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Der tägliche und jahreszeitliche Wechsel in den Lichtverhältnissen bedeutet für alle Lebewesen eine regelmäßige und fundamentale Veränderung ihrer Lebensbedingungen. Mit Hilfe einer Inneren Uhr können Lebewesen regelmäßige Veränderungen ihrer Umwelt antizipieren. Diese Innere Uhr gewährleistet die Generierung eines endogenen, zirkadianen Rhythmus und dessen Synchronisation mit der Umwelt. Bei Wirbeltieren werden diese Funktionen durch einen spezifischen neuronalen Schaltkreis im Gehirn, dem photoneuroendokrinen System (PNS), erfüllt. Das Pinealorgan ist ein essenzieller Bestandteil des PNS. Dort werden photoperiodische Reize und Signale vom endogenen Oszillator in die Synthese des Neurohormons Melatonin umgesetzt. Die vom zentralen Oszillator im SCN gesteuerte Freisetzung von Noradrenalin (NA) aus sympathischen-postganglionären Nervenfasern in das Pinealorgan ist der entscheidende Reiz zur nächtlichen Ankurbelung der Melatoninbiosynthese. Melatonin wird ausschließlich in der Nacht gebildet und fungiert daher als ein Zeithormon. Unmittelbar nach der Synthese wird das Melatonin in die Blutbahn abgegeben und liefert allen Zellen, die mit spezifischen Melatoninrezeptoren ausgestattet sind, die entsprechenden Licht- und Zeitinformationen. NA bewirkt in allen untersuchten Säugetierarten die Aktivierung des Schlüsselenzyms der Melatoninbiosynthese, der AANAT. Die zellulären und molekularen Regulationsmechanismen für die AANAT unterscheiden sich jedoch artspezifisch. So ruft NA in Pinealozyten der Ratte die cAMP/PKA/pCREB-vermittelte Aktivierung der Transkription des Aanat Gens hervor, wogegen in Pinealozyten des Rindes NA die Regulation der proteasomalen Proteolyse des AANAT Proteins kontrolliert. Das übergeordnete Ziel dieser Arbeit war es, zelluläre und molekulare Mechanismen der noradrenergen Signaltransduktionskaskade zu identifizieren, welche für die Steuerung der Melatoninbiosynthese im Pinealorgan von Säugetieren verantwortlich sind. Deshalb wurden in kultivierten Pinealozyten der Ratte und des Rindes sowohl transkriptionale als auch posttranslationale Regulationsmechanismen untersucht, welche durch NA gesteuert und an der Regulation des Schlüsselenzyms der Melatoninbiosynthese, der AANAT, beteiligt sind. Mit Hilfe der Immunzytochemie konnte erstmalig das subzelluläre Verteilungsmuster sämtlicher bekannter regulatorischer (R)-Untereinheiten der PKA Typ I und II in Pinealozyten der Ratte nachgewiesen werden. Ebenso wurden die A Kinase Anker Proteine (AKAP) 95 und 150 immunzytochemisch dargestellt, wobei zwischen der AKAP 150-Immunreaktivität (IR) und der IR von RII alpha bzw. RII beta eine weitgehende Kolokalisation in der Nähe der Zellmembran der Pinealozyten vorlag. Diese Kolokalisationen deuten eine funktionelle Interaktion der PKA Typ II mit AKAP 150 in Pinealozyten der Ratte an. Keine Funktion bei der Steuerung der Melatoninbiosynthese scheinen der cAMPregulierte Austauschfaktor EPAC und die monomere GTPase Rap zu besitzen. So konnte eine Stimulation kultivierter Pinealorgane mit 8-CPT-2'-O-Me-cAMP, einem EPAC-spezifischen cAMP-Analog, einzeln oder in Kombination mit Noradrenalin (NA) weder den AANAT Proteingehalt noch die Freisetzung von Melatonin beeinflussen. Die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit belegen, dass die cAMP-vermittelte Aktivierung der Melatoninbiosynthese ausschließlich auf die PKA zurückzuführen ist. Ebenso beeinflussten weder NA noch 8- CPT-2'-O-Me-cAMP den Aktivitätszustand von ERK 1 und 2. Eine Erhöhung des cAMP-Spiegels in Pinealozyten der Ratte scheint somit keinen Einfluss auf den Aktivitätszustand von ERK 1 und 2 im Pinealorgan der Ratte auszuüben. In der vorliegenden Arbeit konnte gezeigt werden, dass die schnelle Dephoshorylierung von pCREB eine entscheidende Funktion bei der akuten Herabregulation des CRE-tragenden Aanat Gens darstellt und somit eine wichtige Rolle für die Beendigung der Melatoninbiosynthese im Pinealorgan der Ratte spielt. Nach Entzug des NA-Stimulus kam es innerhalb von 30 Minuten zu einer fast vollständigen pCREB Dephosphorylierung, die mit einer Abnahme der Aanat mRNA, des AANAT Proteingehalts und der Melatoninbiosynthese einherging. Die pCREB Dephosphorylierung und die Abnahme der Melatoninbiosynthese konnten durch PSP-Inhibitoren verhindert werden. Aufgrund der pharmakologischen Untersuchungen und des intrazellulären Verteilungsmusters scheint die PSP 1 die pCREB Dephosphorylierung im Zellkern der Rattenpinealozyten zu steuern. Mit Hilfe eines Ko-Immunpräzipitationsansatzes wurde erstmalig eine NA-abhängige Komplexbildung von AANAT und Protein 14-3-3 in Pinealozyten der Ratte und des Rindes dargestellt. Die vorliegenden Untersuchungen belegen somit, dass Tierarten, welche generell eine unterschiedliche molekulare Strategie zur Regulation der Melatoninbiosynthese entwickelt haben, mit der NA-abhängigen Ausbildung des AANAT/Protein 14-3-3 Komplexes jedoch einen gemeinsamen Mechanismus zur Regulation des AANAT Proteins besitzen. Ferner wurde die funktionelle Bedeutung des Cannabinoidsystems für die Steuerung der Melatoninbiosynthese im Pinealorgan der Ratte untersucht. Mit Hilfe der Immunhistochemie und des Immunoblotverfahrens konnten erstmalig CB 1- und 2 Rezeptorproteine im Pinealorgan der Ratte dargestellt werden. Die Stimulation kultivierter Pinealorgane der Ratte mit THC hatte keinen Einfluss auf den pCREB- und AANAT Proteingehalt, konnte jedoch die NA-induzierte Aktivierung des AANAT Proteins und die Melatoninfreisetzung hemmen. Das Pinealorgan der Ratte und des Rindes dient als ein gut geeignetes Modellsystem zum Studium von Signalskaskaden, da hier Noradrenalinreize in ein definiertes, einfach messbares Endprodukt, die Biosynthese und Sekretion des Neurohormons Melatonin, umgewandelt werden. Die in dieser Arbeit aufgedeckten Signaltransduktionsprozesse liefern daher nicht nur neue Einblicke in die Regulationsprozesse der Melatoninbiosynthese, sondern dienen ebenso dem besseren Verständnis von Signalübertragungs- und Signalverarbeitungsprozessen in komplexeren neuronalen und neuroendokrinen Systemen.
