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Die Entwicklung neuer und die Adaption bestehender Methoden ist weiterhin eine der vordringlichsten Aufgaben der Forschung zur Bekämpfung der tödlichen Infektion mit dem HI-Virus. So wurde im ersten Teil dieser Arbeit untersucht, ob die Methode der Generierung MHC-unabhängiger Immunantworten gegen Oberflächenproteine, die bereits in der experimentellen Tumortherapie verwendet wird, für die HIV Therapie adaptiert werden kann. In dieser Arbeit war das HIV Hüllprotein Env das Zielmolekül. Der zweite Teil der Arbeit versucht, Erkenntnisse aus der HIV-Forschung für alternative Tumortherapieansätze am Beispiel des kutanen T-Zell Lymphoms zu verwenden. Der erste Teil beschäftigt sich mit der Verwendung des Hüllproteins Env von HIV als Zielstruktur für die Generierung MHC-unabhängiger Immunantworten gegen HIV-infizierte Zellen. Hierfür wurden CD4, 5-Helix sowie zwei Varianten von DC-SIGN als HIV Env-bindende Liganden als chimäre T Zell-Rezeptoren, zusammen mit Teilen von CD3 und CD28, in humanen Zellen exprimiert. Die Funktionalität der Konstrukte konnte gezeigt werden, ein therapeutischer Effekt in vitro war jedoch nicht nachweisbar. Der zweite Teil untersucht die Verwendung des HIV Hüllproteins als therapeutischem Gen zur Behandlung des kutanen T-Zell Lymphoms. Die Pseudotypisierung von MLV-basierenden Vektoren mit HIV Env ermöglicht das zielzellspezifische Eindringen der Vektoren in humane CD4-positive Zellen. Aus diesen Zellen besteht auch das kutane T Zell Lymphom (CTCL). MLV/HIV pseudotypisierte retrovirale Vektoren, die die 89.6P Variante des HIV Hüllproteins Env als therapeutisches Gen transportieren, wurden generiert und zunächst in vitro getestet. Das Wachstum von CTCL-Zellen konnte durch Zugabe dieser Vektorpartikel verhindert und die Zellzahl unter den Ausgangswert reduziert werden. Die Verwendung im Maus-Experiment zeigte einen vergleichbaren Erfolg wie die Verwendung der Herpes simplex Thymidinkinase, obwohl von syn Env nur etwa ein Viertel der Vektorpartikel appliziert wurde. Ein bystander-Effekt ließ sich damit also nachweisen. Die Verwendung chimärer T-Zell-Rezeptoren für MHC-unabhängige Immunantworten gegen HIV-Reservoirs im Körper ist ein vielversprechender Therapieansatz. Neben der Verwendung HIV Env-bindender zellulärer Proteine könnte das Spektrum möglicher Liganden durch die Verwendung Subtypen-übergreifender, nicht-inhibitorischer Antikörper, erweitert werden. Dies ist möglich, da für die Immunantwort lediglich die Bindung an das Hüllprotein notwendig ist. Zur Erhöhung des therapeutischen Effektes des retroviralen Gentransfers zur Therapie kutaner T-Zell Lymphome eignen sich hoch fusogene virale Hüllproteine, die auf diese Weise einen noch stärkeren bystander-Effekt ermöglichen. Die in dieser Arbeit beschriebenen Ergebnisse deuten darauf hin, dass dieser sehr groß sein muss, solange replikationsinkompetente Vektoren verwendet werden.
Die Ursache von Adipositas liegt im übermäßigen Wachstum von Fettgewebe, welches hauptsächlich aus Fettzellen, den Adipozyten, besteht. Die Zellen der stroma-vaskulären Fraktion, welche Vorläuferzellen, Makrophagen und Zellen des lokalen Gefäßnetzwerks enthält, sind außerdem an der Homöostase des Fettgewebes beteiligt. Insbesondere spielt das Gefäßsystem des Fettgewebes in Nagetieren eine wichtige Rolle im Fettgewebewachstum, da die Hemmung der Angiogenese in genetisch- und diät-induzierten fettleibigen Mäusen die Entstehung von Adipositas verhindert. Dennoch wurde das Gefäßsystem des menschlichen Fettgewebes bis heute nicht erforscht. Durch immuno-histochemische Analysen am subkutanen menschlichen Fettgewebe konnten wir zwei verschiedene Gefäßsysteme identifizieren: das vaskuläre Netzwerk des Bluts und das lymphatische vaskuläre Netzwerk. Während die Endothelzellen von beiden Gefäßsystemen die gemeinsamen Endothelzellmarker von Willebrand factor (vWf) und CD31 (PECAM, Platelet Endothelial Cell Adhesion Molecule) exprimierten, konnten die Endothelzellen der Blutgefäße an der Expression des Markers CD34 (Stamm/Blutgefäß-Endothel-Zell-Marker) und die Endothelzellen der Lymphgefäße an der Expression der beiden lymphatischen Marker Podoplanin und VEGFR3 (Vascular Endothelial Growth Factor Receptor 3) spezifisch erkannt werden. Ausschließlich für den Marker CD34-positive Zellen und in Rosetten angeordnete CD31-positive Zellen, welche als residente Makrophagen wurden auch charakterisiert. Um die beiden Gefäßsystemen des menschlichen Fettgewebes weiterhin zu erforschen, haben wir ein auf Immunoselektion basiertes Protokoll entwickelt. Es ermöglicht, Blut- (BEC) und lymphatische (LEC) Endothelzellen aber auch Makrophagen und CD34-positive Zellen spezifisch zu isolieren. Sowohl BEC als auch LEC exprimierten VEGFR1, VEGFR2, vWf und Notch4 und nehmen acetyliertes LDL auf. Darüber hinaus konnte in LEC die Expression von Genen, welche spezifisch für das Lymphgefäßsystem sind, wie Podoplanin, Reelin, VEGFR3, Desmoplakin, LYVE-1 nachgewiesen werden. Durch fluss-cytometrischen Analysen des Anzahls von BEC und LEC im Fettgewebe von Patienten mit unterschiedlichen Body Mass Indices (BMI) wurde entdeckt, dass Fettleibigkeit von einer Erweiterung des vaskulären Netzwerks des Bluts im Fettgewebe begleitet wird, jedoch nicht von einer Erweiterung des lymphatischen vaskulären Systems. Flusscytometrische Analysen belegen, dass es in der CD34-positive Stroma-Zellpopulation Zellen gibt, die den endothelialen Progenitor-Zellmarker CD133 und den primitiven Stammzellmarker ABCG2 exprimieren. Außerdem zeigten die CD34-positive Zellen eine signifikant stärkere Proliferation und Expression von Endothelzellmarkern wie CD31 und vWf, wenn dem Kulturmedium zuvor die Faktoren Vascular Endothelial Growth Factor A (VEGF A) und Insulin-Like Growth Factor-1 zugefügt worden waren. Wurden Mäusen mit Hinterbeinischämie CD34-positive Zellen in vivo injiziert, beteiligten sich diese Zellen an der Neovaskularisation des ischämischen Hinterbeins. Eine signifikante Zunahme des Blutflusses im ischämischen Bein, gekoppelt an einer erhöhten Kapillardichte im ischämischen Muskel und einer Integration der menschlichen Zellen in die Vaskulatur der Maus waren erkennbar. Diese Ergebnisse weisen darauf hin, dass es unter den CD34-positive Zellen eine Population von endothelialen Progenitorzellen gibt, die -bei geeigneter Stimulation- zu Endothelzellen differenzieren. Parallel dazu wurden die lokalen Faktoren untersucht, die potentiell an der Wachstumskontrolle, der Migration und der Organisation der ruhenden, aus dem Fettgewebe stammenden, BEC und LEC beteiligt waren. Sekrete der Adipozyten, jedoch nicht der CD34-positive Zellen, induzierten eine signifikante BEC- und LEC-Proliferation. Außerdem induzierte die Kombination von Leptin und VEGF A oder des basic Fibroblast Growth Factor eine signifikante Zunahme der BrdU-Inkorporation in BEC während Adiponectin, VEGF C und VEGF D bereits alleine konzentrationsabhängig die Proliferation von LEC induzierten. Leptin, und nicht Adiponectin, führte zu signifikant höherer BEC-Migration und Röhrenformung, während Adiponectin, und nicht Leptin, die LEC-Migration und -Organisation förderte. Dabei führte Leptin in BEC und Adiponectin in LEC zeitabhängig zu einer signifikanten Zunahme der Phosphorylierung der Kinase Akt. Diese Ergebnisse belegen, dass die beiden aus Adipozyten stammenden Adipokine Leptin und Adiponectin eine tragende Rolle in der Umverteilung von BEC bzw. LEC spielen. Im Rahmen der Adipositas steigt die Plasmakonzentration von Leptin an während die Plasmakonzentration von Adiponectin sinkt. Unsere Ergebnisse deuten daraufhin, dass Leptin als lokaler pro-angiogenetischer Faktor identifizieren und Adiponectin als neuer lymphangiogenetischer Faktor im menschlichen Fettgewebe beschreiben konnte. Demnach könnten Veränderungen, in der Adipositas, der Adipokinfreisetzung durch Adipozyten am Umbau des vaskulären Netzwerks des Bluts und am ausbleibenden Wachstum des lymphatischen vaskulären Systems innerhalb des Fettgewebes beteiligt sein. Schließlich belegen die vorliegenden Ergebnisse das Vorhandensein einer Progenitor-Zell-Population in der Stroma-Fraktion des menschlichen Fettgewebes. Diese Progenitor-Zellen sind in der Lage sich an der Neovaskularisation ischämischen Gewebes zu beteiligen. Diese Population könnte im Hinblick auf zelltherapeutische Strategien eine interessante Alternative zu Stammzellen aus dem Knochenmark darstellen.
