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Die vorliegenden Arbeit analysiert 270 Traumapatienten, die durch das am Klinikum der Johann Wolfgang Goethe-Universität Frankfurt stationierte NEF in den Schockraum der Universitätsklinik eingeliefert wurden. Der Beobachtungszeitraum erstreckt sich von Anfang Januar 2004 bis einschließlich August 2007. Als Grundlage der Studie dient der Vergleich der präklinischen Daten des Notarzteinsatzprotokolls mit den klinischen Daten, die im Schockraum erhoben wurden. Ziel der Studie war es, den Stand der präklinischen Traumaversorgung darzustellen. Eine mögliche Überversorgung sowie eine Unterversorgung soll anhand präklinischer Maßnahmen, wie die Durchführung einer endotrachealen Intubation, die Anlage einer Thoraxdrainage und die prophylaktische Immobilisation der Halswirbelsäule erfasst werden. Insgesamt bestand für 28,1 % der Patienten eine präklinische Intubationsindikation. In internationalen Studien werden Indikationen von 16 % bis 29 % angegeben und somit bestätigt. Um eine präklinische Unterversorgung hinsichtlich der endotrachealen Intubation festzustellen, wurden notwendige Intubationen innerhalb der ersten 15 Minuten im Schockraum analysiert. Nach Einzelfallprüfung zeigt sich, dass 4,5 % der Patienten, die vom NEF in den Schockraum eingeliefert wurden, als unterversorgt bezeichnet werden können. Die rasche Indikation im Schockraum zur Sicherung des Atemwegs mittels endotrachaealer Intubation, ergab sich in mehr als der Hälfte der Fälle (55,6 %) durch eine stark eingeschränkte Vigilanz (GCS<9). Zur Detektion einer hinsichtlich der endotrachealen Intubation bestehenden präklinischen Überversorgung, wurden die am Unfallort zur Intubation führenden Indikationen analysiert. Hierbei zeigte sich, dass nur ein Patient (1,47 %) ohne anerkannte Indikation, nur aufgrund des Unfallmechanismus und der zu erwartenden Verletzungen ohne klinisches Korrelat endotracheal intubiert wurde. Ein Gruppenvergleich von Patienten mit und ohne Intubation zeigte signifikante Unterschiede in Bezug auf die anhand des Injury Severity Scores erhobenen Verletzungsschwere. Die Ergebnisse dieser Studie mit 4,5 % der Patienten, die präklinisch hinsichtlich der Atemwegssicherung unterversorgt und den 1,47 % der Patienten, die überversorgt waren, sind Ausdruck der eher zurückhaltenden Indikationsstellung einer endotrachealen Intubation unter präklinischen Bedingungen unter Berücksichtigung des engen präklinischen Zeitfensters. 12,2 % der Patienten benötigten nach dem Trauma eine Thoraxdrainage. Um eine präklinische Unterversorgung hinsichtlich der Anlage einer Thoraxdrainage zu ermitteln, wurde die Dringlichkeit und die Indikation der im Schockraum gelegten Drainagen beurteilt. Patienten, die innerhalb der ersten 15 Minuten nach Ankunft in der Klinik eine Drainage erhielten, wurden als unterversorgt eingestuft. Per Definition dieser Studie sind 33,3 % der Patienten, die eine Drainage benötigten, unterversorgt, das entspricht 4,1 % vom gesamten Patientenkollektiv. Von diesen Patienten hatten mehr als 90 % auffällige Atemmuster und 54,5 % waren endotracheal intubiert und beatmet. Trotz therapeutischer Maßnahmen, wie die Sauerstoffgabe oder die Intubation, war die periphere Sauerstoffsättigung bei den Unterversorgten in 45,5 % nicht zufriedenstellend (SpO2 < 90 %). In 45,5 % der Fälle war die Traumaursache mit der offensichtlichen Gefahr eines Pneumothorax eine Stichverletzung im Thoraxbereich. Als Ursachen für diese Mängel in der Patientenversorgung sind die eingeschränkten präklinischen diagnostischen Möglichkeiten, die Invasivität der Maßnahme mit den daraus resultierenden Komplikationen und die zeitlich aufwendige, auch für lange Jahre tätige Notärzte seltene Maßnahme der Thoraxdrainagenanlage zu nennen. Die Unsicherheit in Diagnostik und Therapie lassen das präklinische Konzept des „scoop and run“ mit dem sofortigen Transport in die Klinik vorteilhaft erscheinen. Die Ergebnisse der Immobilisation der Halswirbelsäule als prophylaktische Maßnahme, um Sekundärschäden durch Rettung und Transport abzuwenden, zeigen eklatante Mängel in der Patientenversorgung. Mehr als ein Drittel (35,9 %) der Patienten mit aufgrund des Unfallmechanismus klarer Indikation zur Durchführung der Protektion wurden ohne Immobilisation der Halswirbelsäule in die Klinik eingeliefert. Um diese Versäumnisse zu analysieren, erfolgte ein Vergleich der Gruppe mit und ohne HWS-Protektion. Patienten, die eine HWS-Protektion erhielten, hatten anhand des Injury Severity Scores erhoben