Ziel dieser Arbeit ist es, eine Lücke im methodischen Spektrum neurobiologischer Methoden zu schließen. Es ist heute möglich, das Gehirn auf unterschiedlichen Ebenen zu beschreiben. Es stehen jedoch keine Methoden zur Verfügung, um die Anordnung der Zellen innerhalb eines Nukleus quantitativ zu beschreiben. Die Anzahl und die Anordnung der Zellen ist jedoch eine essentielle Voraussetzung, um die Funktion eines Nukleus zu verstehen. Das hier vorgestellte Verfahren zur Rekonstruktion eines Nukleus basiert auf Nissl-gefärbten Semidünnschnitten der Medialen Superioren Olive (MSO) der Wüstenrennmaus Meriones ungiuculatus. Diese werden mit einer Digitalkamera lichtmikroskopisch aufgenommen und bilden die Basis der Rekonstruktion. In einem ersten Schritt werden innerhalb einer Schnittebene mehrere Einzelbilder patchworkartig zu einem Image Mosaic zusammengefügt. Durch diesen Schritt ist die Auflösung innerhalb einer Schnittebene praktisch unbegrenzt. Das Verfahren beinhaltet mehrere Kontrollmechanismen und funktioniert praktisch fehlerfrei. Danach werden die Bilder farblich korrigiert und mit Methoden der Mustererkennung werden die Zellkerne extrahiert. Die Extraktion der Zellkerne steht in ihrer Qualität einer manuellen Extraktion in nichts nach. Die Zellkerne dienen als Grundlage für den Archimedes-Alignment-Algorithmus, der die Schnittserie in einen dreidimensionalen Bezug setzt, indem aufeinander folgende Schnitte aneinander ausgerichtet werden. Auch dieses Verfahren beinhaltet eine Kontrolle und funktioniert fehlerfrei. Aus diesen Daten kann dann eine Rekonstruktion erstellt werden. Diese wird weiter ausgewertet und ergibt schließlich ein dreidimensionales Abbild des untersuchten Bereichs. Sämtliche Verfahrensschritte arbeiten entweder fehlerfrei oder mit einer nur sehr geringen Fehlerrate. Somit stellt dieses Verfahren eine robuste, effiziente und universell anwendbare Möglichkeit für die umfassende Analyse der Neuronenverteilung im ZNS dar. Das Verfahren eröffnet die Möglichkeit, Nuklei dreidimensional zu untersuchen, bietet aber auch einen Ansatzpunkt um mittels histologischer Daten weiteres Datenmaterial (etwa elektrophysiologischer oder morphologische Daten) zu integrieren.
Es wurden Untersuchungen über die Stoffwechselleistungen der im Most und Wein vorkommenden Essigsäurebakterien der Gattungen Acetobacter (13 Stämme) und Gluconobacter (2 Stämme) während der Weinbereitung durchgeführt. Die 15 Stämme der Essigsäurebakterien stammten aus der Sammlung des Fachgebiet Mikrobiologie und Biochemie Forschungsanstalt Geisenheim sowie aus der CCM (Czechoslovak Collection of Microorganisms). Die Stoffwechselleistungen, die unter Berücksichtigung des Zucker-Säure-Stoffwechsels beobachtet wurden, wurden bei Trauben der Sorten Riesling, Rotberger, Portugieser und Reichensteiner, den Mosten der Sorten Riesling, Portugieser und Rotberger und den Weißweinen der Sorten Riesling, Müller Thurgau und Rotwein eines Sortengemisches sowie Weiß- und Rotweinen verschiedener Jahrgänge aus Tunesischen Weinanbaugebieten durchgeführt. Die Essigsäurebakterien wurden auf die Nährböden (Traubenbeeren, Moste und Weine) beimpft und nach festgelegten Zeiten geerntet und analysiert. Die Beimpfung der Traubenbeeren erfolgte durch Besprühen der intakten und angestochenen Beeren mit den Bakterienkulturen. Im Verlauf der Arbeit wurden verschiedene Analyseverfahren angewandt. Dünnschichtchromatographie wurde für die qualitative Analyse der Zuckersäure eingesetzt. Die Ketozuckersäuren wurde durch Flüssigchromatographie sowie HPLC bestimmt. Außerdem auch für die Bestimmung organischer Säuren, Zucker und Alkohole. Ethanol wurden auch mit Titration nach der Methode von Rebelein bestimmt. Gluconsäure, Essigsäure, Glucose, Fructose, D- und L-Milchsäure sowie Dihydroxyaceton wurden enzymatisch spektrophotometrisch quantifiziert. Der Vergleich der Ergebnisse von intakten und angestochenen Beeren zeigte, dass bei angestochenen Beeren ein schnelleres Wachstum der Essigsäurebakterien und damit auch höhere Stoffwechselleistungen erfolgten. Gluconsäure, 2-Ketogluconsäure, 5-Ketogluconsäure sowie 2,5-Diketogluconsäure können von verschiedenen Essigsäurebakterienstämmen produziert werden. Es scheint so, als ob die verschiedenen Arten der Essigsäurebakterien spezifische Muster der Gluconsäure Oxidationprodukte aufweisen. In synthetischen Medien produzierten Essigsäurebakterien große Menge Gluconsäure. Nach 30 Tage produzierten Essigsäurebakterien der Stämme Acetobacter aceti var. aceti, A. liquefaciens Stamm 1347-2, A. xylinum und Gluconobacter oxydans var. suboxydans im Glucosemedium jeweils mehr als 40 g/l Gluconsäure. 