Mitochondrien, Organellen der oxidativen Phosphorylierung, sind in vielfältiger Weise an Alterungsprozessen in unterschiedlichen Modellorganismen beteiligt. Viele Mechanismen und Faktoren, die das Altern beeinflussen, scheinen konserviert zu sein. In dem in dieser Arbeit untersuchten Ascomyzeten Podospora anserina treten z. B. altersabhängige Reorganisationen der mtDNA auf, die zu einem Verlust lebensnotwendiger Gene führen können. In Menschen wurden ebenfalls Umstrukturierungen des mitochondrialen Genoms in unterschiedlichen Geweben mit fortschreitendem Alter beschrieben. Umgekehrt treten manche Faktoren, die die Lebensspanne beeinflussen, nur in einigen Modellsystemen auf. Hierzu gehört z. B. die Induktion der alternativen Oxidase in vielen langlebigen P. anserina-Mutanten. Diese Modifikation in der Atmungskette kann in S. cerevisiae und Säugern nicht beobachtet werden, da diesen Organismen eine alternative terminale Oxidase der oxidativen Phosphorylierung fehlt. Der Fragestellung, wie die Atmungskette im Falle der exklusiven PaAOX-abhängigen Respiration in der unsterblichen Mutante ex1 hinsichtlich der Zusammensetzung und kinetischer Eigenschaften des Elektronentransports charakterisiert ist, wurde in der vorliegenden Arbeit nachgegangen. Über die funktionalen Eigenschaften der Mitochondrien hinaus ist auch die Morphologie dieser Organellen altersabhängiger Änderungen unterworfen. Hinsichtlich der Gestalt der Mitochondrien in verschiedenen Altersstadien ist nur sehr wenig bekannt. Bisher steht nur fest, dass der P. anserina-Wildstamm „S“ im mittelalten Stadium filamentöse Mitochondrien aufweist. Ob und in welchem Ausmaß es zu Veränderungen der mitochondrialen Morphologie während des Alterns im Wildstamm „s“ und der Mutante grisea kommt, wurde im Rahmen der vorliegenden Arbeit analysiert. In der vorliegenden Arbeit wurde darüber hinaus PaDnm1 als putativer mitochondrialer Teilungsfaktor charakterisiert. Insbesondere die Modulation der PaDnm1-Expression durch Überexpression bzw. Deletion soll zeigen, welchen Einfluss PaDnm1 auf die mitochondriale Morphologie und andere phänotypische Parameter wie z. B. die Lebensspanne hat. Die in dieser Arbeit durchgeführten Untersuchungen führten zu folgenden Ergebnissen: 1. Im Wildstamm „s“ wurde im Gegensatz zu ex1 durch enzymkinetische Analysen eine starke Interaktion der Komplexe I und III nachgewiesen. Ein Großteil der Komplexe I und III ist im Wildstamm „s“ in Form von Superkomplexen organisiert. In der Mutante ex1 liegen die Komplexe I und III dagegen hauptsächlich frei vor. Die spezifische Aktivität der Cytochrom-c-Reduktase ist in ex1 niedriger als im Wildstamm „s“. 2. Seneszente Isolate des Wildstammes „s“ und der PaDnm1::ble-Mutante weisen im Gegensatz zur Mutante grisea eine starke Freisetzung von Wasserstoffperoxid auf. 3. Juvenile und mittelalte Wildstamm „s“-Isolate enthalten überwiegend kurze, filamentöse Mitochondrien, die entlang der Hyphenachse im Cytoplasma orientiert sind. Im seneszenten Stadium kommt es zu einer starken mitochondrialen Fragmentierung. Der Übergang von einer filamentösen zu einer sphärischen Morphologie dieser Organellen tritt auch in Mutante grisea auf. In ex1-Hyphen sind hauptsächlich filamentöse Mitochondrien enthalten. Initiale Analysen zur mitochondrialen Feinstruktur zeigen, dass in Wildstamm „s“ und Mutante grisea eine lamellenartige Cristaestruktur erkennbar ist. In der Mutante ex1 hingegen erscheinen die Cristae ungeordneter und weniger zahlreich. 4. Die Mitochondrienfragmentierung im seneszenten Wildstamm „s“ korreliert mit einer Induktion der Transkription von PaDnm1. In Mutante grisea ist die PaDnm1-Transkriptmenge während des Alterns konstant, obwohl sich die mitochondriale Morphologie wie im Wildstamm „s“ verändert. Überexpression von PaDnm1 führt zur Mitochondrienfragmentierung während die gezielte Deletion dieses Gens eine starke Elongation der Mitochondrien zur Folge hat. PaDnm1 ist somit das erste in einem filamentösen Pilz charakterisierte Gen der mitochondrialen Teilungsmaschinerie. 5. PaDnm1::ble-Isolate zeigen im seneszenten Stadium mitochondriale Fragmentierung wie Wildstamm „s“ und Mutante grisea. Das mitochondriale Genom von PaDnm1::ble ist stabilisiert, d. h. die Bildung der seneszenzfördernden plDNA wird unterdrückt. Die mittlere Lebensspanne der PaDnm1::ble-Mutante ist deutlich (> Faktor 10) gegenüber der des Wild-stammes „s“ erhöht. Bemerkenswerterweise zeigt PaDnm1::ble im Gegensatz zu anderen langlebigen P. anserina-Mutanten nach der Sporenkeimung keine physiologischen Defekte: Wuchsrate, männliche und weibliche Fertilität, Myzelmorphologie und Mitochondrien-segregation während der Ascosporengenese sind nicht eingeschränkt. Allerdings weist PaDnm1::ble eine erhöhte Empfindlichkeit gegenüber Ammoniumazetat auf. Dies äußert sich in einer Inhibierung der Sporenkeimung und einer Verringerung der Wuchsrate bei Anzucht der Mutante auf AmAc-haltigem Medium.
Replizierende Murine Leukämieviren (MLV) können wertvolle Werkzeuge für die humane Krebsgentherapie werden, da sie das Transgen innerhalb des gewünschten Gewebes verteilen, ihr Genom stabil integrieren und einen natürlichen Tumortropismus aufweisen. In vorliegender Arbeit wurde ein System zur visuellen Analyse der MLV‐Replikation sowie der Virusbindung an Zielzellen mittels Einfügung fluoreszierender Proteine etabliert und als Werkzeug für dasDesign und die Optimierung dieser Viren als Gentherapievektoren benutzt. Zuerst wurde die Kodierungskapazität dieser Retroviren durch Aufteilen der viralen Gene auf zwei semireplikative Vektoren vergößert. Die Kopplung der Genome mit fluoreszierenden Proteinen ermöglichte ebenfalls in diesem Zusammenhang die Beobachtung der Repliktion aber auch die einfache Aufdeckung von Rekombinationsereignissen. Die Ergebnisse zeigten den Bedarf weiterer Optimierungen, stellten allerdings einen Vorreiter auf diesem Forschungsgebiet dar und zeigten das Potential dieses Systems auf (Sliva et al., 2004a). Zusätzlich zum natürlichen Tumortropismus sollte die Sicherheit von replizierenden Retroviren für die Tumortherapie erhöht werdn. Gezielte Veränderungen des ecotropen Hüllproteins zu EGFR‐exprimierenden Zellen mittels gerichteter Evolution sowie der Versuch, den Wirtstropismus des Env mit der Insertion des Liganden SDF‐1α auf humane CXCR4‐exprimierende Zellen auszuweiten, sind jedoch gescheitert. Diese Daten müssen sich in die Reihe der erfolglos gebliebenen Versuche, den Wirtstropismus des ecotropen Env auf humane Zellen auszuweiten, einreihen (Sliva et al., 2004b). Abschließend wurde shRNA als therapeutisches Effektormolekül erfolgreich mittels replikationskompetenter MLV in Zielzellen überragen, was zur deutlichen Herabsetzung des Proteinlevels des Zielproteins der siRNA führte (Sliva et al., 2006). Diese modifizierten Viren sind ein gutes Werkzeug zur einfachen in vitro Untersuchung von Genfunktionen, und könnten auch eine Erleichterung für die Untersuchung von Genfunktionen innerhalb von proliferierendem Tumorgewebe darstelln. Des Weiteren präsentieren die Ergebnisse und Beobachtungen dieser Arbeit einen großen Schritt in Richtung Anwendung dieser Virn für die humane Gentherapie. Denn gekoppelt mit z.B. einer tumorspezifischen Expression der shRNA‐Expressionskassette und der intelligenten Wahl der siRNA‐(Ziel)Sequenz, die nach Applikation zum Tod von malignen Tumorzellen führt, wären sie die perfekte Waffe gegen solide Tumoren.
Das Zytolysin ClyA von Escherichia coli ist der Prototyp einer neuartigen Familie von porenbildenden, bakteriellen Zytolysinen, welche in verschiedenen Vertretern der Enterobacteriaceae vorkommen. Es handelt sich bei diesem Toxin um ein Protein von 34 kDa, das hämolytische und zytotoxische Aktivität aufweist und das in Zellmembranen stabile Poren einführt, indem es sich zu ringförmigen ClyA-Oligomeren zusammenlagert. Die vorliegende Dissertation sollte einen Beitrag zur funktionalen Charakterisierung des ClyA-Proteins von E. coli K12 liefern. Insbesondere sollte die Bedeutung der N-terminalen Region für den Sekretionsmechanismus, für die hämolytische und porenbildende Aktivität, für die Interaktion mit Zielmembranen und für die Fähigkeit zur Oligomerisierung des Proteins analysiert werden. Im Rahmen dieser Arbeit wurden hierzu ClyA-Derivate mit spezifischen Mutationen innerhalb des N-terminalen Bereiches hergestellt und auf ihre Funktions-tüchtigkeit überprüft. Diese Untersuchungen gingen von den bestehenden Erkenntnissen aus, dass die Sekretion von ClyA über eine periplasmatische Zwischenstufe verläuft und keine N-terminale Prozessierung des Toxins erfolgt. Es wurde festgestellt, dass bereits kurze, sukzessive Deletionen innerhalb der beginnenden N-terminalen Region, wie die Deletion der Aminosäuren an Position zwei bis fünf (ClyA∆2-5) und sechs bis zehn (ClyA∆6-10), einen deutlich hemmenden Effekt auf den Transfer von ClyA über die zytoplasmatische Membran zur Folge hatte, welcher durch die Deletion der Aminosäuren an Position zwei bis zehn (ClyA∆2-10) weiter verstärkt wurde. Größere N-terminale Mutationen, wie die Deletionen der Aminosäuren an Position zwei bis fünfzehn (ClyA∆2-15) und zwei bis zwanzig (ClyA∆2-20) sowie interne Deletionen, die Aminosäuren jenseits von Aminosäureposition zehn betrafen (ClyA∆6-15, ClyA∆11-15, ClyA∆11-20, ClyA∆16-20), führten zur fast vollständigen Inhibierung (ClyA∆6-15) oder totalen Blockierung (ClyA∆11-15, ClyA∆11-20, ClyA∆16-20, ClyA∆2-20, ClyA∆2-15) des Transports von ClyA in den periplas-matischen Raum. Während die hämolytische Aktivität der ClyA-Mutanten ClyA∆2-5, ClyA∆6-10 und ClyA∆2-10 zwar abnahm, jedoch im Vergleich zu der des wildtypischen ClyA-Proteins noch verhältnismäßig hoch war, beeinflussten die weiteren Deletionen (ClyA∆6-15, ClyA∆11-15, ClyA∆11-20, ClyA∆16-20, ClyA∆2-15, ClyA∆2-20) die hämolytische Eigenschaft des Toxins ganz erheblich. So verursachten diese Mutationen eine massive Abnahme (ClyA∆6-15) bzw. einen kompletten Verlust (ClyA∆11-15, ClyA∆11-20, ClyA∆16-20, ClyA∆2-20, ClyA∆2-15) der zytolytischen Aktivität des ClyA-Proteins gegenüber Erythrozyten. Untersuchungen an künstlichen Lipidmembranen ergaben, dass die Deletion der Aminosäuren an Position zwei bis fünf, sechs bis zehn und zwei bis zehn die porenbildende Aktivität des ClyA-Proteins nur unwesentlich beeinträchtigt. Dagegen störte die Deletion der Aminosäuren an Position zwei bis fünfzehn und zwei bis zwanzig die porenbildende Eigenschaft von ClyA so tiefgreifend, dass keine (ClyA∆2-20) oder nur Transmembranporen mit extrem geringem Innendurchmesser (ClyA∆2-15) erzeugt wurden. Daneben spiegelten instabile Membranporen, die durch die ClyA-Mutanten ClyA∆6-15, ClyA∆11-15, ClyA∆11-20 und ClyA∆16-20 im künstlichen Lipid-Bilayer gebildet wurden, die negativen Auswirkungen dieser Mutationen auf die porenbildende Aktivität des Toxins wider. Die gesammelten Daten unterstreichen somit nicht nur die essentielle Bedeutung der N-terminalen Region des Zytolysins ClyA von E. coli K12 für den Transport in den periplasmatischen Raum, sondern auch für die hämolytische und porenbildende Eigenschaft des Toxins. Allerdings wurde die hämolytische und porenbildende Aktivität des ClyA-Proteins erst durch Mutationen ab Aminosäureposition zehn signifikant beeinträchtigt. Demgegenüber verdeutlichten Untersuchungen zum Bindungsverhalten an Zielzellen sowie Crosslinking-Experimente, dass die N-terminale Aminosäuresequenz von Position zwei bis zwanzig von ClyA weder für die Bindung an Erythrozyten noch für die Oligomerisierung des Toxins einen wesentlichen Faktor darstellt.
