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Active neurogenesis continuously takes place in the dentate gyrus of the adult mammalian brain. The dentate gyrus of the adult rodent hippocampus contains an astrocytelike cell population that is regarded as residual radial glia. These cells reside with their cell bodies in the subgranular layer (SGL). Radial processes traverse the granule cell layer (GCL) and form bushy ramifications in the inner molecular layer (IML). The residual radial glial cells apparently represent neuronal progenitor cells that can give rise to functionally integrated granule cells. To date the cellular and molecular events driving a subpopulation of these cells into neurogenesis as well as the cellular transition states are poorly understood. The present study shows, that in the mouse dentate gyrus, this cell type selectively expresses surfacelocated ATPhydrolyzing activity and is immunopositive for nucleoside triphosphate diphosphohydrolase 2 (NTPDase2). NTPDase2 is an ectoenzyme and hydrolyzes extracellular nucleoside triphosphates such as ATP or UTP to their respective nucleoside diphosphates. The enzyme becomes expressed in the hippocampus during late embryogenesis from E17 onwards, and is thus not involved in early brain development. Its embryonicpattern of expression mirrors dentate migration of neuroblasts and the formation of the primary and finally the tertiary dentate matrix. NTPDase2 is also expressed by a transient population of cortical radial glia from late embryonic development until postnatal day 5. NTPDase2 can be employed as a novel markerfor defining cellular transition states along the neurogenic pathway. It is associated with subpopulations of GFAP and nestinpositive cells. These intermediate filaments are typically expressed by the progenitor cells of the dentate gyrus. In addition there is a considerable overlap with doublecortinand PSANCAM positive cells. The expression of the microtubuleassociated protein doublecortin and of PSANCAM which are expressed by migrating neuroblasts is indicative of a transition of progenitors to a neural phenotype or an immature form of granule cell. NTPDase2 is no longer associated with young neurons and with maturegranule cells, as indicated by the lack of doubleimmunostaining for III tubulin and NeuN, respectively. Furthermore, β S100positive astrocytes do not express NTPDase2 validating that NTPDase2 is also not associated with later stages of gliogenesis. Experiments with the Sphase marker bromodeoxyuridine (BrdU) demonstrate that NTPDase2positive cell proliferate. Postmitotic BrdU-labeled cells preferentially acquire an NTPDase2positive phenotype. Many of these cells were also positive for GFAP. The contribution of BrdUlabeled cells positive for NTPDase2 increased with time from 2 h to 72 h, validating a strong association of NTPDase2 with proliferating cells of the dentate gyrus. The colocalization studies with various markers and the results of the experiments suggestthat NTPDase2 is associated with cell types of varying maturation states but not with mature neurons or astrocytes. Studies on the formation of neurospheres from the dentate gyrus validate previous data suggesting that the hippocampal progenitors have little capacity for self renewal in vitro. In situ hybridization results indicate the presence of one of the metabotropic purinergic receptor subtypes (the P2Y1 receptor) within the adult neurogenic regions, the dentate gyrus and the lateral walls of the lateral ventricles. A patchclamp analysis demonstrates the presence of functional ionotropic nucleotide receptor (P2X receptors) in progenitor cells expressing nestin promotordriven GFP. They suggest that the signaling pathway via extracellular nucleotides and nucleotide receptors may play a role in the control of adult hippocampal neurogenesis.
Das für die Phytoen-Desaturase (CrtI) aus Rubrivivax gelatinosus kodierende Gen konnte aus genomischer DNA amplifiziert und in unterschiedliche Expressionsvektoren kloniert werden. Die Funktion der Phytoen-Desaturase wurde in vivo durch Komplemetierung einer Phytoen bildenden E. coli-Transformante überprüft. Die heterologe Expression von crtIRg in E. coli, als lösliches und aktives Enzym mit einer molekularen Masse von 57 kDa, konnte nur mit dem Plasmid pPEUcrtIRg erreicht werden. Mittels in vitro Enzymtests konnten kinetische Parameter und der Kofaktor des Enzyms bestimmt werden. Der Km-Wert für das Substrat Phytoen lag bei 14,8 μM, der Vmax-Wert bei 5,2 nmol/h*mg CrtIRg. Für das Substrat Neurosporin konnte ein Km-Wert von 33 μM und ein Vmax-Wert von 0,6 nmol/h*mg CrtIRg ermitteltwerden. FAD steigerte als Kofaktor den Umsatz des Substrates um das 39-fache. Sowohl für die Phytoen-Desaturase aus Rvi. gelatinosus, als auch für die Phytoen-Desaturase aus Rba. sphaeroides konnte in vitro gezeigt werden, dass die Anzahl der an einem Carotinoidmolekül katalysierten Reaktionsschritte stark von der Enzym- bzw. Substratkonzentration abhängt. Bei einer hohen Phytoen- und einer niedrigen Enzymkonzentration wird fast nur Neurosporin gebildet (3 zusätzliche Doppelbindungen), während bei einer hohen Enzym- und einer niedrigen Phytoenkonzentration deutlich mehr Lycopin synthetisiert wird (4 zusätzliche Doppelbindungen). In den jeweiligen Organismen spielt die Konkurrenz der bakteriellen Phytoen-Desaturase mit dem sich in der Carotinoidbiosynthesekette anschließenden Enzym in Bezug auf die Anzahl der eingefügten Doppelbindungen eine wichtige Rolle. Dies konnte in Hemmstoffuntersuchungen am Beispiel zweier Xanthphyllomyces dendrohous-Mutanten gezeigt werden. Die Verringerung der aktiven CrtI-Menge in der Torulin-Mutante DQ1 förderte die Bildung von β-Carotin (nur 4 Desaturierungsschritte). Dagegen führte die Senkung der aktiven Lycopin-Zyklase-Menge in der β-Carotin-Mutante PR1-104 zur Förderung der durch CrtI katalysierten Reaktion mit der Folge, dass hauptsächlich Torulin gebildet wurde (5 Desaturierungsschritte). Mittels Error Prone PCR sowie dem E. coli-Stamm XL1-Red konnte das Gen crtI aus Rvi. gelatinosus mutagenisiert werden. Die erstellten Mutationsbibliotheken konnten in Phytoen bildenden E. coli-Transformanten exprimiert und Klone mit veränderten Phytoen-Desaturasen mittels Farbscreening identifiziert werden. Aus Klonen mit einem veränderten Lycopin/Neurosporin-Verhältnis wurde die DNA isoliert und crtI sequenziert. Dadurch konnten mutierte Gene ermittelt werden, deren modifizierte Expressionsprodukte entweder mehr Lycopin oder fast ausschließlich Neurosporin bildeten. Es zeigte sich, dass die Veränderung der Aminosäure an Position 208 einen starken Einfluss auf die Anzahl der eingefügten Doppelbindungen hat. Die Aminosäure befindet sich in einer membrangebundenen Helixstruktur bei der es sich vermutlich um einen direkt an der katalytischen Reaktion beteiligten Bereich handelt. Es konnte gezeigt werden, dass alle Mutationen, die die Anzahl der katalysierten Reaktionsschritte senkten, Leucin-Prolin-Austausche (oder umgekehrt) waren. Prolin (bzw. Leucin) veränderte in diesen Fällen die Sekundärstruktur des Proteins wodurch, die Funktion gestört wurde. Neben diesen strukturellen Veränderungen wurden Mutationen ermittelt, die zu einer verstärkten Expression der Phytoen-Desaturase führten, was eine erhöhte Lycopinbildung bewirkte. Es zeigte sich, dass bei einigen dieser Mutanten die Replikation der Plasmid-DNA erhöht war. Die starke Replikation ist wahrscheinlich auf eine Verarmung an beladenen tRNA Molekülen zurückzuführen. In ColE1-Plasmiden (pPEU) kann es zu einer unkontrollierten Replikation kommen, die auf Wechselwirkungen zwischen den Replikationsregulierenden Strukturen RNAI und RNAII mit den unbeladenen tRNA Molekülen zurückzuführen ist. Auf der Grundlage der erlangten Erkenntnisse und mittels Computer gestützter Analysen konnte ein Modell der Sekundärstruktur und der Membranassoziation des Enzyms erstellt werden.
Identifizierung potentieller Schlüsselgene für die Pathogenese des myelodysplastischen Syndroms
(2005)
Das Ziel der vorliegenden Arbeit war die Identifizierung von potentiellen Pathogeneserelevanten Genen in differenzierenden, hämatopoetischen Zellen von Patienten mit myelodysplastischem Syndrom. Grundlage für diese Arbeit war die Etablierung eines in vitro Systems zur Differenzierung primärer, hämatopoetischer Stammzellen. Durch globale Genexpressionsanalyse mit Oligonukleotid Mikroarrays sollten enexpressionsmuster gefunden werden, die die normale Hämatopoese charakterisieren und darüber hinaus zur Identifizierung relevanter Gene für die einzelnen Risikotypen des MDS beitragen. Die Ergebnisse können in Anlehnung an die einzelnen Fragestellungen (Kapitel 1.4.) wie folgt zusammengefasst werden: 1. Welche Gene werden im Verlauf der normalen hämatopoetischen Differenzierung angeschaltet? Bei der Differenzierung normaler hämatopoetischer Stammzellen werden im Verlauf der Erythro-, Granulo- und Megakaryopoese hochdifferentielle transkriptionelle Programme initiiert. Die Betrachtung von Genen mit einem sich kontinuierlich verändernden Expressionsniveau zeigte eine ansteigende Expression linienspezifischer Markergene mit zunehmender Differenzierung der Zellen. Darüberhinaus lassen sich differentielle Gene definieren, die für die einzelnen hämatopoetischen Linien und den Zeitpunkt der Expression im untersuchten Zeitrahmen spezifisch sind. Die Anzahl zellreihenübergreifender „Schlüsselgene“ im Verlauf der normalen hämatopoetischen Differenzierung ist stark begrenzt. Lediglich ein Gen (CD86) wird in allen drei hämatopoetischen Linien exprimiert. 2. Gibt es spezifische Genexpressionsmuster, die für die Differenzierung der unterschiedlichen hämatopoetischen Zellreihen charakteristisch sind? Mit Hilfe der „Class membership prediction“ konnte ein Set von 53 Genen identifiziert werden, deren Expression zu unterschiedlichen Zeitpunkten in den einzelnen hämatopoetischen Linien eine Klassifizierung der Einzelproben gemäß dem determinierenden Stimulus zulassen. Diese prädiktiven Gene haben ein spezifisches Expressionsmuster, das Zellen der Erythro-, Granulo- oder Megakaryopoese charakterisieren kann. 3. Ist eine Differenzierung von CD34+ Stammzellen im in vitro Modell möglich? Lassen sich normale Stammzellen und Stammzellen von Patienten mit MDS unterscheiden? Es wurde ein in vitro Modell zur Untersuchung von differenzierenden hämatopoetischen Stammzellen etabliert und eine liniendeterminierte Differenzierung normaler Stammzellen durch Morphologie und Immunophänotyp bestätigt. Die Untersuchungen zeigen, dass die Differenzierung und Proliferation in vitro differenzierter Zellen bei Patienten mit MDS im Vergleich zu normalen Zellen vermindert ist. Diese in vitro Daten korrelieren gut mit klinischen Befunden des MDS, wonach die veränderte Proliferation und Differenzierung der Stammzellen die Insuffizienz der Hämatopoese beim MDS nach sich zieht. 4. Gibt es Gene, welche die differenzierende myelodysplastische Stammzelle charakterisieren können ? Mittels globaler Genexpressionsanalyse differenzierender CD34+ Zellen ist es möglich, zwischen der Gruppe der low risk MDS, der Gruppe der high risk MDS sowie normalen CD34+ Zellen zu unterscheiden. Diese Ergebnisse könnten für die Einschätzung des Krankheitsrisikos beim MDS herangezogen werden. Die vergleichende Analyse der Genexpression in differenzierenden CD34+ Zellen von gesunden Spendern und MDS-Patienten zeigt, dass die Regulation der Differenzierung beim MDS bereits in CD34+ Zellen und nicht erst auf der Ebene späterer Entwicklungsstufen (wie bisher angenommen) gestört ist. Es konnten eine Reihe von Schlüsselgenen (z.B. DLK1, RAP1GA1, BNIP3L, API5), die in differenzierenden CD34+ Zellen differentiell exprimiert sind, gefunden werden. 5. Welchen Einfluss haben demethylierende und hyperacetylierende Substanzen auf die Genexpression hämatopoetischer Stammzellen? Nur eine relativ begrenzte Anzahl von Genen werden sowohl in normalen als auch in MDS-Zellen durch eine Behandlung mit Decitabine und SAHA induziert bzw. reprimiert. Diese Daten weisen darauf hin, dass die Induktion bzw. Repression der Genexpression in einer gerichteten und spezifischen Art und Weise erfolgen muss. Eine Induktion der Expression konnte in allen verwendeten Stammzelltypen nachvollzogen werden, was zeigt, dass die verwendeten demethylierenden und hyperacetylierenden Substanzen nicht ausschließlich tumorzellspezifisch wirken. Die verstärkte Suppression der Expression von Transkriptionsregulatoren in MDS-Zellen deutet darauf hin, dass eine Verbesserung der Hämatopoese in MDS-Patienten durch Behandlung mit Decitabine und SAHA möglicherweise primär durch die Blockierung von Signalkaskaden und nicht durch die Aktivierung von Tumorsuppressorgenen erreicht wird. 6. Unterscheiden sich die Genexpressionsprofile von low und high risk MDS-Zellen nach Behandlung mit Decitabine und Suberoylanilidhydroxaminsäure? Die veränderte Genexpression in high und low risk MDS-Zellen zeigen nach einer Behandlung mit Decitabine und SAHA unterschiedliche Profile. Die Anzahl von induzierten Genen in high risk MDS-Zellen ist höher als in low risk MDS-Zellen. Nur wenige Gene lassen sich in beiden Zelltypen induzieren (2 Gene). Der Effekt der Behandlung auf das Genexpressionslevel ausgewählter Gene zeigt einen graduellen Verlauf, wobei z.B. die Genexpression in normalen Zellen, hin zu Zellen von low risk MDS und schließlich zu high risk MDS-Zellen abnimmt (Methylierung). Diese Resultate lassen vermuten, dass in normalen und MDS-Zellen zwar die gleichen Gene durch eine Behandlung induziert werden, das Maß der Induktion aber vom Subtyp und möglicherweise von der Schädigung der Zelle abhängt. 7. Welche Hinweise zum Pathomechanismus des MDS können mit Hilfe globaler Genexpressionsanalysen gesammelt werden? Mit Hilfe der Genexpressionsanalysen konnte bestätigt werden, dass Zellen von MDSPatienten bereits auf Ebene der Stammzelle Defekte aufweisen und dass diese alterierten Stammzellen ein transkriptionelles Programm determinieren, das massive Alterationen zum transkriptionelles Programm normaler Zellen aufweist. Eine gestörte Expression essentieller linienspezifischer Markergene der Erythro-, Granulo- und Megakaryopoese konnte identifiziert werden und bestätigt die klinischen Befunde. Im Zuge dieser Untersuchungen sind darüber hinaus neue Kandidatengene, die an der Pathogenese des MDS beteiligt sein könnten erstmals durch eine massiv gestörte Expression im Vergleich zu normalen Zellen gefunden worden.
Molekulare Regulation der UDP-Zucker-Biosynthese Untersuchungen anhand der myo-Inositoxygenase
(2006)
Der Nukleotidzucker UDP-Glucuronsäure ist die prinzipielle Zuckervorstufe für UDP-Galacturonsäure, -Xylose, -Arabinose und –Apiose, welche alle in die Zellwandpolymere der pflanzlichen Zellwand einfließen. UDP-Glucuronsäure kann in Arabidopsis über zwei alternative, funktionelle Synthesewege gebildet werden, wobei entweder die UDP-Glucose-Dehydrogenase oder die myo-Inositoxygenase als Schlüsselenzym, welche den Kohlehydratfluss in Richtung Zellwandbiosynthese katalysiert, involviert ist. In dieser Arbeit wurden die Gene für die Enzymisoformen der Inositoxygenase (MIOX) aus Arabidopsis thaliana analysiert. Sie repräsentieren eine kleine Genfamilie bestehend aus vier Isoformen. Studien mittels Promotor::GUS-Konstrukten und RT-PCR zeigten, dass die Transkription der MIOX-Gene eine sehr transiente und organspezifische Genexpression ist. Die Isoformen MIOX1 und MIOX2 ließen sich in nahezu allen Geweben nachweisen wogegen die Isoformen MIOX4/5 nur in den generativen Geweben aufzufinden waren. Es konnte eine deutliche Präsenz aller vier MIOX-Isoformen in den generativen Geweben nachgewiesen werden und die Nukleotidzucker, die während der Samenentwicklung benötigt werden, scheinen überwiegend über die MIOX zur Verfügung gestellt zu werden. So zeigen T-DNA-Insertionslinien von ΔMIOX1 & 2 eine reduzierte Schleimhülle um die Samen und eine erhöhte Ausfallrate bei der Samenentwicklung auf. Ansonsten zeigen die untersuchten T-DNA-Insertionslinien einen ähnlichen Wuchs wie der Wildtyp auf. Auch konnten keine Unterschiede über die durchgeführten Zellwandanalysen, mittels GC-MS, MALDI und Dionex-HPLC verifiziert werden, was durch die Redundanz der MIOX- und UGD-Isoformen erklärt werden könnte. Nichtsdestotrotz konnte bei den Isoformen ΔMIOX1 & 2 eine dramatische Reduktion beim Einbau von 3H-Inosit in Zellwandpolymere von Keimlingen verzeichnet werden, was einen klaren Beweis für eine funktionelle MIOX liefert, da in diesem Gewebe diese beiden Isoformen die einzig aktiven sind. Außerdem konnten über Promotor-Deletions-Analysen potentielle cis-Elemente für die Promotoren von MIOX2 und MIOX4 aufgedeckt werden.
In der vorliegenden Arbeit konnte die β-Carotin-Ketolase aus dem Cyanobakterium Synechocystis PCC 6803 nach heterologer Expression in E. coli gereinigt und enzymatisch charakterisiert werden. Die Funktion der β-Carotin-Ketolase wurde in vivo durch Komplementierung von β- Carotin-produzierenden E. coli-Transformanten überprüft. Die β-Carotin-Ketolase agierte hier auch als Diketolase und synthetisierte sowohl Echinenon als auch Canthaxanthin. Untersuchungen der Substratspezifität der β-Carotin-Ketolase in vivo und in vitro ergaben, daß nur Carotinoide erkannt werden, die einen β-Iononring ohne Hydroxygruppe in Position C3 aufwiesen. So wurden die Carotinoide β-Carotin, Echinenon, β-Cryptoxanthin und α-Carotin als Substrate erkannt und zu Echinenon, Canthaxanthin, 3’-Hydroxyechinenon und 4-Keto-α-Carotin umgesetzt. Zeaxanthin, 3’-Hydroxyechinenon, 4-Ketozeaxanthin sind keine Substrate der β-Carotin-Ketolase. Die β-Carotin-Ketolase kann einen ε-Iononring, wie in α-Carotin, nicht modifizieren. Die β-Carotin-Ketolase mit einer apparenten Molmasse von 61 kDa wurde durch pPQE30crtO und pPEU30crtO als rekombinantes Polypeptid mit sechs N-terminalen Histidinen in E. coli heterolog exprimiert. Die kinetischen Parameter der β-Carotin-Ketolase konnten in in vitro-Enzymaktivitätstests bestimmt werden. Der KM-Wert für das Substrat β-Carotin lag bei 41,6 μM und der dazugehörende Vmax-Wert bei 1,318 μmol mg-1 h-1. Für das Substrat Echinenon wurde ein KM-Wert von 35,3 μM und ein Vmax-Wert von 0,339 μmol mg-1 h-1 ermittelt. Die Spezifität der β-Carotin-Ketolase war für β-Carotin dreimal höher als für Echinenon. Es konnte keine Kofaktorabhängigkeit nachgewiesen werden, aber eine starke Abhängigkeit der β-Carotin-Ketolase von molekularem Sauerstoff. Die Zugabe des Detergenz Nonidet P-40 in in vitro-Enzymaktivitätstests erhöhte die enzymatische Aktivität der β-Carotin-Ketolase deutlich. Durch die Metallionen-Affinitätschromatographie konnte das Enzym annährend zur Homogenität (93%) unter Erhalt seiner enzymatischen Aktivität gereinigt werden. Dabei blieb die enzymatische Aktivität der β-Carotin-Ketolase nicht nur erhalten, sondern steigerte sich im Vergleich zur Aktivität in der cytosolischen Fraktion um den Faktor 4,5. Die funktionelle Expression der β-Carotin-Ketolase in höheren Pflanzen Nicotiana tabacum, N. tabacum CrtZ Linie U3, N. glauca und Solanum tuberosum Baltica 47-18 erfolgte unter der Kontrolle des konstitutiven CaMV 35S-Promotors. Außer in der Transformante N. glauca CrtO schien die Integration der Ketolase in das Genom der Pflanzen und die Expression von CrtO die Fitness der Transformanten, gemessen am Chlorophyllgehalt und der photosynthetischen Effizienz, nicht negativ beeinflußt zu haben. Der Gesamtcarotinoidgehalt in den Blättern von N. tabacum CrtO und N. tabacum CrtZ Linie U3 CrtO änderte sich trotz der Integration des crtO-Gens kaum im Vergleich zu den Wildtypen. In Blättern von S. tuberosum Baltica 47-18 CrtO konnte eine leichte Erhöhung des Gesamtcarotinoidgehaltes beobachtet werden. Dagegen kann es in Blättern von N. glauca CrtO zu einer Verdoppelung des Carotinoidgehaltes bei gleichzeitig halbiertem Chlorophyllgehalt. In den Blättern akkumulierten Ketocarotinoide mit Anteilen von 5% in N. tabacum CrtO, 12% in S. tuberosum Baltica 47-18 CrtO, 18% in N. tabacum CrtZ Linie U3 CrtO und 16-33% in N. glauca CrtO. Die Anteile der synthetisierten Ketocarotinoide setzten sich in den Blättern von N. tabacum CrtO und N. tabacum CrtZ Linie U3 CrtO aus Echinenon, 3’-Hydroxyechinenon und Ketolutein zusammen, während in Blättern von N. glauca CrtO und S. tuberosum Baltica 47-18 CrtO Echinenon, 3’-Hydroxyechinenon und 4-Ketozeaxanthin enthalten waren. In Nektarien von N. tabacum CrtO und N. tabacum CrtZ Linie U3 CrtO wurde der Gesamtcarotinoidgehalt verdoppelt bis verdreifacht im Vergleich zu den Nektarien des entsprechenden Wildtyps. Es akkumulierten Echinenon, 3’-Hydroxyechinenon, 4-Ketozeaxanthin und Ketolutein. Dabei enthielten die Nektarien von N. tabacum CrtZ Linie U3 CrtO die meisten Ketocarotinoide. Die Nektarien von N. glauca CrtO enthielten deutlich weniger Ketocarotinoidanteile, obwohl der Gesamtcarotinoidgehalt fast dreimal so hoch ist wie in N. tabacum CrtO und N. tabacum CrtZ Linie U3 CrtO. Es akkumulierten nur Echinenon, 3’-Hydroxyechinenon und Ketolutein. Die anderen Blütenorgane von N. glauca CrtO wiesen deutlich höhere Anteile an Ketocarotinoiden auf, zeigten aber wie die Nektarien gegenüber dem Wildtyp keine deutlichen Unterschiede im Gesamtcarotinoidgehalt. Für die Synthese von Astaxanthin war eine Interaktion zwischen der β-Carotin-Hydroxylase und der β-Carotin-Ketolase von entscheidender Bedeutung. Die Akkumulation von „Intermediaten“ der Astaxanthin-Biosynthese in N. tabacum CrtO, N. tabacum CrtZ Linie U3 CrtO und N. glauca CrtO wies auf eine erfolgreiche Interaktion hin. Einzig in den Knollen der CrtO-Transformanten von S. tuberosum Baltica 47-18 konnte Astaxanthin mit einem Anteil von 2% am Gesamtcarotinoidgehalt nachgewiesen werden. Die Nektarien N. tabacum CrtZ Linie U3 CrtO erwiesen sich neben den Knollen als am besten für die Produktion von ketolierten und hydroxylierten Carotinoiden. Die Transformation von N. glauca mit einem Gen der Carotinoidbiosynthese wurde in der vorliegenden Arbeit erstmals durchgeführt, zeigte aber nicht die erwartete Produktion größerer Mengen an Ketocarotinoiden in Kronblättern. Außerdem ist es in der vorliegenden Arbeit erstmals gelungen, in der Kartoffelknolle durch die Einführung einer cyanobakteriellen β-Carotin-Ketolase die Biosynthese von Ketocarotinoiden zu etablieren, um das für die Ernährung wichtige Ketocarotinoid Astaxanthin zu akkumulieren.