5-Ketogluconsäure wurden in allgemein mehr als 2-Ketogluconsäure produziert. Von allen beobachteten Stämmen produzierte nur A. liquefaciens 2,5-Diketogluconsäure. Sowohl in den roten- als auch in den weißen Traubenbeeren produzierten sie Gluconsäure und ihre Oxidationsprodukte. In 15 Tagen wurden bis 11,5 g/l Gluconsäure, 5,3 g/l 2-Ketogluconsäure und bis 9,8 g/l 5-Ketogluconsäure produziert. Das Wachstum der Essigsäurebakterien in den Weinen verlief sehr langsam. In den Weinen wurden von den Essigsäurebakterien nur Essigsäure produziert. Die Produktion von Essigsäure war bei den unterschiedlichen Stämme sehr verschieden. A. aceti var. aceti produzierte die höchste Konzentration von Essigsäure sowohl bei Rotwein als auch bei Rieslingwein. A. aceti var. aceti produzierte bis 87 g/l in Rotwein und bis 61 g/l in Rieslingwein Bei Untersuchungen fertiger Weine wurden außer Gluconsäure auch 2-Ketogluconsäure, 5-Ketogluconsäure und 2,5-Diketogluconsäure gefunden, die auf den Stoffwechsel der Essigsäurebakterien aus Glucose und Gluconsäure zurückgeführt werden müssen. In den untersuchten fertigen Weinen aus Tunesien wurde 0,2 - 7,4 g/l Gluconsäure, 2 - 35 mg 2-Ketogluconsäure, 6 - 30 mg/l 5-Ketogluconsäure und bis 14 mg 2,5-Diketogluconsäure analysiert. Nach den vorliegenden Untersuchungsergebnissen stammen die hohen Gluconsäurekonzentrationen in den Weinen von Gluconobacter oxydans. Die Herkunft der Gluconsäure in diesen Weinen aus dem Stoffwechsel von Essigsäurebakterien wird durch die hochsignifikanten Beziehungen zwischen Gluconsäure und 2-Ketogluconsäure, sowie 2,5-Diketogluconsäure belegt.
Die Neubildung von Aromasubstanzen durch Carotinoidabbau ist eine der vielen Veränderungen der Weine während der Flaschenlagerung. In gealterten Weinen entstehen aromawirksame Kohlenwasserstoffe, C13-Komponenten, u.a. TDN aus den Carotinoidsubstanzen der Weinbeeren. TDN, das natürlich in Pflanzenprodukten vorhanden ist, liefert einen wichtigen Beitrag zum typischen Kerosin-ähnlichen Charakter in Flaschen gealterter Rieslingweine. Als TDN-Precursoren sind oft die Carotinoide Lutein und ß-Carotin vorgeschlagen worden. Die TDN-Bildung wird von mehreren Faktoren beeinflusst. Außer vom Carotinoidgehalt in den Beeren bzw. Mosten, auch von den Traubensorten und -klonen, den verwendeten Hefen und auch durch die Jahrgänge. Andere Aspekte, wie das Vorhandensein von Luteinestern, die Verhältnisse der Carotinoide untereinander, weinbauliche Maßnahmen, wie Entblätterungen, sowie die Gesamtsäure bzw. die pH-Werte der Traubenmaischen, die die TDN-Bildung beeinflussen könnten, wurden ebenfalls mit einbezogen. Die TDN-Bildung während des Weinherstellungsprozesses sowie die TDN-Entwicklung bei der Alterung und dem damit verbundenen Carotinoid-Abbauprozess wurde in dieser Arbeit durch Modellversuche zu klären versucht. Während der Studien wurden Traubenbeeren, Moste und Jahrgangsweine der Sorte Riesling und anderer weißer Sorten verwendet. Der Einfluss von Mikroorganismen auf den TDN-Gehalt wurde durch Verwendung von 9 Hefestämmen (Saccharomyces spp.) und auch bei Spontangärung untersucht. Die Extraktionen der Carotinoide aus Trauben, Mosten und Weinen wurden unter verschiedenen Bedingungen durchgeführt. Eine neue Methode musste wegen des hohen Wasser-, Zucker- und Säuregehalt des Mostes und Weines sowie der gärenden Moste verschiedener Dichten entwickelt werden. Für die Analysen der Carotinoide sowie die deren Luteinestern wurden verschiedene HPLC-Verfahren eingesetzt. Als stationäre Phase dienten Säulen LiChroCART 250-4 HPLC Cartridge LiChrospher 100 RP18 (5µm), RP18 125-4 M LiChroCART, sowie eine 250x4,6 mm (5µm) Hypersil Elite C18. Die Säulentemperatur lag bei 28°C. Die Trennungen wurden mit verschiedenen mobilen Phasen durchgeführt. Mit dem Einsatz des Dioden-Array-Detektor wurden verschiedene Wellenlänge zur Messung der einzelnen Carotinoide verwendet. Lutein wurde bei 450(±4) nm bestimmt, während Zeaxanthin, ß-Apo-8'-Carotinal, ß-Carotin und Chlorophyll-b bei 460(±6) nm und Chlorophyll-a bei 440(±4) nm, gemessen wurden. Außerdem wurden auch typische Wellenlängen wie 473(±6) nm für ß-Apo-8'-Carotinal und 662(±4) nm für Chlorophyll-a eingesetzt. Die TDN-Konzentrationen der Proben wurden durch Gaschromatographie/ Massenspektrometrie analysiert. Die mögliche TDN-Bildung unter Berücksichtigung des Carotinoidabbaus wurde außer in Jungweinen auch in Blankweinen nach Zugabe von Reinsubstanzen bzw. Beerenextrakten beobachtet. In den trüben Jungweinen veränderten sich die Mengen aller Farbstoffe während der Gärung. Die bedeutendsten Veränderungen der Carotinoid-Inhaltstoffe fanden nach dem Erreichen der Maximum-Werte der gebundenen ß-Glucosidaseaktivität der Hefen statt. Die größere Aktivität bei Kellertemperatur, die ebenfalls von der Populationszahl abhängt, verursachte auch die größeren Veränderungen des Carotinoidgehaltes. Es wird festgestellt, dass nach der Gärung nur noch die Hälfte der Konzentrationen der Carotinoide und Chlorophylle übrig geblieben ist und die Bildung von TDN bereits während der Gärung stattgefunden hat. Es wurde gezeigt, dass der Lutein- bzw. der TDN-Gehalt in Jungweinen mit der Glucosidaseaktivität der verwendeten Hefen korreliert werden kann. Dass der Zusammenhang zwischen dem Lutein in Mosten und den TDN-Konzentrationen in den Weinen bei den Rieslingklonen deutlicher ist als bei den anderen Sorten, zeigt dass