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1. Zielsetzung Die menschliche Leber erfüllt im Körper eine Vielzahl von Funktionen. Diese reichen von der Produktion von Blutgerinnugsfaktoren über die Speicherung von Glykogen bis zum Metabolismus von Fremstoffen. Pro Jahr ereignen sich jedoch mehrere tausend Fälle eines akuten oder chronischen Leberversagens, die häufig nicht anders als durch eine Lebertransplantation beherrschbar sind und häufig im „Tod auf der Warteliste“ enden. Eine adjuvante Maßnahme zur Lebertranplantation stellt die Überbrückung der Wartezeit mit Bioreaktoren oder Hepatozytentransplantationen dar, beide jedoch benötigen große Menge an differenzierten Hepatozyten. Hepatozyten dedifferenzieren jedoch schnell in Zellkulturen, so daß zuverlässige Marker zur Bestimmung des Differenzierungsgrades vonnöten sind. 2. Material und Methode Hepatozyten, die aus menschlichen Gewebeproben isoliert worden waren, wurden verschiedenen Komponenten der extrazellulären Matrix ausgesetzt, um zu überprüfen, ob sich ein spezifischer Einfluß einer oder mehrerer Komponenten belegen ließe. Als Marker dienten die zytoskelettalen Marker der Zytokeratine sowie die Oberflächenmarker der Integrine, MHC-I und II sowie ICAM-I, da von diesen Markern Veränderungen im Rahmen entzündlicher, neoplastischer und metabolischer Erkrankungen bekannt sind und weiterhin ein unterschiedliches Expressionsverhalten in embryonalen und adulten Geweben bekannt ist. Integrine, MHC-I und II sowie ICAM-I wurden stimuliert, um die Reaktionsfähigkeit im Laufe der Zellkultur zu erfassen. Untersucht wurden diese Marker mittels Durchflußzytometrie, Western Blot und konfokaler Laserscanmikroskopie. 3. Ergebnisse In allen Zellkulturen kam es zu Dedifferenzierungserscheinungen mit dem Auftreten unphysiologischer Zytokeratine und unphysiologischer Integrine. Hierbei war das Ausmaß der Dedifferenzierungserscheinungen eher von der Struktur der extrazellulären Matrix als ihrer Zusammensetzung abhängig, so daß unter dreidimensionalen Kulturbedingungen eine bessere Differenzierung als unter zweidimensionalen Bedingungen erzielt wurde. 4. Schlußfolgerung Humane Hepatozyten dedifferenzieren in Zellkulturen nach Aussaat in verschiedene extra zelluläre Matrices. Dabei ist das Ausmaß an Dedifferenzierung weniger abhängig von der Zusammensetzung der Matrix als mehr von der zwei- respektive Dreidimensionalität. Integrine stellen einen interessanten frühen Marker zur Beurteilung der Differenzierung dar und sollten in ergänzenden Experimenten, z. B. Kokultivierung mit nichtparenchymalen Zellen, weiter evaluirt werden.
Bisherige Untersuchungen der Uroplakine und deren mRNA sprechen für ein exklusives Vorkommen der Uroplakin-Proteine und deren Genexpression in Urothel, Urothelkarzinomen und Brenner Tumoren. Unter Verwendung einer hochsensitiven und hochspezifischen Uroplakin RT-PCR konnte in der vorliegenden Arbeit erstmals gezeigt werden, daß die vier verschiedenen Uroplakin mRNAs nicht nur in Urothel und Urothelkarzinomen, sondern auch von zahlreichen anderen Geweben exprimiert werden. Die Expressionsstärke der Uroplakin mRNAs und das Muster der Genexpressionen ist dabei erheblichen Schwankungen unterworfen. Lediglich Urothel, Urothelkarzinome, Hodenteratome und Plazenta erreichen Sättigung der Uroplakin PCR bei drei und mehr Uroplakinen. Die Mehrzahl der untersuchten Urothelkarzinome (total: 78 % ; invasive 69 %; nichtinvasive 100 %) und alle drei untersuchten Hodenteratome (100 %) weisen eine starke Uroplakin-Genexpression für drei und mehr Uroplakine auf Für Nierenrinde, kultivierte Tubulusepithelien und Nierenzellkarzinome konnte erstmals die starke Expression von Uroplakin IB demonstriert werden. Diese bleibt in 12/13 (92 %) der Nierenzellkarzinome erhalten. Eine Expression von Uroplakin IB konnte auch für das humane Chorion und 2 Endometriumkarzinome nachgewiesen werden. Aktuell wird an der Johann Wolfgang Goethe-Universität im Urologischen Labor untersucht, ob Uroplakine auch bei anderen Erkrankungen oder in der Schwangerschaft im peripheren Blut nachweisbar sind. Auch eine Anwendung der Uroplakin RT-PCR bei Patienten mit Blasenkarzinom wird erprobt. Dabei wird der Versuch unternommen, die relative Unspezifität der Uroplakine durch den parallelen Nachweis aller vier Uroplakine, eine starke Vorselektion des Probanden-Kollektivs und die Beobachtungen der Genexpressionen im zeitlichen Verlauf zu überwinden. Zur Aufklärung der biologischen Funktion der Uroplakine werden noch zahlreiche Studien erforderlich sein. Dabei sind vor allem die Signaltransduktion am Urothel, die Vermittlung der Apoptose urothelialer Zellen und die Induzierbarkeit der Uroplakin-Synthese von zentralem Interesse.