Soluble guanylyl cyclase (sGC) is a cytosolic enzyme producing the intracellular messenger cyclic guanosine monophosphate (cGMP) on activation with nitric oxide (NO) which leads to the activation of GMP dependent protein kinases and to vasodilation. NO signaling may be affected by altered expression of sGC subunits, as has been shown in different pathological and physiological conditions and developmental stages. The molecular mechanisms underlying altered sGC expression in these and other conditions have not yet been revealed. Gene expression can also be regulated at the level of mRNA through alterations in translational efficiency and in mRNA stability. HuR (Human R) is a ubiquitously expressed member of the embryonic lethal abnormal vision (ELAV) family of RNA-binding proteins. Among other RNAs, there has been recent evidence that the expression of sGC is subject to post-transcriptional regulation by HuR. It has been shown that chronic hypertension induces changes in HuR expression and activity, which account for decreased sGC expression and activity in the aorta of hypertensive rats. This thesis should study was performed in an effort to provide some insight to the transcriptional and post-transcriptional regulation of sGC expression in a mammal, the rat. We investigated rat sGC alpha-1 transcriptional regulation in rat lung fibroblast (RLF-6) cells. The 3000bp 5' upstream region of the alpha-1 sGC gene was isolated and analyzed for promoter activity by using luciferase reporter constructs- Alpha3000 (with -2794 bp), Alpha1100 (-1092 bp), Alpha350 (-346 bp) and Alpha200 (-200 bp). The promoter activity was the highest in the 200bp construct (about 6-fold higher than Alpha3000) suggesting that this fragment contains all the crucial elements necessary to support basal transcription of the alpha-1 sGC gene. Analysis of the 200 bp of the 5’ UTR of the alpha-1 gene was performed using the MATINSPECTOR V2.2 software for putative transcription factors. The constructs containing the deleted sites for NFY and Sp1 showed a significant decrease in constitutive promoter activity by almost 80% and 60% respectively, implying that these transcription factors are crucial elements in the basal expression of the of sGC alpha-1 subunit. Treatment of RLF-6 cells with genistein 50 microM and mithramycinA 100 nM, known to inhibit the NFY and Sp1 binding to DNA respectively, reflected the same effects. Furthermore the cGMP content of the cells was significantly reduced by both inhibitors, almost completely by genistein, and by about 40 % by mithramycinA. Electrophoretic mobility-shift assay (EMSA) clearly showed the formation of multiple complexes with the biotinylated ODN (decoy oligodeoxynucleotide) probes for NFY and Sp1 when incubated with RLF-6 nuclear extract. A “supershift” observed in the presence of antibodies to the individual transcription factors confirmed that these factors were present in the shifted band, indeed. NFY and Sp1 are instrumental in several physiological and pathophysiological effects mediated by several growth factors in smooth muscle cells. Thus the regulation of the promoter, in response to serum, was also analysed. 10% foetal calf serum led to decreased alpha-1 sGC level as shown by western blots performed with rat aorta. Decreased sGC alpha-1 mRNA expression was observed in RLF-6 cells and cultured rat aortic smooth muscle cells incubated with FCS for 24 hours. This decrease was reflected in the promoter activity in RLF-6 cells using both Alpha3000 and Alpha200 constructs confirming that the regulation took place at promoter level. EMSA performed with nuclear extracts from FCS treated RLF-6 cells led to diminished binding to NFY, but to an enhanced binding to Sp1 site. We concluded that the factors Sp1 and NFY (the sites overlapping) compete for binding, and in the presence of FCS, it is Sp1 that binds stronger, and hence results in diminishing promoter activity. In order to delineate the post-transcriptional regulation of sGC alpha-1 subunit, studies were performed to demonstrate the regulation of expression of the mRNA stabilizing protein HuR. It has been observed that exposure of isolated rat aortic segments to the activator of adenylyl cyclase, forskolin, strongly reduced sGC alpha-1/beta-1 and HuR protein and mRNA expression in a time-dependent and actinomycin D-sensitive fashion. Transcription factor decoy approach proved that the cAMP-induced down-regulation of HuR is mediated by the activation of AP-1. It has been established that HuR stabilises the sGC alpha-1 and beta-1 mRNA. However the pathway underlying this regulation remains unknown. In order to identify the mechanism of this regulation, we looked for HuR interacting proteins employing the yeast two hybrid assay. The enzyme of the polyamine catabolic pathway spermidine/spermine N1-acetyltransferase (SSAT) was found to interact with the hinge region of HuR. This interaction was confirmed by performing immunoprecipitation and GST-pulldown experiments. A direct effect of these proteins on each other’s biological activity was not visible as tested through the SSAT activity assay and HuR gel shift. It might be possible that SSAT-mediated modulation of local polyamine concentrations enhances/reduces HuR activity and sGC expression to affect cell proliferation. In summary, this study represents an analysis of the rat sGC alpha-1 promoter regulation in rat fibroblast cells and identifies NFY and Sp1 as important factors in sGC alpha-1 expression. It also gives first evidence of sGC regulation at the transcriptional level in response to an external stimulus, and proposes the possible mechanism. It also identifies SSAT as a HuR interacting protein. These might have implications in the various pathophysiological conditions where sGC plays an important role.
Background: Growth rate is central to the development of cells in all organisms. However, little is known about the impact of changing growth rates. We used continuous cultures to control growth rate and studied the transcriptional program of the model eukaryote Saccharomyces cerevisiae, with generation times varying between 2 and 35 hours.
Results: A total of 5930 transcripts were identified at the different growth rates studied. Consensus clustering of these revealed that half of all yeast genes are affected by the specific growth rate, and that the changes are similar to those found when cells are exposed to different types of stress (>80% overlap). Genes with decreased transcript levels in response to faster growth are largely of unknown function (>50%) whereas genes with increased transcript levels are involved in macromolecular biosynthesis such as those that encode ribosomal proteins. This group also covers most targets of the transcriptional activator RAP1, which is also known to be involved in replication. A positive correlation between the location of replication origins and the location of growth-regulated genes suggests a role for replication in growth rate regulation.
Conclusion: Our data show that the cellular growth rate has great influence on transcriptional regulation. This, in turn, implies that one should be cautious when comparing mutants with different growth rates. Our findings also indicate that much of the regulation is coordinated via the chromosomal location of the affected genes, which may be valuable information for the control of heterologous gene expression in metabolic engineering.
Length variations of repetitive sequences in different AT-rich loop-coding regions of mitochondrial 16S rDNA in two gastropod species were discovered during intraspecific haplotype surveys. Examination of the discrete length variation of the basic repeat unit in a phylogenetic framework led to the conclusion of a microsatellite-like mutational dynamic. The observations suggest that the presence of a repetitive sequence structure alone is sufficient to trigger this dynamic.
I analysed the importance of shell size, shell shape, habitat preferences and availability, experienced climate, active dispersal and influence of Pleistocene glaciations for the range sizes of 37 Western Palaearctic Helicidae s.l. species for which a phylogeny was available. In both cross-species and phylogenetically controlled analyses, the range sizes were positively correlated to climatic tolerance, shell size, active dispersal and influence of Pleistocene glaciations. In addition, range sizes increased significantly with latitude. Multiple regression suggested that, predominantly, the influence of Pleistocene glaciations, tolerance to large annual temperature ranges and shell size influenced the distributional range sizes. Habitat preference, range and availability, active dispersal and shell shape explained no additional variance. The results suggest that the processes influencing species range size of the Helicidae s.l. are mainly related to the climatic shifts after the Pleistocene.
Background Reliable taxonomic identification at the species level is the basis for many biological disciplines. In order to distinguish species, it is necessary that taxonomic characters allow for the separation of individuals into recognisable, homogeneous groups that differ from other such groups in a consistent way. We compared here the suitability and efficacy of traditionally used shell morphology and DNA-based methods to distinguish among species of the freshwater snail genus Radix (Basommatophora, Pulmonata). Results Morphometric analysis showed that shell shape was unsuitable to define homogeneous, recognisable entities, because the variation was continuous. On the other hand, the Molecularly defined Operational Taxonomic Units (MOTU), inferred from mitochondrial COI sequence variation, proved to be congruent with biological species, inferred from geographic distribution patterns, congruence with nuclear markers and crossing experiments. Moreover, it could be shown that the phenotypically plastic shell variation is mostly determined by the environmental conditions experienced. Conclusion Contrary to DNA-taxonomy, shell morphology was not suitable for delimiting and recognising species in Radix. As the situation encountered here seems to be widespread in invertebrates, we propose DNA-taxonomy as a reliable, comparable, and objective means for species identification in biological research.
ATP ist ein weit verbreitetes Signalmolekül im ZNS. Seine Hauptfunktionen betreffen die präsynaptische Modulation der Transmitterfreisetzung und die schnelle exzitatorische Transmission. Die Aktivierung ionotroper P2X-Rezeptoren durch ATP beinhaltet den Einstrom von Kalzium in die Zelle. Unter pathologischen Bedingungen, wie bei Epilepsie oder Ischämie, ist die ATP-Freisetzung erhöht und könnte einen neuronalen Zelltod induzieren. Eine anhaltender Aktivierung von NMDA-Rezeptoren und der dadurch erhöhte Einstrom von Kalzium in die Zelle stellt dabei den primären Effektor der Neurotoxizität dar. Dieses, als Exzitotoxizität bezeichnete Phänomen, ist an vielen neurologischen Krankheiten beteiligt. In der vorliegenden Arbeit wurde die Wirkung von ATP und anderen Purin- und Pyrimidin-Nukleotiden und von Adenosin auf die Überlebensrate von Neuronen bei induzierter Toxizität in hippokampalen Primärkulturen untersucht. Neurotoxizität wurde durch die Applikation der Glutamat-Rezeptor-Agonisten NMDA (30 μM) oder Kainat (300 μM) und durch Applikation von KCl (30 mM) induziert. Purin- und Pyrimidin-Nukleotide wurden in verschiedenen Konzentrationen von 10 μM – 1000 μM koappliziert. Nach 24 Stunden wurde die Überlebensrate der Neurone mit der Methode des Neuronen-spezifischen zellulären ELISA quantifiziert. Applikation von NMDA reduzierte den Anteil lebender Zellen auf 56 ± 3%. Der NMDARezeptor-Antagonist MK-801 verhinderte die NMDA-induzierte Toxizität. Die Koapplikation von ATP (0,01-1 mM) schwächte die zytotoxischen Wirkung von NMDA konzentrationsabhängig ab. Die Purine ITP und GTP zeigten ebenfalls eine protektive Wirkung und reduzierten die NMDA-induzierte Toxizität, wohingegen die Pyrimidin-Nukleotide UTP und CTP keinen protektive Wirkung zeigten. Weitere getestete P2-Rezeptor-Agonisten, wie ADP, AMP, Adenosin, α,β-meATP, 2MeSATP, das Dinukleotid Ap4A, α,β-meADP und BenzoylATP waren unwirksam. Der P2-Rezeptor-Antagonist Reactive Blue 2 (100 μM) inhibierte die Wirkung von ATP. Suramin und PPADS (100 μM) verhinderten die protektive Wirkung von ATP nicht. Applikation von Kainat reduzierte den Anteil lebender Zellen auf 37 ± 0,3%. Der Antagonist CNQX (100 μM) verhinderte die Kainat-induzierte Toxizität. Weder ATP noch GTP zeigten eine protektive Wirkung nach Kainat-induzierter Toxizität. Dies steht im Gegensatz zu ihrer protektiven Wirkung nach NMDA-vermittelter Toxizität. Applikation von KCl reduzierte den Anteil lebender Zellen auf 61 ± 4%. Die Purin- und Pyrimidin-Nukleotide (1 mM) zeigten bei K+-Depolarisation ein völlig anderes Wirkungsspektrum als bei Applikation von NMDA: GTP > ITP > ATP > ADP > CTP > α,β-meATP > UTP > AMP. 2MeSATP, α,β-meADP, Ap4A, BenzoylATP und Adenosin veränderten die Überlebensrate der Zellen nach KCl-induzierter Toxizität nicht. Weder Suramin noch PPADS (100 μM) inhibierten die protektive Wirkung von ATP. Diese Ergebnisse lassen vermuten, daß die protektive Wirkung von ATP, GTP und ITP weder P2- noch Adenosin-Rezeptor-vermittelt war. Zudem schienen sie spezifisch für eine NMDARezeptor-vermittelte Toxizität, da ATP und GTP nach Kainat-Applikation keine Wirkung erzielten und die alleinige Applikation der verwendeten P2-Rezeptor-Agonisten und Antagonisten (Kontrollen) keine Wirkung auf das Überleben von Neuronen hatte. Deshalb wurde eine direkte Inhibition des NMDA-Rezeptors durch ATP postuliert. In einer Kooperationsarbeit führte Dr. Bodo Laube vom Max-Planck-Institut für Hirnforschung in Frankfurt am Main elektrophysiologische Messungen an Oozyten und hippokampalen Neuronen zur Bestätigung dieser Hypothese durch. ATP inhibierte in Oozyten NMDA-induzierte Einwärtsströme kompetitiv durch Bindung an die NR2B-Rezeptor-Untereinheit. ITP, GTP, AMP waren an dieser rekombinanten NR1/NR2BRezeptorkombination ebenso effektiv, wohingegen UTP, CTP, ADP und Adenosin nur schwache inhibitorische Wirkungen zeigten. In kultivierten hippokampalen Neuronen inhibierte ATP auch NMDA-induzierte Ströme, nicht jedoch Kainat-induzierte Ströme. Die Expression der beiden NMDA-Rezeptor-Untereinheiten NR1 und NR2B wurde durch immunzytochemische Untersuchungen in den hippokampalen Neuronen bestätigt. Die Resultate zeigten, daß ATP direkt NMDA-Rezeptoren mit einer bestimmten Untereinheitenzusammensetzung inhibierten. Zusammenfassend zeigen die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit, daß ATP und andere Purinund Pyrimidin-Nukleotide durch Inhibition des NMDA-Rezeptors neuroprotektive Wirkungen vermitteln können. Dies ist eine neue Funktion von ATP zu der bereits beschriebenen direkten Aktivierung von postsynaptischen P2X-Rezeptoren und zu seiner Rolle als eine extrazelluläre Quelle des synaptischen Modulators Adenosin an glutamatergen Synapsen.
