris-Linien ist hier so zu erklären, dass allein eine Veränderung der Ernährungsbedingungen eine Ausbildung von Harris-Linien hervorrufen kann. In diesem Fall wird eine schlechte Grundsituation abgelöst durch eine optimale Versorgung im Annastift. Die Bezeichnung ”Wachstumsstillstandslinien“ ist für diese Serie somit wahrscheinlich unzutreffend, ”Wachstumslinie“, als Ausdruck für einen Wachstumsschub, würde das Phänomen besser erklären. Der Begriff ”Gesundheitsveränderungslinie“, sei es Ernährungs- oder Krankheitsbedingt, trüge dem Umstand Rechnung, dass eine einmalige Krankheit oder einmalige Hungerperiode bei einer allgemein guten Lebenssituation genauso eine Linie erzeugt, wie eine Periode des Wohlbefindens bei einer allgemein schlechten Lebenssituation. Im Ganzen zeigt diese Sammlung deutliche Indizien für nahezu katastrophale Lebensumstände im frühen 20. Jahrhundert: Infektions- und Mangelerkrankungen sind weit verbreitet. Es ist aber auch zu konstatieren, dass sich diese Bedingungen mit der Zeit besserten, was zu einer Reduzierung der Mortalität geführt haben dürfte.
Molekularbiologische Charakterisierung und Expressionsanalyse des Brust-Tumorantigens NY-BR-1
(2005)
Brustkrebs ist die häufigste Krebserkrankung bei Frauen. Trotz guter Behandlungsmöglichkeiten für lokalisierte Primärtumoren verläuft die fortgeschrittene Erkrankung, bei der sich bereits Metastasen gebildet haben, oft tödlich. Es besteht daher ein großer Bedarf an weiteren Tumormarkern für die Diagnostik und Verlaufsbeurteilung sowie an geeigneten Zielproteinen für die Entwicklung neuer therapeutischer Strategien. Neben Radio- und Chemotherapie hat in den letzten Jahren die Immuntherapie bei der Behandlung von Krebserkrankungen an Bedeutung gewonnen. Im Gegensatz zur systemischen Wirkungsweise der Zytostatika wird hierbei das zytolytische Potential des Immunsystems genutzt, um zielgerichtet Tumorzellen zu eliminieren. Sogenannte tumorassozierte Antigene bzw. „Cancer/Testis“ Antigene repräsentieren potente und effektive Zielproteine sowohl für die Anwendung therapeutischer Antikörper als auch für Vakzinierungen. Besonders die auf dem Einsatz von Antikörpern basierenden Strategien haben sich in Kombination mit einer Chemotherapie in jüngster Zeit als erfolgreich erwiesen. In einer brustspezifischen SEREX Analyse konnte vor wenigen Jahren das Tumorantigen NY-BR-1 identifiziert werden, für das eine gewebespezifische mRNA Expression in Testis, Brust sowie eine Überexpression in Mammakarzinomen beschrieben wurde. Bioinformatische Vorhersagen legten nahe, dass es sich bei diesem neuen, nicht charakterisierten Protein um einen Transkriptionsfaktor handeln könnte. Ziel der vorliegenden Arbeit war es, das Brust Tumorantigen NY-BR-1 molekularbiologisch und biochemisch zu charakterisieren. Des Weiteren sollten dessen Expression in Zelllinien und Geweben untersucht und eine erste Evaluierung der klinischen Relevanz dieses Tumorantigens als Zielprotein für immuntherapeutische Strategien durchgeführt werden. Hierfür wurden zunächst ein NY-BR-1 Volllängen-Expressionskonstrukt kloniert sowie ein polyklonales anti-NY-BR-1 Antiserum hergestellt, das in der Lage ist, rekombinantes und überexprimiertes NY-BR-1 Protein zu detektieren. Für den Nachweis des endogenen Proteins konnte später ein monoklonaler anti-NY-BR-1 Antikörper verwendet werden, der im Rahmen dieser Arbeit bezüglich seiner Funktionalität und Spezifität in diversen Anwendungen (Western Blot, Immunpräzipitation, Immunfluoreszenz, Durchflusszytometrie, Immunhistochemie) getestet und eingesetzt wurde. Expressionsanalysen mittels quantitativer RT-PCR und cDNA-„Microarrays“ zeigten, dass NY-BR-1 in normalem Brustgewebe, in primären Mammakarzinomen und in Brusttumormetastasen exprimiert ist, wobei im Vergleich zu Normalgewebe in 70% der Tumorproben eine Überexpession zu beobachten war. Interessanterweise wird NY-BR-1 auch in normalem Prostatagewebe und in einigen Prostatatumoren exprimiert. Es gelang in der vorliegenden Arbeit erstmalig, die