signifikant schwerere und multiplere Verletzungen als Patienten ohne Protektion. Unter Berücksichtigung des Unfallmechanismus führten Stürze aus größer Höhe und Verkehrsunfälle häufiger zur Anwendung einer Zervikalstütze als Stürze aus geringer Höhe. Die Vigilanz hatte hingegen keinen Einfluss auf die Häufigkeit der HWS-Immobilisation, obwohl der bewusstlose Traumapatient eine relativ eindeutige Indikation darstellt. Von den 270 Patienten dieser Studie haben sich 2,9 % eine Verletzung der Halswirbelsäule zugezogen, davon 0,37 % mit einer instabilen Fraktur in diesem Bereich. Da Frakturen der Wirbelsäule sich häufig nicht aus der präklinischen eingeschränkten Diagnostik ergeben, ist es dringend erforderlich, unter Berücksichtigung des Unfallmechanismus und der Umstände am Unfallort, Sekundärschäden durch die Anlage eine Zervikalstütze abzuwenden. Um einen Vergleich mit anderen Kliniken zu ermöglichen, wurden Patientenkollektiv und Einsatzaufkommen analysiert. Hier zeigt sich eine Dominanz der männlichen Traumapatienten in der Altersgruppe der Berufstätigen, wie sie in anderen Traumazentren beschrieben wird. Auch der jahreszeitliche Verlauf mit einer Häufung der Traumapatienten in den Sommermonaten und ein typischer zirkadianer Rhythmus, die das Verkehrsaufkommen und das Freizeitverhalten der Bevölkerung wiederspiegeln, zeigt, dass von einem repräsentativen Patientenkollektiv ausgegangen werden kann. Der größte Anteil der Patienten hatte hinsichtlich der Traumaursache einen Unfall im Straßenverkehr (41,5 %), gefolgt von Stürzen aus unterschiedlichen Höhen (36,7 %). Gewalttaten mit einem Anteil von knapp 12 % als Traumaursache spiegeln das Patientenkollektiv einer Großstadt wie Frankfurt am Main wieder. Zur Objektivierung der Ergebnisqualität der präklinischen Patientenversorgung wurde der Mainz Emergency Evaluation Score (MEES) erhoben. Entsprechend ihrem Ausgangszustand konnten 87 % der Patienten stabil oder mit einem entsprechen dem MEES verbesserten Zustand der Vitalparameter in die Klinik transportiert werden. Maßnahmen wie die suffiziente Analgesie und Verbesserungen im Bereich der Atmung durch Sauerstoffgabe und endotracheale Intubation sind dafür wesentlich verantwortlich. Die präklinische Patientenversorung und die Struktur des Rettungswesens in Deutschland genießt international einen herausragenden Ruf. Dennoch konnten Defizite in der Erkennung und Behandlung von Traumapatienten festgestellt und in dieser Studie bestätigt werden. Um diese Defizite langfristig beheben zu können, sollte ein kontinuierliches Qualitätsmanagement implementiert werden. Auf eine Verbesserung der Dokumentationscompliance in der präklinischen Phase sollte geachtet werden, um eine Qualitätsbewertung regelhaft durchführen zu können. Kontinuierliche Schulungsmaßnahmen und regelmäßiges Training durch Simulation von Notfallsituationen sollten das notwendige Wissen praxisnah vermitteln und vertiefen. Simulationstraining, wie es im „Frankfurter Institut für Notfallmedizin und Simulation (FINeST)“ angeboten wird und Schulungsprogramme mit neuen Lernkonzepten müssen regelmäßig angeboten und ausgebaut werden, um die hohe Qualität des Rettungsdienstes in Deutschland zu sichern und weiter zu verbessern.
Die weltweit steigende Teilnehmerzahl bei Volks- und Marathonläufen zeigt, dass sich das Langstreckenlaufen in den letzten Jahren zum Volkssport entwickelt hat [Merz, 2004]. Das Streben vieler Freizeitläufer, außergewöhnliche sportliche Leistungen zu erbringen und beim Marathon an die eigenen Grenzen zu stoßen, birgt jedoch auch die Gefahr von Überlastungsreaktionen und Verletzungen besonders des Kniegelenks [Hohmann et al., 2005]. In welchem Maße die Belastungen beim Langstreckenlaufen physiologische Grenzen überschreiten und damit den hyalinen Gelenkknorpel schädigen sowie die Gonarthroseentstehung begünstigen, konnte bislang noch nicht eindeutig geklärt werden. Ziel unserer Studie war es, den hyalinen Knorpel im Kniegelenk zu quantifizieren (Knorpelvolumen und -dicke), um auf dieser Grundlage Rückschlüsse auf ein möglicherweise erhöhtes Arthroserisiko bei Marathonläufern ziehen zu können. Zu diesem Zweck erfolgte die Untersuchung aller Probanden, mit einem weit verbreiteten MRT-Gerät (1.5 T Magnetom Symphony, Siemens). Spezielle MRT-Sequenzen (qMRT) in Kombination mit digitalen Bildbearbeitungsprogrammen ermöglichen eine exakte drei-dimensionale Analyse der quantitativen Knorpelparameter Volumen und mittlerer Dicke im Kniegelenk. Bei den Wettkampfanfängern (5 Frauen und 6 Männer; 39.5 ± 4.8 Jahre; 75.9 ± 