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Das Gehirn als Hypoxie-empfindlichstes Organ des menschlichen Körpers ist auf eine konstante Blutversorgung angewiesen. Zur Gewährleistung der Unabhängigkeit von systemischen hypo- bzw. hypertensiven Blutdruckschwankungen, existieren verschiedene Regulationsmechanismen, welche den cerebralen Blutfluss (CBF) in einem weiten Bereich (arterieller Mitteldruck zwischen 60 - 150mmHg) konstant halten. Zu diesen Mechanismen gehören die Blutdruck-adaptierte Autoregulation, die metabolische Vasoreaktivität sowie die neurovasculäre Kopplung. Außerhalb des physiologischen Autoregulationsbereichs folgt der CBF druckpassiv den Schwankungen des systemischen Blutdrucks. Ischämische Hypoperfusion oder Gefäßwand-schädigende Blutdruckspitzen können die Folge sein. Zusätzlich führen verschiedene cerebrovasculäre Erkrankungen zu einer Einschränkung der cAR. Zu diesen gehören die cerebrale Mikroangiopathie, Stenosen bzw. Verschlüsse der A. carotis interna (ACI), der Schlaganfall sowie das Schädel-Hirn-Trauma (SHT). Eine valide Untersuchungsmethode zur Messung der cAR mit geringem apparativen Aufwand und fehlender Strahlenbelastung ist die transcranielle Doppler-Sonographie (TCD). Allerdings stellt eine Verfälschung der Messergebnisse durch verstärkte Streuung des Ultraschallsignals an der Schädelkalotte (schlechtes Schallfenster [sSF]) eine relevante Fehlerquelle dar. Mit steigendem Lebensalter finden sich in bis zu 30% der Bevölkerungen insuffiziente Schallbedingungen. Ziel der vorliegenden Studie war es daher festzustellen, ob die Dauerinfusion eines Ultraschallkontrastmittels (Levovist®) bei der TCD-Autoregulationsmessung an Probanden mit künstlich verschlechtertem Schallfenster eine valide Messung verschiedener Autoregulationswerte ermöglicht. 45 unselektierte Personen mit gutem Schallfenster aus dem Patientengut der Neurologie der J.W.G.-Universität Frankfurt am Main wurden in die Studie eingeschlossen. Die Doppler-Signalqualität, die Blutflussgeschwindigkeiten, der Pulsatilitätsindex nach Gosling und King (PI) sowie die Autoregulationsparameter Phasendifferenz (PD) und Kreuzkorrelations-Koeffizient (Mx) wurden anhand der über das transtemporale Schallfenster abgeleiteten A. cerebri media (ACM) beidseits bestimmt. Zur Imitation des sSF wurde eine Lage Aluminiumfolie ohne Veränderung der Sondenposition zwischen Ultraschallsonde und Haut eingebracht. Die Messungen erfolgten nach einem standardisierten Protokoll in drei Durchgängen (native Messbedingungen, künstliche Schallfensterverschlechterung, Infusion des Ultraschallkontrastmittels (KM) Levovist® [300 mg/min] bei bestehendem sSF) in einem Zeitraum von je 15 Minuten in Ruhe und je 3 Minuten während metronomischer Atmung. Mit künstlicher Verschlechterung des Schallfensters zeigte sich eine signifikante Verfälschung aller erhobenen Messparameter. Die mittlere Flussgeschwindigkeit in der ACM und die mittlere Energie des Doppler-Spektrums verringerten sich um 40%, bzw. um 22%, wohingegen sich der PI verdreifachte. Ebenso veränderten sich die Autoregulationsparameter mit einer Abnahme der PD um durchschnittlich 8 - 10° und des Kreuzkorrelations-Koeffizienten Mx von 0.308 +/- 0.170 auf 0.254 +/- 0.162. Die Verringerung der PD täuscht eine pathologische Einschränkung der cAR vor. Diese Einschränkung entspricht z.B. der einer 75 - 99%-igen Stenose der ACI und kann darüber hinaus auch bei einer Reihe weiterer cerebrovasculärer Erkrankungen (z.B. lakunäre Infarkte bei cerebraler Mikroangiopathie, Subarachnoidalblutung [SAB], maligne Hypertonie) beobachtet werden. Die Abnahme des Kreuzkorrelations-Koeffizienten Mx täuscht im Gegensatz dazu eine scheinbar intakte cAR (Mx < 0.3) vor. Bei Patienten mit schwerem Schädel-Hirn-Trauma (SHT), SAB oder Stenose der ACI besteht in diesem Fall die Gefahr, eine optimale Prävention von Sekundärschäden nicht gewährleisten zu können, da frühe Hinweise auf eine Schädigung des Gehirns, ausgelöst durch verminderte cerebrale Autoregulation, unter Umständen fehlen. Die Infusion des Ultraschallkontrastmittels Levovist® konnte diese Effekte der künstlichen Verschlechterung des Schallfensters auf die Autoregulationsparameter über den gesamten Messzeitraum fast vollständig ausgleichen (PD nativ vs. KM 38.2 +/- 10.0 vs. 37.2 +/- 12.3 und Mx nativ vs. KM 0.308 +/- 0.170 vs. 0.323 +/-0.163). Auch die übrigen erfassten Messparameter näherten sich durchweg den Werten unter nativen Messbedingungen an. Die Verwendung eines Ultraschallkontrastmittels bei der transcraniellen Doppler-Sonographie erhöht also die Validität der Messung der cerebralen Autoregulation bei Patienten mit schlechtem Schallfenster. Eine klinische Relevanz entsteht im besonderen, da sowohl ein schlechtes Schallfenster, als auch cerebrovasculäre Erkrankungen, welche im Zusammenhang mit einer verminderten cerebralen Autoregulation stehen, bevorzugt bei älteren Menschen anzutreffen sind.
