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Erstmals konnte eine zCarotinDesaturase einer höheren Pflanze nach heterologer Expression in E. coli in nativer Form gereinigt und enzymatisch charakterisiert werden. Dazu wurde die cDNA der CapsicumZDS in einen Expressionsvektor kloniert, der die ZDS als rekombinantes Polypeptid mit 6 Nterminalen Histidinen exprimierte. Dadurch konnte das Enzym in nur zwei Schritten über eine Kombination von Ammoniumsulfatfällung und MetallionenAffinitätschromatographie selektiv aus E. coli separiert werden. Die ZDS wurde ohne eine mutmaßliche Transitsequenz als ein Polypeptid von 59 kDa exprimiert. Das pH Optimum der ZDSAktivtität liegt bei 7,2 in der Nähe der rechnerisch ermittelten pIWertes von 7,4. Die ZDS führt zwei Desaturierungsschritte ausgehend von zCarotin zu Lycopin als ein monomeres Protein durch. Unter Verwendung des TwoHybridSystems, einer Gelelektrophorese unter nativen Bedingungen und einer Gelfiltration der nativen ZDS, konnte gezeigt werden, daß die ZDS als Monomer und als Dimer vorliegen kann. Die Dimerisierung der ZDS ist jedoch für deren enzymatischer Aktivität und für die Durchführung beider Desaturierungsschritte nicht notwendig. Für die Substratcarotinoide zCarotin und Neurosporin, wurden die Km Werte von 8,4 µM und 9,0 µM bestimmt. Die CapsicumZDS zeigt von ihrer Aminosäuresequenz her eine große Ähnlichkeit zu den cyanobakteriellen zCarotinDesaturasen und eine geringere Ähnlichkeit zu den pflanzlichen Phytoendesaturasen. Eine diskutierte phylogenetische Verwandtschaft der zCarotin und Phytoendesaturase aus höheren Pflanzen und Cyanobakterien wird durch die Verwendung des gleichen Kofaktors Plastochinon und durch die gemeinsame Hemmbarkeit mit den zCarotinDesaturaseHemmstoffen J852 und LS80707 unterstützt. Eine Kofaktoruntersuchung ergab, daß Plastochinon sowohl der Kofaktor der ZDS aus Capsicum, als auch der Phytoendesaturasen aus Gentiana lutea (gelber Entian), aus dem Cyanobakterium Synechococcus sp. PCC 7942, sowie der z CarotinDesaturase aus Synechocystis sp. PCC 6803 ist. Der Km Wert von Decyl Plastochinon wurde für die CapsicumZDS zu 0,4 µM bestimmt. Der Kofaktor der z CarotinDesaturase Plastochinon, sowie die Entdeckung einer plastidären terminalen Oxidase (Carol et al., 1999) ermöglicht die Entwicklung eines Modells der Übertragung der bei der Desaturierung von zCarotin gewonnenen Elektronen über Plastochinon auf Sauerstoff, wie es bereits für die pflanzliche Phytoendesaturase postuliert wurde (Carol
Zur Untersuchung der Zusammensetzung und Diversität von Bambusameisengemeinschaften (Hymenoptera, Formicidae) sowie ausgewählten Nischenparametern der beteiligten Ameisenarten, wurden auf dem Gelände des Gombak Field Studies Centre (University Malaya, Selangor, Westmalaysia) fünf Haine von Riesenbambusarten (Gigantochloa scortechinii, G. thoii, Bambusoidea) gefällt und abgesammelt. Es wurden Hinweise auf deterministische oder stochastische Strukturierungsmechanismen der Ameisengemeinschaften gesucht. Hierzu wurden verschiedene Fragestellungen anhand der Multiplen Regression untersucht. Zusätzlich wurden Stichproben von Bambusschößlingen und jungen Bambushalmen hinsichtlich der Nutzungsweise und Besiedlung durch Ameisen studiert. In der vorliegenden Arbeit werden die Ergebnisse der Auswertung auf Hainebene, d. h. der Bambusameisenzönosen als Ganzes betrachtet, vorgestellt. 1. In fünf Bambushainen wurden bisher 66 nistende Ameisenarten aus 21 Gattungen und 6 Unterfamilien identifiziert. Die drei gattungs
Ziel der vorliegenden Arbeit war es, ausgewählte Gruppen der Dekapoden (brachyure Krabben, Einsiedler und Porzellankrebse) des PersischArabischen Golfes und des Golfes von Oman taxo nomischfaunistisch zu erfassen, eine Abschätzung des Artenreichtums und der Faunenzusam mensetzung vorzunehmen und die zoogeographischen Beziehungen innerhalb der Golfregion und zu anderen Teilen des westlichen Indischen Ozeans zu analysieren. Die Dekapodenfauna der Golfregion war -- im Gegensatz zur sehr viel besser untersuchten des Roten Meeres -- bislang Gegenstand vergleichsweise weniger wissenschaftlicher Arbeiten, und der faunistischtaxonomische Kenntnisstand stellte sich als entsprechend lückenhaft dar. Dies erwies sich einerseits als Problem bei der Beurteilung des Zustands von Lebensgemeinschaften und Folgeschäden nach der Ölkatastrophe von 1991, andererseits als Hindernis für Faunen vergleiche und zoogeographische Studien. Um vor allem die bislang wenig bearbeiteten eulitoralen Lebensräume wie Watten und Man groven, aber auch Korallenriffe, intensiv zu beproben, wurden Sammelreisen in verschiedene Teile des PersischArabischen Golfes und den Golf von Oman durchgeführt. Daneben wurde umfangreiches Museumsmaterial der bedeutenden Sammlungen aus der Golfregion taxonomisch untersucht, mit Material aus anderen Regionen verglichen und neu bewertet. Insgesamt konnte für den PersischArabischen Golf das Vorkommen von 188 Arten brachy urer Krabben, 20 Pagurideen (Einsiedlerkrebse) und 18 Porcellaniden (Porzellankrebse) eindeutig belegt werden; 43 Arten (37 Brachyuren, 4 Pagurideen und 2 Porcellaniden) wurden erstmals für den Golf nachgewiesen. Bei 11 dieser Neunachweise handelt es sich um bislang unbeschriebene Arten. Ein faunistischer Vergleich zu anderen Teilen des Indischen Ozeans zeigt, daß der Golf für die untersuchten Taxa insgesamt deutlich artenärmer als das Rote Meer oder die ostafrikanische Küste ist. Dies ist vor allem auf die geringere Ausdehnung und schlechtere Entwicklung von Korallenriffen sowie das Fehlen von Tiefwasserhabitaten, aber auch auf das Vorherrschen extre mer ökologischer Bedingungen in weiten Teilen des Golfes zurückzuführen. Zwischen verschie denen systematischen