18.2 kg; BMI 25.1 ± 3.5 kg/m2) erfolgten die MRT-Messungen zu Beginn ihrer sechsmonatigen Vorbereitung auf den Frankfurt-Marathon und in den ersten Tagen nach dem Rennen. Die durchschnittliche Laufleistung der Marathon-Debütanten, die im Schnitt seit 3 Jahren freizeitmäßig joggten, lag bei 34 km/Woche während des sechsmonatigen Marathontrainings. Die fortgeschrittenen Wettkampfläufer (12 Männer; 37.9 ± 7.4 Jahre; 75.2 ± 5.4 kg; BMI 23 ± 1.3 kg/m2) wurden vor und nach einem Trainings- und Wettkampfjahr untersucht, in dem sie ein durchschnittliches Laufpensum von 67 km pro Woche absolvierten. Eine validierte T1-gewichtete Gradientenechosequenz mit Wasseranregungstechnik (FLASH: TR = 49 ms, TE = 10.3 ms, FA = 30°, Auflösung = 0.156 mm x 0.156 mm, Schichtdicke 1.5 mm, Matrix = 512 Pixels x 512 Pixels, Bildausschnitt [FOV] = 160 mm x 160 mm) diente zur Akquisition koronarer Datensätze des femoralen und tibialen Knorpels (jeweils laterales und mediales Kompartiment) und transversaler Datensätze des patellaren Gelenkknorpels. Nach manueller Segmentierung und 3D-Rekonstruktion erfolgte die Analyse der quantitativen Knorpelparameter. Die Veränderungen von Knorpelvolumen und mittlerer Knorpeldicke im Zeitverlauf wurden prozentual dargestellt und die Signifikanz mittels gepaartem T-Test berechnet. Bei den Wettkampfanfängern zeigte sich keine signifikante Reduktion der Knorpeldicke oder des Knorpelvolumens, lediglich am lateralen Femur war eine signifikante Reduktion von Knorplvolumen (-3.2 ± 3.0 %, p = 0.012) und mittlerer Knorpeldicke (-1.7 ± 1.6 %, p = 0.010) zu finden. Da jedoch die Schwankungen vom Knorpelvolumen im Tagesverlauf und nach 50 Kniebeugen größer sind als die prozentualen Veränderungen am lateralen Femur, kann die berechnete signifikante Abnahme nicht als relevanter Knorpelverlust oder -verschleiß interpretiert werden. Die fortgeschrittenen Wettkampfläufer wiesen in keinem der fünf Knorpelkompartimente des Kniegelenks (laterale und mediale Tibia, lateraler und medialer Femur und Patella) eine signifikante Zu- oder Abnahme der Knorpelparameter auf. Die Ergebnisse dieser Studie legen den Schluss nahe, dass die andauernden und hohen axialen Lasten beim Langstreckenlaufen, vom Kniegelenksknorpel der Marathon-Debütanten und etablierten Wettkampfläufer gut toleriert werden. Insgesamt liefert die quantitative Analyse der Knorpelmorphologie im Kniegelenk keine Anhaltspunkte für ein erhöhtes Risiko der vorzeitigen Arthroseentstehung bei Marathonläufern.
Ferrocenbasierte Polymere stellen interessante Verbindungen dar. Sie weisen herausragende optische und/oder elektronische Eigenschaften auf, die sich auf die redoxaktiven Eisenionen sowie die kooperativen Effekte entlang des Polymerstrangs zurückführen lassen. Befindet sich Ferrocen in der Hauptkette und sind die Ferrocenbausteine jeweils über ein einzelnes Atom miteinander verbunden, so ist dieses Brückenelement maßgebend für die substanzspezifischen Merkmale des Makromoleküls. Während bereits effiziente Syntheserouten bekannt sind, auf denen sich Atome der Gruppen 14 bis 16 in die Brücke einführen lassen, bereitet die Synthese borverbrückter Poly(ferrocenylene) große Schwierigkeiten. Gerade diese Stoffklasse wäre aber besonders attraktiv, da Boratome sowohl dreifach als auch vierfach koordiniert vorliegen können und über diese Eigenschaft das Ausmaß der elektronischen Wechselwirkungen entlang des Polymerrückgrats ebenso wie die Struktur des Makromoleküls gezielt beeinflussbar ist. Vor diesem Hintergrund galt es im Rahmen der vorliegenden Arbeit, chemisch stabile Poly(ferrocenylene) mit tetrakoordinierten anionischen Boratbrücken darzustellen. Als Grundlage diente die Adduktbildung zwischen lewissauren 1 ,1'-fc(BRz)zDerivaten und dem lewisbasischen doppelt deprotonierten Ferrocen 1,1 '-fcLi2 x 2/3 TMEDA. Frühere Untersuchungen an BMez-verbrückten di- (35) und tri nuklearen (36) Ferrocenkomplexen haben gezeigt, dass diese Verbindungen extrem empfindlich gegenüber Luft und Feuchtigkeit sind. Auch mussten cyclovoltammetrische Messungen an 35 bzw. 36 bei tiefen Temperaturen (-78 Oe) durchgeführt werden, um zu verhindern, dass es zu einer Zersetzung der Moleküle im Zuge der Fe{fI)Oxidation kam. Im Rahmen dieser Arbeit sind Systeme dargestellt worden, bei denen die labilen BMe2-Gruppen durch BPh2- bzw. Borafluorenylbrücken ersetzt sind. An mononuklearen Verbindungen konnten (Diphenylboryl)ferrocen 57, 1, 1'MBis(diphenylboryl) ferrocen 58 und 9-Ferrocenyl-9-borafluoren 61 isoliert und voIlständig charakterisiert werden (Abb. 53). ....