Untersuchungen zur Wechselwirkung zwischen der Polo-like kinase 1 und dem CCCTC-binding factor
(2009)
Die Polo-like kinase 1 ist ein Schlüsselprotein bei der Steuerung mitotischer, meiotischer und zytokinetischer Prozesse. Um den korrekten Ablauf dieser Prozesse zu gewährleisten, muss die Menge an PLK1 in den verschiedenen Phasen des Zellzykluses genauestens reguliert werden. Eine Vielzahl verschiedener Tumorentitäten weisen eine stark erhöhte Konzentration an PLK1-Protein auf. Für die Krebsforschung ist es daher von großer Relevanz Aufschluss über solche Proteine zu erhalten, die Einfluss auf die PLK1 Expression nehmen. Dieses Wissen könnte dazu beitragen, Strategien für eine noch gezieltere Krebstherapie zu entwickeln. Die vorliegende Arbeit zeigt einerseits erste Hinweise für eine Rolle des multivalenten Transkriptionsfaktors CCCTC-binding factor (CTCF) für die Regulation des PLK1-Promotors und andererseits erste Anhaltspunkte für einen Einfluss der PLK1 auf die transkriptionsregulatorische Funktion von CTCF. Grundlage dieser Arbeit war die Identifikation einer putativen Binderegion von CTCF im Bereich des PLK1-Promotors, die die Frage aufkommen ließ, ob CTCF einen transkriptionsregulatorischen Einfluss auf den PLK1-Promotor besitzt. Deshalb wurden initial Reportergenanalysen durchgeführt, bei denen gezeigt werden konnte, dass CTCF die Promotoraktivität einer PLK1-Promotorsequenz, welche die putative CTCF-Binderegion beinhaltet, steigern kann. Zudem ist es gelungen, die Bedeutung der putativen Binderegion für die Aktivitätssteigerung herauszuarbeiten, da eine 50%ige Deletion dieses Bereiches mit einer deutlichen Reduktion der CTCFbedingten Induktion der Reportergentranskription einherging. Interessanterweise konnten in den daraufhin durchgeführten in vitro-Interaktionsstudien erste Daten, die für eine Interaktion von CTCF und PLK1 sprechen, gesammelt werden, wobei die Kombination der Ergebnisse aus dem GST-Pull-Down- und dem Co-Immunopräzipitationsexperiment die Aussage zulassen, dass diese Wechselwirkung auf Seiten der PLK1 über die Polo-Box-Domäne und auf Seiten von CTCF über die aminoterminale Domäne vermittelt wird. Mit dem Nachweis der in vitro-Phosphorylierbarkeit von CTCF durch PLK1 konnte zudem ein mögliche Funktion dieser Interaktion herausgearbeitet werden. Durch den Einsatz von CTCF-Deletionsmutanten und eines punktmutierten CTCF-Fragments gelang es in weiteren Phosphorylierungsstudien Serin-224 als PLK1-Phosphorylierungsstellen in CTCF zu identifizieren. Abschließend ist es im Zuge von Reportergenanalysen, die den Effekt einer S224A Mutante von CTCF mit demjenigen von CTCF Wildtyp verglichen, gelungen, erste Hinweise für einen Rolle von Serin 224 im Hinblick auf die transkriptionsregulatorische Modulation von CTCF zu sammeln.
Die vorliegende Arbeit befasste sich in erster Linie mit der Regulation des P2X2 Rezeptors (P2X2R) durch Phosphoinositide (PI). P2X Rezeptoren sind durch extrazelluläres ATP aktivierte Kationenkanäle, die ubiquitär unter Vertebraten, v. a. im zentralen wie peripheren Nervensystem exprimiert werden. Bis heute sind 7 verschiedene Untereinheiten dieser Rezeptorfamilie bekannt, die nach homo- oder heterotrimerer Assemblierung unterschiedliche funktionelle Phänotypen ausbilden. Die P2X Rezeptoren sind an einer Vielzahl von physiologischen und pathophysiologischen Prozessen beteiligt. Für ihre Beteiligung am zellulären Signalgeschehen wurde in der Vergangenheit der Begriff der purinergen Signaltransduktion geprägt. PI4,5P2 ist ein zelluläres, an der Innenseite der Plasmamembran verankertes Phospholipid, dem zahlreiche, essentielle Funktionen zukommen. Dass es auch Signalfunktion besitzen kann, wurde erst spät (1980) bekannt; dass es darüber hinaus zudem membranäre Transportsysteme reguliert, konnte erst in den letzten Jahren gezeigt werden. Die ersten Kanäle, für die eine Phosphoniositid (PI)-Beeinflussung nachgewiesen wurde, waren die einwärts gleichrichtenden K+-Kanäle. 