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Modern experiments in heavy ion collisions operate with huge data rates that can not be fully stored on the currently available storage devices. Therefore the data flow should be reduced by selecting those collisions that potentially carry the information of the physics interest. The future CBM experiment will have no simple criteria for selecting such collisions and requires the full online reconstruction of the collision topology including reconstruction of short-lived particles.
In this work the KF Particle Finder package for online reconstruction and selection of short-lived particles is proposed and developed. It reconstructs more than 70 decays, covering signals from all the physics cases of the CBM experiment: strange particles, strange resonances, hypernuclei, low mass vector mesons, charmonium, and open-charm particles.
The package is based on the Kalman filter method providing a full set of the particle parameters together with their errors including position, momentum, mass, energy, lifetime, etc. It shows a high quality of the reconstructed particles, high efficiencies, and high signal to background ratios.
The KF Particle Finder is extremely fast for achieving the reconstruction speed of 1.5 ms per minimum-bias AuAu collision at 25 AGeV beam energy on single CPU core. It is fully vectorized and parallelized and shows a strong linear scalability on the many-core architectures of up to 80 cores. It also scales within the First Level Event Selection package on the many-core clusters up to 3200 cores.
The developed KF Particle Finder package is a universal platform for short- lived particle reconstruction, physics analysis and online selection.
Conceptual design of an ALICE Tier-2 centre integrated into a multi-purpose computing facility
(2012)
This thesis discusses the issues and challenges associated with the design and operation of a data analysis facility for a high-energy physics experiment at a multi-purpose computing centre. At the spotlight is a Tier-2 centre of the distributed computing model of the ALICE experiment at the Large Hadron Collider at CERN in Geneva, Switzerland. The design steps, examined in the thesis, include analysis and optimization of the I/O access patterns of the user workload, integration of the storage resources, and development of the techniques for effective system administration and operation of the facility in a shared computing environment. A number of I/O access performance issues on multiple levels of the I/O subsystem, introduced by utilization of hard disks for data storage, have been addressed by the means of exhaustive benchmarking and thorough analysis of the I/O of the user applications in the ALICE software framework. Defining the set of requirements to the storage system, describing the potential performance bottlenecks and single points of failure and examining possible ways to avoid them allows one to develop guidelines for selecting the way how to integrate the storage resources. The solution, how to preserve a specific software stack for the experiment in a shared environment, is presented along with its effects on the user workload performance. The proposal for a flexible model to deploy and operate the ALICE Tier-2 infrastructure and applications in a virtual environment through adoption of the cloud computing technology and the 'Infrastructure as Code' concept completes the thesis. Scientific software applications can be efficiently computed in a virtual environment, and there is an urgent need to adapt the infrastructure for effective usage of cloud resources.
Eine Autoimmunreaktion impliziert Verlust der Autotoleranz und ermöglicht Immunreaktionen gegen körpereigene Antigene. Bei autoimmuner Erkrankung der Schilddrüse Typ M. Basedow führt die Aktivierung von T-Lymphozyten zur vorübergehenden und sequentiellen Expression von spezifischen Molekülen auf der Zelloberfläche, z.B. CD25 oder HLA-DR. Dass die CD4+CD25+-, CD8+CD25+-Zellen sowie HLA-DR-positive T-Zellen eine wesentliche Rolle in der Autoimmunität der Schilddrüse haben, ist erwiesen. Dennoch sind die genauen pathophysiologischen Mechanismen ungeklärt. Zusätzlich haben mehrere Studien eine Erhöhung der B-Zellen, insbesondere die Erhöhung der Anzahl von CD19+CD25+-Zellen bei Ophtalmopathie, sowie eine Erhöhung der zytotoxischen Aktivität der NK-Zellen beschrieben. Ziel der vorliegenden Arbeit war es, mit Hilfe der Durchflusszytometrie die Veränderungen in der Expression von Aktivierungsmarkern CD25, HLA-DR und CD94 auf peripheren und intrathyreoidalen Lymphozytensubpopulationen bei M. Basedow und Struma zu bestimmen. Im ersten Teil der Arbeit wurden periphere Lymphozytensubpopulationen von M. Basedow, Struma, und Kontrollgruppe untereinander verglichen. Die Analyse von peripheren T-Helferzellen CD3+CD4+CD25- zeigte sowohl bei M. Basedow- als auch bei Struma-Patienten eine signifikant niedrigere Anzahl im Vergleich zur Kontrolle, während die peripheren CD3+CD4+CD25+-Zellen signifikant höhere Werte gegenüber der Kontrollgruppe aufwiesen. Im Rahmen der Untersuchung traten die peripheren aktivierten B-Zellen (CD45+CD19+CD25+) sowie peripheren NK-Zellen (CD45+CD56+CD94-, CD45+CD56+CD94+, CD45+CD8-CD56+, CD45+CD3-CD56+ und NK-T-Zellen (CD45+CD8+CD56+, CD45+CD3+CD56+) bei Struma in eine signifikant erhöhten Anzahl im Vergleich zur Kontrolle auf. Die nicht aktivierten B-Zellen (CD45+CD19+CD25-) zeigten bei Patienten mit M. Basedow eine signifikante Erhöhung der Anzahl verglichen mit der Strumagruppe. Diese Ergebnisse zeigen deutliche Unterschiede in den Aktivierungsmustern von M. Basedow und Struma gegenüber der Kontrolle. Somit kann man bei beiden Erkrankungen über eine immunologische Reaktion in der Peripherie sprechen, die sich deutlich von der bei gesunden unterscheidet. Dennoch war in der Peripherie bei M. Basedow-Patienten die Aktivierung von B-Zellen, wahrscheinlich autoimmun bedingt, beeinträchtigt. Im zweiten Teil der Arbeit wurden intrathyreoidale Lymphozytensubpopulationen von M. Basedow- und Struma-Patienten untereinander verglichen. Die Anzahl der intrathyreoidalen CD3+CD4+CD25--Zellen von M. Basedow war signifikant höher im Vergleich zu Struma, andererseits waren die Werte der CD45+CD19+CD25+-Zellen signifikant niedriger. Zusätzlich wurde bei M. Basedow-Patienten eine Analyse der Verhältnisse zwischen aktivierten und nicht aktivierten intrathyreoidalen Lymphozytensubpopulationen durchgeführt. Der Anteil nicht aktivierter T-Helferzellen (CD4+CD25-), zytotoxischer Zellen (CD8+CD25-) und B-Zellen (CD19+CD25-) war höher als der Anteil aktivierter T-Helferzellen (CD4+CD25+), zytotoxischen Zellen (CD8+CD25+) und B-Zellen (CD19+CD25+). Die hier vorgestellten Ergebnisse legen nahe, dass die Fähigkeit der CD4+CD25+-Zellen, die Proliferation von CD4+CD25--Zellen zu unterdrücken, bei M. Basedow-Patienten beeinträchtig ist. Dies führt bei diesen Patienten zu einer Zunahme der CD4+CD25--Subpopulation. Die Änderung der Verhältnisse von intrathyreoidalen aktivierten zu nicht aktivierten T-Helferzellen scheint hierbei mit der Entwicklung von M. Basedow assoziiert zu sein. Im dritten Teil der Arbeit wurden periphere und intrathyreoidale Lymphozyten von M. Basedow gegenübergestellt. Die Anzahl von intrathyreoidalen aktivierten zytotoxischen Zellen von M. Basedow mit dem Phänotyp CD3+CD8+CD25+ war erhöht im Vergleich zur Peripherie. Derselbe Vergleich wurde auch bei Struma durchgeführt. Dabei zeigten die intrathyreoidalen CD3+CD4+HLA-DR+- CD3+CD4+CD25+- CD3+CD8+CD25+- und CD3+CD8+HLA-DR+-Zellen sowie CD45+CD56+CD94--NK-Zellen höhere Werte als Periphere. Somit konnten wir zeigen, dass bei M. Basedow die Aktivierung von CD3+CD4+HLA-DR+- CD3+CD4+CD25+- und CD3+CD8+HLA-DR+-Zellen in der Schilddrüse unterdrückt ist. Dies könnte als Unterscheidungsmerkmal zwischen M. Basedow und Struma wichtig sein. Im vierten Teil der Arbeit wurden die peripheren und intrathyreoidalen Lymphozyten nach der Kultivierung mit Thyreozyten verglichen. Die Kultivierung von peripheren CD3+CD4+HLA-DR--Zellen mit Thyreozyten von Patienten mit M. Basedow bzw. Struma zeigte eine Vermehrung dieser Zellen im Vergleich zur Kultivierung ohne Thyreozyten. Die Struma-Patienten zeigten jedoch bei Kultivierung mit Thyreozyten höhere Anzahlen von intrathyreoidalen aktivierten T-Helferzellen (CD3+CD4+HLA-DR+) und zytotoxischen Zellen (CD3+CD8+HLA-DR+), als kultiviert ohne Thyreozyten. Aufgrund der Ergebnisse in diesem Teil der Arbeit kann angenommen werden, dass ein hemmender Einfluss von Thyreozyten auf intrathyreoidalen CD3+CD4+HLA-DR+- und CD3+CD8+HLA-DR+ -Zellen bei M. Basedow vorhanden ist.
Zur adäquaten Bestrahlung maligner Tumoren ist eine gute Reproduzierbarkeit der angestrebten Bestrahlungsposition bei jeder Therapiefraktion von entscheidender Bedeutung. Bei der freien Lagerung von Patienten muß die Bestrahlungsposition anhand von Hautmarkierungen sicher nachvollziehbar sein. Häufiges Nachzeichnen schränkt die Identifizierbarkeit dieser Einstellhilfen durch ein zunehmendes Maß an Ungenauigkeit ein. Im ersten Teil der Studie wurden drei verschiedene Markierungsverfahren in bezug auf ihre Eignung in der Bestrahlungsroutine verglichen. Es handelte sich um zwei Verfahren zur Konservierung der Haumarkierungen mit Hilfe von Wundverbänden und um die Hautmarkierung mit einem speziellen Hautmarkierungsstift. Zur Bewertung dienten die Kriterien Haltbarkeitsdauer und Identifizierbarkeit, sowie Hautverträglichkeit. Es zeigte sich, daß ausschließlich der Viomedex ® Hautmarkierungsstift für den Einsatz bei der Bestrahlung geeignet war. Im zweiten Teil der Studie wurde prospektiv untersucht, ob verglichen mit der bisher geübten Praxis mit Viomedex ® eine Verlängerung der Haltbarkeit der Hautmarkierungen und eine Verbesserung der Reproduzierbarkeit der Patientenlagerung erreicht werden kann. Haltbarkeit und Reproduzierbarkeit wurden in Abhängigkeit von den Hautmerkmalen Nachtschweiß, Schweißneigung, Behaarungsgrad und Hauttyp sowie dem Zeitpunkt der Einzeichnung ermittelt. Die durchschnittliche Haltbarkeit, betrug 11,02 Tage. Sie stand in keinem signifikanten Zusammenhang zu bestimmten Hautparametern. Einzeichnungen, die zu einem späteren Zeitpunkt im Verlauf der Strahlenbehandlung erfolgten, wiesen eine etwas längere Haltbarkeit auf, der Unterschied war statistisch nicht signifikant. Durch Identifizierung anatomischer Bildpunkte wurden die Verifikationsaufnahmen mit der jeweiligen Simulationsaufnahme verglichen und die mittlere Gesamtabweichung aller untersuchten Einstellungen als Maß für die Reproduzierbarkeit der Bestrahlung berechnet. Ein signifikanter Zusammenhang mit dem Zeitpunkt der Einzeichnung oder mit bestimmten Hautparametern trat nicht auf. Gegenüber früheren Untersuchungen unseres Institutes ergab sich eine stark verbesserte Reproduzierbarkeit. So verringerte sich der Wert der Gesamtabweichung bei der Bestrahlung der weiblichen Brust von 0,605 cm auf 0,490 cm. Bei Betrachtung der übrigen Patienten, die ohne Fixationshilfen bestrahlt wurden, konnte die Gesamtabweichung von 1,082 cm auf 0,655 cm gesenkt werden. Auch der Prozentsatz sehr großer Einstellfehler (>1 cm) ist im internen Vergleich bei der Bestrahlung aller Körperregionen von 47,7 % auf 20,4 % zurückgegangen. Es wurde gezeigt, daß durch langhaftende, sorgfältig eingezeichnete Hautmarkierungen, die Reproduzierbarkeit der Einstellungen bei frei gelagerten Patienten verbessert werden kann. Eine ProblemPatientengruppe, die aufgrund ihrer Hauteigenschaften einer gesonderten Markierungsmethode bedarf, wurde nicht ermittelt. Es konnten feste Regeln zum Anbringen und Überwachen der Hautmarkierungen formuliert werden, die in die Bestrahlungsroutine der Klinik für Strahlentherapie der J. W. GoetheUniversität aufgenommen wurden.
Orthopockenviren sind große DNA-Viren, die im Zytoplasma der Wirtszelle replizieren und für über 200 Proteine kodieren. Sie besitzen ein breites Wirtszellspektrum (host-range) und modulieren auf komplexe Art und Weise zelluläre Prozesse, um ihre Replikation zu gewährleisten. Zu diesem Genus der Familie der Pockenviren gehört auch das modifizierte Vacciniavirus Ankara (MVA). MVA ist ein hoch attenuiertes, replikationsdefizientes Impfvirus, dem im Vergleich zu ursprünglichen Vacciniavirus-Stämmen viele virale Genfunktionen fehlen. Zu diesen verlorengegangenen Genen zählen so genannte host-range-Gene, die für das breite Wirtszellspektrum des Vacciniavirus (VACV) verantwortlich sind, deren molekulare Funktion aber größtenteils unbekannt ist. Diese Arbeit befasste sich zum einen mit der Untersuchung der Rolle der host-range-Gene K1L und C7L in der MVA-Infektion. Zum anderen sollte geprüft werden, ob der im MVA-Genom unvollständige Leserahmen F11L durch Wiederherstellung seiner Funktionalität den Wirtstropismus von MVA erweitern kann. Das Fehlen von K1L und C7L in MVA ist mit dem Verlust der späten viralen Genexpression verbunden. Als mögliche Ursache hierfür wurde in dieser Arbeit die Phosphorylierung des eukaryotischen Translationsinitiationsfaktors 2alpha (eIF2alpha) entdeckt, welche zum Abbruch der Proteinsynthese in der infizierten Zelle führt. Unter den möglichen Kinasen wurde die Proteinkinase R (PKR) als das verantwortliche Schlüsselenzym identifiziert und somit gezeigt, dass das K1- und C7-Protein den anti-viralen PKR-eIF2alpha-Signalweg inhibieren. Es stellte sich heraus, dass die eIF2alpha-Phosphorylierung alleine jedoch nicht für das Fehlen der späten Genexpression verantwortlich ist. Neben dem inhibitorischen Einfluss auf den PKR-eIF2alpha-Signalweg zeigte sich, dass C7 die Aktivierung des NFKB-Signalwegs reduziert, welcher für eine anti-virale Antwort der Wirtszelle wichtig ist. Ein weiterer Ansatz zur Aufklärung der K1- und C7-Funktion bestand darin, zelluläre Interaktionspartner zu identifizieren. Hierbei konnte das heterogene nukleäre Ribonukleoprotein K (HNRPK) als möglicher Interaktionspartner von C7 entdeckt werden. Neben den bisher bekannten host-range-Genen gibt es vermutlich weitere Gene, die den Wirtsbereich des VACV definieren. Das im MVA-Genom defekte F11L-Gen war ein guter Kandidat für eine solche Genfunktion, da es bei der Virionenmorphogenese, Virusausbreitung und der Migration VACV-infizierter Zellen eine Rolle zu spielen scheint. Deshalb wurde ein rekombinantes MVA mit vollständiger F11L-Gensequenz konstruiert und das Wirtszellspektrum dieses Virus untersucht. Die Reparatur des F11L-Gens ermöglichte MVA die Induktion von Zellbewegung nach Infektion, jedoch blieben seine unvollständige Morphogenese und eingeschränkte Vermehrungsfähigkeit in Säugetierzellen unbeeinflusst. F11L hat daher zumindest keine selbstständige Funktion als VACV host-range-Gen. Die Ergebnisse dieser Arbeit sind ein Beitrag zum besseren Verständnis der komplexen Virus-Wirts-Interaktionen des VACV sowie des eingeschränkten Wirtstropismus des Impfvirus MVA.
In Deutschland erhalten jährlich etwa 12.500 Patienten die Diagnose Leukämie. Unter ihnen befinden sich ca. 6 % Kinder, welche mit 33,8 % den größten Anteil der kindlichen Krebsneuerkrankungen repräsentieren. Die überwiegende Form im Kindesalter ist die akute lymphatische Leukämie (ALL), deren genetische Ursache meistens in einem hyperdiploiden Karyotyp oder einer chromosomalen Translokation zu finden ist. Bei 8 % der pädiatrischen ALLs ist ein Rearrangement des MLL-Gens involviert. Unter Beteiligung des häufigsten Translokationspartnergens (TPG) AF4 entsteht die t(4;11)(q21;q23)-Translokation mit den beiden Fusionsproteinen AF4•MLL sowie MLL•AF4. Die Therapie erfolgt in der Regel gemäß Hochrisikoprotokollen aufgrund der extrem schlechten Prognose und der mit hoher Therapieresistenz assoziierten Rezidivrate. Eine Studie zur Korrelation zwischen klinischen Merkmalen und molekularen Charakteristika belegte die Abhängigkeit des Outcomes von der Verteilung des Bruchpunkts im MLL-Gen. Bei älteren Patienten treten die Bruchpunkte überwiegend in MLL Intron 9 oder 10 auf und bedeuten eine signifikant bessere Prognose im Vergleich zu den besonders bei Säuglingen präsenten Bruchpunkten im MLL Intron 11. Die damit verbundene Verkürzung der Plant Homeodomain (PHD) 1 kann neben einer modifizierten Funktion des PHD1 auch in einer veränderten Konformation der gesamten PHD-Domäne resultieren. Besondere Bedeutung hat die PHD1-3-Domäne wegen der Fähigkeit des PHD3 einerseits H3K4me-Signaturen zu erkennen und auf der anderen Seite mit CYP33 zu interagieren. Die mit transkriptionell aktivem Chromatin assoziierten H3K4me-Signaturen sowie die CYP33-vermittelte repressive Aktivität bedingen einen ambivalenten Charakter des MLL-Proteins. Daneben ist der PHD3 allein interessant wegen des Vorkommens von 4 differenten Varianten mit keinen, 3, 11 oder 14 fehlenden Aminosäuren, welche durch alternatives Spleißen an der MLL Exon 15/16-Verknüpfung entstehen (PHD3-0, PHD3-3, PHD3 11 und PHD3-14). Semiquantitative Bestimmungen in verschiedenen Zelllinien verdeutlichen die nahezu ähnliche Transkription aller 4 Varianten. Weiterführende Untersuchungen mit dem Yeast Two-Hybrid (Y2H)-System sowie folgende Koimmunpräzipitations (CoIP)-Experimente zeigten, dass der PHD3-0 die beste Dimerisierungsfähigkeit aufweist. Dagegen ist der am schlechtesten dimerisierende PHD3-3 allein in der Lage, CYP33 bzw. dessen RRM-Domäne zu binden. Die Interaktion mit inhibitorischen Proteinen und die folgende Funktion als transkriptioneller Repressor sind allein mit der PHD3-3-Variante möglich. Bei Betrachtung der gesamten PHD1-3-Domäne sowie deren verkürzter Variante (ΔPHD1-3) fällt die reduzierte Bindungsfähigkeit der ΔPHD1-3-Domäne an die CYP33 RRM-Domäne sowie deren fehlende Dimerisierung auf. Über die resultierende geringere Bindung an inhibitorische Proteine kann die transkriptionell repressive Aktivität reduziert werden, während die transkriptionell aktive Funktion an Bedeutung gewinnt. Neben der Untersuchung der PHD-Domänen des MLL-Proteins wurde das Y2H-System zur weiteren Aufklärung der AF4- und AF4•MLL-Multiproteinkomplexe (MPC) verwendet. Ähnlich den Wildtypproteinen MLL und AF4 sind auch die beiden aus der t(4;11)(q21;q23)-Translokation resultierenden Fusionsproteine an der Assemblierung von MPCs beteiligt. Besonders das reziproke AF4•MLL scheint bezüglich des Therapieerfolgs für die Leukämogenese entscheidend zu sein. Die Identifizierung und Verifizierung sowohl bekannter als auch neuer Komponenten der AF4- und AF4•MLL-MPCs gelang in verschiedenen Experimenten. Allerdings wurde meist nur die Präsenz der Proteine im MPC nachgewiesen. Die Y2H-Untersuchungen konnten Interaktionen zwischen den verschiedenen Proteinen der Komplex identifizieren und damit die Kenntnis über die Zusammensetzung der MPCs wesentlich erweitern und vertiefen. Aufgrund der Beteiligung viraler Proteine an der Krebsentstehung sowie der Rekrutierung von Transkriptionsfaktoren der Wirtszelle für die virale Replikation erscheint auch die Nutzung der Superelongationskomplexe (SEC) durch virale Proteine plausibel. Die Funktion des AF4-Proteins als Kofaktor von viralen Proteinen, besonders der HCMV und EBV immediate early (IE)-Proteine, wurde bereits gezeigt. Außerdem konnte der Einfluss des HCMV IE1 auf AF4-abhängige Effekte sowie dessen Beteiligung am AF4-MPC nachgewiesen werden. Mithilfe der Y2H-Experimente konnten nicht nur Interaktionen des HCMV IE1 sondern auch Wechselwirkungen der Onkoproteine E6/E7 des HPV mit den Proteinen der AF4- und AF4•MLL-MPCs identifiziert werden.
Im Rahmen des FAIR Projektes wurde ein neuartiger Prototyp eines nicht strahlzerstörenden Bunch Struktur Monitors (BSM) am GSI UNILAC entwickelt. Ziel ist es, ein zuverlässiges Diagnosegerät zu entwickeln, welches die longitudinale Struktur der Ionenbunche innerhalb des LINACs untersuchen kann. Notwendig ist hierbei eine effektive Zeitauflösung deutlich unter 100 ps, bei möglichst wenigen Makropuls Mittelungen. Nach der erfolgreichen Inbetriebnahme soll der BSM Prototyp dazu dienen, die Umsetzbarkeit eines weiteren nichtinvasiven Geräts für den geplanten Proton-LINAC bei FAIR mit einer notwendigen Zeitauflösung von 10 ps zu beurteilen.
Die numerische Simulation von Materialien, welche dem Hochstrom-Ionenstrahl ausgesetzt sind, zeigten einen sehr hohen thermischen Stress. Daher wurde der Ansatz eines nicht strahlzerstörenden Diagnosegerätes verfolgt. Das Design beruht auf der Erzeugung von Sekundärelektronen durch Strahl-Restgas Kollisionen im Strahlrohr. Durch das Anlegen eines homogenen Hochspannungspotentials von bis zu -31 kV, wird ein Elektronenstrahl erzeugt, welcher die zeitliche Struktur des Ionenbunches trägt. Die zeitliche Information des Elektronenstrahles wird beim Durchfliegen eines HF-Ablenkers, welcher resonant an die 36 MHz des Beschleunigers gekoppelt ist, in eine räumliche Intensitätsverteilung umgewandelt. Anschließend wird die Elektronenverteilung auf einem bildgebenden MCP-Phosphor-Detektor durch eine CCD-Kamera detektiert und in die Bunch Struktur überführt.
Intensive Untersuchungen der BSM Eigenschaften ergaben eine höchste Auflösung von 37 ±6.3 ps bei gleichzeitig akzeptabler Intensität auf dem MCP-Detektor. Unter anderem wurden auch stabile Einzelschussmessungen durchgeführt, welche für die Profilmessung nur einen einzelnen Makropuls benötigten, statt über typischerweise 8-32 Pulse zu mitteln.
Durch die systematische Manipulation der Bunchlänge durch einen Rebuncher sind nicht gaußförmige Profile von 280 ps bis 650 ps detektiert worden, welche als Studie für eine Emittanzbestimmung genutzt worden sind. In Abhängigkeit des Analyseverfahrens sind Werte von εGauss = 1.42 ±0.14 keV/u ns bis εSD = 3.03 ±0.33 keV/u ns für die Emittanz bestimmt worden.
Des Weiteren ist ein Finite-Elemente Modell erstellt worden, um die Zeitstruktur der Sekundärelektronen innerhalb des elektronenoptischen Systems zu bestimmen. Für das Setup mit der höchsten Auflösung von 37 ps ergab sich eine zusätzliche Zeitverbreiterung von 5.6 ps, welche nur geringfügig die experimentell bestimmte Auflösung verschlechtert.
Der nicht strahlzerstörende BSM liefert eine ausreichend hohe zeitliche Auflösung für detailreiche Untersuchung der longitudinalen Bunchstruktur, ohne negative Einflüsse auf den Ionenstrahl auszuüben. Fortgeschrittene Messungen, wie longitudinale Emittanzbestimmung und Makropulsanalysen, sind möglich und werden dazu beitragen, die LINAC Strukturen besser zu verstehen und weiter zu optimieren.
Obwohl bei der Umsetzung des Arbeitsprinzips für den geplanten Proton-LINAC die veränderten Strahlparameter berücksichtigt werden müssen, zeigen die Ergebnisse, wie die Zeitstrukturuntersuchung und die erreichte Phasenauflösung von 0.5° bei 36 MHz, dass zeitliche Auflösungen bei Aufrechterhaltung der Phasenauflösung von bis zu 10 ps für einen neuen BSM Prototypen möglich sind.
Die Translokation von gelösten Stoffen über zelluläre Membranen ist ein essentieller biologischer Prozess, der durch eine Vielfalt an integralen Membranproteinen vermittelt wird. Diese sind in den selektiven Austausch verschiedenster Stoffe bzw. Teilchen involviert und ermöglichen somit die Kommunikation zwischen den einzelnen Zellkompartimenten untereinander bzw. mit der extrazellulären Umgebung. Eine der größten Familien paraloger Proteine, die den vektoriellen Transport von Substanzen über Zellmembranen katalysieren, stellen die ATP‐binding cassette (ABC)‐Transporter dar. Mitglieder dieser Proteinfamilie sind in allen bisher untersuchten Organismen von Prokaryoten bis hin zu höheren Eukaryoten vertreten und übernehmen essentielle Funktionen in einer Vielzahl von zellulären Abläufen. ABC‐Transporter zeichnen sich durch eine breite Substratdiversität aus, d.h. sie energetisieren unter ATP‐Verbrauch die Translokation zahlreicher, strukturell und chemisch unterschiedlicher Substanzen wie Zucker, Lipide, Ionen, Aminosäuren, Proteine oder auch zelltoxische Stoffe. In Bakterien können sie sowohl als Importproteine fungieren, welche hauptsächlich die Aufnahme von Nährstoffen vermitteln, als auch als Exportproteine, deren Hauptaufgabe es ist, zelltoxische Substanzen aus der Zelle heraus zu schleusen. Eukaryotische ABC‐Transporter sind sowohl in der Plasmamembran als auch in den intrazellulären Membranen zu finden – beispielsweise in denen des Endoplasmatischen Retikulums, des Golgi Apparats, der Lysosomen, der Peroxisomen und der Mitochondrien. Sie fungieren als Exportproteine und sind z.B. an der Ionen‐Homöostase, der Antigenprozessierung, der Insulinfreisetzung oder am Cholesterol‐ und Lipidtransport beteiligt. ...
Fuer die schlechte Prognose von Glioblastompatienten mit einer ueberlebenszeit von 9-15 Monaten (Norden and Wen, 2006) ist vor allem die hohe Invasivitaet dieser Tumore verantwortlich. Nach operativer Entfernung des Haupttumors entstehen aus den verbleibenden invadierten Zellen sekundaere Tumore, die sich mitunter ueber weite Bereiche des Hirns verteilen. Des Weitern sind die hochinvasiven Tumorzellen oft resistent gegen Chemo- und Strahlentherapie (Drappatz et al., 2009; Lefranc et al., 2005). In Maustumormodellen und Pateinten konnte zudem gezeigt werden, dass die neuartige antiangiogenetische Therapie zwar das Tumorwachstum verringert, jedoch die Invasivitaet stark erhoeht. (Norden et al., 2008; Ebos et al., 2009; Paez-Ribes et al., 2009). Ueber die Mechanismen die diese hohen Invasivitaet induzieren, ist bislang nur sehr wenig bekannt. Die durch Reduktion von Blutgefaessen steigende Hypoxie des Tumors foerdert die Expression von Matrix-Metalloproteinasen (MMPs). Dies fuehrt zum Abbau der extrazelluaeren Matrix des umgebenden gesunden Gewebes und beguenstigt dadurch die Tumorzellinvasion (Indelicato et al., 2010; Miyazaki et al., 2008; Shyu et al., 2007). Die Umformung des Aktinzytoskeletts und damit die Mobilitaet von Zellen wird vorwiegend durch ein akkurates Zusammenspeil der Rho GTPasen Rac, Rho und Cdc42, kontrolliert (Ridley et al., 2003). Fuer die Organisation von Axonen im Nervensystem und fuer die Blut- und Lymphgefaessbildung wurde gezeigt, dass die Interaktion der Eph-Rezeptortyrosinkinasen und Ihrer Ephrin-Liganden Signalwege induziert, die in die Regulation dieses Zusammenspiels involviert sind (Egea and Klein, 2007; Makinen et al., 2005; Palmer et al., 2002; Sawamiphak et al., 2010). Des Weiteren zeigt die Analyse der Genloci von Eph-Rezeptoren und Ephrinen in verschieden Hirntumoren eine gehaeufte Deletionen des Ephrin-B2-Gens. Die Quantifizierung von Ephrin-B2 mRNA in diesen Tumoren hat ausserdem ergeben, dass mit zunehmender Malignitaet die Expression von Ephrin-B2 sinkt. Aus diesen Gruenden wurden die Untersuchungen in dieser Arbeit auf die Rolle von Ephrin-B2 anhaengigen Signalwegen in der Glioblastomzellinvasion konzentriert. In einem modifiziertem Boyden-Chamber-Assay konnte gezeigt werden, dass das Ephrin-B2 induzierte EphB4 forward signaling und EphB4 induzierte Ephrin-B2 reverse signaling die Invasivitaet der human Glioblastomzelllinien LN-229, G55 und SNB-19 reduziert. In einem Maustumormodel konnte weiterhin gezeigt werden, dass Ephrin-B2 Knock-Out (KO) Astrozytomzellen, im Vergleich zu Wild-Typ (WT) Zellen, Tumore mit einem groesseren Volumen und einer erhoehten Invasivitaet bilden. Da die Expressionslevel fuer die Ephrin-B2 bindenden Rezeptoren EphA4, EphB1 EphB3 und EphB6 auch im adulten Hirn hoch sind (Hafner et al., 2004), weisen diese in vitro und in vivo Ergebnisse auf eine Tumorsupressorfunktion von Ephrin-B2 hin, die durch repulsive Effekte des Ephrin-B2 reverse signaling vermittelte werden koennten. Dies geht mit Erkenntnissen ueber kolorektale Tumore einher (Batlle et al., 2005). Die in einem Sphaeroid-Invasionsassay mit einer EphB-Rezeptoren freien Umgebung beobachtete verminderte Invasion von Ephrin-B2 WT deutet auf eine zusaetzliche invasionsblockierende Rolle der Ephrin-B2-Eph-Rezeptor Interaktion zwischen benachbarten Tumorzellen hin, wie sie auch in Brusttumoren gefunden wurde (Noren et al., 2006). Es scheint als sei Tumorprogression und Invasion erst moeglich, nachdem die Expression von Ephrin-B2 vermindert wurde. Es konnte weiterhin gezeigt werden, dass in hypoxischen Glioblastomzellen die Ephrin-B2 Expression durch die direkte Bindung des den Transkriptionsfaktors ZEB2 an den Ephrin-B2 Promoter reprimiert wird. In einem Weiteren Maustumormodel konnte gezeigt werden, dass die Blockierung der ZEB2 Expression mittels shRNA und die damit einhergehenden Inhibition der hypoxie induzierten Ephrin-B2 Repression das Wachstum und die Invasivitaet von Glioblastomen verringert. Zusaetzlich wurde gezeigt, dass der Verlust von ZEB2 ausreicht, die durch antiangiogenetische Therapie induzierte stark erhoehte Invasivitaet zu vermeiden. Die in dieser Arbeit gewonnen Erkenntnisse fuehren zu folgendem Modelmechanismus. In kleinen normoxischen Tumoren koennen repulsive Effekte des Ephrin-B2 reverse signalings und EphB forward signalings zwischen Tumorzellen und Zellen des umgebenden Gewebes die Ausbreitung und Invasion des Tumors unterdruecken. Zusaetzlich koennte das Ephrin-B2 induzierte EphB forward signaling zwischen benachbarten Tumorzellen die Mobilitaet der Tumorzellen wie in Brusttumoren inhibieren. Beim Erreichen einer bestimmten Tumorgroesse tritt Hypoxie auf, wodurch HIF-1alpha stabilisiert wird. Dies fuehrt dann zur ZEB2 Expression und leitet die Repression von Ephrin-B2 ein, was wiederum zur erhoehten Tumorzellemobilitaet und im Zusammenspiel mit MMPs zu Invasion fuehren kann. Gleichzeitig werden durch den HIF-induzierten VEGF-Gradienten neue Blutgefaesse rekrutiert. Damit wird der hypoxie-induzierten Invasivitaet entgegengewirkt. Wird mittels antiangiogenetischer Behandlung versucht Tumorprogression entgegenzuwirken, resultiert daraus eine erneut gesteigerte Hypoxie, die dann durch die ZEB2 vermittelte Repression von Ephrin-B2 wieder eine erhoehte Invasivitaet induzieren kann. Das Blockieren der ZEB2 Expression kann dieser durch antiangiogenetischen Behandlung induzierten Invasivitaet entgegenwirken.
Nierensteine sind eine häufige Diagnose, welche Patient und Gesundheitssystem gleichermaßen belasten. In dieser Arbeit sollten deshalb bekannte präoperative und intraoperative Faktoren bestätigt und neue identifiziert werden, welche das Ergebnis bei der endourologischen Steintherapie durch rigide oder flexible Ureterorenoskopie vorhersagen können. Die untersuchten Outcome-Variablen waren die Steinfreiheit, die postoperative Schmerzfreiheit, sowie die ökonomischen Faktoren OP-Zeit und Verweildauer. Ist eine Prädiktion dieser Variablen möglich, so wird der Krankenhausaufenthalt für Patient und Kliniken besser planbar, zudem kann anhand der ökonomischen Faktoren abgeschätzt werden, wie rentabel die Behandlung sein wird. Zu diesem Zweck sollten aus den Prüfvariablen Scores erstellt werden, welche die Steinfreiheit möglichst zuverlässig vorhersagen und bei gleicher Prädiktionskraft einfacher anzuwenden sind als der bekannte S.T.O.N.E. Score zur Abschätzung der Steinfreiheit nach starrer und flexibler URS. Zudem sollten erstmals auch Outcome-Scores für die OP-Zeit, die Verweildauer und die postoperative Schmerzfreiheit erstellt werden.
Hierfür wurden zunächst Patientendaten, sowie radiologische und intraoperative Ergebnisse zusammengetragen und mittels statistischer univariater Analyse auf einen Zusammenhang mit den Outcome-Faktoren überprüft. Hierbei wurden die starre und die flexible URS getrennt analysiert. Im nächsten Schritt wurden in multivariater Analyse die unabhängigen Faktoren identifiziert, welche das Outcome beeinflussen. Aus diesen Variablen wurden schließlich Scores errechnet und deren Prädiktionskraft im Hinblick auf das klinische und ökonomische Outcome nach URS mittels ROC-Analyse untersucht und verglichen. Für die Vorhersage der Steinfreiheit konnte zu jedem Eingriff ein Score erstellt werden, der bei gleicher oder besserer Prädiktionskraft mit weniger Variablen auskommt, als der bisher bekannteste publizierte S.T.O.N.E. Score und somit leichter anzuwenden ist. Der Renewal-Score für die starre URS umfasst die Parameter Steinlänge, Steinlokalisation, Steinanzahl und initiale Notfallvorstellung der Patienten, der Flexfree-Score für die flexible URS beinhaltet hingegen die Steinlänge, eine präinterventionelle DJ-Kathetereinlage und die Erfahrung des Urologen. Auch für die ökonomischen Parameter Operations- und Verweildauer konnten erstmals spezifische Outcome-Scores erstellt werden, lediglich die Schmerzfreiheit ließ sich mit den gesammelten Daten nicht vorhersagen. Bei der flexiblen URS konnte der zur gemeinsamen Prädiktion von OP- und Verweildauer geeignete Fleconomy-Score aus den Variablen Steinbreite und Steinvorgeschichte errechnet werden. Bei der starren URS mussten getrennte Scores erstellt werden. Für die OP-Dauer wurde der Ritime-Score aus den Parametern Steinlänge, Steinbreite, Steinlokalisation und Notfallvorstellung errechnet. Auch der Renewal-Score zur Vorhersage der Steinfreiheit nach rigider URS eignete sich zur Prädiktion der Operationszeit. Der Ristay-Score zur Vorhersage der Verweildauer nach starrer URS umfasst hingegen die Faktoren präoperative DJ-Kathetereinlage, den präinterventionellen Kreatininwert und die OP-Zeit. Auch die ökonomischen Tests sind klinisch einfach zu bestimmen und kommen bei hoher Vorhersagegüte mit wenigen Variablen aus. Alle erstellten Scores sind praxistauglich und stellen eine Weiterentwicklung der bisher zur Verfügung stehenden Tools oder komplette Neuerungen zur Vorhersage des Outcomes nach endourologischer Steintherapie dar. Dies ist nicht nur für den Patienten von Bedeutung, sondern hilft auch den Kliniken OP- und Verweiltage besser zu planen und somit den Behandlungsertrag zu kalkulieren.
Gegenstand dieser Arbeit sind Eigenschaften angeregter hadronischer Materie sowie physikalische Systeme, in denen diese Materie auftritt bzw. produziert wird. Die Beschreibung der stark wechselwirkenden Materie erfolgt in einem hadronischen, chiral-symmetrischen SU(3)L x SU(3)R Modell, welches die Saturierungseigenschaften von Kernmaterie und die Eigenschaften von Atomkernen reproduziert. Die Untersuchung heißer und dichter unendlicher hadronischor Materie zeigt, dass das vom Modell vorhergesagte Phasendiagramm stark von den Kopplungen der Baryonenresonanzen abhängt. Für kalte hadronische Materie ergibt die Einbeziehung des Baryonendekupletts und die Freiheit in deren Vektorkopplungen eine sehr große Bandbreite an verschiedenen Zustandsgleichungen. Für heiße hadronische Materie mit verschwindendem baryochemischen Potential zeigt sich ebenfalls eine starke Abhängigkeit der Eigenschaften hadronischer Materie von der Ankopplung der baryonischen Resonanzen. Es werden drei verschiedene Parametrisierungen betrachtet. Das resultierende Phasenübergangsverhalten variiert von einem "Crossover" über einen schwachen, zu einem doppelten Phasenübergang erster Ordnung. Es zeigt sich jedoch, dass die beobachteten Eigenschaften von Neutronensternen die Unbestimmtheit bzgl. der Vektorkopplung dieser Freiheitsgrade und damit der Zustandsgleichung deutlich verringern. Das Raum-Zeit Verhalten relativistischer Schwerionenkollisionen bei SPS- und RHIC-Energien wird mittels einer hydrodynamischen Simulation unter Benutzung der chiralen Zustandsgleichungen untersucht. Dabei spiegelt sich das unterschiedliche Phasenübergangsverhalten deutlich im Ausfrierverhalten der hadronischen Materie wider. Die im chiralen Modell berechneten Teilchenzahlverhältnisse werden mit den aus Schwerionenkollisionen von AGS- bis RHIC-Energien erhaltenen experimentellen Daten verglichen. Dabei zeigt sich, dass die verschiedenen Parametersätze des chiralen Modells und die Rechnungen für ein nichtwechselwirkendes, ideales Hadronengas eine ähnlich gute Beschreibung der gemessenen Weite liefern. Die deduzierten Ausfrierwerte für die Temperatur sind sensitiv auf das Phasenübergangsverhalten und liegen unterhalb der jeweiligen kritischen Temperatur. Die vorhergesagten Ausfriermassen sind in allen Parametrisierungen sehr ähnlich mit Abweichungen bis zu 15% von den entsprechenden Vakuumwerten. Die Untersuchung der Eigenschaften von Vektormesonen in dichter Materie erfolgt in der Mittleren-Feld- und in der HartreeNäherung. Hierbei zeigt sich eine signifikante Reduzierung der Teilchenmassen durch Vakuumpolarisationseffekte.
In der vorliegenden, randomisierten Doppelblindstudie wurde bei 48 Patienten mit gesicherter koronarer Herzerkrankung die Dosis-Wirkungs-Beziehung eines neuen, antianginös wirksamen Pharmakons mit dem Namen Trimetazidine (TMZ) in den Dosierungen 3 mg, 6 mg und 16 mg gegenüber Placebo untersucht. Zusätzlich sollte die Beeinflussung der Hämodynamik nach Gabe dieses Medikamenten untersucht werden. Frühere tierexperimentelle Untersuchungen (4,7,12,24,30,35,38,39) und klinische Untersuchungen an Patienten mit koronarer Herzkrankheit , die mit einer oralen oder intravenösen Gabe von Trimetazidine behandelt wurden, hatten eine antiischämische Wirksamkeit der Substanz ohne Beeinflussung hämodynamischer Parameter ergeben (7,11,26,30,34). Nach den bisher vorliegenden pharmakologischen Untersuchungen ist anzunehmen, dass die antiischämische Wirkung von Trimetazidine nicht über die Beeinflussung der Hämodynamik, sondern wahrscheinlich auf einer Stabilisierung der myokardialen ATP- Depots und der elektrischen Membranpotentiale während einer Ischämie beruht und somit TMZ einen direkt myokardprotektiven Effekt besitzt (11,13,14,24,35,41). In der vorliegenden Studie wurden während Perkutaner Transluminaler Koronarer Angioplastie (PTCA), 3, 6 oder 16 mg TMZ oder Placebo intrakoronar injiziert und in weiteren Dilatationen die Beeinflussung der PTCA-bedingten Ischämie durch TMZ untersucht. Zur Beurteilung der antianginösen Wirksamkeit von Trimetazidine wurden die ST-Strecken zum Ausgangszeitpunkt mit den maximalen ST-Strecken-Änderungen während der jeweiligen Okklusionen in den vier verschiedenen Therapiegruppen vergl ichen. Zusätzlich wurden die Ausbildungszeiten der maximalen ST-Strecken-Änderungen und deren Rückbildungszeiten in den vier Gruppen (Placebo, 3 mg, 6 mg und 16 mg TMZ) untersucht. Die Untersuchungen ergaben keine signifikanten Unterschiede zwischen den vier Gruppen sowohl vor, als auch nach der Gabe von TMZ bzw. von Placebo. Es wurde keine Beeinflussung der hämodynamischen Parameter unter Trimetazidine (systemischer Blutdruck, intrakoronarer Blutdruck und Herzfrequenz) beobachtet, was auf Grund einer früheren Studie auch erwartet wurde. Die subjektiv eingeschätzten pektanginösen Beschwerden blieben vor und nach der Gabe von TMZ / Placebo gleich. Die während der Untersuchung beobachteten Nebenwirkungen waren gering und nicht auf die Gabe vom TMZ zurückzuführen. Nach gewissenhafter Abwägung der Ergebnisse und dem Vergleich mit den Daten aus der Literatur scheinen weitere Untersuchungen mit vergleichbarem Studienau fbau an einem grösseren Patientenkollektiv und - um ein homogeneres Patientenko llektiv zu erhalten - bei Beschränkung der Dilatationen auf nur ein Gefäss, vorzug sweise den RIVA wünschenswert, um das Ausmass der antiischämischen Wirkung und die Dosis-Wirkungs-Effekte von TZM weiter zu erforschen.
Das kolorektale Karzinom stellt die zweithäufigste Krebstodesursache bei Männern und Frauen in der Bundesrepublik Deutschland dar
Das CRC hat aus diesem Grund eine große Bedeutung in chirurgischen und radiologischen Fachgebieten. Hierbei spielen zahlreiche Verfahren und Behandlungsmethoden eine zentrale Rolle, um das CRC und die hiervon ausgehenden kolorektalen Lebermetastasen zu behandeln und eine bestmögliche Therapie zu evaluieren. Über die letzten Jahrzehnte haben sich daher viele verschiedene Methoden für die Behandlung von CRLMs entwickelt, wie Mikrowellenablation (MWA), laserinduzierte interstitielle Thermotherapie (LITT), Radiofrequenzablation (RFA) und das chirurgische Vorgehen. Die vielversprechendste unter den Techniken und Verfahren stellt die chirurgische Resektion dar. Problematisch ist hierbei, dass viele erkrankte Patienten keine ausreichend gute körperliche Verfassung mehr aufweisen, um eine Resektion ohne große Risiken durchführen zu können.