Verfahren zur elektrochemischen Messung von Stickstoffmonoxid und S-Nitrosothiolen in Flüssigkeiten
(2001)
Stickstoffmonoxid (NO) ist in den letzten Jahren als Kreislaufregulator und biologischer Botenstoff in den Mittelpunkt des Interesses gerückt. Inzwischen gilt als sicher, dass NO an vielen Schlüsselstellen, nicht nur in der Kreislaufregulation, aber dort besonders, eine prominente Rolle spielt. Das Endothel als disseminiertes Organ betrachtet ist als Produktionsort des zu Beginn der Forschungen phänomenologisch ,,endothelium derived relaxing factor" genannten NO scheinbar von größerer Bedeutung, als zunächst angenommen. Anstelle einer einfachen Gefäßauskleidung ist das Endothel Regulator vieler wichtiger Prozesse. Diskutierte Wirkungen reichen vom septischen Kreislaufversagen bei überschießender NO-Produktion, bis zur Atherosklerose bei gestörter Endothelfunktion mit verminderter NO-Produktion. Es gibt hier ,,gute" und ,,böse" Wirkungen, so das hier von einer Janusköpfigkeit, also Doppelgesichtigkeit, gesprochen wird. NO wird hier jeweils eine Schlüsselrolle als Botenstoff und Effektor zugewiesen. Bisher gibt es aber keine praktikablen Verfahren, um die effektive NO-Produktion zeitnah und in vivo zu quantifizieren. In der vorliegenden Arbeit ist im Anschluß an vorbestehenden Überlegungen und Verfahren eine Methode entwickelt worden, mit deren Hilfe Rückschlüsse auf die jeweilige Produktion und den Plasmaspiegel von NO gezogen werden können. Stickstoffmonoxid hat eine Halbwertszeit von wenigen Sekunden im Plasma. Ein wichtiges Stoffwechselprodukt aus dem Abbau des freien NO sind S-Nitrosothiole. Freies NO geht eine Verbindung mit Thiolgruppen von Plasmaproteinen ein. Diese gebundene Form von NO ist relativ stabil und gilt als Plasmaspeicher von NO. Es kann aus dieser Verbindung wieder herausgelöst werden und liegt dann wieder als freies NO vor. In der vorliegenden Arbeit werden die Grundlagen geschaffen für ein Verfahren, mit dem der Plasmaspiegel von S-Nitrosothiolen bestimmt, und Rückschlüsse auf die NO Produktion gezogen werden können. Die Methode basiert auf dem Umstand, dass man mittels Metallionen, wie beispielsweise Kupferionen, S-Nitrosothiole zur Dekomposition bringen kann. Das freigesetzte NO wurde dann mittels einer amperometrischen NO-selektiven Sonde gemessen. Die zu erwartenden Konzentrationen sind sehr gering und einer verlässlichen Messung nur bedingt zugänglich, da die Abspaltung von NO aus hochmolekularen S-Nitrosothiolen, wie dem S-Nitrosoalbumim, nur sehr langsam abläuft. Günstiger ist die Zerfallskinetik von niedermolekularen S-Nitrosoverbindungen. Daher wird der Zwischenschritt der Transnitrosylierung, der Übertragung der Nitrosylgruppe von Albumin auf einen niedermolekularen Baustein mit einer Nitrosogruppe, eingeschaltet. Die Konzentrationen des zu messenden NO bleiben aber sehr gering, so dass die Minimierung der Störeinflüsse der Methodik einen großen Teil der Arbeit einnimmt. Es konnte in dieser Arbeit nachgewiesen werden, dass S-Nitrosoalbumin mittels des beschriebenen Verfahrens quantitativ bestimmbar ist. Eine Übertragung des Verfahrens auf Messungen im Blutplasma wird der Gegenstand weiterer Forschungen sein.
