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Alzheimer’s disease (AD) is a common, age associated neurodegenerative disease that manifests as progressive dementia and is characterized by accumulation of the amyloid beta (Aβ) peptide which is a processing product of a transmembrane protein termed Alzheimer Amyloid Precursor Protein (APP). The Aβ peptide is generated by a sequential proteolytic processing of APP by two distinct proteases that are termed β- and γ-secretase. The β-secretase, also called BACE-1 or memapsin 2, belongs to the family of aspartyl proteases. BACE-1 evidently cleaves APP in an acidic endosomal compartment after endocytosis of APP, thereby facilitating Aβ peptide generation.
Sorting of transmembrane proteins is generally controlled by sorting signals in the cytoplasmic domains of the cargo proteins. The short cytoplasmic tail of BACE-1 with 23 amino acids contains a sorting signal of the acidic cluster, di-leucine (ACDL) type. The two Leu residues in this determinant are important for the clathrin mediated endocytosis of BACE-1, whereas the acidic residues together with the Leu are required for the endosomal sorting and recycling of BACE-1 back to the plasma membrane. The ACDL motif binds to the members of the GGA (Golgi-localized γ ear-containg ARF- binding proteins) family (GGA1-GGA3) that are involved in the sorting of BACE-1.
One of the major aims of this study was to address the role of flotillins in the intracellular sorting of BACE-1. This study shows that flotillin-1 directly binds to the di-leucine motif in the cytoplasmic tail of BACE-1, whereas flotillin-2 only shows an association mediated by flotillin-1. Flotillin-1 competes with GGA2 for the binding to BACE-1 tail, and thus influences the endosomal sorting of BACE-1. Importantly, depletion of flotillins results in an altered localization of the wildtype BACE-1, whereas the plasma membrane resident Leu to Ala (LLAA) mutant is not affected. Flotillin knockdown results in an accumulation of BACE-1, implicating reduced degradation and enhanced stability of this protease. Thus, flotillins appear to be important for the cellular targeting of BACE-1 and also influence the amyloidogenic processing of APP, as demonstrated by an increase in the amyloidogenic C-99 processing fragments.
When flotillin depleted cells were subjected to apoptotic stresses including Aβ25-35 synthetic peptide (inducer of the extrinsic apoptosis pathway) or several chemotherapeutic agents (staurosporine, brefeldin A, doxorubicin, carboplatin and paclitaxel: intrinsic apoptosis pathway) and cytotoxicity was determined, various apoptotic markers were activated in flotillin depleted cells. Caspase-3 and GGA3 are well accepted apoptosis markers and an enhanced caspase-3 cleavage was detected upon STS induced apoptosis in SH-SY5Y, HeLa, and HaCaT cell lines and increased GGA3 cleavage was observed in MCF7 cell line.
One of the major reasons for the apoptotic sensitivity in the absence of flotillins was a PI3K/Akt signaling defect. Neuroblastoma cells depleted of flotillins showed diminished levels of total Akt, phospho-Akt and phospho-ERK upon STS induced apoptosis. Since PI3K/Akt was the primary survival pathway affected upon STS induced apoptosis, ectopic expression of Akt in neuroblastoma cell line reduced caspase-3 cleavage and retarded apoptosis.
The direct downstream target of Akt is FOXO3a, whose localization was investigated in flotillin depleted cells. A major proportion of FOXO3a was localized in the nucleus of flotillin knockdown cells, implicating that FOXOs are active in these cells and subsequently trigger the transcription of death genes. Strikingly, an essential anti-apoptotic molecule and a major cancer target, Mcl-1, was inherently downregulated in flotillin knockdown cells. Mcl-1 is a chief member of the Bcl-2 family as it plays a pivotal role in cell survival and it is a critical protein in cancer therapeutics as suppression of Mcl-1 protein can curtail the survival and growth of tumorous cells.
Neuroblastoma cells were rescued from undergoing permanent damage due to STS induced apoptosis by overexpression of anti-apoptotic Bcl-2. Phorbol esters are well known PKC activators, and pre-treatment of neuroblastoma cells with phorbol esters along with staurosporine reduced caspase-3 cleavage.
These results demonstrate that absence of flotillins can sensitize cellular systems to apoptosis induction. The two main characteristics of cancer cells include resistance to apoptosis and unresponsiveness to chemotherapeutic agents. It is a well established fact that impaired apoptosis is central to tumour development. This study implicates that the downregulation of flotillin function can trigger cellular susceptibility and enhances apoptosis in response to conventional chemotherapeutic agents. Therefore, flotillins can serve as vital regulators in providing a more rational approach in molecular-targeted therapies for receding cancer growth and survival.
De Gryphius à Hallmann, le Trauerspiel, comme forme théâtrale, vit et meurt. Il se crée d’abord en réaction à la crise de légitimité qui affecte le souverain. Si Carolus Stuardus aboutit à une figuration christologique de la royauté, que celle-ci soit étayée ou non par les sources, si Gryphius réaffirme avec force l’identité sacrée du représentant, de manière fort sanglante, la réconciliation du corpus mysticum et du corpus realum, c’est bien que la théorie des Deux Corps du Roi est alors concrètement remise en cause. On sait, grâce à Kantorowicz, qu’elle l’est dans le contexte de la situation politique anglaise, mais on en avait négligé la réalité en Allemagne. Il faut donc soutenir que le Trauerspiel élabore, dans un premier temps, son mode de représentation sur ce point aveugle qu’est l’identité double et quasi schizophrène du monarque – ce que nous avons appelé le double bind –, laquelle entraîne forcément une série de contradictions soumises au regard critique du spectateur. Devant ses yeux, le drame du martyr performe l’emblème qui constitue la souveraineté, rapproche le rex, l’individu royal, du sacerdos, son identité christomimétique qui est menacée la sécularisation de l’absolutisme. L’exemple le plus éclatant en est donné par Carolus Stuardus de Gryphius. Nous avons que, dans les faits, la Révolution anglaise cherche incontestablement à disjoindre les termes de l’allégorie de la double corporalité, à opérer un détournement de celle-ci au profit d’un pouvoir qui n’est plus fondé par un pacte emblématique transcendant qui faisait de Dieu le seul garant du fonctionnement de la souveraineté sacrée. Les Trauerspiele sont donc, avant tout, une réponse aux crises qui remettent en cause l’ordre des choses dans le domaine du politique et le sépare de la théologie. La tragédie baroque silésienne n’est pas une invention, une simple création littéraire tout droit sortie de l’imaginaire de ses auteurs, elle figure une idée du théâtre mettant en relation l’esthétique et la question de la souveraineté, dans la mesure où l’une et l’autre ont partie liée dans l’ordre de la représentation. Dans ce sens, il est possible de comprendre la notion d’origine (Ursprung) telle que l’emploie Benjamin dans le Trauerspielbuch. Il s’agissait donc de le montrer dans un travail propédeutique à la lecture des pièces, travail qui se concentrait sur la question de l’emblème avant d’examiner la transformation du Trauerspiel en genre encadré par des règles implicites. La première partie de notre mémoire a donc contribué à mettre en place les outils d’analyse (« Du texte théorique à la théorie de la représentation »). Tout d’abord spectacle de sang et rituel expiatoire visant à sauver la théologie politique en réunissant de façon violente les Deux Corps du Roi, le Trauerspiel finit en effet par se pacifier en construisant son esthétique sur une série de codes aisément reconnaissables. Nous en arrivions à l’échec du modèle gryphien qui faisait l’objet du premier chapitre de la seconde partie consacrée à l’analyse dramaturgique (« Le sauvetage emblématique précaire du théologico-politique »). Nous y décrivions l’accord tacite conclu au moment de la représentation entre l’auteur, les acteurs et les spectateurs, analogue au pacte emblématique contracté par le souverain médiéval et ses sujets, qui finissait alors par se transformer en simple convention. Les termes du contrat deviennent les topoï qui forment la loi du genre. Aussi, l’emblématique autrefois liée à la vision du monde médiévale se transforme-t-elle en ornement baroque qui sert toutes les causes politiques et derrière lequel se dissimulent les enjeux de pouvoir. La coupure épistémique disjoint le théologique du politique, fait éclater le miroir de la représentation comme l’a montré la lecture spéculaire de Shakespeare. Une fois le règne des analogies terminé, chacun est libre de manipuler les images, qu’il soit poète ou homme de pouvoir, personnage ou spectateur. Nous avions montré cette transformation au deuxième chapitre de l’analyse dramaturgique intitulé « L’élargissement de la perspective politique et scénique ». Partant de constat, l’on pouvait comprendre pourquoi le prince recouvre du voile de l’État ses ambitions d’omnipotence en leur donnant la forme d’un absolutisme tempéré, tandis que le courtisan manipule les emblèmes dans un univers de faux-semblants afin de s’attirer la bienveillance du monarque et de son entourage. Alors que chez Gryphius la performance emblématique tenait à la fois de l’esthétique du théâtre, de son système de représentation, et de son message idéologique, elle se transforme, peu à peu, au cours de l’histoire du Trauerspiel, en numéro d’acteur et en divertissement visuel...
At present, there is a huge lag between the artificial and the biological information processing systems in terms of their capability to learn. This lag could be certainly reduced by gaining more insight into the higher functions of the brain like learning and memory. For instance, primate visual cortex is thought to provide the long-term memory for the visual objects acquired by experience. The visual cortex handles effortlessly arbitrary complex objects by decomposing them rapidly into constituent components of much lower complexity along hierarchically organized visual pathways. How this processing architecture self-organizes into a memory domain that employs such compositional object representation by learning from experience remains to a large extent a riddle. The study presented here approaches this question by proposing a functional model of a self-organizing hierarchical memory network. The model is based on hypothetical neuronal mechanisms involved in cortical processing and adaptation. The network architecture comprises two consecutive layers of distributed, recurrently interconnected modules. Each module is identified with a localized cortical cluster of fine-scale excitatory subnetworks. A single module performs competitive unsupervised learning on the incoming afferent signals to form a suitable representation of the locally accessible input space. The network employs an operating scheme where ongoing processing is made of discrete successive fragments termed decision cycles, presumably identifiable with the fast gamma rhythms observed in the cortex. The cycles are synchronized across the distributed modules that produce highly sparse activity within each cycle by instantiating a local winner-take-all-like operation. Equipped with adaptive mechanisms of bidirectional synaptic plasticity and homeostatic activity regulation, the network is exposed to natural face images of different persons. The images are presented incrementally one per cycle to the lower network layer as a set of Gabor filter responses extracted from local facial landmarks. The images are presented without any person identity labels. In the course of unsupervised learning, the network creates simultaneously vocabularies of reusable local face appearance elements, captures relations between the elements by linking associatively those parts that encode the same face identity, develops the higher-order identity symbols for the memorized compositions and projects this information back onto the vocabularies in generative manner. This learning corresponds to the simultaneous formation of bottom-up, lateral and top-down synaptic connectivity within and between the network layers. In the mature connectivity state, the network holds thus full compositional description of the experienced faces in form of sparse memory traces that reside in the feed-forward and recurrent connectivity. Due to the generative nature of the established representation, the network is able to recreate the full compositional description of a memorized face in terms of all its constituent parts given only its higher-order identity symbol or a subset of its parts. In the test phase, the network successfully proves its ability to recognize identity and gender of the persons from alternative face views not shown before. An intriguing feature of the emerging memory network is its ability to self-generate activity spontaneously in absence of the external stimuli. In this sleep-like off-line mode, the network shows a self-sustaining replay of the memory content formed during the previous learning. Remarkably, the recognition performance is tremendously boosted after this off-line memory reprocessing. The performance boost is articulated stronger on those face views that deviate more from the original view shown during the learning. This indicates that the off-line memory reprocessing during the sleep-like state specifically improves the generalization capability of the memory network. The positive effect turns out to be surprisingly independent of synapse-specific plasticity, relying completely on the synapse-unspecific, homeostatic activity regulation across the memory network. The developed network demonstrates thus functionality not shown by any previous neuronal modeling approach. It forms and maintains a memory domain for compositional, generative object representation in unsupervised manner through experience with natural visual images, using both on- ("wake") and off-line ("sleep") learning regimes. This functionality offers a promising departure point for further studies, aiming for deeper insight into the learning mechanisms employed by the brain and their consequent implementation in the artificial adaptive systems for solving complex tasks not tractable so far.
One of the most important shifts in mathematics learning and instruction in the last decades has taken place in the conception of the subject matter, changing from a perspective of mathematics as composed of concepts and skills to be learned, to a new one emphasizing the mathematical modelling of the reality (De Corte, 2004). This shift has had, as it is to be expected, an impact on classroom processes, and changed instructional settings and practices.
Instructional explanations, the object of study in the present work, are an interesting topic in that landscape, since they continue to be a typical form of classroom discourse, especially −but no exclusively−when new contents are introduced to the students (e.g. Leinhardt, 2001; Perry, 2000; Wittwer & Renkl, 2008). Consequently, good teachers are also supposed to be good explainers, independently whether they are the main speaker, or play the role of moderator in exchange between students (e.g. Charalambous, Hill, & Ball, 2011; Danielson, 1996; Inoue, 2009).
Despite the central role that instructional explanations play in classroom practices, current instructional quality models, which describe how effective teaching practices should look like, do not consider instructional explanations as a key element (Danielson, 1996; Klieme, Lipowsky, Rakoczy, & Ratzka, 2006; Pianta & Hamre, 2009). Moreover, aside from a few notable exceptions (Duffy, Roehler, Meloth, & Vavrus, 1986; Leinhardt & Steele, 2005; Perry, 2000), instructional explanations have not been investigated empirically within other traditions either. Thus, there is scarce of empirical work about instructional explanations and their potential contribution to promote students’ learning.
The purpose of the present work is to examine instructional explanations from a theoretical perspective as well as empirically, in order to characterize them and investigate their association with students’ learning outcomes. The underlying theoretical framework chosen to organize the study is the one proposed by Leinhardt (2001) with some adaptations according to pertinent complementary literature (Drollinger-Vetter & Lipowsky, 2006; Leinhardt & Steele, 2005).
The empirical work of this dissertation was carried out in the context of the project “Analysis of mathematic lessons” (FONIDE 209) funded by the Chilean Ministry of Education during 2007. This study, in turn, was embedded in the international extension of the research project the ‘‘Quality of instruction, learning, and mathematical understanding’’ carried out between 2000 and 2006 by the German Institute for International Educational Research (DIPF) in Frankfurt, Germany, and the University of Zurich in Switzerland (e.g. Klieme & Reusser, 2003; Klieme et al., 2006). According to the design of the original project, the study considers the inclusion of different perspectives, namely, teachers, students and external observers, by means of questionnaires, tests and classroom observation protocols.
The examination of instructional explanations in this dissertation begins in chapter 2 with the review of relevant literature and introduction of the theoretical background underpinning the study of instructional explanations. This theoretical review comprises three subsections, the first one describing the evolution of the process-product-paradigm into the actual instructional quality models that are presented in a next step. The second subsection includes a detailed theoretical presentation of explanations and instructional explanations, addressing the main theoretical issues and giving examples of the few empirical works about instructional explanations found in the literature. Finally, the third subsection with the description of Chilean teaching practices in order to contextualize the study.
Chapter 3 presents the research questions and lists the associated work hypotheses that are investigated throughout this work. Chapter 4 includes the methodological aspects of the work, indicating the description of the sample, design of the study, the methods used the gather the data and the analyses chosen to answer the proposed research questions.
Chapter 5 contains the presentation of results, which are organized by research question, starting with the results from quantitative analyses and continuing with the results from qualitative analyses. This chapter closes with a general summary of the results organized according to the central themes of the study. Finally, chapter 6 concludes with a discussion of the link between the results and the instructional explanations literature and research, or lack thereof, that originally motivated the research questions addressed in this study. This chapter finishes with a discussion of the limitations of the study and the implications of its results, as well as an examination of areas where the research on instructional explanations can be fruitfully expanded in the future.
Cardiac trabeculation is one of the essential processes required for the formation of a competent ventricular wall, whereby clusters of ventricular cardiomyocytes (CMs) from a single layer delaminate and expand into the cardiac jelly to form sheet-like projections in the developing heart (Samsa et al., 2013). Several congenital heart diseases are associated with defects in the formation of these trabeculae and lead to embryonic lethality (Jenni et al., 1999; Zhang et al., 2013, Jenni et al., 2001; Towbin 2010). It has been experimentally shown that lack of Nrg1/ErbB2/ErbB4, Angipoetin1/Tie2, EphrinB2/B4, BMP10, or any component of the Notch signaling pathway can cause defective trabeculation. Moreover, changes in blood flow and/or contractility can also affect trabeculation (Samsa et al., 2013). Together, these observations demonstrate that cardiac trabeculation is a highly dynamic and regulated process.
Trabeculation is a morphogenetic process that requires control over cell shape changes and rearrangements, similar to those observed during EMT. Epithelial cells within an epithelium are polarized and establish cell-cell junctions with the neighboring cells (Ikenouchi et al., 2003; Ferrer-vaquer et al., 2010), thus epithelial cell polarity is an important feature to maintain cell shape and tissue structure. During developmental processes such as cell migration and cell division or in disease states epithelial polarity might be disrupted. As a consequence of this alteration, cells lose their tight cell-cell adhesions, undergo cytoskeletal rearrangements, change their shape and gain migratory properties becoming mesenchymal cells (Micalizzi et al., 2010). In epithelial cells, apicobasal polarity is regulated by a conserved set of core complexes, including the PAR, Scribble and Crumbs complexes (Kemphues et al., 1988; Bilder and Perrimon, 2000; Teppas et al., 1984). The polarity proteins composing these complexes interact in a well organized and coordinated-manner creating molecular asymmetry along the apicobasal axis of the cell. In turn, this crosstalk regulates the maturation and stabilization of the junctions between cells and cytoskeleton in order to strengthen cell polarization (Roignot et al., 2013). Amongst the different polarity complex, Crumbs has been shown to be a key regulator of apicobasal polarity during development in both vertebrates and invertebrates (Tepass et al., 1990; Fan et al., 2004).
Here, taking advantage of zebrafish as a model organism, I study in vivo at single cell resolution changes in CM apicobasal polarity during cardiac trabeculation. Moreover, I show which factors regulate CM apicobasal polarity during this process. In addition, I dissect the role of the polarity complex Crumbs in regulating CM junctional rearrangements and the formation of the trabecular network.
