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Diese Zusammenfassung ist in zwei Abschnitte gegliedert. Im Abschnitt 6.1. wird die physiologische Bedeutung der Glutamatrezeptoren (GluR) und ihr biologischer Hintergrund kurz erklärt. Am Ende dieses Abschnitts wird der Stand der Strukturanalyse des GluR-B Ionenkanals zu Beginn des Projektes zusammengefasst. Im nachfolgenden Abschnitt 6.2. sind die wesentlichen Ergebnisse der hier vorgelegten Arbeit zusammengefasst. 6.1. Die Bedeutung von Glutamatrezeptoren - Stand der Strukturanalyse zum Beginn dieser Arbeit Die Kommunikation zwischen Nervenzellen erfolgt vorwiegend an hochspezialisierten Kontaktstellen den chemischen Synapsen. Der enge Raum zwischen sendender und empfangender Nervenzelle wird auch als synaptischer Spalt bezeichnet. Der Prozess der synaptischen Übertragung beruht auf der präsynaptischen Freisetzung von chemischen Botenstoffen, sogenannten Neurotransmittern in den synaptischen Spalt. Die Aminosäure L- Glutamat (Glu) ist der wichtigste erregende Neurotransmitter im menschlichen Gehirn und Rückenmark. Dementsprechend bedeutend ist die Rolle der ionotropen Glutamatrezeptoren (iGluRs), die sie bei der elektrochemischen Erregungsübertragung am synaptischen Spalt spielen (Seeburg, 1993), (Hollmann and Heinemann, 1994), (Dingledine et al., 1999). Die Freisetzung von Neurotransmittern wird durch ein elektrisches Signal (Aktionspotential) ausgelöst, das sich entlang der Nervenfaser, dem Axon, bis zur Nervenendigung, der Synapse, fortpflanzt. Nach der Freisetzung diffundieren die Neurotransmitter durch den synaptischen Spalt und binden an sogenannte Rezeptoren. Ionotrope Glutamatrezeptoren sind Ionenkanäle, die in die Membran der nachgeschalteten (postsynaptischen) Nervenzelle eingebaut sind. Sie zählen deshalb zu den Membranproteinen. Als ligandgesteuerte kationenselektive Ionenkanäle machen Glutamatrezeptoren (GluRs) die postsynaptische Membran nach Aktivierung durch Ligandbindung für bestimmte Kationen durchlässig. Der Einstrom von Ionen bewirkt eine Änderung des Membranpotentials. Die Stärke der synaptischen Übertragung ist lebenslang modulierbar; die sogennante synaptische Plastizität wird als eine entscheidende Grundlage für die Erklärung von Lernen und Gedächtnis angesehen. Drei synthetische Agonisten aktivieren die GluRs selektiv und wurden deshalb für die Klassifizierung der ionotropen Glutamatrezeptoren herangezogen. Bei den Agonisten handelt es sich um -Amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazol-4-propionat (AMPA), Kainat and N- Methyl-D-Aspartat (NMDA). Die ersten beiden Subtypen werden auch als non-NMDA- Rezeptoren zusammengefasst. Die Aktivierung und Desensitivierung der non-NMDA Rezeptoren ist schneller als die der NMDA-Rezeptoren. Aus molekularbiologischer Sicht (siehe Kapitel 1.3.2.) zeigen die drei Klassen der ionotropen Glutamatrezeptoren eine beträchliche Diversität. So gibt es vier verschiedene Unterheiten vom AMPA-Subtyp, nämlich GluR-A, GluR-B, GluR-C und GluR-B. In dieser Arbeit steht die Strukturanalyse eines aus GluR-B Untereinheiten bestehenden AMPA-Rezeptors im Vordergrund. (Die weitere Unterteilung der NMDA- und Kainatrezeptoren kann dem Kapitel 1.3.2. auf Seite 6 entnommen werden.) Bestimmte Abschnitte der Aminosäurensequenz von Glutamatrezeptoren sind durch hydrophobe Bereiche gekennzeichnet ((M1-M4) in Abbildung 6.1.A (A.)). Das durch verschiedene Untersuchungen etablierte Modell der Glutamatrezeptor-Topologie zeigt 3 Transmembrandomänen (M1, M3 und M4) und eine Membranschleife (M2) (Hollmann et al., 1994), (Kuner et al., 1996). Der Aminoterminus ist extrazellulär, der Carboxyterminus hingegen intrazellulär. Daraus ergibt sich die in Abbildung 6.1.A (B.) abgebildete Topologie (Paas, 1998). S1 und S2 kennzeichnen die Ligandbindungsdomäne. Glutamatrezeptoren (GluR) sind Oligomere, die sich mit grosser Wahrscheinlichkeit aus vier Untereinheiten (Rosenmund et al., 1998), (Ayalon and Stern-Bach, 2001) zusammensetzen (siehe Kapitel 1.3.3.). Die Zusammenlagerung verschiedener Untereinheiten zu einem funktionellen Kanal setzt voraus, dass die Untereinheiten zum gleichen Subtyp gehören, d.h. AMPA Untereinheiten können nur mit anderen AMPA Untereinheiten einen Ionenkanal bilden. Das gleiche gilt für die Zusammensetzung von NMDA und Kainat-Rezeptoren. Das Modell eines tetrameren Glutamatrezeptors ist im Bild C. der Abbildung 6.1.A zu sehen. Die Bestimmung der Quartärstruktur eines vollständigen Glutamatrezeptors ist bislang nicht veröffentlicht. Die strukturelle Analyse von Proteinen erfordert die Isolierung von reinem und funktionellem Protein. Im Vergleich zu den meisten löslichen Proteinen erfordert die Isolierung von Membranproteinen oft besonderer Optimierung. Falls das Vorkommen des Proteins in natürlichem Gewebe gering ist, so kann die strukturelle Analyse durch rekombinante Expression in einem geeigneten Wirtsorganismus zugänglich gemacht werden. Die Isolierung von Milligramm-Mengen eines rekombinanten homomeren GluR-B Rezeptors aus dem entsprechenden Baculovirusexpressionssystem (Keinänen et al., 1994) wurde in unserem Labor etabliert (Safferling et al., 2001) und wurde im ersten Jahr dieses Projektes fortgeführt. Durch zonale Ultrazentrifugation konnte gezeigt werden, dass die molekulare Masse des GluR-B Proteinkomplexes ca. 495 kD beträgt. Dieser Wert liegt in der Nähe des theoretischen Molekulargewichts eines tetrameren Ionenkanals, dessen Molmasse sich aus vier GluR-B Untereinheiten (104 kD) und einer Detergenzmizelle von ca. 63-97 kD zusammensetzt (Safferling et al., 2001). Die elektronenmikroskopische Analyse des Proteinkomplexes von W. Tichelaar aus unserer Gruppe erfolgte 1999 durch Negativfärbung. Für die Strukturanalyse mit Hilfe der Software IMAGIC wurden 10 000 Proteinteilchen selektiert. Das Ergebnis der Bildrekonstruktion ist in der folgenden Abbildung 6.1.B gezeigt. Die projezierten Dimensionen des Models entsprechen einem Molekül mit den Dimensionen 17 nm × 11 nm × 14 nm. Das Model zeigt keine ausgezeichnete Symmetrie, die auf die Stöchiometrie des GluR hinweisen könnte. Das Molekül zeigt mit Färbemittel gefüllte Vertiefungen und innere Strukturen, die vielleicht an der Ionenleitung beteiligt sind. 6.2. Funktionelle und strukturelle Charakterisierung des GluR-B Ionenkanals In der Fortsetzung des oben beschriebenen Projektes wurden für die rekombinante Expression desselben Rezeptors (GluR-B homomer) stabil transformierte Insektenzellen eingesetzt. Dazu wurde die für die GluR-B Untereinheit kodierende und in Plasmiden enthaltene DNA in Insektenzellen transformiert (siehe APPENDIX A.2.2.). Im Vergleich zu dieser auf Dauerhaftigkeit angelegten Integration der Rezeptor DNA wird die Proteinexpression beim Baculovirusexpressionssystem durch Infektion mit rekombinanten Baculoviren initiiert. Der Vergleich zeigte, dass die mit Baculoviren erzielten Ausbeuten bei GluR-B etwa doppelt so hoch waren als bei stabil transformierten Zellen. Allerdings fallen bei stabil transformierten Zellen die eventuellen Nachteile der viralen Belastung auf die zellulären