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Bei akuten oder chronischen Handgelenksbeschwerden stellt sich nach Anfertigung einer Röntgenaufnahme oft die Frage, welche diagnostische Maßnahme zur Ursachenklärung angeschlossen werden sollte. Übliche Untersuchungsmethoden sind das CT bei Verdacht auf ossäre Läsionen, die MRT bei Hinweise auf ligamentäre Störungen oder die diagnostische Handgelenksarthroskopie. Diese retrospektive Studie hat diese drei diagnostischen Maßnahmen gegenübergestellt und die CT und die MRT mit der diagnostischen Arthroskopie verglichen. Zu diesem Zweck wurden die Untersuchungsdaten von 34 Patienten, die im Zeitraum von 2001 bis 2006 in der Universitätsklinik Frankfurt am Main untersucht wurden ausgewertet. Dabei hat sich bestätigt, dass bei Verdacht auf knöcherne Läsionen, Knochenfehlstellungen oder Knochenanomalien ein Untersuchung mittels CT am sinnvollsten zur sichern Diagnosestellung ist. Im Vergleich von der CT und der diagnostischen Arthroskopie konnten alle 5 gesehenen ossären Schäden in beiden Verfahren erkannt werden. Die diagnostische Arthroskopie scheint also abhängig von der Lokalisation der Pathologie und dem gewählten arthroskopischen Zugang gleichwertig in der Diagnostik knöcherner Schädigungen zu sein. Zur Beurteilung von ligamentären Störungen, Knorpeldestruktionen oder Synovialitis, ist die CT im Gegensatz zur diagnostischen Arthroskopie aufgrund der eigenen Ergebnisse ungeeignet. Im Vergleich von MRT und diagnostischen Arthroskopie in der Bewertung von Knochenläsionen, können Bone bruise ausschließlich in der MRT, Frakturen der distalen Handwurzelreihe, aber in der MRT und der diagnostischen Arthroskopie erkannt werden. Störungen des Knorpels unterschiedlichen Ausmaßes, zeigten sich in der MRT doppelt so oft wie in der diagnostischen Arthroskopie, so dass die MRT in der eigenen Studie bei der Beurteilung des Knorpels der Arthroskopie überlegen war. Bei der Beurteilung von Ligamenten sind MRT und diagnostische Arthroskopie in der Lage gleichgut Schädigungen zu erkennen, sofern das Ligament im Zugangsbereich der Spiegelung liegt. Die MRT bietet also eine sehr gute Übersicht über wichtige Strukturen des gesamten Handgelenkes und lässt Pathologien oft schon früher erkennen als die diagnostische Arthroskopie. Vorteil der diagnostischen Arthroskopie und gleichzeitig Nachteil der MRT ist die Möglichkeit der anschließenden Therapie in derselben Sitzung. Nachteile der Arthroskopie sind die Invasivität, der Aufwand, die Kosten und dass je nach gewähltem Zugang nur ein Teil des Handgelenkes beurteilbar ist. Wichtig erscheinen zusammengefasst eine gute Anamnese, eine gezielte körperliche Untersuchung und die damit verbundene möglich exakte Verdachtsdiagnose. Dadurch ist es möglich unter Berücksichtung der Untersuchungsrisiken die Diagnostik und Therapie kostengünstig zu beeinflussen. Bei Verdacht auf ossäre Schäden wäre nach der Röntgenaufnahme ein CT sinnvoll. Finden sich auf dem Röntgenbild indirekte Anzeichen für Verletzungen anderer Genese und ist die Verdachtsdiagnose sehr wahrscheinlich und mittels Arthroskopie behandelbar, sollte sich direkt eine diagnostische Arthroskopie anschließen. Ist keine genaue Lokalisation der Handgelenksbeschwerden mit Erstellung einer Verdachtsdiagnose möglich, ist die Durchführung der MRT anzustreben. Zeigen sich hierbei verletzte Strukturen, die mittels Arthroskopie therapiert werden können, sollten beide Untersuchungen durchgeführt werden. Für die Zukunft wäre die Durchführung weiterer Studien unter Beachtung der zunehmend notwendigen Einsparungen im Gesundheitswesen sinnvoll. So könnten kostensparende Richtlinien aufgestellt und die Durchführung der bildgebenden Verfahren optimiert werden.
Das Hepatitis C-Virus (HCV) ist ein umhülltes RNA-Virus, das der Virusfamilie Flaviviridae angehört. Fast alle immunkompetenten Patienten bilden während einer HCV-Infektion multispezifische T-Zell-Antworten und neutralisierende Antikörper gegen verschiedene HCV-Hüllglykoproteine. Trotzdem sind sie nicht in der Lage, das Virus erfolgreich zu eliminieren. Etwa 70% der HCV-infizierten Patienten entwickeln eine chronische Infektion, die zu einer progressiven Leberschädigung führen kann. Aufgrund des Fehlens einer geeigneten in vivo oder in vitro Neutralisationsuntersuchung ist wenig über die humorale Immunantwort bzw. die Rolle und Bedeutung der neutralisierenden Antikörper bei der HCV-Infektion bekannt. Ein lang ersehntes Ziel in der HCV-Forschung ist die Entwicklung eines verlässlichen Virus-Systems zur Untersuchung der Interaktionen zwischen Zielzellen und HCV-Hüllglykoproteinen. In meiner Studie wurde die humorale Immunantwort bei 31 chronisch HCV-infizierten Patienten unter Anwendung von Hepatitis C-Pseudopartikeln (HCVpp) untersucht. Die untersuchten Patienten waren mit unterschiedlichen HCV-Genotypen infiziert, befanden sich zum Zeitpunkt der Untersuchung (Probeentnahme) in keiner Therapie und wiesen keine HIV- oder HBV-Koinfektion auf. Als Negativ-Kontrolle standen mir die Serum-Proben von 5 gesunden Probanden zur Verfügung. In dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass man durch die Anwendung von Hepatitis C-Pseudopartikeln neutralisierende Antikörper bei chronisch HCV-infizierten Patienten nachweisen kann. Gesunde Probanden hingegen wiesen keine neutralisierenden Antikörper auf. Die zur Untersuchung der humoralen Immunantwort hergestellten HCV-Pseudopartikel hatten den Genotyp 1a. Die Serum-Proben der untersuchten Patienten in meiner Studie waren mit HCV-Genotypen infiziert, die sich zum Teil von dem eingesetzten HCVpp-Genotyp unterschieden. Die Ergebnisse zeigen, dass diese Serum- Proben die Infektiösität der HCVpp mit nahezu gleicher Wirksamkeit reduzierten wie die Serum-Proben von Patienten, die mit dem HCV-Genotyp 1a infiziert waren (kreuzreaktive Eigenschaft der neutralisierenden Antikörper). Im letzten Teil dieser Arbeit wurden die antikörpervermittelte Virusneutralisation und die CD4+- und CD8+-T-Zell-Stimulation bei 22 chronisch HCV-infizierten Patienten gleichzeitig miteinander verglichen. In meiner Studie zeigten 11 Patienten eine starke, 9 Patienten eine schwache und 2 Patienten keine HCV-Neutralisation. Die Ergebnisse der Virusneutralisation waren unabhängig von den Ergebnissen der T-Zell-Stimulation und den HCV-Genotypen. Auch bei fehlender T-Zell- Antwort konnte eine Neutralisation beobachtet werden. Das untersuchte Patientenkollektiv bestand hauptsächlich aus Patienten mit einer chronischen HCV-Infektion, die weder zum Zeitpunkt der Untersuchung (Probeentnahme) noch anamnestisch eine Therapie unterzogen waren. Es gab lediglich zwei therapierte Patienten, die HCV-positiv (Non-Responder) waren. Sie zeigten beide eine starke Neutralisation bei starker CD8+-T-Zell-Antwort aber schwacher bzw. fehlender CD4+-T-Zell-Antwort. Andererseits zeigte ein Patient, der unter Therapie initial Responder war, eine starke T-Zell-Antwort in beiden CD4+- und CD8+-T-Lymphozyten bei schwacher Neutralisation. Vermutlich aufgrund der kleinen Gruppe aber auch in Übereinstimmung mit anderen Studien konnte in meiner Studie keine relevante Korrelation zwischen der Neutralisationsstärke und der T-Zell-Antwort bzw. keine Übereinstimmung der Ergebnisse im Verlauf der Infektion beobachtet werden. Die Ergebnisse meiner Studie haben gezeigt, dass Hepatitis C-Pseudopartikel (HCVpp) geeignete Antigene für die Untersuchung der Aktivität der neutralisierenden Antikörper und die spezifische Stimulation der T-Lymphozyten sind. Die Vorteile dieser Untersuchungsmethode sind ihre leichte Handhabung, die hohe biologische Sicherheit durch replikationsinkompetente und somit vermehrungsunfähige virale Partikel und der eindeutige und schnelle Nachweis durch die standardisierte Durchflusszytometrie. Mit dieser Methode kann eine Untersuchung der HCV-Infektion bzw. -Neutralisation auf reproduzierbare und einfache Weise erfolgen.
Zahlreiche Arbeiten konnten bislang einen Zusammenhang zwischen Sexualhormonen und dem Glukosestoffwechsel nachweisen. Ziel der vorliegenden Promotionsarbeit war die Untersuchung, inwiefern Sexualhormone durch eine Verbesserung der Glukosehomöostase durch optimierte Insulinbehandlung bei männlichen und weiblichen Patienten mit Typ 1- und Typ 2-Diabetes beeinflußt werden. Gleichzeitig sollte untersucht werden, ob sich Unterschiede der Sexualhormone zwischen Patienten mit günstiger und solchen mit ungünstiger diabetischer Einstellung zeigen lassen. Als Unterscheidungsparameter wurde hierzu der HbA1c-Wert mit einer Schwelle von 7,0 % verwendet. Im Zeitraum von Januar 2001 bis Oktober 2002 wurden insgesamt 280 männliche und weibliche Patienten mit Typ 1- und Typ 2-Diabetes im Alter von 16 bis 87 Jahren (57 ±14 Jahre, MW ± Std-Abw) untersucht. Das Gesamtkollektiv wurde hinsichtlich Diabetestyp, Geschlecht und bei Frauen dem Menopausenstatus in Subgruppen unterteilt. Die Glukosehomöostase sollte durch individuell optimierte Insulintherapie innerhalb einer 12-tägigen klinischen Intervention mit stationärem Aufenthalt verbessert werden. Innerhalb des Kollektivs fanden sich vor Beginn der Intervention keine signifikanten oder relevanten Korrelationen zwischen den Sexualhormonen und Parametern der Glukosehomöostase. Im Vergleich der Sexualhormone zwischen Patienten mit günstiger und solchen mit ungünstiger diabetischer Voreinstellung fanden sich ebenfalls keine signifikanten und gleichzeitig klinisch relevanten Unterschiede, wohl aber zu den Literaturhinweisen passende auffällige Unterschiede ohne Signifikanz. Obwohl im Verlauf der Intervention alle Gruppen ihren Fruktosaminspiegel durchschnittlich gesenkt und damit als Schlußfolgerung ihre Glukosehomöostase verbessert haben, war der Effekt der Blutzuckerverbesserung auf die Sexualhormonspiegel sehr gering, desweiteren uneinheitlich und zum Teil gegensätzlich, so daß die Frage im Raum steht, ob der Zusammenhang zwischen Glukosehomöostase und Sexualhormonen tatsächlich so eng ist wie zuvor vermutet. Allerdings fanden sich in einigen Subgruppen sehr kleine Fallzahlen und die Ergebnisse dieser Subgruppen sind deshalb eventuell nicht aussagekräftig.
Die 5-Lipoxygenase (5-LO) ist das Schlüsselenzym bei der zellulären Leukotriensynthese. Sie katalysiert zunächst die Umwandlung von AA zu 5-Hydroperoxyeicosatetraensäure (5-HPETE) und als zweiten Schritt die Dehydratisierung der 5-HPETE zum instabilen Epoxid Leukotrien A4 (LTA4). Leukotriene sind wichtige Mediatoren bei Entzündungsprozessen und allergischen Reaktionen. Die 5-LO besteht aus zwei Domänen, einer N-terminalen regulatorischen Domäne (AS 1-121) und einer C-terminalen katalytischen Domäne (AS 120-673). Die katalytische Domäne besteht hauptsächlich aus a-Helices, die regulatorische hingegen hat fast ausschließlich b-Faltblätter als Sekundärstrukturelemente. Mit ihrem aus acht Faltblättern bestehenden antiparallelen b-Sandwich hat sie Ähnlichkeit mit einer C2- Domäne. Sie besitzt eine Ca2+-Bindungsstelle und ist maßgeblich bei der Bindung des Enzyms an Membranen beteiligt. Für einige Inhibitoren und zelluläre Faktoren existieren Hinweise, dass sie an die C2-ähnliche Domäne der 5-LO binden, die direkten Beweise fehlen jedoch. Die katalytische Domäne enthält das aktive Zentrum mit einem prosthetischen Eisen und drei Phosphorylierungsstellen. In der vorliegenden Arbeit wurde zum ersten Mal erfolgreich eine Methode zur Überexpression und Aufreinigung der regulatorischen Domäne in E. coli entwickelt, die eine große Ausbeute des Zielproteins erbringt. In einer einfachen one-step Aufreinigung können bis zu 80 mg Fusionsprotein aus MBP und der regulatorischen Domäne der 5-LO (MBP-5LO1-128) pro Liter Expressionskultur gewonnen werden. Ein Verdau mit TEV-Protease führt zur effizienten Abspaltung des MBP. Die weitere Aufreinigung mit hydrophober Interaktionschromatogragphie ergibt eine Ausbeute von 3,4 mg reiner regulatorischer Domäne. Dabei weisen sowohl das Fusionsprotein, als auch die abgespaltene regulatorische Domäne eine Reinheit von über 95% auf. Leider ist die momentan erreichbare Konzentration der reinen regulatorischen Domäne noch nicht ausreichend, um damit NMR-Messungen zur Strukturaufklärung durchführen zu können. Es konnte bestätigt werden, dass die katalytische Domäne der 5-LO alleine nicht zu einer Umsetzung von Arachidonsäure in der Lage ist. Der Verlust der enzymatischen Aktivität ist vermutlich nicht auf eine Fehlfaltung der Proteindomäne zurückzuführen. Die korrekte Faltung der katalytischen Domäne konnte durch eine - wenn auch schwache - Bindung der Domäne an ATP gezeigt werden konnte. Die Zugabe von regulatorischer Domäne zu rekombinanter, aufgereinigter WT 5-LO hat unter gewissen Bedingungen (Abwesenheit von PC) einen stimulierenden Effekt auf die Aktivität des Gesamtenzyms. Dieser Effekt könnte durch eine „Dimerisierung“ der regulatorischen Domäne mit WT 5-LO hervorgerufen werden. In Gegenwart von PC ruft die regulatorische Domäne eine Hemmung der 5-LO-Aktivität hervor. Außerdem ist MBP-5LO1-128 (im Gegensatz zu MBP alleine) in der Lage, das Zwischenprodukt der 5-LO, 5-HPETE, in einer 1:1 Reaktion zu reduzieren. Diese Fähigkeit könnte zur Unterdrückung einer Selbstaktivierung der 5-LO physiologisch bedeutend sein. Interessant ist, dass die Reduktion in Anwesenheit von Ca2+, PC oder PC und Ca2+ deutlich verringert war. Ca2+ führte vor allem in Abwesenheit von PC zu einer deutlichen Verminderung der 5-HPETE-Reduktion. In Gegenwart von PC zeigt Ca2+ nur einen minimalen Einfluss auf die 5-HPETE-Reduktion. Es existieren deutliche Hinweise für eine Konformationsänderung von C2-Domänen durch Ca2+-Bindung [105; 106]. Geht man davon aus, dass dies auch für die C2-ähnliche Domäne der 5-LO zutrifft, erklärt sich damit die Verminderung der 5-HPETE-Menge in Gegenwart von Ca2+. Es ist gut vorstellbar, dass eine Ca2+-induzierte Konformationsänderung zu einer schlechteren Zugänglichkeit der für die Reduktion wichtigen Aminosäureseitenketten führt. Die Anwesenheit von PC führte zu einer noch stärkeren Hemmung der 5-HPETEReduktion, als die Zugabe von Ca2+. Die Beobachtung, dass 5-HPETE in Anwesenheit von PC teilweise vor einer Reduktion geschützt wird, ist in Übereinstimmung mit Ergebnissen von Rakonjac [62]. Vermutlich werden die, für die Reduktion wichtigen Aminosäureseitenketten bei Bindung der Domäne an die PC-Micellen teilweise verdeckt. Cystein 99 könnte eine Rolle bei dieser Reaktion spielen. Es konnte jedoch gezeigt werden, dass es bei der Reduktion von 5-HPETE nicht zu einer maßgeblichen Ausbildung von Disulfidbrücken kommt. Vorstellbar wäre die Ausbildung einer Hydroxysulfonylgruppe am Cystein. Eine Beteiligung von Cystein 99 wird durch die Ergebnisse des Dockings von 5-HPETE an das Homologiemodell der 5-LO und experimentelle Daten aus anderen Arbeiten (M. Hörnig, O. Rådmark) unterstützt. Um den genauen Mechanismus aufzuklären und die physiologische Relevanz zu zeigen sind weitere umfassende Untersuchungen nötig. Um eine Bindung von Hyperforin, LP 121, C06 und B02 an die regulatorische Domäne zu untersuchen wurde ein Kompetitionsassay entwickelt. Dabei wurde rekombinante, aufgereinigte 5-LO mit dem entsprechenden Inhibitor versetzt und dann versucht, die Hemmung mit Hilfe der regulatorischen Domäne aufzuheben. Greift der Inhibitor an der regulatorischen Domäne an, so sollte die Zugabe von MBP-5LO1-128 bewirken, dass ein Teil des Inhibitors an die regulatorische Domäne bindet, er sich somit nicht mehr an der 5-LO befindet und seine Wirkung vermindert wird. Um sicher zu gehen, dass die beobachteten Effekte nicht artifiziell sind, wurde ein Inhibitor, der an der katalytischen Domäne der 5-LO angreift als Negativkontrolle für den Assay benutzt. Für diesen Zweck wurde der Eisenligandinhibitor Zileuton ausgewählt. Es ist bekannt, dass Zileuton das Eisen im aktiven Zentrum der 5-LO chelatiert und nicht an die regulatorische Domäne bindet. Die Hemmung von Zileuton konnte erwartungsgemäß durch Zugabe der regulatorischen Domäne nicht aufgehoben werden. Hyperforin und B02 zeigten eine deutlich verminderte 5-LOHemmung bei steigender Menge an MBP-5LO1-128. Die Hemmung durch LP 121 und C06 wurde nicht von der regulatorischen Domäne beeinflusst. Es konnte also ein effektives und einfaches Screeningverfahren zur Untersuchung der Bindung von 5-LO-Inhibitoren an die regulatorische Domäne entwickelt werden, mit der Einschränkung, dass der Assay nur für den Nachweis einer reversiblen Bindung von Inhibitoren an die regulatorische Domäne tauglich ist. Dieser Assay wird sich in Zukunft als wichtiges Tool bei der Suche nach neuen 5-LO-Inhibitoren erweisen, da die Substanzen mit einem direkten Angriff des aktiven Zentrums bisher nicht zu effektiven und nebenwirkungsarmen Arzneimitteln geführt haben.
Einleitung Ziel dieser retrospektiven Studie war die Evaluation des Eurotransplant Senior Program (ESP) an unserem Zentrum unter besonderer Berücksichtigung operativer Gesichtspunkte und der Vergleich mit älteren Empfängern aus dem regulären Eurotransplant Kidney Allocation System (ETKAS). Patienten und Methoden Die Daten von 73 Patienten (durchschnittliches Empfänger-/Spenderalter 67,1 Jahre / 71,1 Jahre) aus dem ESP- und 51 Patienten (63,6 Jahre/49,7 Jahre) aus dem ETKAS-Programm, die zwischen den Jahren 1999 und 2006 transplantiert wurden, wurden miteinander verglichen. Das mittlere Follow-up betrug 39,5 ± 23,6 Monate. Ergebnisse Die Nierenfunktion der Spender gemessen an der Kreatinin-Clearance (ESP vs. ETKAS: 81,7 vs. 109,9 ml/min), die kalte Ischämiezeit (10,6 vs. 15,1h), die Dauer der Nierenersatztherapie (42,2 vs. 76,8 Monate) sowie die HLA Mismatches (4,1 vs. 2,4) waren zwischen den Gruppen signifikant verschieden (p<0,001). Die primäre Funktionsaufnahme der Transplantate lag im ESP vs. ETKAS bei 74% vs. 69%, 90% vs. 92% der Patienten wurden mit einem funktionierenden Transplantat entlassen (alle p>0,05). Die chirurgische Komplikationsrate lag im ESP vs. ETKAS bei 47% vs. 28% (p=0,031), die Revisionsrate bei 33% vs. 24% (p=0,259). 18% der Patienten aus dem ESP und 14% aus dem ETKAS sind im Verlauf des Follow-up verstorben (p=0,273), 95% davon mit guter Transplantatfunktion. Das 3-Jahres-Patientenüberleben betrug im ESP vs. ETKAS 84% vs. 92% (p=0,252), das zensierte 3-Jahres-Transplantatüberleben 85% vs. 88% (p=0,757). Schlussfolgerungen Es zeigte sich eine deutliche Erweiterung des Spender- und Empfängerpools durch das ESP. Die Transplantationsergebnisse im ESP waren hinsichtlich Patienten- und Transplantatüberleben durchaus mit den Ergebnissen der ETKAS-Gruppe vergleichbar. Patienten und deren betreuende Ärzte sollten allerdings über eine höhere chirurgische Komplikationsrate im ESP informiert sein. Chirurgische Komplikationen können die postoperative Behandlung der Patienten erheblich beeinflussen, bleiben jedoch meist ohne signifikanten Einfluss auf das Transplantationsergebnis.
