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P2X receptors represent the third superfamily of ligand gated ion channels with ATP as their natural ligand. Most of the mammalian P2X receptors are non-selective cation channels, which upon activation, mediate membrane depolarization and have physiological roles ranging from fast excitatory synaptic transmission, modulation of pain-sensation, LTP to apoptosis etc. In spite of them being an attractive drug target, their potential as a drug target is limited by the lack of basic understanding of the structure-function relationship of these receptors. In my thesis, I have investigated the behavior of homomeric P2X receptor subunits with the help of photolabeling and fluorescence techniques coupled to electrophysiological measurements using Xenopus laevis oocytes heterologous expression system. Concurrent photolabeling by BzATP and current recordings from the same set of receptors in real time has revealed that the gating process in homomeric P2X receptors is contributed individually by each subunit in an additive manner. Our study for the first time describes the agonist potency of Alexa-ATP (a fluorescent ATP analog) on P2X1 receptors. The use of Alexa-ATP in our experiments elucidated that receptor subunits are not independent but interacting with each other in a cooperative manner. The type of cooperativity, however, depended on the type and concentrations of allosteric/competing ligands. Based on our results, in my thesis we propose an allosteric model for ligand-receptor interactions in P2X receptors. When simulated, the model could replicate our experimental findings thus, further validating our model. Further, correlation between occupancy of P2X1 receptors (determined using binding curve for Alexa-ATP) with the steady-state desensitization suggests that binding of three agonist molecules per receptor are required to desensitize P2X1 receptors. We further extended the approach of fluorescence with electrophysiological measurement to assign the role for different domains in P2X1 receptors with the help of environmental sensitive, cysteine reactive fluorophore (TMRM). Cysteine rich domain-1 of P2X1 receptors (C117-C165) was found to be involved in structural rearrangements after agonist and antagonist binding. In contrast to the present understanding, that the binding of an antagonist cannot induce desensitization in P2X1 receptors and the receptors need to open first before undergoing desensitization, we propose based on our results that a competitive antagonist can also induce desensitization in P2X1 receptors by bypassing the open state. We have attempted to answer few intriguing questions in the field of P2X receptor research and we think that our answers provide many avenues to the basic understanding of functioning of P2X receptors.
Platelets are anucleate cells that play a major role in hemostasis and thrombosis in the vasculature. During primary hemostasis platelets adhere to sites of vascular damage and the initial platelet coat is reinforced by additional platelets forming a stable aggregate. At the same time platelets secrete their intracellular granules containing substances that further activate platelets in an autocrine and paracrine fashion and affect local coagulation and endothelial smooth muscle cell function. The small guanine nucleotide binding protein Rap1 regulates the activity of the platelet integrin alphaIIbbeta3 and thus platelet aggregation. Rap1 activity is controlled by guanine nucleotide exchange factors and GTPase activating proteins. In platelets, Rap1GAP2 is the only GTPase activating protein of Rap1. In order to identify Rap1GAP2-associated proteins, a genetic two-hybrid screening in yeast was performed and synaptotagmin-like protein 1 (Slp1, also called JFC1) was found as a new putative binding partner of Rap1GAP2. Slp1 is a tandem C2 domain containing protein and is known to bind to Rab27, a small GTPase involved in platelet dense granule secretion. The direct interaction between Rap1GAP2 and Slp1 was confirmed in yeast and in transfected cells. More importantly, Slp1 is expressed in platelets and binding of endogenous Rap1GAP2 and Slp1 was verified in these cells. The Rap1GAP2 and Slp1 interaction sites were mapped by mutational analysis. Rap1GAP2 binds through the -TKXT- motif within its C-terminus to the C2A domain of Slp1. Moreover, the Slp1 binding -TKXT- motif of Rap1GAP2 was confirmed by complementary approaches using short synthetic Rap1GAP2 peptides. The C2A domain of Slp1 is a phospholipid binding domain and thus mediates binding of Slp1 to the plasma membrane. Phospholipid overlay assays revealed that simultaneous binding of Slp1 via its C2A domain to Rap1GAP2 and to phospholipids can occur. In addition, the interaction between Rap1GAP2 and Slp1 is regulated by cAMP-dependent protein kinase (cAK or PKA), and kinase activation in platelets enhanced binding of endogenous Rap1GAP2 to Slp1. In-vitro phosphorylation assays revealed that Slp1 is a substrate of PKA, and serine 111 was identified as phosphorylation site. Since Slp1 is a Rab27 binding protein, a trimeric complex of Slp1, Rab27 and Rap1GAP2 is conceivable. The association