Sekretionsprozesse weg. Im Verlauf der elektronenmikroskopischen Analyse von baculoviral erzeugtem GluR-B Protein hat sich gezeigt, dass Proteine viralen Ursprungs unter Umständen selbst doppelt aufgereinigte GluR-B Proben verunreinigen können (siehe APPENDIX A.2.1.). Dieser Punkt ist bei einer Einzelbildverarbeitung von grosser Relevanz, falls die virusspezifischen Proteinverunreinigungen eine ähnliche Grösse haben wie das eigentliche Zielprotein. Das Hauptziel dieser Arbeit war es, das Potenzial stabil transformierter Insektenzellen für die Expression von homomeren GluR-B Ionenkanälen zu bewerten und dabei die Stöchiometrie der Untereinheiten in diesem Ionenkanal aufzuklären. Zu diesem Zweck wurden biochemische und elektronenmikrosopische Techniken eingesetzt. Zur Isolierung des GluR-B Ionenkanals aus stabil transformierten Insektenzellen wurde das bestehende Aufreinigungsprotokoll für die Affinitätchromatographie an immobilisierten Metallionen (IMAC) (Safferling et al., 2001) optimiert, indem das Chargenverfahren durch das Durchflussverfahren ersetzt wurde (zur genaueren Erklärung der Optimierung siehe RESULTS 4.1.2.). Abbildung 6.C zeigt ein silbergefärbtes Gel mit den Eluaten der IMAC und Eluaten der abschliessenden Affinitätschromatographie mit immobilisiertem M1-Antikörper. Die auf den Bahnen 5-8 aufgetragen GluR-B Proben wurden auch für die Einzelteilchenanalyse mittels Elektronenmikroskopie verwendet. Die Ligandbindungsaktivität von GluR-B wurde durch Filterbindungsexperimente mit dem Radioliganden [3H]-AMPA vor und nach der Isolierung aus den Membranfragmenten bestimmt. Die KD-Werte sind für beide Proben ähnlich gross. Der Bmax-Werte ist für die aufgereinigte Probe wie erwartet sehr viel (mehr als 200×) höher. Die Ergebnisse der Ligandbindungsexperimente sind im Kapitel 4.2.1 tabellarisch zusammengefasst. Die oligomere Struktur des isolierten Ionenkanals wurde durch Quervernetzungsexperimente (Cross-linking) und Einzelteilchenanalyse von negativ gefärbten Proteinmolekülen bewertet. Die Quervernetzungsexerimente selbst erbrachten kein eindeutiges Ergebnis im Hinblick auf oligomere Struktur des komplett zusammengesetzten Rezeptors. Kontrollexperimente mit dem Lysat vom Rattenhippocampus zeigten, dass mit DTSSP ein geeigneter Cross-Linker verwendet wurde (siehe RESULTS 4.3.2.). Neben einem aus 4 Banden bestehenden Muster (siehe RESULTS 4.3.1.) lieferten die Quervernetzungsexperimente mit isoliertem GluR-B aber einen deutlichen Hinweis auf die Stabilität von dimeren GluR-B Strukturen, die im Einklang mit einer jüngst veröffentlichten Arbeit stehen (Ayalon and Stern-Bach, 2001). Diese Veröffentlichung liefert zusätzliche (Armstrong et al., 1998) Hinweise auf die Bedeutung von Dimeren in der Glutamatrezeptorstruktur und postuliert, dass sich ein kompletter Glutamaterezeptor aus einem Dimer-Paar zusmmensetzt, wobei die Dimere zuerst gebildet werden. Die nachfolgende Abbildung 6.2.B zeigt negativ gefärbte GluR-B Ionenkanäle bei einer 46000× Vergrösserung. Die Aufnahme stammt von einem Philips EM 400 Elektronenmikroskop. Für die 3D Rekonstruktion wurden 500 der in Abbildung 6.2.B gezeigten Rezeptormoleküle ausgewählt. Dieser relativ kleine Datensatz besteht aus GluR-B Ionenkanälen deren Präservierung in Uranylacetat als besonderes vielversprechend eingeschätzt wurde. Dieser positive Effekt wurde auf die Verwendung frisch von einer Wasseroberfläche aufgefischter Kohlefilme zurückgeführt (siehe RESULTS 4.4.3.3.). Während der Klassifizierung dieses Datensatzes fiel auf, dass die beim Band-Pass-Filtern für die niedrigen Frequenzen gesetzten Cut-offs einen deutlichen Einfluss auf die erste Klassifizierung der unterschiedlichen zweidimensionalen Ansichten des Proteinkomplexes haben (siehe RESULTS 4.4.3.4.). Aus diesem Grund wurde der gleiche Datensatz mit 5 verschiedenen low-frequency cut-offs (LFCO) gefiltert (siehe Table 4.4.3.4.) und getrennt klassifiziert. Von den 5 resultierenden Klassifikationen wurden 3 (LFCO 0,005, 0,03 und 0,05) für die weiterführende 3D Rekonstruktion ausgewählt. Die Evaluierung der resultiernden 3D Modelle ergab, dass der mit einem LFCO von 0,03 gefilterte Datensatz eine Klassifikationen erlaubte, die zu einem 3D Modell (Modell GluR-BII/a siehe RESULTS Figure 4.4.3.4.H) führte, das im Vergleich zu den beiden anderen Rekonstruktionen konsistenter war. Am stärksten spricht für dieses Modell die Übereinstimmung der Input-Projektionen mit den Reprojektionen der 3D Rekonstruktion (siehe siehe RESULTS Figure 4.4.3.4.H). Zur Verfeinerung des Modells GluR-BII/a wurden die beiden Projektionen mit der höchsten Standardabweichung vom Klassendurchschnitt (class average) eliminiert. Die verbleibenden 11 Projektionen bildeten die Input-Projektionen für die Berechung eines verfeinerten Modells, GluR-BII/b, das auf einer neuen Zuordnung der Euler-Winkel beruht. Das Ergebnis dieser Berechung ist in der nachfolgenden Abbildung gezeigt. Das Modell in Abbildung 6.2.C zeigt einen zentralen Kanal und hat die Dimensionen 18 nm × 14 nm × 11 nm. Die Stöchiometrie der Untereinheiten ist aus dem Modell, das mit grosser Wahrscheinlichkeit einen komplett zusammengesetzten GluR darstellt, nicht ablesbar. Ebensowenig zeigt das Modell eine eindeutig vierzählige oder fünfzählige Symmetrie. Allerdings ist die erkennbare zweizählige Symmetrie im Einklang mit dem vorgeschlagenen Pair-of-Dimer Modell (Ayalon and Stern-Bach, 2001), das auf eine teramere Struktur des oligomeren Ionenkanals schliessen lässt. Die Ergebnisse dieser Arbeit zeigen, dass stabil transifzierte Insektenzellen eine durchaus geeignete Quelle für GluR-B Ionenkanäle sind. Nachteilig sind die geringen Ausbeuten. Allerdings kann durch weitere Selektion der Zellen die GluR Expression noch gesteigert werden (siehe APPENDIX A.2.2.). Bei höheren GluR-B Ausbeuten könnte zukünftig auch die Detektion des Rezeptors in vitrifizierten Proben in Verbindung mit Kryo-Elektronen- mikroskopie und auch die 2D-Kristallisation gelingen. Die während dieses Projekts gemachten Kristallisationsexperimente (siehe APPENDIX A.3.) und Kryo-Experimente mit GluR-B Protein aus dem Baculovirusexpressionssystem (siehe RESULTS 4.4.1. und 4.4.2.) ergaben negative Ergebnisse. Das Potential der Kryo-Methode konnte allerdings in Kontrollexperimenten mit Tabak-Mosaik-Virus (TMV) gezeigt werden. Kryo-Daten von GluR-B würden die Berechnung eines genaueren Strukurmodells erlauben. Die Reprojektionen des hier besprochenen Strukturmodells GluR-BII/b aus der Abbildung 6.2.C könnten als Referenzen für das Alignment der vitrifizierten GluR Ionenkanäle dienen. Für das langfristige Ziel der Rekonstituition des Rezeptors in Liposomen sollte die Delipidierung des Membranproteins während der Aufreinigung möglichst reduziert werden. Hier erscheinen zwei Ansätze sinnvoll. Die Aufreinigung des Proteins in einem Schritt durch die Erweiterung des tags am Carboxyterminus von nur 6 auf 10 Histidin-Reste. Ausserdem gibt es Hinweise, dass die Anwesenheit von Lipiden während der Aufreinigung für seine Rekonstituierbarkeit förderlich ist (Huganir and Racker, 1982).