2006 wurden die ersten vorläufigen Hinweise publiziert, dass auch die Kanalfunktion der P2X Rezeptoren durch Phosphoinositide beeinflusst werden kann. Darauf aufbauend wurde in der vorliegenden Arbeit der P2X2R nach Expression in Xenopus Oozyten elektrophysiologisch auf eine mögliche Regulation durch PIPns untersucht. Um die in der Oozyte vorliegenden PI-Level gezielt während der Messung ändern zu können, wurde die spannungsgesteuerte Phosphoinositid-Phosphatase Ci-VSP coexprimiert. Ci-VSP, die der PTEN-Phosphatase strukturell sehr ähnlich ist, wurde 2005 aus der Schlauchascidie Ciona intestinalis kloniert. In der veröffentlichten Klonierungsarbeit wurde bereits gezeigt, dass Ci-VSP in der Lage ist, bekannte PI4,5P2-sensitive Membrankanäle, wie z. B. bestimmte K+-Kanäle, spannungsabhängig zu inhibieren. Es konnte in TEVC-Experimenten gezeigt werden, dass die durch Depolarisation induzierte Aktivierung dieser Phosphatase den P2X2 Rezeptorstrom in seiner Desensibilisierung sowohl beschleunigt als auch verstärkt. Dieser Effekt war spannungsabhängig und nahm mit höherer Depolarisation zu. Die ermittelte Spannungsabhängigkeit stimmte dabei mit dem sensitiven Potentialbereich der spannungsgesteuerten Ci-VSP-Domäne, gemessen an ihren gating-Strömen, überein. Der „Ci-VSP-Effekt“ auf den P2X Rezeptor konnte nur in Anwesenheit von ATP, d.h. bei aktiviertem Rezeptor, beobachtet werden. Wurden die Oozyten mit Wortmannin, einem PI4-Kinase(PI4K)-Inhibitor, behandelt, zeigte sich eine vergleichbare Veränderung des Rezeptorstroms. Eine PI4K-Inhibition zielt demnach offensichtlich auf die gleichen Regulationsmechanismen wie die Ci-VSP-Aktivierung. In weiterführenden zellfreien Patch Clamp-Messungen an Oozytenmembranen wurden sowohl Einzelkanal- als auch makroskopische Ströme des P2X2R unter Einfluss verschiedener, intrazellulär verabreichter PIs und PI-beeinflussender Enzyme untersucht. Einzig die Zugabe von PI4,5P2 hatte einen deutlich aktivierenden Einfluss auf den makroskopischen Rezeptorstrom, andere getestete PIs (wie auch PI3-Kinase und PTEN-Phosphatase) zeigten keinerlei Wirkung. Vergleichbare Ergebnisse konnten in vorläufigen Einzelkanal-Messungen an diesem Rezeptor Subtyp beobachtet werden. Da die PI4-Kinase offensichtlich an der beobachteten Beeinflussung der P2X2R Desensibilisierung beteiligt ist, wurde die P2X2-Rezeptorsequenz auf potentielle - über sogenannte SH3-Epitope vermittelte - PI4K-Interaktionsbereiche hin untersucht. Diese SH3-Epitope kommen in vielen zellulären Proteinen vor, um Protein-Protein-Interaktionen zu vermitteln. Nach Sequenzanalyse des maßgeblich am Desensibilisierungsgeschehen beteiligten C-Terminus des P2X2R konnte im distalen Teil ein SH3-Bindungsmotiv lokalisiert werden, das daraufhin durch gerichtete Mutagenese (P2X2-P451A/P454A) unwirksam gemacht wurde. Dieser mutierte Rezeptor verhielt sich in seiner Desensibilisierung wie der Wildtyp nach Wortmannin-Behandlung, zeigte also eine intrinsisch verstärkte Desensibilisierung. Eine Wortmannin-Behandlung der Oozyten, die den mutierten Rezeptor exprimierten, führte hingegen zu keiner weiteren Beeinflussung des Rezeptorstroms. Somit konnte letztlich der Schluss gezogen werden, dass die PI4K, und das mit ihr in direkter Verbindung stehende PI4,5P2, einen maßgeblichen Einfluss auf das Desensibilisierungsverhalten des P2X2R hat. Auf Basis der erarbeiteten Befunde wurde ein kinetisches Reaktionsmodell des P2X2R erstellt, das bisher aufgestellte Modelle mit den Ergebnissen dieser Arbeit vereint, aber auch in teilweisem Gegensatz zu dem von FUJIWARA & KUBO [2006] steht. Des Weiteren wurde im Verlauf dieser Arbeit die reversible Inhibition des P2X2R durch eine Reihe von Aminoglykosid-Antibiotika untersucht. Durch Analyse der Dosis-Wirkungs-Beziehungen, der Spannungs- sowie wie ATP-Konzentrations-Abhängigkeit der Inhibition konnte gezeigt werden, dass es sich dabei um einen nicht-kompetitiven open pore block handelte. Durch weiterführende Untersuchungen an einer nicht-desensibilisierenden P2X2/1 Rezeptorchimäre wurde gezeigt, dass eine Aminoglykosid-Inhibition die ATP-Dissoziation von der Rezeptorbindungsstelle signifikant verlangsamte. Dieser Befund deutet auf eine im Vergleich zum geschlossenen Zustand erhöhte Affinität des offenen Zustands für ATP hin. Neben den hier untersuchten Aminglykosiden sind bislang keine weiteren Substanzklassen bekannt, die den P2X2R durch einen derartigen Mechanismus hemmen.