Die extrakorporale Zirkulation ist mit einer Reihe inflammatorischer Reaktionen und dadurch verursachten pathologischen Veränderungen verschiedener Organsysteme verbunden. {2}{17}{40}-{42}{56}{57} Dies wird zu einem großen Teil durch die Aktivierung der Leukozyten nach dem Kontakt mit der Fremdoberfläche der EKZ und nachfolgender Ausschüttung von Entzündungsmediatoren vermittelt. {36}-{38} Die freigesetzten proteolytischen Enzyme der Leukozyten rufen eine pathologische Hyperpermeabilität des Endothels mit massiver Einschwemmung neutrophiler Granulozyten ins Gewebe und möglicher Parenchym- und Organschädigung hervor. {2}{17}{56}{57} Um diese inflammatorische systemische Reaktion (SIRS) zu verringern, wurden Versuche unternommen, den Aufbau und die Fremdoberfläche der Herz-Lungen-Maschine biokompatibler zu gestalten. {3}-{9}{18}-{23} Ebenfalls wurden im Rahmen klinischer Studien Therapieansätze auf pharmakologischer Ebene evaluiert. {10}-{13}{15}-{17} Das Prinzip der Leukozytendepletion mittels eines speziell angefertigten Filters wurde in den dreißiger Jahren entwickelt. Es fand Anfang der siebziger Jahre in der Transfusionsmedizin seine erste routinierte Anwendung. {31} In der Herzchirurgie wurde der Leukozytenfilter Ende der achtziger Jahre eingeführt. Dort wurde er in der arteriellen und venösen Linie sowie für die Kardioplegie und zur Filtrierung des Restblutes aus dem Kardiotomiereservoir eingesetzt. {62}{92}{93}{95}-{97} In der vorliegenden Studie erfolgte die Leukozytendepletion in der arteriellen Linie der EKZ bei 80 Patienten mittels eines Leukozytenfilters (Leukoguard LG6, Pall, Dreieich, Deutschland). Da die Filterkapazität und –effizienz zeitlich begrenzt sind, wurde der Einsatz des Filters in der kritischen Phase der Reperfusion evaluiert. Während dieser Phase erreicht die Leukozytenaktivierung den Höchstwert (Gruppe III: 10 Minuten vor Aortenklemmöffnung und für die ersten 20 Minuten der cardiopulmonalen Reperfusion, Gruppe IV: nach erfolgter 20minütiger Reperfusionsphase bis Ende der EKZ). Zum Vergleich wurde der Leukozytenfilter auch während des Gesamtdauer der CCB angewendet (Gruppe II). Bei der Kontrollgruppe kam ein Standardfilter zum Einsatz. Die Patientengruppen wurden aus 20 radomisierten Patienten gebildet. Zu bestimmten peri-, intra- und postoperativen Zeitpunkten wurden folgende Parameter untersucht: PMN-Elastase, Procalcitonin, MDA (Malondialdehyd), MPO (Myeloperoxidase), NSE (Neuronenspezifische Enolase), S100-Protein, CK, CK-MB, Kreatinin und Harnstoff. Ebenso wurden die Leukozyten-, Erythrozyten- und Thrombozytenzahlen sowie der Hämatokrit- und Hämoglobinwert gemessen. Die Sauerstoffsättigung wurde mittels des Sauerstoffdruckes der Sauerstofffraktion und -indizes untersucht. Zusätzlich wurde die Dauer der Intubation, des Aufenthaltes auf der Intensivstation und des stationären Gesamtaufenthaltes ermittelt. Bei allen diesen Parametern konnten unter den Gruppen keine signifikanten Differenzen festgestellt werden. Die sensitiven Marker der Leukozytenaktivierung und der systemischen inflammatorischen Reaktion zeigten den in der Literatur beschriebenen typischen Kurvenverlauf. {106}{107}{135}{126}-{128}{148} Jedoch blieb der positive Einfluss der Leukozytendepletion aus. Die im Blutkreislauf gemessenen Leukozytenzahlen ebenso wie die Erythrozyten- und Thrombozytenzahlen konnten durch den Filtrationsvorgang nicht statistisch absicherbar reduziert werden. Auch die intraoperative Leukozytose wurde nicht signifikant reduziert. Offenbar reicht die Filterleistung nicht aus, um entsprechende Mengen an Leukozyten zurückzuhalten. Würde es sich hierbei ausschließlich um eine rasche Kapazitätsausschöpfung des Filters handeln, müsste jedoch zumindest am Anfang des Filtrationsvorganges eine Verringerung der Leukozytenzahlen feststellbar sein. Vermutlich wird der lokale Filtrationseffekt des Leukozytenfilters durch die massive systemische Mobilisation der Leukozyten durch weitere Aktivierung aufgrund von Entzündungsmediatoren und Endothelschäden überdeckt. Die Ergebnisse deuten des Weiteren darauf hin, dass die Leukozyten durch den Filtrationsvorgang ihre Funktion nicht verlieren. Sie sind weiterhin in der Lage, Entzündungsmediatoren auszuschütten und systemische inflammatorische Reaktionen in Gang zu setzen. Eine neue Filtergeneration, die neben der Verbesserung der mechanischen Filtration eine pharmakologische Inaktivierung der Leukozyten bewirkt, bleibt Gegenstand weiterer Forschung.
Reggie-1 (flotillin-2) and reggie-2 (flotillin-1) are membrane microdomain proteins which are associated with the membrane by means of acylation. They influence different cellular signaling processes, such as neuronal, T-cell and insulin signaling. Upon stimulation of the EGF receptor, reggie-1 becomes phosphorylated and undergoes tyrosine 163 dependent translocation from the plasma membrane to endosomal compartments. In addition, reggie-1 was shown to influence actindependent processes. Reggie-2 has been demonstrated to affect caveolin- and clathrin-independent endocytosis. Both proteins form homo- and hetero-oligomers, but the function of these oligomers has remained elusive. Moreover, it has not been clarified if functions of reggie-1 are also influenced by reggie-2 and vice versa. The first aim of the study was to further investigate the interplay and the heterooligomerization of reggie proteins and their functional effects. Both reggie proteins were individually depleted by means of siRNA. In different siRNA systems and various cell lines, reggie-1 depleted cells showed reduced protein amounts of reggie-1 and reggie-2, but reggie-2 knock down cells still expressed reggie-1 protein. The decrease of reggie-2 in reggie-1 depleted cells was only detected at protein but not at mRNA level. Furthermore, reggie-2 expression could be rescued by expression of siRNA resistant wild type reggie-1-EGFP constructs, but not by the soluble myristoylation mutant G2A. This mutant was also not able to associate with endogenous reggie-1 or reggie-2, which demonstrates that membrane association of reggie-1 is necessary for hetero-oligomerization. In addition, fluorescence microscopy studies and membrane fractionations showed that correct localization of overexpressed reggie-2 was dependent on co-overexpressed reggie-1. Thus, hetero-oligomerization is crucial for membrane association of reggie-2 and for its protein stability or protein expression. Moreover, the binding of reggie-2 to reggie-1 required tyrosine 163 of reggie-1 which was previously shown to be important for endosomal translocation of reggie-1. Since reggie-2 was implicated to function in clathrin- and caveolin-independent endocytosis pathways, the effect of reggie-2 depletion on reggie-1 endocytosis was investigated. Indeed, reggie-1 was dependent on reggie-2 for endosomal localization and EGF-induced endocytosis. By FRET-FLIM analysis it could be shown that reggie heterooligomers are dynamic in size or conformation upon EGF stimulation. Thus, it can be concluded that reggie proteins are interdependent in different aspects, such as protein stability or expression, membrane association and subcellular localization. In addition, these results demonstrate that the hetero-oligomers are dynamic and reggie proteins influence each other in terms of function. A further aim was the characterization of reggie-1 and reggie-2 function in actindependent processes, where so far only reggie-1 was known to play a role. Depletion of either of the proteins reduced cell migration, cell spreading and the number of focal adhesions in steady state cells. Thus, also reggie-2 affects actin-dependent processes. Further investigation of the focal adhesions during cell spreading revealed that depletion of reggie-1 displayed different effects as compared to reggie-2 knock down. Reggie-1 depleted cells had elongated cell-matrix-adhesions and showed reduced activation of FAK and ERK2. On the other hand, depletion of reggie-2 resulted in a restricted localization of focal adhesion at the periphery of the cell and decreased ERK2 phosphorylation, but it did not affect FAK autophosphorylation. Hence, reggie proteins influence the regulation of cell-matrix-adhesions differently. A link between reggie proteins and focal adhesions is the actin cross-linking protein -actinin. The interaction of -actinin with reggie-1 could be verified by means of co-immunoprecipitations and FRET-FLIM analysis. Reggie-1 binds -actinin especially in membrane ruffles and in other locations where actin remodeling takes place. Moreover, -actinin showed a different localization pattern during cell spreading in reggie-1 depleted cells, as compared to the control cells. These results provide further insights into the function of both reggie proteins. Their interplay and hetero-oligomerization was shown to be crucial for their role in endocytosis. In addition, both reggie proteins influence actin-dependent processes and differentially affect focal adhesion regulation.
Untersuchung von Rezeptor-Ligand-Komplexen mittels organischer Synthese und NMR-Spektroskopie
(2008)
Viele biologische Prozesse basieren auf der spezifischen Bindung eines Liganden an einen Rezeptor. Die Wechselwirkung zwischen dem Rezeptor und seinem Ligand kann im Wesentlichen durch zwei verschiedene Modelle beschrieben werden: zum einen das vom E. Fischer eingeführte Schlüssel-Schloss-Prinzip und zum anderen das von Koshland beschriebene "induced-fit-model". Bei dem Schlüssel-Schloss-Prinzip liegt der Ligand in der Bindetasche des Rezeptors wie ein Schlüssel im Schloss. Ganz anders hierzu setzt die induzierte Anpassung ("induced-fit-model") eine konformationelle Änderung des Proteins durch den Liganden für die Bindung voraus. Ändern sich jedoch die Konformationen von Substrat und Rezeptor in einer gegenseitigen Beeinflussung, dann spricht man von "double-induced-fitmodel". Die Untersuchung dieser Erkennung auf molekularer Ebene ist von großer Wichtigkeit, denn sie dient zum besseren Verständnis und damit auch zur gezielten Beeinflussung solcher Prozesse. Wie wird der Ligand von einem Rezeptor selektiv erkannt und gebunden? Für die Erkennung und Bindung spielen spezifische nichtkovalente Wechselwirkungen eine wichtige Rolle. Zum Repertoire der nichtkovalenten Wechselwirkungen gehören die elektrostatische Wechselwirkungen, die Wasserstoffbrückenbindung und der hydrophobe Effekt.
In der vorliegenden Arbeit werden anhand von drei ausgewählten Beispielen solche Wechselwirkungen zwischen verschiedenen Liganden mit ihrem Rezeptor untersucht. In den ersten beiden Kapiteln werden Proteine und im letzten Kapitel RNA als Rezeptor untersucht. Die einzelnen Kapitel beginnen jeweils mit einer kurzen Einführung der Rezeptoren und der dazugehörenden Liganden, schließlich wird dann die Rezeptor-Ligand-Wechselwirkung beschrieben. Als Rezeptor wurden in der vorliegenden Arbeit Proteine (Kinasen und Membranproteine) und strukturierten Elemente der RNA (Aptamerdomäne der purinbindenden Riboswitche und der SELEX-RNA) gewählt. Membranproteine der Atmungskette, Kinasen und Riboswitches stellen zusätzlich attraktive Rezeptoren für das Wirkstoffdesign dar. Die damit interferierenden Liganden umfassen Substrate, Cofaktoren, Metabolite und Inhibitoren. Die Untersuchung der Wechselwirkung erfolgte mittels NMR-Spektroskopie und organischer Synthese.
Struktur, Funktion und Dynamik von Na(+)-, H(+)-Antiportern : eine infrarotspektroskopische Studie
(2008)
Die Funktion von Membranproteinen ist von entscheidender Bedeutung für eine Vielzahl zellulärer Prozesse. Um diese verstehen zu können, ist das Verständnis der Beziehungen zwischen der Struktur, der Dynamik und der Wechselwirkung mit der Umgebung der Membranproteine notwendig. Spektroskopische Methoden, wie beispielsweise FTIR- und CD-Spektroskopie sind in der Lage, diese Informationen zu geben. In der vorliegenden Dissertation haben sie bedeutende Beiträge zum Verständnis der durch die Aktivierung induzierten Konformationsänderungen der Na+/H+ Antiporter geleistet. Die hohe Empfindlichkeit einer selbstkonstruierten FTIR-ATR-Perfusionszelle ermöglichte es, über eine Proteinprobe verschiedene Wirkstoffmoleküle perfundieren zu lassen und die dadurch verursachten strukturellen Änderungen spektroskopisch zu charakterisieren. Die Konformationsänderungen, die den Aktivierungsprozess begleiten, wurden bei zwei verschiedenen Na+/H+ Antiportern, NhaA und MjNhaP1, untersucht. Sie werden bei unterschiedlichen pH-Bereichen aktiviert bzw. deaktiviert. Der Na+/H+ Antiporter NhaA aus E. coli hat seine maximale Transportaktivität bei pH 8,5 und ist bei pH < 6,5 vollständig inaktiv. Trotz bekannter 3D-Struktur dieses Proteins für die inaktive Konformation bei pH 4 bleiben die Konformationsänderungen, die mit der Aktivierung des Proteins einhergehen, immer noch ungeklärt. Die Analyse der FTIR- und CD-Spektren von NhaA ergab in beiden Zuständen Anteile an beta-Faltblatt, an Schleifen und ungeordneten Strukturen, wobei die alpha-helikale Struktur dominiert. Die FTIR Spektren des inaktiven und aktiven Zustands zeigen zwei Komponenten, die auf die Präsenz zweier alpha-Helices mit unterschiedlichen Eigenschaften abhängig vom Aktivitätszustand hindeuteten. Die temperaturinduzierten strukturellen Änderungen und die Reorganisation des Proteins während des Entfaltungsprozesses bestätigten, dass die Aktivierung des Proteins eine Änderung in den Eigenschaften der alpha-Helices zur Folge hat. Aktivierung führt zu einer thermischen Destabilisierung dieser Struktur. Auch für die beta-Faltblattstruktur, welche den Hauptkontakt zwischen den Monomeren bildet, wurde ein unterschiedliches thermisches Verhalten zwischen dem inaktiven und aktiven Zustand beobachtet. Daraus konnte gefolgert werden, dass Aktivität nur dann möglich ist, wenn NhaA als Dimer vorliegt. Die Ergebnisse des (1)H/(2)H Austauschs zeigen, dass die Lösungsmittelzugänglichkeit des Proteins sich mit der Aktivierung ändert. Die Aktivierung des Proteins induziert eine offene, für die Lösung zugänglichere Konformation, in welcher die Aminosäureseitenketten in der hydrophilen Region des Proteins schneller Wasserstoff durch Deuterium austauschen, und in welcher zusätzliche Aminosäureseitenketten, die sich im inaktiven Zustand in der hydrophoben Region des Proteins befinden, mit der Aktivierung der Lösung exponiert werden. Die Aufnahme reaktionsinduzierter Differenzspektren ergab eindeutige spektroskopische Signaturen für die Zustände „inaktiv“ und „aktiv“. Die Differenzspektren der pH-Titration zeigten, dass der pH-Wert einen dramatischen Effekt sowohl auf die Sekundärstruktur als auch auf den Protonierungszustand der Aminosäureseitenketten hat. Die pH- und Na+-induzierte Aktivierung des Proteins führt zur Umwandlung der transmembranen alpha-helikalen Struktur bezüglich Länge, Ordnungsgrad und/oder Anordnung und zur einer Protonierungsänderung der Aminosäureseitenketten von Glutaminsäure oder Asparaginsäure. Die pD induzierten Sekundärstrukturänderungen lieferten zusätzlich Informationen über die Umgebungsänderung der Aminosäureseitenkette des Tyrosins mit der Aktivierung. Der Vergleich der durch die Bindung des Natriums und des Inhibitors induzierten Differenzspektren zeigte, dass die Bindungsstellen des Natriums und des Inhibitors unterschiedlich sind. Die FTIR- und CD-Ergebnisse für den Na+/H+ Antiporter MjNhaP1 aus M. jannaschii, der im Gegensatz zu NhaA bei pH 6 aktiv und bei pH Werten > 8 inaktiv ist, zeigten, dass ähnlich wie NhaA das Protein im aktiven Zustand bei pH 6 hauptsächlich aus alpha-Helices aufgebaut ist. Es bestand die Möglichkeit, zwei verschiedene Probenpräparationen (Protein in Detergenz bzw. in 2D-Kristallen) zu untersuchen und miteinander zu vergleichen. Die Erhöhung des pH-Werts bei der in Detergenz solubilisierten Probe führte zu einer Abnahme der alpha-helikalen und einer Zunahme der ungeordneten Strukturen. Das äußerte sich auch in den Untersuchungen zur thermischen Stabilität und im (1)H/(2)H Austauschexperiment. Die thermische Stabilität der alpha-Helices nahm mit der Inaktivierung dramatisch ab. Diese Ergebnisse zeigten auch, dass bei der Aktivierung von MjNhaP1 die beta-Faltblattstruktur nicht involviert ist, aber diese von fundamentaler Bedeutung für die Gesamtstabilität des Proteins und wahrscheinlich für den Hauptkontakt zwischen den Monomeren verantwortlich ist. Im Gegensatz zu NhaA ist die Monomer Monomer Wechselwirkung nicht für die Aktivität von MjNhaP1 notwendig. Aufgrund des höheren Anteils von ungeordneter Struktur im inaktiven Zustand der in Detergenz solubilisierten Probe beobachtet man in diesem Zustand einen höheren (1)H/(2)H Austausch. Der Vergleich mit den Ergebnissen des (1)H/(2)H Austausches von 2D-Kristallen ermöglichte die Lokalisation der ungeordneten Struktur an der Außenseite des Proteinmoleküls im inaktiven Zustand. Die pH-induzierten Differenzspektren zeigten, dass die Aktivierung zu einer Helikalisierung des Proteins und einer Protonierungsänderung der Aminosäureseitenketten von Asparaginsäure und/oder Glutaminsäure unabhängig von der Probenpräparation führt. Der Vergleich von NhaA und MjNhaP1 zeigt, dass die Aktivierung in beiden Fällen mit einer Konformationsänderung und Änderung der Protonierung oder der Umgebung von einer oder mehreren Seitenketten von Asparaginsäure oder Glutaminsäure verbunden ist. Dabei sind die Strukturänderungen der beiden Proteine während der Aktivierung ähnlich, bei Inaktivierung jedoch deutlich unterscheidbar. Die pH-induzierten Strukturänderungen wurden bei NhaA und MjNhaP1 durch die Mutanten G338S und R347A, die keine pH-Abhängigkeit der Aktivität zeigen, bestätigt.
Proteorhodopsin (PR) originally isolated from uncultivated γ-Proteobacterium as a result of biodiversity screens, is highly abundant ocean wide. PR, a Type I retinal binding protein with 26% sequence identity, is a bacterial homologue of Bacteriorhodopsin (BR). The members within this family share about 78% of sequence identity and display a 40 nm difference in the absorption spectra. This property of the PR family members provides an excellent model system for understanding the mechanism of spectral tuning. Functionally PR is a photoactive proton pump and is suggested to exhibit a pH dependent vectorality of proton transfer. This raises questions about its potential role as pH dependent regulator. The abundance of PR in huge numbers within the cell, its widespread distribution ocean wide at different depths hints towards the involvement of PR in utilization of solar energy, energy metabolism and carbon recycling in the Sea. Contrary to BR, which is known to be a natural 2D crystal, no such information is available for PR til date. Neither its functional mechanism nor its 3D structure has been resolved so far. This PhD project is an attempt to gain a deeper insight so as to understand structural and functional characterization of PR. The approach combines the potentials of 2D crystallography, Atomic Force Microscopy and Solid State NMR techniques for characterization of this protein. Wide range of crystalline conditions was obtained as a result of 2D crystallization screens. This hints towards dominant protein protein interactions. Considering the high number of PR molecules reported per cell, it is likely that driven by such interactions, the protein has a native dense packing in the environment. The projection map represented low resolution of these crystals but suggested a donut shape oligomeric arrangement of protein in a hexagonal lattice with unit cell size of 87Å*87Å. Preliminary FTIR measurements indicated that the crystalline environment does not obstruct the photocycle of PR and K as well as M intermediate states could be identified. Single molecule force spectroscopy and atomic force microscopy on these 2D crystals was used to probe further information about the oligomeric state and nature of unfolding. The data revealed that protein predominantly exists as hexamers in crystalline as well as densely reconstituted regions but a small percentage of pentamers is also observed. The unfolding mechanism was similar to the other relatively well-characterized members of rhodopsin family. A good correlation of the atomic force microscopy and the electron microscopy data was achieved. Solid State NMR of the isotopically labeled 2D crystalline preparations using uniformly and selectively labeling schemes, allowed to obtain high quality SSNMR spectra with typical 15N line width in the range of 0.6-1.2 ppm. The measured 15N chemical shift value of the Schiff base in the 2D crystalline form was observed to be similar to the Schiff base chemical shift values for the functionally active reconstituted samples. This provides an indirect evidence for the active functionality of the protein and hence the folding. The first 15N assignment has been achieved for the Tryptophan with the help of Rotational Echo Double Resonance experiments. The 2D Cross Polarization Lee Goldberg measurements reflect the dynamic state of the protein inspite of restricted mobility in the crystalline state. The behavior of lipids as measured by 31P from the lipid head group showed that the lipids are not tightly bound to the protein but behave more like the lipid bilayer. The 13C-13C homonulear correlation experiments with optimized mixing time based on build up curve analysis, suggest that it is possible to observe individual resonances as seen in case of glutamic acid. The signal to noise was good enough to record a decent spectrum in a feasible period. The selective unlabeling is an efficient method for reduction in the spectral overlap. However, more efficient labeling schemes are required for further characterization. The present spectral resolution is good for individual amino acid investigation but for uniformly labeled samples, further improvement is required.