und ökologischen Gruppen bestehen allerdings große Unterschiede hinsichtlich des Artenreichtums. Während hartboden und korallenassoziierte Gruppen im Golf deutlich unterrepräsentiert sind, findet sich bei weichbodenbewohnenden Taxa eine vergleichs weise artenreiche Fauna. Besonders auffallend ist dabei der Artenreichtum der eulitoralen Ocypodidae, die mit 23 Arten im Golf eine weitaus höhere Artendiversität erreichen als im Roten Meer oder an der ostafrikanischen Küste und gemeinsam mit den ebenfalls vorwiegend in der Gezeitenzone leben den Grapsiden einen Schwerpunkt der Arbeit bildeten. Innerhalb der Golfregion zeigten sich für diese Familien große Unterschiede hinsichtlich des Artenreichtums und der Faunenzusammen setzung. Die Wattgebiete und Mangroven des nördlichen und des südöstlichen PersischArabi schen Golfes sowie des Golfes von Oman fallen dabei durch ihre sehr diverse Fauna auf. Stark verarmt ist dagegen die eulitorale Fauna des südwestlichen und westlichen Teils des Persisch Arabischen Golfes. Der Grund für diese Verarmung ist dabei vor allem im hohen Salzgehalt des küstennahen Wasserkörpers zu sehen. Die Ergebnisse der faunistischtaxonomischen Auswertungen ermöglichten eine zoogeogra phische Analyse, bei der die Dekapodenfauna sowohl auf ihre Homogenität innerhalb der Golf region, als auch auf ihre Beziehungen zu der aus anderen Teilen des Indischen Ozeans untersucht wurde. Hierzu wurden Endemismusraten und Verbreitungsmuster der aus dem Golf nachgewie senen Arten betrachtet sowie Faunenähnlichkeiten mit Hilfe multivariater statistischer Methoden analysiert. Zoogeographisch stellt sich die Dekapodenfauna der Golfregion als Mischung unterschied licher zoogeographischer Elemente dar. Dies reflektiert die Lage des Golfes am Übergang zwischen westlichem Indischen Ozean und indischer bzw. indomalaiischer Region. Die Endemis musraten liegen bei 6 % für Porcellaniden, 7 % für Brachyuren und rund 10 % für Pagurideen. Für keine der Gruppen läßt sich daraus eine Begründung für eine eigene Faunenprovinz oder ein Endemismuszentrum ableiten. Neben den Endemiten beinhaltet die Fauna Arten unterschied licher geographischer Beziehungen. Den größten Anteil stellen weit verbreitete Arten, die je nach Gruppe zwischen der Hälfte und zwei Dritteln der im Golf vorkommenden Arten ausmachen. Für die Einsiedlerkrebse sind daneben vor allem Arten aus dem Roten Meer und dem Golf von Aden von Bedeutung, was auf eine enge Beziehung der Pagurideenfauna zu diesen Gebieten hin weist. Dagegen sind für die Brachyuren indopakistanische und indomalaiische Arten von weit aus größerer Bedeutung, was eine größere Ähnlichkeit der Krabbenfauna zu der Pakistans und Indiens andeutet. Innerhalb der Golfregion ergaben sich für die Brachyurenfauna, insbesondere für Ocypodi den, deutliche Unterschiede hinsichtlich der zoogeographischen Beziehungen. Während der von östlichen Faunenelementen dominierte nördliche und östliche Golf kaum westliche Faunen elemente aufweist, stellen diese im südlichen Golf und vor allem im westlichen Teil des Golfes von Oman einen erheblichen Anteil an der Gesamtfauna. Getrennt werden diese beiden Gebiete durch die Bereiche des südlichen und westlichen Golfes, in denen die extrem hohen Salzgehalte eine wirksame Verbreitungsbarriere darstellen. Zumindest für einige Taxa ist demnach die Golf region nicht als einheitliche faunistischzoogeographische Region zu betrachten. Während der nördliche und östliche Teil des PersischArabischen Golfes zoogeographisch eng mit Pakistan verbunden sind, zeigen sein südlicher Teil und der westliche Golf von Oman engere Beziehungen zum Golf von Aden und dem Roten Meer. Aufgrund der vergleichsweise guten Dokumentation der Faunenzusammensetzung in ver schiedenen Teilen des Indischen Ozeans ließ sich für Ocypodiden und Grapsiden ein überregio naler Faunenvergleich mit Hilfe multivariater Analysenmethoden durchführen und eine zoogeo graphische Unterteilung des Indischen Ozeans vornehmen. Innerhalb des westlichen Teils des Indischen Ozeans lassen sich dabei drei Regionen aufgrund ihrer Faunenähnlichkeit voneinander abgrenzen. Dies sind -- eine ost/südostafrikanische Region, die von der Nordostküste Südafrikas bis nach Somalia reicht -- eine west/südarabische Region bestehend aus Rotem Meer, Golf von Aden, der südarabi schen Küste und dem westlichen Golf von Oman, die auch in den südöstlichen Persisch Arabischen Golf hineinzieht -- eine ostarabischpakistanische oder iranischpakistanische Region, die den nördlichen und östlichen Teil des PersischArabischen Golfes, den östlichen Golf von Oman sowie Pakistan und Nordwestindien umfaßt Hinsichtlich der Besiedlungsgeschichte des PersischArabischen Golfes zeigen die Ergebnisse, daß eine Besiedlung durch eulitorale Krabben zum größten Teil von der indischen Seite aus entlang der iranischen Küste stattgefunden haben muß, während später eingewanderte westliche Elemente aufgrund der massiven Salinitätsbarriere und der Strömungsverhältnisse auf den süd östlichsten Teil beschränkt blieben. Vor allem die Gezeitenzonen des PersischArabischen Golfes weisen teilweise sehr diverse Lebensgemeinschaften auf, deren Artenzusammensetzung in ihrer Mischung unterschiedlicher zoogeographischer Elemente einzigartig ist und den Einfluß verschiedener Wasserkörper auf den Golf anzeigt. Für die Ocypodiden führt dies zu einer hohen regionalen oder gammaDiversität sowie einer über reine Artendiversität hinausgehenden Diversität der Lebensgemeinschaften. Während sich die Folgen des Golfkriegs als weniger gravierend als ursprünglich befürchtet erwiesen haben, könnten Habitatzerstörung und schleichende Verschmutzung die Lebensgemein schaften des PersischArabischen Golfes irreparabel schädigen.