Expression des endogenen NY-BR-1 Proteins in normalem Brust-, Testis- und Prostatagewebe sowie entsprechenden Tumorproben im “Western Blot” nachzuweisen, wobei das Protein nur in der unslöslichen Membranfraktion einer Gewebe-Lysatpräparation detektiert werden konnte. Es wurde mit verschiedenen biochemischen und zellbiologischen Methoden in transient transfizierten Zellen gezeigt, dass NY-BR-1 ein Membranprotein ist, dessen N- und C-Terminus sich auf der Zelloberfläche befinden. Immunfluoreszenz und FACS-Analysen belegen, dass der monoklonale Antikörper das NY-BR-1 Epitop auf der Zelloberfläche lebender transfizierter Zellen erkennt. Da NY-BR-1 in Pleuralergusszellen von Brustkrebspatientinnen sowie in etablierten Brust-Zelllinien nur in einigen Fällen auf mRNA Ebene, nicht jedoch auf Proteinebene nachweisbar war, wurde die Lokalisation des endogenen Proteins in Gewebeproben immunhistochemisch untersucht. Während NY-BR-1 in Brust-, Prostata- und Hodentumorzellen überwiegend im Zytoplasma gefunden wird und zum Teil vesikulär/aggregiert vorliegt, konnte in einigen Zellen der Brust- und Hodenkarzinome eine Membranlokalisation des Proteins beobachtet werden. Die vorhergesagte Funktion von NY-BR-1 als Transkriptionsfaktor konnte experimentell nicht bestätigt werden. Die Ergebnisse von Co-Immunpräzipitationsexperimenten legten nahe, dass das NY-BR-1 Protein Dimere oder Multimere mit sich selbst bzw. mit dem C-Terminus des Proteins bilden kann. Erste funktionelle Studien lassen eine direkte Beteiligung von NY-BR-1 an der malignen Transformation vermuten. In Weichagar Experimenten konnten NY-BR-1 exprimierende murine Fibroblasten (NIH3T3 Zellen) Kolonien bilden. Desweiteren wurde beobachtet, dass NY-BR-1 Expression in embryonalen Nierenzellen (293T Zellen) einen positiven Einfluß auf deren Adhäsionsverhalten an humane Endothelzellen zur Folge hat. Serologische Untersuchungen von über 50 Brustkrebs Patientenseren konnten bestätigen, dass NY-BR-1 ein Tumorantigen ist und ergaben, dass mindestens 5% der Patienten detektierbare anti-NY-BR-1 Serumantikörper entwickelten. Die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit konnten dazu beitragen, das Expressionsmuster, die zelluläre Lokalisation und die biologische Funktion des Tumorantigens NY-BR-1 näher zu untersuchen. Da NY-BR-1 gewebespezifisch in Brust, Testis und Prostata exprimiert ist und in 70% der Brust- und einigen Prostatatumoren (über)exprimiert wird, ist NY-BR-1 ein geeigneter Tumormarker und ein attraktives Zielprotein für aktive und passive Immuntherapie bei Brust- und evtl. bei Prostatakrebspatienten. Speziell für auf Antikörpern basierenden Therapien stellt das Zelloberflächenantigen NY-BR-1 ein interessantes „target“ für zukünftige Therapiestudien dar.
Die vorliegende Arbeit untersucht die Systematik und phylogenetischen Beziehungen der Familie der Bromeliaceae auf der Basis chloroplastidärer DNA-Sequenzdaten des trnT-trnL-Intergenischen Spacers (33 untersuchte Arten aus 28 Gattungen), des trnL-Introns (129 untersuchte Arten aus 48 Gattungen) und des trnL-trnF-Intergenischen Spacers (120 Arten aus 48 Gattungen). Untersucht wurden Vertreter aller Untergattungen der artenreichsten Gattungen Aechmea (Bromelioideae) und Tillandsia (Tillandsioideae). Mit den editierten Alignments der drei Sequenzdatensätze wurden Analysen zu den Verwandtschaftsverhältnissen durchgeführt. Alle drei untersuchten Marker lieferten phylogenetisch informative Signale. Die Pitcairnioideae erwiesen sich als polyphyletisch. Ayensua und Brocchinia sind nah verwandt und nehmen innerhalb der Familie eine basale Position ein. Hechtia und Navia stellen jeweils eigene Gruppen dar, aber ohne ausreichende Auflösung ihrer Beziehungen zu den übrigen Bromeliaceae. Fosterella und Puya sind gut gestützte Gruppen mit möglicher Schwestergruppenbeziehung zu den Bromelioideae. Die Gattungen Pitcairnia/Pepinia und Deuterocohnia/Dyckia bilden als Pitcairnioideae s.str. einen gut gestützten Ast. Die Tillandsioideae sind monophyletisch, nur die