Die Coltrims-Methode hat sich seit den 1990er Jahren als gutes experimentelles Instrument in der Atomphysik und darüberhinaus etabliert. Sie beruht darauf, dass die bei einer Reaktion entstehenden Fragmente mit ortssensitiven Detektoren nachgewiesen werden. Die Signale der Detektoren wurden bisher mit einem analogen Vorverstärker verstärkt und dann mit Hilfe eines Constant Fraction Discriminators in digitale Signale umgewandelt. Die Zeitinformation der digitalen Signale wurden von Time to Digital Convertern aufgenommen und im Computer gespeichert. Mit dieser Form der Auslese und Analyse der von den Detektoren stammenden Signale können nur einige wenige Fragmente nachgewiesen werden. Die Lösung dieses Problems besteht also darin, eine neue Variante für die Auslese und Analyse der Signale zu finden. Diese wurde in der Verwendung eines Transientenrekorders gefunden. Anstatt nur die Zeitinformation zu speichern, nimmt dieser die gesamte Signalform der Detektoren auf. Die Aufgabe, die in dieser Arbeit bearbeitet werden sollte, bestand darin, eine Software zu entwickeln, mit deren Hilfe der Transientenrekorder gesteuert werden kann. Auch sollte ein Weg gefunden werden nur die für das Experiment notwendigen Informationen des aufgenommenen Zeitfensters zu speichern. Des Weiteren sollten Methoden aufgezeigt werden, wie die aufgenommen Signale untersucht und deren Parameter extrahiert werden können. Diese Methoden wurden dann an realen Signalen getestet. Nachdem im ersten Kapitel die Motivation zu dieser Arbeit und einige theoretische Hintergründe vorgestellt werden, wird im zweiten Kapitel auf verschiedene Methoden der Signalanalyse eingegangen. Der Augenmerk liegt dabei sowohl auf Einzel- sowie Doppelsignalanalyse. Die Güte der vorgestellten Algorithmen wird mit Hilfe von künstlichen Signalen ermittelt. Es zeigt sich, dass die beste Methode die zeitliche Position der Einzelsignale zu finden, der Pulsfit ist. Mit dieser Methode kann eine Auflösung von etwa 50 ps erzielt werden. Bei der Betrachtung der Doppelsignale stellt sich heraus, dass der minimale Abstand zwischen den Signalen 5 ns bis 7 ns betragen muss. Das dritte Kapitel zeigt eine Anwendung des neuen Aufnahmesystems. Dort werden die physikalischen Ergebnisse, die mit Hilfe des neuen Systems gewonnen werden konnten, mit einem herkömmlichen Aufnahmesystem verglichen. Aufgrund der geringeren Totzeit des neuen Aufnahmesystems konnte mehr Statistik gewonnen werden. Der dadurch gewonnene Vorteil zeigt sich deutlich in den Ergebnissen, bei denen eine vierfach Koinzidenz verlangt wird. Bei dem nächsten Kapitel beschriebenen Experiment mussten sehr viele Fragmente nachgewiesen werden. Hierzu wird ein weiteres Kriterium neben der Zeitsumme vorgestellt mit dem die Anodensignale einander zugewiesen werden können. Die in diesem Kapitel gezeigten physikalischen Ergebnisse zeigen die Impulsverteilungen für Neon und Helium für unterschiedliche Lichtintensitäten bzw. Ionisationsprozesse. Im darauf folgenden Kapitel wird beschrieben, wie die neue Aufnahmemethode dazu verwendet werden kann, die von den Detektoren kommenden Signale genauer zu analysieren. Die physikalische Reaktion führte dazu, dass von dem Detektor hauptsächlich Doppelsignale aufgenommen wurden. Dies erlaubt die Untersuchung der Doppelsignalalgorithmen an realen Signalen. Hierbei zeigte sich, dass die Totzeit bei realen Signalen vergleichbar mit der Totzeit bei künstlichen Signalen ist. Die Algorithmen können bei Abständen der Einzelsignale von weniger als 10 ns die Position der Signale nicht mehr genau bestimmen. Anhand der Pulshöhenverteilung kann gezeigt werden, dass der verwendete Detektor in der Mitte eine geringere Nachweiseffizienz hatte. Im letzten Kapitel wird die Güte der verschiedenen Methoden der Einzelsignalanalyse anhand von realen Signalen überprüft. Dabei wurden Signale desselben Detektors mit unterschiedlichen Vorverstärkern verstärkt. Die beiden Vorverstärker unterschieden sich in ihrer Bandbreitenbegrenzung. Die Daten wurden mit einem Transientenrekorder mit 2 GS aufgenommen. Es wird gezeigt wie diese Daten umgewandelt werden können, so dass sie einem System mit nur 1 GS entsprechen. Dies erlaubt es die Güte der Methoden für Signale eines Systems mit 2 GS mit denen eines Systems mit 1 GS zu vergleichen. Es zeigt sich in der Pulshöhenverteilung, dass die Signale des stärker bandbreitenbegrenzten Vorverstärkers vergleichbar mit den künstlichen Signalen sind. Die Signale des weniger stark bandbreitenbegrenzten Vorverstärkers weisen eine zu starke Abhängigkeit ihrer Breite von der Pulshöhe auf. Aus diesem Grund sind die Ergebnisse des letzt genannten Vorverstärkers abweichend von den Ergebnissen mit den künstlichen Signalen. Bei diesem Vorverstärker zeigte der einfache Constant Fraction Algorithmus die beste Auflösung.
Stressorinduzierte ökotoxikologische Effekte und Genexpressionsveränderungen bei Chironomus riparius
(2008)
Die Effekte von Stressoren auf Chironomus riparius wurden im Lebenszyklustest und auf genomischer Ebene mit dem Ziel untersucht, ein auf einem DNA-Mikroarray („ChiroChip“) basierendes Screeningverfahren zu entwickeln. Die empfindlichsten Endpunkte der Lebenszyklustests waren die Mortalität, der Anteil fruchtbarer Eigelege, der mittlere Schlupfzeitpunkt der Weibchen sowie das Gewicht der Männchen. Temperaturveränderungen um ± 6°C gegenüber einer normalen Hälterungstemperatur von 20°C führten in allen Endpunkten zu hochsignifikanten Effekten. Eine LC10 konnte nur für die Salinität berechnet werden (0,66‰, KI: 0,26 − 1,68‰). Aufgrund der nicht-linearen Konzentrations-Wirkungs-Beziehungen konnte nur für den mittleren Schlupfzeitpunkt der Weibchen nach einer Exposition gegenüber Cadmium eine EC50 (0,53 mg/kg, KI: 0,29 − 0,97 mg/kg) bestimmt werden. In den Versuchen mit Methyltestosteron, Ethinylöstradiol, Carbamazepin, Fluoxetin, Blei und Tributylzinn (mit denen auch molekularbiologische Untersuchungen durchgeführt wurden) waren die empfindlichsten Endpunkte die Mortalität, der Anteil fruchtbarer Eigelege, der mittlere Schlupfzeitpunkt der Weibchen sowie die Populationswachstumsrate. Carbamazepin (CBZ) wirkte schlupfverzögernd bei den Weibchen. 10 mg CBZ/kg führte zu einer höheren Mortalität, weniger Eigelegen, die vermehrt unfruchtbar waren, sowie zu einer geringeren Populationswachstumsrate. Fluoxetin (FX) wirkte bei beiden Geschlechtern schlupfverzögernd. 0,9 mg FX/kg führte zu einer erhöhten Mortalität, weniger und vermehrt unfruchtbaren Eigelegen und einer geringeren Populationswachstumsrate. In der höchsten Konzentration (5,9 mg/kg) waren die Weibchen leichter als die Kontrolltiere. Tributylzinn (in µg Sn/kg angegeben) bewirkte eine höhere Mortalität und geringere Populationswachstumsrate bei 100 µg Sn/kg und führte zu einer Verzögerung im Schlupfverlauf bei den Weibchen. Bei 160 µg Sn/kg gab es weniger Eigelege, die vermehrt unfruchtbar waren. Die Männchen, die gegenüber Konzentrationen von 120 und 160 µg Sn/kg exponiert wurden, waren leichter als die Kontrolle. Expositionen gegenüber Blei (Pb) in Konzentrationen von 0,65 − 65 mg/kg führten bei 6,5 mg Pb/kg zu einer erhöhten Mortalität und zu mehr unfruchtbaren Gelegen. Bei 0,65 mg Pb/kg waren die Männchen leichter und bei 6,5 mg Pb/kg schwerer. Die Anzahl der fruchtbaren Gelege pro Weibchen war bei 3,25 und 6,5 mg Pb/kg geringer als in der Kontrolle. Die gegenüber 17alpha-Methyltestosteron (MET) exponierten Mücken hatten geringere Mortalitäten als in der Kontrolle und zeigten einen verfrühten Schlupf beider Geschlechter. Ab 27 µg MET/kg gab es weniger unfruchtbare Gelege, leichtere Männchen sowie erhöhte Populationswachstumsraten. 17alpha-Ethinylöstradiol (EE2) führte zu einem verfrühten Schlupf bei beiden Geschlechtern sowie zu erhöhten Populationswachstumsraten. Bei 9 µg EE2/kg gab es weniger unfruchtbare Gelege. Die Exposition von Chironomus-Larven gegenüber Methyltestosteron, Ethinylöstradiol, Fluoxetin, Carbamazepin, Tributylzinn und Blei führte zur differenziellen Expression von neun (Methyltestosteron) bis 49 (Carbamazepin) Genen. Bei der Untersuchung der exprimierten Proteine fällt auf, dass kaum bekannte Stressproteine (z.B. Glutathion-S-Transferase oder Cytochrom P450) differentiell reguliert wurden. Bei der Exposition wurden verschiedene Prozesse durch eine veränderte Genexpression beeinflusst. Eine Exposition gegenüber Methyltestosteron führte zu einer Beeinträchtigung von drei identifizierten biologischen Prozessen, während bei den anderen Substanzen sieben bis acht Prozesse beeinflusst waren. Die am häufigsten beeinflussten Prozesse waren der Protein- und der Energiemetabolismus. Der Sauerstofftransport ist ein Prozess, der bei allen Substanzen beeinflusst wurde, jedoch mit unterschiedlichen Anteilen. Bei einer Exposition gegenüber Methyltestosteron war der Anteil des Sauerstofftransports an den beteiligten Prozessen mit 84,6% am größten und mit 10,5% bei Fluoxetin am geringsten. Die veränderte Genexpression der Globine kann möglicherweise aufgrund der schadstoffspezifischen Veränderungen als Biomarker für das Monitoring von Freilandgewässern angewendet werden. Da Tubulin und Aktin häufig nach einer Exposition gegenüber Stressoren differenziell exprimiert wird (bei Tributylzinn und CBZ in der vorliegenden Arbeit und bei Antidepressiva und Östrogenen in anderen Studien) wären die beiden Proteine möglicherweise ebenfalls als Biomarker für Chemikalienstress geeignet. Vor der Verwendung des ChiroChips als Screeninginstrument für die Chemikalienuntersuchung und das Biomonitoring müssen noch Untersuchungen zur konzentrationsabhängigen Genexpression und zur Expression in unbehandelten Larven und weiteren Lebensstadien erfolgen. Des Weiteren müssen die vorliegenden Daten verifiziert und die Funktion der differentiell regulierten Gene vertieft untersucht werden.
In dieser Arbeit wurden potentielle Mitglieder des Proteinnetzwerks um Ataxin-2 untersucht, um Rückschlüsse auf die bisher unbekannte Funktion von Ataxin-2 machen zu können. Ataxin-2 ist das Krankheitsprotein der Spinozerebellären Ataxie Typ 2, einer Polyglutaminerkrankung, bei der die Expansion eines Polyglutamintraktes zur Degeneration von Purkinje-Neuronen führt. Da die Funktion von Ataxin-2 bisher nicht ermittelt werden konnte, sollte die Charakterisierung seiner Protein-Interaktoren es ermöglichen, Einblicke in seine Funktion zu gewinnen. Dazu wurden die drei Kandidaten „Similar to golgin-like“, TRAP und alpha-Actinin-1 untersucht, die alle drei mit Hilfe von Hefe-2-Hybrid Screens identifiziert worden waren. Im Fall von „Similar to golgin-like“, einem aus Genom und cDNA-Fragmenten hervorgesagten Protein unbewiesener Existenz, konnte eine mutationsabhängige Modulation der Bindungsstärke an Ataxin-2 im Hefe-2-Hybrid-System gezeigt werden, die sich allerdings mit rekombinanten Proteinen in Koimmunpräzipitationen in Säuger-Zellen nicht reproduzieren ließ. Beide Proteine kolokalisierten am ER, unabhängig von der Länge des pathogenen Polyglutamintraktes-2 in Ataxin. Gegen ein SIM-Peptid hergestellte Antikörper zeigten eine exklusive Expression im menschlichen Gehirn und wurden erfolgreich zum Nachweis eines endogenen Komplexes aus Ataxin-2 und SIM-IR im krankheitsrelevanten Gewebe eingesetzt. Allerdings war es nicht möglich, mittels 5’-RACE und 2D-Gel Massenspektrometrie die potentiellen Isoformen von SIM näher zu charakterisieren. Zur funktionellen Analyse von SIM wurden intrazelluläre Transportvorgänge am Golgi-Apparat untersucht, aber ein Einfluss von SIM / Ataxin-2 ließ sich nicht belegen. Im Fall des Interaktions-Kandidaten TRAP wurden Antikörper hergestellt und mit einem bereits publizierten polyklonalen Antikörper, der TRAP in rattus norvegicus erkennt, verglichen. Die Expressionsmuster zeigten eine identische Expression im Hirn und der Testis. Eine Kolokalisations-Studie wies sowohl TRAP als auch Ataxin-2 am ER nach. Allerdings erwiesen sich alle verwendeten Antikörper als ungeeignet für Immunpräzipitationen, so dass die physiologische Existenz des endogenen TRAP-Ataxin-2 Komplexes nicht bewiesen werden kann. Im Fall des Interaktor-Kandidaten alpha-Actinin-1 ließ sich die Interaktion mit Ataxin-2 sowohl für die endogenen Proteine in der zytosolischen Fraktion von Mausgehirnen als auch für die rekombinanten Proteine in Säuger-Zellen belegen. Beide Proteine konnten im Zytosol und zu kleineren Anteilen an der Plasmamembran kolokalisiert werden. Als verantwortliche Subdomänen im Fall von Ataxin-2 wurde der N-terminale Bereich des Proteins in der Nähe der pathogenen Expansion, im Fall von alpha-Actinin-1 die Aktin-bindende Domäne durch GST-pulldown Analysen identifiziert. Darauf aufbauend wurde in Patienten-Fibroblasten das Aktinzytoskelett und die Dynamik von alpha-Actinin-1 in Anwesenheit der Ataxin-2-Polyglutamin-Expansion untersucht, wobei allerdings kein Unterschied zu erkennen war. Anschließend an die Analyse des Zytoskeletts wurde ein möglicher Einfluss von Ataxin-2 und seiner Polyglutamin-Expansion auf die EGF-Rezeptorinternalisierung studiert, da eine Rolle von Ataxin-2 auf die Endozytose in parallelen Analysen der Arbeitsgruppe wahrscheinlich wurde. Hierzu wurden Säuger-Zellen mit alpha-Actinin-1 transfiziert und die Internalisierung mikroskopisch und mittels Analyse der ERK1/2 Aktivierung verfolgt. Ergänzt wurden die Experimente durch Analysen zur ERK1/2 Aktivierung in Patienten- und Kontroll-Fibroblasten. Entgegen den Erwartungen hatte die Überexpression von alpha-Actinin-1 keinen Einfluss auf die Internalisierung, und bei keinem der Ansätze zeigte sich eine signifikante Veränderung der ERK1/2 Aktivierung. Auch Transkriptombefunde aus SCA2-KO Gewebe, nach denen einzelne Gene des Zytoskeletts oder der Rezeptor-Endozytose ihre Expression ändern, ließen sich nicht mit Konsistenz validieren. Abschließend wurden Experimente zur subzellulären Lokalisation von Ataxin-2 durchgeführt, die eine Lokalisation am ER und nicht wie bisher berichtet am Golgi-Apparat sicherten und Ergebnisse zur Assoziation mit Polyribosomen bekräftigten. Obwohl somit bei allen drei Proteininteraktor-Kandidaten glaubwürdige Befunde für eine Ataxin-2 Bindung sprechen, ist derzeit eine funktionelle Analyse der Assoziationen nicht möglich und eine klare Definition der physiologischen Rolle von Ataxin-2 lässt sich aus diesen Daten nicht ableiten, wenn auch die prominente Lokalisation von Ataxin-2 am rauen endoplasmatischen Retikulum mit einem Einfluss von Ataxin-2 auf die ribosomale Translation und die Sekretion in Cisternen kompatibel ist.
Im Rahmen dieser Arbeit wurden ausgewählte 5’- und 3’-untranslatierte Regionen (UTRs) von mRNAs aus H. volcanii bestimmt. Dieses Datenset wurde verwendet um (1) haloarchaeale UTRs zu charakterisieren, (2) Konsensuselemente für die Transkrikptionsinitiation und -termination zu verifizieren und (3) den Einfluss haloarchaealer UTRs auf die Initiation und Regulation der Translation zu untersuchen. Es konnte gezeigt werden, dass alle untersuchten Transkripte nichtprozessierte 3’-UTRs mit einer durchschnittlichen Länge von 45 Nukleotiden besitzen. Darüber hinaus konnte ein putatives Transkriptionsterminationssignal bestehend aus einem pentaU-Motiv mit vorausgehender Haarnadelstruktur identifiziert werden. Die Analysen der Regionen stromaufwärts der experimentell bestimmten Transkriptionsstarts führten zur Identifizierung dreier konservierter Promotor Elemente: Der TATA-Box, dem BRE-Element und einem neuen Element an Position -10/-11. Überraschenderweise bestand die TATA-Box nur aus vier konservierten Nukleotiden. Die Untersuchung der UTRs ergab, dass die größte Anteil der haloarchaealen Transkripte keine 5’-UTR besitzt. Falls eine 5’-UTR vorhanden ist, besitzen unerwarteterweise nur 15% der 5’-UTRs aus H. volcanii eine Shine-Dalgarno-Sequenz (SD-Sequenz). Es konnte jedoch gezeigt werden, dass verschiedene native und artifizielle 5’-UTRs ohne SD-Sequenz sehr effizient in vivo translatiert werden. Außerdem hat die Sekundärstruktur der 5’-UTR und die Position struktureller Elemente offenbar einen entscheidenden Einfluss auf die Translatierbarkeit von Transkripten. Die Insertion von Strukturelementen nahe des Startkodons führte zu einer vollkommenen Repression der Translation, während die proximale Insertion des Motivs an das 5’-Ende der 5’-UTR keinen Einfluss auf die Translationsseffizienz hatte. Zusammenfassend kann sowohl der eukaryotische Scanning-Mechanismus als auch die bakterielle Initiation der Translation über die SD-Sequenz für haloarchaeale Transkripte mit 5’-UTR ohne SD-Sequenz ausgeschlossen werden. Die im Rahmen dieser Arbeit durchgeführten Untersuchungen bilden die Grundlage für weitere Untersuchungen zur Identifizierung eines entsprechenden dritten Mechanismus zur Initiation der Translation in H. volcanii. Eine aktuelle Studie zur globalen Analyse der Translationsregulation zeigte, dass der Anteil translational regulierter Gene in H. volcanii genauso hoch ist wie bei Eukaryoten (Lange et al., 2007). Um die Rolle haloarchaealer UTRs bei der Regulation der Translation zu charakterisieren, wurden die UTRs zweier ausgewählter translationsregulierter Gene untersucht. Es stellte sich heraus, dass nur die Anwesenheit beider UTRs, 5’- und 3’-UTR, zu einer Wachstumsphasen-abhängigen Regulation der Translation führt. Dabei hat die 3’-UTR allein keinen Einfluss auf die Translationseffizienz, während die 5’-UTR die Translationseffizienz in beiden Wachstumsphasen reduziert. Es zeigte sich außerdem, dass die 3’-UTR für die „Richtung“ der Regulation auf Translationsebene verantwortlich ist und putative Strukturelemente möglicherweise in den Regulationsmechanismus involviert sind. Zusammengefasst ergibt sich folgendes Modell der Translationsregulation in H. volcanii: Strukturierte 5’-UTRs führen zu einer Herabsetzung der konstitutiven Translationseffizienz. Dies kann differentiell durch regulatorische Faktoren kompensiert werden, welche spezifische Elemente der 3’-UTR binden. Sowohl natürliche als auch artifizielle Aptamere und allosterische Ribozyme stellen effektive Werkzeuge zur exogen kontrollierten Genexpression dar. Daher wurde die Anwendbarkeit eines Tetracyclin-induzierbaren Aptamers und eines konstitutiven Hammerhead-Ribozyms in H. volcanii untersucht. Es stellte sich allerdings heraus, dass das Aptamer bereits ohne Tetracyclin starke inhibitorische Sekundärstrukturen ausbildet. Als Alternative wurden Reportergenfusionen mit einem selbstspaltenden Hammerhead-Ribozym konstruiert. Die selbstspaltende Aktivität des Hammerhead-Ribozyms in H. volcanii konnte erfolgreich in vivo demonstriert werden, was die Grundlage zur Entwicklung konditionaler Expressionssysteme basierend auf dem Hammerhead-Ribozym in H. volcanii bildet.