Die neuronalen Mechanismen, welche den meisten kognitiven Prozessen zu Grunde liegen, bestehen aus dem Zusammenspiel verschiedener Neuronen-Typen und deren spezifischen Funktionsmechanismen, sowohl in lokalen, als auch in globalen neuronalen Netzwerken. Eine funktionelle Interaktion mit diesen Netzwerken ist unumgänglich um das „kognitive“ Gehirn zu studieren, da neuronale Gruppen in einer hierarchischen, nicht linearen Weise miteinander interagieren, und dabei charakteristische raum-zeitliche Muster aufweisen. In dieser Arbeit untersuchten wir die Struktur und Funktion eines wichtigen Merkmals kortikaler Prozesse: Die neuronale gamma-Band Oszillation.
In addition to infectious viral particles, hepatitis B virus-replicating cells secrete high amounts of SVPs, which are ssembled by HBsAg in the shape of spheres and filaments but lack any capsid and genome. Filaments are characterized by a much higher amount of the surface protein LHBs as compared to spheres. Spheres are
released via the constitutive secretory pathway, while viral particles are ESCRT-dependently released via MVBs. The interaction of virions with the ESCRT machinery is mediated by α-taxilin that connects the PreS1 domain of LHBs with the ESCRT-component tsg101. Since viral particles and filaments contain a significant amount of LHBs, it is unclear whether filaments are secreted as spheres or released like viral particles. To study the release pathways of HBV filaments in the absence of viral particles, A core-deficient
HBV mutant (1.2×HBVΔCore) was generated by site-directed mutagenesis based on wt1.2x HBV. The start codon of core protein was mutated into stop codon, which was confirmed by DNA sequencing. Data from HBsAg ELISA, Western blot, immunofluorescence microscopy and immunoelectron microscopy showed that the lack of core protein did neither affect the production nor the secretion of HBV SVPs. The intracellular distribution of
LHBs and SHBs showed no difference between wtHBV and the core-deficient mutant expressing cells. Therefore, this system is suitable to investigate the release pathway of HBV filaments in the absence of viral particles. Confocal microscopy analysis of cells cotransfected core-deficient mutants with peYFPRab7 as marker for the endosomal/MVB pathway or with pGalT-eGFP as marker for the trans Golgi apparatus showed that YFP-Rab7, but not GalT-GFP, partially colocalized with LHBs. Furthermore, LHBs could be found in dilated MVBs by immune electron microscopy of ultrathin sections. This was confirmed by isolation of MVBs by cell fractionation using discontinuous sucrose gradient ultracentrifugation and percoll-based linear gradient ultracentrifugation, indicating that filaments enter MVBs in the absence of virion formation. Moreover, inhibition of MVB biogenesis by the small molecular inhibitor U18666A significantly abolished the release of filaments in a dose-dependent manner, but no inhibition could be observed in the production. In contrast, no inhibition on the secretion and production of spheres could be
detected. Inhibition of ESCRT-functionality by coexpression of transdominant negative mutants (Vps4A, Vps4B, CHMP3) abolished the release of filaments while secretion of spheres was not affected. These data indicate that in contrast Abstract 73 to spheres while are secreted via the secretory pathway, filaments are released via ESCRT/MVB pathway like infectious viral particles.
Three types of post-translation modifications (PTMs) containing N-glycosylation, phosphorylation, ubiquitylation were characterized in diffuse large B-cell lymphoma (DLBCL) on a global scale using quantitative mass spectrometry based proteomics technology in this study.
DLBCL is the most common type of malignant lymphomas and has a heterogeneous gene expression profiling, phenotype and clinical response to chemotherapy. DLBCL is a good model for the correct classification of cancers into molecularly different subtypes, which benefits for the selection of rational therapeutic strategies. It resulted in two histologically indistinguishable subtypes-activated B-cell-like (ABC) subgroup and germinal center B-cell-like (GCB) subgroup according to gene expression profiling. Signals originating from the B-cell receptor (BCR), the key protein on the surface of B cells, promote growth and survival of DLBCL. Antigen-dependent/independent BCR signaling is found in DLBCL subtypes.
Recent researches reveal that glycosylation plays role in human cells via site-specific regulation. Aberrant N-glycosylation in BCR-related effectors, such as, CD79a, immunoglobulin M or G (IgM or IgG), has been found to be associated with lymphoid malignancies. However, accurate quantification of intact glycopeptides and their individual glycan moieties in a cell-wide manner is still challenging. Here we established a site-specific quantitative N-glycoproteomics platform termed SugarQuant. It included a fast sample preparation workflow using Protein Aggregation Capture (PAC), an optimized multi-notch MS3 acquisition workflow (Glyco-SPS-MS3), a self-developed R-based tool (GlycoBinder). The robustness and accuracy of quantitation in SugarQuant were proved in a study using the different amounts of TMT-labelled IgM N-glycopeptides spiked into a background of TMT-labelled yeast peptides. Next, we used SugarQuant to identify and quantify more than 5000 unique glycoforms in Burkitt’s lymphoma cells treated with a series of doses of 2-deoxy-2-fluoro-L-fucose (2FF) and determine the more accurate site-specific glycosylation changes that occurred upon inhibition of fucosylation compared to using MS2 analysis. It revealed that 2FF-sensitive N-glycosylation on key players in BCR-mediated signaling in DG75. Furthermore, 2FF treatment also affects phosphorylation of the key players involving in B cell receptor signaling.
Then we investigated the site-specific quantitative N-glycoproteome in the cell lines of DLBCL subtypes using SugarQuant. More than 7000 unique intact glycopeptides (glycoforms) were quantified in five ABC DLBCL and four GCB DLBCL cell lines. The glycoproteome mapping (intact glycopeptide expressions) in each cell line allows to segregate DLBCL subtypes. The majority of these glycoforms were from the key cell-surface BCR effectors, such as IgM, CD79 and PTPRC. Lastly, we investigated the change of fucosylated glycopeptides in TMD8 cell line upon knockout of the fucosyltransferase FUT8, which is responsible for core-fucose synthesis, and by the treatment with 2FF. The results revealed that FUT8 might also regulate the synthesis of sub/terminal fucose on glycan chain and the inhibition of fucosylation increased the sialyated glycopeptide expression.
Phosphorylation is involved in regulating multiple processes as an important mediator in BCR signaling. Likewise, ubiquitylation plays vital roles in the activation of the nuclear factor-kappaB (NF-κB) pathway in BCR signaling. There are two vital upstream BCR-proximal tyrosine kinases, Bruton’s tyrosine kinase (BTK) and spleen tyrosine kinase (SYK), which regulate the auto-phosphorylation and phosphorylation of other proteins in BCR signaling pathway. Here we investigated the dynamics of downstream phosphorylation and ubiquitylation signaling in ABC DLBCL and GCB DLBCL cell lines upon the inhibitions of BTK and SYK using quantitative proteomics strategy. In the phosphoproteome analysis, a large dataset of quantified phosphorylation sites was obtained in the three ABC and four GCB DLBCL cell lines. BCR signaling in the subtypes of DLBCL cell lines was found to be highly individual in distinct cell lines. These significantly regulated phosphorylation events in each cell line with individual treatment were involved in multiple Reactome pathways, such as, M phase, signaling by Rho GTPases and diseases of signal transduction. Moreover, the gene regulation-related biological processes including chromosome organization and medication, DNA metabolic process, nuclear export, were involved in the DLBCL cell lines. In the ubiquitinome analysis, we identified more than 15,000 ubiquitylation sites in two ABC and one GCB cell lines upon the inhibition of BTK and SYK. The different ubiquitylation events observed in ABC and GCB subtypes revealed distinct BCR signaling pathways in two subtypes. The similar signaling perturbations across each cell line upon BTK and SYK inhibition, which were obtained from the significantly regulated ubiquitylated peptides expression, revealed the cell-type-specific concordance in ubiquitylation regulation upon BTK and SYK inhibition. These ubiquitylation modified proteins who bore the significantly regulated ubi-peptides in the samples were also found to be highly involved in gene regulatory processes.
...
Das Verständnis von Tumorerkrankungen wurde durch neue technologische und ökonomische Verbesserungen für die Next-Generation-Sequencing Analyse (NGS) gefördert. Die Komplexität der Interpretation genomischer Daten erschwert jedoch die Anwendung von NGS-Analysen im klinischen Kontext. Die Herausforderung besteht darin bei stetig wachsendem medizinischem Wissen dieses im klinischen Kontext zu interpretieren und eine personalisierte Therapieempfehlung abzugeben. Einen ressourcensparenden Ansatz können KI-unterstützende Software-Programme bieten, welche die genomischen Varianten mit der aktuellen Literatur vergleichen, eine Bewertung der Therapieoptionen geben und klinische Studien empfehlen können. In dieser retrospektiven Arbeit wurden Patient:innen mit metastasiertem Brustkrebs (n=77) mittels gezielter NGS-Analyse anhand von sogenannten Genpanels mit 126 bzw. 540 krebsrelevanten Genen im Zeitraum von 01/2019-02/2022 untersucht. Mit Hilfe von bioinformatischen Methoden wurden patientenspezifische genomische Veränderungen mit Behandlungsoptionen abgeglichen. Diese Methoden stützen sich vollständig auf öffentliche Datenbanken über somatische Varianten mit prädiktiver Evidenz für das Ansprechen auf bestimmte Medikamente. Diese Versorgungsforschung einer repräsentativen Kohorte des Universitätsklinikums Frankfurt in Kooperation mit Regionalverbund OncoNet Rhein-Main wurden systematisch ausgewertet inklusive der Bedeutung genomischer Varianten. Das OncoNet Rhein-Main ist eine Kooperation aus führenden onkologischen Zentren und Praxen im Rhein-Main-Gebiet, welche sich als Netzwerk der Aufgabe angenommen haben Patient:innen optimal therapeutisch zu versorgen. Für 51% (39/77) der Patient:innen konnte mindestens eine gezielte Therapieoption mit einem effektivem Biomarker im gleichen Tumortyp gemäß Zulassung der Europäischen Arzneimittelbehörde (EMA) gefunden werden.
Bei 12/77 (16%) wurde mindestens eine Alteration mit einem effektivem Biomarker und einer OFF-Label Therapieoption gefunden. Bei 30% der Patient:innen wurden Veränderungen in optionalen Biomarkern gefunden, welche Resistenzmechanismen erklären. Die umfassende molekulare Analyse von Patient:innen mit fortgeschrittenem Brustkrebs erlaubt die Behandlungsoption zu verbessern und ermöglicht durch die Analyse von bekannten Resistenzmarkern auch den klinischen Verlauf besser zu verstehen. Die interdisziplinäre Besprechung der Befunde im molekularem Tumorboard ist im Hinblick auf kontinuierliches Lernen aller Beteiligten sowie zur Qualitätssicherung eine entscheidende obligate Maßnahme.
Global analysis of halogenated trace gases in the UTLS: from long-lived to short-lived substances
(2023)
In this dissertation, the distribution of chlorinated and brominated substances in the upper troposphere and lower stratosphere is investigated. These substances contribute significantly to the catalytic decomposition of ozone and are involved in the recurrent formation of the polar ozone hole in the Antarctic winter and spring. The Montreal Protocol, a multilateral environmental treaty to protect the ozone layer, has successfully reduced emissions of long-lived chlorine- and bromine-containing substances. Short-lived chlorinated and brominated substances, some of which are natural and anthropogenic in origin, are not regulated by the Montreal Protocol and it can be assumed that their relative contribution to the stratospheric halogen budget will increase, while the contribution of long-lived compounds will steadily decrease. The distribution of long- and short-lived halogenated substances are part of current research. For the upper troposphere and lower stratosphere, the very short-lived substances are particularly important. The lower stratosphere needs special investigation in this respect, since its composition is influenced by different transport processes. The influences on ozone trends in the lower stratosphere are subject to great uncertainties. Especially in the Southern Hemisphere, the number of observations is very limited.
In this work, the GhOST (Gas chromatograph for Observational Studies using Tracers) instrument was used during the SouthTRAC measurement campaign on the German HALO (High Altitude and LOng range) research aircraft, providing observations of halogenated hydrocarbons in Antarctic late winter to early spring 2019, a generally poorly sampled region. The polar vortex was, compared to previous years, significantly weaker and shifted towards the eastern South Pacific and South America. From the airborne measurements of chlorinated source gases, inorganic chlorine (the sum of active chlorine and reservoir gases; Cly) could be inferred with the result that Cly within the vortex increased up to 1687 ± 19 ppt at 385 K potential temperature, accounting for about 50 % of the total chlorine within the vortex and only 15 % of the total chlorine in the southern mid-latitudes. A comparison with the Northern Hemisphere could be made using the PGS measurement campaign in the Arctic winter 2015/2016. Under comparable conditions (season and distance from the tropopause), only 40 % of the total chlorine was in the inorganic form within the Arctic polar vortex and about 20 % was found in the mid-latitudes of the Northern Hemisphere. In addition, about 540 ppt more Cly was present in the Antarctic vortex than in the Arctic vortex, exceeding the annual variations previously reported for Antarctica.
The mean age of air plays an essential role in the derivation of Cly via the organic source gases, as was done in this work. A new method for determining the mean age of air from observational data has been introduced that accounts for extra-tropical input to the stratosphere in addition to tropical input. This new method was compared with the previously used method, which considered only the tropical input. The new method shows more realistic values especially near the tropopause. On average, the air of the lower stratosphere in the Northern Hemisphere was older than in the Southern Hemisphere by about 0.5 ± 0.3 years. About 65 K above the tropopause, the pattern changed with older air in the mid-latitudes of the Northern Hemisphere, but older air in high latitudes of the Southern Hemisphere, which implies differences in the strength and isolation of the respective polar vortex as well as the wave forcing in the shallow branch of the Brewer-Dobson circulation of the respective hemisphere. This is in good agreement with the distribution of Cly. The difference in the lower stratosphere was not clearly evident with the old method and it can be assumed that investigations of the differences in Cly of Northern and Southern Hemisphere will benefit from the new method.
Finally, the global and seasonal distribution of the two most important representatives of the short-lived brominated substances, CH2Br2 and CHBr3, was investigated. For this purpose, two additional HALO measurement campaigns have been used, the 2012 TACTS measurement campaign and the 2017 WISE measurement campaign, as well as the HIAPER Pole-to-Pole Observations (HIPPO) and Atmospheric Tomography (ATom) measurement campaigns. Observations of CH2Br2 show a pronounced seasonality in the free and upper troposphere of both hemispheres with slightly larger values in the Northern Hemisphere. CHBr3, on the other hand, shows a generally higher variability and lower seasonality with larger mixing ratios at mid and high latitudes in the northern hemispheric winter and autumn. A comparison of the lower stratosphere is limited to autumn and spring of both hemispheres due to the limited data basis of the observations. The distributions in each spring are similar (less than 0.1 ppt differences for e.g., CH2Br2). In hemispheric autumn, larger differences are evident with substantially smaller mixing ratios in the southern hemispheric lower stratosphere. This suggests that the transport processes of the two hemispheres may be different and implies that the input of tropospheric air (flushing) to the Northern Hemisphere lowest stratosphere is more efficient than in the Southern Hemisphere. Vertical profiles of CH2Br2 and CHBr3 in the mid-latitudes of both hemispheres and resulting vertical gradients support this conjecture. However, the Southern Hemisphere data set is insufficient to quantify this difference and further measurements are needed.
Unter den weltweit in ständigem Gebrauch befindlichen Chemikalien befinden sich nicht nur Verbindungen mit akuter toxischer Wirkung, sondern auch solche mit Wirkung auf das endokrine System. Eine große Rolle spielt hier vor allem die Störung der Geschlechtsdifferenzierung und der Reproduktion, ausgelöst durch natürliche oder synthetische Chemikalien mit endokrinem Potential, sogenannte endokrine Disruptoren (ED). Diese Chemikalien können über unterschiedliche Eintragspfade in die Umwelt gelangen. Seit Mitte des 20. Jahrhunderts werden mehr und mehr Fälle bekannt, in denen anthropogene Chemikalien die Pflanzen- und Tierwelt belasten, darunter zahlreiche Befunde zu Störungen des Hormonsystems von Mensch und Tier.
Im Rahmen der Gefahren- und Risikobewertung steht bereits eine Vielzahl harmonisierter Prüfrichtlinien für die Identifizierung und Evaluierung der Effekte von (potentiellen) ED zur Verfügung. Um die Gesamtheit aller potentiellen Interaktionen von ED mit dem Hormonsystem detektieren zu können, ist die In-vivo-Untersuchung an Vertebraten in der Chemikalienregistrierung bisher unabdingbar. Bei der Untersuchung endokriner Potentiale in höheren Vertebraten spielen vor allem nager- und vogelbasierte Testsysteme eine wichtige Rolle. Diese bergen jedoch einen hohen zeitlichen, personellen und finanziellen Aufwand und erfordern eine massive Zahl an Versuchstieren, die für diese Tests benötigt werden. Darüber hinaus beinhalten Tierversuche eine Vielzahl von Problemen einschließlich ethischer Bedenken, die sich als Konsequenz der Tierhaltung unter Versuchsbedingungen ergeben. Ein sehr interessanter und vielversprechender Ansatz zur Reduktion von Tierversuchen ist die Entwicklung eines standardisierten Verfahrens für die Untersuchung potentieller ED in Vogelembryonen. Auf Vogelembryonen basierende In-ovo-Modelle stellen einen Mittelweg zwischen In-vitro- und In-vivo-Testsystemen dar. Mit dem Vogeleitest wird der sich entwickelnde Embryo, das für ED sensitivste Entwicklungsstadium im Leben eines Organismus, berücksichtigt.
Das Ziel der vorliegenden Arbeit war die Entwicklung und Eignungsuntersuchung eines auf dem Embryo des Haushuhns (Gallus gallus domesticus) basierenden Testsystems für den Nachweis von ED. Das resultierende Testsystem soll als Alternativmethode zu bisher etablierten nager- und vogelbasierten Testsystemen für die Untersuchung der Effekte hormonell aktiver Substanzen auf die Geschlechtsdifferenzierung in höheren Wirbeltieren eingesetzt werden.