of Slp1, Rab27 and Rap1GAP2 was investigated by immunofluorescence and co-immuno-precipitation experiments in both, transfected cells and platelets. By Slp1 affinity chromatography and subsequent mass spectrometric analysis additional Slp1 binding proteins were identified in platelets, and binding of Slp1 to Rab8 was confirmed in pull-down assays. To investigate the functional significance of the interaction between Rap1GAP2 and Slp1, an assay system was established to determine serotonin secretion of streptolysin-O permeabilized platelets. Addition of recombinant Slp1 protein to permeabilized platelets strongly inhibited platelet dense granule secretion, whereas addition of recombinant Rap1GAP2 protein or synthetic Rap1GAP2 peptide enhanced secretion. Deleting the Slp1 binding -TKXT- motif abolished the stimulatory effect of Rap1GAP2 on secretion. Addition of Rap1 to permeabilized platelets had no effect on secretion. These findings indicate that the Rap1GAP2 effect on platelet secretion does not depend on the GTPase activating function of Rap1GAP2, but is rather dependent on the -TKXT- mediated interaction of Rap1GAP2 with Slp1. In addition, in-vitro GAP assays revealed that Slp1 binding to Rap1GAP2 does not affect the Rap1GAP activity of Rap1GAP2, and adhesion assays excluded a role for the Rap1GAP2/Slp1 interaction in cell adhesion. Altogether, the results of the present study demonstrate that besides its function in platelet aggregation by controlling the activity of the small guanine nucleotide binding protein Rap1, Rap1GAP2 is involved in platelet dense granule secretion by the new -TKXT- mediated interaction with the Rab27 and membrane binding protein Slp1. In addition, the interaction between Rap1GAP2 and Slp1 is embedded into an elaborate network of protein-protein interactions in platelets which appear to be regulated by phosphorylation. Future studies will in particular aim to dissect the molecular details of Rap1GAP2 and Slp1 action in platelet secretion and investigate the potential biochemical and pharmacological value of the unique protein binding -TKXT- motif of Rap1GAP2.
Der dänische Anästhesist Björn Ibsen : ein Pionier der Langzeitbeatmung über die oberen Luftwege
(2009)
The Danish anaesthesiologist Björn Ibsen should be placed among the pioneers of the development of long term ventilation by the upper airways (in this publication I have only briefly mentioned his other contributions, in particular the development of Intensive care medicine). Ibsen learned the basics of anaesthesia in the USA (1949/50). Returning to Denmark he worked as independent anaesthesiologist. In 1952, together with Mogens Björneboe, he treated newborn child who suffered from Tetanus. The treatment consisted of barbiturates and curare, in an attempt to suppress the muscular cramps of the child. The child was ventilated with manual positive pressure during the treatment. The child died but this attempt of treatment proved to be an important step in the development of long term ventilation by the upper airways. The core of this work is Ibsen’s introduction of the new treatment for treating poliomyelitis patients with respiratory insufficiency. In 1952, a severe poliomyelitis epidemic hit Copenhagen. At the time the normal treatment of poliomyelitis patients with respiratory failure was passive negative pressure ventilation. At the hospital treating the poliomyelitis patients in Copenhagen there were by far not enough respirators to treat all the severely ill patients. As several patients died from respiratory failure the epidemiologist Lassen was lead to try out a new and untested treatment, and contacted Ibsen. Because I have been able to find the records of the patient, it has now been possible to describe exactly what happened on the 27. August 1952, as Ibsen demonstrated his new treatment on a 12-year old girl. Ibsen intended to ventilate the girl by a tracheotomy, with manual positive pressure from an oxygen filled bag (he had read about his method in an American paper from 1950. here the method was being used as supplement to the negative pressure ventilation from the Iron Lung). Ventilating the patient, however, was only possible after Ibsen had anaesthetised her with barbiturate. The girl survived. As a direct consequence the treatment of the poliomyelitis patients with respiratory problems was changed to follow Ibsen’s directions. Numerous helpers would within days ventilate until 75 patients until they recovered (or died). I do not know for how long the longest ventilation-period was, but I presume it was several weeks. After the epidemic Ibsen found time to develop his method. In 1953 he treated a child with tetanus with anaesthetic drugs and curare, and had it ventilated by a tracheotomy. This positive pressure ventilation by the upper airways of an unconscious patient lasted 17 days. This time the patient survived. It was only later in his life that Ibsen received international recognition for his work (directly after the poliomyelitis epidemic it was Lassen who took the glory). He remained a modest man, something I have been able to verify my self when I interviewed him shortly before his death. He died the 7th of August 2007.
