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Der 2‘-Desoxyguanosin-Riboschalter gehört zur unter Bakterien weit verbreiteten Klasse der Purin-Riboschalter. Allerdings wurden 2‘-Desoxyguanosin-bindende Riboschalter bisher ausschließlich in M. florum gefunden, damit stellt diese RNA eine Ausnahme unter den ansonsten verbreiteten Purin-Riboschaltern dar. In der vorliegenden Arbeit wurde ein NMR-Strukturmodell des IA-Aptamer-2‘-Desoxyguanosinkomplexes erstellt und anhand der mittels NMRSpektroskopie zugänglichen strukturellen Informationen sowohl Struktur und Dynamik des freien RNA-Aptamers als auch des 2‘-Desoxyguanosinkomplexes charakterisiert. Dabei wurde insbesondere der Einfluss von Mg2+ auf Struktur und Dynamik der jeweiligen Zustände sowie auf den durch 2‘-Desoxyguanosin induzierten Faltungsprozess untersucht.
Mg2+-Ionen modulieren die Faltungstrajektorien von sensorischen RNA-Domänen. Die Übertragbarkeit von Mg2+-abhängigen Charakteristika der RNA-Faltung innerhalb verschiedener Messmethoden ist durch die schlechte Vergleichbarkeit der relativen Konzentrationsverhältnisse eingeschränkt. Die NMR-spektroskopisch beobachtbaren Mg2+-Einflüsse sollten also unter besonderer Berücksichtigung der für NMR benötigten vergleichsweise sehr hohen RNAKonzentrationen mit Ergebnissen aus kalorimetrischen oder fluoreszenzspektroskopischen Messungen interpretiert werden. Die in der NMR-Spektroskopie üblichen hohen Probenkonzentrationen befinden sich in dem Regime, in dem auch der physikalische Effekt des verdrängten Volumens eine Rolle zu spielen beginnt. Demnach ist es für die RNA-Moleküle im NMR-Probenröhrchen bei Konzentrationen von 5-10 mg/ml auch ohne Zugabe von Mg2+ entropisch günstiger, kompakte Konformationen einzunehmen. Die Relevanz des Effekts des verdrängten Volumens für die RNA-Faltung unter NMR-Bedingungen und unter zellulären Bedingungen ist Gegenstand der aktuellen Forschung und wird in dieser Arbeit am Beispiel des IA-Aptamers diskutiert.
Der oft einzigartige Bindungsmodus ubiquitärer Metaboliten durch bakterielle Riboschalter (Montange and Batey, 2006) ermöglicht prinzipiell den Einsatz von RNA-Aptameren in vivo, ohne mit zellulären Proteinsystemen zu interferieren (Mulhbacher et al., 2010). Therapeutische Ziele sind beispielsweise die Anwendung von Riboschaltern gegen bakterielle Pathogene beziehungsweise gegen pathogene Bakterien selbst. Eine weitere Rolle wird RiboschalterElementen zukünftig als Bausteine in der synthetischen Biologie zukommen (Dixon et al., 2010; Knight, 2003; Topp and Gallivan, 2008). Hierfür ist es von grundlegender Bedeutung, Charakterisierung von Struktur als Basis für das Verständnis von Funktion unter zellulären Bedingungen zu etablieren. Im Rahmen einer Zusammenarbeit mit Robert Hänsel aus dem Arbeitskreis von Prof. Dr. Volker Doetsch wurde am Beispiel des IA-Aptamers und einer nichtnatürlichen Sequenzvariante gezeigt, dass eine strukturelle Charakterisierung von Riboschaltern mittels in cell NMR-Spektroskopie möglich ist. In Zusammenarbeit mit Karl von Laer aus der Arbeitsgruppe von Prof. Dr. Beatrix Suess wurden beide RNA-Aptamer hinsichtlich ihrer Funktion in einem biologischen Assay getestet. Die Ergebnisse dieser Experimente zeigten eine deutliche Korrelation von Struktur und Funktion in vivo, während Diskrepanzen zwischen Struktur in vitro und Funktion in vivo demonstriert werden.
Weiterhin wurde im Rahmen dieser Arbeit gezeigt, dass eine gewisse strukturelle Flexibilität der Bindungstaschen regulatorischer RNA-Motive für Selektion und Adaption während Evolution nötig ist. Beispielsweise wurde für den Guanin-Riboschalter gezeigt, dass der nicht-native Ligand 2‘-Desoxyguanosin zur Komplexbildung des Aptamers führt. Demnach könnte die Bindung von 2‘-Desoxyguanosin im Guanin-Riboschalter bereits evolutionär angelegt sein und die Entstehung des IA-Aptamers nach Genomreduktion der Mesoplasmen begünstigt haben. Das IA-Aptamer dagegen bindet Guanin nicht, stattdessen besitzt M. florum auf Guanin spezialisierte Sequenzvarianten dieses Riboschalters (Kim et al., 2007). Strukturell hochauflösende Einblicke in unterschiedliche Zustände der Bindungstasche im G-Aptamer-Thioguaninkomplex, die durch die Lösung der Kristallstruktur des GLoop-Aptamers ermöglicht wurden, unterstützen die Hypothese einer anpassungsfähigen Bindungstasche im G-Aptamer. Für B. subtilis wäre es interessant, die physiologische Bedeutung der Komplexbildung des G-Aptamers mit 2‘-Desoxyguanosin zu untersuchen.
Cancer cells, in general and especially Rhabdomyosarcoma (RMS) cells have been reported to be highly susceptible to oxidative stress. Based on this knowledge we examined whether the inhibition of the two main antioxidant defense pathways, i.e. the thioredoxin (TRX) and the glutathione (GSH) system, represents a possible new strategy to induce cell death in RMS. To do so, we combined the -glutamylcysteine synthetase (γGCL) inhibitor buthionine sulfoximine (BSO) or the cystine/glutamate antiporter (xc-) inhibitor erastin (ERA), both GSH depleting enzymes, with the thioredoxinreductase (TrxR) inhibitor auranofin (AUR) to evaluate synergistic cell death in the alveolar RMS (ARMS) cell line RH30 and the embryonal RMS (ERMS) cells RD.
Furthermore, we tried to unravel the underlying molecular mechanisms of AUR/BSO or AUR/ERA treatment in RMS cells. Thereby we showed that AUR/BSO as well as AUR/ERA treatment leads to proteasome inhibition characterized by the accumulation of ubiquitinated proteins, which is in agreement with the already published ability of AUR to inhibit proteasomeassociated deubiquitinases (DUBs) aside from TrxR. As a consequence, the protein levels of ubiquitinated short-lived proteins, like NOXA and MCL-1, increase upon treatment with AUR/BSO or AUR/ERA. Consistently, we could detect an increased binding of NOXA to MCL-1. Interestingly, not only NOXA protein levels but also mRNA levels rise upon treatment, pointing to a transcriptional regulation of pro-apoptotic NOXA through AUR/BSO or AUR/ERA combination treatment. The fact that siRNA mediated knockdown of NOXA rescues cells from combination treatment-induced cell death strengthens the role of NOXA as an important regulator of cell death induction. Apart from proteasome inhibition and subsequent NOXA accumulation, AUR cooperates with BSO or ERA to trigger BAX/BAK activation, which is needed for cell death induction, too. Additionally, loss of mitochondrial membrane potential (MMP) as well as caspase activation and PARP cleavage is detected after treatment of RMS cells with AUR/BSO or AUR/ERA.
Except of apoptotic cell death we also detected features of iron-dependent ferroptosis after treatment with AUR/BSO or AUR/ERA. This is not surprising, since BSO and ERA already have been described to induce ferroptotic cell death. Although lipid peroxidation takes place in both cell lines, only in RH30 cells, cell death seems to be partially ferroptosis-dependent, since especially in this cell line AUR/BSO- or AUR/ERA-induced cell death can be rescued with different ferroptosis inhibitors.
Although both combination treatments, AUR/BSO as well as AUR/ERA, induce production of reactive oxygen species (ROS), only the thiol-containing ROS scavengers GSH and its precursor N-acetylcysteine (NAC), but not the non-thiolcontaining antioxidant α-Tocopherol (α-Toc), consistently prevent proteasome inhibition, NOXA accumulation and cell death.
Additionally, we demonstrated that BSO and ERA abolish AUR-mediated upregulation of GSH thereby releasing the AUR cytotoxic effect on RMS cells, in line with the described ability of cysteines to inhibit the function of AUR. Together, this points to the conclusion that GSH depletion, rather than an increase in ROS levels, is important for AUR/BSO- or AUR/ERA-induced cell death.
In conclusion, through revealing that the antitumor activity of AUR is enhanced in combination with GSH depleting agents, we identified redox homeostasis as a new and promising target for the treatment of RMS cells.
Das Ziel der vorliegenden Arbeit war es, MALDI-Massenspektrometrie als robuste Analysenmethode für die quantitative Analyse niedermolekularer Verbindungen aus komplexen biologischen Matrizes zu etablieren. Zu Beginn der Arbeit wurden drei typische Fragestellungen im Bereich der Lebensmittelanalytik, der medizinischen Forschung und der klinischen Chemie ausgewählt, um die Methodik anhand dieser Modellsysteme zielgerichtet zu entwickeln und zu bewerten. Für jede dieser Fragestellungen wird routinemäßig ein hoher Probendurchsatz verlangt und damit werden hohe Anforderungen an die Probenvorbereitung gestellt, da diese einfach, schnell, reproduzierbar, Matrix-tolerant und automatisierbar sein muss um die Weiterentwicklung zur Hochdurchsatzanalytik zu erlauben.