Die im Rahmen der vorliegenden Dissertation durchgeführten Arbeiten umfassten sowohl die Charakterisierung der Normalentwicklung des Hühnerembryos, unbeeinflusst durch ED, als auch die morphologisch-histologischen Veränderungen der Gonaden von substanzexponierten Embryonen. Für die Untersuchung substanzbedingter Effekte, welche den Schwerpunkt der vorliegenden Arbeit darstellen, wurden die Embryonen gegenüber verschiedenen (anti)estrogenen und (anti)androgenen Substanzen exponiert. Unter Einfluss der Estrogene Bisphenol A (BPA) und 17α-Ethinylestradiol (EE2) entwickelten sich die Keimdrüsen der Männchen zu Ovotestes, während Weibchen ein Ovar mit deutlich schmalerem Cortex ausbildeten. Unter Einfluss der Antiestrogene Fulvestrant und Tamoxifen blieben Effekte auf die Gonaden männlicher Embryonen aus, eine durch das potente Estrogen EE2 hervorgerufene Feminisierung männlicher Gonaden konnte durch beide Substanzen jedoch effektiv antagonisiert werden. Weibchen bilden unter Einfluss von Tamoxifen deutlich schmalere linke Gonaden mit einem missgebildeten Cortex aus. Unter Einfluss der Androgene Tributylzinn (TBT) und 17α-Methyltestosteron (MT) blieben die Effekte auf männliche Embryonen aus, während die Weibchen anatomisch virilisierte Gonaden und eine Reduktion des linken gonadalen Cortex aufwiesen. Allein die untersuchten antiandrogenen Versuchssubstanzen Cyproteronacetat (CPA), Flutamid und p,p´-Dichlorodiphenyldichloroethen (p,p´-DDE) hatten keinen Effekt auf die gonadale Geschlechtsdifferenzierung männlicher und weiblicher Hühnerembryonen.
Es konnte gezeigt werden, dass der Embryo von G. gallus domesticus einen sensitiven Organismus innerhalb des Tierreichs darstellt und hinreichend sensitiv auf eine Reihe von endokrin wirksamen und reproduktionstoxischen Chemikalien reagiert. Anatomische und histologische Änderungen der Gonaden können daher als Biomarker für die Wirkung von ED bei Vögeln nützlich sein. Die untersuchten Endpunkte beziehen sich jedoch auf apikale Effekte und liefern keine mechanistischen Informationen zu den untersuchten Substanzen. Der
Hühnereitest ist eine sinnvolle Ergänzung zur bestehenden OECD-Testbatterie und zeichnet sich besonders durch seine kostengünstige und einfache Handhabung im Labor sowie einfach durchzuführende Tests aus. Durch die vergleichsweise kurze Versuchsdauer von nur 19 Tagen ist ein schnelles Substanzscreening möglich, welches zeitlich deutliche Vorteile gegenüber den etablierten nager- und vogelbasierten Testsystemen hat. Als Alternative zu bisherigen Assays könnte der vorgeschlagene Hühnereitest dazu beitragen, im Rahmen der (öko)toxikologischen Gefährdungs- und Risikobewertung von Chemikalien künftig weniger Versuchstiere zu verwenden.
In der vorliegenden Arbeit konzentrierte ich mich auf mediterrane wirbellose Tierarten, welche sich als Konsequenz ihrer Lebensweise nur schlecht ausbreiten können. Nichtsdestotrotz haben es Süßwasserkrabben der Gattung Potamon und Landschnecken der Gattung Tudorella geschafft, große Gebiete zu besiedeln, die heute durch das Mittelmeer getrennt sind. Für beide Gruppen wurde spekuliert, dass Menschen an ihrer Ausbreitung beteiligt waren. Es war mein Ziel die biogeographischen Muster dieser beiden Gattungen zu analysieren und abzuschätzen, ob Menschen tatsächlich Vektoren ihrer Ausbreitung waren. Meine Analysen fanden auf drei Ebenen statt: Taxonomie, Gattung und Art.
Untersuchungen zur Interaktion zytoplasmatischer Proteine mit dem Serotonintransporter Der plasmamembranständige Serotonintransporter SERT terminiert die Neurotransmission an serotonergen Synapsen durch den schnellen Rücktransport des Neurotransmitters Serotonin (5HT) in die Präsynapse. Neben seinem präsynaptischen Vorkommen wird der SERT auch axonal in Varikositäten immundetektiert. Der Substrattransport selbst unterliegt der Kontrolle des Ca 2 /CaM, des Stickoxid (NO) und des Proteinkinase C (PKC) Signaltransduktionsweges. Letzterer bestimmt die Oberflächenverfügbarkeit des SERT durch dessen Sequestrierung. Die Regulation der Lokalisation und des Substrattransports des SERT sollte durch assoziierte Proteine erzielt werden. Da bislang jedoch keine interagierenden Proteine des SERT bekannt waren, sollten in dieser Arbeit mit Hilfe des HefeZweiHybridSystems zytoplasmatische Interaktionspartner des SERT identifiziert werden. Erste Untersuchungen an heterolog exprimierten Deletionsmutanten der Termini des SERT ergaben, daß diese zytoplasmatischen Domänen für die Funktion des Proteins unabdingbar sind. Im folgenden wurde daher mit dem Carboxyterminus des SERT eine hirnspezifische cDNABibliothek der neugeborenen Ratte durchsucht. Es wurden vier cDNAKlone isoliert, die für putative Interaktionspartner des SERT kodierten. Die Relevanz dieser genetisch nachgewiesenen Interaktionen wurde biochemisch mittels affinitätschromatographischer Studien untersucht, während immunzytochemische Analysen die Interaktionen durch die Umverteilung oder durch die Colokalisation der coexprimierten Proteine in vivo validierte. Pharmakologische Untersuchungen sollten darüberhinaus Aufschluß über den regulatorischen Einfluß der Interaktion auf die Transportfunktion des SERT geben. Nach diesen Aspekten wurden zwei der putativen Interaktionspartner näher untersucht. Der erste untersuchte cDNAKlon kodierte für die ßUntereinheit der intrazellulären Acetylhydrolase des "plateletactivating factor" (ßPAFAH). Affinitätschromatographisch wurde die Interaktion durch die Präzipitation der eukaryotisch überexprimierten ß Untereinheit an einem bakteriell exprimierten Fusionsprotein des SERTCT bestätigt. Die immunzytochemische Analyse zeigte nach der Coexpression der ßPAFAH und dem SERT eine Umlokalisierung des zytoplasmatischen Proteins an Bereiche plasmamembranständiger SERTImmunreaktivität. Durch Wiederaufnahmestudien wurde kein Effekt der ßPAFAH auf die Transportfunktion des SERT ermittelt, weshalb die funktionelle Bedeutung dieser Interaktion vorerst unklar bleibt. Der zweite Klon kodierte für das Rattenspezifische Homolog des myristoylierten Alanin reichen Proteinkinase CSubstrats (MacMARCKS). Der biochemische Nachweis einer Interaktion konnte hier nicht erbracht werden. Dagegen zeigte die immunzytochemische Analyse eine Colokalisation von MacMARCKS und SERT in diskreten Bereichen der Plasmamembran. Hinweise auf die physiologische Bedeutung konnten durch die pharmakologische Analyse gewonnen werden. So induzierte die Coexpression von MacMARCKS und SERT eine Abnahme der maximalen Transportrate (Vmax) um 29,6 ± 18,6 % (n = 3) im Vergleich zu GFPexprimierenden Kontrollzellen. Die Stimulierung der PKC erzielte dagegen kaum eine weitere Reduktion der Vmax im Gegensatz zu den Kontrollzellen, während die Behandlung der Zellen mit einem PKCInhibitor zum Angleich der Vmax der Konrollzellen und der MacMARCKSexprimierenden Zellen führte. Daraus wurde gefolgert, daß MacMARCKS an der Regulation der Transportfunktion des SERT durch dessen Sequestrierung beteiligt ist. Zusammenfassend wurden in dieser Arbeit zwei Interaktionspartner des SERTCT identifiziert, deren mögliche Funktionen in der Regulation der intrazellulären 5HT Konzentration einerseits bzw. der Regulation der Transportfunktion des SERT andererseits liegen könnten.
The peroxisome proliferator activated receptor gamma (PPARgamma) plays an eminent role during alternative activation of macrophages and resolution of inflammation. As an antiinflammatory signaling molecule, it seems likely that it is tightly regulated dependent on the state of the immune response. There is growing evidence that PPARgamma expression is reduced during inflammation, whereas molecular mechanisms are illdefined. Even though, its role in immunosuppression is getting more definite. Apoptotic cells (AC) provoke an active repression of pro-inflammatory responses inter alia by the inhibition of pro-inflammatory cytokine expression or attenuated generation of reactive oxygen species (ROS). The reduced formation of ROS was attributed to PPARgamma activation, while mechanisms behind the reduced cytokine expression remained unclear. Therefore, my Ph.D. thesis addressed the role of PPARgamma during inhibited cytokine synthesis in response to AC and the regulation of PPARgamma expression during an inflammatory response, which was initiated by lipopolysaccharide (LPS) exposure. In the first part of the thesis, I investigated the role of PPARgamma in coordinating the attenuation of pro-inflammatory cytokine expression in response to AC. Exposing murine RAW264.7 macrophages to AC prior to LPS-stimulation, reduced NFKB transactivation and lowered target gene expression of e.g. TNFalpha and IL-6 compared to controls. In macrophages over-expressing a dominant negative (d/n) mutant of PPARgamma, NFKB transactivation in response to LPS was restored, while using macrophages from myeloid lineage-specific conditional PPARgamma knock-out mice proved that PPARgamma transmitted the anti-inflammatory response delivered by AC. Domain analysis revealed that amino acids 32-250 are essential for inhibition of NFKB. Mutation of a SUMOylation (SUMO: small-ubiquitin related modifier) site in this region (K77R) and interfering SUMOylation by silencing the SUMO E3 ligase PIAS1 (protein inhibitor of activated Stat1) eliminated AC-provoked NFKB inhibition and concomitant TNFalpha expression. Chromatin-immunoprecipitation assays demonstrated that AC prevented the LPS-induced removal of nuclear receptor co-repressor (NCoR) from the KB response element within the TNFalpha promoter. I concluded that AC induce PPARgamma SUMOylation to attenuate the removal of NCoR, thereby blocking transactivation of NFKB. This contributes to an anti-inflammatory phenotype shift in macrophages in response to AC, by lowering pro-inflammatory cytokine production. The second part addressed molecular mechanisms responsible for reduced PPARgamma expression upon LPS exposure. PPARgamma gained considerable interest as a therapeutic target during chronic inflammatory diseases. Remarkably, the pathogenesis of diseases such as multiple sclerosis or Alzheimer’s disease is associated with impaired PPARgamma expression. Initiation of an inflammatory response by exposing primary human macrophages to LPS revealed a rapid decline of PPARgamma1 expression. PPARgamma1 mRNA decrease was prevented by inhibition of NFKB and also after pre-treatment with the PPARgamma agonist rosiglitazone, suggesting a NFKB-dependent pathway, because activated PPARgamma is known to inhibit NFKB transactivation. Since promoter activities were not affected by LPS, I focused on mRNA stability and noticed a decreased PPARgamma1 mRNA half-life. RNA stability is often regulated via 3’ untranslated regions (UTRs). Therefore, I analyzed the impact of the PPARgamma-3’UTR by luciferase assays. LPS significantly reduced luciferase activity of pGL3-PPARgamma-3’UTR, suggesting that PPARgamma1 mRNA is destabilized. Deletion of a potential miR-27a/b binding site within the 3’UTR completely restored luciferase activity. Moreover, inhibition of miR-27b, which was induced upon LPS-exposure, partially reversed PPARgamma1 mRNA decay, whereas the mature miR-27 mimicked the effect of LPS. MiR-27b was at least partially induced by NFKB, thus correlating with NFKB-dependent PPARgamma1 mRNA decrease. Since deletion of the miR-27 site also containing an AU-rich element (ARE) completely abrogated LPS-induced reduction but inhibition of miR-27b only partially restored PPARgamma1 mRNA expression, I suggested an additional implication of an ARE-binding protein. I provide evidence that LPS induces miR-27b, which in turn destabilizes PPARgamma1 mRNA. Understanding the molecular mechanism of PPARgamma mRNA destabilization, might help to rationalize inflammatory diseases associated with impaired PPARgamma expression. Even though, further experiments are needed to clarify the potential involvement of ARE-binding proteins.
Beim Übergang vom Wachstum zur Entwicklung entsteht in Dictyostelium discoideum aus einzelnen vegetativ wachsenden Zellen ein multizellulärer Organismus, der in der Lage ist ausdauernde Sporen zu bilden. Während der im multizellulären Verband stattfindenden morphologischen Veränderungen und Zelldifferenzierung nimmt die Proteinkinase A (PKA) eine Schlüsselfunktion ein. Der C-Modul bindende Faktor A (CbfA), ursprünglich aufgrund seiner spezifischen Bindung an eine regulatorische DNA-Sequenz des Non-LTR Retrotransposons TRE5-A.1 in D. discoideum entdeckt, ist für den Übergang vom Wachstum zur Differenzierungsphase essentiell. Zellen der CbfA-Mangelmutante JH.D2 weisen im Vergleich zu denen des Wildtyp-Stamms AX2 ein verlangsamtes Wachstum und eine verzögerte Einleitung der Aggregation und der Entwicklung auf. Charakteristisch für diese CbfA-Mutante ist die Unterexpression der mRNA für die katalytische Untereinheit der Proteinkinase A (PkaC). Da die Expression der PkaC sowohl auf der Transkriptions- als auch auf der Translationsebene reguliert ist, wurde in dieser Arbeit ein monoklonaler Antikörper gegen die katalytische Untereinheit hergestellt, um den Proteingehalt an PkaC in Zellen der CbfA-Mutante zu untersuchen. Dabei konnte eine starke Unterexpression der PkaC in den CbfA-depletierten Zellen nachgewiesen werden. Demnach scheint es einen mittelbaren Zusammenhang zwischen der Menge an CbfA und dem sich selbst verstärkenden cAMP-abhängigen Signaltransduktionssystem der Zellen zu geben, da ein Mangel an cAMP eine fehlende Aktivierung der sich selbst induzierenden PKA nach sich zieht. Für D. discoideum konnte erstmals eine reproduzierbare 2D-gelelektrophoretische Trennmethode etabliert werden, mit der es gelang, differentiell exprimierte Proteine im Stadium der frühen Entwicklung zwischen den untersuchten D. discoideum-Stämmen AX2 und JH.D2 aufzufinden. Die Anwendung der DIGE-Technologie ermöglichte dabei die Detektion von ca. 30-40 differentiell exprimierten Proteinen. Durch die massenspektrometrische Untersuchung dieser Proteine unter Verwendung der MALDI-TOF Methode in Kombination mit dem Peptid-Massen-Fingerabdruck konnten insgesamt ca. 30% der differentiell exprimierten Proteine identifiziert werden. Dabei stellte sich heraus, daß vor allem Proteine mit essentiellen Funktionen im zellulären Stoffwechsel in der CbfA-Mangelmutante JH.D2 auf geringerem Niveau exprimiert wurden als im Wildtyp-Stamm AX2. Dies könnte eine Erklärung für die letalen Auswirkungen eines vollständigen knockouts von CbfA in D. discoideum liefern. Zusätzlich wurde mit Hilfe der DIGE-Technologie die Funktion der C-terminalen Domäne des CbfA-Proteins untersucht. Für diese Experimente wurde eine CbfA-Mutante verwendet, die den C-Terminus konstitutiv überexprimiert. Die daraus resultierenden Proteinmuster haben gezeigt, daß die C-terminale Domäne unabhängig vom Rest des Proteins sowohl induzierenden als auch reprimierenden Einfluß auf die Proteinexpression nimmt. Diese Ergebnisse zeigen eine unerwartet komplexe Funktion des Proteins CbfA in der Regulation von Genen während der untersuchten Lebensphasen von D. discoideum.
Die Herztransplantation ist die Goldstandardtherapie der Herzinsuffizienz [24]. Verglichen mit der konventionellen Therapie führt sie zu einer verbesserten Überlebensrate, Belastbarkeit und Lebensqualität [15b]. Diese werden durch die internationale Gesellschaft für Herz- und Lungentransplantation (ISHLT) mit ihrer weltweit größten Datenbank für Herz- und Lungentransplantationsdaten überprüft [45]. Aufgrund des hohen Stellenwerts und der umfassenden Arbeit der ISHLT findet in dieser Dissertation der Vergleich der Daten über das Outcome von 76 Herztransplantierten der Johann-Wolfgang-Goethe-Universitätsklinik Frankfurt am Main (KGU) mit den Daten der ISHLT statt.
Es handelt sich bei dieser Arbeit um eine retrospektive Studie, die 60 Männer und 16 Frauen im Alter zwischen 18 und 68 Jahren einschließt, die an der Uniklinik Frankfurt zwischen dem 24.02.1997 und dem 04.05.2013 eine Herztransplantation erhielten. Das Ziel dieser Arbeit ist es, die Ergebnisse der Universitätsklinik Frankfurt a.M. mit den internationalen Werten zu vergleichen um genauere Informationen zur internationalen Positionierung zu erhalten. Die Resultate sollen dazu dienen, die eigenen Prozesse zu verbessern, Stärken auszubauen und Schwächen zu beheben und die Behandlung der Patienten den wissenschaftlichen Empfehlungen anzupassen.
Die Ergebnisse dieser Studie zeigten, dass die 1-Jahres-Überlebenswahrscheinlichkeit an der KGU mit 69% deutlich geringer war als international mit 81% [37a]. Dabei zeigte sich in genaueren Analysen, dass das schlechtere Kurzzeitüberleben vor allem von der Transplantationsära von Februar 1997 bis 2001, der zur Transplantation führenden Diagnose einer ischämischen Kardiomyopathie (ICM) und dem Vorhandensein eines Assist Devices vor der Transplantation verursacht wurde. Das Alter und das Geschlecht des Patienten dagegen schienen keinen Einfluss darauf zu nehmen. Im Langzeitüberleben lagen die Ergebnisse der KGU deutlich über den Werten der ISHLT. Unter der Bedingung, dass das erste postoperative Jahr überlebt wurde, ergab sich für KGU Patienten eine 10- bzw. 15-Jahres-Überlebenswahrscheinlichkeit von 74% (n=40) bzw. 60% (n=33). Die Wahrscheinlichkeit das 10. postoperative Jahr zu überleben lag für ISHLT Patienten bei 63,9%; für das 15. Jahr lag dieser Wert bei 42% [37g].