Information sent to and received by cells is essential for a homeostatic development of tissues and organs. These same signals are responsible for the good functioning of lymphatic organs and therefore govern the immune response. Dysfunctioning of the signaling networks is related to pathological situations, among which one can find cancer and auto-immune diseases. Intercellular communication involves the synthesis and the adjustment of signals by the secreting/emitting cell in order to reach the needed threshold. Diffusion of the signal to the target cell in addition to its interpretation lead to functional changes like cell migration and aggregation. Individual cells such as bacteria find food or increase their virulence through taxis (directional stimulus) and/or kinesis (speed stimulus). Immune cells appear to use the same processes to find bacteria and cellular debris, as well as to perform the cellular dance observed in germinal centers. This behavior is a result of an up or down regulation of specific signals that suggest to B and T-cells the paths to follow. Furthermore, cell segregation in the white pulp of the spleen, was also shown to be a result of a tight adjustment of T-cell kinesis. Restriction to cellular tracks and other experimentally provided measurements does not ensure a full comprehension of the observed cellular behavior. Thus, the study of patterns opens new gates to our understanding of the immune system. With the help of the agent-based modeling technique, cellular migration and aggregation are investigated in response to various cell-cell interactions. This work aims to explore different mechanisms that lead to cellular migration and aggregation, by defining the emergent properties of interest and that will help distinguish between interactions, starting by a simple look at the emergent patterns, followed by an analysis of their size, their degree of aggregation and the effective communication distances. Finally, the results obtained from the in silico experiments provided a guideline to differentiate between many cell-cell interactions under specific circumstances. Chemotaxis and phototaxis with and without diffusive cellular motion were shown to be distinguishable through an analysis of the emerging aggregation profiles.
In der vorliegenden Arbeit wurden die Angaben von 355 Patientinnen ausgewertet, die zwischen Januar 2000 und September 2007 aufgrund eines metastasierten Brustkrebses im onkologischen Fachzentrum Frankfurt Nord-Ost behandelt worden sind. Die 5-JÜR nach Kaplan-Meier liegt im untersuchten Kollektiv bei 76 %. Die Wahrscheinlichkeit, fünf Jahre nach Erstdiagnose einer Metastasierung überlebt zu haben beträgt 50 %. Die mittlere Überlebenszeit ab Metastasierung liegt bei 7,4 Jahren. Die Wahrscheinlichkeit für metastasenfreies Überleben nach fünf bzw. zehn Jahren beträgt 60 % bzw. 44 %. Im univariaten Log-Rank-Verfahren weisen Patientinnen mit folgenden Charakteristika eine bessere Prognose hinsichtlich der Gesamtüberlebenswahrscheinlichkeit auf: Prämeno-pausaler Status bei ED, Ablatio mammae, CMF-Chemotherapie sowie operative und antihormonelle Therapie der Fernmetastasen. Als prognostisch ungünstig gelten: Positiver Nodalstatus, niedriger Differenzierungsgrad, invasiv duktaler oder lobulärer Tumortyp, höheres UICC-Stadium, Stadium > 2 der St. Gallener Risikoklassifikation, First-Line-Chemotherapie, R1-resezierte Tumoren, adjuvante Chemotherapie, > 3 verschiedene Metastasenorte und zytostatische Metastasentherapie. Die Lokalisation der Fernmetastasen ermöglicht eine differenziertere prognostische Einschätzung: Viszerale Metastasen, vor allem in der Leber und im ZNS, beeinflussen die Überlebenszeit negativ. Im Verlauf auftretende Metastasen im Abdomen/ Peritoneum gehen ebenfalls mit einer schlechteren Prognose einher. Bei ossärer Metastasierung hingegen kann mit einem benigneren Krankheitsverlauf gerechnet werden, ebenso bei Erstmanifestation der Metastasen in der Haut und/oder den Weichteilen. In der multivariaten Cox-Analyse übt die Leber als primärer Metastasierungsort den größten negativen Einfluss auf die Überlebens-wahrscheinlichkeit aus. Auch eine hohe Anzahl befallener Lymphknoten, Metastasen an > 3 verschiedenen Lokalisationen sowie ein positiver Resektionsrand führen zu signifikant schlechteren Überlebensraten. Bessere Prognosen besitzen Patientinnen, die zum Diagnosezeitpunkt prämenopausal gewesen sind und deren Metastasen im Verlauf antihormonell therapiert werden konnten. In der Cox-Regressionsanalyse erwiesen sich das Grading und der Nodalstatus als unabhängige Prognoseparameter hinsichtlich des metastasenfreien Überlebens. Demnach gilt: Je schlechter der Differenzierungsgrad eines Tumors und je mehr Lymphknoten befallen sind, desto niedriger ist die Wahrscheinlichkeit nach zehn Jahren metastasenfrei überlebt zu haben.