Der quantitative Nachweis von Melamin und seinen Derivaten wurde aufgrund des Aufkommens von Milchprodukten, die mit diesen Verbindungen kontaminiert waren, ein wichtiger Bestandteil der Analytik dieser Lebensmittel. Insbesondere an diesem Beispiel zeigte sich der Vorteil des Einsatzes von MALDI-Massenspektrometrie zur Analyse kleiner Moleküle. Aufgrund der höheren Toleranz gegenüber Puffern und Salzen konnte die Probenvorbereitungszeit der für die FDA entwickelten Methode zur Quantifizierung von Melamin in Milchpulver mittels LC-ESI von ca. 140 min auf 90 min reduziert werden, da auf die zeitaufwendige Flüssigchromatographie verzichtet werden konnte. So wurde Melamin mit einem LLOQ von 0,5 ppm quantifiziert, was unterhalb der Vorgaben der WHO (2,5 ppm in Milichpulver und 1 ppm in Babynahrung) lag. Cyanursäure, ein Derivat von Melamin welches für die Bildung schwerlöslicher Komplexe in der Niere mitverantwortlich gemacht wird, konnte ebenfalls mit der entwickelten MALDI-MS Methode quantifiziert werden. Allerdings war die ermittelte Bestimmungsgrenze mit 15 ppm um den Faktor 30 schlechter als bei Melamin. Die Nachweisgrenze bei MALDI-MS ist stark von der MALDI-Matrix abhängig und die Verwendung von Sinapinsäure war eine gute Kompromisslösung, um die Analyten in einem Spot im positiven und negativen Reflektormodus zu analysieren. Allerdings wurde diese Matrix zur Analyse von Analyten im positiven Reflektormodus entwickelt. Bislang wurden nur wenige Matrizes für MALDI-MS im negativen Reflektormodus beschrieben, um z.B. Säuren besser nachweisen zu können. Forschung in diesem Bereich wird neue Möglichkeiten zur Detektion negativ geladener kleiner Moleküle ergeben.
Des Weiteren wurden im Rahmen dieser Arbeit auch Lösungen für klinische Fragestellungen wie etwa den Nachweis von Methylphenidat im Plasma und Gehirn von Ratten oder der Dried Blood Spot Analytik entwickelt. Bei beiden Methoden wurde jeweils nur eine einfache Flüssig-Flüssig-Extraktion zur Probenvorbereitung angewendet und sie ließen sich sehr gut auf Realproben übertragen.
Methylphenidat konnte im Plasma im Konzentrationsbereich von 0,1-40 ng/mL und im Hirnhomogenat im Konzentrationsbereich von 0,4-40 ng/mL quantifiziert werden, was gut im Konzentrationsbereich der Realproben von mit Methylphenidat gefütterten Ratten lag. Dazu standen das Plasma und die Gehirne von fünf Ratten zur Verfügung. Es wurde eine lineare Korrelation zwischen der MPH-Konzentration im Gehirnhomogenat und im Plasma gefunden, was basierend auf den bis dato bekannten Literaturergebnissen ein zu erwartendes Ergebnis war, aber zukünftig mit einer größeren Anzahl von Versuchstieren verifiziert werden sollte. Während der Methodenentwicklung war auch bei diesem Projekt die Auswahl der MALDI-Matrix ausschlaggebend für den Erfolg der Messungen. Im MALDI-Massenspektrum interferierte das Signal des Natriumaddukts von CHCA mit dem Signal von MPH. Für dieses Problem kamen zwei mögliche Lösungen in Betracht. Erstens die Quantifizierung mit ClCCA als MALDI-Matrix, da hier keine Interferenzen auftraten. In ersten Vorversuchen konnte MPH so in einem Konzentrationsbereich von 1-48 ng/mL mit einer exzellenten Linearität von R2=0,9992 quantifiziert werden. Eine zweite mögliche Problemlösung war die Verwendung von Tandem-Massenspektrometrie. Hierzu wurden Fragmentionen-Massenspektren der überlagerten Signale aufgenommen. MPH und der verwendete interne Standard MPH-d9 zeigten dabei spezifische Fragmentionensignale, über die quantifiziert wurde. Da die Sensitivität um den Faktor 100 im Vergleich zu MS-Spektren von CHCA und ClCCA gesteigert werden konnte, wurde die weitere Methodenentwicklung basierend auf der Tandem-Massenspektrometrie mit der MALDI-Matrix CHCA durchgeführt. Überdies sind MS/MS-Versuche unter Verwendung von ClCCA als MALDI-Matrix für kleine Moleküle sehr erfolgsversprechend und sollten in weiteren Forschungsarbeiten durchgeführt werden.
Die Dried Blood Spot Technik als alternative Probenvorbereitung bietet eine Reihe von Vorteilen, wie etwa den einer einfacheren Lagerung und eines einfacheren Transports einer großen Menge von Proben. Darüber hinaus werden nur wenige Mikroliter Blut verwendet, was vorteilhaft ist bei z B. klinischen Studien oder dem Therapeutic Drug Monitoring. Diese Art der Probennahme ist somit eine perfekte Ergänzung für weitere quantitative Analysen von Methylphenidat in Rattenblut. Den Ratten würden nur wenige Mikroliter Blut entnommen werden, was ihr Überleben sichert und der Transport der Proben auf dem Postweg wäre wesentlich einfacher. Um eine allgemein verwendbare DBS-MALDI-MS-Methode zu entwickeln, wurden neben Methylphenidat auch bekannte Analyten aus dem Bereich des Dopings sowie Lamotrigin, Coffein und Theophyllin als Beispiele für das Therapeutic Drug Monitoring verwendet. Es wurden verschiedene Lösungsmittel zur Extraktion eingesetzt, wobei sich eine Kombination aus Methyl-tert-Butylether und Ethanol, sowie Aceton als am besten geeignet erwies. Einige Analyten wie Coffein, Theophyllin und Lamotrigin wurden bis zu einer Konzentration von 0,5 μg/mL quantifiziert. Diese Bestimmungsgrenze ist bei Analyten aus dem Bereich des Dopings wie z.B. Salbutamol, Methylphenidat oder Clenbuterol, deren therapeutisch wirksame Plasmakonzentration im Bereich von wenigen Nanogramm pro Milliliter Blut liegt, um den Faktor 15-500 zu hoch. Diese Analyten waren bis zu einer Konzentration von 5 μg/mL im Blut mittels MALDI-MS problemlos nachweisbar. Um die Sensitivität zu erhöhen, ist es allerdings sinnvoll, die Extraktion zukünftig für die einzelnen Analyten zu optimieren, sie mittels Festphasenextraktion oder LC anzureichern und MS/MS-Spektren aufzunehmen. Für die Analyten Coffein, Theophyllin und Lamotrigin, deren therapeutisch wirksame Plasmakonzentration im ein- bis zweistelligen Mikrogramm-pro-Milliliter Bereich liegt, eignete sich die entwickelte Methode sehr gut. Es wurde eine Methodenvalidierung durchgeführt, wobei die validierten Parameter den Vorgaben der FDA entsprachen.
Da die Auswahl der MALDI-Matrix bei den verschiedenen Methodenentwicklungen jeweils ein kritischer Faktor war, wurden abschließend eine Auswahl von Analyten mit einer Molekülmasse bis ca. 600 Da mit verschiedenen MALDI-Matrizes präpariert. Ein Großteil der Analyten wurde am sensitivsten mit ClCCA nachgewiesen. Im Rahmen dieser Versuche wurde auch erstmals ein Strukturanalogon von ClCCA, und zwar ClCCA-Tetrazol, als alternative MALDI-Matrix eingesetzt, bei welchem die Carboxylgruppe durch einen Tetrazolring ausgetauscht wurde. Diese zeigte eine sehr homogene Kristallisation und für einige Analyten eine bis zu Faktor 3 höhere Signalintensität im Vergleich zu ClCCA. Außerdem war auffällig, dass einige Analyten unter bestimmten Präparationsbedingungen wie z B. der Graphite Supported Preparation sensitiver mittels MALDI-MS nachweisbar waren. Bei anderen Analyten verschlechterten sich die Analysenergebnisse. Graphit verändert stark die Kristallisation der MALDI-Matrix und es wird vermutet, dass sich dies auf den Einbau der Analyten in die Matrixkristalle auswirkt. Es konnte bislang aber noch nicht abschließend geklärt werden, wie genau die Präparation der Proben Einfluss auf den Einbau der Analyten in die Matrix nimmt. Eine Untersuchung dieser Phänomene sollte daher Gegenstand weiterer Forschungsprojekte sein.
Zusammenfassend stellt die MALDI-Massenspektrometrie eine schnelle und robuste Methode zur Quantifizierung einer Vielzahl kleiner Moleküle in komplexen biologischen Matrizes dar.
Die Modulation molekularer Systeme mit Licht ist ein in den letzten Jahren immer stärker untersuchtes Forschungsgebiet. Es existiert bereits eine große Anzahl an Publikationen, die mittels statischer Spektroskopie und anderer statischer Methoden Einblicke in die ablaufenden Prozesse gewähren konnten. Untersuchungen im Ultrakurzzeitbereich sind jedoch eher selten, liefern aber detaillierte Informationen zu den ablaufenden Prozessen. Den Wissensstand diesbezüglich zu erweitern, war Ziel dieser Dissertation.
Untersucht wurden neun photoschaltbare, molekulare Dyaden hinsichtlich ihrer Dynamik nach Photoanregung. Die Dyaden setzten sich aus einem Fluorophor (Bordipyrromethen, BODIPY), einem Photoschalter (Dithienylethen, DTE; offen oder geschlossen) und gegebenenfalls einer COOH-Ankergruppe zusammen.
Die Unterschiede in den Molekülstrukturen bestanden in der Verknüpfung der einzelnen Bauteile (kurze oder lange, beziehungsweise gerade oder gewinkelte Brücke) und der Art des Fluorophors und des Photoschalters (jeweils zwei verschiedene Strukturen).
Durch Belichtung mit UV- oder sichtbarem Licht konnten photostationäre Zustände generiert werden, die 40 – 98 % geschlossenes Isomer (je nach Molekül) beziehungsweise 100 % offenes Isomer enthielten.
Unter Verwendung von Licht verschiedener Wellenlängen konnten beide Teile der Dyade (BODIPY beziehungsweise DTE) separat angeregt und hinsichtlich der ablaufenden Photodynamik untersucht werden, wobei der Fokus der Arbeit auf transienten Absorptionsmessungen mit Anregung des BODIPY lag. Bei einem Großteil der untersuchten Moleküle kam es in diesem Fall, je nach Zustand des Photoschalters, zu einem intramolekularen Energietransfer nach der Theorie von Theodor Förster. Durch diese Energietransferprozesse kommt es zu einer drastischen Verkürzung der Lebenszeit des angeregten Zustands des BODIPY. Ausgehend von Lebenszeiten im Bereich von Nanosekunden im Falle der offenen Dyaden (entspricht der Fluoreszenzlebensdauer) reduziert sich die Lebenszeit auf wenige Pikosekunden, beziehungsweise je nach Aufbau des Moleküls sogar noch weiter. Die unterschiedlich schnellen Transferprozesse sind im Sinne der Förster-Theorie durch die unterschiedlichen Entfernungen und relativen Orientierungen der beiden beteiligten Übergangsdipolmomente (von DTE und BODIPY) erklärbar.