Oft wurden Aeromonas aus Trinkwassersystemen isoliert und ihre Eigenschaften beschrieben. Mit Hilfe der vorliegenden Arbeit wurden ihre Existenz und ihre Artendiversität in den Biofilmen von Trinkwasserverteilungssystemen in Nordrhein-Westfalen (Deutschland) näher beleuchtet. Hierzu wurden vermehrungsfähige Aeromonas-Arten aus Rohrinkrustationen und Belägen der Rohrinnenoberflächen von Grauguss- und PVC-Trinkwasserrohren isoliert und auf ihre phänotypischen Eigenschaften untersucht. Anhand zahlreicher biochemischer Tests wurden die isolierten Aeromonas-Arten in Unterarten und Biovare unterteilt und mittels Hierarchischer Clusteranalyse weiter klassifiziert. Insgesamt wurden aus fünf der 7 Proben Aeromonas isoliert. Für die Besiedlungsdichte wurden Werte zwischen 24 und 746 KBE/cm2 ermittelt. Eine Abhängigkeit zwischen dem Rohrmaterial (PVC, Grauguss) bzw. dem pH-Wert und der Kolonieanzahl von isolierten Aeromonas konnte nicht festgestellt werden. Während der warmen Jahreszeit wurde in den Belägen eine höhere Koloniezahl von Aeromonas ermittelt. 502 Aeromonas-Kolonien wurden weiter untersucht. Bei 94% der nachgewiesenen Aeromonas-Keime handelte es sich um Aeromonas hydrophila. Außerdem wurden Aeromonas caviae (5%) und Aeromonas sobria (1%) in den Belagssuspensionen identifiziert. Aeromonas caviae nahm in einem System sogar die dominante Rolle ein. Je Probe wurden 120 Aeromonas-Kolonien weiter klassifiziert. Dabei wurden teilweise 35 bzw. 64 Biovare mit unterschiedlichen biochemischen Eigenschaften identifiziert. Bei einigen Proben war die Unterteilung von Aeromonas-lsolaten in weitere Biovare kaum ausgeprägt. Die niedrige Besiedlungsrate und die hohe Anzahl von Biovaren schließen eine Massenvermehrung einzelner Aeromonas innerhalb des Biofilms aus. Vielmehr hat Aeromonas hier nur einen Überlebensraum gefunden. Die hohe Anzahl der Biovare ist auf eine zeitlich versetzte Besiedlung von Aeromonas in den Belagsinkrustationen zurückzuführen.
In zahlreichen Studien konnte ein tumorwachstumshemmender Effekt der überwiegend in Fischöl vorkommenden Omega-3-Fettsäuren, insbesondere der Eikosapentaensäure (EPA), belegt werden. In den bisher vorliegenden Studien wurde überwiegend der Effekt freier Fettsäuren auf das Wachstum von Tumorzellen untersucht. Ziel dieser Studie war es deshalb, den Effekt einer Fettemulsion mit komplexer Triglyzeridstruktur, die als solche auch am Patienten im Rahmen einer parenteralen Ernährung Anwendung findet, auf das Wachstum der Pankreaskarzinomzelllinie Mia-Paca-2 und der Kolonkarzinomzelllinie Caco-2 zu untersuchen, und die zugrundeliegenden Mechanismen für die erhobenen Effekte zu evaluieren. • Die in der vorliegenden Studie eingesetzte Fischölemulsion hemmte die Proliferation sowohl der Pankreaskarzinomzelllinie Mia-Paca-2 als auch der Kolonkarzinomzelllinie Caco-2 dosis- und zeitabhängig. Dieser Effekt war auf eine Zunahme der Apoptoseinduktion und eine Blockierung der Zellen in der S- und G2/M-Phase des Zellzyklus zurückzuführen. Tumorzellen sind in der Lage, durch Expression von Wachstumsfaktoren ihr Zellwachstum selbständig zu stimulieren. Eine bedeutende Rolle scheint in diesem Zusammenhang der epidermale Wachstumsfaktor (EGF) zu spielen. Bei zahlreichen Tumoren kann eine Überexpression des membranständigen EGF-Rezeptors nachgewiesen werden. Es gibt Hinweise, dass die Modifikation der Lipidkomposition zellulärer Membranen durch ein verändertes Angebot an mehrfach ungesättigten Fettsäuren mit einer Änderung der Aktivität von Membranrezeptoren einhergeht. In weiterführenden Experimenten wurde deshalb der Einfluß von EGF auf das Wachstum der mit der Omega-3-fettsäurereichen Fischölemulsion vorbehandelten Pankreaskarzinomzelllinie Mia-Paca-2 untersucht. • Eine Präinkubation der Mia-Paca-2 Zellen mit der Omega-3-fettsäurereichen Fischölemulsion führte zu einer Umkehrung des wachstumsfördernden Effektes von EGF. Eine entscheidende Determinante in der Entwicklung und dem Wachstum von Tumoren ist deren Sensitivität gegenüber chemotherapeutischer Behandlung. Das Auftreten von chemotherapieresistenten Tumorzellen ist häufig limitierender Faktor für eine erfolgreiche zytostatische Therapie. In einem weiteren Versuchsansatz sollte deshalb der Fragestellung nachgegangen werden, ob eine Verbesserung der Wirksamkeit gängiger Chemotherapeutika in der Antitumortherapie von Pankreas- und Kolonkarzinomen nach kombinierter Behandlung mit der Fischölmulsion zu erwarten ist. • Der Einsatz der Fischölemulsion in Kombination mit Gemcitabin und 5-FU bei Mia-Paca-2 Zellen bzw. Caco-2 Zellen führte zu einem additiven wachstumshemmenden Effekt. Die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit belegen, dass Omega-3-fettsäurereiche Lipidemulsionen eine sinnvolle adjuvante therapeutische Maßnahme in der Behandlung des Pankreas- und Kolonkarzinoms darstellen können.