Das Hauptziel dieser Studie war es nun, eine möglichst genaue und
aussagekräftige Untersuchung von Patientengruppen durchzuführen, bei denen eine kolorektale Lebermetastase diagnostiziert wurde. In der vorliegenden Studie wurden 132 Patienten mit kolorektalen Lebermetastasen (CRLM) untersucht, welche zwischen 2010 und 2018 mit einer CT-gesteuerten MWA-Therapie im Institut für Diagnostische und Interventionelle Radiologie des Universitätsklinikums in Frankfurt am Main behandelt wurden. Hierbei war von besonderer Bedeutung, welche prognostischen Parameter die Überlebenszeiten und Überlebensraten beeinflussen. Die Daten konnten anhand von vielfältigen Personendaten und den dazugehörigen Therapieverläufen erhoben werden. Außerdem wurden CT-Bilder, welche im Zuge der Behandlung entstanden waren, für die Erhebung zusätzlicher Parameter verwendet. Die erhobenen Daten und Messwerte wurden retrospektiv ermittelt und umfassten eine große Patientengruppe. Dies steigert die Aussagekraft der Ergebnisse und Kennzahlen wesentlich. Ein besonderes Augenmerk lag auf der Einteilung der Patienten in zwei Gruppen entsprechend ihrer Behandlungsindikation.
Zu den prognostischen Faktoren zählten das Ablationssystem, die Lokation der Metastasen, die Anzahl der Metastasen, der technische Erfolg, die Energie und Leistung, der Durchmesser und das Volumen der Metastasen, die Vor- und Nachbehandlung und die Lokalrezidive.
Die Patientengruppe mit palliativer Therapieindikation (1.08 Jahre) zeigte eine signifikant geringere mediane Überlebenszeit im Vergleich mit der kurativen Patientengruppe (3.48 Jahre). Die mediane Überlebenszeit aller Patienten betrug insgesamt 2.68 Jahre. Zusätzlich wurden die Überlebensraten der Patienten ermittelt. Die 1- und 3-Jahres-Überlebensraten aller behandelten Patienten im Untersuchungszeitraum lagen bei 82.7% und 41.6%. Die 1- und 3-JahresÜberlebensraten der 57 Patienten mit palliativer Behandlungsindikation waren 54.4% und 14.9%. Im Vergleich hierzu betrugen die 1- und 3-JahresÜberlebensraten der kurativ behandelten Patientengruppe 96.9% und 55.1%. Die mediane Beobachtungszeit nach der Behandlung betrug 2.39 Jahre. In dieser Zeit erreichten 96.2% aller Patienten eine lokale Tumorkontrolle (127/132). Die Überlebenszeit von Patienten mit einer, zwei oder drei, vier oder fünf und multiplen Lebermetastasen betrug 3.79, 2.13, 1.09 und 0.93 Jahre (alle p<0,017). Es gab eine einzige relevante Komplikation (Abszess) bei allen Behandlungen (1/257; 0,4%). Alle Unterschiede der Überlebenszeiten im primären Tumorursprung (p <0,038) und bei der Anzahl der Metastasen waren signifikant. Die anderen prognostischen Faktoren zeigten keine statistische Signifikanz. Prognostische Faktoren wie die Anzahl der Lebermetastasen, die Lokation des Primärtumors und das verwendete Ablationssystem haben einen bedeutenden Einfluss auf die Überlebenszeiten der CRLM-Patienten in dieser Studie gezeigt. Die Ergebnisse dieser Studie sind als vornehmlich anzusehen, weil eine strenge Zuteilung der Patienten in kurative und palliative Behandlungsindikationen für die Analyse der Überlebensdaten in dieser Form bis zu diesem Zeitpunkt nicht durchgeführt worden war.
Die Prognosefaktoren und deren Einfluss auf die Überlebenszeiten stellen für zukünftige radiologische Prognosen und Therapiemaßnahmen in Bezug auf CRLM Patienten gute Richtwerte dar. Sowohl für die Radiologen und Ärzte als auch für die Patienten und Angehörigen sind dies zukunftsweisende Anhaltspunkte.
Die Allgemeinanästhesie ermöglicht die zahnärztliche Sanierung bei Patienten, deren Behandlung unter konventionellen Bedingungen nicht erfolgen kann. In der vorliegenden retrospektiven Studie wurden die Daten zu 430 im Zeitraum von 1997 bis 2006 im Zahnärztlichen Universitätsinstitut Carolinum der Johann Wolfgang Goethe-Universität Frankfurt am Main bei 382 Patienten durchgeführten ambulanten zahnärztlichen Vollnarkosen (Gruppe 3G) erfasst und ausgewertet. Ziele der Arbeit waren die Untersuchung der Eingriffe in Bezug auf Organisation, Patientencharakteristika, Therapiekonzepte und therapeutische Maßnahmen sowie die Evaluation des Bedarfs nach Veränderungen. Die Sanierungen erfolgten bei Patienten aller Altersgruppen und unterschiedlicher Morbiditätsgrade. In 84,4 % der Fälle waren die Patienten älter als 6 Jahre. Der Altersdurchschnitt beim untersuchten Kollektiv betrug 25 Jahre. Die Mehrzahl der Patienten hatte schwere Allgemeinerkrankungen, geistige Behinderungen und motorische Störungen. Hauptindikation für die Behandlung in Vollnarkose war die unzureichende Kooperationsfähigkeit der Patienten für die Behandlung in Lokalanästhesie und ein hoher Sanierungsbedarf. An 10,5 % der Termine erfolgte die Therapie bei kooperationsunwilligen Kleinkindern. Gruppe 3G umfasste die chirurgischen (Gruppe 3C), konservierenden (Gruppe 3K) und kombiniert konservierenden und chirurgischen Sanierungen (Gruppe 3K + C). Es erfolgte eine gesonderte Auswertung der Behandlungen in der jeweiligen Subgruppe und die Gesamtauswertung in der Gruppe 3G. Das untersuchte Patientenkollektiv hatte einen niedrigen Sanierungsgrad und einenhohen Sanierungsbedarf. Infolgedessen wurde in allen Gruppen eine umfangreiche Therapie durchgeführt. Die häufigsten therapeutischen Maßnahmen waren die Restauration mittels plastischer Füllungsmaterialien und die Zahnextraktion. An einzelnen Terminen erfolgten prothetische und parodontologische Behandlungen. In der Gruppe 3G wurden pro Intervention durchschnittlich 5,6 Zahnflächen mittels 2,9 Füllungen restauriert und 6,5 Zähne extrahiert. Bei der Kohorte der Kinder im Alter von bis zu 6 Jahren waren 3,8 Füllungen an 7,5 Zahnflächen und 7,6 Extraktionen pro Patient festzustellen. Aus der jährlichen Verteilung der Füllungswerkstoffe werden ein Rückgang in der Anwendung des Amalgams und der Trend zur Verwendung adhäsiver Materialien deutlich. Die prä- und intraoperative Befunderhebung hat sich bei dem untersuchten Patientengut als sehr schwierig herausgestellt. Aufgrund fehlender Mitarbeit der Patienten konnte die röntgenologische Untersuchung in 35,6 % der Fälle nicht durchgeführt werden. Durch Einrichtung einer intraoperativen Röntgenmöglichkeit könnte eine genauere Diagnostik und Therapieplanung erzielt werden. Abschließend werden Therapiekonzepte für die Behandlung in Vollnarkose, die Compliance der Patienten für präventive Maßnahmen, die Inzidenz der Mehrfachbehandlungen in Allgemeinanästhesie und die Einführung eines strukturierten Recalls diskutiert.
Aim: The aim of this study was to measure cortico-cortical connectivity in multiple sclerosis (MS) patients by TMS-evoked potential (TEP) latencies in EEG evoked by transcranial magnetic stimulation (TMS) of the hand area of the primary motor cortex of one hemisphere. TEPs were recorded on the stimulated- and at the homologue site in the non-stimulated contralateral hemisphere. Both interhemispheric directions were tested. Interhemispheric latencies of the two main reproducible TEPs, the positive component at 60 ms and the negative component at 100 ms (P60 and N100, respectively), were expected to be significantly prolonged in MS-patients compared to healthy volunteers.
Material and methods: The study compared interhemispheric propagation of P60 and N100 in groups of 12 patients with early-stage relapsing-remitting MS (RRMS) and 16 age- and gender-matched healthy controls. The study was approved by the Ethics Committee of the Medical Faculty of the Goethe-University of Frankfurt/Main and conformed to the latest revision of the Declaration of Helsinki of 2008. TEPs were recorded by means of EEG and their latencies were statistically evaluated in 10 channels around the stimulation site and in 10 corresponding electrodes in the non-stimulated contralateral hemisphere. Interhemispheric conduction time was calculated by the difference of TEP latency in non-stimulated vs. stimulated hemisphere.
Results: An ANOVA on interhemispheric conduction time showed a significant prolongation for the N100 from left to right hemisphere in MS compared to controls, while no group differences were found for the P60 and the N100 from right to left hemisphere.
Conclusion: The results provide first evidence that the N100 may constitute an interesting marker to measure interhemispheric conduction delays in early-stage RRMS. The specificity of the present finding and its relation to fiber tract pathology should be examined in further correlative analyses with diffusion tensor imaging and other structural MRI data.
Zyklotronresonanzen von Ionen im hochfrequenz-modulierten magnetisch fokussierten Elektronenstrahl
(2000)
Ein Prototyp einer Kombination aus Penningfalle und EBIS/T wurde im Rahmen dieser Arbeit entwickelt. Dazu wurde ein Standard NMRMagnet erfolgreich so umgebaut, daß er in Bezug auf Vakuum, Temperatur und Temperaturbeständigkeit den Erfordernissen einer EBIS/T als Ionenfalle entspricht. Diese Apparatur ermöglicht nun die Untersuchung der in der EBIS/T erzeugten Ionen mit den Methoden der 'Fallenphysik'. Die Anregung der Ionen in der Falle wurde hier erstmals durch Hochfrequenzmodulation des Elektronenstroms über die Wehneltelektrode der Elektronenkanone durchgeführt. Messungen haben gezeigt, daß man in der EBIS/T erzeugte Ionen selektiv nach ihrem Verhältnis von Masse zu Ladung mit der Modulation in Resonanz bringen kann, bis sie den Elektronenstrahl verlassen. Die Ionen besitzen auch im dichten Elektronenstrahl eine charakteristische Eigenfrequenz, die zwar von der Raumladung in der Falle abhängt, mit der jedoch trotzdem eine Resonanzanregung durchgeführt werden kann. Im Experiment bestätigte sich die Vorhersage für die Mindestdauer der Anregung in der Größenordnung von Mikrosekunden und für Relaxionszeiten der kohärenten Ionenbewegungen im Bereich von Millisekunden, was eine grundsätzliche Voraussetzung für eine resonante Separation verschiedener Ionensorten darstellt. Die auftretenden Eigenfrequenzen der unterschiedlichen Ionen lassen sich theoretisch und im Einklang mit numerischen Simulationen beschreiben. Die Anregung der Eigenfrequenzen von Ionen über den Elektronenstrahl funktioniert bis zu so hohen Ionendichten, wie sie in einer EBIS vorkommen. Ionenmanipulationen, wie man sie von den Penningfallen her kennt, lassen sich auf ein Ionenensemble mit bis zu 10 10 Ionen pro cm 3 übertragen. Die gemessenen Verschiebungen der Eigenfrequenzen gegenüber der Zyklotronfrequenz geben darüber hinaus Aufschluß über den Kompensationsgrad des Elektronenstrahls in der EBIS/T und können damit als wichtiges Diagnosehilfsmittel für die Optimierung von ElektronenstrahlIonenquellen verwendet werden. Läßt man die Resonanzanregung kontinuierlich einwirken, so tritt überraschenderweise eine Erhöhung des Anteils an hochgeladenen Ionen in der EBIS/T auf. Darüberhinaus konnte experimentell gezeigt werden, daß die hochgeladenen Ionen auf der Achse des Elektronenstrahls konzentriert werden, während niedrig geladene Ionenen dort verschwinden und bevorzugt den äußeren Strahlbereich bevölkern. Die Erklärung dafür ist, daß durch kontinuierliches Entfernen dieser niedrig geladenen Ionen aus dem Elektronenstrahl eine vollständige Kompensation der Raumladung des Elektronenstrahls verhindert wird. Dadurch lassen sich Ionen in der Ionenquelle über einen längeren Zeitraum züchten. Vorteilhafterweise drängt die Anregung über eine Modulation des Elektronenstrahls im Gegensatz zu der normalen Dipolanregung bevorzugt niedrig geladenen Ionen, mit größerer Aufenthaltswahrscheinlichkeit am Rand, aus dem Elektronenstrahl. Dies führt zu einer verstärkten CoulombKühlung der hochgeladenen Ionen und konzentriert diese in der Mitte des Strahls, wo die Anregung fast unwirksam ist. Diese Kühlkraft wirkt als Zusammenspiel der attraktiven radialen Kraft des nicht vollständig raumladungskompensierten Elektronenstrahls und der Coulombstöße der Ionen untereinander. Durch diese Methode der Kühlung der Ionen untereinander können verstärkt Ionen hoher Ladungszustände in der Ionenquelle konzentriert werden. Der Vorgang der Kühlung durch Coulombstöße konnte mit einem Modell beschrieben werden, bei dem die thermische Verteilung aller Ionen im Elektronenstrahl einer Boltzmann Verteilung folgt. Das Modell benutzt vier Kräfte: die magnetische Kraft, die elektrische Haltekraft des Elektronenstrahls, die periodische elektrische Anregungskraft und die Reibung der Ionen proportional zu ihrer Geschwindigkeit und ihres Ladungszustandes bzw. die Stöße der Ionen untereinander. Die Resonanzanregung im Raumladungspotential sowie die Aufenthaltsverteilung der Ionen im Elektronenstrahl konnten damit dargestellt werden. Für Präzisionsexperimente an hochgeladenen Ionen bietet sich die Kombination aus einer EBIS/T mit integrierter Penningfalle an. Die Experimente haben gezeigt, daß es möglich ist, Ionenspektren mit einem eingekoppelten Wechselfeld in dem Ionisationsraum der EBIS/T zu separieren und zu reinigen. Für die Zukunft wünscht man sich aber eine größere Effektivität für das vollständige Entfernen bestimmter Ionensorten. Dies kann man erreichen, indem man den Elektronenstrahl noch dichter mit der Ionisationsröhre umschließt. Durch die kontinuierliche Resonanzanregung profitiert man von einer längeren Einschlußzeit für die stufenweise Ionisierung zu höheren Ladungszuständen und/oder eröffnet ElektronenstrahlIonenquellen neue Einsatzmöglichkeiten unter schlechteren Vakuumbedingungen. Die verstärkte Kühlung und Zentrierung der Ionen auf der Achse während dieses Betriebsmodus verbessert die Emmitanz von ElektronenstrahlIonenquellen. Für die Zukunft kann man sich eine EBIS mit moduliertem Elektronenstrahl auch im Strahlweg niederenergetischer hochgeladener Ionen zum Verbessern deren Emittanz vorstellen. Die im Elektronenstrahl erzeugten und sich selbst kühlenden Ionen wirken durch Coulombstöße als Kühlmedium ohne die Gefahr der Umladung wie bei gasgefüllten hfQuadrupolen.
Untersuchungen zur Bedeutung von Superoxid-Dismutasen für die Alterung von Podospora anserina
(2012)
Im Rahmen dieser vorliegenden Doktorarbeit sollte die Bedeutung von Superoxid-Dismutasen für das Resistenzverhalten und den Alterungsprozess bei P. anserina untersucht werden. Folgende Befunde aus den Analysen konnten erhalten werden:
1. Lokalisationsstudien der drei PaSods: Aus den biochemischen und fluoreszenzmikroskopischen Untersuchungen der drei verschiedenen PaSODs geht hervor, dass PaSOD1, eine Cu/ZnSOD, überwiegend im Cytosol und zu einem geringen Anteil im mitochondrialen Intermembranraum lokalisiert ist. Eine der beiden MnSODs, PaSOD2, wird vermutlich zur Abwehr von exogenem Superoxid sekretiert. Bei PaSOD3 handelt es sich um eine mitochondriale MnSOD.
2. Generierung von verschiedenen PaSod-Mutanten: Im Rahmen dieser Arbeit wurden von jeder PaSod mindestens drei unabhängige Überexpressionsstämme, ein GFP-Stamm- und ein Deletionsstamm hergestellt. Weiterhin wurden alle möglichen Doppel-Deletionsstämme und die Dreifach-Deletionsmutante erzeugt. Alle Stämme wurden auf DNA-Ebene verifiziert, zusätzlich wurde die Proteinmenge bzw. –Aktivität überprüft.
3. Einfluss der PaSODs auf die ROS-Toleranz: Die Analysen der ROS-Resistenzen haben gezeigt, dass PaSODs eine wichtige Rolle in der Entgiftung von Superoxiden spielt. So ließ sich bei den Deletionsstämmen der PaSods eine gesteigerte Sensitivität gegenüber Paraquat feststellen. Eine Aufsummierung der Sensitivität gegenüber Paraquat ist bei der PaSod-Tripelmutante (ΔPaSod1/2/3) zu erkennen.
Überraschenderweise kann durch die gesteigerten Mengen an aktiver PaSOD in den Überexpressionsstämmen (PaSod1-3_OEx) keine verbesserte Resistenz gegenüber Paraquat erzielt werden. Darüber hinaus führt die Überexpression des Gens für die mitochondriale SOD, PaSOD3, zu massiven negativen Effekten.
4. Einfluss auf die Lebensspanne: Durch eine fehlende Entgiftung von Superoxid in den PaSod-Deletionsmutanten ist eine Verminderung der Lebensspanne nicht festzustellen. Bei PaSod-Mutantenstämme, die eine erhöhte PaSOD-Aktivität und damit eine gesteigerte Abbaurate des Superoxids aufweisen, kann bei den PaSod1- und PaSod2-Überexpressionsstämmen keine verbesserte Lebensspanne unter den gewählten Standardbedingungen erzielt werden. Vielmehr noch ist die Lebensspanne der PaSod3-Überexpressionsstämme stark reduziert.
5. Einfluss der PaSod-Modulation auf andere Komponenten des ROS-Abbausystems: Die PaSOD-Aktivitäten scheinen miteinander co-reguliert zu werden. Des Weiteren scheint es ein Zusammenhang zwischen den beiden sekretierten Enzymen PaSOD2 und PaCATB zu geben. Deutlich wird auch, dass die Modulation der Superoxid-Dismutasen eine weitreichende Auswirkung auf andere Schutzsysteme hat. Beispielweise konnte gezeigt werden, dass Komponenten des mitochondrialen ROS-Schutzsystems und der Protein-Qualitätskontrolle in den PaSod3-Überexpressionsstämmen verändert sind.
Zusammenfassend lassen die Analysen der PaSod-modulierten Stämme den Schluss zu, dass die Superoxid-Dismutase in P. anserina ein wichtiges Enzym zum Abbau des schädlichen Superoxids darstellt, welches aber nur eine untergeordnete Rolle bei der Kontrolle der Lebensspanne unter den gewählten Wachstumsbedingungen im Labor ausübt. Des Weiteren haben die Analysen gezeigt, dass es durch die Modulation der PaSod-Gene zu weitreichenden Änderungen, die das ROS-Schutzsystem (PaSOD, PaCATB und PaPRX1) sowie die Protein-Qualitätskontrolle (PaHSP60, PaLON und PaCLPP) betreffen, kommt. Welche Auswirkung dabei diese Veränderungen in Bezug auf die Lebensspanne hat, kann nur schwer abgeschätzt werden und muss mit weiteren Untersuchungen geklärt werden.
This dissertation is an investigation of pitch accent, or lexical tone, in standard Croatian. The first chapter presents an in-depth overview of the history of the Croatian language, its relationship to Serbo-Croatian, its dialect groups and pronunciation variants, and general phonology. The second chapter explains the difference between various types of prosodic prominence and describes systems of pitch accent in various languages from different parts of the world: Yucatec Maya, Lithuanian and Limburgian. Following is a detailed account of the history of tone in Serbo-Croatian and Croatian, the specifics of its tonal system, intonational phonology and finally, a review of the most prominent phonetic investigations of tone in that language.
The focal point of this dissertation is a production experiment, in which ten native speakers of Croatian from the region of Slavonia were recorded. The material recorded included a diverse selection of monosyllabic, bisyllabic, trisyllabic and quadrisyllabic words, containing all four accents of standard Croatian: short falling, long falling, short rising and long rising. Each target word was spoken in initial, medial and final positions of natural Croatian sentences. This research fills several gaps in the existing literature. Namely, the production of tone was investigated in words with a syllabic /r̩/, in pretonal syllables and in non-initial context. Acoustic parameters measured included duration, F0 in every 10% of the nucleus duration, overall pitch, pitch range and pitch peak alignment.
Results showed that differences between falling and rising accents in Croatian are produced mainly with tonal parameters and that the most salient features were pitch peak alignment and overall pitch. The difference between long and short accents was primarily durational and optionally tonal. Words produced in initial and medial sentence positions had a rising contour in their accented syllable, while in the final, segments were usually falling.
Aufgrund wachsender Evidenz zu guten Langzeitergebnissen und geringen Komplikationsraten gewinnt die Prostataarterienembolisation (PAE) in der Therapie des Benignen Prostatasyndroms an Bedeutung. Durch ihren hohen technischen Anspruch bedarf es im Vorfeld einer umfassenden Untersuchung der Beckengefäßanatomie. Das Vorliegen eines zum Teil jungen Patientenkollektivs rückt zudem das Einsparen von Strahlung in den Fokus. In diesem Rahmen gewinnt die Magnet-Resonanz-Angiografie (MRA) an Aufmerksamkeit. Obwohl bereits erste Studien Erfolg versprechen, wird die MRA zur PAE-Planung zum Teil kritisch betrachtet, da sie aufwändiger und in der Auflösung unterlegen sei. In dieser Arbeit wurde untersucht, welche Vorteile die MRA im Zuge der PAE-Planung bietet und ob die klinische Effektivität der PAE unbeeinträchtigt bleibt. Weiterhin wurde untersucht, ob eine erfolgreiche MRA-geführte Planung die benötigte Strahlendosis reduziert.
In diese retrospektive Analyse wurden 56 Patienten, die zwischen Januar 2017 und April 2018 im Frankfurter Institut für Diagnostische und Interventionelle Radiologie eine PAE erhielten und bei denen ein vollständiger, die Interventionszeit und Strahlungsparameter umfassender Datensatz sowie eine MRA vor der PAE vorlagen, eingeschlossen. Zusätzlich wurden mittels International Prostate Symptom Score (IPSS), Quality of Life (QoL) und International Index of Erectile Function (IIEF) klinische Daten vor und nach der PAE erhoben. In der Magnet-Resonanz-Tomografie (MRT) vor der PAE wurden das Prostatavolumen, die Intravesical Prostatic Protrusion (IPP) und der Prostatic Urethral Angle (PUA) untersucht. Zur Analyse der Prostataarterie wurden Maximum Intensity Projection (MIP) und ein dreidimensionales Modell verwendet. Um die Auswirkungen einer erfolgreichen Urspungsanalyse auf Interventionszeit und Strahlungsparameter zu untersuchen, wurden diese Faktoren zwischen zwei Gruppen verglichen. In der ersten Gruppe konnte die Prostataarterie mittels MRA ermittelt werden, in der zweiten Gruppe war dies v.a. aufgrund von technischen Mängeln der Bildakquisition nicht möglich.
Der Nachweis des Ursprungs gelang bei 84,73% (111 von 131) der Prostataarterien, davon entsprangen 52,25% der A. pudenda interna, 18,92% zusammen mit der A. vesicalis superior, 13,51% seltenen Ursprüngen, 10,81% der A. obturatoria und 4,51% der vorderen Division der A. iliaca interna unterhalb der A. vesicalis inferior. Die Gruppe mit erfolgreicher Ursprungsanalyse mittels MRA zeigte signifikant geringere Werte in Fluoroskopiezeit (-26,96%, p = 0,0282), Dosisflächenprodukt (-38,04%, p = 0,0025) und Eingangsdosis (-37,10%, p = 0,0020). Die PAE bedingte eine signifikante Verbesserung in IPSS (p < 0,0001), Lebensqualität (p < 0,0001) und IIEF (p = 0,0016), dabei konnte der von den Patienten angegebene IPSS-Wert um durchschnittlich 9,42 Punkte (-43,37%) und der QoL-Wert um 2 Punkte (-50,00%) reduziert werden. Das Prostatavolumen (p < 0,0001), IPP (p = 0,0004) und PUA (p < 0,0001) zeigten sich ebenfalls signifikant reduziert. Das Volumen der Prostata schrumpfte um 4,92 ml (-8,35%), die IPP um 1,2 mm (-9,2%) und der PUA um 5,5° (-8,10%). Signifikante Zusammenhänge konnten zwischen IPSS- und QoL-Reduktion (p < 0,0001, r = 0,7555), sowie zwischen Höhe des IPSS vor der PAE und der absoluten IPSS-Reduktion (p = 0,0041, r = -0,4434) nachgewiesen werden.
Die MRA ermöglicht eine strahlungsfreie Analyse des Abgangs der Prostataarterie. Durch diese Auswertung konnte die benötigte Strahlendosis signifikant reduziert werden. Die MRA-geplante PAE erzielte eine deutliche Verbesserung der Symptomatik und der Lebensqualität. Die erektile Funktion konnte signifikant verbessert werden. Prostatavolumen, IPP und PUA zeigten zwar signifikante Veränderungen, wiesen jedoch keinen Zusammenhang zu klinischen Entwicklungen auf. Zwischen dem Ausgangsvolumen der Prostata und dem klinischen Ergebnis konnte ebenfalls keine signifikante Korrelation festgestellt werden, jedoch scheint der Ausgangswert des IPSS eine prädiktive Funktion zu haben.
Die MRA-geplante PAE ist klinisch effektiv und ermöglicht durch die Analyse der Prostataarterie eine Reduktion der benötigten Strahlung. Zusammen mit der MRT unterstützt sie die Indikationsstellung und Planung der PAE.
Alle lebenden Organismen sind in der Lage, sich an den re-gelmäßigen Wechsel von Licht und Dunkelheit und den zeitli-che Veränderungen im Takt der Jahreszeiten anzupassen. Die-se Synchronisierung der Aktivitäts- und Ruhephasen, sowie von physiologischen Stoffwechselprozessen an die vorgegebe-nen tageszeitlichen und saisonalen Zyklen findet beim Säu-getier in der inneren Uhr im Nucleus Suprachiasmaticus (SCN) statt. Das Licht, als wichtigster Zeitgeber für die Synchronisation der inneren Uhr, findet Eingang zum SCN über die Retina und den retinohypothalamischen Trakt (RTH), der Glutamat als Neurotransmitter nutzt. Ist dieses System fehlerhaft, führt dies zu Störung der oben beschriebenen Anpassungsprozesse. Dies hat eine gestörte Homöostase des Organismus zu Folge, aus denen sich wiederum Veränderungen im Tag/Nacht- Rhythmus, Schlafstörungen und depressive Ver-stimmungen ergeben können. Die genannten Symptome decken sich mit den Frühsymptomen den neurodegenerativen Erkran-kung Morbus Parkinson.
Ziel der vorliegenden Arbeit war es, Störungen im photoneu-roendokrinen System, insbesondere Veränderungen in der Re-tina an den photosensitiven Ganglienzellen mit dem Photo-pigment Melanopsin und dem SCN bei transgene Mäuse mit dem humanen alpha-Synuclein zu untersuchen. Hierbei wurden transgene Mäuse mit dem gesunden humanen alpha-Synuclein (Wildtyp) und transgene Mäuse mit der für Parkinson spezi-fischen Mutation im alpha-Synuclein Ala53Thr (A53T) vergli-chen.
Die immunochemischen Untersuchungen an Retina und SCN zei-gen einen signifikanten Anstieg der alpha-Synuclein Immun-reaktion bei der A53T Maus im Vergleich zum Wildtyp.
Parallel dazu wurden Unterschiede in Bezug auf das Photo-pigment Melanopsin zwischen den beiden Gruppen untersucht. Melanopsin ist lichtsensitiv und trägt, durch Übermittlung der aktuellen Lichtverhältnisse über den retinohypothalami-schen Trakt zum SCN, zur Synchronisation der circadianen Rhythmik bei. Durch den in dieser Arbeit nachgewiesene Me-lanopsindefizit und des deutlich reduzierten Vglut2 im hy-pothalamischen Trakt der A53T Maus lässt sich die Hypothese ableiten, dass möglicherweise die Überexpression des mu-tierten alpha-Synuclein in der Retina einen Untergang von melanopsinhaltigen Ganglienzellen herbeiführt und dadurch die Synchronisation der inneren Uhr durch Licht gestört ist. Diese Hypothese wird durch die Aktivitätsprofile ge-stützt, die durch die Aufzeichnung der lokomotorischen Ak-tivität der Tiere erstellt wurden.
Da in beiden Gruppen unter Dauerdunkel (DD) ein endogener zirkadianer Rhythmus beobachtet werden konnte, lässt dies auf die Funktionstüchtigkeit der inneren Uhr im SCN schlie-ßen. Im anschließenden Versuch die endogene Rhythmik an exogenen Reize anzupassen, zeigte sich bei dem A53T Stamm eine fehlende Synchronisierung an vorgegebene Lichtverhält-nisse mit gesteigerter Tagaktivität und reduzierten Schlaf-phasen. Somit trägt der fehlerhaft verarbeitete Lichtreiz bei A53T Mutanten zur Destabilisierung des zirkadianen Rhythmus der Lokomotion bei. Trotz des gestörten glutama-tergen Signalweges im retinohypothalamischen Trakt konnten keine Unterschiede in der Expression der Homerproteine zwi-schen Wildtyp und A53T unter Standard-Photoperiode und nach Schlafdeprivation nachgewiesen werden.
Die vorliegenden Befunde liefern Erkenntnisse zur Entste-hung der Frühsymptome bei Morbus Parkinson. Dies könnte neue Ansatzpunkte für die Therapie und Linderung von Schlafstörungen sowie Veränderungen im Tag/Nachtrhythmus liefern.
Zelluläre Zytotoxizität ist ein Phänomen, das für die Wirkung allogener Stammzelltransplantationen verantwortlich gemacht wird. Sie wird zudem genutzt im Rahmen zellulärer Immuntherapien mit Spenderlymphozyten, angereicherten, aktivierten und z.T. gentechnisch veränderten T- und NK-Zellen, Targeting der Antitumor-Immunantwort mit bispezifischen Antikörpern und der Vakzinierung mit dendritischen Zellen. Ihre Messung ist von großer Bedeutung bei der Weiterentwicklung und Validierung solcher Verfahren. In der Klinik für Kinderheilkunde und Jugendmedizin der Johann Wolfgang Goethe-Universität werden gegenwärtig mehrere solcher Verfahren entwickelt und eingesetzt. Eine Zytotoxizitätsmessung insbesondere gegen patienteneigene Leukämieblasten ist daher unerlässlich. Proben von Leukämieblasten aus peripherem Blut oder Knochenmark von Patienten sind heterogen und enthalten in der Regel restliche gesunde Zellen. Diese Zellen verzerren die Messung einer spezifischen Zytotoxizität gegen die Blasten, wenn sie nicht gezielt aus der Auswertung ausgeschlossen werden. Effektorzellen bestehen ebenfalls aus Subpopulationen, die in unterschiedlichem Ausmaß mit den Blasten interagieren. Um solche komplexen Proben adäquat analysieren zu können, sollte ein durchflusszytometrischer Assay unter Ausnutzung des Potenzials monoklonaler Antikörper zur differenziellen Markierung von Zellpopulationen entwickelt werden. Die Auswertung der Leukämietypisierungen von 47 Patienten und Austestung in Frage kommender Antikörper ergab, dass eine Wahl der Antikörper aufgrund des immunologischen Subtyps einer Leukämie nur mit Einschränkung möglich ist, so dass eine Vorabtestung der Antikörper erfolgen muss. Bei Einsatz der Markierung von Proben mit FITC- und PEkonjugierten Antikörper in einem konventionellen durchflusszytometrischen Assay, der die PI positiven Zielzellen an den Gesamtzielzellen als Korrelat der zytotoxischen Aktivität der Effektorzellen maß, traten Diskrepanzen in den Anteilen der Zellpopulationen einer Probe auf. Diese legten den Schluss nahe, dass tote Zellen durch vollständige Fragmentierung einer Messung entgehen. In einer neu konzipierten Assayvariante wurde daher das gegenteilige Konzept gewählt, die Messung des Überlebens der Zellen. Dies wurde ermöglicht durch die Einführung eines internen Standards, der eine durchflusszytometrische Konzentrationsmessung erlaubt. Mit diesem Verfahren wurde gezeigt, dass die Zunahme der mit PI erfassten toten Zellen nur gering mit der Abnahme lebender Zellen korreliert. Die Validierung anhand des Europium-Release-Assays ergab übereinstimmende Ergebnisse dieser zweiten Assayform mit diesem bei signifikantem (P ≤ 0,01, Wilcoxon-Rangtest) Unterschied der ersten Variante. Der im Rahmen dieser Doktorarbeit entwickelte Assay erlaubte zusätzlich die Beurteilung auch des Verhaltens der Effektorzellkonzentrationen. Es wurde gezeigt, dass diese sich bei vorhandener zytotoxischer Aktivität gegen die Zielzellen änderten im Sinne einer initialen Abnahme insbesondere in den geringen Effektor:Zielzell-Ratien und einer erneuten Zunahme bei längerer Kokulturdauer im Sinne einer Proliferationsinduktion durch den Zielzellstimulus. In einem letzten Schritt wurde eine modifizierte Zytometersteuerung und die Markierung CD4 und CD8 positiver T-Zellen in der gleichen Fluoreszenz unter Ausnutzung der unterschiedlichen Fluoreszenzintensitäten eingeführt. Dadurch wurde es möglich, bei vier Fluoreszenzbereichen simultan bis zu fünf verschiedene monoklonale Antikörper zuzüglich Propidiumjodid in einem einzigen Ansatz zu verwenden und so nicht nur lebende Ziel- und Effektorzellen zu differenzieren, sondern durch entsprechende Kombination der Antikörper auch Effektorzellsubpopulationen wie CD4+ und CD8+ T-Zellen in ihrem Verhalten zu beurteilen. Über die gleichzeitige Auswertung von Ziel- und Effektorzellen in verschiedenen Effektor:Zielzell-Ratien erlaubt dieser neue Assay differenzierte Aussagen über das Verhalten und die Reaktivität von Zellen in Kokultur bei einfacher Handhabung, minimaler Zellmanipulation im Verlauf des Assays durch Markierung erst nach Kokultur und hoher Flexibilität in der bearbeiteten Fragestellung.
Die Neurowissenschaften sind in Forschungsarbeiten für Schüler und Studierende immer wieder als eines der schwierigsten Teilgebiete der Biologie angeführt. Die Inhalte werden überwiegend nicht verstanden. Als mögliche Ursache gelten die seltenen praktischen Zugänge für die Lernenden aufgrund limitierter Ressourcen. Diese Ursache konnte in der vorliegenden Arbeit durch eine Befragung der Lehrkräfte zu ihren Praxisumsetzungen bestätigt werden. 70 % der Lehrkräfte gaben an, dass sie keine Experimente in der Schule zum Thema Nervenzellen anbieten. Experimente zur Verhaltensbiologie führen 65 % der Lehrkräfte nicht durch.
Um Schülern die Möglichkeit zu geben, sich experimentell mit den Themenfeldern der Neuro- und Verhaltensbiologie auseinanderzusetzen, wurden im Rahmen der vorliegenden Arbeit Schülerlabortage auf dem Feld der Neurowissenschaften konzipiert. Die Konzepte wurden schülerorientiert umgesetzt und neurowissenschaftliche Forschung durch den eigenen Umgang mit modernen Forschungsapparaturen erfahrbar gemacht. Die drei Labortage für die Sekundarstufe II wurden wissenschaftlich begleitet: 1) Verhaltensbiologie, 2) systemische Ebene der Elektrophysiologie, 3) elektrophysiologische Forschungsmethoden. Um die Qualität und Wirksamkeit der Labortage beurteilen zu können, wurden sie mit Feedbackerhebungen begleitet. Die drei Labortage wurden sowohl von den Lehrkräften als auch von den Schülern bezüglich ihrer Qualität positiv bewertet. Für die Schüler konnte gezeigt werden, dass die Beurteilung weitgehend unabhängig von einem zugrunde liegenden Interesse an Biologie und Forschung ausfällt. Anhand einer retrospektiven Erhebung wird außerdem gezeigt, dass alle drei Labortage eine höchst signifikante, selbsteingeschätzte Steigerung des „Wissens“, der „Anwendungszuversicht“ und des „Interesses“ bewirken. Schüler mit niedrigen Ausgangswerten zeigen einen besonders hohen Anstieg. Für das Interesse kann weiter gezeigt werden, dass auch Schüler mit hohem Ausgangswert eine große Interessenssteigerung durch den Labortag aufweisen. Das Interesse für den verhaltensbiologischen Labortag liegt etwas niedriger – die Labortage mit elektrophysiologischen Inhalten zeigen dagegen für die Anwendungszuversicht etwas niedrigere Werte.
Der Fokus der fachdidaktischen Forschung lag auf der Betrachtung des experimentellen Zugangs zur Elektrophysiologie über ein entwickeltes „EPhys-Setup“. Dabei handelt es sich um einen quasi-realen Messaufbau. Die Umsetzung kombiniert dazu Komponenten eines realen Elektrophysiologie-Setups (Hands-on Komponenten) mit einer speziell entwickelten schülerfreundlichen Software (Neurosimulation) und einem virtuellen Nervensystem in Form einer Platine. Als Modellnervensystem werden für diese Umsetzung Ganglien von Hirudo medicinalis verwendet – der Neurosimulation liegen originale elektrophysiologische Messspuren des Ganglions zugrunde. Experimentelle Vermittlungsansätze für die Elektrophysiologie finden sich kaum für den Schulbereich. Dem Bedarf einer entsprechenden Beforschung wurde mit verschiedenen Testinstrumenten nachgegangen, um den Vermittlungsansatz mit dem EPhys-Setup bewerten zu können. Dafür fand eine Wirksamkeitsanalyse über die Erhebung der Motivation der Schüler statt (Lab Motivation Scale; Dohn et al. 2016). Von Bedeutung war auch, inwiefern gegenüber der Umsetzung eine Technologieakzeptanz vorliegt (Technology Acceptance Model; Davis 1989), die im Schulkontext ausgehend von der steigenden Einbindung von Technologien einen entsprechenden Forschungsbedarf aufweist. Weiter wurde untersucht, ob sich die Bewertung des EPhys-Setups von der Bewertung einer Kontrollgruppe unterscheidet. Für die Kontrollgruppe wurde die Neurosimulation von den Hands-on Komponenten gelöst und die Schüler arbeiteten ausschließlich PC-basiert. Die Ergebnisse zeigen, dass beide Umsetzungen die Motivation förderten und eine Technologieakzeptanz bei den Schülern aufwiesen. Der Unterschied der Untersuchungsgruppen fällt gering aus. Die Abhängigkeiten, die für die verwendete Simulationsumsetzung gefunden wurden, beziehen sich ausschließlich auf Komponenten der „Freude“. Somit wird der intrinsische Bereich von den Schülern die am EPhys-Setup gearbeitet haben höher bewertet. Zur weiteren Analyse der Testinstrumente wurde auch eine Abhängigkeit der Bewertung vom zugrunde liegenden Biologieinteresse sowie von den Computerfähigkeiten vergleichend betrachtet. Der Einfluss auf die Bewertungen der drei Testskalen ist in vielen Fällen höher als der Einfluss der verwendeten Simulation. Vom individuellen Biologieinteresse der Schüler zeigen alle untersuchten Komponenten eine Abhängigkeit. Die größeren Effekte beziehen sich auf die Komponenten der „Lernwirksamkeit“ oder der „Freude“. Von den individuellen Computerfähigkeiten der Schüler zeigen Komponenten zur „Zuversicht bezüglich der Methoden und der Inhalte“ eine Abhängigkeit.
Theater der Spur
(2014)
Plastics contain a complex mixture of chemicals including polymers, additives, starting substances and side-products of processing. These plastic chemicals are prone to leach into the packaged goods, in the case of food contact materials (FCMs), or into the natural environment, in the case of plastic debris. Thus, plastics represent an exposure source of chemicals for humans and wildlife alike. While it is widely known that individual plastic chemicals, such as bisphenol A and phthalates, are hazardous, little is known on the overall chemical composition and toxicity of plastics. When fragmented into smaller particles, referred to as microplastics (< 5 mm), the plastic itself can be ingested by many species. It is well established that microplastic ingestion can have negative consequences for a wide range of organisms including invertebrates, but the contribution of plastic chemicals to the toxicity of microplastics is unclear.
Given the above, the present thesis aimed at a comprehensive toxicological, ecotoxicological and chemical characterization of everyday plastics. For a comparative evaluation, 77 plastic products were selected covering 16 material types (e.g., polyethylene) made from petroleum or renewable feedstocks. These products included biodegradable products, FCMs and non-FCMs, as well as raw materials and final products, respectively. In the first two studies, the chemical mixtures contained in the 77 products were extracted with methanol and extracts were analyzed in a set of four in vitro bioassays and by non-target high-resolution gas or liquid chromatography mass spectrometry. Since an exposure only occurs if chemicals actually leach under realistic conditions, in a third study migration experiments with water were conducted for 24 out of the 77 products. The aqueous migrates were assessed in the same way as the methanolic extracts. In addition, the freshwater invertebrate Daphnia magna was exposed chronically to microplastics made of polyvinylchloride (PVC), polyurethane (PUR) and polylactic acid (PLA) to investigate the contribution of chemicals in microplastic toxicity, in a fourth study.
The experimental findings demonstrate that a wide variety of chemicals is present in plastics. A single plastic product can contain up to several thousand chemical features, most of which unique to that product and at the same time unknown. The results also indicate that the majority of these chemical mixtures are toxic in vitro. Accordingly, 65% of the plastic extracts induced baseline toxicity and 42% an oxidative stress response, while 25% had an antiandrogenic and 6% an estrogenic activity. This implies that chemicals causing unspecific toxicity are more prevalent in plastics than such with endocrine effects. These chemicals can also leach from plastics under realistic conditions. Between 17 and 8936 chemical features were detected in a single migrate sample and all 24 tested migrates induced in vitro toxicity. This means that humans and wildlife can actually be exposed to toxic plastic chemicals under realistic conditions. Generally, each product has its individual toxicological and chemical fingerprint. Thus, neither material type, feedstock, biodegradability nor the food contact suitability of a product can serve as a predictor for the toxicity, the chemical composition or complexity of a product. Likewise, this means that bio-based and biodegradable materials are not superior to their petroleum-based counterparts from a toxicological perspective despite being promoted as sustainable alternatives to conventional plastics.
Moreover, the present thesis demonstrates that plastic chemicals can be the main driver for microplastic toxicity. Irregular microplastics made of PVC, PUR and PLA adversely affected life-history traits of D. magna in a polymer type- and endpoint-dependent manner at concentrations between 100 and 500 mg L-1 and with a higher efficiency than natural kaolin particles. While the toxicity of PVC was triggered by the chemicals used in the material, the effects of PUR and PLA were induced by the physical properties of the particle.
In addition, in the fifth study, results and observations made during this thesis were integrated inter- and transdisciplinarily with the perspectives of a social scientist and a product manufacturer. This elucidated that knowledge on plastic ingredients is often concealed, is lacking or not applicable in practice. These intransparencies hinder the safety evaluation of plastic products as well as the choice and sale of the least toxic packaging material.
Overall, the present thesis highlights that the chemical safety of plastics and their bio-based and biodegradable alternatives is currently not ensured. Thus, chemicals require more consideration in the toxicity and risk assessment of plastics and microplastics. Product-specific and complex chemical compositions, including unknown compounds, pose a challenge here. Two essential steps towards non-toxic products are to increase transparency along the product life cycle and to reduce the chemical complexity of plastics by communication and regulation. The results of the present thesis indicate that products exist which do not contain toxic chemicals. These can serve to direct the design of safer plastics. Since toxicity and chemical complexity seem to increase with processing, the integration of toxicity testing during the production steps would further support the safe and sustainable production and use of plastic products.