Neben Experimenten mit Anregung des BODIPY-Teils der Dyaden wurden weitere Experimente durchgeführt, in denen der geschlossene Photoschalter direkt angeregt wurde. Aus diesen Messungen konnten Erkenntnisse über die Relaxation des DTE erlangt werden. Auf diese Weise war es möglich, bei einigen der Moleküle die Ringöffnungsreaktion zu beobachten und zu charakterisieren. Im Fall von Dyade 4 konnten zusätzlich kohärente Schwingungen des Moleküls nach Photoanregung detektiert werden, die sich anhand einer Frequenzmodulation der Absorptionsbande des BODIPY-Teils über einen Zeitbereich von 2 ps beobachten ließen.
Der Name Histamin hat seinen Ursprung aus dem griechischen Wort "histos" (Gewebe) und spielt auf sein breites Spektrum an Aktivitäten, sowohl unter physiologischen als auch unter pathophysiologischen Bedingungen an. Histamin ist eines der Moleküle mit welchem man sich im letzten Jahrhundert am intensivsten beschäftigt hat.
Im Jahr 1907 wurde das Histamin erstmals synthetisiert. Drei Jahre später gelang es, dieses Monoamin erstmals aus dem Mutterkornpilz Claviceps purpurea zu isolieren. Weitere 17 Jahre vergingen, ehe Best et al. Histamin aus der humanen Leber und der humanen Lunge isolieren konnten. Best konnte somit beweisen, dass dieses biogene Amin einen natürlichen Bestandteil des menschlichen Körpers darstellt. Nach der Entdeckung wurden dem Histamin mehrere Effekte zugeschrieben. Dale et al. beobachteten, dass Histamin einen stimulierenden Effekt auf die glatte Muskulatur des Darms und des Respirationstraktes hat, stimulierend auf die Herzkontraktion wirkt, Vasodepression und ein schockähnliches Syndrom verursacht.
Popielski demonstrierte, dass Histamin dosisabhängig einen stimulierenden Effekt auf die Magensäuresekretion von Hunden hat. Lewis wiederum beschrieb erstmals, dass Histamin einen Effekt auf der Haut hervorruft. Dies zeigte sich durch verschiedene Merkmale, wie geröteter Bereich aufgrund der Vasodilatation und Quaddeln aufgrund der erhöhten Gefäßpermeabilität. Des Weiteren wurde Histamin eine mediatorische Eigenschaft bei anaphylaktischen und allergischen Reaktionen zugeschrieben. Zusätzlich spielt das biogene Amin eine entscheidende Rolle im zentralen Nervensystem (ZNS), unter anderem beim Lernen, bei der Erinnerung, beim Appetit und beim Schlaf-Wach-Rhythmus. Von den zahlreichen physiologischen Effekten des Histamins ist seine Rolle bei Entzündungsprozessen, der Magensäuresekretion und als Neurotransmitter am besten verstanden.
In dieser Arbeit wurde das Protein OR1 ausführlich charakterisiert und die Grundlage für weitere Studien an diesem Protein gelegt. Die Zielsetzung dieser Arbeit bestand primär in der biophysikalischen Analyse eines eukaryotischen Proteorhodopsins, da bislang keine Daten zu diesen vorlagen. Dieser Ansatz ist vergleichbar mit der Studie am BR ähnlichen Rhodopsin aus dem Pilz Leptosphaeria maculans (Waschuk et al. 2005). Auch wenn man aus den Eigenschaften von OR1 keine Signatur für eukaryotische PRs herausfiltern kann, so weist OR1 eine Reihe von Charakteristika auf, die es wert sind weiterbearbeitet zu werden. Zu den hervorzuhebenden Ergebnissen dieser Arbeit zählen:
(1) OR1 zeigte in der methylotrophen Hefe Pichia pastoris ein hohes Expressionsniveau weit über der gewohnten Ausbeute bei Membranproteinen.
(2) OR1 offenbarte sich als Proteorhodopsin mit BR ähnlichen Eigenschaften wie dem niedrigen pKs-Wert des Protonenakzeptors und damit guten Protonenpumpeigenschaften über einen großen pH-Bereich. Auch bindet OR1 keinen zweiten Chromophor, was die nahen Verwandten GR und XR hingegen tun.
(3) OR1 demonstriert, dass die Konfiguration des komplexen Gegenions von Proteorhodopsinen stark variiert und sich anscheinend flexibel den physiologischen Erfordernissen des jeweiligen Organismus anpasst. In diesem Zusammenhang spielt auch das konservierte Histidin eine Rolle, da es den primären Protonenakzeptor beeinflusst. Bei OR1 stellte sich heraus, dass das Histidin den pKs Wert der D100 Position nicht signifikant beeinflusst.
(4) OR1 wurde mit 13C und 15N Atomen erfolgreich markiert und das entwickelte Protokoll für die Rekonstitution bewährte sich. Die Proteoliposomen des Wildtyps gaben sehr gut aufgelöste Festkörper-NMR Spektren. In Zukunft sind somit ausführliche NMR Studien an OR1 möglich.
Bacteria are highly organized organisms which are able to adapt to and propagate under a multitude of environmental conditions. Propagation hereby requires reliable chromosome replication and segregation which has to occur cooperatively with other cellular processes such as transcription, translation or signaling. Several mechanisms were proposed for segregation of the Escherichia coli (E. coli) chromosome, for example a mitotic-like active segregation model or entropy-based passive chromosome segregation. Another segregation model suggests coupled transcription, translation and insertion of membrane proteins (termed "transertion"), which links the replicating chromosome (nucleoid) to the growing cell cylinder.
Fluorescence microscopy was widely used to provide evidence for a distinct segregation model. However, the dynamic nature of bacterial chromosomes, the small bacterial size and the optical resolution limit of ~ 200-300 nm impair unveiling the underlying mechanisms. With the emergence of super-resolution fluorescence microscopy techniques and advanced labeling methods, a new toolbox became available enabling scientists to visualize biomolecules and cellular processes in unprecedented detail. Single-molecule localization microscopy (SMLM) represents a set of super-resolution microscopy techniques which relies on the temporal separation of the fluorescence signal and detection of single fluorophores. Separation can be achieved using photoactivatable or -convertible fluorescent proteins (FPs) in photoactivated localization microscopy (PALM), photoswitchable organic dyes in direct stochastic optical reconstruction microscopy (dSTORM) or dynamically binding fluorescent probes in point accumulation for imaging in nanoscale topography (PAINT). In all these techniques, the fluorescence emission pattern of single fluorophores is spatially localized with nanometer-precision. An artificial image is finally reconstructed from the coordinates of all single fluorophores detected. This provides a spatial resolution of ~ 20 nm, which is perfectly suited to investigate cellular processes in bacteria. In this thesis, different SMLM techniques were applied to study fundamental processes in E. coli. This includes determination of protein copy numbers and distributions as well as the nanoscale organization of nucleic acids and lipids.
A novel labeling approach was applied and used for super-resolution imaging of the E. coli nucleoid. It is based on the incorporation of the modified thymidine analogue 5-ethynyl-2’- deoxyuridine (EdU) into the replicating chromosome. Azide-functionalized organic fluorophores can be covalently attached to the ethynyl group of incorporated EdU bases using a copper-catalyzed "click chemistry" reaction. Under the investigated growth condition, E. coli cells exhibited overlapping replication cycles, which is commonly referred to as multi-fork replication and enables cells to divide faster than they can replicate the entire chromosome. dSTORM imaging of such labeled nucleoids revealed chromosome features with diameters of 50 - 200 nm, representing highly condensed DNA filaments. Sorting single E. coli cells by length allowed visualizing structural changes of the nucleoid throughout the cell cycle. Replicating nucleoids segregated and expanded along the bacterial long axis, while constantly covering the entire width of the cell. Measuring cell and nucleoid length revealed a relative nucleoid expansion rate of 78 ± 6 %. At the same time, nucleoids populated 63 ± 8 % of the cell length, almost exclusively being localized to the cylindrical part of the cell. This value was hence normalized to the cylindrical fraction of the cell, yielding a value of 79 ± 10 % (nucleoid-populated fraction of the cell cylinder), which is in good agreement with the observed relative nucleoid expansion rate. These results therefore support a growth-mediated segregation model, in which the chromosome is anchored to the inner membrane and passively segregated into the prospective daughter cells upon cell growth. 3-dimensional dSTORM imaging of labeled nucleoids confirmed that compacted nucleoids helically wrap along the inner membrane. Similar results were obtained by imaging orthogonally aligned E. coli cells using a holographic optical tweezer approach.
In order to visualize particular proteins together with the nucleoid, several correlative imaging workflows were established, facilitating multi-color SMLM imaging in single E. coli cells. These workflows bypass prior limitations of SMLM, including destruction of FPs by reactive oxygen species in copper-catalyzed click reactions or incompatibility of PALM imaging with dSTORM imaging buffers. A sequential SMLM imaging routine was developed which is based on postlabeling and retrieval of previously imaged cells. Optimal imaging conditions can be maintained for each fluorophore, enabling to extract quantitative information from PALM measurements while correlating the protein distribution to the nucleoid ultrastructure within the highly resolved cell envelope. Applying this workflow to an E. coli strain carrying a chromosomal rpoC - photoactivatable mCherry (PAmCh) fusion, transcribing RNA polymerase (RNAP) was found to be localized on the surface of nucleoids, where active genes are exposed towards the cytosol. During growth in nutrient-rich medium, the majority of RNAP molecules was bound to the chromosome, thus ensuring that the RNAP pool is equally distributed to the daughter cells upon cell division. This work represented the first triple-color SMLM study performed in E. coli cells. ...
A great challenge in life sciences remains the site-specific modification of proteins with minimal perturbation for in vitro as well as in vivo studies. Therefore, different chemoselective reactions and semi-synthetic techniques such as native chemical ligation or intein-mediated protein splicing have been established. They enable a site-specific incorporation of chemical reporters into proteins, such as organic fluorophores or unnatural amino acids. In this PhD Thesis, protein trans-splicing was guided by minimal high-affinity interaction pairs to trace proteins in mammalian cells. In addition, the temporal modulation of cellular processes by photo-cleavable viral immune evasins was achieved.