Lutein ein TDN-Precursor ist. Die Verhältnisse von Lutein zu ß-Carotin ist in den Rieslingtraubenbeeren größer als in den Beeren der anderen "Weißen-Sorten". Die TDN-Bildung in Weinen, die aus den Mosten mit niedrigeren pH-Werten gewonnen wurden, war höher als solche aus Mosten mit höherem pH-Wert. Bei den Weinen aus Trauben der entblätterter Rebstocke zeigten höhere TDN-Gehalt, weil solche weinbauliche Maßnahmen die Konzentrationen der gelöster Carotinoide in den Trauben und folgend auch in den Jungweinen erhöht. Lutein, ß-Carotin und Zeaxanthin sind die Carotinoid-Hauptprecursor bei der TDN-Bildung. Beim prozentualen Vergleich deren Verluste während der Gärung und Lagerung ist der bei Lutein bzw. Zeaxanthin grösser als der bei ß-Carotin. Dabei sind die Mengen maßigen Verluste von ß-Carotin höher als bei Lutein und Zeaxanthin. Als TDN-Precursor sind die Carotinoide Lutein bzw. Zeaxanthin labiler als ß-Carotin. Zeaxanthin wurde nur in sehr geringen Mengen in der Traubenbeeren gefunden. Die Reinsubstanzen Lutein bzw. ß-Carotin zeigten auch deutlich ihren Precursor-Charakter in Hinblick auf die potentielle TDN-Bildung. Durch Säurehydrolyse der Reinsubstanzen bei 50oC zeigte es sich, dass normales TDN, TDN+2 und TDN+4 in D2O (2H2O) aus Lutein gebildet wurde. Aus ß-Carotin wurde nur wenig TDN erzeugt.
Lipophile, sedimentgebundene Substanzen sind für endobenthische Tiere in hohem Maße bioverfügbar und können von diesen aufgenommen und angereichert werden. Für benthivore Fische besteht damit das Risiko, diese Chemikalien mit der Nahrung aufzunehmen. Die Aufkonzentrierung sedimentgebundener Chemikalien über zwei oder mehr trophische Ebenen (Biomagnifikation) kann somit durch die Bestimmung der Biokonzentration von Chemikalien in Fischen nach der OECD-Richtlinie 305 (OECD 1996) nicht adäquat erfasst werden. Zur standardisierten Bestimmung der Bioakkumulation und Biomagnifikation wurde eine einfache, zwei trophische Stufen umfassende Labornahrungskette etabliert. Diese bestand aus dem endobenthischen Oligochaeten Tubifex tubifex (MÜLLER) als Beute und dem Dreistachligen Stichling (Gasterosteus aculeatus LINNÉ) als Prädator. Die Experimente wurden mit 14C-markiertem Hexachlorbenzol und Terbutryn in dotiertem künstlichem Sediment und rekonstituiertem Wasser durchgeführt. Um den Einfluss einzelner Expositionspfade an der Gesamtanreicherung der Modellchemikalien zu quantifizieren, wurden die Fische gegenüber dotiertem Wasser bzw. dotiertem Sediment (Biokonzentrationsszenario), vorexponierten Würmern (Biomagnifikationsszenario) und Kombinationen dieser Aufnahmepfade (Bioakkumulationsszenario) exponiert. Sedimentgebundenes HCB wurde im Bioakkumulationsszenario sowohl in den Tubificiden (BAFWurm/Sediment (FG/FG) = 7,8) als auch in den Fischen (AFFisch/Wasser (FG/FG) = 52500; AFFisch/Sediment (FG/FG) = 47; AFFisch/Wurm (FG/FG) = 3,2) deutlich angereichert. Da die Gewebekonzentration von HCB im Räuber, auch auf Basis lipidnormierter Konzentrationen, die Konzentration in seiner Beute überstieg (AFFisch/Wurm (lipidnormiert) = 1,3), kann von einer Aufkonzentrierung der Chemikalie entlang der Labornahrungskette ausgegangen werden (Biomagnifikation). Es konnte gezeigt werden, dass die Exposition gegenüber der Kombination sämtlicher Aufnahmepfade zu deutlich höherer Anreicherung in den Fischen führte als im Falle einzelner Expositionspfade. Ein Vergleich der Ergebnisse der einzelnen Expositionsszenarien erlaubt den Schluss, dass HCB von den Fischen im Bioakkumulationsszenario zu ungefähr gleichen Teilen über das Wasser (45%) und über die Nahrung (41%) aufgenommen wurde, während die Anwesenheit kontaminierten Sediments nur mit 14% zur Gesamtanreicherung beitrug. 14C-Terbutryn wurde im Bioakkumulationsszenario - auf Basis der Gesamtradioaktivität - sowohl in den Tubificiden (AF Wurm/Sediment (FG/FG) = 4,4) als auch in den Fischen (AFFisch/Wasser (FG/FG) = 323; AFFisch/Sediment (FG/FG) = 10; AFFisch/Wurm (FG/FG) = 1,4) angereichert. Allerdings wurde Terbutryn in den Stichlingen zum überwiegenden Teil zu einem polareren Metaboliten transformiert (84%). Daher müssen zur Abschätzung der Anreicherung von Terbutryn die auf den Gehalt an Ursubstanz korrigierten Gewebekonzentrationen und Anreicherungsfaktoren betrachtet werden. Hierbei wird deutlich, dass Terbutryn nicht entlang der Labornahrungskette aufkonzentriert wurde (AFFisch/Wurm = 0,09). Ein Vergleich der Ergebnisse der einzelnen Expositionsszenarien zeigt, dass der Hauptaufnahmepfad von 14C-Terbutryn in Stichlingen das umgebende Wasser ist, während die Anwesenheit kontaminierten Sediments und die Aufnahme über die Nahrung eine untergeordnete Rolle spielen. Da die Messung der Bioakkumulation und Biomagnifikation von sedimentassoziierten Substanzen sehr aufwendig ist, werden zur Abschätzung ihres Risikopotentials vermehrt mathematische Modelle entwickelt und eingesetzt, die eine Chemikalienanreicherung in Nahrungsketten vorhersagen sollen. Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurden die Vorhersagen dreier Modelle mit den experimentell ermittelten Daten verglichen. Hierdurch sollte sowohl die Eignung des entwickelten Testsystems als auch der verwendeten Modelle als nützliche Instrumente des environmental risk assessment überprüft werden. Die Vorhersagen der drei Modelle bei Applikation auf die Daten der Labornahrungskette stimmen gut mit den experimentell bestimmten Konzentrationen von HCB und Terbutryn in den Tubificiden und Fischen überein. Für HCB sagen alle drei Modelle eine Biomagnifikation in der Labornahrungskette vorher. Die Modelle unterschätzen die gemessenen Konzentrationen in den Fischen mit einem Faktor von 1,1 - 1,7 nur geringfügig. Die Konzentration in den Tubificiden wird vom Gobas/Morrison-Modell sehr präzise vorhergesagt (Unterschätzung um Faktor 1,1), während sie im Campfens/Mackay-Modell (Faktor 2,1) und Gobas-Modell (Faktor 6,3) deutlicher unterschätzt wird. Speziell die dem Campfens/Mackay- und Gobas-Modell zugrunde liegenden Annahmen zur Anreicherung in benthischen Organismen erwiesen sich für HCB und Tubificiden als unzureichend zu sein, da die Modelle hierbei nur die Aufnahme aus dem Porenwasser berücksichtigen. Für Terbutryn sind die Modellvorhersagen sehr viel ungenauer als für HCB, da vor allem die starke Metabolisierung von Terbutryn in den Stichlingen unterschätzt wird. Dies resultiert in einer Überschätzung der Terbutryn-Konzentration in den Fischen (Faktor 5,8 - 6,4). Allerdings bleiben zwei Punkte festzuhalten: 1) Die Modelle sagen keine Biomagnifikation von Terbutryn in der Labornahrungskette vorher. 2) Die Modellvorhersagen bestärken die Annahme, dass die Anreicherung von Terbutryn in den Fischen dominiert ist von der Aufnahme aus dem umgebenden Wasser über die respiratorische Oberfläche. Die analysierten Modelle können bei entsprechender Weiterentwicklung als nützliche Instrumente für eine erste Abschätzung des Risikos der Bioakkumulation sedimentgebundener, hoch lipophiler Substanzen in aquatischen Nahrungsketten im Rahmen der Risikoabschätzung (environmental risk assessment) dienen. Zum gegenwärtigen Entwicklungsstand ist die Labornahrungskette jedoch den Modellen vorzuziehen, da sie die konservativeren Daten liefert. Für eine abschließende Beurteilung der vorgestellten Methoden bedarf es allerdings einer Verbreiterung der Datenbasis.
Die Regulation des Zellzyklus wird durch Phosphorylierung und Dephosphorylierung gesteuert. Schlüsselenzyme sind dabei die Cdk/Cyclin-Komplexe. Für den Eintritt und das Durchlaufen der Mitose von besonderer Bedeutung ist die Polo-like Kinase 1 (Plk1). Zur Aufklärung Mitose-spezifischer Signalwege wurden in dieser Arbeit neue Interaktionspartner der Plk1 gesucht. Die Bedeutung dieser Interaktionen für Zellzyklus und Mitose sollten näher charakterisiert werden. In dieser Arbeit konnte gezeigt werden, daß Plk1 direkt mit humanem Cyclin B1, der regulatorischen Untereinheit des M-phase-promoting-factors (MPF), interagiert. Dabei konnte festgestellt werden, daß Plk1 in der Lage ist, Cyclin B1 innerhalb dessen cytoplasmic retention signals (CRS) am Ser-133 zu phosphorylieren. Ferner konnte gezeigt werden, daß die Phosphorylierung der CRS in einer synergistischen Weise durch Plk1 und MAPK (Erk2) stattfindet. Vorphosphorylierung der CRS durch MAPK an Ser-126 und Ser-128 führt nicht nur zu einer 3-4 fach stärkeren Phosphorylierung durch Plk1, sondern auch zur Entstehung neuer Phosphorylierungs-Stellen für Plk1. Die hier aufgeführten Daten zeigen, daß durch synergistische Phosphorylierung der CRS, an der Plk1 beteiligt ist, der rapide nukleäre Import des Cyclin B1/Cdk1-Komplexes in der Prophase gesteuert wird. Dieser rapide Import in den Kern ist Voraussetzung für die Auflösung der Kernmembran in der Prometaphase. Damit konnte gezeigt werden, daß Plk1 dazu beiträgt, den MPF in den Kern (zu seinen Substraten) zu bringen, um früh-mitotische Ereignisse zu induzieren. Mitotische Kinasen (wie MPF, aber auch MAPK) phosphorylieren ihre Substrate oft an Ser/Thr-Pro-Motiven. Sind diese Motive phosphoryliert (pSer/Thr-Pro), so können sie von Pin1, einer Peptidyl-Prolyl-cis/trans-Isomerase isomerisiert werden. In dieser Arbeit wurde gezeigt, daß Plk1 mit Pin1 interagiert. Dabei bindet Plk1 an die Protein-Interaktionsdomäne (WW-Domäne) von Pin1, ist aber gleichzeitig in der Lage, Pin1 innerhalb seiner katalytischen Domäne (PPIase Domäne) zu phosphorylieren. Es konnte gezeigt werden, daß das Ser-65 in Pin1 eine Phosphorylierungs-Stelle für Plk1 darstellt. Da bekannt war, daß Vortäuschung einer Phosphorylierung an Ser-16 oder Ser-67 die Pin1-Aktivität hemmt, wurde ein ähnlicher Effekt für Ser-65 erwartet. Jedoch führte die Vortäuschung der Phosphorylierung an Ser-65 nicht zu einer Reduktion der PPIase-Aktivität von Pin1. In dieser Arbeit konnte erstmals gezeigt werden, daß Pin1 über das Proteasom abgebaut wird. Die Vortäuschung der Ser-65-Phosphorylierung führt zur Stabilisierung des Pin1-Proteins. Damit ist Plk1 das erste bekannte Enzym, welches Pin1 durch Phosphorylierung stabilisiert.