Background The reciprocal (9;22) translocation fuses the bcr (breakpoint cluster region) gene on chromosome 22 to the abl (Abelson-leukemia-virus) gene on chromosome 9. Depending on the breakpoint on chromosome 22 (the Philadelphia chromosome – Ph+) the derivative 9+ encodes either the p40(ABL/BCR) fusion transcript, detectable in about 65% patients suffering from chronic myeloid leukemia, or the p96(ABL/BCR) fusion transcript, detectable in 100% of Ph+ acute lymphatic leukemia patients. The ABL/BCRs are N-terminally truncated BCR mutants. The fact that BCR contains Rho-GEF and Rac-GAP functions strongly suggest an important role in cytoskeleton modeling by regulating the activity of Rho-like GTPases, such as Rho, Rac and cdc42. We, therefore, compared the function of the ABL/BCR proteins with that of wild-type BCR. Methods We investigated the effects of BCR and ABL/BCRs i.) on the activation status of Rho, Rac and cdc42 in GTPase-activation assays; ii.) on the actin cytoskeleton by direct immunofluorescence; and iii) on cell motility by studying migration into a three-dimensional stroma spheroid model, adhesion on an endothelial cell layer under shear stress in a flow chamber model, and chemotaxis and endothelial transmigration in a transwell model with an SDF-1α gradient. Results Here we show that both ABL/BCRs lost fundamental functional features of BCR regarding the regulation of small Rho-like GTPases with negative consequences on cell motility, in particular on the capacity to adhere to endothelial cells. Conclusion Our data presented here describe for the first time an analysis of the biological function of the reciprocal t(9;22) ABL/BCR fusion proteins in comparison to their physiological counterpart BCR.
Das sympathische Nervensystem entsteht aus Vorläuferzellen der Neuralleiste, die an die dorsalen Aorta gelangen und dort die primären sympathischen Ganglien bilden. Der Entwicklungsverlauf dieser Zellen hängt von den Signalen ab, welche sie während ihrer Wanderung empfangen. Die Differenzierung der Vorläuferzellen wird an der dorsalen Aorta angeregt. Als Signalmoleküle dienen die BMPs, die von der dorsalen Aorta gebildet und sezerniert werden. Die BMPs induzieren in den Vorläuferzellen die Expression der Transkriptionsfaktoren Mash1, Phox2b, Hand2 und Phox2a, die notwendig für den weiteren Differenzierungsprozess sind. Diese Transkriptionsfaktoren steuern direkt oder indirekt die Expression der terminalen Differenzierungsgene TH, DBH, SCG10 und NF160. In der vorliegenden Arbeit wird gezeigt, dass die Zink-Finger-Transkriptionsfaktoren Gata2 und Gata3 ebenfalls eine essentielle Funktion in der Entwicklung sympathischer Neurone ausüben. Im Huhnembryo wird, im Gegensatz zur Situation in der Maus, in den sympathischen Vorläuferzellen nur Gata2 exprimiert. Gata2 wird nach den Transkriptionsfaktoren Mash1, Phox2b, Hand2 und Phox2a, jedoch vor den noradrenergen Markergenen TH und DBH exprimiert. Die Expression von Gata2 ist BMP-abhängig, wie durch BMPÜberexpression und BMP-Funktionsblockierung gezeigt wird. Die Überexpression von Mash1, Phox2b und Hand2 in Vorläuferzellen führt zur Expression von Gata2. In der Phox2b-Nullmutante sind Gata2 und Gata3 nicht exprimiert. Damit ist Gata2/3 unterhalb von Mash1, Phox2b und Hand2 in der BMP-induzieren Signalkaskade einzuordnen. Die Funktionsblockierung von Gata2 im Huhnembryo und die Eliminierung des Gata3-Gens in der Maus ergaben eine starke Reduktion in der Größe der sympathischen Ganglien. Zusätzlich war die Expression des noradrenergen Markergens TH stark reduziert. Die Überexpression von Gata2 in Neuralleistenvorläuferzellen führt vorwiegend zur Entstehung von Neuronen, die keine autonomen Eigenschaften aufweisen und TH-, Phox2b- und Mash1-negativ sind. Die vorliegenden Ergebnisse zeigen, dass Gata2 im Huhn und Gata3 in der Maus Mitglieder des regulatorischen Netzwerks von Transkriptionsfaktoren sind, das essentiell für die Entwicklung sympathischer Neurone ist. Die Funktion der Gata-Faktoren in der noradrenergen Differenzierung autonomer sympathischer Neurone scheint jedoch von der Interaktion mit Koregulatoren abhängig zu sein, die in sympathischen Vorläuferzellen vorhanden sind. In Vorläuferzellen, welche diese Kofaktoren nicht erhalten, induziert Gata2 nahezu ausschließlich nicht-adrenerge Neurone. Gata2 könnte mit Phox2a/b und Hand2 interagieren, oder mit anderen unbekannten Faktoren die in den sympathischen Vorläuferzellen exprimiert sind. Die Entwicklung sympathischer und parasympathischer Neurone wird von BMPs sowie von den Transkriptionsfaktoren Mash1 und Phox2b gesteuert. Der Differenzierungsprozess in sympathischen und parasympathischen Ganglien führt zu unterschiedlichen Transmitterphänotypen. Sympathische Ganglien bestehen vorwiegend aus noradrenergen, parasympathische Ganglien dagegen aus cholinergen Neuronen. Hand2 wird in sympathischen Neuronen und nicht in parasympathischen Ziliarneuronen exprimiert und gilt als Transkriptionsfaktor der den noradrenergen Transmitterphänotyp spezifiziert. In der vorliegenden Arbeit wird gezeigt, dass auch die Transkriptionsfaktoren Gata2/3 nicht in parasympathischen Ziliarganglien exprimiert werden. Die Expressionsanalysen an mehreren parasympathischen Ganglien zeigte jedoch, dass die Expression von Gata2/3- nicht vollständig mit der noradrenergen Genexpression korreliert. Die Analyse der Gata2/3- Expression im Locus ceoruleus, dem wichtigsten noradrenergen Zentrum im Gehirn ergab, dass Gata2 und Gata3 im LC des Huhnembryos nicht exprimiert werden. Die Expression von Gata2/3 hängt somit nicht zwingend mit den noradrenergen Phänotyp zusammen. Die selektive Funktion von Gata2/3 in der Entwicklung peripherer noradrenerger Neurone zeigt zudem, dass der noradrenerge Phänotyp in den peripheren und zentralen Neuronen unterschiedlich reguliert wird.
Der Einfluss von Stress auf einen Organismus führt zur Expression molekularer Chaperone unterschiedlichster Hitzestressprotein-(Hsp)-Familien, die die Zellen vor stressbedingten Schäden schützen. Mitglieder der Hsp2O-Familie (kurz small Hsps, sHsps) besitzen ein Molekulargewicht von 12-43 kDa und sind durch einen zentralen, evolutiv konservierten Bereich, der als alpha-Crystallin-Domäne (ACD) bezeichnet wird, gekennzeichnet. Diese besteht größtenteils aus beta-Strängen, während die flankierenden Bereiche hingegen variabel in Länge, Sequenz sowie Sekundärstrukturen sind. sHsps bilden mit Hilfe der Sekundärstrukturen oligomere Komplexe aus. Darüber hinaus besitzen sie eine ATP-unabhängige Chaperonaktivität und spielen beim Schutz thermosensitiver Proteine eine wichtige Rolle. In Pflanzenzellen führt ein anhaltender Hitzestress zur Ansammlung von sHsps zu so genannten Hitzestressgranula (HSGs), die sich wiederum zu größeren HSG-Komplexen (HSCs) organisieren. Eine mögliche Funktion von HSCs ist der Schutz zellulärer denaturierter Proteine vor einer irreversiblen Aggregation. Durch deren Bindung mittels sHsps und Eingliederung in den HSC-Verband werden die denaturierten Proteine in einem faltungskompetenten Zustand gehalten. Schließlich können die mit den HSCs assoziierten ATP-abhängigen Hsp-Maschinen (z.B. Hsp70/40, Hsp100) die sHsp-gebundenen Substrate renaturieren. Wie in der vorliegenden Arbeit dargestellt, weisen Pflanzen die höchste soweit bekannte Anzahl von sHsp-Genen auf. Die korrespondierenden Proteine werden anhand ihrer Primärsequenz und subzellulären Lokalisation in verschiedene Klassen eingeteilt: sHsps der Klassen CI und CI1 befinden sich im nucleo-cytoplasmatische Raum, sHsps der Klasse M in Mitochondrien, der Klasse P in den Plastiden und der Klasse ER im endoplasmatischen Reticulum sowie im Golgi-Apparat. Da das Genom von Arabidopsis thaliana das erste komplett sequenzierte pflanzliche Genom ist, eignete sich dieser Modelorganismus zur Identifikation aller sHsp kodierenden Gene. Der Einsatz von Protein- und Nukleotidsequenzen bereits bekannter pflanzlicher sHsps als Suchkriterium in der NCBI-Datenbank (BLASTP und BLASTN), ergab die ldentifikation 19 putativer sHsp kodierender Gene, von denen erstaunlicheweise 13 bislang noch nicht bekannt waren. Proteinsequenzvergleiche ergaben, dass 7 der neu entdeckten sHsps nicht den typischen Klassen zugehörig sind. Dies bildete den Ausgangspunkt für deren nähere Analyse und Charakterisierung im Rahmen des ,,Functional Genomics": (1) Lokalisationsstudien I: Myc-Epitop markierte sHsp-Konstrukte wurden transient in Tabak-Mesophyllprotoplasten transformiert. Über Lokalisationsstudien per lmmunfluoreszenz konnten diese Proteine in tatsächlich 7 neu definierte sHsp Klassen eingeteilt werden. Interessanteweise werden die Vertreter dieser neuen Klassen von jeweils nur einem Gen kodiert. Die Vertreter der Klassen CI11 bis CVII lokalisieren im nucleo-cytoplasmatischen Kompartiment. Ferner bewiesen die Kodetektionen von organellären Markerproteinen, dass Klasse MII sHsps in die Mitochondrien und Mitglieder der Klasse Po in die Peroxisomen transportiert werden. Dies stimmte überein mit der Vorhersage von organellären Signalsequenzen. (2) Lokalisationsstudien II: Frühere Studien zeigten, dass sHsps der Klassen CI und CII unter Hitzestressbedingungen HSCs ausbilden. Wahrscheinlich fungieren Klasse CII sHsps als Grundgerüst für die HSC-Bildung und rekrutieren sHsps der Klasse CI in diese Multichaperonkomplexe. Die Proteine (Myc-markiert) Hsp17.4-CIII, Hsp15.4-CIV, Hsp18.5-CVI und Hsp14.7-CVII wurden unter Hitzestressbedingungen in endogene HSCs von Tabak-Mesophyllprotoplasten eingegliedert. Dieses Phänomen bleibt auf die genannten sHsp Klassen beschränkt, da weder Hsp21.7-CV, noch die organellären Proteine Hsp26.5-MI1 sowie Hsp15.7-Po in HSCs detektiert wurden. (3) Das sHsp-lnteraktom: Im Gegensatz zu früheren Studien, konnte in der vorliegenden Arbeit eine lnteraktion zwischen sHsps verschiedener Klassen zum ersten Mal im Hefe-Zwei-Hybrid-System sowie über Pull-down und nativer SDS-Gelelektrophorese detektiert werden. Am Beispiel eines Klasse CIII sHsps wurde gezeigt, dass die lnteraktion mit sHsps anderer Klassen zu einer Heterooligomerisierung führt. Dies wiederum hat eine nachhaltige Beeinflussung der intrazellulären Lokalisation der sHsps zur Folge. (4) Darüber hinaus ist für sHsps der Klasse CIII typisch, dass sie aufgrund einer Kernlokalisationssequenz innerhalb der ACD in den Nukleus transportiert werden. Im Vergleich zu sHsps der Klassen CI und CII, die Oligomere Strukturen von 220-230 kDa ausbilden, assemblieren sHsp-Monomere der Klasse CIII zu hochmolekularen Komplexen im Bereich von 1 MDa. (5) Das sHsp-Transkriptom: Durch RT-PCR-Analysen und Auswertung der öffentlich zugänglichen Microarray-Daten des AtGenExpress Konsortiums, konnte die Expression aller sHsps kodierenden Gene im Arabidopsis Genom auf transkriptioneller Ebene analysiert werden. Es zeigte sich, dass neben Hitzestress auch der Einfluss anderer abiotischer Stressoren, wie U. a. oxidativer stress und UV-B Bestrahlung, zu einer Akkumulation von sHsp-Transkripten führt. Ferner werden einige sHsps in bestimmten Entwicklungsstufen bzw. Organen, wie z.B. Blüten, Blättern und Samen, unabhängig von Stresseinflüssen exprimiert. (6) Funktionelle Analysen: Ein seminatives in vitro Chaperontestsystem, in dem Luciferase als thermosensitives Modelsubstrat eingesetzt wird, wurde herangezogen, um ausgesuchte sHsps bezüglich ihrer möglichen Chaperonfunktion zu testen. In Abhängigkeit der rekombinant hergestellten Proteine Hsp18.5-CVI, Hsp26.5-MII und Hsp15.7-Po konnte eine verminderte Aggregation der Luciferase unter Hitzestresseinwirkung und eine darauf folgende erhöhte Renaturierung durch ATP-abhängige Chaperonmaschinen während einer Erholungsphase beobachtet werden. (7) Peroxisomale sHsps: Da nie zuvor über peroxisomale sHsps berichtet wurde, nahm Hsp15.7-Po eine besondere Rolle bei den Untersuchungen ein. Dieses Protein besitzt eine putative peroxisomale Lokalisationssequenz (PTS) am C-Terminus, bestehend aus der Abfolge der Aminosäurereste SKL (PTS1). Durch Hefe-Zwei-Hybrid-Studien und lmmunfluoreszenzanalysen (in Tabak-Mesophyllprotoplasten und Säugerzellen) sowie den Einsatz von Mutanten wurde demonstriert, dass die PTS1 tatsächlich für die lnteraktion von Hsp15.7-Po mit den TPR-Domänen des peroxisomalen Importrezeptors Pex5 und für die peroxisomale Lokalisation des sHsps verantwortlich ist. Ein Hefe-Zwei-Hybrid-Screening nach möglichen lnteraktionspartnern von Hsp15.7-Po lieferte den ersten Anhaltspunkt für die lnteraktion mit cytoplasmatischen sHsps (Hspl7.7-CII). Dies ließ sich durch Pull-down-Analysen bestätigten und auf Hsp17.6-CII erweitern. Diese Interaktionen beeinflussten jedoch nicht die subzelluläre Lokalisation der jeweiligen Proteine bei Koexpression in Tabak-Mesophyllprotoplasten. All die hier dargestellten Ergebnisse weisen auf diverse Funktionen der einzelnen neu identifizierten sHsps der unterschiedlichen Klassen hin und bilden die Grundlage für zukünftige, detaillierte in planta Untersuchungen, die hierdurch erleichtert werden können.