Das Y-Chromosom war, mit Ausnahme der Pseudoautosomalen Regionen, während der Genomevolution einer enormen Veränderung unterworfen, die zu einem weitesgehenden Verlust oder der Inaktivierung von Genen führte, die nicht in den Prozess der Geschlechtsdetermination bzw. –differenzierung, oder Spermatogenese involviert sind. Gleichzeitig kam es durch Amplifikation von funktionellen Kopien der Spermatogenesespezifischen Genen zu sog. amplifikonischen Genfamilien, die fast ausschliesslich im Testis exprimiert werden. TSPY (Testis Specific Protein Y-encoded) ist nach bisherigen Untersuchungen mit 35 Kopien, bestehend aus funktionellen Kopien und inaktiven Pseudogenen, die grösste und homogenste Protein-kodierende amplikonische Genfamilie auf dem Y-Chromosom und wurde im Rahmen dieser Arbeit genauer analysiert. Es wird unter normalen Bedingungen in den Spermatogonien des Testis exprimiert, aber es ist auch eine aberrante Expression in malignen Geweben, wie Gonadoblastom, Carcinoma in situ (CIS) des Testis oder in einer Fraktion von Prostatakarzinomen detektierbar. Aufgrund der Expression und der korrelierten Kopplungsanalyse wurde postuliert, dass es sich bei TSPY um ein Kandidatengen für den sog. Gonadoblastom-Locus auf dem Y-Chromosom (GBY) handelt. TSPY gehört ausserdem aufgrund einer evolutionär konservierten Domäne zur Familie der SET/NAP-Proteine. Andere Mitglieder dieser Familie sind z.B. in Proliferation, Zell-Zyklus-Regulation, Chromatin-Umbau und Kerntransport involviert. Durch die Analyse der TSPY-Transkription konnte anhand des LNCaP-Zellkultursystems die postulierte Androgen-abhängige TSPY-Transkription widerlegt werden. Zusätzlich wurden zwei TSPY-Transkripte unterschiedlicher Grösse und Transkriptionsraten detektiert, wobei das grössere Transkript TSPY-S stärker exprimiert wird als das kleinere Transkript TSPY-L. Ursache hierfür ist alternatives Splicing in Intron 4 des TSPY-Gens, das zur Expression der beiden Protein-Varianten mit unterschiedlichen C-Termini führt. Die durchgeführte Haplotyp-Analyse zur Identifizierung transkribierter TSPY-Gene konnte aufzeigen, dass das einzige funktionelle Gen des sog. TSPY minor Clusters (mit dem Haplotyp G-G-18) als einziges nicht alternativ gespliced wird und andererseits das häufigste TSPY-S Transkript (44 %) darstellt. Hierfür wird die Möglichkeit einer „locus-control-region“ diskutiert. Um Interaktionspartner von TSPY-S zu identifizieren und dadurch möglicherweise Hinweise auf die Funktion von TSPY zu erhalten, wurde das Hefe-Zwei-Hybrid-System eingesetzt. Vorversuche lokalisierten eine mögliche Transkriptions-Aktivierungsdomäne im N-Terminus von TSPY, weshalb eine N-terminale Deletion von TSPY-S, die einen grossen Teil der NAP Domäne und den C-Terminus enthält, als Köder eingesetzt wurde, um eine Testis-cDNABibliothek nach interagierenden Proteinen zu durchsuchen. Die Interaktion von TSPY mit den drei interessantesten Kandidaten hTid-1, dem menschlichen Homolog eines Tumor-Suppressor-Gens aus Drosophila, einem Mitglied der Ubiquitin-like-Proteinfamilie Ubiquilin 3 (UBQLN3), das aufgrund der Protein-Struktur eine Funktion bei der Regulation des Zellzyklus haben könnte und Isopetidase T (USP5), einer Ubiquitin-spezifische Protease, die an der proteasomalen Protein-Degradation beteiligt ist wurde durch Co-Transformation verifiziert und genauer analysiert. Immunhistochemische Experimente bestätigten die ausschliessliche zelluläre Lokalisation von TSPY in den Spermatogonien. Es konnten jedoch leichte entwicklungsspezifische Unterschiede gezeigt werden. In post-pubertärem und adulten Testis-Gewebe wird TSPY im Kern und Cytoplasma der mitotischen Spermatogonien exprimiert, aber in einem sehr grossen Anteil der ruhenden Spermatogonien im früh-kindlichen Testis (6 Monate) fehlt ein Kernsignal. Expression der EGFP (enhanced green fluorescent protein) -markierten Wildtyp cDNAs von TSPY-S und –L in HEK-293 Zellen bestätigte eine Protein-Lokalisation in Cytoplasma und Kern. Gezielte Deletion des C-Terminus der EGFP-TSPY-Fusionsproteine führte zur Degradation der Proteine, was die Bedeutung des variablen C-Terminus hervorhebt. Selektive Mutation einer mit den Computer vorhergesagten und durch einen Phosphorylierungs-Assay experimentell bestätigten CK2-Phosphorylierungs-Stelle im C-Terminus von TSPY-S verhinderte die Kern-Lokalisation, was darauf hindeutete, dass die C-terminale Phosphorylierung für die Lokalisation im Zellkern notwendig ist. Für TSPY-L konnte dieses Muster nicht bestätigt werden, da Mutationen im direkten C-Terminus von TSPY-L zur Protein-Degradation führten. Aufgrund der Datenlage wurde die Arbeitshypothese aufgestellt, dass TSPY im Cytoplasma durch CK2 phosphoryliert und in den Zellkern transportiert wird. Nach Androgen-Stimulus und Signal-Transduktion kommt es zur Kern-Lokalisation von CK2 und dadurch zur verstärkten Phosphorylierung von TSPY im Kern. Dort führt die Interaktion von TSPY mit den einzelnen identifizierten Proteinen zur Regulation des Zellzyklus und der mitotischen Proliferation der Spermatogonien, aber auch zur pathologischen Funktion von TSPY bei der Entstehung von Keimzelltumoren. Diese Arbeitshypothese müsste überprüft und verbessert werden, um die Funktion von TSPY bei der Proliferation der Spermatogonien und der Krebsentstehung aufzuklären.
The heat stress response is characterized by the presence of heat stress transcription factors (Hsfs) which mediate transcription of heat stress genes. In tomato (Lycopersicon peruvianum) cell cultures the simultaneous expression of four Hsfs, which are either constitutively (HsfA1 and HsfA3) or heat-stress inducible (HsfA2 and HsfB1) expressed, results in a complex network with dynamically changing cellular levels, intracellular localization and functional interactions. In order to examine the relevance of their multiplicity as well as to get more insights into the complexity of the plant heat stress response, the individual tomato Hsfs were investigated with respect to their protein interactions in vitro and in vivo. To this aim, I used pull-down assays as well as yeast assays to study the following aspects: 1. Oligomeric state of Hsfs: the results show that all class A Hsfs (HsfA1, HsfA2 and HsfA3) are trimeric proteins and interact with each other via the oligomerization (HR-A/B) domain. The similarity of their HRA/B regions allows formation of homo- and heterooligomeric complexes between all class A Hsfs. This special property was investigated by mutational studies with HsfA2 indicating that the linker and the HR-B regions are the minimal part required for Hsf/Hsf interactions. The conserved hydrophobic amino acid residues of the HR-B region are most important whereas the amino acid residues of the linker may provide higher flexibility to the HR-B region. Another investigated factor was HsfB1. HsfB1 is a member of class B Hsfs, which are characterized by an oligomerization domain without the 21 amino acid residues linker inserted between the HR-A and HR-B regions. It has a low activator potential and exists exclusively as dimer. HsfB1 can not physically interact with class A Hsfs. However, HsfB1 and HsfA1, binding to adjacent HSE sites, are assumed to cause strong synergistic effects in gene activation. 2. Potential HsfB1 interacting proteins: we searched for HsfB1 interacting proteins by using recombinant His-tagged proteins with HsfB1 as baits in pull-down assays. Histones H2A, H2B and H4 were identified by means of Peptide Mass Finger Printing and N-terminal sequencing analyses. The three histones represent the major proteins in tomato whole cell extracts retrieved by HsfB1. 3. HsfA2/small heat stress proteins (sHsps) interaction: pull-down and yeast two-hybrid assays were used to study the specific interaction of HsfA2 with tomato class II sHsp. This interaction occurs via the oligomerization domain of HsfA2. Other members of the plant Hsp20 family, including class I sHsp, do not interact with HsfA2. Heterooligomers of HsfA2 with class II sHsp may represent precursor forms of the plant higher molecular weight cytoplasmic complexes of heat stress granules, which form during heat stress. The findings presented in this thesis are a contribution to support the concept of a Hsfs network via protein-protein interactions. These data, together with information obtained from other studies, are used to propose a tentative model of the complex Hsfs network controlling the plant heat stress response.