Molekulare Systematik und Phylogeographie der Formengruppe Ancylus fluviatilis O. F. Müller 1774
(2001)
Ziel dieser Dissertation war es, die genetische Variation innerhalb der Formengruppe Ancylus fluviatilis (Gastropoda: Basommatophora) zu untersuchen, und eine auf molekula ren Markern basierende Phylogenie zu erstellen. Die phylogenetischen Untersuchungen beinhalteten auch die Stellung der Familie Ancylidae innerhalb der Basommatophora. Außerdem wurde die geographische Verteilung der genetischen Variation untersucht und die phylogeographischen Prozesse, die zu dieser Verteilung geführt haben, analysiert. Die gefundene genetische Konstitution wurde im Zusammenhang mit bereits vorhandenen Daten über chromosomale und fortpflanzungsbiologische Besonderheiten von A. fluviatilis diskutiert. Für 147 Individuen aus 62 Populationen des gesamten Verbreitungsgebiets von A. fluviatilis wurden mitochondriale 16S rDNASequenzen ermittelt. Es konnten 67 Haplotypen unterschieden werden. Die Haplotypen zeigen eine große genetische Diversität innerhalb der Formengruppe (bis zu 8.2% paarweise Sequenzdivergenz). Es lassen sich neun genetisch stark divergente Linien unterscheiden. In einer Population konnten dynamische dinukleotide Mikrosatelliten in der mtDNASequenz nachgewiesen werden, die eine Längenvariation von vier bis achtfachem Grundmuster aufweisen. Als wahr scheinlicher Mechanismus für diese Längenvariation wird "slippedstrandmispairing" angenommen. Mit Hilfe von nukleären RAPDMarkern wurde die genetische Trennung der mitochon drialen Linien bei syntop vorkommenden Linien auch auf nukleärer Ebene nachgewiesen. Die Formengruppe A. fluviatilis setzt sich somit aus einem Komplex reproduktiv isolierter Linien zusammen. Im Zusammenhang mit der bereits nachgewiesenen allotetraploiden Konstitution zumindest einer Linie und der resultierenden hohen Selbstbefruchtungsrate sind sowohl sympatrische als auch allopatrische Diversifizierungsereignisse für die Differenzierung der Linien verantwortlich. Drei der neun genetischen Linien sind geographisch weitverbreitet und kommen zum Teil syntop vor. Phylogeographische Analysen anhand von "nested clades" zeigten, daß isolation by distance zwar das Grundmuster für die Verbreitung von A. fluviatilis darstellt, daß dieses aber durch Expansionsereignisse, die die Besiedlung über weite Distanzen einschließen, überlagert sein kann. Zeitliche Abschätzungen ergaben für die Formengruppe A. fluviatilis ein Alter von mindestens 20 Millionen Jahren. Die rezent vorkommenden Linien sind schätzungsweise zwischen 8 und 14 Millionen Jahren alt. Für die phylogenetischen Untersuchungen innerhalb der Basommatophora wurde die 16S rDNA von weiteren Gattungen sequenziert. Die resultierende molekulare Phylogenie belegt die monophyletische Entstehung der Formengruppe A. fluviatilis sowie eine gemeinsame Abstammung der Gattungen Ferrissia und Ancylus. Die Familie Ancylidae bildet eine Schwestergruppe zur Familie Planorbidae und läßt sich somit nicht aus dieser ableiten. Die Gattung Burnupia zeigt sich als nahe verwandt zur Gattung Acroloxus (Familie Acroloxidae) und gehört somit nicht, wie bisher angenommen, zu den Ancylidae.
Die doppelblinde Pilotstudie ''Wirksamkeit und Verträglichkeit einer Enzym oder Vitamin ATherapie bei Patienten mit Plattenepithelkarzinom im Kopf/Halsbereich" wurde in Zusammenarbeit mit der HNOKlinik in dem Zeitraum von Oktober 1994 bis Juni 1996 mit 25 Patienten mit Plattenepithelkarzinomen und 15 gesunden Kontrollpersonen durchgeführt. Den Patienten wurde neben der konventionellen Therapie entweder VitaminA (Retinolpalmitat, 150,000 IE/d), die Enzympräparation (proteolytische Gesamtaktivität 20,880 F.I.P.E/d) oder Placebo zugeteilt. In regelmäßigen Abständen wurde das Allgemeinbefinden/ Nebenwirkungen protokolliert, Blutbild und Leberwerte bestimmt, die peripheren Lymphozyten phänotypisiert und die NK LAK, bzw. LAKZellAktivität gemessen. Zur Auswertung gelangten 16 Patienten. Statistisch signifikant war eine Erhöhung der CD2 und CD3Werte der EnzymGruppe (41 Messungen) gegenüber den Patienten der Gruppen VitaminA (18 Messungen), Placebo (12 Messungen) und den Ausgangswerten der Patienten (25 Messungen). Auch im Verlauf konnte die Erhöhung der CD3Werte bei der Enzymgruppe gegenüber den anderen Patientengruppen bestätigt werden. Der Anteil der TZellen im peripheren Blut lag im Bereich der gesunden Kontrollen. Um die Wirkungen der Prüfmedikationen auf Leukozyten (PBL, PMNL, Monozyten) in vitro zu untersuchen, wurde ein Panel durchflußzytometrischer Tests entwickelt, bzw. etabliert, die die Messung der Funktionen NKZellaktivität, LAKAktivität, ADCC, Phagozytose und Sauerstoffradikalbildung ermöglichten bzw. vereinfachten. Die untersuchte Enzympräparation enthielt Papain, Trypsin und Chymotrypsin im Verhältnis 2,5:1:1. In vitroVersuche ergaben eine dosisabhängige Stimulierung der NK, NKLAK, CTL bzw. LAKAktivität und der ADCC durch NKZellen durch die Enzympräparation. Es war möglich, die Lymphozyten mehrfach zu stimulieren, eine Enzymdauergabe, bzw. hohe Enzymdosen führten zu einem Aktivitätsrückgang. Die Enzymmischung verbesserte die Phagozytose und den oxidativen Burst bei PMNL und erhöhte die CD18 und CD54 bzw. erniedrigte die CD16Expression auf PMNL. Mit alltransRetinsäure bzw. Retinol konnten die Lymphozytenaktivitäten in vitro mit den gewählten Versuchsbedingungen kaum beeinflußt werden, Änderungen konnten meist 48h bis 72h nach Zugabe beobachtet werden, die jedoch nicht signifikant waren. Beobachtungen zu VitaminAWirkungen auf PMNL waren nicht möglich, da diese nur maximal 24h kultiviert werden konnten.