Cellular metabolism can be envisaged by fluorescence lifetime imaging of fluorophores sensitive to specific intracellular factors such as [H+], [Ca2+], [O2], membrane potential, temperature, polarity of the probe environment, and alterations in the conformation and interactions of macromolecules. Lifetime measurements of the probes allow the quantitative determination of the intracellular factors. Fluorescence microscopy taking advantage of time-correlated single photon counting is a novel method that outperforms all other techniques with its single photon sensitivity and picoseconds time resolution. In this work, a time- and space-correlated single photon counting system was established to investigate the behavior of 2-(4-(dimethylamino)styryl)-1-methylpyridinium iodide (DASPMI) in living cells. DASPMI is known to selectively stain mitochondria in living cells. The uptake and fluorescence intensity of DASPMI in mitochondria is a dynamic measure of membrane potential. Hence, an endeavour was made to elucidate the mechanism of DASPMI fluorescence by obtaining spectrally-resolved fluorescence decays in different solvents. A bi-exponential decay model was sufficient to globally describe the wavelength dependent fluorescence in ethanol and chloroform. While in glycerol, a three-exponential decay model was necessary for global analysis. In the polar low-viscous solvent water, a mono-exponential decay model fitted the decay data. The sensitivity of DASPMI fluorescence to solvent viscosity was analysed using various proportions of glycerol/ethanol mixtures. The lifetimes were found to increase with increasing solvent viscosity. The negative amplitudes of the short lifetime component found in chloroform and glycerol at the longer wavelengths validated the formation of new excited state species from the initially excited state. Time-resolved emission spectra in chloroform and glycerol showed a biphasic increase of spectral width and emission maxima. The spectral width had an initial fast increase within 150 ps and a near constant thereafter. A two-state model based on solvation of the initially excited state and further formation of TICT state has been proposed to explain the excited state kinetics and has been substantiated by the de-composition of time-resolved spectra. The knowledge of DASPMI photophysics in a variety of solvents now provides the means of deducing complex physiological parameters of mitochondria from its behavior in living cells. Spatially-resolved fluorescence decays from single mitochondria or only very few organelles of XTH2 cells signified distinctive three-exponential decay kinetics of viscous environment. Based on DASPMI photophysics in a variety of solvents, these lifetimes have been attributed to the fluorescence from locally excited state (LE), intramolecular charge transfer state (ICT) and twisted intramolecular charge transfer (TICT) state. A considerable variation in lifetime among mitochondria of different morphology and within single cell was evident corresponding to the high physiological variations within single cells. Considerable shortening of the short lifetime component (τ1) under high membrane potential condition, such as in the presence of ATP and/or substrate, was similar to quenching and dramatic decrease of lifetime in polar solvents. Under these conditions τ2 and τ3 increased with decreasing contribution. Upon treatment with ionophore nigericin, hyperpolarization of mitochondria resulted in remarkable shortening of τ1 from 159 ps to 38 ps. Inhibiting respiration by cyanide resulted in notable increase of mean lifetime and decrease of mitochondrial fluorescence. Increase of DASPMI fluorescence on conditions elevating mitochondrial membrane potential has been attributed to uptake according Nernst distributions, to de-localisation of π electrons, quenching processes of the methyl pyridinium moiety and restricted torsional dynamics at the mitochondrial inner membrane. Accordingly, determination of anisotropy in DASPMI stained mitochondria in living XTH2 cells, revealed dependence of anisotropy on membrane potential. Such changes in anisotropy attributed to restriction of the torsional dynamics about the flexible single bonds neighboring the olefinic double bond revealed the previously known sub-mitochondrial zones with higher membrane potential along its length. Membrane-potential-dependent changes in anisotropy have further been demonstrated in senescent chick embryo fibroblasts. In conclusion, spectroscopic observations of excited-state kinetics of DASPMI in solvents and its behavior in living cells had revealed for the first time its localisation, mechanism of voltage sensitive fluorescence and its membrane-potential-dependent anisotropy in living cells. The simultaneous dependence of DASPMI photophysics on mitochondrial inner membrane viscosity and transmembrane potential has been highlighted.
Die Untersuchung der Eigenschaften von Hadronen und ihren Konstituenten (Quarks und Gluonen) in heißer und/oder dichter Kernmaterie ist eines der Hauptziele der Physik mit schweren Ionen. Der Zustand dichter und heißer Materie kann im Labor für kurze Zeit in der Reaktionszone von relativistischen Schwerionenkollisionen geschaffen werden. Einen Einblick über die Eigenschaften der starken Wechselwirkung und über die Massenerzeugung der Hadronen geben Dileptonen-Experimente, da Leptonen nicht von der starken Wechselwirkung beeinflusst werden. Unabhängig von der Strahlenergie zeigen die invarianten Massenspektren der Dileptonen in Schwerionenkollisionen im Vergleich zur Superposition der erwarteten hadronischen Zerfälle im Vakuum einen Überschuss im invarianten Massenbereich 0,2 - 0,6 GeV/c². Während dieser Überschuss bei CERN-SPS Energien in Zusammenhang mit der In-Medium-Modifikation der Spektralfunktion des Rho-Mesons gebracht wird, konnte die hohe Zahl der Dileptonen, die von der DLS Kollaboration in C + C und Ca + Ca bei 1 GeV/u beobachtet wurde, bis zum Erscheinen der HADES Daten nicht zufrieden stellend erklärt werden. Die Diskrepanz zwischen experimentellen Daten und Transportrechnungen erhielt den Namen "DLS Puzzle". In diesem Zusammenhang wurde eine kontroverse Diskussion über die Validität der Ergebnisse der DLS Kollaboration geführt. Das HADES Detektorsystem (High Acceptance Di-Electron Spectrometer), das sich am Schwerionensynchroton der Gesellschaft für Schwerionenforschung (GSI) in Darmstadt befindet, ist zur Zeit das einzige Experiment, das Dielektronen bei Projektilenergien von 1 - 2 GeV/u misst. Es tritt somit die Nachfolge des DLS Experiments an. Jedoch ist HADES durch zahlreiche technische Verbesserungen, u.a. Massenauflösung und Akzeptanz, im Vergleich zum Spektrometer DLS ein Experiment der 2. Generation. Erste Ergebnisse der Messung 12C + 12C bei 2 GeV/u der HADES Kollaboration bestätigen den generellen Trend einer erhöhten Zählrate im Vergleich zu den erwarteten Beiträgen von hadronischen Zerfällen. Es stellt sich die Frage, wie sich diese Beobachtung zu kleineren Strahlenergien hin fortsetzt. Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wird die mit dem HADES Detektorsystem durchgeführte Messung der Dielektronenproduktion in der Schwerionenkollision 12C + 12C bei einer Projektilenergie von 1 GeV/u ausgewertet. Wesentliche Zielsetzungen sind u. a. die Überprüfung der DLS Daten und die Bestimmung der Anregungsfunktion des Überschusses. In der Analyse wird demonstriert, dass Leptonen effizient nachgewiesen werden. Die dargestellte Paaranalyse zeigt, dass der kombinatorische Untergrund erfolgreich reduziert und die Menge der wahren Dielektronen weitgehend erhalten werden kann. Nach Abzug des kombinatorischen Untergrundes werden die effizienzkorrigierten und normierten invarianten Massen-, Transversalimpuls- und Rapiditätsverteilungen der Dielektronen untersucht. Die Ergebnisse werden mit hadronischen Cocktails verschiedener theoretischer Ansätze verglichen. Diese beinhalten die Beiträge kurz- und langlebiger Dileptonenquellen einer thermischen Quelle (PLUTO) sowie mikroskopische Transportrechnungen (HSD,IQMD). Im Massenbereich 0,2 - 0,6 GeV/c² wird der gemessene Überschuss relativ zu den Vorhersagen bestätigt. Zusammen mit den Ergebnissen der Messung 12C + 12C bei 2 GeV/u zeigt sich, dass der Überschuss mit abnehmender Strahlenergie relativ zunimmt. Eine detaillierte Analyse zeigt, dass der Überschuss in dem Massenintervall 0,15 - 0,5 GeV/c² als Funktion der Projektilenergie entsprechend der Zahl der produzierten neutralen Pionen und nicht wie die Zahl des Eta-Mesons skaliert. Der direkte Vergleich der HADES mit den DLS Ergebnissen zeigt, dass die Daten der vorliegenden Arbeit mit den für lange Zeit angezweifelten DLS Resultaten übereinstimmen. Die Frage nach dem physikalischen Ursprung des Überschusses rückt somit erneut in den Vordergrund. In diesem Zusammenhang ist das Studium der Dileptonenproduktion in elementaren Reaktionen p + p und d + p wichtig. Neuere Rechnungen mit einem One Boson Exchange (OBE) Modell deuten darauf hin, dass die Beiträge von p-p und hauptsächlich p-n zur Bremsstrahlung signifikant höher sind als bisher vermutet. Eine aktualisierte Transportrechnung (HSD), deren Parametrisierung der Bremsstrahlung durch dieses OBE Resultat inspiriert ist, scheint in der Lage zu sein, die Ergebnisse der Messungen 12C + 12C bei 1 GeV/u der HADES und DLS Kollaboration recht gut zu beschreiben. Die entsprechenden Vergleiche sind dargestellt und werden diskutiert. Aber auch die Transportrechnung IQMD erklärt die HADES Daten recht gut. Daher ist es offensichtlich, dass eine direkte Gegenüberstellung der OBE Modellrechnungen und der von der HADES Kollaboration gemessenen und derzeit analysierten Daten zur Dileptonenproduktion in p + p und d + p Reaktionen erforderlich ist. Nur so können sichere Schlüsse über den Ursprung der Dileptonen bei SIS Energien gezogen werden.
In vergangenen Studien wurde gezeigt, dass die körperliche Leistungsfähigkeit stark von der diastolischen Funktion beeinflusst wird. Es wurde postuliert, dass eine sich unter Belastung verschlechternde diastolische Füllung zu einer Beeinträchtigung des Schlagvolumens führt und auf diese Weise die körperliche Belastbarkeit einschränkt. Der Sauerstoffpuls als Indikator des Schlagvolumens bietet eine einfache Möglichkeit das Verhalten des Schlagvolumens unter Belastung zu untersuchen. Es sollte festgestellt werden, von welchen Faktoren die Kinetik des Sauerstoffpulses unter Belastung bei Patienten mit arterieller Hypertonie und diastolischer Dysfunktion bestimmt wird. Eine Spiroergometrie wurde bei 102 Patienten zwischen 25 und 75 Jahren sowie bei 15 jungen gesunden Probanden durchgeführt. Um gleiche Testzeiten bei unterschiedlichem Trainingszustand zu ermöglichen, wurden unterschiedliche Rampenprotokolle ausgewählt. Die Berechnung der Steigung des Sauerstoffpulses erfolgte korrigiert um die individuelle Leistung und das fettfreie Körpergewicht für die ersten und letzten zwei Minuten der Belastung (O2P*Start, O2P*Ende). Zusätzlich wurden bei jedem Teilnehmer eine Echokardiographie sowie Blut- und Urinuntersuchungen durchgeführt. Echokardiographisch zeigten die Patienten gegenüber den Probanden Zeichen der linksventrikulären Hypertrophie sowie der diastolischen Dysfunktion. Die Gruppen unterschieden sich nicht hinsichtlich des Erreichens der alters- und geschlechtsabhängigen Sollwerte für die maximale Sauerstoffaufnahme und den maximalen Sauerstoffpuls. Die Probanden erreichten signifikant höhere Laktatkonzentrationen und einen höheren respiratorischen Quotienten. O2P*Ende unterschied sich nicht. Entsprechend O2P*Ende wurden die Patienten in Tertile eingeteilt. Die auf diese Weise entstandenen Gruppen unterschieden sich bezüglich der Basisparameter nur hinsichtlich des HbA1c und der Ruheherzfrequenz. In der Spiroergometrie erreichte das Tertil mit dem geringsten O2P*Ende einen höheren respiratorischen Quotienten, eine höhere maximale Laktatkonzentration und einen größeren Anstieg der Herzfrequenz. In allen Tertilen wurden gleiche Werte für die maximale Sauerstoffaufnahme, die Testdauer und die erreichte Leistung erzielt. Die multivariate Analyse ergab RQmax und HFincr als einzige unabhängige Prädiktoren für ein niedriges O2P*Ende. Es bestand eine starke inverse Korrelation zwischen HFincr und dem HbA1c sowie der Einnahme von Betablockern und dem chronologischen Alter. O2P*Ende unterschied sich nicht zwischen Patienten und Probanden und erreichte in beiden Gruppen ein Plateau. Damit ist die Plateaubildung des Schlagvolumens bei Belastung ein physiologischer Prozess, der unabhängig von Alter und Trainingszustand ist. Bei Patienten mit arterieller Hypertonie wird die Steigung des Sauerstoffpulses bei maximaler Belastung vom Anstieg der Herzfrequenz und des RQ bestimmt und ist nicht zur Beurteilung der Eigenschaften der Diastole geeignet. Physiologischerweise erreicht der Sauerstoffpuls bei maximaler Belastung ein Plateau, das Schlagvolumen wird nicht weiter gesteigert. Eine chronotrope Inkompetenz infolge Alter, Betablockereinnahme oder autonomer Dysfunktion führt zu einem Ausbleiben der physiologischen Plateaubildung und mutmaßlich zu einer Belastungsintoleranz mit Abbruch noch vor Erreichen einer metabolischen Ausbelastung. In Anbetracht der außerordentlichen prognostischen Bedeutung einer chronotropen Inkompetenz ist es denkbar, dass eine anhaltende Steigerung des Sauerstoffpulses bei maximaler Belastung selbst auf ein erhöhtes kardiovaskuläres Risiko hinweist. Die enge Korrelation des Anstiegs der Herzfrequenz mit dem HbA1c obwohl dieser im Mittel nicht pathologisch erhöht war, lässt darauf schließen, dass bereits leichte Störungen der Glukosetoleranz zu Schädigungen des autonomen Nervensystems des Herzens führen.
Mannheimia haemolytica und Pasteurella multocida gehören zu den Verursachern der unter Rindern weltweit verbreiteten Enzootischen Bronchopneumonie. Derzeitige Impfstoffe und Antibiotika gegen diese Bakterien können die Verbreitung der Krankheit nicht maßgeblich einschränken, weshalb Bedarf an neuen Medikamenten besteht. Bei der Besiedelung der Lunge treffen M. haemolytica und P. multocida auf Eisenmangel. Die Aufnahme von Eisen ist ein wesentlicher Faktor bei der Kolonisierung und Persistenz pathogener Bakterien im Wirt, da Eisen essentiell ist. Medikamente, die an Proteinen der Eisenversorgung angreifen, können deshalb zur Eindämmung der Bronchopneumonie beitragen. Um einen Überblick über die Gene von M. haemolytica und P. multocida zu erhalten, die bei der Adaptation an Eisenmangel beteiligt sind, wurden die Bakterien in der vorliegenden Arbeit in vitro unter Eisenmangel kultiviert, denn die meisten bakteriellen Gene, die an der Eisenaufnahme beteiligt sind, werden erst bei Eisenmangel transkribiert. Mittels Mikroarray-Analyse der Transkriptome wurden erstmals die in vitro eisenregulierten Gene von M. haemolytica und erstmals auch die eisenregulierten Gene eines Rinder-Isolats von P. multocida identifiziert. Der in dieser Arbeit verwendete Mikroarray war ein Multigenom-Mikroarray und stellt die offenen Leserahmen beider Bakterien dar. Mit der Mikroarray-Analyse wurden 129 Gene von M. haemolytica identifiziert, die bei Wachstum unter Eisenmangel eine veränderte Transkription aufwiesen. Die größte Gruppe der Gene mit verstärkter Transkription bildeten die Gene, die für Rezeptoren und Transporter kodieren. Von diesen kodieren etwa drei Viertel für Proteine, die an der Aufnahme von Eisen aus verschiedenen Quellen beteiligt sind. Die größte Gruppe der Gene mit verminderter Transkription wurde von Genen gebildet, die für Proteine des Energie-Stoffwechsels kodieren. Damit wurde auch für M. haemolytica das Prinzip bestätigt, dass Bakterien bei Eisenmangel verstärkt Gene transkribieren, deren Proteine an der Eisenaufnahme beteiligt sind, während Gene für eisenhaltige Proteine des Energie-Stoffwechsels vermindert transkribiert werden. Bei der Analyse des Transkriptoms von P. multocida wurden 173 Gene mit veränderter Transkription identifiziert. Auch bei P. multocida konnte mit der funktionellen Klassifizierung der kodierten Proteine die größte Gruppe an Genen mit verstärkter Transkription den Transport- und Bindungsproteinen zugeordnet werden. Die größte Gruppe an Genen mit verminderter Transkription wurde auch bei P. multocida von Genen gebildet, die für Proteine des Energie-Stoffwechsels kodieren. Beim Vergleich des Transkriptoms von M. haemolytica mit dem von P. multocida wurden mehr Unterschiede als Gemeinsamkeiten festgestellt. Nur 40 der 1424 homologen Gene zeigten die gleiche Richtung in der Änderung in der Transkription. Unter den 15 homologen Genen mit verstärkter Transkription waren die Gene, die für einen Hämoglobin-Rezeptor, die ABC-Transportsysteme FbpABC und YfeABCD sowie das Energie liefernde System TonB-ExbBD kodieren. In den 25 homologen Genen mit verminderter Transkription waren 15 Gene enthalten, deren kodierte Proteine am Energie-Stoffwechsel beteiligt sind. Dies waren die Proteine NapABCDFGH des Nitrat-Reduktase-Komplexes, die Proteine NrfABCD des Nitrit-Reduktase-Komplexes und die Proteine FrdABCD des Komplexes der Fumarat-Reduktase. Ein auffälliger Unterscheid war, dass bei M. haemolytica die gesamten Gene verstärkt transkribiert wurden, deren Proteine an der Aufnahme von Eisen aus Transferrin beteiligt sind. Bei P. multocida dagegen konnte das Gen für den Transferrin-Rezeptor nicht nachgewiesen werden. Somit gehört das in dieser Arbeit verwendete Isolat von P. multocida vermutlich zu den 30% der Rinder-Isolate von P. multocida, die keinen Transferrin-Rezeptor besitzen, aber die Rinderlunge besiedeln können (Ewers et al., 2006). Im Vergleich zu M. haemolytica fielen bei P. multocida die vielen verstärkt transkribierten Gene auf, die an der Aufnahme von Eisen aus dem Blut beteiligt sind. Die Transkription dieser verschiedenen Transporter deutet auf eine gute Adaptation von P. multocida für die Verwendung von Eisen aus dem Blut des Wirts hin, die bei M. haemolytica in diesem Maß nicht gegeben scheint. Für M. haemolytica wurde die in vivo-Relevanz einiger eisenregulierter Gene überprüft, die in der Mikroarray-Analyse eine erhöhte Transkription zeigten. Dazu wurde die RNA untersucht, die aus dem Lungengewebe von infizierten Rindern isoliert worden war. In diesem Gewebe wurde die Transkription von 11 Genen mittels RT-PCR nachgewiesen. Für die Gene, die für die Hämoglobin-Rezeptoren von M. haemolytica kodieren, wurde mittels quantitativer real time PCR auch eine Verstärkung der Transkription im Lungengewebe nachgewiesen. Die Verstärkung der Transkription in vivo war der transkriptionellen Verstärkung in vitro vergleichbar, was auf eine Funktion der Hämoglobin-Rezeptoren bei der Infektion in vivo hindeutet. Zur Untersuchung der Regulation des Eisenhaushalts von M. haemolytica wurde versucht, das Gen fur zu deletieren, das für den Hauptregulator des Eisenhaushalts kodiert, was jedoch nicht gelungen ist. In einem antisense-Ansatz konnte jedoch gezeigt werden, dass der Stamm mit dem fur-antisense-Plasmid ein signifikant verzögertes Wachstum hatte, was auf die essentielle Funktion des Gens fur in M. haemolytica hinweist. Ein antisense-Ansatz ist noch kein Beweis für die essentielle Funktion eines Gens. Doch die mit Gioia et al. (2007) übereinstimmenden Schwierigkeiten bei der Herstellung einer ∆-fur-Mutante von M. haemolytica sowie das verringerte Wachstum in Gegenwart der fur-antisense-mRNA deuten stark auf eine essentielle Funktion dieses Gens hin.
Es werden ontologische Antinomien, semantische Antinomien und die Sätze von Tarski, Gödel, Rosser und Church miteinander verglichen. Der Vergleich verläuft in zwei Schritten: Abstrakte Formulierungen der Sätze von Tarski, Gödel, Rosser und Church ermöglichen eine direkte Gegenüberstellung mit der Lügner-Antinomie und der Antinomie von Grelling. Der Beweis des Unvollständigkeitssatzes wird dabei mit und ohne Verwendung des Fixpunktsatzes betrachtet und die Rolle des Fixpunktsatzes analysiert. Parallel zur Antinomie von Richard werden abstrakte Sätze für Terme anstelle von Formeln gebildet. Hieraus erhält man wiederum einen Unvollständigkeitssatz. Im zweiten Schritt werden ontologische und semantische Antinomien gegenübergestellt. Es wird der Begriff einer Diagonalstruktur entwickelt, auf den beide Antinomietypen bezogen werden. Im Fall von ontologischen Antinomien werden die Antinomien von Cantor, Russell und Burali-Forti behandelt.
Pulsed electron-electron double resonance (PELDOR) is a well established method concerning nanometer distance measurements involving two nitroxide spin-labels. In this thesis the applicability of this method to count the number of spins is tested. Furthermore, this work explored the limits, up to which PELDOR data obtained on copper(II)-nitroxide complexes can be quantitatively interpreted. Spin counting provides access to oligomerization studies – monitoring the assembly of homo- or hetero-oligomers from singly labeled compounds. The experimental calibration was performed using model systems, which contain one to four nitroxide radicals. The results show that monomers, dimers, trimers, and tetramers can be distinguished within an error of 5% in the number of spins. Moreover, a detailed analysis of the distance distributions in model complexes revealed that more than one distance can be extracted from complexes bearing several spins, as for example three different distances were resolved in a model tetramer – the other three possible distances being symmetry related. Furthermore, systems exhibiting mixtures of oligomeric states complicate the analysis of the data, because the average number of spin centers contributes nonlinearly to the signal and different relaxation behavior of the oligomers has to be treated explicitly. Experiments solving these problems are proposed in the thesis. Thus, for the first time spin counting has been experimentally calibrated using fully characterized test systems bearing up to four spins. Moreover, the behavior of mixtures was quantitatively interpreted. In addition, it has been shown that several spin-spin distances within a molecule can be extracted from a single dataset. In the second part of the thesis PELDOR experiments on a spin-labeled copper(II)-porphyrin have been quantitatively analyzed. Metal-nitroxide distance measurements are a valuable tool for the triangulation of paramagnetic metal ions. Therefore, X-band PELDOR experiments at different frequencies have been performed. The data exhibits only weak orientation selection, but a fast damping of the oscillation. The experimental data has been interpreted based upon quantitative simulations. The influence of orientation selection, conformational flexibility, spin-density distribution, exchange interaction J, as well as anisotropy and strains of the g-tensor has been examined. An estimate of the spin-density delocalization has been obtained by density functional theory calculations. The dipolar interaction tensor was calculated from the point-charge model, the extension of the point-dipole approximation to several spin bearing centers. Even assuming asymmetric spin distributions induced by an ensemble of asymmetrically distorted porphyrins the effect of delocalization on the PELDOR time trace is weak. The observed damping of dipolar oscillations has been only reproduced by simulations, if a small distribution in J was assumed. It has been shown that the experimental damping of dipolar modulations is not solely due to conformational heterogeneity. In conclusion the quantitative interpretation of PELDOR data is extended to copper-nitroxide- and multi-spin-systems. The influence of the mean distance, of the number of coupled spins, of the conformational flexibility, of spin-density distribution and of the electronic structure of the spin centers has been analyzed using model systems. The insights on model compounds mimicking spin-labeled biomacromolecules – in oligomeric or metal bound states – calibrate the method with respect to the information that can be deduced from the experimental data. The resulting in-depth understanding allows correlating experimental results (from for example biological systems) with models of structure and dynamics. It also opens new fields for PELDOR as for example triangulation of metal centers and oligomerization studies. In general, this thesis has demonstrated that modern pulsed electron paramagnetic resonance techniques in combination with quantitative data analysis can contribute to a detailed insight into molecular structure and dynamics.