Ein transgenes Mausmodell zur Untersuchung der Zink-vermittelten Modulation des Glyzinrezeptors
(2002)
Zink (Zn2+) ist ein im Zentralnervensystem der Säuger weitverbreitetes Metallion, das in kleinen synaptischen Vesikeln hoch angereichert wird. Zink-reiche Vesikel sind besonders gut dokumentiert in exzitatorischen Synapsen, z.B. im Hippocampus, sie werden jedoch auch in inhibitorischen Synapsen von Neuronen des Rückenmarks oder der Retina gefunden. Nach exozytotischer Freisetzung dieser Vesikel in den synaptischen Spalt können Zink-Konzentrationen von bis zu zehn mikromolar erreicht werden. In vitro hat Zink modulatorische Effekte auf eine Vielzahl von Neurotransmitter-Rezeptoren, so u.a. auf Glutamat-Rezeptoren vom AMPA-, NMDA-, oder Kainat-Typ, aber auch auf GABAA- und Glyzinrezeptoren (GlyR). Zink wurde daher als endogener Neuromodulator vorgeschlagen. Der modulatorische Effekt von Zink auf den GlyR ist biphasisch: Niedrige mikromolare Konzentrationen bewirken eine Potenzierung Glyzin-induzierter Ströme, höhere mikromolare Konzentrationen dagegen deren Inhibition. Dieser potenzierende Effekt von Zn2+ kann in transfizierten HEK 293 Zellen oder cRNA-injizierten Xenopus laevis Oozyten durch eine Punktmutation im N-terminalen Bereich des α1-Polypeptids aufgehoben werden (D80A (Lynch et al., 1998), oder D80G (Laube et al., 2000)). Ein revers-genetischer Ansatz wurde in der vorliegenden Arbeit benutzt, um Rückschlüsse auf die physiologische Relevanz der Potenzierung Glyzin-induzierter Ströme durch Zn2+ zu gewinnen: In einem „Knock-In“ Mausmodell wurde durch homologe Rekombination in ES-Zellen eine Mutation in der kodierenden Sequenz des GlyRα1-Genlocus eingeführt, die den o.g. AS Austausch (D80A) in der adulten ligandenbinden Untereinheit des GlyR bewirkt. Um die Veränderung des Genlocus zu minimieren war die als Selektionsmarker bei der Einführung der Mutation benötigte Neor-Kassette von zwei loxP-Sequenzen flankiert, und konnte so nach dem Nachweis des homologen Rekombinationsereignisses durch Wirkung der Cre-Rekombinase wieder entfernen werden. Nach Blastozysteninjektion homolog rekombinierter ES-Zellen zur Herstellung chimaerer Tiere und Keimbahntransmission der Mutation in einem Teil dieser Chimaeren konnten so Mauslinien mit zwei verschiedenen mutierten Allelen generiert werden: In zwei Linien wurde das intronisch miteingeführte Neor-Element bereits in ES-Zellen in vitro deletiert, wonach lediglich eine der loxP-Sequenzen verbleibt; in einer dritten Linie wurde der Selektionsmarker als intronische Insertion belassen. Während heterozygote Tiere aller drei Linien keinerlei offensichtliche Auffälligkeiten zeigen, findet sich bei homozygot-mutanten Tieren aller Linien ein mit der zweiten postnatalen Woche eintretender Phänotyp, dessen auffälligste Symptome eine verstärkte akustisch oder taktil induzierbare Schreckreaktion, ein erhöhter Muskeltonus, taktil induzierbarer Tremor und generalisierter Myoklonus sowie ein verlangsamtes Wiederaufrichten sind. Dieser Symtomkomplex ähnelt stark dem der spontanen Mutationen des GlyRs spasmodic, spastic oder oscillator und weist auf einen Verlust glyzinerger Inhibition als Ursache hin. Die verschiedenen Allele verursachen unterschiedlich starke Phänotypen: Das mutierte Allel, in welchem die Neor–Kassette deletiert ist, bewirkt einen schwachen Phänotyp, wohingegen das Verbleiben des intronischen Neor-Elements einen schwerwiegenderen Phänotyp zur Folge hat, und homozygote Tiere bis auf wenige Ausnahmen bis zur achten Lebenswoche sterben. Die Immunoblot-Analyse zeigt, daß bei homozygot mutanten Tieren dieser stärker betroffenen Linie ein partieller Verlust der Proteinexpression der GlyRα -Untereinheit auftritt. Dagegen ist in Tieren, in denen die Neor-Kassette deletiert ist, keine Verringerung der GlyRα-Expression durch Immunoblot nachweisbar. Der milde Phänotyp ist demnach am einfachsten durch den spezifischen pharmakologischen Effekt der Mutation, d. h. den Verlust der Zn2+-induzierten Potenzierung des GlyR, erklärbar. Hiermit wurde erstmals ein Hinweis daraufhin gewonnen, daß niedrige mikromolare Konzentrationen von Zn2+ für die physiologische Funktion des adulten GlyR notwendig sind. Darüberhinaus unterstreichen die Ergebnisse das Potential des GlyR als Ansatzpunkt zur Entwicklung neuer Muskel-relaxierender oder sedativer Substanzen, die - ähnlich der Wirkung von Zn2+ - einen potenzierenden Effekt auf die glyzinerge Inhibition haben.
Identification and characterization of TNFalpha responsive genes in human breast cancer cells
(2006)
One of the hallmarks of cancer is the escape of the transformed cells from apoptosis. Therefore, the identification of survival genes, allowing cancer cells to circumvent programmed cell death, could provide new diagnostic markers as well as targets for therapeutic intervention. A well known transcription factor regulating the balance between pro- and anti- apoptotic factors is NF-kappaB, which is strongly induced by tumor necrosis factor alpha (TNFalpha). When cells are stimulated by TNFalpha their response is biphasic with an initial NF-kappaB induction of survival genes which is overridden by the subsequent activation of initiator caspases triggering apoptosis. By combining gene trap mutagenesis with site specific recombination a strategy was developed, which enriches for genes induced by TNFalpha in the human breast cancer cell line MCF-7. The strategy relies on a one way gene expression switch based on Cre/loxP mediated recombination, which uncouples the expression of a marker gene from the trapped cellular promoter thereby enabling the recovery of genes that are only transiently induced by TNFalpha. The marker gene used in these experiments was a dominant negative variant of the TNFalpha-receptor associated protein FADD (dnFADD), which blocks the apoptotic branch of the TNFalpha induced signaling pathway. Initial experiments indicated that MCF-7 cells expressing high levels of dnFADD were insensitive to TNFalpha induced apoptosis and therefore suitable for the installment of a one way gene expression switch susceptible to Cre/loxP mediated recombination. A MCF-7 reporter clone harboring the recombinase dependent gene expression switch was infected with the gene trap retrovirus U3Cre, which inserts the Cre recombinase gene into a large collection of chromosomal sites. Insertion of Cre downstream of an active cellular promoter induces dnFADD expression from the gene expression switch enabling the cells to block TNFalpha triggered apoptosis. From a gene trap integration library containing approximately 2000000 unique proviral integrations, 69 unique TNFalpha inducible gene trap insertion sites were recovered in a two step selection procedure. Sequencing of the genomic regions adjacent to the insertion sites, which were obtained by inverse PCR (gene trap sequence tags, GTSTs), and data base analysis revealed that 42% of the GTSTs belonged to annotated genes, 13% to known cDNAs with open reading frames, 17% to Genscan predicted genes, 9% to ESTs, 9% to repetitive sequences and 10% to unannotated genomic sequence. Overall, 44% of the annotated genes recovered in this screen were directly or indirectly related to cancer, indicating that the gene trap strategy developed here is suitable for the identification of cancer relevant genes. Analysis of the expression patterns of the trapped and annotated genes in wild type cells revealed that 19 out of 24 genes were either up- or down- regulated by a factor of at least 1.45 by TNFalpha. A large fraction of the gene trap insertions were located upstream, in introns or in opposite orientation to annotated transcripts, indicating that the strategy efficiently recovers non-coding RNAs (ncRNAs). While the biological significance of these transcripts still needs to be elucidated, they fall into two main categories. The first category includes gene trap insertions upstream of genes, which could either represent regulatory RNAs interacting with promoter elements or transcripts driven by bidirectional promoters. The second includes inverse orientation gene trap insertions in introns of annotated genes suggesting the presence of natural antisense transcripts (NATs). Interestingly, more than 50% of all antisense integrations are located downstream of transcription start sites predicted by different algorithms supporting the existence of RNAs transcribed from the corresponding genomic regions. Intronic integrations on the coding strand could be derived from cryptic splicing, alternative promoter usage or additional, so far uncharacterized transcripts. Preliminary functional analysis of two genes recovered in this screen encoding the transcription factor ZFP67 and the FLJ14451 protein revealed that FLJ14451 but not ZFP67 inhibited anchorage independent growth in soft agar, suggesting that FLJ14451 might have some tumor suppressor functions. In summary, besides identifying a putative tumor suppressor protein, the present experiments have shown that gene trapping is useful in identifying non-coding transcripts in living cells and may turn out to be the method of choice in characterizing these transcripts whose functions are still largely unknown.
Gephyrin ist ein Protein mit strukturellen und enzymatischen Eigenschaften. Ein Aspekt der strukturellen Funktion ist die synaptische Verankerung inhibitorischer Rezeptoren an das Zytoskelett. Darüber hinaus besteht die Möglichkeit, dass ein Interaktionspartner von Gephyrin, Collybistin, die Organistion des Aktin-Zytoskeletts reguliert. Die enzymatische Funktion von Gephyrin besteht in der Synthese eines Kofaktors, welcher für die Aktivität von Molybdoenzymen notwendig ist. Das gezielte Ausschalten des für Gephyrin kodierenden Gens weist im Mausmodell einen letalen Phänotyp auf. Als Ursache hierfür kommen die fehlende synaptische Aggregation von Glyzin- und GABAA-Rezeptoren in neuronalem Gewebe, sowie die fehlende Aktivität von Molybdoenzymen in peripheren Organen in Frage. Da sowohl Molybdän-Kofaktor-Defizienzen beim Menschen, wie auch bestimmte Mutationen von Glyzin- und GABAA-Rezeptoren bei Mäusen letal sind, kann der beobachtete Phänotyp nicht eindeutig zugeordnet werden. Die vorliegende Arbeit verfolgt zwei Ziele. Das erste ist eine Einengung der Binderegion von Collybistin an Gephyrin. Dabei konnte diese durch immunzytochemische und biochemische Methoden auf wenige Aminosäuren genau beschrieben werden. Verschiedene Strukturvorhersageprogramme weisen auf eine helikale Struktur für diesen Sequenzabschnitt hin. Der Austausch der Aminosäuren R107, D108, R111 und E117 mit Alanin führt über den Verlust ionischer Ladungen zum Verlust der Bindungseigenschaft. Das zweite verfolgte Ziel ist die Einführung eines transgenen Konstrukts, welches nur die Molybdän-Kofaktor-Synthesefunktion wiederherstellen soll, in den genetischen Hintergrund der Gephyrin-„knock-out“ Maus. Ziel dieser Analyse ist die Herstellung eines Phänotyps, bei dem die inhibitorische Transmission in einer Weise gestört ist, welche Symptome der Molybdän-Kofaktor-Insufizienz ausschließt. So sollte die Ursache für die Letalität der Gephyrin-Mutation zugeordnet werden können. Dazu wurde das pflanzliche Gephyrin-Homolog Cnx1 in ein Expressionskonstrukt kloniert, und nach biochemischer, immunzytochemischer und funktioneller Analyse in heterologen Zellen in eine Wildtyp-Mauslinie injiziert. Diese wurde mit Geph-/--Mäusen gekreuzt und die daraus resultierenden homozygoten, transgenen Tiere analysiert. Diese Tiere sterben ebenso wie die Geph-/--Mäuse am Tag der Geburt. mRNA des Transgens konnte in Hirn und Leber nachgewiesen werden, das Protein allerdings nur in Hirnextrakten. Dementsprechend lag die Aktivität des für die Lebensfähigkeit von Säugetieren wichtigsten Molybdoenzyms, der Sulfitoxidase, in Leberextrakten nur bei 30%. Eine morphologische Untersuchung von Gehirnschnitten ergab keine Auffälligkeiten. Eine Immunhistochemische Analyse von Rückenmarkschnitten zeigte in Übereinstimmung mit Beobachtungen an Gephyrin-„knock out“-Mäusen diffus verteilte Glyzin-Rezeptoren. Somit wurde eine Maus mit beeinträchtigter inhibitorischer synaptischer Transmission und partiell wiederhergestellter Molybdän-Kofaktor Biosynthese hergestellt. Aufgrund der großen Schwankungsbreite der Aktivität der Sulfitoxidase in Leberextrakten verschiedener Geph-/- + cnx Tiere wäre ein Unterschied in der Lebenserwartung verschiedener Tiere zu erwarten gewesen, wenn die Defizienz dieses Molybdoenzyms die Ursache für den letalen Phänoyp gewesen wäre. Da die transgenen Tiere aber wie die Geph-/- Mäuse wenige Stunden nach der Geburt sterben, ist davon auszugehen, dass der beschriebene Phänotyp auf das Fehlen der strukturellen Eigenschaften von Gephyrin zurückzuführen ist, und nicht von einer durch Beeinträchtigung des Schwefelstoffwechsels hervorgerufene progressive Schädigung des ZNS.