Im Gegensatz zu den Arbeiterinnen der sozial lebenden Wespen und Bienen sind alle Ameisen flügellos. Die Flügellosigkeit der Ameisenarbeiterinnen bedingt, dass selbst kleinste Räume in der Erde oder in Holz von Kolonien besiedelt werden können. Sie war eine wichtige Voraussetzung für ihre Vorherrschaft auf dem Boden. Die für bodennistende Arten als Baumaterial in Frage kommende Erde hat jedoch die Eigenschaft, dass z. B. starke Regenfälle die Stabilität der Bauwerke negativ beeinflussen können. Deshalb und weil Erde in den höheren Regionen des Laubdaches schwierig zu beschaffen ist, sind Erdnester für den Übergang zum Leben in den Baumkronen wenig geeignet. Höhlungen in verrottendem Holz stehen aufgrund der schnellen Zersetzung in den Tropen nur für einen relativ kurzen Zeitraum und wenig regelhaft zur Verfügung. Der dadurch vorherrschende Mangel an Nistraum im tropischen Regenwald ist möglicherweise der wichtigste Faktor der Koloniegrößeregelung bei Ameisen. Erst mit dem Übergang zu aktivem Freinestbau ist es den Ameisen gelungen, sich (i) unabhängig von natürlichen Höhlen zu machen und dadurch große Kolonien zu etablieren, (ii) den Kronenraum als Habitat dauerhaft zu erschließen, (iii) negativen Witterungseinflüssen entgegenzuwirken und (iv) vorhandene Nahrungsressourcen in diesem Stratum permanent zu nutzen. Die in der vorliegenden Arbeit untersuchten freinestbauenden Ameisen sind selbst in der Lage, additiv Nistraum zu schaffen. Die Vertreter dieser Gilde legen ihre Nester nicht in der Erde oder in natürlichen oder selbst ,ausgeräumten-- Hohlräumen von Bäumen an, sondern konstruieren aktiv frei in der Laubregion der Holzgewächse Nisträume bzw. Unterstände, indem sie Material zusammentragen oder herstellen, mit dem eine Abschottung des Brut- und Nahrungsraumes gegenüber der Umwelt erreicht wird. Die erfolgreiche Besiedlung der Kronenregion war den Ameisen nur durch veränderte Bautechniken und eine verbesserte und angepasste Materialverwendung möglich. Gegenstand der vorliegenden Dissertation war zunächst die Bestandsaufnahme der freinestbauenden Ameisen der Baumkronenregion südostasiatischer Regenwälder. Der erste Schritt einer Analyse der Freinestkonstruktionen von Ameisen bestand darin, die Vielfältigkeit der verwirklichten Nestformen zu erfassen und darzustellen, Gemeinsamkeiten und Unterschiede herauszuarbeiten und die beteiligten Ameisenarten zu identifizieren. Im zweiten Teil der Arbeit wurden intensiv die proximaten Mechanismen des aktiven Nest- und Pavillonbaus untersucht. Dazu wurden die einzelnen Schritte der Nestentwicklung für sieben Ameisenarten aus sechs Gattungen in allen Details dargestellt und zusammenfassend beschrieben. Es wurde ermittelt, welche Baumaterialien die verschiedenen Ameisen nutzen und wie diese Materialien verwendet werden. Zur Bestimmung der verschiedensten Nesttypen wurden neben architektonischen Unterschieden auch Differenzen in der Substratwahl, Materialbeschaffenheit und in der Funktion der Nestkonstruktionen berücksichtigt. Als weiteres Kriterium zur Klassifikation arborealer Nestanlagen diente die Verschiedenartigkeit der Materialbearbeitung und der Substratvorbereitungen durch die Ameisen. Einige dieser Nestcharakteristika sind quantitativer, andere qualitativer Natur. Im Verlauf der Untersuchung wurden 1767 Kolonien bearbeitet und eingeordnet. Davon konnten insgesamt 100 Arten bzw. Morphospezies bestimmt und als echte Freinestbauer im Sinne der vorher formulierten Definition charakterisiert werden. Die ermittelten Arten verteilten sich auf acht Gattungen aus den drei Unterfamilien Formicinae, Dolichoderinae und Myrmicinae. Diese drei Unterfamilien gelten als die am weitesten entwickelten Ameisen und dominieren in der Kroneregion tropischer Regenwälder. Auffallend an dieser höher entwickelten Gruppe von Ameisen ist die Tendenz, pflanzliche Produkte als Hauptnahrungsressource zu nutzen. Die artenreichste Gattung Polyrhachis (39 Arten) gehört der Unterfamilie Formicinae an; zusammen mit den Gattungen Camponotus (10) und Oecophylla (1) wurden allein 50 Arten aus dieser Unterfamilie gefunden. In der Gattung Camponotus konnten zwei Untergattungen (C. Karavaievia, C. Myrmotarsus) mit freinestbauenden Arten ermittelt werden. Mit 29 identifizierten Arten aus drei Gattungen stellten die Myrmicinae die zweitgrößte Unterfamilie, wobei allein 23 Arten auf die Gattung Crematogaster entfielen. In den beiden anderen Myrmicinen-Gattungen Monomorium (5 Arten) und Myrmicaria (1 Art) fanden sich nur vergleichsweise wenige Vertreter mit Freinestbau. Die dritte Unterfamilie, die Dolichoderinae, wird durch die Gattungen Dolichoderus und Technomyrmex mit zusammen 21 Arten repräsentiert. Die als Freinestbauer ermittelten Ameisenarten zeigen hinsichtlich ihrer Koloniestruktur und Nestorganisation einige nennenswerte Parallelen. Die Mehrzahl der Arten lebt in polydomen Kolonieverbänden, die ihre manchmal mehr als 200 Nestanlagen meist nur auf eine einzelne oder wenige Nestpflanzen verteilen. In den Gattungen Camponotus und Monomorium sind alle Arten polydom organisiert, bei Dolichoderus und Technomyrmex sind es 90 % und bei Crematogaster 70 %. Polydomie findet man auch bei Myrmicaria arachnoides und Oecophylla smaragdina. Als weitere Gemeinsamkeit fällt ins Auge, dass mit Ausnahme von Myrmicaria arachnoides und Polyrhachis spp. funktionell als Stallnester zu charakterisierende Nestkonstruktionen überwiegen. Insbesondere bei Technomyrmex (100 %), Dolichoderus (100 %), Camponotus (70 %), Crematogaster (82 %), aber auch bei Monomorium (100 %) und Oecophylla smaragdina besteht eine ausgeprägte Tendenz, die Honigtau liefernden Trophobionten und die Brut in denselben Bauten unterzubringen. Bei den meisten Arten besteht somit ein enger Zusammenhang zwischen Freinestbau und trophobiotischer Ernährungsweise. Diese enge räumliche Vereinigung von Nahrungs- und Nistressourcen bildet die Basis für die Entwicklung individuenreicher, konkurrenzstarker und ökologisch dominanter Ameisenarten in der Kronenregion. Insgesamt wurden 22 unterscheidbare Nesttypen ermittelt und in allen Einzelheiten dargestellt. Auf 47 Bildtafeln wurden dazu fotografisch und zeichnerisch die Charakteristika der verschiedenen Nesttypen hinsichtlich der Nestarchitektur und ethologischer Besonderheiten der beteiligten Ameisenarten abgebildet. Während die Anzahl der freinestbauenden Ameisenarten sicherlich nur annähernd erfasst werden konnte, ist bei der Darstellung der verschiedenen Nesttypen zu erwarten, dass die erfolgreichsten, auf der Basis ethoökologischer sowie material- und substrattechnischer Unterschiede ermittelten Erscheinungsformen aufgeklärt werden konnten. Die vorgenommene Unterteilung der Hauptkategorie ,Nestsubstrat-- in drei blattgebundene und zwei stammgebundene Unterkategorien zeigte, dass die zweifach geschützte und materialsparende Position zwischen Blättern, von zusammen 13 Arten aus den Gattungen Polyrhachis (6), Camponotus (Karavaievia) (2), Oecophylla (1) und Crematogaster (3) präferiert wurde. Nester auf der vergleichsweise ungeschützten Blattoberseite wurden nur von Arten der Gattung Polyrhachis gebaut. Die bevorzugte Position der Polyrhachis-Nester war auf der Blattunterseite, 67 % aller Polyrhachis Nester waren dort lokalisiert. Die Nester der Untergattung Camponotus (Karavaievia) waren zu 75 % und die von Technomyrmex, Monomorium und Myrmicaria gar zu 100 % auf der Blattunterseite angebracht. Zusammen betrachtet waren 64 % aller im Rahmen der vorliegenden Arbeit aufgenommenen Nestbauten auf der Unterseite einzelner Blätter zu finden. Von allen Nestbauten auf Stamm- und Astoberflächen waren 75 % von Crematogaster-Arten besiedelt. Diese Nestposition konnte ansonsten nur noch bei zwei Polyrhachis-Arten und bei der mit Epiphyten assoziierten Camponotus (Myrmotarsus) gefunden werden. Je nach Anteil der hauptsächlich verarbeiteten Baustoffe kann man in vier Nestmaterialtypen unterteilen: (i) Nester aus toten pflanzlichen Materialien, (ii) Pilznester, (iii) Seidennester und (iv) Wurzelnester (Ameisengärten). Am häufigsten vertreten waren die aus Larvalseide gefertigten Webenester der Gattungen Polyrhachis, Camponotus (Karavaievia) und Oecophylla; insgesamt 45 % aller Funde gehörten zu dieser Materialgruppe. Fremde Seide konnten neben drei Polyrhachis-Arten auch drei Arten aus der Gattung Dolichoderus verarbeiten. Bemerkenswert ist der hohe Anteil pilzbewachsener Nestbauten. In allen drei Unterfamilien fanden sich Arten, die zu unterschiedlichen Teilen Pilze in ihren Nestern hielten. In der Gattung Technomyrmex waren 70 % aller älteren Nester vollständig aus Pilzhyphen gebildet. Mehr als die Hälfte des Nestmaterials von Monomorium-Nestern bestand ebenfalls aus einem dichten Pilzmyzel. Pilze bildeten auch in den Nestern von einigen Arten der Gattungen Dolichoderus, Crematogaster und Camponotus (Myrmotarsus) die maßgebliche Materialkomponente. Folgt man der bisher verwendeten Begriffsdefinition, die arboreale Ameisennester in der Regel nach den hauptsächlich verwendeten Baumaterialien einteilt, so muss man zu den bislang bekannten Karton- und Seidennestern die dritte Gruppe der Pilznester hinzufügen. Die Wahl des jeweiligen Baumaterials wirkt sich direkt auf die angewandten Bearbeitungsmechanismen und die Art und Weise der Nestfixierung und Neststabilisierung aus. Die Vertreter der Myrmicinen-Gattungen Myrmicaria und Monomorium zeigten in der Materialnutzung sowie bei der Stabilisierung und Fixierung der Konstruktionen gattungsspezifische Eigenheiten. Die Festigung der Nestbauten werden über H- Brückenstabilisierung (Myrmicaria) und Trichomstabilisierung (Monomorium) erreicht. Pilzhyphenstabilisierte Nester bauen Vertreter der Gattungen Technomyrmex, Dolichoderus und Crematogaster. Wobei innerhalb der beiden letztgenannten Gattungen noch eine Reihe weiterer Fixierungsmechanismen auftreten können. Bei Dolichoderus und Crematogaster sind die Methoden der Materialverfestigung sehr vielfältig und haben jeweils eine große Radiation erfahren (Stabilisierung durch Fremdseide, Pilze, Wurzeln und Klebstoff). Den Camponotus-Arten war die Eroberung der Baumkronenregion mit Hilfe von wurzelstabilisierten Ameisengärten (C. (Myrmotarsus)) und mit der Verwendung klebriger Larvalseide (C. (Karavaievia)) möglich. Beschränkt auf Seide zur Nestfixierung sind die Arten der Gattungen Oecophylla und Polyrhachis. Das bestimmende Element in der Nestarchitektur von fast allen Ameisennestern ist die Bogenkammer oder der Bogengang. Die innere Architektur von Oecophylla-Nestern weicht praktisch als einzige von dieser weit verbreiteten ,Bogenkammer-Struktur-- ab. Bei allen anderen Ameisenarten sind die Nestkammern in der Höhendimension in etwa auf die Größe einer einzelnen Arbeiterin beschränkt. Wegen der kooperativen Zusammenarbeit vieler Arbeiterinnen bei Oecophylla wird die Korrelation von Kammerhöhe und Körpergröße in dieser Gattung aufgehoben. Morphologische Besonderheiten, die als Anpassung an das Leben in Freinestern gedeutet werden könnten, konnten in der vorliegenden Arbeit bei keiner der untersuchten Arten festgestellt werden. Bei Bienen, Wespen und bei den Termiten wird überwiegend eine modellierende Bearbeitungstechnik angewandt. Die körpereigenen, flüssig-adhäsiven Substanzen (Wachs, Sekret und Kot) werden dazu oft noch mit Wasser verdünnt. Auch viele Ameisenarten verarbeiten wassergetränktes Material, nur einige wenige Vertreter der Gattung Crematogaster versetzen es allerdings mit klebenden Sekreten. Die durch das Baumaterial und dessen Fixierung am Substrat vorgegebene Verschiedenartigkeit der Bearbeitungstechniken hat bei den Ameisen zu sehr komplexen Verhaltensweisen geführt. So zum Beispiel das gezielte Verzahnen von Blatthaaren und das Verbinden von Baustoffen ohne die Zugabe von Leim. Weiter bearbeiten Ameisen Materialien, indem sie sie mit Fäkalien und anderen nährstoffreichen Substanzen düngen und so das Wachstum von Pilzhyphen und Wurzelfasern aktiv lenken. Die Seidenweber zeigen mit dem Verspinnen noch eine zusätzliche Möglichkeit der Materialbearbeitung bei Ameisen. Im Vergleich mit anderen sozialen Insekten findet man innerhalb der Ameisen eine mehr generalisierte Bautechnik, die möglicherweise variabler und effizienter ist als die Spezialisierung auf nur eine Materialkomponente. Generell sind die Freinestbauer, anders als die weitgehend deterministisch eingenischten obligaten Pflanzenameisen, bei der Auswahl des Nistplatzes nicht auf vorgegebene Hohlraumstrukturen (Domatien etc.) ganz bestimmter Pflanzen angewiesen, sondern erhöhen ihre Beweglichkeit in der Nistplatzwahl durch die Auswahl vergleichsweise häufig zu findender Substrattypen und Nestmaterialien. Bei allen untersuchten Freinestbauern konnte keine Spezialisierung auf eine bestimmte Pflanzenart festgestellt werden. Stochastische Besiedlungsprozesse gewinnen damit in dieser Ameisengilde, im Vergleich mit den myrmekophytischen Ameisenarten, an Bedeutung. In der vorliegenden Dissertation konnte erstmalig experimentell gezeigt werden, dass die bislang nur aus der Neotropis bekannten Ameisengärten auch im paläotropischen Faunengebiet zu finden sind. Die erstaunlichen Ähnlichkeiten zwischen neotropischen und paläotropischen Ameisengarten-Assoziationen deuten darauf hin, dass es in den unterschiedlichen tropischen Gebieten zu einer konvergenten und parallelen Entwicklung von ähnlich präadaptierten Ameisen und Pflanzen gekommen ist. Freinestbau ist mehrfach unabhängig voneinander entstanden. Sehr wahrscheinlich stand bei vielen Ameisen die Sicherung von Trophobiosestellen am Anfang der Entwicklung. Denkbar ist ebenso, dass die Vergesellschaftung von Epiphyten und Ameisen bei einigen Gruppen die Basis für die Evolution von Freinestbau war. Die Fertigung ausgedehnter Schutzbauten außerhalb der Nester, wie man sie beispielsweise bei der Myrmicinen-Gattung Pheidole findet, könnte ebenfalls die Evolution von frei gestalteten Nestern initiiert haben. Insgesamt wird deutlich, dass Konkurrenzvermeidung und die Erweiterung des Nistraum- und Nahrungsspektrums die drei bestimmenden Faktoren in der Evolution des Nestbauverhaltens von Ameisen waren. Anders als bei Wespen und Termiten fehlt den Ameisen jegliche Prädisposition für die Produktion von liquiden Klebesubstanzen. Sie haben vielfältige Wege gefunden, Wasser zum Nest zu transportieren und damit ihren Möglichkeiten entsprechende Verarbeitungs- mechanismen anzuwenden. Die fehlende gemeinsame Prädisposition der Ameisen für eine dauerhafte Fixierung von Baumaterialien, wie sie für freie Nestkonstruktionen notwendig ist, hat viele verschiedene Lösungen hervorgebracht und ist einer der Gründe für die hohe Variabilität der Freinestbauten bei Ameisen. Die in der vorliegenden Arbeit gezeigte variable Nistbiologie hat einen wichtigen Einfluss auf die Abundanzstrukturen tropischer arborealer Arthropodengemeinschaften und ist in hohem Maße für den großen Erfolg der Ameisen in diesem Habitat verantwortlich.
Hypoxie entsteht, wenn das Sauerstoffangebot bzw. die Sauerstoffversorgung unter ein Niveau sinkt, das benötigt wird, um physiologische O2-Drücke des betreffenden Gewebes aufrecht zu erhalten. Sinkt der Sauerstoff-Partialdruck, so werden adaptive Mechanismen aktiviert. Neben der Anpassung durch das kardiovaskuläre System werden auch verschiedene Gene aktiviert. Die Forschung der letzten Jahre hat gezeigt, dass Hypoxieinduzierte Genexpression insbesondere von zwei Transkriptionsfaktoren, HIF (hypoxia inducible factor) -1 und -2 , gesteuert wird. Man kennt über 70 Gene, die von HIF transaktiviert werden. Dabei handelt es sich um Modulatoren von Angiogenese und Vasodilatation, Erythropoese sowie der Umstellung des Stoffwechsels von oxidativer Phosphorylierung auf Glykolyse. Die Hypoxie-induzierbare Genexpression wird sowohl über eine Steigerung der Transaktivierungsaktivität als auch der Proteinmenge der HIF- -Untereinheiten reguliert. Die Regulation der HIF-Proteinmenge erfolgt über eine vom O2-Partialdruck abhängige Stabilisierung der -Untereinheit des Proteins. Unter normoxischen Bedingungen wird das Protein durch die Prolylhydroxylasen (PHD) O2-abhängig hydroxyliert, pVHL-vermittelt (VHL = von Hippel-Lindau), ubiquitiniert und proteosomal abgebaut. Unter hypoxischen Bedingungen dagegen wird das Protein stabilisiert, akkumuliert im Zellkern und bindet an eine spezifische Zielsequenz, das Hypoxia-responsive element oder HRE, imPromotor von Hypoxie-aktivierten Genen. Die PHDs gehören zu einer Familie von Eisen- und 2-Oxoglutarat-abhängigen Dioxygenasen. Neben diesen Faktoren wird eine Regulation von HIF durch Sauerstoffradikale (ROS, reactive oxygen species) in der Literatur sehr kontrovers diskutiert, da die Wirkung von ROS auf HIF sich unter Normoxie, Hypoxie oder dem Einfluss von Wachstumsfaktoren unterscheidet. Im Rahmen dieser Arbeit sollte die Frage, welche Rolle die PHDs bei der ROS-vermittelten HIF-Regulation spielen, beantwortet werden. Der zugrunde liegende Mechanismus wurde anhand von Glioblastom-Zelllinien untersucht. Die vorliegende Arbeit zeigt eine Stabilisierung von HIF nach Verringerung der ROS-Konzentration unter Normoxie. Eine Erhöhung der ROS-Konzentration führt dagegen zu einer dosisabhängigen Verminderung von HIF und der HIF-Targetgen-Expression. Es konnte eine direkte Abhängigkeit der Destabilisierung von VHL und den Prolylhydroxylasen gezeigt werden, da sowohl eine VHL-Defizienz als auch eine Mutation der Prolylreste oder eine Inhibition der PHDs zu einer Aufhebung des Effekts führen. Eine vergleichbare destabilisierende Wirkung auf HIF übt Ascorbat aus. Überraschenderweise führt sowohl die Zugabe von H2O2 mit seiner oxidativen Wirkung als auch die Zugabe des Reduktionsmittels Ascorbat zu einer Erhöhung des intrazellulären Fe2+-Gehaltes. Dieser Befund kann durch eine Aktivierung von Enzymen mit eisenreduzierenden Eigenschaften erklärt werden. Im Rahmen dieser Arbeit wurde die Proteinfamilie der Ferrireduktasen (FR) identifiziert und fünf Enzyme, die eine Homologie zur cytb561-Domäne aufweisen, kloniert. Eine detaillierte Charakterisierung zeigte, dass die Enzyme tatsächlich eine eisenreduzierende Aktivität aufweisen, die durch die exogene Zugabe von ROS noch erhöht wird. Eine Überexpression der FR führt zu einem erhöhten Abbau von HIF. Ein knock down mittels siRNA führt dagegen zu einer Akkumulation von HIF und die destabilisierende Wirkung von ROS ist nach einemknock down der FR deutlich reduziert. Aufgrund der in dieser Doktorarbeit gezeigten Daten kann folgendes Modell aufgestellt werden: Die primäre oxidative Wirkung von ROS führt vermutlich zu einer Aktivierung der Ferrireduktasen, die in Abhängigkeit von Ascorbat dann vermehrt Eisen reduzieren, so dass dies den PHDs als Substrat zur Verfügung steht. Der regulierende Einfluss auf HIF wird somit vermutlich über eine erhöhte Aktivität der Prolylhydroxylasen durch eine Erhöhung des intrazellulären Fe2+-Gehaltes vermittelt. Die erhobenen Daten deuten an, dass die Familie der Ferrireduktasen ein zentrales Bindeglied im O2-Sensing darstellt, das in Abhängigkeit von Redox-Signalen homeostatische Antworten auf Hypoxie moduliert.
Hitze-Stress-Transkriptionsfaktoren (Hsfs) stellen die zentralen regulatorischen Komponenten einer Signal-Transduktionskette dar, welche die Aktivierung von Hitze-Stress-induzierbaren Genen bewirken. Die Sequenzierung des Genoms von Arabidopsis thaliana (Arabidopsis) führte zu der Entdeckung von 21 Genen, die für putative Hsfs codieren. Aufgrund struktureller Charakteristika und phylogenetischer Analysen wurden die 21 Hsfs in die Klassen A, B und C aufgeteilt. Der Hauptteil der vorliegenden Arbeit beschäftigt sich mit der funktionellen Charakterisierung der Hsf Familie aus Arabidopsis. Um generelle Konzepte zur Funktion von pflanzlichen Hsfs als Aktivatoren zu unterstützen, wurden als Ausgangspunkt ausgewählte Hsfs aus Lycopersicon peruvianum (Tomate) zu detaillierten Analysen herangezogen. Hsfs besitzen, ähnlich anderen Transkriptions -aktivierenden Proteinen, eine modulare Struktur. In der vorliegenden Arbeit wurden funktionelle Module der 21 Arabidopsis Hsfs untersucht, die für den Oligomerisierungs-Zustand, die intrazelluläre Lokalisation sowie das Transkriptions-aktivierende Potential von Bedeutung sind. Essentiell für die Funktion von Klasse A Hsfs als Transkriptions-Aktivatoren sind kurze Peptidmotive, die durch aromatische und große hydrophobe Aminosäure-Seitenketten geprägt sind, die in einer sauren Umgebung eingebettet sind (AHA Motive: aromatic, large hydrophobic and acid amino acid residues). Es wurde mit GST pull-down Assays gezeigt, dass AHA Motive mit ausgewählten Transkriptions-Komplexen interagieren. Das generelle Konzept für AHA Motive als kohäsive Elemente zur Interaktion mit der Transkriptions- Maschinerie wurde durch Mutationsanalysen verifiziert, besonders detailliert am Beispiel von LpHsfA2 und LpHsfA1 aus Tomate in Reporter-Assays in Tabak-Protoplasten und Hefe als auch GST pull-down Experimenten gezeigt. Im Kontrast zu den Klasse A Hsfs besitzen Klasse B und C Hsfs keine AHA Motive. Diese zeigten auch keine eigene Aktivator-Funktion aber Experimente deuten darauf hin, daß sie Coregulatoren für Klasse A Hsfs darstellen. Es wurde gezeigt, dass diese pflanzliche Besonderheit bei Tomate als auch Arabidopsis existiert. Alle 21 Arabidopsis Hsfs wurden als Transkripte nachgewiesen, ihre Expression verhält sich sehr dynamisch in bezug auf Hitze-Stress als auch Entwicklungssignale. Die präsentierte funktionelle Charakterisierung der Hsf Familie von Arabidopsis gibt erste Einsichten in das komplexe Netzwerk der Hsfs und demonstriert bereits, dass im Vergleich zu anderen Organismen, wie z.B. Drosophila und Hefe mit einem Hsf und Säugern mit drei Hsfs, das komplexe pflanzliche Hsf System eine fein regulierte und effiziente Voraussetzung für Pflanzen darstellt, um schnell und vor allem erfolgreich auf Umwelteinflüsse zu reagieren, denen sie nicht entfliehen können.
The radiation-sensitive mutant pso4-1 of Saccharomyces cerevisiae shows a pleiotropic phenotype, including sensitivity to DNA cross-linking agents, nearly blocked sporulation and reduced mutability. We have cloned the putative yeast DNA repair gene PSO4 from a genomic library by complementation of the blocked UV-induced mutagenesis and of sporulation in diploids homozygous for pso4-1. Sequence analysis revealed that gene PSO4 consists of 1512 bp located upstream of UBI4 on chromosome XII and encodes a putative protein of 56.7 kDa. PSO4 is allelic to PRP19, a gene encoding a spliceosome-associated protein, but shares no significant homology with other yeast genes. Gene disruption with a destroyed reading frame of our PSO4 clone resulted in death of haploid cells, confirming the finding that PSO4/PRP19 is an essential gene. Thus, PSO4 is the third essential DNA repair gene found in the yeast S.cerevisiae.