Stickstoffmonoxid (NO) ist ein gasförmiger Botenstoff, der über die Regulation des Vasotonus, die Hemmung der Thrombocytenaggregation sowie die Stimulation der Angiogenese auf die vaskuläre Homöostase einwirkt. Das wichtigste NO-produzierende Enzym im kardiovaskulären System ist die endotheliale NO-Synthase (eNOS), deren Aktivität durch posttranslationale Modifikationen wie Phosphorylierung und Acylierung, durch Interaktionen mit regulatorischen Proteinen wie Ca2 /Calmodulin und Caveolin sowie durch differentielle subzelluläre Lokalisation reguliert wird. Dabei sind die Faktoren, welche die (Trans-)Lokation der eNOS zwischen subzellulären Kompartimenten wie den Caveolae der Plasmamembran und dem Golgi-Apparat dirigieren, weitgehend unbekannt. Zur Identifizierung neuer Interaktionspartner wurde humane eNOS im "yeast two-hybrid"-System als "Köderprotein" eingesetzt und dabei das Fragment eines neuen humanen Proteins identifiziert, das vorläufig NOSTRIN (für: eNOS traffic inducer) genannt wurde. Im Rahmen der vorliegenden Arbeit gelang nun die Klonierung der kompletten NOSTRIN-cDNA, der Nachweis einer spezifischen Interaktion von eNOS und NOSTRIN in Säugerzellen sowie die Charakterisierung von NOSTRIN als Modulator der subzellulären Lokalisation und Aktivität von eNOS. Nach der kompletten Klonierung der NOSTRIN-cDNA mit Hilfe einer 5'-RACE resultierte ein offenes Leseraster von 506 Aminosäuren entsprechend einer Größe von ca. 58 kDa für NOSTRIN. Eine Datenbankrecherche zum Vergleich der NOSTRIN-Sequenz mit Sequenzen bekannter Proteinmotive ergab die Vorhersage einer N-terminalen Cdc15-Domäne sowie einer C-terminalen SH3-Domäne. Die direkte Interaktion zwischen eNOS und NOSTRIN konnte durch Copräzipitation in vivo und in vitro bestätigt werden. Weiterhin wurde nachgewiesen, dass die SH3-Domäne von NOSTRIN essentiell für die Bindung an eNOS ist. Zur Untersuchung des Einflusses von NOSTRIN auf die eNOS-Lokalisation wurden stabil transfizierte CHO-Zellen, die eNOS überexprimierten ("CHO-eNOS") eingesetzt. In der Immunofluoreszenz war eNOS vornehmlich in Assoziation mit der Plasmamembran und dem Golgi-Apparat zu sehen. Mit Hilfe des Semliki-Forest-Virussystems (SFV) wurde nun NOSTRIN transient überexprimiert; dabei zeigte sich für NOSTRIN eine vesikelartige Verteilung im Cytoplasma. Die NOSTRIN-Überexpression führte zu einer drastischen Umverteilung von eNOS, die nun in charakteristischen vesikelartigen Strukturen mit NOSTRIN colokalisierte. Die Verwendung von NOSTRIN-Konstukten, bei denen die SH3- Domäne deletiert war ("NOSTRIN.SH3"), veränderte zwar die typische NOSTRIN-Lokalisation nicht, ließ aber auch die subzelluläre Verteilung von eNOS unverändert, so dass NOSTRIN.SH3 und eNOS in unterschiedlichen zellulären Kompartimenten lokalisiert waren. Mit Hilfe der Immunofluoreszenz konnte ebenfalls eine Colokalisation von NOSTRIN und Caveolin-1, einem inhibitorisch wirkenden Interaktionspartner von eNOS, nachgewiesen werden. Die Analyse von Copräzipitationen mit NOSTRIN bzw. NOSTRIN.SH3 zeigte, dass Caveolin-1 in eNOS-unabhängiger Weise an NOSTRIN bindet, so dass ein ternärer Komplex aus NOSTRIN, eNOS und Caveolin-1 resultiert. Zur Klärung der Frage, ob NOSTRIN neben der subzellulären Lokalisation auch die Aktivität von eNOS beeinflusst, wurde die NO-Freisetzung von CHO-eNOS-Zellen analysiert. Dabei ergab sich, dass die transiente Überexpression von NOSTRIN in CHO-eNOS-Zellen die eNOS-Aktivität um 62 % im Vergleich zu Kontrollzellen reduzierte. In humanen primären Endothelzellen konnte mittels Immunoblotting und Immunofluoreszenzmikroskopie das Vorkommen von endogenem NOSTRIN sowie dessen Colokalisation mit endogener eNOS an der Plasmamembran nachgewiesen werden. Die Ergebnisse der vorliegenden Dissertation führen zur Hypothese, dass NOSTRIN als "molekulare Klammer" zwischen eNOS und Caveolin-1 dient, eine dynamische Umverteilung von eNOS innerhalb der Zelle vermittelt und damit das Enzym - direkt und/oder indirekt - inhibiert. Somit dürfte NOSTRIN als Modulator der Aktivität und Lokalisation von eNOS eine wichtige Rolle bei der Regulation der endothelialen NO-Produktion spielen.
Bei weltweit steigender Inzidenz von Krebserkrankungen in Verbindung mit den beträchtlichen Kosten für die Therapie und limitierten finanziellen Ressourcen ist eine wirtschaftlich sinnvolle Verteilung der Geldmittel die erstrebenswerteste Strategie um für ein Maximum an Patienten eine den Umständen entsprechend maximal wirksame Therapieform zu ermöglichen. Zur Beurteilung der Kostenentstehung und verteilung bei Krebstherapien wurde eine retrospektive Analyse hinsichtlich der Dauer der verschiedenen Abschnitte der Therapie bei 30 Patienten (13 Frauen, 17 Männer) durchgeführt und die Kosten der unterschiedlichen Behandlungsabschnitte betrachtet. Am Beginn stand dabei die Frage nach der Definition der Start und Endpunkte der einzelnen zeitlichen Intervalle und am Schluß die Ermittlung der Kosten pro Zeiteinheit, um Vergleiche der einzelnen Therapieintervalle auf ökonomischer Basis zu ermöglichen. Dabei ergab sich schon für die relativ kleine Stichprobe mit verschiedensten Anamnesen und Therapiezeiten ein verlängertes kuratives Behandlungsintervall im Gegensatz zu einer im Vergleich kürzeren palliativen Behandlungsdauer. Dabei konnte gezeigt werden, daß die Kosten pro Behandlungstag in der Regel für die kurative Behandlung geringer ausfielen als für die palliative, wobei sich der stationäre Aufenthalt in jedem Fall als maßgeblicher Kostenfaktor herausstellte. Generell scheinen die Ergebnisse darauf hinzudeuten, daß, während sich die kurativen Kosten in gewissen Grenzen prognostizieren lassen, dies bei den palliativen Kosten so nicht vorhersagbar ist. Aufgrund der Qualität der retrospektiv gewonnenen Daten und ihrer eingeschränkten Übertragbarkeit sollte die Wertigkeit dieser Aussage jedoch auch mit der nötigen Kritik betrachtet werden.
Um die Rolle von potentiell schmerzauslösenden Substanzen bei der Entstehung von menschlichem Muskelschmerz und von muskulärer Hyperalgesie zu beurteilen, wurde bei dieser Arbeit das DOMS Muskelschmerzmodell und das hypertone NaCl Muskelschmerzmodell in Kombination mit der Mikrodialysetechnik verwendet. Dabei wurden bei 10 gesunden, untrainierten Probanden metabolische Änderungen im Glucosestoffwechsel (Glucose, Laktat) und Fettstoffwechsel (Glycerol), Änderung der Glutamat Freisetzung und Änderungen von inflammatorischen Mediatoren (PGE2, NO, Substanz P) in den schmerzhaften und in den Kontrollmuskeln untersucht. Studienbegleitend erfolgte zur Beurteilung der Effektivität der Übungen und des dabei entstandenen Muskelschadens die Bestimmung von Serum CK, Serum Laktat, des Muskelumfangs und der Muskeldruckschmerzschwelle (PPT). Die Probanden gaben regelmäßig die Schmerzintensität auf einer visuellen Analogskala (VAS) an. Die DOMS Muskelschmerzen wurden 24 Stunden vor dem Beginn der Mikrodialyse durch konzentrisch/ exzentrische Kontraktionen der Wadenmuskulatur im Verum Bein ausgelöst. Während der Mikrodialyse erfolgte die Schmerzstimulation der Wadenmuskulatur durch Plantar- und Dorsalflexion des Fußes. Die Schmerzauslösung beim hypertonen NaCl Modell geschah während der Mikrodialyse durch sequentielle Injektionen von hypertoner NaCl Lösung ( 5 ∗ 200 µl 5.8% NaCl Lösung in 2 Minuten Intervallen) in den Bizepsmuskel am Oberarm. Die Zuordnung der Behandlung (Verum vs. Kontrollmuskel) erfolgte jeweils nach dem Zufallsprinzip.
Direkt nach den DOMS Übungen kam es zu einem signifikanten Anstieg von Laktat im Serum, nach 24 Stunden zu einem signifikanten Ansteigen der CK Aktivität und einer Zunahme des Muskelumfangs. Mit beiden Modellen konnte zuverlässig ein Muskelschmerz erzeugt werden, wobei die Schmerzintensität bei wiederholter Stimulierung abnahm und dies im DOMS Modell stärker ausgeprägt war. Eine mechanische Hyperalgesie konnte nur an den Waden beobachtet werden, die dort aber beidseitig auftrat und damit eine Art „zentraler Übererregbarkeit“ vermuten lässt. Die Dialysatkonzentrationen von Glutamat, PGE2 und Substanz P zeigten aufgrund der Schmerzstimulation im DOMS Bein einen lokalen Anstieg (Glutamat 125 ± 20 µM [p=0.005], PGE2 239 ± 45 pg/ml, Substanz P 64 ± 11 pg/ml). Dabei traten im Kontrollbein keine signifikanten Änderungen auf. Während der Mikrodialyseperiode war die NO Konzentration im DOMS Bein signifikant geringer als im Kontrollbein (p = 0.02), zeigte dabei aber keine Beeinflussung durch die Schmerzstimulation. Gleichzeitig war dabei die Laktatkonzentration im DOMS Bein im Vergleich zum Kontrollbein erhöht. Die Glucose- und Glycerolkonzentrationen wiesen durch die Schmerzauslösung keine bedeutenden Veränderungen auf.
Im Bizepsmuskel kam es infolge der hypertonen NaCl Injektionen zu einem signifikanten Anstieg der Glutamat Konzentration im Dialysat (50 ± 3 µM, p = 0.003), wobei diese im Kontrollmuskel konstant blieb. Die Injektionen hatten aber keinen Einfluss auf die Werte von Glucose, Laktat, Glycerol, NO, PGE2, des Muskelumfangs und der PPT.
Möglicherweise ist ein inflammatorischer Prozess an den peripheren Mechanismen der Muskelschmerzentstehung beim DOMS Modell beteiligt. Die Injektion von hypertoner NaCl Lösung löst den Muskelschmerz vermutlich direkt durch die hohe extrazelluläre Natrium Konzentration aus, wobei es zu einer Depolarisation der Nozizeptormembran mit einer nachfolgenden Glutamat Freisetzung aus den aktivierten Nozizeptoren kommt. Die Vorteile dieses Modells sind die Wiederholbarkeit und die kurze Dauer des Muskelschmerzes. Die dem ausgelösten Schmerz zugrundeliegenden Mechanismen ähneln jedoch nicht den Mechanismen die dem klinischen Muskelschmerz zugrunde liegen. Deshalb könnte es sein, dass die Bedeutungen der Ergebnisse aus diesem Modell relativ beschränkt sind und die Nützlichkeit insbesondere für pharmakologische Studien damit auch eingeschränkt ist.
Der Neurotransmitter Glutamat ist an den peripheren Mechanismen der Muskelschmerzentstehung beteiligt, da die Glutamat Freisetzung direkt mit dem Muskelschmerz beim DOMS Modell und beim Hypertonen NaCl Modell assoziiert war. Die beim DOMS Modell erhöhten Konzentrationen von Laktat, PGE2, sowie die Änderungen von Substanz P und die erniedrigten NO Konzentrationen könnten auch zu der Entstehung von Muskelschmerz beitragen.
Der beobachtete Rückgang der Schmerzintensität bei wiederholter Stimulierung lässt auf eine Art „Gewöhnung“ schließen, die bei Anwendung des DOMS Modells für pharmakologische Untersuchungen einen Nachteil darstellen könnte.
Ziel der vorliegenden Arbeit ist die Entwicklung, Aufbau und Inbetriebnahme eines Funnelsystems zur Zusammenführung zweier Teilchenstrahlen, bestehend aus zwei Injektionssystemen, zwei RFQ-Beschleunigern, Hochfrequenz-Deflektoren und Diagnoseeinheiten. Die Aufgabe des Experiments ist die praktische Umsetzung eines neuartigen Verfahrens zur Strahlstromerhöhung bei im Idealfall gleichbleibender Emittanz und steigender Brillanz. Notwendig wird dies durch die benötigten hohen Strahlströme im niederenergetischen Bereich einiger zukünftiger geplanter Beschleunigeranlagen. Hier kann der Strahlstrom nicht mehr konventionell von einer einzigen Ionenquelle erzeugt werden. Nur durch die Parallelerzeugung mehrerer Teilchenstrahlen sowie mehrfachem Zusammenführen (Funneling) der Teilchenstrahlen ist es möglich, die notwendigen Strahlströme bei der geforderten kleinen Emittanz zur Verfügung zu stellen. Das Frankfurter Funneling-Experiment ist die skalierte erste HIDIF-Funneling-Stufe als Teil eines Fusionstreibers. Hier werden zwei möglichst identische Helium-Teilchenstrahlen von zwei Ionenquellen erzeugt und in zwei RFQ-Beschleunigern beschleunigt. Der Deflektor biegt die Teilchenstrahlen reißverschlussartig auf eine gemeinsame Strahlachse. Am Anfang der Arbeit stand die Optimierung des Betriebs der Beschleunigerkomponeten und die Entwicklung und der Aufbau eines Einzellendeflektors. Erste erfolgreiche Strahlexperimente zur Strahlvereinigung werden im Kapitel 7.5 vorgestellt. Die Phasenraumellipse des zusammengeführten Strahls zeigt starke bananenförmige Deformierungen, die auf eine schlechte Anpassung des RFQ an den Funnel-Deflektor zurückzuführen sind. Das Elektrodendesign des RFQ ist in zwei unabhängige Bereiche unterteilt. Die erste Zone dient der Beschleunigung der Teilchen. In der zweiten Zone soll erstmals ein sogenannter 3D-Fokus der Strahlradien der x- und y-Ebene und einer longitudinaler Fokussierung erreicht werden. Der zweite Abschnitt bestand für erste Strahltests aus zunächst unmodulierten Elektroden. Zur besseren Anpassung des RFQ an den Funneldeflektor wurde dann das letzte Elektrodenteil erneuert. Der Umbau erfolgte zunächst nur bei einem der beiden RFQ-Beschleuniger. Somit war der direkte Vergleich zwischen altem und neuen Elektrodendesign im Strahlbetrieb möglich. Mit diesem neuen Elektrodenendteil wurde eine Reduktion der Strahlradien der x- sowie y-Ebene, eine bessere longitudinalen Fokussierung sowie eine höhere Transmission erreicht (Kapitel 8). Damit ist es erstmals gelungen mit einer speziellen Auslegung der RFQ-Elektroden eine direkte Anpassung an nachfolgende Elemente zu realisieren. Untersuchungen zur Strahlzusammenführungen werden seit einigen Jahren am Institut durchgeführt. Mit der Entwicklung des 3D-matchers wurde ein weiteres der kritischen Probleme gelöst. Der Umbau des zweiten Beschleunigers findet zur Zeit statt. Nach der Inbetriebnahme werden Funneling-Experimente mit dem Einspalt- und einem neuem Vielspaltdeflektor folgen.
Der zweckmäßige Einsatz der Skelettmuskulatur stellt in alltäglichen Bewegungen und im Sport ein zentrales Thema dar. Zur Ausführung unterschiedlicher Bewegungsziele verfügt die Muskulatur über verschiedene Arbeitsweisen, welche wiederum durch einzigartige neuronale Aktivierungsmuster realisiert werden. Bei der negativen Arbeitsweise, der Exzentrik, ist die innere Kraft der Muskulatur kleiner als die äußere Kraft des Widerstandes, wodurch die aktivierte Muskulatur in die Länge gezogen wird. Da hierbei durch das neuromuskuläre System die höchsten Kraftwerte erzielt werden, wird die Muskulatur unter exzentrischen Bedingungen einer sehr hohen Spannung ausgesetzt. Dies stellt eine wesentliche Voraussetzung für die Kraftsteigerung und Muskelhypertrophie dar. Deshalb befürworten Trainer und Autoren vielfach den Einsatz maximaler und supramaximaler exzentrischer Trainingsmethoden, um das Kraftvermögen in verschiedenen leistungssportlichen Disziplinen zu steigern. Ebenso wird diese Form des Trainings in präventiven und rehabilitativen Bereichen eingesetzt, um vor allem das Muskel-Sehnen-System zu kräftigen.
Ziel der vorliegenden Untersuchung war es, die Kontraktionsbedingungen und Effektivität des exzentrischen und konventionellen Krafttrainings zu vergleichen. Gleichermaßen war der Leistungstransfer auf eine funktionale mehrgelenkige Übung von besonderem Interesse. An der dazu durchgeführten Untersuchung nahmen 56 Probanden teil, wovon fünf aufgrund unerwarteter zeitlicher sowie verletzungsbedingter Ausfälle nicht das Ende der Untersuchung erreichten. In die Auswertung gelangten demnach 51 Probanden, davon 19 der exzentrischen Trainingsgruppe (ETG), 17 der konventionellen Trainingsgruppe (KTG) und 15 der Kontrollgruppe (KON). Letztere absolviert lediglich die Ein- und Ausgangstests. Vor, während und nach einem sechswöchigen Trainingszyklus am Beinstrecker wurden die exzentrische und konzentrische Maximalkraft sowie das Dreier-Wiederholungsmaximum an der Beinpresse ermittelt. Zur weiteren Analyse wurden bei diesen Tests die mittlere myoelektrische Aktivität (ARV) und Medianfrequenz (MDF) aus dem Oberflächen-EMG des m. vastus lateralis, m. vastus medialis und des m. rectus femoris aufgezeichnet. Von einer Teilgruppe aller Trainingsgruppen wurden zudem Veränderungen der Sprunghöhen aus Countermovement Jump (CMJ) und Squat Jump (SJ) ermittelt.
Beide Interventionsgruppen trainierten zweimal wöchentlich mit 5 Sätzen zu je 8 Wiederholungen am Beinstrecker. Der ETG wurde das Gewicht manuell angereicht, welches nach erfolgter Übergabe langsam und kontrolliert (maximal 25 °/Sekunde) von der gestreckten in die gebeugte Position geführt werden sollte. Die KTG führte das Gewicht ohne weitere Beschränkungen von der gebeugten in eine vordefinierte gestreckte Position und wieder zurück. Zur statistischen Auswertung wurden die Daten der Kontraktionsbedingungen des Eingangstests mittels t-Test für abhängige Stichproben analysiert. Zum Vergleich der Trainingsanpassungen wurde eine zweifaktorielle Varianzanalyse mit Messwiederholung und bei signifikantem F-Wert der post-hoc Test nach Scheffé durchgeführt. Dabei wurden die Steigerungsraten der Trainingsgruppen an den Veränderungen der KON relativiert. Das Signifikanzniveau wurde auf p ≤ 0,05 gesetzt.
Vor der Trainingsintervention lag die exzentrische Maximalkraft aller Probanden durchschnittlich 35,63 % über der konzentrischen und wurde begleitet von einer geringeren ARV und MDF. Durch beide Trainingsformen wurde die exzentrische Maximalkraft erhöht, jedoch fiel der Anstieg der ETG (35,41 %) signifikant größer aus als jener der KTG (24,48 %). Im Gegensatz dazu konnte die konzentrische Maximalkraft jedoch nur von der KTG signifikant gesteigert werden (19,92 %). Zum Vergleich ETG: 8,10 %. Das Dreier-Wiederholungsmaximum an der Beinpresse wurde in beiden Gruppen im ähnlichen Ausmaß signifikant erhöht (ETG 19,92 % vs. KTG 16,08 %). Die Analyse der Sprungkraftsteigerungen im CMJ (KTG 4,54 % vs. ETG 3,21 %) sowie im SJ (KTG 5,14 % vs. ETG 2,70 %) hingegen erbrachte keine signifikanten Steigerungen oder Unterschiede zwischen den Gruppen. Die festgestellten Entwicklungen der Kraftwerte lassen sich auf Grund der relativ kurzen Interventionsdauer überwiegend auf Anpassungen der intramuskulären Koordination zurückführen, welche durch einen Anstieg der ARV kenntlich wird. Dieser ARV-Anstieg fiel besonders bei der exzentrischen Maximalkraft auf, was auf einen trainingsbedingten Rückgang der Inhibition schließen lässt. Einen signifikanten Rückgang der MDF in allen Tests erzielte lediglich die ETG, dies jedoch nur für den m. rectus femoris. Signifikante Veränderungen der KTG oder Unterschiede zwischen den Trainingsgruppen blieben hier aus.
So führten beide Trainingsprogramme zu spezifischen Anpassungen der Kraft und myoelektrischen Aktivitätsmuster. Bezüglich der kumulierten Kraftsteigerung, des Leistungstransfers und der Veränderung der myoelektrischen Aktivität konnte jedoch keine Überlegenheit der exzentrischen Trainingsform herausgestellt werden. Aus ökonomischer Sicht bietet die exzentrische Methode allein keine genügende Vorbereitung auf primär konzentrische Bewegungsaufgaben. Die Ergebnisse legen jedoch nahe, dass das exzentrische Training zu äußerst spezifischen Anpassungen führt, welche bei der Trainingsplanung zielgerichtet Berücksichtigung finden sollten.
Einfluss des Lungensports auf die Muskelmasse, Lebensqualität und Lungenfunktion bei COPD-Patienten
(2009)
In der vorliegenden Arbeit wurde die Auswirkung von Lungensport auf die Systemerkrankung COPD untersucht. Es nahmen 42 Patienten mit COPD Gold II-III, die in eine Kontroll- und Studiengruppe aufgeteilt wurden, an der Studie teil. Die Untersuchung fand eineinhalb Jahre lang statt und die Probanden kamen regelmäßig alle 6 Monate zu Untersuchungen. Es wurde mittels BIA-Messung die Muskelmasse, Ernährungs- und Trainingszustand der Probanden gemessen. Ebenso füllte die Studiengruppe regelmäßig einen Lebensqualitäts-Fragebogen aus, den so genannten St. George Respiratory Questionnaire, der speziell für Patienten mit Atemwegserkrankungen erstellt wurde. Ein weiterer Untersuchungsschwerpunkt lag in der Erfassung der Atmungsverbesserung, die mittels Peak Flow und Spirometrie ermittelt wurde. Die Studiengruppe nahm einmal wöchentlich am Lungensport teil. Die Kontrollgruppe trieb keinerlei Sport. Der Lungensport ist ein ambulantes Rehabilitationsprogramm für Lungenkranke, das von einer Diplom-Sportwissenschaftlerin geleitet wird. Ziel der Studie war es zu zeigen, dass Lungensport eine positive Auswirkung auf den Verlauf der COPD, als Systemerkrankung, hat. Die Ergebnisse zeigen, dass die Muskelmasse der Studiengruppe signifikant ansteigt. Ebenso bessert sich der Trainings- und Ernährungszustand der COPD in der Trainingsgruppe signifikant nach längerer Teilnahme. Dies zeigen die Werte des Phasenwinkels (p < 0,01) und des ECM/BCM-Index (p < 0,05) im Vergleich zur Kontrollgruppe nach einem Jahr Teilnahme am Lungensport. Der expiratorische Peak Flow verbessert sich signifikant nach einem Vierteljahr um 5% und nach einem halben Jahr Teilnahme am Lungensport um 10-20%. Am deutlichsten zeigen sich diese Effekte während der Belastungsphase und nach dem Training. Die Lebensqualität der COPD-Patienten verbessert sich gering in der Studiengruppe, die Ergebnisse waren nicht p-signifikant, wobei sich das Gesamtergebnis um 4 Punkte verbessert. Jones P. et al zeigte dass eine Verbesserung um 4 Punkte ein klinisch signifikantes Ergebnisse gibt. Die Ergebnisse dieser Studie zeigen einen positiven Einfluss von Lungensport auf die Körperzusammensetzung und die Lebensqualität der Patienten. Die schädigenden Einflüsse der COPD auf die Körperzusammensetzung können im Vergleich zu sportlich inaktiven Patienten reduziert werden, im Falle der BCM (p < 0,01) ist sogar eine Besserung möglich. Diese Studie repräsentiert einen weiteren Beleg für die Effizienz von Lungensport in der Therapie der COPD. Der Peak Flow ist ein einfacherer Parameter, um die Besserung der Leistungsfähigkeit durch Lungensport objektivieren zu können. Der expiratorische Peak Flow ist ein wichtiger Indikator für die Prognose quod vitam von COPD Patienten, der mindestens ebenso aussagekräftig ist wie der FEV1-Wert. Zusammenfassend ergab die Studie, dass die regelmäßige Teilnahme am Lungensport einen steigernden Effekt auf die Muskelmasse hat und den Ernährungszustand von COPD-Patienten verbessert. Die Lebensqualität verbessert sich klinisch signifikant um 4 Punkte. Man kann also annehmen, dass die COPD Patienten ihre Lebensqualität verbessern. Im Hinblick darauf dass die COPD eine unaufhaltsame, irreversible Systemerkrankung ist, ist dieses Ergebnis als Erfolg anzusehen. Der Lungensport ist als Evidenz basierte Maßnahme in der Behandlung der COPD anzusehen. Lungensport kann ergänzend zu den schon bestehenden etablierten Therapiemethoden, die oft sehr kostenintensiv sind, angewendet werden. Die Kombination des Lungenports und der medikamentösen Therapie hält den Verlauf der COPD auf. Die Teilnahme am Lungensport dient damit gleichfalls zur Verbesserung der Prognose, Lebenserwartung und Lebensqualität der COPD-Patienten. Er leistet neben der medizinischen Relevanz auch einen gesundheitspolitischen Beitrag durch den Einsatz kostendämpfender Maßnahmen. Leider gibt es noch nicht genügend Angebote im Lungensport um die große Anzahl der COPD-Patienten abzudecken. Was könnte getan werden, dass Lungensport etabliert wird? - Lungenfachärzte müssen informiert werden - Krankenkasse sollten die Patienten mehr unterstützen - mehr Lungensport-Gruppen zu alternativen Uhrzeiten
Reduction in natural speech
(2009)
Natural (conversational) speech, compared to cannonical speech, is earmarked by the tremendous amount of variation that often leads to a massive change in pronunciation. Despite many attempts to explain and theorize the variability in conversational speech, its unique characteristics have not played a significant role in linguistic modeling. One of the reasons for variation in natural speech lies in a tendency of speakers to reduce speech, which may drastically alter the phonetic shape of words. Despite the massive loss of information due to reduction, listeners are often able to understand conversational speech even in the presence of background noise. This dissertation investigates two reduction processes, namely regressive place assimilation across word boundaries, and massive reduction and provides novel data from the analyses of speech corpora combined with experimental results from perception studies to reach a better understanding of how humans handle natural speech. The successes and failures of two models dealing with data from natural speech are presented: The FUL-model (Featurally Underspecified Lexicon, Lahiri & Reetz, 2002), and X-MOD (an episodic model, Johnson, 1997). Based on different assumptions, both models make different predictions for the two types of reduction processes under investigation. This dissertation explores the nature and dynamics of these processes in speech production and discusses its consequences for speech perception. More specifically, data from analyses of running speech are presented investigating the amount of reduction that occurs in naturally spoken German. Concerning production, the corpus analysis of regressive place assimilation reveals that it is not an obligatory process. At the same time, there emerges a clear asymmetry: With only very few exceptions, only [coronal] segments undergo assimilation, [labial] and [dorsal] segments usually do not. Furthermore, there seem to be cases of complete neutralization where the underlying Place of Articulation feature has undergone complete assimilation to the Place of Articulation feature of the upcoming segment. Phonetic analyses further underpin these findings. Concerning deletions and massive reductions, the results clearly indicate that phonological rules in the classical generative tradition are not able to explain the reduction patterns attested in conversational speech. Overall, the analyses of deletion and massive reduction in natural speech did not exhibit clear-cut patterns. For a more in-depth examination of reduction factors, the case of final /t/ deletion is examined by means of a new corpus constructed for this purpose. The analysis of this corpus indicates that although phonological context plays an important role on the deletion of segments (i.e. /t/), this arises in the form of tendencies, not absolute conditions. This is true for other deletion processes, too. Concerning speech perception, a crucial part for both models under investigation (X-MOD and FUL) is how listeners handle reduced speech. Five experiments investigate the way reduced speech is perceived by human listeners. Results from two experiments show that regressive place assimilations can be treated as instances of complete neutralizations by German listeners. Concerning massively reduced words, the outcome of transcription and priming experiments suggest that such words are not acceptable candidates of the intended lexical items for listeners in the absence of their proper phrasal context. Overall, the abstractionist FUL-model is found to be superior in explaining the data. While at first sight, X-MOD deals with the production data more readily, FUL provides a better fit for the perception results. Another important finding concerns the role of phonology and phonetics in general. The results presented in this dissertation make a strong case for models, such as FUL, where phonology and phonetics operate at different levels of the mental lexicon, rather than being integrated into one. The findings suggest that phonetic variation is not part of the representation in the mental lexicon.
Die Differenzierung zwischen Teilpopulationen hin zu unterschiedlichen Arten kann nur erfolgen, wenn zwischen diesen Teilpopulationen reproduktive Isolation besteht. Wie die unterschiedlichen Arten von reproduktiver Isolation zusammenwirken und welche Voraussetzungen bestehen müssen, um neue Arten zu bilden, muss in jedem Studiensystem untersucht werden. Ein idealer Ansatzpunkt sind Arten, die sich mehrfach an anspruchsvolle Habitate angepasst haben, deren Artbildung also von ökologischen Habitatparametern bestimmt wird. Dieser Vorgang wird als Ökologische Artbildung bezeichnet. Im Artkomplex Poecilia spec., der im Süden Mexikos mehrere schwefelangepasste Ökotypen ausgebildet hat, wurden erste Hinweise auf eine Korrelation zwischen der Selektionsstärke von natürlicher und sexueller Selektion gefunden, deren Einfluss zusammen die bestehenden reproduktiven Barrieren zwischen Klarwasser- und Schwefelökotyp formen. Wie diese Reproduktionsbarrieren beschaffen sind und wie die Umweltvariable Schwefel auf die Morphologie und das Verhalten der Poeciliiden Einfluss nimmt, wurde in der vorliegenden Arbeit anhand von fünf Fragestellungen untersucht. (1) Die Körperfärbung kann ein aussagekräftiges Signal für die Qualität des potentiellen Partners bei der Fortpflanzung sein. Wie beeinflusst die extreme Umweltvariable Schwefel die Ausbildung von Färbung? (2) Sind die gefundenen Anpassungen der Färbung erblich oder werden sie plastisch entsprechend des Nahrungsangebots ausgebildet? (3) In einem der untersuchten Flusssysteme konnte unvollständige reproduktive Isolation zwischen der Klarwasser- und Schwefelpopulation nachgewiesen werden. Sind in den Mischzonen zwischen diesen beiden Habitaten Hybriden genetisch nachweisbar und bilden diese die Färbungsanpassungen der Klarwasser-, der Schwefelpopulation oder eine intermediäre Form aus? (4) Die Gelbfärbung der Flossen bei Männchen scheint ein geeignetes Merkmal für die Anzeige der Qualität zu sein, da es möglicherweise unabhängig vom Nahrungsangebot ausgebildet wird. Besteht eine weibliche Präferenz für dieses Merkmal? (5) Auch die weibliche Partnerwahlpräferenz wird vom Habitat und dem eigenen Zustand beeinflusst. Wie verändert sich die Präferenz für Männchen mit gutem Ernährungszustand bei Weibchen, die hungrig sind?
Um diese Fragen zu beantworten, wurden in mehreren Jahren Männchen und Weibchen der Arten Poecilia mexicana und Poecilia sulphuraria aus sieben Populationen im Studiengebiet in Südmexiko gefangen und auf ihre Färbung untersucht sowie Laborpopulationen getestet. Es konnten generelle Anpassungen der Färbung an die Umweltvariable Schwefel nachgewiesen werden. Dazu gehören die Aufhellung der Körperregionen, die durch Tarnung (konkret: countershading und background matching) vor Entdeckung durch Prädatoren schützen, und die Reduktion von Gelb- und Rottönen. Diese Anpassung ist vermutlich auf das geringe Angebot an Karotinoiden in den schwefelbelasteten Extremhabitaten zurückzuführen. Außerdem konnten zahlreiche flusssystem¬spezifische Anpassungen beschrieben werden, deren Ursachen in den Unterschieden zwischen den Schwefelhabitaten untereinander begründet sind. Das Flusssystem des Río Tacotalpa stellt hier eine Besonderheit dar, da Männchen eine besonders starke Gelbfärbung der Flossen aufweisen. Wildgefangene und laborgeborene Männchen dieses Flusssystems wurden verglichen, um einen Hinweis auf den Einfluss des Nahrungsangebots auf dieses Merkmal zu untersuchen. Tatsächlich ist die Ausprägung dieses Merkmals, die Gelbfärbung der Flossen, unabhängig vom Angebot an Karotinoiden. Während die hier verwendeten genetischen Analysen nicht geeignet waren, Hybriden aus den Mischzonen zwischen Schwefel- und Klarwasserhabitat nachzuweisen, ergaben die Untersuchungen von Individuen aus den Mischzonen keine eindeutigen Ergebnisse über eine etwaige intermediäre Ausbildung der Färbung. Die Präsentation von Männchen, deren Gelbintensität an den Flossenspitzen künstlich verändert wurde, konnte bei Weibchen keine eindeutige Präferenz für stärker gefärbte Männchen aufzeigen. Vielmehr weist dieses Ergebnis auf eine starke Korrelation zwischen mehreren Merkmalen (z. B. weitere morphologische Merkmale, Verhalten) hin, die für die Beurteilung der männlichen Qualität herangezogen werden. Die weibliche Präferenz für konditionsabhängige Merkmale wird bei schwefelangepassten Weibchen leicht verstärkt, wenn diese hungrig sind. Eine solche flexible Präferenz sollte gerade in Habitaten mit starken Fluktuationen im Nährstoffangebot existieren. Dabei waren Weibchen, denen Videoaufnahmen präsentiert wurden, eher in der Lage, das qualitativ hochwertigere Männchen zu identifizieren, als Weibchen, denen animierte Bilder präsentiert wurden. Auch hier wird davon ausgegangen, dass die Reduktion auf eines oder wenige Merkmale, die für die Partnerwahl zur Verfügung stehen, keine ausreichend starke Reaktion auslösen können. Vielmehr ist der Zugriff auf alle Aspekte der männlichen Erscheinung wichtig, um die Qualität des potentiellen Partners zu beurteilen.
Färbung ist also generell geeignet, den Ökotyp eines Individuums zu bestimmen und ein solches Merkmal kann der Artbestimmung im ersten Schritt der Partnerwahl dienen. Dasjenige männliche Färbungsmerkmal, das über mehrere Generationen gleichbleibend ausgeprägt wurde – die Gelbfärbung der Flossen – reicht jedoch nicht aus, um bei der weiblichen Partnerwahl eine Reaktion auszulösen. Vielmehr deuten die Ergebnisse auf eine enge Korrelation der Färbung mit weiteren Merkmalen in Morphologie und Verhalten eines Individuums hin, die vom wählenden Weibchen stets gemeinsam entsprechend der Multiple-message-Theorie betrachtet werden. Auch der Vergleich zwischen Videoaufnahmen und animierten Fotografien als Stimuli bei der Partnerwahl ergab, dass der Aspekt Verhalten (nur verfügbar mit Videoaufnahmen) für eine Partnerwahlentscheidung von Bedeutung ist.
Meine Arbeit konnte den bestehenden Wissensschatz um die bestehenden reproduktiven Barrieren im Studiensystem um den Aspekt der Färbung erweitern. Meine Ergebnisse zeigen weitere spannende Fragestellungen auf. Je größer das Verständnis der vorliegenden Selektionskräfte und Mechanismen reproduktiver Isolation ist, desto besser kann die Wissenschaft verstehen, welche Umgebungsvariablen welchen Einfluss auf den Prozess der Artbildung haben.
Die randomisierte, dreiarmig kontrollierte Studie zu täglicher, peroraler Zusatzkost (ONS) bei Hämodialysepatienten (CHD) im Endstadium der Niereninsuffizienz (ESRD) über 6 Monate zeigte keine signifikanten Verbesserungen hinsichtlich folgender Nutritions-/Retentions- und Inflammationsparameter: Subjective Global Assessment (SGA); Body Mass Index (BMI); Querschnitt des Muskulus Iliopsoas,Oberarmumfang und Dicke des Unterhautfettgewebes (MRT); örperzellmasse und Phasenwinkel (Bioimpedanzanalyse BIA); Tumornekrosefaktor α (TNFα); Interleukin 1β und 6 (IL-1β und IL-6); C-Reaktives Protein (CRP). Der Querschnitt des Muskulus biceps brachii blieb in der Kontrollgruppe anfangs und zum Ende höher wie in den Interventionsgruppen. Der Serumkreatininwert der Interventionsgruppe mit HIV war anfangs geringer als in den übrigen Gruppen, die glomeruläre Filtrationsrate entsprechend besser, zum Ende waren diese Unterschiede nivelliert. Der Hauptbefund liegt in der hohen Mortalitätsrate der HIV-positiven Hämodialysepatienten (2 von 7 Pat., 28,6%), von denen beide im SGA als schwer mangel-/fehlernährt eingestuft wurden. Die Therapie eines Malnutritions-Infalmmations-Komplexes ist nicht allein durch orale Zusatzkost möglich. Weitere Studien müssen multimodale Konzepte zur Diagnose und zur Therapie erforschen. Hierzu kann perorale Zusatzkost ein einfach durchzuführendes Mittel als Teil der Behandlungsstrategie sein, zur erweiterten Diagnose kann die Bioimpedanzanalyse eine Möglichkeit sein, um den Teilaspekt der Nutritionskontrolle zu erfüllen.
The technique of site-specific fluorescence labelling with Tetramethylrhodaminemaleimide (TMRM) in combination with two electrode voltage-clamp technique (TEVC), an approach that has been named voltage clamp fluorometry (VCF), has been used in this work to study the Na,K-ATPase. The TMRM dye has the ability to attach covalently to cysteine residues and it responds to changes in the hydrophobicity of its local environment. We exploited this property using a construct of the Na-pump in which the native, extracellularly accessible cysteines were removed and cysteine residues were introduced by site-directed mutagenesis in specific positions of the Na-pump. In this way it was possible to detect site-specific conformational rearrangements of the Na-pump in a time-resolved fashion within a native membrane environment. In particular this technique allows to resolve reactions with low electrogenicity that cannot be satisfactorily analyzed with purely electrophysiological techniques and to identify the conformations of the enzyme under specific ionic composition of the measuring buffers. We used VCF to study the influence that several cations like Na+, K+, NMG+, TEA+ and BTEA+ exert on the distribution of the Na,K-ATPase between several enzymatic intermediates and on some of the reactions related to cation transport. To this end we utilized the mutants N790C in the loop M5-M6 and the mutant E307C, T309C, L311C and E312C in the loop M3-M4. From the correspondence of the fluorescence changes with the activation and inhibition of pumping current, by K+ and ouabain respectively, and from the fact that in Na+/Na+ exchange conditions the voltage distribution of charge movement and fluorescence changes evoked by voltage jumps are in reasonable agreement we conclude that through the fluorescence signals measured from these mutants, we can indeed monitor conformational changes linked to transport activity of the enzyme. For the mutants N790 and L311, it was found that the Na+ dependence of the amplitude and kinetics of the fluorescence signal associated with the E1P-E2P transition is in agreement with the prediction of an access channel model describing the regulation of the access of extracellular Na+ to its binding site. In particular for the mutants E307 and T309 it was found that in Na+/Na+ exchange conditions, the conformational change tracked by the fluorescence was much slower than the charge relaxation at hyperpolarized potentials while the kinetics was very similar at depolarized potentials. This implies that at hyperpolarized potentials the conformational change connected to the E1P-E2P transition does not give a large contribution to the electrogenicity of the process which is also consistent with the access channel model. On the mutant N790C it was found that the external pH does not seem to have any effect on the E1P-E2P equilibrium even if it seems to modulate the fluorescence quantum yield of the dye. Fluorescence quenching experiments with iodide and D2O indicate that at hyperpolarized potentials the local environment of the mutant N790C, experiences a small change in the accessibility to water without major changes in the local electrostatic field ...
IL-22 ist ein TH17-Signaturzytokin und wird primär von aktivierten T- und NK-Zellen produziert. Die Literatur beschreibt IL-22 als immunregulatorisches Signalmolekül, welches vor allem bei Infektionen und Entzündungsprozessen eine wichtige Rolle spielt. Typische IL-22-induzierte Gene sind beispielsweise Akut-Phase-Proteine, β-Defensine sowie Matrixmetalloproteasen. In dieser Arbeit wurde erstmals gezeigt, dass IL-22 die IFNγ-induzierte iNOS-Expression in humanen DLD-1 Kolonkarzinomzellen massiv verstärkt. Eine gestörte iNOS-Induktion mit folglich extensiver NO-Produktion trägt zu entzündlichen Veränderungen und zur Tumorentstehung bei. Insbesondere gibt es stichhaltige Belege, welche iNOS und NO in Verbindung mit Krebs als potentes Mutagen, als Angiogenesefaktor, als Verstärker der Protoonkogenexpression und als Inhibitor der Apoptose charakterisieren. Demzufolge ist gerade die Identifikation von Signaltransduk-tionswegen von Interesse, welche das Potential zur Regulation der iNOS-Expression in epithelialen Kolonkarzinomzellen besitzen. Der Nachweis des IL-22-Rezeptorkomplexes sowie einer STAT3-Phosphorylierung belegte die IL-22-Responsivität der hier verwen-deten DLD-1 Kolonkarzinomzellen. Der Transkriptionsfaktor STAT3 gilt als prominentes Signalmolekül in der Signaltransduktionskette von IL-22. In der aktuellen Literatur wird STAT3 aufgrund seiner antiapoptotischen und proliferativen Eigenschaften als Onkogen definiert. Sowohl in Patienten mit Morbus Crohn als auch im humanen Kolorektalkarzinom ist eine Überexpression von STAT3 und iNOS beschrieben. Unter Verwendung einer STAT3-spezifischen siRNA konnte der Nachweis erbracht werden, dass STAT3 ein essen-tieller Faktor in der IL-22-vermittelten Induktion der iNOS-Expression ist. Luciferase-Reporterstudien zeigten, dass IL-22 die humane iNOS-Promotoraktivität in DLD-1 Zellen, welche die Photinus pyralis (Firefly)-Luciferase unter Kontrolle eines 16kb-iNOS-Promotor-konstrukts überexprimieren (DLD-1/pXP2-16kb), erhöht. Somit kann eine Regulation der Transkription durch IL-22 angenommen werden. Dennoch vermag diese Arbeit die Frage nach den transkriptionellen Regulationsmechanismen der IL-22-vermittelten iNOS-Expres-sion in DLD-1 Zellen nicht abschließend zu beantworten. Eine Beteiligung ausgewählter Parameter der Zellaktivierung wie beispielsweise NFκB, STAT1α oder IRF-1 an der IL-22-vermittelten iNOS-Induktion konnte durch die vorliegende Arbeit ausgeschlossen werden. Neben transkriptionellen Regulationsmechanismen übernimmt auch die Regulation der iNOS mRNA-Stabilität eine wichtige Funktion bei der Induktion der iNOS-Expression. Allerdings zeigten auch hier die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit, dass IL-22 die iNOS-mRNA nicht stabilisieren kann. Dies bekräftigt wiederum die Annahme, dass IL-22 auf transkriptioneller Ebene den iNOS-Promotor reguliert. Weitere Versuche zeigten auch, dass IL-22 spezifisch an der iNOS-Expression in Kolonkarzinomzellen beteiligt ist und keinen generellen Verstärker der IFNγ-induzierten Genexpression darstellt. Beachtet man hierbei die bedeutende Rolle von STAT3 und iNOS bei Entzündung und Karzinogenese, so repräsentiert IL-22 möglicherweise eine neue Zielstruktur für immuntherapeutische Interventionen im Rahmen dieser Erkrankungen. Der zweite Abschnitt der vorgelegten Arbeit beschäftigte sich mit der Regulation der IL-22-Sekretion im Kontext von Sepsis und systemischer Entzündung. Es stellte sich die Frage, inwiefern IL-22 in diesem komplexen klinischen Syndrom der Sepsis nachzuweisen ist. In diesem Zusammenhang zeigte sich, dass sowohl eine generelle T-Zellaktivierung sowie verschiedene Stimuli der angeborenen Immunität, hier im Besonderen ein hitze-inaktiviertes Lysat von Staphylococcus epidermidis, eine vermehrte IL-22-Produktion anre-gen. Eine wichtige Frage ist hier die pharmakologische Beeinflussung der IL-22-Sekretion. Da bei der Therapie einer Sepsis die Behandlung mit niedrig dosierten Glukokortikoiden Erfolg versprechend ist, wurde im Folgenden der Einfluss des klassischen antientzünd-lichen Pharmakons Dexamethason auf die IL-22-Sekretion in PBMC untersucht. Es konnte eindrucksvoll gezeigt werden, dass Dexamethason sowohl auf mRNA- als auch auf Proteinebene einen sehr potenten Inhibitor der S. epidermidis-induzierten IL-22-Sekretion darstellt. Um die in vitro-Daten der IL-22-Sekretion nach Immunaktivierung humaner PBMC durch in vivo-Experimente zu ergänzen, wurde ein kürzlich etabliertes Nagermodell der schweren Sepsis mit akutem Verlauf verwendet (CLI; caecum ligation and incision). In diesem Modell ist IL-22 im Vergleich zu unbehandelten Tieren signifikant erhöht. In Über-einstimmung mit den in vitro-Experimenten in humanen PBMC hat die Applikation von Dexamethason im CLI-Modell die Hemmung der IL-22-Produktion zur Folge. Zur Abrun-dung dieser Ergebnisse wurde das Serum von Patienten mit einer Peritonitis-bedingten Sepsis untersucht und es konnte erstmals eindrucksvoll gezeigt werden, dass IL-22 in dieser Patientengruppe signifikant erhöht ist. Zum aktuellen Zeitpunkt ist die Rolle von IL-22 in der Sepsis noch nahezu unbekannt. Daher ist zu klären, wie die eingehend beschriebene IL-22-vermittelte Aktivierung der epithelialen Immunabwehr, die systemische Immunsuppression über die Induktion von IL-10 sowie das proinflammatorische und destruktive Potential von IL-22 in Einklang zu bringen sind.