Der hereditäre Fibrinogen-Mangel ist ein seltener Hämostasedefekt, der in einer quantitativen (Hypofibrinogenämie und Afibrinogenämie) oder qualitativen Form (Dysfibrinogenämie) bzw. einer Kombination aus beiden Formen (Hypodysfibrinogenämie) vorliegt. Seltene Ausprägungen wie die Fibrinogen- Amyloidose und die hepatische Speicherkrankheit Endoplasmic Reticulum Storage Disease (ERSD) tragen zum heterogenen klinischen Bild der Erkrankungen bei, das neben einem asymptomatischen Verlauf Blutungen und Thrombosen umfassen kann. Ziel der vorliegenden Arbeit war es, das Spektrum genetischer Veränderungen, deren Auswirkungen auf die klinische Manifestation und gerinnungsphysiologische Ausprägung bei 101 Probanden mit angeborenem Fibrinogen-Mangel sowie bei 41 erstgradig verwandten Familienangehörigen zu untersuchen. Die vorliegende Arbeit stellt das bisher größte zusammenhängend untersuchte und genetisch charakterisierte Patientenkollektiv mit Fibrinogen-Mangel dar. Von den insgesamt 96 nachgewiesenen Sequenz-Varianten wurden 30 erstmals beschrieben. Hierdurch ergibt sich ein Zuwachs von 15 % an der Gesamtzahl der verschiedenen bisher in der Literatur beschriebenen genetischen Defekten. Bei acht nachgewiesenen Mutationen war bisher erst eine Familie mit dieser Sequenz-Variante beschrieben. Die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit bestätigen, dass diese Mutationen kausal für den Phänotyp des Fibrinogen-Mangels sind. Die klinische Präsentation der Patienten umfasste, häufiger als in der Literatur bisher beschrieben, zu 50 % leichte bis moderate Blutungen in Form von Menorrhagien oder verlängerten Nachblutungen nach Verletzungen. Schwere Blutungen traten bei Patienten mit Afibrinogenämie oder selten bei heterozygoten Mutationsträgern in Assoziation mit Operationen, Schwangerschaften und Traumata auf. Probanden mit ERSD erlitten gegensätzlich zu den bisherigen Beschreibungen aus der Literatur sowohl Blutungen als auch Thrombosen. Die Vorhersage des klinischen Phänotyps nach traditioneller Einteilung des Fibrinogen-Mangels anhand laborchemischer Beschreibungen war nicht zuverlässig. Zudem lagen die hierfür erforderlichen Laborparameter häufig nicht vor. Die Mutationsdiagnostik konnte zu einer verbesserten Einschätzung des klinischen Phänotyps beitragen. Spezifische Mutationen wiesen eine Korrelation zu bestimmten klinischen Manifestationen auf. Hierbei zeigte sich eine ausgeprägte Assoziation der Varianten BbArg14Cys und gAsn319-Asp320del mit thromboembolischen Ereignissen. Für weitere Mutationen (AaArg19Gly, BbArg44Cys, gTyr262Cys, gAla327Thr und gLys380Asn) ist ebenfalls eine Assoziation mit Thromboseneigung anzunehmen, konnte jedoch aufgrund kleiner Fallzahlen nicht zweifelsfrei beurteilt werden. Die am häufigsten auftretenden Mutationen an Position AaArg16 waren mit einer moderaten Blutungs- (17 % bis 53 %) und einer nur geringen Thromboserate (3 % bis 13 %) assoziiert, die jedoch für die AaArg16Cys-Variante höher lag im Vergleich zur AaArg16His-Variante. Die Mutationen gGly333Ser und gArg375Trp zeigten eine Korrelation zur hepatischen Speicherkrankheit ERSD und gingen mit einer beeinträchtigten Leberfunktion einher. Die Verdachtsdiagnose des Fibrinogen-Mangels wurde bei einem Großteil der Indexpatienten (42 %) aufgrund pathologischer Gerinnungswerte gestellt. Vor allem „Null“-Mutationen gingen jedoch oftmals mit im Referenzbereich liegenden Fibrinogen-Werten einher, so dass sich neben der mehrmaligen Fibrinogen-Bestimmung die zusätzliche Testung weiterer Laborparameter, wie die Thromboplastinzeit (TPZ), die aktivierte partielle Thromboplastinzeit (aPTT) und die Thrombinzeit (TZ) als hilfreich erwiesen haben. Die Bestimmung des abgeleiteten Fibrinogens (Fib. QD) zeigte sich als nicht geeignet zur Detektion des kongenitalen Fibrinogen-Mangels, da die am häufigsten vorliegenden Mutationen an AaArg16 zu keiner Erniedrigung führten. Die Messung des funktionellen Fibrinogen nach Clauss (Fib. n. Cl.), der Fibrinogen- Konzentration (Fib. Ag) und die daraus resultierende Fibrinogen-Ratio (RaAg) bzw. die Bestimmung von RZ und TZ waren die Grundlage eines in der vorliegenden Arbeit entwickelten Stufenmodells für einer schnelle und kostengünstige Mutations-Detektion. Bei Anwendung der vorgeschlagenen Stufendiagnostik im Vergleich zur herkömmlichen Komplettsequenzierung ist eine Reduktion von Arbeitsaufwand und Kosten um bis zu 64 % zu erwarten.