Im Rahmen dieser Arbeit wurde die Vegetation der Savannenlandschaften der Sahelzone von Burkina Faso analysiert. Diese semiaride bis aride Region, die seit einigen Jahrzehnten von Landdegradation betroffen ist, ist als Untersuchungsgebiet u.a. deshalb besonders interessant, weil sie an einem Nutzungsübergang zwischen sesshafter Landwirtschaft und traditionell nomadischer Viehwirtschaft liegt. Im Vordergrund stand bei der Vegetationsanalyse ihre Klassifikation, die Frage nach der floristischen Struktur sowie dem aktuellen Zustand der Vegetation. Zu Beginn der Feldarbeiten wurde das Untersuchungsgebiet, das einen Niederschlagsgradienten von rund 200 mm umfasst, in geomorphologische Landschaftseinheiten (Inselberge, glacis, Niederungen, mares, Dünenzüge) stratifiziert. Innerhalb dieser Einheiten erfolgte die Vegetationsaufnahme mit Hilfe pflanzensoziologischer Aufnahmen. Die Arten der Gehölz- und Krautschicht wurden getrennt behandelt. Die Vegetationsaufnahmen wurden durch Strukturprofiltransekte in der brousse tigrée und Bodenuntersuchungen ergänzt. Auf verschiedenen Skalenebenen wurden die verschiedenen Vegetationsgesellschaften detailliert beschrieben und zu Standortfaktoren in Beziehung gesetzt. Außerdem wurden Vegetationsprofile zur Veranschaulichung der räumlichen Struktur der Vegetation abgeleitet. Bei der Analyse kamen auch computergestützte Methoden und statistische Verfahren (Tests der absichernden Statistik, Berechnung verschiedener Diversitätsindices, Ordinationsverfahren, numerische Klassifikation) zum Einsatz, um die Interpretation der Vegetationsstruktur zu unterstützen. Rund 320 Gefäßpflanzensippen aus 65 Familien konnten sicher bestimmt werden. Die artenreichste Familie sind die Poaceen. Insgesamt können 20 Gesellschaften der Gehölzschicht sowie 22 Gesellschaften der Krautschicht klassifiziert werden, die zur Mehrzahl weiter in Untereinheiten gegliedert sind. Innerhalb jeder Landschaftseinheit werden die Gesellschaften der Gehölzschicht, anschließend diejenigen der Krautschicht, vorgestellt. In der Regel sind sie in ihrer Verbreitung auf jeweils eine Landschaftseinheit beschränkt. Vor allem die Gesellschaften des glacis und der Niederungen besiedeln auch Habitate in Landschaftseinheiten außerhalb ihres Schwerpunktes. Daraus werden Schlüsse zum Ausbreitungsverhalten gezogen. In keinem Fall sind Einheiten der Krautschicht und der Gehölzschicht ausschließlich miteinander kombiniert; vielmehr sind Einheiten der Krautschicht jeweils mit mehreren Einheiten der Gehölzschicht kombiniert, was ihren selbständigen Charakter betont. Zehn Einheiten der Krautschicht sind überwiegend oder völlig gehölzfrei. Eine floristische Verwandtschaft besteht vor allem zwischen den Landschaftseinheiten glacis und Dünenzügen sowie zwischen mares, Niederungen und Dünenzügen; die Inselberge unterscheiden sich deutlich. Die Gehölzvegetation der Inselberge ist in Abhängigkeit von der menschlichen Nutzung in fünf Gesellschaften gegliedert. Während die Commiphora africana-Gesellschaft für wenig beeinflusste Bereiche typisch ist, hat die Combretum micranthum-Fragmentgesellschaft ihren Verbreitungsschwerpunkt in den intensiv genutzten Bereichen. Die Acacia raddiana-Zentralgesellschaft ist an den Unterhängen vertreten. Die Krautschicht der Inselberge gliedert sich in sechs, relativ artenreiche Gesellschaften mit Untereinheiten. Sie stellen zum Teil lokale Besonderheiten dar. Das räumliche Muster der Einheiten der Brachiaria lata-Gesellschaft lässt eine Abhängigkeit von der Art der Beweidung erkennen. Die Vegetation der Sandrampen wird oftmals von Einheiten gebildet, die ihren Verbreitungsschwerpunkt auf den Dünenzügen haben. Die Gehölzvegetation des glacis ist in drei relativ artenarme Gesellschaften gegliedert, die in Abhängigkeit der Lage zum lokalen Vorfluter zoniert und auch über das Untersuchungsgebiet hinaus weit verbreitet sind. Weite Bereiche des glacis sind völlig gehölzfrei. Die häufigste Gesellschaft ist die Acacia raddiana-Zentralgesellschaft. Die Ordination der Daten unterstützt die Klassifikation und zeigt Übergänge zwischen den Einheiten sowie Beziehungen zu den Standortparametern auf. Die Krautvegetation der glacis-Flächen ist relativ einheitlich; es gibt insgesamt nur zwei Gesellschaften. Der Anteil an Ruderalarten, Arten mit Pioniercharakter und solchen, die ihren Verbreitungsschwerpunkt auf Dünenzügen haben, ist relativ hoch. Bedeutendste Einheit ist die Tribulus terrestris-Untereinheit der Schoenefeldia gracilis-Gesellschaft, die eine weite ökologische Amplitude besitzt. Vor allem zu den Krautgesellschaften der Niederungen bestehen enge floristische und räumliche Beziehungen. Die krautigen Arten des glacis haben eine weite ökologische Amplitude. Es bestehen floristische Beziehungen zu Vegetationseinheiten der Sahara. Die Vegetation der mares und Niederungen hat die höchste β-Diversität. Die Gehölzvegetation der Niederungen ist in Abhängigkeit der Überflutungsdauer und -höhe zoniert und relativ struktur- und artenreich. In Galeriewäldern kommen sudanische Gehölzarten vor. Während von Viehherden stark frequentierte mares niedrige Gehölzdeckungen aufweisen oder komplett gehölzfrei sind, ist die Gehölzdeckung an den Ufern nur schwach besuchter mares geschlossen. Dies gilt auch für die artenreiche Krautvegetation. Insgesamt ist die Gehölzvegetation der Niederungen und mares in acht Gesellschaften gegliedert; die einzelnen Einheiten zeigen Übergänge miteinander. Die Krautvegetation der Niederungen enthält ebenfalls sudanische Arten. Sie lässt sich in drei Gesellschaften gliedern, die z.T. nur ein kleines Verbreitungsgebiet haben. Einige Uferabschnitte sind stark degradiert und vegetationslos. Die oftmals röhrichtartige Krautvegetation der mares ist ebenfalls in Abhängigkeit der Überflutungshöhe gegliedert, allerdings kommen an den einzelnen mares teilweise unterschiedliche Einheiten vor. Die Melochia corchorifolia-Gesellschaft steht im Mittelpunkt der Krautvegetation der mares, während die Brachiaria mutica-Gesellschaft für die nicht oder nur wenig überfluteten Bereiche typisch ist. Die Gehölzvegetation der Dünenzüge lässt sich im Untersuchungsgebiet in neun Gesellschaften gliedern. Diese gruppieren sich in einem artenreichen Block wenig beeinflusster Bereiche und in einem relativ artenarmen Block intensiv genutzter Dünenabschnitte. Bestände, die zur Pterocarpus lucens-Gesellschaft gestellt werden, bilden auf abgelegenen Dünenzügen kleine Wäldchen. In diese Gesellschaft werden auch die Bestände der brousse tigrée eingegliedert. Es sind in der Region nur noch wenige Flächen mit intakter brousse tigrée vorhanden. Anhand von zwei Strukturprofiltransekten wird ihre floristische und räumliche Struktur mit vier Zonen veranschaulicht. Pterocarpus lucens und Combretum micranthum sind die beiden dominanten Gehölzarten. Im Untersuchungsgebiet ist die Combretum glutinosum-Zentralgesellschaft weit verbreitet. Durch zwei Ordinationsdiagramme wird der ökologische Schwerpunkt wichtiger Dünenarten aufgezeigt. Die numerische Klassifikation lässt sich gut mit der manuellen Klassifikation in Übereinstimmung bringen. Die Krautvegetation der Dünen ist in sieben Gesellschaften mit vielen, z.T. relativ artenarmen Untereinheiten gegliedert, deren ökologische Bindung aufgrund eines starken, nivellierenden Beweidungseinflusses nicht immer geklärt werden kann. Es dominieren annuelle Arten; viele der Arten kommen in anderer Artenkombination auch in der Sudanzone vor. Daneben zeigt sich eine floristische Verwandtschaft zur Sahara. Unter Bäumen wächst die Achyranthes aspera-Gesellschaft. Krauteinheiten, die in anderen Landschaftseinheiten ihren Verbreitungsschwerpunkt haben, sind auf den Dünenzügen ebenfalls vorhanden, z.B. die Enteropogon prieurii-Gesellschaft der Inselberge und die Schoenefeldia gracilis-Gesellschaft des glacis. Es ist keine floristische Differenzierung entlang des Niederschlagsgradienten erkennbar. Hirsefelder sind mit Kulturbaumparks bestanden. Die Acacia raddiana-Zentralgesellschaft gewinnt auch auf den Dünenzügen an Bedeutung. Die Ergebnisse werden in Beziehung zu den in der Literatur vorhandenen, oftmals auf formationskundlichen Kriterien beruhenden Klassifikationen in Beziehung gesetzt. Je nach verwendetem Verfahren und Distanzmaß liefert die numerische Klassifikation unterschiedliche Ergebnisse, die sich nur zum Teil mit der Klassifikation in Deckung bringen lassen. Durch die Betrachtung der aktuellen Verjüngung, aus den Ergebnissen und ihrer Diskussion werden Aussagen über die aktuelle Vegetationsdynamik abgeleitet. Aktuelle Strukturveränderungen der Vegetation sind mit einem Landnutzungswandel verbunden. In erster Linie handelt es sich um Degradation, für die Beispiele auch aus der Literatur gegeben werden. Auf den Inselbergen gehen artenreiche Bestände zurück, gleichzeitig wandern Arten von den glacis-Flächen her ein. Auf dem glacis sind einerseits eine Artenverarmung, andererseits eine Verbuschung tiefliegender Bereiche sowie eine floristische Homogenisierung vieler Flächen zu beobachten, letzteres gilt auch für die Dünenzüge. An den mares und Niederungen findet ebenfalls eine floristische Verarmung statt, sudanische Arten sterben wie auch auf den Dünenzügen aus. Klimaungunst und vor allem Überbeweidung als mögliche Ursachen für den Vegetationswandel werden diskutiert.
Aus Fruktose-gezogenen Zellen von A. woodii, die in Gegenwart von Caffeat als Elektronenakzeptor gewachsen waren, wurde durch Behandlung mit Lysozym und anschliessendem French-Press-Aufschluß bei niedrigem Druck ein zellfreier Rohextrakt unter strikt anaeroben Bedingungen hergestellt. Dieser katalysierte eine H2-abhängige Caffeatreduktion mit Raten von 8,7 – 18,7 nmol/min x mg Protein. Die Aktivität war strikt ATP-abhängig. Nach einer Auftrennung des Rohextraktes in Cytoplasma- und Membranfraktion war die H2-abhängige Caffeatreduktion ausschliesslich in der cytoplasmatischen Fraktion lokalisiert. Die Zugabe von Membranen führte zu keiner Stimulierung der Aktivität. Die Membranfraktion selbst wies keine Caffeatreduktionsaktivität auf. Verschiedene Verbindungen wurden auf ihre Fähigkeit getestet, als artifizielle Elektronendonatoren für die Caffeatreduktion zu fungieren. TMPD, 1,5-Diphenylcarbazid und reduziertes Methylviologen konnten Caffeat nicht reduzieren. In Gegenwart von Phenylendiamin wurde in zellfreiem Rohextrakt und in der Cytoplasmafraktion Caffeatreduktionsaktivität beobachtet. In der Membranfraktion wurde dagegen keine Reduktion von Caffeat mit Phenylendiamin als Elektronendonor nachgewiesen. NADH + H+ konnte als physiologischer Elektronendonor für die Reduktion von Caffeat fungieren. Die NADH-abhängige Caffeatreduktion war ausschliesslich in der cytoplasmatischen Fraktion lokalisiert und strikt abhängig von ATP. Die Beobachtung, dass NADH + H+ als Elektronendonor für die Caffeareduktion fungieren kann, führte zu der Frage, wie im Zuge H2-abhängiger Caffeatreduktion NADH + H+ gebildet wird und welche Enzyme daran beteiligt sein könnten. NAD+-abhängige Hydrogenaseaktivität wurde an Membranen und im Cytoplasma nachgewiesen. Rund 70% der Aktivität waren in der löslichen Fraktion lokalisiert. Die Gegenwart einer Elektronendonor:NAD+-Oxidoreduktase in A. woodii wurde untersucht. Gewaschene Membranen vermittelten die Oxidation von NADH + H+ mit Kaliumhexacyanoferrat oder Benzylviologen als Elektronenakzeptor. Diese Beobachtung wurde als Hinweis auf eine NAD+-Reduktase gewertet, da solche Enzyme in der Regel reversibel sind. Eine Hydrogenase konnte hierfür ausgeschlossen werden, da die NADH-oxidierende Aktivität Sauerstoff-unempfindlich war. Die Aktivität des NADH-oxidierenden Enzyms konnte durch zugesetztes Na+ nicht stimuliert werden. In Analogie zu Na+-translozierenden NADH:Chinon-Reduktasen wurde die NADH-oxidierende Aktivität an gewaschenen Membranen aber durch Ag+ oder Cu2+ in mikromolaren Konzentrationen vollständig inhibiert. Membranen von A. woodii vermittelten die Reduktion von NAD+ mit reduzierten Ferredoxin als Elektronendonor. Ob diese Aktivität durch das gleiche membranständige Enzyme katalysiert wurde, das auch die NADH-Oxidation bewerkstelligte, konnte nicht geklärt werden. Die Ferredoxin-abhängige NAD+-Reduktion wurde durch micromolare Konzentrationen Ag+ vollständig inhibiert. Die Inihibition war aber wahrscheinlich unspezifischer Natur. Mittels vergleichender 2D-Gelelektrophorese wurden zwei Caffeat-induzierte Proteine identifiziert. Ein Vergleich der Peptidsequenzen, die durch ESI-MS/MS-Analyse der Proteine erhalten wurden, mit in Datenbanken hinterlegten Proteinsequenzen, ergab eine große Übereinstimmung zu der großen alpha- bzw. kleinen beta-Untereinheit von heterodimeren Elektronentransfer-Flavoproteinen (ETFP). Die Proteine wurden mit EtfA und EtfB bezeichnet. Anhand der Peptidsequenzen von EtfA und EtfB wurden degenerierte Oligonukleotide abgeleitet, die zur Amplifikation von Fragmenten der kodierenden Gene herangezogen wurden. Die Analyse der abgeleiteten Aminosäuresequenzen der erhaltenen PCR-Produkte untermauerte die Zuordnung von EtfA und EtfB als Untereinheiten eines ETFP. Die Fähigkeit zur Caffeatreduktion ist in A. woodii nicht konstitutiv vorhanden, sondern wird in erst durch Gegenwart des Phenylacrylats induziert. Die Spezifität dieser Induktion wurde untersucht. Suspensionen ruhender Zellen, die aus Caffeat-induzierten Zellen hergestellt worden waren, reduzierten neben Caffeat auch die Phenylacrylate Ferulat oder p-Cumarsäure mit H2 als Elektronendonor. Analoge Beoabachtungen wurden mit Ferulat-induzierten und p-Cumarsäure-induzierten Zellsuspensionen gemacht. Die Ergebnisse legen den Schluß nahe, dass in A. woodii die Reduktion von Phenylacrylaten durch ein induzierbares enzymatisches System bewerkstelligt wird. EtfA und EtfB wurden als MalE-Fusionsproteine dargestellt und gereinigt. Dagegen wurden Antiseren hergestellt. Immunologische Untersuchungen zeigten, dass die Produktion von EtfA und EtfB durch Gegenwart verschiedener Phenylacrylate induziert wird. Die Induktion war unabhängig vom Wachstumssubstrat. In Gegenwart von zu Phenylacrylaten ähnlichen Verbindungen erfolgte keine Induktion. Für EtfA und EtfB wurde eine Funktion als universeller Elektronenüberträger des Phenylacrylat-Reduktionssystems in A. woodii postuliert. Für die H2-abhängige Reduktion von Caffeat und anderer Phenylacrylate wurde die folgende Reaktionssequenz postuliert: die Oxidation des Elektronendonors H2 durch eine Hydrogenase geht einher mit der Bildung von reduziertem Ferredoxin. Dieses wird durch eine membranständige Ferredoxin-NAD+-Oxidoreduktase oxidiert, die den Transfer der Elektronen auf NAD+ mit der Translokation von Na+ koppelt. Ein aus EtfA und EtfB gebildetes ETFP fungiert dann als Elektronenüberträger zwischen NADH + H+ und einer löslichen Phenylacrylatreduktase.
Das Thema der vorliegenden Arbeit war die molekulargenetische Charakterisierung der Funktion der Glukosesensoren Snf3 und Rgt2 in der Hefe S. cerevisiae. Snf3 und Rgt2 gehören zur Familie der Hexosetransporter. Sie unterscheiden sich von ihnen jedoch in ihrer Funktion als Glukosesensoren wie auch durch ihre ungewöhnlich langen Cterminalen Domänen. Snf3 und Rgt2 sind integrale Membranproteine, die als Reaktion auf extrazelluläre Glukose Signale auslösen, die zur Expression bestimmter Hexosetransporter führt. Einige Komponenten, die an der Signaltranduktion beteiligt sind, wurden bereits identifiziert. Jedoch ist der genaue Mechanismus, der zur Expression der Hexostransporter führt, noch nicht vollständig aufgeklärt. Im ersten Teil dieser Arbeit wurden die Proteine Snf3, Rgt2, Mth1, Std1 und Rgt1 auf direkte Interaktionen untereinander getestet, um Einblicke in den molekularen Mechanismus der Signaltransduktion zu erhalten. Desweiteren sollte festgestellt werden, ob die Protein-Wechselwirkungen von der C-Quelle abhängig sind. Es konnte gezeigt werden, dass zwischen den Membranproteinen Rgt2 bzw. Snf3 und den löslichen Proteinen Mth1 bzw. Std1 Interaktionen in Abhängigkeit von Glukose stattfanden. Diese Ergebnisse unterstützen das von Moriya und Johnston aufgestellte, gegenwärtige Modell für eine glukoseinduzierte HXT Genexpression. Im zweiten Teil dieser Arbeit wurde geprüft, ob sich aus dem Glukosesensor Snf3 durch eine Aminosäuresubstitution ein bifunktionaler Sensor für Glukose und Galaktose erzeugen läßt. Dazu wurden die für den Galaktosetransport verantwortlichen Aminosäuren in den homologen Positionen von Snf3 ausgetauscht. Die Bestimmungen der Regulation des Snf3-kontrollierten HXT7 Promotors ergaben, dass das mutierte Snf3 Protein, wie das Wildtyp-Snf3 Protein, eine normale Glukosesensorfunktion ausübt aber keine Galaktosesensorfunktion vorzeigt.
Elche stellen eine Problemart in der Zootierhaltung dar. Sie erreichen im Zoo entgegen dem Trend, dass Tiere in Menschenobhut älter werden als ihre frei lebenden Artgenossen, meist weniger als die Hälfte des biologisch möglichen Alters. Besonders schwierig gestaltet sich die adäquate Fütterung, da die Tiere sehr stark von der Gabe frischer Laubäsung abhängen und die Fütterung mit Ersatzfuttermitteln, wie z.B. Heu, langfristig nicht erfolgsversprechend ist. Zudem sind die Tiere sehr anfällig für Parasiten und eine von Schafen übertragene Viruserkrankung (Bösartiges Katarrhalfieber). Ihr hoher Platzbedarf und das Problem der innerartlichen Aggression machen die Haltung dieser größten Hirschart zusätzlich kompliziert. In dieser Arbeit wird die Methode der Angewandten Chronoethologie in der Zootierhaltung vorgestellt, die sich die von der Inneren Uhr gesteuerten Verhaltensrhythmen einer Tierart zur Beurteilung ihres Wohlbefindens und ihrer Haltungsbedingungen in der künstlichen Zooumwelt zu Nutze macht. Der Besitz einer Inneren Uhr stellt in der hochgradig rhythmisch organisierten Umwelt einen Selektionsvorteil im Sinne einer frühzeitigen Anpassung an wiederkehrende Umweltbedingungen dar. Die Innere Uhr ist so alt wie das Leben selbst, genetisch fixiert, über Zeitgeberreize mit ihrer Umwelt synchronisiert und regelt die Lebensvorgänge von Organismen auf allen organisatorischen Ebenen, auch auf der Ebene des Verhaltens. Ist der normale Verhaltensrhythmus einer Tierart bzw. eines Individuums bekannt, ist es möglich, aus Abweichungen von der Norm auf Störungen des Organismus - auf Unwohlsein - zu schließen. Anhand des Vergleiches von drei Elchhaltungen mit jeweils zwei Tieren, die unter verschiedenen Bedingungen gehalten wurden, konnten mit Hilfe zeitgeraffter Videoaufzeichnung und dem Einsatz eines Speichertelemetriesystems die folgenden Faktoren als einflussreich auf das Verhaltensmuster von Elchen in Menschenobhut identifiziert werden. Die nächtliche Aufstauung von Elchen ist aufgrund des Raum- und Reizmangels in den Boxen ein erheblicher Eingriff in das natürliche, gleichmäßig über Tag und Nacht verteilte Verhaltensmuster der Tiere. Außerdem sind sie in ihrem Verhalten hochgradig vom täglichen Ablauf des Pflegeralltags im Zoo beeinflusst. Feste Fütterungszeiten können einen starken Zeilgeberreiz darstellen- den die Elche in den beiden naturferneren Haltungen stärker zu antizipieren scheinen als den Zeitgeber „Licht". Größe und vor allem Strukturierung des Außengeheges haben einen Einfluss auf dessen zeitliche und räumliche Nutzung. Abschüssige Gehegeteile können die unerwünschte Verhaltensweise Grasen fördern. In unseren mitteleuropäischen Breiten leiden die Elche im Sommer unter Hitzestress, was sich in verringerter Aktivität widerspiegelt. Ein hohes Besucheraufkommen kann die Tiere ebenfalls in ihrem Verhalten beeinflussen. Es hat sich jedoch gezeigt, dass sich der Elch schnell an die Zoogegebenheiten und viele Besucher gewöhnt. Durch den Vergleich der verschiedenen Haltungsbedingungen konnten in der vorliegen Arbeit Vorschläge zur Verbesserung der Haltung von Elchen in Menschenobhut und zu ihrem zeitlichen Management gemacht werden. Der Elch hat sich aufgrund des für Wiederkäuer typischen, sehr geregelten Verhaltensrhythmus aus alternierenden Aktivitäts- und Ruhephasen, der auch unter den verschiedenen Haltungsbedingungen prinzipiell bestehen bleibt, als sehr gut geeignetes Modelltier für die Anwendbarkeit der Methode der Angewandten Chronoethologie in der Zootierhaltung herausgestellt. Abweichungen von der Norm können leicht erkannt werden. Änderungen im Verhaltensmuster m Form erhöhter lokomotorischer Aktivität lassen bei den untersuchten Tieren auf Unwohlsein (Krankheit, Abweichungen von der täglichen Routine, unterbundenes Brunftverhalten) schließen und können im Sinne eines chronoethologischen Paradigmas als eine indikative Verhaltensweise gewertet werden. Das Ziel einer vollständig automatisierten Verhaltenserfassung- und Auswertung mittels Bewegungsmeldern soll im restringierten Raum der Elchbox in einem weiteren Projekt verwirklicht werden, um damit Tierpflegern, Zooveterinären und Verantwortlichen ein gut handhabbares Mittel zur objektiven und langfristigen Beurteilung des Wohlbefindens ihrer Schützlinge zur Verfügung stellen zu können.