Die Langzeitkomplikationen der Malignität und der TVP traten an der KGU anteilig seltener auf als international. Die TVP-Freiheit nach 10 Jahren lag international bei 47% und an der KGU bei 75% [37e]. Für die Freiheit von Malignität lag die Wahrscheinlichkeit des 10. Jahres international bei 66% und an der KGU bei 74% [37c]. Die Wahrscheinlichkeit für die Freiheit von einem Kreatininwert über 2,5mg/dl bis zum 10. Jahr nach Transplantation war an der KGU mit 70% (n=26) ähnlich wie die internationalen Werte von 61,5% [37b]. Die Patienten der KGU erlitten des Weiteren deutlich mehr Abstoßungen im ersten Jahr. Während international zwischen 25 und 30% der Patienten eine Abstoßungsreaktion im ersten Jahr erlebten, waren es an der KGU mindestens 50%. Trotzdem war der Anteil an behandlungsbedürftigen Abstoßungen an der KGU anteilig geringer als bei dem Patientenkollektiv der ISHLT [37d]. Bei der Analyse der Immunsuppression zeigte sich, dass die KGU das Steroidweaning deutlich später und in wesentlich geringerem Ausmaß durchführt: während im 5. postoperativen Jahr 48% der ISHLT-Patienten Steroide erhalten, sind es an der KGU noch 83% (n=40) [37n]. Im Vergleich der verschiedenen Kombinationstherapien zeigte sich, dass in der Patientengruppe der KGU hauptsächlich Kombinationen mit Ciclosporin (Jahr 1 85,2%, n=46) angewendet wurden, während unter den ISHLT-Patienten hauptsächlich Tacrolimus (Jahr 1 57,5%, n=4053) eingesetzt wurde. Beide Gruppen haben gemeinsam, dass der Anteil an Sirolimus- bzw. Everolimus-Kombinationen von Jahr 1 auf Jahr 5 zunimmt. Dabei kommen diese Kombinationen prozentual gesehen international häufiger vor [37m].
Folglich konnte diese Studie nicht nur zeigen, wo die Stärken der Universitätsklinik Frankfurt liegen, sondern auch welche Punkte in naher Zukunft verbessert werden können. Somit werden konkrete Anpassungen an der Behandlung der HTx-Patienten der KGU erfolgen können.
Die alpha-Untereinheiten von Ionenkanälen assemblieren durch eine Tetramerisierung von Coiled-Coils
(2002)
Der spannungsabhängige Kaliumkanal EAG1 besitzt eine carboxyterminale 40 Aminosäuren lange Domäne, die für die Assemblierung von vier alpha-Untereinheiten zu einem funktionellen Kanal verantwortlich ist. Die Zielsetzung dieser Arbeit war zunächst die Analyse der Sekundärstruktur dieser Assemblierungsdomäne, sowie die Identifikation weiterer Ionenkanäle, die im Carboxyterminus eine strukturelle Homologie zur Assemblierungsdomäne des EAG1- Ionenkanals zeigen. Darüber hinaus sollten Aussagen über die Bedeutung der Domäne für die Funktion des jeweiligen Ionenkanals getroffen werden. Computergestützte Analysen der Sekundärstruktur ergaben, dass strukturell konservierte homologe Domänen in den Familien der durch zyklische Nukleotide gesteuerten Kationenkanälen (CNG), in den spannungsabhängigen kaliumselektiven Kanälen (neben EAG, auch in ELK, ERG und KCNQ), in den calciumabhängigen Kaliumkanälen (SK, IK), in den nicht selektiven Kationenkanälen (PKD) und in den Calciumkanälen (TRP) zu finden sind. Diese Ionenkanäle zeigen in computergestützten Analysen Domänen, mit einer hohen Wahrscheinlichkeit zur Ausbildung einer Coiled-Coil Struktur im Caboxyterminus. Im zweiten Teil ging es darum, die berechnete Sekundärstruktur experimentell zu belegen. Dazu wurden die caboxyterminal gelegenen Proteinbereiche mit einer Möglichkeit zur Ausbildung eines Coiled-Coils exemplarisch von den Kanälen EAG1, EAG2 und ERG1 als Peptide synthetisiert und analysiert. Anhand von Gelfiltrationsexperimenten und Lichtstreuung wurde die Stöchiometrie der Peptid-Assemblierung als Tetramerisierung identifiziert. Mittels Zirkulardichroismus-Spektroskopie konnte ein hoher alpha-helikaler Strukturanteil und eine außerordentliche Stabilität gegenüber hitzedenaturierenden Bedingungen gezeigt werden. Aus diesen Daten kann, in Übereinstimmung mit computergestützten Analysen der Aminosäuresequenz, geschlossen werden, dass die Peptide zu tetrameren Coiled-Coils assemblieren. In Analogie kann diese Art der Zusammenlagerung ebenfalls für die alpha-Untereinheiten der Ionenkanäle angenommen werden, für die in computergestützten Analysen eine hohe Wahrscheinlichkeit zur Ausbildung eines Coiled-Coils berechnet werden konnte. Die dafür verantwortliche Domäne wurde als „Tetramerisierende Coiled-Coil“ (TCC) Domäne benannt und kann als generelles Strukturmotiv angenommen werden. Im dritten Teil wurde ein auf Oberflächen-Plasmonresonanz basierender Proteininteraktionstest entwickelt, der es ermöglicht, die Kinetik der Tetramerisierung in Echtzeit zu verfolgen. Für die Peptide, deren Aminosäuresequenz der TCC-Domäne eines funktionellen Ionenkanals entsprach, konnte eine Ausbildung homomerer Komplexe gezeigt werden. Eine stabile heterologe Interaktion konnte nur zwischen den aus einer Proteinunterfamilie stammenden Domänen EAG1 und EAG2 gemessen werden. Dagegen interagierten diese Peptide nicht mit der Interaktionsdomäne aus ERG1. Die TCC-Domäne ist demnach in der Lage, die Spezifität der Bindung zu bestimmen. Aufbauend auf den Ergebnissen der Sekundärstrukturanalyse stand nun die Bedeutung der TCC-Domäne für die Funktionalität des jeweiligen Ionenkanals im Zentrum dieser Arbeit. In weiteren Experimenten konnte gezeigt werden, dass der Austausch einer hydrophoben Aminosäure gegen eine polare Aminosäure innerhalb des Coiled-Coils drastische Auswirkungen auf die Funktion dieser ca. 40 Aminosäuren langen Domäne hatte. Diese Peptide lagen nur noch zu einem geringen Anteil als Tetramere vor und wiesen eine deutlich geringere Stabilität gegenüber hitzedenaturierenden Bedingungen auf. Im Proteininteraktionsassay äußerte sich der Einfluss des Austausches in einer rascheren Assoziations- und Dissoziationsphase im Vergleich zu den tetrameren Coiled-Coil Peptiden. In vivo durchgeführte elektrophysiologische Messungen an Ionenkanalkonstrukten bestätigten die physiologische Relevanz der TCC-Domäne. Die Abwesenheit dieser Domäne in HERG1 führte zu einem Verlust der Funktion des Ionenkanals. Diese konnte jedoch durch Klonierung der entsprechenden TCC-Domäne des EAG1-Ionenkanals in den HERG1-Ionenkanal wieder hergestellt werden. Das Ionenkanalkonstrukt, bestehend aus dem HERG1-Kanal mit der TCC-EAG1 Domäne konnte, im Gegensatz zu dem HERG1 Wildtyp, funktionelle Heteromultimere mit EAG1 alpha- Untereinheiten bilden, so dass ein Ionenkanal mit veränderten Eigenschaften elektrophysiologisch beschrieben werden konnte. Die Relevanz der TCC-Domäne für die Funktionalität des Ionenkanals wird auch durch natürlich vorkommende Mutationen belegt. Diese beeinflussen die Struktur und damit die Funktion der TCC-Domäne. In Datenbanken des humanen Genoms konnten 38 Mutationen in sieben verschiedenen Genen identifiziert werden, die die Struktur der Coiled-Coil Domäne der resultierenden Ionenkanäle beeinflussen. Diese Mutationen äußern sich in zahlreichen phänotypischen Krankheitsbildern.
Diese Arbeit entstand im Rahmen eines größeren Forschungsprojektes zum Thema Bewältigung von Lebensenttäuschungen, initiiert von Prof. Dr. Siegfried Preiser am Institut für Psychologie der Universität Frankfurt am Main. In diesem Kontext wurde die vorliegende Studie entwickelt.
Ausgehend von interpersonalem Engagement wurden mögliche Verknüpfungen von Einflussfaktoren im Umgang mit unterschiedlichen kritischen Lebenssituationen und der sich daraus ergebenden Konsequenzen auf psychische und physische Gesundheit, d.h. persönliches Wohlbefinden untersucht. Das Konstrukt Wohlbefinden wurde in dieser Studie als eine latente Variable gebildet, die sich aus einer Konstellation von bereichsspezifischen und allgemeinen Lebenszufriedenheitsfaktoren, dem seelischen Gesundheitsempfinden und – mit negativem Gewicht - dem aktuellen Belastungsempfinden zusammensetzt.
Außer der Erfassung der Partizipation an sozialen Gemeinschaften bzw. des sozialen Engagements wurden intrapsychische, motivationale, biographische und soziale Faktoren erfasst sowie religiöse Aspekte einbezogen. Zielgruppen der Untersuchung waren Gruppierungen vorwiegend aus dem Selbsthilfebereich.
Zur Beachtung der Zeitperspektive war die Befragung als Längsschnittstudie in Form einer Zweifachmessung konzipiert.
Erhoben und untersucht wurden im einzelnen Belastungs-, Persönlichkeits-, Gesundheits- und Zufriedenheitsfaktoren, des Weiteren die Aspekte des sozialen Kontextes mit Differenzierung der Ebenen von sozialer Unterstützung sowie religiöse Aspekte als angenommene Einflussfaktoren auf Lebenszufriedenheit und persönliches Wohlbefinden.
Zusammenfassend hatten die Persönlichkeitsfaktoren Flexibilität und Selbstwirksamkeit den größten positiven Einfluss auf Wohlbefinden. Bzgl. des sozialen Engagements zeigte sich dagegen kein signifikanter Einfluss.
Neben den Variablen Flexibilität und Selbstwirksamkeit stellte sich die wahrgenommene Unterstützung als bedeutsamster Einflussfaktor auf das Wohlbefinden heraus.
Religiöse Vorstellungen konnten nach ihrer persönlichen positiven oder negativen Grundhaltung gegenüber Gott bzw. einer höheren Wirklichkeit differenziert werden. Eine positive religiöse Grundhaltung ist geprägt von der Vorstellung eines schützenden, fürsorglichen und hilfreichen Gottes. Ein negatives Gottesbild beinhaltet die Vorstellung eines bedrohlichen und strafenden Gottes. Nur für diese Betrachtungsweise konnten eindeutige - und zwar negative - Einflüsse auf das Wohlbefinden ermittelt werden
Inhaltlich gliedert sich die Arbeit in vier Blöcke:
In Kapitel 1 werden theoretische Grundlagen und untersuchungsrelevante Konzepte näher erläutert und daraus die konkreten Fragestellungen einschließlich der Hypothesen entwickelt.
In Kapitel 2 schließt sich der methodische Teil mit den Beschreibungen der Stichprobe, der Erhebungsinstrumente und des Untersuchungsverlaufes an.
Kapitel 3 enthält die Ergebnisse und deren Diskussion. Kapitel 4 beinhaltet ein Resümee und Ausblick. In Kapitel 5 befindet sich die für diese Arbeit verwendete Literatur, woran sich der Anhang anschließt. Der Anhang besteht zum einen aus weitergehenden Informationen und Erläuterungen, die Durchführung und Auswertung betreffend (Anhang I). Anhang II, der der Druckversion als CD beiliegt, listet zum anderen die Originalantworten der Probanden in strukturierter Form auf.
This thesis discusses important questions of the beam dynamics in the proton-lead operation in the Large Hadron Collider (LHC) at CERN in Geneva. In two time blocks of several weeks in the years 2013 and 2016, proton-lead collisions have so far been successfully generated in the LHC and used by the experiments at the LHC. One reason for doubts regarding the successful operation in proton-lead configuration was the fact that the beams have to be accelerated with different revolution frequencies. There is long-range repulsion between the beams, since both beams share the beam chamber around the interaction points. Because of the different revolution frequencies, the positions of the interaction between the beams shift each revolution. This can lead to resonant excitation and to an increase in the transverse beam emittance, as was observed in the Relativistic Heavy-Ion Collider (RHIC). In this thesis, simulations for the LHC, RHIC and the High-Luminosity Large Hadron Collider (HL-LHC) are performed with a new model. The results for RHIC show relative growth rates of the emittances of the gold beam in gold-deuteron operation in RHIC from 0.1 %/s to 1.5 %/s. Growth rates of this magnitude were observed experimentally in RHIC. Simulations for the LHC show no significant increase of the emittance of the lead beam for different intensities of the counter-rotating beam. The simulation results confirm the measured stability of the beams in the LHC and the issue of strongly increasing emittances in RHIC is reproduced. Also, no significant increase of the emittance is predicted for the Future Circular Collider (FCC) and the HL-LHC.
Using a frequency-map analysis, this work verifies whether the interaction of the lead beam with the much smaller proton beam in the proton-lead operation of the LHC leads to diffusion within the lead beam. Experiences at HERA at DESY in Hamburg and at SppS at CERN have shown that the lifetime of the larger beam can rapidly decrease under certain circumstances. The results of the simulation show no chaotic dynamics near the beam centre of the lead beam. This result is supported by experimental observation.
A program code has been developed which calculates the beam evolution in the LHC by means of coupled differential equations. This study shows that the growth rates of the lead beam due to intra-beam scattering is overestimated and that particle bunches of the lead beam lose more intensity than assumed in the model. The analysis also shows that bunches colliding in a detector suffer additional losses that increase with decreasing crossing angle at the interaction point.
In this work, 2016 data from beam-loss monitors in combination with the luminosity and the loss rate of the beam intensity are used to determine the cross section of proton-lead collisions at the center-of-mass energy of 8.16 TeV. Beam-loss monitors that mainly detect beam losses that are not caused by the collision process itself are used to determine the total cross section via regression. An analysis of the data recorded in 2016 at the center-of-mass energy of 8.16 TeV resulted in a total cross section of σ=(2.32±0.01(stat.)±0.20(sys.)) b. This corresponds approximately to a hadronic cross section of σ(had)=(2.24±0.01(stat.)±0.21(sys.)) b. This value deviates only by 5.7 % from the theoretical value σ(had)=(2.12±0.01) b.
The simulation code for determining the beam evolution is also used to estimate the integrated luminosity of a future one-month run with proton-lead collisions. The result of the study shows that in the future the luminosity in the ATLAS and CMS experiments will increase from 15/nb per day in 2016 to 30/nb per day, which is a significant increase in terms of the performance. This operation, however, requires the use of the TCL collimators to protect the dispersion suppressors at ATLAS and CMS from collision fragments.
This work also gives an outlook on the expected luminosity production in proton-nucleus operation using ion species lighter than lead ions. For example, a change from proton-lead to proton-argon collisions would increase the integrated luminosity from monthly 0.8/nb to 9.4/nb in ATLAS and CMS. This is an increase of one order of magnitude and approximately a doubling of the integrated nucleon-nucleon luminosity. There may be a test operation with proton-oxygen collisions in 2023, which will last only a few days and will be operated with a low luminosity. The LHCf experiment (LHCb experiment) would achieve the desired integrated luminosity of 1.5/nb (2/nb) within 70h (35h) beam time.
Untersuchung: Aus acht Werken des zeitgenössischen Schriftstellers Zigmunds Skujins wurden 500 lettische Wörter untersucht, die in den drei umfangreichsten lettischen Wörterbüchern nicht verzeichnet und somit möglicherweise Neologismen des Autors sind. Analysiert werden die Wortarten, die Komposita, die Herkunft der assimilierten Lehnwörter, orthographische und andere Varianten bereits lexikalisierter Wörter, die Arten der Diminutivbildung und der Präfigierung. Außerdem werden Aussagen über die Motivation des Autors gemacht und schließlich die Langlebigkeit dieser Neologismen mit Hilfe der Suchmaschine www.google.lv untersucht. Resultate: Es fanden sich 353 Substantive, 74 Verben, 55 Adjektive und 18 Adverbien. Unter den 500 Neuwörtern waren 210 Komposita und 185 assimilierte Lehnwörter, wovon die überwiegende Mehrheit aus dem Deutschen rekrutiert wurden. Orthographisch variiert waren 36 Wörter. Die Motivation für die Bildung von Neologismen lag bei diesem Autor in der Erhöhung der Plastizität des Ausdrucks, in der Erzeugung von Despektierlichkeit und Humor. Im Internet fanden sich 52,2 % der 500 Neologismen, 45,2 % konnten nicht gefunden werden und 2,6 % waren mit dieser Methode nicht eruierbar, weil sie mit Eigennamen identisch waren. Schlussfolgerungen: Der lettische Autor Zigmunds Skujins hat in diesen Werken durch die Bildung und die Anwendung vieler Neologismen dazu beigetragen die Lexik des Lettischen zu bereichern. Durch seine v.a. aus Morphemen des Lettischen gebildeten Neuwörter hat er bewiesen, dass es möglich ist neue Begriffe aus dem Lettischen zu bilden. Bei Entlehnungen greift er vor allem auf das Deutsche und auf Sprachen aus dem westlichen Kulturkreis zurück, weniger auf das Russische. Um solchen Neologismen zu mehr Verbreitung zu verschaffen, wäre es wünschenswert ein elektronisches Neologismenwörterbuch zu erstellen, das allen privat und beruflich an der lettischen Sprache Interessierten frei zugänglich ist.