More than 70 years ago, the effects of extracellular adenosine 5'-triphosphate (ATP), a newly identified and purified biomolecule at that time (Fiske and Subbarow, 1925; Lohmann, 1929) were observed by Drury and Szent-Györgyi (1929). Since then, many pharmacological studies were carried out with extracellular adenine nucleotides in various intact organ systems, isolated tissues, and purified cell preparations. Yet it was not until 1972 that Burnstock introduced the concept of "purinergic nerves" and suggested that ATP might fulfil the criteria generally regarded as necessary for establishing a substance as a neurotransmitter, summarised by Eccles (1964):
• synthesis and storage of transmitter in nerve terminals
Strips of guinea-pig taenia coli (GPTC) were shown to take up large amounts of tritium-labelled adenosine when incubated with tritium-labelled adenosine, adenosine 5'-monophosphate (AMP), adenosine 5'-diphosphate (ADP) and ATP. The nucleoside was rapidly converted into and retained largely as [ 3 H]-ATP (Su et al., 1971).
• release of transmitter during nerve stimulation
Spontaneous relaxation of GPTC as well as relaxations induced by nerve stimulation or nicotine, respectively, in the presence of compounds which block adrenergic and cholinergic responses were accompanied by a remarkable increase in release of tritium-labelled material from taenia coli incubated in [ 3 H]-adenosine (Su et al., 1971).
• postjunctional responses to exogenous transmitters that mimic responses to nerve stimulation
Burnstock et al. (1966) characterised ATP and ADP as the most potent inhibitory purine compounds in the gut and observed that the effects of ATP mimic more closely the inhibitory response of the taenia to non-adrenergic nerve-stimulation than to adrenergic nerve stimulation (Burnstock et al., 1970).
enzymes that inactivate the transmitter and/or uptake systems for the transmitter or its breakdown products
When ATP was added to a perfusion fluid recycled through the vasculature of the stomach, very little ATP remained, but the perfusate contained substantially increased amounts of adenosine and inosine, as well as some ADP and AMP (Burnstock et al., 1970).
• drugs that can produce parallel blocking of potentiating effects on the responses of both exogenous transmitter and nerve stimulation
Tachyphylaxis to ATP produced in the rabbit ileum resulted in a consistent depression of responses to non-adrenergic inhibitory nerve stimulation, whereas responses to adrenergic nerve stimulation remained unaffected (Burnstock et al., 1970). Lower concentrations of quinidine reduced and finally abolished relaxation of GPTC induced by noradrenaline (NA) and by adrenergic nerve stimulation. Using higher concentrations of the compound, relaxant responses of GPTC to ATP as well as to non-adrenergic inhibitory nerve stimulation were abolished (Burnstock et al., 1970). ...
Human epidermal-type fatty acid binding protein (E-FABP) belongs to a family of intracellular non-enzymatic 14-15 kDa lipid binding proteins (LBP) that specifically bind and facilitate the transport of fatty acids, bile acids or retinoids. Their functions have also been associated with fatty acid signalling, cell growth, regulation and differentiation. As a contribution to better understand the structure-function relationship of this protein, the features of its solution structure determined by NMR spectroscopy are reported here. Both unlabeled and 15N-enriched samples of recombinant human E-FABP were used for multidimensional high-resolution NMR. The sequential backbone as well as side-chain resonance assignments have been completed. They are reported here and are also available at the BioMagResBank under the accession number BMRB-5083. The presence of six cysteines in the amino acid sequence of human E-FABP is highly unusual for LBPs. Four of the six cysteines are unique to the E-FABPs: C43, C47, C67 and C87. In the three-dimensional structure of E-FABP, two cysteine pairs (C67/C87 and C120/C127) were identified by X-ray analysis to be close enough to allow disulfide bridge formation, but a S-S bond was actually found only between C120 and C127 [Hohoff et al., 1999]. Since the exclusion of a disulfide bridge between C67 and C87 improved the Rfree factor of the crystallographic model, the existence of a covalent bond between these two side- chains was considered unlikely. This agrees with the NMR data, where SCH resonances have been observed for the cysteine residues C43, C67 (tentative assignment) and C87, thus excluding the possibility of a second disulfide bridge in solution. Based on the NOE and hydrogen exchange data, an ensemble of 20 energy-minimized conformers representing the solution structure of human E-FABP complexed with stearic acid has been obtained. The analysis of homonuclear 2D NOESY and 15N-edited 3D NOESY spectra led to a total of 2926 NOE-derived distance constraints. Furthermore, 37 slow- exchanging backbone amide protons were identified to be part of the hydrogen-bonding network in the >-sheet and subsequently converted into 74 additional distance constraints. Finally, the disulfide bridge between C120 and C127 was defined by 3 upper and 3 lower distance bounds. The structure calculation program DYANA regarded 998 of these constraints as irrelevant, i.e., they did not restrict the distance between two protons. Out of the remaining 2008 non-trivial distance constraints, 371 were intraresidual (i = j), 508 sequential (|i - j| = 1), 233 medium-range (1 < |i - j| £ 4), and 896 long-range (|i - j| > 4) NOEs. The protein mainly consists of 10 antiparallel -strands forming a >-barrel structure with a large internal cavity. The three-dimensional solution structure of human E-FABP has been determined with a root-mean-square deviation of 0.92 ± 0.11 Å and 1.46 ± 0.10 Å for the backbone and heavy atoms, respectively, excluding the terminal residues. Without the portal region (i.e., for residues 4-26, 40-56, 63-75 and 83-134; the portal region apparently represents the only opening in the protein surface through which the fatty acid ligand can enter and exit the internal binding cavity), an average backbone RMSD of 0.85 ± 0.10 Å was obtained, thus reflecting the higher conformational dispersion in the portal region. Superposition with the X-ray structure of human E-FABP (excluding the terminal residues) yielded average backbone RMSD values of 1.00 ± 0.07 Å for the entire residue range and 0.98 ± 0.06 Å without the portal region. This indicates a close similarity of the crystallographic and the solution structures. The structure coordinates have been deposited at the RCSB data bank under PDB ID code 1JJJ. The measurement of 15N relaxation experiments (T1, T2 and heteronuclear NOE) at three different fields (500, 600 and 800 MHz) provided information on the internal dynamics of the protein backbone. Nearly all non-terminal backbone amide groups showed order parameters S2 > 0.8, with an average value of 0.88 ± 0.04, suggesting a uniformly low backbone mobility in the nanosecond-to-picosecond time range throughout the entire protein sequence. Moreover, hydrogen/deuterium exchange experiments indicated a direct correlation between the stability of the hydrogen-bonding network in the >-sheet structure and the conformational exchange (Rex) in the millisecond-to-microsecond time range. The features of E-FABP backbone dynamics elaborated here differ from those of the phylogenetically closely related heart-type FABP and the more distantly related ileal lipid binding protein. The results on protein dynamics obtained in this work allow to conclude that the different LBP family members E-FABP, H-FABP and ILBP are characterized by varying stabilities in the protein backbone structures. Hydrogen/deuterium exchange experiments displayed significant differences in the chemical exchange with the solvent for the backbone amide protons belonging to the hydrogen-bonding network in the >-sheets. The >-barrel structure of H- FABP appears to be the most rigid, with exchange processes presumably slower than the millisecond-to-microsecond time range. ILBP, on the other hand, shows the fastest hydrogen exchange as well as a significant number of exchange parameters (Rex), implying a decreased stability in the >-sheet structure. E-FABP, finally, appears to rank between these two proteins based on the hydrogen/deuterium exchange, with Rex terms in the >-strands indicating millisecond-to-microsecond exchange processes like in ILBP.