Extracts of Boswellia serrata, also known as Indian frankincense, have been used to treat inflammatory diseases in the Indian ayurvedic medicine or Chinese traditional medicine (TCM) for over 3000 years, but the molecular mechanisms of the anti-inflammatory effects are still not well understood. It is obvious that the boswellic acids, the major compounds in the extracts, are responsible for the efficacy. This work employed a protein fishing technique to identify putative targets of boswellic acids at different stages within the inflammatory cascade. For fishing experiments, boswellic acids were immobilized to sepharose and incubated with cell lysates. After washing and boiling, fished proteins were separated by SDS-PAGE and analysed by MALDI-TOF-MS. CatG, DNA-PK and the protein kinase Akt were identified by protein pulldowns with immobilised BAs and characterised as selective and important targets for BAs with an IC50 in the range of physiologically achievable plasma levels up to 5 microM. In addition, the influence on several signal transductions by BAs was tested. Calcium influx, arachidonic acid release, platelet aggregation and TNFalpha-release were assayed to reveal further pharmacological effects of BAs. Celecoxib is a well-known selective COX-2 inhibitor that is in clinical use. In this work, it is demonstrated that celecoxib is also a highly potent direct 5-LO inhibitor. Celecoxib is used in arthritis and its gastro-intestinal side effects are reduced compared to non-selective NSAIDs. In patients with a familiar disposition to polyp forming, celecoxib reduced polyps and the incidence of colon cancer. Because of lowered leukotriene levels in patients under celecoxib therapy it was plausible to test whether celecoxib interferes with 5-LO. Here it is shown that the activity of 5-LO is inhibited in PMNL and cell-free assays with IC50 of 8 microM in intact cells, 20 microM with supplemented arachidonic acid and 30 microM in cell-free systems. Thus, celecoxib is a dual inhibitor of COX-2 and 5-LO. Since 2006, celecoxib has been approved as an orphan drug for the treatment of familial adenomatous polyposis. Aside from this indication, it could be useful for treatment of asthma and other diseases where 5-LO is implicated.
A graph theoretical approach to the analysis, comparison, and enumeration of crystal structures
(2008)
As an alternative approach to lattices and space groups, this work explores graph theory as a means to model crystal structures. The approach uses quotient graphs and nets - the graph theoretical equivalent of cells and lattices - to represent crystal structures. After a short review of related work, new classes of cycles in nets are introduced and their ability to distinguish between non-isomorphic nets and their computational complexity are evaluated. Then, two methods to estimate a structure’s density from the corresponding net are proposed. The first uses coordination sequences to estimate the number of nodes in a sphere, whereas the second method determines the maximal volume of a unit cell. Based on the quotient graph only, methods are proposed to determine whether nets consist of islands, chains, planes, or penetrating, disconnected sub-nets. An algorithm for the enumeration of crystal structures is revised and extended to a search for structures possessing certain properties. Particular attention is given to the exclusion of redundant nets and those, which, by the nature of their connectivity, cannot correspond to a crystal structure. Nets with four four-coordinated nodes, corresponding to sp3 hybridised carbon polymorphs with four atoms per unit cell, are completely enumerated in order to demonstrate the approach. In order to render quotient graphs and nets independent from crystal structures, they are reintroduced in a purely graph-theoretical way. Based on this, the issue of iso- and automorphism of nets is reexamined. It is shown that the topology of a net (that is the bonds in a crystal) constrains severely the symmetry of the embedding (that is the crystal), and in the case of connected nets the space group except for the setting. Several examples are studied and conclusions on phases are drawn (pseudo-cubic FeS2 versus pyrite; α- versus β- quartz; marcasite- versus rutile-like phases). As the automorphisms of certain quotient graphs stipulate a translational symmetry higher than an arbitrary embedding of the corresponding net would show, they are examined in more detail and a method to reduce the size of such quotient graphs is proposed. Besides two instructional examples with 2-dimensional graphs, the halite, calcite, magnesite, barytocalcite, and a strontium feldspar structures are discussed. For some of the structures it is shown that the quotient graph which is equivalent to a centred cell is reduced to a quotient graph equivalent to the primitive cell. For the partially disordered strontium feldspar, it is shown that even if it could be annealed to an ordered structure, the unit cell would likely remain unchanged. For the calcite and barytocalcite structures it is shown that the equivalent nets are not isomorphic.
Eine große Anzahl pharmakologischer und klinischer Studien zeigt die Wirksamkeit des standardisierten Ginkgo biloba Extraktes EGb 761 bei vaskulären und kognitiven Stö-rungen, wie der Alzheimer-Krankheit, der vaskulären Demenz und der peripheren arte-riellen Verschlusskrankheit. Experimentelle Ergebnisse weisen darauf hin, dass Terpen-laktone und Flavonolglykoside für die meisten pharmakologischen Wirkungen von EGb 761 verantwortlich sind. Allerdings gibt es wenige Studien, die die orale Biover-fügbarkeit von Terpenlaktonen und besonders von Flavonolglykosiden aus Ginkgo bilo-ba im Blut oder Zentralnervensystem untersuchten. Deshalb wurde in dieser Arbeit die Fähigkeit der Flavonoidglykosiden bzw. deren Metaboliten die Blut-Hirn-Schranke zu überwinden im Tierversuch an männlichen Sprague-Dawley-Ratten erforscht. Unter-sucht wurden dabei orale Einfach- und Mehrfachgaben von EGb 761 über einen Zeit-raum von 8 Tagen in den Dosierungen 100 bzw. 600 mg Extrakt pro kg Körpergewicht. Zusätzlich wurde die Verteilung der Ginkgoflavonolmetabolite in den unterschiedlichen Bereichen des Gehirns untersucht (Hippocampus, frontaler Cortex, Striatum und Klein-hirn). Zu diesem Zweck wurde eine HPLC-Fluoreszenzmethode für die Ermittlung der Plasma- und Gehirnkonzentrationen der Flavonoidmetaboliten (Derivate von Quercetin, Kämpferol und Isorhamnetin) entwickelt und validiert. In beiden Studien (Einfach- und Mehrfachgabe) wurden Flavonoidmetaboliten im Plasma und im Gehirn nachgewiesen. Dabei wurden Metaboliten in allen untersuchten Gehirnbereichen gefunden. Bei der Dosierung von 100 mg/kg war Kämpferol vorzugsweise im frontalen Cortex lokalisiert, während die anderen Flavonole in allen Regionen vergleichbare Konzentrationen auf-wiesen. Bei der höheren Dosierung von 600 mg/kg waren die Konzentrationen der Fla-vonolmetaboliten in allen Gehirnbereichen vergleichbar. Obgleich die vier untersuchten Gehirnbereiche nur 38% des gesamten Gehirns darstellten, wurden die meisten Gink-goflavonole in diesen Regionen gefunden. Im übrigen Gehirngewebe wurden nur be-grenzte Mengen von Flavonolen nachgewiesen. Zusammenfassend kann festgehalten werden, dass es erstmalig gelungen ist, im Tier-versuch die Bioverfügbarkeit einer der therapeutisch aktiven Substanzklassen von Ginkgo biloba - die Flavonoide - sowohl im Plasma als auch im ZNS nachzuweisen.
In this work data of the NA49 experiment at CERN SPS on the energy dependence of multiplicity fluctuations in central Pb+Pb collisions at 20A, 30A, 40A, 80A and 158A GeV, as well as the system size dependence at 158A GeV, is analysed for positively, negatively and all charged hadrons. Furthermore the rapidity and transverse momentum dependence of multiplicity fluctuations are studied. The experimental results are compared to predictions of statistical hadron-gas and string-hadronic models. It is expected that multiplicity fluctuations are sensitive to the phase transition to quark-gluon-plasma (QGP) and to the critical point of strongly interacting matter. It is predicted that both the onset of deconfinement, the lowest energy where QGP is created, and the critical point are located in the SPS energy range. Furthermore, the predictions for the multiplicity fluctuations of statistical and string-hadronic models are different, the experimental data might allow to distinguish between them. The used measure of multiplicity fluctuations is the scaled variance omega, defined as the ratio of the variance and the mean of the multiplicity distribution. In the NA49 experiment the tracks of charged particles are detected in four large volume time projection chambers (TPCs). In order to remove possible detector effects a detailed study of event and track selection criteria is performed. Naively one would expect Poisson fluctuations in central heavy ion collisions. A suppression of fluctuations compared to a Poisson distribution is observed for positively and negatively charged hadrons at forward rapidity in Pb+Pb collisions. At midrapidity and for all charged hadrons the fluctuations are larger than the Poisson ones. The fluctuations seem to increase with decreasing system size. It is suggested that this is due to increased relative fluctuations in the number of participants. Furthermore, it was discovered that omega increases for decreasing rapidity and transverse momentum. A hadron-gas model predicts different values of omega for different statistical ensembles. In the grand-canonical ensemble, where all conservation laws are fulfilled only on the average, not on an event-by-event basis, the predicted fluctuations are the largest ones. In the canonical ensemble the charges, namely the electrical charge, the baryon number and the strangeness, are conserved for each event. The scaled variance in this ensemble is smaller than for the grand-canonical ensemble. In the micro-canonical ensemble not only the charges, but also the energy and the momentum are conserved in each event, the predicted $omega$ is the smallest one. The grand-canonical and canonical formulations of the hadron-gas model over-predict fluctuations in the forward acceptance. In contrast to the experimental data no dependence of omega on rapidity and transverse momentum is expected. For the micro-canonical formulation, which predicts small fluctuations in the total phase space, no quantitative calculation is available yet for the limited experimental acceptance. The increase of fluctuations for low rapidities and transverse momenta can be qualitatively understood in a micro-canonical ensemble as an effect of energy and momentum conservation. The string-hadronic model UrQMD significantly over-predicts the mean multiplicities but approximately reproduces the scaled variance of the multiplicity distributions at all measured collision energies, systems and phase-space intervals. String-hadronic models predict for Pb+Pb collisions a monotonous increase of omega with collision energy, similar to the observations for p+p interactions. This is in contrast to the predictions of the hadron-gas model, where omega shows no energy dependence at higher energies. At SPS energies the predictions of the string-hadronic and hadron-gas models are in the same order of magnitude, but at RHIC and LHC energies the difference in omega in the full phase space is much larger. Experimental data should be able to distinguish between them rather easily. Narrower than Poissonian (omega < 1) multiplicity fluctuations measured in the forward kinematic region (1<y(pi)<y_{beam}) can be related to the reduced fluctuations predicted for relativistic gases with imposed conservation laws. This general feature of relativistic gases may be preserved also for some non-equilibrium systems as modeled by the string-hadronic approaches. A quantitative estimate shows that the predicted maximum in fluctuations due to a first order phase transition from hadron-gas to QGP is smaller than the experimental errors of the present experiment and can therefore neither be confirmed nor disproved. No sign of increased fluctuations as expected for a freeze-out near the critical point of strongly interacting matter is observed.
In the first part of this study, we have identified the two steroid hormones progesterone and norgestimate as novel TRPC channel blockers. Both substances blocked TRPC-mediated Ca2+ influx with micromolar activities in fluorometric measurements. TRPC channel inhibition did not seem to be a general steroid effect since another progestin, the norgestimate metabolite levonorgestrel, was not effective. Norgestimate was 4- to 5-fold more active on the TRPC3/6/7 subfamily compared to TRPC4/5, whereas progesterone was similarly potent. This selectivity of norgestimate was confirmed by patch clamp recordings. As norgestimate blocked channels directly gated by DAG with a fast kinetic, we assume the compound acts on the channel protein itself. This view was further substantiated by the lack of effects on IP3R-mediated Ca2+ release from the endoplasmic reticulum, which is activated in parallel with TRPCs by Gq/11-coupled receptor stimulation. Norgestimate did not only block ectopically expressed TRPC channels but also native, TRPC-mediated currents in rat aortic smooth muscle cells with similar activity. The usefulness of norgestimate as a tool compound for the investigation of physiological TRPC functions was tested in isolated vessel rings. Consistent with TRPC6 being an essential component of the alpha-1-adrenoceptor-activated cation channel, we demonstrated a direct vasorelaxant, endothelium-independent effect of norgestimate on rat aortic rings precontracted with phenylephrine. Thus, our results provide further experimental support for a role of TRPC6 in alpha-1-adrenergic vessel constriction. In the second part of this study, we screened a human aorta cDNA-library for novel TRPC4-interacting proteins with a modified yeast two-hybrid (Y2H) system in which the TRPC4-C-terminus was expressed as tetrameric bait protein, thereby mimicking the native channel conformation. Of the eleven interacting proteins found SESTD1 was chosen for further analyses since it contains a phospholipid-binding Sec14p-like domain and thus could be involved in regulation of TRPC channels by phospholipids. After the biochemical validation of the found interaction, the first spectrin domain of SESTD1 was then identified to interact with the CIRB domain of TRPC4 in directed Y2H tests. SESTD1 also co-immunoprecipitated with the closely related TRPC5 protein in which the SESTD1-binding domain is highly conserved. Independent of the CIRB site, co-immunoprecipitation with TRPC6 and the distantly related TRPM8 channel was observed indicating the existence of other sites in these channel proteins that mediate interaction with SESTD1. Analysis of SESTD1 gene expression in human tissues showed that its transcripts are ubiquitously expressed and tissues with significant coexpression with TRPC4 and -5 were identified. We have generated two polyclonal antisera directed against SESTD1 that consistently detected SESTD1 protein in brain, aorta, heart, and in smooth muscle and endothelial cells. The functional consequences of the found interaction were investigated by examination of the TRPC5-mediated Ca2+ influx in a clonal HM1 cell line stably expressing the channel. Since SESTD1 overexpression had no detectable effects on TRPC5-mediated Ca2+ influx, most likely due to expression of endogenous SESTD1, we knocked-down the native protein with specific siRNA. This procedure reduced TRPC5-mediated Ca2+ influx following receptor stimulation by 50%. Parallel biotinylation experiments did not reveal any differences in cell surface expressed TRPC5-protein, suggesting that reduction of TRPC5 activity resulted from a loss of a direct SESTD1 effect on the channel. In addition, in immunofluorescence experiments we observed that reduced SESTD1 protein levels resulted in a redistribution of the multifunctional protein ß-catenin from the plasma membrane to the cytosol. This result may point to an involvement of SESTD1 in formation and maintenance of adherens junctions. SESTD1 contains a phospholipid-binding Sec14p-like domain and we were the first to demonstrate its Ca2+-dependent binding to phosphatidic acid and all physiological phosphatidylinositol mono- and bisphosphates in vitro. The physiological function of this binding activity is not known at present, but it could play a role in regulation of associated TRPC channels. TRPC4 and -5 channels are activated by phospholipid hydrolysis and also bind phospholipids directly. The identification of SESTD1 as novel TRPC-interacting protein could thus be an important step forward in the investigation and better comprehension of the complex molecular mechanisms of TRP channel regulation by lipids.
Weiterentwicklung und Evaluation eines drei-dimensionalen Hautmodelles zur pharmakologischen Testung
(2008)
Die vorliegende Arbeit beschäftigt sich mit Gruppen von quasi-Automorphismen von Graphen, genauer gesagt, von gefärbten Graphen. Ein gefärbter Graph ist ein Graph, dessen Kantenmenge in eine disjunkte Vereinigung von Mengen von Kanten einer bestimmten Farbe zerlegt ist. Ein Automorphismus eines solchen Graphen muss insbesondere die Farben der Kanten respektieren. Ein quasi-Automorphismus eines solchen Graphen ist eine Bijektion der Eckenmenge auf sich selbst, die nur endlich oft die Autmomorphismeneigenschaft verletzt, d.h. nur endlich viele Kanten nicht respektiert und nur endlich viele Kanten neu entstehen läßt. Die Menge der quasi-Automorphismen eines Graphen bildet eine Untergruppe in der Gruppe der Permutationen der Eckenmenge. Eine Auswahl interessanter Beispiele solcher Gruppen und manche ihrer Eigenschaften sind neben einigen grundsätzlichen Überlegungen Thema dieser Arbeit. Die erste Klasse von Graphen, die wir untersuchen, sind Cayley-Graphen (endlich erzeugter) Gruppen. Dabei werden wir zeigen, dass die quasi-Automorphismengruppe eines Cayley-Graphen nicht von dem (endlichen) Erzeugendensystem abhängt. Wir werden zeigen, dass für eine einendige Gruppe $G$ die quasi-Automorphismengruppe des Cayley-Graphen stets als semidirektes Produkt der finitären Permutationen von $G$ und der Gruppe $G$ selbst zerfällt. In der Klasse der mehrendigen Gruppen gibt es genau $2$ Gruppen für die das ebenfalls gilt, nämlich die Gruppe der ganzen Zahlen ...Z und die unendliche Diedergruppe $D_infty$. In allen anderen Gruppen ist das oben erwähnte semidirekte Produkt stets eine echte Untergruppe. Trotzdem werden wir im Ausblick eine Konstruktion angeben, die für eine gegebene Gruppe $G$ einen Graphen $Gamma$ liefert, dessen quasi-Automorphismengruppe als semidirektes Produkt von $S_Gamma$ -- so bezeichnen wir die Gruppe der finitären Permutationen der Ecken von $Gamma$ -- und $G$ zerfällt. Des Weiteren werden wir die quasi-Automorphismengruppe des ebenen binären Wurzelbaumes betrachten. Wir werden zeigen, dass diese eine Erweiterung von (Richard) Thompsons Gruppe VV durch die Gruppe der finitären Permutationen ist, eine Präsentierung entwickeln und die Endlichkeitseigenschaften dieser Gruppe und einiger Untergruppen beleuchten. Insbesondere werden wir einen Zellkomplex konstruieren, auf dem die Gruppe der quasi-ordnungserhaltenden quasi-Automorphismen, welche das Urbild der Untergruppe FF von VV unter der kanonischen Projektion ist, mit endlichen Stabilisatoren operiert. Diese Operation erfüllt dabei die Bedingungen, die nötig sind, um mit Hilfe von Browns Kriterium nachzuweisen, dass die Gruppe vom Typ FPunendlich ist. Das co-Wort-Problem einer Gruppe $G$ bezüglich eines unter Inversion abgeschlossenen Erzeugendensystems $X$ ist die Sprache aller Worte aus dem freien Monoid $X^*$, die unter der kanonischen Projektion auf ein Element ungleich der Identität in $G$ abgebildet werden. Wir werden zeigen, dass das co-Wort-Problem der quasi-Automorphismengruppe des ebenen binären Wurzelbaumes eine kontext-freie Sprache bildet. Sei $mathop{coCF}$ die Klasse der Gruppen mit kontextfreiem co-Wort-Problem. Diese Klasse ist abgeschlossen bezüglich Untergruppenbildung und alle Gruppen, deren Zugehörigkeit zu $mathop{coCF}$ bisher nachgewiesen wurde, sind Unterguppen der quasi-Automorphismengruppe des ebenen binären Wurzelbaumes. Die $n$-strahligen Houghton-Gruppen erweisen sich als quasi-Automorphismengruppen von Sterngraphen, d.h. von Graphen, die disjunkte Vereinigungen von $n$ Strahlen verschiedener Farben sind. Wir werden uns mit geometrischen Phänomenen der Cayley-Graphen dieser Gruppen beschäftigen. Insbesondere werden wir nachweisen, dass die $2$-strahlige Houghton-Gruppe Houn[2] beliebig tiefe Sackgassen besitzt. Eine Sackgasse der Tiefe $k$ in einem Cayley-Graphen ist ein Element, dessen Abstand zur Identität mindestens so groß ist, wie der Abstand zur Identität aller Elemente im $k$-Ball um das Element. Sogar in einem stärkeren Sinne, der in dieser Arbeit definiert wird, ist die Tiefe der Sackgassen unbeschränkt. Um dies und verwandte Fragen besser behandlen zu können, entwickeln wir Modelle, die eine Beschreibung der Cayley-Graphen von Houn[n] ermöglichen. Im abschließenden Ausblick thematisieren wir einige Ansätze, in denen wir interessante Anwendungen von quasi-Automorphismengruppen sehen.