Um die Biodiversität Burkina Fasos darzustellen und auszuwerten, wurden umfangreiche Diversitätsdaten aus Sammlungsbelegen, Vegetationsaufnahmen und Literatur zusammengestellt. Die eigene Datenerhebung während dreier Feldaufenthalte hat mit > 300 Vegetationsaufnahmen (einschließlich der Biodiversitätsobservatorien) und > 1200 Herbarbelegen dazu beigetragen. Die Verwendung von relationalen Datenbanken (Microsoft Access) und GIS ermöglichte eine umfassende Analyse dieser enormen Datenmengen (> 100 000 Verbreitungspunkte) unter Einbeziehung von weiteren Art- oder ortsgebundenen Informationen. Datenbankstrukturen und Prozeduren wurden zu einem großen Teil selbst entwickelt. Unregelmäßigkeiten in den Primärdaten konnten durch Artverbreitungsmodelle ausgeglichen werden, die rasterbasierte Umweltdaten verwenden, insbesondere Satellitenbilder, Klima- und Höhendaten. Für die zusammenfassenden Analysen (Artenreichtum nach Familie, Lebensform, Photosynthesetyp; turnover) mussten wiederum eigene Prozeduren entwickelt werden. Räumliche Muster der Biodiversität wurden im landesweiten Rahmen, wie auch lokal für die Regionen Oudalan und Gourma, dargestellt. Die Zusammenfassung der Flora nach taxonomischen und ökologischen Gruppen gewährt dabei Einblicke in ökologische Zusammenhänge und die Eignung einzelner Gruppen als Indikatoren. Deutlich zeigen sich die Veränderungen des Lebensformspektrums und des Artenreichtums sowohl auf Landesebene im Zusammenhang mit dem Makroklima als auch in einer detaillierten Analyse des Oudalan – wo der Einfluss von Boden und Relief deutlich wird. Die großräumigen Muster der Artenvielfalt sind hauptsächlich durch klimatische Faktoren geprägt, auch der menschliche Einfluss ist in Form verschiedener Nutzungsformen vom Klima abhängig und schwer davon zu trennen. Umso deutlicher werden die Folgen intensiver Landnutzung aber in den Detailstudien der nordsudanischen Biodiversitätsobservatorien und des sahelischen Wiederbegrünungsprojektes. Über die in diesem Rahmen dargestellten Ergebnisse hinaus ergeben sich insbesondere aus der umfassenden Datenbasis und der interdisziplinären Zusammenarbeit mit Fernerkundung und Ethnobotanik weitere vielversprechende Möglichkeiten. Unter anderem wird auf der Grundlage der Datenbanken und ergänzender Literaturrecherchen eine aktualisierte Checklist der Gefäßpflanzen Burkina Fasos erstellt und eine Revision der phytogeographischen Zonen für Burkina Faso ist geplant.
Unter humanbiologischen, geschichtlichen und soziokulturellen Aspekten wird eine umfangreiche Sammlung von Röntgen- und Patientenbildern des Annastifts Hannover (ehemals ”Krüppelheim“) aus der Zeit von Oktober 1908 bis September 1942 analysiert. Einige der häufigsten Erkrankungen dieser Sammlung (Hüftluxation, Infektionskrankheiten, Rachitis und Skoliose) werden beschrieben, ausgewertet und im Kontext der Epoche diskutiert. Dabei wird folgender Arbeitshypothese nachgegangen: Wenn das frühe 20. Jahrhundert als entscheidende Phase des Übergangs von einer hohen zu einer niedrigen Mortalität gilt, so müsste sich das auch in der Sammlung des Annastifts nachweisen lassen. Auch wäre zu erwarten, dass in der frühen Phase ein hoher Morbiditäsindex, welcher über die Anzahl von Harris-Linien ermittelt werden kann, festgestellt werden müsste. Patientenbilder (Fotografien) Von 6519 Patientenbildern konnten 6047 mit einer Diagnose erfasst werden. Für den Zeitraum Oktober 1908 bis 1.Oktober 1934 sind dies 3275 und für den Zeitraum 2. Oktober 1934 bis 1. September 1942 sind es 2772 Diagnosen. Die genannten Zeitrüume unterscheiden sich deutlich hinsichtlich der Häufigkeit der einzelnen Krankheitsbilder. Besonders auffällig: • Die Zahl fotografierter Patienten mit Infektionserkrankungen (u. a. Osteomyelitis und Tuberkulose) reduzierte sich im Untersuchungszeitraum. Maßgeblichen Einfluss hatten dafür vorteilhaftere Lebensbedingungen. Die therapeutischen Möglichkeiten waren zu dieser Zeit noch vergleichsweise gering. • Es wird eine Vervielfachung der Diagnosen Skoliose und Rundrücken in der Zeit des Nationalsozialismus’ beobachtet. Dass dies einen Anstieg der Pathologien widerspiegelt, ist unwahrscheinlich, eher zeigt es das besondere Augenmerk, welches im Nationalsozialismus der ”Haltung“ entgegengebracht wurde. Röntgenbilder Die 1894 Röntgenbilder stammen von 1063 Patienten, die zwischen dem 21. 07. 1909 und dem 18. 08. 1925 geröntgt wurden. Das Durchschnittsalter der Patienten lag bei zehn Jahren. In der Sammlung der Röntgenbilder gab es folgende Auffälligkeiten: • Der Anteil von Hüftluxationen lag bei über 21%. Dieser hohe Wert ist als Resultat einer fehlenden Frühdiagnose zu werten, so dass aufwendige orthopädische Behandlungen notwendig wurden. Mit Dr. Peter Bade stand dem Annastift ein anerkannter Spezialist auf dem Gebiet der Behandlung von Hüftluxationen vor, so dass das Annastift für diese Erkrankung als Schwerpunktklinik zu betrachten ist. • Bei dem Stressmarker ”Harris-Linien“ (in der Literatur auch meist als Wachstumsstillstandslinien“ bezeichnet) zeigt sich ein Paradoxon: Entgegen der Erwartung im Untersuchungszeitraum, aufgrund der zahlreichen und schweren Infektionserkrankungen und Hungersnöte, ein gehäuftes Auftreten der Harris-Linien als unspezifisches Zeichen von Stress vorzufinden, zeigten sich diese nur bei 15% der Patienten. Sie signalisieren mit der insgesamt geringen Anzahl einen vermeintlich niedrigen Morbiditäts-Index (= 0,32), welcher gemäß Literatur [z. B. Blanco et al. (1974); Nowak & Piontek (2002)] auf günstige Lebensbedingungen schließen ließe. Das Phänomen der Harris-Linien ist hier so zu erklären, dass allein eine Veränderung der Ernährungsbedingungen eine Ausbildung von Harris-Linien hervorrufen kann. In diesem Fall wird eine schlechte Grundsituation abgelöst durch eine optimale Versorgung im Annastift. Die Bezeichnung ”Wachstumsstillstandslinien“ ist für diese Serie somit wahrscheinlich unzutreffend, ”Wachstumslinie“, als Ausdruck für einen Wachstumsschub, würde das Phänomen besser erklären. Der Begriff ”Gesundheitsveränderungslinie“, sei es Ernährungs- oder Krankheitsbedingt, trüge dem Umstand Rechnung, dass eine einmalige Krankheit oder einmalige Hungerperiode bei einer allgemein guten Lebenssituation genauso eine Linie erzeugt, wie eine Periode des Wohlbefindens bei einer allgemein schlechten Lebenssituation. Im Ganzen zeigt diese Sammlung deutliche Indizien für nahezu katastrophale Lebensumstände im frühen 20. Jahrhundert: Infektions- und Mangelerkrankungen sind weit verbreitet. Es ist aber auch zu konstatieren, dass sich diese Bedingungen mit der Zeit besserten, was zu einer Reduzierung der Mortalität geführt haben dürfte.
Molekularbiologische Charakterisierung und Expressionsanalyse des Brust-Tumorantigens NY-BR-1
(2005)
Brustkrebs ist die häufigste Krebserkrankung bei Frauen. Trotz guter Behandlungsmöglichkeiten für lokalisierte Primärtumoren verläuft die fortgeschrittene Erkrankung, bei der sich bereits Metastasen gebildet haben, oft tödlich. Es besteht daher ein großer Bedarf an weiteren Tumormarkern für die Diagnostik und Verlaufsbeurteilung sowie an geeigneten Zielproteinen für die Entwicklung neuer therapeutischer Strategien. Neben Radio- und Chemotherapie hat in den letzten Jahren die Immuntherapie bei der Behandlung von Krebserkrankungen an Bedeutung gewonnen. Im Gegensatz zur systemischen Wirkungsweise der Zytostatika wird hierbei das zytolytische Potential des Immunsystems genutzt, um zielgerichtet Tumorzellen zu eliminieren. Sogenannte tumorassozierte Antigene bzw. „Cancer/Testis“ Antigene repräsentieren potente und effektive Zielproteine sowohl für die Anwendung therapeutischer Antikörper als auch für Vakzinierungen. Besonders die auf dem Einsatz von Antikörpern basierenden Strategien haben sich in Kombination mit einer Chemotherapie in jüngster Zeit als erfolgreich erwiesen. In einer brustspezifischen SEREX Analyse konnte vor wenigen Jahren das Tumorantigen NY-BR-1 identifiziert werden, für das eine gewebespezifische mRNA Expression in Testis, Brust sowie eine Überexpression in Mammakarzinomen beschrieben wurde. Bioinformatische Vorhersagen legten nahe, dass es sich bei diesem neuen, nicht charakterisierten Protein um einen Transkriptionsfaktor handeln könnte. Ziel der vorliegenden Arbeit war es, das Brust Tumorantigen NY-BR-1 molekularbiologisch und biochemisch zu charakterisieren. Des Weiteren sollten dessen Expression in Zelllinien und Geweben untersucht und eine erste Evaluierung der klinischen Relevanz dieses Tumorantigens als Zielprotein für immuntherapeutische Strategien durchgeführt werden. Hierfür wurden zunächst ein NY-BR-1 Volllängen-Expressionskonstrukt kloniert sowie ein polyklonales anti-NY-BR-1 Antiserum hergestellt, das in der Lage ist, rekombinantes und überexprimiertes NY-BR-1 Protein zu detektieren. Für den Nachweis des endogenen Proteins konnte später ein monoklonaler anti-NY-BR-1 Antikörper verwendet werden, der im Rahmen dieser Arbeit bezüglich seiner Funktionalität und Spezifität in diversen Anwendungen (Western Blot, Immunpräzipitation, Immunfluoreszenz, Durchflusszytometrie, Immunhistochemie) getestet und eingesetzt wurde. Expressionsanalysen mittels quantitativer RT-PCR und cDNA-„Microarrays“ zeigten, dass NY-BR-1 in normalem Brustgewebe, in primären Mammakarzinomen und in Brusttumormetastasen exprimiert ist, wobei im Vergleich zu Normalgewebe in 70% der Tumorproben eine Überexpession zu beobachten war. Interessanterweise wird NY-BR-1 auch in normalem Prostatagewebe und in einigen Prostatatumoren exprimiert. Es gelang in der vorliegenden Arbeit erstmalig, die Expression des endogenen NY-BR-1 Proteins in normalem Brust-, Testis- und Prostatagewebe sowie entsprechenden Tumorproben im “Western Blot” nachzuweisen, wobei das Protein nur in der unslöslichen Membranfraktion einer Gewebe-Lysatpräparation detektiert werden konnte. Es wurde mit verschiedenen biochemischen und zellbiologischen Methoden in transient transfizierten Zellen gezeigt, dass NY-BR-1 ein Membranprotein ist, dessen N- und C-Terminus sich auf der Zelloberfläche befinden. Immunfluoreszenz und FACS-Analysen belegen, dass der monoklonale Antikörper das NY-BR-1 Epitop auf der Zelloberfläche lebender transfizierter Zellen erkennt. Da NY-BR-1 in Pleuralergusszellen von Brustkrebspatientinnen sowie in etablierten Brust-Zelllinien nur in einigen Fällen auf mRNA Ebene, nicht jedoch auf Proteinebene nachweisbar war, wurde die Lokalisation des endogenen Proteins in Gewebeproben immunhistochemisch untersucht. Während NY-BR-1 in Brust-, Prostata- und Hodentumorzellen überwiegend im Zytoplasma gefunden wird und zum Teil vesikulär/aggregiert vorliegt, konnte in einigen Zellen der Brust- und Hodenkarzinome eine Membranlokalisation des Proteins beobachtet werden. Die vorhergesagte Funktion von NY-BR-1 als Transkriptionsfaktor konnte experimentell nicht bestätigt werden. Die Ergebnisse von Co-Immunpräzipitationsexperimenten legten nahe, dass das NY-BR-1 Protein Dimere oder Multimere mit sich selbst bzw. mit dem C-Terminus des Proteins bilden kann. Erste funktionelle Studien lassen eine direkte Beteiligung von NY-BR-1 an der malignen Transformation vermuten. In Weichagar Experimenten konnten NY-BR-1 exprimierende murine Fibroblasten (NIH3T3 Zellen) Kolonien bilden. Desweiteren wurde beobachtet, dass NY-BR-1 Expression in embryonalen Nierenzellen (293T Zellen) einen positiven Einfluß auf deren Adhäsionsverhalten an humane Endothelzellen zur Folge hat. Serologische Untersuchungen von über 50 Brustkrebs Patientenseren konnten bestätigen, dass NY-BR-1 ein Tumorantigen ist und ergaben, dass mindestens 5% der Patienten detektierbare anti-NY-BR-1 Serumantikörper entwickelten. Die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit konnten dazu beitragen, das Expressionsmuster, die zelluläre Lokalisation und die biologische Funktion des Tumorantigens NY-BR-1 näher zu untersuchen. Da NY-BR-1 gewebespezifisch in Brust, Testis und Prostata exprimiert ist und in 70% der Brust- und einigen Prostatatumoren (über)exprimiert wird, ist NY-BR-1 ein geeigneter Tumormarker und ein attraktives Zielprotein für aktive und passive Immuntherapie bei Brust- und evtl. bei Prostatakrebspatienten. Speziell für auf Antikörpern basierenden Therapien stellt das Zelloberflächenantigen NY-BR-1 ein interessantes „target“ für zukünftige Therapiestudien dar.
Die vorliegende Arbeit untersucht die Systematik und phylogenetischen Beziehungen der Familie der Bromeliaceae auf der Basis chloroplastidärer DNA-Sequenzdaten des trnT-trnL-Intergenischen Spacers (33 untersuchte Arten aus 28 Gattungen), des trnL-Introns (129 untersuchte Arten aus 48 Gattungen) und des trnL-trnF-Intergenischen Spacers (120 Arten aus 48 Gattungen). Untersucht wurden Vertreter aller Untergattungen der artenreichsten Gattungen Aechmea (Bromelioideae) und Tillandsia (Tillandsioideae). Mit den editierten Alignments der drei Sequenzdatensätze wurden Analysen zu den Verwandtschaftsverhältnissen durchgeführt. Alle drei untersuchten Marker lieferten phylogenetisch informative Signale. Die Pitcairnioideae erwiesen sich als polyphyletisch. Ayensua und Brocchinia sind nah verwandt und nehmen innerhalb der Familie eine basale Position ein. Hechtia und Navia stellen jeweils eigene Gruppen dar, aber ohne ausreichende Auflösung ihrer Beziehungen zu den übrigen Bromeliaceae. Fosterella und Puya sind gut gestützte Gruppen mit möglicher Schwestergruppenbeziehung zu den Bromelioideae. Die Gattungen Pitcairnia/Pepinia und Deuterocohnia/Dyckia bilden als Pitcairnioideae s.str. einen gut gestützten Ast. Die Tillandsioideae sind monophyletisch, nur die einzige untersuchte Akzession der Gattung Mezobromelia liegt außerhalb dieses statistisch gut gestützten Astes. Innerhalb der Tillandsioideae nehmen Catopsis, Glomeropitcairnia erectiflora und Alcantarea regina/Vriesea racinae basale Positionen ein. Die Gattungen Guzmania, Racinaea, Tillandsia und Vriesea sind keine natürlichen Gruppen. Für die Bromelioideae liegt die Sequenzdivergenz bei 0,1 bis max. 2%. Die beste Auflösung erreichte hier die kombinierte Analyse des trnL-Introns und des trnL-trnF Intergenischen Spacers bei Polarisierung der Daten mit den Tillandsioideae als Außengruppe. Bromelia, Deinacanthon, Greigia, Fascicularia-Ochagavia-Fernseea und eine wenig aufgelöste Kerngruppe der übrigen Bromelioideae bilden eine basale Polytomie. Mit höheren Wiederfindungswahrscheinlichkeiten gestützt sind Ananas, Greigia und von der Gruppe Fascicularia-Ochagavia-Fernseea die Gattung Fascicularia und die kontinentale Ochagavia litoralis. Die Gattungen Fascicularia-Ochagavia-Greigia (Bromelioideae) und Abromeitiella- Deuterocohnia (Pitcairnioideae) wurden mit Fragmentanalysen (AFLPs, RAPDs) untersucht. Analysen der RAPD- und AFLP-Daten mit UPGMA (Unweigthed pair group method using arithmetic averages) und NJ (Neighbor-Joining) stützen die Fassung der Gattung Fascicularia als eine Art (Fascicularia bicolor) mit zwei Unterarten (F. bicolor ssp. bicolor und F. bicolor ssp. canaliculata). F. bicolor ssp. canaliculata weist 28 Fragmente auf, die in keiner untersuchten Akzession von F. bicolor ssp. bicolor vorkommen. Die 5 untersuchten Akzessionen von F. bicolor ssp. bicolor sind durch 13 Fragmente charakterisiert, die in den 4 untersuchten Akzessionen von F. bicolor ssp. canaliculata fehlen. Die AFLP-Analysen der Gattungen Abromeitiella- Deuterocohnia stützen die Vereinigung der Gattungen Abromeitiella und Deuterocohnia in der älteren Deuterocohnia. Alle untersuchten Akzessionen der Artengruppe Abromeitiella-Deuterocohnia besitzen 11 gemeinsame charakteristische Banden, die Arten der Gattung Abromeitiella und Deuterocohnia für sich alleine genommen jedoch keine. Die größten genetischen Unterschiede bestehen zwischen der in Chile isoliert vorkommenden Deuterocohnia chrysantha und allen übrigen Arten der Gruppe. Der Informationsgehalt der analysierten chloroplastidären Sequenzen erwies sich für eine Auflösung der phylogenetischen Beziehungen von offenbar schnell evolvierenden Gattungsgruppen der Bromelioideae und Tillandsioideae als unzureichend. Fragmentanalysen, besonders AFLPs, zeigten auf der taxonomischen Ebene nah verwandter Gattungen eine gute Auflösung.
Mit der vorliegenden Arbeit wird für den südöstlichen Taunus und sein Vorland erstmals eine umfassende monographische Bearbeitung von Flora und Vegetation des Grünlands auf Basis umfangreicher Geländeerhebungen und Literaturrecherchen vorgelegt. Die wesentlichen Ziele der Untersuchung sind: • Darstellung der aktuellen und historischen Vorkommen und räumlichen Verbreitung von Pflanzenarten, Pflanzengesellschaften und Nutzungsintensitäten des Grünlands. • Darstellung der historischen Entwicklung des Grünlands und der sozioökonomischen Situation der Landwirtschaft. • Gefärdungseinstufung der Pflanzenarten und -gesellschaften (Rote Liste). • Kritische Bewertung des derzeitigen Stands der floristisch-vegetationskundlichen Landesforschung. • Bereitstellung von fachlichen Grundlagen für den praktischen Naturschutz, für Naturschutzbehörden, Planungsbüros, regionale Naturschutzforschung und die interessierte Öffentlichkeit. Das 1105 km2 große Untersuchungsgebiet liegt in nordwestlichen Rhein-Main-Gebiet und erstreckt sich von Wiesbaden im Südwesten und Bad Nauheim im Nordosten bzw. Schmitten im Nordwesten und Frankfurt im Südosten. Es umfasst mit dem Hebungsgebiet des Taunus (größte Höhe 878,5 m ü. NN) und dem Senkungsgebiet des Rhein-Main-Tieflands (tiefster Punkt 84 m ü. NN) zwei sehr unterschiedliche geowissenschaftliche Landschaftstypen, die im einzelnen 33 verschiedene naturräumliche Teileinheiten umfassen...