Die Beschäftigung mit Muskarinrezeptoren reicht bis in das vergangene Jahrhundert zurück als, in Folge der verschiedenen Wirkungen des Neurotransmitters Acetylcholin, einerseits Nikotin- und andererseits Muskarinrezeptoren sowie deren Subtypen entdeckt und charakterisiert werden konnten. Aufgrund der weiten Verbreitung von Muskarinrezeptoren innerhalb des zentralen und peripheren Nervensystems sowie in entsprechend innervierten Organen sind diese nach wie vor als Target für bestimmte klinische Indikationen von großem Interesse. Besonders im Bereich der chronisch obstruktiven Atemwegserkrankungen (COPD) sind Bronchodilatoren Mittel der Wahl. Obwohl die derzeitige Behandlungsstrategie im wesentlichen auf dem Einsatz des unselektiven muskarinischen Antagonisten Ipratropiumbromid, allein oder in Kombination mit einem kurzwirksamen b2-Sympathomimetikum, beruht, ist ihr Einsatz aufgrund der dabei auftretenden unerwünschten Nebenwirkungen limitiert. Neben M3- Rezeptoren findet man in der menschlichen Lunge auch präsynaptische M2- Rezeptoren, deren Blockade zu einem Anstieg der Acetylcholinfreisetzung führt. Demzufolge würde die Entwicklung eines hochselektiven und/oder langwirksamen muskarinischen M3-Rezeptorantagonisten einen großen Fortschritt für die Behandlung von Patienten mit COPD und auch Asthma bedeuten. Untersuchung der Stereoisomere des Glycopyrroniumbromids und der entsprechenden tertiären Analoga: Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurden sowohl die vier reinen Stereoisomere des Glycopyrroniumbromids als auch die entsprechenden vier tertiären Analoga untersucht. Bislang wird das Diastereomerengemisch (RS/SR), das als RobinulÒ im Handel ist, vorwiegend als Antisialagogum in der Prämedikation der Narkose oder als Spasmolytikum therapeutisch eingesetzt. Die molekulare Struktur des Glycopyrroniumbromids weist zwei Chiralitätszentren auf, woraus sich vier stereoisomere Verbindungen ergeben. Die pharmakologische Untersuchung sowohl der quartären als auch der korrespondierenden tertiären Isomere in den funktionellen Standardmodellen, Kaninchen-Vas-deferens für M1-Rezeptoren, linker Vorhof des Meerschweinchenherzens für M2-Rezeptoren und die Längsmuskulatur des Meerschweinchenileum für M3-Rezeptoren, ergab, dass sich alle Verbindungen an den untersuchten Muskarinrezeptorsubtypen als potente Antagonisten verhielten. Ihre Rezeptorselektivität war jedoch relativ gering, wobei im Allgemeinen die niedrigste Affinität zum M2-Rezeptor beobachtet wurde. Innerhalb der Stereoisomeren zeigten die (R/R')- und (S/R')-konfigurierten Verbindungen den stärksten, die (S/S')-konfigurierten Isomere hingegen den geringsten antagonistischen Effekt. Diese Ergebnisse konnten durch Radioligand- Bindungsstudien bestätigt werden. Bemerkenswert war jedoch, dass insbesondere am M3-Rezeptor eine extrem langsame Dissoziation der Substanzen vom Rezeptor festgestellt wurde. Verbunden mit der hohen Affinität und der in Bindungsstudien ermittelten Dissoziationshalbwertszeit von 120 min könnte das quartäre (R/R')-konfigurierte Stereoisomer des Glycopyrroniumbromids eine geeignete Alternative zur Behandlung der COPD darstellen: Die lange Halbwertszeit sollte eine Einmalgabe pro Tag erlauben und somit die Patientencompliance erhöhen, die hohe Affinität eine geringe Dosierung ermöglichen und die kinetische Selektivität' sowie die quartäre Struktur könnten zur Minimierung unerwünschter Nebenwirkungen führen. Aufgrund dieser Vorteile wurde die Substanz patentiert und der pharmazeutischen Industrie für weiterführende Untersuchungen zur Verfügung gestellt. Untersuchungen an der Längsmuskulatur des Meerschweinchenileum in Hinblick auf die Verteilung von P2-Rezeptoren: Aufgrund der Pionierarbeit, die Ende der 70er Jahre von Burnstock und seinen Mitarbeitern geleistet wurde, wandelte sich das Bild von ATP als einer Energiequelle der Zelle zu einem Neurotransmitter ubiquitären Vorkommens mit entsprechenden Zielstrukturen, den P2-Rezeptoren. Inzwischen ist allgemein anerkannt, dass zwischen metabotropen P2Y-Rezeptoren und ionotropen P2X- Rezeptoren unterschieden werden kann. Mit Hilfe von Klonierungstechniken konnte diese Klassifizierung validiert und außerdem eine Vielzahl unterschiedlicher Subtypen identifiziert werden. Bis heute wurden sieben P2X- (P2X1-7) und sechs P2Y- Rezeptorsubtypen (P2Y1, P2Y2, P2Y4, P2Y6, P2Y11, P2Y12) kloniert und pharmakologisch charakterisiert. Sie gelten unumstritten als Vertreter der P2-Rezeptorfamilie. Heute besteht eine der größten Herausforderungen auf diesem sich explosionsartig expandierendem Gebiet darin, die geklonten P2-Rezeptoren mit den verschiedenen physiologischen Antworten, die durch native P2-Rezeptoren vermittelt werden, in Einklang zu bringen. Da die Längsmuskulatur des Meerschweinchenileum ein bekanntes Modell, z.B. für Untersuchungen an Muskarinrezeptoren, darstellt, war das Ziel der vorliegenden Arbeit, dieses Modell in Bezug auf die Verteilung von P2-Rezeptoren hin zu untersuchen. Neben Agonisten, die eine Präferenz für entweder ionotrope (a,b-meATP) oder metabotrope (ADPbS) P2-Rezeptoren aufweisen, wurden im wesentlichen eine Reihe gut untersuchter Antagonisten mit zum Teil hoher Affinität für einen Rezeptorsubtyp für die funktionellen Untersuchungen verwendet. Die neuronale Lokalisation des P2X-Rezeptors konnte durch die komplette Aufhebung der durch a,b-meATP-vermittelten Kontraktionen nach Zugabe von TTX charakterisiert werden. Die ebenfalls fast vollständige Hemmung der Kontraktion nach Einsatz von Atropin wies auf einen indirekten, durch Acetylcholin vermittelten Effekt hin. Aufgrund dieser Beobachtungen wurden sämtliche Versuche mit P2-Antagonisten unter Zusatz von 70 µM Physostigmin in der Nährlösung durchgeführt. Die eingesetzten Antagonisten Suramin, NF023 und NF279 erwiesen sich als kompetitive Antagonisten, während PPADS neben der Rechtsverschiebung einen Maximumabfall der Agonistenkurven bewirkte. Ein Vergleich der funktionell ermittelten pA2-Werte mit den Wirkstärken an rekombinanten P2-Rezeptoren von Ratte und Mensch lässt vermuten, dass es sich hierbei um einen P2X3- Rezeptorsubtyp handelt, der über die Freisetzung von Acetylcholin eine Kontraktion der glatten Muskulatur über einen indirekten Mechanismus auslöst. Da sich P2X-Rezeptoruntereinheiten neben homomeren auch zu heteromeren, funktionell aktiven Kanälen vereinen können, könnte es sich bei dem vorliegenden soma-dendritischen P2X-Rezeptor aber auch um ein Heteromer handeln, bei dem der P2X3-Rezeptor den Phänotyp bestimmt. Solange noch keine eindeutige Identifizierung dieses Rezeptors speziesspezifisch auf molekularer Ebene erfolgt ist, sollte man deshalb die Bezeichnung P2X3(-ähnlicher)-Rezeptor verwenden. Es konnte gezeigt werden, dass eine Stimulation des präsynaptischen P2X3(- ähnlichen)-Rezeptors zur Ausschüttung von Acetylcholin führt, das wiederum postsynaptisch einen kontraktionsvermittelnden Muskarinrezeptor aktiviert. Um zu beweisen, dass es sich dabei um denselben Muskarinrezeptorsubtyp handelt, der bereits auf direktem Weg durch APE oder mittels EFS als M3-Rezeptor charakterisiert werden konnte, wurden die Affinitäten muskarinischer Antagonisten als Kriterien herangezogen. Die erhaltenen Korrelationen wiesen eindeutig darauf hin, dass dieser postsynaptisch im GPI lokalisierte Muskarinrezeptor dem nativen und rekombinanten, kontraktionsvermittelnden M3-Rezeptorsubtyp entspricht. Durch Zugabe von ADPbS konnten im GPI Kontraktionen ausgelöst werden, die allerdings mit TTX und Atropin nur zum Teil gehemmt wurden. Diese Beobachtungen führten zu der Erkenntnis, dass postsynaptisch P2Y-Rezeptoren lokalisiert sind. Ihre Subtypcharakterisierung erfolgte unter Zusatz von 0.3 µM Atropin in der Nährlösung, um den Einfluss der neuronalen P2X3-Rezeptoren zu unterbinden. Suramin, NF023 und NF279 zeigten wiederum einen kompetitiven Antagonismus gegen ADPbS, während PPADS auch hier eine Rechtsverschiebung mit Maximumdepression der Agonistenkurve hervorrief. Ein erneuter Vergleich mit beschriebenen Affinitätswerten von rekombinanten P2- Rezeptoren ließ den Schluss zu, dass der im GPI postsynaptisch gefundene P2Y- Rezeptor Eigenschaften des P2Y1-Rezeptorsubtyps aufweist. Eine Bestätigung dafür gaben außerdem die P2Y1-selektiven Bisphosphate A3P5P und MRS2179, obgleich sie geringere pIC50-Werte aufzeigten als in der Literatur beschrieben. Mit der Charakterisierung des neuronalen P2X3-Rezeptors und des postsynaptischen P2Y1-Rezeptors ist das GPI ein bisher einzigartiges funktionelles pharmakologisches Modell, in dem beide P2-Rezeptorsubtypen durch Einsatz des jeweiligen Agonisten, a,b-meATP oder ADPbS, pharmakologisch isoliert werden können. Charakterisierung von P2-Rezeptoren in der Längsmuskulatur des Rattenileum: Eine im Vergleich zum GPI gänzlich andere Situation zeigte sich im RI. Die getesteten P2-Agonisten ADPbS, a,b-meATP, a,b-meADP und ATPgS erzeugten Kontraktionen im untersuchten Gewebe, wobei sich a,b-meATP als effektivster Agonist erwies. Im Unterschied zum GPI führte eine wiederholte Gabe von a,b- meATP allerdings nicht zu einer Desensibilisierung des Rezeptors. Die durch Zugabe von TTX und Atropin erreichte Kontraktionshemmung lässt auf das Vorhandensein von sowohl prä- als auch postsynaptischen P2X-Rezeptoren schließen. Eine Trennung der durch diese Rezeptoren hervorgerufenen Effekte war im funktionellen Experiment jedoch nicht durchführbar. Keinerlei Effekt zeigte allerdings der Zusatz von TTX und Atropin auf die durch ADPbS ausgelösten Kontraktionen. Suramin, NF023 und PPADS erwiesen sich als sehr schwache Antagonisten an diesem Präparat. Auffällig war hingegen, dass die durch den Antagonisten verschobenen Kurven jeweils steiler und im Maximum höher waren als die Kontroll-Agonistenkurve. Man kann also hier nur spekulieren, dass durch die Antagonisten zunächst ein relaxationsvermittelnder Rezeptor geblockt wurde und in Folge nur noch der Effekt des kontraktionsvermittelnden Rezeptors sichtbar war. Obwohl Gewebe der Ratte häufig als funktionelle Modelle in der experimentellen Pharmakologie eingesetzt werden, konnten auf Grund fehlender subtypselektiver Agonisten und Antagonisten die kontraktionsvermittelnden P2-Rezeptorsubtypen im RI nicht identifiziert werden. Des weiteren zeigt ein Vergleich mit dem GPI, dass bedeutende Unterschiede bei der Verwendung gleichen Gewebes zweier verschiedener Spezies existieren können, die bei der vergleichenden Betrachtung von Affinitätswerten von Agonisten und Antagonisten zur Charakterisierung von Rezeptorsubtypen beachtet werden müssen.