Reisen sind aus verschiedenen Gründen mit erhöhten gesundheitlichen Risiken verbunden, insbesondere dann, wenn damit lange Reisezeiten, beengte Reiseverhältnisse, klimatische und Ernährungsumstellungen sowie vermehrte physische und psychische Belastungen verbunden sind. Besonders gefährdet sind Reisende, deren Leistungsfähigkeit durch bedeutsame chronische Erkrankungen eingeschränkt sind, wozu die Erkrankungen des kardiovaskulären Formenkreises zählen. Häufig verzichten herzkranke Patienten deshalb auf Urlaubsreisen, weil sie das damit verbundene Gesundheitsrisiko scheuen. Die Deutsche Herzstiftung e. V. und die Deutsche Gesellschaft für Prävention und Rehabilitation von Herz-Kreislauferkrankungen (DGPR) empfehlen daher speziell für Herzkranke angebotene Reisen. Diese sogenannten „Herzreisen“ werden nach strengen Richtlinien durchgeführt und verstehen sich als ärztlich begleitete Gruppenreisen, die spezielle Angebote für Herzkranke enthalten. Hierzu zählen, ähnlich wie in den ambulanten Herzgruppen (AHG), ein tägliches Bewegungs- und Entspannungsprogramm, die Durchführung von Arzt-Patient-Seminaren, Arztsprechstunden sowie spezielle diätetische Angebote und cholesterinreduzierte Mahlzeiten. Diese Reisen und alle in diesem Zusammenhang organisierten Ausflüge werden von 2 bis 3 in der Notfallmedizin erfahrenen Ärzten begleitet, die immer eine Notfallausrüstung (Notfallkoffer, EKG-Gerät, Defibrillator) mit sich führen. Über das Auftreten von Erkrankungen, Komplikationen, Verletzungen und erforderliche ärztliche Kontrolluntersuchungen bei Herzkranken und nicht herzkranken Vergleichspersonen bei Urlaubs- bzw. Herzreisen lagen jedoch bisher keine wissenschaftlichen Daten vor. Ziel dieser prospektiven Untersuchung war es, Erkenntnisse über die Art und Häufigkeit kardiovaskulärer und anderer Komplikationen oder Erkrankungen zu gewinnen, die im Rahmen kommerzieller Urlaubsreisen bei Herz-Kreislaufpatienten auftreten und wie sie von den begleitenden Ärzten allein oder mit Hilfe der medizinischen Einrichtungen vor Ort gelöst werden können. Deshalb wurden die Daten aller Herzpatienten und Begleitpersonen analysiert (n = 588), die in den Jahren 2000 und 2001 an Urlaubsreisen der Firma Kalina, Köln, unter ärztlicher Betreuung teilgenommen haben. Die Datenerfassung der hauptsächlich als Flugreisen angebotenen Herzreisen war durch einen speziell entwickelten Anamnesebogen und ein Sprechstunden-/Betreuungsprotokoll möglich, die vor den Reisen an die begleitenden Ärzte ausgegeben wurden. 421 Herzpatienten (71,6 %) und 165 Begleitpersonen (28,1 %) nahmen an den untersuchten Herzreisen teil. Die Geschlechtsverteilung der Herzpatienten war sehr ausgeglichen ( 48,0 %, 51,8 %), unter den Begleitpersonen befanden sich jedoch deutlich mehr Frauen (82,4 %). Das mittlere Alter der Herzpatienten lag bei 66,5 Jahren, das der Begleitpersonen bei 60,9 Jahren. Die evaluierte Gruppe der Herzpatienten bestand aus teilweise schwer kardial erkrankten Personen, die häufig sogar an mehreren kardialen Erkrankungen gleichzeitig litten. Sie unterschieden sich von den Begleitpersonen vor allem im Bezug auf die Prävalenz von Begleiterkrankungen, (kardialen) Risikofaktoren und die Einnahme kardial wirksamer Medikamente. Wie zu erwarten war, kam es auf Herzreisen zu kardiovaskulären und auch anderen Zwischenfällen, die mit dem speziellen Patientenkollektiv und seinen Vorerkrankungen in Verbindung gebracht werden konnten. Alle Zwischenfälle wurden von den begleitenden Ärzten jedoch sicher gelöst, so dass die ständige Anwesenheit eines Arztes inklusive Notfallausrüstung zu Recht gefordert wird. Nur in Ausnahmefällen kam es zu schwereren Komplikationen, die die begleitenden Ärzten nicht selbst behandeln konnten und die eine ambulante Behandlung bei einem anderen Arzt oder eine stationäre Aufnahme im Krankenhaus notwendig machten. Die auf den Reisen aufgetretenen Komplikationen sind jedoch selten und unterscheiden sich zahlenmäßig nicht von denen, die im Rahmen anderer kardiologischer Rehabilitationen oder der ambulanten Herzgruppen auftreten. Auf Herzreisen muss allerdings aufgrund des speziellen Gefahrenpotentials von Herzpatienten schon aus statistischen Gründen immer mit Komplikationen gerechnet werden. Anders als in Berichten von Krasemann und Laubinger kam es während des 2-jährigen Untersuchungszeitraumes von Herzreisen zu keinem tödlichen Zwischenfall oder zum Auftreten eines Myokard- oder Reinfarktes. Im Vergleich zu den Begleitpersonen traten jedoch überdurchschnittlich mehr allgemeine und leichtere kardiale Probleme und auch medizinisch kritischere Komplikationen auf. Die Ergebnisse unserer Untersuchung bestätigen die Annahmen anderer Autoren, dass Herzreisen sicher durchführbar sind. Sie tragen dem Bedürfnis der Herzpatienten Rechnung, auch im Urlaub ein subjektives Gefühl der Sicherheit durch einen Arzt vermittelt zu bekommen und einen medizinischen Ansprechpartner zu haben, der im Notfall eingreifen kann. Die Herzreisen entsprechen damit wichtigen Zielen in der kardiologischen Rehabilitation und tragen zu einer weiteren Wiedereingliederung in den Alltag bei. Den Patienten wird es trotz Herzerkrankung ermöglicht, mit reduziertem Risiko, betreut in den Urlaub zu fahren und krankheitsangepasste Freizeitaktivitäten durchzuführen. Somit kann die Herzreise einen wichtigen Beitrag in der kardiologischen Rehabilitation leisten.
The process of urbanization is one of the major causes of the global loss of biodiversity; however, cities nowadays also have the potential to serve as new habitats for wildlife. The European rabbit (Oryctolagus cuniculus, L. 1758) is a typical example of a wildlife species that reaches stable population densities in cities. Due to intense plant and soil damages, German city authorities aim to control high rabbit densities through the application of a yearly hunting regime (e. g., in Munich, Berlin or Frankfurt am Main). In contrast, population densities of O. cuniculus are on decline in German rural areas, i. e., numbers of yearly hunting bags decreased. The aim of my doctoral thesis was to answer the following research questions: Do population densities of the European rabbit correlate with the intensity of urbanization in and around Frankfurt am Main and if so, which factors play a role in varying densities? How are burrow construction behaviors and group sizes, daytime activity patterns and anti-predator behaviors as well as communication behaviors of this mammal affected by urbanization?
In my first study, I focused on population dynamics across 17 different study sites in and around Frankfurt. As one of yet few studies, I invented an approach that quantified the intensity of urbanization (degree of urbanity) of each study site base on four variables: (1) intensity of anthropogenic disturbance per min and ha, (2) number of residents within a radius of 500 m, (3) proportion of artificial ground cover and (4) numbers of anthropogenic objects per ha. Spearman rank correlations confirmed that with increasing degree of urbanity also rabbit and burrow densities increased. The access to dense shrubs, bushes etc. as suitable sites for burrow construction is the most determining factor for rabbit abundances, and therefore I presumed different densities along the rural-to-urban gradient to be driven by shifts in the availability of thick vegetation.
In the second study, I calculated two indices that in both cases classified burrows to be either accumulated, evenly or randomly distributed within study sites. Additionally, in cooperation with local hunters the number of burrow entrances and animals that occupy the same burrow had been determined during the hunting season. With increasing degree of urbanity burrow distribution patterns shifted from accumulated in rural areas towards more evenly distributed within the city center of Frankfurt. This is a clear sign for an increasing access to sites suitable for burrow construction along the rural to-urban gradient. Additional Spearman rank correlations revealed that the external dimensions of burrows decreased (shorter distances between entrances) and that burrows became less complex (fewer entrances) along the rural-to-urban gradient. In accordance, the number of rabbits that commonly shared the same burrow system was highest within rural areas, whereas I found mainly pairs and single individuals within highly urbanized study sites.
In the last study I compared activity patterns, burrow use and percentages of anti-predator behaviors from one hour before sunrise until one hour after sunset of rural, suburban and urban rabbit groups. A linear mixed model (LMM) and Spearman rank correlations confirmed that rabbits located at urban and suburban sites spent more time outside their protective burrows compared to their rural conspecifics. At suburban sites, individuals invested the least amount of time in anti-predator behavior. Results of this third study gave evidence that suburban rabbit populations on one hand benefit from less predation pressure by natural predators in comparison to rural sites, whereas on the other hand are exposed to less intense disturbance by humans compared to urban study sites.
The last study focused on the effects that urbanization had on the latrine-based communication behavior of rabbits. As many other mammals, O. cuniculus exchange information via the deposition of excreta in latrines, and depending on the intended receiver(s), latrines are either formed in central areas for within-group communication or at territorial boundaries, e. g., for between-group communication. The relative importance of within- vs. between-group communication depends on, amongst other factors, population densities and group sizes which I proved both to shift along the considered rural-to-urban gradient. I determined latrine sizes, latrine densities and latrine utilization frequencies relative to their distance to the nearest burrow at 15 different study sites. Latrine densities and utilization frequencies increased with increasing distance from the burrow in suburban and urban populations whereas at rural sites, largest latrines and those containing the most fecal pellets were close to the burrow, suggesting that within-group communication prevailed.
To sum up, for the first time, I was able to relate shifts in the ecology and behavior of the European rabbit as adaptations to a gradual anthropogenic habitat alteration that are typical for “urban exploiters”. Especially the suburban habitat provides high landscape heterogeneity (“edge habitat“) which is essential for high and stable rabbit populations. Moreover, here, comparably low human disturbance and predation pressure are given in contrast to the agriculturally transformed, open landscapes which are nowadays typical for most rural areas in central Europe. I argue that this mainly leads to the observed behavioral changes along the rural-to-urban gradient. Future plans for rural land management actions should aim to increase refuge availability by generating networks of ecotones. This would also benefit species that depend on similar ecosystem structures as the European rabbit and are on decline in Germany.
Metallorganische Netzwerke (engl. metal-organic frameworks, MOFs) sind eine neuartige Klasse mikro/mesoporöser Materialien, für die eine Vielzahl von möglichen Anwendungen demonstriert werden konnte. Das Ziel dieser Arbeit besteht in der Synthese von MOF Mikro/Nanopartikeln sowie der Herstellung von sogenannten Oberflächen-deponierten MOFs (engl. surface-attached metal-organic frameworks, SURMOFs). MOF Partikel mit kontrollierbarer Morphologie und Größe wurden unter milden Bedingungen synthetisiert. Um MOFs als Sensoren, intelligente Membrane, oder in nanotechnologischen Bauelementen verwenden zu können, ist die Integration auf der jeweiligen Oberfläche wichtig. Daher beschäftigt sich der Großteil dieser Arbeit mit der kontrollierten Abscheidung von SURMOFs auf verschiedenartigen Trägermaterialien. Etliche interessante Eigenschaften (z.B. die Fluoreszenz in Abhängigkeit von der Gegenwart von Gastmolekülen und die dynamische Gasadsorptionskapazität) der SURMOFs wurden untersucht.
Within this thesis, an experimental study of the photo double ionization (PDI) and the simultaneous ionization-excitation is performed for lithium in different initial states Li (1s22l) (l = s, p). The excess energy of the linearly polarized VUV-light is between 4 and 12 eV above the PDI-threshold. Three forefront technologies are combined: a magneto-optical trap (MOT) for lithium generating an ultra-cold and, by means of optical pumping, a state-prepared target; a reaction microscope (ReMi), enabling the momentum resolved detection of all reaction fragments with high-resolution and the free-electron laser in Hamburg (FLASH), providing an unprecedented brilliant photon beam at favourable time structure to access small cross sections. Close to threshold the total as well as differential PDI cross sections are observed to critically depend on the excitation level and the symmetry of the initial state. For the excited state Li (1s22p) the PDI dynamics strongly depends on the alignment of the 2p-orbital with respect to the VUV-light polarization and, thus, from the population of the magnetic substates (mp = 0, ±1). This alignment sensitivity decreases for increasing excess energy and is completely absent for ionization-excitation. Time-dependent close-coupling calculations are able to reproduce the experimental total cross sections with deviations of at most 30%. All the experimental observations can be consistently understood in terms of the long range electron correlation among the continuum electrons which gives rise to their preferential back-to-back emission. This alignment effect, which is observed here for the first time, allows controlling the PDI dynamics through a purely geometrical modification of the target initial state without changing its internal energy.
Xenorhabdus and Photorhabdus bacteria are gaining more and more attention as a subject of research because of their unique yet similar life cycle with nematodes and insects. This work focused on the secondary metabolites that are produced by Xenorhabdus and Photorhabdus. With the help of modern HPLC-MS methodologies and increasingly available bacterial genome sequences, the structures of unknown secondary metabolites could be elucidated and thus their biosynthesis pathways could be proposed, too.
The first paper reported 17 depsipeptides termed xentrivalpeptides produced by the bacterium Xenorhabdus sp. 85816. Xentrivalpeptide A could be isolated from the bacterial culture as the main component. The structure of xentrivalpeptide A was elucidated by NMR and the Marfey´s method. The remaining xentrivalpeptides were exclusively identified by feeding experiments and MS fragmentation patterns.
The second paper described the discovery and isolation of xenoamicin A from Xenorhabdus mauleonii DSM17908. Additionally, other xenoamicin derivatives from Xenorhabdus doucetiae DSM17909 were analyzed by means of feeding experiments and MS fragmentation patterns. The xenoamicin biosynthesis gene cluster was identified in Xenorhabdus doucetiae DSM17909.
The manuscript for publication focused on the biosynthesis of anthraquinones in Photorhabdus luminescens. The Type II polyketide synthase for the biosynthesis of anthraquinone derivatives was discovered in P. luminescens in a previous publication by the Bode group,1 in which a partial reaction mechanism for the biosynthesis has been proposed. The manuscript reported in this thesis however elucidated the biosynthetic mechanisms in a greater detail as compared to the previous publication. Particularly, the biosynthetic mechanism was deciphered through heterologous expression of anthraquinone biosynthesis (ant) genes in E. coli. Additionally, deactivation of the genes antG encoding a putative CoA ligase and antI encoding a putative hydrolase, was performed in P. luminescens. Selected ant genes were over-expressed in E. coli as well as the corresponding proteins purified for in vitro assays. Model compounds were chemically synthesized as possible substrates of AntI and were used for in vitro assays. Here, it was revealed that the CoA ligase AntG played an essential role in the activation of the ACP AntF. Furthermore, a chain shortening mechanism by the hydrolase AntI was identified and was further confirmed by in vitro assays using model compounds. Additionally, this chain shortening mechanism was supported by homology based structural modeling of AntI.
Philosophy is essentially dialectical. One gets into a dialectic by a puzzle, an aporia in thought and understanding. The point of philosophizing is not (necessarily) to get hold of the ultimate, objective, and immutably correct answers. The point is rather to come to be able to see one’s way out of the aporia, and to understand how one got into it in the first place.
The essay that follows – which I am submitting as my dissertation – is dialectical in two senses. As a piece of philosophizing, the essay is guided by a problem, the problem of understanding how laws of nature are possible, and how it is possible for us to know them. The movement of thought generated by attempts to get out of the problem then yields some ideas that do not stay in the original context in which the problem was felt to exist. Two important ones are, first, perceptual experience is not the only ultimate source of warrant we have for empirical knowledge claims, and second, perceptual experience is not the only epistemically significant experience we can have. Both are consequences of the idea that the mastery of skills is a form of interaction with nature that provides epistemic warrant for nomological claims. I shall leave it to the epilogue to examine how this view of skills contrasts with the ways skills are ordinarily thought of in philosophy and the implication of it for empiricism.
The other sense in which the essay is dialectical is more interesting, and it has to do with the way in which I approach the problem that got me into started, namely, by paying special attention to the dialectic exchange between the realists and the antirealists about the laws of nature. Antirealism about the lawfulness of nature has experienced something like a post-Humean revival since the publication of van Fraassen’s The Scientific Image. Most, including me, have strong realist intuitions about nomological “connections” in nature. Philosophical positions that are strongly counterintuitive have mostly not ended well in history. So it becomes something of a puzzle why antirealism about laws of nature manages to enjoy popularity every now and then.
Slack (sequence like a Ca2+ -activated K + channel; also termed Slo2.2, Kcnt1, or KNa 1.1) is a Na+ -activated K + channel that is highly expressed in the peripheral and central nervous system. Previous studies have shown that Slack is enriched in the isolectin B4binding, non-peptidergic subpopulation of C-fiber sensory neurons and that Slack controls the sensory input in neuropathic pain. Recent single-cell RNA-sequencing studies suggested that Slack is highly co-expressed with transient receptor potential (TRP) ankyrin 1 (TRPA1) in sensory neurons. By using in situ hybridization and immunostaining we confirmed that Slack is highly co-localized with TRPA1 in sensory neurons, but only to a minor extent with TRP vanilloid 1. Mice lacking Slack globally or conditionally in sensory neurons (SNS-Slack─/─ ), but not mice lacking Slack conditionally in neurons of the spinal dorsal horn (Lbx1-Slack─/─ ), displayed increased pain behavior after intraplantar injection of the TRPA1 activator allyl isothiocyanate. Patch-clamp recordings with cultured primary neurons and in a HEK-293 cell line transfected with TRPA1 and Slack revealed that Slack-dependent K + currents are modulated in a TRPA1-dependent manner. Taken together, these findings highlight Slack as a modulator of TRPA1-mediated activation of sensory neurons.
Furthermore, we investigated the contribution of Slack in the spinal dorsal horn to pain processing. Lbx1-Slack ─/─ mice demonstrated normal basal pain sensitivity and Complete Freund’s Adjuvant-induced inflammatory pain. Interestingly, we observed a significantly increased spared nerve injury (SNI)-induced neuropathic pain hypersensitivity in Lbx1-Slack ─/─ mutants compared to control littermates. Moreover, we tested the effects of pharmacological Slack activation in the SNI model. Systemic and intrathecal, but not intraplantar administration of the Slack opener loxapine significantly alleviated SNI-induced hypersensitivity in control mice, but only slightly in Lbx1Slack ─/─ mice, further supporting the inhibitory function of Slack in spinal dorsal horn neurons in neuropathic pain processing.
Altogether, our data suggest that Slack in sensory neurons controls TRPA1-induced pain, whereas Slack in spinal dorsal horn neurons inhibits peripheral nerve injury induced neuropathic pain. These data provide further insights into the molecular mechanisms of pain sensation.
The Na+/proline transporter of E. Coli (PutP) is responsible for the uptake of proline which is subsequently used not only as a carbon and nitrogen source and a constituent of proteins but also as a particularly effective osmoprotectant. However, for a long time there was little known about the single steps in the reaction cycle of this transporter and only few details about its structure-function relationship are available. Aim of the present work was to achieve a deeper understanding about the kinetic properties of the Na+/proline transporter and to get insights into the structure-function relationship of the substrate binding. To answer these questions different techniques were used. By using the novel SSM technique combining the preparation of PutP proteoliposomes it was possible to demonstrate for the first time the electrogenic substrate binding to PutP transporter. Due to rapid solution exchange measurements on the SSM it was additionally possible to obtain time resolved information about the kinetic details of the cytoplasmic substrate binding sites which were not available by previous steady state and equilibrium binding measurements. Pre-steady-state charge translocation was observed after rapid addition of one or both of the cosubstrates Na+ and/or proline to the PutP-WT proteoliposomes adsorbed on the SSM. Thereby it was possible to link the observed electrical signals with the binding activity of PutP. The observed Na+ and/or proline induced charge displacement were assigned to an electrogenic Na+ and/or proline binding process at the cytoplasmic face of the enzyme with a rate constant of k > 50 s-1 proceeding the rate limiting step of the reaction cycle. Furthermore, based on the kinetic analysis of the electrical signals obtained from the measurements of PutP on SSM, the following characteristics of the substrates binding in PutP were deduced: (1) both Na+ and proline can bind individually to the transporter. Under physiological conditions, an ordered binding mechanism prevails; while at sufficiently high concentrations, each substrate can bind in the absence of the other; (2) substrate binding is electrogenic not only for Na+, but also for the uncharged cosubstrate proline. The charge displacement associated with Na+ binding and proline binding is of comparable size and independent of the presence of the respective cosubstrate. In addition, it was concluded that Na+ accesses its binding site through a high-field access channel resulting in a charge translocation, whereas the binding of the electroneutral proline induces a conformation alteration involving the displacement of charged amino acid residue(s) of the protein; (3) Na+ and proline binding sites interact cooperatively with each other by increasing the affinity and/or the speed of binding of the respective cosubstrate; (4) proline binding proceeds in a two step process: low affinity (~ 0.9 mM) electroneutral substrate binding followed by a nearly irreversible electrogenic conformational transition; (5) membrane impermeable PCMBS inhibits both Na+ and proline binding to the inside-out orientated PutP transporter, indicating that rather than selectively blocking a specific binding site, PCMBS probably locks the enzyme in an inactive state. The possible targets for this SH-reagent are cysteines 281 and 344 located close to the cytoplasmic surface of the protein. Beyond it, transient electrical currents of PutP were also observed on the BLM after rapid addition of proline in the presence of Na+. This was possible by combining the conventional BLM technique with high-speed flash-photolysis of caged-proline. Indeed the signals on the BLM indicate the detection of a different underlying reaction process in comparison to the data achieved by the SSM technique. This has paved the way for supplemental information about the reaction cycle since it was possible to assign the flash-photolysis BLM signals to the proline binding step followed by the internalization of Na+ and proline into the liposome. Thereby it was found, that the presence of Na+ is indispensable and the time constant for the process is ~ 63 ms. Moreover, structure-function information about the Na+ and proline binding sites of PutP was obtained by investigating the functionally important amino acid residues Asp55, Gly63 and Asp187 with site-directed mutagenesis and the combined SSM technique. One finding is that the mutated proteins PutP-D55C and PutP-G63C showed no activity on the SSM. Therefore, it can be assumed that either both Asp55 and Gly63 are crucial for the structure of PutP protein, or they are located at or close to the Na+ and proline binding sites. Furthermore, the results obtained from PutP-D187N and PutP-D187C mutants on SSM suggest that Asp187 of PutP is likely to be involved in the Na+ binding at the cytoplasmic side of the backward running carrier. Taken together the results of the present work have substantially broadened the known picture of the Na+/proline transporter PutP thereby several steps of the reaction cycle were elucidated, and moreover, valuable insights into the structure-function relationship of the transporter have become available.
Der Schwerpunkt der vorliegenden Arbeit lag in der Synthese und strukturellen Charakterisierung von sandwichartig aufgebauten kupferhaltigen Organosiloxanen. Diese sollten nach Möglichkeit kristalline Eigenschaften aufweisen und ein interessantes magnetisches Verhalten zeigen. Es galt, die Beziehungen zwischen molekularer Struktur und magnetischen Eigenschaften herauszuarbeiten, um auf der Basis experimenteller Daten dem maßgeschneiderten Design neuer molekularer Magnete näher zu kommen. .... Die in der hier vorgelegten Arbeit erzielten Ergebnisse belegen, dass der Weg zur gezielten Erzeugung molekularer Magnete erfolgreich beschritten wurde. Es wird weiteren Arbeiten vorbehalten bleiben, Cluster der nun vorliegenden Art chemisch so zu verknüpfen, dass daraus polymere Ketten oder Netzwerke entstehen. Deren magnetisches Verhalten lässt erwarten, dass damit möglicherweise neue Materialien zugänglich werden, die dem Anspruch eines molekularen Magneten voll gerecht werden.
Clinical application of transcranial Doppler for detection of cerebral emboli during cardiac surgery
(2010)
Objective: Neurologic injury is one of the most damaging complications for cardiac surgery. How to decrease neurologic impairment by improving perioperative monitoring remains a challenge for both cardiac surgeons and anesthetists. For this reason, transcranial doppler (TCD) has been widely used in cerebral monitoring during cardiac surgery. In this study, two experiments of clinical application of TCD for detection of cerebral emboli during cardiac surgery were to be done. One was “Solid and gaseous cerebral emboli during valvular surgery are significantly reduced with axillary artery cannulation”. The other was “Do intraoperative cerebral embolic signals differ between valvular surgery (VS) and CABG”. Methods: In experiment one, 20 valve and combined procedures with aortic cannulation (AoC group) were compared to 18 procedures with axillary cannulation (AxC group) in a prospective non-randomized study. In experiment two, 18 VS patients and 18 CABG patients were matched by extracorporeal circulation (ECC) time retrospectively. Intraoperative monitoring of both middle cerebral arteries was performed with TCD discriminating between solid and gaseous embolic signals (ES). Results: In experiment one, the AxC group had less solid ES than the AoC group (38±22 vs 55±25, P<0.05), but no significant difference was found in gaseous (501±271 vs 538±333, P>0.05) and total (539 ± 279 vs 593 ± 350, P>0.05) ES. The AxC group had less solid ES during arterial cannulation (2.1±1.5 vs 6.6±3.6, P<0.05) and during aortic cross-clamp time (4.4 ±3.1 vs 10.2 ± 5.1, P<0.05) than the AoC group. During ECC, gaseous ES was not significantly different between groups (398±210 vs 448±291, P>0.05). However, AxC showed less gaseous ES (85±68 vs 187±148, P<0.05) and less gaseous ES per minute (1.8±1.5 vs 4.5±3.2, P<0.05) during weaning off extracorporeal circulation than the AoC group. No significant difference in gaseous ES (313±163 vs 261±189, P>0.05) and gaseous ES per minute (3.1±2.2 vs 2.8±2.2, P>0.05) was found between groups from bypass start to aortic declamping. No neurologic complications occurred. In experiment two, no significant difference was found in solid (38±20 vs 40±26, P>0.05) or gaseous (457±263 vs 412±157, P>0.05) ES between the VS and CABG group during the whole recording time. During ECC, solid ES (20±10 vs 24±19, P>0.05) and gaseous ES (368±230 vs 317±157, P>0.05) were comparable between groups. Specifically, during weaning off ECC, the VS group had more gaseous ES/min (5.6±3.6 vs 3.1±1.2, P<0.05) than the CABG group. But this difference in gaseous ES/min was not significant during the period from bypass start to aortic declamping (2.5±1.8 vs 3.0±1.8, P>0.05). Conclusion: Cerebral embolization does occur during cardiac surgery. Through these two experiments, we demonstrated the feasibility and importance of clinical application of transcranial doppler for detection of cerebral emboli during cardiac surgery. Due to the diversity in clinical application of TCD, it is impossible to compare the number of ES between different research centers. More unified standards should be drawn in order to make wider clinical application possible. Up till now, no robust evidence shows the correlation between intraoperative ES and postoperative neurological impairment. The research on intraoperative ES and postoperative neurological impairment should rely on a complete concept.
Unlimited self-renewal is an absolute prerequisite for any malignancy, and is the ultimate arbiter of the continuous growth and metastasis of tumors. It has been suggested that the self-renewal properties of a tumor are exclusively contained within a small population, i.e., the so-called cancer stem cells. Enhanced self-renewal potential plays a pivotal role in the development of leukemia. My data have shown that APL associated translocation products PML/RARalpha and PLZF/RARalpha increased the replating efficiency of mouse lin-/Sca1+ hematopoietic stem cells (HSCs). This effect is partly mediated by induction of gamma–catenin which is an important mediator of the Wnt signaling pathway and has been shown to be up regulated by the AML associated translocation products(AATPs). Suppression of gamma–catenin by siRNA can abrogate the increased replating efficiency induced by AATPs. Transduction of gamma–catenin in lin-/Sca1+ HSCs led to increased replating efficiency and the expression of stem cell markers Sca1 and c-kit. Additionally it induced accelerated cell cycle progression of mouse bone marrow HSCs. Transduction/transplantation mouse models have shown that ectopic expression of gamma–catenin in HSCs led to acute myeloid leukemia without maturation. These data suggest important roles of Wnt signaling pathway in the leukemogenesis induced by PML/RARalpha, PLZF/RARalpha and AML1/ETO. In contrast to AATPs, CML and Ph+-ALL associated translocation products p185(BCR-ABL) and p210(BCR-ABL) did not affect the self-renewal potential of hematopoietic stem/progenitor cells. However my studies indicated that their reciprocal translocation products p40(ABL/BCR) and p96(ABL/BCR) actually increased the replating efficiency of hematopoietic stem/progenitor cells. The effect is stronger when induced by p96(ABL/BCR) than by p40(ABL/BCR). It is very intriguing that p96(ABL/BCR) can activate Wnt signaling and up regulate the expression of HoxB4. Transduction/transplantation mouse model has shown that p40(ABL/BCR) and p96(ABL/BCR) both have their own leukemogenic potential. Given the fact that leukemic stem cells maintain the growth of tumor and are the origin of relapse, the cure of leukemia is dependent on the eradication of the leukemic stem cell and abrogation of aberrantly regulated self-renewal capability. Both t-RA and As2O3 have been shown to induce complete remission in APL patients with PML/RARalpha translocation product. However, t-RA as a single agent achieves completeremission (CR) but not complete molecular remissions (CMR). Therefore, virtually all patients will experience a relapse within a few months. In contrast to t-RA, As2O3 as a single agent is able to induce CR as well as CMR followed by long-term relapse-free survival in about 50% of APL patients even if relapsed after treatment with t-RA-containing chemotherapy regimens. Nothing is known about the mechanisms leading to the complete different clinical outcomes by the two compounds although both have been shown to induce differentiation of blast cells, proliferation arrest, induction of apoptosis and degradation of PML/RARalpha. We investigated the effect of t-RA and arsenic on PML/RARalpha-expressing cell population with stem cell capacity derived from the APL cell line NB4 as well as Sca1+/lin- murine bone marrow cells. We found that t-RA did not reduce the replating efficiency in PML/RARalpha- and PLZF/RARalpha-infected Sca1+/lincells whereas it selected small compact colonies representing very early progenitor cells. T-RA was unable to reduce the capacity to form colony forming units-spleen (CFU-S) of Sca1+/lin-cells expressing PML/RARalpha, additionally t-RA did not impair the capability of engraftment of NB4 cells in NOD/SCID mouse. On the contrary to t-RA, As2O3 abolished the aberrant self-renewal potential of Sca1+/lin- cells expressing PML/RARalpha. As2O3 not only abolished the replating efficiency of PML/RARalpha positive cells but also completely abrogated the ability of PML/RARalpha-positive HSC to produce CFU-S in vivo. On the contrary to As2O3, t-RA increased the absolute cell number and the percentage of cells in the side population with respect to the whole cell population in NB4 cells. Taken together these data suggest that arsenic but not all-trans retinoic acid overcomes the aberrant stem cell capacity of PML/RARalpha positive leukemic stem cells. My data prove for the first time that there is a direct relationship between the capacity of compounds to effectively target the LSC and their capacity to eradicate the leukemia, and, thereby, to induce complete molecular remission and long-term relapse-free survival. Thus, in order to increase the curative potential of leukemia therapies, future studies need to include the effect of given compounds on the stem cell compartment to determine their ability to eradicate the LSC.
The application of natural products (NPs) as drugs and lead compounds has greatly improved human health over the past few decades. Despite their success, we still need to find new NPs that can be used as drugs to combat increasing drug resistance via new modes of action and to develop safer treatments with less side effects.
Entomopathogenic bacteria of Xenorhabdus and Photorhabdus that live in mutualistic symbiosis with nematodes are considered as promising producers of NPs, since more than 6.5% of their genomes are assigned to biosynthetic gene clusters (BGCs) responsible for production of secondary metabolites. The investigation on NPs from Xenorhabdus and Photorhabdus can not only provide new compounds for drug discovery but also help to understand the biochemical basis involved in mutualistic and pathogenic symbiosis of bacteria, nematode host and insect prey.
Nonribosomal peptides (NRPs) are a large class of NPs that are mainly found in bacteria and fungi. They are biosynthesized by nonribosomal peptide synthetases (NRPSs) and display diverse functions, representing more than 20 clinically used drugs. Although a large number of NRPs have been identified in Xenorhabdus and Photorhabdus, the advanced genome sequencing and bioinformatic analysis indicate that these bacteria still have many unknown NRPS-encoding gene clusters for NRP production that are worth to explore. Therefore, this thesis focuses on the discovery, biosynthesis, structure identification, and biological functions of new NRPs from Xenorhabdus and Photorhabdus.
The first publication describes the isolation and structure elucidation of seven new rhabdopeptide/xenortide-like peptides (RXPs) from X. innexi, incorporating putrescine or ammonia as the C-terminal amines. Bioactivity testing of these RXPs revealed potent antiprotozoal activity against the causative agents of sleeping sickness (Trypanosoma brucei rhodesiense) and malaria (Plasmodium falciparum), making them the most active RXP derivatives known to date. Biosynthetically, the initial NRPS module InxA might act iteratively with a flexible methyltransferase activity to catalyze the incorporation of the first five or six N-methylvaline/valine to these peptides.
The second publication focuses on the structure elucidation of seven unusual methionine-containing RXPs that were found as minor products in E. coli carrying the BGC kj12ABC from Xenorhabdus KJ12.1. To confirm the proposed structures from detailed HPLC-MS analysis, a solid-phase peptide synthesis (SPPS) method was developed for the synthesis of these partially methylated RXPs. These RXPs also exhibited good effects against T. brucei rhodesiense and P. falciparum, suggesting RXPs might play a role in protecting insect cadaver from soil-living protozoa to support the symbiosis with nematodes.
The third publication presents the identification of a new peptide library, named photohexapeptide library, which occurred after the biosynthetic gene phpS was activated in P. asymbiotica PB68.1 via promoter exchange. The chemical diversity of the photohexapeptides results from unusual promiscuous specificity of five out of six adenylation (A) domains being an excellent example of how to create compound libraries in nature. Furthermore, photohexapeptides enrich the family of the rare linear D-/L-peptide NPs.
The fourth publication concentrates on the structure elucidation of a new cyclohexapeptide, termed photoditritide, which was produced by P. temperata Meg1 after the biosynthetic gene pdtS was activated via promoter exchange. Photoditritide so far is the only example of a peptide from entomopathogenic bacteria that contains the uncommon amino acid homoarginine. The potent antimicrobial activity of photoditritide against Micrococcus luteus implies that photoditritide can protect the insect cadaver from food competitor bacteria in the complex life cycle of nematode and bacteria.
The last publication reports a new family of cyclic lipopeptides (CLPs), named phototemtides, which were obtained after the BGC pttABC from P. temperata Meg1 was heterologously expressed in E. coli. The gene pttA encodes an MbtH protein that was required for the biosynthesis of phototemtides in E. coli. To determine the absolute configurations of the hydroxy fatty acids, a total synthesis of the major compound phototemtide A was performed. Although the antimalarial activity of phototemtide A is only weak, it might be a starting point towards a selective P. falciparum compound, as it shows no activity against any other tested organisms.
The transporter associated with antigen processing-like (TAPL) acts as a lysosomal ATP-dependent polypeptide transporter with broad length selectivity. To characterize in detail its substrate specificity, a procedure for solubilization, purification and functional reconstitution of human TAPL was developed. TAPL was expressed in Sf9 insect cells with the baculovirus expression system and solubilized from crude membranes. By intensive screening of detergents, the mild non-ionic detergents digitonin and dodecylmaltoside were found to be ideal for solubilization with respect to efficiency, long term stability, and functionality of TAPL. TAPL was isolated in a two-step procedure with a yield of 500 micro g/L cell culture and, subsequently, reconstituted into proteoliposomes. The KM(pep) for the peptide RRYCfKSTEL (f refers to fluorescence label) and KM(ATP) were determined to be 10.5 ± 2.3 micro M and 97.6 ± 27.5 micro M, respectively, which are in the same range as the Michaelis-Menten constants determined in the membranes. The peptide transport activity of the reconstituted TAPL strongly depends on the lipid composition. Interestingly, the E. coli lipids are prefered over other tested natural lipids extracts. Moreover, phosphatidylcholine, the most abundant phospholipid in eukaryotic cells influenced TAPL activity in a dose dependent manner. In addition, some negatively charged lipids like DOPA and DOPS increased peptide transport activity with preference for DOPS. However, DOPE or egg PG which are also negatively charged had no effect. It seems not only the charge but also the specific head group of phospholipids that has impact on the function of TAPL. With the help of combinatorial peptide libraries containing D-amino acid residues at defined positions as well as bulky fluorescein labeled peptides, the key positions of the peptides were localized to the N- and C-terminal residues with respect to peptide transport. The C-terminal position has the strongest selectivity since modification at this position shows strongest impact on peptide transport. Additionally, positions 2 and 3 of the peptide also have weak influence on peptide selectivity. Subsequently, the residue preferences at the key positions were systematically investigated by combinatorial peptide libraries with defined residues at certain positions. At both ends, TAPL favors positively charged, aromatic, or hydrophobic residues and disfavors negatively charged residues as well as asparagine and methionine. The residue preferences at the key positions are valid for peptide substrates with different length, indicating a general rule for TAPL selectivity. Besides specific interactions of both terminal residues, electrostatic interactions are important, since peptides with positive net charge are more efficiently transported than negatively charged ones. By size exclusion chromatography (SEC) and blue native PAGE, TAPL purified in the presence of digitonin or dodecylmaltoside had an apparent molecular weight of 200 kDa which is close to the theoretical molecular mass of the TAPL homodimer (172 kDa). The purified and reconstituted TAPL showed specific ATP hydrolysis activity which can be inhibited by orthovanadate. TAPL in proteoliposomes showed 6-fold higher ATP hydrolysis than digitonin solubilized protein, indicating the phospholipids impact on TAPL function. However, no peptide substrate stimulated ATPase activity was observed. For site-specific labeling of TAPL, eight cysteines in each half transporter were replaced by alanine or valine. The TAPL cys-less mutant showed the same peptide transport activity as TAPL wt. Based on the functional TAPL cys-less mutant, seven single cysteine mutants were introduced into strategic positions. All single cysteine mutants in the TMD did not influence peptide transport, whereas the mutant L701C, which is close to the conserved H-loop motif, displayed impaired transport. TAPL orthologs Haf-4 and Haf-9 from Caenorhabditis elegans possess around 40% sequence identities with TAPL and 50% with each other. Both proteins are putative half transporters and reported to be involved in the intestinal granule formation (Bauer, 2006; Kawai et al., 2009). To further understand the physiological functions of these two proteins, they were expressed in Sf9 insect cells. Haf-4 and Haf-9 showed weak but specific ATP- and peptide-dependent peptide transport activity for the given peptide RRYCfKSTEL. Therefore, it was proposed that the physiological roles for Haf-4 and Haf-9 might be related to their peptide transport activity. Besides forming functional homodimeric complex as estimated by the peptide transport activities, both half transporter could also form heteromers which was confirmed by coimmunoprecipitation. However, the heteromers showed decreased transport activity.
Trace elemental concentrations of bivalve shells content a wealthy of environmental and climatic information of the past, and therefore the studies of trace elemental distributions in bivalve shells gained increasing interest lately. However, after more than half century of research, most of the trace elemental variations are still not well understood and trace elemental proxies are far from being routinely applicable. This dissertation focuses on a better understanding of the trace elemental chemistry of Arctica islandica shells from Iceland, and paving the way for the application of the trace elemental proxies to reconstruct the environmental and climatic changes. Traits of trace elemental concentrations on A. islandica shells were explored and evaluated. Then based the geochemical traits of the shells, four non-environmental/climatic controlling is indentified. (1) Trace elemental concentrations of bivalve shells are effected by early diagenesis by the leach or exchange of elemental ions, especially in shell tip part, even with the protection of periostrucum; (2) The analytical methods also affect the results of trace elemental concentrations, especially for the element, such as Mg, which is highly enriched in organic matrices; (3) Shell organic matrices are found play a dominating role on the concentration of trace elements on A. islandica shells. Most trace elements only occurred in insoluble organic matrices (IOM), although others are only found in the carbonate fraction. IOM of A. islandica shells is significantly enriched in Mg, while Li and Na are more deplete in IOM, but enriched in shell carbonate. Ba is more or less even contented in IOM and shell carbonate. The concentrations of certain elements vary between primary layer and secondary layer; (4) The vital /physiological controlling on trace elemental distributions of bivalve shells is also confirmed. Six elemental (B, Na, Mg, Mn, Sr, and Ba) concentrations show significant correlation (exponential functions) with ontogenetic age and shell grow rates (logarithmic equations). It is worthy to remark that B, Mg, Sr and Ba concentrations are negatively correlated with shell growth rate, positive with ontogenetic age, while the concentrations of Na and Mn show the opposite trends. At last, all the controlling described above can be taken into account and corrected to extract the environmental and climatic signal by a kind of standardization. The derived six exponential functions of the high correlations between six trace elemental concentrations and ontogenetic year are applied to make the standardization of these element-Ca ratios. The gotten standardized indices are compared with the variations of environmental and climatic parameters in this region, and many correlations are found. Standardized indices of Sr/Ca ratios are strongly related to the sun spot number, autumn NAO, autumn Europe surface air temperature (SAT) and Arctic sea surface temperature anomaly (TA), and those of Mg/Ca ratios are strongly associated with Arctic TA, Europe SAT and Solar variation (irradiance). The variations of autumn Europe SAT demonstrated more similarity with standardized indices of B/Ca than other parameters. Except for the SAT index of Arctic, the standardized indices of Na/Ca showed no distinct relation to temperature. European precipitation and the Arctic sea level pressure index compared well the Na/Ca ratios of the shells, and so did the autumn NAO. Standardized indices of Mn/Ca were correlated with the number of hurricanes in the North Atlantic, Northern Europe SAT and sun spot number.