einzige untersuchte Akzession der Gattung Mezobromelia liegt außerhalb dieses statistisch gut gestützten Astes. Innerhalb der Tillandsioideae nehmen Catopsis, Glomeropitcairnia erectiflora und Alcantarea regina/Vriesea racinae basale Positionen ein. Die Gattungen Guzmania, Racinaea, Tillandsia und Vriesea sind keine natürlichen Gruppen. Für die Bromelioideae liegt die Sequenzdivergenz bei 0,1 bis max. 2%. Die beste Auflösung erreichte hier die kombinierte Analyse des trnL-Introns und des trnL-trnF Intergenischen Spacers bei Polarisierung der Daten mit den Tillandsioideae als Außengruppe. Bromelia, Deinacanthon, Greigia, Fascicularia-Ochagavia-Fernseea und eine wenig aufgelöste Kerngruppe der übrigen Bromelioideae bilden eine basale Polytomie. Mit höheren Wiederfindungswahrscheinlichkeiten gestützt sind Ananas, Greigia und von der Gruppe Fascicularia-Ochagavia-Fernseea die Gattung Fascicularia und die kontinentale Ochagavia litoralis. Die Gattungen Fascicularia-Ochagavia-Greigia (Bromelioideae) und Abromeitiella- Deuterocohnia (Pitcairnioideae) wurden mit Fragmentanalysen (AFLPs, RAPDs) untersucht. Analysen der RAPD- und AFLP-Daten mit UPGMA (Unweigthed pair group method using arithmetic averages) und NJ (Neighbor-Joining) stützen die Fassung der Gattung Fascicularia als eine Art (Fascicularia bicolor) mit zwei Unterarten (F. bicolor ssp. bicolor und F. bicolor ssp. canaliculata). F. bicolor ssp. canaliculata weist 28 Fragmente auf, die in keiner untersuchten Akzession von F. bicolor ssp. bicolor vorkommen. Die 5 untersuchten Akzessionen von F. bicolor ssp. bicolor sind durch 13 Fragmente charakterisiert, die in den 4 untersuchten Akzessionen von F. bicolor ssp. canaliculata fehlen. Die AFLP-Analysen der Gattungen Abromeitiella- Deuterocohnia stützen die Vereinigung der Gattungen Abromeitiella und Deuterocohnia in der älteren Deuterocohnia. Alle untersuchten Akzessionen der Artengruppe Abromeitiella-Deuterocohnia besitzen 11 gemeinsame charakteristische Banden, die Arten der Gattung Abromeitiella und Deuterocohnia für sich alleine genommen jedoch keine. Die größten genetischen Unterschiede bestehen zwischen der in Chile isoliert vorkommenden Deuterocohnia chrysantha und allen übrigen Arten der Gruppe. Der Informationsgehalt der analysierten chloroplastidären Sequenzen erwies sich für eine Auflösung der phylogenetischen Beziehungen von offenbar schnell evolvierenden Gattungsgruppen der Bromelioideae und Tillandsioideae als unzureichend. Fragmentanalysen, besonders AFLPs, zeigten auf der taxonomischen Ebene nah verwandter Gattungen eine gute Auflösung.
Mit der vorliegenden Arbeit wird für den südöstlichen Taunus und sein Vorland erstmals eine umfassende monographische Bearbeitung von Flora und Vegetation des Grünlands auf Basis umfangreicher Geländeerhebungen und Literaturrecherchen vorgelegt. Die wesentlichen Ziele der Untersuchung sind: • Darstellung der aktuellen und historischen Vorkommen und räumlichen Verbreitung von Pflanzenarten, Pflanzengesellschaften und Nutzungsintensitäten des Grünlands. • Darstellung der historischen Entwicklung des Grünlands und der sozioökonomischen Situation der Landwirtschaft. • Gefärdungseinstufung der Pflanzenarten und -gesellschaften (Rote Liste). • Kritische Bewertung des derzeitigen Stands der floristisch-vegetationskundlichen Landesforschung. • Bereitstellung von fachlichen Grundlagen für den praktischen Naturschutz, für Naturschutzbehörden, Planungsbüros, regionale Naturschutzforschung und die interessierte Öffentlichkeit. Das 1105 km2 große Untersuchungsgebiet liegt in nordwestlichen Rhein-Main-Gebiet und erstreckt sich von Wiesbaden im Südwesten und Bad Nauheim im Nordosten bzw. Schmitten im Nordwesten und Frankfurt im Südosten. Es umfasst mit dem Hebungsgebiet des Taunus (größte Höhe 878,5 m ü. NN) und dem Senkungsgebiet des Rhein-Main-Tieflands (tiefster Punkt 84 m ü. NN) zwei sehr unterschiedliche geowissenschaftliche Landschaftstypen, die im einzelnen 33 verschiedene naturräumliche Teileinheiten umfassen...