Die vorliegende Arbeit liefert einen Beitrag zum Verständnis der Rolle des RO x bei der troposphärischen Ozonbildung. Troposphärisches Ozon (O 3 ) spielt eine wichtige Rolle bei der Selbstreinigung der Atmosphäre. Andererseits führen erhöhte Ozonkonzentrationen zu gesundheitlichen Beeinträchtigungen beim Menschen und Schäden an Pflanzen und Umwelt. Die Anwesenheit von flüchtigen organischen Verbindungen (VOCs) führt zur Bildung von Peroxyradikalen (RO x ), die das normale photochemische Gleichgewicht zwischen Ozon und Stickoxiden zu Gunsten erhöhter OzonKonzentrationen verschieben. Im Rahmen der Arbeit wurde ein chemischer Verstärker zur Messung der GesamtPeroxyradikalkonzentration gebaut. RO x reagiert im Einlass des Gerätes mit hinzugefügtem NO und CO in einer Kettenreaktion und bildet dabei NO 2 . Dieses wird mit einem Luminoldetektor nachgewiesen. Der Detektor wird alle 2 Stunden kalibriert. Die Kettenlänge wird durch eine Kalibrierung des Gerätes mit HO 2 Radikalen bestimmt, die durch die Photolyse von H 2 O gebildet werden. Der Verstärkungsfaktor wurde in Bezug auf eine Querempfindlichkeit gegen Wasserdampf korrigiert. Die Messgenauigkeit ist etwa 70% bei 60% relativer Feuchte. Messungen am Taunus Observatorium auf dem Kleinen Feldberg in den Sommermonaten der beiden Jahre 1998 und 1999 werden vorgestellt. Die Ozon und RO x Konzentrationen sind gut miteinander korreliert. Allerdings ist die Tagestemperatur die für die Ozon und RO x Konzentrationen bei weitem wichtigste Einflussgröße und ist daher der beste Parameter zur statistischen Beschreibung von photochemischen Vorgängen. Auf der Grundlage der Messungen am Kleinen Feldberg wurde ein einfaches statistisches Modell zur Vorhersage des Ozonmaximums erstellt. Mit den Parametern Temperatur und Ozonkonzentration am Vortag konnte das statistische Modell bereits 80% der Variation der Ozonkonzentration erklären. Durch die Berücksichtigung der RO x Messungen am Vormittag konnte lediglich eine Verbesserung der erklärten Varianz um 0.5% erzielt werden. Um einen Hinweis auf den Einfluss anthropogener Emissionen zu bekommen, wurde der Wochengang von Ozon, RO x und NO x ebenfalls untersucht. Die Zunahme des Ozonmischungsverhältnisses am Wochenende bei gleichzeitigem Rückgang des Mischungsverhältnisses der Stickoxide wird damit erklärt, dass am Kleinen Feldberg eine VOClimitierte Situation vorgefunden wurde. Die Ozonbildungsrate auf Basis der Reaktion zwischen RO x und NO wurde für Tage mit einem Maximum der Globalstrahlung über 600 W m tdatensatz niedrig (r = 0,46). Die beobachtete Änderung des Ozonmischungsverhältnisses wurde mit dem berechneten mittleren Tagesgang der Ozonbildungsrate verglichen. Die Ozonbildungsrate lag um die Mittagszeit bei etwa 5 ppbv h Verlustprozesse zu erklären. Am Abend werden etwa 2 ppbv O 3 pro Stunde abgebaut. Im Rahmen einer Messkampagne im Juni/Juli 2000 am Meteorologischen Observatorium Hohenpeißenberg fanden Messungen der Konzentrationen von RO x , OH, einer Reihe von VOCs, und anderen relevanten Spurengasen statt. Die Messdaten werden mit Hilfe eines auf der Annahme des lokalen photostationären Gleichgewichts der Radikale basierenden Modells interpretiert. Die Modellergebnisse stimmten sehr gut mit den Messungen überein. Die Überschätzung der Konzentration an 2 Tagen wurde durch den Einfluss sauerstoffhaltiger VOCs erklärt. Das '' Recycling" der HO 2 Radikale (die Reaktion zwischen HO 2 und NO) ist die wichtigste Quelle für OH und die wichtigste Senke für RO x . Durch die erhöhte NOKonzentration am Vormittag wird HO 2 sehr schnell in OH umgewandelt, das wiederum für die VOCOxidation und RO x Bildung verantwortlich ist. Die wichtigste OHSenke und RO x Quelle ist die Oxidation von Isopren und den Terpenen. Um die Rolle der photochemischen Ozonbildung auf regionaler Skala zu untersuchen, wurden Ozonmessungen aus ganz Deutschland auf unterschiedlichen zeitlichen und räumlichen Skalen statistisch untersucht. Die Netto Änderungsrate der Ozonkonzentration war tagsüber an 3 nahe zusammenliegenden Stationen sehr ähnlich. Die OzonMessdaten von 277 deutschen Messstationen wurden mit den an einer Waldmessstelle nahe Königstein gemessenen Ozonwerten korreliert. Die Ozonmessungen in Königstein erklären 50% der Varianz der sommerlichen Ozonmessungen zwischen 11:00 und 16:00 MEZ an Stationen, die in einem Umkreis von etwa 250 km von Königstein liegen. Auf das ganze Jahr bezogen, liegt diese ''charakteristische Entfernung" bei etwa 350 km. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass die Prozesse, die einen wichtigen Einfluss auf die Ozonkonzentration ausüben, auf regionalen Skalen von einigen hundert Kilometern aktiv sind. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass die gemessenen RO x Konzentrationen mit den aufgrund der Oxidation der VOCs durch OH berechneten Konzentrationen konsistent sind. Obwohl die RO x Konzentationen für die chemische Modellierung von Bedeutung sind, tragen RO x Messungen nur wenig zu einer Verbesserung der Qualität von kurzfristigen statistischen Ozonprognosen bei. Keywords: Ozone, Troposphere, Peroxy Radicals, Free Radicals, Photochemistry, Chemical Amplifier
Informally, commitment schemes can be described by lockable steely boxes. In the commitment phase, the sender puts a message into the box, locks the box and hands it over to the receiver. On one hand, the receiver does not learn anything about the message. On the other hand, the sender cannot change the message in the box anymore. In the decommitment phase the sender gives the receiver the key, and the receiver then opens the box and retrieves the message. One application of such schemes are digital auctions where each participant places his secret bid into a box and submits it to the auctioneer. In this thesis we investigate trapdoor commitment schemes. Following the abstract viewpoint of lockable boxes, a trapdoor commitment is a box with a tiny secret door. If someone knows the secret door, then this person is still able to change the committed message in the box, even after the commitment phase. Such trapdoors turn out to be very useful for the design of secure cryptographic protocols involving commitment schemes. In the first part of the thesis, we formally introduce trapdoor commitments and extend the notion to identity-based trapdoors, where trapdoors can only be used in connection with certain identities. We then recall the most popular constructions of ordinary trapdoor protocols and present new solutions for identity-based trapdoors. In the second part of the thesis, we show the usefulness of trapdoors in commitment schemes. Deploying trapdoors we construct efficient non-malleable commitment schemes which basically guarantee indepency of commitments. Furthermore, applying (identity-based) trapdoor commitments we secure well-known identification protocols against a new kind of attack. And finally, by means of trapdoors, we show how to construct composable commitment schemes that can be securely executed as subprotocols within complex protocols.