One of the known apoptotic pathways in mammalian cells involves release of mitochondrial Cytochrome c into the cytosol. Cyt c then together with ATP or dATP induces a conformational change in the adaptator protein Apaf-1 (a homologue of the C. elegans CED4 protein) (Zou, Henzel et al. 1997), leading to its oligomerization and the recruitment of several pro-Casp-9 molecules. This protein complex assembly called "apoptosome" leads to the activation of Casp-9 which then initiates or amplifies the caspase cascade. The cell death program can be stalled at several points and we were interested in identifying new proteins inhibiting cell death downstream of Cyt c release. This thesis describes how I have screened a cDNA library derived from a pool of human breast carcinomas in a yeast-based survival screen, using the S. pombe yeast strain HC4 containing an inducible CED4 construct(James, Gschmeissner et al. 1997). The screen resulted in the identification of six proteins displaying cell death-inhibiting activity in S. pombe as well as anti-apoptotic potential in mammalian cells. Those six molecules were RoRet (Ruddy, Kronmal et al. 1997), Aven (Chau, Cheng et al. 2000), Fte-1/S3a (Kho, Wang et al. 1996), PGC2 (Padilla, Kaur et al. 2000; Goetze, Eilers et al. 2002), SAA1-2ß (Moriguchi, Terai et al. 2001) and FBP (Brockstedt, Rickers et al. 1998) of which I selected RoRet, Aven and Fte-1/S3a for further analysis. RoRet is a new anti-apoptotic molecule that can inhibit the mitochondrial pathway via its PRY-SPRY domain. RoRet does not seem to bind to Apaf-1, and does not co-localize with the activated Apaf-1/Caspase-9 complex. Aven was published to act as an anti-apoptotic protein and suggested to function via the recruitment of Bcl-XL to Apaf-1. This work shows that its C-terminal domain can bind to Apaf-1 and has a strong anti-apoptotic activity by itself. Moreover, Aven co-localizes with the activated Apaf-1/Caspase-9 complex suggesting that it is a component of the apoptosome. Furthermore, the expression of Aven is regulated in mammary glands during the pregnancy cycle. Fte-1/S3a has been already implicated in increased transformation capacity of v-Fos in fibroblasts (Kho and Zarbl 1992; Kho, Wang et al. 1996). This work shows that it has anti-apoptotic activity and can protect against Bak- and Apaf-1-induced apoptosis. It can bind directly to activated Apaf-1 at the linker domain between the WD40 repeats and the CED4-like domain, suggesting that it may protect by sequestering the activated Apaf-1 to some organelles whose nature remains to be determined. Moreover, expression studies on mRNA and protein level showed upregulation of Fte-1/S3a in colon, lung and kidney carcinoma. Hmgb1 (Flohr, Rogalla et al. 2001; Pasheva, Ugrinova et al. 2002; Stros, Ozaki et al. 2002) was identified during a survival screen performed with a NIH 3T3 mouse fibroblast cDNA library in a Bak-expressing yeast S. pombe strain. HMGB1 can protect against Bak-, UV-, FasL- and TRAIL-induced apoptosis. Significant overexpression of HMGB1 was found in breast and colon carcinoma, and elevated mRNA amounts were detected in uterus, colon and stomach carcinoma, suggesting that it may be a tumour marker (Brezniceanu et al., 2003).
Der Typ 1 Diabetes mellitus (IDDM) ist eine multifaktorielle Erkrankung deren Risiko zu 50-60% von genetischen Faktoren vermittelt werden, wobei dem HLA-System auf Chromosom 6 (IDDM1) eine Schlüsselrolle zugesprochen wird. Innerhalb dieser Genregion befinden sich die beiden solitären retroviralen "long terminal repeats" (LTRs) DQ-LTR3 und DQ-LTR13. Sie können theoretisch mit Hilfe ihrer regulatorischen Elemente die Expression benachbarter funktioneller Gene beeinflussen. Im Rahmen der Fragestellung nach einer möglichen Funktion retroviraler LTRs im Kontext des Typ 1 Diabetes mellitus ist das unmittelbar benachbarte DQB1 Gen ein Kandidatengen von besonderer Bedeutung. Im Rahmen einer Familienassoziationsstudie wurde DQ-LTR13 als potentieller genetischer Risikomarker charakterisiert und es konnte gezeigt werden, daß die Haplotypen DQ8/LTR13+ und DQ2/LTR13- signifikant häufiger transmittiert werden als bei einer zufälligen Vererbung erwartet. Gleichzeitig unterscheidet sich ihr Segregationsmuster signifikant von dem der Haplotypen DQ8/LTR13- und DQ2/LTR13+. Das Kopplungsungleichgewicht zwischen DQ-LTR3 und DQ-LTR13 ist so ausgeprägt, daß sie zwar präferentiell aber nicht ausschließlich zusammen auf einem Haplotypen vorkommen. Die Wahrscheinlichkeit einer Erkrankung an IDDM in Zusammenhang mit einem der beiden Risikohaplotypen DQ8/LTR13+ bzw DQ2/LTR13- liegt bei 76% bzw. 68%. Aufgrund dieser Ergebnisse ist DQ-LTR13 insgesamt als unabhängiger genetischer Risikomarker für Typ 1 Diabetes mellitus zu bewerten, zusätzlich zu den bekannten Risikohaplotypen DQ8 und DQ2 und unabhängig von DQ-LTR3. Im Rahmen funktioneller Analysen unter Verwendung eines Reportergen-Assays konnte nach Transfektion diverser EBV-transformierter lymphoblastoider B-Zellen für keine der beiden LTRs die Fähigkeit nachgewiesen werden, als eigenständiger Promotor auf die Expression des Reportergens Luciferase zu wirken. Diese Fähigkeit konnte auch nicht durch die Gabe von Hydrocortison bzw. ß-Estradiol induziert werden. DQ-LTR13 ist jedoch in vitro in der Lage, abhängig von transkriptioneller Orientierung und Position, über den Promotor des DQB1 Gens verstärkend auf die Expression des Luciferase-Gens zu wirken. Dieser Effekt ist darüber hinaus, bezüglich der beiden Risikoallele DQB1*0302 und DQB1*0201, differentiell ausgeprägt. Eine Verifizierung des beobachteten Effekts in vivo war im Rahmen der vorliegenden Doktorarbeit leider nicht möglich.