Organisation und Steuerung des Treiberameisenverhaltens südostasiatischer Ponerinen der Gattung Leptogenys Treiberameisen zeichnen sich durch eine einzigartige Kombination aus Wanderverhalten (häufige Umzüge) und koordinierter Massenjagd (kollektive Raubzüge) aus. Obwohl allgemein angenommen wird, daß die Kommunikation dieser Ameisen zu einem bedeutenden Teil durch Spurpheromone erfolgt, sind bisher in den drei Unterfamilien Ecitoninae, Dorylinae und Aenictinae nur wenige Drüsen bekannt, die derartige Pheromone produzieren. Welche Rolle einzelne Pheromonkomponenten bei der Koordination des komplexen Schwarmverhaltens spielen, wurde bislang noch nicht untersucht. In der Gattung Leptogenys gibt es ein weites Spektrum verschiedener Ökotypen, u.a. auch Arten, die echtes Treiberameisenverhalten zeigen. Bei sieben malaiischen Leptogenys-Arten wurde die Koordination des kollektiven Verhaltens auf Basis der Kommunikation zwischen den Einzelindividuen untersucht. Bei allen Arten wurden mehrere Spurpheromone entdeckt, die in den Gift- und in den Pygidialdrüsen lokalisiert waren. Ökologisch verschiedene Arten wiesen Unterschiede im Kommunikationssystem auf. Die Koordination des Treiberameisenverhaltens von L. distinguenda wurde besonders ausführlich untersucht. Diese Art besitzt ein Mehr-Komponenten-Signalsystem, bei dem die einzelnen Pheromone multiple Funktionen erfüllen. Die Pygidialdrüse enthält eine Pheromonkomponente, die ca. 20 min lang gute Spurfolge bewirkt. Sie dient der Orientierung einzelner Individuen und damit dem Koloniezusammenhalt. Aufgrund konzentrationsabhängiger Spurfolge und durch Modulation der Spurkonzentration kann eine langsame Rekrutierung auf neues Territorium mit diesem Pheromon koordiniert werden. Die Giftdrüse enthält zwei Pheromone. Eine sehr flüchtige Substanz (4-Methyl-3-Heptanon) bewirkt nur 1-2 min lang eine außerordentlich starke Attraktion sowie Erregung, Beschleunigung der Fortbewegung und Aggressivität. Mit dieser Komponente werden Beuterekrutierungen koordiniert. Die starke Wirkung kann das Verhalten zahlreicher Tiere und auf diese Weise sogar die Vorstoßrichtung ganzer Raubzüge beeinflussen. Aufgrund der extremen Flüchtigkeit des Pheromons ist dieser Einfluß jedoch nur momentan, so daß die Raubzugformation außerordentlich dynamisch ist. Eine zweite Komponente der Giftdrüse bewirkt bis zu 5 min lang gute Spurfolge ohne Erregung. Diese Substanz dient ebenfalls dem Koloniezusammenhalt. In den chemischen Spuren können Komponenten gemischt und der Informationsgehalt dadurch variiert werden. Zudem reagieren einzelne Tiere je nach Motivation nur auf bestimmte Komponenten, was situationsspezifisches Verhalten ermöglicht. Beute eintragende Arbeiterinnen folgen selektiv einer Komponente der Pygidialdrüse und ignorieren Komponenten der Giftdrüse. Auf diese Weise steuern sie gezielt das Nest an. In ähnlicher Weise fungieren beim Nestumzug hoch konzentrierte Spuren aus Pygidialdrüsensekret als Leitlinie zum neuen Nest. Umziehende Tiere meiden zudem sehr empfindlich das Sekret der Giftdrüse. Auf diese Weise werden Raubzugspuren klar unterschieden und nicht betreten, so daß beide für Treiberameisen charakteristischen Verhaltensweisen synchron ausgeführt werden können. Der Nestumzug wird mit einem distinkten, mechanischen Signal ausgelöst. Im Notfall kann ein Umzug oder Raubzug mit einer spezifischen Alarmsubstanz aus der Mandibeldrüse abrupt beendet werden. Dies ist z.B. von Bedeutung, wenn sich artgleiche Kolonien begegnen. Das Kommunikationssytem von L. distinguenda zeigt, wie komplexes Verhalten mit einem minimalen Satz an Signalen koordiniert werden kann. Nach den Ergebnissen der vorliegenden Arbeit reicht ein einziges Pheromon bei weitem nicht aus, um treiberameisentypisches Verhalten zu realisieren. Treiberameisen sind besonders reich an Myrmekophilen. Die Integration dieser Ameisengäste vor allem in das Kommunikationssystem ihrer Wirte wurde in der vorliegenden Arbeit ebenfalls untersucht. Dabei wurden unterschiedliche Strategien vorgefunden, mit denen Myrmekophile den häufigen Umzügen ihrer Wirtskolonie folgen. Ein Teil der Arten läßt sich von den Ameisen auf der Brut aufsitzend in das neue Nest tragen. Diese Arten reagieren i.d.R. nicht auf die Pheromonspuren der Ameisen. Ein anderer Teil ist in der Lage, den Pheromonspuren aktiv zu folgen. Diese Fähigkeit ist erstmalig bei einer Spinne (Gamasomorpha maschwitzi) nachgewiesen worden. Einen besonders bemerkenswerten Gast stellt die neu beschriebene Lungenschnecke Allopeas myrmecophilos dar. Sie sondert selektiv bei Kontakt mit L. distinguenda ein spezifisches Attraktionssekret ab, welches die Ameisen dazu veranlaßt, die Schnecke mit den Mandibeln aufzunehmen und ins Nest zu tragen. A. myrmecophilos ist der erste nachgewiesene Fall eines Myrmekophilen aus dem Stamm der Mollusken.
Das Applikationssystem Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurde ein innovatives System für die Applikation von Pharmaka während elektrophysiologischer Experimente entwickelt und getestet. Das AchtkanalApplikationssystem eignet sich hervorragend für Experimente an Hirnschnitten und kann durch folgende Eigenschaften charakterisiert werden: - Das System ist durch die Verwendung von DruckluftVentilen nahezu frei von elektromagnetischen Störfeldern. - Aufgrund der geringen Dimensionen der Applikationspipette (Spitzendurchmesser = 250 µM) können gezielt unterschiedliche Regionen einer Zellkultur oder eines Hirnschnittes beeinflusst werden. - Die geringen Dimensionen des Systems ermöglichen einen kostengünstigen Betrieb, da nur kleine Mengen an Pharmaka benötigt werden. - Das System schaltet exakt und zuverlässig. Alle 8 Kanäle schalten in guter Übereinstimmung, und zwischen den einzelnen Kanälen kann dank eines zentralen Spülkanals akkurat und sicher gewechselt werden. - Mit dem System können Substanzen auf zwei Arten appliziert werden. Es besteht zum einen die Möglichkeit der sogenannten SpitzenApplikation. Die SpitzenApplikation eignet sich besonders für Experimente an Zellkulturen, isolierten Zellen oder Membranstücken, und zeichnet sich bei dieser Art der Anwendung durch einen schnellen Konzentrationsaufbau (< 1 s) aus. Weiterhin können Substanzen mittels der sogenannten PulsApplikation appliziert werden. Die PulsApplikation bietet einerseits den Vorteil einer kontinuierlichen Applikation ohne Druckschwankungen, und ermöglicht andererseits die schnell aufeinanderfolgende Applikation mehrerer Substanzen. Demgemäß eignet sich die PulsApplikation hervorragend für Experimente an Hirnschnitten. Ionotrope GlutamatRezeptoren bei LSO und MNTBNeuronen Das Hauptziel der vorliegenden Arbeit war eine tiefergehende Beschreibung der ionotropen, nonNMDARezeptoren bei Neuronen der LSO des auditorischen Hirnstammes der Ratte. Im Vergleich hierzu wurden entsprechende Untersuchungen auch an MNTBNeuronen durchgeführt. Von besonderem Interesse war dabei der Nachweis funktioneller Kainat Rezeptoren. Im Gegensatz zu RNA oder ProteinNachweisen einzelner Rezeptor Untereinheiten wurden funktionelle Rezeptoren elektrophysiologisch, mit Hilfe der Patch ClampTechnik, charakterisiert. Mit Hilfe von spezifischen Agonisten, Antagonisten und Modulatoren konnten folgende Sachverhalte nachgewiesen werden: - LSO und MNTBNeurone exprimieren funktionelle AMPARezeptoren. - Die GlutamatRezeptor Untereinheit GluR2 ist Bestandteil von AMPARezeptoren bei LSONeuronen. - Funktionelle AMPARezeptoren werden zwischen P3 und P10 von LSO und MNTB Neuronen exprimiert. In diesem Abschnitt der Entwicklung ist die Größe der AMPA Rezeptor vermittelten Ströme unabhängig vom Alter der Tiere. - LSO und MNTBNeurone exprimieren funktionelle KainatRezeptoren. - Im Hinblick auf die KainatRezeptoren gibt es jeweils zwei Klassen von LSO bzw. MNTBNeuronen. LSONeurone lassen sich in eine Klasse, die sich durch schnelle KainatRezeptor vermittelte Ströme auszeichnet, und eine Klasse, die sich durch langsame KainatRezeptor vermittelte Ströme auszeichnet, unterteilen. Den beiden Klassen liegen sehr wahrscheinlich unterschiedliche Rezeptordichten und / oder Unterschiede in der Untereinheitenzusammensetzung zugrunde. MNTBNeurone lassen sich in Zellen, die KainatRezeptoren besitzen, und Zellen, die diesen Typ von Rezeptor nicht besitzen, unterscheiden. - Die GlutamatRezeptor Untereinheit GluR5 ist Bestandteil von KainatRezeptoren bei LSO und MNTBNeuronen. - Funktionelle KainatRezeptoren werden zwischen P3 und P10 von LSO und MNTB Neuronen exprimiert. In diesem Zeitraum ist die Größe der KainatRezeptor vermittelten Ströme unabhängig vom Alter der Tiere.