Reggie-1 (flotillin-2) and reggie-2 (flotillin-1) are membrane microdomain proteins which are associated with the membrane by means of acylation. They influence different cellular signaling processes, such as neuronal, T-cell and insulin signaling. Upon stimulation of the EGF receptor, reggie-1 becomes phosphorylated and undergoes tyrosine 163 dependent translocation from the plasma membrane to endosomal compartments. In addition, reggie-1 was shown to influence actindependent processes. Reggie-2 has been demonstrated to affect caveolin- and clathrin-independent endocytosis. Both proteins form homo- and hetero-oligomers, but the function of these oligomers has remained elusive. Moreover, it has not been clarified if functions of reggie-1 are also influenced by reggie-2 and vice versa. The first aim of the study was to further investigate the interplay and the heterooligomerization of reggie proteins and their functional effects. Both reggie proteins were individually depleted by means of siRNA. In different siRNA systems and various cell lines, reggie-1 depleted cells showed reduced protein amounts of reggie-1 and reggie-2, but reggie-2 knock down cells still expressed reggie-1 protein. The decrease of reggie-2 in reggie-1 depleted cells was only detected at protein but not at mRNA level. Furthermore, reggie-2 expression could be rescued by expression of siRNA resistant wild type reggie-1-EGFP constructs, but not by the soluble myristoylation mutant G2A. This mutant was also not able to associate with endogenous reggie-1 or reggie-2, which demonstrates that membrane association of reggie-1 is necessary for hetero-oligomerization. In addition, fluorescence microscopy studies and membrane fractionations showed that correct localization of overexpressed reggie-2 was dependent on co-overexpressed reggie-1. Thus, hetero-oligomerization is crucial for membrane association of reggie-2 and for its protein stability or protein expression. Moreover, the binding of reggie-2 to reggie-1 required tyrosine 163 of reggie-1 which was previously shown to be important for endosomal translocation of reggie-1. Since reggie-2 was implicated to function in clathrin- and caveolin-independent endocytosis pathways, the effect of reggie-2 depletion on reggie-1 endocytosis was investigated. Indeed, reggie-1 was dependent on reggie-2 for endosomal localization and EGF-induced endocytosis. By FRET-FLIM analysis it could be shown that reggie heterooligomers are dynamic in size or conformation upon EGF stimulation. Thus, it can be concluded that reggie proteins are interdependent in different aspects, such as protein stability or expression, membrane association and subcellular localization. In addition, these results demonstrate that the hetero-oligomers are dynamic and reggie proteins influence each other in terms of function. A further aim was the characterization of reggie-1 and reggie-2 function in actindependent processes, where so far only reggie-1 was known to play a role. Depletion of either of the proteins reduced cell migration, cell spreading and the number of focal adhesions in steady state cells. Thus, also reggie-2 affects actin-dependent processes. Further investigation of the focal adhesions during cell spreading revealed that depletion of reggie-1 displayed different effects as compared to reggie-2 knock down. Reggie-1 depleted cells had elongated cell-matrix-adhesions and showed reduced activation of FAK and ERK2. On the other hand, depletion of reggie-2 resulted in a restricted localization of focal adhesion at the periphery of the cell and decreased ERK2 phosphorylation, but it did not affect FAK autophosphorylation. Hence, reggie proteins influence the regulation of cell-matrix-adhesions differently. A link between reggie proteins and focal adhesions is the actin cross-linking protein -actinin. The interaction of -actinin with reggie-1 could be verified by means of co-immunoprecipitations and FRET-FLIM analysis. Reggie-1 binds -actinin especially in membrane ruffles and in other locations where actin remodeling takes place. Moreover, -actinin showed a different localization pattern during cell spreading in reggie-1 depleted cells, as compared to the control cells. These results provide further insights into the function of both reggie proteins. Their interplay and hetero-oligomerization was shown to be crucial for their role in endocytosis. In addition, both reggie proteins influence actin-dependent processes and differentially affect focal adhesion regulation.