1.) Zahlreiche Medikamente werden nach Einnahme nahezu unverändert wieder ausgeschieden und gelangen über Abwasser und Kläranlagen in die aquatische Umwelt. 2.) Die gemessenen Konzentrationen erscheinen gegenüber anderen Kontaminantengruppen vergleichsweise niedrig, sind jedoch angesichts der Tatsache, dass Medikamente biologisch hoch aktive Substanzen sind, besorgniserregend. Das Beispiel Ethinylöstradiol zeigt, dass bereits im ng/l-Bereich Effekte auftreten. Abgesehen vom Beispiel Ethinylöstradiol lagen bislang keine Erkenntnisse über chronische Effekte von Medikamenten bei umweltrelevanten Konzentrationen vor. 3.) Die in der Umwelt festgestellten Arzneimittelwirkstoffe werden fast ausschließlich in Ab-, Oberflächen- und Grundwasser detektiert. Angaben über Medikamentanreicherungen in Sedimenten liegen nur vereinzelt vor. 4.) Angaben über die Ökotoxizität von Medikamenten beruhen bislang fast ausschließlich auf bei sehr hohen Substanzkonzentrationen durchgeführten Akuttests. Die Übertragung auf umweltrelevante Verhältnisse erfolgte durch Einbeziehung hoher Sicherheitsfaktoren. 5.) Die vorliegende Arbeit zeigt, dass in komplexeren Tests bereits bei sehr viel niedrigeren Konzentrationen Effekte auftreten. Diese Effekte sind nicht unmittelbar toxisch, beeinträchtigen jedoch die Entwicklung und Fortpflanzung der Versuchsorganismen nachhaltig. 6.) Als Modellsubstanzen für die in Oberflächengewässern nachgewiesenen Pharmaka wurden das Antiepileptikum Carbamazepin, Clofibrinsäure als Metabolit zahlreicher Lipidsenker, das Antibiotikum Ciprofloxacin und das Antidepressivum Fluoxetin ausgewählt. Sämtliche Pharmaka werden in der Umwelt weit verbreitet nachgewiesen. 7.) Als Testorganismen dienten die Zuckmücke Chironomus riparius, die Zwergdeckelschnecke Potamopyrgus antipodarum und der aquatische Annelide Lumbriculus variegatus. C. riparius ist ein bereits standardisierter Versuchsorganismus, L. variegatus ist zur Zeit im Standardisierungsverfahren (OECD 2004B) und für ökotoxikologische Untersuchungen empfohlen (ASTM 1995). Außerdem wurde mit den Einzellern Blepharisma japonicum und Tetrahymena thermophila ein Destruentenmikrokosmos entwickelt. Beide Einzeller sind ebenfalls erprobte Versuchsorganismen (PAULI 1996, FOX & MORIN 2001). 8.) Von den vier untersuchten Pharmaka erwiesen sich im getesteten Konzentrationsbereich Carbamazepin und Fluoxetin für jeweils einen der Testorganismen als schädlich. Carbamazepin blockierte ab einer Sedimentkonzentration von 234 µg/kg Sediment (Trockengewicht) die Entwicklung von C. riparius. Fluoxetin führte ab einer Testkonzentration von 2 µg/l zu einer Reduzierung der Embryonenzahl bei P. antipodarum. Die EC10 für Carbamazepin wurde zu 113 µg/kg Sediment berechnet, die EC10 für Fluoxetin zu 0,81 µg/l. Beide Konzentrationen sind bei Berücksichtigung der im TGD vorgesehenen Sicherheitsfaktoren umweltrelevant (PEC/PNEC > 1). Als Grundlage dieser Berechnung dienten gemessene Umweltkonzentrationen im Sediment beziehungsweise Wasser. Ein negativer Effekt von Ciprofloxacin auf L. variegatus erschien anhand der Daten zwar möglich, konnte jedoch nicht statistisch belegt werden. Für Clofibrinsäure ergaben sich keine Hinweise auf negative Effekte im getesteten Konzentrationsbereich. 9.) Die vorliegenden Berechnungen sind weitaus tragfähiger als bisher vorliegende, da sie auf chronischen Toxizitätsdaten und gemessenen Umweltkonzentrationen beruhen, statt auf Akutdaten und geschätzten Umweltkonzentrationen. 10.) Die in den Versuchen festgestellten, sehr niedrigen Effektkonzentrationen lassen Effekte auch bei umweltrelevanten Konzentrationen als wahrscheinlich erscheinen. Indirekte Effekte wie vermindertes Futterangebot für Prädatoren oder Verschiebungen im Artenspektrum sind denkbar. 11.) Der Destruentenmikrokosmos erwies sich als prinzipiell geeignet, Effekte von Xenobiotika auf Einzeller zu untersuchen, da die Positivkontrolle funktionierte. Die Daten aus den Versuchsansätzen zeigen jedoch, dass Versuchsdesign und Haltung der Testorganismen weiter entwickelt werden müssen. 12.) Die vorliegenden Daten zeigen, dass Pharmaka bei umweltrelevanten Konzentrationen ein ökologisches Risiko darstellen können. Maßnahmen zur Risikominderung sind dringend erforderlich. Angesichts des therapeutischen Nutzens der Substanzen erscheinen Verbote nicht durchsetzbar.