Alignment, characterization and application of polyfluorene in polarized light-emitting devices
(2001)
Ziel im Rahmen der vorliegenden Dissertation war die Realisierung der polarisierten Elektrolumineszenz blau emittierender flüssigkristalliner Polyfluorene. Polymere Leuchtdioden, die aufgrund hoher Orientierung der Moleküle in der aktiven Schicht polarisiert emittieren, sind für eine Anwendung beispielsweise als Hintergrundbeleuchtung in Flüssigkristallanzeigen (LCDs) von Interesse. Es wurde gezeigt, dass sich mit der Ausrichtung von Polyfluoren auf Ori entierungsschichten auf der Basis von geriebenem Polyimid hohe Ordnungsgrade erzielen lassen. Die Dotierung mit lochleitenden Materialien erlaubte erstmals den Einbau solcher Orientierungsschichten in Leuchtdioden und ermöglichte die Realisierung polarisierter Elektrolumineszenz. Die Morphologie und Struktur sowohl der hoch orientierten Polyfluoren filme als auch lochleitender Orientierungsschichten wurden eingehend untersucht. Die ElektrolumineszenzEigenschaften von isotropen sowie polarisierten Leuchtdioden wurden ausführlich analysiert und anschließend durch chemische Modifizierung des Polyfluorens entscheidend verbessert. Zusätzlich wurde Polyfluoren mit fluoreszierenden Farbstoffen dotiert, um ausgehend von blauem Licht grüne und rote Emission zu erhalten. Hierbei wurde unter sucht, in welchem Maß FörsterEnergietransfer sowie Ladungsträgereinfang für die Emission der eingemischten Farbstoffe verantwortlich sind. Eine Einführung in die Grundlagen der Elektrolumineszenz konjugierter Polymere findet sich in Kapitel 2 dieser Arbeit. Da polarisierte Elektrolumineszenz ein hohes Maß an Anistotropie der emittierenden Schicht erfordert, werden anschließend verschiedene Methoden zur Ausrichtung von Polymeren besprochen, wobei besondere Betonung auf der Orientierung flüssigkristalliner Polymere liegt. Kapitel 3 behandelt die signifikanten Eigenschaften der Polymere sowie die experimentel len Methoden, die im Rahmen dieser Arbeit verwendet wurden. Neben Polyfluoren wird ein weiteres blau emittierendes Polymer, Polyphenylenethynylen (PPE), eingeführt. Bei der Cha rakterisierung der Polyfluorene wird im Anschluss an die Beschreibung der reinen Polymere insbesondere der positive Einfluss des Anbringens von lochleitende Endgruppen an die Hauptkettenenden auf wesentliche Eigenschaften bezüglich der Elektrolumineszenz aufgezeigt. Außerdem werden die wesentlichen Merkmale von Polyimid, welches die Matrix der Orientierungsschicht bildet, sowie von verschiedenen Polymeren, die der Lochleitung und der Lochinjektion dienen, besprochen. Die Beschreibung der Methoden zur Präparation isotroper und polarisierter Leuchtdioden sowie zur Untersuchung der optischen, elektrischen und mor phologischen Eigenschaften der Polymerfilme bilden den Abschluss dieses Abschnitts. Im vierten Kapitel dieser Arbeit werden unterschiedliche Verfahren zur Ausrichtung der Polymermoleküle auf Polyfluoren sowie auf PPE angewandt und hinsichtlich der erreichbaren Ordnungsgrade verglichen und beurteilt. Im Falle von Polyfluoren wurde gezeigt, dass eine Orientierung im flüssigkristallinen Zustand mit Hilfe zusätzlicher Orientierungsschichten, welche auf geriebenem Polyimid basieren, die einzige geeignete Methode zur Orientierung dieses Po lymers ist. Durch den Zusatz von niedrigmolekularen lochleitenden Materialien in geeigneter Konzentration in die PolyimidMatrix konnte das nichtleitende Polyimid so modifiziert wer den, dass es sich in Leuchtdioden einbinden ließ, ohne dass die Orientierungseigenschaften der Schichten verloren gingen. Vergleiche unterschiedlicher Polyfluorene ergaben, dass die Länge und Struktur der AlkylSeitenketten das Orientierungsverhalten entscheiden beeinflussen. Hierbei wurde gezeigt, dass sich für verzweigte Seitenketten deutlich höhere Orientierungsgrade erreichen lassen als für solche mit linearen Seitenketten. Dies wurde mit dem vergrößerten Verhältnis aus Persistenzlänge und Polymerdurchmesser erklärt, was gemäß der Theorie der flüssigkristallinen Polymere zu einer Zunahme des erreichbaren Ordnungsparameter führt. Außerdem wiesen die Absorptionsspektren der Polyfluorene mit langen Seitenketten auf eine planare Konformation der Polymerrückgrate hin, welche aufgrund der starken Wechselwirkung zwischen den einzelnen Ketten eine Orientierung im flüssigkristallinen Zustand verhindert. Von allen untersuchten Polyfluorenen ließ sich Poly(diethylhexylfluoren) (PF2/6) am besten orientieren. Im Gegensatz zu Polyfluoren scheiterte der Versuch, PPE im flüssigkristallinen Zustand auf Orientierungsschichten auszurichten. Kalorimetrische DSCUntersuchungen machten deutlich, dass sich die Struktur von PPE in flüssigkristalliner und kristalliner Phase nur unwesentlich voneinander unterscheiden. In beiden Phasen deuteten Absorptionsuntersuchungen auf eine planare Konformation der PPERückgrate. Die Viskosität des als sehr steif bekannten Polymers PPE ist daher auch in flüssigkristallinem Zustand zu hoch, um eine Umordnung der Moleküle zu verursachen, welche allein durch Wechselwirkung mit einer Orientierungsschicht hervorgerufen wird. PPE konnte jedoch im kristallinen Zustand orientiert werden, indem anstatt einer zusätzlichen Orientierungsschicht der Polymerfilm selbst gerieben wurde. Die hohe Steifigkeit von PPE erlaubte die Übertragung der Kräfte, die durch das Reiben verursacht werden, auf das starre Polymerrückgrat und ermöglichte eine homogene Ausrichtung der Moleküle. Mit Hilfe dieser Methode konnten Leuchtdioden mit PPE in der aktiven Schicht verwirklicht werden, die polarisiert emittierten. Die bestmöglichen Methoden zur Ausrichtung der Moleküle unterschie den sich demnach für die beiden flüssigkristallinen Polymere Polyfluoren und PPE, und für beide Polymere wurden Verfahren gefunden, die die Herstellung von polarisierten Leuchtdioden ermöglichten. In Kapitel 5 dieser Arbeit werden die Morphologie, die Struktur sowie weitere wesentliche Eigenschaften sowohl orientierter Polyfluorenfilme als auch der zur Ausrichtung benötigten lochleitenden Orientierungsschichten aus dotiertem Polyimid besprochen. Hierfür wurden die Filme mit Hilfe von Licht und Elektronenmikroskopie sowie von Elektronen und Röntgen beugungsexperimenten untersucht. Im ersten Teil wird die beobachtete Abnahme der Orien tierbarkeit von Polyfluoren mit zunehmendem Molekulargewicht durch Elektronenbeugungs untersuchungen näher beschrieben. Ergebnisse aus TransmissionsElektronenmikroskopie Untersuchungen zeigten, dass sich die Morphologie orientierter PF2/6Filme durch hochgeordnete Lamellen auszeichnet, welche in regelmäßigen Abständen von ungeordneten Regionen unterbrochen werden. Innerhalb der orientierten Lamellen sortieren sich die Moleküle nach ähnlicher Kettenlänge, wohingegen in den ungeordneten Gebieten vornehmlich die Endgruppen der Ketten vorzufinden sind. Strukturuntersuchungen ergaben, dass die einzelnen Polymerketten von PF2/6 zylindrisch sind und eine hexagonale Packung aufweisen, wobei die Polymerrück grate eine 5/2Helixstruktur bilden. Das wurmähnliche Rückgrat ist dabei zylinderförmig von einer Hülle aus ungeordneten Seitenketten umgeben, die ähnlich wie ein Lösungsmittel zwi schen den einzelnen Ketten wirken. Die hieraus folgende geringe Viskosität des Polymers dient als Erklärung für die beobachtete bessere Orientierbarkeit von PF2/6 im Vergleich zu Polyfluoren mit linearen