Die Kephalometrie stellt einen bedeutenden Diagnostikbestandteil der kieferorthopädischen Diagnostik und Behandlungsplanung dar, mit deren Hilfe es möglich ist, skelettale Ursachen dentaler Befunde zu evaluieren. Üblicherweise erfolgt die kephalometrische Analyse anhand eines Fernröntgenseitenbildes, das jedoch neben der unausweichlichen Strahlenbelastung des Patienten, der sich zumeist im jugendlichen Alter und im Wachstum befindet und damit besonders vulnerabel bezüglich ionisierender Strahlung ist, auch geometrische Verzerrungen und Verzeichnungen aufweist, die eine kephalometrische Analyse erschweren. Zudem erfolgt beim FRS eine dreidimensionale Analyse, die auf einer zweidimensionalen Ansicht basiert und daher nicht die Exaktheit einer 1:1 Analyse besitzen kann. Die Kephalometrie mittels Magnetinduktion stellt eine strahlenfreie Alternative zur Verfügung. Im Rahmen der vorliegenden Studie ist untersucht worden, inwieweit Untersucher mit dem auf einer elektromagnetischen Induktion basierenden noXrayCeph®- Gerätes in der Lage sind, genaue Messdaten zu generieren und zu reproduzieren. Beim noXrayCeph®-Gerät handelt es sich um eine Weiterentwicklung des 3-Space®-Isotrak®- Gerätes der Firma POLHEMUS. Im Rahmen der hier durchgeführten Studie konnte die Messgenauigkeit der kephalometrischen Messung auf Basis der Magnetinduktion sowie die Reproduzierbarkeit durch verschiedene Untersucher statistisch belegt werden. Weiterhin sollten mit der Durchführung einer Anwenderschulung die Anwenderfreundlichkeit des Gerätes und das einfache Erlernen der Handhabung eruiert werden. Hierfür wurden insgesamt drei differente Versuchsreihen aufgebaut. Die Messgenauigkeit des noXrayCeph®-Gerätes wurde anhand eines normierten Abstands von exakt 100 mm nachgewiesen. Außerdem konnten fünf unterschiedliche Untersucher jeweils 15mal eine kephalometrische Analyse mit dem noXrayCeph®-Gerät reproduzierbar durchführen. Dabei waren die Messergebnisse sowohl Untersucher sowie zeitunabhängig. Diese kephalometrischen Untersuchungen erfolgten hierbei an einem Kunststoffschädel, auf den 55 Messpunkte als kephalometrische Variablen übertragen worden waren. In einer nachfolgenden Anwenderschulung konnten sechs männliche und vier weibliche Probanden nachweisen, dass auch ohne eine Anwenderschulung eine hohe Reproduzierbarkeit der ermittelten Werte erreicht werden konnte. Ebenfalls wurde der Einfluss des Geschlechts, des Winkels des angesetzten 103 Messstiftes, der Handhabung dieses Messstiftes sowie des physiologischen Tremors auf die Messgenauigkeit und die Reproduzierbarkeit der Daten geprüft. Es ließ sich wiederholt zeigen, dass mit dem noXrayCeph®-System genaue und reproduzierbare Werte einer kephalometrischen Analyse gewonnen werden, die bei den unterschiedlichen Untersuchern in einem Rahmen tolerierbarer Schwankungen vergleichbar sind. Auch intraindividuell weisen die ermittelten Daten eine hohe Reproduzierbarkeit auf. In dieser Studie sind Einflüsse des Geschlechts, der Handhabung des Messstiftes sowie des Winkels dieses Stiftes ebenso wenig nachweisbar wie ein positiver Einfluss einer Vorab-Schulung der Probanden. Der bei den Probanden vorhandene, unterschiedlich ausgeprägte physiologische Tremor und die unterschiedliche Haltung der Messspitze hatten keinerlei Auswirkung auf die Reproduzierbarkeit der Messergebnisse. Zusammenfassend lässt sich aus der durchgeführten Studie somit ableiten, dass das noXrayCeph®-Verfahren geeignet ist für eine exakte kephalometrische Analyse. Die Patienten sind keiner Strahlenexposition wie bei einer Röntgenaufnahme ausgesetzt. Die Anwenderschulung zeigte außerdem, dass das Verfahren und der Umgang mit dem noXrayCeph®-Gerät bei der Messung einfach erlernbar und gut durchführbar ist. Die aus dem Röntgenverfahren resultierenden Probleme wie Verzerrungen und Überlagerungsfehler sowie die Strahlenexposition gerade bei jungen Patienten können mit diesem Verfahren umgangen und eliminiert werden. Somit stellt die Kephalometrie mit dem noXrayCeph®-Gerät eine fundierte Alternative in der Kieferorthopädie dar.
Im Rahmen dieser Arbeit wurden sRNAs des halophilen Archaeons Haloferax volcanii hinsichtlich ihrer biologischen und ihrer regulatorischen Funktion charakterisiert.
Um einen Überblick über die biologischen Funktionen archaealer sRNAs zu erhalten, wurde eine umfassende phänotypische Charakterisierung von 27 sRNA-Deletionsmutanten im Vergleich zum Wildtyp ausgewertet. Im Zuge dieser phänotypischen Charakterisierungen wurden zehn verschiedene Wachstumsbedingungen, morphologische Unterschiede und Veränderungen in der Zellmotilität untersucht. Hierbei zeigten nahezu alle Deletionsmutanten unter mindestens einer der getesteten Bedingungen phänotypische Unterschiede. Durch den Verlust von sRNAs wurden sowohl sogenannte Gain-of-function als auch Loss-of-function Phänotypen beobachtet. Haloarchaeale sRNAs spielen eine wichtige Rolle beim Wachstum mit verschiedenen Salzkonzentrationen, mit verschiedenen Kohlenstoffquellen und beim Schwärmverhalten, sind jedoch weniger in die Adaptation an diverse Stressbedingungen involviert.
Zur näheren Charakterisierung der regulatorischen Funktion archaealer sRNAs wurden sRNA362, sRNAhtsf468 und sRNA479 mittels molekulargenetischer Methoden wie Northern Blot-Analyse und DNA-Mikroarray sowie bioinformatischer in silico-Analyse untersucht. Das Expressionslevel von sRNA362 konnte bestimmt und potentielle Zielgene für sRNAhtsf468 und sRNA479 identifiziert werden.
Eine vorangegangene Studie zeigte den Einfluss von sRNA30 unter Hitzestress und führte zur Identifikation differentiell produzierter Proteine in Abwesenheit der sRNA. In dieser Arbeit wurde mittels Northern Blot-Analysen die Expression der sRNA30 charakterisiert. Das Wachstum in An- und Abwesenheit von sRNA30 wurde bei 42°C und 51°C phänotypisch charakterisiert und der regulatorische Einfluss der sRNA auf die mRNA differentiell regulierter Proteine durch Northern Blot-Analyse überprüft. Eine Transkriptomanalyse mittels DNA-Mikroarray nach Hitzeschock-Induktion führte zur Identifikation differentiell regulierter Gene involviert in Transportprozesse, Metabolismus, Transkriptionsregulation und die Expression anderer sRNAs. Die differentielle Regulation des Proteoms nach Hitzeschockinduktion in An- und Abwesenheit von sRNA30 konnte bestätigt werden.
Desweiteren wurde in dieser Arbeit sRNA132 und deren phosphatabhängige Regulation der Ziel-mRNA HVO_A0477-80 näher charakterisiert. Eine Induktionskinetik nach Phosphatentzug bestätigte die Bedeutung von sRNA132 für die verstärkte Expression des Operons HVO_A0477-80 unter Phosphatmangel-Bedingungen und verwies auf die Existenz weiterer Regulationsmechanismen. Während vor und nach Phosphatentzug kein Unterschied bezüglich der Zellmorphologie von Wildtyp und Deletionsmutante zu erkennen war, führte das Wachstum mit einem starken Phosphatüberschuss von 5 mM zu einer Zellverlängerung der Deletionsmutante. Die Kompetition der nativen 3‘-UTR des Operons HVO_A0477-80 mit einer Vektor-kodierten artifiziellen 3‘-UTR legt eine Regulation über die Bindung von sRNA132 an die 3‘-UTR nahe. Der Transkriptomvergleich nach Phosphatentzug in An- und Abwesenheit von sRNA132 führte zur Identifikation des Phosphoregulons der sRNA. Zu diesem Phosphoregulon gehören unter anderem zwei Glycerinphosphat-Dehydrogenasen, Transkriptionsregulatoren, eine Polyphosphatkinase und eine Glycerolphosphodiesterase. Zudem waren die Transkriptlevel der beiden ABC-Transporter HVO_A0477-80 und HVO_2375-8 für anorganisches Phosphat und des Transporters HVO_B0292-5 für Glycerinaldehyd-3-Phosphat in Abwesenheit der sRNA verringert. Die beiden ABC-Transportsysteme für anorganisches Phosphat wurden im Rahmen dieser Arbeit deletiert und weiter charakterisiert. Es konnte gezeigt werden, dass das ABC-Transportsystem HVO_2375-8 bei geringen Phosphatkonzentrationen leicht induziert wird und das Transkriptlevel in Anwesenheit von sRNA132 erhöht ist. Wachstumsversuche der jeweiligen Deletionsmutante in direkter Konkurrenz mit dem Wildtyp zeigten, dass keiner der beiden ABC-Transporter den anderen vollständig ersetzen kann und der Wildtyp mit beiden intakten ABC-Transportern unter phosphatlimitierenden Bedingungen einen Wachstumsvorteil besitzt. In silico-Analysen der Promotorbereiche von sRNA und ABC-Transporter legen zudem die Existenz von P-Boxen nahe.
In the qualitative analysis of solutions of partial differential equations, many interesting questions are related to the shape of solutions. In particular, the symmetries of a given solution are of interest. One of the first more general results in this direction was given in 1979 by Gidas, Ni and Nirenberg... The main tool in proving this symmetry and monotonicity result is the moving plane method. This method, which goes back to Alexandrov’s work on constant mean curvature surfaces in 1962, was introduced in 1971 by Serrin in the context of partial differential equations to analyze an overdetermined problem...
Nach der Revolution 1917 schlossen sich mehrere russische Avantgardekünstler den kollektiven geistigen Anstrengungen ein, um ein revolutionäres Gesamtkunstwerk der neuen Menschheit zu gestalten. Sie nutzten alle Medien der Kunst, um ihre innovativen Ideen in diesem Experimentierfeld zu verwirklichen. Die Keramik wurde von ihnen als eines der bedeutenden Experimentierfelder und eine zukunftsweisende Kunstgattung gesehen, die durch den alltäglichen Gebrauch das Bewusstsein und die Wahrnehmung der Menschen entscheidend revolutionieren sollte.
Die vorliegende Dissertation untersucht erstmals die Keramik der russischen Avantgarde als eigenständiges künstlerisches Phänomen. Alle dokumentarisch belegten Entwürfe und Keramiken der russischen Avantgardisten werden zusammengefasst sowie alle bekannten Marken der Keramik aufgeführt. Die Autorin systematisiert die Formensprache und Dekormotive der avantgardistischen Keramikwerke und hebt Hintergrunde sowie theoretische Grundlagen der jeweiligen avantgardistischen Gruppen im Bereich Keramik hervor.
Die vorliegende vergleichende Analyse der russischen und westeuropäischen Keramikkunst des ersten Drittels des 20. Jahrhunderts deckt zum ersten Mal in der kunsthistorischen Forschung ihre Gemeinsamkeiten sowie die gegenseitigen Einflüsse auf, dabei werden die Unterschiede der russischen und europäischen avantgardistischen Keramikkunst deutlich reflektiert.
Adenosintriphosphat (ATP) als universelles Energieäquivalent der Zelle wird durch die oxidative Phosphorylierung synthetisiert, bei der Elektronen entlang des elektrochemischen Gefälles der Atmungskette über verschiedene Redoxkomplexe transferiert und durch die chemiosmotische Kopplung Protonen über die Membran gepumpt werden. Der Protonengradient wird dann von der ATP-Synthase genutzt, um ADP zu ATP zu phosphorylieren. Zentraler Redoxkomplex der Atmungskette vieler Pro- und Eukaryonten ist der bc1-Komplex, der Elektronen von Ubichinol auf Cytochrom c überträgt, von wo sie nachfolgend auf die Cytochrom c-Oxidase transferiert werden. Das mesophile Bodenbakterium Paracoccus denitrificans wird als Modellsystem für den mitochondrialen Elektronentransfer (ET) verwendet, da es eine aerobe Atmungskette exprimiert, die der mitochondrialen homolog ist, allerdings einen wesentlich einfacheren Aufbau der einzelnen Redoxkomplexe aufweist. Auch Thermus thermophilus als extrem thermophiles Bakterium bildet eine vergleichbare aerobe Atmungskette aus, wobei deren Proteine allerdings eine hohe Thermostabilität aufweisen, wodurch sie in das Interesse der Forschung gerückt sind. Ziel dieser Arbeit war die funktionelle Charakterisierung des ET zwischen Komplex III und IV der Atmungsketten von P. denitrificans und T. thermophilus, die aufgrund ihrer mesophilen und thermophilen Eigenschaften unterschiedliche Mechanismen in der Wechselwirkung ihrer Redoxproteine aufweisen. Es wurden lösliche Redoxfragmente verwendet, um anhand von Mutagenesestudien, Stopped-Flow (SF)- und Laserflash-Kinetiken (LF) unter pre-steady state-Bedingungen sowie FRET-Experimenten den ET zu untersuchen. Für die LF-Experimente wurde eine photoaktive Rutheniumverbindung kovalent an Cyt c552 gekoppelt, durch die bei Laseranregung das Häm photooxidiert und dadurch der ET von einem reduzierten Redoxpartner induziert werden kann. Die Strukturdaten des bc1/Cyt c-Cokomplexes aus Hefe zeigen, dass direkte Kontakte zwischen Cyt c1 und Cyt c durch unpolare Wechselwirkungen und eine zentrale Kation-p-Interaktion vermittelt werden. Daher wurden anhand von Sequenz- und Struktur-alignments äquivalente Aminosäurepositionen im Paracoccus Cyt c1 identifiziert, die an der Wechselwirkung zu Cyt c552 beteiligt sein könnten. Diese wurden durch gerichtete Mutagenese in ihrem Raumvolumen, ihrer Polarität oder Ladung variiert und in kinetischen Studien untersucht. Für die LF-Kinetiken sowie für die FRET-Experimente wurden Oberflächen-Cysteinmutanten des Cyt c1 bzw. c552 generiert, über deren SH-Gruppen kovalent der Rutheniumkomplex bzw. Fluorophore gekoppelt werden konnten. Die ET-Reaktion zeigt zwei Phasen in Abhängigkeit von der Ionenstärke. Bei niedrigen Ionenstärken ergeben sich Geschwindigkeitskonstanten von 109 M -1s-1 und eine geringe Ionenstärkeabhängigkeit (etwa eine effektive Ladung), wohingegen bei Ionenstärken ab 35 mM 2-3 effektive Ladungen pro Redoxpartner beteiligt sind und bimolekulare Geschwindigkeitskonstanten von 107 bis 109 M-1s-1 erhalten werden. Diese Ergebnisse deuten auf die Bildung eines Encounter-Komplexes bei niedrigen Ionenstärken hin, der ein Ensemble verschiedener Distanzen und relativer Orientierungen der Redoxpartner zueinander darstellt. Diese Annahme wurde ebenfalls durch FRET-Experimente bestätigt, durch die selbst bei niedrigen Ionenstärken keine definierten Abstände erhalten werden konnten. Die Geschwindigkeitskonstanten der bimolekularen Reaktion weisen auf einen diffusionskontrollierten Prozess hin, an dem 2 bis 3 effektive Ladungen an der elektrostatischen Annäherung der beiden Redoxpartner beteiligt sind. Diese Ergebnisse werden durch vorherige kinetische Untersuchungen und EPR-Studien des ET von Cyt c552 zum CuA-Fragment der aa3-Oxidase bekräftigt, für den die gleiche Anzahl effektiver Ladungen und die Bildung eines Encounter-Komplex gefunden wurden. Lediglich c1-Mutanten, deren variierte Aminosäuren sich direkt oberhalb der Hämspalte und in der Sequenz um bzw. innerhalb des Hämbindemotivs befinden, bewirken eine Verlangsamung der Gesamtreaktion und ein leicht verändertes Ionenstärkeverhalten, das auf eine leicht verschobene Interaktionsfläche hindeutet. Es wurde durch Sequenz- und Strukturalignments kein aromatischer Rest in direkter Nähe der entsprechenden Position im Paracoccus Cyt c1 gefunden, der wie im Hefekomplex eine stabilisierende Kation-p-Interaktion zwischen den Redoxpartnern vermittelt. Zur Untersuchung des ET zwischen Komplex III und Komplex IV aus T. thermophilus wurde die hydrophile Cytochrom c-Domäne der caa3-Oxidase in Analogie zum Paracoccus-System als lösliches Redoxfragment kloniert, heterolog exprimiert und charakterisiert. Dieses Fragment wurde in SF-Studien eingesetzt, um den ET zu seinen potentiellen Redoxpartnern Cyt cbc des bc-Komplexes und Cyt c552 zu charakterisieren. Es konnte gezeigt werden, dass das ccaa3-Fragment Elektronen von beiden Redoxpartnern empfängt, wobei die ET-Reaktion mit Cyt c552 so schnell verläuft, dass sie durch SF-Techniken nur schlecht aufgelöst und lediglich eine Größenordnung der Geschwindigkeitskonstanten abgeschätzt werden kann (kon ~ 1010 M-1s-1). Die Reaktion mit Cyt cbc verläuft auch noch schnell (kon = 108-109 M-1s-1) und ist nahezu unabhängig von der Ionenstärke, was eine hydrophobe Wechselwirkung zwischen beiden Redoxpartnern bestätigt. Die Ergebnisse deuten erstmals darauf hin, dass ein ET direkt zwischen zwei Redoxproteinkomplexen (bc-Komplex und caa3-Oxidase) stattfindet, ohne dass ein Elektronenüberträger (wie z. B. Cyt c552) zwischengeschaltet ist. Um die Übertragbarkeit der Erkenntnisse, die hier über den ET an löslichen Redoxfragmenten gewonnen wurden, in einem Proteinkomplex zu verifizieren, wurde ein bc1-Komplex verwendet, in dem die für P. denitrificans einzigartige saure Cyt c1-Domäne deletiert ist. Der Komplex wurde für eine erleichterte Aufreinigung mit einem His-tag versehen, homolog exprimiert und erste Aufreinigungs- und Charakterisierungsschritte unternommen. Er soll zukünftig eingesetzt werden, um die Mutationen des löslichen c1-Fragmentes in den Komplex zu überführen und die Mutanten kinetisch mittels pre-steady state- und steady state-Techniken im Vergleich zum bc1WT-Komplex zu untersuchen, ohne dass die Effekte der Punktmutationen durch die hohe negative Ladungsdichte der sauren Domäne überlagert werden.