1.) Zahlreiche Medikamente werden nach Einnahme nahezu unverändert wieder ausgeschieden und gelangen über Abwasser und Kläranlagen in die aquatische Umwelt. 2.) Die gemessenen Konzentrationen erscheinen gegenüber anderen Kontaminantengruppen vergleichsweise niedrig, sind jedoch angesichts der Tatsache, dass Medikamente biologisch hoch aktive Substanzen sind, besorgniserregend. Das Beispiel Ethinylöstradiol zeigt, dass bereits im ng/l-Bereich Effekte auftreten. Abgesehen vom Beispiel Ethinylöstradiol lagen bislang keine Erkenntnisse über chronische Effekte von Medikamenten bei umweltrelevanten Konzentrationen vor. 3.) Die in der Umwelt festgestellten Arzneimittelwirkstoffe werden fast ausschließlich in Ab-, Oberflächen- und Grundwasser detektiert. Angaben über Medikamentanreicherungen in Sedimenten liegen nur vereinzelt vor. 4.) Angaben über die Ökotoxizität von Medikamenten beruhen bislang fast ausschließlich auf bei sehr hohen Substanzkonzentrationen durchgeführten Akuttests. Die Übertragung auf umweltrelevante Verhältnisse erfolgte durch Einbeziehung hoher Sicherheitsfaktoren. 5.) Die vorliegende Arbeit zeigt, dass in komplexeren Tests bereits bei sehr viel niedrigeren Konzentrationen Effekte auftreten. Diese Effekte sind nicht unmittelbar toxisch, beeinträchtigen jedoch die Entwicklung und Fortpflanzung der Versuchsorganismen nachhaltig. 6.) Als Modellsubstanzen für die in Oberflächengewässern nachgewiesenen Pharmaka wurden das Antiepileptikum Carbamazepin, Clofibrinsäure als Metabolit zahlreicher Lipidsenker, das Antibiotikum Ciprofloxacin und das Antidepressivum Fluoxetin ausgewählt. Sämtliche Pharmaka werden in der Umwelt weit verbreitet nachgewiesen. 7.) Als Testorganismen dienten die Zuckmücke Chironomus riparius, die Zwergdeckelschnecke Potamopyrgus antipodarum und der aquatische Annelide Lumbriculus variegatus. C. riparius ist ein bereits standardisierter Versuchsorganismus, L. variegatus ist zur Zeit im Standardisierungsverfahren (OECD 2004B) und für ökotoxikologische Untersuchungen empfohlen (ASTM 1995). Außerdem wurde mit den Einzellern Blepharisma japonicum und Tetrahymena thermophila ein Destruentenmikrokosmos entwickelt. Beide Einzeller sind ebenfalls erprobte Versuchsorganismen (PAULI 1996, FOX & MORIN 2001). 8.) Von den vier untersuchten Pharmaka erwiesen sich im getesteten Konzentrationsbereich Carbamazepin und Fluoxetin für jeweils einen der Testorganismen als schädlich. Carbamazepin blockierte ab einer Sedimentkonzentration von 234 µg/kg Sediment (Trockengewicht) die Entwicklung von C. riparius. Fluoxetin führte ab einer Testkonzentration von 2 µg/l zu einer Reduzierung der Embryonenzahl bei P. antipodarum. Die EC10 für Carbamazepin wurde zu 113 µg/kg Sediment berechnet, die EC10 für Fluoxetin zu 0,81 µg/l. Beide Konzentrationen sind bei Berücksichtigung der im TGD vorgesehenen Sicherheitsfaktoren umweltrelevant (PEC/PNEC > 1). Als Grundlage dieser Berechnung dienten gemessene Umweltkonzentrationen im Sediment beziehungsweise Wasser. Ein negativer Effekt von Ciprofloxacin auf L. variegatus erschien anhand der Daten zwar möglich, konnte jedoch nicht statistisch belegt werden. Für Clofibrinsäure ergaben sich keine Hinweise auf negative Effekte im getesteten Konzentrationsbereich. 9.) Die vorliegenden Berechnungen sind weitaus tragfähiger als bisher vorliegende, da sie auf chronischen Toxizitätsdaten und gemessenen Umweltkonzentrationen beruhen, statt auf Akutdaten und geschätzten Umweltkonzentrationen. 10.) Die in den Versuchen festgestellten, sehr niedrigen Effektkonzentrationen lassen Effekte auch bei umweltrelevanten Konzentrationen als wahrscheinlich erscheinen. Indirekte Effekte wie vermindertes Futterangebot für Prädatoren oder Verschiebungen im Artenspektrum sind denkbar. 11.) Der Destruentenmikrokosmos erwies sich als prinzipiell geeignet, Effekte von Xenobiotika auf Einzeller zu untersuchen, da die Positivkontrolle funktionierte. Die Daten aus den Versuchsansätzen zeigen jedoch, dass Versuchsdesign und Haltung der Testorganismen weiter entwickelt werden müssen. 12.) Die vorliegenden Daten zeigen, dass Pharmaka bei umweltrelevanten Konzentrationen ein ökologisches Risiko darstellen können. Maßnahmen zur Risikominderung sind dringend erforderlich. Angesichts des therapeutischen Nutzens der Substanzen erscheinen Verbote nicht durchsetzbar.
1. Das Dissoziations- und Reaggregationsverhalten von Epidermiszellen der Larven von Xenopus laevis wird unter verschiedenen Bedingungen in vitro mit Hilfe des Zeilrafferfilmes untersucht. Die Kultur der Schwänze erfolgt in Salzlösung nach STEINBERG und Serum hämolysierten Kälberblutes. Für die Reaggregation werden serumfreie Salzlösungen verwendet. 2. Am Auswandern der Zellrasen beteiligen sich alle dem Deckglas anliegenden Zellen. Sie bilden einen Plasmasaum in die Richtung aus, in der sie sich fortbewegen. Der Zusammenhalt zwischen den Zellen wird hierbei nicht gelöst. 3. Die Zellrasen lassen sich mit 0;05%igem EDTA in Einzelzellen auflösen; dabei tritt eine Trennung des Zellplasmas in ein zentral gelegenes granuliertes Plasma und einen hyalinen Plasmasaum auf. Bei längerer Einwirkung des EDTA werden die hyalinen Säume eingezogen. Die Zellen sind dann abgekugelt; es brechen blasenförmige "Lobopodien" aus den Zellen hervor und verschwinden wieder: "Blubbern". 4. In Gegenwart von Ca++ breiten sich die Zellen wieder auf dem Deckglas aus. Die Bildung "stabilisierter Aggregate" erfolgt in Ringerlösung (mit 0,02% CaCl2), in isotonischer Calciumchlorid-Lösung, in isotonischer Kochsalz- und Kaliumchlorid-Lösung, wenn Calciumchlorid mindestens 0,02%ig enthalten ist. Es wird angenommen, daß die einwertigen Kationen für die Zellbewegung und Reaggregation nur als Ladungsträger wirksam sind. In KCN-haltiger (2,5 X 10-3 M) und in PCMB-haltiger (2,5 X 10-3 M) Ringerlösung ist ebenfalls Reaggregation möglich. Unter dem Einfluß von PCMB ist die Stabilisierung der Zollgrenzen jedoch nicht von Dauer. Die Aggregate werden wieder aufgelöst; die Zellen zeigen keine Kontakthemmung mehr, sie wandern übereinander. 5. Wird das Calciumchlorid der Ringerlösung durch die äquimolare Menge Magnesiumchlorid ersetzt, so werden die Kontakte nicht stabilisiert, sondern "sliding sheets" gebildet. Keine Reaggregation ist in Calcium-haltiger Natrium- oder Kaliumchlorid-Lösung einer Konzentration unter 0,33 M und in Ringerlösung unter pH 4,0 möglich. Die Zellen sind dann auch zu keiner Ortsbewegung mehr fällig. Selbst kurze (3 min) Trypsinbehandlung (2%) verhindert die Reaggregation der Zellen im serumfreien Medium. 6. Besonders die Versuche zur Störung des Energiehaushaltes der Zellen legen nahe, daß die dabei zu beobachtenden Viskositätsänderungen im Hyaloplasmasaum auf einer Änderung des Kontraktionszustandes in ihm enthaltener kontraktiler Proteine beruhen. Die Auswirkungen von PCMB, niederem pH und geringer Ionenstärke deuten auf die Beteiligung eines Membranpotentials an der Steuerung der Viskositätsänderung hin. Diese Hypothese wird zu Ergebnissen der Muskelphysiologie in Beziehung gesetzt.
Hauptanliegen der vorliegenden Arbeit waren einerseits die Inventarisierung der Waldvegetation des Rothaargebirges sowie andererseits der Vergleich mit historischen Bearbeitungen zur Ermittlung von Vegetationsveränderungen. Die aktuelle Vegetation wurde mit Hilfe pflanzensoziologischer Methoden erfaßt und klassifiziert. Ergänzend erfolgte eine Kartierung vieler Waldvegetationseinheiten, welche in Verbreitungskarten dargestellt ist. Von großer Bedeutung im Bereich der Waldgesellschaften ist das Luzulo-Fagetum, welches in einer Reihe unterschiedlicher Ausbildungen vorkommt und im gesamten Gebiet verbreitet ist. Weitere Buchenwälder sind dem Galio odorati-Fagetum und in geringem Umfang dem Hordelymo-Fagetum zuzuordnen. Als Ersatzgesellschaften der Buchenwälder sind die große Flächen einnehmenden Fichtenforste, die überwiegend aus der Haubergswirtschaft entstandenen Wälder des Betulo-Quercetum und die wenigen dem Carpinion zugehörigen Bestände einzustufen. An feuchtere Standorte gebunden sind die Schluchtwälder des Fraxino-Aceretum pseudoplatani sowie Auenwälder, die durch das Carici remotae-Fraxinetum und das Stellario nemorum-Alnetum repräsentiert sind. Weiterhin kommen Bruchwälder des Betuletum carpaticae und des Sphagno-Alnetum vor, welche auf nassen Standorten siedeln. Ebenfalls pflanzensoziologisch dokumentiert wurden Gesellschaften, die im räumlichen Verbund der Wälder auftreten oder mit diesen in einem syndynamischen Zusammenhang stehen. Hierzu gehören insbesondere krautige Formationen der Schlagfluren sowie deren strauchige Folgegesellschaften. Des weiteren wurden Gesellschaften der Heiden, der Quellfluren, der Bachröhrichte und der Felsen erfaßt. Für eine Gegenüberstellung des Luzulo-Fagetum mit seinen forstlichen Ersatzgesellschaften erfolgte eine Betrachtung struktureller Parameter, floristischer Unterschiede sowie von Zeigerwerten. Sowohl Fichtenforst als auch Betulo-Quercetum weisen im Vergleich zum Luzulo-Fagetum eine geringere Anzahl an Varianten auf und Arten der Ordnung Fagetalia treten zurück. Im Fichtenforst häufiger sind Säurezeiger sowie Arten der Schlag- und Ruderalfluren, im Betulo-Quercetum vor allem Säure- und Magerkeitszeiger. Bezogen auf mittlere Zeigerwerte äußern sich die Unterschiede beider Gesellschaften zum Luzulo-Fagetumin höheren Werten für den Faktor Licht, während in bezug auf die Faktoren Feuchte, Bodenreaktion und Stickstoff lediglich das Betulo-Quercetum deutlich vom Luzulo-Fagetum abweicht, wobei die Werte jeweils deutlich geringer ausfallen. Die Relevanz dieser beobachteten Unterschiede offenbart sich an einer exemplarisch durchgeführten Darstellung des Bestockungswandels der Markenwaldungen Winterberg. Hier wurde für das 20. Jahrhundert ein deutlicher Anstieg der mit Fichten bewachsenen Flächen registriert, der auf Kosten des Buchenanteils geht. Zur ergänzenden Beurteilung der Waldvegetation wurden Analysen geringeren Umfangs angestellt. Hierunter fällt zum einen die Darstellung der Waldgesellschaften in einem Ökogramm anhand der mittleren Zeigerwerte für Feuchte, Bodenreaktion und Stickstoff. Bei der Betrachtung der Naturverjüngung in den einzelnen Waldgesellschaften erwiesen sich insbesondere Fagus sylvatica, Picea abies, Acer pseudoplatanus und Sorbus aucuparia als die sich am häufigsten verjüngenden Baumarten. Zur Beurteilung des Faktors Wild wurde die Verbißhäufigkeit an Waldpflanzen registriert. Danach gehören Athyrium filix-femina, Epilobium angustifolium, Dryopteris dilatata und Polygonatum verticillatum zu den beliebtesten Äsungspflanzen. Weiterhin wurde exemplarisch die Vegetation auf den im Rothaargebirge häufig anzutreffenden Meilerflächen dokumentiert. Im Bereich dieser Plätze werden nicht selten Arten der Ordnung Fagetalia sowie andere nährstoffliebende Taxa gefördert. Eine Gegenüberstellung der Aufnahmen von Fagion-Gesellschaften, Luzulo-Fagetum, Fichtenforst und Betulo-Quercetum mit vergleichbaren Aufnahmen historischer Bearbeitungen ergab eine Reihe von Unterschieden. Deutlich zeichnet sich eine Zunahme an stickstoffliebenden Arten ab, die pflanzensoziologisch überwiegend den Klassen Epilobietea angustifolii und Artemisietea vulgaris zuzuordnen sind. In den Fichtenforsten ist dieser Wandel besonders auffällig und spiegelt sich in erhöhten mittleren Zeigerwerten für Stickstoff und Bodenreaktion wider. Für die Fagion-Gesellschaften wurde zudem eine Abnahme an Arten der Ordnung Fagetalia registriert, so daß die Veränderungen der mittleren Zeigerwerte nur gering ausfallen, da diese Arten ebenfalls als Stickstoffzeiger einzustufen sind. Für das Luzulo-Fagetum fällt der Zuwachs an den betreffenden Arten zwar geringer als im Fichtenforst aus, zeigt sich aber in einzelnen Aufnahmen mit dominantem Auftreten der stickstoffzeigenden Arten. Im Betulo-Quercetum ist die Zunahme an Stickstoffzeigern am geringsten ausgeprägt und der Anstieg des entsprechenden mittleren Zeigerwertes beruht primär auf einem Rückgang an Säure- und Magerkeitszeigern. Letztere verzeichnen auch in den anderen Waldgesellschaften unterschiedlich stark ausgeprägte Verluste. Als Ursache für die Veränderungen werden insbesondere stickstoffreiche Immissionen diskutiert, sowie Kompensationskalkungen und Bestandsauflichtungen. Ergänzend sind Nutzungsänderungen in Erwägung zu ziehen, die sich vor allem bei den ehemals als Hauberg bewirtschafteten Beständen des Betulo-Quercetum auswirken. Die ermittelten Ergebnisse fügen sich in eine Reihe ähnlicher Untersuchungen ein und bestätigen damit auch die angewendete Methode des pflanzensoziologischen Typenvergleichs zum Monitoring von Vegetationsveränderungen. Weiterhin wurde in vorliegender Arbeit ein Blick auf die Situation des Wald-Naturschutzes im Rothaargebirge geworfen und Empfehlungen für eine weitere Entwicklung kurz angerissen. Als Beispiel für das Vorkommen gefährdeter Arten und deren Abhängigkeit von der Waldvegetation wurden Verbreitungskarten von Bärlapp-Arten angeführt.
Der derzeitige Stand der Gentherapie bedarf der Entwicklung neuer Systeme zur Selektion bislang unbekannter Proteine und zur Verbesserung der Gentransfereffizienz viraler Vektorsysteme. Bisher verwendete Systeme wie Phagen display bergen erhebliche Nachteile, die alle auf die Verwendung von Prokaryonten zurückzuführen sind. Deswegen wurde in der vorliegenden Arbeit ein System entwickelt, welches eine Selektion und Produktion von Proteinen im stets eukaryonten Kontext ermöglicht. Dazu wurde ein ein replikationskompetenter retroviraler Vektor entwickelt durch den eine erhebliche Steigerung der Gentransfereffizienz möglich ist. Beide Teilaspekte meiner Arbeit beruhen auf Modifikationen unterschiedlicher Stämme des Maus Leukämie Virus (MLV). Zur Selektion von Proteinen im eukaryonten Kontext wurde erstmalig eine retrovirale display Bibliothek etabliert, wobei ecotropes MLV varible Antikörper-Fragmente (scFv´s) auf der Oberfläche präsentiert. Eine Modellselektion mit dem Antigen Laminin, simuliert durch das Mischen von zwei erstellten Virusvarianten (7A5 Xa Mo/ L36 Xa Mo) in unterschiedlichen Konzentrationen, konnte die Selektion der Laminin-bindenen Variante L36 Xa Mo aus einem Überschuß von 10 hoch -4 nicht bindender 7A5 Xa Mo zeigen. Die Anreicherung der bindenden L36 Xa Mo Variante konnte ebenfalls aus dem Kontext einer erstellten retroviralen alphaHUVEC Bibliothek erzielt werden. Die Anwendbarkeit des Systems wurde durch diese Modellselektionen sowie durch die Selektion der alphaHUVEC Bibliothek auf VEGFR-1 als Antigen demonstriert. Derart selektionierte Proteine konnten im nächsten Schritt, unter Verwendung einer Furinspaltstelle im Hüllprotein des amphotropen MLV, in verschiedenen Zelllinien produziert werden. Gezeigt werden konnte eine effiziente Produktion und Sezernierung der verwendeten scFv´s bis zu einer Konzentration von 6µg/ml im Zellkulturüberstand, wobei der Tropismus des amphotropen MLVs nicht beeinflußt wurde. Die biologische Aktivität derart hergestellter Proteine, konnte mittels FACS und ELISA nachgewiesen werden. Eine Abtrennung von den viralen Bestandteilen kann durch Filtration mit molekularer Ausschlußgrenze erzielt werden. Besonders hervorzuheben ist die genomische Stabilität derart mordifizierter Viren. Trotz des zusätzlichen Leserahmens war das auf die beschriebene Weise modifizierte MLV über 12 Infektionszyklen genetisch stabil und gewährleistete so erstmalig eine stetige Produktion der gewünschten Proteine. Die erfolgreiche Anwendung dieses Vektorsystems zur Tumortherapie erwies sich bereits in weiterführenden Arbeiten.
Die Zusammensetzung der Plasmamembran tierischer Zellen kann unter anderem durch regulierte Exozytose und durch hydrolytische Abspaltung von Ektodomänen membran-assoziierter Proteine (Ectodomain Shedding) modifiziert werden. Regulierte Exozytose spezialisierter Vesikel, den sogenannten GSVs (GLUT4 containing small vesicles), dient der intrazellulären Speicherung des Glucosetransporters4 (GLUT4) sowie seinem insulin-abhängigen Einbau in die Plasmamembran. Die proteolytische Abspaltung der Ektodomänen von Zelloberflächenproteinen wie z.B. des Heparin-bindenden epidermalen Wachstums-faktors (heparin binding-epidermal growth factor = HB-EGF) führt zur Modifikation der Plasmamembranzusammensetzung. Wir zeigten, dass GSVs in vielen Säugerzellen für die intrazelluläre Speicherung spezifischer Plasmamembranproteine und deren stimulations-abhängigen Transfer in die Plasmamembran zuständig sind. Um GSVs eindeutig identifizieren zu können, wurden Rat1-Zellen stabil mit GLUT4myc als heterologem Marker für dieses spezifische Speicherkompartiment transfiziert. Die intrazelluläre GLUT4-Lokalisation in den als positiv identifizierten Rat1/GLUT4myc-Klonen entsprach dem für CHO/GLUT4-Zellen beschriebenen Verteilungsmuster. In der Folge wurden mehrere potentiell vesikel-assoziierte Membranproteine in die Untersuchungen zur Membran-zusammensetzung einbezogen: eine endogene proHB-EGF hydrolysierende Proteaseaktivität und die Metalloproteasen ADAM10 und TACE. Es zeigte sich, dass GSVs eine Proteaseaktivität enthielten, die VSVG-proHB-EGF hydrolysierte. Eine Colokalisation der beiden endogenen Metalloproteasen ADAM10 und TACE mit GLUT4 in GSVs konnte gezeigt werden. Untersuchungen zeigten, dass beide endogenen Proteasen ADAM10 und TACE in Rat1/GLUT4myc-Zellen mit einer Subpopulation von GSVs assoziiert zu sein scheinen. Die Stimulation des G-Protein-gekoppelten Thrombinrezeptors löste in diesen Zellen eine regulierte Exozytose der GSVs aus. Die Metalloproteasen-enthaltenden GSVs reagierten jedoch nicht auf diese Art der Stimulation. Sie bildeten möglicherweise eine Reservepopulation von GSVs, die erst bei stärkerer Stimulation mobilisiert werden kann. Unter Ruhebedingungen schien auch diese Vesikelpopulation über andere intrazelluläre Kompartimente, nicht jedoch über die Plasmamembran, zu rezirkulieren.
Pflanzliche Biomasse bietet sich hervorragend als billiges und in großen Mengen verfügbares Ausgangssubstrat für industrielle Fermentationsprozesse an. Dabei könnte z.B. die Hefe Saccharomyces cerevisiae zur Herstellung von Bioalkohol eingesetzt werden. S. cerevisiae kann jedoch die in großen Mengen in der Biomasse enthaltenen Pentosen D-Xylose und L-Arabinose nicht vergären. Deshalb wäre ein Hefestamm mit entsprechend erweitertem Substratspektrum von großem wirtschaftlichen Interesse. In dieser Arbeit sollte rekombinante Hefestämme konstruiert bzw. optimiert werden, die in der Lage sind D-Xylose und/oder L-Arabinose zu Ethanol zu vergären. Zunächst wurde ein bereits vorhandener L-Arabinose vergärender Hefestamm unter Einsatz der Methoden der „gerichteten Evolution“ optimiert, L-Arabinose effektiver zu verstoffwechseln. Dies geschah durch repetitive Selektion auf Wachstum mit L-Arabinose als einziger Kohlenstoffquelle unter Sauerstoff-limitierten Bedingungen. Eine genetische und physiologische Charakterisierung des Stammes ergab, dass dieser sowohl Mutationen im Hefegenom als auch auf den L-Arabinose Stoffwechselweg exprimierenden Plasmiden erworben hatte. Dieser Stamm exprimierte die für den L-Arabinose Katabolismus notwendigen Enzyme und Transporter von vier verschiedenen Plasmiden. Für den industriellen Einsatz eines rekombinanten Hefestammes ist es jedoch unerlässlich, die Gene des L-Arabinose Katabolismus stabil in das Genom zu integrieren. In dieser Arbeit ist es gelungen, zwei der insgesamt drei essentiellen Gene des Stoffwechselweges in funktioneller Form in den rDNA-Locus von S. cerevisiae zu integrieren. Im letzten Teil der Arbeit konnte erstmals ein Hefestamm konstruiert werden, der sowohl die Gene des Stoffwechselweges für den L-Arabinose- als auch die des Stoffwechselweges für den D-Xylose-Katabolismus exprimiert. Der Stamm war in der Lage auf Nähragarplatten zu wachsen, bei denen L-Arabinose oder/und D-Xylose die einzigen Kohlenstoffquellen darstellten. Wachstumstests mit Flüssigkulturen sowie HPLC-Analysen des Zuckerverbrauchs ergaben jedoch, dass der Hefestamm überraschenderweise nicht in der Lage war, D-Xylose in Flüssigmedien zu verstoffwechseln. Mögliche Erklärungen hierfür werden diskutiert.