Bisher konnte allein für den Magnetkompass der Vögel ein Mechanismus der Magnetperzeption identifiziert werden. In Verhaltensversuchen, die Zugorientierung als Kriterium einsetzten, ob Magnetrezeption ungestört abläuft oder nicht, konnte dieser Mechanismus analysiert werden. Die Experimente zeigten, dass der Magnetrezeptionsmechanismus lichtabhängig ist. Vögel die im blau bis grünen Teil des Spektrums in Orientierungstrichtern getestet wurden bevorzugten signifikant ihre der Jahreszeit entsprechende Zugrichtung. Führte man diese Tests mit längerwelligerem Licht durch, zeigten die Tiere Desorientierung. Durch die gezielte Manipulation des umgebenden Erdmagnetfeldes durch künstliche Felder, ergab sich ein Wirkprinzip des Magnetkompasses der Vögel, welches nichts mit dem der uns bekannten technischen Kompasse gemein hat. Die Tiere richten sich nicht nach der Polarität des Feldes, sondern detektieren vielmehr den Neigungsgrad und den Verlauf der magnetischen Feldlinien. Durch den Einsatz von Hochfrequenzfeldern als diagnostisches Werkzeug, konnte gezeigt werden, dass der Inklinationskompass der Vögel auf einem Radikalprozess basiert. Darüber hinaus konnte gezeigt werden, dass der Sitz des lichtabhängigen Magnetkompasses im rechten Auge lokalisiert ist. Unter bestimmten künstlichen Lichtbedingungen wurden von Rotkehlchen allerdings Verhaltensantworten gezeigt, die von der normalen Zugorientierung abwichen. In der vorliegenden Arbeit werden gerade jene Phänomene genauer analysiert, die in der Vergangenheit zu Nicht-Kompass-Antworten geführt haben. Die Intensitätserhöhung kurzwelliger Lichter hatte zu vermehrt axialem Verhalten geführt, eine Kombination aus langwelligem, gelben Licht mit einer kurzwelligen Komponente hatte zu Fixrichtungen geführt, d.h. die Vögel zeigten nicht mehr die saisontypische Zugumkehr. Auf biogenem Eisen (Magnetit) basierende Rezeptoren der Magnetfeld-wahrnehmung werden als zweites System der Perzeptionsmöglichkeit diskutiert, wobei ihnen im Zusammenhang mit dem ‚Kartensinn’ eher eine Intensitätssensibilität zugeschrieben wird. In der vorliegenden Arbeit wurden Versuche durchgeführt, die das komplexe Zusammenspiel unterschiedlicher Perzeptionsmechanismen des Erdmagnetfeldes untersuchen. Mischlichtbedingungen wurden daraufhin untersucht, ob sie einem radikalpaar-basierenden Inklinationskompass unterliegen, oder nicht. Für türkis-gelbes Mischlicht wird gezeigt, dass die eingeschlagene Fixrichtung nicht mit Hilfe eines Inklinationskompasses aufgesucht wird. Darüber hinaus beruht die Richtungswahl des getesteten Vogels nicht auf einem Radikalpaarmechanismus, ist aber abhängig vom vorliegenden Magnetfeld. Da Magnetit bei Vögeln in der Oberschnabelregion lokalisiert werden konnte, wurden Betäubungsversuche mit einem Lokalanästhetikum durchgeführt. Die Fixrichtung bricht zusammen und die Vögel zeigen desorientiertes Verhalten. Im Gegensatz dazu bleiben Vögel unter Grün und Weisslicht, Bedingungen wo ein Inklinationskompass zum Einsatz kommt, mit Oberschnabelbetäubung unbeeindruckt und suchen die jahreszeitlich passende Richtung auf. Für kurzwellige Lichter wird eine Intensitätsabhängigkeitsstudie durchgeführt, die analysiert ab wann Zugorientierung in Nicht-Kompass-Antworten umschlägt. Die Wellenlängenabhängigkeit der Intensitätssensitivität, die beobachtet wird, lässt auf die Beteiligung des optischen Systems schliessen. Deshalb wurden Versuche durchgeführt, die über die Lateralisation des Magnetkompasses hinaus die Rechtsdominanz des Rotkehlchenauges genauer untersucht haben. Mittels einer Brille, die die gleiche Lichtintensität auf beide Augen fallen ließ, aber in klare und unscharfe Wahrnehmung der Umgebung unterschied, konnte herausgefunden werden, dass über die reine Aktivierung von Licht hinaus Formensehen eine entscheidene Rolle zu spielen scheint. Versuche in absoluter Dunkelheit zeigen, dass von Rotkehlchen trotz der Abwesenheit von Licht signifikant eine Vorzugsrichtung aufgesucht wird, die keiner saisonalen Zugumkehr unterläuft. Die Fixrichtung beruht nicht auf einem Inklinationskompass und sie bricht nach Oberschnabelbetäubung zusammen. Alle bisher analysierten Nicht-Kompass-Antworten scheinen auf einem zweiten, magnetit-basierenden Mechanismus zu beruhen. Diese Rezeptoren scheinen neben Intensitätsinformationen des Erdmagnetfeldes auch Richtungsinformationen zu generieren. Die biologische Relevanz der ihnen unterliegenden Fixrichtungen bleibt allerdings ungeklärt.
Die Chemoresistenz von Tumoren ist ein schwerwiegendes Problem in der Krebstherapie. Insbesondere das maligne Melanom gilt aufgrund seiner ausgeprägten Therapieresistenz als nahezu unheilbar. Ein erster Schritt zur Verbesserung der Chemotherapie von Tumoren ist das Verständnis von Mechanismen, die der Resistenz zugrunde liegen. Für die Aufklärung der Mechanismen ist die Molekularbiologie des chemoresistenten Phänotyps von großem Interesse. Im Rahmen dieser Arbeit wurden Veränderungen im Transkriptionsmuster analysiert, die mit dem Erwerb von Chemoresistenz in Melanomzellinien einhergehen. Die Melanomzellinie MeWo wurde mit Abkömmlingen, die erworbene Resistenz gegen die DNA-schädigenden Agenzien Etoposid (MeWoEto1), Cisplatin (MeWoCis1) und Fotemustin (MeWoFote40) aufweisen, bezüglich ihres Transkriptionsmusters verglichen. Um zunächst eine möglichst große Anzahl von Genen in die Analyse einzubeziehen, wurden initiale Genexpressionsanalysen unter Verwendung des RZPD UniGene 1 Arrays durchgeführt. Dieses Array repräsentiert ca. 31.500 cDNA Sequenzen, die bei einer geschätzten Redundanz von 1,44 einer Anzahl von 21.875 verschiedenen Transkripten entsprechen. Geht man davon aus, dass der Mensch insgesamt über ca. 30.000 Gene verfügt, wurde durch die Verwendung dieses Arrays ein großer Teil aller humanen Gene untersucht. Unter definierten Selektionskriterien wurden 126 Gene ausgewählt, die als im chemoresistenten Phänotyp differentiell exprimiert angesehen wurden. Diese 126 Gene wurden mit 1.143 weiteren tumorassoziierten Genen für die Zusammenstellung und Produktion eines chemoresistenzspezifischen Kandidatengen-Arrays ausgewählt. In verifizierenden Analysen unter Verwendung des Kandidatengen-Arrays wurde eine differentielle Expression für 57 der initial selektierten Gene sowie für weitere 209 tumorassoziierte Gene festgestellt. Die in diesen Analysen angewandten Kriterien für die Definition differentieller Genexpression wurden in exemplarischen Northernblot-Analysen geprüft. Hier zeigte sich eine qualitative Übereinstimmung der Ergebnisse beider Methoden von 81,4%. Da zur Zeit noch keine Hochdurchsatz-Methoden für funktionelle Analysen zur Verfügung stehen, wurde versucht, den Kreis vielversprechender Kandidaten durch eine Integration von Ergebnissen anderer Experimente einzuengen. In Clusteranalysen zur Untersuchung von Verwandtschaftsgraden zwischen den resistenten Zellpopulationen zeigte die MeWoEto1-Zellinie eine vergleichsweise hohe Stabilität in ihrem Genexpressionsmuster über einen Zeitraum von ca. 2,5 Jahren, während MeWoCis1 und MeWoFote40 hier beträchtliche Schwankungen aufwiesen. Die Expressionsmuster der letzteren resistenten Linien zeigten zum spätesten analysierten Zeitpunkt Konvergenz, nachdem sie zunächst deutlich voneinander abwichen. Da die Wirkung sowohl von Cisplatin als auch von Fotemustin zur Bildung von DNA-Addukten führt, kann die Konvergenz als Ergebnis einer fortschreitenden Optimierung der Resistenz in beiden Linien gedeutet werden. Einzelne Gene wie z.B. PEPP2 und CRYAB, die konvergierend differentielle Expression zeigten, können demnach als vielversprechende Kandidaten für eine funktionelle Relevanz in der Resistenz gegen Cisplatin und Fotemustin betrachtet werden. Neben der Clusteranalyse wurden Ergebnisse von vergleichenden genomischen Hybridisierungen (CGH), der Untersuchung einer Deregulation von Kandidatengenen in mehreren der resistenten Linien oder nach Kurzzeitbehandlung von MeWo-Zellen mit den Zytostatika sowie Literaturdaten verwendet, um die Relevanz der differentiellen Expression für einzelne Gene zu validieren. Danach wurden unter anderen die apoptoserelevanten Gene CRYAB und STK17A sowie MPP1, AHCYL1, CYR61 und STMN3 als vielversprechende Kandidaten eingestuft. Ein weiteres bis dahin unbekanntes Gen aus der C2H2-Zinkfinger-Genfamilie, für das in initialen Analysen sowie in Northernblot und RT-PCR-Experimenten eine Überexpression in MeWoCis1 und MeWoEto1 nachgewiesen werden konnte, wurde bezüglich seiner mRNA-Sequenz vervollständigt und im Detail analysiert. Für dieses Gen konnte phänotyp- bzw. gewebespezifisches differentielles Spleissen sowie differentielle Polyadenylierung nachgewiesen werden. Das alternative Spleissen von Exon 3, dem aufgrund seiner ausgeprägten Homologie zu bereits charakterisierten KRAB A Domänen die Funktion der transkriptionalen Repression zugewiesen werden kann, könnte für ein phänotypspezifisches Transkriptionsprogramm verantwortlich sein. Ausgehend von insgesamt 267 differentiell exprimierten Genen konnte der Kreis vielversprechender Kandidaten durch die Integration von Daten aus anderen Experimenten auf ca. 20 Gene eingeengt werden. Unmittelbar im Anschluss and die Dissertation werden diese Gene in funktionellen Analysen bezüglich ihrer Relevanz für den chemoresistenten Phänotyp analysiert.