OktylSeitenketten oder zu PPE. Im zweiten Teil des fünften Kapitels werden Ergebnisse von Untersuchungen der lochlei tenden Orientierungsschichten vorgestellt. Der Einfluss der Zugabe von lochleitenden Materialien zu Polyimid auf mechanische sowie auf elektrische Eigenschaften wurde untersucht. Bei moderater LochleiterKonzentration war die mechanische Stabilität der Filme ausreichend, um nach dem Reiben keine merklichen Unterschiede zu undotierten geriebene Filmen aufzuweisen. Vergleiche entsprechender Filme hinsichtlich Ladungsinjektion und transport zeigten, dass erst durch die Dotierung eine Verwendung von PolyimidOrientierungsschichten in Leuchtdioden ermöglicht wird. Sowohl polymere als auch niedrigmolekulare lochleitende Materialien wur den hinsichtlich der erreichbaren Orientierungsgrade sowie der resultierenden ElektrolumineszenzEigenschaften verglichen, wobei nur letztere in beiden Belangen zugleich zu vorteilhaften Ergebnissen führten. Es wurde gezeigt, dass sich die besten Resultate mit polarisierten Leuchtdioden erzielen ließen, bei denen die emittierende Schicht auf eine DoppelschichtStruktur aufgebracht war, die der Lochinjektion und der Orientierung dienten. Hierbei befand sich oberhalb einer LochinjektionsSchicht aus reinem Lochleitermaterial eine weitere lochleitende Orientie rungsSchicht aus dotiertem Polyimid. Variation der Lochleiterkonzentrationen in Polyimid er gaben, dass die Helligkeit mit zunehmender Konzentration zunahm, wohingegen die erreichten Polarisationsverhältnisse gleichzeitig abnahmen. SEM und AFMUntersuchungen über den Einfluss der Lochleiterkonzentration auf die Schichtmorphologie ergaben, dass diese Beobachtungen durch Phasenseparation und mechanische Beschädigung der Filme zu erklären ist, welche bei Konzentrationen oberhalb 20 Gewichtsprozent eintreten. Im Kapitel 6 wird schließlich die Elektrolumineszenz von Leuchtdioden mit Polyfluoren als emittierende Schicht diskutiert. Zuerst wurde in isotropen Leuchtdioden die günstigste Diodenarchitektur ermittelt sowie die Optimierung der verwendeten Schichten vorgenommen. Die Ergebnisse wurden mit den Kenntnissen kombiniert, die im Rahmen der oben beschriebenen Untersuchungen erworben wurden, um die Herstellung von Leuchtdioden mit hochpolarisierter Emission zu verwirklichen. Blaue Elektrolumineszenz mit einem Emissionsmaximum von 450 nm und einem Polarisationsverhältnis von 21 wurden erzielt, wobei die Leuchtdichte bei einer angelegten Spannung von 18 V etwa 100 cd/m 2 betrug, was der typischen Helligkeit eines Computermonitors entspricht. Alle ElektrolumineszenzEigenschaften ließen sich durch End funktionalisierung des Polyfluorens weiter deutlich verbessern, indem lochleitende TriarylaminDerivate an die Enden der Hauptketten angebracht wurden ('Endcapping'). Der unerwünschte Beitrag zur Emission bei höheren Wellenlängen, welcher im Falle des reinen Polyfluoren beo bachtet wurde und gemeinhin aggregierten Polymermolekülen zugeschrieben wird, wurde durch das Konzept der Endfunktionalisierung wirksam unterdrückt. Außerdem war die Farbstabilität wesentlich verbessert und die Effizienz der Leuchtdioden um mehr als eine Größenordnung höher als bei der Verwendung des reinen Polyfluorens. Diese Beobachtungen wurden mit den elektrochemischen Eigenschaften der Endgruppen erklärt. Letztere wirken als anziehende Fallen für Ladungsträger, was dazu führt, dass die Erzeugung von Exzitonen und die anschließende Rekombination vorwiegend in der Nähe der Kettenenden stattfindet, anstatt wie im Falle des reinen Polyfluorens an weniger effizienten Aggregaten oder Exzimererzeugenden Stellen. Es wurde gezeigt, dass die Endfunktionalisierung weder das Verhalten des Polymers im flüssig-kristallinen Zustand, noch dessen Orientierbarkeit beeinträchtigte. Die Verwendung des modifizierten Polyfluorens erlaubte die Herstellung von polarisierten Leuchtdioden mit einem Polarisationsverhältnis von 22 und einer Leuchtdichte von 200 cd/m 2 bei 19 V, wobei die Schwellspannung auf 7,5 V gesenkt wurde. Dioden mit einem Anisotropiefaktor von 15 er reichten Leuchtdichten von bis zu 800 cd/m 2 . Die Effizienz dieser Leuchtdioden war mit 0,25 cd/A bei ähnlichem Polarisationsverhältnis und Leuchtdichte um mehr als doppelt so hoch wie die bisher berichteten Werte. Die Veränderung der eigentlich blauen Emissionsfarbe durch die Zugabe von Materialien mit niedrigerer Bandlücke in eine Polyfluorenmatrix wird im Kapitel 7 beschrieben. Es wurde gezeigt, dass der Zusatz bereits geringer Konzentrationen eines grün emittierenden Thiophen Farbstoffes das Emissionsspektrum des Polyfluorens entscheidend veränderte und die Realisierung grüner Emission ermöglichte. Genau wie im Falle der nichtemittierenden Lochleiter, die für die Endfunktionalisierung des Polyfluoren verwendet wurden, wirken auch die ThiophenFarbstoffe als effektive Ladungsträgerfallen, was neben der Farbveränderung eine drastische Verbesserung der Leuchtdiodeneffizienzen zur Folge hatte. Darüber hinaus konnte mit Hilfe des dotierten Polyfluorens polarisierte grüne Elektrolumineszenz verwirklicht werden, wobei die Polarisationsverhältnisse Werte von bis zu 30 erreichten, bei einer Leuchtdichte von 600 cd/m 2 und einer Effizienz von 0,3 cd/A. Im Hinblick auf rote Elektrolumineszenz wurden Leuchtdioden mit dendronisierten Pery lenfarbstoffen in der emittierenden Schicht untersucht, zum einen in reiner Form und zum an deren in Mischungen mit Polyfluoren. Hierfür wurden zwei Generationen von Dendrimeren, bestehend aus zentralem PerylendiimidChromophor und PolyphenylenGerüst, mit einer nichtdendronisierten Modellverbindung verglichen. Leuchtdioden mit reinen Filmen der ersten und zweiten Dendrimergeneration emittierten rotes Licht mit CIEKoordinaten (0,627/0,372) und einer Leuchtdichte von bis zu 120 cd/m 2 bei 11 V, wobei die Effizienz allerdings nur 0,03 cd/A betrug. Um die unterschiedlichen Mechanismen zu klären, die zur Emission der Farbstoffmoleküle führen, wurden die Farbstoffe in Polyfluoren beigemischt, und der Einfluss der Dendronisierung auf die Emissionsfarbe und die Intensität der Elektrolumineszenz wurde untersucht. In Photolumineszenz wurde mit zunehmender Dendronisierung eine Abnahme des Förster Energieübertrags vom PolyfluorenWirt zu dem PerylenfarbstoffGast verzeichnet, was zu einen höheren blauen Anteil im Emissionsspektrum führte. Hingegen wurde gezeigt, dass in Elektrolumineszenz die Farbstoffe als Elektronenfallen wirken und die Rekombination der Ladungsträger zu Exzitonen somit vorwiegend auf den Farbstoff anstatt auf den Polyfluorenmolekülen statt findet. Aus diesem Grund war die Betonung der roten Emission in Elektrolumineszenz ungleich stärker als in Photolumineszenz, bei der die rote Emission ausschließlich durch Energieübertrag via Förstertransfer zu Stande kommt. Die Verstärkung einer Farbverschiebung von rot nach blau, die mit zunehmender Dendronisierung und ansteigender Betriebsspannung beo bachtet wurde, konnte qualitativ mit der kinetischen Beeinträchtigung des Elektronenübertrags vom PolyfluorenWirt auf den PerylendiimidChromophor erklärt werden. Der bestmögliche Kompromiss aus roter Farbtiefe und Helligkeit wurde für die Mischung aus Polyfluoren und dem Farbstoff der ersten Dendrimergeneration erzielt. Bei angelegter Spannung von 6,5 V lag die Leuchtdichte bei 100 cd/m 2 und bei 11 V bei 700 cd/m 2 , wobei das Emission bei 600 nm ihr Maximum hatte.