1. Das Dissoziations- und Reaggregationsverhalten von Epidermiszellen der Larven von Xenopus laevis wird unter verschiedenen Bedingungen in vitro mit Hilfe des Zeilrafferfilmes untersucht. Die Kultur der Schwänze erfolgt in Salzlösung nach STEINBERG und Serum hämolysierten Kälberblutes. Für die Reaggregation werden serumfreie Salzlösungen verwendet. 2. Am Auswandern der Zellrasen beteiligen sich alle dem Deckglas anliegenden Zellen. Sie bilden einen Plasmasaum in die Richtung aus, in der sie sich fortbewegen. Der Zusammenhalt zwischen den Zellen wird hierbei nicht gelöst. 3. Die Zellrasen lassen sich mit 0;05%igem EDTA in Einzelzellen auflösen; dabei tritt eine Trennung des Zellplasmas in ein zentral gelegenes granuliertes Plasma und einen hyalinen Plasmasaum auf. Bei längerer Einwirkung des EDTA werden die hyalinen Säume eingezogen. Die Zellen sind dann abgekugelt; es brechen blasenförmige "Lobopodien" aus den Zellen hervor und verschwinden wieder: "Blubbern". 4. In Gegenwart von Ca++ breiten sich die Zellen wieder auf dem Deckglas aus. Die Bildung "stabilisierter Aggregate" erfolgt in Ringerlösung (mit 0,02% CaCl2), in isotonischer Calciumchlorid-Lösung, in isotonischer Kochsalz- und Kaliumchlorid-Lösung, wenn Calciumchlorid mindestens 0,02%ig enthalten ist. Es wird angenommen, daß die einwertigen Kationen für die Zellbewegung und Reaggregation nur als Ladungsträger wirksam sind. In KCN-haltiger (2,5 X 10-3 M) und in PCMB-haltiger (2,5 X 10-3 M) Ringerlösung ist ebenfalls Reaggregation möglich. Unter dem Einfluß von PCMB ist die Stabilisierung der Zollgrenzen jedoch nicht von Dauer. Die Aggregate werden wieder aufgelöst; die Zellen zeigen keine Kontakthemmung mehr, sie wandern übereinander. 5. Wird das Calciumchlorid der Ringerlösung durch die äquimolare Menge Magnesiumchlorid ersetzt, so werden die Kontakte nicht stabilisiert, sondern "sliding sheets" gebildet. Keine Reaggregation ist in Calcium-haltiger Natrium- oder Kaliumchlorid-Lösung einer Konzentration unter 0,33 M und in Ringerlösung unter pH 4,0 möglich. Die Zellen sind dann auch zu keiner Ortsbewegung mehr fällig. Selbst kurze (3 min) Trypsinbehandlung (2%) verhindert die Reaggregation der Zellen im serumfreien Medium. 6. Besonders die Versuche zur Störung des Energiehaushaltes der Zellen legen nahe, daß die dabei zu beobachtenden Viskositätsänderungen im Hyaloplasmasaum auf einer Änderung des Kontraktionszustandes in ihm enthaltener kontraktiler Proteine beruhen. Die Auswirkungen von PCMB, niederem pH und geringer Ionenstärke deuten auf die Beteiligung eines Membranpotentials an der Steuerung der Viskositätsänderung hin. Diese Hypothese wird zu Ergebnissen der Muskelphysiologie in Beziehung gesetzt.
Hauptanliegen der vorliegenden Arbeit waren einerseits die Inventarisierung der Waldvegetation des Rothaargebirges sowie andererseits der Vergleich mit historischen Bearbeitungen zur Ermittlung von Vegetationsveränderungen. Die aktuelle Vegetation wurde mit Hilfe pflanzensoziologischer Methoden erfaßt und klassifiziert. Ergänzend erfolgte eine Kartierung vieler Waldvegetationseinheiten, welche in Verbreitungskarten dargestellt ist. Von großer Bedeutung im Bereich der Waldgesellschaften ist das Luzulo-Fagetum, welches in einer Reihe unterschiedlicher Ausbildungen vorkommt und im gesamten Gebiet verbreitet ist. Weitere Buchenwälder sind dem Galio odorati-Fagetum und in geringem Umfang dem Hordelymo-Fagetum zuzuordnen. Als Ersatzgesellschaften der Buchenwälder sind die große Flächen einnehmenden Fichtenforste, die überwiegend aus der Haubergswirtschaft entstandenen Wälder des Betulo-Quercetum und die wenigen dem Carpinion zugehörigen Bestände einzustufen. An feuchtere Standorte gebunden sind die Schluchtwälder des Fraxino-Aceretum pseudoplatani sowie Auenwälder, die durch das Carici remotae-Fraxinetum und das Stellario nemorum-Alnetum repräsentiert sind. Weiterhin kommen Bruchwälder des Betuletum carpaticae und des Sphagno-Alnetum vor, welche auf nassen Standorten siedeln. Ebenfalls pflanzensoziologisch dokumentiert wurden Gesellschaften, die im räumlichen Verbund der Wälder auftreten oder mit diesen in einem syndynamischen Zusammenhang stehen. Hierzu gehören insbesondere krautige Formationen der Schlagfluren sowie deren strauchige Folgegesellschaften. Des weiteren wurden Gesellschaften der