Protein trans-splicing mediated by split inteins is a powerful technique for site-specific and 'traceless' protein modifications. Despite recent developments there is still an urgent need for ultra-small high-affinity intein tags for in vitro and in vivo approaches. So far, only a very few in-cell applications of protein trans-splicing are reported, all limited to C-terminal protein modifications. Here, a strategy for covalent N-terminal intein-mediated protein labeling at sub-nanomolar probe concentrations was developed. Combined with the minimalistic Ni-trisNTA/His-tag interaction pair, the affinity between the intein fragments was increased 50-fold (KD ~ 10 nM). Site-specific and efficient 'traceless' protein modification by high-affinity trans-splicing is demonstrated at nanomolar concentrations in mammalian cells.
High background originating from non-reacted, 'always-on' fluorescent probes still is a crucial issue in life sciences. Covalent labeling approaches with simultaneous activation of fluorescence are advantageous to increase sensitivity and to reduce background signal. Therefore, high-affinity protein trans-splicing was combined with fluorophore/quencher pairs for online detection of covalent N-terminal protein labeling in cellular environments. Substantial fluorescence enhancement at nanomolar probe concentrations was achieved. This ultra-small fluorogenic high-affinity split intein system is an unprecedented example for real-time monitoring of the trans-splicing reaction in cell-like environments as well as for protein labeling with fluorogenic probes at nanomolar concentrations.
To extend the field of chemical immunology and to address spatiotemporal aspects in adaptive immune response, new tools to control antigen processing are required. Therefore, synthetic photo-conditional viral immune evasins were designed to modulate antigen processing on demand. By using light, the time and dose controlled antigen translocation by the transporter associated with antigen processing (TAP) was triggered with response in the second regime. Peptide delivery and loading by the peptide-loading complex (PLC) was rendered inactive, whereas blocking was abolished in a light-controlled fashion to inactivate the synthetic viral immune evasin ICP47 along with simultaneous activation of the antigen presentation pathway. Lightresponsive peptide translocation by the TAP complex was assayed in vitro by utilizing microsomes isolated from professional antigen presenting B-cell lymphomas (Raji). To extend these studies, suppression and photo-controlled rescue of antigen presentation was examined at single-cell resolution in human primary immune cells.
Native chemical ligation interconnects peptide chemistry with recombinantly expressed proteins. This technique was applied to generate the semi-synthetic full-length ICP47. Although this approach was realized, the low product yield was not sufficient for further functional studies. Therefore, full-length ICP47 was consecutively generated by utilizing a full synthetic four-fragment ligation approach. However, this synthetic viral immune evasin was not able to block peptide translocation in a robust way.
Die Paarverteilungsfunktion (PDF) beschreibt die Wahrscheinlichkeit, zwei Atome eines Materials in einem Abstand r voneinander zu finden. Diese Methode bewährt sich seit längerer Zeit zur Untersuchung von Gläsern, Flüssigkeiten, amorphen, stark fehlgeordneten und nanokristallinen anorganischen Substanzen. Die Anwendung für organische Substanzen ist jedoch relativ neu, mit etwa 20 Veröffentlichungen und Patenten insgesamt.
Im Rahmen dieser Dissertation wurden zwei Methoden zur Strukturverfeinerung und Strukturlösung organischer Substanzen anhand von PDF-Daten erfolgreich entwickelt und an diversen Beispielen validiert. Als erster Schritt hierzu wurde eine Methodenverbesserung vorgenommen. Hierbei handelte es sich um eine Verbesserung der Simulation der PDF-Kurven organischer Verbindungen anhand eines gegebenen Strukturmodells. Mit Hilfe der bisherigen Methoden können die PDF-Kurven anorganischer Substanzen erfolgreich simuliert werden. Für organische Substanzen werden bei Anwendung der bisherigen Methode die Signalbreiten der intramolekularen und intermolekularen Beiträge zu der PDF-Kurve falsch wiedergegeben, dies führt zu einer schlechten Anpassung der simulierten PDF-Daten and die experimentellen PDF-Daten. Deshalb wurde ein neuer Ansatz entwickelt, in welchem für die Berechnung der intramolekularen Beiträge zum PDF-Signal ein anderer isotroper Auslenkungsparameter verwendet wurde, als bei der Berechnung der intermolekularen Beiträge zum PDF-Signal. Mit diesem Ansatz konnte eine sehr gute Simulation der PDF-Kurve für alle Testbeispiele erzielt werden. Zur Strukturverfeinerung organischer Substanzen anhand von PDF-Daten wurden zwei Ansätze entwickelt: der Rigid-Body-Ansatz zur Behandlung starrer organischer Moleküle und der Restraint-Ansatz zur Behandlung flexibler organischer Moleküle.
Neben methodischen Entwicklungen wurden in dieser Arbeit zwei weitere Untersuchungen organischer Verbindungen mittels PDF-Analyse durchgeführt.
Es wurden drei, auf unterschiedliche Weise hergestellte, amorphe Proben des Wirkstoffes Telmisartan untersucht. Des Weiteren wurde mittels PDF-Analyse eine pharmazeutische Nanosuspension untersucht.
This thesis is concerned with quantum dynamical propagation methods suitable for high-dimensional systems, and their application to excitation energy transfer (EET), electron transfer (ET), and intra-molecular vibrational redistribution (IVR) in molecular aggregates. The theoretical description of these processes, which are often ultrafast – with time scales in the range of femtoseconds to picoseconds – is challenging, both with regard to quantum dynamical simulations and electronic structure calculations.
The present thesis comprises two parts. The first part concerns the implementation of a novel quantum dynamical method based on Gaussian Wavepackets (GWPs): the 2-Layer Gaussian-MCTDH (2L-GMCTDH) method. This method, which has recently been proposed in [S. Römer, M. Ruckenbauer, I. Burghardt, The Journal of Chemical Physics, 2013, 138, 064106] was implemented in a Fortran90 code and applied to various high-dimensional test systems. The second part of the thesis addresses the combined electronic structure and dynamical study of a novel type of donor-acceptor systems that have been investigated in a joint project with experimental collaboration partners at Strasbourg University. In both parts, numerical applications focus on high-dimensional model Hamiltonians for EET and ET processes.
Regarding the first part, the interest of using GWP-based methods is two-fold: First, GWPs represent spatially localized basis sets that are useful for on-the-fly dynamics in conjunction with electronic structure calculations. Second, they are naturally suited for the explicit representation of quantum mechanical system-bath type problems where a large number of vibrational bath modes are weakly perturbed from equilibrium. In this context, various methods exist that are based upon classically evolving GWP bases. A major improvement results from variational methods which involve optimized, non-classical GWP trajectories. In particular, the variational Gaussian-based Multi-Configuration Time-Dependent Hartree (GMCTDH) and its variational Multi-Configurational Gaussians (vMCG) variant were originally derived as semiclassical variants of the Multi-Configuration Time-Dependent Hartree (MCTDH) method. However, the G-MCTDH and vMCG methods mostly use Frozen Gaussian (FG) basis sets that are far less flexible than the single-particle (SPF) representation of standard MCTDH. As a consequence, a significantly larger number of GWPs are generally required to reach convergence. To remedy the lack of flexibility of the FG basis sets, the abovementioned two-layer (2L-G-MCTDH) approach has been introduced: Here, the first layer is composed of flexible SPFs, while the second layer is composed of low-dimensional FGs. The numerical scaling properties are significantly improved as compared with the conventional G-MCTDH and vMCG schemes. The first implementation of the method in an in-house Fortran90 code is presented, along with applications to (i) a model of site-to-site vibrational energy flow in the presence of intra-site vibrational energy redistribution (IVR) and (ii) a multidimensional donor-acceptor electron transfer system described within a linear vibronic coupling model. The second system relates to a model for ET at an oligothiophene-fullerene interface relevant to organic photovoltaics. Besides the description of the implementation, a detailed assessment of the convergence properties and comparison with multi-layer MCTDH (ML-MCTDH) benchmark calculations is presented. Finally, a perspective is given on the future combination with the existing ML-MCTDH scheme; indeed, such a combination is straightforward since the first layer of the 2L-G-MCTDH approach can be chosen to be orthogonal.
Regarding the second part of the thesis, two generations of a novel donor-acceptor (DA) system for organic photovoltaics applications, involving self-assembled block co-oligomers DA dyads and triads with perylene-diimide (PDI) accepter units, are addressed within a collaborative project with S. Haacke and S. Mery (University of Strasbourg). Based upon detailed excited-state electronic structure investigations along with quantum dynamical and kinetic studies, the relevant ET formation and recombination steps are characterized quantitatively, in view of optimizing the chemical design and reducing recombination losses.
In a first-generation variant of the abovementioned DA systems, which involves liquid-crystalline triads, we were able to show that a highly efficient inter-chain ET process prevails over intra-molecular ET, leading to fast recombination. Due to the latter, this system turns out to be inefficient for photovoltaic applications. To fully understand the elementary steps, high-dimensional quantum dynamics simulations were carried out using the ML-MCTDH method, in collaboration with Matthias Polkehn from our group. In the second-generation variant, which is in the focus of the present thesis, both the nanomorphology and the chemical design were modified. The present work, focuses upon the aspect of chemical design, by characterizing a series of modified DA’s, with donor units of varying length while the PDI accepter units remain unchanged. The intra-molecular ET is observed in these systems, but the processes are comparatively slow, of the order of tens to hundreds of picoseconds. Hence, a kinetic analysis using the Marcus-Levich-Jortner rate theory is employed. Among the main results of the study is that addition of an electron donating amine unit strongly increases the lifetime of the charge-separated state, and therefore reduced recombination losses.
Overall, the present thesis shows how a combination of high-dimensional quantum dynamics, electronic structure calculations, and vibronic coupling model Hamiltonians can be employed to obtain an accurate picture of EET, ET, and IVR in high-dimensional molecular assemblies. Furthermore, the 2L-GMCTDH method paves the way for accurate and efficient on-the-fly calculations; a suitable set-up for such calculations is currently in progress.