Over the last decade, cryo-EM has developed exponentially due to improvements in both hardware (“machine”-based) and software (“algorithm”-based). These improvements have pushed the best achievable resolutions closer to atomic level, bridging “gaps” not covered by other biophysical techniques, and allowing more difficult biological questions to be addressed. Thus, this PhD project was designed and constructed to apply cryo-EM to answer biological questions, while allowing simultaneous cryo-EM method development.
The biological focus of this research is pentameric ligand-gated ion channels (pLGICs), specifically the serotonin receptor type-3 receptor (5HT3R), which also belongs to the Cys-loop receptor family. 5HT3R plays an important role in fast synaptic signal transduction in response to agonist and antagonist binding. Binding to its native ligand results in opening of the channel at the transmembrane domain, allowing cations to pass through, resulting in membrane depolarization and conversion of the chemical signal into an electrical one.
This work consisted mainly of two specific aims. One was focused on conformational investigation of 5HT3R in its ligand-bound open conformation, using cryo-electron microscopy (cryo-SPA), in order to understand the gating mechanism upon ligand activation. The other one was to combine SPA with cryo-ET and STA to push the resolution limitation of conventional cryo-ET and STA workflows.
In the end, three different cryo-EM conformations of membrane-embedded 5HT3R were resolved using cryo-SPA, two structures in resting closed forms, one C5-symmetric and one C1-asymmetric, and one serotonin-bound open form. These three structures presented a number of novel features related to the transition of the receptor to its ion-conductive state. Specifically, the serotonin-bound receptor shows asymmetric opening, which was speculated to occur via an intermediate asymmetric Apo state. In addition to the cryo-SPA work, application of cryo-ET and STA to the study of 5HT3R in native vesicles is described in this thesis. Additional work on methods development, focused on combining SPA and STA techniques, along with preliminary results on tobacco mosaic virus are also detailed and discussed.
Moreover, previously unreported asymmetric arrangements of the subunits of the homopentameric 5HT3R around the pore axis were revealed. The asymmetric open state is stabilized by phospholipids inserted at the interface between subunits, at a site well-documented for the binding of allosteric pLGIC modulators. These results not only give structural support to a large body of functional data on the effects of lipids on the function of this receptor family, but also provide structural guidance for future studies in this field. Meanwhile, the SPA-STA combined methods developed during the course of this work have the potential to help resolve higher resolution tomography-based structures, which would benefit researchers seeking to do in-situ-based structural studies.
The venture capital industry holds relevance for entrepreneurs looking for money to finance an innovative project, investors seeking to make money by investing in entrepreneurial firms and governments trying to promote innovation and entrepreneurship. Venture capital investment could facilitate innovation and thus a better economy.
Venture capital has enabled the U.S. to support its entrepreneurial talent by turning ideas into world-famous products and services, building companies from mere business plans to mature and powerful organizations. Three of the five largest U.S. public companies by market capitalization – Apple, Google and Microsoft – received most of their early external funding from venture capital. Having its ups and downs, venture capital investment in the U.S. expanded from virtually zero in the mid-1970s to $8 billion in 1995 and $49.3 billion in 2014. Venture backed companies have been a prime driver of economic growth in the U.S.Across the pacific, venture capital investment in China has grown out of the transition from a centrally planned economy to a free market economy over the past three decades, becoming an important pillar supporting China’s innovation system. In 2015, a total of 2,824 venture capital investment deals provided an aggregate investment of $36.9 billion. Venture capital has long been a hot topic in China’s capital market, particularly since the government decided to boost “mass entrepreneurship and innovation” in 2014.
In the U.S., most venture capital firms are organized as limited partnerships, with the venture capitalists being general partners and the investors limited partners. Studies have shown that investors choose to invest through venture funds as an intermediary rather than placing their investments directly with the entrepreneurs; because of the high risk nature of the entrepreneur’s business, it is hard for them to get bank loans or direct equity investments. Conflicts may also arise, however, between the venture capitalists acting as agents and the investors as principals.5 This agency problem maybe particularly severe, since venture capital provides money for businesses with high potential and high risk, although the limited partnership has certain merits and is still most commonly chosen as the business form for venture capital funds.6 At the same time, the fact that general partners have total control of the partnership business necessitates that the agency problem is addressed by legal rules, contracts and other mechanisms.
Meanwhile, despite the rapid growth of venture capital investments in China, little attention has been paid to the organizational form of venture capital funds. In contrast to the U.S., most Chinese venture funds have been structured as corporations. One may argue that it was due to legislative reasons: that the limited partnership was not recognized by Chinese law when venture capital first appeared in China. However, after adopted a chapter was adopted in the Partnership Enterprise Law (PEL) governing limited partnerships in 2007, most of the venture funds abided by their choice, while those opting for the limited partnership have encountered difficulties: the limited partners are having trouble trusting the general partners with their money and are therefore interfering with the operation of the partnership business, which may lead to dissolution of the partnership.
This thesis applies transaction cost theory to explain the benefits and costs of choosing the limited partnership as a business form in the special context of venture capital investments, showing that the potential agency conflict between the general partners and the limited partners have been mitigated by legal and other mechanismsin the United States, and that the U.S. investors could therefore exploit the merit of the limited partnership form in venture capital financing. In China, investors have different answers to the agency problem. Similarly to the situation in the U.S., Chinese partners also employ contract terms to deal with agency problems, and the legislators enact laws that aim at regulating the limited partnership form; some legislation was even transplanted from the U.S., such as that part of the PEL which governs limited partnerships. It seems, then, that similar mechanisms that deal with agency problems also exist in China. However, given the unique history of the development of China’s innovation system and venture capital market, the effectiveness of these constraints is questionable. Chinese venture capital investors have therefore characteristically behaved differently to U.S. investors. Rather than relying on these questionable mechanisms, Chinese investors as well as the Chinese government have developed different approaches to addressing these agency problems.
In this thesis I use effective models to investigate the properties of QCD-like theories at nonzero temperature and baryon chemical potential. First I construct a PNJL model using a lattice spin model with nearestneighbor interactions for the gauge sector and four-fermion interactions for the quarks in (pseudo)real representations of the gauge group. Calculating the phase diagram in the plane of temperature and quark chemical potential in QCD with adjoint quarks, it is qualitatively confirmed that the critical temperature of the chiral phase transition is much higher than the deconfinement transition temperature. At a chemical potential equal to half of the diquark mass in the vacuum, a diquark Bose–Einstein condensation (BEC) phase transition occurs. In the two-color case, a Ginzburg–Landau expansion is used to study the tetracritical behavior around the intersection point of the deconfinement and BEC transition lines which are both of second order. A compact expression for the expectation value of the Polyakov loop in an arbitrary representation of the gauge group is obtained for any number of colors, which allows us to study Casimir scaling at both nonzero temperature and chemical potential. Subsequently I study the thermodynamics of two-color QCD (QC2D) at high temperature and/or density using ZQCD, a dimensionally reduced superrenormalizable effective theory, formulated in terms of a coarse grained Wilson line. In the absence of quarks, the theory is required to respect the Z2 center symmetry, while the effects of quarks of arbitrary masses and chemical potentials are introduced via soft Z2 breaking operators. Perturbative matching of the effective theory parameters to the full theory is carried out explicitly, and it is argued how the new theory can be used to explore the phase diagram of two-color QCD.
This dissertation consists of three essays, which study the implication of financial frictions in business cycles and monetary policy making. The first essay develops a Dynamic Stochastic General Equilibrium (DSGE) model to study how the instability of the banking sector can amplify and propagate business cycles. Model simulations show that in an economic down turn, in addition to credit demand contraction induced by low firm net worth, low bank capital
position can create strong credit supply contraction, and have a quantitatively significant effect on business cycle dynamics. The second essay studies the optimal Taylor-type monetary policy rules based on the model developed in the first chapter and find that with interest rate smoothing, 'leaning against the wind' can significantly dampen the procyclicality of financial distortions, and increase the welfare of the economy. The third chapter examines the role of households frugality in a financial crisis and finds that higher savings by more frugal households provide an important cushion for the fall in private investment funding.
In the present study the cryo-immunogold technique was used and optimized for investigating the ultrastructure and immunolabeling of synaptic proteins. It is evidently a suitable method for the localization of membrane proteins since the antigens are not treated with any chemical denaturation before immunolabeling except for the fixation and since the antigens are directly exposed to the surface of the cryo-ultrasections. The v-SNARE VAMP II and the vesicle-associated proteins SV2 and Rab3A were detected extensively at small vesicles in the mossy fiber terminals. The t-SNARE SNAP-25, and N-type and P/Q type Ca2+ channels were allocated to the plasma membrane both at the active zone and outside the active zone. SNAP-25 and N-type Ca2+ channels appeared also at synaptic vesicles. A significantly increased immunolabeling of VAMP II, SV2, Rab3A, SNAP-25 and N-type Ca2+ channels was found at the active zones of fast synapses, indicating a concentration of these proteins at sites of exocytosis. The widespread distribution of the t-SNARE SNAP-25 at the axonal plasma membrane reveals that membrane-targeting specificity cannot be determined solely by v/t-SNARE interactions. Additional control components are required to assure the docking and exocytosis of the synaptic vesicles at active zones. The novel protein Bassoon was only found at active zones of central synapses and showed the highest specific labeling among all proteins investigated. Its labeling pattern implies an association of Bassoon with the presynaptic dense projections, the structural guide for vesicle exocytosis. The involvement of Bassoon in the organization of the neurotransmitter release site suggests that Bassoon may play an important role in determining the specificity of vesicle docking and fusion. In the neurosecretory endings of neurohypophysis the synaptic proteins VAMP II, SNAP- 25, SV2, Rab3A, and the N-type Ca2+ channels showed a preferential labeling over microvesicles. Moreover, the immunolabeling intensity of these proteins over microvesicles corresponded closely to that over synaptic vesicles. This suggests that these synaptic proteins share an identical association with synaptic vesicle and microvesicles. A significant labeling of SNAP-25, the N-type Ca2+ channels and VAMP II was also detected at the plasma membrane near the clustered microvesicles, indicating the competence of microvesicles for docking and exocytosis along the plasma membrane in the absence of active zones. No significant labeling of VAMP II, SNAP-25, SV2 and N-type Ca2+ channel was observed at the membrane of neurosecretory granules. This is in agreement with the notion that synaptic vesicles and microvesicles possess regulatory mechanisms for exocytosis different from those of granules. In contrast, a/ß-SNAP and NSF were found on the granules, and Rab3A and the P/Q-type Ca2+ channels on granules in a subset of terminals. Rab3A is associated specifically with the oxytocin-containing granule population. Interestingly, some plasma membrane proteins, such as SNAP-25 and even N-type Ca2+ channels and P/Q-type Ca2+ channels, were observed not only at the plasma membrane but also at the vesicular organelles. This suggests that these vesicular organelles may be involved in transporting newly synthesized proteins from the soma to the plasma membrane of the terminal. Furthermore, the vesicular pool of the Ca2+ channels may serve in the stimulationinduced translocation into the plasma membrane when required. Using the conventional preembedding method with Epon and the post-embedding method with LR Gold, VAMP II was localized at vesicular organelles of varying size and on horseradish peroxidase filled endocytic organelles in cultured astrocytes, with and without stimulation in the presence of the horseradish peroxidase. This indicates that VAMP II is involved in the cycle of vesicular exocytosis and endocytosis in astrocytes. U373 cells are capable of expressing all three members of the synaptic SNARE complex (v-SNARE VAMP II, t-SNARE syntaxin I and SNAP25). This indicates the competence of U373 to carry out regulated exocytosis by means of the classical SNARE mechanism. In addition, the ubiquitous v-SNARE cellubrevin and the endosome-associated small GTPbinding protein Rab5 could be expressed in U373 cells. All recombinant synaptic proteins investigated in U373 cells revealed a punctuate cellular distribution under the fluorescence microscope, suggesting that they are mainly associated with intracellular compartments. The cryo-electron microscopy provided direct evidence for the association of all expressed proteins with electron-lucent vesicular organelles. It further supports the potential of U373 MG cells to release low molecular weight messengers by a regulated exocytosis mechanism. In addition, myc-VAMP II was found on dispersed granules. Probably, VAMP II also participates in the exocytosis event of granules in U373 cells. Gold labeling for the two presumptive t-SNAREs syntaxin I and SNAP-25 in U373 cells was confined to the vesicular organelles. At the ultrastructural level no significant labeling was identified at the plasma membrane. The high level of colocalization of the two SNARE proteins VAMP II and syntaxin I in the cell body and in cell processes suggests that the two proteins are mostly sorted into identical vesicular organelles. A partial colocalization of VAMP II and cellubrevin as well as of VAMP II and Rab5 was observed under the fluorescence microscope. At the ultrastructural level, a colocalization of VAMP II and cellubrevin as well as of VAMP II and Rab5 was found on some clustered vesicles. The partial colocalization of VAMP II and cellubrevin implies that they similarly function as v-SNAREs. The partial colocalization of Rab5 with VAMP II in U373 cells suggests that the endosomal protein Rab5 is associated with VAMP II-containing organelles during some stages of their life cycle.
In the past sixty years, excessive water consumption and dam construction have significantly influenced natural flow regimes and surface freshwater ecosystems throughout China, and thus resulted in serious environmental problems. In order to balance the competing water demands between human and environment and provide knowledge on sustainable water management, assessments on anthropogenic flow alterations and their impacts on aquatic and riparian ecosystems in China are needed.
In this study, the first evaluation on quantitative relationships between anthropogenic flow alterations and ecological responses in eleven river basins and watersheds in China was performed based on the data that could be obtained from published case studies. Quantitative relationships between changes in average annual discharge, seasonal low flow and seasonal high flow and changes in ecological indicators (fish diversity, fish catch and vegetation cover, etc.) were analyzed. The results showed that changes in riparian vegetation cover as well as changes in fish diversity and fish catch were strongly correlated with the changes in flow magnitude (r = 0.77, 0.66), especially with changes in average annual river discharge. In addition, more than half of the variations in vegetation cover could be explained by changes in average annual river discharge (r² = 0.63) and roughly 50 % changes in fish catch in arid and semi-arid region and 60% changes of fish catch in humid region could be related to alterations in average annual river discharge (r² = 0.53, 0.58).
In a supplementary analysis of this study, the first estimation on quantitative relationships between decreases in native fish species richness and anthropogenic flow alterations in 34 river basins and sub-basins in China was conducted. Linear relationships between losses of native fish species and five ecologically relevant flow indicators were analyzed by single and multiple regression models. For the single regression analysis, significant linear relationships were detected for the indicators of long-term average annual discharge (ILTA) and statistical low flow Q90 (IQ90). For the multiple regressions, no indicator other than ILTA has significant relationships with changes in number of fish species mainly due to collinearity. Two conclusions emerged from the analysis: 1) losses of fish species were positively correlated with changes in ILTA in China and 2) indicator of ILTA was dominant over other flow indicators included in this research for the given dataset. These results provide a guideline for the sustainable water resources management in rivers with high risk of fish extinction in China.
This work presents a biochemical, functional and structural characterization of Aquifex aeolicus F1FO ATP synthase obtained using both a native form (AAF1FO) and a heterologous form (EAF1FO) of this enzyme.
F1FO ATP synthases catalyze the synthesis of ATP from ADP and inorganic phosphate driven by ion motive forces across the membrane and therefore play a key cellular function. Because of their central role in supporting life, F1FO ATP synthases are ubiquitous and have been remarkably conserved throughout evolution. For their biological importance, F1FO ATP synthases have been extensively studied for many decades and many of them were characterized from both a functional and a structural standpoint. However, important properties of ATP synthases – specifically properties pertaining to their membrane embedded subunits – have yet to be determined and no structures are available to date for the intact enzyme complex. Therefore, F1FO ATP synthases are still a major focus of research worldwide. Our research group had previously reported an initial characterization of AAF1FO and had indicated that this enzyme presents unique features, i.e. a bent central stalk and a putatively heterodimeric peripheral stalk. Based on such a characterization, this enzyme revealed promising for structural and functional studies on ATP synthases and became the focus of this doctoral thesis. Two different lines of research were followed in this work.
First, the characterization of AAF1FO was extended by bioinformatic, biochemical and enzymatic analyses. The work on AAF1FO led to the identification of a new detergent that maintains a higher homogeneity and integrity of the complex, namely the detergent trans-4-(trans-4’-propylcyclohexyl)cyclohexyl-α-D-maltoside (α-PCC). The characterization of AAF1FO in this new detergent showed that AAF1FO is a proton-dependent, not a sodium ion-dependent ATP synthase and that its ATP hydrolysis mechanism needs to be triggered and activated by high temperatures, possibly inducing a conformational switch in subunit γ. Moreover, this approach suggested that AAF1FO may present unusual features in its membrane subunits, i.e. short N-terminal segments in subunits a and c with implications for the membrane insertion mechanism of these subunits.
Investigating on these unique features of A. aeolicus F1FO ATP synthase could not be done using A. aeolicus cells, because these require a harsh and dangerous environment for growth and they are inaccessible to genetic manipulations. Therefore, a second approach was pursued, in which an expression system was created to produce the enzyme in the heterologous host E. coli. This second approach was experimentally challenging, because A. aeolicus F1FO ATP synthase is a 500-kDa multimeric membrane enzyme with a complicated and still not entirely determined stoichiometry and because its encoding genes are scattered throughout A. aeolicus genome, rather than being organized in one single operon. However, an artificial operon suitable for expression was created in this work and led to the successful production of an active and fully assembled form of Aquifex aeolicus F1FO ATP synthase. Such artificial operon was created using a stepwise approach, in which we expressed and studied first individual subunits, then subcomplexes, and finally the entire F1FO ATP synthase complex. We confirmed experimentally that subunits b1 and b2 form a heterodimeric subcomplex in the E. coli membranes, which is a unique case among ATP synthases of non-photosynthetic organisms. Moreover, we determined that the b1b2 subcomplex is sufficient to recruit the soluble F1 subcomplex to the membranes, without requiring the presence of the other membrane subunits a and c. The latter subunits can be produced in our expression system only when the whole ATP synthase is expressed, but not in isolation nor in the context of smaller FO subcomplexes. These observations led us to propose a novel mechanism for the assembly of ATP synthases, in which first the F1 subcomplex attaches to the membrane via subunit b1b2, and then cring and subunits a assemble to complete the FO subcomplex. Furthermore, we could purify the heterologous ATP synthase (EAF1FO) to homogeneity by chromatography and electro-elution. Enzymatic assays showed that the purified form of EAF1FO is as active as AAF1FO. Peptide mass fingerprinting showed that EAF1FO is composed of the same subunits as AAF1FO and all soluble and membrane subunits could be identified. Finally, single-particle electron microscopy analysis revealed that the structure of EAF1FO is identical to that of AAF1FO. Therefore, the EAF1FO expression system serves as a reliable platform for investigating on properties of AAF1FO.
Specifically, in this work, EAF1FO was used to study the membrane insertion mechanism of rotary subunit c. Subunits c possess different lengths and levels of hydrophobicity across species and by analyzing their N-terminal variability, four phylogenetic groups of subunits c were distinguished (groups 1 to 4). As a member of group 2, the subunit c from A. aeolicus F1FO ATP synthase is characterized by an N-terminal segment that functions as a signal peptide with SRP recognition features, a unique case for bacterial F1FO ATP synthases. By accurately designing mutants of EAF1FO, we determined that such a signal peptide is strictly necessary for membrane insertion of subunit c and we concluded that A. aeolicus subunit c inserts into E. coli membranes using a different pathway than E. coli subunit c. Such a property may be common to other ATP synthases from extremophilic organisms, which all cluster in the same phylogenetic group.
In conclusion, the successful production of the fully assembled and active F1FO ATP synthase from A. aeolicus in E. coli reported in this work provides a novel genetic system to study A. aeolicus F1FO ATP synthase. To a broader extent, it will also serve in the future as a solid reference for designing strategies aimed at producing large multi-subunit complexes with complicated stoichiometry.
Metabotropic glutamate receptor subtype 7 (mGluR7) belongs to the family of G-protein coupled receptors. mGluR7 is widely distributed in the brain and primarily localized at presynaptic terminals, where it is thought to regulate neurotransmitter release and synaptic plasticity. Studies have shown that the intracellular C-terminal tail of mGluR7 binds a variety of proteins in addition to trimeric G-proteins. These newly identified protein interactions are believed to play a key role in the synaptic targeting and G-protein dependent signaling of mGluR7. Protein interacting with C kinase 1 (PICK1), a PDZ-domain protein, is a strong interaction partner of mGluR7a. In order to investigate the role of PICK1 in the synaptic trafficking and signaling of mGluR7a, a knock-in mouse line in which the interaction of mGluR7a and PICK1 is disrupted was generated. Analysis of the mutant mice by immunocytochemistry and immunoelectron microscopy showed that the synaptic targeting and clustering of mGluR7a was not altered, indicating that PICK1 is not required for mGluR7a receptor membrane trafficking and synaptic localization. However, when the spontaneous synaptic activity of cerebellar granule cell cultures prepared from both wild-type and knock-in mice was monitored, and L-AP4 (400μm) was found to decrease the frequency, but not the amplitude, of spontaneous excitatory currents in wild-type neurons, while no effect of L-AP4 on spontaneous synaptic activity was observed in knock-in neurons. This indicates that PICK1 binding to the C-terminal region of mGluR7a plays an essential role in mGluR7a mediated G-protein signaling. We examined the threshold sensitivity for the convulsant pentetrazole (PTZ) in knock-in mice. It was found that mGluR7a knock-in mice had a greater sensitivity to PTZ than wild-type mice. Moreover, the surface parietal cortex EEG recordings of the mutant mice revealed spontaneous synchronous oscillation, or "spike-and-wave discharges" (SWD), which displayed similar characteristics to absence-like seizures. It was also observed that the knock-in mice responded to pharmacology as human absence epilepsy. These data suggests that the knock-in mice displayed the phenotype of absencelike epilepsy. Furthermore, the behavioral analysis of the mGluR7a knock-in mice showed no deficits in motor coordination, pain sensation, anxiety as well as spatial learning and memory, thus the interaction of mGluR7a and PICK1 appears not to contribute to these physiological processes. Taken together, our data provides evidence for an important role of PICK1 in Gprotein dependent signaling of mGluR7a, whereas PICK1 is not required for synaptic targeting and clustering of mGluR7a. Our results also provide an animal model of absencelike epilepsy generated by disruption of a single mGluR7a-PDZ interaction, thus creating a novel therapeutic target against this neurological disease.
Energy and environment are two major concerns in the 21st century. At present, the energy required for the daily life still mainly relies on the traditional fossil fuel resources, but the caused air pollution problem and greenhouse effect have seriously threatened the sustainable development of mankind. Another adopted energy source which can provide a large fraction of electricity for the world is the nuclear fission reaction. However, the increasing high-radioactive spent nuclear fuels, which half-lives are usually >1 million years, are becoming the hidden perils to the earth. A great advance in accelerator physics and technology opens an opportunity to solve this dilemma between man and nature, because powerful accelerator-based neutron sources can play important roles for clean nuclear power production, for example: - The Accelerator-Driven System (ADS) can serve as an easy control of a sub-critical fission reactor so that the nuclear fuels will be burnt more completely and safely. - The EUROTRANS project launched by EU is investigating another application of the ADS technology to reduce the radiotoxicity and the volume of the existing nuclear waste greatly and quickly in a transmutation way. - The developing international IFMIF plant will be used to test and qualify reactor materials for future fusion power stations, which can produce much cleaner nuclear electricity more efficiently than the fission ones. Therefore, the R&D of high-power driver linacs (HPDL) is of a worldwide importance. As the proverb said, "everything is hard at the beginning", the front end is the most difficult part for realizing an HPDL machine. Based on the RFQ and H-type DTL structures, this dissertation is dedicated to study the beam dynamics in the presence of significantly strong space-charge effects while accelerating intense hardon beams in the low- and medium-beta-region. Besides the 5mA/30mA, 17MeV proton injector (RFQ+DTL) and the 125mA, 40MeV deuteron DTL of the above-mentioned EUROTRANS and IFMIF facilities, a 200mA, 700keV proton RFQ has been also intensively studied for a small-scale but ultra-intense neutron source FRANZ planned at Frankfurt University. The most remarkable properties of the FRANZ RFQ and the IFMIF DTL are the design beam intensities, 200mA and 125mA, which are the record values for the proton and deuteron linacs, respectively. Though the design intensities for the two development stages, XT-ADS (5mA) and EFIT (30mA), of the EUROTRANS injector are well within the capability of the modern RF linac technology, the special design concept for an easy upgrade from XT-ADS to EFIT brings unusual challenges to realize a linac layout which allows flexible operation with different beam intensities. To design the 200mA FRANZ RFQ and the two-intensity EUROTRANS RFQ, the classic LANL (Los Alamos National Laboratory) Four-Section Procedure, which was developed by neglecting the space-charge forces, is not sufficient anymore. Abandoning the unreasonable constant- B (constant-transverse-focusing-strength) law and the resulting inefficient evolution manners of dynamics parameters adopted by the LANL method, a new design approach so-called "BABBLE", which can provide a "Balanced and Accelerated Beam Bunching at Low Energy", has been developed for intense beams. Being consistent with the beam-development process including space-charge effects, the main features of the "BABBLE" strategy (see Pages 55-58) are: 1) At the entrance, the synchronous phase is kept at = phi s = -90° while a gradual increase in the electrode modulation is started so that the input beam can firstly get a symmetrical and soft bunching within a full-360° phase acceptance. 2) In the following main bunching section, B is increasing to balance the stronger and stronger transverse defocusing effects induced by the decreasing bunch size so that the bunching speed can be fast and safely increased. 3) When the real acceleration starts, the quickly increased beam velocity will naturally weaken the transverse defocusing effects, so B is accordingly falling down to avoid longitudinal emittance growths and to allow larger bore apertures. Taking advantage of the gentle initial bunching and the accelerated main bunching under balanced forces enabled by the "BABBLE" strategy, a 2m-long RFQ with beam transmission in excess of 98% and low emittance growths has been designed for FRANZ, and a 4.3m-long RFQ with almost no beam losses and flat emittance evolutions at both 5mA and 30mA has been designed for EUROTRANS. All design results have proven that the "BABBLE" strategy is a general design approach leading to an efficient and robust RFQ with good beam quality in a wide intensity-range from 0mA to 200mA (even higher). To design the IFMIF DTL and the injector DTL part of the EUROTRANS driver linac, which have been foreseen as the first real applications of the novel superconducting CH-DTL structure, intensive attempts have been made to fulfill the design goals under the new conditions, e.g. long drift spaces, SC transverse focusing elements and high accelerating gradients. For the IFMIF DTL, the preliminary IAP design has been considerably improved with respect to the linac layout as well as the beam dynamics. By reserving sufficient drift spaces for the cryosystem, diagnostic devices, tuner and steerer, introducing SC solenoid lenses and adjusting the Linac Design for Intense Hadron Beams accelerating gradients and accordingly other configurations of the cavities (see Pages 78-80), a more realistic, reliable and efficient linac system has been designed. On the other hand, the specifications and positions of the transverse focusing elements (see Pages 81-82) as well as the phase- and energy-differences between the bunch-center particle and the synchronous particle at the beginning of the phi s=0° sections have been totally redesigned (see Pages 83-84) resulting in good beam performances in both radial and longitudinal planes. For the EUROTRANS injector DTL, in addition to the above-mentioned procedures, extra optimization concepts to coordinate the beam dynamics between two intensities, such as employing short adjustable rebunching cavities with phi s = -90° (see Page 116), have been applied. ...
Generally speaking, protein import into mitochondria and chloroplasts is a post-translational process during which the precursor proteins destined for mitochondria or chloroplasts are translated with cytosolic ribosomes and targeted. The previous results showed that the isolated chloroplasts can import in vitro synthesized proteins and the absence of ribosomes in the immediate area around chloroplasts in electron microscopy (EM) images. However, none of the EM images were recorded in the presence of a translation elongation inhibitor. Also, the observation showed that ribosomes stably bind to purified liver mitochondria in vitro, and the first indication of chloroplast localization of mRNAs encoding plastid proteins in Chlamydomonas rheinhardtii, which challenge the post-translational import and support the co-translational process. Therefore, in this study, the association of the ribosomes to the isolated chloroplasts were analyzed, a binding assay was established and showed that naked ribosomes are not considerably bound to chloroplasts. Additionally, mRNA localize in close vicinity to mitochondria also challenged post-translation protein import. Global analysis of transcripts bound to mitochondria in yeast or human revealed that around half of the transcripts of mitochondrial proteins displayed a high mitochondrial localization. The observed association of mRNAs with chloroplast fractions and the in vivo analysis of the distribution of mRNAs was used as base to formulate the hypothesis that mRNA can bind to chloroplast surface. Therefore, in this study, the mRNA binding assay was established and revealed that mRNAs coding for the mitochondrial cytochrome c oxidase copper chaperone COX17 showed unspecific binding to the chloroplasts. The mRNA coding for chloroplast outer envelope transport protein OEP24 and mRNA coding for the essential nuclear protein 1 (ENP1) showed specific binding, and OEP24 has a 3-fold higher affinity than ENP1 mRNA. Moreover, the BY2-L (Nicotiana tabacum non-green cell culture) could confer the highest enhancement of OEP24 mRNA binding efficiency than the COX17 and ENP1 mRNA and the preparation of the BY2-L was optimized. Afterwards, the feasibility to fix the interaction between mRNA and the proteins on the surface of chloroplasts was confirmed. OEP24 mRNA showed more efficiency in the UV-crosslinking. Following, the pull-down with antisense locked nucleic acid (LNA)/DNA oligonucleotides was established which could be used for the further investigation of the proteins involved in the mRNA binding to the chloroplasts.
Bei der Analyse der Diffusion von Gallensäuren durch Lipiddoppelmembranen (SUV´s, LUVET´s) erweisen sich die lipophilen Gallensäuren als besonders diffusionsfreudig. Zu diesen können die LC, CDC und die DC gezählt werden. Die deutlich hydrophilere und therapeutisch bedeutende UDC permeiert ebenfalls durch Liposomenmembranen, hat jedoch eine geringere Geschwindigkeitskonstante. Konjugierte Gallensäuren zeigen dagegen nur eine minimale Diffusionsrate. Weiterhin wurde nachgewiesen, daß eine deutliche Abhängigkeit der Permeation von der Gallensäurenkonzentration besteht. Mit steigender Konzentration erhöht sich die Geschwindigkeit. Auch bei diesen Experimenten sind die lipophileren Substanzen die schnelleren. Zudem kann festgehalten werden, daß auch eine Temperaturerhöhung bis auf 37 °C und ein Abfall des pH- Wertes auf 5,4 einen positiven Einfluß auf die Permeabilitätsrate von Gallensäuren haben. Umgekehrt verhält es sich bei einer Temperaturminderung auf 10 °C und einer pH- Erhöhung auf 9,4. Eine gleichzeitige pH- Minderung und Temperaturerhöhung hat einen additiven Effekt auf die Diffusion. Geschwindigkeitssteigernd erweist sich auch die Verwendung größerer Liposomen. Eine Steigerung des Liposomendurchmessers geht mit einer Zunahme der Permeabilität einher. Auch die Zugabe von Ethanol bewirkt eine Zunahme der Diffusion durch Liposomenmembranen. Eine herabgesetzte Diffusionsrate kann bei Änderungen in der Lipidkomposition von Lipiddoppelmembranen beobachtet werden. Ein Einbau von Cholesterin führt eine deutliche Minderung der Permeation aller Gallensäuren herbei, wobei die lipophilen Gallensäuren auch weiterhin rascher permeieren. Ein Cholesteringehalt von 20% (w/w) wirkt dabei stärker hemmend als ein Gehalt von 10% (w/w). Im zweiten Abschnitt der vorliegenden Arbeit konzentrieren sich die Beobachtungen auf den Einfluß von Ethanol auf Lipiddoppelmembranen. Es kann gezeigt werden, daß Ethanol einen membrandestabilisierenden Effekt hat, der um so stärker ist, je höher die Ethanolkonzentration gewählt wird. Die DPH- Fluoreszenzversuche lassen zudem erkennen, daß Ethanol zu einer Reduktion der Membranordnung führt und damit zu einer Zunahme der Membranfluidität. Ein Einbau von UDC in die Liposomenmembran hat dagegen einen membran-stabilisierenden Effekt und reduziert die Ethanolwirkung. Dieser Effekt ist zu der Menge der in der Membran eingebauten UDC proportional. Der Cholesterineinbau in die Membran zeigt ähnliche Effekte wie der Einbau von UDC. Die Ergebnisse dieser Arbeit liefern zusätzliche Erklärungen für Phänomene beim therapeutischen Einsatz von Gallensäuren, die bisher nur mangelhaft zu verstehen waren. So kann aus den Diffusionsstudien die Erkenntnis gewonnen werden, daß bei der Diffusion von mehr apolaren Gallensäuren, wie z.B. der CDC, eine leichtere Diffusion durch Membranen möglich ist als für die mehr polaren Moleküle. In der PBC sind vor allem die mehr apolaren Gallensäuren nachweisbar und stellen somit einen vielleicht wichtigen pathophysiologischen Faktor dar, der sich eventuell durch Einbau von Cholesterin in Membranen oder durch Applikation von UDC mindern läßt. UDC scheint jedoch auch gegen andere schädigende Substanzen eine protektive Wirkung zu haben. Ethanolinduzierte Schädigungen an Membranen konnten z.B. durch die Anwendung von UDC deutlich reduziert werden. Eine wenig geschädigte oder sogar intakte Membran kann ihren vielfältigen Funktionen gerecht werden, z.B. die Funktion von Transportsystemen aufrechterhalten. Dies könnte erklären, warum UDC bei primär biliären Leberkrankheiten eine Cholestase vermindert oder sogar aufheben kann, die heute weitgehend mit einer Schädigung membranständiger Carriersysteme erklärt wird.
Hintergrund: Seit mehr als 50 Jahren werden in Deutschland Herzschrittmacher-Implantationen durchgeführt, mittlerweile mit mehr als 100.000 Implantationen pro Jahr. Obwohl es sich um einen gängigen Eingriff handelt, existieren wenig prospektiv randomisierte Studien zu technischen Aspekten der Implantation, insbesondere dem Wundverschluss am Ende der Operation. Ziel der vorliegenden Arbeit war es, an einem Kollektiv von Patienten unerwünschte Ereignisse und kosmetische Ergebnisse, in Abhängigkeit des beim Hautverschluss verwendeten Nahtmaterials (resorbierbarer bzw. nicht-resorbierbarer Faden), miteinander zu vergleichen.
Methoden: In einem Zeitraum von Juli 2018 bis April 2019 wurden Patienten mit geplanter de novo Herzschrittmacher-Implantation ohne Defibrillationstherapie prospektiv in die Studie eingeschlossen und anhand einer Randomisierungliste in zwei Probandengruppen eingeteilt: nicht-resorbierbares Nahtmaterial (Gruppe Prolene®) bzw. resorbierbares Nahtmaterial (Gruppe Monocryl®).
Ein Tag (Beobachtungszeitpunkt 1), sechs Wochen (Beobachtungszeitpunkt 2) und ein Jahr post-OP (Beobachtungszeitpunkt 3) erfolgte die Beurteilung der Narbe bezüglich des kosmetischen Ergebnisses und klinisch relevanter, unerwünschter Ereignisse. Zur kosmetischen Beurteilung diente die Wundbreite in mm, eine auftretende Kelloidbildung und die „Patient and Observer Scar Assessment Scale“ (POSA-Score). Dieser wurde zu Beobachtungszeitpunkt 1 seitens des Patienten auf zwei Fragen (Schmerzhaftigkeit, Juckreiz) reduziert. Die erhobenen klinisch relevanten Parameter waren Nachblutungen, Infektionen, Insuffizienz der Naht und Revisions-OP aufgrund eines Lokalbefundes.
Ergebnisse: Es konnten 114 Patienten in die Studie eingeschlossen werden. Zu Beobachtungszeitpunkt 2 und Beobachtungszeitpunkt 3 belief sich die Anzahl auf jeweils 92 Probanden. Zu allen drei Beobachtungszeitpunkten konnte zwischen beiden Gruppen weder ein signifikanter Unterschied im kosmetischen Ergebnis noch im Auftreten klinisch relevanter Ereignisse festgestellt werden.
Schlussfolgerung: Anhand der vorliegenden Studie scheint das verwendete Nahtmaterial keinen großen Einfluss auf das kosmetische Ergebnis der Narbe, sowie auf das Auftreten von unerwünschten Ereignissen zu haben. Eine multizentrische prospektiv randomisierte Studie mit größerer Patientenanzahl ist notwendig, um die hier erhobenen Daten zu verifizieren.
Obesity is considered as a type of chronic inflammation. It enhances the risk of developing cardiovascular disease, diabetes, and some cancers. The key players in the induction of inflammation in adipose tissue are macrophages. However the mechanism of macrophage activation in obese fat tissue is still not fully understood. Elevated level of saturated fatty acids in adipose tissue promotes inflammation and insulin resistance. Exposure of macrophages to saturated fatty acids stimulates pro-inflammatory c-Jun N-terminal kinase (JNK), nuclear factor kappa B (NF-kB) signaling, and production of pro-inflammatory cytokines, such as IL-6, IL-8, IL-1β, and TNFα. Palmitate is a major saturated free fatty acid released by adipocytes. It activates inflammatory pathways through Toll-like receptors (TLR) 2 and 4, provokes endoplasmic reticulum (ER) stress and increases levels of diacylglycerols (DAGs) and ceramides. Saturated fatty acids also affect cellular oxidative metabolism. Thus, mitochondrial fatty acid oxidation reduces ER-stress and expression of inflammatory cytokines in palmitate-treated macrophages. On the other hand mitochondrial reactive oxygen species (ROS) promote palmitate-mediated pro-inflammatory cytokine production. Recently, mitochondrial functions were linked to their morphology. Mitochondrial fission has been reported in β-cells and myocytes in response to high levels of glucose and free fatty acids, and was associated with disruption of mitochondrial functions, increased ROS level, and cell death. The aim of this study was to investigate the role of mitochondrial fragmentation in palmitate-induced inflammation in human macrophages. In our settings fatty acids, independently of their saturation, affected mitochondrial morphology. Mixtures of long chain saturated and unsaturated fatty acids as well as triglyceride-rich lipoprotein lipolysis products promoted mitochondrial fission. Mitochondrial fragmentation in palmitate-treated macrophages revealed a time- and concentration-dependent character, and was reversible upon palmitate removal. This observation, together with unaltered levels of mitochondrial protein and DNA content, and intact mitochondrial respiration, suggested that mitochondria were not damaged and were functionally active. Mechanistically, palmitate-induced mitochondrial fragmentation was not regulated by ER stress or loss of mitochondrial membrane potential. However, inhibition of palmitate incorporation into mitochondrial membrane phospholipids decreased mitochondrial fragmentation. Other approach to prevent mitochondrial fission was the inhibition of dynamin-related protein 1 (DRP1) activity, which drives mitochondrial fission by forming ring- like structures around mitochondria and constricting mitochondrial membranes. Palmitate altered mitochondrial membrane lipid composition and promoted DRP1-oligomerization. The inhibition of palmitate-induced mitochondrial fragmentation enhanced mitochondrial ROS production, c-Jun phosphorylation, and upregulated expression of pro-inflammatory cytokines. Taken together, these results suggest that mitochondrial fragmentation is a protective mechanism attenuating palmitate-induced inflammatory responses. Future experiments will be required to investigate the role of mitochondrial fragmentation in obesity-associated diseases in vivo.
"Autonomy is the condition under which what one does reflects who one is" (Weinrib, 2019, p.8). This quote encapsulates the core idea of autonomy, namely the correspondence of one’s inner values with one’s actions. This is a beautiful idea. After all, who wants their actions to be determined or controlled from the outside?
The classical definition of autonomy is precisely about this independence from external circumstances, which Murray (1938) primarily coined. Among other things, Murray characterizes autonomy as resistance to influence and defiance of authority. Similarly, Piaget (1983) describes individuals as autonomous, independent of external influences, in their thinking and actions, and foremost, adult authority. Subsequent work criticized this equation of autonomy with separation or independence (Bekker, 1993; Chirkov et al., 2003; Hmel & Pincus, 2002). In lieu thereof, autonomy is defined as an ability (Chirkov, 2011; Rössler, 2017) and as an essential human need (Ryan & Deci, 2006). Focus is now
on self-governing while relying on rationally determined values to pursue a happy life (Chirkov, 2011). According to Social Determination Theory (SDT), autonomy is about a sense of initiative and responsibility for one’s own actions. The experience of interest and appreciation can strengthen autonomy, whereas experiences of external control, e.g., through rewards or punishments, limit autonomy (Ryan & Deci, 2020). In the psychological discourse of autonomy, SDT is strongly represented (Chirkov et al., 2003; Koestner & Losier, 1996; Weinstein et al., 2012). Notably, SDT distinguishes between autonomy and independence as follows. While a person can autonomously ask for help or rely on others, a person can also be involuntarily alone and independent. Interestingly, these definitions are again closer to its etymological meaning as self-governing, originating from Greek αυτòνoμζ (autonomous).
The two strands of autonomy as independence and autonomy as self-determination are also reflected in the vital differentiation into reactive and reflective autonomy by Koestner and Losier (1996). Resisting external influence, particularly interpersonal in fluence, is what reactive autonomy entails. This interpretation is closely related to the classical concept of autonomy as separation and independence from others (Murray, 1938). On the other hand, reflective autonomy concerns intrapersonal processes, such as self-governing or self-regulation, as defined in Self-Determination Theory (Ryan et al., 2021). In this dissertation, we investigated the concept in three different approaches while focusing on its assessment and operationalization: To begin, in Article 1, we compared the layperson’s and the scientific perspective to each other to gain insight into the characteristics of autonomy. Then, in Articles 2 and 3, we experimentally tested behavioral autonomy as resistance to external influences. Simultaneously, we investigated the link between various autonomy trait measures and autonomous behavior. As a result, in Article 2, we looked at how people reacted to the effects of message framing and sender authority on social distancing behavior during the early COVID-19 pandemic. Finally, in Article 3 we investigated the resistance to a descriptive norm in answering factual questions, in the context of autonomous personality. In our first article, we used a semi-qualitative bottom-up approach to gain insights into the laypersons’ perspective on autonomy and compare it to the scientific notion. We followed a design proposed by Kraft-Todd and Rand (2019) on the term heroism. We derived five components from philosophical and psychological literature: dignity, independence from others, morality, self-awareness, and unconventionality. In three preregistered online studies, we compared these scientific components to the laypersons’ understanding of autonomy. In Study 1, participants (N = 222) listed at least three and up to ten examples of autonomous (self-determined) behaviors. Here, the participants named 807 meaningful examples, which we systematically categorized into 34 representative items for Study 2. Next, new participants (N = 114) rated these regarding their autonomy. Finally, we transferred the five highest-rated autonomy and the five lowest-rated autonomy items to Study 3 (N = 175). We asked participants to rate how strongly the items represented dignity, independence from others, morality, self-awareness, and unconventionality. We found all components to distinguish between high and low autonomy items but not for unconventionality. Thus, we conclude that laypersons’ view corresponds with the scientific characteristics of dignity, independence from others, self-awareness, and morality. A qualitative analysis of the examples also showed that both reactive and reflective definitions of autonomy are prevalent.
Um sich an ändernde Umwelteinflüsse und metabolische Bedürfnisse anpassen zu können, ist es für Zellen essenziell, dass Boten-RNA (engl. messenger RNA, mRNA) stetig und schnell nach der Translation abgebaut wird. In Prokaryoten ist dafür der Proteinkomplex Degradosom verantwortlich, in dem Endo- und Exoribonukleasen RNase E und PNPase das RNA-Transkript in kleinere Fragmente und schließlich einzelne Nukleotide spalten. Die DEAD-Box Helikase RhlB im Komplex dient zusätzlich dazu, mögliche Sekundärstrukturen in der RNA zu entfalten, welche sonst die weitere Degradation behindern würden. Es konnte gezeigt werden, dass RhlB’s sehr geringe katalytische Aktivität – gemessen durch ATP-Verbrauch und Rate an entwundener RNA – signifikant durch die allosterische Bindung an Komplexpartner RNase E erhöht wird. Gleichzeitig deuten andere Studien darauf hin, dass RhlB eine mögliche Selektivität für doppelsträngige RNA-Substrate mit 5‘-Einzelstrang-Überhängen aufweist.