Heiden, der Quellfluren, der Bachröhrichte und der Felsen erfaßt. Für eine Gegenüberstellung des Luzulo-Fagetum mit seinen forstlichen Ersatzgesellschaften erfolgte eine Betrachtung struktureller Parameter, floristischer Unterschiede sowie von Zeigerwerten. Sowohl Fichtenforst als auch Betulo-Quercetum weisen im Vergleich zum Luzulo-Fagetum eine geringere Anzahl an Varianten auf und Arten der Ordnung Fagetalia treten zurück. Im Fichtenforst häufiger sind Säurezeiger sowie Arten der Schlag- und Ruderalfluren, im Betulo-Quercetum vor allem Säure- und Magerkeitszeiger. Bezogen auf mittlere Zeigerwerte äußern sich die Unterschiede beider Gesellschaften zum Luzulo-Fagetumin höheren Werten für den Faktor Licht, während in bezug auf die Faktoren Feuchte, Bodenreaktion und Stickstoff lediglich das Betulo-Quercetum deutlich vom Luzulo-Fagetum abweicht, wobei die Werte jeweils deutlich geringer ausfallen. Die Relevanz dieser beobachteten Unterschiede offenbart sich an einer exemplarisch durchgeführten Darstellung des Bestockungswandels der Markenwaldungen Winterberg. Hier wurde für das 20. Jahrhundert ein deutlicher Anstieg der mit Fichten bewachsenen Flächen registriert, der auf Kosten des Buchenanteils geht. Zur ergänzenden Beurteilung der Waldvegetation wurden Analysen geringeren Umfangs angestellt. Hierunter fällt zum einen die Darstellung der Waldgesellschaften in einem Ökogramm anhand der mittleren Zeigerwerte für Feuchte, Bodenreaktion und Stickstoff. Bei der Betrachtung der Naturverjüngung in den einzelnen Waldgesellschaften erwiesen sich insbesondere Fagus sylvatica, Picea abies, Acer pseudoplatanus und Sorbus aucuparia als die sich am häufigsten verjüngenden Baumarten. Zur Beurteilung des Faktors Wild wurde die Verbißhäufigkeit an Waldpflanzen registriert. Danach gehören Athyrium filix-femina, Epilobium angustifolium, Dryopteris dilatata und Polygonatum verticillatum zu den beliebtesten Äsungspflanzen. Weiterhin wurde exemplarisch die Vegetation auf den im Rothaargebirge häufig anzutreffenden Meilerflächen dokumentiert. Im Bereich dieser Plätze werden nicht selten Arten der Ordnung Fagetalia sowie andere nährstoffliebende Taxa gefördert. Eine Gegenüberstellung der Aufnahmen von Fagion-Gesellschaften, Luzulo-Fagetum, Fichtenforst und Betulo-Quercetum mit vergleichbaren Aufnahmen historischer Bearbeitungen ergab eine Reihe von Unterschieden. Deutlich zeichnet sich eine Zunahme an stickstoffliebenden Arten ab, die pflanzensoziologisch überwiegend den Klassen Epilobietea angustifolii und Artemisietea vulgaris zuzuordnen sind. In den Fichtenforsten ist dieser Wandel besonders auffällig und spiegelt sich in erhöhten mittleren Zeigerwerten für Stickstoff und Bodenreaktion wider. Für die Fagion-Gesellschaften wurde zudem eine Abnahme an Arten der Ordnung Fagetalia registriert, so daß die Veränderungen der mittleren Zeigerwerte nur gering ausfallen, da diese Arten ebenfalls als Stickstoffzeiger einzustufen sind. Für das Luzulo-Fagetum fällt der Zuwachs an den betreffenden Arten zwar geringer als im Fichtenforst aus, zeigt sich aber in einzelnen Aufnahmen mit dominantem Auftreten der stickstoffzeigenden Arten. Im Betulo-Quercetum ist die Zunahme an Stickstoffzeigern am geringsten ausgeprägt und der Anstieg des entsprechenden mittleren Zeigerwertes beruht primär auf einem Rückgang an Säure- und Magerkeitszeigern. Letztere verzeichnen auch in den anderen Waldgesellschaften unterschiedlich stark ausgeprägte Verluste. Als Ursache für die Veränderungen werden insbesondere stickstoffreiche Immissionen diskutiert, sowie Kompensationskalkungen und Bestandsauflichtungen. Ergänzend sind Nutzungsänderungen in Erwägung zu ziehen, die sich vor allem bei den ehemals als Hauberg bewirtschafteten Beständen des Betulo-Quercetum auswirken. Die ermittelten Ergebnisse fügen sich in eine Reihe ähnlicher Untersuchungen ein und bestätigen damit auch die angewendete Methode des pflanzensoziologischen Typenvergleichs zum Monitoring von Vegetationsveränderungen. Weiterhin wurde in vorliegender Arbeit ein Blick auf die Situation des Wald-Naturschutzes im Rothaargebirge geworfen und Empfehlungen für eine weitere Entwicklung kurz angerissen. Als Beispiel für das Vorkommen gefährdeter Arten und deren Abhängigkeit von der Waldvegetation wurden Verbreitungskarten von Bärlapp-Arten angeführt.