Das Apolipoprotein (Apo) B100 ist der wesentliche Proteinbestandteil der Low Density Li poproteine (LDL). Es spielt als Ligand bei der rezeptorvermittelten Aufnahme der LDL aus dem zirkulierenden Blut in die Leber und andere periphere Gewebe eine wichtige Rolle. Erhöhte Plasmakonzentrationen der LDL gelten als unabhängiger Risikofaktor in der Genese der Koronaren Herzkrankheit (KHK). Eine gestörte Interaktion des LDLRezeptors mit seinem Liganden Apo B100 vermindert die Endozytose der im Blut befindlichen LDL und kann damit eine primäre Hyperlipoproteinämie (HLP) des Typ IIa verursachen. Die Rezeptorbindungsregion des Apo B100, dessen Primärstruktur 4536 Aminosäuren um fasst, ist im carboxyterminalen Bereich des Moleküls lokalisiert. Im Gegensatz zu einer Viel zahl bekannter LDLRezeptormutationen wurden lediglich drei Mutationen am Apo B100 bekannt, die als Auslöser der Typ IIa HLP in Frage kommen. Diese werden in der Literatur als Familiär Defektes Apo B100 (FDB) beschrieben. Bei allen drei FDBVarianten (FDB 3500Q , FDB 3500W , FDB 3531C ) liegen Punktmutationen innerhalb des Exons 26 des Apo B100 Gens vor. In der hier vorliegenden Arbeit wurde versucht, weitere, bisher unbekannte Punktmutationen am Apo B100, die als Ursache bindungsdefekter LDL in Frage kommen, zu finden und zu charakterisieren. Die zunächst durchgeführte Sequenzierung der genomischen DNA einer Pa tientin mit bindungsdefekten LDL, die negativ für FDB war, zeigte keine Abweichungen von der WildtypDNASequenz im Bereich der Rezeptorbindungsregion. Es wurde daraufhin eine genetische ScreeningStrategie für bindungsdefekte Apo B100 entwickelt, die für die Analyse größerer Probenmengen geeignet erschien. Hierzu wurden zunächst parallel zwei Verfahren, der singlestrand conformation polymorphism (SSCP) und die Temperatur Gradienten Gel E lektrophorese (TGGE) getestet. Letztere erwies sich als geeignete Methode. Ein Kollektiv von 297 Typ IIa HLPPatienten, deren LDLCholesterin > 1,55 g/L und Trigly zeridKonzentrationen <2,0 g/l waren, wurde zusammengestellt. Die Blutproben stammten von nicht miteinander verwandten, im Rhein/MainGebiet ansässigen Personen kaukasischer Abstammung. Ein DNA Bereich von 2,8 Kilobasenpaaren korrespondierend zu den Aminosäureresten 3131 3837 und 42694498 des Apo B100 wurde in einzelnen Abschnitten amplifiziert und mit He teroduplexTGGE analysiert. Es wurden neun Substitutionen identifiziert. Diese waren: FDB 3500Q , FDB 3500W , L3350L, Q3405E, R3611Q, I4287V, N4311S, A4454T, und T4457M. Bei 21 Personen (7,1%) wurde FDB 3500Q nachgewiesen. Dies entspricht nach Extrapolation auf die Gesamtbevölkerung einer Mutationshäufigkeit von 1,4% in unserer Region. Es konnte festgestellt werden, dass bei allen Merkmalsträgern die R3500Q Mutation mit einem einheitli chen Haplotypen kosegregiert, so dass eine stammesgeschichtliche Verwandtschaft der Muta tionsträger belegt ist. FDB 3500W wurde bei zwei HLPPatienten diagnostiziert. Dies war insofern überraschend, da diese Mutation zuvor lediglich bei einer Person kaukasischer Abstammung in Großbritannien gefunden worden war. Beide R3500W Mutationen waren mit unterschiedlichen, bisher unbe kannten Haplotypen assoziiert. LDL der beiden heterozygoten Merkmalsträger für FDB 3500W zeigten in einem an normalen humanen Fibroblasten durchgeführten Bindungsassay eine deut lich verminderte Rezeptorbindungsaffinität, jedoch lag diese etwas höher als die der LDL ei ner FDB 3500Q heterozygoten Person. Es ist daher anzunehmen, dass der Austausch eines Argi nins durch Tryptophan an Position 3500 einen geringeren Bindungsverlust der LDL bewirkt als der Austausch von Arginin zu Glutamin. Zwei der in der TGGE identifizierten Punktmutationen stellten bekannte Apo B100 Poly morphismen (MspI 3611 und N4311S) dar, eine weitere stille Mutation an Kodon L3350L wur de bei drei Personen festgestellt. Daneben fand sich ein Merkmalsträger mit einer Punktmuta tion an Kodon 4457 (T4457M). Zwei zuvor beschriebene Substitutionen, Q3405E und A4454T, traten mit einer Prävalenz von 1,3%, bzw. 6,4% im untersuchten Kollektiv auf. LDL eines heterozygoten Merkmalträgers für Q3405E hatten normale Bindungsaffinität an LDL Rezeptoren, zeigten jedoch eine signifikant erniedrigte Internalisation und Degradation im in vitroBindungstest. Schliesslich wurde eine bisher unbekannte Mutation des Apo B100 am Aminosäurerest I4287V, die mit einer Allelfrequenz von 1% im untersuchten Kollektiv auf trat, funktionell überprüft. Dabei zeigte sich sowohl im Fibroblasten Bindungsassay als auch in einem zweiten in vitroTestverfahren, dem U937 Zellen Wachstumsassay keine Assoziati on der I4287V Mutation mit bindungsdefekten LDL in der Familie einer heterozygoten Merkmalsträgerin. Eine funktionelle Relevanz dieses Aminosäureaustausches ist daher un wahrscheinlich. An einem Tryptophanrest an Position 4369 des Apo B100, der bei der Formation der dreidi mensionalen Struktur des Proteins mit Arginin 3500 interagiert, wurden Nukleotidveränderun gen zunächst durch gezielte Mutagenese des Kodon 4369 erzeugt, um sicherzustellen, dass diese Mutationen durch TGGE nachweisbar sind. Nachfolgend wurde bei den Typ IIa HLP Patienten nach Mutationen an dieser Position gesucht. Es konnte festgestellt werden, dass im untersuchten Kollektiv keine Punktmutationen am Aminosäurerest 4369 existierten. Die Vermutung, dass weitere klinisch relevante Apo B100 Mutationen mit einem dem FDB konformen Merkmalsbild bei Typ IIa HLPPatienten vorhanden sind, konnte nicht bestätigt werden. Andererseits wurde eine überraschend hohe Prävalenz (1:72) des FDB 3500Q im Rhein/Main Gebiet festgestellt. Aufgrund der gemeinsamen Abstammung aller Merkmalsträ ger und der hohen Mutationsfrequenz in dieser Region ist es denkbar, dass sich die vermutlich vor ca. 6000 Jahren datierte FounderMutation in diesem Teil Deutschlands ereignete. Da es offensichtlich auch, zwar seltener auftretende, Fälle des FDB 3500W in der hier untersuch ten Region gibt, sind AnalyseMethoden, wie etwa die TGGE, die sich als ein hochsensibles Nachweisverfahren multipler Punktmutationen erwies, bei der differentialdiagnostischen Ab klärung von Fettstoffwechselstörungen solchen Methoden vorzuziehen, die nur auf die Substi tution FDB 3500Q testen.