In dieser Dissertation wurde die Rolle des Proteins Carboxypeptidase E (CPE) im Glioblastom (GBM) untersucht. Ursprünglich wurde CPE in der neuroendokrinen Regulation beschrieben, wo es die Reifung der meisten Neuropeptide und Hormone reguliert und somit Einfluss auf Stoffwechsel und humorale Effekte hat (Fricker et al., 1982; Fricker & Snyder, 1982 and 1983; Davidson & Hutton, 1987; Shen & Loh, 1997; Lou et al., 2005). Ab 1989 wurde CPE in unterschiedlichen Tumorentitäten nachgewiesen (Grimwood et al., 1989; Manser et al., 1991), jedoch ohne Hinweise, welche Bedeutung das Protein dort haben könnte. Erst im letzten Jahrzehnt konnten sowohl pro- als auch anti-tumorigene Wirkungen von CPE gezeigt werden. Die beschriebenen Wirkungen von CPE sind jedoch von dessen Isoform abhängig. Das ∂(delta)N-trunkierte CPE zeigte sich mit erhöhtem Tumorwachstum und schlechter Überlebensprognose in verschiedenen Krebsentitäten assoziiert (Murthy et al., 2010; Lee et al., 2011; Zhou et al., 2013). Im Gegensatz dazu verringerte sezerniertes CPE (sCPE) im Fibrosarkom und Glioblastom die Zellmigration, was einen anti-tumorigenen Effekt suggeriert (Höring et al., 2012; Murthy et al., 2013a). Die Molekularmechanismen, die für die Regulation der Migration zuständig sind, sind jedoch kaum untersucht. Die meisten Untersuchungen von sCPE in Normal- und Tumorgewebe beschränken sich hauptsächlich auf Apoptose und Zellüberleben (Skalka et al., 2013; Murthy et al., 2013b; Cheng et al., 2013; Selvaraj et al., 2015; Cheng et al., 2015). Die vorliegende Arbeit ist demzufolge die erste Studie, die sich dem Mechanismus der Migrationsregulation durch sCPE im Glioblastom widmet.
Humane Gliome stellen die größte und bösartigste Gruppe hirneigener Tumore dar. Bösartige Gliome sind höchst resistent gegen alle zurzeit verfügbaren Behandlungsmethoden. Einer der Hauptgründe dafür ist, dass die Tumorzellen durch diffuse Infiltration in das Gehirn einwandern können. Ferner sind Gliomzellen metabolisch sehr aktiv und können sich dadurch an schnell verändertes Milieu anpassen (Fack et al., 2015; Demeure et al., 2016). Über die grundlegenden Mechanismen für diese Art des infiltrierenden Tumorwachstums ist bisher noch nicht viel bekannt. Zurzeit sind nur wenige Schlüsselfaktoren beschrieben, die den sogenannten Mechanismus der Migration oder Proliferation ("go or grow") in bösartigen Tumoren beeinflussen: wenige Transkriptionsfaktoren, miRNAs sowie metabolische Faktoren. Interessanterweise, sind miRNAs zum Teil mit der Regulation des Metabolismus in Tumorzellen assoziiert. Eine vorangehende Studie aus unserem Labor hat sCPE aufgrund seines Potentials, Zellwanderung zu verringern, als einen weiteren Schlüsselfaktor identifiziert. Wir konnten zeigen, dass sCPE in der Gliomzelllinie LNT-229 zur einer differentiellen Regulation von Migration und Proliferation führt (Höring et al., 2012). Die vorliegende Arbeit widmet sich nun der Frage nach den genauen zugrundeliegenden Mechanismen, wie sCPE seine Effekte auf molekularer Ebene vermittelt. Darüber hinaus soll geklärt werden, ob sCPE auch in der metabolischen Adaptation eine Rolle spielt und dadurch ebenfalls die Gliomzellmigration beeinflußen kann.
Proteinen die ExHepatitis C ist eine entzündliche Erkrankung der Leber, die durch das Hepatitis-C-Virus (HCV) verursacht wird. Trotz vieler Bemühungen ist heutzutage immer noch keine prophylaktische Vakzinierung verfügbar. Neuartige Therapien versprechen eine hohe Heilungsrate, sind aber mit hohen Kosten verbunden. HCV induziert oxidativen Stress, welcher für das Auftreten und die Progression der Pathogenese eine zentrale Rolle spielt. Um zellulären Stress (z.B. durch ROS) entgegenzuwirken, haben Zellen cytoprotective und detoxifizierende Mechanismen entwickelt, die die zelluläre Homöostase aufrechterhalten. Dabei kontrolliert der redoxsensitive Transkriptionsfaktor Nrf2 als Heterodimer zusammen mit sMaf- pression von cytoprotective und ROS-detoxifizierenden Genen. Vorherige Studien haben gezeigt, dass HCV den Nrf2/ARE-Signalweg beeinträchtigt. Dabei induziert HCV eine Translokation der sMaf-Proteine aus dem Zellkern in das Cytoplasma, wo diese das virale Protein NS3 binden. Im Cytoplasma lokalisierte sMaf-Proteine verhindern dadurch eine Translokation von Nrf2 in den Zellkern. Folglich ist die Expression von Nrf2/ARE-abhängigen cytoprotective Genen inhibiert und intrazelluläre ROS-Spiegel dauerhaft erhöht. Ein weiterer zentraler cytoprotective Mechanismus ist die Autophagie. Sie dient der Aufrechterhaltung der zellulären Homöostase durch den Abbau von defekten Proteinen und Organellen. Des Weiteren ist bekannt, dass Autophagie nicht nur im Laufe von Nährstoffmangel induziert wird, sondern auch durch erhöhte Mengen an ROS. In sämtlichen Studien konnte beobachtet werden, dass Autophagie für die Aufrechterhaltung des viralen Lebenszyklus eine wesentliche Rolle spielt, da sie mit der Ausbildung des membranous web, der Translation, der Replikation und der Freisetzung des Virus interferiert. Ausgehend davon sollte in dieser Arbeit zunächst die Relevanz von HCV-induziertem oxidativen Stress, resultierend aus der Nrf2/ARE-Signalweginhibition, als möglicher Aktivator der Autophagie untersucht werden. Dabei wurde in HCV-positiven Zellen eine Akkumulation von LC3-II beobachtet, was auf eine Induktion der Autophagie schließen lässt. In Übereinstimmung damit wurde eine erhöhte Expression von Autophagie-Markerproteinen in HCV-infizierten PHHs detektiert. Im Laufe der Autophagie wird p62 abgebaut. Somit sollte eine Induktion der Autophagie in einer Verminderung der Menge an p62 resultieren. Nichtsdestotrotz ist eine Akkumulation von p62 in HCV-positiven Zellen nachzuweisen. Dies erscheint zunächst widersprüchlich. Aufgrund der Tatsache, dass die Expression der katalytischen Untereinheit des Proteasoms (PSMB5) Nrf2-abhängig ist, führt die beeinträchtigte Nrf2-Aktivität in HCV-positiven Zellen jedoch zu einer verringerten Aktivität des konstitutiven Proteasoms. Dieser Befund kann auch die erhöhte Halbwertzeit von p62 in HCV-positiven Zellen erklären. Kürzlich wurde ein Zusammenspiel des Nrf2/ARE-Signalwegs und der Autophagie beobachtet. Dabei kann Nrf2 nicht nur über den kanonischen Signalweg aktiviert werden, sondern auch durch eine direkte Interaktion des phosphorylierten Autophagie-Adaptorproteins p62 (pS[349] p62) mit Keap1. In HCV-positiven Zellen können nicht nur eine Zunahme der Gesamtmenge von p62 beobachtet werden, sondern auch erhöhte Mengen an pS[349] p62. Die Berechnung des Quotienten aus pS[349] p62 und p62 zeigt in etwa eine Verdopplung der Menge an pS[349] p62 , was auf eine vermehrte Phosphorylierung von p62 in HCV-positiven Zellen rückschließen lässt. Des Weiteren konnte beobachtet werden, dass erhöhte Mengen an ROS, wie sie auch in HCV-positiven Zellen vorkommen, Autophagie induzieren können, die durch eine Akkumulation von LC3-II und die Zunahme von LC3 Puncta charakterisiert ist. Auch eine Zunahme von pS[349] p62 konnte beobachtet werden. Ferner resultierte die Überexpression der phosphomimetischen Mutante (p62 [S351E]) in einer Akkumulation von LC3-II, was auf die Fähigkeit von pS[349] p62 rückschließen lässt, Autophagie zu induzieren. Eine Modulation der Autophagie mittels der Inhibitoren 3-Methyladenin und Bafilomycin führte zu einer inhibierten Freisetzung von infektiösen viralen Partikeln und unterstreicht damit, dass der Autophagie eine essentielle Bedeutung bei der Freisetzung viraler Partikel zukommt. Eine HCV-Infektion wird sowohl von erhöhten Mengen an ROS als auch von einer Induktion der Autophagie begleitet. Dementsprechend führte eine Verminderung des intrazellulären Radikalspiegels durch eine Inkubation mit den Radikalfängern PDTC und NAC zu geringeren Mengen an LC3-II und pS[349] p62. Dabei konnte auch eine Abnahme der freigesetzten infektiösen viralen Partikel beobachtet werden, was ein Zusammenspiel zwischen erhöhten Mengen an ROS, Induktion der Autophagie und Virusfreisetzung nahelegt. Vorschlag: Erhöhte Mengen an ROS werden durch eine Aktivierung des Nrf2/ARE-Signalwegs detoxifiziert und würden somit den zuvor beschriebenen viralen Mechanismus verhindern. HCV die Aktivierung Nrf2/ARE-regulierter Gene beeinträchtigt, wurde die Hypothese aufgestellt, dass in HCV-positiven Zellen dieser komplexe Mechanismus dazu dient, die Translokation des pS[349] p62-abhängig freigesetzte Nrf2 in den Zellkern zu verhindern. Das wiederum hat eine eingeschränkte Expression von Nrf2/ARE-abhängigen Genen und Detoxifizierung von ROS zur Folge. Um diese Hypothese experimentell zu untersuchen, wurden HCV-positive und negative Zellen cotransfiziert mit dem p62 Wildtyp (p62 [wt]), der p62 phosphomimetischen Mutante (p62 [S351E]) oder einem Kontrollplasmid in Kombination mit einem Reporterkonstrukt, welches die Nrf2-Aktivierung darstellt (OKD48). Während in HCV-negativen Zellen im Vergleich zum p62 [wt] eine Transfektion mit p62 [S351E] zu einer signifikanten Aktivierung des Nrf2-abhängigen Reportergens führt konnte dies in HCV-positiven Zellen nicht beobachtet werden. Zusammengenommen beschreiben diese Ergebnisse einen neuartigen Mechanismus wie HCV das Zusammenspiel zwischen dem Nrf2/ARE-Signalweg, erhöhten Mengen an ROS und Autophagie beeinflusst. Dabei übt HCV einen negativen Effekt auf den Nrf2/ARE-Signalweg aus, um dem pS[349] p62-abhängig freigesetzten Nrf2 zu entkommen. Folglich werden erhöhte Mengen an ROS aufrechterhalten, die eine Induktion der Autophagie ermöglichen, welche für die Freisetzung viraler Partikel essentiell ist.