Das photoneuroendokrine System der Vertebraten steuert die rhythmische Melatoninsynthese. Melatonin ist ein wichtiges Signal für circadiane und saisonale Rhythmen und für die Synchronisation der Föten mit dem mütterlichen Organismus. Bei Säugetieren besteht das photoneuroendokrine System aus den folgenden Komponenten: der Retina für die circadiane Lichtperzeption, dem endogenen Rhythmusgenerator im Nucleus suprachiasmaticus (SCN) und dem Pinealorgan als neuroendokrinem Effektor. Dieses System vermittelt, durch die nächtliche Abgabe des Hormons Melatonin vom Pinealorgan, Änderungen in den Belichtungsverhältnissen der Umgebung an den Körper. Bei der Synthese von Melatonin im Pinealorgan ist die Arylalkylamin Nacetyltransferase (AANAT) das geschwindigkeitsbestimmende Enzym. Die nächtlich erhöhte Expression von Aanat in Pinealozyten wird vor allem durch die Freisetzung des Neurotransmitter NA aus sympathischen Nervenendigungen angetrieben. NA bindet an adrenerge Rezeptoren in der Pinealozytenmembran und aktiviert den cAMP-Signaltransduktionsweg, der zur CRE-vermittelten gesteigerten Aanat Expression führt. In der Promoterregion von Aanat ist auch ein E-box Promoterelement vorhanden, das durch Uhrenproteine angesteuert werden kann. Bislang jedoch war die Rolle des molekularen Uhrwerkes für die Expression von Aanat noch unklar. Um zu untersuchen, wie sich eine Schwächung des negativen Regulatorkomplexes auf die Expression von Aanat im Pinealorgan und in anderen Geweben auswirkt, wurden Mäuse mit gezielter Deletion des Per1 Gen (Per1 KO) untersucht. Die Expression von Aanat im Pinealorgan von Per1 KO Mäusen, die in der Standardphotoperiode gehalten wurden, zeigte einen circadianen Rhythmus mit ähnlicher Dynamik, aber erhöhter Amplitude im Vergleich zum WT. AANAT Enzymaktivität und Melatoninkonzentration folgen dem gleichen Profil. Eine Verkürzung der Photoperiode hat bei Per1 KO Mäusen starke Auswirkungen auf dieendogene Periodenlänge der Aanat Expression, die sich gegenüber dem WT drastisch verlängert. Bei einer Verlängerung der Photoperiode kommt es zu einer Verzögerung im Rhythmus der Aanat Expression von ca. 8 h gegenüber dem WT. Dies zeigt, dass das molekulare Uhrwerk je nach Photoperiode Amplitude, Periodenlänge und Phasenlage modulieren kann. Um zu untersuchen, ob es sich dabei um Pinealorgan-intrinsische Effekte handelt, wurden in vitro Experimente durchgeführt. Im WT-Pinealorgan gibt es zum Zeitpunkt CT18 ein Sensitivitätsfenster für die NA-induzierte Aanat Expression. Überraschenderweise steigt die Aanat Expression im unstimulierten Per1 KO Pinealorgan in der Nacht signifikant gegenüber dem subjektiven Tag an. Eine weitere Induktion durch NA ist nicht möglich. Dies deutet darauf hin, dass ein abgeschwächter negativer Regulator Komplex (NRC), welcher über das E-box Element wirkt, dieselben Auswirkungen in der Per1 KO Maus hat, wie eine NA-Stimulation im WT. Im WT wird der inhibitorische Effekt des NRC offenbar durch die NA-abhängige Aktivierung von CRE überwunden. Untersuchung zur ektopischen Expression von Aanat zeigten, dass dieses Gen in der Hypophyse einen cicadianen Rhythmus aufweist, der unabhängig von einem intakten molekularen Uhrwerk abläuft. Im Gegensatz dazu findet sich in der Milz von Per1 KO Mäusen eine verstärkte Aanat Expression am subjektiven Tag im Vergleich zum WT. Offenbar hat das molekulare Uhrwerk auch einen Einfluss auf die Gewebespezifität der Aanat Expression. Weiterhin wurde in dieser Arbeit die ontogenetische Entwicklung des molekularen Uhrwerkes im SCN von Melatoninrezeptor1 und 2 defizienten (MT1,2 -/-) Mäusen untersucht. Im Gegensatz zu Mäusen mit intakten Melatoninrezeptoren, zeigen diese Mäuse im Fötalstadium noch keinen Rhythmus in der Anzahl mPER1- und mPER2-Ir Zellen. In diesem Stadium sind die einzelnen SCN-Neurone noch kaum durch Synapsen miteinander gekoppelt. Dies deutet darauf hin, dass das mütterliche Melatonin die rhythmischen Uhrengenexpression in den einzelnen fötalen SCN-Zellen synchronisiert. Erst im juvenilen SCN ist ein Rhythmus der Uhrenproteine identisch mit dem adulten Tier. Zu diesem Stadium sind die intrasuprachiasmatischen Kontakte vermutlich schon soweit ausgebildet, dass kein rhythmisches Eingangssignal für die Synchronisation der SCN-Zellen notwendig ist.