Der Typ I Interferonrezeptor, der aus den Transmembranproteinen ifnar1 und ifnar2 besteht, nimmt eine wichtige Rolle bei der angeborenen und erworbenen Immunantwort ein. Durch Bindung von Typ I Interferonen werden antivirale, antiproliferative und immunmodulatorische Aktivitäten in der Zelle induziert. Die Wirkung der Interferone wird bereits bei der Behandlung einer Vielzahl von Krankheiten eingesetzt. Es ist bislang nicht bekannt, wie die verschiedenen Typ I Interferone nach Bindung an einen gemeinsamen Rezeptor, unterschiedliche Zellantworten induzieren. So unterscheiden die Typ I Interferone sich nicht hinsichtlich ihrer Bindungsstelle oder der Stöchiometrie der Bindung an ifnar1 bzw. ifnar2. Sie weisen jedoch unterschiedliche Affinitäten zu den Rezeptoruntereinheiten auf, wobei ihnen eine niedrigere Affinität zu ifnar1 gemeinsam ist. Bislang konnte keine Interaktion zwischen den Rezeptoruntereinheiten nachgewiesen werden. Es wird angenommen, dass bei der Rezeptorassemblierung das Interferon zunächst an ifnar2 bindet und anschließend ifnar1 rekrutiert. Es wird postuliert, dass die unterschiedlichen Zellantworten für verschiedene Typ I Interferone auf Unterschieden in der Stabilität der ternären Komplexe beruhen könnten. Im Rahmen dieser Arbeit wurden daher die Struktur und Dynamik des Interferonrezeptors in vitro für die Typ I Interferone IFNa2 und IFNb charakterisiert. Die Struktur des ternären Komplexes aus den extrazellulären Domänen von ifnar1 und ifnar2 mit IFNa2 wurde mittels Elektronenmikroskopie untersucht. Über Einzelpartikelanalyse aufgereinigter Komplexe von IFN mit den extrazellulären Domänen von ifnar1 (ifnar1-EC) und ifnar2 (ifnar2-EC) konnte ein Strukturmodell des ternären Komplexes erstellt werden. Dieses zeigte eine Verschiebung der membranproximalen Domänen von ifnar1-EC und ifnar2-EC wie sie bereits für den Rezeptor für Erythropoietin und den Wachstumsfaktor beobachtet wurden, welche zu den Typ I Zytokinrezeptoren gehören. Die Struktur des ternären Komplexes ermöglicht als erste Struktur eines Typ II Zytokinrezeptors einen Einblick in die Architektur des Komplexes und mögliche Aktivierungsmechanismen. Die Strukturen der Komplexe für die verschiedenen Typ I Interferone IFNa2 und IFNb wiesen keine fundamentalen Unterschiede auf, was auf einen gemeinsamen Aktivierungsmechanismus hinweist. Temperatur-abhängige Messungen von Bindungskinetik und –affinität ergaben sehr unterschiedliche Energiehyperflächen für die Ligandenbindung an ifnar1- und ifnar2-EC, und wiesen auf einen mehrstufigen Prozess und mögliche Konformationsänderungen bei der Bindung an ifnar1-EC hin. Zur Analyse der Dynamik von ifnar1-EC wurden daher verschiedene fluoreszenzbasierte Assays etabliert. Eine besondere Herausforderung bestand darin, das Protein ortsspezifisch und stöchiometrisch mit zwei verschiedenen Fluorophoren zu koppeln. Ifnar1-EC wurde an verschiedenen Stellen kovalent mit Fluoreszenzfarbstoffen markiert. Es wurde gezeigt, dass nach Bindung eines geeigneten tris-NTA-Fluorophor-Konjugats an den C-terminalen His-Tag die Fluoreszenz abstandsabhägig durch Förster-Resonanz-Energie-Transfer gelöscht wurde. Für ifnar1-EC wurde eine ligandeninduzierte Abstandsänderung detektiert. Die detaillierte Analyse ergab nach Bindung von IFNa2 eine Abstandszunahme von 13 A vom N- zum C-Terminus. Durch die Interferonbindung nimmt demnach ifnar1-EC eine gestrecktere Konformation ein. Ähnliche Ergebnisse wurden auch in Anwesenheit von ifnar2-EC und für IFNb erhalten. Die Einzelmolekülanalysen mittels Fluoreszenz Korrelationsspektroskopie (FCS) zeigten sowohl einen Verlust der Flexibilität von ifnar1-EC nach Ligandenbindung als auch ein ligandeninduziertes Rearangement der Ig-ähnlichen Domänen. Die Änderung der Flexibilität wurde durch Messungen der Fluoreszenzlebensdauer bestätigt. Untersuchungen der Kinetik der Ligand-induzierten Konformationsänderung mittels Stopped-Flow Messungen bestätigten eine mehrstufige Umorientierung der Ig-ähnlichen Domänen nach Ligandenbindung. Zusätzlich konnte gezeigt werden, dass sich nach Ligandenbindung die Zugänglichkeit des Tryptophans in der membranproximalen Domäne von ifnar1-EC ändert. Da die membranproximale Domäne nicht bei der Ligandenbindung beteiligt ist, deutet dieser Effekt auf eine Propagation der Ligand-induzierten Konformationsänderung in diese Domäne hin. Das Tryptophan könnte mit der Membran interagieren, was auf eine wichtige Rolle der membranproximalen Domäne für die korrekte Orientierung von ifnar1 in der Membran hindeut. Die Stopped-Flow Analyse zeigte, dass es sich hierbei um einen einstufigen Prozess handelt, der mit der Interferonbindung korreliert. Die Ergebnisse wiesen insgesamt auf eine Ligand-induzierte Flexibilitätsänderung und Umorientierung der Ig-ähnlichen Domänen bei ifnar1-EC hin. Vermutlich wird nach Ligandenbindung das Signal in die membranproximale Domäne von ifnar1-EC propagiert. Die Strukturen der ternären Komplexe mit den verschiedenen Typ I Interferonen wiesen keine fundamentalen Unterschiede auf. Auch die Ergebnisse der fluoreszenzbasierten Assays zeigten keine Unterschiede für IFNa2 und IFNb, was die Hypothese stützt, dass die differentielle Aktivität der Interferone nicht auf grundsätzlichen Unterschieden in der Architektur des ternären Komplexes beruht, sondern in der unterschiedlichen Dynamik der Komplexe codiert sein könnte.
Ein bakteriendichter Kavitätenverschluss zur Vermeidung von Pulpairritationen und möglicher Sekundärkaries stellt eines der obersten Ziele in der modernen minimalinvasiven Füllungstherapie dar. Ziel dieser Studie war es, den Einfluss unterschiedlicher Sekundärpräparations- und Konditionierungstechniken (konventionell, SÄT, sonoabrasiv mit Rondoflex und oszillierend mit Sonicflex Seal) auf die Randqualität von Fissurenversiegelung und kunststoffgefüllten Klasse V Kavitäten von 60 menschlichen extrahierten Zähnen mittels Farbstoffpenetrationtests zu prüfen. Die statistischen Analysen ergaben, dass in der Untersuchungsreihe der Fissurenversiegelungen die Zähne, die mit Rondoflex konditioniert wurden, die geringsten prozentualen Farbstoffpenetration (1,65 %) gemessen an der zu penetrierenden Gesamtstrecke aufwiesen. Diese Gruppe konnte eine nicht signifikant günstigere Randspaltqualität aufweisen als die Gruppe, in der mit Sonicflex die Fissur aufgezogen wurde. Hier wiesen 2,00 % der Gesamtstrecke eine Farbstoffpenetration auf. Die höchste prozentuale Penetration (4,31 %) wurden bei den konventionellen Versiegelungen ausgewertet. Diese Gruppe weist nicht signifikant die höchste Penetrationsrate aller drei Gruppen auf. Bei den Klasse V Kavitäten erwies sich die Untersuchungsgruppe „mit Anschrägung“ als die mit der signifikant geringsten Penetrationsrate (7,44 %). Die Gruppe, bei der mit Rondoflex konditioniert wurde, wurde eine signifikant geringere Randqualität ausgewertet (19,15 %) als bei der Gruppe „mit Anschrägung“ und eine nicht signifikant geringere Penetrationsrate festgestellt als in der Gruppe „ohne Anschrägung“ (22,65 %).
Die zunehmende Technologisierung aller Lebensbereiche sowie der seit Mitte der 60er Jahre wachsende Touristenstrom lassen uns fast jeden Tag von Katastrophen hören, bei denen eine Vielzahl von Menschen ums Leben kommen. Bei solchen Vorfällen werden viele Menschen oftmals bis zur Unkenntlichkeit verstümmelt. Ziel muss es daher sein, die Leichen so schnell wie möglich zu identifizieren. „Sei es in Ramstein, Bopal, Enschede oder New York am 11.September 2001: Nur ein Zahn kann ausreichen, um einem Toten seinen Namen zurückzugeben2.“ Diese Aussage von Benedix kann als Anstoß für die vorliegende Arbeit gesehen werden. .... Zur Verifizierung der anfangs formulierten Vermutungen wurde im Verlauf der vorliegenden Dissertation schrittweise vorgegangen. Durch die Bearbeitung der russischen Fachliteratur wurde das notwendige Basiswissen für eine genauere Umschreibung der These geschaffen. Die anschließenden Untersuchungen in der JVA, der Zahnarztpraxis mit überwiegend russischem Patientenanteil sowie der Karteikartenauswertung in der Ukraine bestätigten in manchen Hinsichten die These, wiesen aber auch deutliche Grenzen auf. So konnte festgestellt werden, dass die Arbeiten sich häufig sehr voneinander unterschieden. Während in der Universitätsklinik von Kiev zeitgemäßer, zum Teil moderner Standard der Zahnmedizin praktiziert wurde, gab es Dorfkliniken sowie kleineren Zahnarztpraxen in und um Kiev, die in der Entwicklung noch Jahre von diesem Standard entfernt waren. Gleichzeitig konnten jedoch auch Patienten der höheren sozialen Schicht registriert werden, die sich in Behandlung in Privatpraxen befanden, welche sich bereits Ende der 90er Jahre dem hohen westeuropäischen Standard angenähert hatten. Aber nicht nur während der Reise in die Ukraine waren Unterschiede erkennbar. Bei der Auswertung der Untersuchungen aus der JVA wurde eine ähnliche Problematik erkennbar. Während in der JVA selbst häufig provisorische oder eher kostengünstige Lösungen gesucht wurden, gab es Patienten, die sich vorher entweder in ihrem Herkunftsland oder aber bereits in Westeuropa in zahnärztlicher Behandlung befanden und sich somit unterschiedliche Arbeiten im Mund befanden. Das gleiche Bild zeichnete sich in der Zahnarztpraxis in Frankfurt am Main ab. Es gab Patienten, die jahrelang in Behandlung in ihrem Heimatland waren und sich in Westeuropa nur nach Bedarf einzelne Komponente haben erneuern lassen, so dass auch bei diesen Patienten sehr unterschiedliche Arbeiten im Mund registriert wurde. Dieser Faktor würde im DVI-Fall die Arbeit erheblich erschweren. Dennoch kann man bestimmte wiederkehrende und auffallende Merkmale sowohl in der prothetischen als auch in der konservierenden Zahnheilkunde festhalten. Die konservierende Zahnheilkunde lieferte, wie aufgrund der Fachliteratur zu vermuten war, nur einen eindeutigen Hinweis im Identifizierungsfall: eine rosafarbene Verfärbung der Zahnkrone als Hinweis auf mit Paracinzement aufgefüllte Kanäle nach einer Wurzelbehandlung. Die statistische Auswertung in der Ukraine wird durch die Fachliteratur im Hinblick auf die weite Verbreitung einer solchen Versorgungsart in den 80er bis in die 90er Jahre im molaren sowie prämolaren Bereich bestätigt. Aufgrund der hohen und lang anhaltenden antibakteriellen Wirkung von Parazinzement kann ein Zahn nach einer solchen Behandlung noch lange im Mund bleiben. Obwohl diese Zähne häufig spröde geworden sind, die Zähne brechen zum Teil ab und werden oftmals überkront. Dennoch ist bei abstehenden Kronenrändern oder häufig auch unterhalb des Kronenrandes die rosa Verfärbung deutlich erkennbar. Dies kann aufgrund der vorliegenden Untersuchungen aus der JVA und der Zahnarztpraxis bestätigt werden, wo Zähne mit einer solchen Versorgung häufig anzutreffen waren. Auf den dort gefertigten Röntgenbildern wurde deutlich, dass die Versorgungsart sich auf Röntgenbildern deutlich von einer in Westeuropa als Standard angesehen Wurzelbehandlung unterscheidet. Es sind im Gegensatz zu Behandlungen aus dem westeuropäischen Raum keine Guttaperchastifte zu erkennen, sondern ein spinnennetzartiges Gewebemuster, das sich wie ein dünnes Netz durchzieht. Häufig reicht das Wurzelfüllngsmaterial nur bis zum oberen Drittel des Wurzelkanals. Im westeuropäischen Raum ist Parazinzement auf Resorzinformalinbasis nicht erlaubt aufgrund der enthaltenen kanzerogenen Substanzen. Die weiteren zeitlich aufeinanderfolgenden Versorgungsarten der konservierenden Zahnheilkunde wie die Füllungen mit Gamma 2 – Amalgam hatte zwar eine starke Korrosionserscheinung (schwarze Verfärbung) der Zähne zur Folge, dies kann jedoch nicht als eindeutiges Merkmal im realen DVI-Fall gewertet werden. In den 80er Jahren waren Kunststoffe, die nicht auf der Adhäsivbasis eingesetzt worden sind, sowie Zemente weit verbreitet. Diese Versorgungsart führte jedoch zu einem schnellen Verlust der Zähne, im Falle der Kunststoffe häufig hervorgerufen durch eine Entzündung der Pulpa und bei der Versorgung mit Zement aufgrund der negativen mechanischen Eigenschaften, so dass Zähne mit diesen Versorgungsarten in der Regel nicht mehr anzutreffen sind. Erst Mitte Ende der 90er Jahre war mit Kunststoffen auf Adhäsivbasis, zunächst aus Westeuropa stammend, dann in Osteuropa nachproduziert, eine Alternative zu Amalgam als Füllungsmaterial im Front- und Seitenzahnbereich gefunden worden. Kunststoffe dieser Art waren farbbeständig und hatten positive mechanische Eigenschaften. Für den realen Identifikationsfall liefert diese Versorgungsart jedoch keinerlei Hinweise auf die Herkunft einer unbekannten Leiche. Die Untersuchung im Hinblick auf die prothetische Zahnheilkunde ergab zusammenfassend folgende Ergebnisse: • Die gestanzte Krone war im osteuropäischen Raum in den 70er und 80er Jahren weit verbreitet und lässt mit Ihrer Form einen Rückschluss auf die Herkunft einer unbekannten Leiche zu. • Die goldähnliche Beschichtung war bei allen Untersuchungen anzutreffen und weist ebenfalls auf eine Herkunft aus dem osteuropäischen Raum hin. • Die gestanzte Brücke mit gelöteten Zwischengliedern lässt in dieser Form den Schluss einer osteuropäischen Herkunft zu. • Die gestanzte Krone mit Kunststoffverblendung ist ebenfalls nur im osteuropäischen Raum anzutreffen. • Der typische Rotgoldton der gestanzten Goldkrone kann ebenfalls als Merkmal einer osteuropäischen Herkunft gewertet werden. Im Hinblick auf die herausnehmbare prothetische Versorgung wurde im Verlauf der Untersuchungen deutlich, dass weder die MEG- noch die Totalprothese Hinweise auf die Herkunft einer unbekannten Leiche liefern können. Die Teilprothese mit handgebogener Klammer liefert zwar insofern Hinweise, als dass eine solche Art der Versorgung im osteuropäischen Raum als defintive Versorgung galt, während eine solche Versorgung im westeuropäischen Raum nur als Interimsversorgung genutzt wurde. Zusammenfassend muss man zu dem Schluss kommen, dass der festsitzende Zahnersatz eindeutigere Merkmale für den DVI-Fall liefern kann.
In der vorliegenden Arbeit werden die angewendeten Kräfte, die von drei Behandlergruppen (Studenten, Zahnärzte und Spezialisten) während der lateralen Kondensation von Guttapercha aufgebracht werden, in Abhängigkeit vom Qualifikationsgrad des Behandlers und der unterschiedlichen Kanalkonizität untersucht. Die Behandlergruppen bestehen aus jeweils 12 Personen. Jeder Proband füllt in folgender Reihenfolge einen vorgefertigten Kunststoffkanal der Konizität .02, .04, .06 und p30 (ProTaper F3) nach der Methode der lateralen Kondensation unter Verwendung von AH plus Sealer und Guttapercha. Dabei werden von einem Kraftsensor die entstehenden vertikalen Kräfte gemessen, aufgezeichnet und dann mittels geeigneter Software hinsichtlich folgender Ergebnisgrößen ausgewertet: • Absolute Maxima der angewendeten Kraft bei Wurzelkanalfüllung • Durchschnittswerte der angewendeten Kraft • Häufigkeitsverteilung der Kraftmesswerte • Zugkraftwerte (Minima der angewendeten Kraft) • Streuungsmaße (Standardabweichung und Varianz) • Anzahl der auftretenden Kraftspitzen pro Kanalfüllung • zugrunde liegende probandenspezifische Füllmuster • Anzahl der zur Kanalfüllung verwendeten Guttaperchastifte • benötigte Kanalfüllzeit Folgende Ergebnisse sind erarbeitet worden: 1. Die 36 Probanden haben durchschnittliche Maximalwerte von 1,10-2,12 kg eingesetzt: Spezialisten wendeten im Mittel 2,12 kg an, Studenten 1,48 kg und Zahnärzte 1,10 kg. 2. Die Durchschnittswerte der eingesetzten Lasten der 36 Probanden liegen zwischen 0,51-0,92 kg: Spezialisten wendeten im Mittel 0,92 kg an, Studenten 0,65 kg und Zahnärzte 0,51 kg. Auch hier kondensieren die Spezialisten mit höheren Kraftwerten. 3. Statistisch signifikante Unterschiede zwischen den Behandlergruppen bestehen bei: • Maximalkraft: bei allen Konizitäten • Durchschnittskraft: bei den Konizitäten .02 und .04 • Minimalkraft: keine signifikanten Unterschiede • Standardabweichung: bei allen Konizitäten • Kraftspitzen: keine signifikanten Unterschiede 4. Statistisch signifikante Unterschiede zwischen den Kanalkonizitäten bestehen bei: a) Studenten • Maximalkraft: keine signifikanten Unterschiede • Durchschnittskraft: zwischen den Konizitäten .04 und .06 • Minimalkraft: keine signifikanten Unterschiede • Standardabweichung: keine signifikanten Unterschiede b) Zahnärzten • Maximalkraft: keine signifikanten Unterschiede • Durchschnittskraft: zwischen den Konizitäten .06 und p30 • Minimalkraft: keine signifikanten Unterschiede • Standardabweichung: keine signifikanten Unterschiede c) Spezialisten • Maximalkraft: zwischen den Konizitäten .04 und .06 • Durchschnittskraft: bei allen Konizitäten bis auf zwischen .02 und .04 sowie zwischen .06 und p30 • Minimalkraft: keine signifikanten Unterschiede • Standardabweichung: keine signifikanten Unterschiede 5. Es gibt bei den untersuchten Kraftwerten keine signifikanten Unterschiede zwischen weiblichen und männlichen Behandlern. 6. Es wurde ein individuelles Kraftauftragsmuster bei den Behandlern der unterschiedlichen Gruppen festgestellt. 7. Mit ansteigender Konizität werden von allen Behandlergruppen signifikant mehr Guttaperchastifte in den Kanal eingebracht. Zahnärzte tendieren dazu, weniger Guttaperchastifte zu verwenden und die Kanäle schneller zu füllen, als die Probanden der anderen beiden Gruppen.
Mit der Ausweitung von Implantatversorgungen auf den Seitenzahnbereich teilbezahnter Patienten haben sich in der internationalen Zahnheilkunde verschiedene Therapiekonzepte mit teilweise konträren Inhalten entwickelt, um die Komplikationsraten der prothetischen Versorgungen zu senken. Ziel dieser Arbeit ist die Analyse von implantatprothetischen Konzepten bei festsitzenden Versorgungen im Seitenzahnbereich sowie der Vergleich internationaler Studien mit der vorliegenden klinischen Langzeitstudie zur Bewährung von Suprastrukturen. Im Rahmen dieser prospektiven klinischen Studie wurden 357 Patienten mit 799 Implantaten im Seitenzahnbereich versorgt und regelmäßig jährlich nachuntersucht. Entsprechend ihrer Versorgung werden 346 implantatgetragene Einzelkronen, 83 verblockte Kronen, 108 reinimplantat- getragene Brücken und 111 Verbundbrücken unterschieden und die Überlebensraten dieser Suprastrukturen verglichen. In der Gruppe der implantatgetragenen Einzelkronen beträgt die Überlebensrate der Implantate nach fünf Jahren 97,9%. Der Anteil komplikationsloser Versorgungen in diesem Zeitraum beträgt 78%. Bei den verblockten Kronen wurden während des Untersuchungszeitraums keine Implantatverluste festgestellt, der Anteil komplikationsloser Versorgungen liegt nach fünf Jahren bei 84%. Im Bereich der reinimplantatgetragenen Brücken frakturierte eines der Implantate unter Belastung, so dass daraus eine 5-Jahres-Überlebensrate der Implantate von 99,6% resultiert. Bei 66,7% der Brücken traten keinerlei prothetische Komplikationen auf. Auch in der Gruppe der Verbundbrücken traten keine Implantatverluste auf. Zudem wiesen die Versorgungen in diesem Bereich mit einem Anteil komplikationsloser Versorgungen von 89,2% nach fünf Jahren die besten prothetischen Ergebnisse auf. In allen vier Gruppen zeigte sich die Dezementierung als häufigstes prothetisches Ereignis. Sowohl die Wahl des Implantatsystems als auch die Liegedauer weisen einen statistisch signifikanten Einfluss auf die Komplikationsrate der Suprastrukturen auf. Dagegen haben der Implantationsort (Ober- bzw. Unterkiefer, Prämolaren- bzw. Molarengebiet), die Zahl der Implantate im Verbund der prothetischen Konstruktion sowie der Implantatdurchmesser keinen statistisch signifikanten Einfluss hinsichtlich des Anteils der Suprakonstruktionen mit Komplikationen. Die festsitzende Versorgung von Implantaten mit bewährten prothetischen Konzepten zeigt in unserer klinischen Studie niedrigere Komplikationsraten als die Literatur. Selbst bei hohen Kaubelastungen, wie sie vor allem im Molarengebiet auftreten, kann auf die Verblockung von Kronen verzichtet werden. Zudem können Implantate im Rahmen einer Pfeilervermehrung mit natürlichen Zähnen verbunden werden, ohne dass daraus eine höhere Rate technischer Misserfolge resultiert. Dabei stellt die Dezementierung als häufigstes Ereignis keine echte prothetische Komplikation dar. Sie ist vielmehr abhängig von der Größe des verwendeten Abutments, von der Oberflächenbeschaffenheit von Abutment und Krone (poliert oder gestrahlt), von der Art des Befestigungszementes sowie von der Passgenauigkeit. Die Ergebnisse dieser klinischen Studie zeigen, dass bei Verwendung eines mechanisch hochfesten Implantatsystems auf spezielle implantatprothetische Konzepte verzichtet werden kann, sondern vielmehr zahnbasierte prothetische Konzepte übertragen werden können.
Die ionenstrahlinduzierte Desorption ist eine Beeinträchtigung der Leistungsfähigkeit moderner Hochstrom-Schwerionensynchrotrons. Umgeladene Projektilionen folgen in den Ablenkmagneten nicht der Sollbahn des Strahls und kollidieren mit der Strahlrohrwand. Dies führt zu einer stimulierten Gasabgabe an das Beschleunigervakuum. Der resultierende erhöhte Druck hat eine deutliche Einschränkung der Strahllebensdauer zur Folge. Um die Menge des abgegebenen Gases zu minimieren wurden zahlreiche Experimente durchgeführt, die der Bestimmung der Desorptionsausbeute (desorbierte Gasmoleküle pro auftretendem Ion) unterschiedlicher Materialien unter Bestrahlung mit verschiedenen Ionen dienten. Die vorliegende Arbeit ist ein Beitrag zum Verständnis der physikalischen Prozesse der ionenstrahlinduzierten Desorption. Die Messung der Desorptionsausbeuten mittels der Druckanstiegsmethode wurde erstmals mit Materialanalytiken wie ERDA und RBS kombiniert. Mit diesem einzigartigen experimentellen Aufbau kann das Desorptionsverhalten mit den Oberflächen- und Festkörpereigenschaften der Proben korreliert werden. Anhand der durchgeführten Experimente mit 1,4 MeV/u Xenon-Ionen konnte gezeigt werden, dass die ionenstrahlinduzierte Desorption im Wesentlichen ein Oberflächeneffekt ist. Zerstäubte Verunreinigungen oder abgetragene Oxidschichten von Metallen liefern keinen nennenswerten Beitrag zum desorbierten Gas. Dennoch ist die Desorptionsausbeute stark von den Festkörpereigenschaften der Probe abhängig. Rein metallische Proben desorbieren unter Bestrahlung mit schnellen Schwerionen weniger stark als Isolatoren. Durch die experimentellen Ergebnisse wurde es möglich, Desorptionsausbeuten unter Ionenbestrahlung anhand eines modiffizierten inelastischen Thermal-Spike-Modells vorauszusagen. Die Erweiterung des Modells ist die Kombination des Temperaturprofils mit der thermischen Desorption. Damit kann die ionenstrahlinduzierte Desorption als die Abgabe von Oberflächenadsorbaten, ausgelöst durch eine kurzzeitige Erhöhung der Oberflächentemperatur um den Ioneneinschlag herum, betrachtet werden.