Reinigung, biochemische Charakterisierung und Struktur der A1AO-ATPase aus Methanococcus jannaschii
(2006)
Die A1AO-ATPase wurde aus Membranen von M. jannaschii unter Erhalt der Struktur isoliert. Das Enzym wurde durch eine Saccharose-Dichtegradientenzentrifugation, eine Anionenaustauschchromato-graphie an DEAE und eine Gelfiltration zur Homogenität gereinigt. Alle 9 aus der Operon-Struktur vorhergesagten Untereinheiten konnten mittels Western-Blot-Analyse oder einer N-terminalen Sequenzierung identifiziert werden. Die funktionelle Kopplung der A1- und AO-Domäne wurde durch Studien mit dem Inhibitor DCCD nachgewiesen. Das gereinigte Enzym hatte eine Masse von 670 kDa. Die ATP-Hydrolyseaktivität war bei einer Temperatur von 80°C und einem pH-Wert von 6 optimal. Der KM-Wert für MgATP wurde zu 1,2±0,2 mM bestimmt. Bei den Versuchen zur Entwicklung eines Na+-freien Tespuffers trat die strikte Abhängikeit des Enzyms von Hydrogensulfit oder Sulfit als Problem zu Tage. Aus Membranen von M. jannaschii wurden durch Chloroform/Methanol Lipide extrahiert, aus denen dann Liposomen hergestellt wurden. Die A1AO-ATPase aus M. jannaschii wurde in diese Liposomen erfolgreich rekonstituiert, eine ATP-Synthese konnte jedoch nicht nachgewiesen werden. Die elektronenmikroskopischen Analysen zeigten einen für ATPasen charakteristischen Aufbau, aus einer hydrophilen Domäne, die durch mindestens zwei Stiele mit der Membrandomäne verbunden ist. Anhand der Bildrekonstruktion von 17.238 Einzelpartikeln konnten zwei Klassen von ATPase-Molekülen unterschieden werden, die entweder über einen oder zwei periphere Stiele verfügten. Aus verschiedenen Einzelprojektionen wurden Summenbilder generiert, anhand dieser 2D- Rekonstruktion wurde die ATPase vermessen. Der Kopfteil, die Membrandomäne und der zentrale Stiel haben eine Größe von 11,5 x 9,4 nm, 10,6 x 6,4 nm und 8 x 3,9 nm (Länge x Breite). Die Gesamtlänge des Enzyms betrug 25,9 nm. Der zentrale Stiel der ATPase ist über der Membran von einer Kragen-ähnlichen Struktur umgeben, die wiederum mit den peripheren Stielen in Kontakt steht. Scheinbar steht nur einer der peripheren Stiele in direktem Kontakt mit der AO-Domäne. Die Überlagerung der 3D-Rekonstruktion eines A1-Subkomplexes aus Methanosarcina mazei mit der 2D-Rekonstruktion der A1AO-ATPase aus M. jannaschii zeigen deutlich, dass die peripheren Stiele mit dem oberen Ende der A1-Domäne in Kontakt stehen. Durch diese Analysen konnte erstmals die Struktur einer A1AO-ATPase mit einer Auflösung von 1,8 nm dargestellt werden. Sequenzanalysen haben gezeigt, dass das Proteolipid-Gen von Methanopyrus kandleri verdreizehnfacht ist. Das Gen wurde mittels PCR vervielfacht und in einen TOPO®-Vektor kloniert. Versuche das Gen in einen Expressionsvektor umzuklonieren, waren noch nicht erfolgreich.
Background Fermentation of lignocellulosic biomass is an attractive alternative for the production of bioethanol. Traditionally, the yeast Saccharomyces cerevisiae is used in industrial ethanol fermentations. However, S. cerevisiae is naturally not able to ferment the pentose sugars D-xylose and L-arabinose, which are present in high amounts in lignocellulosic raw materials. Results We describe the engineering of laboratory and industrial S. cerevisiae strains to co-ferment the pentose sugars D-xylose and L-arabinose. Introduction of a fungal xylose and a bacterial arabinose pathway resulted in strains able to grow on both pentose sugars. Introduction of a xylose pathway into an arabinose-fermenting laboratory strain resulted in nearly complete conversion of arabinose into arabitol due to the L-arabinose reductase activity of the xylose reductase. The industrial strain displayed lower arabitol yield and increased ethanol yield from xylose and arabinose. Conclusion Our work demonstrates simultaneous co-utilization of xylose and arabinose in recombinant strains of S. cerevisiae. In addition, the co-utilization of arabinose together with xylose significantly reduced formation of the by-product xylitol, which contributed to improved ethanol production.
The European Strategy on Invasive Alien Species T-PWS(2002) 8 mandates intensified research by member nations on invasive species. This research will not be restricted solely to the biology and remediation of invasive species, but will also evaluate their adverse health effects and economic impact. Previous studies of these issues have only been carried out in the Unites States of America, or in a limited, regional manner. Consequently, 20 plant and animal species from various problem areas (species which pose a threat to public health; losses to agriculture, fisheries, and forestry; damage to public roads and waterways; costs associated with the protection of native species threatened by non-native species as mandated by Recommendation 77 of the Bern Convention were assessed in Germany nation-wide. The accruing costs were sorted into 3 categories: a) direct economic losses, such as those caused by destructive pest species; b) ecological costs, in the form of extra care and protection of native taxa, biotopes, or ecosystems threatened by invasive species; c) costs of measures to combat invasive species. Because of the nature of available data, as well as the different biology and ecology of the invasive species, each had to be treated individually, and the associated costs vary greatly from species to species. Moreover, not all of the species investigated cause economic losses. Accordingly, a nuanced approach to alien species is essential. Cost assessment of losses deriving from ecological damage was only possible in a few cases. Ongoing, multi-year studies incorporating cost/benefit analysis will be necessary to resolve remaining issues.
In dem Entwurf einer European Strategy on Invasive Alien Species T-PVS (2002) 8 werden verstärkte Forschungsaktivitäten der Mitgliedstaaten angeregt, die nicht nur auf den biologischen Bereich oder Bekämpfung invasiver Arten beschränkt bleiben, sondern auch die Bewertung der Auswirkungen auf Gesundheitswesen und Volkswirtschaft untersuchen sollen. Derartige Studien wurden bisher nur für die Vereinigten Staaten von Amerika oder mit eher regionalen Charakter durchgeführt. Aus diesem Grunde wurden 20 Tiere und Pflanzen aus verschiedenen Problemgebieten (Gesundheitsgefährdende Arten, Schäden in Forst-, Land-, und Fischereiwirtschaft, im kommunalen Bereich, an aquatischen und terrestrischen Verkehrswegen sowie Kosten von Arten, die einheimische Spezies gefährden oder in der Empfehlung 77 der Berner Konvention aufgeführt sind) ausgewählt und beispielhaft für das Gebiet Deutschlands bearbeitet. Die entstehenden Kosten wurden in drei Kategorien aufgeschlüsselt: a) direkte ökonomische Schäden, beispielsweise durch Vorratsschädlinge, b) ökologische Schäden, verursacht durch Pflege und Schutz gefährdeter heimischer Arten, Biozönosen oder Ökosysteme und c) Kosten für Maßnahmen zur Bekämpfung invasiver Arten. Es zeigte sich, dass auf Grund der Datenlage sowie der unterschiedlichen Biologie und Ökologie der invasiven Arten jeweils individuelle Ansätze notwendig waren. Die hier ermittelten Kosten unterscheiden sich stark von Art zu Art. Nicht alle untersuchten Arten verursachen ökonomische Schäden. Eine differenzierte Betrachtung von Neobiota ist nach dem Prinzip der Einzelfallbewertung erforderlich. Die Monetisierung von ökologischen Schäden gelang hierbei nur in wenigen Fällen. Weitergehende, mehrjährige Studien sollten willingness to pay-Analysen einbeziehen, um offen gebliebene Fragen zu beantworten.
Im Rahmen dieser Diplomarbeit konnte das Plasmid pB6 isoliert werden, das die MNNG-Hyperresistenz einer rng1-1-Mutante komplementierte. Das komplementierende Gen dieses Plasmids konnte jedoch weder über 17 Subklone noch über Komplementationsanalysen identifiziert werden. Die Sensibilität gegen „Congo red“ konnte als ein weiterer Phänotyp des Stammes Q2rng1 bestimmt werden. Es wurden im Zuge der Subklonierung des Plasmids pB6 pRS424-Derivate gefunden, die unabhängig vom genetischen Hintergrund des transformierten Stammes, heterogenes Wachstum verursachten. Zurückzuführen war dies auf die Überexpression des ORFs YLR112w alleine oder gemeinsam mit dem ORF YLR111w. Neben der bereits beschriebenen MNNG-Hyperresistenz durch die Überexpression von SNG1 in Wildtypen, GSH-Mutanten und Reparaturdefizienten Stämmen, konnte auch in dem bereits gegen MNNG hyperresistenten Stamm Q2rng1 eine Steigerung der Resistenz durch SNG1 gezeigt werden. Des weiteren wurden Anzeichen gefunden, dass die MethioninAuxotrophie des Stammes Q3 auf die Disruption des GSH1-Gens zurückzuführen war. Zudem konnte nachgewiesen werden, dass die funktionierende GSH-Synthese letal auf eine ero1-Delta-Mutante wirkte. Als Auslöser für die Cadmium-Sensibilität der Stämme Q3 und Q4 konnten die bekannten Mutationen dieser Stämme im GSH1- und im LWG1-Gen ausgeschlossen werden.
Das Ziel dieser Arbeit war, Unterschiede bezüglich der Körperbautypen an Elitekarateka zu eruieren. Hierzu wurden die Konstitutionstypologien nach Conrad, Knußmann, Parnell sowie Heath und Carter, Proportionsfiguren, und das Phantom stratagem verwendet, ebenso wie die Hautfettfalten-Dickenmessungen, die Bioelektrische-Impedanz-Analyse (BIA) und der Body-Mass-Index (BMI). Unter der Annahme Großmeisters Funakoshis, dass es durch ständiges Karatetraining zu körperbaulichen Konstitutionstypusänderungen kommt, wurde diese sportanthropologische Studie durchgeführt. Es sollte geklärt werden, ob innerhalb der Karatewettkampfdisziplinen Kata und Kumite unterschiedliche Körperbautypen, unter Einbeziehung des Sexualdimorphismus, zu finden sind. Die 80 untersuchten männlichen und weiblichen Karateka kamen aus den Disziplinen Kata (Schattenboxen) und Kumite (Freikampf). Im Vergleich dazu wurden 62 und 66 Breitensportkarateka als Kontrollgruppe gegenübergestellt. Das Vergleichskollektiv wurde aus zwei Fitnessstudios rekrutiert, in denen die Probanden 2 - 4 mal pro Woche trainierten. Die Messungen wurden unter standardisierten Bedingungen vom Verfasser dieser Arbeit (und einer Kollegin) durchgeführt. Die Ergebnisse wurden statistisch geprüft. Die Konstitutionstypognosen von Conrad, die durch die Betrachtungen der Somatocharts von Parnell bzw. Heath und Carter bestätigt wurden, zeigten Unterschiede der Leistungssportler gegenüber den Kontrollgruppen. Demnach ist der typische Kata- und Kumiteathlet kleiner und wiegt weniger als die Sportler des Vergleichskollektivs der Fitnessprobanden. Er ist athletischer gebaut und weist ein günstiges Verhältnis von aktiver und passiver Körpermasse auf. Des Weiteren sind innerhalb der Karatedisziplinen die Katasportler endomorpher als ihre Kollegen. Die Kumiteathleten nehmen mehr ektomorphe Positionen in den Somatocharts (Parnell, Heath und Carter) ein. Anhand der Ergebnisse lässt sich die ursprüngliche Vermutung Funakoshis nach differenzierten Konstitutionstypen sowohl für die beiden Untersuchungskollektive als auch innerhalb des Karate für die Wettkampfdisziplinen Kata und Kumite bestätigen. Die vorliegende Studie lässt den Schluss zu, dass es sowohl den Kata- als auch den Kumite-Konstitutionstypus im Karate gibt. Weiterer Forschungsbedarf besteht hinsichtlich longitudinaler Datenerhebungen des Konstitutionswandels jugendlicher Karateka im Laufe ihrer Wettkampfkarriere. Die Karriere beeinflussende Faktoren wie Trainingshäufigkeit, „Trainingsalter“ und Verletzungshäufigkeit, bezogen auf das Leistungsniveau, lassen Spielraum für weiterführende Untersuchungen. Dies gilt auch für eventuelle ethnische Körperbauunterschiede und das Leistungsniveau der Athleten.
Herman P. Schwan [1915–2005] was a distinguished scientist and engineer, and a founding father of the field of biomedical engineering. A man of integrity, Schwan influenced the lives of many, including his wife and children, and his many students and colleagues. Active in science until nearly the end of his life, he will be very much missed by his family and many colleagues.
High-throughput gene trapping is a random approach for inducing insertional mutations across the mouse genome. This approach uses gene trap vectors that simultaneously inactivate and report the expression of the trapped gene at the insertion site, and provide a DNA tag for the rapid identification of the disrupted gene. Gene trapping has been used by both public and private institutions to produce libraries of embryonic stem (ES) cells harboring mutations in single genes. Presently,~ 66% of the protein coding genes in the mouse genome have been disrupted by gene trap insertions. Among these, however, genes encoding signal peptides or transmembrane domains (secretory genes) are underrepresented because they are not susceptible to conventional trapping methods. Here, we describe a high-throughput gene trapping strategy that effectively targets secretory genes. We used this strategy to assemble a library of ES cells harboring mutations in 716 unique secretory genes, of which 61% were not trapped by conventional trapping, indicating that the two strategies are complementary. The trapped ES cell lines, which can be ordered from the International Gene Trap Consortium (http://www.genetrap.org), are freely available to the scientific community.
Background: Cancer gene therapy will benefit from vectors that are able to replicate in tumor tissue and cause a bystander effect. Replication-competent murine leukemia virus (MLV) has been described to have potential as cancer therapeutics, however, MLV infection does not cause a cytopathic effect in the infected cell and viral replication can only be studied by immunostaining or measurement of reverse transcriptase activity. Results: We inserted the coding sequences for green fluorescent protein (GFP) into the proline-rich region (PRR) of the ecotropic envelope protein (Env) and were able to fluorescently label MLV. This allowed us to directly monitor viral replication and attachment to target cells by flow cytometry. We used this method to study viral replication of recombinant MLVs and split viral genomes, which were generated by replacement of the MLV env gene with the red fluorescent protein (RFP) and separately cloning GFP-Env into a retroviral vector. Co-transfection of both plasmids into target cells resulted in the generation of semi-replicative vectors, and the two color labeling allowed to determine the distribution of the individual genomes in the target cells and was indicative for the occurrence of recombination events. Conclusions: Fluorescently labeled MLVs are excellent tools for the study of factors that influence viral replication and can be used to optimize MLV-based replication-competent viruses or vectors for gene therapy.
The 5'-terminal cloverleaf (CL)-like RNA structures are essential for the initiation of positive- and negative-strand RNA synthesis of entero- and rhinoviruses. SLD is the cognate RNA ligand of the viral proteinase 3C (3Cpro), which is an indispensable component of the viral replication initiation complex. The structure of an 18mer RNA representing the apical stem and the cGUUAg D-loop of SLD from the first 5'-CL of BEV1 was determined in solution to a root-mean-square deviation (r.m.s.d.) (all heavy atoms) of 0.59 A (PDB 1Z30). The first (antiG) and last (synA) nucleotide of the D-loop forms a novel ‘pseudo base pair’ without direct hydrogen bonds. The backbone conformation and the base-stacking pattern of the cGUUAg-loop, however, are highly similar to that of the coxsackieviral uCACGg D-loop (PDB 1RFR) and of the stable cUUCGg tetraloop (PDB 1F7Y) but surprisingly dissimilar to the structure of a cGUAAg stable tetraloop (PDB 1MSY), even though the cGUUAg BEV D-loop and the cGUAAg tetraloop differ by 1 nt only. Together with the presented binding data, these findings provide independent experimental evidence for our model [O. Ohlenschläger, J. Wöhnert, E. Bucci, S. Seitz, S. Häfner, R. Ramachandran, R. Zell and M. Görlach (2004) Structure, 12, 237–248] that the proteinase 3Cpro recognizes structure rather than sequence.
We have isolated the human protein SNEV as downregulated in replicatively senescent cells. Sequence homology to the yeast splicing factor Prp19 suggested that SNEV might be the orthologue of Prp19 and therefore might also be involved in pre-mRNA splicing. We have used various approaches including gene complementation studies in yeast using a temperature sensitive mutant with a pleiotropic phenotype and SNEV immunodepletion from human HeLa nuclear extracts to determine its function. A human–yeast chimera was indeed capable of restoring the wild-type phenotype of the yeast mutant strain. In addition, immunodepletion of SNEV from human nuclear extracts resulted in a decrease of in vitro pre-mRNA splicing efficiency. Furthermore, as part of our analysis of protein–protein interactions within the CDC5L complex, we found that SNEV interacts with itself. The self-interaction domain was mapped to amino acids 56–74 in the protein's sequence and synthetic peptides derived from this region inhibit in vitro splicing by surprisingly interfering with spliceosome formation and stability. These results indicate that SNEV is the human orthologue of yeast PRP19, functions in splicing and that homo-oligomerization of SNEV in HeLa nuclear extract is essential for spliceosome assembly and that it might also be important for spliceosome stability.
Background: Costly structures need to represent an adaptive advantage in order to be maintained over evolutionary times. Contrary to many other conspicuous shell ornamentations of gastropods, the haired shells of several Stylommatophoran land snails still lack a convincing adaptive explanation. In the present study, we analysed the correlation between the presence/absence of hairs and habitat conditions in the genus Trochulus in a Bayesian framework of character evolution. Results: Haired shells appeared to be the ancestral character state, a feature most probably lost three times independently. These losses were correlated with a shift from humid to dry habitats, indicating an adaptive function of hairs in moist environments. It had been previously hypothesised that these costly protein structures of the outer shell layer facilitate the locomotion in moist habitats. Our experiments, on the contrary, showed an increased adherence of haired shells to wet surfaces. Conclusion: We propose the hypothesis that the possession of hairs facilitates the adherence of the snails to their herbaceous food plants during foraging when humidity levels are high. The absence of hairs in some Trochulus species could thus be explained as a loss of the potential adaptive function linked to habitat shifts.
Reggie-1 und Reggie-2 stellen eine über diverse Spezies konservierte Proteinfamilie dar und werden in den meisten Geweben exprimiert. Die physiologische Funktion dieser Proteine ist bisher nicht geklärt. Die Reggie-Proteine wurden zunächst im Zusammenhang mit der Regeneration von Axonen retinaler Ganglienzellen des Goldfisches beschrieben. In diesen Zellen wird die Expression beider Proteine nach Läsion des Nervs hochreguliert. Unabhängig davon wurden Reggies aufgrund ihres Sedimentationsverhaltens in Dichtegradienten als Flotilline beschrieben. Dabei ist Reggie-1 identisch mit Flotillin-2 und Reggie-2 mit Flotillin-1. Beide Reggie-Proteine sind Raft-assoziiert. Bei Rafts handelt es sich um Membran-Mikrodomänen, deren Rolle in verschiedenen zellulären Prozessen wie Signaltransduktion, Endozytose und dem Transport von Proteinen beschrieben wurde. Strukturell zeichnen sich Rafts durch einen im Vergleich zur restlichen Membran erhöhten Anteil an Cholesterol und Sphingolipiden aus, der unter anderem in einer herabgesetzten lateralen Beweglichkeit der beteiligten Moleküle resultiert, und so Sortierungs- und Signalvorgänge innerhalb der Zelle begünstigt. Aus der Beobachtung, dass Reggie-2 mit dem Struktur-Vorläuferprotein des Rotavirus interagiert, ergab sich die Fragestellung zu dieser Arbeit. Das Ausschleusen von Rotaviren aus infizierten Zellen ist von Rafts abhängig. Die strukturellen Eigenschaften des Rotavirus-Proteins ähneln Gag, dem Struktur-Vorläuferprotein des Humanen Immundefizienz-Virus und verwandter Retroviren. Das HIV Gag-Protein ist außerhalb des viralen Kontext nach Expression in der Lage, an zellulären Membranen zu assemblieren und Virus-ähnliche Partikel zu bilden. Die molekularen Abläufe dieses Vorgangs, der als budding bezeichnet wird, sind noch nicht im Detail verstanden. Sie werden jedoch sowohl für Gag allein, als auch für die Virusproduktion in infizierten Zellen mit Rafts in Verbindung gebracht. Ein Hinweis darauf ergibt sich aus der Tatsache, dass HIV-infizierte Zellen nach Cholesterol-Depletion kein produktives Virus mehr abschnüren. Im Rahmen dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass Reggie-2 mit HIV-1 Gag interagiert und sich Veränderungen der Reggie-2 Expressions sowohl auf die zelluläre Lokalisation von Gag als auch auf die Produktion Virus-ähnlicher Partikel auswirkt. Die Überexpression von Reggie-2 in HeLa-Zellen führt zu einer Umverteilung von Gag mit erhöhter Lokalisation an der Plasmamembran, an der es dann stark mit Reggie-2 kolokalisiert. Die Verminderung der Reggie-2 Expression mittels siRNA resultiert in einer erhöhten Freisetzung Virus-ähnlicher Partikel aus Gag-transfizierten HeLa-Zellen und in einer eher löslichen Lokalisation des viralen Proteins im Zytoplasma. Der Ort des buddings von HIV ist Zelltyp-abhängig und involviert die zelluläre ESCRT-Maschinerie, die physiologisch für das Sortieren von Proteinen in multivesicular bodies (MVBs) zuständig ist. Gag rekrutiert das ESCRT-System, indem es über ein kurzes Aminosäuremotif an das ESCRT-I Protein TSG101 bindet und dabei die Eigenschaft des zellulären Proteins HRS nachahmt. Im Rahmen dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass Reggie-2 in HeLa-Zellen mit Komponenten der ESCRT-Maschinerie kolokalisiert. Dabei ist denkbar, dass eine Verbindung zwischen ESCRT und Reggie-Proteinen besteht, da Rafts als Signal- und Sortier-Plattformen die physiologischen Prozesse begünstigen könnten, die bei der Funktion von MVBs eine Rolle spielen. Im Gegensatz zu Reggie-2 findet keine Interaktion von Gag mit Reggie-1 statt. Beide Reggie-Proteine sind jedoch biochemisch in produktiven Viren infizierter primärer T-Zellen nachweisbar. Des Weiteren zeigen Immunfluoreszenz-Studien infizierter Lymphozyten, dass beide Reggies in diesen Zellen in einem großen Ausmaß mit Gag kolokalisieren. Der Grund dafür ist wahrscheinlich die Fähigkeit der Reggies zur Homo- und Heterooligomerisierung. Die direkte und spezifische Interaktion von Gag mit dem Raft-assozierten Protein Reggie-2 konnte mit verschiedenen Methoden gezeigt werden. Dabei können die Ergebnisse als Grundlage für ein besseres Verständnis der HIV-Pathogenese dienen, und zusätzlich gibt die mögliche Verbindung von Reggies zum ESCRT-Komplex neue Hinweise auf die zelluläre Funktion dieser Raft-Proteine.