Die mitochondriale Atmungskette und insbesondere die Cytochrom c Oxidase als deren terminales Enzym sind essentiell für den Energiestoffwechsel eukaryotischer Zellen. Die Assemblierung der mitochondrialen Cytochrom c Oxidase mit ihren bis zu 13 Untereinheiten ist noch nicht bis ins Detail aufgeklärt, aber es handelt sich um einen geordneten, stark regulierten Prozess, und Defekte der Assemblierung sind häufig Ursache für neurodegenerative und myopathische Erkrankungen. In Eukaryoten sind bisher mehr als 30 Proteine identifiziert worden, die an der Biogenese der Cytochrom c Oxidase beteiligt sind, darunter Surf1. Beim Menschen führt der Verlust von Surf1 zu einer letalen neurodegenerativen, als Leigh-Syndrom bezeichneten Krankheit, wobei die genaue Rolle von Surf1 bei der Assemblierung der Cytochrom c Oxidase unklar ist. Das Bodenbakteriums Paracoccus denitrificans kann als Modellorganismus für die mitochondriale Atmungskette dienen, da seine aeroben Atmungskettenkomplexe eine deutliche Homologie zu denen der Mitochondrien auf weisen. P. dentrificans besitzt zwei homologe Gene für Surf1, die in Operons mit terminalen Oxidasen assoziiert sind: surf1c ist im cta-Operon lokalisiert, das für Untereinheiten der aa3-Cytochrom c Oxidase kodiert, und surf1q im qox-Operon, das die Gene für die ba3-Ubichinoloxidase enthält. Vorrangiges Ziel dieser Arbeit war es, diese beiden Gene und ihre Translationsprodukte zu charakterisieren und auf ihre Funktion hin zu untersuchen. Chromosomale Einzel- und Doppeldeletionen beider surf1-Gene führten zu einem spezifischen Aktivitätsverlust der jeweiligen Oxidase in Membranen, wobei surf1c und surf1q unabhängig von einander für ihre korrespondierenden Oxidasen zuständig sind und keine überlappenden Funktionen besitzen. Dies war der erste experimentelle Hinweis, dass ein Surf1-Protein auch bei der Assemblierung einer Chinoloxidase eine Rolle spielt. Untersuchungen an aufgereinigter aa3-Cytochrom c Oxidase ergaben, dass der Hämgehalt im Fall der surf1c-Deletion stark vermindert ist. Diese Ergebnisse bestätigten frühere Vermutungen, dass Surf1 eine Rolle beim Häm-Einbau in UEI spielt. Diese Arbeit untersuchte zum ersten Mal aufgereinigtes Surf1-Protein und lieferte mit der Charakterisierung weitere Hinweise auf seine Rolle beim Häm a-Einbau in terminale Oxidasen. So konnte gezeigt werden, dass sowohl Surf1c und als auch Surf1q Häm a in vivo binden. Mit Hilfe spektroskopischer Methoden und der isothermen Titrationskalorimetrie konnte die Bindung von Häm a an apo-Surf1c und Apo-Surf1q quantifiziert werden. Beide Proteine binden Häm a mit submikromolaren Affinitäten in einer 1:1 Stöchiometrie. Ligandenbindungspektren wiesen weiterhin darauf hin, dass das Eisenatom des Häm a in Surf1 nur über fünf Liganden koordiniert ist. Über gerichtete Mutagenese konnte der konservierte Histidinrest His193 für Surf1c und His202 für Surf1q als möglicher fünfter Ligand des Eisenatoms identifiziert werden. Untersuchungen zur Wechselwirkung mit anderen Proteinen zeigten eine direkte Interaktion zwischen der Häm a Synthase und den beiden Surf1-Proteinen in vivo und in vitro, die zuvor noch für kein anderes Surf1-Homolog beschrieben war. Zusätzlich konnte ein Transfer von Häm von der Häm a Synthase auf Surf1c bzw. Surf1q in vitro erreicht werden. Für Surf1c ließ sich außerdem eine Interaktion mit Untereinheit I der Cytochrom c Oxidase nachweisen. Obwohl die Funktion von Surf1 im Rahmen der Biogenese der Cytochrom c Oxidase noch nicht abschließend geklärt werden konnte, liefern die Ergebnisse dieser Arbeit nichtsdestotrotz klare Hinweise auf eine direkte Beteiligung von Surf1 beim Einbau der Häm a-Kofaktoren, und ein neues Modell für die Funktion von Surf1 konnte erstellt werden.