Hintergrund: Die häufigsten infektiösen Ursachen für Durchfallerkrankungen sowohl im Kindes- als auch im Erwachsenenalter sind viraler Genese. Dabei werden Rota-, Noro-, Adeno- und Astroviren in absteigender Reihenfolge benannt. Die Diagnose der oft nosokomialen Infektionen erfolgt durch Virusnachweis in Stuhlproben. Material und Methodik: In dieser retrospektiven epidemiologischen Auswertung wurden anhand der Stuhlproben von Gastroenteritispatienten im Zeitraum 2000 – 2008 die Häufigkeitsverteilung der einzelnen Viren sowie saisonale Aspekte untersucht. Bestimmt wurden des Weiteren die Geschlechts- und die Altersverteilung der Patienten. Der überwiegende Anteil der eingesandten Proben entstammte der Universitätsklinik Frankfurt/Main; hinzu kamen Proben von einigen in näherer Umgebung liegenden Gesundheitsämtern, Krankenhäuser und Laborarztpraxen. Ergebnisse: Die laborchemische Effizienz beträgt ca. 10 – 20 %. In Deutschland ist die winterliche Rotavirusinfektion bei Kleinkindern die häufigste Ursache des Brechdurchfalls. An zweiter Stelle stehen im Wechsel Adeno- und Norovirusinfektionen, während Astrovirusinfektionen in den letzten Jahren selten geworden sind. Schlussfolgerung: In Übereinstimmung mit neuen Studien aus anderen Regionen wird belegt, dass Noroviren des Typ 2 heute einen wesentlichen Anteil bei der infektiösen Gastroenteritis stellen und – im Unterschied zu Rotaviren – vor allem ältere Menschen betroffen sind.
Organische Verbindungen sind für den Einsatz in der Elektronik und Optoelektronik von großem Interesse, da ihre Eigenschaften durch Derivatisierung gezielt verändert werden können. Eine vielversprechende Strategie ist hierbei der Einbau von Hauptgruppenelementen (z.B. Boratomen) in die Kohlenstoffgerüste.
Bislang fehlte jedoch ein detaillierter Vergleich der optischen und elektronischen Eigenschaften einer umfassend charakterisierten Kohlenwasserstoffspezies mit denen einer isostrukturellen Bor-dotierten Verbindung. In unserer Gruppe wird 9,10-Dihydro-9,10-diboraanthracen (DBA) als Bor-haltiger Baustein zum Aufbau lumineszierender Polymere genutzt. Das isostrukturelle Kohlenstoffanalogon zum DBA-Fragment stellt hierbei das Anthracen-Gerüst dar. Vor diesem Hintergrund wurden in dieser Arbeit die elektronischen, strukturellen und optischen Eigenschaften des DBA-Derivats 30 und des Anthracen-Derivats 31 umfassend untersucht und miteinander verglichen, wobei signifikante Unterschiede zwischen der Kohlenstoffverbindung 31 und dem Bor-dotierten Analogon 30 beobachtet wurden.
Ziel: Anliegen des Kooperationsprojektes der Klinik für Nephrologie und der Klinik für Psychosomatische Medizin und Psychotherapie ist die internistische und eine umfassende psychologische Untersuchung von152 Lebendnierenspendern, die ihre Niere zwischen 1973 und 2001 in der Universitätsklinik Frankfurt am Main spendeten. Im Rahmen dieser Studie werden aus der oben genannten Arbeitsgruppe heraus, mehrere Arbeiten und Publikationen entstehen. Ziel der vorliegenden Arbeit ist die Untersuchung der 152 Frankfurter Lebendnierenspender in Bezug auf psychosomatische und psychosoziale Aspekte des Erlebens und der Verarbeitung der Lebendnierentransplantation und ihrer Folgen. In der bisherigen empirischen Forschung zu psychischen und psychosomatischen Folgen einer Lebendnierentransplantation wurden beim Spender eher wenige und wenn, dann im Ausmaß begrenzte psychische Komplikationen berichtet. In der Regel sind die psychische Verarbeitung sowie die psycho-sozialen Auswirkungen einer Lebendnierentransplantation insgesamt positiv zu bewerten.
Methode: N= 152 Lebendnierenspender werden internistisch und psychologisch untersucht. Die psychologische Untersuchung verwendet ein breites Spektrum von Erhebungsmethoden. Neben vier standardisierten testpsychologischen Fragebögen wird ein semistrukturiertes ca. einstündiges Interview mit den Spendern geführt. Die vorliegende Arbeit befasst sich gesondert mit dem halbstrukturierten Interview. Die Erlebnisberichte der Spender werden mittels eines eigens erstellten Kategoriensystems ausgewertet.
Ergebnisse: Abschluss der Datenerhebung der vorliegenden Arbeit ist der 15. Februar 2002. Sieben Spender verstarben vor Beginn der Studie, jedoch nicht an den Folgen der Einnierigkeit.Drei Spender waren nicht auffindbar. 19 Spender wurden wegen Wohnsitz im Ausland und/oder Mangel an deutschen Sprachkenntnissen vom psychologischen Interview ausgeschlossen. Von den 123 in Frage kommenden Untersuchungsteilnehmern haben wir mit 100 Spendern Interviews führen können, was einer vergleichsweise hohen Rücklaufquote von 81,3% entspricht. Die meisten Spender trafen ihre Entscheidung sofort (84%) und bereuten ihre Spende im Nachhinein nicht.
Nahezu alle Spender (97%) würden die Entscheidung ihre Niere spenden zu wollen heute wieder treffen. Die meisten Spender bewerten die Spende als ein positives Ereignis vergleichbar mit einer Lebensrettung oder einer Geburt. Einige Spender berichten durch die Spende eine Steigerung ihres Selbstwertgefühls und Selbstbewusstseins erfahren zu haben. 75% der Spender schildern durch die Spende keine Veränderung in der Beziehung zu dem Empfänger erlebt zu haben, bei 23% habe sich die Beziehung verbessert. 3% geben an, die Beziehung zu bestimmten Familienmitgliedern sei nach der Spende schlechter geworden. 3% der Spender bereuen gespendet zu haben. 8% empfanden Druck im Entscheidungsprozess. 5% hatten starke Angst vor der Operation oder dem Leben mit einer Niere. Insgesamt 6% der Spender berichten über langfristige psychische Komplikationen (Verdacht auf: 2% Anpassungsstörung, 2% Angststörung, 1% Depression, 1% Burnout). 11% wünschen sich eine professionelle psychologische Vor- und/oder Nachbetreuung.
Diskussion: Die Ergebnisse der Untersuchung weisen insgesamt auf eine langfristig positive psychische Verarbeitung, sowie auf positive psychosoziale Auswirkungen einer Lebendnierentransplantation hin. Es gibt eine inhomogene Subgruppe mit kleiner Personenanzahl, die negative Erfahrungen mit der Lebendnierenspende machte. Dieser wird gesondert Beachtung geschenkt und die Bereitstellung von adäquaten Beratungs- und Hilfsangeboten diskutiert.
Ibuprofen gehört zu den am meisten verwendeten nichtsteroidalen Antiphlogistika (NSAIDs) und ist in niedriger Dosierung von 200-400 mg als sogenanntes OTC (over the counter) Analgetikum frei erhältlich. Obwohl es in den meisten Fällen als razemische Mischung aus S- und R-Ibuprofen verabreicht wird, ist mittlerweile auch das reine S-Ibuprofen (Dexibuprofen) als Medikament erhältlich. Während S-Ibuprofen ein potenter COX-Inhibitor ist, zeigt R-Ibuprofen in den klinisch relevanten Konzentrationen keine COX-Hemmung. Seit längerem ist bekannt, dass NSAIDs bei einer kontinuierlichen Einnahme über mehrere Jahre die Initiierung und Proliferation von Tumoren hemmen. Die Hemmung der Cyclooxygenase wird dabei als ein wichtiger Mechanismus für die antikarzinogene Wirkung angesehen, doch für viele NSAIDs sind auch schon COX unabhängige Mechanismen beschrieben worden. In der vorliegenden Arbeit wurde unter Verwendung zweier Tumorzelllinien mit unterschiedlicher COX-2 Expression und dem Einsatz von beiden Ibuprofen Enantiomeren untersucht, inwieweit COX unabhängige Mechanismen für die antikarzinogenen Effekte von S- und R-Ibuprofen verantwortlich sind. Sowohl die COX-2 defizienten HCT-15 als auch die COX-2 exprimierenden HCA-7 Zellen wurden durch Behandlung mit S- oder R-Ibuprofen in ihrer Proliferaton gehemmt. Dabei führte die Behandlung mit S- und R-Ibuprofen für 24 h zu einem G1-Zellzyklusblock und nach 72 h zu einem signifikanten Anstieg von apoptotischen Zellen, was im Western-Blot Assay durch eine verminderte Cyclin A und B Expression, einer erhöhten Expression des Zellzyklusinhibitors p27KIP1 und PARP-Spaltung bestätigt wurde. Dabei zeigten beide Enantiomere in den Tumorzellen eine gleich starke antiproliferative und apoptotische Wirkung. Eine Messung der intrazellulären S- und R-Ibuprofen Konzentrationen ergab außerdem, dass in den verwendeten Tumorzellen keine unidirektionale Konfigurationsinversion von R- zu S-Ibuprofen stattgefunden hat. In den COX-2 exprimierenden HCA-7 Zellen waren die antikarzinogenen Effekte von S- und R-Ibuprofen schwächer ausgeprägt als in den HCT-15 Zellen, was jedoch auf eine niedrigere intrazelluläre S- bzw. R-Ibuprofen Konzentration zurückzuführen war. Diese Ergebnisse zeigen auf jeden Fall, dass COX unabhängige Mechanismen bei der antikarzinogenen Wirkung von S- und R- Ibuprofen eine Rolle spielen. Dass auch COX abhängige Mechanismen an der antikarzinogenen Wirkung von Ibuprofen beteiligt sind, konnte in verschiedenen Studien gezeigt werden. In der vorliegenden Arbeit wurde eine Abnahme an PGE2 nach S-Ibuprofen Behandlung in den COX-2 exprimierenden Tumorzellen beobachtet. In welchem Ausmaß aber die COX Hemmung an der antikarzinogenen Wirkung von S-Ibuprofen in den COX-2 exprimierenden (Hemmung der PGE2 Synthese) und möglicherweise auch in den COX-2 defizienten Zellen (Anstieg an Arachidonsäure und daraus resultierend an Ceramid) beteiligt war, konnte anhand der Ergebnisse nicht geklärt werden. Es kann jedoch angenommen werden, dass S-Ibuprofen zumindest in den COX exprimierenden HCA-7 Zellen sowohl über COX Hemmung als auch über COX unabhängige Mechanismen antiproliferativ und apoptotisch wirkt. Auch im Tumormodell der Maus wurde bei einer täglichen i.p. Applikation von 15 mg/kg S- oder R-Ibuprofen eine Hemmung des Tumorwachstums beobachtet. Dabei betrug die unidirektionale Inversion von R- zu S-Ibuprofen ca. 54 %. Die Inkubation mit S- bzw. R-Ibuprofen führte in beiden Zelllinien außerdem zu einer Akkumulation des Tumorsuppressors p53, der an der Regulierung von Zellzyklus und Apoptose beteiligt ist. Daher wurde im zweiten Teil der Arbeit untersucht, ob S- und R-Ibuprofen die Induktion von Apoptose und Zellzyklusarrest über die Aktivierung des Transkriptionsfaktors p53 und dessen Zielgene vermitteln. Verwendet wurde eine HCT-116 Zelllinien, in der beide p53 Allele durch homologe Rekombination inaktiviert waren (p53-/-). Im Gegensatz zu den HCT-116 p53wt Zellen führte die Behandlung mit S- bzw. R-Ibuprofen in den p53 defizienten Zellen zu keinem signifikanten G1-Zellzyklusblock und auch die Apoptoserate war in diesen Zellen deutlich geringer als in p53wt Zellen. In vivo zeigte eine tägliche i.p. Injektion von 15 mg/kg S- bzw. R-Ibuprofen bei den Mäusen mit p53-/- Tumoren keine signifikante Wachstumshemmung. Im Vergleich dazu wurde die Proliferation der HCT-116 p53wt Tumore durch die R-Ibuprofen Behandlung signifikant gehemmt, und auch die mit S-Ibuprofen behandelten Tieren zeigten deutlich kleinere Tumore als die Gruppe mit den p53 defizienten Tumoren. Nach der Inkubation mit S- bzw. R-Ibuprofen wurde in beiden HCT-116 Zelllinien eine erhöhte Expression des Membranrezeptors p75NTR beobachtet. Außerdem führte die Behandlung mit S- bzw. R-Ibuprofen in den p53wt Zellen, im Gegensatz zu den p53 defizienten Zellen, zu einer vermehrten Bax Expression und einem Anstieg an Bax Protein in der mitochondrialen Fraktion. Schließlich wurde gezeigt, dass die erhöhte p53 Konzentration in den Zellen zumindest teilweise über den p75NTR Rezeptor reguliert wird, da durch die externe Zugabe des Liganden NGF die Ibuprofen induzierte Akkumulation von p53 in den HCT-116 p53wt Zellen wieder aufgehoben wurde. Da in vitro in den HCA-7 Zellen nicht nur die Behandlung mit S-Ibuprofen, sondern auch die mit R-Ibuprofen zu einer Hemmung der PGE2 Synthese führte, wurde im dritten Teil der Arbeit die Wirkung von S- und R-Ibuprofen auf die Expression der PGE-Synthasen und auf die mPGES-1 Aktivität untersucht. Dabei wurden HeLa Zellen verwendet, deren mPGES-1 Expression durch die Zugabe von IL-1ß und TNF-alpha stimmuliert wurde. Nach gleichzeitiger Inkubation mit S- bzw. R-Ibuprofen wurde keine Inhibierung der mPGES-1, mPGES-2 oder cPGES Expression beobachtet. Auch die Enzymaktivität von mPGES-1 wurde weder durch die Inkubation mit S-Ibuprofen noch mit R-Ibuprofen beeinflußt. Die bei der Inkubation mit R-Ibuprofen auftretende Hemmung der PGE2 Synthese konnte in der vorliegenden Arbeit nicht abschließend erklärt werden und bietet somit einen interessanten Ansatzpunkt für weitere Untersuchungen.
Autoimmune Endokrinopathien entstehen durch die Aktivierung pathogener TLymphozyten, welche in de Lage sind, bestimmte Ziel-Zellen mittels Zytokinen oder anderer Mechanismen zu zerstören. Typ I Diabetes mellitus ist ein durch Insulinmangel bedingter Defekt der Glukoseverwertung, der durch eine autoimmune Zerstörung der pankreatischen Beta-Zellen verursacht wird. Als häufigste chronische Erkrankung Jugendlicher und junger Erwachsener in den Industrienationen stellt sie durch ihre stetig steigende Inzidenz, ihr immer früheres Erkrankungsalter und nicht zuletzt die steigende allgemeine Lebenserwartung eine bedeutende medizinische und ökonomische Herausforderung dar. Die zunehmende Aufklärung der mannigfaltigen Wechselbeziehungen des Immunsystems und der starke Einfluss des Vitamin D auf die Entwicklung und Funktion des Immunsystems führten zu der Überlegung, dass auch der Vitamin D Rezeptor (VDR) in Verbindung mit seinem biologisch aktivsten Liganden 1,25 (OH)2D3 einen Einfluss auf die Entwicklung einer Autoimmunendokrinopathie haben könnte. In Tierexperimenten konnte gezeigt werden, dass 1,25 (OH)2D3 und auch seine Analoga die Produktion des Interleukins IL-12 hemmen, welches eine wichtige Rolle in der Entwicklung der Th1-Helferzellen ausübt, gleichzeitig wird die Produktion des Interleukins IL-10 stimuliert, welches die Entwicklung von Th1-Helferzellen blockiert. Dieser Zelltyp ist bei der Entwicklung eines Typ 1 Diabetes mellitus ursächlich beteiligt. 1,25 (OH)2D3 kann auch die Entwicklung der Th2 Helferzellen inhibieren, welche in der Pathogenese einer Hashimoto Thyreoiditis involviert sind. In betroffenen Geweben, in denen pathogen-wirksame Th1-Zellen die Bildung zytotoxischer T-Zellen und aktivierter Makrophagen bewirken, kann 1,25 (OH)2D3 und seine Analoga die Anzahl der Th1-Zellen herunterregeln. Des weiteren regt Vitamin D die Bildung von CD4+CD25+-regulatorischen T-Zellen und Th2-Zellen an, die ihrerseits wiederum hemmend auf Th1-Zellen wirken. Bisher haben bereits diverse Studien bestätigt, das funktionelle Auswirkungen verschiedener Einzelnukleotid-Polymorphismen in kodierenden und nicht kodierenden Regionen des VDR- Gens in kausalem Zusammenhang mit dem Auftreten eines Typ 1 Diabetes Mellitus stehen. In dieser Arbeit zeigten sich erniedrigte 1,25 (OH)2D3 Spiegel in deutschen Patienten mit Typ 1 Diabetes Mellitus. Eine vergleichbare Studie wurde in der finnischen Bevölkerung durchgeführt und bestätigt unsere Resultate. Dies spiegelt die zentrale Rolle des Vitamin D bei der Entwicklung eines Typ 1 Diabetes Mellitus wieder. Um den kausalen Zusammenhang zwischen molekularen und funktionellen Beziehungen des Vitamin D Rezeptors näher zu definieren, liegt die Frage nahe, inwiefern eine Korrelation der schon bekannten VDR- Polymorphismen und neu etablierten mit Vitamin D Spiegeln in Patienten und Kontrollen besteht, weiterhin, ob auf der Ebene der Genexpression schon ein signifikanter Unterschied bei Patienten mit Typ 1 Diabetes Mellitus zu beschreiben ist. Zusätzlich wurden sieben neue VDR- Polymorphismen in Familien, mit jeweils einem an Typ 1 Diabetes Mellitus erkrankten Kind, untersucht. Bestimmte Transmissionsmuster wurden bereits für die VDR- Polymorphismen ApaI, BsmI, FokI und TaqI bei Typ 1 Diabetes Mellitus beschrieben und eine signifikante Korrelation hergestellt. In dieser Doktorarbeit zeichnet sich eine grenzwertig signifikante Korrelation zwischen dem VDR- Polymorphismus 2238135 und Typ 1 Diabetes Mellitus ab. Das Allel „C“ wurde häufiger auf die erkrankten Kinder transmittiert. Dieses Ergebnis ließ sich ebenfalls in der Gegenüberstellung von Patienten zu Kontrollen nachweisen, in der Allelfrequenzanalyse stellte sich das Allel „C“ ebenfalls als dominant heraus. Für die anderen sechs untersuchten VDR- Polymorphismen konnte keine signifikante Korrelation zu Typ 1 Diabetes Mellitus in der deutschen Population nachgewiesen werden. Jedoch konnten bei vier der sieben VDR- Polymorphismen signifikante Haplotypen beschrieben werden, die den Zusammenhang zu Typ 1 Diabetes Mellitus erneut bestätigen. Dies zeigt, wie die alleinige Analyse eines VDR- Polymorphismus scheinbar keine Assoziation zum Typ 1 Diabetes Mellitus zu haben scheint, aber durch die Bildung von Allelkombinationen sich signifikante Korrelationen für die gleichen Polymorphismen ausbilden können. Die gemeinsame Analyse verleiht den untersuchten VDR-Polymorphismen erst die Signifikanz. Das Gleichgewicht war jedoch deutlich zugunsten der signifikant seltener transmittierten und damit protektiven Haplotypen verschoben. Nur „GCTG“ wurde häufiger transmittiert (62,7% vs. 37,3%, p= 0,0087), während die folgenden 3 Haplotypen „TCTG“, „TCGG“ und „GCGG“ seltener transmittiert wurden und sich als signifikant herausstellten. „TCGG“ stellte sich als grenzwertig signifikanter Haplotyp heraus, während „GCGG“ als signifikante Allelkombination anzusehen ist. Am stärksten jedoch zeigte sich der diabetogen- protekive Effekt beim Screening des „TCTG“ Haplotypen, der fast gar nicht an die erkrankten Nachkommen transmittiert wurde (99,1% vs. 0,9%, p= 0,0006). In der vorliegenden Doktorarbeit bestätigt sich einerseits die molekulare Korrelation zwischen bestimmten Polymorphismen des VDR- Gens und dem Auftreten eines Typ 1 Diabetes Mellitus. Andererseits konnten vier neue Haplotypen bestimmt werden, die im Rahmen des durchgeführten Screenings in der deutschen Bevölkerung das Risiko für die Entstehung eines Diabetes als schützende oder prädisponierende Faktoren mitbestimmen. 1,25(OH)2D3, der stärkste immunregulatorische Vitamin D Metabolit, stellt für die medikamentöse Prävention und Therapie der autoimmunen Erkrankungen auch weiterhin ein interessantes Ziel dar, unter Umständen auch über die Beeinflussung seiner Stoffwechselwege, deren molekulare Korrelation hier weiterführend geklärt wurde.