Die einzelnen Forschungsprojek
te sollen den breit aufgestellten Anwendungsbereich der Röntgenpulverdiffraktometrie im Bereich der Klärung von wissenschaftlichen Problemstellungen mit weiteren Beispielen komplementieren. Weiter soll die Nutzung der Synergie aus der kombinierten Anwendung von diversen strukturaufklärenden Methoden an polykristallinen Festkörpern aufgezeigt werden. Verwendet werden dazu Testsubstanzen aus verschiedenen, breit gefächerten Stoffklassen. Zum Einen wird die erfolgreiche Kristallstrukturbestimmung aus Röntgenpulverbeugungsdaten an einem diradikalischen Azobenzol-Derivates 1 (4-4'-Diazendiylbis[(1,4-phenyl)-bis-(carbonyloxy)]bis(2,2,6,6-tetramethylpiperidinyloxidanyl) gezeigt. Die Substanzklasse der diradikalischen Verbindungen ist für die Bestimmung von Radikal-Radikal-Abständen per EPR-Methoden (electron paramagnetic resonance) sehr wichtig. Zur Validierung der ermittelten Abstände aus den EPR-Messungen musste der Radikal-Radikal-Abstand vorab bekannt sein. Der intramolekulare Radikal-Radikal-Abstand von 23,658(6) Å. welcher im gewünschten Radikal-Radikal-Abstandsbereich für EPR-Messungen liegt, somit konnte 1 als Testsubstanz für Abstandsbestimmungen mittels EPR validiert werden. Die vorliegende
Kristallstruktur wurde in der Raumgruppe P21/c (Z = 2, Z’ = 0,5) mit a = 19,3355(5) Å, b = 5,9277(2) Å, c = 14,5264(4) Å, β = 109,22(1)° und einem Volumen V = 1572,12(8) ų ermittelt. Der Molekülmittelpunkt von 1 liegt auf einem kristallographischen Inversionszentrum und das aromatische Fragment von Estergruppe zu Estergruppe bildet annähernd eine Ebene. Anhand der Kristallstrukturbestimmung aus Röntgenpulverbeugungsdaten soll die
Lokalisierung eines Wasserstoffatoms in direkter Nachbarschaft zu Molekülfragmenten mit einer hohen Anzahl an Chlorsubstituenten untersucht werden. Am Beispiel der Bestimmung des tautomeren Zustands des achtfach chlorierten Color Index Pigment Yellow 138 (P.Y. 138) kann die Synergie aus quantenchemischen Rechnungen, Festkörper-NMR-Messungen und der Kristallstrukturbestimmung aus Röntgenpulverbeugungsdaten gezeigt werden. Hierbei wurden unter anderen unterschiedliche Kristallstrukturverfeinerungsstrategien zur Ermittlung des tautomeren Zustands entwickelt und angewendet. P.Y. 138 liegt in der monoklinen Raumgruppe P21/c (Z = 4, Z’ = 1) mit a = 19,3750(5) Å, b = 7,8516(1) Å, c = 16,9704(4) Å, β = 105,649(2)° und V = 2485,9(1) ų als NH-Tautomer vor. Es bilden sich Molekülschichten parallel zur (100)-Ebene aus. Innerhalb der Schichten wirken Van-der-Waals-Kräfte; zwischen den Schichten dominieren Typ I Cl⋯Cl-Wechselwirkungen. An dem pharmazeutisch aktiven Wirkstoffes Flupirtinmaleat wird die immer noch hohe Relevanz der Röntgenpulverdiffraktometrie bei einer Polymorphiesuche gezeigt. Flupirtinmaleat ist aufgrund seiner analgetischen Wirkung, ohne typische weitere Eigenschaften von Schmerzmittel wie beispielsweise opiode oder herzrhythmusbeeinflussende aufzuweisen, eine höchst interessante Substanz. Neue Polymorphe können bessere Eigenschaften als die Ausgangsphase aufweisen oder auch den wirtschaftlichen Nutzen erhöhen, da diese patentierbar oder kostengünstiger und ressourcenschonender in der Herstellung sein können. Für das Flupirtinmaleat-Projekt wurden Aufnahme und Auswertung von Röntgenpulverdiffraktogrammen als standardisierte analytische Methoden zur Bestimmung von neuen kristallinen Phasen bei einer sehr großen Probenanzahl von über 500 Einzelversuchen, welche bei Polymorphiesuchen aufkommt, genutzt. Von der pharmazeutisch aktiven Substanz Flupirtinmaleat ist es gelungen, die neuen Festkörperphasen C, F, G und H zu entdecken. Ebenfalls konnte durch Vermahlungsexperimente Flupirtinbromid erzeugt werden. Des Weiteren wurden die Einkristallstrukturen von Flupirtinmaleat Form A und Flupirtin Phase B bestimmt. Das letzte Projektkapitel zeigt den Beginn einer methodischen Entwicklung zur Konfigurationsbestimmung von chiralen Molekülen aus Röntgenpulverbeugungsdaten. Ziel
der Methode ist es, ein schnelles Verfahren zur Ermittlung der absoluten Konfiguration und Strukturaufklärung von neu entwickelten Substanzen beispielsweise für pharmazeutische Wirkstoffe zu haben. Bei der Einkristallstrukturanalyse kann aus dem Reflexbild anhand von Intensitätsunterschieden spezieller Reflexpaare die Konfiguration einer Verbindung direkt bestimmt werden. Da dies bei Röntgenpulverdiffraktogrammen nicht der Fall ist, kann diese
Methode nicht angewendet werden. Zur Umsetzung des Leitgedankens sollen daher chirale Salze aus der Zielsubstanz mit unbekannter Konfiguration und einem Salzbildner bekannter Chiralität erzeugt werden. Der Drehsinn des bekannten Salzbildners soll sozusagen als
Ankerpunkt für die Bestimmung der absoluten Konfiguration dienen. Da ein Anwendungsschwerpunkt die pharmazeutische Forschung sein könnte, wurden als Grundlage der Methodenentwicklung chirale Testsysteme bestehend aus pharmazeutischen Wirkstoffen und Salzbildnern jeweils mit bekannter Konfiguration. Acht neue Entitäten von verschiedenen Wirkstoff-Salzbildner-Paaren konnten erzeugt und mittels Röntgenpulverbeugungsdaten bestätigt werden. Dies zeigt, dass durch Kristallisation wahrscheinlich durch Salzbildung, neue Entitäten mit einem Ankerpunkten zur späteren Konfigurationsbestimmung erzeugbar sind. Ebenfalls konnten aus Einkristallbeugungsdaten die Kristallstruktur von R-Flurbiprofen und Kristallstrukturen der Salze aus R-Flurbiprofen mit R-Phenylpropylamin und R-Aminoglutethimid mit R-Camphersulfonsäure bestimmt werden. Diese Kristallstrukturen, ganz speziell die der Salze, können im weiteren Verlauf zum Vergleich und/oder zur Validierung mit den Kristallstrukturen aus Röntgenpulverbeugungsdaten dienen. Hervorzuheben sind die Kristallisationsprodukte aus S-Flurbiprofen bzw. R-Flurbiprofen mit R-Phenylpropylamin, da diese voneinander unterscheidbare Röntgenpulverdiffraktogramme aufweisen die enantiomeren Ausgangsstoffe S- und R-Flurbiprofen jedoch nicht. Dies legt nahe, dass es grundsätzlich möglich sein sollte eine Konfigurationsbestimmung aus Röntgenpulverbeugungsdaten durchzuführen.
Riboswitches are an important class of regulatory RNA elements that respond to cellular metabolite concentrations to regulate gene expression in a highly selective manner. 2’-deoxyguanosine-sensing (2’dG) riboswitches represent a unique riboswitch subclass only found in the bacterium Mesoplasma florum and are closely related to adenine- and guanine-sensing riboswitches. The I-A type 2’dG-sensing riboswitch represses the expression of ribonucleotide reductase genes at high cellular concentrations of 2’dG as a result of premature transcription termination.
Increasing evidence within the last decade suggests that transcriptional regulation by riboswitches is controlled kinetically and emphasizes the importance of co-transcriptional folding.2–4 Addition of single nucleotides to nascent transcripts causes a continuous shift in structural equilibrium, where refolding rates are competing with the rate of transcription.5,6
For transcriptional riboswitches, both ligand binding and structural rearrangements within the expression platform are precisely coordinated in time with the rate of transcription. The current thesis investigates the mechanistic details of transcriptional riboswitch regulation using the I-A 2’dG-sensing riboswitch as an example for a riboswitch that acts under kinetic control.