The reggie protein family consists of two homologous members, reggie-1 and reggie-2, also termed flotillin-2 and flotillin-1, respectively, that are ubiquitously expressed and evolutionarily well conserved, suggesting an important but so far ill-defined function. In various cell types, both reggies have been found to be constitutively associated with lipid rafts by means of acylation modifications and oligomerization. Lipid rafts are glycosphingolipid- and cholesterol-rich membrane microdomains which have been implicated in several cellular processes including membrane transport and signal transduction through growth factor receptors. However, the molecular details of these processes are still poorly understood. With the observation that reggies colocalize with activated glycosylphosphatidylinositolanchored proteins (GPI-APs) and Fyn kinase in rafts, a role for these proteins in signaling events has been suggested. In agreement with that, we have previously shown that reggie-1 becomes multiply tyrosine phosphorylated by Src kinases in response to epidermal growth factor (EGF) stimulation, pointing to a function for reggie-1 in growth factor signaling. Furthermore, overexpression of reggie-1 enhances spreading on fibronectin substrate in a tyrosine-dependent manner, thus revealing a role for reggie-1 in regulation of actin cytoskeleton through growth factor receptors. Due to the similarity shared by reggie proteins at amino acid level and to their ability to form hetero-oligomeric complexes, the first aim of this study was to analyze the putative tyrosine phosphorylation of reggie-2 in growth factor stimulated cells. Similarly to reggie-1, reggie-2 was found to be multiply tyrosine phosphorylated by Src kinase and to exist in a molecular complex with Src, with the degree of co-immunoprecipitation dependent on the activity of Src. Recent studies from us have also shown that administration of EGF results in the endocytosis of reggie-1 from the plasma membrane into endosomes, which is in line with a proposed role for reggies in membrane trafficking processes. In order to characterize in detail the endocytic mechanism that mediates the uptake of reggie-1, the dependency of reggie-1 endocytosis on clathrin and dynamin was investigated by means of overexpressing a variant form of Eps15 or a dominant negative form of dynamin-2. In either case the translocation of reggie-1 into endosomes in response to EGF was not affected, and this, together with the results that reggie-1 colocalized with cholera toxin (CTX) but not with transferrin receptor (TfnR) during EGF signaling, indicates that reggie-1 is taken up by means of a dynaminindependent, raft-mediated pathway. These findings are very well in line with recent data showing the pathway of entry into cells of reggie-2 as a raft-mediated endocytic pathway. The endocytosis of reggie-2 in response to EGF was also analyzed in this study. Similarly to reggie-1, in growth factor stimulated cells reggie-2 underwent a translocation from the plasma membrane to endosomes where the two reggies were found to colocalize with each other, suggesting that epidermal growth factor signaling might trigger the endocytosis of reggie oligomers. In addition, colocalization with both the late endosomal marker LAMP3/CD63 and epidermal growth factor receptor (EGFR) was detected, again indicating a function for reggies in signal transduction through growth factor receptors. EGFR has been reported to localize in rafts but, although this association is thought to be functional during EGF stimulation, how segregation of EGFR into rafts modulates its endocytosis and signaling is still under debate. Since reggie oligomers have recently been suggested to define a raft subtype, a further aim of this study was to investigate whether the depletion of reggies by means of small interfering RNA could interfere with the signaling and the trafficking through EGFR. Knockdown of reggie-2 resulted in an altered tyrosine phosphorylation of EGFR in response to EGF, while the degree of ubiquitination was not affected. Less efficient phosphorylation of tyrosine residues, especially of those which are docking sites for Grb2 and Shc, led in turn to an impaired activation of p38 and ERK1/2 MAPKs. Depletion of reggie-2 did not affect the early trafficking of activated EGFRs, with receptors being endocytosed and delivered to late endosomes as efficiently as in control cells. This would be in line with the normal degree of ubiquitination observed for EGFR, as ubiquitin moieties have been proposed to represent sorting tags that ensure receptor endocytosis into early endosomes and its proper intracellular trafficking. On the contrary, after prolonged EGF stimulation, depletion of reggie-2 resulted in a decreased downregulation of both receptor-bound ligand and EGFR, and in their accumulation in intracellular vesicles, thus pointing to a role for reggie-2 in the degradative pathway. Taken all together, these data ndicate that the association of EGFR with reggie-microdomains is likely to be important for proper receptor trafficking and signaling.
Das proinflammatorische Zytokin Interleukin (IL)-18 scheint an einer Vielzahl von Entstehungsprozessen pathologischer Erkrankungen, darunter rheumatoide Arthrits und Artherosklerose, sowie Tumorwachstum und Metastasierungsfähigkeit von Tumoren, beteiligt zu sein. Da die biologische Aktivität der Matrix-Metallo-Proteinase-9 (MMP-9) ebenfalls entscheidenden Einfluss auf die Pathologie dieser Erkrankungen hat, wurden die Auswirkungen von IL-18 auf die MMP-9-Produktion in peripheren Blutmonozyten (PBMC) untersucht. Darüber hinaus richtete sich unser Augenmerk auf die Möglichkeiten einer immunopharmakologischen Intervention mittels anti-Tumor-Nekrose-Faktorα (anti-TNFα) oder IL-10. In der vorliegenden Arbeit konnte gezeigt werden, daß die MMP-9-Produktion in PBMC durch IL-18 gesteigert wird. Dabei ist die Potenz von IL-18 bei der Freisetzung von MMP-9 vergleichbar mit derjenigen von TNFα. Durch die Verwendung neutralisierender monoklonaler Antikörper konnte gezeigt werden, dass die Freisetzung von MMP-9 von einer endogenen TNFα-Produktion abhängig ist. Während IL-18 und TNFα die Protease induzieren, ergibt eine Inkubation mit IFNγ keine Effekte auf die Freisetzung von MMP-9 in den PBMC. Die hier beschriebene Induktion von MMP-9 durch IL-18 ließ sich ebenfalls in humanen Vollblutkulturen nachweisen. Das antientzündliche Zytokin IL-10 ist in der Lage, die Sekretion von MMP-9 sowohl aus unstimulierten als auch aus PBMC, die zuvor mit IL-18 inkubiert wurden, konsequent zu unterdrücken. Die Produktion des tissue inhibitor of metalloproteinase-1 (TIMP-1) bleibt von einer Stimulation mit IL-18 unberührt, wohingegen eine Zugabe von IL-10 die Sekretion von TIMP-1 aus PBMC steigert. Die vorliegende Arbeit erweitert somit die proentzündlichen Wirkungsweisen von IL-18 auf PBMC, betont die herausragende Rolle einer intermediären TNFα-Produktion und stellt einen Zusammenhang her zwischen den biologischen Funktionen von IL-18 und der pathologischen Potenz von MMP-9.