Der derzeitige Stand der Gentherapie bedarf der Entwicklung neuer Systeme zur Selektion bislang unbekannter Proteine und zur Verbesserung der Gentransfereffizienz viraler Vektorsysteme. Bisher verwendete Systeme wie Phagen display bergen erhebliche Nachteile, die alle auf die Verwendung von Prokaryonten zurückzuführen sind. Deswegen wurde in der vorliegenden Arbeit ein System entwickelt, welches eine Selektion und Produktion von Proteinen im stets eukaryonten Kontext ermöglicht. Dazu wurde ein ein replikationskompetenter retroviraler Vektor entwickelt durch den eine erhebliche Steigerung der Gentransfereffizienz möglich ist. Beide Teilaspekte meiner Arbeit beruhen auf Modifikationen unterschiedlicher Stämme des Maus Leukämie Virus (MLV). Zur Selektion von Proteinen im eukaryonten Kontext wurde erstmalig eine retrovirale display Bibliothek etabliert, wobei ecotropes MLV varible Antikörper-Fragmente (scFv´s) auf der Oberfläche präsentiert. Eine Modellselektion mit dem Antigen Laminin, simuliert durch das Mischen von zwei erstellten Virusvarianten (7A5 Xa Mo/ L36 Xa Mo) in unterschiedlichen Konzentrationen, konnte die Selektion der Laminin-bindenen Variante L36 Xa Mo aus einem Überschuß von 10 hoch -4 nicht bindender 7A5 Xa Mo zeigen. Die Anreicherung der bindenden L36 Xa Mo Variante konnte ebenfalls aus dem Kontext einer erstellten retroviralen alphaHUVEC Bibliothek erzielt werden. Die Anwendbarkeit des Systems wurde durch diese Modellselektionen sowie durch die Selektion der alphaHUVEC Bibliothek auf VEGFR-1 als Antigen demonstriert. Derart selektionierte Proteine konnten im nächsten Schritt, unter Verwendung einer Furinspaltstelle im Hüllprotein des amphotropen MLV, in verschiedenen Zelllinien produziert werden. Gezeigt werden konnte eine effiziente Produktion und Sezernierung der verwendeten scFv´s bis zu einer Konzentration von 6µg/ml im Zellkulturüberstand, wobei der Tropismus des amphotropen MLVs nicht beeinflußt wurde. Die biologische Aktivität derart hergestellter Proteine, konnte mittels FACS und ELISA nachgewiesen werden. Eine Abtrennung von den viralen Bestandteilen kann durch Filtration mit molekularer Ausschlußgrenze erzielt werden. Besonders hervorzuheben ist die genomische Stabilität derart mordifizierter Viren. Trotz des zusätzlichen Leserahmens war das auf die beschriebene Weise modifizierte MLV über 12 Infektionszyklen genetisch stabil und gewährleistete so erstmalig eine stetige Produktion der gewünschten Proteine. Die erfolgreiche Anwendung dieses Vektorsystems zur Tumortherapie erwies sich bereits in weiterführenden Arbeiten.
Die Zusammensetzung der Plasmamembran tierischer Zellen kann unter anderem durch regulierte Exozytose und durch hydrolytische Abspaltung von Ektodomänen membran-assoziierter Proteine (Ectodomain Shedding) modifiziert werden. Regulierte Exozytose spezialisierter Vesikel, den sogenannten GSVs (GLUT4 containing small vesicles), dient der intrazellulären Speicherung des Glucosetransporters4 (GLUT4) sowie seinem insulin-abhängigen Einbau in die Plasmamembran. Die proteolytische Abspaltung der Ektodomänen von Zelloberflächenproteinen wie z.B. des Heparin-bindenden epidermalen Wachstums-faktors (heparin binding-epidermal growth factor = HB-EGF) führt zur Modifikation der Plasmamembranzusammensetzung. Wir zeigten, dass GSVs in vielen Säugerzellen für die intrazelluläre Speicherung spezifischer Plasmamembranproteine und deren stimulations-abhängigen Transfer in die Plasmamembran zuständig sind. Um GSVs eindeutig identifizieren zu können, wurden Rat1-Zellen stabil mit GLUT4myc als heterologem Marker für dieses spezifische Speicherkompartiment transfiziert. Die intrazelluläre GLUT4-Lokalisation in den als positiv identifizierten Rat1/GLUT4myc-Klonen entsprach dem für CHO/GLUT4-Zellen beschriebenen Verteilungsmuster. In der Folge wurden mehrere potentiell vesikel-assoziierte Membranproteine in die Untersuchungen zur Membran-zusammensetzung einbezogen: eine endogene proHB-EGF hydrolysierende Proteaseaktivität und die Metalloproteasen ADAM10 und TACE. Es zeigte sich, dass GSVs eine Proteaseaktivität enthielten, die VSVG-proHB-EGF hydrolysierte. Eine Colokalisation der beiden endogenen Metalloproteasen ADAM10 und TACE mit GLUT4 in GSVs konnte gezeigt werden. Untersuchungen zeigten, dass beide endogenen Proteasen ADAM10 und TACE in Rat1/GLUT4myc-Zellen mit einer Subpopulation von GSVs assoziiert zu sein scheinen. Die Stimulation des G-Protein-gekoppelten Thrombinrezeptors löste in diesen Zellen eine regulierte Exozytose der GSVs aus. Die Metalloproteasen-enthaltenden GSVs reagierten jedoch nicht auf diese Art der Stimulation. Sie bildeten möglicherweise eine Reservepopulation von GSVs, die erst bei stärkerer Stimulation mobilisiert werden kann. Unter Ruhebedingungen schien auch diese Vesikelpopulation über andere intrazelluläre Kompartimente, nicht jedoch über die Plasmamembran, zu rezirkulieren.