Untersucht wurde die spätpleistozäne und holozäne Diatomeenflora aus drei Teilgebieten der westlichen Ostsee, dem Kattegat, der Kieler Bucht und der Pommerschen Bucht. Die Ergebnisse bestätigen die hervorragende Eignung der Diatomeen als Indikatororganismen in der Paläoökologie. Anhand der Mikroflora war es möglich, die wechselhafte Geschichte der verschiedenen Ostsee-Teilgebiete detailliert nachzuvollziehen. Es konnten Lage und Ausdehnung der Paläogewässer während der verschiedenen Stadien der Ostsee-Entwicklung sowie verschiedene abiotische Faktoren der Paläoumwelt - Salinität, pH-Wert, Trophie, Temperatur und Wassertiefe - rekonstruiert werden. Zur Rekonstruktion von Salinität, Trophie und pH-Wert kamen erstmals verschiedene Indikationssysteme - der Halobienindex nach ZIEMANN (1971), das Trophie-Indikationssystem nach HOFMANN (1994) und die pH-Rekonstruktion nach ARZET (1987) - zur Anwendung. Kattegat Der Schwerpunkt der Untersuchung lag auf dem südwestlich der Insel Anholt gelegenen Teil des Kattegats. In den 22 Kernprofilen konnten insgesamt 596 Diatomeentaxa registriert werden. In den Ablagerungen des Spätglazials waren im gesamten Untersuchungsgebiet keine silifizierten Mikrofossilien nachweisbar. Die anhand der seismoakustischen Untersuchungen aufgestellte Gliederung der holozänen Sedimente in die Abschnitte Holozän 1 (H1), Holozän 2 (H2) und Holozän 3 (H3) konnte durch die Analyse der Diatomeenfloren bestätigt werden. Die Ablagerungen des Sedimentabschnitts H1 entstanden während einer Transgressionsphase. Das in Alleröd und Jüngerer Dryas trockengefallene Untersuchungsgebiet wurde zu Beginn des Präboreals vollständig transgrediert. Durch das Auftreten halobionter Diatomeentaxa konnte der Beginn der Transgression im Untersuchungsgebiet auf den Anfang des Präboreals und ein Alter von 10.200 Jahren BP datiert werden. Für die Hauptphase der Transgression wurde ein Alter von rund 9.700 bis 9.300 Jahren BP ermittelt. In Übereinstimmung mit den seismoakustischen Befunden und den Ergebnissen der Makrofossil-Analyse konnte der Sedimentabschnitt H2 als Ablagerung aus dem Mündungsgebiet eines Fließgewässers identifiziert und auf ein Alter von rund 9.300 bis 8.300 Jahren BP datiert werden; wahrscheinlich entwässerte der Ancylus-See zumindest zeitweilig über den großen Belt in diesen Abschnitt des Paläokattegats. Die Diatomeenflora indiziert eine überwiegend durch den Einstrom von Süßwasser beeinflusste Paläoumwelt und ein alkalisches und eutrophes Milieu. Das charakteristische Merkmal der Thanathozönosen ist der hohe Anteil an allochthonen Schalen. Die Analyse der autökologischen Präferenzen zeigt, dass durchschnittlich 30 % der Taxa ursprünglich aus anderen Gewässertypen stammen. Mithilfe der Diatomeenflora konnte der Sedimentabschnitt H2 in drei Abschnitte untergliedert werden. Der Abschnitt H2a wurde während der Bildung einer Landzunge abgelagert, die die Mündung des Fließgewässers vom Paläokattegat trennte. Die Thanathozönosen indizieren die zunehmende Beeinflussung durch den Einstrom von Süßwasser. Der Abschnitt H2b wurde vor rund 8.800 Jahren BP deponiert, während die Landzunge ihre größte Ausdehnung und Isolationskraft erreichte. Die Diatomeenflora indiziert die maximale Beeinflussung durch den Zustrom von Süßwasser. Im Sedimentabschnitt H2c indizieren die Thanathozönosen die Verlagerung der Landzunge infolge küstendynamischer Prozesse und eine zunehmende Beeinflussung durch Meerwasser. Der Sedimentabschnitt H3, der während einer erneuten Transgression vor ca. 8.300 Jahren BP deponiert wurde, ist in weiten Bereichen vollständig frei von silifizierten Mikrofossilien. Eine autochthone, aus überwiegend halobionten Taxa zusammengesetzte Diatomeenflora ließ sich lediglich in einem der Kernprofile nachweisen. Das charakteristische Taxon der Transgressionsfloren in den Sedimentabschnitten H1 und H3 ist Paralia sulcata. Typisch sind des Weiteren Actinoptychus senarius, Cymatosira belgica, Dimeregramma minor, Ehrenbergia granulosa und Plagiogramma staurophorum. Kieler Bucht Aus der Kieler Bucht stand ein Kernprofil zur Verfügung. In diesem Profil konnten insgesamt 344 Diatomeentaxa nachgewiesen werden. Die brackischen Ablagerungen entstanden in der Mastogloia-Phase und konnten mithilfe der Diatomeenflora in zwei Abschnitte - Mastogloia 1 (M1) und Mastogloia 2 (M2) - untergliedert werden. Der Sedimentabschnitt M1 wurde deponiert, während das Milieu des Paläogewässers durch sporadische Ingressionen über den Großen Belt beeinflusst wurde. Die Diatomeenflora indiziert einen Paläosalzgehalt von maximal 9 Promille, ein eutrophes und alkalisches Paläomilieu und eine geringe Wassertiefe. Die Veränderungen im Artgefüge der Thanathozönosen innerhalb des Sedimentabschnitts M2 belegen einen kontinuierlichen Anstieg der Salinität um mindestens 8 Promille und das Auftreten starker Strömungen. Die Sedimentation erfolgte während des Übergangs vom brackigen Mastogloia-Stadium zur marinen Littorina-Phase. Mithilfe der Diatomeenflora konnte nachgewiesen werden, dass sich in dem Paläogewässer der Kieler Bucht frühestens vor 7.100 Jahren BP marine Verhältnisse etablierten. Die Flora indiziert einen Anstieg des Paläosalzgehalts auf mindestens 17 und maximal 30 Promille. In Übereinstimmung mit den Ergebnissen der Sedimentanalyse konnten die Ablagerungen der Littorina-Phase anhand der Diatomeenflora in zwei Subzonen - Littorina 1 (L1) und Littorina 2 (L2) - untergliedert werden. Während das Artgefüge in dem Abschnitt L1 auf große Strömungsgeschwindigkeiten während der Sedimentation hinweist, belegt die Flora in dem Abschnitt L2 eine deutliche Abnahme der Strömungsintensität. Pommersche Bucht In den neun Kernprofilen aus der Pommerschen Bucht konnten insgesamt 265 Diatomeentaxa identifiziert