Helicobacter pylori (H. pylori) ist ein weit verbreitetes Humanpathogen, welches den menschlichen Magen besiedelt und zu schwerwiegenden entzündlichen Erkrankungen des gastralen Traktes führen kann. Bereits 1994 wurde das Bakterium als ein Klasse 1 Karzinogen deklariert, da H. pylori im erwiesenen Maße mit der Entstehung von hochinvasivem Magenkrebs in Verbindung gebracht wird. In vitro induziert H. pylori eine starke Migration der infizierten Epithelzellen, die unter anderem mit der Auflösung der Zellkontakte einhergeht. Die zugrunde liegenden molekularen Zusammenhänge konnten bisher noch nicht vollständig aufgeklärt werden. Die Mechanismen der Auflösung der Zelladhäsion wurden in der vorliegenden Arbeit untersucht, um einen tieferen Einblick in die H. pylori vermittelten Virulenz zu erhalten. So konnte eine H. pylori-induzierte Dissoziation des E-Cadherin Komplexes, bestehend aus p120, 􀄮- und 􀈕-Catenin beobachtet werden, der in einem Verlust der Zelladhäsion resultierte. Es konnte darüber hinaus eine Spaltung der extrazellulären Domäne von ECadherin detektiert werden, die wahrscheinlich zu einer Destabilisierung und somit zur Auflösung des gesamten E-Cadherin Komplexes führte. Durch den Zerfall der Adhärenzverbindungen wurden Catenine in den zytoplasmatischen Pool freigegeben, von denen p120 in den Zellkern translozierte und die Transaktivierung von Zielgenen auslöste, die in diesem Zusammenhang mit Hilfe von Reportergenanalysen quantifiziert wurden. Diese Prozesse zeigten sich von dem Pathogenitätsfaktor CagA (cytotoxin associated gene A) unabhängig, der über das bakterielle Typ IV Sekretionssystem in die Wirtszellen transloziert wird und krebsassoziierte Signaltransduktionswege aktivieren kann. In weiteren Untersuchungen wurden deshalb die Auswirkungen löslicher H. pylori Faktoren auf die Spaltung von E-Cadherin und folglich auf die Zellmotilität und Morphologie epithelialer Zellen analysiert. Aufgrund dieser Beobachtungen wurden in weiteren Experimenten proteolytische Aktivitäten von H. pylori untersucht. Dabei konnte erstmalig die hypothetische Protease HtrA (high temperature requirement protein A) von H. pylori durch massenspektrometrischen Analysen als eine caseinolytisch aktive Protease gefunden werden. Nach der Klonierung und Aufreinigung von HtrA konnte darüber hinaus auch E-Cadherin als spezifisches biologisches Substrat der Wirtszellen für HtrA identifiziert werden. Diese selektive Fragmentierung von E-Cadherin durch HtrA fügt sich als ein neues Element in das Modell der H. pylori Pathogenese, die einen initialen Schritt in der frühen Phase der Infektion darstellen könnte.
Antikarzinogene Effekte konnten mehrfach für sowohl klassische NSAIDs als auch für selektive COX-2-Inhibitoren belegt werden, wobei Celecoxib eine herausragende Stellung einnimmt und als einziges NSAID zur Behandlung der familiären adenomatösen Polyposis den Zulassungsstatus erreicht hat. Dimethylcelecoxib (DMC), ein Strukturanalogon des Celecoxibs, zeigte aufgrund einer strukturellen Molekülaufweitung in vitro in Konzentrationen kleiner 100 µM keine Hemmung der COX-2. Dennoch weist dieses Molekül ähnliche antikarzinogene Eigenschaften auf und wird daher häufig als Vergleichssubstanz zu Celecoxib verwendet, um COX-abhängige Mechanismen von COX-unabhängigen zu trennen. In der vorliegenden Arbeit konnte für DMC eindeutig gezeigt werden, dass es in vitro die PGE2-Synthese in den drei humanen Krebszellen HeLa, A-549 und HCA-7 im niedrigen mikromolaren Bereich hemmt. Da DMC weder die COX-Aktivität noch die Proteinexpression der COX-Isoenzyme in HeLa-Zellen beeinflusst, muss diese Substanz mit anderen Enzymen des PGE2-Syntheseweges interagieren. Die mPGES-1 zeigte wie die COX-2 eine gesteigerte Expression in einer Vielzahl von Tumorgeweben. Eine daraus resultierende gesteigerte PGE2-Produktion erwies sich durch die Wirkung auf spezifische Rezeptoren als prokarzinogen. DMC zeigte in einem zellfreien Assay eine Hemmung der mPGES-1-Aktivität bis zu einem maximalen Effekt von 65 % und einer daraus resultierenden IC50 von ca. 16 µM. Daneben konnte DMC in HeLa-Zellen auch die Protein- und mRNA-Expression der mPGES-1 in Konzentrationen größer 15 µM hemmen. Die Analyse der Gesamtprostanoide in Krebszellen nach DMC-Behandlung zeigte eine Hemmung der Synthese aller vorhandenen Prostanoide. Da extern zugesetzte Arachidonsäure diesen Effekt von DMC sowohl in HeLa- als auch in HCA-7-Zellen unterbinden konnte, war eine Hemmung der Arachidonsäurefreisetzung durch Beeinflussung der Phospholipasen A2 nahe liegend. Es konnte für DMC eine Hemmung der cPLA2a-Aktivität in einem in vitro Assay mit einer IC50 von 58 µM gezeigt werden. Die zur Steigerung der Aktivität notwendige Translokation der cPLA2a vom Cytosol zu intrazellulären Membranen sowie die Phosphorylierung am Serin505 blieben wie auch die Gesamtproteinexpression der cPLA2a von DMC unbeeinflusst. Somit konnte für DMC in vitro eine Hemmung von mPGES-1 und cPLA2a nachgewiesen werden. Jedoch wurden in vitro weitaus höhere Konzentrationen an DMC eingesetzt, um diese Enzyme zu hemmen, als für die Hemmung der PGE2-Produktion