Hintergrund und Fragestellung: Beweggrund dieser Studie war es, die Therapie von rezidivierten indolenten Non-Hodgkin Lymphomen mit neuen Kombinationen zu untersuchen. Die Kombination des monoklonalen Antikörpers Rituximab mit Fludarabin und Bendamustin wird verabreicht und im Hinblick auf Überleben, Ansprechraten und Toxizität verglichen. Patienten und Methoden: 99 Patienten mit rezidiviertem indolenten Non-Hodgkin Lymphom verschiedener Histologien und Mantelzell Lymphomen wurden in dieser multizentrischen Studie in die Arme Bendamustin-Rituximab oder Fludarabin-Rituximab randomisiert und erhielten 6 Zyklen des jeweiligen Regimes alle 4 Wochen. Die Dosierung war wie folgt: Rituximab 375 mg/m² an Tag 0 und entweder 90 mg/m² Bendamustin an Tag 1 und 2 oder 25 mg/m² Fludarabin an Tag 1-3. Ergebnisse: Von den 97 auswertbaren Patienten ergab sich eine ORR von 82% für die BR-Gruppe mit einer CR von 46% und PR von 36%. Die mit F-R behandelten Patienten erreichten eine ORR von 55% mit einer CR-Rate von 23% und PR von 32%. P-Werte für die ORR ist 0,0078. Die PFS ist signifikant unterschiedlich (p=0,0019), günstiger für BR, der Median der BR-Gruppe ist noch nicht erreicht, der der F-R Gruppe ist 12. Der Unterschied der infektiösen Toxizität ist nicht signifikant, unter Bendamustinbehandlung ereigneten sich jedoch schwerwiegendere Infektionen als unter Fludarabin, Hämatotoxizität war etwa gleich verteilt auf beide Gruppen. Schlussfolgerung: Die Kombination Bendamustin-Rituximab ermöglichte signifikant bessere Remissionsraten und PFS als die Kombination Fludarabin-Rituximab. Die vorbeschriebenen schwerwiegenden hämatotoxischen Nebenwirkungen von Fludarabin wurden in unserer Studie nicht bestätigt, unter der Kombination Bendamustin-Rituximab ereigneten sich schwerwiegendere Infektionen als unter F-R. Bendamustin erreicht signifikant bessere Therapieergebnisse als Fludarabin mit akzeptablen Nebenwirkungen in der Therapie der indolenten Non-Hodgkin-Lymphome.