Die Atherosklerose ist eine chronischentzündliche Erkrankung der Blutgefäße, die nach der "responsetoinjury"Hypothese durch die Verletzung des Endothels initiiert wird. Dabei führt die Aktivierung von Endothelzellen durch verschiedene proatherosklerotische Faktoren, wie z.B. das Komplementsystem oder das CD40 System, zur "Endotheldysfunktion". In den betroffenen Bereichen des Gefäßes entstehen frühe atherosklerotische Läsionen, die durch veränderte Adhäsivität und Permeabilität des Endothels zur Rekrutierung und Aktivierung verschiedener Entzündungszellen und somit zum Fortschreiten der inflammatorischen Reaktion und zur Progression der Atherosklerose führen. Die laminare Schubspannung des fließenden Blutes (Shear Stress) ist einer der wichtigsten endogenen atheroprotektiven Faktoren im kardiovaskulären System. Dagegen sind Störungen der lokalen Hämodynamik im Blutgefäß mit endothelialer Dysfunktion und dem Auftreten von atherosklerotischen Läsionen assoziiert. Zur Identifizierung atheroprotektiver Mechanismen wurde die Shear Stressregulierte Genexpression in Endothelzellen mittels ''Atlas cDNA Expression Array" im Rahmen dieser Arbeit untersucht. Von den 55 Shear Stressinduzierten Genen, wurde die Expression der potentiell antiinflammatorischen Proteine Clusterin und TRAF3 und der möglichen Mechanotransduktoren Integrin alpha5 und Integrin ß1 analysiert und die Bedeutung für die Funktion von Endothelzellen untersucht. Shear StressExposition erhöhte spezifisch die Expression des KomplementInhibitors Clusterin. Zusätzlich inhibierte Shear Stress, über die erhöhte Clusterin Expression, die Komplementinduzierte Expression der proinflammatorischen Chemokine MCP1 (''Monocyte chemoattractant protein1") und Interleukin8, die Monozyten und Leukozyten anlocken und die Entzündungsreaktion der Endothelzellen vorantreiben. Desweiteren konnte gezeigt werden, daß Shear Stress die Expression des inhibitorischen Proteins TRAF3 (''tumor necrosis factor receptorassociated factor 3"), das an der CD40Signalkaskade beteiligt ist, erhöht. Im Gegensatz dazu, wurden weder die homologen Proteine TRAF2 und TRAF5, noch der CD40 Rezeptor oder CD40 Ligand durch Shear Stress reguliert. Sowohl Shear Stress als auch TRAF3 hemmen die CD40induzierte Expression des proinflammatorischen Proteins MCP1 und des prothrombotischen Proteins "Tissue Factor". Entgegen den Erwartungen lokalisierte TRAF3, das urprünglich als Rezeptorassoziiertes Adapterprotein identifiziert wurde, hauptsächlich im Zellkern. Demzufolge könnte TRAF3 eine inhibitorische Funktion im Zellkern ausüben, indem es beispielsweise die Translokation von MAPKinasen oder die Bindung von Transkriptionsfaktoren an die DNA beeinflußt. Die Umsetzung von mechanischen Kräften in biochemische Signale im Zytoplasma ist Voraussetzung für den protektiven Effekt von Shear Stress auf Endothelzellen. Als Mechanotransduktoren sind Integrine von zentraler Bedeutung, da sie eine Verbindung zwischen dem Zytoskelett und der extrazellulären Matrix herstellen. Die Ergebnisse dieser Arbeit zeigen, daß Shear Stress die Expression der IntegrinUntereinheiten alpha5 und ß1, die zusammen den FibronektinRezeptor bilden, erhöht. Dabei konnte die Beteiligung von Stickstoffmonoxid (NO) und Wachstumsfaktoren, die durch Shear StressExposition freigesetzt werden und die Expression von Integrinen stimulieren, ausgeschlossen werden. Andere Integrine, wie z.B. der LamininRezeptor alpha6ß4, wurden durch Shear Stress nicht reguliert. Als physiologische Relevanz der Shear Stressinduzierten Integrin Expression wurde die Adhäsion von Endothelzellen erhöht. Weiterhin induzierte die Präexposition von Endothelzellen mit Shear Stress die Adhäsionsinduzierte Aktivierung der MAPKinase ERK1/2, die wichtige Überlebenssignale in Endothelzellen vermittelt. Zusammenfassend zeigen die Ergebnisse dieser Arbeit, daß Shear Stress die Expression der antiinflammatorischen Proteine Clusterin und TRAF3 sowie der Mechanotransduktoren Integrin alpha5 und ß1 erhöht. Die Hemmung der Komplement und CD40induzierten Aktivierung von Endothelzellen durch Shear Stress ist von Bedeutung, um sowohl der Initiation als auch der Progression der Atherosklerose entgegen zu wirken. Die Shear Stressinduzierte Adhäsion, die über die Stimulation der Expression des FibronektinRezeptors alpha5ß1 vermittelt wird, ist eine wichtige Voraussetzung für die Mechanotransduktion von Shear Stress und das Überleben von Endothelzellen. Die Identifizierung und Aufklärung atheroprotektiver Mechanismen, die durch die laminare Schubspannung des Blutes aktiviert werden, könnten dazu beitragen, die Integrität des Endothels und die Funktionalität der Blutgefäße im Rahmen der Atherosklerose zu schützen.