In der vorliegenden Arbeit werden Verfahren der Mathematik und Informatik entwickelt und eingesetzt, um Struktur, Dynamik und biologische Aktivität aus NMR spektroskopischen und empirischen Parametern zu bestimmen. Dolastatin 10 und Epothilon A sind potentielle Wirkstoffe gegen Krebs, da sie durch Wechselwirkung mit Tubulin die Zellteilung unterbinden. Die 3D Struktur beider Wirkstoffe in Lösung und die Struktur von an Tubulin gebundenem Epothilon A wird aus NMR spektroskopischen Parametern bestimmt. Dolastatin 10 liegt in einem konformationellen Gleichgewicht zwischen der cis -- und trans -- Konformation in der ungewöhnlichen Aminosäure DAP vor. Beide Konformationen des flexiblen Pentapeptids können bestimmt werden mit RMSD = 1.423 Å für das cis -- Konformer und RMSD = 1.488 Å für das trans -- Konformer. Während das trans -- Konformer gestreckt vorliegt, faltet das cis -- Konformer am DAP zurück. Epothilone A ist durch einen Makrozyklus weniger flexibel und sowohl die an Tubulin gebundene Struktur (RMSD = 0.537 Å) als auch freie Form (RMSD = 0.497 Å) kann mit geringen RMSD -- Werten bestimmt werden. Die Struktur der freien Form, welche in Lösung hauptsächlich vorliegt, ist mit der Röntgenstruktur weitgehend identisch. In der an Tubulin gebundenen Form wird eine essentielle Umorientierung der Seitenkette beobachtet, die für die Wechselwirkung mit Tubulin entscheidend ist. Dipolare Kopplungen eines Proteins sind geeignet, eine 3D Homologiesuche in der PDB durchzuführen, da die relative Orientierung von Sekundärstrukturelementen und Domänen durch sie beschrieben wird 85 . Die frühe Erkennung 3D homologer Proteinfaltungen eröffnet die Möglichkeit, die Bestimmung von Proteinstrukturen zu beschleunigen. Eine Homolgiesuche unter Nutzung dipolarer Kopplungen ist in der Lage, Proteine oder zumindest Fragmente mit ähnlicher 3D Struktur zu finden, auch wenn die Primärsequenzhomologie gering ist. Darüber hinaus wird eine Transformation für experimentelle dipolare Kopplungen entwickelt, die die indirekte Orientierungsinformation eines Vektors relativ zu einem externen Tensor in den möglichen Bereich für den Projektionswinkel zwischen zwei Vektoren und somit in eine intramolekulare Strukturinformation übersetzt. Diese Einschränkungen können in der Strukturbestimmung von Proteinen mittels Molekulardynamik genutzt werden 92 . Im Gegensatz zu allen existierenden Implementierungen wird die Konvergenz der Rechnung durch die auf diese Weise eingeführten dipolare Kopplungsinformation kaum beeinflusst. Die dipolaren Kopplungen werden trotzdem von den errechneten Strukturen erfüllt. Auch ohne die Nutzung bereits bekannter Protein oder Fragmentstrukturen kann so ein erheblicher Teil der NOE -- Information substituiert werden. Die Dynamik des Vektors, der die beiden wechselwirkenden Dipole verbindet, beeinflusst den Messwert der dipolaren Kopplung. Dadurch wird Information über die Dynamik von Molekülen auf der µsZeitskala zugänglich, die bisher nur schwer untersucht werden konnte. Die Messung dipolarer Kopplungen für einen Vektor in verschiedenen Orientierungen erlaubt die Analyse seiner Bewegung 89 . Im besonderen ist die Ableitung eines modellfreien Ordnungsparameters 2 S möglich. Weiterhin lassen sich ebenso modellfrei eine mittlere Orientierung des Vektors, axialsymmetrische Anteile und nichtaxialsymmetrische Anteile der Dynamik ableiten und auswerten. Die Anwendung der so entwickelten Protokolle auf experimentelle Daten 90 lässt Proteine deutlich dynamischer erscheinen als auf der Zeitskala der Relaxationsexperimente zu erkennen ist. Der mittlere Ordnungsparameter sinkt von 0.8 auf 0.6. Dies entspricht einer Erhöhung des Öffnungswinkels der Bewegung von ca. 22 ° auf ca. 33°. Die Bewegungen weichen teilweise bis zu 40% und im Mittel 15% von der Axialsymmetrie ab. Neuronale Netze erlauben eine schnelle (ca. 5000 chemische Verschiebungen pro Sekunde) und exakte (mittleren Abweichung von 1.6 ppm) Berechnung der 13 C NMR chemischen Verschiebung 115 . Dabei kombinieren sie die Vorteile bisher bekannter Datenbankabschätzungen (hohe Genauigkeit) und Inkrementverfahren (hohe Geschwindigkeit). Das 13 C NMR Spektrum einer organischen Verbindung stellt eine detaillierte Beschreibung seiner Struktur dar. Resultate des Strukturgenerators COCON können durch den Vergleich des experimentellen mit den berechneten 13 C NMR Spektren auf ca. 1 o/oo der vorgeschlagenen Strukturen eingeschränkt werden, die eine geringe Abweichung zum experimentellen Spektrum haben 122 . Die Kombination mit einer Substrukturanalyse erlaubt weiterhin die Erkennung wahrscheinlicher, geschlossener Ringsysteme und gibt einen Überblick über die Struktur des generierten Konstitutionssubraumes. Genetische Algorithmen können die Struktur organischer Moleküle ausgehend von derer Summenformel auf eine Übereinstimmung mit dem experimentellen 13 C NMR Spektrum optimieren. Die Konstitution von Molekülen wird dafür durch einen Vektor der Bindungszustände zwischen allen Atom -- Atom Paaren beschrieben. Selbige Vektoren sind geeignet, in einem genetischen Algorithmus als genetischer Code von Konstitutionen betrachtet zu werden. Diese Methode erlaubt die automatisierte Bestimmung der Konstitution von Molekülen mit 10 bis 20 Nichtwasserstoffatomen 123 . Symmetrische neuronale Netze können fünf bzw. sieben dimensionale, heterogene Parameterrepräsentationen der 20 proteinogenen Aminosäuren unter Erhalt der wesentlichen Information in den dreidimensionalen Raum projizieren 134 . Die niederdimensionalen Projektionen ermöglichen eine Visualisierung der Beziehungen der Aminosäuren untereinander. Die reduzierten Parameterrepräsentationen sind geeignet, als Eingabe für ein neuronales Netz zu dienen, welches die Sekundärstruktur eines Proteins mit einer Genauigkeit von 66 % im Q 3 -- Wert berechnet. Neuronale Netzte sind aufgrund ihrer flexiblen Struktur besonders geeignet, quantitative Beziehungen zwischen Struktur und Aktivität zu beschreiben, da hier hochgradig nichtlineare, komplexe Zusammenhänge vorliegen. Eine numerische Codierung der über 200 in der Literatur beschriebenen Epothilonderivate erlaubt es, Modelle zur Berechnung der Induktion der Tubulin Polymerisation (R = 0.73) und der Inhibierung des Krebszellenwachstums (R = 0.94) zu erstellen 136 . Die trainierten neuronalen Netze können in einer Sensitivitätsanalyse genutzt werden, um die Bindungsstellen des Moleküls zu identifizieren. Aus der Berechnung der Aktivität für alle Moleküle des durch die Parameter definierten Strukturraums ergeben sich Vorschläge für Epothilonderivate, die bis zu 1 000 mal aktiver als die bisher synthetisierten sein könnten.