Ziel dieser Arbeit war es, die Effizienz der Ambulanten Endokrinologie an der Universität Frankfurt mit Hilfe statistischer Methoden zu untersuchen. Die Basis hierfür bildeten die Karteikarten von 449 Kassenpatienten, die im Jahr 2000 die Ambulanz aufsuchten!. Dank dieser großen Zahl von Fällen konnten die meisten Aussagen, die im Rahmen dieser Arbeit gemacht wurden, statistisch signifikant belegt werden. Dies geschah mit Hilfe sogenannter statistischer Tests, mit denen es möglich ist, eine Hypothese gegen eine Alternativaussage auf ihre Gültigkeit zu testen. Zentrale Kernaussagen der Arbeit sind die folgenden: o Der Aufwand, der beispielsweise bei den Laboruntersuchungen investiert wird, ist in der Ambulanten Endokrinologie zwar hoch; er ist aber immer noch geringer als der Aufwand, der von niedergelassenen Ärzten getrieben wird, bis die richtige Diagnose feststeht. Der Grund hierfür liegt vor allem in der Anzahl der Ärzte, die vor der Ambulanz aufgesucht werden. o Der Aufwand bei anderen Untersuchungen, wie zum Beispiel Röntgenaufnahmen, Sonographie- oder Szintigraphieuntersuchungen ist in der endokrinologischen Ambulanz deutlich geringer als außerhalb. o Mitglieder der Ersatzkassen sind als Patienten in der Ambulanten Endokrinologie eindeutig überrepräsentiert, Mitglieder der AOK eindeutig unterrepräsentiert. Trotzdem bilden die AOK-Mitglieder die größte Gruppe unter den Kassenpatienten in der Ambulanz. o Die durchschnittliche Dauer bis zur Diagnose beträgt in der Ambulanten Endokrinologie 5 Tage. Ein Arztbrief wird im Mittel jedoch erst 76 Tage nach der Erstaufnahme verfaßt. Diese relativ lange Zeit ist aber immer noch kürzer als die Zeitspanne vom ersten Aufsuchen eines Arztes bis zur richtigen, als Arztbrief festgehaltenen Diagnose. Diese beträgt nämlich 110 Tage. o Obwohl man vermuten könnte, daß die Diagnosezuverlässigkeit von Hausärzten, Fachärzten und der Uniklinik unterschiedlich ist, konnte ein solcher Unterschied nicht in statistisch signifikanter Weise nachgewiesen werden. Der Anteil der Fälle, bei denen die Diagnose geändert werden mußte, betrug bei Hausärzten etwa 15%, bei Fachärzten 18% und bei anderen Abteilungen der Frankfurter Universitätsklinik 9%. Die letzte Zahl ist zwar deutlich kleiner als die anderen beiden; da aber nur 56 Karteikarten von Patienten vorlagen, die aus der Uniklinik heraus überwiesen wurden, ist hier keine sichere Aussage möglich. o Bei der Weiterversorgung der Patienten nach dem Aufsuchen der Ambulanten Endokrinologie ist in mindestens 85% der Fälle der Hausarzt involviert. In 43% aller Fälle übernimmt der Hausarzt die Weiterversorgung sogar alleine; die Ambulanz wird nicht mehr hinzugezogen. Selbst bei den verbleibenden 15% der Patienten ist davon auszugehen, daß sie sich mittelfristig wieder in die Behandlung des überweisenden Arztes begeben - auch wenn sie sich beispielsweise einer Operation unterziehen müssen. Nur 4 % der Patienten befinden sich seit mehr als 5 Jahren in der Obhut der Ambulanz. Die Befürchtung einiger Hausärzte, sie könnten die Patienten im Falle einer Überweisung an die Ambulante Endokrinologie verlieren, konnte mit all diesen Fakten eindeutig widerlegt werden. Zusammenfassend kann man sagen, daß die Effizienz der Ambulanten Endokrinologie bereits sehr hoch ist: o Eine eindeutige Diagnose ist gegeben. o Die Patienten der Ambulanten Endokrinologie erhalten eine lege artis Behandlung, insbesondere eine individuelle medikamentöse Einstellung. o Für die Krankenkassen bedeutet dies langfristig gesehen eine kostengünstige Versorgung. Neben den statistischen Ergebnissen gestattete es die Arbeit auch, Empfehlungen für eine weitere Effizienzsteigerung der Ambulanz zu machen. In diesem Zusammenhang sind die folgenden Vorschläge zu nennen: oDer Arztbrief sollte früher erstellt werden; unter anderem, um die Kommunikation mit dem Hausarzt, auf dessen Überweisung der Patient angewiesen ist, zu verbessern. o Bei den Karteikarten sollten einige zusätzliche Felder definiert werden, die in standardisierter Weise vom behandelnden Arzt auszufüllen sind. Dies gestattet es, in Zukunft ähnliche Statistiken wie die in dieser Arbeit präsentierten leichter und noch präziser auszuarbeiten. o Generell sollte die Flächendeckung der Endokrinologischen Ambulanzen verbessert werden. Auch die Öffnungszeiten könnten den Bedürfnissen berufstätiger Patienten folgend ausgeweitet werden. All dies ist zwar mit einem hohen finanziellen und personellen Aufwand verbunden; volkswirtschaftlich gesehen dürfte aber durch die präzisere Diagnostik und die bessere medikamentöse Einstellung ein gewisser Kompensationseffekt eintreten. Durch die höhere Patientenanzahl wäre eine bessere Kostendeckung gegeben. Beispielsweise wäre die Auslastung der apparativen Einrichtungen bei einer Ganztagssprechstunde deutlich höher.