Die G/F-Transition zytoskelettärer Elemente bildet die molekulare Basis zur Kontrolle der Zellform, Motilität, Migration und Invasivität von Zellen. Die Änderungen der Filamentlängen werden durch bindende Proteine kontrolliert, wodurch sich die viskoelastischen Eigenschaften des Zytoplasmas ändern. Die Kenntnis der mechanischen Eigenschaften der einzelnen Zytoskelettelemente in vitro (mit und ohne bindende Proteine) ist die Grundlage zum Verständnis der Zellmechanik. Daher wurde eine nicht destruktive Methode zur Bestimmung viskoelastischer Eigenschaften von Gelen und Flüssigkeiten entwickelt. Als Viskositätssensor dient ein kleines Glasstäbchen, welches in der zu untersuchenden Flüssigkeit in seiner Resonanzfrequenz schwingt. Aufgrund der Zähigkeit der Flüssigkeiten kommt es zur Mitbewegung angrenzender Flüssigkeitsschichten. Die Eindringtiefe der erzeugten Scherwellen ist eine Funktion der Viskosität und der Dichte der Flüssigkeit. Die extrem kleinen Auslenkungen (1100 nm) des Sensors werden von einem phasensensitiven akustischen Mikroskop detektiert, welches gleichzeitig die Detektion des Elastizitätsmoduls der Flüssigkeit ermöglicht. Nach Aufbau und Weiterentwicklung des Gerätes wurde die Viskoelastizität während der Polymerisation von Aktin, Tubulin und Neurofilamentprotein gemessen sowie während der Interaktion der Polymere mit einer Reihe spezifisch bindender Proteine, wie z.B. aAktinin, Profilin, Glykolyseenzyme, MAPs bzw. Zellgiften wie Cytochalasin D, Phalloidin, Colchizin und Taxol. Im Vergleich zu FAktinlösungen ist die dynamische Viskosität von Mikrotubulilösungen um eine Zehnerpotenz und die Schallgeschwindigkeit um etwa 100 m/s höher. Die Viskoelastizität von Nicht-Muskelaktin ist im Vergleich zu Muskelaktin etwa dreimal höher. Die steadystate-Viskositäten von F-Aktin und Mikrotubulilösungen nähern sich mit steigender Proteinkonzentration einem Maximalwert an, wohingegen die Elastizitäten sich einem Minimalwert annähern, was auf eine nematische Phasentransition zurückzuführen ist. Der Schallgeschwindigkeitsverlauf während der Polymerisation von Aktin und Tubulin ist biphasisch: er nimmt zunächst vor messbaren Viskositätsänderungen zu, was hinsichtlich des Aktins auf eine Zunahme steifer Aktinprimer und hinsichtlich des Tubulins auf die Bildung oligomerer Strukturen mit hoher intrinsischer Steifigkeit zurückzuführen ist. Für Proteinkonzentrationen >20 µM fällt dann die Schallgeschwindigkeit nach dem Erreichen des Viskositätsmaximums ab, was durch eine erhöhte Volumenkompressibilität infolge zunehmender Hydratation der Polymere begründet ist. Versuche mit polymerisationsfördernden bzw. depolymerisierenden Agenzien wie Taxol bzw. Colchizin und Kalzium zeigen, dass die hohe Elastizität von Mikrotubulilösungen durch die intrinsische Elastizität der Tubulinoligomere dominiert wird. Die Viskosität von Mikrotubuli mit assoziierten MAPs (MTP) ist im Vergleich zu FAktin ungefähr doppelt so hoch und im Vergleich zu PC-Tubulin ungefähr dreimal niedriger. Die Elastizität von MTP ist im Vergleich zu FAktin durchschnittlich 4 % höher und 3 % niedriger im Vergleich zu MAP-freien Mikrotubuli. Die Assoziationen von Neurofilamenten an Mikrotubuli induzierte einen Viskositätsanstieg, während die Elastizität fiel, was auf eine Destabilisation der Mikrotubuli während der Interaktion zurückzuführen ist. Die Destabilisation ist möglicherweise eine Folge einer GTP-Hydrolyse durch die an den Neurofilamenten assoziierte GTPase. Neben den zeitlich voneinander unabhängigen Verläufen der Schallgeschwindigkeit und der Viskosität konnte mit Hilfe der Detektion der Schalldämpfung während der Polymerisation von Aktin eine weitere zeitlich unabhängig verlaufende Kinetik bestimmt werden, welche mit der Quervernetzung und der Filamentlänge zusammenhängt. Die Schalldämpfung von Neurofilamenten ist im Vergleich zu F-Aktin etwa 10mal höher. Während der Polymerisation von Tubulin, mit und ohne MAPs, konnte aufgrund hoher Schallreflektionen, bedingt durch die festkörperähnlichen Strukturen, keine klar definierte Schalldämpfungskinetik bestimmt werden. Die Elastizität von Aktingelen (1 mg/ml) hängt nicht mit der Deformationsfrequenz (0,0533 kHz) zusammen. Nach der Zugabe von a-Aktinin steigt jedoch die Elastizität mit der Frequenz gemäß dem Verhalten eines elastischen Körpers an. Auch durch die Zugabe hoher ATP-Konzentrationen (2 mM) kann die Elastizität von Aktin erhöht werden. Impulsartige Modulationen der Schwingungsamplitude von ± 30 nm senkten die Viskosität von Aktingelen (< 25 µM) um 50 %, was auf ein Zerschlagen und Umorientieren von Filamenten zurückzuführen ist. Durch die Zugabe von aAktinin waren diese Viskositätsänderungen siebenmal niedriger. Die Viskosität von Aktingelen > 50 µM konnte durch impulsartige Erhöhungen der Schwingungsamplitude (> 40 nm) nicht verringert werden. Ebenso wurden die Viskositäten von Tubulingelen (15100 µM) und Neurofilamentlösungen (> 0,5 µM) durch impulsartige Deformationen im Nanometerbereich (10100 nm) nicht beeinflusst. Niedrige Profilinkonzentrationen (Aktin:Profilin 1) fördern die Polymerisation von Mg 2 bgGAktin. Ebenso führt die Zugabe von Profilin (Aktin:Profilin = 1:1) zu bereits polymerisiertem Aktin zu einer Viskositätszunahme. Profilin im Überschuss (Aktin:Profilin = 1:5) hemmt die Polymerisation von Mg 2 bgG Aktin. Im Gegensatz zu Muskelaktin verliert NichtMuskelaktin nach einiger Zeit (> 40 Minuten) seine Elastizität. Dieser Elastizitätsverlust kann durch die Zugabe von Profilin verzögert werden. Nach der Zugabe geringer Profilinkonzentrationen zu bgAktin wurde anhand von EM-Aufnahmen vermehrt nicht filamentöse Aktin-Aggregate gezeigt, welches besonders hohe Elastizitätswerte aufwies. Zusammen mit den rheologischen Befunden für Aktin und Mikrotubulilösungen kann geschlossen werden, dass nicht filamentöse Formen zytoskelettärer Elemente (Tubulinoligomere, Aktintrimere, GAktincluster) in hohem Maße zur Elastizität von Zellen beitragen. Hexokinase fördert die Polymerisation von Aktin. In Gegenwart hoher ATP-Konzentrationen wirkt sie durch Fragmentierung von Aktinfilamenten elastizitätsmindernd. In Gegenwart von Glukose wird dieser Effekt aufgehoben. LDHH 4 fördert in Gegenwart ihres Coenzyms NADH die Polymerisation von Aktin. Gibt man zusätzlich Pyruvat hinzu, so wird dieser Effekt nahezu umgekehrt. Unter diesen Bedingungen ist ferner die Enzymaktivität der LDHH 4 eingeschränkt. Umgekehrt fördert die LDHH 4 in Gegenwart von Laktat und NAD die Polymerisation von Aktin, wobei gleichzeitig die Enzymaktivität der LDHH 4 erhöht ist. Diese Befunde sprechen für eine deutliche Reziprozität zwischen LDHH 4 und Aktin. Aldolase reduziert deutlich die Viskoelastizität von F-Aktin, was in der Bildung von F-Aktin-Aldolase Parakristallen begründet ist. Die Zugabe des Substrates FBP erhöht hingegen die Viskoelastizität von F Aktin. Der Effekt hängt jedoch davon ab, ob Magnesium-Ionen an den Aldolase-G-Aktin-Komplex binden. Wird Aldolase zu polymerisierendem Aktin zugegeben, so bleibt die Viskosität der Lösung unverändert, während die Elastizität zunimmt. In diesem Falle wird die Steifigkeit der Filamente durch die Anla gerung der Aldolase erhöht. Zytosolische, nichtmembrangebundene Enzyme, wie die Aldolase, Hexokinase und LDH binden demnach an F-Aktin und modulieren seine Mechanik. Das Ausmaß der Modulation hängt von der Konzentration der Enzyme sowie der Gegenwart der jeweiligen Substrate ab. Ferner moduliert Aktin reziprok die Aktivität der Enzyme.