Diese Arbeit liefert neue Erkenntnisse in Bezug auf die Kommunikation zwischen den Degradosom-Komponenten RhlB und RNase E aus E. coli, indem das potenzielle Wechselspiel zwischen RhlBs RNA-Selektivität und der allosterischen Aktivierung durch RNase E untersucht wurde. Der vielseitige Einsatz NMR-spektroskopischer Techniken sowie die Verwendung kurzer RNA-Substrate mit spezifischen Strang-Eigenschaften ermöglicht es, mit einen ungewöhnlichen, RNA-zentrierten Ansatz an diese unzureichend verstandene Protein-Interaktion heranzugehen.
Zunächst wurden hierzu eine Reihe kurzer doppelsträngiger RNA-Konstrukte hergestellt, die sich nicht nur in ihren Einzelstrang-Merkmalen unterscheiden, sondern auch die thermodynamischen Anforderungen eines DEAD-Box Helikase Substrats erfüllen, und gleichzeitig eine ausreichende NMR-spektroskopische Signal-Zuordnung erlauben. Die thermale Stabilität, das Faltungsverhalten sowie die 1H Imino-protonen- und 13C HSQC-Zuordnungen aller geeigneten Konstrukte wurden erfolgreich bestimmt.
Um den Einfluss spezifischer RNA-Substrate sowie die Bindung zweier verschiedener RNase E Fragmente auf RhlBs ATP-Umsatzrate zu untersuchen, wurde sich zunächst eines photometrischen Phosphat-Assays bedient. Damit konnte deutlich gezeigt werden, dass RhlB in Abwesenheit des Komplex-Partners nicht in der Lage ist, signifikante Mengen an ATP umzusetzen, unabhängig davon, welches RNA-Konstrukt eingesetzt wird. Die Bindung der RNase E Fragmente erhöhte signifikant die ATP-Hydrolyse-Rate der Helikase, wobei die größte Aktivierung für den RNA-Duplex mit 5‘-Einzelstrang sowie ein einzelsträngiges Substrat zu beobachten ist. Da diese Ergebnisse deutlich eine RNA-Abhängigkeit beim ATP-Umsatz der Helikase zeigen, wurde untersucht, ob diese Unterschiede ihren Ursprung bereits in der Bindung der spezifischen RNA-Substrate haben. Mittels einer Mischapparatur, die es erlaubt die enzymatische Reaktion direkt im Spektrometer zu initiieren sowie zeitaufgelöster 31P NMR-Experimente konnte die allosterische Aktivierung der ATP-Hydrolyse-Rate von RhlB auch unter NMR-spektroskopischen Messbedingungen nachgewiesen werden.
Da die Ergebnisse des ATPase Assays deutlich eine RNA-Abhängigkeit bei der ATP-Umsatz-Rate der Helikase zeigen, wurde zusätzlich untersucht, ob diese Unterschiede ihren Ursprung in den Affinitäten für die verschiedenen RNA-Substrate haben und ob diese durch die Bindung von RNase E and RhlB beeinflusst werden. Um im gleichen Zuge zu überprüfen, ob die Bindung der RNA an RhlB die RNA-Konformation oder Basenpaarung ändert, werden 1H NMR-Titrationsexperimente durchgeführt. Es konnte erstmals gezeigt werden, dass RhlB eine inhärente Präferenz für Duplexe mit 5‘-Überhang gegenüber Konstrukten mit 3‘-Überhang oder stumpfen Enden besitzt, was sich in einer erhöhten Affinität zeigt. Zusätzlich offenbaren die Messungen, dass RNase Es allosterische Bindung selektiv die Affinität gegenüber Konstrukten mit Einzelstrang-Überhang erhöht, während die Affinität zu RNA Duplexen ohne Überhang sogar verringert wird. Diese Ergebnisse liefern erstmals einen Nachweis, dass RNase E aktiv Einfluss auf RhlBs RNA-Bindung nimmt. Weder die Bindung der RNA and RhlB noch an den RhlB/RNase E Komplex scheint die Basenpaarung oder Konformation der RNA-Substrate zu beeinflussen, da lediglich eine homogene Peak-Verbreitung aller Imino-Protonen-Signale im 1H NMR-Spektrum beobachtet werden konnte.
Die vorliegende, in kumulativer Schreibweise verfasste Arbeit erläutert die Entwicklung, Charakterisierung und Optimierung zweier unterschiedlicher Leitstrukturen, die als Agonisten von Peroxisomen Proliferator-aktivierten Rezeptoren (PPAR) und gleichsam als duale Inhibitoren der mikrosomalen Prostaglandin E2 Synthase-1 (mPGES-1) und der 5-Lipoxygenase (5-LO) wirken. Chemisch betrachtet sind dies zum ersten die Gruppe der alpha-n-Hexyl-Pirinixinsäurederivate und zum zweiten die Gruppe der 2-(Phenylthio)-hexansäurederivate. Die Publikation zur Synthese und in vitro-pharmakologischen Charakterisierung der alpha-n-Hexyl-Pirinixinsäurederivate an PPAR (Zettl et al., QSAR & Combinatorial Science, 28:576–586, 2009) enthält einerseits die strukturelle Optimierung durch Variation der Aryl-Substitution des zentralen Pyrimidinringes der Leitstruktur und andererseits die durch Docking-Verfahren gestützte Untersuchung des Einflusses der Stereochemie auf die PPAR-Aktivierung. Letztlich konnte durch die Einführung von Biphenyl-Substituenten eine Verbesserung insbesondere der PPARalpha-Aktivität gegenüber der als strukturellen Referenz dienenden alpha-n-Hexyl-Pirinixinsäure (Rau et al., Archiv der Pharmazie, 341:191–195, 2008) erreicht werden. Mit Hilfe von präparativer enantioselektiver HPLC wurde eine ausgewählte Verbindung in ihre beiden Enantiomere getrennt. Deren in vitro-pharmakologische Charakterisierung ergab, dass das (R)-Enantiomer insbesondere bei PPARalpha als Eutomer fungiert. Dieses Ergebnis konnte mit Hilfe von Docking-Studien weiter untermauert werden. Hierbei wurde deutlich, dass die Besetzung der linken proximalen Bindetasche der PPARalpha-Liganden-Bindungs-Domäne durch den alpha-n-Hexyl-Rest lediglich im Fall einer (R)-Konfiguration optimal erfolgen kann. Die Synthese und die in vitro-pharmakologische Charakterisierung der Substanzklasse der 2-(Phenylthio)-hexansäurederivate an PPAR sind in Zettl et al., Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters, 19: 4421-4426, 2009 zusammengefasst. Bei der Analyse der Struktur-Wirkungs-Beziehungen erwies sich die Leitstruktur als hochaktiv und sehr robust. Je nach Substitutionsmuster des lipophilen Molekülteils wurden potente selektive PPARalpha-Agonisten wie auch PPARalpha-präferenzielle duale PPARalpha/gamma-Agonisten dargestellt. Durch die Synthese von Kohlenstoff-Analoga und alpha-unsubstituierten Verbindungen wurde des Weiteren der Einfluss des Schwefelatoms und des n-Butylrestes in alpha-Position zur Carbonsäure auf die PPAR-Aktivität untersucht. Hierbei konnte gezeigt werden, dass beide Strukturelemente einen großen Beitrag zur hohen PPARalpha-Aktivität der Leitstruktur leisten. Wie auch bei den alpha-n-Hexyl-Pirinixinsäurederivaten wurde eine ausgewählte Verbindung in ihre Enantiomere getrennt und der Einfluss des Stereozentrums in alpha-Position zur Carbonsäure untersucht. Das Ergebnis bestätigte die Resultate der vorangegangenen Studie: Das (R)-Enantiomer wirkte als Eutomer, wobei der stereochemische Einfluss bei PPARalpha besonders deutlich war. Ausgewählte Synthesen und die in vitro-pharmakologische Charakterisierung von Pirinixinsäurederivaten an mPGES-1, 5-LO sowie der Cyclooxygenase (COX) sind in Koeberle und Zettl et al., Journal of Medicinal Chemistry, 51:8068–8076, 2009 publiziert. Die Arbeit beinhaltet eine umfassende Reihe an Pirinixinsäurederivaten mit Strukturvariationen in alpha-Position zur Carbonsäure und im Aryl-Substitutionsmuster des Pyrimidinringes. Hinsichtlich der alpha-Substitution zeigte sich, dass für Alkylreste eine Kettenlänge von mindestens 6 Kohlenstoffatomen für einen dualen Wirkmechanismus erforderlich ist. Als Leitstruktur für duale mPGES-1/5-LO-Inhibitoren ergab sich somit alpha-n-Hexyl-substituierte Pirinixinsäure, deren Aryl-Substitutionsmuster am zentralen Pyrimidin weiter optimiert wurde. Als vorteilhaft erwies sich die Substitution mit Biphenylresten, wodurch die Darstellung von niedrig mikromolar aktiven dualen mPGES-1/5-LO-Inhibitoren gelang. Bei der Analyse der Strukur-Wirkungs-Beziehungen von unterschiedlichen Biphenylresten zeigte sich eine hohe strukturelle Toleranz hinsichtlich der dualen inhibitorischen Aktivität an der mPGES-1 und der 5-LO. Somit stellen die alpha-n-Hexyl-Pirinixinsäurederivate die ersten publizierten dualen mPGES-1/5-LO-Inhibitoren dar.
Einleitung: Um die empfindlichen Nervenzellen des Gehirns vor den Einflüssen schädigender Substanzen im systemisch zirkulierenden Blut zu schützen, besitzen höhere Lebewesen einen Barrieremechanismus, der das zentrale Nervensystem (ZNS) nach außen hin abriegelt. Diese Blut-Hirn-Schranke (BHS) wird durch die Gefäßendothelzellen im Gehirn gebildet, die über eine Kombination mehrerer Mechanismen Substanzen vom Eindringen in das Gehirngewebe abhalten. Zum einen stellt die Existenz dieser Barriere einen lebensnotwendigen Schutz dar, zum anderen jedoch bedeutet sie eine große Hürde in der Pharmakotherapie von Erkrankungen des zentralen Nervensystems, da nur wenige Arzneimittel in der Lage sind sie zu überwinden. Eine gute Gehirngängigkeit besitzen in der Regel kleine Moleküle mit einer hohen Lipophilie oder solche, die aktiv über Transporter oder Rezeptoren in das ZNS aufgenommen werden. Alle anderen Substanzen, wie effektiv sie auch im restlichen Körper sein mögen, stehen für die Therapie zerebraler Krankheiten wie z.B. Epilepsie, Alzheimer, Gehirntumore oder ZNS-HIV unter normalen Umständen nicht zur Verfügung. Das Gebiet der kolloidalen Trägersysteme bietet eine Lösung für dieses Problem. Durch den Einsatz von Liposomen oder Nanopartikeln als „Carrier“ können verschiedene Arzneistoffe aktiv in das Gehirn transportiert warden, um dort ihre Wirkung zu entfalten. Des Weiteren führt ein solches „Drug targeting“ nicht nur zu einer Überwindung der BHS sondern gleichzeitig zu einer vermehrten Anreicherung des Arzneistoffs im ZNS und dadurch zu geringeren Nebenwirkungen im restlichen Organismus. Durch die erhöhte Selektivität für das ZNS können kleinere und somit für den Körper verträglichere Dosen des Arzneistoffs eingesetzt werden. In der Vergangenheit konnte gezeigt werden, dass unter anderem Nanopartikel aus humanem Serumalbumin, welche mit Polysorbat 80 überzogen waren oder deren Oberfläche mit Apolipoproteinen modifiziert wurde, Arzneistoffe, die üblicherweise nicht in der Lage sind die Blut-Hirn-Schranke zu überwinden, zentral zur Wirkung brachten. Der genaue Mechanismus, durch den diese Arzneistoffe mithilfe der Trägersysteme ins Gehirn gelangen,war bisher weitgehend ungeklärt. Ein Eindringen des arzneistoffbeladenen Nanopartikels als Ganzes in das Gehirn sowie die Einleitung 2 Vermittlung des Arzneistoff-Transportes durch das Partikel am Endothel oder gar eine unselektive Zerstörung der Barrierefunktion wurden diskutiert. Im Rahmen dieser Arbeit wurden mit Apolipoproteinen modifizierte Partikel aus humanem Serumalbumin hergestellt und hinsichtlich ihrer Größe, der Größenverteilung, des Partikelgehaltes, der Oberflächenladung und ihres morphologischen Erscheinungsbildes charakterisiert. Anschließend wurde die Interaktion dieser kolloidalen Trägersysteme mit isolierten Endothelzellen des Nagergehirns mittels verschiedener Analytiken untersucht. Gleichzeitig wurden in umfangreichen Untersuchungen an Mäusen und Ratten die Geschehnisse in vivo beleuchtet und mit Hilfe eines bildgebenden Verfahrens, der Elektronenmikroskopie, dargestellt. Des Weiteren wurde der Effekt einer nanopartikulären Applikation auf die Integrität der Barrierefunktion der BHS untersucht, wodurch eine schädliche Wirkung der Partikel ausgeschlossen und die der Aufnahme in das ZNS zugrunde liegenden Transportmechanismen aufgeklärt werden konnten.
Etablierung, Charakterisierung und Anwendung eines In-vitro-Zellkulturmodells der Blut-Hirn-Schranke
(2001)
Es wurde durch die Optimierung der Isolierung und Kultivierung von cerebralen mikrovaskulären Endothelzellen (BCEC) ein in vitro-Zellkulturmodell der Blut-Hirn-Schranke (BHS) etabliert, das bezüglich seiner Permeabilitäts-Charakteristiken spezifische und herausragende Eigenschaften aufwies. Nach Abschluss der Etablierungs- und Optimierungsphase konnten im bovinen System wiederholt und reproduzierbar transendotheliale elektrische Widerstände (transendothelial electrical resistance, TEER) von zum Teil deutlich oberhalb 1000 Ohm mal cm hoch 2 erzielt werden, und die parazelluläre Permeabilität der bovinen BCEC-Monolayer für Sucrose lag annähernd auf dem niedrigen Niveau hochimpermeabler MDCK-Epithelzell-Monolayer und der entsprechenden in vivo-Parameter. Die per se niedrige Permeabilität des in vitro-BHS-Zellkulturmodells konnte sowohl durch Erhöhung des intrazellulären cAMP-Spiegels der BCEC als auch durch Kokultur der BCEC-Monolayer mit C6-Glioma- Zellen zusätzlich deutlich verringert werden. In Kombination konnte dabei ein TEER von über 3000 Ohm mal cm hoch 2 erzielt werden, einem Wert, der deutlich über dem TEER cerebraler pialer Kapillaren in vivo (1000-2000 Ohm mal cm hoch 2) liegt und in BHS-Zellkultursystemen bisher nicht einmal annähernd erreicht wurde. Der Vergleich des im Rahmen dieser Arbeit etablierten in vitro-BHS-Modells mit gut etablierten und charakterisierten BHS-Modellen bestätigten eindeutig dessen hohe Qualität und herausragende Eigenschaften. Im Rahmen eines indirekt-Kontakt-Kokultursystems konnte in zahlreichen Experimenten eindeutig und reproduzierbar gezeigt werden, dass eine Kokultur von postkonfluenten bovinen oder humanen BCECMonolayern mit humanen Makrophagen zu einer durch deutliche Erhöhung des TEER nachweisbaren Verringerung ihrer Permeabilität führte. Die bei den BCEC durch die Makrophagen induzierte TEER-Erhöhung war mit der durch die Kokultur mit C6-Glioma-ZeIlen bewirkten vergleichbar. Eine proinflammatorische Stimulation der Makrophagen vor Beginn der Kokultur zeigte keine eindeutige Beeinflussung ihrer Wirkung auf die mit ihnen kokultivierten BCEC-Monolayer. Eine Infektion der Makrophagen mit zwei verschiedenen HIV-1-Isolaten zeigte trotz Vorhandenseins einer produktiven HIV-1-lnfektion keine Auswirkung auf die von ihnen bewirkte TEER-Erhöhung bei den kokultivierten BCEC-Monolayer, es konnten diesbezüglich keine Unterschiede zwischen uninfizierten und infizierten Makrophagen festgestellt werden. Eine Erhöhung des intrazellulären cAMP-Spiegels führte bei den mit Makrophagen kokultivierten BCECMonolayern wie bei den mit C6-Glioma-Zellen kokultivierten BCEC-Monolayern zu einer zusätzlichen Steigerung des TEER. Die Inhibition der Adenylat-Cyclase und verschiedener Protein-Kinasen (Protein-Kinasen A, C, G und MLCK) zeigte keine Auswirkung auf die von Makrophagen bewirkte TEER-Erhöhung bei den kokultivierten BCEC-Monolayern; die Aktivierung der Protein-Kinase C führte zu dem gleichen Ergebnis. Die Inhibition der Phospholipase C und der Ca2~-vermittelten Aktivierung des Calmodulins zeigte ebenfalls keine Auswirkung auf die durch die Makrophagen- beziehungsweise C6-Kokultur bewirkte TEER-Erhöhung bei den BCEC-Monolayern. Eine Beteiligung der untersuchten Signaltransduktionswege an dem von Makrophagen oder 06 ausgeübten Einfluss auf die BCEC erscheint somit unwahrscheinlich. Der Befund, dass hämatogene Makrophagen in der Lage sind, bei kultivierten BCEC BHS-spezifische Eigenschaften zu induzieren und/oder aufrechtzuerhalten, ist überaus bemerkenswert, da diese Wirkung bislang ausnahmslos Zellen neuroektodermalen Ursprungs (beispielsweise Astrocyten) sowie glialen Zelllinien zugeschrieben wurde. Hämatogene Makrophagen oder davon abgeleitete Zellen des Hirnparenchyms könnten damit ein Teil der Mikroumgebung sein, die in vivo die charakteristischen Eigenschaften von Hirnendothelzellen modulieren, beispielsweise in Form der perivaskulären Mikrogliazellen, die in engem Kontakt mit den cerebralen Blutgefäßen stehen und höchstwahrscheinlich durch aus dem Blutstrom in das Gehirn einwandernde Monocyten/Makrophagen kontinuierlich ersetzt werden. Das in vitro-BHS-Zellkulturmodell wurde weiterhin für pharmakologische Studien eingesetzt, um den Einfluss von Nanopartikeln, die als potentielle brain targeting-Trägersysteme für Arzneistoffe diskutiert werden, auf die Barriere-Eigenschaften postkonfluenter cerebraler Endothelzellen zu untersuchen. Dabei zeigte sich, dass die Zugabe verschiedener Nanopartikel-Präparationen zu postkonfluenten BCECMonolayern zu einer deutlichen und konzentrationsabhängigen Erhöhung deren Permeabilität für Elektrolyte und makromolekulare Substanzen führte.
Ausgangspunkt der Studie ist die These, dass sprachlich und kulturell heterogene Lerngruppen, an denen Studierende mit und ohne spanischsprachigen Familienhintergrund gemeinsam teilnehmen, als eine günstige Lernsituation betrachtet werden können. Voraussetzung dafür ist, dass die unterschiedlichen sprachlichen und kulturellen Gegebenheiten als Ressourcen für den Unterricht verstanden werden.
Mit dem Fokus auf Sprachveranstaltungen in Spanisch, die von Studierenden an der Johann Wolfgang Goethe-Universität Frankfurt am Main besucht werden, und die im Rahmen ihres Lehramtsstudiums im Fach Spanisch stattfinden, wurden in dieser Studie folgende Forschungsfragen verfolgt:
1. Wie entstehen und entwickeln sich Sprachlernprozesse in sprachlich und kulturell vielfältigen Lernkontexten?
2. Wie zeichnet sich das Lernen in sprachlich und kulturell vielfältigen Lernkontexten aus?
3. Welche sprachlichen und kulturellen Ressourcen können für die sprachliche und kulturelle Förderung genutzt und bewusst eingesetzt werden?
Wichtigste Forschungsergebnisse:
Es wurde festgestellt, dass Sprachlernprozesse bei Studierenden mit und ohne spanischsprachigen Familienhintergrund sowohl im kognitiven als auch im emotionalen Bereich qualitativ unterschiedlich verlaufen und, dass in sprachlich und kulturell vielfältigen Lernkontexten individuelle und überindividuelle Sprachlern-prozesse stattfinden, die einander bedingen.
Was das gemeinsame Lernen angeht, konnte festgestellt werden, dass Studierende ohne spanischsprachigen Familienhintergrund widersprüchliche Erwartungen an die Studierenden mit spanischsprachigem Familienhintergrund haben: Einerseits schätzen sie die Präsenz ihrer Kommilitonen und sehen sie als Mittler zwischen dem Unterricht und der Realität außerhalb des Unterrichts, weil sie die „echte“ Sprache und Kultur in den Klassenraum bringen. Anderseits fühlen sie sich durch ihre Anwesenheit im Unterricht verunsichert, was ihre sprachliche Entwicklung zum Teil hemmt. Bei den Studierenden mit spanischsprachigem Familienhintergrund konnten unterschiedliche Phasen in ihrem Sprachlernprozess beobachtet werden, die ihre Lernattitüde und ihre Haltung zu den Kommilitoninnen und Kommilitonen konditionieren.
Entscheidend für die Konstruktion gemeinsamer Sprachlernprozessen ist, dass die Studierenden ihre Positionierung als peer ihrer Kommilitoninnen und Kommilitonen bewusst wahrnehmen, was nicht immer der Fall ist. Auch die Bewusstwerdung der eigenen Funktion als Mittler zwischen Sprachen und Kulturen insbesondere (aber nicht nur) bei Studierenden mit spanischsprachigem Familienhintergrund soll im Unterricht durch die Reflexion über die eigene sprachliche und kulturelle Identität gefördert werden.
Im Umgang mit solchen Lerngruppen haben Dozentinnen und Dozenten unterschiedliche Erwartungen. In der Regel werden aber Lerninhalte vermittelt, die die sprachliche und kulturelle Vielfalt im Unterricht nicht berücksichtigen. Für die Leistungsbewertung beider Studierendengruppen werden oft unterschiedliche Kriterien angewendet, woraus Konflikte zwischen den Veranstaltungsteilnehmerinnen und -teilnehmern entstehen.
Die Rolle der Dozentinnen und Dozenten selbst ist in der Gestaltung gemeinsamer Lernkontexte, in denen die Interaktion der Studierenden gefördert werden, grundlegend. Damit dies gelingt, sollen sie einerseits für Mehrsprachigkeit als Phänomen der Gesellschaft, das den Sprachunterricht im besonderen Maße betrifft, sensibilisiert sein. Andererseits soll ihnen bewusst werden, dass das Sprachenlernen aus einer kognitiven und einer emotionalen Seite besteht, die in engem Zusammenhang mit mehrsprachigen und mehrkulturellen Identitätskonstruktionen stehen. Beide Seiten sollen im Unterricht gefördert werden.
The electron transport chain (ETC) is used by cells to create an electrochemical proton gradient which can be used by the ATP synthase to produce ATP. ETC, also called respiratory chain, is formed in mitochondria by four complexes (complex I-IV) and mediated by two electron carriers: cytochrome c and ubiquinone. Electrons are passed from one complex to another in a series of redox reactions coupling proton pumping from the negative (N) side of the membrane to the positive (P) side. Complex I can introduce electrons into the ETC by oxidizing NADH to NAD+ and reducing quinone (Q) to quinol (QH2). The process accomplishes pumping of four protons across the membrane. Complex II is another electrons entry point. It catalyzes the oxidation of succinate to fumarate while reducing Q to QH2. Complex III, also called cytochrome bc1 complex, can transfer the electrons from QH2 to cytochrome c and couple to proton pumping. In complex III the Q-cycle contributes four proton translocations: two protons are required for the reduction of one quinone to a quinol and two protons are released to the P side. Complex IV (cytochrome c oxidase), the terminal complex of the ETC, catalyzes the electron transfer to oxygen and pumps four protons to the P side. Structures of ETC complexes are available. However, the structure of a hyperthermophilic cytochrome bc1 complex has not been elucidated till now. Additionally, the dimeric crystal structure of cytochrome c oxidase from bovine has been discussed controversially.
To build up a functional complex, cofactors are required. The active site of A- and B-type cytochrome c oxidases contain the high spin heme a which is synthesized by the integral membrane protein heme A synthase (HAS). HAS can form homooligomeric complexes and its oligomerization is essential for the biological function of HAS. HAS is evolutionarily conserved among prokaryotes and eukaryotes. Despite its importance, little is known about the detailed structural properties of HAS oligomers.
During my PhD studies, I focused on the cytochrome c oxidase (AaCcO), the cytochrome bc1 complex (Aabc1) and the heme A synthase (AaHAS) from Aquifex aeolicus. This organism is one of the most hyperthermophilic ones and can live at extremely high temperatures, even up to 95 °C. Respiratory chain complexes provide energy for the metabolism of organisms, and their structures have been studied extensively in the past few years. However, there has been a lack of atomic structures of complexes from hyperthermophilic and ancient bacteria, so little is known about the mechanism of these macromolecular machines under hyperthermophilic conditions. Therefore, my PhD studies had four main objectives: 1) to structurally and functionally characterize AaCcO, 2) to reveal the mechanism of Aabc1 thermal stability based on its structure, 3) to determine the oligomerization of AaHAS, 4) to provide valuable insights into the relationship between function and oligomerization of AaHAS.
1) Structure of AaCcO
Heme-copper oxidases (HCOs) catalyze the oxygen reduction reaction being the terminal enzymes in the plasma membranes in many prokaryotes or of the aerobic respiratory chain in the inner mitochondrial membrane. By coupling this exothermic reaction to proton pumping across the membrane to the P side, they contribute to the establishment of an electrochemical proton gradient. The energy in the proton electrochemical proton gradient is used by the ATP synthase to generate ATP. HCOs are classified into three major families: A, B and C, based on phylogenetic comparisons. The well-studied aa3-type cytochrome c oxidase from Paracoccus denitrificans (P. denitrificans) represents A-family HCOs. So far, the only available structure of the ba3-type cytochrome c oxidase from Thermus thermophilus represents the B-family of HCOs. This family contains a number of bacterial and archaeal oxidases. The C-family contains only cbb3-type cytochrome c oxidases.
The AaCcO is one of the ba3-type cytochrome c oxidases. Based on the genomic DNA sequence analysis, it has been revealed that A. aeolicus possesses two operons coding for cytochrome c oxidases (two different subunit I genes, two different subunit II genes and one subunit III gene). So far, only subunits CoxB2 and CoxA2 were identified. The presence of the additional subunit IIa was reported in 2012. Moreover, a previous paper reported that AaCcO can use horse heart cytochrome c and decylubiquinol as electron donors and the typical cytochrome c oxidase inhibitor cyanide does not block the reaction completely.
In the course of my PhD studies, I performed heterologous expression of AaCcO in Pseudomonas stutzeri (P. stutzeri) and co-expression with AsHAS in Escherichia coli, respectively. The subcomplex CoxA2 and CoxB2 can be purified from P. stutzeri, however, it lacks heme A. Additionally, a protocol for the heterologous production of cytochrome c555 from A. aeolicus was established. In parallel, I also purified the AaCcO from native membranes according to previously reported methods with some modifications. The activity of AaCcO with its native substrate, cytochrome c555, was 14 times higher than with horse heart cytochrome c.
To enable a detailed investigation and comparison of AaCcO and other cytochrome c oxidases, the cryo-EM structure of AaCcO was determined to 3.4 Å resolution. It shows that the three subunits CoxA2, CoxB2, and IIa are tightly bound together to form a dimer in the membrane. Surprisingly, CoxA2 contains two additional TMHs (TMH13 and TMH14) to enhance the protein stability. The cofactors heme a3, heme b, CuA and CuB are also identified. Interestingly, two molecules of 1,4-naphthoquinone and cardiolipin were observed in the dimer interface. Based on the structure analysis, the AaCcO possesses only the K-pathway for proton delivery to the active site and proton pumping.
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Trotz der Verfügbarkeit von siRNA, dem aktuellen Goldstandard zur Generierung von RNAInterferenz-vermitteltem Gen-silencing, stellen unerwünschte Immunantworten des Organismus auf doppelsträngige RNA exogenen Ursprungs noch immer ein fundamentales Problem dar, besonders mit Hinblick auf die Entwicklung Oligonukleotid-basierter Wirkstoffe.
Durch das begrenzte Repertoire an Modifikationen, welches durch die Abhängigkeit von zelleigenen Faktoren unter anderem zur Steigerung der intrazellulären Stabilität und zur Reduktion unerwünschter Effekte zur Verfügung steht, konnte bis dato nur einer überschaubaren Anzahl entsprechender Oligonukleotide eine offizielle Zulassung für die therapeutische Anwendung in der Medizin erteilt werden.
Hier bergen künstliche Ribonukleasen, welche die Umesterungsreaktion unabhängig von der zellinternen Maschinerie ebenfalls effizient und sequenzspezifisch bewerkstelligen können, großes Potential als eine Alternative. Während Metall-basierte Systeme in der Regel auf unphysiologisch hohe Konzentrationen zweiwertiger Übergangsmetallionen, wie beispielsweise Lanthanoide oder auch Kupfer, angewiesen sind, könnten metallfreie Katalysatoren dahingehend eine wesentlich flexiblere Option darstellen. Die Optimierung Guanidin-basierter RNA-Spalter für den Einsatz in der Bioanalytik und Medizin stellt seit geraumer Zeit eines der obersten Ziele unseres Arbeitskreises dar. Unter diesen bewährte sich vor allem das Tris(2-aminobenzimidazol), welches in Form von Konjugaten mit Antisense-Oligonukleotiden kurze Modellsubstrate sequenzspezifisch spaltet.
Neben der äußerst mühseligen, vielstufigen Synthese eines konjugierbaren Tris(2-aminobenzimidazol)s waren die untersuchten Systeme mit Halbwertszeiten von teilweise über 20 Stunden jedoch viel zu langsam, um auch potentiell beobachtbare Veränderung des Phänotyps in vivo induzieren zu können. Ein weiterer begrenzender Faktor stellte die Konjugationstrategie des Spalters über Aktivester-Chemie und Aminolinker dar, welche eine Kupplungsausbeute von 0 % bis im besten Fall ca. 30 % lieferte. Um eine Methode zu erhalten, welche routinemäßig zur sequenzspezifischen Spaltung einer Vielzahl verschiedener RNA-Substrate genutzt werden kann, war folglich eine praktikablere Synthesestrategie zur Darstellung der Spalterkonjugate einerseits und zudem eine Erhöhung der Katalysatoraktivität andererseits notwendig, um auch kurzlebige Ziel-RNAs wirkungsvoll ausschalten zu können. In diesem Zusammenhang wurde eine neue Syntheseroute erarbeitet, welche den für die Konjugation funktionalisierten Spalter über wenige Stufen in Mengen von über 10 g lieferte. Daran anschließend konnte die Synthese eines Phosphoramidits realisiert werden, welches in einer manuellen Kupplungsprozedur die Darstellung von 5‘-Konjugaten des Tris(2-aminobenzimidazol)s in exzellenten Ausbeuten und, im Vergleich zur vorherigen Methode, wesentlich kürzeren Kupplungszeiten ermöglichte. Die vollständige Kompatibilität des Phosphoramidits mit der automatisierten Festphasensynthese konnte im Rahmen dieser Arbeit jedoch nicht erreicht werden. Während die manuelle Prozedur Konjugationsausbeuten von über 90 % lieferte, wurden an einem handelsüblichen Oligonukleotid-Synthesizer auch nach Modifikation der Kupplungsprotokolle und bei erhöhtem Amiditverbrauch lediglich 65 %erzielt. Durch Inkorporation von LNA-Nukleotiden in zwei gegen die PIM1-mRNA gerichtete 15mer DNA-Konjugate ließ sich eine Reduktion der Halbwertszeit von Cy5-markierten 22mer Modellsubstrate auf unter 4 h erreichen, wobei dieses Resultat auch anhand eines 412mer Modellsubstrats und in Gegenwart hoher Phosphatkonzentrationen reproduziert werden konnte. Darüber hinaus wurde die besondere Rolle des closing base pairs, sowohl bezüglich der Selektivität als auch der Kinetik der Spaltung, offensichtlich. Während stärker hybridisierende GC-Basenpaare generell eine hohe Präzision gewährleisteten, trat im Falle von AT-Basenpaaren fraying auf, d. h. es konnte auch innerhalb des vermeintlichen Duplex Spaltung beobachtet werden. Genauere Studien zur Positionierung von LNA-Nukleotiden ergaben bei unmittelbarer Lokalisation am 5‘-Terminus von AT-closing base pairs zwar einen selektivitätssteigernden Effekt, überraschenderweise konnte in diesem Fall jedoch auch eine Inhibierung der Spaltungskinetik festgestellt werden. Durch Verschiebung in die vorletzte Position konnte die Aktivität des Konjugats ohne Präzisionsverlust jedoch wiederhergestellt werden. Erste Experimente zur intrazellulären Stabilität der Spalterkonjugate ergaben quantitative, stufenweise Zersetzung, sowohl des DNA- als auch der Mixmer-Konjugate nach wenigen Stunden, was die Notwendigkeit weiterer stabilitätssteigernder Modifikationen zur Vorbereitung auf in vivo-Experimente impliziert. Auf der Suche nach neuen Spaltern stellte sich vor allem das 2-Aminoimidazol als einer der aussichtsreichsten Kandidaten für genauere Untersuchungen heraus. Das korrespondierende Tris(2-aminoimidazol) konnte über eine Marckwald-Synthese in wenigen Stufen dargestellt werden. Erste Spaltexperimente ergaben vor allem in niedrigen Konzentrationen (10 μM) eine im Vergleich zum Benzimidazol-Analogon vielfach höhere Aktivität. Obwohl die Synthese eines funktionalisierten Bisimidazol-benzimidazols gelang, steht dessen Konjugation mit Oligonukleotiden und deren Aktivitätsbestimmung noch aus.
Im EU-Projekt „Regulatory Control Networks of Synthetic Lethality“ (SYNLET) wurden durch Vergleich der Genexpressionsprofile auf Transkriptionsebene von parentalen sensitiven Neuroblastom-Zelllinien und ihren Vincristin-resistenten Sublinien bioinformatisch 40 Kandidatengene ermittelt, die für Vincristin-Resistenz und damit Zellüberleben essentiell sein könnten. Diese Kandidatengene wurden im Rahmen dieser Dissertation einzeln in Neuroblastomzellen der Vincristin-resistenten Sublinie UKF-NB-2rVCR20 herunterreguliert durch Transfektion (Elektroporation) von small interfering RNAs (siRNAs; knock down). Anschließend wurden die Zellen ohne und mit verschiedenen Vincristin-Konzentrationen auf Zellviabilitätsveränderungen getestet. Beim Kandidatengen mit den niedrigsten Zellviabilitäten (SMARCC1) wurde ein Western Blot gemacht, um die Herunterregulierung zu bestätigen. Zu Beginn wurde das effektivste Programm zur Elektroporation der UKF-NB-2rVCR20-Zellen durch eine Transfektionsoptimierung ermittelt. Alle Kandidatengene wurden 2x transfiziert, bei unklaren oder besonders interessanten Ergebnissen auch 3x. Als positive Kontrolle wurde der ABC-Transporter MDR1 herunterreguliert, da hier die Auswirkungen auf die Resistenz gegen Vincristin bekannt sind. Bei 10 von 40 Kandidatengenen waren die Zellviabilitäten ohne Vincristin und/oder bei mindestens einer Vincristin-Konzentration extrem verändert (FOXJ1, MAP2K1, NFYB, RICS, SMARCA1, SMARCB1, SMARCC1, STK35, TOCA1 und TPM2). Das entspricht einem Prozentsatz von 25 % Kandidatengenen, bei denen die bioinformatisch vorhergesagte Wirkung in vitro bestätigt werden konnte. Allerdings sind bei diesen 10 effektiven Kandidatengenen auch 2 Gene dabei, nach deren Herunterregulierung es zu einer erhöhten Zellviabilität kam (FOXJ1 und RICS). Bei der Frage, welche Gene das Absterben der Tumorzellen beschleunigen und als ein mögliches Therapieziel in Frage kommen könnten, bleiben also 8 Kandidatengene (20 % aller Kandidatengene). Das interessanteste Kandidatengen ist SMARCC1, da die Herunterregulierung alleine (ohne Zugabe von Vincristin) zu einer massiven Abnahme der Zellviabilität führte. Damit stellt SMARCC1 ein interessantes Ziel zur Therapie in Tumorzellen dar.
This dissertation analyses the degrees and trajectories of financialisation in the region of South-Eastern Europe. It modifies and applies an eclectic comparative framework for comparing the degrees of financialisation across time and space on different levels. The thesis finds that from the turn of the century until the Great Financial Crisis of 2008, most South-Eastern European countries have increased their degree of financialisation on the different levels, especially on the levels of household, international financialisation and partly the financial sector. Financialisation of non-financial companies is barely existing. After the financial crisis, financialisation is revealed to stagnate in the region. In a second step, the dissertation conducts three case studies on extreme cases: financial sector financialisation in Bulgaria, international financialisation in Serbia and non-financial company and household financialisation in Croatia. Their trajectories are exposed to be mainly driven by deregulation, changed practices by foreign banks, the privatisation of public goods and the liberation of capital controls. The dissertation serves to geographically enlarge the research of financialisation to a peripheral region of the Global North and to add to the discussion on comparative financialisation approaches.
Autophagy is an important degradation pathway mediating the engulfment of cellular material (cargo) into autophagosomes followed by degradation in autophagosomes.
Different stress stimuli, e.g. nutrient deprivation, oxidative stress or organelle damage, engage autophagy to maintain cellular homeostasis, recycle nutrients or remove damaged cell organelles. Autophagy not only degrades bulk cytoplasmic material but also selective autophagic cargo, for example lysosomes (lysophagy), mitochondria (mitophagy), ER (ER-phagy), lipid droplets (lipophagy), protein aggregates (aggrephagy) or pathogens (xenophagy). Selective autophagy pathways are regulated by selective autophagy receptors which bind to ubiquitinated cargo proteins and link them to LC3 on the autophagosomal membrane.
Ubiquitination is an essential post-translational modification controlling different cellular processes such as proteasomal and lysosomal degradation or innate immune signaling.
M1-linked (linear) poly-Ubiquitin (poly-Ub) chains are exclusively assembled by the E3 ligase linear ubiquitin chain assembly complex (LUBAC) and removed by the M1 poly-Ub-specific OTU domain-containing deubiquitinase with linear linkage specificity (OTULIN). In addition to key functions in innate immune signaling and nuclear factor-κB (NF-κB) activation, M1 ubiquitination is also implicated in the regulation of autophagy.
LUBAC and OTULIN control autophagy initiation and maturation and the autophagic clearance of invading bacteria via xenophagy. However, additional functions of LUBAC- and OTULIN-regulated M1 ubiquitination in autophagy are largely unknown and it also remains unexplored if LUBAC and OTULIN control other selective autophagy pathways in addition to xenophagy. This study aimed to unravel the role of LUBAC- and OTULIN-controlled M1 ubiquitination in bulk and selective autophagy in more detail.
In this study, characterization of OTULIN-depleted MZ-54 glioblastoma (GBM) cells revealed that OTULIN deficiency results in enhanced LC3 lipidation in response to autophagy induction and upon blockade of late stage autophagy with Bafilomycin A1 (BafA1). Furthermore, electron microscopy analysis showed that OTULIN-deficient cells have an increased number of degradative compartments (DGCs), confirming enhanced autophagy activity upon loss of OTULIN. APEX2-based autophagosome content profiling identified various OTULIN-dependent autophagy cargo proteins. Among these were the autophagy receptor TAX1BP1 which regulates different forms of selective autophagy (e.g. lysophagy, aggrephagy) and the glycan-binding protein galectin-3 which serves key functions in lysophagy, suggesting a role of OTULIN and M1 poly-Ub in the regulation of aggrephagy and lysophagy.
Abstract 2
To study aggrephagy, protein aggregation was induced with puromycin which causes premature termination of translation and accumulation of defective ribosomal products (DRiPs). Loss of OTULIN increased the number of M1 poly-Ub-positive foci and insoluble proteins and reduced the levels of soluble TAX1BP1 and p62 in response to puromycin-induced proteotoxic stress.
Intriguingly, upon induction of lysosomal membrane permeabilization (LMP) with the lysosomotropic drug L-Leucyl-L-Leucine methyl ester (LLOMe), M1 poly-Ub strongly accumulated at damaged lysosomes and colocalized with TAX1BP1- and galectin-3-positive puncta. M1 poly-Ub-modified lysosomes formed a platform for NF-κB essential modulator (NEMO) and inhibitor of κB (IκB) kinase (IKK) complex recruitment and local NF-κB activation in a K63 poly-Ub- and OTULIN-dependent manner. Furthermore, inhibition of lysosomal degradation enhanced LLOMe-induced cell death, suggesting pro-survival functions of lysophagy following LMP. Enrichment of M1 poly-Ub at damaged lysosomes was also observed in human dopaminergic neurons and in primary mouse embryonic cortical neurons, confirming the importance of M1 poly-Ub in the response to lysosomal damage.
Together, these results identify OTULIN as a negative regulator of autophagy induction and the autophagic flux and reveal OTULIN-dependent autophagy cargo proteins.
Furthermore, this study uncovers novel and important roles of M1 poly-Ub in the response to lysosomal damage and local NF-κB activation at damaged lysosomes.
Nach der Entdeckung und strukturellen Aufklärung des Ribosoms war bekannt, dass neben den Proteinen auch regulatorische RNA Sequenzen für die Steuerung biologischer Prozesse im Organismus verantwortlich sind. Dazu zählt unter anderem das trans-activation responsive element (TAR) aus HIV-1, welches am terminalen 5' Bereich (1-59) aller HIV-1 mRNAs eine identische bulge-loop Struktur ausbildet. Die basale Trans-kription des integrierten HIV Promotors ist in Abwesenheit des viralen trans-activator of transcription (Tat) sehr gering (und abhängig von zellulären Transkriptionsfaktoren). Sobald Tat exprimiert wird, bindet es zusammen mit dem humanen positive trancription elongation factor b (p-TEFb) spezifisch an TAR und aktiviert die Transkriptionsrate des viralen Genoms und die Bildung von volllängen Transkripten drastisch. Die Notwendigkeit der Tat-vermittelten Aktivierung als Grundlage einer funktionierenden HIV Replikation macht dieses System zu einem hoch interessanten Target für eine antivirale HIV Therapie. Basierend auf der Hemmung des Tat/TAR Komplexes wurde in den vergangen Jahren eine Reihe von Verbindungen identifiziert, die zwar in-vitro eine inhibierende Wirkung zeigten, aber keine von ihnen konnte bis jetzt als Therapeutikum Verwendung finden. So wäre die noch ausstehende Entdeckung eines effizienten Tat Antagonisten, der ohne die zelleigene Transkription zu beeinträchtigen eine Reduzierung der Virusreplikation von 80 - 90 % akut infizierter Zellen bewirkt, ein bedeutender Durchbruch in der HIV Forschung. Durch eine längere Behandlung von chronisch infizierten Zellen könnte so die Transkription des viralen Genoms abgeschaltet und dadurch eine Eliminierung latenter HIV Reservoirs ermöglichen werden.
Das Ziel dieser Arbeit war die Entwicklung neuartiger TAR Liganden, zunächst auf Grundlage eines nicht auf Strukturmodellen beruhenden Ligandenscreenings, gefolgt von einem strukturbasierten Ligandendesign. Bei der Suche nach potentiellen Wirkstoffen, beschränkte man die Auswahl der untersuchten Verbindungen auf Guanidin- und Amidinanaloga. Dazu zählten einfache Guanidinderivate mit unterschiedlichen aromatischen Resten sowie heterocyclische Verbindungen, wie Isochinoline, Chinazoline, Perimidine und Phenanthridine. Die Bindungsaffinitäten dieser Wirkstoffkandidaten in Bezug zu TAR wurden über einen FRET Assay nach Matsumoto[1] bestimmt. Eine Auswahl an Verbindungen wurde zudem über eine NMR Titration charakterisiert (AK Schwalbe). Dadurch konnte beobachtet werden, an welcher Position die Liganden mit der TAR RNA in Wechselwirkung treten. Bei diesen Untersuchungen zählten 1,7-
Diaminochinolin (IC50 = 150 µM), 2,4,6-Triaminochinazolin (IC50 = 40 µM) sowie 6,8-Diaminophenanthridin (IC50 = 15 µM) zu den aktivsten Verbindungen.