Die Ergebnisse der vorgelegten Arbeit zeigen die reproduzierbare Induktion assoziativer L TP- und L TD-ähnlicher Plastizität im Motorkortex des Menschen, mit Hilfe eines IPAS-Reizprotokolls (Interventional Paired Associative Stimulation) aus 200 gepaarten Stimuli a 0,25 Hz. Die gepaarten Stimuli bestehen aus einem elektrischen afferenten Reiz des Nervus medianus und einem transkraniellen magnetischen Stimulus über dem Motorkortexareal des Musculus abductor pollicis brevis. Dabei bestätigt sich die Bedeutsamkeit assoziativer (zeitlich gekoppelter) synaptischer Ereignisse zur plastischen Modifikation neuronaler Verbindungen durch den Nachweis signifikanter fazilitatorischer Effekte in Form von vergrößerten elektromyographisch ableitbaren motorisch evozierten Potentialen (MEP) nach Intervention mit zeitgleich an Neuronen im Motorkortex auftretenden afferenten und efferenten Stimuli (Interstimulusintervall= 0 ms). Außerdem konnte mit einem analogen Reizprotokoll, die bisher nur aus tierexperimentellen Simulationsdaten bekannte assoziative LTD-ähnliche Plastizität signifikant reproduziert werden. Hierbei geht der TMS-Stimulus dem afferenten Stimulus um 5 ms voraus (Interstimulusintervall = -5 ms), was zu einer signifikanten Verkleinerung der MEP-Amplituden nach der Intervention führt. Beide Befunde untermauern das bereits bekannte Konzept der STDP (Spike Timing-Dependent Plasticity). Als wichtige Evidenz für die Beteiligung LTP- und LTD-ähnlicher Plastizität beim Erlernen neuer motorischer Fertigkeiten gilt die lediglich aus tierexperimentellen Arbeiten bekannte signifikante Abnahme der Induzierbarkeit LTP-ähnlicher Plastizität gepaart mit der signifikanten Zunahme der Induzierbarkeit LTD-ähnlicher Plastizität nach wiederholtem Training einfacher fein motorischer Bewegungsmuster, als Ausdruck eines konstant gebliebenen "synaptic modification range". Dies konnte hier durch analoge Versuche mit Training von repetitiven ballistischen Daumenabduktionen erstmals auch am Menschen nachgewiesen werden. Neue Erkenntnisse über die plastische Modellierbarkeit des adulten menschlichen Gehirns bereiten den Weg für neue Therapie- und Rehabilitationsverfahren für Schlaganfall- und andere.neurologische Patienten.
Degenerationsvorgänge am Innenohr und experimentelle Untersuchungen über Protektionsmöglichkeiten
(2000)
Hörverluste durch Innenohrschäden gelten beim Menschen und anderen Säugetieren als irreversibel. Deshalb wird es von vielen Wissenschaftlern versucht, eine Regeneration im Innenohr der Säugetiere zu induzieren oder das Ohr pharmakologisch vor Schädigung zu schützen. Ziel dieser Arbeit war es zu untersuchen, ob neurotrophe Wachstumsfaktoren Meerschweinchen vor experimentell ausgelösten Innenohrschäden schützen können. Als erstes wurde in dieser Arbeit ein Tiermodell zur akuten und frequenzspezifischen Hörschädigung entwickelt. Meerschweinchen wurden Kanamycin und Ethakrynsäure intravenös infundiert. Es wurde festgestellt, daß die erwünschten frequenzspezifischen Hörverluste durch 266 mg/kg Kanamycin kombiniert mit 30 mg/kg Ethakrynsäure reproduzierbar induziert werden konnten. Die Hörschwellen und ihre Verluste wurden anhand der Summenaktionspotentiale vom Hörnerv bestimmt. Anschließend wurde an Meerschweinchen eine Methode zur chronischen Applikation von Wachstumsfaktoren ausgearbeitet. Es wurden drei implantierbare Applikationssysteme getestet, das Mikrodosiersystem (MDS) aus der Tübinger HNO-Klinik, die