Im Rahmen dieser Arbeit wurden ausgewählte 5’- und 3’-untranslatierte Regionen (UTRs) von mRNAs aus H. volcanii bestimmt. Dieses Datenset wurde verwendet um (1) haloarchaeale UTRs zu charakterisieren, (2) Konsensuselemente für die Transkrikptionsinitiation und -termination zu verifizieren und (3) den Einfluss haloarchaealer UTRs auf die Initiation und Regulation der Translation zu untersuchen. Es konnte gezeigt werden, dass alle untersuchten Transkripte nichtprozessierte 3’-UTRs mit einer durchschnittlichen Länge von 45 Nukleotiden besitzen. Darüber hinaus konnte ein putatives Transkriptionsterminationssignal bestehend aus einem pentaU-Motiv mit vorausgehender Haarnadelstruktur identifiziert werden. Die Analysen der Regionen stromaufwärts der experimentell bestimmten Transkriptionsstarts führten zur Identifizierung dreier konservierter Promotor Elemente: Der TATA-Box, dem BRE-Element und einem neuen Element an Position -10/-11. Überraschenderweise bestand die TATA-Box nur aus vier konservierten Nukleotiden. Die Untersuchung der UTRs ergab, dass die größte Anteil der haloarchaealen Transkripte keine 5’-UTR besitzt. Falls eine 5’-UTR vorhanden ist, besitzen unerwarteterweise nur 15% der 5’-UTRs aus H. volcanii eine Shine-Dalgarno-Sequenz (SD-Sequenz). Es konnte jedoch gezeigt werden, dass verschiedene native und artifizielle 5’-UTRs ohne SD-Sequenz sehr effizient in vivo translatiert werden. Außerdem hat die Sekundärstruktur der 5’-UTR und die Position struktureller Elemente offenbar einen entscheidenden Einfluss auf die Translatierbarkeit von Transkripten. Die Insertion von Strukturelementen nahe des Startkodons führte zu einer vollkommenen Repression der Translation, während die proximale Insertion des Motivs an das 5’-Ende der 5’-UTR keinen Einfluss auf die Translationsseffizienz hatte. Zusammenfassend kann sowohl der eukaryotische Scanning-Mechanismus als auch die bakterielle Initiation der Translation über die SD-Sequenz für haloarchaeale Transkripte mit 5’-UTR ohne SD-Sequenz ausgeschlossen werden. Die im Rahmen dieser Arbeit durchgeführten Untersuchungen bilden die Grundlage für weitere Untersuchungen zur Identifizierung eines entsprechenden dritten Mechanismus zur Initiation der Translation in H. volcanii. Eine aktuelle Studie zur globalen Analyse der Translationsregulation zeigte, dass der Anteil translational regulierter Gene in H. volcanii genauso hoch ist wie bei Eukaryoten (Lange et al., 2007). Um die Rolle haloarchaealer UTRs bei der Regulation der Translation zu charakterisieren, wurden die UTRs zweier ausgewählter translationsregulierter Gene untersucht. Es stellte sich heraus, dass nur die Anwesenheit beider UTRs, 5’- und 3’-UTR, zu einer Wachstumsphasen-abhängigen Regulation der Translation führt. Dabei hat die 3’-UTR allein keinen Einfluss auf die Translationseffizienz, während die 5’-UTR die Translationseffizienz in beiden Wachstumsphasen reduziert. Es zeigte sich außerdem, dass die 3’-UTR für die „Richtung“ der Regulation auf Translationsebene verantwortlich ist und putative Strukturelemente möglicherweise in den Regulationsmechanismus involviert sind. Zusammengefasst ergibt sich folgendes Modell der Translationsregulation in H. volcanii: Strukturierte 5’-UTRs führen zu einer Herabsetzung der konstitutiven Translationseffizienz. Dies kann differentiell durch regulatorische Faktoren kompensiert werden, welche spezifische Elemente der 3’-UTR binden. Sowohl natürliche als auch artifizielle Aptamere und allosterische Ribozyme stellen effektive Werkzeuge zur exogen kontrollierten Genexpression dar. Daher wurde die Anwendbarkeit eines Tetracyclin-induzierbaren Aptamers und eines konstitutiven Hammerhead-Ribozyms in H. volcanii untersucht. Es stellte sich allerdings heraus, dass das Aptamer bereits ohne Tetracyclin starke inhibitorische Sekundärstrukturen ausbildet. Als Alternative wurden Reportergenfusionen mit einem selbstspaltenden Hammerhead-Ribozym konstruiert. Die selbstspaltende Aktivität des Hammerhead-Ribozyms in H. volcanii konnte erfolgreich in vivo demonstriert werden, was die Grundlage zur Entwicklung konditionaler Expressionssysteme basierend auf dem Hammerhead-Ribozym in H. volcanii bildet.