In der vorliegenden Arbeit wird die Identifizierung von Genen der Carotinoid Biosynthese (crt) aus den Coryneformen Bakterien Brevibacterium linens und Brevibacterium flavum beschrieben. Hierbei konnten sechs neue crt Gene durch funktionelle Komplementierung bestimmt werden. Außerdem wurde erstmalig die Carotinoid Biosynthese von B. flavum, darunter auch drei neue Carotinoide, beschrieben. Voraussetzung für die Klonierung der crt Gene aus B. linens war die Entwicklung eines geeigneten Komplementierungssystems. Dieses System wurde in Carotinoidmutanten von B. flavum entwickelt. So konnte eine B. linens ExpressionsBibliothek nach Passage durch mehrere E. coliStämme, unter Umgehung des starken B. flavumRestriktionssystems, in B. flavumCarotinoidmutanten auf crt Genexpression hin untersucht werden. . Durch Komplementierung der Carotinoidmutanten von B. flavum konnte das Gen der Phytoen Synthase (crtB) aus B. linens funktionell kloniert werden. Mit diesem Gen als Sonde wurde aus einer B. linensCosmid Bibliothek das gesamte crt Gencluster isoliert. Auf dem sequenzierten DNAFragment von B. linens befanden sich 14 offene Leseraster mit Ähnlichkeiten zu Sequenzen aus Datenbanken. Durch Sequenzähnlichkeiten zu bekannten Genen konnte die Gene einer GGPP Synthase (crtE), einer Phytoen Synthase (crtB) und einer Phytoen Desaturase (crtI) bestimmt werden. Außerdem wurden erstmalig die Gene einer IPP Isomerase und einer DNAPhotolyase in einem crt Gencluster identifiziert. Durch heterologe Expression in B. flavum konnte das neue Gen einer bCarotin Desaturase (crtU) funktionell nachgewiesen werden. Dieses Gen kodiert für ein Enzym, das bCarotin in das aromatische Carotin Isorenieraten umsetzt. Ebenfalls durch heterologe Expression in B. flavum wurden zwei neue Gene (crtYc und crtYd) gefunden, deren Genprodukte gemeinsam die Zyklisierung von Lycopin zu bCarotin katalysieren. Die errechnete Molmasse dieser beiden Lycopin Zyklasen ist mit 12,5 und 13,9 kDa ungewöhnlich klein. Die zwei Lycopin Zyklasegene aus B. linens kodieren für eine neue Klasse von Lycopin Zyklasen. Es bestehen keine Sequenzähnlichkeiten dieser neuen Gene zu bisher bekannten Lycopin Zyklasegenen oder zu anderen Genen bekannter Funktion. Durch die partielle Deletion einer cDNA mit Lycopin Zyklase und Phytoen Synthaseaktivität (crtYB) aus dem Pilz Xanthophyllomyces dendrorhous konnte gezeigt werden, daß die Zentren der beiden Aktivitäten in unterschiedlichen Regionen des gebildeten Polypeptids sitzen. Die Phytoen Synthaseaktivität des Genproduktes geht auf einen Bereich des Polypeptids zurück, der Sequenzähnlichkeiten zu Phytoen Synthasen anderer Organismen aufweist. Das Zentrum der Lycopin Zyklaseaktivität liegt in dem Nterminalen Bereich des Polypeptids, der interessanterweise Sequenzähnlichkeiten zu den beiden Lycopin Zyklasen aus B. linens aufweist. Dieses Fusionsgen crtYB ist das erste bekannte Gen einer pilzlichen Lycopin Zyklase. Die Entwicklung der pilzlichen crtYB Fusionsgene aus crtB und Lycopin Zyklasegenen des in B. linens gefundenen Typs wird diskutiert. Die Hauptcarotinoide von B. flavum wurden als die C 50 Carotinoide Decaprenoxanthin, Decaprenoxanthin Monoglucosid und Decaprenoxanthin Diglucosid bestimmt. Bei der Analyse von B. flavumPigmentmutanten wurden außerdem die neuen Carotinoide Nonapren [2(3Methyl2butenyl)e, ycarotin], Flavuxanthin [2,2'Bis(4hydroxy3 methyl2butenyl)y, ycarotin] und Nonaflavuxanthin [2(4Hydroxy3methyl2 butenyl)y, ycarotin] als Intermediate identifiziert. Basierend auf den nachgewiesenen Carotinoiden konnte der vermutliche C 50 Carotinoid Biosyntheseweg für B. flavum vorgeschlagen werden. Durch Sequenzanalyse von B. flavumTransposonmutanten konnten erstmalig crt Gene der C 50 Carotinoid Biosynthese isoliert werden. Auf dem crt Gencluster von B. flavum konnten die Gene crtE, crtB und crtI aufgrund von Sequenzähnlichkeiten zu bekannten Genen bestimmt werden. Heterologe Expression in E. coli und Geninaktivierung durch homologe Rekombination in B. flavum zeigten, daß die Produkte von drei weiteren Genen ausreichen, um die C 50 Carotinoide von B. flavum zu bilden. Das Produkt eines neuen Lycopin Elongasegens (crtEb) verlängert Lycopin an Position C2 und C2' um jeweils eine C 5 Isopreneinheit und bildet ein azyklisches C 50 Carotinoid. Dieses wird von den Produkten der neuen C 50 Zyklasegene crtYe und crtYf zu einem zyklischen C 50 Carotinoid umgesetzt. Die Ergebnisse zeigen, daß entgegen früherer Vorstellungen, die Addition einer Isopreneinheit und die Zyklisierung bei der Bildung von zyklischen C 50 Carotinoiden zwei getrennte Schritte sind.