Um eine Aussage über die Bindungsposen treffen zu können, wurde mittels HF-docking Methoden die Komplexgeometrie energetisch optimiert. Ausgehend von diesen Bindungsmodellen entwickelte man eine Leitstruktur, die als Grundlage eines strukturbasierten Ligandendesigns diente. Im Fokus stand hierbei die Entwicklung einer GC-Basenpaar erkennenden Untereinheit. Mit 3,5-Diamino-9-methyl-3,4,9,10-tetrahydro-1H-pyrrolo[3,4-b]phenanthridin-8(2H)-on (IC50 = 45 µM) konnte ein Ligand identifiziert werden, der im NMR Titrationsexperiment ausschließlich am Basenpaar G26/C39 von TAR eine Verschiebung der Iminoprotonen induzierte. In einem weiteren Projekt versuchte man eine Selektivitätssteigerung durch simultane Adressierung zweier Bindungsstellen zu erreichen. Nachdem im NMR Experiment gezeigt werden konnte, dass 2,4,6-Triaminochinazolin mit hoher Affinität an zwei verschiedenen Bereichen der RNA bindet, wurden eine Reihe dimerer 2,4,6-Triaminochinazolinderivate mit unterschiedlich langen Linkern hergestellt. Mit diesem Ansatz gelang es den hoch affinen Liganden N6,N6'-(1,4-phenylenbis(methylen))bis(chinazolin-2,4,6-triamin) (IC50 = 150 nM) zu identifizieren.
Subject of this thesis is the non-perturbative investigation of the thermal transition in Quantum Chromodynamics by means of lattice gauge theory and a particular type of lattice fermions, the so-called twisted mass fermions. These fermions offer the possibility of improvement as compared to the standard Wilson-type formulation. We investigate the properties of these fermions at finite temperature, i.e. the structure of the bare parameter space as well as leading order cutoff effects in the weak coupling limit. Then we focus on two-flavour simulations at finite pion mass. We identify the (pseudo-)critical temperatures for our set of pion masses (300 to 500 MeV) and discuss the extrapolation to the chiral limit for which the nature of the transition is still an open question. Besides pseudo-critical temperatures we consider the magnetic equation of state and screening observables. We find that the assumption of a second order transition (in the 3d O(4) universality class) agrees with our data without being able to exclude alternatives. Finally, we discuss the future inclusion of strange and charm quarks in dynamical twisted mass simulations and look at the corresponding cutoff effects in the free limit.
In der vorliegenden Dissertation werden mit einem chiralen SU(3)-Modell die thermodynamischen Eigenschaften von stark wechselwirkender hadronischer Materie und die mikroskopischen Medium-Eigenschaften von Hadronen bei hohen Temperaturen und hohen Baryonen-Dichten untersucht. Das verwendete chirale Modell ist ein erweitertes sigma-omega-Modell in Mittlerer-Feld-Näherung (Mean-Field) mit baryonischen und mesonischen effektiven Freiheitsgraden; es basiert auf spontan gebrochener chiraler Symmetrie und Skaleninvarianz. Das Phasenübergangsverhalten des chiralen Modells wird systematisch untersucht und dabei gezeigt, dass es signifikant von den Kopplungen zusätzlicher schwererer hadronischer Freiheitsgrade ('Resonanzen') abhängt. Durch entsprechende Ankopplung des niedrigsten baryonischen Dekupletts kann ein Phasendiagramm in qualitativer Übereinstimmung mit aktuellen Vorhersagen der Gitter-QCD erreicht werden. Alternativ wird die Ankopplung einer schweren baryonischen Test-Resonanz untersucht, welche effektiv für das Spektrum der schweren hadronischen Zustände steht. Hier ergibt sich für einen bestimmten Bereich der Kopplungen sogar eine quantitative Übereinstimmung zu den Gitter-QCD-Vorhersagen bei gleichzeitig guter Beschreibung der Grundzustandseigenschaften von Kernmaterie. Für diese Zustandsgleichung werden Vorhersagen (innerhalb der Modellannahmen) zu geplanten Experimenten gemacht -- konkret wird gezeigt, dass der Phasenübergangsbereich für das CBM Experiment des geplanten Beschleunigerzentrums FAIR an der GSI Darmstadt experimentell zugänglich ist. Weiter wird das chirale Modell auf die Beschreibung von experimentellen Teilchenzahlverhältnissen (Yield-Ratios) aus Schwerionen-Kollisionen von AGS, SPS und RHIC angewendet. Studiert werden Parametersätze mit stark unterschiedlichen Phasendiagrammen aufgrund unterschiedlicher Ankopplung des baryonischen Dekupletts sowie ein ideales Hadronengas. Bei den niedrigen und mittleren Kollisionsenergien zeigt sich eine verbesserte Beschreibung durch die chiralen Parametersätze im Vergleich zum idealen Hadronengas, besonders deutlich für Parametersätze mit Phasendiagramm ähnlich der Vorhersage aus der Gitter-QCD. Die Wechselwirkung im chiralen Modell führt zu Medium-Modifikationen der chemischen Potentiale und der Hadronenmassen. Die resultierenden Ausfrierparameter mu und T sind deshalb gegenüber dem nichtwechselwirkenden Fall signifikant verändert. An den Ausfrierpunkten zeigen sich deutliche Abweichungen der effektiven Massen von den Vakuummassen (5 bis 15 %) und des effektiven baryo-chemischen Potentials vom ursprünglichen Wert (bis zu 20 %). Ferner werden universelle Kriterien für das Ausfrieren diskutiert und isentrope Expansion zu den Ausfrierpunkten untersucht, wo sich eine starke Abhängigkeit der Trajektorien von der Zustandsgleichung ergibt. Schließlich wird der Einfluss des Dilaton-Felds (Gluonkondensat) auf das Phasenübergangsverhalten bei mu=0 studiert, indem das Gluonkondensat an die Dekuplett-Baryonen gekoppelt wird. Es zeigt sich, dass dadurch eine Restauration der Skaleninvarianz im Modell möglich wird, die gleichzeitig auch eine vollständige Restauration der chiralen Symmetrie bewirkt. Die Restauration der Skaleninvarianz erfolgt erst bei Temperaturen, die oberhalb der chiralen Restauration (im nichtseltsamen Sektor) liegen. Diese Modellerweiterung ermöglicht es, zukünftig das Phasenübergangsverhalten -- Restauration von chiraler Symmetrie und Skaleninvarianz -- auch bei nichtverschwindenden Baryonendichten zu untersuchen. Die Resultate dieser Arbeit zeigen die Wichtigkeit der schweren hadronischen Zustände, der Resonanzen, für das QCD-Phasendiagramm. Für die Zukunft ist eine Ankopplung des gesamten hadronischen Massenspektrums an das Modell erstrebenswert, wie sich sowohl aus der Untersuchung der Modellerweiterung um eine Test-Resonanz als auch aus der Anwendung auf experimentelle Teilchenzahlverhältnisse ergibt.
Die Bande q23 auf Chromosom 11 ist in zahlreiche reziproke chromosomale Translokationen verwickelt. Diese sind dominant mit dem Krankheitsphänotyp einer AML, ALL und seltener mit malignen Lymphomen und myelodysplastischen Syndromen assoziiert. Mittlerweile sind fünfundachtzig cytogenetische Aberrationen der Bande 11q23 bekannt. Das auf 11q23 betroffene Gen wird als das Mixed Lineage Leukemia (MLL), Acute Lymphoblastic Leukemia (ALL-1), Human Homolog of trithorax (HRX) oder als Human Trithorax 1 (Htrx1) bezeichnet. Die häufigsten Partnergene des MLL sind AF4 (40 %), AF9 (27 %), sowie ENL, AF6, ELL und AF10 (4-7 %).
Die Bruchpunkte von t(11;V) Translokationen sind nicht gleichmäßig über das gesamte, 92 kb große humane MLL-Gen verteilt, sondern liegen alle in der 8,3 kb großen Bruchpunktsregion Bpr. Auch innerhalb der Bpr ist die Verteilung der Translokationsbruchpunkte nicht homogen. Die Bruchpunkte von Patienten mit de novo Leukämien und einem Alter über einem Jahr liegen mehrheitlich in der 5’-Hälfte der Bpr, dem Subcluster I. Dagegen liegen die Bruchpunkte von Patienten mit therapiebedingten Leukämien und einem Alter unter einem Jahr überwiegend in der 3’-Hälfte der Bpr, dem Subcluster II.
Neuere Forschungsergebnisse zeigten, daß DNA-Doppelstrangbrüche auf zwei verschiedenen Chromosomen eine hinreichende Voraussetzung für das Entstehen chromosomaler Translokationen sind. Aufgrund der inhomogenen Verteilung der Translokationsbruchpunkte im MLL-Gen stellte sich die Frage, ob bestimmte Regionen dieses Gens für DNA-Doppelstrangbrüche prädisponiert sind. Interessanterweise ist Subcluster II extrem sensitiv gegenüber DNA-Doppelstrangbrüchen, die durch cytotoxische Agenzien oder Apoptose-auslösende Ereignisse induziert werden können. In unserer Arbeitsgruppe konnte eine etwa 200 bp große Region lokalisiert werden, über die sich nahezu alle Etoposid-induzierten DNA-Doppelstrangbrüche verteilten.
In dieser Arbeit konnte gezeigt werden, daß die Bildung von DNA-Doppelstrangbrüchen in dieser Region durch die Gabe eines Caspase-Inhibitors gehemmt werden kann. Eine Etoposid-induzierte Protein-DNA-Wechselwirkung konnte allerdings nicht nachgewiesen werden. In der Literatur fanden sich Hinweise darauf, daß Subcluster II im Gegensatz zu Subcluster I eine verstärkte Histonacetylierung aufweist. Basierend auf diesen Hinweisen sollte die Arbeitshypothese untersucht werden, ob Subcluster II einen geninternen Promotor des MLL-Gens darstellt.
Die potentielle Promotorregion wurde zunächst durch Computeranalysen eingegrenzt. Mit RT-PCR Experimenten wurde anschließend der potentielle geninterne Promotor des murinen Mll-Gens in einer murinen Fibroblastenzellinie lokalisiert, die einen Transkriptionsstop und eine Polyadenylierungssequenz in Exon 4 des Mll-Gens trug. Um die am Mausmodell gewonnenen Erkenntnisse auch im humanen System zu überprüfen, wurde die geninterne Promotorregion des humanen MLL Gens vor ein Luciferasereportergen kloniert. Durch RTPCR konnte der geninterne Transkriptionsstart im Subcluster II des humanen MLL-Gens lokalisiert werden. Damit konnte zum ersten Mal gezeigt werden, daß Transkriptionsinitiation und genetische Instabilität im Subcluster II des humanen MLL-Gens kolokalisieren.
Durch Deletionsmutanten wurde die Bedeutung der einzelnen Module dieser Promotorregion ermittelt. Dabei zeigte sich, daß die Anwesenheit von zwei retromobilen Elementen eine Enhancer-Funktion haben. Demgegenüber zeigte die homologe murine Sequenz, die in unserer Arbeitsgruppe gleichzeitig von S. Scharf untersucht wurde und für die keine erhöhte Anfälligkeit für DNA-Doppelstrangbrüche bekannt ist, nur eine schwache Promotoraktivität. Dies weist auf einen Zusammenhang zwischen der genetischen Instabilität von Subcluster II und der Rate geninterner Transkriptionsinitiationsprozesse hin.
Das Protein, für das das Transkript des geninternen murinen Promotors kodiert, wurde mittels immunhistologischer und Western Blot Experimente nachgewiesen. Dabei konnte gezeigt werden, daß dieses Protein, wie auch das MLL-Protein, proteolytisch durch Taspase1 und daß sich ein Mini-MLL-Komplex bildet.
Ob Klimawandel oder Luftverschmutzung: Die chemischen und physikalischen Prozesse in der Atmosphäre haben wichtige Auswirkungen auf die menschliche Gesundheit und Ökosysteme. Dabei ist die Atmosphäre mehr als ein Gemisch aus Stickstoff, Sauerstoff, Wasserdampf, Helium und Kohlenstoffdioxid. Es gibt zahlreiche Spurengase, deren Gesamtanteil am Volumen weniger als 1 % ausmacht. In dieser Arbeit werden Stickstoffoxide, Schwefeldioxid, Kohlenstoffmonoxid und Schwefelsäure näher betrachtet, die im Rahmen der flugzeugbasierten Messkampagne Chemistry of the Atmosphere: field experiment in Europe (CAFE-EU)/BLUESKY gemessen wurden.
Die Stickstoffoxide NO und NO2, als NOx zusammengefasst, besitzen hauptsächlich anthropogene Quellen, allen voran fossile Verbrennung und industrielle Prozesse. Zwischen NO und NO2 besteht ein photochemisches Gleichgewicht, sodass in der Atmosphäre vor allem NO2 in relevanten Konzentrationen vorkommt; dies wirkt aufgrund der Bildung von Salpetersäure, HNO3, in wässriger Lösung beim Einatmen ätzend und ist entsprechend gesundheitsschädlich. Troposphärisches Ozon, O3, wesentlicher Bestandteil von Sommersmog, wird hauptsächlich durch die Reaktion von NO mit Peroxiden (HO2 und RO2) gebildet. In der Stratosphäre entstehen NOx hauptsächlich durch die Photodissoziation von Lachgas, N2O, das aufgrund seiner langen Lebenszeit von der Tropo- in die Stratosphäre transportiert werden kann und dort die wichtigste Stickstoffquelle darstellt. In der Stratosphäre tragen NOx zum katalytischen Abbaumechanismus des Ozons bei (Bliefert, 2002; Seinfeld and Pandis, 2016).
Schwefeldioxid, SO2, ist ein toxisches Gas, dessen atmosphärische Quellen hauptsächlich anthropogen sind, nämlich fossile Verbrennung und industrielle Prozesse; Senken sind trockene und feuchte Deposition, wobei letztere zu saurem Regen führen kann. Seit den 1980ern sinken die globalen SO2-Emissionen. SO2 kann in der Atmosphäre zu Sulfat und Schwefelsäure oxidiert werden, was Hauptbestandteil des Wintersmogs ist. Der wichtigste Mechanismus ist die Oxidation mit dem Hydroxylradikal, OH˙, unter Beteiligung von Wasserdampf. In der Stratosphäre ist Carbonylsulfid, OCS, die wichtigste Schwefelquelle, da es analog zum N2O dank seiner langen Lebenszeit von der Tropo- in die Stratosphäre transportiert werden kann (Bliefert, 2002; Seinfeld und Pandis, 2016). Typische Konzentrationen von Schwefelsäure sind 105 cm–3 nachts und 107 cm–3 tagsüber in der Troposphäre sowie 105 cm–3 tagsüber in der Stratosphäre (Clarke et al., 1999; Weber et al., 1999; Fiedler et al., 2005; Arnold, 2008; Kürten et al., 2016; Berresheim et al., 2000).
Kohlenstoffmonoxid, CO, ist ein toxisches Gas, das zu gleichen Teilen durch direkte Emissionen (v.a. Biomasseverbrennung und fossile Verbrennung) und In-situ-Oxidation (v.a. von Methan, Isopren und industriellen Kohlenwasserstoffen) in die Atmosphäre gelangt. Die Hauptsenke ist die Reaktion mit OH˙ in der Troposphäre. Seit 2000 sinkt die globale CO-Konzentration (Bliefert, 2002).
Doch neben Gasen sind auch Aerosolpartikel fester Bestandteil des Gemisches Luft, welche luftgetragene feste oder flüssige Teilchen sind. Primäre Aerosolpartikel werden direkt als solche in die Atmosphäre emittiert, während sekundäre Aerosolpartikel in der Atmosphäre gebildet werden, indem gasförmige Vorläufersubstanzen mit geringer Flüchtigkeit auf primären Partikeln kondensieren oder durch Zusammenclustern und Anwachsen komplett neue Partikel bilden. Aerosolpartikel ermöglichen als Wolkenkondensationskeime erst die Bildung von Wolken und wirken somit – neben ihrem direkten reflektierenden Effekt – durch Änderung der Wolkenbedeckung und -eigenschaften insgesamt kühlend aufs Klima und beeinflussen die lokalen und globalen Wasserkreisläufe. Doch sie haben auch negative Auswirkungen auf die menschliche Gesundheit und sind für eine Verkürzung der durchschnittlichen Lebensdauer in Regionen mit hohen Feinstaubbelastungen verantwortlich (Seinfeld und Pandis, 2016; Bellouin et al., 2020; World Health Organization, 2016).
Neben den bisher betrachteten neutralen, also ungeladenen Gasen und Partikeln sind Ionen in der Gasphase sowie geladene Partikel ebenfalls Bestandteil der Atmosphäre. Sie spielen bei vielen atmosphärischen Prozessen eine wichtige Rolle, wie etwa bei Gewittern, Radiowellenübertragung und ionen-induzierter Nukleation von Aerosolpartikeln. Die Hauptquellen für Ionisation in der Tropo- und Stratosphäre ist die galaktische kosmische Strahlung, die entgegen ihrem Namen hauptsächlich aus Protonen und α-Partikeln (primäre Partikel genannt) besteht und in der Erdatmosphäre durch Kollision mit Luftmolekülen Teilchenschauer von sekundären Partikeln (u.a. Myonen, Pionen und Neutrinos) hervorruft. Die primären und sekundären Partikel können die Luftmoleküle ionisieren unter Entstehung von N+, N2+, O+, O2+ und Elektronen. Sauerstoff reagiert rasch mit letzteren zu O– und O2–. Diese Kationen und Anionen reagieren weiter, bis Ionenclustern der Summenformeln (HNO3)n(H2O)mNO3– und H+(H2O)n(B)m gebildet werden, wobei B Basen wie Methanol, Aceton, Ammoniak oder Pyridin sind. Weitere Ionisationsquellen sind der Zerfall des Radioisotops 222Rn in Bodennähe und ionisierende Solarstrahlung oberhalb der Stratosphäre. Atmosphärische Ionen haben zwei wichtige Senken: die Wiedervereinigung, auch Rekombination genannt, bei der sich ein Kation und ein Anion gegenseitig neutralisieren sowie das Anhaften an Aerosolpartikeln. Letztere Senke ist vor allem in der Troposphäre aufgrund der relativ hohen Konzentration an Aerosolpartikeln relevant (Arnold, 2008; Viggiano und Arnold, 1995; Bazilevskaya et al., 2008; Hirsikko et al., 2011).
The role of orthographic knowledge for reading performance in German elementary school children
(2021)
Reading is crucial for successful participation in the modern world. However, 3-8% (e.g., Moll et al., 2014) of children in elementary school age show reading difficulties, which can lead to limited education and enhance risks of social and financial disadvantages (Valtin, 2017). Therefore, it is important to identify reading relevant components (Tippelt & Schmidt-Hertha, 2018). In this context, especially phonological awareness (i.e., awareness of the sound structure of the language) and naming speed (i.e., fast and automatized retrieval of information) were identified as significant components for reading skills (e.g., Georgiou et al., 2012; Landerl & Thaler, 2006; Vellutino, Fletcher, Snowling, & Scanlon, 2004). One further component, which is of growing interest to the recent research, is orthographic knowledge. It comprises the knowledge about the spelling of specific words (word-specific orthographic knowledge) and about legal letter patterns (general orthographic knowledge; Apel, 2011).
Previous research focused predominantly on examining the role of orthographic knowledge on basic reading level, including word identification and word meaning (Conrad et al., 2013; Rothe et al., 2015). The relationship between orthographic knowledge and reading comprehension as the core objective of reading, including understanding of the relationship between words within a sentence as well as building a coherence between sentences (Perfetti et al., 2005), was on the contrary scarcely the object of research. The first goal of this dissertation is, therefore, to provide a remedy by investigating the role of orthographic knowledge on higher reading processes (sentence- and text-level). The scarce body of research investigating children with reading difficulties provide a mixed result pattern (e.g., Ise et al., 2014). Therefore, this dissertation aims at clarifying the influence of orthographic knowledge on word-, sentence-, and text-level in children without and with reading difficulties.
A thorough understanding of reading relevant components is also important for conception of interventions aiming at individual reading performance improvements in order to prevent school failure. One promising approach to help children to overcome their reading difficulties is a text-fading based reading training. During this procedure, reading material is faded out letter by letter in reading direction (i.e., in German from left to right; Breznitz & Nevat, 2006). The aim of this manipulation is to prompt the individual to read faster than usual, resulting in reading rate and comprehension improvements (e.g., Nagler et al., 2015). However, the underlying mechanisms leading to improvements of reading performance are still unclear. Considering previous findings showing orthographic skills to influence training outcomes (Berninger et al., 1999), and also word reading performance after a reading intervention (Stage et al., 2003), it seems plausible to include orthographic knowledge when investigating potential training effects. Therefore, this dissertation aims at investigating the predictive value of orthographic knowledge for comprehension performance during the text-fading based reading training.
In order to answer the first research question, two empirical papers are implemented (see Appendix A: Zarić et al., 2020 and Appendix B: Zarić & Nagler, 2021), which investigate the role of orthographic knowledge for reading at word-, sentence-, and text-level in German school children without and with reading difficulties. The study by Zarić et al. (2020) examines the incremental predictive value for explained reading variance of both word-specific and general orthographic knowledge in relation to variance amount explained by general intelligence and phonological awareness. For this purpose, data from 66 German third-graders without reading difficulties were analyzed. Correlation and multiple regression analyses have shown that word-specific and general orthographic knowledge contribute a unique significant amount to the variance of reading comprehension on word-, sentence-, and text-level, over and above the explained variance by general intelligence and phonological awareness. In order to answer the question whether word-specific and general orthographic knowledge also explain variance in children with poor reading proficiency, in addition to established predictors phonological awareness and naming speed, the data from 103 German third-graders with reading difficulties were analyzed in a second study (Zarić & Nagler, 2021). The analyses revealed that word-specific and general orthographic knowledge explain a unique significant amount of the variance of reading on word- and sentence-level. On text-level, these two components did not explain a significant amount of unique variance. Here, only phonological awareness was shown to be a significant predictor. The results indicate that the knowledge about the spelling of specific words (word-specific orthographic knowledge) and the knowledge about legal letter patterns (general orthographic knowledge) contribute to reading comprehension on word-level. Following the assumptions, for instance, of the Lexical Quality Hypothesis (Perfetti & Hart, 2002) high-quality orthographic representations are considered to be important for higher reading processes, such as comprehension.
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New York und Tokio in der Medienkunst : urbane Mythen zwischen Musealisierung und Mediatisierung
(2004)
In der Doktorarbeit wurde ein Verfahren zur Ermittlung der Schwerpunkthöhe eines Fahrzeugs aus den Messwerten von Sensoren, die serienmäßig in vielen geländegängigen Fahrzeugen verbaut sind, entwickelt. Dieses Verfahren benötigt nur die Signale von Sensoren des elektronischen Stabilitätssystems (ESP) und eines Fahrwerks mit Luftfeder. Um die Höhe des Schwerpunkts zu bestimmen, wurde ein Modell entworfen, das die Drehbewegung des Fahrzeugs um seine Längsachse beschreibt. Eine der unbekannten Größen in diesem Modell ist das Produkt m_g\Deltah, wobei mit m_g die gefederte Masse des Fahrzeugs und mit Deltah der Abstand zwischen dem Schwerpunkt und der Wankachse des Fahrzeugs bezeichnet wird. Die Höhe des Schwerpunkts wird berechnet, indem zu diesem Abstand der als bekannt vorausgesetzte Abstand der Wankachse von der Straße addiert wird. Es wurden drei Varianten des Modells betrachtet. Die eine Modellvariante (stationäres Modell) beschreibt das Fahrzeugverhalten nur in solchen Fahrsituationen exakt, in denen die Wankgeschwindigkeit und die Wankbeschleunigung vernachlässigbar klein sind. In dieser Modellvariante wurden die Federkräfte mit einem detaillierten Modell der Luftfeder berechnet. Eine Eingangsgröße dieses Modells ist der Druck in den Gummibälgen der Luftfeder. Um diesen Druck zu ermitteln, wurde ein Algorithmus auf dem Steuergerät des Luftfedersystems implementiert. Um die Genauigkeit des Luftfedermodells zu testen und um die Abmessungen bestimmter Bauteile der Luftfeder zu ermitteln, wurden Messungen am Federungsprüfstand durchgeführt und eine Methode entwickelt, wie aus diesen Messungen die gesuchten Größen berechnet werden können. Bei den zwei übrigen Modellvarianten (dynamisches Modell) gelten die Einschränkung für die Fahrsituationen nicht. Die einzelnen Varianten des dynamischen Modells unterscheiden sich darin, dass das eine Mal die Feder- und Dämpferkonstanten als bekannt vorausgesetzt und das andere Mal aus den Sensorsignalen geschätzt werden. Passend zu jeder Modellvariante wurde ein Verfahren gewählt, mit dem Schätzwerte für das Produkt m_g\Deltah berechnet wurden. Des Weiteren wurde auch eine Methode entwickelt, mit der die Masse mg geschätzt wurde, ohne zuvor ein Wert für das Produkt m_g\Deltah zu ermitteln. Die Schätzwerte wurden unter Verwendung von Daten ermittelt, die bei einer Simulation und bei Messfahrten gewonnen worden sind. Das Ergebnis des Vergleiches der betrachteten Modellvarianten ist, dass die eine Variante des dynamischen Modells zum Teil falsche Werte für m_g\Deltah liefert, weil die Modellgleichungen ein nicht beobachtbares System bilden. Die andere Variante dieses Modells liefert nicht bei jeder Beladung exakte Werte, was vor allem daran liegt, dass in den Modellgleichungen dieses Modells ein konstanter Wert für die Federsteifigkeit angenommen wird. Bei Fahrzeugen mit Luftfeder ändert sich jedoch dieser Wert in Abhängigkeit von der Fahrzeugmasse. Die Werte von m_g\Deltah und mg können am genauesten mit dem stationären Modell ermittelt werden. Des Weiteren wurden Methoden entwickelt, die die Genauigkeit der durch den Schätzalgorithmus ermittelten Werte verbessern. So wurde zusätzlich zu dem Produkt m_g\Deltah und der Masse mg auch die Verteilung des Gewichtes auf die Vorder- und Hinterachse betrachtet. Es wurde ermittelt, welche Zusammenhänge zwischen dieser Verteilung und dem Produkt m_g\Deltah sowie zwischen dieser Verteilung und der Masse des Fahrzeugs bestehen. So konnte der Fehler in den Schätzwerten dieser Größen minimiert werden. Außerdem wurde auch der Zusammenhang zwischen dem Produkt m_g\Deltah und der Masse des Fahrzeugs ermittelt. Damit konnten die Schätzwerte dieser Größen genauer bestimmt werden. Aus den so gewonnenen Werten kann die Schwerpunkthöhe von einem Mercedes ML auf etwa 8cm genau berechnet werden. Diese Genauigkeit reicht aus, um das elektronische Stabilitätsprogramm auf die aktuelle Beladung des Fahrzeugs abzustimmen und damit einen Gewinn an Agilität für dieses Fahrzeug zu realisieren.
Prognostische Faktoren und das Outcome von Patienten mit einem primären Glioblastom sind in der Fachliteratur gut beschrieben. Im Gegensatz dazu gibt es wenige vergleichbare Informationen zu Patienten mit einem sekundären Glioblastom. Das Ziel dieser Arbeit war es, das Outcome von Patienten mit einem sekundären Glioblastom zu beurteilen und prognostische Faktoren in Be-zug auf das Gesamtüberleben zu identifizieren.
Dazu wurde die interne Datenbank des Universitätsklinikums Frankfurt/Main von Patienten mit Hirntumoren retrospektiv nach klinischen Daten durchsucht. Alle Patienten hatten ein histologisch gesichertes WHO Grad II oder III Gliom und anschließend ein WHO Grad IV sekundäres Glioblastom. Paraffiniertes Hirntumorgewebe wurde auf Mutationen der Isocitrat Dehydrogenase-1 (IDH1) mittels einer immunhistochemischen Färbung mit einem R132H (clone H09) spezifischen Antikörper untersucht. Eine uni- und multivariate statistische Analyse wurde durchgeführt, um Faktoren zu ermitteln, die potentiell das Gesamt-überleben beeinflussen könnten.
Es wurden 45 Patienten mit einem histologisch gesicherten sekundären Glioblastom untersucht. Das mediane Alter betrug 41 Jahre. 14 Patienten unterzogen sich einer radiologisch kompletten Resektion des sekundären Glioblastoms, 31 Patienten wurden subtotal reseziert oder biopsiert. Initial ist bei 37 Patienten ein astrozytärer Tumor nachgewiesen worden und die restlichen Patienten litten an Oligodendrogliomen oder gemischten Gliomen; bei der initialen Diagnose wurden 17 WHO Grad II und 28 WHO Grad III Tumoren fest-gestellt. Die mediane Zeit zwischen Ursprungstumor und dem Auftreten des sekundären Glioblastoms betrug 158,9 Wochen. Das mediane Gesamtüberleben betrug 445 Tage nach der Diagnose eines sekundären Glioblastoms. Mutationen des IDH1 (R132H) Proteins wurden bei 24 Patienten festgestellt und fehlten bei 17 Patienten; bei 4 Patienten konnte keine IDH1 immunhistochemische Färbung durchgeführt werden.
In der univariaten Analyse konnte der Zeitraum zwischen initialer Läsion und dem Progress zu einem sekundären Glioblastom als statistisch signifikanter Einflussfaktor identifiziert werden- Patienten mit einem Zeitraum von mehr als 2 Jahren hatten ein besseres Gesamtüberleben (460 vs. 327 Tage, p = 0,011). Außerdem konnte bei Patienten, die eine kombinierte Radiochemotherapie bekamen, ein besseres Gesamtüberleben nachgewiesen werden als bei Patienten, welche ausschließlich eine Therapieform erhielten (611 vs. 380 Tage, p < 0,001). Weiterhin konnten ein WHO Grad II Ursprungstumor (472 vs. 421 Tage, p = 0,05) und eine Frontalllappenlokalisation des Glioblastoms (472 vs. 425 Ta-ge, p = 0,031) das Überleben steigern.
In der multivariaten Analyse konnte gezeigt werden, dass die Mutation des IDH1 (R132H) Proteins in statistisch signifikanter Weise mit einem längeren Gesamtüberleben assoziiert war (p = 0,012); statistische Signifikanz für ein län-geres Gesamtüberleben bei Patienten mit initial einem WHO Grad II (p = 0,047) und einer Frontallappenlokalisation des Glioblastoms (p = 0,042) stellte sich auch ein. In Bezug auf die Patienten spezifischen Daten wurden zwei Prognosegruppen erstellt; Patienten in der guten Prognosegruppe scheinen einen Benefit von einer totalen Tumorresektion zu haben (p = 0,02), während eine Resektion für die andere Prognosegruppe keine große Rolle spielte (p = 0,926).
Trotz des relativ geringen Erkrankungsalters haben sekundäre Glioblastom Patienten eine schlechte Prognose. Die Ergebnisse dieser Arbeit unterstreichen die Wichtigkeit und den prognostischen Wert der IDH1 Diagnostik, die Notwendigkeit einer kombinierten Radiochemotherapie und eine Risikostratifizierung für eine Prognoseabschätzung anhand der Patienten spezifischen Einflussfaktoren.
Therapeutische Konzepte der Radioiodtherapie bei der Autoimmunhyperthyreose vom Typ Morbus Basedow
(2004)
In der vorliegenden Arbeit wurden retrospektiv Ergebnisse einer Radioiodtherapie bei 126 konsekutiven Patienten (19 Männer; 107 Frauen, Alter 50,9±14,6, Median 51,5 Jahre) analysiert, die im Zeitraum von 1992 bis 2001 wegen einer Autoimmuthyreopathie vom Typ M. Basedow in der Klinik für Nuklearmedizin der Gutenberg Universität Mainz behandelt wurden. Ziel der Arbeit war es, die Effektivität unterschiedlicher Therapieansätze zu vergleichen sowie Faktoren, welche einen Einfluss auf die Therapieergebnisse haben könnten, zu ermitteln, wobei Anamnese, Schilddrüsenvolumen, Stoffwechsellage und Thyreostase zum Zeitpunkt der Therapie besondere Berücksichtigung fanden. Bei 47 Patienten erfolgte die Radioiodtherapie nach einem funktionsoptimierten Konzept mit dem Ziel (150 Gy), eine Euthyreose zu erreichen. 79 Patienten wurden nach ablativem Konzept mit dem Ziel einer posttherapeutischen Hypothyreose behandelt. Die Dosis in dieser Gruppe betrug bei 19 Patienten 200 Gy; bei 29 Patienten 250 Gy; bei 15 Patienten 275 Gy und bei 16 Patienten 300 Gy. In 21% aller Fälle erfolgte die Therapie bei Erstmanifestation, bei 15% nach dem 1. Rezidiv und bei 64 % nach dem 2. Rezidiv. Bezüglich der Thyreostase, der Stoffwechsellage und des prätherapeutischen Radioiod-Uptakes waren die Gruppen nicht signifikant unterschiedlich. Entsprechend den Therapiekonzepten wurde bei funktionsorientiertem Konzept im Median 372 MBq als Aktivität errechnet und 400 MBq appliziert (14,3 MBq/ml). Für Patienten mit ablativem Therapiekonzept wurden im Median 514 MBq errechnet und 600 MBq appliziert (28,6 MBq/ml). Erreicht wurden in der ersten Gruppe Organdosen zwischen 80 und 380 Gy (Median 180 Gy). Bei 7 Patienten (14%) wurde dabei der angestrebte Bereich nicht erreicht, bei 27 Patienten (57%) erreicht und bei 13 Patienten (29%) überschritten. Der Variationskoeffizient lag bei 52%. In der Gruppe mit ablativem Ziel erreichten die Organdosen 56-685 Gy (Median 275 Gy). Bei 67 der 79 Patienten (85%) lag die erreichte Dosis wie geplant oder höher, bei 12 Patienten (15%) wurde die angestrebte Dosis nicht erreicht. Nur bei 3 der 47 Patienten (6%) wurde eine Euthyreose erreicht. Eine Hyperthyreose lag dagegen bei 22 Patienten (47%) vor. 22 Patienten (47%) wiesen posttherapeutisch eine Hypothyreose auf. Dagegen waren in der Gruppe mit ablativer Therapie 61 Patienten (77%) wie erwünscht hypothyreot und 18 (23%) hatten eine Resthyperthyreose. Patienten, die nach der ablativen Radioiodtherapie eine erwünschte Hypothyreose erreichten, hatten eine kürzere eff. HWZ und einen höherer Radioiod-Uptake (4,7 Tage; 52%) als Therapieversager (5,4 Tage; 49%) sowie ein geringeres Schilddrüsenvolumen nach der Behandlung (7,2±4,7 vs. 21,5±13,3 ml). Zehn Patienten nach ablativer Therapie (n=10) hatten trotz erreichter Dosis >250 Gy eine Resthyperthyreose. Das Schilddrüsenvolumen lag bei diesen Patienten zwischen 14 und 70 ml (Mittelwert: 29,5 ml). Die posttherapeutische Volumenreduktion war bei funktionsorientierter Therapie geringer als bei ablativem Konzept (um 55% vs. 65%). Die TRAK und anti-TPO-AK-Titer waren in beiden Gruppen gegenüber dem Ausgangswert angestiegen. Dabei waren die posttherapeutischen Konzentrationen bei funktionsoptimiertem Konzept höher als nach ablativer Therapie. Die Radioiodtherapie wurde in beiden Gruppen gut toleriert. Beschwerden durch eine strahleninduzierte Thyreoiditis zeigten sich bei 13 Patienten (10%), die mit Eiskrawatte und nichtsteroidale Antiphlogistika behandelt wurden. Unter Cortisonprophylaxe (n=29) wurde nur bei einem Patienten eine Verschlechterung der vorbestehenden EO beobachtet. Das Schilddrüsenvolumen wurde als wesentlicher, den Therapieerfolg bestimmender Parameter bei ablativem Konzept in der multivariaten Analyse identifiziert. So hatten Patienten mit einem Schilddrüsenvolumen ab 25 ml ein 10-fach höheres Risiko für ein Versagen der Radioiodtherapie in Relation zu Patienten, die eine Schilddrüse <25 ml hatten. Die Radioiodtherapie mit ablativen Dosen erweist sich in einem Iodmangelgebiet gegenüber der funktionsorientierten Behandlung als eine effektivere Therapie. Dieses Konzept geht mit niedrigerem Risiko der Verschlechterung einer vorbestehenden EO (unter Cortisonprophylaxe) einher. Es stellt sich bei diesem Konzept heraus, dass die Thyreostase in niedriger Dosierung keinen bedeutenden Einfluss auf den Therapieerfolg hatte. Die Auswertung der Daten bestätigt, dass die aktuell verwendete individuelle Dosisplanung mittels Radioiodtest eine präzise Abschätzung der notwendigen Aktivität erlaubt. Ausgehend von Ergebnissen diese Studie erscheint bei ablativem Konzept eine volumenadaptierte Korrektur der Zieldosis sinnvoll: während bei Schilddrüsenvolumina zwischen 25-40 ml eine Dosis von 250 Gy (entsprechend aktuellen Empfehlungen der Leitlinie der DGN) optimal ist, sollten bei Volumina > 40 ml höhere Zieldosen gewählt werden. Bei Patienten mit Schilddrüsenvolumina < 20 ml ist eine Dosis von 200 Gy ausreichend.
Diese Thesis befasst sich mit dem Problem korrelierter Elektronensysteme in realen Materialien. Ausgangspunkt hierbei ist die quantenmechanische Beschreibung dieser Systeme im Rahmen der sogenannten Kohn-Scham Dichtefunktionaltheorie, welche die Elektronen der Kristallsysteme als effektiv nicht-wechselwirkende Teilchen beschreibt.
Während diese Modellierung im Falle vieler Materialklassen erfolgreich ist, unterscheiden sich die korrelierten Elektronensysteme dadurch, dass der kollektive Charakter der Elektronendynamik nicht zu vernachlässigen ist.
Um diese Korrelationseffekte genauer zu untersuchen, verwenden wir in dieser Arbeit das Hubbard-Modell, welches mit der projektiven Wannierfunktionsmethode aus der Kohn-Scham Dichtefunktionaltheorie konstruiert werden kann.
Das Hubbard-Modell umfasst hierbei nur die lokale Elektron-Elektron-Wechselwirkung auf einem Gitter. Auch wenn das Modell augenscheinlich sehr simpel ist, existieren exakte Lösungen nur in bestimmten Grenzfällen. Dies macht die Entwicklung approximativer Ansätze erforderlich, wobei die Weiterentwicklung der sogenannten Two-Particle Self-Consistent Methode (TPSC) eine zentrale Rolle dieser Arbeit einnimmt.
Bei TPSC handelt es sich um eine Vielteilchenmethode, die in der Sprache funktionaler Ableitungen und sogenannter conserving approximations hergeleitet werden kann.
Der zentrale Gedanke dabei ist, den effektiven Wechselwirkungsvertex als statisch und lokal zu approximieren. Dies wiederum erlaubt die Bewegungsgleichung des Systems
erheblich zu vereinfachen, sodass eine numerische approximative Lösung des Hubbard-Modells möglich wird. Vorsetzung hierbei ist nur, dass sich das System in der normalleitenden Phase befindet und die bei Phasenübergängen entstehenden Fluktuationen nicht zu groß sind.
Während diese Methode ursprünglich von Y. M. Vilk und A.-M. Tremblay für das Ein-Orbital Hubbard-Modell entwickelt wurde, stellen wir in dieser Arbeit eine Erweiterung auf Viel-Orbital-Systeme vor.
Im Falle mehrerer Orbitale treten in der TPSC-Herleitung einzelne Komplikationen auf, die mit weiteren Approximationen behandelt werden müssen. Diese werden anhand eines einfachen Zwei-Orbital Modell-Systems diskutiert und die TPSC-Ergebnisse werden darüber hinaus mit den Ergebnissen der etablierten dynamischen Molekularfeldnährung verglichen.
In diesem Zusammenhang werden auch mögliche zukünftige Erweiterungen bzw. Verbesserungen von TPSC diskutiert.
Ein weiterer wichtiger Aspekt ist die Anwendung von TPSC auf reale Materialien.
In diesem Zusammenhang werden in dieser Arbeit die supraleitenden Eigenschaften der organischen K-(ET)2X Systeme untersucht. Hierbei lassen die TPSC-Resultate darauf schließen, dass das populäre Dimer-Modell, welches zur Beschreibung dieser Materialien herangezogen wird, nicht genügt um die experimentell bestimmten kritischen Temperaturen zu erklären und dass das komplexere Molekülmodell weitere exotische supraleitende Lösungen zulässt.
Schließlich untersuchen wir außerdem die elektronischen Eigenschaften des eisenbasierten Supraleiters LiFeAs und diskutieren inwieweit nicht-lokale Korrelationseffekte, welche durch TPSC aufgelöst werden können, die experimentellen Daten reproduzieren.