wiederbefüllbaren ESOX-Pumpen und osmotische ALZET-Pumpen. Durch die osmotischen ALZET-Mikropumpen konnten neurotrophe Faktoren über einen Zeitraum von mehreren Wochen kontinuierlich und zuverlässig appliziert werden. Diese Pumpen wurden in Meerschweinchen implantiert und lieferten eine Lösung mit der Testsubstanz oder eine Kontrollösung, die an das runde Fenster der Cochlea oder in die Zerebrospinalflüssigkeit abgegeben wurden. Im dritten Teil der Arbeit wurden die beiden entwickelten Methoden miteinander kombiniert. Damit war es möglich zu testen, ob der durch die Mikropumpen applizierte neurotrophische Faktor-3 (NT-3) die durch Ototoxika ausgelösten Schwellenverluste vermindert, Argumente für die Wahl von NT-3 waren, daß NT-3 in vitro bereits eine starke protektive Wirkung an den Neuronen des Spiralganglions erwiesen hatte (Marzella et al., 1997). Außerdem sind Rezeptoren für NT-3 auch bei adulten Tieren in den cochleären Haarzellen vorhanden. Die physiologische Wirkung von NT-3 war aber in vivo noch nicht untersucht worden. Zu Beginn der Experimente wurden die Tiere mit Mikropumpen implantiert, die über 14 Tage eine NT-3-haltige oder Kontrollösung applizierten. Vier Tage nach Implantation der Pumpen wurden die Meerschweinchen durch die Infusion der oben genannten ototoxischen Arzneimitteln vertäubt. Die Hörschwellen wurden kurz bevor und über 32 Tage nach der Vertäubung gemessen. Die Hörschwellen der mit NT-3 behandelten Tiere wurden mit den Hörschwellen der Kontrolltiere verglichen. Durch die Infusion von Kanamycin und Ethakrynäure wurden bei Meerschweinchen Hörverluste in der Größenordnung von 40 dB induziert. Bei der Gabe von NT-3 an die rechten Cochleae wurden diese ototoxisch ausgelösten Schwellenverluste um 9 dB vermindert, und dies nicht nur auf der behandelten, sondern auch auf der kontralateralen Seite. Diese Befunde deuteten darauf hin. daß bei der lokalen Gabe die neurotrophen Faktoren auf systemischem Wege auch andere Seite erreichen und dort eine Wirkung ausüben. Ähnliche Effekte wurden auch bei lokaler Gabe von einem anderen neurotrophen Faktor, Glial cell line-derived neurotrophic factor (GDNF), beoobachtet (Shoji et al., 2000). Die kontralaterale Wirkung war hier aber schwächer (3 dB), als die ipsilaterale (5 dB). Die ins Ohr implantierten Pumpen verursachten per se Hörverluste von etwa 5 dB. NT-3 verminderte auch diese Hörverlustedurchschnittlich um 4 dB. In einer weiteren Versuchsreihe wurde der systemische Effekt von NT-3 geprüft. Dafür wurde NT-3 nicht lokal an das runde Fenster der Cochlea, sondern in die Zerebrospinalflüssigkeit appliziert. Die ototoxisch ausgelösten Hörverluste konnten durch den systemisch gegebenen NT-3 um 5 dB verringert werden. Relativ zu den ototoxisch ausgelösten Hörverlusten in der Größenordnung von 40 dB war die Protektion durch systemisch (5 dB) oder lokal (9 dB) applizierten NT-3 gering. Die stärkste otoprotektive Wirkung durch Wachstumsfaktoren, von 12-18 dB, wurde bis jetzt durch gentechnisch in die Cochlea eingebrachten GDNF erreicht (Yagi et al., 1999). Der Schutzeffekt durch den lokal am Ohr gegebenen GNDF (5 dB, Shoji et al., 2000) war aber geringer, als der vom identisch verabreichten NT-3 (9 dB, diese Arbeit, s. auch Sudavicius et al., 2000). Wenn durch gentechnische Art des Verabreichens die Wirkung von NT-3 im gleichen Maße potenziert werden sollte, wie es bei GDNF der Fall ist, wäre die protektive Wirkung von NT-3 stärker als die von GDNF.