Die postnatale Neovaskularisierung ist eine wichtige Vorraussetzung um Gewebe vor kritischer Ischämie zu schützen. Eine der Grundlagen dieses Prozesses bilden die Angiogenese, bei der neue Kapillaren durch Proliferation und Migration von Endothelzellen aus bereits vorhandenen Blutgefäßen entstehen. Ein zweiter Eckpfeiler ist die Vaskulogenese, die unter anderem durch zirkulierende endotheliale Vorläuferzellen (EPC) vermittelt wird. Homeobox-Gene der Klasse 1 (Hox) sind Transkriptionsfaktoren, die während der Embryonalentwicklung an der Organogenese und der Entwicklung des kardiovaskulären Systems beteiligt sind. Verschiedene Studien weisen darauf hin, dass Homeobox-Proteine auch im adulten Organismus bei der transkriptionellen Regulation von Genen der Angio- und Vaskulogenese eine wichtige Rolle spielen. Die in dieser Arbeit vorliegenden Ergebnisse zeigen eine essentielle Rolle von HoxA9 für die postnatale Neovaskularisierung sowie für die funktionelle Integrität von Endothelzellen und endothelialen Progenitorzellen. HoxA9-defiziente Mäuse hatten einen signifikant verringerten Blutfluss nach einer Hinterlauflauf-Ischämie. Für die reduzierte Neovaskularisierung des ischämischen Gewebes, genügte der Verlust eines einzigen HoxA9-Wildtypallels. Außerdem zeigen HoxA9-defiziente Endothelzellen in vitro eine stark gehemmte Migration sowie eine verringerte Gefäßstrukturbildung. Zusätzlich war auch deren Interaktion mit EPC im Matrigel verschlechtert. Eine Bestätigung dieser Beobachtung zeigten Untersuchungen an endothelialen Vorläuferzellen, die ebenfalls einen Verlust angiogener Funktionen bei verminderter HoxA9-Expression aufwiesen. Neben der postnatalen Neovaskularisierung konnten erste Untersuchungen embryonaler Allantois zeigen, das HoxA9 vermutlich auch in der embryonalen Gefäßbildung beteiligt ist. Diese Theorie wird durch eine nicht-Mendelsche Verteilung der postnatalen Genotypen nach Kreuzung heterozygoter HoxA9-Mäuse unterstützt. Als molekulare Ursachen der Hemmung angiogener Funktionen bei Endothelzellen, konnte die Regulation verschiedener Gene nachgewiesen werden. So ist HoxA9 für die Expression der endothelialen Stickstoffmonoxidsynthase (eNOS), des VEGF-Rezeptors 2 (VEGF-R2), der Adhäsionsmoleküle VE-Cadherin und Integrin v3 sowie des EphB4-Rezeptors von essentieller Bedeutung. Diese von HoxA9 regulierten Gene spielen für die Angio- und Vaskulogenese alle eine entscheidende Rolle. Der EphB4-Rezeptor, die eNOS und der VEGF-R2 werden durch eine direkte Bindung von HoxA9 an den jeweiligen Promotor auf transkriptioneller Ebene reguliert. Bei den Genen Integrin v3 und VE-Cadherin erfolgt die Regulation durch HoxA9 indirekt über andere Gene oder posttranskriptionell. Zusätzlich zum Nachweis der Kontrolle der Genexpression, konnte für den EphB4-Rezeptor nachgewiesen werden, dass dieser von großer Bedeutung für die HoxA9-regulierte Migration ist. Außerdem besitzt der EphB4-Promotor eine für die Regulation der EphB4-Expression durch HoxA9 wichtige Bindungsstelle. In weiteren Versuchen konnte gezeigt werden, dass HoxA9 Schubspannungs-abhängig reguliert wird und dabei auch in die Regulation der Schubspannungs-induzierten Migration und die Schubspannungs-abhängige Expression der untersuchten Zielgene von HoxA9 eingreift. Zusammenfassend zeigen die hier vorgestellten Daten, dass HoxA9 endotheliale Gene vielfältig reguliert, eine entscheidende Rolle bei der Modulation verschiedener endothelialer Funktionen spielt und essentiell für die postnatale Neovaskularisierung ist.
Hodgkin-Lymphom-Biopsien und abgeleitete Zelllinien sind charakterisiert durch die konstitutive Aktivität verschiedener Komponenten des JAK/STAT-Signalweges. Dennoch ist die Bedeutung dieser Signalvermittler für die Pathogenese des klassischen Hodgkin-Lymphoms nicht vollständig geklärt. Gegenstand dieser Arbeit war die Bedeutung der JAK/STAT-Signalkaskade, sowie insbesondere die zellulären Funktionen von STAT3 und STAT6 zu untersuchen. Zu diesem Zweck kamen zwei verschiedene synthetische Kinase-Inhibitoren (AG490, Cucurbitacin I) zum Einsatz. Beide Substanzen blockieren die Kaskade auf Ebene der Kinasen und sind als JAK2/STAT3-spezifische Inhibitoren beschrieben. In dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass die Behandlung mit beiden Substanzen das Wachstum der malignen Zellen hemmte. Gelretardierungsexperimente ergaben jedoch, dass beide Inhibitoren in allen HL-Zelllinien immer mehr als nur ein STAT-Molekül hemmten. Somit konnte keine Aussage über die Bedeutung einzelner STATs getroffen werden. Um die zellulären Funktionen von STAT3 und STAT6 zu untersuchen wurden daher spezifische siRNAs mittels lentiviraler Vektoren exprimiert. Die Rolle von STAT3 bei der Entstehung verschiedenster Krebsarten ist bereits gut charakterisiert. In dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass STAT3 auch in HL-Zellen ein wichtiger Regulator von Proliferation und Apoptose ist. Darüber hinaus konnte auch STAT6 als Vermittler proliferations-fördernder, anti-apoptotischer Signale identifiziert werden. Es konnte zum ersten Mal gezeigt werden, dass eine alleinige Hemmung von STAT6 ausreicht um Apoptose in einigen HL-Zellen auszulösen. Diese Induktion von Apoptose wurde durch Caspasen vermittelt. Um den genauen Mechanismus aufzuklären und um STAT6-Zielgene zu identifizieren, die anti-apoptotisch wirken, wurde eine Microarray-Analyse durchgeführt. Eine weitere Möglichkeit die Aktivierung der JAK/STAT-Signalkaskade zu beeinflussen bieten die SOCS-Proteine. Diese sind direkte Zielgene der STATs und regulieren die Signalvermittlung in einer negativen Rückkopplung. In vielen unterschiedlichen Krebsarten ist diese Negativregulation ausgefallen oder fehlerhaft. Das kann zu einer konstitutiven Aktivierung des JAK/STAT-Signalweges beitragen. Die Bedeutung der SOCS-Proteine im klassischen Hodgkin-Lymphom ist noch unbekannt und wurde in dieser Arbeit untersucht. Es wurden unterschiedliche Mengen endogenes SOCS1 und SOCS3 in verschiedenen HL-Zelllinien und in HL-Biopsien detektiert. In Überexpessionsexperimenten mit SOCS1 und SOCS3 konnte gezeigt werden, dass sowohl SOCS1, als auch SOCS3 nur in Zellen, die wenig endogene SOCS besitzen, die Aktivität von STAT3 und STAT6 inhibieren konnten. Die Überexpression resultierte in einem Wachstumsarrest und einem erhöhten Anteil toter Zellen. In Zellen, die bereits viel SOCS besaßen, konnten weder STAT3 noch STAT6 inhibiert werden. In diesem Zusammenhang wurde ein Modell, das potentielle Möglichkeiten zum Umgehen einer Negativregulation durch die SOCS-Proteine darstellt, diskutiert. Darüber hinaus konnte in Gelretardierungsexperimenten gezeigt werden, dass SOCS3 zusätzlich zu STAT3 und STAT6 in Zellen, die wenig SOCS besaßen, auch NF?B-Aktivierung hemmte. Da NF?B bereits als wichtiger Überlebensfaktor für HL-Zellen beschrieben wurde, trägt dessen Inhibition wahrscheinlich zu einer Hemmung des Wachstums bei. Zusammenfassend konnten in dieser Arbeit STAT3 und STAT6 als potentielle Ziele für therapeutische Ansätze für das klassische Hodgkin-Lymphom identifiziert werden. Einen weiteren Angriffspunkt für zukünftige Strategien liefern die SOCS-Proteine, die eine signalweg-übergreifende Hemmung von Transkritionsfaktoren erlauben.
Lesion of the rat entorhinal cortex denervates the outer molecular layer of the fascia dentata followed by layer-specific axonal sprouting of uninjured fibers in the denervated zone. One of the candidate molecules regulating the laminar-specific sprouting response in the outer molecular layer is the transmembrane chondroitin sulfate proteoglycan NG2. NG2 is found in glial scars and has been suggested to impede axonal regeneration following injury of the spinal cord. The present study adressed the question whether NG2 could also regulate axonal growth in denervated areas of the brain. Therefore, (1) changes in NG2 mRNA and NG2 protein levels, (2) the cellular and the extracellular localisation of the molecule, (3) the identity of NG2 expressing cells, and (4) the generation of NG2-positive cells were studied in the rat fascia dentata before and following entorhinal deafferentation. Laser microdissection was employed to selectively harvest the denervated molecular layer and combined with quantitative reverse transcription-PCR to measure changes in NG2 mRNA amount (6h, 12h, 2d, 4d, 7d post lesion). The study revealed increases of NG2 mRNA at day 2 (2.5-fold) and day 4 (2-fold) post lesion. Immunocytochemistry was used to detect changes in NG2 protein distribution (1d, 4d, 7d, 10d, 14d, 30d, 6 months post lesion). NG2 staining was increased in the denervated outer molecular layer at 1 day post lesion, reached a maximum at 10 days post lesion, and returned to control levels within 6 month. Interestingly, the accumulation of NG2 protein was strongly restricted to the denervated outer molecular layer forming a border to the unaffected inner molecular layer. Using electron microscopy, NG2-immunoprecipitate was localized not only on glial surfaces and in the extracellular matrix but also in the vicinity of neuronal profiles indicating that NG2 is secreted following denervation. Double-labelings of NG2-immunopositive cells with markers for astrocytes, microglia/macrophages, and oligodendrocytes suggested that NG2-cells are a distinct glial subpopulation before and after entorhinal deafferentation. Bromodeoxyuridine-labeling revealed that some of the NG2-positive cells are postlesional generated. Taken together, the data revealed a layer-specific upregulation of NG2 in the denervated outer molecular layer of the fascia dentata that coincides with the sprouting response of uninjured fibers. This suggests that NG2 could regulate lesion-induced axonal growth in denervated areas of the brain.
Homing in with GPS
(2000)
Flight paths of homing pigeons were measured with a newly developed recorder based on GPS. The device consists of a GPS receiver board, a logging facility, an antenna, a power supply, a DCDC converter and a casing. It has a weight of 33g and works reliably with a sampling rate of 1/s with an operation time of about 3 h, providing timeindexed data on geographic positions, ground speed and altitude. The data are downloaded when the bird is recaptured. The devices are fixed to the birds with a harness. The measured complete flight paths show many details: e.g. initial loops flown immediately after release and large detours flown by some pigeons. We are here presenting 3 examples of flight paths from a release site 17.3 km Northeast of the home loft in Frankfurt. Mean speed in flight, duration of breaks and length of the flight path were calculated. The pigeons chose different routes and have different individual tendencies to fly loops over the village close to the release site.
This paper describes a first version of the GPS flight recorder for homing pigeons. The GPS recorder consists of a hybrid GPS board, a patch antenna 19*19 mm, a 3 V Lithium battery as power supply, a DCDC converter, a logging facility and an additional microprocessor. It has a weight of 33g. Prototypes were tested and worked reliably with a sampling rate of 1/sec and with an operation time of about 3 h. In first tests on homing pigeons 9 flight paths were recorded, showing details like loops flown immediately after the release, complete routes over 30 km including detours, rest periods and speed.
An die Signalübertragung im ZNS werden in bestimmten Entwicklungsstadien sehr unterschiedliche Anforderungen gestellt. Im adulten Gehirn dient sie nicht nur der Nachrichtenübermittlung, sondern auch der aktivitätsbasierten Umgestaltung neuronaler Verbindungen bei Lernprozessen und der regenerativen Umgestaltung nach Verletzungen. Im sich entwickelnden Gehirn werden schon frühzeitig Nervenzellen elektrisch erregbar und spontan aktiv. Diese elektrische Aktivität und die dadurch verursachte Transmitterausschüttung spielen bei der selektiven Stabilisierung von Synapsen und damit bei der Ausgestaltung des neuronalen Netzwerks eine große Rolle. Im ZNS von Vertebraten beruht die Wirkung des Neurotransmitters und Neuromodulators Acetylcholin auf den nikotinischen und muskarinischen Acetylcholinrezeptoren. Muskarinische Acetylcholinrezeptoren (mAChRen) koppeln, abhängig von den fünf identifizierten Rezeptorsubtypen (M1- M5), an unterschiedliche intrazelluläre Signalketten an. Dabei interagieren für gewöhnlich die M1, M3 und M5 Rezeptoren mit einem G-Protein des Typs Gq/11, während M2 und M4 ein G-Protein des Typs Gi/o aktivieren. Der Colliculus inferior (IC) ist eine wichtige Verschaltungsstation im auditorischen Mittelhirn von Säugetieren. Inhibitorische und exzitatorische Eingänge werden dort während der Entwicklung mit großer Präzision angelegt und konvergieren auf einzelne ICNeurone. Die physiologische Bedeutung von mAChRen im IC ist weitgehend unerforscht und die Subtypen die im juvenilen IC eine Rolle spielen wurden noch nicht charakterisiert. Es war das Ziel der vorliegenden Arbeit mittels elektrophysiologischer Untersuchungen im IC der juvenilen Ratte (P5-P12) folgende Fragen zu klären: i) Gibt es im IC der jungen Ratte eine Modulation der GABAergen Transmission durch muskarinische Acetylcholinrezeptoren? ii) Welcher muskarinische Rezeptorsubtyp spielt dabei eine Rolle? iii) Welcher intrazelluläre Signalmechanismus ist der Aktivierung des muskarinischen Acetylcholinrezeptors nachgeschaltet? Unter Wirkung von Muskarin kam es bei 41,2% der untersuchten Neurone des Colliculus inferior zu einer Erhöhung der Frequenz der spontanen IPSCs. Die sIPSCs wurden durch Bicucullin blockiert, somit handelt es sich um GABAerge IPSCs. Die Wirkung von Muskarin nahm zu, wenn die Tiere älter als 9 Tage waren. Es wurde gezeigt, dass nAChRen keine Rolle spielen bei der Erhöhung der sIPSC-Frequenz, während eine selektive Blockade der M3-(M5-) mAChRen durch 4-DAMP die Muskarinwirkung blockierte. In der Regel sind die M3-Rezeptoren über folgende Signalkaskade aktiv: Phospholipase C, Kalzium-Calmodulin, NO-Synthase, Guanylatzyklase, die NO-Konzentration und cGMP. Alle Glieder dieser Kaskade wurden untersucht, sie hatten aber keinen Einfluss auf die Muskarinwirkung. Im Gegensatz dazu führte die Erhöhung des intrazellulären cAMP-Spiegels zu einer vergleichbaren Frequenzsteigerung der sIPSCs wie sie unter der Wirkung von Muskarin gemessen wurde. Weiterhin ließ sich die Erhöhung der sIPSC-Frequenz durch Muskarin vollständig aufheben, wenn die intrazelluläre Adenylatzyklase blockiert wurde. Es ist bekannt, dass der M3-(M5-) mAChR über verschiedenste Signalwege den intrazellulären cAMP-Spiegel verringern oder erhöhen kann und dass die Spezifizierung des Rezeptors vom Grad der Rezeptorexpression, dem Zelltyp und der Kombination der Effektormoleküle abhängig ist. Die Abweichung der juvenilen Kaskade vom im erwachsenen Tier üblichen Signalweg hat dabei den Vorteil, dass eine Aufgabentrennung zwischen Netzwerkbildung und Synapsenstabilisierung einerseits und Signalweiterleitung andererseits erfolgt. Beim juvenilen Tier steht die Netzwerkbildung im Vordergrund, beim erwachsenen Tier wird die Signalweiterleitung moduliert. Der sekundäre Botenstoff NO, der weit diffundieren kann, spielt beim juvenilen Signalweg keine Rolle und dies ermöglicht eine klare Trennung der aktivierten von den umgebenden Synapsen. Dadurch wird eine starke Selektion innerhalb der vorhandenen Synapsen ermöglicht und eine aktivitätsbasierte Netzwerkbildung vereinfacht. Die Etablierung funktioneller GABAerger Synapsen ist ausschlaggebend für die Entwicklung des neuronalen Netzwerks. Innerhalb der ersten postnatalen Wochen führt die Aktivierung von GABAA-Rezeptoren zur Depolarisierung der IC-Neurone und zu einer Erhöhung der intrazellulären Ca2+-Konzentration. Acetylcholin potenziert also letztlich den GABA-aktivierten Einstrom von Ca2+ und führt damit zur Erhöhung der intrazellulären Ca2+ Konzentration im postsynaptischen Neuron des IC. Diese modulatorische Wirkung von Acetylcholin könnten damit eine wichtige Rolle bei der Entwicklung und Stabilisierung von inhibitorischen Synapsen im sich entwickelnden IC der Ratte spielen.
Die Hitzestressantwort stellt einen universellen Schutzmechanismus aller lebenden Organismen dar. Infolge einer Temperaturerhöhung werden Hitzestresstranskriptionsfaktoren (Hsf) aktiviert und bewirken eine gesteigerte Expression von Hitzestressproteinen (Hsp). Als molekulare Chaperone schützen diese die Zelle vor durch Hitze verursachten Schäden. In höheren Pflanzen ist dieses Phänomen sowohl auf der Ebene der Hsf als auch der Hsp besonders komplex. Das Ziel der vorliegenden Arbeit war die Untersuchung der Funktion von Komponenten des Chaperonsystems in der pflanzlichen Thermotoleranz. Zur Untersuchung der Thermotoleranz wurde ein transientes Expressionsystem mit Mesophyllprotoplasten aus steril angezogenen Tomatenpflanzen (Lycopersicon esculentum) zweier Linien (WT und CS) verwendet. CS-Pflanzen zeigen Cosuppression von HsfA1 und zeichnen sich durch eine Integration zweier direkt aufeinander folgender Transgenkassetten in invertierter Orientierung aus. Die fehlende Expression von HsfA1 in CS-Pflanzen ist die Folge eines Prozesses, der als RNA-interference (RNAi) bezeichnet wird. In unserem transienten Expressionssystem wurden Mesophyllprotoplasten mit einem Expressionsplasmid transformiert, das für Luciferase aus Photinus pyralis als thermosensitivem, leicht nachweisbarem Reporterprotein kodiert. Mit Hilfe dieses Testsystems konnten wir den Schutz der Luciferase gegen eine thermische Denaturierung bei 41°C (30 min) und die nachfolgende Renaturierung für 120 min bei 25°C in Abhängigkeit von endogenen und transient exprimierten Hsp und Hsf beobachten. Mit Hilfe der RNAi-Technologie und unter Verwendung von genspezifischen inverted repeat-Konstrukten konnten wir weiterhin die Bildung einzelner Komponenten des endogenen Chaperonsystems verhindern und damit ihre Funktion untersuchen. Es zeigte sich, dass in Protoplasten aus CS-Pflanzen praktisch alle hitzestressinduzierten Proteine fehlten und diese nicht in der Lage waren, Thermotoleranz auszuprägen, wie unter Verwendung des Reporterproteins Luciferase nachgewiesen werden konnte. Weiterhin fand keine Bildung cytoplasmatischer Multichaperonkomplexe, der sogenannten Hitzestressgranula (HSG), statt. Dieser Defekt in der Ausprägung von Thermotoleranz konnte durch Expression von HsfA2, HsfA3 und HsfA4b repariert werden. Die Überexpression dieser Hsf führte gleichermaßen zu (1) einer Expression von Chaperonen, (2) Thermoprotektion des Reporterenzyms Photinus pyralis-Luciferase und (3) Bildung von HSG-Komplexen. In weiteren Analysen lag unser Augenmerk insbesondere auf Vertretern der sHsp, sowie der Hsp70- und Hsp101-Chaperonfamilien. Hierbei erwies sich, dass vor allem Klasse CI-sHsp und Vertreter der Hsp70-Famile beim Schutz der Luciferase gegen Denaturierung während eines Hitzstresses eine Rolle spielen, während hauptsächlich Hsp101 und Vertreter der Hsp70-Familie in der darauf folgenden Erholungsphase von Bedeutung sind. Die Untersuchung der Interaktionen von drei Klassen cytoplasmatischer sHsp und ihrer intrazellulären Verteilung im Rahmen meiner Arbeit zeigte, dass jeder dieser Klassen eine unterschiedliche Funktion im Netzwerk cytoplasmatischer sHsp zukommt. Unter Verwendung nativer Gelelektrophorese und indirekter Immunfluoreszenz konnte nachgewiesen werden, dass sHsp der Klassen CI, CII und CIII in der Lage sind, auf der Ebene oligomerer Komplexe zu interagieren und ihre intrazelluläre Lokalisation wechselseitig zu beeinflussen. Proteine der Klasse CII zeigten eine starke Tendenz zur Bildung von Aggregaten, in die Klasse CIII-sHsp rekrutiert wurden. Im Unterschied dazu verfügten Klasse CI-Proteine über die Fähigkeit, diese Aggregate aufzulösen. Die detaillierte Untersuchung von fünf Isoformen der Klasse CI und zwei Isoformen der Klasse CII aus Lycopersicon esculentum ergab, dass diese oligomere Komplexe einer unterschiedlichen Anzahl von Untereinheiten bilden. Nach Coexpression waren Proteine beider Klassen in heterooligomeren Komplexe zu finden. Allerdings deuteten sich bei der Analyse der Fähigkeit einzelner Isoformen der Klasse CI, Heterooligomere mit Klasse CII-Proteinen zu bilden, Unterschiede an. sHsp kommt weiterhin eine Funktion in der Kontrolle der Aktivität von HsfA2 zu. Im Rahmen dieser Arbeit konnte ich zeigen, dass sHsps der Klassen CI und CII völlig unterschiedliche Rollen in der Regulation der intrazellulären Verteilung von HsfA2 spielen. Nach Überexpression in Mesophyllprotoplasten bildete LpHsp17.4-CII, nicht aber das nahe verwandte LpHsp17.3-CII mit HsfA2 große, cytoplasmatische Aggregate. Hsp17-CI dagegen verhinderte die Coaggregation von Hsp17.4-CII mit HsfA2.