Antibiotic resistance of pathogenic bacteria is a major worldwide problem. Bacteria can resist antibiotics by active efflux due to multidrug efflux pumps. The focus of this study has been the mycobacterial multidrug transporter TBsmr because it belongs to the small multidrug resistance (SMR) family whose members are a paradigm to study multidrug efflux due to their small size. SMR proteins are typically 11-12 kDa in size and have a four-transmembrane helix topology. They bind cationic, lipophilic antibiotics such as ethidium bromide (EtBr) and TPP+, and transport them across the membrane in exchange for protons. To understand the molecular mechanism of multidrug resistance, we have to gain information about the structure and function of these proteins. The research described in this thesis aimed to deduce details about the topology, transport cycle and key residues of TBsmr using biophysical techniques. Solid-state NMR (ssNMR) can provide detailed insight into structural organization and dynamical properties of these systems. However, a major bottleneck is the preparation of mg amounts of isotope labeled protein. In case of proteoliposomes, the problem is compounded by the presence of lipids which have to fit into the small active volume of the ssNMR rotor. In Chapter 3, an enhanced protein preparation is described which yields large amounts of TBsmr reconstituted in a native lipid environment suitable for further functional and structual studies. The achieved high protein-to-lipid ratios made a further characterization by ssNMR feasible. The transport activity and oligomeric state of the reconstituted protein in different types of lipid was studied as shown in Chapter 4. The exact oligomeric state of native SMR proteins is still uncertain but a number of biochemical and biophysical studies in detergent suggest that the minimal functional unit capable of binding substrate is a dimer. However, binding assays are not ideal since a protein may bind substrate without completing the transport cycle which can only be shown for reconstituted protein in transport assays.By combining functional data of a TPP+ transport assay with information about theoligomeric state of reconstituted TBsmr obtained by freeze-fracture electron microscopy, it could be shown that lipids affect the function and the oligomeric state of the protein, and that the TBsmr dimer is the minimal functional unit necessary for transport. The transport cycle must involve various conformational states of the protein needed for substrate binding, translocation and release. A fluorescent substrate will therefore experience a significant change of environment while being transported, which influences its fluorescence properties. Thus the substrate itself can report intermediate states that form during the transport cycle. In Chapter 5, the existence of such a substrate-transporter complex for the TBsmr and its substrate EtBr could be shown. The pH gradient needed for antiport has been generated by co-reconstituting TBsmr with bacteriorhodopsin. The measurements have shown the formation of a pH-dependant, transient substrate-protein complex between binding and release of EtBr. This state was further characterized by determining the Kd, by inhibiting EtBr transport through titration with non-fluorescent substrate and by fluorescence anisotropy measurements. The findings support a model with a single occluded intermediate state in which the substrate is highly immobile. Liquid-state NMR is a useful tool to monitor protein-ligand interactions by chemical shift mapping and thus identify and characterize important residues in the protein which are involved in substrate binding. In agreement with previous studies (Krueger-Koplin et al., 2004), the detergent LPPG was found to be highly suitable for liquid-state NMR studies of the membrane protein TBsmr and 42% of the residues could be assigned, as reported in Chapter 6. However, no specific interactions with EtBr were found. This observation was confirmed by LILBID mass spectrometry which showed that TBsmr was predominantly in the non-functional monomeric state. Functional protein was prepared in proteoliposomes which can be investigated by solidstate NMR (Chapter 7). Besides the essential E13, the aromatic residues W63, Y40, and Y60 have been shown to be directly involved in drug binding and transport. Different isotope labeling strategies were evaluated to improve the quality of the NMR spectra to identify and characterize these key residues. In a single tryptophan mutant of reconstituted TBsmr W30A, the binding of ethidium bromide could be detected by 13C solid-state NMR. The measurements have revealed two populations of the conserved W63 residue with distinct backbone structures in the presence of substrate. There is a controversy about the parallel or anti-parallel arrangement of the protomers in the EmrE dimer (Schuldiner, 2007) but this structural asymmetry is consistent with both a parallel and anti-parallel topology.
Die spinale Kompression bei Wirbelsäulenfrakturen löst eine komplexe Abfolge von pathophysiologischen Ereignissen aus. Dem neuronalen Primärschaden, der unmittelbar durch das Trauma entsteht, folgt ein Sekundärschaden, der durch die Aktivierung immunkompetenter Zellen vermittelt wird. Durch die Ausschüttung proinflammatorischer Zytokine und anderer potentiell neurotoxischer Faktoren wie Interleukin (IL)-1, IL-6, Tumor Nekrose Faktor (TNF)-α, Stickstoffmonoxid (NO) oder freier Radikale wird der initial entstandene Primärschaden verstärkt. Um die Hypothese zu prüfen, dass eine Hemmung von immunkompetenten Zellen mit dem Immunsuppressivum Mycophenolatmofetil (MMF) zu einem verbesserten Erhalt neuronaler Strukturen führt, wurde das etablierte Modell der organotypischen hippocampalen Schnittkultur (OHSC) gewählt. In diesem Modell können die komplexen Vorgänge der neuronalen Schädigung und der glialen Aktivierung exzellent dargestellt werden, da die verschiedenen Zelltypen des Hirngewebes in organotypischer Anordnung erhalten bleiben. Die reproduzierbare experimentelle Schädigung der OHSC wurde am 6. Tag in vitro (div) durch exzitotoxische Behandlung mit N-Methyl-d-Aspartat (NMDA; 50 μM; 4 h) erzielt. Zeitgleich mit der Schädigung mittels NMDA und weiter bis zum Fixationszeitpunkt nach 9 div wurde das Immunsuppressivum MMF verabreicht. Die mit NMDA geschädigten Schnittkulturen zeigten einen dramatischen neuronalen Schaden und eine starke Zunahme der Zahl der Mikrogliazellen. Die hier nach quantitativer Analyse mittels konfokaler Laser Scanning Mikroskopie ermittelten Korrelate des neuronalen Schadens, also die Zahl mit Propidiumiodid (PI) angefärbter, lädierter Neurone, und die Zahl der mit Griffonia simplicifolia (IB4) markierten Mikrogliazellen, wurden auf einen Wert von 100% normalisiert. Die Kontrollkulturen zeigten im Vergleich zu den geschädigten Kulturen fast keinen neuronalen Schaden (1,1% PI-markierte Zellen verglichen mit 100% in der mit NMDA geschädigten Gruppe, p<0,05), und nur wenige, ruhende Mikrogliazellen (13,8%, p<0,05). Nach Schädigung mittels NMDA und gleichzeitiger Verabreichung von MMF (10 μg/ml) zeigte sich eine signifikante Reduktion der Zahl PI-markierter Neurone auf 51,0% (p<0,05) und der Zahl der Mikrogliazellen auf 47,1 % (p<0,05), jeweils verglichen mit der NMDA-Gruppe. Bei der Verwendung von MMF in höherer Konzentration (100 μg/ml) wurden Werte von 50,4 % (p<0,05) für den neuronalen Schaden und 31,9 % (p<0,05) für die Zahl der Mikrogliazellen ermittelt. Die Kurzzeitverabreichung von MMF in einer Konzentration von 100 μg/ml für nur 4 Stunden parallel mit der exzitotoxischen Schädigung mittels NMDA resultierte nur in einer signifikanten Verminderung der Anzahl Mikrogliazellen auf 34,9% (p<0,01), nicht hingegen in einer signifikanten Reduzierung des neuronalen Schadens. Weiterhin konnte gezeigt werden, dass MMF einen antiproliferativen Effekt auf Gliazellen hat. Mittels Ki67-Färbung konnte nach Gabe von MMF im Vergleich zu den nur mit NMDA geschädigten Kulturen (100%) ein Rückgang der Zahl proliferierender Ki67+-Gliazellen auf 21,9% (MMF 10 μg/ml; p<0,01) bzw. 17% (MMF 100 μg/ml; p<0,01) gezeigt werden. Ferner wurden viele Zellen gesehen, die nach MMF-Gabe fragmentierte Kerne aufwiesen. Dieses Phänomen wurde als Zeichen von apoptotischen Vorgängen in Gliazellen aufgefasst. Die hier beschriebenen Ergebnisse zeigen, dass MMF den neuronalen Schaden und das Ausmaß der Mikrogliaaktivierung um ca. 50% reduziert. Zusätzlich wurde belegt, dass MMF einen antiproliferativen Effekt auf Mikrogliazellen und Astrozyten hat. Die Befunde sprechen für die genauere Charakterisierung der ermittelten neuroprotektiven Effekte in einem in vivo-Modell der spinalen Kompression.
Die Analyse der Ionisation des in Zürich durchgeführten Ionisationsexperimentes an Helium hat in erster Line gezeigt, wie exakt die optischen Eigenschaften der lambda/4 Platte bekannt sein müssen, um die richtigen Schlussfolgerungen aus den experimentellen Daten zu ziehen. Insbesondere, dass bei der Bandbreite des verwendeten Lichtes, rein zirkulare Laserpulse mit den heutzutage zu Verfügung stehenden Verzögerungsplatten nicht erzeugt werden können und wie gravierend sich eine Restelliptizität von wenigen Prozent auf die Impulsverteilung auswirkt. Wird dieses Wissen jedoch in die Analyse mit eingebracht, so erlaubt der präsentierte Ansatz eine Bestimmung des Ionisationszeitpunktes mit der Genauigkeit in der Größenordnung von 10 Prozent der Dauer einer Laserperiode. Diese Analyse erlaubt in Zukunft in Experimenten mit zirkular polarisierter Laserstrahlung beim Auftreten von Mehrfachionisation die Bestimmung der Zeitintervalle zwischen den einzelnen Ionisatiosereignissen. Des weiteren ermöglicht die vorgestellte Analyse aus den gemessenen Impulsvereilungen eine CEO-Phasenbeestimmung durzuführen, bei welcher die Anzahl der benötigten Ionisationsvorgänge geringer ist als bei der Benutzung eines Stereo-ATI. In Verbindung mit Detektorsystemen, welche in der Lage sind die Winkelverteilungen für Ereignisse zu bestimmen, bei denen sehr viele Ionisationsereignisse auf einmal auftreten, kann die Anzahl der Laserschüsse, die für die Bestimmung der CEO-Phase benötigt werden, stark verringert werden. Das Pump-and-Probe-Experiment liefert trotz der Problematik, welche sich in diesem Fall bei der Anwendung des Pump-and-Probe-Schemas auf Grund der zur Verfügung stehenden Wellenlänge ergeben einen Hinweis auf die Zeitdauer, die zur Isomerisation benötigt wird. Bei den gewählten Intensitäten ist nach einem Zeitraum zwischen 30 und 60 fs zwischen dem Pump- und Probe-Puls ein Anstieg der Anzahl der in drei Teilchen fragmentierten Moleküle zu beobachten, welche einer Vinylidenkonfiguration entstammen. Der relative Anstieg der Vinylidenpopulation beträgt zehn Prozent. Der Grund, dass kein Anstieg der Vinyliden Population von null an zu beobachten ist, ist wahrscheinlich dadurch begründet, dass die Isomerisation schon an den Flanken des Pump-Pulses stattfindet und schon vor Erreichen der maximalen Intensität des Pump-Pulses abgeschlossen ist. Der Analoge Prozess könnte an den Flanken des Probe-Pulses stattfinden. Dies muss durch eine separate theoretische Behandlung erörtert werden.
Während zerebraler Ischämie und Reperfusion (I/R) kommt es zur Bildung von reaktiver Sauerstoffspezies (ROS), von welchen ausgegangen wird, dass sie zum neuronalen Schaden beitragen. NADPH Oxidasen produzieren ROS. Wir untersuchten daher, ob und in welchem Maße NADPH Oxidasen am Gewebeschaden und insbesondere an der Schädigung der Blut-Hirn-Schranke (BHS) nach experimenteller I/R beteiligt sind. Hierfür induzierten wir an Wildtyp und NADPH Oxidase (gp91phox-/-) Knockout Mäusen in An-und Abwesenheit pharmakologischer Inhibitoren eine transiente zerebrale Ischämie mittels Fadenverschlusses der Arteria cerebri media (MCAO) für 120 Minuten mit anschließender Reperfusion. Das Infarktvolumen nach 24 Stunden war bei den Tieren mit fehlender funktioneller NADPH Oxidase (gp91phox-/-) bzw. (p47phox-/-) deutlich kleiner als in der Gruppe der Wildtyp Mäuse (TTC Färbung). I/R erhöhte bei den Wildtyp Mäusen im Vergleich zur kontralateralen Hemisphäre die BHS Permeabilität für Evans Blue innerhalb der ersten Stunde nach Ischämie signifikant. Apocynin, ein NADPH Oxidase Inhibitor schwächte diesen Effekt dosisabhängig signifikant ab. In der Gruppe der gp91phox Knockout-Tieren war dieser protektive Effekt auf die BHS Permeabilität noch ausgeprägter. In Schweinehirnendothelzellen (PBEC) induzierten wir durch I/R eine Translokation des NADPH Oxidase Aktivators Rac-1 an die Membran.Die deutliche Reduktion des BHS Schadens nach Hemmung von Rac-1 durch Clostridium difficile lethal Toxin B ( TcdB) und Atorvastatin weist darauf hin, dass dies die Folge der Inhibition der NADPH Oxidase Aktivierung war. Die Stimulation von PBEC mit H2O2 steigerte die Permeabilität, was durch die Inhibition der Phosphatidyl-Inositol-3-Kinase oder c-Jun N-terminale Kinase abgeschwächt werden konnte. Die Inhibition der Extracellular-regulated Kinase 1/2 oder p38 mitogen-activated-protein Kinase hatte dagegen keinen Effekt. Jedoch konnte die Inhibition von Rho eine ROS induzierte Steigerung der Permeabilität sowie eine ROS induzierte Polymerisation des Zytoskelett vollkommen unterbinden. Die Ergebnisse dieser Studie belegen, dass die Aktivierung der NADPH Oxidase ein zentraler Bestandteil der Pathophysiologie des ischämischen Infarktes ist und liefern darüber hinaus eine Erklärung für die positiven Effekte der Statintherapie beim Schlaganfall des Menschen. Die direkte Hemmung der NADPH Oxidase stellt ein vielversprechendes Prinzip in der Akuttherapie des ischämischen Infarktes dar.
Natural killer (NK) cells are white blood lymphocytes of the innate immune system that have diverse biological functions, including recognition and destruction of certain microbial infections and neoplasms [1]. NK cells comprise ~ 10% of all circulating lymphocytes and are also found in peripheral tissues including the liver, peritoneal cavity and placenta. Resting NK cells circulate in the blood, but, following activation by cytokines, they are capable of extravasation and infiltration into most tissues that contain pathogen-infected or malignant cells [2-5]. NK cells discriminate between normal and abnormal cells (infected or transformed) through engagement and dynamic integration of multiple signaling pathways, which are initiated by germline-encoded receptors [6-8]. Healthy cells are protected from NK cell-mediated lysis by expression of major histocompatibility complex (MHC) class I ligands for NK cell inhibitory receptors [6, 9]. The MHC is a group of highly polymorphic glycoproteins that are expressed by every nucleated cell of vertebrates, and that are encoded by the MHC gene cluster. The human MHC molecules are termed human leucocyte antigen (HLA)-A, B and C molecules. Every NK cell expresses at least one inhibitory receptor that recognizes a self-MHC class I molecule. So, normal cells that express MHC class I molecules are protected from self-NK cells, but transformed or infected cells that have down-regulated MHC class I expression are attacked by NK cells [10]. There are 2 distinct subsets of human NK cells identified mainly by cell surface density of CD56. The majority (approximately 90%) of human NK cells are CD56dimCD16bright and express high levels of FcγRIII (CD16), whereas a minority (approximately 10%) are CD56brightCD16dim/- [11]. Resting CD56dim NK cells are more cytotoxic against NK-sensitive targets than CD56bright NK cells [12]. However, after activation with interleukin (IL)-2 or IL-12, CD56bright cells exhibit similar or enhanced cytotoxicity against NK targets compared to CD56dim cells [12-14]. The functions of NK cells are regulated by a balance of signals (Fig. 1.1). These are transmitted by inhibitory receptors, which bind MHC class I molecules, and activating receptors, which bind ligands on tumors and virus-infected cells [15]. These receptors are completely encoded in the genome, rather than being generated by somatic recombinations, like T- and B-cell receptors.
Resistenz polyklonaler, reifer T-Zellen gegenüber der Transformation durch retrovirale Transduktion
(2008)
Nach den ersten Erfolgen der Gentherapie bei angeborenen Immundefekten wurden einige Fälle von Leukämie nach gammaretroviralem Gentransfer in Blutstammzellen bei Patienten mit „severe combined immunodeficiency“ (SCID-X1) veröffentlicht. Diese entfachten eine Diskussion über das Risiko der Insertionsmutagenese bei der Verwendung gammaretroviraler Vektoren. Durch eine insertionsbedingte Transaktivierung potentieller Onkogene und damit verbundenen malignen Veränderungen können gammaretroviral transduzierte Blutstammzellen Leukämien hervorrufen. Aber nicht nur Blutstammzellen werden als Zielzellen in der Gentherapie genutzt. In der Gruppe von Laer wurde in den letzten Jahren eine neue Gentherapie der HIV-1 Infektion entwickelt. Hierbei werden dem Patienten genetisch geschützte, autologe T-Lymphozyten infundiert. Die Gefahr einer Leukämie durch Insertionsmutagenese sollte im Zuge dieser Studie für reife T-Lymphozyten evaluiert werden. In einer vergleichenden Analyse wurde untersucht, ob der gammaretrovirale Gentransfer in reife T-Lymphozyten die gleiche Genotoxizität birgt wie in hämatopoetische Stammzellen. Hierzu wurden reife T-Lymphozyten und hämatopoetische Progenitoren von C57BL/6(Ly5.1)-Mäusen mit multiplen Kopien gammaretroviraler Vektoren transduziert, die für die potenten T-Zell Onkogene LMO2, TCL1, dTrkA oder das Kontrollgen GFP kodierten. Es wurden sehr hohe Transduktionseffizienzen mit bis zu 70% für reife T-Lymphozyten und bis zu 98% für hämatopoetische Progenitoren erzielt, um möglichst leukämiefördernde Bedingungen zu schaffen. Nach Transplantation in kongene Rag-1 defiziente Empfängertiere (Ly5.2) entwickelten Onkogen-modifizierte Stammzellen nach einer charakteristischen Latenzperiode Leukämien/Lymphome. Am häufigsten wurden unreife, CD8+CD4+ doppelpositive T-Vorläufer Leukämien/Lymphome beobachtet. In einigen Rezipienten führte außerdem eine Überexpression von TCL1 in hämatopoetischen Stammzellen zu der Entwicklung von reifzelligen T-Zell Leukämien/Lymphomen und B-Zell Leukämien/Lymphomen. Die Integrationsanalyse ergab oligo- bis monoklonale Tumore, wobei keine offensichtlich tumorfördernden, die gammaretroviralen Insertionen flankierenden Gene identifiziert werden konnten. Bemerkenswerterweise entwickelte keines der T-Zell transplantierten Empfängertiere ein/e Lymphom/Leukämie, obwohl auch diese Zellen mit den gleichen Vektoren modifiziert wurden und über einen sehr langen Zeitraum persistierten. Um die Kontrollmechanismen dieser Resistenz näher zu untersuchen, wurde eine für den TCR monoklonale, adulte T-Zell Population mit dTrkA transduziert. Nach einer kurzen Latenzperiode entwickelten sich reifzellige T-Zell Leukämien/Lymphome. Anscheinend existiert eine Verbindung zwischen der relativen Transformationsresistenz reifer T-Lymphozyten und dem Konkurrenzverhalten verschiedener T-Zell Klone um stimulatorische MHC-TCR Nischen. Weiterhin wurde in vitro durch gammaretroviralen Transfer von LMO2 ein immortalisierter T-Zell Klon generiert. Dieser zeigte zwar nach einer langen Beobachtungszeit einen CD8-CD4-doppelnegativen Phänotyp, aber auch einen rekombinierten TCR. In vitro überwuchs er eine unmanipulierte Kompetitorpopulation, konnte jedoch nach Transplantation kein/e T-Zell Lymphom/Leukämie induzieren. Die LM-PCR Analyse des Klons lieferte eine sehr interessante Integration zwischen den Genen für die alpha-Ketten des IL-2 und des IL-15 Rezeptors, welche dadurch konstitutiv exprimiert wurden. Dies könnte das erste Beispiel für eine insertionsbedingte Immortalisierung eines adulten T-Zell Klons sein. In der vorliegenden Arbeit konnte zum ersten Mal eindeutig gezeigt werden, dass polyklonale, reife T-Zell Populationen in vivo eine hohe Transformationsresistenz aufweisen. Durch bestimmte Bedingungen können jedoch durchaus maligne Veränderung adulter, reifer T-Lymphozyten induziert werden. Für die Sicherheitsabschätzung gammaretroviraler Gentherapie-Studien mit reifen T-Lymphozyten sind die vorgestellten Ergebnisse von großer Bedeutung und könnten darüber hinaus Aufschluss über die populationsdynamischen Kontrollmechanismen reifer T-Zell Leukämien/Lymphome geben.