The documentation of life on Earth, that is, the inventorization of nature and the naming and classification of organisms found therein, is a major task for biologists today and a fundamental precondition for nature conservation efforts. This study aimed at contributing to the inventory of amphibians and reptiles in selected, previously understudied ecoregions of Bolivia. I strove to document diversity patterns and seek possible ecological and historical reasons for these patterns. Special attention was paid to the Chiquitano Region situated in the eastern lowlands of Bolivia in a climatic transition zone between the humid evergreen Amazon Forests and the deciduous thorn-scrub vegetation of the Gran Chaco. In congruence with its location in the transition zone, the Chiquitano Region displays a mosaic of habitats: The vegetation is dominated by the endemic Chiquitano Dry Forest, which is probably the largest extant patch of Seasonal Dry Tropical Forest, with enclaves of savanna, the western outliers of the Cerrado biome of central Brazil. Taxonomic revisions: The taxonomic data in this study are used as a tool to measure biodiversity, to assess biogeographic relationships, and to evaluate conservation needs. Since all is predicated on the taxonomic decisions made, an adequate taxonomy is essential, and taxonomy can be regarded as the foundation of this study. The methodology encompassed a variety of herpetological field techniques, such as different survey methods, preparation and documentation of voucher specimens, recording of frog calls, and herpetological laboratory techniques, such as morphology, molecular procedures with mtDNA, phylogenetic analyses, and bioacoustic analysis and descriptions of frog calls. A total of 1251 specimens belonging to 200 species were obtained during this study, including 87 amphibian and 123 reptile species. This constitutes about 36% of the herpetofauna currently known for Bolivia, about 34% of the amphibians currently known for Bolivia and about 40% of the reptiles, respectively. In the course of this study, a new species of frog was described from the study site Caparu in the eastern lowlands of Bolivia; this species, Hydrolaetare caparu Jansen, Gonzales & G. Köhler 2007, differs from the other two congeners in external morphology (e.g., lateral fringes and relative length of fingers, size of palmar tubercle, webbing of toes, and colouration) and advertisement call. Two new colubrid snake species were also described from the study site San Sebastián. Thus far, both are known only from the Chiquitano Region, Provincia Ñuflo de Chávez. Phalotris sansebastiani Jansen & G. Köhler 2008 differs from all the other species in the genus in having a triangular projection of the red snout colouration reaching onto the parietals. Xenopholis werdingorum Jansen, Gonzales & G. Köhler 2009 can be identified as a member of the genus Xenopholis by its vertebral morphology. It differs from the other two species of Xenopholis in having a unique uniform dorsal colour pattern, and from X. scalaris in having two prefrontals and a narrow septum within the neural spine and perpendicular to its long axis as evident in the x-ray images. A review of a small collection of pitvipers from different lowland localities and from the Inter-Andean dry valleys of the region of Pampagrande revealed one new species of Bothrops and one of Bothrocophias (both to be formally described elsewhere). The two pitviper species differ morphologically and genetically from their congeners. The results of a brief review of a small collection of frogs of the genus Scinax (Anura: Hylidae) from different localities in the lowlands, together with analyses of their bioacoustics, suggest an unknown cryptic diversity in Bolivian species of Scinax cf. fuscomarginatus and allies. However, further studies are necessary to clarify the taxonomic status of these populations. In addition, this study provides new data on the morphology (e.g., pholidosis) of snakes, many of them previously known only from few museum specimens. Keys to the Bolivian lizard species of Cercosaura and the Bolivian snake species of Chironius, Clelia, Liophis, Lystrophis, Phalotris, and Xenodon are presented here for the first time. New information on distribution includes many range extensions of amphibian and reptile species, such as five new country records (one frog species, four snake species) and six new departmental records (two frog species, four snake species). Observations on ecology and natural history: Several observations on ecology and natural history were made during field work. Visual signaling, an aspect of territorial behavior that was already known for several species of the genus Phyllomedusa, could be described for the first time for Phyllomedusa boliviana (Jansen & J. Köhler 2007). Furthermore, during audio surveys of an anuran community at the study site San Sebastián from 2005 to 2007, a decline of certain amphibian populations was observed in the rainy season 2006/2007 (Jansen et al., in press). This is possibly related to an extreme drought in the dry season of 2006 where 158 consecutive days without rainfall were recorded. In addition, a new method for measuring intensity of anuran choruses by means of a continuous sound pressure metre was developed (Jansen 2009). The method was suitable to detect calling phenology (during one night), as well as differences in calling activity (between two nights). Biodiversity and biogeographical relationships: Species lists were compiled at the six study sites Pampagrande, Los Volcanes, San Sebastián, Caparú, El Espinal und El Corbalan. The total amphibian and reptile species numbers observed ranged from 37 to 101 with the highest species numbers in San Sebastián (101) and Caparú (89) and the lowest in Los Volcanes (37) and El Espinal (41). A preliminary species list of the herpetofauna of the Chiquitano Region was presented, including 60 amphibian and 84 reptile species. The majority of the amphibians of the Chiquitano Region are classified predominantly as inhabitants of open formations (41 species, 68.3%). Interestingly, even the majority of species recorded from the Chiquitano Dry Forest (32 species) are usually associated with open formations (22 species, 66.7%), followed by the number of species associated with open and forest formations (8 species, 24.4%). Only two of the observed species (6.0%) are predominant forest dwellers. The amphibian assemblage of the Chiquitano Region is most similar in composition to that of the Cerrado biome: 46 species (76.7%) occur in the Cerrado as well, and three species are regarded as Cerrado endemics (5.0%). The Chiquitano Region shares considerably fewer amphibian species with the other biomes (Amazon: 22 species, 36.7%; Gran Chaco: 13 species, 21.7%; Caatinga: 16 species, 26.7%). The reptile assemblage also has significant affinities to the Cerrado, which can be seen in the high proportion of reptile species distributed in that biome (68 species; 81.0%). Affinities to the other biomes are as follows: Amazon (48 species, 57.1%), Chaco (37 species, 40.1%), and Caatinga (30 species, 35.7%). When arranged in mutually exclusive biome categories, reptiles and amphibians showed similar patterns so that the majority of both amphibians and reptiles of the Chiquitano Region can be regarded as widespread. The high proportion of reptile species probably endemic to this region (5 species, 6.0%) is remarkable (i.e. Tropidurus xanthochilus, Apostolepis phillipsi, Phalotris sansebastiani, Xenopholis werdingorum, and Micrurus diana). In an analysis of the biodiversity patterns and biogeographical relationships of the herpetofauna of the study sites, these sites were compared with literature data from 37 localities and included in a presence/absence matrix with a total of 657 amphibian and reptile species in the surrounding South American biomes Amazon, Cerrado and Gran Chaco. The biogeographic relationships between these sites were evaluated using the Coefficient of Biogeographic Resemblance (CBR), cluster analysis, and multidimensional scaling (MDS) of sites. The analyses were first conducted on amphibians and reptiles combined, and than group-specific each for amphibians, reptiles, lizards, and snakes, separately. A “bias-reduced analysis” was developed for a better understanding of the affinities of the amphibians. In this analysis, e.g., the distinct habitat types of the Chiquitano Region, the Chiquitano Dry Forest and the Cerrado were taken into account. Analyses of the biodiversity patterns revealed that the sites in the Amazon comprise highest species numbers, as expected, followed successively by the sites in the Cerrado biome and sites in-between the two biomes. Within the eastern lowlands of Bolivia, the Chiquitano Region is the most rich in species. Comparing it with the other South American sites, the Chiquitano Region has a surprisingly high alpha diversity, especially in amphibians. The microgeographic variation in species composition (beta diversity) in the Chiquitano Region is also remarkably high and obviously related to the mosaic character of the vegetation and habitats. However, the bias-reduced analysis revealed that the amphibian fauna of the open areas and savannas at Hacienda San Sebastián (with 36 species in the Cerrado and pastureland) was one of the most species-rich savanna sites known for amphibians in South America. Considering that the Hacienda San Sebastián site is only ca. 3300 ha (= 1.29 amphibian species per km2), this outcome is particularly suprising. The results of the analyses of the biogeographical relationships suggest that the herpetofauna of Bolivia’s lowlands, including the Beni, the Pantanal and the Chiquitano Region, is as distinct from the herpetofauna of the Gran Chaco, Amazon, and Cerrado as these biomes are from each other. The Chiquitano herpetofauna in particular represents a unique and well-defined herpetofaunal assemblage when compared to all surrounding localities and biomes. This is supported by high CBR-values, findings from the cluster analysis, as well as a clear separation of the Chiquitano sites in the MDS. Biogeographic relations exist in all the surrounding biomes, but are strongest to Cerrado, followed by the Amazon. This study strongly suggests that the Chiquitano herpetofauna is composite and has multiple affinities. This is congruent with a well-defined Chiquitano flora, avifauna and mammalian fauna, suggesting a similar history. The bias-reduced analysis revealed a more detailed picture of the biogeographic relations of the Chiquitano Region, especially the Chiquitano Dry Forest. I argue here that the Chiquitano Dry Forest herpetofauna is a “young”, and “former savanna herpetofauna”. Whereas the Chiquitano Dry Forest is rather poor in amphibian and reptile species, and endemics are lacking from this forest type, the isolated Cerrado enclaves are especially diverse in species and probably contain locally endemic species, such as Phalotris sansebastiani and Xenopholis werdingorum. The colonization of the young Chiquitano Dry Forest may have taken place from savannas by mainly open area species, and only briefly through the Amazon. The results emphasise the importance of bias-reduction in studies of biogeography, e.g., by using group-specific analyses or by taking into account criterias as area size and heterogeneity of compared sites. The different biogeographic patterns of reptiles and amphibians of the Andean valleys indicate a different history of these two groups. In regard to reptiles, dispersals and withdrawals into the valleys in warm humid and dry cool periods in the Pleistocene seem likely, supported by a relation between the valleys and the dry lowland (e.g., Chaco). However, it is more plausible that, during these climatic fluctuations, amphibians migrated to adjacent, more humid regions, such as Yungas. The study verified the known patterns of sister-species pairs in the Inter-Andean Dry Forest and the lowlands. Additionally, pairs of populations with slight differences in morphology were found in the valleys and in the lowlands (Cercosaura parkeri and Xenodon rhapdocephalus). Further studies must test the taxonomic status of these populations. The discovery of new species of Bothrops and Bothrocophias from the Andean valleys has several implications, and possible reasons for the high endemism in the dry valleys are discussed. Conservation and outlook: The high local alpha and beta diversity of the Chiquitano herpetofauna shows that this is a region of complex faunal interaction, which reflects the present heterogeneity of the region, but which is possibly also related to a complex geological and environmental history. The Chiquitano Region can be assessed as a region of distinct regional herpetofaunal diversity charaterised by small scale diversity patterns. It therefore merits recognition as a unique ecoregion, and conservation effort should be increased. Further research is necessary to solve the taxonomic problems addressed in this study. Moreover, future work should be directed towards the development and institution of longterm monitoring programs to evaluate the effects of climate change and changes in land-use on biodiversity, especially that of the Chiquitano Region.
Hintergrund: Epoxyeicosatriensäuren (Epoxyeicotrienoic acids, EETs) sind antihypertensiv, anti-inflammatorisch, anti-proliferativ und pro-fibrinolytisch wirksam. Die lösliche Epoxid-Hydrolase (soluble epoxid hydrolase, sEH) wandelt EETs in ihre korrespondierenden, weniger aktiven Diole (DHETEs) um. Das legt die Vermutung nahe, dass eine Steigerung der EET-Spiegel durch sEH-Inhibition eine Strategie zur Verhinderung von Endorganschäden sein kann. Wir untersuchten den Effekt der sEH-Inhibition im Modell der chronischen Niereninsuffizienz bei der Maus. Methoden: Es wurde eine 5/6 Nephrektomie (5/6 Nx) an männlichen SV129 Mäusen durchgeführt um eine chronisch progressive Niereninsuffizienz zu induzieren. Postoperativ wurden die Tiere in Gruppen randomisiert und mit Placebo (Leitungswasser), einem ACE-Hemmer (Ramipril, 40 mg/kgKG/d), dem sEH-Inhibitor 1471 (15 mg/kgKG/d) und dem CYP-Inhibitor Fenbendazol (15 mg/kgKG/) für 8 Wochen behandelt. Ergebnisse: Verglichen mit den sham-operierten Mäusen induzierte die 5/6 Nx einen arteriellen Hypertonus, eine Proteinurie, Glomerulosklerose und eine erhöhte Sterblichkeit. Wie erwartet führte die Gabe von Ramipril zu einer Blutdrucksenkung, einer verminderten Albuminurie und einer verbesserten Überlebensrate. Fenbendazol senkte die Plasma- Konzentration von einigen EETs, hatte aber keinen Einfluss auf die Progression der Niereninsuffizienz. Überraschenderweise kam es unter sEH-Inhibitor-Therapie zu keiner Blutdrucksenkung in diesem Modell. Im Gegenteil, die Proteinurie war sogar noch verstärkt bei den 5/6 Nx-Tieren unter 1471-Therapie verglichen mit der Placebo-Gruppe. Die Plasma-EET-Spiegel waren >2 mal höher in den 5/6 Nx-Mäusen als in der korrespondierenden sham-Gruppe. Die renale sEH-Expression war in den 5/6 Nx-Mäusen vermindert, eine medikamentöse sEH-Inhibition steigerte die EET-Spiegel in diesen Tieren noch weiter. Bemerkenswert war, dass, ausschließlich in den 5/6 Nx-Gruppen, eine sEH-Inhibition und eine CYP-Inhibition zu einer gesteigerten Konzentration von 5-Hydroxyeicosatriensäure (5-HETE), 12-HETE und 15-HETE führte, welche Lipid Peroxidations- und Lipoxygenase-Produkte sind. Fazit: Im Modell der 5/6 Nephrektomie bei der Maus führt die Hemmung der sEH zu keiner Blutdrucksenkung, sondern zu einer Verschlechterung der Proteinurie. Ursächlich hierfür sind vermutlich die durch die Niereninsuffizienz hervorgerufe Akkumulation von EETs sowie eine Verschiebung des Arachidonsäure-Metabolismus hin zu Lipoxgenase-Produkten mit nierenschädigender Wirkung.
Der Gegenstand der vorliegenden Arbeit ist eine theoretische und empirische Analyse der Wachstumseffekte der arbeitsorganisatorischen Veränderungen in den Unternehmen, die seit Mitte der achtziger Jahre weltweit beobachtbar sind.