Glutamat ist einer der wichtigsten erregenden Neurotransmitter im zentralen Nervensystem (ZNS), der unter anderem metabotrope Glutamatrezeptoren (mGluRs) aktiviert. Die Signalübertragung der mGluRs erfolgt indirekt durch Aktivierung intrazellulär gekoppelter heterotrimerer G-Proteine, die daraufhin zelluläre Signalprozesse beeinflussen. Es sind acht verschiedene mGluRs bekannt, die in drei Gruppen gegliedert werden, welche sich in ihrer Lokalisation, ihrer Struktur und ihren pharmakologischen Eigenschaften unterscheiden. Die hauptsächlich präsynaptisch lokalisierten Gruppe III mGluRs sind an der Regulation der Neurotransmission an exzitatorischen Synapsen beteiligt. Sie fungieren als Autorezeptoren, die rückkoppelnd die Glutamatausschüttung hemmen. Um eine möglichst exakte Übersetzung der extrazellulären Glutamatsignale durch mGluRs zu gewährleisten, muss die Signaltransduktion dieser Rezeptoren sehr genau kontrolliert und reguliert werden. Als Regulatoren der Signalübertragung verschiedener G-Protein gekoppelter Rezeptoren (GPCRs) haben sich Vertreter der RGS-(Regulators of G protein Signalling)-Proteinfamilie erwiesen. RGS-Proteine können direkten Einfluss auf die Kinetik der Signalübermittlung eines GPCRs nehmen. RGS-Proteine beschleunigen mittels ihrer GAP (GTPase Accelerating Protein)-Funktion die GTP-Hydrolyse, wodurch die Geschwindigkeit der Inaktivierung der Ga-Untereinheit und somit der Signalantwort des GPCRs deutlich erhöht wird. Bis heute wurden mehr als 30 verschiedene RGS-Proteine beschrieben, die alle eine konservierte RGS-Domäne besitzen, die die Bindung an die Ga-Untereinheit des G-Proteins und die GAP-Aktivität vermittelt. Für einige GPCRs wurde bereits eine spezifische und selektive Interaktion sowie Regulation durch bestimmte RGS-Proteine gezeigt. An Gruppe III mGluRs gab es bisher keine einschlägigen Untersuchungen, außer am in der Retina exprimierten mGluR6, der jedoch einen Sonderfall innerhalb dieser Rezeptorgruppe darstellt. Deshalb sollte in dieser Dissertation untersucht werden, ob Gruppe III mGluRs, mit besonderem Augenmerk auf eine der zwei bekannten Spleißvarianten des mGluR7 (mGluR7a), durch ein oder auch mehrere Mitglieder der RGS-Familie reguliert werden können. Zwei Vertreter der RGS-Protein Familie, RGS3 und RGS4, die beide im Gehirn exprimiert werden, wurden als potentielle Kandidaten ausgewählt. Biochemische Interaktionsanalysen dieser Dissertation zeigten, dass sowohl RGS3 als auch RGS4 direkt an mGluR7a binden. Die Bindung zwischen mGluR7a und RGS3 bzw. RGS4 war in Abwesenheit von Ca2+ deutlich verstärkt. Da Calmodulin (CaM) in Anwesenheit von Ca2+ sowohl an mGluR7a als auch an RGS3 und RGS4 bindet, wurde postuliert, dass gebundenes Ca2+/CaM ein räumliches Hindernis für die Wechselwirkung zwischen Rezeptor und RGS-Protein darstellen könnte. Die Daten dieser Arbeit weisen darauf hin, dass die Bindung von Ca2+/CaM an den C-Terminus des mGluR7a die Interaktion zwischen dem Rezeptor und RGS4 abschwächt. Ein physiologischer Effekt der beiden RGS-Proteine auf die mGluR7a-vermittelte Signalübermittlung wurde zunächst in transfizierten HEK-Zellen nachgewiesen. Hierzu wurde die Signalantwort des mGluR7a in An- und Abwesenheit von RGS3 oder RGS4 durch Bestimmung der Menge der sekundären Botenstoffe gemessen und verglichen. RGS3 sowie RGS4 beschleunigten in diesem System durch ihre GAP-Aktivität die GTP-Hydrolyse an der Ga-UE und damit die Inaktivierung der Signaltransduktion des Rezeptors. Mittels hochauflösender Elektronenmikroskopie konnte gezeigt werden, dass RGS3 und RGS4 wie auch mGluR7a in vivo an der präsynaptischen Membran kortikaler Maus-Neuronen zu finden sind. Da die Proteine in den Nervenzellen kolokalisieren, sollte die Interaktion und Regulation, die in vitro nachgewiesen wurde, auch in vivo möglich sein. Ein in vivo-Nachweis des regulatorischen Effektes von RGS4 auf die Signaltransduktion der Gruppe III mGluRs bzw. des mGluR7a erfolgte durch Vergleich der Signalantworten dieser Rezeptoren in kultivierten kortikalen Neuronen aus Wildtyp- und RGS4-defizienten Mäusen. Mit dem Gruppe III mGluR-spezifischen Agonisten L-AP4 konnte im Vergleich zu den Wildtyp-Neuronen keine Antwort der mGluRs in den RGS4-defizienten Nervenzellen gemessen werden. Diese Daten lassen den Schluss zu, dass die Signalübermittlung der Gruppe III mGluRs bzw. des mGluR7a ohne das RGS4-Protein nicht korrekt ablaufen kann. Zusammenfassend kann mit den Daten der vorliegenden Arbeit das bereits bestehende Modell eines mGluR7a-Signalkomplexes erweitert werden: Dabei bildet der Rezeptor bereits vor Stimulation durch einen Agonisten einen Komplex mit dem G-Protein und nachgeschalteten Effektoren, die durch den Rezeptor beeinflusst werden. Durch eine solche lokale Organisation funktionell zusammengehöriger Proteine, die die Initiation (wie das G-Protein) und Termination (wie die RGS-Proteine) der Signaltransduktion bewirken, wird eine schnelle und feinregulierte Signalübermittlung gewährleistet.