Studies in particular of the last decade showed that active neurogenesis continuously takes place in the subventricular zone (SVZ) of the lateral ventricles of the adult rodent brain. Neurogenesis in the SVZ leads to migration of neuroblasts within the rostral migratory stream (RMS) and mature neuron formation mainly in the olfactory bulb (OB). According to present understanding, glial cells with astrocytic properties represent the actual adult neural stem cells. The cell types representing the various cellular transition states leading to the formation of mature neurons as well as the mechanisms controlling adult neurogenesis and neuroblast migration are poorly understood. A previous study from this laboratory demonstrated that the ATP-hydrolyzing enzyme nucleoside triphosphate diphosphohydrolase 2 (NTPDase2) is associated with type B cells, the presumptive neural stem cells. NTPDase2 is a protein of the plasma membrane with its catalytic site facing the extracellular space. It hydrolyzes extracellular nucleoside triphosphates to their respective nucleoside diphosphates. This raises the possibility that the signaling pathway via extracellular nucleotides is involved in the control of adult neurogenesis. Neurons as well as glial cells express several subtypes of receptors (P2 receptors) that are responsive to the nucleotides ATP, ADP, UTP, or UDP. P2X receptors are ATP-gated Na+, K+ and Ca2+ permeable ion channels, P2Y receptors are coupled to trimeric G-proteins. In order to probe for a functional role of nucleotides in adult neurogenesis, the present study referred to an in vitro system (neurospheres). Neurospheres produced from isolates of the mouse SVZ and cultured in the presence of EGF and bFGF expressed the neural stem cell marker nestin and also GFAP, S100β, NTPDase2 and tissue non-specific alkaline phosphatase. Neurospheres generated from the cells of the subventricular zone were multipotenital. This was revealed by immunostaining of differentiated cells with markers for astrocytes, neurons and oligodendrocytes. The presence of ecto-nucleotidase was verified by analyzing the free phosphate released from nucleotides. The tissue non-specific form of alkaline phosphatase was the predominant enzyme. Both NTPDase2 and TNAP could be identified by immunocytochemistry and Western blotting. Hydrolysis was not observed for p-nitrophenyl thymidine monophosphate, a substrate of members of the ectonucleotide pyrophosphatase/phosphodiesterase family (NPP1 to NPP3). Since ecto-nucleotidases control the availability of extracellular nucleotide agonists, neurospheres were studied for the potential expression and functional role of nucleotide receptors. Neurospheres responded to extracellular nucleotides with a transient rise in Ca2+ (ATP = ADP > UTP). The rise in Ca2+ was due to P2Y receptors. The Ca2+ response was unaltered in the absence of extracellular Ca2+ and strongly reduced by thapsigargin, a blocker of internal Ca2+ stores. The P2Y1 antagonist MRS2179 strongly reduced the ATP- or ADP-induced increase in Ca2+, suggesting the involvement of a P2Y1 receptor. In addition, suramin and PPADS, non-selective antagonists for P2 receptors, inhibited most of the Ca2+ response. The agonistic activity of UTP and the lack of response to UDP implied the additional presence of a P2Y2 and/or a P2Y4 receptors and the absence of a functional P2Y6 receptor. RT-PCR experiments demonstrated that neurospheres expressed P2Y1 and P2Y2 receptors but not P2Y4 receptor. That the majority of the Ca2+ response to ATP was mediated via P2Y1 receptors was also confirmed by analysis of P2Y1 knockout mice and by application of the P2Y1 receptor-specific antagonist MRS2179. In addition, agonists of P2Y1 and P2Y2 receptors and low concentrations of adenosine augmented cell proliferation inspite of the presence of mitogenic growth factors. Neurosphere cell proliferation was attenuated after application of MRS2179 and in neurospheres from P2Y1 receptor knockout mice. These results infer a nucleotide receptor-mediated synergism that augments growth factor-mediated cell proliferation. Taken together these results suggest that P2Y-mediated nucleotidergic signalling is involved in neurosphere function and possibly also in adult neurogenesis in situ.
Die Ergebnisse der vorliegenden Dissertation beleuchten neue Aspekte der pflanzlichen Hitzestressantwort. Die Ergebnisse der experimentellen Arbeiten können erheblich die Planung und Durchführung zukünftiger Untersuchungen erleichtern, sowie das Verständnis der Regulation von Hitzestresstranskriptionsfaktoren als terminale Komponenten der zellulären Stressantwort verbessern. Zum ersten Mal wurde die Interaktion zwischen einem Hitzestresstranskriptionsfaktor und einem cytoplasmatischen Hitzestressprotein der Hsp20 Familie nachgewiesen. Die Aktivität des LpHsfA2 hängt von zahlreichen Faktoren ab, die den zellulären Zustand während und nach der Stressperiode widerspiegeln. Der bisher am besten verstandene Regulationsmechanismus, das Verhältnis des Kernimports im Vergleich zum Kernexport, welches stark durch die Heteroligomerisierung mit HsfA1 beeinflusst wird, wird durch den Einfluss von Hsp17.4-CII auf den Aggregationszustand und die Aktivität von HsfA2 erweitert. Nach massiver Akkumulierung von HsfA2 unter Hitzestressbedingungen führt die spezifische Interaktion mit Hsp17.4-CII zu einer reversiblen Inaktivierung des Transkriptionsfaktors und zu einer Bindung in hochmolekularen Komplexen. Die Interaktion ist hochspezifisch. Die nur durch wenige AS-Austausche charakterisierte Isoform Hsp17.3-CII bindet LpHsfA2 nicht. Im Gegensatz dazu ist der solubilisierende Einfluss der Hitzestressproteine der Klasse CI klassen-, nicht aber speziesspezifisch. Das Wechselspiel aus Inaktivierung durch Bindung an Hsp17.4-CII und anschliessende Resolubilisierung durch Hsp17-CI, sowie Kernimport nach erfolger Heterooligomerisierung mit HsfA1, führt zu einer fein abgestimmten Regulation der zellulären Lokalisation von HsfA2 und somit auch zur Modulation seiner Funktion als Transkriptionsaktivator. Die in der Arbeit gewählten experimentellen Bedingungen bewirken eine Aggregation von HsfA2 auch unter Kontrollbedingungen und ähneln der Situation in einer Pflanzenzelle während der Erholungsphase nur teilweise. In vivo wird der massiven Aggregation von HsfA2 und Hsp17.4-CII durch den Einfluss von HsfA1 und Hsp17-CI entgegengewirkt. Die gefundene in vitro Situation bietet somit ein wertvolles experimentelles Artefakt, um die Wechselwirkungen der Proteine während der Erholungsphase der Pflanze zu untersuchen und verstehen zu lernen. Aufgrund verschiedener experimenteller Hinweise kann davon ausgegangen werden, dass es sich bei der gezeigten spezifischen Interaktion nicht um ein auf die Gattung Lycopersicon beschränktes Phänomen handelt. In ersten Experimenten konnten Hinweise auf einen ähnlichen Regulationsmechanismus in A. thaliana gefunden werden (spezifische Interaktion zwischen AtHsfA2 und AtHsp17.7-CII). Allerdings zeigen die Ergebnisse der Experimente, in denen Proteine aus A. thaliana untersucht wurden, Abweichungen zu dem für die Tomatenproteine erarbeiteten Bild. Weitere Untersuchungen an Arabidopsis müssen hierzu durchgeführt werden, um Klarheit über den grundlegenden Regulationsmechanismus sowie speziesspezifische Besonderheiten zu bringen. Das aus den experimentellen Befunden resultierende Bild zeigt thermotolerante Tomatenzellen, in denen LpHsfA2 in einer transkriptionel inaktiven Form durch Bindung mit löslichem Hsp17.4- CII in Gegenwart von Hsp17-CI stabilisiert wird. Der Transkriptionsfaktor ist in diesem Zustand bereit für eine rasche Reaktivierung bei einem wiederkehrenden Hitzestress. Auch wenn mittlerweile die vier wichtigsten Regulatoren dieses Netzwerkes identifiziert werden konnten (LpHsfA1, LpHsfA2, LpHsp17.4-CII und LpHsp17-CI), kann nicht ausgeschlossen werden, dass weitere Faktoren beteiligt sind. Die Identifizierung solcher Faktoren, sowie weiterführende Arbeiten an Tomatenzellen, zum Beispiel durch Ausschalten einzelner Faktoren mit Hilfe von RNAi Konstrukten, wird in Zukunft helfen, noch mehr Details dieses interessanten Phänomens zu klären. Trotz der sehr guten Kenntnis der molekularen Eigenschaften der 21 AtHsf in Bezug auf ihre funktionellen Domänen wird erst das Verständnis der Art und Weise, wie diese Moleküle miteinander oder mit Co-Regulatoren interagieren und wie sie in die zellulären Regulationsnetzwerke eingebunden sind, zu einem Gesamtbild der Funktion der Hitzestresstranskriptionsfaktoren führen. Insbesondere gilt dies, seit die Analyse der Transkritionsprofile der AtHsf mit Hilfe von Micro-Array Analysen gezeigt haben, dass die Aufgaben der Hsf weit über die Regulation der Hitzestressantwort hinausgehen könnten. So könnten einige Vertreter der Hsf eine Rolle in der Pathogenabwehr spielen, bzw. im Laufe der Evolution ausschließlich entwicklungsspezifische Funktionen übernommen haben. Um die geschilderte Fragestellung effektiv zu bearbeiten, wurde in dieser Arbeit das Hefe-Zwei-Hybridsystem zur Charakterisierung der Interaktionseigenschaften der 21 AtHsf eingesetzt. Die zeitsparende Bearbeitung vieler Proben war hierbei ein Kernziel, das erfolgreich bearbeitet werden konnte: Die etablierte Hochdurchsatzmethode kann zukünftige Untersuchungen von Protein-Protein-Interaktionen stark beschleunigen. Die standardisierte Verwendung von Mikrotiterplatten und Mehrkanalpipetten in Kombination mit den etablierten Tranformations-, Analyse und PCR-Verfahren macht eine Bearbeitung großer Probenmengen möglich. Die Synthese dieser Technik mit der Kenntniss des gesamten Genoms von A. thaliana sowie der Fülle an Transkriptionsdaten einzelner Gene unter verschiedenen Umgebungsbedingungen stellt zukünftigen Untersuchungen ein potentes Instrumentarium ganz allgemeiner Art zur Verfügung. Im vorliegenden Fall wurde die etablierte YTH Methode dazu verwendet, Erkenntnisse über das Interaktionsverhalten der AtHsf untereinander zu gewinnen. Die Zusammenfassung aller auftretenden Interaktionen liefert für einige Gruppen von Hsf interessante Einsichten. In vielen Fällen (z.B. AtHsfA4/A5; AtHsfA1/A9) konnte für Vertreter eine Interaktion gezeigt werden, für die bereits physiologische Zusammenhänge bekannt sind. Das erstellte Interaktom kann dazu dienen, bereits bekannte Hsf-Hsf Interaktionen durch einen weiteren experimentellen Befund zu belegen, sowie bisher unbekannte Verbindungen aufzudecken. Zur Identifizierung unbekannter Interaktionspartner mussten zunächst geeignete Bibliotheken hergestellt werden. Mit Hilfe dieser Bibliotheken konnten zahlreiche putative Interaktionspartner identifiziert und durch das Interaktom bereits bekannte Interaktionspartner für fast alle Köder in den Bibliotheken gefunden werden. Dies bestätigt sowohl die gute Abdeckung der mRNA Population der Zellen, aus denen die Bibliotheken gewonnen wurden, als auch die Reproduzierbarkeit und Funktionalität des