Das Hauptziel dieser Dissertation lag in der Verbesserung einzelner Schritte im Prozess der automatischen Proteinstrukturbestimmung mittels Kernmagnetischer Resonanz (NMR). Dieser Prozess besteht aus einer Reihe von sequenziellen Schritten, welche zum Teil bereits erfolgreich automatisiert wurden. CYANA ist ein Programmpaket, welches routinemäßig zur automatischen Zuordnung der chemischen Verschiebungen, der Nuclear Overhauser Enhancement (NOE) Signalen und der Strukturrechnung von Proteinen verwendet wird. Einer der Schritte, der noch nicht erfolgreich automatisiert wurde, stellt die Signalidentifizierung von NMR Spektren dar. Dieser Schritt ist besonders wichtig, da Listen von NMR-Signalen Grundlage aller Folgeschritte sind. Fehler in den Signallisten pflanzen sich in allen Folgeschritten der Datenauswertung fort und können am Ende in falschen Strukturen resultieren. Daher war ein Ziel dieser Arbeit, einen robusten und verlässlichen Algorithmus zur Signalidentifizierung von NMR Spektren in CYANA zu implementieren. Dieser Algorithmus sollte mit dem in FLYA implementierten Ansatz zur automatischen Resonanzzuordnung, der automatischen NOE-Zuordnung und der Strukturrechnung mit CYANA kombiniert werden. Der in CYANA implementierte CYPICK Algorithmus ahmt den von Hand durchgeführten Ansatz nach. Bei der manuellen Methode schaut sich der Wissenschaftler zweidimensionale Konturliniendarstellungen der NMR Spektren an und entscheidet anhand verschiedener Geomtrie- und Ähnlichkeitskriterien, ob es sich um ein Signal des Proteins oder um einen Artefakt handelt. Proteinsignale sind ähnlich zu konzentrischen Ellipsen und erfüllen bestimmte geometrische Kriterien, wie zum Beispiel ungefähr kreisförmiges Aussehen nach entsprechender Skalierung der spektralen Achsen und gänzlich konvexe Formen, die Artefakte nicht aufzeigen. CYPICK bewertet die Konturlinien lokaler Extrema nach diesen Bedingungen und entscheidet anhand dieser, ob es sich um ein echtes Signal handelt oder nicht. Das zweite Ziel dieser Arbeit war es ein Maß zur Quantifizierung der Information von strukturellen NMR Distanzeinschränkungen zu entwickeln. Der sogenannte Informationsgehalt (I) ist vergleichbar mit der Auflösung in der Röntgenkristallographie. Ein weiteres Projekt dieser Dissertation beschäftigte sich mit der strukturbasierten Medikamentenentwicklung (SBDD). SBDD wird meist von der Röntgenkristallographie durchgeführt. NMR hat jedoch einige Vorteile gegenüber der Röntgenkristallographie, welche interessant für SBDD sind. Daher wurden Strategien entwickelt, die NMR für SBDD zugänglicher machen sollen.
Respiration is one of the key processes of energy transduction used by the cell. It consists of two components: electron transfer and ATP production. The electron transfer chain converts the energy released from several biochemical redox reactions into an electrochemical proton gradient across membranes. This stored energy is used as the driving force for the production of ATP by the ATP synthase. The mitochondrial electron transfer chain contains four major protein complexes called complexes I-IV, with counting starting at the lower side of the redox potentials. It has been discussed for a long time how these protein complexes are organized in the membranes. Do they diffuse freely in the membrane? Alternatively, do they form a supercomplex built up of several neighboring complexes? The evidence supporting the free diffusion mode is that both electron transfer intermediates (cytochrome c and quinone) behave as “pool”. However, respiratory supercomplexes have been detected in membranes from bacteria, fungi, yeast, plant and animal during the last decade, and sometimes the respiratory complexes are only stable inside a supercomplex. Therefore, the idea of supercomplex formation has become more popular. The argument that the supercomplex arises from solubilization and is a detergent artifact could be rejected because: 1) supercomplexes can be isolated from many organisms in an active form; 2) supercomplexes have been proven to stabilize the individual complexes in some cases; 3) supercomplexes can be very stable after chromatographic isolation in some cases....
Biophysical studies of the translation-regulating add adenine riboswitch from Vibrio vulnificus
(2017)
Bacterial gene expression can be regulated at mRNA level by cis-acting mRNA elements termed riboswitches. Riboswitches operate by conformational switching between a ligand-free and a ligand-bound state with different structures that either activate or inhibit gene expression. This PhD thesis contributes to the molecular level understanding of full-length purine riboswitches. It presents biophysical investigations on the ligand-dependent folding of the full-length translation-regulating add adenine riboswitch from the gram-negative human pathogenic marine bacterium Vibrio vulnificus (Asw). Asw has the typical bipartite riboswitch architecture with a 5’ ligand-sensing aptamer domain and a 3’ regulatory domain termed expression platform. According to the working hypothesis, Asw employs a unique thermodynamically-controlled 3-state conformational switching mechanism between an apoB, an apoA and a holo conformation to regulate translation initiation in a temperature-compensated manner. The two apo conformations are the putative translation-OFF states and the holo conformation is the putative translation-ON state of Asw. In the main project of this PhD thesis, an integrated nuclear magnetic resonance (NMR) and smFRET spectroscopic study of the full-length 112-nucleotide Asw (112Asw) was performed. The adenine-dependent folding of 112Asw was monitored at the level of base pairing interactions by NMR of the RNA imino protons, and at the level of three long-range intramolecular distances by smFRET of immobilized molecules. The integrated NMR and smFRET spectroscopic study of 112Asw yielded two major findings. First, NMR and smFRET both revealed that adenine binding to 112Asw impedes apoB formation by stabilizing the apoA secondary structure in the holo conformation without modulating tertiary structural interactions between the two riboswitch domains. This highlights the central role of competitive P1 and P4 helix formation at the interface of the aptamer and the expression platform for switching the accessibility of the ribosome binding site of 112Asw. Moreover, it strongly corroborates the hypothesis that purine riboswitches in general operate according to the key principle of a spatially decoupled secondary structural allosteric switch that proceeds without ligand-induced tertiary structural interactions between the aptamer domain and the expression platform. Second, it was uncovered by smFRET that the apoA and the holo conformation of 112Asw do not adopt a single folding state at near-physiological Mg2+ concentration. Instead, apoA and holo exhibit a persistent dynamic equilibrium between substates with an undocked (U), a short-lived docked (D1; ~s) and a Mg2+-bound long-lived docked (D2; ~10 s) aptamer kissing loop motif. In the holo conformation, the fractional population of the long-lived docked substate is ~2-fold increased compared to the apoA conformation, but undocked and docked substates are still comparably stable. The here described multiple folding states of the apoA and the holo conformation might have regulatory properties that are in between the apoB translation-OFF state and the holo-D2 translation-ON state. Additonally, an integrated NMR and smFRET analysis of 127-nucleotide Asw (127Asw) is presented. Compared to 112Asw, 127Asw is 3’-elongated by 15 nucleotides of the adenosine deaminase encoding sequence of the add gene from Vibrio vulnificus. 127Asw was chosen as mRNA template for future investigations of the interaction between Asw and the 30S ribosomal subunit. The NMR spectra of 127Asw demonstrated that 127Asw has the same overall secondary structure as 112Asw. Like for 112Asw, the combined NMR and smFRET analysis of 127Asw showed that adenine binding impedes apoB formation and stabilizes a long-lived docked aptamer kissing loop fold. However, compared to 112Asw, 127Asw has a destabilized aptamer kissing loop motif and a stabilized P4 helix in the expression platform. Finally, ligand-observed studies of the transient encounter complex between Asw and the near-cognate ligand hypoxanthine are described. By competition binding WaterLOGSY NMR experiments with hypoxanthine and the adenine analogue 2,6-diaminopurine, it could be shown that hypoxanthine binds to the same binding site of 112Asw as the cognate ligand adenine. The hypoxanthine binding constant measured with the WaterLOGSY method is in the low mM range (1.8 mM) and substantially exceeds the physiological hypoxanthine concentration in E. coli (~0.3 mM), thus ruling out that hypoxanthine binding can significantly impact the translational regulation of Asw in vivo. Also, preliminary FTIR difference spectra of 13C,15N-labelled and unlabelled hypoxanthine in complex with the pbuE adenine riboswitch aptamer and the xpt guanine riboswitch aptamer are discussed. These spectra showed a pattern of multiple IR bands that appeared to be characteristic for the respective complex.