in intakten Zellen benötigt wurde. Für die bereits wiederholt gezeigte antiproliferative Wirkung von DMC in vitro konnte die PGE2-Unabhängigkeit bestätigt werden. Aufgrund der hier dargestellten Ergebnisse kann DMC jedoch nicht mehr als COX- und Prostaglandin-unabhängige Kontrollsubstanz im Vergleich zu anderen Coxiben eingesetzt werden. Für die mehrfach beschriebenen antiproliferativen Wirkungen von Celecoxib und DMC sowie die Hemmung der identifizierten Zielmoleküle wurden in vitro meist sehr hohe Konzentrationen benötigt. Die Relevanz dieser Ergebnisse wird daher stark diskutiert, da die in vivo erreichten Plasmakonzentrationen von Celecoxib nicht mit den hohen Konzentrationen in vitro korrelieren. Im zweiten Teil dieser Arbeit wurde zunächst gezeigt, dass DMC und Celecoxib eine intrazelluläre Anreicherung in verschiedenen humanen Krebszelllinien und in vaskulären Endothelzellen aufweisen. In den untersuchten Zellsystemen wurden im Vergleich zu den restlichen Coxiben für Celecoxib und DMC ca. 5 - 10-fach höhere intrazelluläre Konzentrationen erreicht, die linear von den eingesetzten Konzentrationen abhängig waren. DMC und Celecoxib zeigten dabei eine Akkumulation in zelluläre Membranstrukturen und hier insbesondere eine Interaktion mit den lipophilen Bestandteilen des Phospholipidbilayers, was mittels subzellulärer Fraktionierung und zweidimensionaler 1H MAS NOESEY NMR-Spektroskopie nachgewiesen werden konnte. Die intrazelluläre Anreicherung für DMC und Celecoxib ist vermutlich vom Zelltyp und der Lipidzusammensetzung der vorliegenden Membran abhängig, da dieser Effekt in Fibroblasten nicht bestätigt werden konnte. Des Weiteren konnte gezeigt werden, dass die Beeinflussung der Membranintegrität neben der Anreicherung in Phospholipidmembranen zu einer effizienteren COX-2-Hemmung durch Celecoxib im Vergleich zu Rofecoxib und Etoricoxib in HCA-7 Zellen führte. Im humanen COX-2-Vollblutassay wurden hingegen ähnliche Effektivitäten der Coxibe auf die COX-2 nachgewiesen. Eine Steigerung der Wirksamkeit von Celecoxib oder DMC auf Membran-gebundene oder Membran-assoziierte Enzyme, die eine Affinität gegenüber diesen Substanzen aufweisen, wäre somit denkbar und würde speziell in solchen Krebszellen eine Rolle spielen, wo durch eine erhöhte Aktivität dieser Enzyme eine verstärkte Proliferation und Überlebensrate nachgewiesen werden konnte. Pharmakokinetische Studien zeigten für Celecoxib im Vergleich zu anderen Coxiben ein vielfach höheres Verteilungsvolumen. Somit besteht die Möglichkeit, dass sich Celecoxib in solche tieferen Kompartimente einlagert, die vermehrt durch hydrophobe Membranstrukturen gekennzeichnet sind. Aufgrund der hier beschriebenen Ergebnisse ist anzunehmen, dass in intakten Zellen die Wirkung von Celecoxib und DMC auf Zielmoleküle mit einer gewissen Affinität zu diesen Substanzen stärker ist als in vitro und so die Diskrepanz zwischen den Wirkkonzentrationen in vitro und in vivo erklärt werden kann.
In der Neurochirurgie sind temporäre externe Ableitungen von Liquor cerebrospinalis häufige Eingriffe zur Behandlung von Liquorabflußstörungen. Besonders bei externen Ableitungen besteht eine unmittelbare Kommunikation zwischen Liquorraum und Hautoberfläche. Infektionen durch den Katheterweg sind häufige Komplikationen. Ziel der vorliegenden Arbeit war es, die Wirksamkeit silberhaltiger EVD Katheter in vivo zu objektivieren. Dazu wurde die Infektionshäufigkeit konventioneller unbeschichteter EVD Katheter mit dem seit 2004 eingeführten antimikrobiellen silberhaltigen EVD Katheter verglichen. Mit einer statistischen Erfassung der Infektionsparameter aller Patienten die im Studienzeitraum eine externe Ventrikel-Drainage erhielten, wurde überprüft ob eine signifikante bzw. klinisch relevante Senkung der Infektionshäufigkeit vorlag. Hierzu wurden 231 Patienten in der Klinik für Neurochirurgie der Johann Wolfgang Goethe-Universitätsklinik retrospektiv untersucht. Von 231 Patienten wurden nach Anwendung der Ausschlußkriterien 164 in die statistische Analyse aufgenommen. In der Studiengruppe mit silberhaltigen EVD Kathetern befanden sich 74 Patienten, 90 in der Kontrollgruppe. In beiden Patientenkollektiven bestanden keine statistisch relevanten Unterschiede bezüglich der klinischen Charakteristika. Besonders die Verteilung von Antibiotika und Glukokortikoiden war annähernd gleich in beiden Gruppen. In unserer Studie ist der Einsatz silberhaltiger EVD Katheter zur Behandlung chronischer oder akuter Liquorabflußstörungen hinsichtlich des primären Endpunktes positive Liquorkulturen, Katheterkolonisierungen oder erhöhten Zellzahlen im Liquor, mit einer statistisch signifikanten Abnahme der Häufigkeit von positiven Infektionsparametern gegenüber herkömmlichen EVD Kathetern assoziiert (18,9 verglichen mit 33,7%; p=0,04 Chi-Quadrat-Test). Da externe Ventrikeldrainagen die Eintrittspforte für fakultativ pathogene Keime sein können, ist die Anwendung silberhaltiger EVD Katheter im Sinne einer lokalen Infektionsbarriere sinnvoll. Das Risiko katheterassoziierter Infektionen bei neurochirurgischen Patienten kann so gesenkt werden.