Kaum ein Thema der mittelalterlichen Kunst wurde so kontrovers diskutiert wie eine Gruppe plastischer Marienbilder am Ende des 14. Jahrhunderts. Diese Madonnenfiguren, die als "Schöne Madonnen" in die Kunstgeschichte eingegangen sind, hatten nur eine relativ kurze Blütezeit (1380–1420/30). Dennoch beherrschte dieser Bildtypus das plastische Marienbild der Zeit "um 1400". Die Provenienz der Schönen Madonnen liegt vorwiegend im osteuropäischen Raum (Böhmen, Deutschordensländer) und in Österreich (Salzburg, Wien) - im Reich Kaiser Karl IV. Gleiches gilt für ihr "trauriges Pendant", dem zeitgenössischen Vesperbild. ...
Identifizierung und Charakterisierung von Liganden für Faktor VIII neutralisierende Antikörper
(2008)
Das Fehlen von funktionellem Blutgerinnungsfaktor VIII (FVIII) in Hämophilie A- (HA-) Patienten wird durch Substitution mit FVIII-Präparaten therapiert. Die wesentlichste gegenwärtige Komplikation der FVIII-Ersatz-Therapie besteht in dem Auftreten von FVIII neutralisierenden Antikörpern (Inhibitoren) gegenüber exogenem FVIII. Diese können mittels verschiedener, kostenintensiver Therapien zur Induktion einer Immuntoleranz (ITI) mit unterschiedlichem Erfolg eliminiert werden. Für Patienten mit persistierenden Inhibitoren bedeuten diese nicht nur eine drastische Verminderung der Lebensqualität sondern ein lebensbedrohliches Szenario. Eine Liganden-vermittelte Blockierung von neutralisierenden anti-FVIII Antikörpern sowie die zielgerichtete Ansteuerung des Rezeptors FVIII-spezifischer Gedächtnis-B-Zellen stellen mögliche Ansätze zur Verwirklichung antigenspezifischer ITI-Strategien für eine dauerhafte, vollständige Eliminierung von FVIII-Inhibitoren dar. Zu diesem Zweck wurden in dieser Arbeit durch Screening von phagenpräsentierten, randomisierten Peptidbibliotheken mit Inhibitor-positiven Patientenplasmen Peptidliganden selektioniert. Diese wiesen eine spezifische Bindung von anti-FVIII Antikörpern in den verwendten Plasmen auf. Durch den Einsatz entsprechender Software konnten AS-Konsensusmotive der Peptidsequenzen möglichen, konformationellen, funktionellen Inhibitorepitopen in der A2- sowie C2-Domäne von FVIII zugeordnet werden. Die von in silico-Analysen vorgegebene Domänenspezifität der anti-FVIII Antikörper wurde in Bindungsstudien mit rekombinant exprimierten FVIII-Domänen verfiziert. Die korrespondierenden, synthetischen Peptidliganden blockierten die IgG-Bindung an FVIII und regenerierten partiell dessen Aktivität im Plasma. Die Peptide stellten funktionelle Mimotope der möglichen Inhibitorepitope in der A2- und C2-Domäne dar. Da FVIII neutralisierende Antikörper zumeist Epitope in beiden Domänen erkennen, wurden die Mimotope kombiniert, was in einer noch effektiveren Blockierung von FVIII-Inhibitoren resultierte. Weiterhin wiesen Mimotopkombinationen Kreuzreaktivität mit anti-FVIII IgG in heterologen Patientenplasmen auf. Durch Fusion der Peptide an die Multimerisierungsdomäne der alpha-Kette des humanen C4-Bindeproteins konnten in Zellkultur heptamere Proteine generiert werden. Gegenüber den synthetischen Peptiden wiesen die Multimere aufgrund ihrer Multivalenz sowie der strukturellen Integrität eine deutlich verbesserte Blockierung von anti-FVIII IgG auf. Das Multimerisierungskonzept erlaubte ferner die Kombination unterschiedlicher Peptidliganden in einem Heteromultimer, was anhand der selektierten, funktionellen Mimotope für mögliche A2- und C2-Epitope getestet wurde. Weiterhin zeichneten sich die Inhibitor-spezifischen Multimere gegenüber den synthetischen Peptiden durch deutlich verlängerte Halbwerstzeiten aus. In Präparationen peripherer mononuklearer Zellen (PBMCs) von Patienten färbten synthetische Peptide sowie Fluoreszenz-markierter FVIII B-Zellsubpopulationen mit einem Gedächntis-B-Zell Phänotyp (CD19+IgG+). Gedächtnis-B-Zellen in PBMCs wurden polyklonal stimuliert. Im ELISPOT-Verfahren konnten Tetanusspezifische, jedoch keine FVIII-spezifischen Zellen, detektiert werden. Im Gegensatz zu den verwandten Kontrollen bewirkte eine Präinkubation der Zellen mit dem Peptid 12C6, welches an das toxische D-AS-Peptid (KLAKLAK)2 gekoppelt war, allerdings eine Reduktion von anti-FVIII IgG in den Überständen stimulierter Zellen.
Im Rahmen der Arbeit wird empirisch untersucht, welche Reaktionen die Veröffentlichung von Periodenergebnissen als Teil der Unternehmenspublizität am deutschen Kapitalmarkt auslöst, welches die Bestimmungsfaktoren für das Ausmaß der Kapitalmarktreaktionen sind und ob Unternehmen in der Lage sind, durch ihre Publizitätsentscheidungen die Kapitalmarktreaktionen auf die Veröffentlichung von Periodenergebnissen zu beeinflussen. Kapitalmarktreaktionen auf die Veröffentlichung von Periodenergebnissen werden im Rahmen dieser Arbeit anhand von Aktienkursen und Handelsvolumen (Informationsgehalt) sowie anhand von Geld-Brief-Spannen (Informationsasymmetrie) gemessen. Als Ergebnis kann ein erhöhtes Ausmaß an abnormalen Renditen und Handelsvolumen am Tag der Ergebnisankündigung festgestellt werden, was darauf hinweist, dass Ergebnisankündigungen Informationsgehalt besitzen. Weiterhin kann festgestellt werden, dass durch Ergebnisankündigungen anhand von Geld-Brief-Spannen gemessene Informationsasymmetrien sinken. Weiterhin zeigt sich, dass die Kapitalmarktreaktion umso stärker ist, je mehr zusätzliche Informationen zusammen mit dem Periodenergebnis veröffentlicht werden. In diesem Zusammenhang kann auch gezeigt werden, dass sowohl Aktienkurs- und Handelsvolumenreaktionen als auch Geld-Brief-Spannen bei Anwendung international anerkannter Rechnungslegungsgrundsätze größer sind als bei Anwendung handelsrechtlicher Grundsätze. Dabei zeigt sich, dass Aktienkursreaktionen und Geld-Brief-Spannen über den Untersuchungszeitraum, der als Gewöhnungsphase an international anerkannte Rechnungslegungsgrundsätze angesehen werden kann, sinken und das Handelsvolumen steigt. Darüber hinaus kann gezeigt werden, dass die Kapitalmarktreaktion umso geringer ausfällt, je mehr oder je qualitativ hochwertiger die Unternehmenspublizität vor der Ergebnisankündigung ausfällt.
Ein wesentlicher Forschungsgegenstand der Kernphysik ist die Untersuchung der Eigenschaften von Kernmaterie. Das Verständnis darüber gibt in Teilen Aufschluss über die Erscheinungsweise und Wechselwirkung von Materie. Ein Schlüssel liegt dabei in der Untersuchung der Modifikation der Eigenschaften von Hadronen in dem Medium Kernmaterie, das durch Parameter wie Dichte und Temperatur gekennzeichnet werden kann. Man hofft damit unter anderem Einblick in die Mechanismen zu bekommen, welche zur Massenbildung der Hadronen beitragen. Zur Untersuchung solcher Modifikationen eignen sich insbesondere Vektormesonen, die in e+e- Paare zerfallen. Die Leptonen dieser Paare wechselwirken nicht mehr stark mit der Materie innerhalb der Reaktionszone, und tragen somit wichtige Informationen ungestört nach außen. Das HADES-Spektrometer bei GSI wird dazu verwendet die leichten bei SIS-Energien produzierten Vektormesonen rho, omega und phi zu vermessen. Hierzu wurde zum erste mal das mittelschwere Stoßsystem Ar+KCl bei einer Strahlenergie von 1,76 AGeV gemessen. Die im Vergleich zum früher untersuchten System C+C höhere Spurmultiplizität innerhalb der Spektrometerakzeptanz verlangte eine Anpassung der bisher verwendeten Datenanalyse. Das bisher verwendete Verfahren, mehrere scharfe Schnitte auf verschiedene Observablen seriell anzuwenden, um einzelne Leptonspuren als solche zu identifizieren, wurde durch eine neu entwickelte multivariate Analyse ersetzt. Dabei werden die Informationen aller beteiligten Observablen mit Hilfe eines Algorithmus zeitgleich zusammengeführt, damit Elektronen und Positronen vom hadronischen Untergrund getrennt werden können. Durch Untersuchung mehrerer Klassifizierer konnte ein mehrschichtiges künstliches neuronalen Netz als am besten geeigneter Algorithmus identifiziert werden. Diese Art der Analyse hat den Vorteil, dass sie viel robuster gegenüber Fluktuationen in einzelnen Observablen ist, und sich somit die Effizienz bei gleicher Reinheit steigern lässt. Die Rekonstruktion von Teilchenspuren im HADES-Spektrometer basiert nur auf wenigen Ortsinformationen. Daher können einzelne vollständige Spuren a priori nicht als solche gleich erkannt werden. Vielmehr werden durch verschiedene Kombinationen innerhalb derselben Mannigfaltigkeit von Positionspunkten mehr Spuren zusammengesetzt, als ursprünglich produziert wurden. Zur Identifikation des maximalen Satzes eindeutiger Spuren eines Ereignisses wurde eine neue Methode der Spurselektion entwickelt. Während dieser Prozedur werden Informationen gewonnen, die im weiteren Verlauf der Analyse zur Detektion von Konversions- und pi0-Dalitz-Paaren genutzt werden, die einen großen Beitrag zum kombinatorischen Untergrund darstellen. Als Ergebnis wird das effizienzkorrigierte, und auf die mittlere Zahl der Pionen pro Ereignis normierte, Spektrum der invarianten Elektronpaarmasse präsentiert. Erste Vergleiche mit der konventionellen Analysemethode zeigen dabei eine um etwa 30% erhöhte Rekonstruktionseffizienz. Das Massenspektrum setzt sich aus mehr als 114.000 Paaren zusammen -- über 16.000 davon mit einer Masse größer als 150 MeV. Ein erster Vergleich mit einem einfachen thermischen Modell, welches durch den Ereignisgenerator Pluto dargestellt wird, eröffnet die Möglichkeit, die hier gefundenen Produktionsraten des omega- und phi-Mesons durch m_T-Skalierung an die durch andere Experimente ermittelten Raten des eta zu koppeln. In diesem Zusammenhang findet sich weiterhin ein von der Einschussenergie abhängiger Produktionsüberschluss von F(1,76) = Y_total/Y_PLUTO = 5,3 im Massenbereich M = 0,15...0,5 GeV/c^2. Die theoretische Erklärung dieses Überschusses birgt neue Erkenntnisse zu den in-Medium Eigenschaften von Hadronen.
In this work the nuclear structure of exotic nuclei and superheavy nuclei is studied in a relativistic framework. In the relativistic mean-field (RMF) approximation, the nucleons interact with each other through the exchange of various effective mesons (scalar, vector, isovector-vector). Ground state properties of exotic nuclei and superheavy nuclei are studied in the RMF theory with the three different parameter sets (ChiM, NL3, NL-Z2). Axial deformation of nuclei within two drip lines are performed with the parameter set (ChiM). The position of drip lines are investigated with three different parameter sets (ChiM, NL3, NL-Z2) and compared with the experimental drip line nuclei. In addition, the structure of hypernuclei are studied and for a certain isotope, hyperon halo nucleus is predicted.
In this work we study the non-equilibrium dynamics of a quark-gluon plasma, as created in heavy-ion collisions. We investigate how big of a role plasma instabilities can play in the isotropization and equilibration of a quark-gluon plasma. In particular, we determine, among other things, how much collisions between the particles can reduce the growth rate of unstable modes. This is done both in a model calculation using the hard-loop approximation, as well as in a real-time lattice simulation combining both classical Yang-Mills-fields as well as inter-particle collisions. The new extended version of the simulation is also used to investigate jet transport in isotropic media, leading to a cutoff-independent result for the transport coefficient $hat{q}$. The precise determination of such transport coefficients is essential, since they can provide important information about the medium created in heavy-ion collisions. In anisotropic media, the effect of instabilities on jet transport is studied, leading to a possible explanation for the experimental observation that high-energy jets traversing the plasma perpendicular to the beam axis experience much stronger broadening in rapidity than in azimuth. The investigation of collective modes in the hard-loop limit is extended to fermionic modes, which are shown to be all stable. Finally, we study the possibility of using high energy photon production as a tool to experimentally determine the anisotropy of the created system. Knowledge of the degree of local momentum-space anisotropy reached in a heavy-ion collision is essential for the study of instabilities and their role for isotropization and thermalization, because their growth rate depends strongly on the anisotropy.
Die Alzheimer Demenz (AD) ist eine progressive, neurodegenerative Erkrankung, die weltweit die häufigste Form der Demenz darstellt und im mittleren bis späten Lebensabschnitt auftritt. Die auffälligsten histopathologischen Merkmale der AD beinhalten –neben dem Untergang von Nervenzellen und Synapsen vorwiegend im Temporal- und Parietallappen – das Auftreten von extrazellulären Ablagerungen aus fibrillogenem Aß1-42-Peptiden in senilen Plaques und intraneuronalen Akkumulationen von hyperphosphoryliertem Tau in so genannten neurofibrillären Bündeln. Derzeitig häufen sich Anhaltspunkte, nach denen die mitochondriale Dysfunktion eine entscheidende Rolle beim Nervenzelluntergang bei der AD spielt. Um genauere Informationen über die Ursache der mitochondrialen Dysfunktion zu erhalten, wurden in dieser Arbeit der Einfluss von Alzheimer-relevanten Faktoren, wie der Aß- und der Tau-Pathologie, sowie das Alter als wichtigster Risikofaktor der AD auf die mitochondriale Funktion untersucht. Als Tiermodelle standen hierfür Thy-1 APP transgene Mäuse, welche erhöhte Aß-Level ab einem Alter von 3 Monaten aufweisen (Blanchard et al., 2003), P301L transgene Mäuse, bei denen es ab einem Alter von 6 Monaten zur NFT-Formation kommt (Gotz et al., 2001b) und NMRI-Mäuse als Altersmodell zur Verfügung. Isolierte Hirn-Mitochondrien von Thy-1 APP transgenen Mäusen weisen unter basalen Bedingungen ein signifikant erniedrigtes Membranpotential im Vergleich zu dem von non-tg Tieren auf. Die Inkubation mit H2O2 und SNP führt weiterhin zu einem signifikant reduzierten mitochondrialen Membranpotential in isolierten Mitochondrien von non-tg Tiere. Demgegenüber können Mitochondrien Thy-1 APP transgener Mäuse offenbar nicht durch oxidativen und nitrosativen Stress zusätzlich geschädigt werden, wofür wahrscheinlich eine Vielzahl von Kompensationsmechanismen verantwortlich ist. Im Gegensatz hierzu führt die Expression der human pathogenen Mutation P301L in isolierten Mitochondrien 15 Monate alter Mäuse zu einem nur tendenziell erniedrigten Membranpotential. In Anbetracht der weiteren Ergebnisse dieser Arbeit und publizierten Daten kann allerdings davon ausgegangen werden, dass das Membranpotential in P301L-Mitochondrien zu einem späteren Alter ebenfalls signifikant vermindert ist. Weiterhin demonstrierten fortführende Experimente einen Defekt der Komplex IV-Aktivität bei Thy-1 APP Mitochondrien und eine reduzierte Komplex I-Aktivität bei P301L-Mitochondrien. Passend zu diesen Daten sind sowohl Thy-1 APP- als auch P301L-Mitochondrien im Alter durch einen reduzierten Atmungskontrollindex gekennzeichnet, das heißt beide transgene Mauslinien weisen im Alter eine beeinträchtigte mitochondriale Atmungsrate auf. Ferner konnte der Einfluss von Aß auf die mitochondriale Atmungskette durch die Inkubation mit extrazellulär zugefügtem fibrillärem Aß zu non-tg Mitochondrien bestätigt werden. Die Inkubation mit Aß führt in non-tg Mitochondrien zu einer reduzierten State 3-Atmung, welche sich ebenfalls in einem verminderten Atmungskontrollindex widerspiegelt. Dieses Ergebnis verdeutlicht nochmals den Zusammenhang der mitochondrialen Dysfunktion mit Aß. Des Weiteren waren isolierte Hirn-Mitochondrien von Mäusen unterschiedlicher Altersstufen mit fortschreitendem Alter durch eine signifikant stärker ausgeprägte Depolarisation des mitochondrialen Membranpotentials gekennzeichnet. Daneben reagieren isolierte Mitochondrien von alten Tieren nach Inkubation mit spezifischen Inhibitoren der Komplexe I, III und IV mit einer stärkeren Abnahme des mitochondrialen Membranpotentials als junge Tiere. Von besonderem Interesse für die hier vorliegende Arbeit war vor allem die erhöhte Empfindlichkeit der Komplexe I und IV in alten Mäusen, da diese Defizite ebenfalls mit der Tau- und Aß-Pathologie in Verbindung gebracht worden sind. Ferner ergab die direkte Messung der Komplex I Aktivität eine signifikante Verminderung der NADH-Ubiquinon-Reduktase-Aktivität im Alter. In Übereinstimmung weisen isolierte Mitochondrien unter Verwendung von Komplex I-Substraten eine mit dem Alter zunehmende Verminderung der Atmungsraten. Es scheint, dass das vermehrte Auftreten mitochondrialer Mutationen im Alter in Kombination mit spezifischen Defekten der Atmungsketten-Komplexe durch synergistische Effekte das späte Einsetzen der mitochondrialen Dysfunktion in Thy-1 APP und P301L transgenen Tieren bzw. bei der AD erklären könnte. Im zweiten Teil dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass sowohl Ginkgo biloba Extrakt als auch Piracetam protektive Effekte auf die mitochondriale Funktion ausüben. Nach jeweils 14-tägigen Behandlungsstudien konnte gezeigt werden, dass sowohl Gingko biloba Extrakt als auch Piracetam in der Lage waren, das mitochondriale Membranpotential nach oxidativem und nitrosativem Stress zu schützen. Des Weiteren konnte bei beiden Stoffen eine Stabilisation der mitochondrialen Atmungskettenkomplexe nach einer Behandlung mit spezifischen Komplexinhibitoren beobachtet werden. Die protektiven Effekte von Ginkgo biloba können durch zwei Mechanismen erklärt werden, durch seine Radikalfänger-Eigenschaften und zum anderen durch seine stabilisierende Funktion der mitochondriale Funktion. Demgegenüber scheint Piracetam die Mitochondrien durch seine membranstabilisierenden Eigenschaften zu schützen. Durch die Erhöhung der Membranfluidität der inneren mitochondrialen Membran scheint Piracetam die Funktion der mitochondrialen Atmungsketten-Komplexe zu stabilisieren. Ginkgobiloba Extrakt und Piracetam scheinen demzufolge zwei sehr interessante Präventions- und Therapieoptionen bei Patienten mit leichten kognitiven Störungen bzw. bei Patienten mit AD dar.
Ziel der vorliegenden Arbeit war die spektroskopische Untersuchung der aromatischen Aminosäuren L-Phenylalanin (Phe), L-Tyrosin (Tyr) und L-Tryptophan (Trp) in der Gasphase. Dabei sollte bei den in der isolierten Gasphase als neutral vorliegenden aromatische Aminosäuren, der Übergang zur Bildung von Zwitterionen mit fortschreitender Solvatisierung untersucht werden. Der Wechsel von einer neutralen Konformation der Aminosäuren hin zum Zwitterion sollte sich mit Hilfe der IR/R2PI-Schwingungsspektroskopie beobachten lassen.Die Untersuchung wurde an dem bereits gut erforschten Niedertemperatursystem Phenol/NH3 begonnen und durch die Hochtemperatursubstanzen der aromatischen Aminosäuren L-Phenylalanin, L-Tyrosin und L-Tryptophan sowie deren Wassercluster erweitert. Aminosäuren besitzen mehrfache Einfachbindungen, um welche sich die Methyl-, Carboxyl- und Aminogruppen relativ frei drehen können. Daraus resultieren in der Potenzialhyperfläche auch mehrere minima; dies bedeutet die Existenz von verschiedenen Konformeren selbst bei tiefen Temperaturen. Durch intramolekulare Wasserstoffbrückenbindungen (H-Bindung) werden die Konformer-Geometrien sehr stark beeinflusst, wobei diese wiederum die intermolekularen Geometrien beeinflussen. Durch die intramolekularen Kräfte sind nicht alle Konformeren zur Ausbildung intermolekularen H-Bindungen fähig, da diese schon durch die intramolekularen H-Bindungen abgesättigt sind. Solche Konformere, die bei den aromatischen Aminosäuren intramolekularen H-Bindungen, der Art COOH-NH2-pi ausbilden, werden als geschlossene Konformere bezeichnet. Bei den offenen Konformeren ist die Carboxylgruppe frei. Für die elektronische Anregung der Aminosäuren und ihren Aggregaten wurde hier die 1C-R2PI-Methode angewendet. Dabei wurden die Moleküle mit einem UV-Photon resonant angeregt und mit einem zweiten, „farbgleichen“ Photon ionisiert. Durch die Auftragung der Anregungswellenlänge gegen die Ionenintensität erhält man ein R2PI-Spektrum. Die charakteristischen Schwingungen der Moleküle wurden durch die IR/R2PI-Methode ermittelt. Bei Einstrahlung auf einer UV-Resonanz wird zunächst ein (konstantes) Ionensignal erhalten. Mit Hilfe eines IR-Laser wird vorher der elektronische schwingungslose Grundzustand depopuliert, dadurch wird immer dann eine Ionensignal-Abschwächung erhalten, wenn eine IR-Resonanz (Schwingungsbande) durchlaufen wird. Durch Auftragung der IR-Wellenzahl gegen die Ionenintensität erhält man IR/R2PI-Spektren. Die eingesetzte IR/R2PI-Spektroskopie erlaubt die Bestimmung der Geometrien von AAA und AAA-(H2O)1,2 Clustern über die Messung der Vibrationsspektren im OH- und NH-Bereich, die dann mit den theoretisch berechneten Spektren (DFT/ MP2) verglichen wurden.