YTH Screenings. Die Tatsache, dass in der Population der putativen Interaktionspartner für AtHsf gehäuft Transkriptionsfaktoren auftreten, lässt auf die Art der Vernetzung der AtHsf in den Proteinnetzwerken schließen: Die Regulation der Zielgene erfolgt möglicherweise bevorzugt durch eine direkte Wechselwirkung von Transkriptionsfaktoren verschiedener Familien. Neben der Etablierung der Methoden zur beschleunigten Untersuchung zahlreicher Proben stellte auch die Standardisierung der experimentellen Folgeschritte einen wichtigen Aspekt dar, um eine reproduzierbare Aussage über die Relevanz einer Interaktion treffen zu können. Interessante Ansatzpunkte, sowie Vorschläge für weiterführende experimentelle Arbeiten sollen im Folgenden für die wichtigsten Klone thesenartig dargestellt werden: Ein möglicher Co-Regulator für AtHsfA5 Das mit Hilfe der AtHsfA5-CTD identifizierte unbekannte Protein, codiert durch den Lokus At5g01370, bietet einen Ansatzpunkt für eine gezielte Untersuchung der Rolle und Regulation des AtHsfA5. Die spezifische Interaktion zwischen HsfA5 und HsfA4, die sowohl in A. thaliana als auch in Tomate existiert, sowie das auffällige Fehlen einer hemmenden Aktivität von AtHsfA5 auf HsfA4 an den bisher untersuchten Reporterkonstrukten in Pflanzenzellen, zeichnen diesen TF als einen besonders interessanten Vertreter der AtHsf aus. Es muss wegen der Pflanzenspezifität des Hemmeffektes über die Existenz eines HsfA5 spezifischen Co-Repressors nachgedacht werden. In diesem Zusammenhang kann die Analyse des identifizierten Proteins helfen, einen solchen Regulator zu charakterisieren. Die im Rahmen dieser Arbeit dokumentierten Ergebnisse legen nahe, dass das von At5g01370 codierte Protein mit der NLS-Region von AtHsfA5 interagiert. Da die entscheidenden Experimente bisher nur in Hefe durchgeführt wurden, steht eine Reproduktion in einem pflanzlichen Expressionssystem für weiterführende Arbeiten im Vordergrund. Die Versuche, die Transkriptionseigenschaften von AtHsfA5 durch Co-Expression des unbekannten Proteins oder Co-Transformation eines RNAi induzierenden Plasmides zu beeinflussen, sind bisher mangels Kenntnis der Zielgene von AtHsfA5 fehlgeschlagen. Weitere Schritte bei der Bearbeitung dieser Fragestellung müssen demnach die Suche nach einem geeigneten Testsystem, sowie die experimentelle Bestätigung einer Interaktion beider Proteine in planta sein. Im Rahmen der Promotion wurde der Lokus des identifizierten Gens auf das Vorhandensein einer T-DNA Insertion hin überprüft. Eine entsprechende Linie existiert nicht, so dass transgene Pflanzen durch Transformation von Überexpressions- oder RNAi-Kassetten hergestellt werden müssten. Es ist nicht auszuschließen, dass schon die Deletion einer der beiden chromosomalen Kopien des Gens zu einem lethalen Phänotyp führt und daher keine T-DNA Insertionslinien existieren. In diesem Fall kann möglicherweise der Phänotyp einer Überexpressionspflanze Aufschlüsse über einen Zusammenhang der Funktion des unbekannten Proteins und der Rolle des AtHsfA5 liefern. AtHsfB2a interagiert mit AtDLC8 (At3g15930) Die Interaktion des Dynein Leichte Kette 8 Proteins (DLC8) mit AtHsfB2a bietet ebenfalls Ansätze für weitere Untersuchungen. Durch die mit Hilfe des Interaktoms identifizierte spezifische Interaktion zwischen AtHsfB2a und HsfB2b hebt sich diese Subgruppe der Klasse B der AtHsf von den übrigen Vertretern ab. Die im Ergebnisteil beschriebenen Befunde, vornehmlich aus Experimenten mit Säugersystemen, deuten eine regulatorische Rolle für DLC Proteine allgemein an (zum Beispiel beschrieben für die Interaktion zwischen dem TF Bim aus der Bcl2 Familie und DLC8 (Day et al., 2004)). Eine detaillierte Charakterisierung der im YTH gefundenen Interaktion zwischen DLC8 und AtHsfB2a könnte eine pflanzenspezifische, regulatorische Funktion der DLC Proteine zeigen, die losgelöst von den Transportfunktionen des Dynein Komplexes existiert. Das Fehlen geeigneter Reportersysteme für AHsfB2a stellt in diesem Zusammenhang ein großes Problem dar. Auch für den Lokus At3g15930 existieren keine TDNA Linien, obwohl der gesamte umgebende chromosomale Kontext zahlreiche Insertionen aufweist. Die Herstellung und Kultivierung von Überexpressions- oder „knock down“ Pflanzen für das DLC8 Protein muss zeigen, ob dieses in Verbindung mit HsfB2a essentielle Aufgaben während der Entwicklung bzw. bei der Stressabwehr von A. thaliana übernimmt. Interaktion von AtHsfA9 mit AtDr1 (At5g23090) Der mit Hilfe von AtHsfA9 identifizierte Klon AtDr1 stellt möglicherweise eine Verbindung zwischen den AtHsf und einem sehr allgemeinen Regulationsmechanismus in Pflanzen dar, über den bisher nur sehr wenig bekannt ist. Die meisten Repressoren, die aus nicht-pflanzlichen Systemen beschrieben wurden, üben ihre Funktion genspezifisch aus, d.h. sie binden entweder Promoter-spezifisch an die entsprechenden Zielgene oder an spezifische Bindungspartner. Einer der wenigen Repressoren, die eine generelle Funktion ausüben, ist Dr1. In Säugerzellen zum Beispiel verringert Dr1 die generelle Effektivität der RNA-Polymerase II. Da kürzlich die Existenz und Funktionalität der pflanzlichen Homologe von Dr1 in Reis bewiesen wurde, bietet die nun gefundene Verbindung mit der Gruppe der AtHsf einen viel versprechenden Ansatzpunkt. Allerdings war es im Rahmen der vorliegenden Arbeit nicht möglich, mit Hilfe geeigneter Reportersysteme eine Repression von Promotoren durch Dr1 zu zeigen. Die Etablierung eines solchen Systems (auch endogener chromosomaler Reportersysteme) steht daher im Vordergrund weiterer Untersuchungen. Im Rahmen der Arbeit konnten transgene T-DNA Insertionslinien des Lokus At5g23090 charakterisiert werden, sie liegen für weitere Untersuchungen bereit. Allen voran steht die Analyse des Transkriptionsniveaus verschiedener Zielgene in Wildtyppflanzen sowie in den beschriebenen Mutanten. Weitere Schritte sind die Herstellung und Analyse transgener Pflanzen, die veränderte Mengen an Dr1 und AtHsfA9 aufweisen. Neben der Identifizierung der Vernetzungen der AtHsf mit Dr1 als einem generellen Regulator der Genexpression kann eventuell auch die molekulare Wirkungsweise des Dr1 Repressors in Pflanzen mit Hilfe solcher Experimente entschlüsselt werden. AtHsfB1 interagiert mit AtbZip44 (At1g75390) Die aus den durchgeführten YTH Screenings resultierende wahrscheinlich wichtigste Vernetzung der AtHsf mit bisher unbekannten Co-Regulatoren stellt das Zusammenspiel der Hsf mit den bZip Transkriptionsfaktoren da. Die Kombination des inaktiven HsfB1 mit AtbZip44 führt zu einer verstärkten Aktivierung von Zielgenen, zu denen auch die Gene von HsfA3 und HsfC1 gehören. Obwohl eine direkte Interaktion beider Transkriptionsfaktoren für die synergistische Aktivierung nicht stattfindet, deutet die am Promoter von AtHsfC1 und AtHsfA3 gefundene Konstellation eine bisher unbekannte Rolle für AtHsfB1 an, die von der kürzlich beschriebenen Rolle von LpHsfB1 in Tomatenzellen abweicht. Die gefundenen experimentellen Ergebnisse lassen folgende Hypothese zu: AtHsfB1, der sowohl in Wurzel- als auch in Sprossgewebe unter zahlreichen Stressbedingungen induziert wird, bindet an Promotoren und besetzt dort spezifische Bindestellen, die klassischen HSE. Aufgrund fehlender Aktivatormotive führt diese Bindung zu keiner Aktivierung der Zielgene. Die Promotoren befinden sich jedoch nun in einem Zustand, in dem die Bindung weiterer Aktivatoren, im beschriebenen Fall AtbZip44, zu einer raschen und starken Aktivierung des Gens führt. Durch das Zusammenwirken von zwei unabhängig voneinander bindenden Transkriptionsfaktoren könnte ein erhöhtes Maß an Flexibilität und Sensitivität der Genregulation erreicht werden. Auch eine generelle induzierte Toleranz gegenüber Stress könnte durch die differentielle Expression von AtHsfB1 und weiteren Faktoren erklärt werden. In diesem Fall würde HsfB1 auch nach Beendigung eines Stresszustandes noch an den Promotoren wichtiger Zielgene gebunden bleiben, ohne diese unnötig zu aktivieren. Bei Wiederkehren der Stresssituation wäre eine rasche Reaktivierung durch Synergismen mit kurzlebigen, potenten Aktivatoren, wie zum Beispiel AtbZip44, möglich. Durch die Wechselwirkung von AtHsfB1 mit Vertretern verschiedener Familien von Transkriptionsfaktoren, möglicherweise auch Repressoren, kann so eine Vielzahl von Zielgenen reguliert werden. Die weitere Untersuchung des AtbZip44 erscheint aus zwei Gründen besonders lohnend: (1) AtbZip44 beeinflusst die Synthese der AS Prolin. Prolin stellt ein weit verbreitetes Osmolyt dar, welches als Hydroxyl-Radikal-Fänger fungiert, Plasmamembranen unter Stressbedingungen schützt sowie die Toleranz von Pflanzen gegenüber Frost und Hochsalzbedingungen erhöht. (2) Für AtHsfA5 wurde eine direkte Interaktion mit AtbZip44 in vitro gezeigt. Ob ein Komplex zwischen AtHsfA5 und AtbZip44 eine Transkription an geeigneten Reportern bewirkt, ist allerdings noch offen, und muss durch geeignete Experimente gezeigt werden. Neben umfangreichen Screeningarbeiten, der basalen Charakterisierung aller interessanten Klone und der Detailcharakterisierung der Interaktion zwischen AtHsfB1 und AtbZip44 konnten zusätzlich erste Vorarbeiten mit transgenen Pflanzen für die interessantesten Kandidaten durchgeführt werden. Als Ergebnis der Arbeit stehen somit einige vielversprechende Ansatzpunkte für weitere Studien zur Verfügung, ebenso die standardisierte Technik und die notwendigen konservierten Bibliotheken, um in kurzer Zeit Screenings mit weiteren Köderproteinen durchzuführen. Die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit tragen dazu bei, zukünftige Experimente besser zu planen, sowie die Rolle der Hsf als terminale Komponenten der pflanzlichen Stressantwort weiter zu entschlüsseln und zu verstehen. Die Entschlüsselung der Funktion aller Proteine eines Gesamtorganismus, deren posttranslationale Modifizierungen, die Möglichkeit stabiler sowie transienter Interaktionen mit anderen Proteinen und somit die Vernetzung aller Proteine zu einem Gesamtnetzwerk stellt die große Herausforderung des Zeitalters der „proteomics“ dar. Verliefen während der Entschlüsselung der Genome von Organismen die Informationen auf Nukleinsäureebene noch linear, so dass mit Hilfe eines hohen Automatisierungsgrades ein rascher Fortschritt erzielt werden konnte, so erfordert die so genannte „post-genomics“ Ära hohe finanzielle und personelle Investitionen. Die Nicht-Linearität der Proteinfunktionen, die durch Modifikationen und Wechslwirkungen beeinflusst werden, hat rasch gezeigt, dass ein komplexer Organismus nicht lediglich durch die Kenntnis der Summe seiner Gene verstanden werden kann. Das Zeitalter der „proteomics“ erfordert trotz potenter Hochdurchsatzmethoden und weit fortgeschrittener Computeranalysen mehr denn je ausgefeilte Testmethoden und eine individuelle Untersuchung einzelner Proteine und deren Wechselwirkungen, um schließlich die Kernfrage der Biologie, wie Leben funktioniert, beantworten zu können.