In der organischen Elektronik werden Moleküle mit konjugierten pi-Elektronensystemen als Halbleiter und Lichtemitter eingesetzt. Für die Fabrikation fortschrittlicher elektronischer Bauelemente, wie z. B.organischer Leuchtdioden, werden Materialien mit besonderen optoelektronischen Eigenschaften benötigt.Die Stoffklasse der Arylamine ist für den Transport positiver Ladungen etabliert, da die exozyklischen Stickstoffatome Elektronenlöcher mesomer zu stabilisieren vermögen. Komplementär dazu sind auch Materialien für den Transport negativer Ladungen in der organischen Elektronik unverzichtbar. Zu diesem Zweck sollten borhaltige Verbindungen ideal geeignet sein, da das Element Bor weniger Valenzelektronen als Kohlenstoff besitzt und Arylborane daher im Vergleich zu den entsprechenden Kohlenwasserstoffen eine geringere Elektronendichte aufweisen. Als Halbleitermaterialien sind Arylborane jedoch nicht so weit verbreitet wie Arylamine, da die Instabilität vieler Vertreter gegenüber Luft und Feuchtigkeit sowie der Mangel an effizienten Synthesemethoden ihre Anwendung verzögert haben. Um geeignete organische Elektronenleiter bereitzustellen, ist die Entwicklung stabiler, pi-konjugierter Borane erstrebenswert. Ansatzpunkte für diese Arbeit waren Erkenntnisse aus der vorangegangenen Masterarbeit, sowie Beispiele für hydrolysestabile Arylborane, welche in der jüngeren Vergangenheit von M. Wagner et al. Und S. Yamaguchi et al. veröffentlicht wurden. Im Rahmen der vorliegenden Arbeit gelang die Entwicklung einer modularen Synthesestrategie, die einen vielseitigen Zugang zur Stoffklasse der borhaltigen polyzyklischen aromatischen Kohlenwasserstoffe (PAKs) ermöglicht: Ausgehend von einem gut verfügbaren siliziumhaltigen Startmaterial und diversen, zum Großteil kommerziell erhältlichen, Carbonylverbindungen wurden mehr als zwanzig verschiedene Triarylborane dargestellt. Dabei wurde eine Auswahl spezieller Reaktionstypen nach den jeweiligen Erfordernissen in geeigneter Weise miteinander kombiniert. Zu diesen gehörte die Peterson-Olefinierung zum Aufbau drei- und vierfach substituierter Alkene, die Photozyklisierung der resultierenden Stilben-artigen Verbindungen, eine Ru(II)-katalysierte Reaktion zur Benzanellierung und der Silizium/Bor Austausch mittels BBr3. An wichtigen Zwischenprodukten wurden Reaktivitätsstudien durchgeführt, um die Anwendungsmöglichkeiten und Einschränkungen dieser Synthesestrategie zu ergründen. Um die Stabilität der Produkte gegenüber Luft und Feuchtigkeit zu gewährleisten, wurden die reaktiven Borzentren in bewährter Weise durch Einführung eines sterisch anspruchsvollen Mesitylsubstituenten kinetisch abgeschirmt. Die überwiegende Zahl der synthetisierten borhaltigen PAKs erwies sich als absolut unempfindlich gegenüber Wasser und konnte mit den gängigen Methoden der organischen Chemie (z. B. Säulenchromatographie an Kieselgel) gereinigt werden. Als Alternative zur sterischen Abschirmung wurde der Einbau des Boratoms in ein starres Molekülgerüst an einem Ausführungsbeispiel verwirklicht. Diese zweite Möglichkeit der Stabilisierung stellte sich in Bezug auf die Eigenschaften des Produkts als vergleichbar heraus, erforderte aber einen größeren synthetischen Aufwand und lieferte eine geringere Ausbeute über die gesamte Reaktionssequenz. Die in dieser Arbeit dargestellten borhaltigen PAKs wurden mittels Röntgenkristallographie umfassend strukturell charakterisiert. Die intensiv genutzten Methoden Cyclovoltammetrie, UV/vis- und Fluoreszenzspektroskopie gewährten zusätzlich einen detaillierten Einblick in ihre elektronischen Strukturen. Die Synthese und systematische Variation der Moleküle führten zu neuen Erkenntnissen über grundlegende Struktur-Eigenschafts-Beziehungen. Insbesondere zeigten diese Vergleiche, dass in ladungsneutralen Triarylboranen keine Delokalisation der pi-Elektronen über das leere p-Orbital eines Boratoms stattfindet. Von entscheidender Bedeutung für die elektronische Struktur borhaltiger PAKs ist das Gerüst aus sp2-hybridisierten Kohlenstoffatomen: Wenn mindestens zwei der Arylsubstituenten am Boratom zu einem gemeinsamen Gefüge verbrückt sind, zeigen diese Verbindungen elektronische Übergänge im sichtbaren Bereich des elektromagnetischen Spektrums und in den meisten Fällen auch eine intensive Fluoreszenz. Des Weiteren besitzen diese borhaltigen PAKs eine hohe Elektronenaffinität und lassen sich elektrochemisch reversibel reduzieren. Damit erfüllen sie bedeutende Kriterien für eine mögliche Anwendung als Elektronenleiter. Von den Molekülen mit ausgedehntem pi-Elektronensystem ließen sich manche zusätzlich reversibel oxidieren und zeichnen sich daher durch eine außergewöhnlich hohe elektrochemische Stabilität aus. An Arylboranen, deren Farbe sich durch externe Stimuli verändern lässt, wurden grundlegende Untersuchungen im Kontext der molekularen Sensorik durchgeführt. Einige der synthetisierten Verbindungen ändern ihr Absorptions- und Emissionsspektrum bei Kontakt mit Fluorid-Ionen, bei Oxidation integrierter Schwefelatome durch ein Carbonsäureperoxid, bei elektrochemischer Reduktion oder in Abhängigkeit der Polarität ihrer Umgebung. Die Ergebnisse dieser Arbeit wurden in vier Fachartikeln beschrieben und veröffentlicht (siehe Anhang). Sie können zu einem besseren Verständnis der elektronischen Eigenschaften borhaltiger PAKs beitragen und die Entwicklung neuer Halbleitermaterialien auf der Basis dieser Stoffklasse erleichtern.
Fettsäuresynthasen vom Typ I (FAS I), hier bezeichnet als Fettsäuremegasynthasen,sind Multienzymkomplexe, in denen sämtliche funktionellen Domänen für die de-novo-Synthese von Fettsäuren einen strukturellen Verbund eingehen. Auch das für den Transport von Edukten und Intermediaten nötige Acyl Carrier Protein (ACP) ist kovalent gebundener Teil dieses Komplexes, der so zu einer hocheffizienten molekularen Maschine zur Massenproduktion dieser grundlegend essentiellen Zellbausteine wird. Die FAS I aus Pilzen (fFAS), als Gegenstand dieser Arbeit, mit einer Masse von bis zu 2,7 MDa ist heute in ihrer Struktur durch Röntgenkristallographische sowie elektronenmikroskopische Methoden gut charakterisiert. 48 funktionelle Domänen sind zu einem geschlossenen Reaktionskörper angeordnet, indem sie in einer strukturgebenden Matrix aus Expansionen und Insertionen bzgl. der enzymatischen Kerndomänen eingebettet sind, die 50% des gesamten Proteins ausmacht. Neben den zahlreichen strukturellen Informationen über fFAS ist jedoch noch wenig über ihre Assemblierung verstanden. Dabei ist sie nicht nur als ein Beispiel für das generelle Verständnis von Assemblierungsmechanismen von Multienzymkomplexen interessant, sondern wird hier auch als Ziel eines inhibitorischen Eingriffs betrachtet, um eine neue antimykotische Wirkstrategie abseits des Ausschaltens aktiver Zentren zu evaluieren. Nur wenn die Mechanismen und Wechselwirkungen im Assemblierungsprozess offen gelegt sind, lassen sie sich später gezielt attackieren. Essentielle Sekundärstrukturmotive müssen identifiziert und bewertet werden, um sie einer weiteren Evaluation als Drug-Target-Kandidaten zugänglich zu machen. In dieser Arbeit werden Resultate aus in-vivo-Experimenten an rational mutierten fFAS-Konstrukten unter Zuhilfenahme einer evolutionären Betrachtung der fFAS gemeinsam mit Erkenntnissen aus andernorts geleisteten in-vitro-Experimenten an fFAS-Fragmenten zu einem geordneten Assemblierungsweg der fFAS zusammengeführt. Dabei werden Evidenzen aus den Kausaltäten zentraler Anforderungen an einen Assemblierungsmechanismus der fFAS zu drei konsequenten Schlüsselschritten verdichtet, die (i) eine frühe Interaktion zweier komplementärer Polypeptidketten zu einer Pseudo-Einzelkette, (ii) eine posttranslationale Modifikation von ACP und (iii) die geordnete Reifung zum fertigen Komplex durch Selbstassemblierung der beteiligten Domänen umfassen. Durch rationale Mutationen an den Schnittstellenmotiven für die Pseudo-Einzelkettenbildung, werden diese als Schwachstelle der Assemblierung unterschiedlicher fFAS-Typen charakterisiert, wobei für S. cerevisiae nicht weniger als zwei gezielte Punktmutationen ausreichen, um die Assemblierung des gesamten Komplexes zu verhindern. Darüber hinaus zeigen Experimente mit fFAS-Konstrukten, deren Schnittstellenmotive einer intramolekular kompetitiven Wechselwirkung ausgesetzt sind, prinzipiell die Möglichkeit zur Inhibierung der fFAS-Assemblierung durch Störung der Pseudo-Einzelkettenbildung.
Membrane proteins are biological macromolecules that are located in a cell’s membrane and are responsible for essential functions within an organism, which makes them to prominent drug targets. The extraction of membrane proteins from the hydrophobic membrane bilayer to determine high-resolution crystal structures is a difficult task and only 2% of all solved proteins structures are membrane proteins. Computational methods may help to gain deeper insights into membrane protein structures and their functions. This study will give an overview of such computational methods on a representative set of membrane proteins and will provide ideas for future computational and experimental research on membrane proteins.
In a first step (chapter 2), I updated an earlier, manually-curated data set of homologous membrane proteins (HOMEP) to more recent versions in 2010 (HOMEP2) and 2013 (HOMEP3) using an automated clustering approach. High-resolution structures of membrane proteins listed in the PDB_TM database were structurally aligned and subsequently clustered using structural similarity scores. Both data sets were used as a standard gold reference set for subsequent work.
Subsequently, I have updated and applied the sequence alignment program AlignMe to determine protein descriptors that are suitable for detecting evolutionary relationship between homologous a-helical membrane proteins. Single input descriptors were tested alone and in combination with each other in different modes of AlignMe by optimizing gap penalties on the HOMEP2 data set. Most accurate alignments and homology models on the HOMEP2 data set were observed when using position-specific substitution information (P), secondary structure propensities (S) and transmembrane propensities (T) in the AlignMe PST mode. An evaluation on an independent reference set of membrane protein sequence alignments from the BAliBASE collection showed that different modes of AlignMe are suitable for different sequence similarity levels. The AlignMe PST mode improved the alignment accuracy significantly for distantly related proteins, whereas for closely-related proteins from the BAliBASE set the AlignMe PS mode was more suitable. This work was published in March 2013 in PLOS ONE. In order to allow also an easier usage of the AlignMe program, I have implemented a web server of AlignMe (chapter 4) that provides the optimized settings and gap penalties for the AlignMe P, PS and PST modes. A comparison to other recent alignment web server shows that the alignments of AlignMe are similar or even more accurate than those of other methods, especially for very distantly related proteins for which the inclusion of membrane protein information has been shown to be suitable. This work was published in the NAR web server issue in July 2014.
Although membrane-specific information has been shown to be suitable for aligning distantly related membrane proteins on a sequence level, such information was not incorporated into structural alignment programs making it unclear which method is the most suitable for aligning membrane proteins. Thus, I compared 13 widely-used pairwise structural alignment methods on an updated reference set of homologous membrane protein structures (HOMEP3) and evaluated their accuracy by building models based on the underlying sequence alignments and used scoring functions (e.g., AL4 or CAD-score) to rate the model accuracy (chapter 5). The analysis showed that fragment-based approaches such as FR-TM-align are the most useful for aligning structures of membrane proteins that have undergone large conformational changes whereas rigid approaches were more suitable for proteins that were solved in the same or a similar state. However, no method showed a significant higher accuracy than any other. Additionally, all methods lack a measure to rate the reliability of the accuracy for a specific position within a structure alignment. In order to solve these problems, I propose a consensus-type approach that combines alignments from four different methods, namely FR-TM-align, DaliLite, MATT and FATCAT and assigns a confidence value to each position of the alignment that describes the agreement between the methods. This work has been published 2015 in the journal “PROTEINS: structure, function and bioinformatics”.
Consensus alignments were then generated for each pair of proteins of the HOMEP3 data set and subsequently analyzed for single evolutionary events within membrane spanning segments and for irregular structures (e.g., 310- and p-helices) (chapter 6). Interestingly, single insertions and deletions could be observed with the help of consensus alignments in the conserved membrane-spanning segments of membrane proteins in four protein families. The detection of such single InDels might help to identify crucial residues for a proteins function.