Pflanzliche Biomasse bietet sich hervorragend als billiges und in großen Mengen verfügbares Ausgangssubstrat für industrielle Fermentationsprozesse an. Dabei könnte z.B. die Hefe Saccharomyces cerevisiae zur Herstellung von Bioalkohol eingesetzt werden. S. cerevisiae kann jedoch die in großen Mengen in der Biomasse enthaltenen Pentosen D-Xylose und L-Arabinose nicht vergären. Deshalb wäre ein Hefestamm mit entsprechend erweitertem Substratspektrum von großem wirtschaftlichen Interesse. In dieser Arbeit sollte rekombinante Hefestämme konstruiert bzw. optimiert werden, die in der Lage sind D-Xylose und/oder L-Arabinose zu Ethanol zu vergären. Zunächst wurde ein bereits vorhandener L-Arabinose vergärender Hefestamm unter Einsatz der Methoden der „gerichteten Evolution“ optimiert, L-Arabinose effektiver zu verstoffwechseln. Dies geschah durch repetitive Selektion auf Wachstum mit L-Arabinose als einziger Kohlenstoffquelle unter Sauerstoff-limitierten Bedingungen. Eine genetische und physiologische Charakterisierung des Stammes ergab, dass dieser sowohl Mutationen im Hefegenom als auch auf den L-Arabinose Stoffwechselweg exprimierenden Plasmiden erworben hatte. Dieser Stamm exprimierte die für den L-Arabinose Katabolismus notwendigen Enzyme und Transporter von vier verschiedenen Plasmiden. Für den industriellen Einsatz eines rekombinanten Hefestammes ist es jedoch unerlässlich, die Gene des L-Arabinose Katabolismus stabil in das Genom zu integrieren. In dieser Arbeit ist es gelungen, zwei der insgesamt drei essentiellen Gene des Stoffwechselweges in funktioneller Form in den rDNA-Locus von S. cerevisiae zu integrieren. Im letzten Teil der Arbeit konnte erstmals ein Hefestamm konstruiert werden, der sowohl die Gene des Stoffwechselweges für den L-Arabinose- als auch die des Stoffwechselweges für den D-Xylose-Katabolismus exprimiert. Der Stamm war in der Lage auf Nähragarplatten zu wachsen, bei denen L-Arabinose oder/und D-Xylose die einzigen Kohlenstoffquellen darstellten. Wachstumstests mit Flüssigkulturen sowie HPLC-Analysen des Zuckerverbrauchs ergaben jedoch, dass der Hefestamm überraschenderweise nicht in der Lage war, D-Xylose in Flüssigmedien zu verstoffwechseln. Mögliche Erklärungen hierfür werden diskutiert.
Reinigung, biochemische Charakterisierung und Struktur der A1AO-ATPase aus Methanococcus jannaschii
(2006)
Die A1AO-ATPase wurde aus Membranen von M. jannaschii unter Erhalt der Struktur isoliert. Das Enzym wurde durch eine Saccharose-Dichtegradientenzentrifugation, eine Anionenaustauschchromato-graphie an DEAE und eine Gelfiltration zur Homogenität gereinigt. Alle 9 aus der Operon-Struktur vorhergesagten Untereinheiten konnten mittels Western-Blot-Analyse oder einer N-terminalen Sequenzierung identifiziert werden. Die funktionelle Kopplung der A1- und AO-Domäne wurde durch Studien mit dem Inhibitor DCCD nachgewiesen. Das gereinigte Enzym hatte eine Masse von 670 kDa. Die ATP-Hydrolyseaktivität war bei einer Temperatur von 80°C und einem pH-Wert von 6 optimal. Der KM-Wert für MgATP wurde zu 1,2±0,2 mM bestimmt. Bei den Versuchen zur Entwicklung eines Na+-freien Tespuffers trat die strikte Abhängikeit des Enzyms von Hydrogensulfit oder Sulfit als Problem zu Tage. Aus Membranen von M. jannaschii wurden durch Chloroform/Methanol Lipide extrahiert, aus denen dann Liposomen hergestellt wurden. Die A1AO-ATPase aus M. jannaschii wurde in diese Liposomen erfolgreich rekonstituiert, eine ATP-Synthese konnte jedoch nicht nachgewiesen werden. Die elektronenmikroskopischen Analysen zeigten einen für ATPasen charakteristischen Aufbau, aus einer hydrophilen Domäne, die durch mindestens zwei Stiele mit der Membrandomäne verbunden ist. Anhand der Bildrekonstruktion von 17.238 Einzelpartikeln konnten zwei Klassen von ATPase-Molekülen unterschieden werden, die entweder über einen oder zwei periphere Stiele verfügten. Aus verschiedenen Einzelprojektionen wurden Summenbilder generiert, anhand dieser 2D- Rekonstruktion wurde die ATPase vermessen. Der Kopfteil, die Membrandomäne und der zentrale Stiel haben eine Größe von 11,5 x 9,4 nm, 10,6 x 6,4 nm und 8 x 3,9 nm (Länge x Breite). Die Gesamtlänge des Enzyms betrug 25,9 nm. Der zentrale Stiel der ATPase ist über der Membran von einer Kragen-ähnlichen Struktur umgeben, die wiederum mit den peripheren Stielen in Kontakt steht. Scheinbar steht nur einer der peripheren Stiele in direktem Kontakt mit der AO-Domäne. Die Überlagerung der 3D-Rekonstruktion eines A1-Subkomplexes aus Methanosarcina mazei mit der 2D-Rekonstruktion der A1AO-ATPase aus M. jannaschii zeigen deutlich, dass die peripheren Stiele mit dem oberen Ende der A1-Domäne in Kontakt stehen. Durch diese Analysen konnte erstmals die Struktur einer A1AO-ATPase mit einer Auflösung von 1,8 nm dargestellt werden. Sequenzanalysen haben gezeigt, dass das Proteolipid-Gen von Methanopyrus kandleri verdreizehnfacht ist. Das Gen wurde mittels PCR vervielfacht und in einen TOPO®-Vektor kloniert. Versuche das Gen in einen Expressionsvektor umzuklonieren, waren noch nicht erfolgreich.