werden. In Übereinstimmung mit den Ergebnissen der geologischen Untersuchungen zeigt die Diatomeenflora, dass sich der südliche Abschnitt der Pommerschen Bucht nach dem Rückzug des Eisschildes bis in das Atlantikum hinein unabhängig vom nördlichen Teil entwickelte; erst während der Littorina-Phase wurde auch der südliche Abschnitt transgrediert. Mithilfe der Diatomeenflora wurde belegt, dass sich im Spätglazial vor ca. 12.000 Jahren BP im Süden der Pommerschen Bucht ein alkalischer, meso- bis schwach eutropher Süßwassersee etablierte. Die Thanathozönosen indizieren erhebliche Milieuunterschiede zwischen diesem See und dem Baltischen Eisstausee, der zeitweise den nördlichen Abschnitt der Pommerschen Bucht bedeckte. Im frühen Holozän entwickelte sich im südlichen Abschnitt der Pommerschen Bucht an gleicher Position wie im Spätglazial wiederum ein Süßwassersee, während der nördliche Abschnitt der Pommerschen Bucht vom Ancylus-See bedeckt war. Die Diatomeenfloren belegen, dass sich die Umweltbedingungen in beiden Paläogewässern ähnelten; sowohl im Norden als auch im Süden lag ein alkalisches und überwiegend eutrophes Milieu vor. Der Beginn der Mastogloia-Phase ist durch einen drastischen Wechsel im Artgefüge der Diatomeenflora gekennzeichnet; Taxa mit höherer Salinitätstoleranz, z. B. Epithemia turgida und Diploneis didyma, ersetzten die rein oligohalobe Ancylus-Flora. Die Veränderungen indizieren einen schwachen aber deutlichen Anstieg der Salinität im Norden der Pommerschen Bucht. Das charakteristische Taxon der Littorina-Phase ist die polyhalobe Planktonart Thalassionema nitzschioides. Es indiziert einen Anstieg des Paläosalzgehalts auf mindestens 13 Promille. Des Weiteren belegen die Diatomeen den stetig steigenden Wasserspiegel zu Beginn der Littorina-Phase. Chrysophyceen-Zysten, Chaetoceros-Sporen und die Skelette des Silicoflagellaten Distephanus speculum stellen in der Pommerschen Bucht wichtige Leitfossilien dar. Während Chrysophyceen-Zysten typisch für die Sedimente der Mastogloia-Phase sind, haben Chaetoceros-Sporen und Distephanus speculum charakteristischerweise ihren Verbreitungsschwerpunkt in den Ablagerungen des Littorina-Meers.
The mechanism of peptide transport has been studied on two different ABC transporters of S. cerevisiae. Thereby, the aim of this PhD thesis was to characterise the transporter function on molecular level and shed light on the physiological role of these transporters. The ABC gene YLL048 encodes a novel intracellular transporter translocating peptides from the cytosol to the lumen of the ER. Deletion of the gene resulted in loss of peptide transport activity. The transport activity was fully restored after transformation of the deletion mutant by plasmid-encoded YLL048. Studying the substrate specificity using randomized peptide libraries it was demonstrated that peptides of the size from 6 to 56 amino acids are recognized. So far, no upper limit of the substrate size was obtained. Introduction of D-amino acids in various positions of a nonamer peptide did not impair transport activity. The physiological function of YLL048p is not well understood. The gene product is not essential for cell viability as the deletion mutant did not show any growth phenotype. To examine the possibility that YLL048 encoded protein is part of a quality control of yeast cells involved in the unfolded protein response (UPR), upregulation of YLL048 transcription by heat shock and stress conditions were investigated. We could not observe an influence of stress factors on YLL048 mRNA level. Upregulation of gene expression by the transcription factors Pdr1p and Pdr3p was excluded. The ABC transporter Mdl1p has been identified as peptide transporter of the inner mitochondrial membrane. This protein is required for the export of peptides with the size of 6 to 21 amino acids from the matrix into the intermembrane space. These peptides are generated by m-AAA proteases degrading non-assembled or missfolded membrane proteins. In order to understand the transport mechanism in detail, Mdl1p was expressed in S. cerevisiae and E. coli. Partially enriched protein was reconstituted into liposomes and was active in ATP binding. The association of the NBDs has been described as a central step of the ATPase cycle of ABC transporters, but it is still controversial how both motor domains cooperate and coordinate ATP hydrolysis. To address this question, the Mdl1p-NBD was overexpressed in E. coli and purified to homogeneity. The isolated NBD was active in ATP binding and hydrolysis with a turnover of 0.5 ATP per min and a Km value of 0.2 mM. Isolated NBDs did not show cooperativity in ATPase activity. However, the ATPase activity was observed to be non-linearly dependent on protein concentration suggesting the active form of this enzyme is not a monomer. Very importantly, for the first time an ATP-induced dimer was observed after trapping the NBD by ortho-vanadate or BeFx. The nucleotide composition of the trapped intermediate state was determined and two ADP molecules were simultaneously bound per dimer. An ATP-induced dimer of the ATPase inactive mutant (E559Q) was observed already in the absence of ATPase inhibitor. The E599Q dimer contained two ATP molecules in the absence of Mg2+ at 4°C. Prolonged incubation at 30°C in the presence of Mg2+ induced a stable dimer in which one ATP and ADP molecule were trapped at the same time. Based on these experiments, a new cycle for ATPase activity of ABC transporters was proposed. Binding of ATP to two NBD monomers induces dimerization. Both nucleotides are hydrolysed sequentially. During the hydrolysis cycle the nucleotides cannot be released from the dimer. After hydrolysis of two ATP molecules the domains dissociate and start a new cycle.