In this thesis I have investigated the regulation of eicosanoid synthesizing-enzymes by cannabinoid receptor agonists. Rat renal mesangial cells were used as a model system. I could show that all three (CB1, CB2, and GPR55) cannabinoid receptors are expressed on the mRNA level in rat renal mesangial cells – but with differing expression profiles. The CB1 and GPR55 receptors are expressed in comparable amounts, whereas the CB2 receptor is considerably less expressed than the CB1 and the GPR55 receptors. Furthermore I could show that stimulation of renal mesangial cells with CB1 receptor agonists, such as R(+)MA or ACEA, increased IL-1β-induced cPLA2, sPLA2-IIa, and COX2 protein and mRNA expression which subsequently led to an enhanced IL-1β-induced PGE2 formation. Additionally, the IL-1β- induced sPLA2-IIa promoter activity was also increased by CB1 receptor stimulation. Besides the modulated expression of the eicosanoid synthesizing enzymes, I could show that CB1 agonists also led to an increase of IL-1β-induced iNOS expression and subsequent NO formation. In contrast, stimulation with CB2 selective agonists led to a decrease in IL-1β- induced sPLA2-IIa protein expression and PGE2 formation. Accordingly, the IL-1β-induced sPLA2-IIa promoter activity was also reduced by CB2 receptor agonists. IL-1β-induced iNOS expression and subsequent NO formation were not influenced by CB2 recptor activation. Matching the results I obtained with CB1 receptor agonists on IL-1β-induced PGE2 formation, I could observe an increased cPLA2 protein and mRNA expression with a subsequent increase in IL-1β-induced PGE2 formation by GPR55 stimulation. Stimulation with THC, an unselective CB agonist, increased the IL-1β-induced sPLA2-IIa protein expression and subsequently led to an enhanced IL-1β-induced PGE2 formation. Subjecting the cells to higher THC concentrations surprisingly led to a reduction of the IL-1b-induced sPLA2-IIa protein expression and PGE2 formation. A possible explanation may be the differential expression of the three CB receptors. At low concentrations THC may predominantly activate CB1 and GPR55 and with increasing concentration CB2 receptors may also be activated, slightly reversing the enhancing effect. Moreover, I could show that the CB1 receptor stimulation mediated phosphorylation and hence the activation of ERK1/2 MAPK. Additionally to ERK1/2, there was also a phosphorylation and activation of NFkB observed by CB1 receptor stimulation. In my thesis I could show for the first time that PPARα was activated by IL-1β in rMC. The IL-1β-induced PPARα promoter activity was completely inhibited by addition of the CB2 receptor agonist, JWH015. These findings were confirmed by inhibition of the IL-1β-induced PGE2 formation by a PPARα antagonist (MK-886). In summary, I could show that activation of CB1 receptors in our system led to a worsening of an inflammatory condition, whereas activation of the CB2 receptors led to the complete opposite; namely a reduction of the inflammatory response by reducing the sPLA2-IIa expression and PGE2 formation. GPR55 activation did not display any alteration of inflammatory conditions, since the classical inflammatory pathway was not influenced.
Ataxin-2 is a novel protein, within which the unstable expansion of a polyglutamine domain can cause Spinocerebellar Ataxia type 2 (SCA2), a neurodegenerative disease which belongs to the group of polyglutamine disorders. SCA2 is characterised by a progressive loss of neurons that first affects the cerebellum and brain stem and then may extend to other areas of the brain, like substantia nigra, motoneurons and thalamus. Several lines of research have attempted to determine therole of ataxin-2 in its normal and mutant version. Different animal models and cell culture approaches to study ataxin-2 function implicated ataxin-2 in RNA processing, embryonic development, apoptosis and cytoskeleton. However, the function of ataxin-2 still remains unclear. In this thesis, a protein interaction approach was chosen as an alternative to gain insights into the cellular function of ataxin-2. Full-length ataxin-2 was used as bait in a yeast two-hybrid screen of human adult brain cDNA. Among five candidate interactor proteins identified, two were the endophilins A1 and A3, proteins involved in vesicle endocytosis. Co-immunoprecipitation studies confirmed the association of these proteins in an endogenous complex of mouse brain. In vitro binding experiments narrowed the binding interfaces down to two proline-rich domains on ataxin-2, which interacted with the SH3 domain of endophilins A1/A3. Ataxin-2 and endophilins A1/A3 colocalised at the endoplasmic reticulum as determined by immunofluorescence microscopy of transfected cell lines, and by centrifugation fractionation studies of mouse brain. Importantly, the pattern observed in transfected cells was conserved in untransfected rat hippocampal neurons. In mouse brain, associations of ataxin-2 with endocytic proteins such as the adaptor CIN85, the ubiquitin ligase c-Cbl and also GRB2, in the last case by means of a SH3 domain array chip, were also demonstrated. GST pull-down assays showed ataxin-2 to interact directly with the SH3 domains A and C of CIN85, the C-terminal SH3 domain of GRB2, and the SH3 domain of Src, a kinase activated after receptor stimulation. Functional studies demonstrated that ataxin-2 affects endocytic trafficking of the epidermal growth factor receptor (EGFR) by reducing the EGFR internalisation after EGF stimulation. Taken together, these data implicate ataxin-2 to play a role in endocytic receptor cycling.