Die chemische Analyse von 17 abundanten Nordseeschwammarten zeigte, dass die Metabolitenzusammensetzung und -konzentration standortbedingt nur geringfügig schwanken. Den Großteil der Schwammmetaboliten bilden mittelpolare bis polare Substanzen ohne UV-Absorption. Allgemein scheinen in Nordseeschwämmen aromatische und olefinische Verbindungen seltener vorzukommen als in tropischen Arten. Die Chemie der einzelnen Nordseeschwämme ist oft ähnlich und wird von kleinen, stickstoffhaltigen Molekülen dominiert. Ubiquitär verbreitete, vermutlich phylogenetisch alte Substanzen wie Inosin, Allantoin, Homarin und Trigonellin wurden in zahlreichen untersuchten Arten nachgewiesen. Trigonellin und Homarin üben, wie für andere marine Organismen bereits dokumentiert, auch in den Nordseeschwämmen Schutzfunktion gegen Konkurrenten und Fouling-Organismen aus. Die identifizierten Verbindungen weisen darauf hin, dass den mit dem Aminosäure- und Purinstoffwechsel verbundenen Biosynthesewegen eine große Bedeutung in der Naturstoffsynthese der untersuchten Schwammarten zukommt. Diese Vermutung wird dadurch untermauert, dass auch die Bildung von Imidazolen (aus Phakellia ventilabrum isoliert) aus Histidin eng mit dem Purinstoffwechsel verbunden ist. Durch den Abbau von Histidin können wiederum Substanzen entstehen, die als Methyldonatoren in Frage kommen (methylierte Verbindungen, vgl. Pachymatisma johnstonia). Biologische Aktivität wurde anhand von Biotests zur antilarvalen, cytotoxischen, antibakteriellen, enzyminhibitorischen und bewuchshemmenden Wirkung in Extrakten der untersuchten Nordseeschwämme nachgewiesen. Dabei zeigten alle Schwammarten Effekte in mehr als einem Biotest. Diese Untersuchungen bestätigen das Vorkommen biologisch aktiver Substanzen in Schwämmen kaltgemäßigter Habitate und widerlegen damit die Latitudinalhypothese. Unabhängig von der geographischen Breite sind Schwämme weltweit einem selektiven Druck ausgesetzt, der die Entwicklung biologisch aktiver Metaboliten begünstigt. Die Art der Selektionsfaktoren scheint jedoch habitatbedingt unterschiedlich zu sein. Während in wärmeren Gewässern vor allem Prädatoren (Fische) das Überleben der Schwämme beeinflussen, sind in kälteren Gebieten Aufwuchsorganismen und Bakterien von entscheidender Bedeutung. Diese Annahme wird durch die Beobachtung der assoziierten Organismen ebenso unterstützt, wie durch die Tatsache, dass in allen untersuchten Nordseeschwammarten (Esperiopsis fucorum, Phakellia ventilabrum, Leucosolenia complicata, Cliona celata, Pachymatisma johnstonia) Bakterien nachgewiesen werden konnten. Neben den ökologischen Beobachtungen bekräftigt auch die starke antibakterielle Wirkung der Schwammmetaboliten diese Hypothese. Während Toxizität seltener beobachtet wurde, zeigten viele Schwämme auch enzyminhibitorische Wirkung. Zusammenhänge zwischen biologischer Aktivität und morphologischen bzw. taxonomischen Kriterien, Lebensweise, Habitatcharakteristika oder assoziierten Organismen waren nicht durch Clusteranalysen aufzudecken. Es konnten jedoch Unterschiede im Metabolitengehalt und der Art der assoziierten Organismen zwischen langlebigen, großen Kieselschwammarten und kleineren, saisonal wachsenden Kalkschwämmen hervorgehoben werden. Leucosolenia compl icata (Calcarea) ist sowohl qualitativ als auch quantitativ relativ metabolitenarm, biologisch sehr aktiv und mit einer großen Zahl an Bakterien assoziiert. Die Mikroorganismen scheinen für diese Art von größerer Bedeutung zu sein als bei den untersuchten Demospongiae. Einige Kieselschwämme (z.B. Cliona celata, Phakellia ventilabrum) sind besonders metabolitenreich, enthalten weniger Bakterien und verfügen ebenfalls über biologisch aktive Substanzen. Um diese Beobachtungen in einem ökologischen Zusammenhang zu sehen, sind eingehendere Studien, wie sie mit Pachymatisma johnstonia durchgeführt wurden, notwendig. Die Isolierung der Hauptmetaboliten von Pachymatisma johnstonia führte zur Identifizierung der methylierten Substanzen Betain, N,N,N-Trimethyl-ß-alanin, L-6-Bromohypaphorin und dem Pyridinalkaloid Trigonellin. Anhand verschiedener biologischer Tests konnte ein Einblick in die Wirkungsweise und Funktion der aktiven Metaboliten gewonnen werden. Die Aminosäure L-6-Bromohypaphorin und eine noch nicht identifizierte Substanz zeigten starke Enzyminhibition gegenüber einer Protein-Tyrosin-Kinase. L-6-Bromohypaphorin wurde im Pinacoderm unbewachsener Individuen in einer höheren Konzentration nachgewiesen als in Schwämmen mit Bryozoenbewuchs, und spielt demnach vermutlich bei der Abwehr von Fouling-Organismen eine Rolle. Bakterien wurden als Produzenten der aktiven Substanzen ausgeschlossen. Eine Abgabe der Metaboliten nach außen ist eher unwahrscheinlich. Die Extrakte von P. johnstonia zeigten starke antibakterielle Wirkung mit einer Breitbandaktivität, vor allem gegen marine Bakterien. Welche Substanzen für diese Effekte verantwortlich sind, ist nicht bekannt. Eine Hälterung von P. johnstonia war möglich. Ebenso wie Cliona celata passte sich der Schwamm an veränderte abiotische und biotische Faktoren an. Verletztes Gewebe wurde regeneriert und Hauptmetaboliten weiter produziert. Die Synthesetätigkeit von P. johnstonia schwankte, die biologische Aktivität blieb über neun Monate hinweg erhalten. Durch eine Optimierung der Hälterungsbedingungen könnte die Naturstoffproduktion vermutlich konstant gehalten werden. Mit P. johnstonia wurde somit ein gutes Beispiel für die Interaktion zwischen Naturstoffchemie, Ökologie und pharmakologischem Potential bzw. biotechnologischer Nutzbarkeit geliefert. Bedingt durch das Ziel der Arbeit, einen Überblick über die Chemie und biologische Aktivität der Nordseeschwämme zu gewinnen, wurde weniger Augenmerk auf die Isolierung neuer Strukturen gelegt. Im Zuge von intensiveren Studien wäre eine Optimierung der chemischen Methodik anzustreben. Die Aufklärung der in geringerer Konzentration vorkommenden Substanzen könnte hilfreich sein, um den ersten Eindruck der Metabolitenzusammensetzung zu überprüfen. Außerdem wird aufgrund der Biotestergebnisse die Existenz zahlreicher biologisch aktiver Substanzen, vor allem antibiotischer Wirkstoffe, vermutet, deren Isolierung eine Herausforderung darstellt. Besonders interessant ist in diesem Zusammenhang auch die Tatsache, dass bisher sämtliche medizinisch genutzten Antibiotika aus Mikroorganismen stammen, Schwämme aber weltweit über ein hohes antibiotisches Potential verfügen. Dadurch stellt sich erneut die Frage, ob Schwämme tatsächlich selbst in der Lage sind, wirksame Substanzen zu produzieren. Diese Ungewissheit zusammen mit der Tatsache, dass alle aus den Nordseeschwämmen isolierten und identifizierten Verbindungen aus Stoffwechselwegen stammen, die bisher als für Mikroorganismen typisch beschrieben wurden, bietet interessante Ansatzmöglichkeiten für weitere Untersuchungen. Auch wenn Schwämme zu den am besten untersuchten Organismen in der marinen Naturstoffchemie zählen, ist das Wissen im Bereich der chemischen Ökologie noch begrenzt. Um mehr über die Beziehung zwischen Schwämmen und ihrer belebten Umwelt zu erfahren und die Rolle der Naturstoffe dabei aufzudecken, müssen geeignete Untersuchungsmethoden bzw. Biotests etabliert werden. Abbildung 4.1 soll die Bedeutung der Schwämme für ihren Lebensraum und den Menschen hervorheben und die komplexen Zusammenhänge, welche durch die Wirkung der Naturstoffe vermittelt werden, verdeutlichen. Häufig werden Schwämme als primitive Organismen beschrieben, da sie sich durch das Fehlen eines Nervensystems und anderer Organe von höheren Tieren unterscheiden. Tatsächlich sind diese Lebewesen aber hochentwickelte Spezialisten. Optimal an eine sessile Lebensweise angepasst, bewohnen sie seit Millionen von Jahren erfolgreich vor allem marine Habitate in großer Artendiversität und Abundanz. Aufgrund der Produktion von aktiven Metaboliten zur Abwehr schädlicher Organismen stellen die Schwämme aus menschlicher Perspektive eine wertvolle Ressource dar. Nicht nur aus diesem Grund sollten wir Ihnen mit Respekt begegnen und versuchen, die (Naturstoff-)forschung nachhaltig zu betreiben, die Beeinträchtigung der Tiere auf ein vertretbares Maß zu reduzieren und ihren Lebensraum zu schützen.
B-cell acute lymphoblastic leukaemia (B-ALL) is characterized by the overproduction of lymphoblasts in the bone marrow (BM), and it is the most common cancer in children while being comparatively uncommon in adults. On the other hand, in chronic myeloid leukaemia (CML), 70% of cases are found in patients older than 50 years, making it uncommon in children. All CML cases and up to 3% of paediatric B- ALL (and 25% of adult B-ALL) cases are due to fusion gene BCR-ABL1, which gives rise to the cytoplasmatic, constitutively active oncoprotein, tyrosine kinase BCR-ABL1 through a reciprocal translocation between chromosomes 9 and 22. The constitutively active BCR-ABL tyrosine kinase leads to deregulation of different signal transduction pathways such as cell growth, proliferation and cell survival. The role of the bone marrow microenvironment (BMM) can mediate disease initiation (only in mice), progression, therapy resistance, and relapse, as has been increasingly recognized over the last two decades. In general, the BMM is a very complex arrangement of various cell types such as osteoblasts, osteoclasts, endothelial cells, adipocytes, mesenchymal stromal cells, macrophages and several others. In addition, the BMM is composed of multiple chemical and mechanical factors and extra cellular matrix (ECM) proteins which contribute to the BMM’s features influencing leukaemia behaviour. Considering the incidence of B-ALL and CML in children and in adults respectively, we hypothesized that the young and/or an aged BMM might also play a previously unrecognized role in the aggressiveness of B-ALL and CML. We proposed that BM, transduced with BCR-ABL1-expressing retrovirus in the murine transduction/transplantation model of B-ALL, transplanted into young versus old recipient mice would lead to a more aggressive disease in young mice, and similarly CML would be more aggressive in old recipient mice. In close recapitulation with the human incidence, induction of CML led to a significantly shorted survival in old recipient mice. On the other hand, induction of B-ALL showed a shortened survival in young compared to old syngeneic mice, as well as in a xenotransplantation model. Among the highly heterogenous composition of the BMM, we implicate young BM macrophages as a supportive niche for B-ALL cells. The results were found to be mostly due to potential soluble factors differentially secreted from young and old macrophages. Therefore, we hypothesized that the chemokine CXCL13, which has been demonstrated to play a role in B cell migration and act as a diagnostic marker in the cerebrospinal fluid of patients with neuroborreliosis, might be responsible for the observed phenotype. CXCL13 was found to be more highly expressed in healthy and leukaemic young mice as well as in conditioned medium of young macrophages. Using a variety of in vitro experiments, CXCL13 showed to significantly increase the proliferation and the migration of leukaemia cells when exposed to young macrophages, and the phenotype was rescued while using a CXCL13 neutralizing antibody. The CXCL13 role was also confirmed in vivo, since macrophage ablation led to a prolongation of survival in young mice and a reduction of CXCL13 levels. The use of an additional mouse model, leukaemia cells with CXCR5 deficiency, led to a significant prolongation of survival of young mice, confirming the importance of the CXCL13-CXCR5 axis in B-ALL. In line with our murine results, we found that human macrophages and CXCL13 levels were higher in pediatric B-ALL patients than in adults. Consistent with our murine data, the expression level of CXCR5 may act as a prognostic marker in B-ALL, as well as a predictive marker for central nervous system relapse in human B-ALL. The overall findings show that a young BMM, and in particular macrophages, influences B-ALL progression. We specifically identified CXCL13, secreted by young macrophages, as a promoter of proliferation of B-ALL cells, influencing survival in B-ALL via CXCR5. The CXCR5-CXCL13 axis may be relevant in human B-ALL, and higher CXCR5 expression in human B-ALL may act as a predictive marker.
The members of the multidrug/oligosaccharidyl-lipid/polysaccharide (MOP) transporter superfamily mediate export of a wealth of molecules of physiological and pharmacological importance. According to the Transporter Classification Database (TCDB), the MOP superfamily is mainly categorized into six distantly related families functionally characterized families: the multidrug and toxic compound extrusion (MATE), the polysaccharide transporter (PST), the oligosaccharidyl-lipid flippase (OLF), the mouse virulence factor (MVF) the agrocin 84 antibiotic exporter (AgnG), and the progressive ankylosis (Ank) family. Among these, the multidrug resistance MATE family transporters are most ubiquitous, being present in all domains of life: Archaea, Bacteria and Eukarya. As secondary active transporters, they utilize transmembrane electrochemical ion gradients of Na+ and/or H+ in order to drive the efflux of xenobiotics or cytotoxic metabolic waste products with specificity mainly for polyaromatic and cationic substrates. Active efflux of drugs and toxic compounds carried out by multidrug transporters is one of the strategies developed by bacterial pathogens to confer multidrug resistance. MATE proteins provide resistance to, e.g., fluoroquinolone, aminoglycoside antibiotics, and anticancer chemotherapeutical agents, thus serving as promising pharmacological targets for tackling a severe global health issue. Based on their amino acid sequence similarity, the MATE family members are classified into the NorM, the DNA-damage-inducible protein F (DinF), and the eukaryotic subfamilies. Structural information on the alternate conformational states and knowledge of the detailed mechanism of the MATE transport are of great importance for the structure-aided drug design. Over the past decade, the crystal structures of representative members of the NorM, DinF and eukaryotic subfamilies have been presented. They all share similar overall architecture comprising 12 transmembrane helices (TMs) divided into two domains, the N-terminal domain (TMs 1-6) and the C-terminal domain (TMs 7-12), connected by a cytoplasmic loop between TM6 and TM7 (Fig. II.1). Since all available MATE family structures are known only in V-shaped outward-facing states with the central binding cavity open towards the extracellular side, a detailed understanding of the complete transport cycle has remained elusive. In order to elucidate the underlying steps of the MATE transport mechanism, structures of distinct intermediates, particularly inward-facing conformation, are required.In my PhD project, structural and functional studies have been performed on a MATE family (DinF subfamily) transporter, PfMATE, from the hyperthermophilic and anaerobic archaeon Pyrococcus furiosus. This protein was produced homologously in Pyrococcus furiosus as well as heterologously in Escherichia coli, and used for the subsequent purification and crystallization trials by the vapor diffusion (VD) and lipidic cubic phase (LCP) method. To the best of my knowledge, PfMATE is the first example of a successful homologous production of a membrane protein in P. furiosus. Due to the very low final amount of the purified protein from the native source, the heterologously produced PfMATE samples were typically used for the extensive structural studies. Crystal structures of PfMATE have been previously determined in an outward-facing conformation in two distinct states (bent and straight) defined on the arrangement of TM1. A pH dependent conformational transition of this helix regulated by the protonation state of the conserved aspartate residue Asp41 was proposed. However, it has been discussed controversially, leading to the hypothesis about TM1 bending to be rather affected by interactions with exogenous lipids (monoolein) present under the crystallization conditions. Based on these open questions, an experimental approach to investigate the role of lipids as structural and functional modulators of PfMATE has been taken in the course of my PhD project. The interplay between membrane proteins and lipids can affect membrane protein topology, structure and function. Considering differences between archaeal and bacterial lipid composition, cultivation of P. furiosus cells and extraction of its lipids was followed by the mass spectrometry (MS) based lipidomics for identification of individual lipid species in the archaeal extract. In order to assess the effects of lipids on PfMATE, different lipid molecules were used for co-purification and co-crystallization trials. This dissertation presents a workflow leading to the structure determination of a MATE transporter in the long sought-after inward-facing state, which has been achieved upon purification and crystallization of the heterologously produced PfMATE in the presence of lipids from its native source P. furiosus. Also, the PfMATE outward-facing state obtained from the crystals grown at the acidic pH conditions sheds light on the previously proposed pH-dependent structural alterations within TM1. It is interesting to note that the inward and outward-facing states of PfMATE were obtained from the crystals grown under similar conditions, but in the presence and absence of native lipids, respectively. This observation supports the hypothesis about physiologically relevant lipids to act as conformational modulators or/and a new class of substrates, expanding the substrate spectrum of the MATE family transporters. Comparative analysis of two PfMATE states reveals that transition from the outward to the inward-facing state involves rigid body movements of TMs 2-6 and 8-12 to form an inverted V, facilitated by a loose binding of TMs 1 and 7 to their respective bundles and their conformational flexibility. Local fluctuations within TM1 in the inward-facing structure, including bending and unwinding in the intracellular half of the helix, invoke its highly flexible nature, which is suitable for ion and substrate gating.
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Modern computational molecular quantum chemical studies, such as the present one, typically employ a wide range of theoretical techniques. The latter are often rather complicated and one should not generally expect that an experimental scientist in the area of physical chemistry, a potential reader of this work, should be familiar with all these techniques. To simplify the reading of the Thesis and to make it self-sufficient, it is supplied with an overview of the employed theoretical methodologies (Chapter 1). The overview explains basic quantum-chemical terminology referred to throughout the Thesis, introduces theoretical foundations of the methods and outlines their properties and limitations. In Part 1.1 of Chapter 1, methods for the solution of the molecular Schrödinger equation are introduced, while in the subsequent Parts 1.2 and 1.3 methods for the solution of the electronic Schrödinger equation are presented to find the ground and excited states, respectively. Part 1.4 is dedicated to basis-set effects which are omnipresent in electronic-structure calculations. It contains a number of unusual insights and concepts proposed by the author and, thus, may be insightful also to experts in quantum chemistry.
In Chapter 2, the phenomenon of acetone-water proton exchange catalyzed by tubular as well as amorphous aggregates of calix[4]hydroquinone (CHQ) macromolecules, which has been observed previously in NMR experiments (Ref. D1D), is investigated by means of correlated quantum-chemical methods. The first part of the study (Section 2.3-2.7) considers concerted proton transfer, assisted by several initially neutral OH-groups in the hydrogen-bonded networks of CHQ aggregates. The second part of the study (Section 2.8-2.13) is dedicated to a second mechanism of proton exchange: step-wise proton transfer via formation of ionic intermediates resulting from CHQ pre-dissociation. CHQ application-specific as well as general conclusions, relevant to the main topic of the Thesis (i.e. influence of specific microsolvation on the considered proton transfer processes), are presented in Section 2.14.
The phenomenon of dual fluorescence observed in clusters of methyl 4-N,N-dimethylaminobenzoate ester (DMABME) and two water molecules in the gas phase, is studied in Chapter 3. Experimentally, the dual fluorescence was detected in experiments combining optical and ground-state ion-depletion infrared spectroscopies in ultracold molecular beams (Ref. D2D). In Section 3.3, calculated ground-state infrared spectra are presented that allow to identify the structures of those isomers, which are present in the gas-phase, as well as the structure of the isomer responsible for dual fluorescence. To further understand the reaction mechanism of dual fluorescence, excited-state potential energy surfaces of the identified isomers were computed along the relevant twisted intermolecular charge-transfer formation coordinate and the mechanism of energy dissipation in these complexes was investigated (Section 3.4-3.5) (Ref. D3D). A brief summary of the main results of this chapter and conclusions are given in Section 3.6. Finally, in Section 3.7 a complementary benchmark study of the quality of ground-state potential energy surfaces of prototypical hydrogen-bonded systems (ammonia-water and formic acid-water dimers) obtained at the level of BSSE-corrected MP2 combined with moderate basis sets, has been conducted. The quality of potential energy surfaces was tested with respect to basis-set size, level of electron correlation and anharmonicity effects and the applied methodology to identify the IR spectrum of hydrated DMABME complexes (Section 3.3) has been found to be sufficient to uniquely assign the IR spectra.
Nucleotide-binding domains (NBDs), roughly 27 kDa in size, are conservative components of the large family of ABC (ATP-binding cassette) transporters, which includes importers, exporters, and receptors. NBDs or ABC-ATPases supply energy for the translocation of a vast variety of substrates across biological membranes. Despite their hydrophilic sequence, many NBDs tend to aggregate and precipitate in solution upon isolation from the complete transporter. The conditions stabilizing an extremely labile NBD component of the E.coli HlyA transporter, HlyB-NBD, were developed. As a result, the pure highly concentrated enzyme was protected from precipitation for months that allowed screening of the unlimited crystallization conditions in the presence of different substrates and performance of the reproducible functional assays. HlyB-NBD was characterized in regard to its uncoupled ATPase activity, oligomeric state, and stability in solution. Comparative analysis of protein stability and ATPase activity in various buffers suggested an inverse relationship between the two. Kinetic analysis of ATPase activity revealed ATP-induced protein dimerization. Gel-filtration experiments with the wild type protein and H662A-mutant of HlyB-NBD provided further evidence of protein dimerization in the presence of ATP. The crystal structures in post- and pre-hydrolysis nucleotide-bound states of HlyB-NBD were determined at 1.6Å and 2.5Å resolution, respectively. While the hydrolytically deficient H662A mutant of HlyB-NBD was crystallized as a stable dimer in the presence of ATP or ATP-Mg2+, with two nucleotide molecules sandwiched between the two monomers, the same protein was shown to be a monomer in the ADP-loaded state. The wild type protein failed to develop crystals with bound ATP, yet formed ADP-bound crystals identical to those of the H662A-mutant. The X-ray structures of HlyB-NBD in various states of the hydrolytic cycle and the functional studies of the enzyme have provided an opportunity to characterize enzyme-substrate complexes and protein-protein interactions between the NBD subunits in great detail. Comparison of the nucleotide-free, the ADP-, and the ATP-loaded states revealed oligomeric and conformational changes of the protein upon substrate binding and resulted in a molecular picture of the catalytic cycle. The correlated results of the structural and functional investigations of HlyB-NBD are discussed with relation to the mechanism of action of ABC transporters.
Die halophilen Archaea Haloferax volcanii und Halobacterium salinarum haben sich aufgrund ihrer metabolischen Vielseitigkeit und der Verfügbarkeit vieler molekulargenetischer und biochemischer Techniken zu archaealen Modellorganismen für die Untersuchung zellulärer Prozesse entwickelt. In den vergangenen Jahren wurden eine Vielzahl prokaryaler Genome sequenziert, es zeigte sich jedoch, dass ca. 30% aller Gene keine Funktion zugeordnet werden kann. Die funktionelle Genomforschung zielt darauf, durch parallele genomweite Untersuchung der Genexpression die Funktion der Transkripte bzw. der Proteine aufzuklären. In der vorliegenden Arbeit wurden für beide halophilen Archaea genomweite Genexpressionsanalysen unter Verwendung der DNA-Mikroarray- Technologie etabliert. Aufgrund der derzeit nicht vorhandenen Genomsequenz wurde für die Untersuchung der Genexpression von H. volcanii der erste und bisher einzig beschriebene genomweite shotgun-DNA-Mikroarray konstruiert. Dazu wurde zunächst eine Genombibliothek mit einer durchschnittlichen Fragmentgröße von 1,5 kb hergestellt. Die Genombibliothek wurde anschließend in eine PCR-Produkt-Bibliothek umgewandelt, die dazu genutzt wurde, in einem hochdichten Raster zwei DNA-Mikroarrays herzustellen, einen 960-Sonden DNA-Mikroarray zur Etablierung und Optimierung der Methode und einen 2880-Sonden DNA-Mikroarray, der einer einfachen Genomabdeckung entspricht. Für den Vergleich der Genexpression nach einer Änderung der Kohlenstoffquelle wurden Zellen von H. volcanii einem Wechsel von Wachstum mit Aminosäuren zu Wachstum mit Glukose als alleiniger Kohlenstoff-Quelle unterzogen. Die Transkriptomänderungen vom Wechsel der Kohlenstoff-Quelle bis zum erneuten Beginn des exponentiellen Wachstums wurden zu fünf Zeitpunkten mit dem 2880-Sonden DNA-Mikroarray analysiert. Es wurden fünf verschiedene Klassen kinetisch gleichregulierter Gene gefunden, die entweder induziert, reprimiert oder transient induziert waren. Insgesamt wurden ca. 10% aller Gene zu mindestens einem Zeitpunkt mehr als 2,5 fach reguliert. Für Gene aller fünf Klassen wurden die Ergebnisse durch Northern-Analysen verifiziert. Die Identität der regulierten Gene wurde durch Sequenzierung der PCR-Produkte von beiden Enden ermittelt. Es wurde ein breites Spektrum an Genen identifiziert, deren Genprodukte für unterschiedliche funktionelle Kategorien wie Stoffwechselenzyme, ABC-Transporter, regulatorische Proteine und hypothetische Proteine usw. kodieren. Viele gleichregulierte Gene kodieren für Proteine gemeinsamer Funktion. Erwartete wie auch unerwartete Ergebnisse erlaubten Vorhersagen über den zentralen Metabolismus, die Transportkapazität und der zellulären Organisation bei Wachstum von H. volcanii auf Aminosäuren bzw. Glukose. Die Mikroarray-Analysen stehen im Einklang mit der Wachstumsrate und dem Ribosomengehalt von H. volcanii bei Wachstum auf den alternativen Kohlenstoffquellen. Die Ergebnisse dieser Arbeit zeigen, dass ein shotgun-DNA-Mikroarray mit einfacher Genomabdeckung die Charakterisierung der Regulation metabolischer Prozesse sowie die funktionelle Charakterisierung von Proteinen bzw. Proteinkomplexen erlaubt. Für Halobacterium salinarum, dessen Genomsequenz bekannt ist, wurde ein genomweiter genspezifischer DNA-Mikroarray konstruiert. Hierzu wurde jeder ORF des Genoms unter Verwendung von ORF-spezifischen Oligonukleotiden mittels PCR amplifiziert. Zur Etablierung dieses Systems wurden zunächst mit einem 200-Sonden DNA-Mikroarray exemplarisch Genexpressionsanalysen für zwei verschiedene Wachstumsbedingungen durchgeführt. Bei anaeroben Wachstum von H. salinarum durch fermentativen Argininabbau wurden im Vergleich zu aeroben Wachstum die für die Argininfermentation essentiellen Gene induziert. Dagegen wurden charakteristische Gene des aeroben Stoffwechsels reprimiert. Zur Untersuchung des Zellzyklusses von H. salinarum wurde der genomweite genspezifische DNAMikroarray verwendet. Um erstmals genomweit die zellzyklusspezifische Genexpression eines Archaeons zu analysieren, wurden Zellen von H. salinarum durch eine reversible Zellzyklusblockade mit Aphidicolin, einem DNA-Polymerase Inhibitor, synchronisiert. Vorläufige Transkriptomstudien mit einer synchron wachsenden H. salinarum-Kultur deuten an, dass die Transkription der Mehrzahl der Gene im Verlauf des Zellzyklusses nicht reguliert wird. Die Untersuchungen dieser Arbeit bilden die Grundlage für genomweite funktionelle Charakterisierungen haloarchaealer Genexpression und Regulationsprozesse.
In this work, we extend the Hegselmann and Krause (HK) model, presented in [16] to an arbitrary metric space. We also present some theoretical analysis and some numerical results of the condensing of particles in finite and continuous metric spaces. For simulations in a finite metric space, we introduce the notion "random metric" using the split metrics studies by Dress and al. [2, 11, 12].
Konuskronen verankerter Zahnersatz hat sich seit mehreren Jahrzehnten als hervorragende Therapieform zur Versorgung des reduzierten Restgebisses bewährt und verbindet zahlreiche Vorteile des festsitzenden mit denjenigen des herausnehmbaren Zahnersatzes. Vor dem Hintergrund einer steigenden Relevanz ästhetischer Versorgungen sowie einer größer werdenden Ablehnung der Patienten hinsichtlich der Verwendung metallischer Werkstoffe, gewann das Ziel, auch kombiniert festsitzend-herausnehmbaren Zahnersatz metallfrei zu fertigen, zunehmend an Bedeutung. Ziel der vorliegenden prospektiven klinischen Studie war die Evaluation des klinischen Langzeitverhaltens von keramischen Primärkronen aus IPS Empress 2® kombiniert mit Sekundärkronen und Prothesengerüsten aus faserverstärktem Kunststoff (Vectris®) sowie die Untersuchung der Patientenzufriedenheit. Als Kontrollgruppe dienten keramische Primärkronen mit Sekundärkronen aus Galvanogold und metallischen Gerüsten. Dazu wurden 29 Patienten mit insgesamt 37 Konusprothesen auf 165 keramischen Primärkronen versorgt, 27 (73%) Prothesen entfielen auf die Kontrollgruppe und 10 (27%) Prothesen auf die Testgruppe. Eingebunden in ein Recall-System, wurden die Patienten in halbjährigen Abständen über einen Zeitraum von 5 Jahren nachuntersucht. Zur Evaluation der Patientenzufriedenheit erhielten die Studienteilnehmer jeweils vor Therapiebeginn, nach Fertigstellung der Konusprothesen und im einjährigen Abstand einen Fragebogen. Die Zeit unter Risiko betrug durchschnittlich 59 ± 22 Monate (min. 16, max. 96 Monate), Befragungen hinsichtlich der Patientenzufriedenheit wurden über 46 ± 18 Monate durchgeführt (min. 15, max. 66 Monate). Beide Gruppen zeigten eine vergleichbar hohe Reparaturanfälligkeit. 88,9% der Restaurationen in der Kontrollgruppe, sowie 90% der Restaurationen in der Testgruppe mussten mindestens einmal instand gesetzt werden (Mann-Whitney-U-Test, p = 0,121). Auch das Schadensrisiko der vollkeramischen Primärkronen zeigte keine statistischen Unterschiede (Testgruppe: 10,81%; Kontrollgruppe: 10,16%; exakter Fisher-Test, p > 0,05). Die Häufigkeit einer Neuanfertigung der Konusprothese war bei der Test-Gruppe (40%) höher als bei der Kontroll-Gruppe (14,8%), ein statistisch signifikanter Unterschied war zwischen beiden Gruppen nicht nachzuweisen (exakter Fisher-Test, p = 0,16). Die Erfolgsrate zeigte in Abhängigkeit der Zeit unter Risiko jedoch ab 2,5 Jahren schlechtere Werte bei metallfreien Prothesen als bei der Kontrollgruppe, nach etwa 5 Jahren nahm dieser Unterschied deutlich zu (Kontrollgruppe: 86%, Testgruppe: 24%) und unterschied sich statistisch signifikant (Log-Rank-Test, p=0,041). Bei drei der 128 Galvano-Matrizen kam es zu einer Beschädigung an den Sekundärstrukturen, bei 9 von 37 Matrizen aus glasfaserverstärktem Kunststoff trat ein Schaden auf. Dieser Unterschied war statistisch hochsignifikant und belegt, dass Vectris®-Mesostrukturen eher zum Versagen neigen als Galvano-Sekundärkronen (exakter Fisher-Test, p = 0,00008). Im Gegensatz zu den durchaus unterschiedlichen klinischen Ergebnissen und den unbefriedigend hohen Reparaturzahlen war die Patientenzufriedenheit mit den jeweiligen Studienprothesen für beide Gruppen vergleichbar gut. Zu keinem Zeitpunkt zeigte sich eine relevante Personenzahl in einer der Gruppen mit dem erhaltenen Zahnersatz unzufrieden. So war in der Testgruppe initial lediglich eine Person unzufrieden, änderte diese Einstellung jedoch im Rahmen der weiteren Kontrollen. Eine weitere Person war anfangs zufrieden, dann vorübergehend unzufrieden, um im Weiteren erneut ihre Zufriedenheit zu äußern. Für die Metallgruppe ergab sich lediglich in der letzten Nachkontrolle eine Person, die unzufrieden mit dem Zahnersatz war. Statistisch signifikante Unterschiede zwischen den Gruppen waren somit zu keinem Zeitpunkt nachzuweisen (exakter Fisher-Test, alle p > 0,05). Die vorliegende Untersuchung bestätigt, dass sich die Verwendung keramischer Primärkronen in Doppelkronenrestaurationen prinzipiell bewährt und die Anforderungen an die gestellten Parameter wie Haftkraftstabilität, Biokompatibilität und Ästhetik erfüllt. Jedoch weist die Lithiumdisilikat-Glaskeramik IPS Empress 2® eine unzureichende Stabilität auf, für diesen Indikationsbereich sind daher ausschließlich hochfeste Zirkoniumdioxid-Keramiken zu empfehlen. Mit diesem Material ist ein wesentlich geringeres Reparaturrisiko zu erwarten. Als Matrizenwerkstoff zeigten galvanogeformte Sekundärkappen sehr gute klinische Ergebnisse. Die hohe Passungspräzision, welches durch die intraorale Fügung erreicht wird, gewährleistet eine ideale Lagerung des Zahnersatzes und reduziert kinetikbedingte Schäden auf ein Minimum. Das Ziel der Untersuchung, die dauerhafte klinische Bewährung metallfreier Konusprothesen aus dem Glasfaserverbundmaterial Vectris® nachzuweisen, konnte nicht erreicht werden. Die Ergebnisse dieser prospektiven klinischen Studie belegen eine Überlegenheit der metallischen Konusprothese. Somit bedarf die Realisation einer klinisch verlässlichen metallfreien Konusprothese noch erheblichen Forschungs- und Entwicklungsbedarf. Insbesondere die Substitution von galvanogeformten Feingoldmatrizen stellt eine große Herausforderung dar.
In der vorliegenden Arbeit wurde das Zinkfinger-µ-Protein HVO_2753 des halophilen Archaeons Haloferax volcanii hinsichtlich seiner biologischen Funktion und seiner Struktur charakterisiert.
Zinkfinger-µ-Proteine wurden bisher nur sehr wenig untersucht, während ihnen jedoch in den letzten Jahren steigendes Interesse entgegengebracht wird. Im Genom von H. volcanii sind mehr als 40 solcher Zinkfinger-µ-Proteine codiert. Von diesen besitzt mit HVO_2753 lediglich eines nicht nur zwei, sondern vier der charakteristischen C(P)XCG-Muster, was für die Anwesenheit von zwei Zinkfinger-Motiven spricht. Während Homologe von HVO_2753 in vielen Euryachaeota vorkommen und manche davon als Zink-Ribbon RNA-Bindeproteine annotiert sind, ist über ihre Funktion jedoch nichts bekannt. Zur Charakterisierung des Proteins wurde zunächst eine in frame-Deletionsmutante seines Gens erstellt und diese einer phänotypischen Charakterisierung unterzogen. Die Mutante wies, verglichen mit dem Wildtyp, keine Unterschiede im Wachstum in Komplexmedium oder in synthetischem Medium mit Glukose als Kohlenstoffquelle auf. Ein schweres Defizit konnte jedoch sowohl bei der Adhäsion und Biofilmbildung als auch der Schwärmfähigkeit der Deletionsmutante festgestellt werden. Während die Schwärmfähigkeit des Wildtyps durch plasmidische Expression von HVO_2753 in der Deletionsmutante teilweise wiederhergestellt werden konnte, war eine solche Komplementation bei der Biofilmbildung nicht möglich. Die Analyse der Relevanz ausgewählter Aminosäuren, wie beispielsweise das jeweils erste Cystein in jedem C(P)XCG-Muster zeigte, dass die Substitution jeder einzelnen der getesteten Aminosäuren einen Funktionsverlust des Proteins nach sich zieht. Die Untersuchung des HVO_2753-Transkripts mittels Northern Blot-Analyse bestätigte erste Hinweise aus vorangegangenen dRNA- und RNA-Seq-Studien, die eine Co-Transkription von HVO_2753 mit dem Nachbargen HVO_2752, das für den Translations-Elongationsfaktor aEF-1 beta codiert, aufzeigten. Daraufhin erfolgte eine Untersuchung des Ribosomenprofils, bei der keine Unterschiede zwischen der Deletionsmutante und der Überexpressionsmutante von HVO_2753 festgestellt werden konnten.
Eine Variante von HVO_2753 mit N-terminalem Hexahistidin-Tag wurde homolog überproduziert und aufgereinigt. Die Überproduktion und Aufreinigung wurden im Zuge dieser Arbeit weiter, speziell für HVO_2753, optimiert. So konnten große Mengen von HVO_2753n überproduziert und bei nativen Salzbedingungen mittels Nickel-Affinitätschromatographie und anschließender Größenausschlusschromatographie aufgereinigt werden. Eine massenspektrometrische Analyse bestätigte sowohl das Molekulargewicht als auch die Abwesenheit posttranslationaler Modifikationen. Die Untersuchung der Menge an gebundenem Zink im Protein erfolgte beim Zink-Assay mit Hilfe des hochsensitiven und hochspezifischen Fluorophors ZnAF-2F. Dabei konnte gezeigt werden, dass überraschenderweise lediglich ein Zink-Ion in HVO_2753 gebunden vorliegt.
Zur weiteren Funktionsaufklärung erfolgte eine Interaktionspartnersuche. Hierfür wurde HVO_2753 überproduziert, ein in vivo-Crosslink und anschließend eine native Aufreinung durchgeführt. Die massenspektrometrische Analyse ausgewählter Fraktionen nach der Größenausschlusschromatographie ergaben eine Vielzahl an möglichen Bindepartnern. Besonders häufig wurde hier die GalE family Epimerase/Dehydratase gefunden. Eine weitere Methode zur Suche nach Interaktionspartnern richtete sich auf RNAs. Hier konnten mittels eines eigens entwickelten Protokolls neben RNAs des Translationsapparates auch mehrfach die tRNA(Glu) gefunden werden.
Zusätzlich sollte die Transkriptomanalyse mittels RNA-Sequenzierung Unterschiede zwischen Wildtyp, Deletionsmutante und Komplementationsmutante aufzeigen. Hier wurden weitreichende Auswirkungen der Deletion von HVO_2753 gefunden. Zahlreiche Gene in mehreren Operons zur Motilität und Chemotaxis lagen in der Deletionsmutante stark herunterreguliert vor, während die Gene einiger Metallionen-Transporter und der Eisen(III)-Siderophor-Biosynthese hochreguliert vorlagen. In der Komplementationsmutante konnten nur von den letzteren Genen Transkriptlevel vergleichbar mit denen des Wildtyps wiedergefunden werden.
In dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass das kleine Zinkfinger-Protein HVO_2753 eine essenzielle Rolle in der positiven Regulation der Motilität, Chemotaxis und der Adhäsion bzw. Biofilmbildung spielt. Gleichzeitig übt HVO_2753 eine negative Regulation auf den Metallionen-Transport und die Biosynthese des Eisen(III)-Siderophors aus.
Mechanismus der funktionell relevanten Kopplung von Kontaktallergenen in dendritischen Zellen
(2002)
Über die Signaltransduktion in Langerhanszellen, den antigenpräsentierenden Zellen der Epidermis, ist bisher nur wenig bekannt. Mit ein Grund dafür ist die schlechte Verfügbarkeit reiner Langerhanszellen aufgrund ihrer geringen Zahl und der schwierigen Präparation, die häufig schon zur Voraktivierung dieser Zellen führt. Humane unreife und reife dendritische Zellen erwiesen sich als geeignete Modellzellpopulation für kutane antigenpräsentierende Zellen. Mit Hilfe dieser Modellzellen wurde die Beteiligung von zentralen Signaltransduktionswegen nach Interaktion mit dem Kontaktallergen TNCB untersucht. 1. Zum ersten Mal wird gezeigt, dass TNCB in den ersten 10 Minuten nach der Haptenisierung bei dendritischen Zellen intrazellulär lokalisiert ist. Die Stimulation von DC mit dem starken Kontaktallergen TNCB führte zu einer Aktivierung der ERK1/2 MAP Kinase. Dieses Ergebnis entspricht der Vorstellung, dass starke Kontaktallergene in subtoxischen Konzentrationen zellulären Streß bei MAP Kinasen auslösen und somit zu einer für die Kontaktallergie typischen Antigenpräsentation führen. 2. Die Tyrosinphosphorylierung wurde bereits in vorausgegangenen Arbeiten (Kuhn, 1998; Brand, 2002) als Charakteristikum für haptenbehandelte Monozyten und humane dendritische Zellen herausgestellt. Diese Ergebnisse konnten mit humanen unreifen und reifen DC weitergeführt werden. Proteinbiochemisch ergab das Kontaktallergen TNCB ein spezifisches und reproduzierbares Muster hyperphosphorylierter Proteinbanden. Der gemessene Anstieg an Phosphotyrosin beruhte auf der gesteigerten Aktivität von Protein Tyrosin-Kinasen. 3. In weiteren Untersuchungen wurden Proteine massenspektrometrisch analysiert, die tyrosinphosphoryliert waren und gleichzeitig TNCB gebunden hatten. Es wurden drei Proteine identifiziert: Gewebstransglutaminase bei 74-80kD, Thyroidhormon Bindeprotein bei 58kD und Aktin bei 38kD. Nach Literaturrecherchen war die Transglutaminase am vielversprechendsten und wurde auf ihre Aktivität innerhalb der Kontaktallergen-induzierten Signaltransduktionskaskade hin untersucht. Drei strukturell verschiedene Stoffe, das Kontaktallergen TNCB, die Retinsäure (RA) und ein Phorbolester (PMA) induzierten eine starke, proteinbiochemisch meßbare Tyrosinphosphorylierung der ERK1/2 MAP Kinase. Aus der Literatur war die RA für eine Aktivierung der tTG bekannt (Antonyak et al., 2002) und PMA als Stimulator der ERK1/2 MAP Kinase (Chen et al., 2002; Lee et al., 2002) - aus diesem Grund wurden sie als Positivkontrolle mitgeführt. 4. Mittels Immunpräzipitation wurde der Nachweis, dass TNCB an die tTG bindet, erbracht. Dies war der erste Indikator für eine Bedeutung der tTG als Zielstruktur für ein Kontaktallergen. 5. TNCB, RA und PMA lösen eine gesteigerte Transamidierungsaktivität der tTG aus, die essentiell zur Induktion der ERK-Phosphorylierung ist. Dies wurde durch einen Transamidierungs Aktivitäts Assay bestimmt (Zhang et al., 1998), einem Nachweis der tTG Aktivität mittels Inkorporation von biotinylierten Polyaminen in lokale Proteine. 6. Sowohl die tTG Aktivität als auch die ERK-Phosphorylierung nach TNCB Stimulation konnten durch den spezifischen Inhibitor der Transamidierungsaktivität der tTG MDC gehemmt werden. Dies war ein zweiter Hinweis, dass die enzymatische Aktivität der tTG eine große Rolle spielt. Das gleichzeitige Ausbleiben der Transamidierung und der ERK-Phosphorylierung deutet auf den deutlichen Einfluß der tTG auf den Signaltransduktionsweg der ERK1/2 MAP Kinase hin. Analysen mit anderen starken Kontaktallergenen, wie z.B. Thiomersal und Chlormethylisothiazolon/ Methylisothiazolon bieten zukünftige Forschungsansätze zur weiteren Charakterisierung der funktionellen Bedeutung der tTG und des ERKWeges. Interessant wären auch Untersuchungen zur Hochregulation der tTGExpression in DC von 24-72 Stunden nach einer Inkubation mit TNCB, RA und PMA. Auch sind weitere Untersuchungen zur Signaltransduktionskaskade im Hinblick auf die erforderlichen, nachgeschalteten Elemente interessant, wie z.B. der von der tTG aktivierten Protein B Kinase AKT (Antonyak et al., 2002) sowie beteiligter Kinasen des ERK-Weges.
Die antivirale Funktion der RNA-abhängigen Adenosin-Desaminase bei der angeborenen Immunantwort
(2004)
Die angeborene Immunantwort von Säugetieren ist die erste wirkungsvolle Barriere gegen eindringende Pathogene, die sowohl Infektionen als auch die Entstehung von Neoplasien verhindern kann. Insbesondere wird durch sie die Ausbreitung und Replikation von Viren wirksam bekämpft. Bei RNA-Viren wird die angeborene Immunabwehr in infizierten Zellen von der doppelsträngigen RNA aktiviert, die während der Replikation oder Transkription dieser Viren entsteht. Es kommt zur Sezernierung von Interferon-alpha und -beta (IFN-alpha/beta), die wiederum die Expression einer Reihe von antiviralen Proteinen stimulieren. Eines dieser Proteine ist die IFN-alpha-induzierbare RNA-abhängige Adenosin Desaminase (iADAR-1). Ziel dieser Arbeit war es, die Rolle der iADAR-1 in der Immunabwehr näher zu charakterisieren. Bisher wurde die antivirale Aktivität der iADAR-1 gegen verschiedene Virusstämme, deren Genome Adenosin zu Guanosin (A->G) Hypermutationen aufweisen, nur angenommen, jedoch noch nicht direkt gezeigt [4]. In dieser Arbeit wurde am Beispiel des Glykoproteins (GP) des lymphozytären Choriomeningitis Virus (LCMV) untersucht, ob solche A->G Mutationen im viralen Genom tatsächlich durch die iADAR-1 verursacht werden und ob dadurch die Funktion der viralen Proteine und damit die Infektiösität von LCMV reduziert wird. Des Weiteren wurde die Induktion der iADAR-1 durch die Infektion mit LCMV und die Wirkung der iADAR-1 auf die Replikation von LCMV analysiert. Bekannt war nur, dass die iADAR-1 durch IFN-alpha selbst oder durch die Infektion von Makrophagen mit Adenoviren induziert wird. In dieser Arbeit wurde erstmals für Fibroblasten, neuronale Zellen und in vivo in Mäusen nachgewiesen, dass die iADAR-1 direkt durch die Infektion mit LCMV hochreguliert wird. Dies ist ein weiterer Hinweis, dass die iADAR-1 zu den antiviralen Effektormolekülen der angeborenen Immunabwehr zählt. LCMV induzierte die Expression der iADAR-1 sowohl auf mRNA- als auch auf Proteinebene. Im Gegensatz zu Vaccinia- und Adenoviren, die die Aktivität der iADAR-1 inhibieren [5, 6], konnte bei der Infektion von SH-SY5Y-Zellen mit LCMV keine reduzierte Aktivität der iADAR-1 festgestellt werden. Ferner konnte das schon in anderen Viren beobachtete A->G Hypermutationsmuster nun auch für LCMV bestätigt werden. Sowohl in vitro in L929-Zellen als auch in vivo in Mäusen wurde eine erhöhte A->G Mutationsfrequenz gefunden, die zwischen 50 und 75 % aller Mutationen in der S-RNA von LCMV ausmacht. Dies zeigte sich vor allem in der späten Phase der Infektion, also zu Beginn der Persistenz. Insgesamt wurden zu diesem Zeitpunkt in L929-Zellen 27 % und in der Maus 15 % nicht funktionelles LCMV-GP synthetisiert. Zudem wurde die Relevanz der A->G Hypermutationen für die beeinträchtigte Funktion des GPs deutlich, da sie 62 % der nicht infektiösen GP-Moleküle verursachen. Die desaminierende Wirkung der iADAR-1 auf das virale Genom von LCMV wurde in 293T-Zellen direkt gezeigt. A->G Mutationen in der S-RNA von LCMV nahmen durch die Überexpression der iADAR-1 in 293T-Zellen um 40 % zu. Ebenso wurde die Replikation bzw. das Assembly von Virionen durch die iADAR-1 reduziert, da im Vergleich zu Kontrollzellen der LCMV-Titer im Überstand von iADAR-1-überexprimierenden Zellen wesentlich niedriger war. Des Weiteren konnte bestätigt werden, dass die A->G Mutationen nicht durch die virale Polymerase induziert werden. Hierfür wurden iADAR-1 „knockout“ murine embryonale Fibroblasten (MEF) isoliert und als stabile Zelllinie etabliert. In diesen Zellen war kein A->G Hypermutationsmuster in der LCMV-RNA zu erkennen. In MEF wt war ebenfalls kein A->G Hypermutationsmuster nachweisbar. Der Grund hierfür könnte die im Vergleich zu L929-Zellen deutlich geringere basale iADAR-1-Expression der nicht völlig ausdifferenzierten MEFs sein.