Die Vorteile von konuskronengestütztem Zahnersatz für den Patienten sind bekannt: Hoher Trage- und Kaukomfort, bequeme Handhabung, einfache Mundhygiene, Selbstreinigungseffekt durch den Speichel, sekundäre Verblockung durch die Suprakonstruktion, axiale Belastung der Pfeilerzähne, Kombinationsfähigkeit von Implantaten mit natürlichen Pfeilern und prospektive Erweiterungsfähigkeit. Bisher jedoch verhinderten die aufwändige Herstellung und die Problematik der Passungspräzision eine breite Anwendung dieser Art von Zahnersatz. Insbesondere für eine günstige Langzeitprognose von Implantaten wird absolute Spannungsfreiheit der Suprastruktur gefordert. In vielen Ländern z. B. auch in den USA, in denen die entsprechende zahntechnische Infrastruktur fehlt, können doppelkronengestützte Prothesen nicht hergestellt werden. Mit der Methode der definitiven intraoralen Fügung von Gerüstkomponenten können diese Anforderungen an die Passungspräzision problemlos erfüllt werden. Gleichzeitig wird die zahntechnische Fertigung vereinfacht und damit Zeitaufwand und Kosten geringer. Durch diese vereinfachte Herstellung und die Kostenreduzierung wird doppelkronengestützter Zahnersatz für eine größere Patientenklientel verfügbar. Ziel der Studie war, das neuartige Behandlungsvorgehen methodisch zu optimieren und die Verweildauer und die klinischen Auswirkungen von intraoral gefügtem doppelkronenverankerten Zahnersatz zu evaluieren. Im Zeitraum von 1992 bis 1998 wurden 61 Patienten mit 64 Prothesen, deren Gerüste an insgesamt 238 Fügestellen definitiv intraoral geklebt wurden, versorgt. Nach der Fertigstellung wurden die Daten des Zahnersatzes (Anzahl, Art und Verteilung der Pfeiler, Werkstoffkombination, Design und Vorbehandlung der Fügestellen und Zeitpunkt der Klebung) dokumentiert. 51 dieser Patienten mit 53 Prothesen und insgesamt 209 Fügestellen konnten halbjährlich kontrolliert werden. Die Nachuntersuchung umfasste eine klinische Untersuchung, eine lichtmikroskopische Kontrolle und eine Evaluation der Patientenmeinung mittels Fragebogen. Eine Klebestelle versagte bereits nach 14 Monaten unter Risiko: Der Klebespalt war aufgrund mangelnder Kongruenz von Patrize und Matrize zu breit, was die Stabilität der Klebung massiv reduzierte. Alle anderen Prothesen wiesen nach durchschnittlich 38,93 Monaten (Min = 18, Max = 85 Monate) eine spannungs- und schaukelfreie Passung auf. Die Klebestellen zeigten auch bei lichtmikroskopischer Untersuchung keine Läsionen, die auf ein Nachlassen der Klebung hindeuten. Freiliegendes Klebekomposit an einer Prothese musste wegen Auswaschungen nachgefüllt werden. Die REM-Aufnahmen einer im Mundmilieu durchgeführten Klebung zeigen den innigen Verbund des Klebekomposits mit den metallischen Prothesenkomponenten. 90 % der befragten Patienten gaben einen schaukelfreien Sitz ihrer Prothese an, lediglich 4 % beklagten Probleme beim Herausnehmen der Prothese. Mit "gut" bzw. "sehr gut" bezeichneten 84 % der Patienten den Tragekomfort der Prothese; 90 % der Patienten bezeichneten den Halt ihrer Prothese mit "zufrieden" bis "sehr gut". Die intraorale Fügung ist eine robuste, fehlertolerante Methode, die eine hochpräzise Passung gewährleistet. Obwohl keine Ausschlusskriterien zur Auswahl der Patienten bestanden, wurde eine außerordentlich hohe Zuverlässigkeit der Methode von 99,58 % erreicht. Aufgrund der starren Lagerung des Zahnersatzes können die kinetikbedingten Folgen wie z. B. Zahnlockerungen, Unterfütterungen, Bruchreparaturen und Schraubenlockerungen bei Implantaten auf ein Minimum reduziert werden. Durch die intraorale Fügung wird eine Prophylaxe oraler Strukturen erreicht, und die Folgebehandlungen und damit auch –kosten reduziert. Zudem erhält der Patient einen Zahnersatz, der einerseits sehr hohen Trageund Kaukomfort bietet und andererseits eine einfache Mundhygiene gewährleistet. Durch die klinische Bewährung können alle Nachteile einer Lötung, insbesondere die Gefahr der Allergisierung durch Korrosionsprodukte, umgangen werden. Zusammen mit der Silikatisierung/Silanisierung mittels dem Rocatec®-Verfahren haben sich die Reparatur-Möglichkeiten von verblendetem Zahnersatz erweitert, da keine Wärmebehandlung mehr notwendig ist. Das intraorale Fügeverfahren bildet die Grundlage für zukunftsweisende Entwicklungen: Mit präfabrizierten Implantatabutments kann die laborseitige Herstellung von Primärkronen und Matrizen ersetzt und damit der Zahnersatz kostengünstiger hergestellt werden. Das metallische Prothesengerüst kann unter erhöhtem Platzbedarf durch Glasfaserverbund-Werkstoff ersetzt werden, was die Herstellung von nahezu metallfreiem doppelkronengestütztem Zahnersatz für entsprechend sensibilisierte Patienten ermöglicht.
The mammary gland is a perfect system to study the pathways regulating organogenesis during development of an individual. The proper development of the mammary gland requires a tight coordination of expression of many genes involved in proliferation and differentiation. The aim of this work was to identify novel genes and pathways involved in the development of the mammary gland and to find possible correlations between the signaling pathways and their downstream targets that are activated during proliferation and functional differentiation of mammary epithelial cells. In this study rapamycin has been used to inhibit the mTOR protein to analyze its role during mammary gland development. Further a genomic approach was used to identify genes differently expressed during this process. The analysis of the effects caused by the inhibition of the mTOR signaling pathway by using rapamycin on mammary epithelial cells for the first time demonstrate that mTOR plays central role in the coordination of pathways governing the proliferation and differentiation of epithelial cells during mammary gland development. More detailed analysis led to the identification of Id1 and Id2 as two major downstream effectors of the mTOR signaling pathway regulating proliferation and differentiation respectively. The genomics analysis revealed several interesting genes involved in the regulation of a proliferative or secretory phenotype of normal epithelial cells in vitro. Various genes identified by microarray analysis are of high interest and to determine their role in mammary gland development. Among the identified genes some contribute to process of proliferation like Nol5 and Kpna2, whereas other genes are required for proper functional differentiation such as Nkd2 and Cited4. Importantly, the mentioned candidate genes are also interesting regarding cancer development, since deregulation of their expression might contribute to tumor formation. The findings described in this work clearly contribute to our better understanding of the mTOR signaling pathway regulating expression of the genes involved in the development of mammary gland. In addition, the presented results should allow broadening our view of the events that contribute to breast cancer development and help to design better anticancer therapies in the future.
Mit der COLTRIMS-Technik können immer kompliziertere Reaktionen untersucht werden, dabei steigt aber die Zahl der zu detektierenden Reaktionsfragmente. Der Nachweis von Ionen ist üblicherweise gut möglich, da die entsprechenden Flugzeiten groß sind im Vergleich zur Totzeit der benutzten Detektoren. Elektronen hingegen sind sehr leicht und erreichen den Detektor innerhalb von wenigen 10 ns. Aktuelle Detektoren erlauben aber nur den Nachweis weniger Elektronen und es werden somit neue Detektoren benötigt, um alle Teilchen nachzuweisen. Ziel dieser Arbeit war es also, einen Detektor zu entwickeln, der dies erreicht.
Zu Beginn dieser Monografie wird die COLTRIMS-Technik vorgestellt. Die Experimente mit dieser Messmethode finden hauptsächlich mit einer Laufzeitanode statt. Diese stößt aber bei dem Nachweis von mehreren Teilchen an ihre Grenzen und manche Experimente können nur unvollständig analysiert werden.
Damit ein neuer Detektor entwickelt werden kann, muss erst verstanden werden, wie die zu detektierenden Teilchen/Signale entstehen und wie ihre Eigenschaften sind. Aus diesem Grund wird das Sekundärteilchen-erzeugende MCP ausführlich vorgestellt.
Weiterhin gibt diese Arbeit einen umfassenden Überblick über bereits realisierte Anoden. Verschiedene Repräsentanten der fünf Anodenarten (Flächen-, Streifen-/Pixel-, Laufzeit-, Kamera-, sowie Halbleiter-Anode) werden vorgestellt und bewertet.
Mit diesem Wissen konnten drei Ansätze für neue Anoden entwickelt, designt, produziert, getestet und bewertet werden. Alle neu entwickelten Anoden benutzen Leiterplatinen als Basis und werden in derselben Vakuumkammer getestet. Auch wenn die Detektionsprinzipien der drei getesteten Detektoren unterschiedlich sind, so verläuft die Auskopplung, Verarbeitung und Digitalisierung der Signale nach dem gleichen Schema. Außerdem wurden im Rahmen dieser Arbeit diverse Algorithmen entwickelt und programmiert, mit deren Hilfe die Signalauswertung und Positionsbestimmung erfolgt.
Das dritte Kapitel beschreibt die neu entwickelte Draht-Harfen-Anode. Dieser Detektor besteht aus vielen kurzen Drähten die parallel auf Rahmen aus Leiterplatinen gespannt werden. Aus dieser Anode ließ sich im Rahmen dieser Arbeit aber kein funktionsfähiger Detektor entwickeln und es wird empfohlen, diesen Ansatz nicht weiterzuverfolgen.
Im Kapitel über die Pixel-Anode mit Streifenauslese wird ein Ansatz vorgestellt, bei dem die Elektronenwolke von einem Muster aus leitenden Rauten absorbiert wird. Es wurde ein funktionsfähiger Detektor mit MAMA-Verschaltung realisiert. Die aktive Fläche ist mit einem Durchmesser von 50 mm aber zu klein. Eine große Variante der Anode ist in der realisierten Form aber nicht als Detektor geeignet.
Als dritter neuer Detektor wird die Streifen-Laufzeit-Anode beschrieben. Diese besteht aus einem rechteckigen Muster von Pixeln, die in einer Richtung über eine Zeitverzögerung ausgelesen werden. Dieser Ansatz ist sehr vielversprechend und es ließen sich nicht nur einzelne Teilchen nachweisen, sondern auch beim Aufbruch eines D2+-Moleküls konnten beide Fragmente gemessen werden.
Das letzte Kapitel befasst sich mit weiteren Konzepten, die als Detektor realisiert werden könnten.
In dieser Arbeit wurde das Protein OR1 ausführlich charakterisiert und die Grundlage für weitere Studien an diesem Protein gelegt. Die Zielsetzung dieser Arbeit bestand primär in der biophysikalischen Analyse eines eukaryotischen Proteorhodopsins, da bislang keine Daten zu diesen vorlagen. Dieser Ansatz ist vergleichbar mit der Studie am BR ähnlichen Rhodopsin aus dem Pilz Leptosphaeria maculans (Waschuk et al. 2005). Auch wenn man aus den Eigenschaften von OR1 keine Signatur für eukaryotische PRs herausfiltern kann, so weist OR1 eine Reihe von Charakteristika auf, die es wert sind weiterbearbeitet zu werden. Zu den hervorzuhebenden Ergebnissen dieser Arbeit zählen:
(1) OR1 zeigte in der methylotrophen Hefe Pichia pastoris ein hohes Expressionsniveau weit über der gewohnten Ausbeute bei Membranproteinen.
(2) OR1 offenbarte sich als Proteorhodopsin mit BR ähnlichen Eigenschaften wie dem niedrigen pKs-Wert des Protonenakzeptors und damit guten Protonenpumpeigenschaften über einen großen pH-Bereich. Auch bindet OR1 keinen zweiten Chromophor, was die nahen Verwandten GR und XR hingegen tun.
(3) OR1 demonstriert, dass die Konfiguration des komplexen Gegenions von Proteorhodopsinen stark variiert und sich anscheinend flexibel den physiologischen Erfordernissen des jeweiligen Organismus anpasst. In diesem Zusammenhang spielt auch das konservierte Histidin eine Rolle, da es den primären Protonenakzeptor beeinflusst. Bei OR1 stellte sich heraus, dass das Histidin den pKs Wert der D100 Position nicht signifikant beeinflusst.
(4) OR1 wurde mit 13C und 15N Atomen erfolgreich markiert und das entwickelte Protokoll für die Rekonstitution bewährte sich. Die Proteoliposomen des Wildtyps gaben sehr gut aufgelöste Festkörper-NMR Spektren. In Zukunft sind somit ausführliche NMR Studien an OR1 möglich.
Einflüsse epigenetischer Mechanismen auf die Gefäßtonusregulation sind bisher kaum untersucht. Ziel der vorliegenden Arbeit war es, die Bedeutung bekannter epigenetischer Modifikatoren in der Gefäßtonuskontrolle aufzuzeigen und molekulare Mechanismen zu identifizieren. Hierzu wurden Vasoreaktivitätsstudien an Mausgefäßen im Organbad durchgeführt und molekularbiologische Methoden eingesetzt. Verwendet wurde ein Mausstamm mit induzierbarem Knockout der Histondemethylase JARID1B (KDM5B) sowie verschiedene Inhibitoren von Histonmethylasen und -demethylasen.
Mittlerweile sind eine Vielzahl an Inhibitoren epigenetischer Modifikatoren kommerziell erhältlich. Getestet wurde u.a. der Wirkstoff GSK343, welcher spezifisch die Funktion der H3K27me3-Methyltransferase Enhancer of zeste homolog 2 (EZH2) inhibiert. Bekannt ist eine Beteiligung von EZH2 in der Carcinogenese und Zellzykluskontrolle. Unter basalen Bedingungen sowie deutlich verstärkt nach mehrstündiger Inkubation mit murinem Lipopolysaccharid (mLPS) zeigte sich eine verzögerte Phenylephrin-induzierte Kontraktion von Präparaten der murinen Aorta thoracica. Da unter inflammatorischen Bedingungen die induzierbare NO-Synthase iNOS stark induziert wird, wurde die Hypothese formuliert, dass eine höhere Bioverfügbarkeit von NO ursächlich für diese Beobachtung ist. NO ist ein potenter Vasodilator und wird im Gefäßendothel produziert. Organbadversuche mit Inhibitoren der iNOS und eNOS konnten jedoch keine Differenzen in der NO-Bioverfügbarkeit zeigen, weder vor noch nach Stimulation mit mLPS. Über schrittweise Depolarisation durch K+-Ionen konnte eine Beeinträchtigung des kontraktilen Apparats der glatten Gefäßmuskelzellen ausgeschlossen werden. Auch die Thromboxan-induzierte Kontraktion, ausgelöst durch das Thromboxan-Analogon U46619, war nicht beeinflusst. Inhibition von EZH2 unter inflammatorischen Bedingungen, wie beispielsweise in der Sepsis, scheint einer Gefäßdysfunktion vorzubeugen. Dies geschieht unabhängig von der NO-Bioverfügbarkeit und ohne Beeinträchtigung der Kontraktilität der glatten Gefäßmuskelzellen sowie der Thromboxan-induzierten Gefäßkontraktion. Es ergibt sich die Hypothese, dass EZH2 nicht in die eigentliche Gefäßtonuskontrolle, sondern in der Transduktion inflammatorischer Signale involviert ist und damit in der Entstehung einer Gefäßdysfunktion. Diese Annahme sollte weiter untersucht werden, da sich durch Inhibition von EZH2 eine mögliche Therapieoption in der Sepsis bietet. Neuste Publikationen bestätigen eine Rolle von EZH2 in der inflammatorischen Signalkaskade.
Die H3K4me3-Histondemethylase JARID1B wird in Gefäßendothelzellen stark exprimiert, bekannt sind eine Rolle in der Embryogenese, Cancerogenese sowie Angiogenese. Die Arteria mesenterica superior der Tamoxifen-induzierbaren globalen Jarid1b-Knockout Maus zeigte eine verstärkte Acetylcholin-induzierte Vasorelaxation. Diese Beobachtung konnte durch Behandlung von Wildtyp- Arterienpräparaten mit dem JARID1B-Inhibitor 2‐4(4‐methylphenyl)‐1,2‐Benziso-thiazol‐3(2H)‐on (PBIT) reproduziert werden. Ein spezifischer Knockout von Jarid1b in Makrophagen zeigte keinen vergleichbaren Phänotyp. Untersucht wurde auch hier die Hypothese, dass Veränderungen der NO-Bioverfügbarkeit Ursache des beobachteten Phänotyps sind. Unterschiede in der NO-Bioverfügbarkeit, der Expression oder des Aktivierungsgrades der eNOS konnten in Versuchen mit Inhibitoren der Synthasen sowie mittels Proteinisolation nicht festgestellt werden. Neben NO wirken Metabolite der Arachidonsäure als Vasorelaxantien. Die Inkubation mit Arachidonsäure im Organbad ergab zunächst keine Unterschiede im Relaxationsverhalten zwischen Knockout- und Wildtypgefäßen. Zur weiteren Untersuchung der Hypothese veränderter Prostanoid-Signalwege sind weitere Studien notwendig. Nach Abschluss der Arbeit konnte gezeigt werden, dass der JARID1B-Knockout die lösliche Epoxid-Hydroxylase (sEH) destabilisiert und damit über verminderten Abbau von Epoxyeicosatriensäuren (EETs) relaxierend und unter Angiotensin II-Einfluss gefäßprotektiv wirkt.
Modifikationen der epigenetischen Regulation in Gefäßzellen wirken sich auf die Gefäßtonusregulation aus. Die Experimente in dieser Arbeit zeigen, dass dies abseits der häufigsten vasoaktiven Autacoid-Signalwege und unter bestimmten Voraussetzungen stattfinden kann. Epigenetische Regulation ermöglicht es, die Gefäßtonuskontrolle den Umgebungsbedingungen anzupassen und spielt in der Pathophysiologie von Gefäßerkrankungen eine entscheidende Rolle.
Die mediane Sternotomie ist in der Kardio-Chirurgie der wichtigste Zugang zum Herzen. Postoperative Wundheilungsstörungen in diesem Bereich sind seltene, jedoch gefürchtete Komplikationen, die zu schwerwiegenden Konsequenzen führen können. Die zunächst einfache oberflächliche Wundheilungsstörung kann sich verkomplizieren und über eine Osteomyelitis des Sternums zu einer Mediastinitis mit eventuell letalen Konsequenzen führen. Aktuell geben unterschiedliche Autoren eine Inzidenz von 1 % – 8 % an. Die Mortalität der Sternumosteitis wird dabei zwischen 10 % und 30 % angegeben. Wird der Pathomechanismus der Erkrankung zu einem Algorithmus zusammengefasst, so kann sich über einen descendierenden Verlauf eine oberflächliche Wundheilungsstörung zu einer Sternumosteitis und schließlich zu einer Mediastinitis entwickeln. Natürlich kann sich die Infektion auch ascendierend ausbreiten. Über eine Infektion des Mediastinums oder des Sternums kann sich eine Infektion über die Weichteile bis an die Körperoberfläche ausdehnen. Der typische Patient, der eine Wundheilungsstörung erleidet ist in aller Regel polymorbide. Besonders bei diesem Patientenkollektiv sind eine kurze Behandlungsdauer und eine schnelle, postoperative Rehabilitation für das Ergebnis vorrangig. Ist der gewählte Therapieplan nicht aggressiv genug, so kommt es häufig zu chronischen Erkrankungen mit Fistelungen und einem konsekutiven Fortschreiten der Infektion in Weichteilen und Knochen. Neben medizinischen Gesichtspunkten kommen auch der wirtschaftliche Aspekte zu tragen. Wiederholte Operationen, lange Liegezeiten auf der Intensivstation und wiederholte sowie langwierige Rehabilitationsphasen sind nur wenige Beispiele der kostenintensiven Therapiebestandteile. Aufgrund der schwer beherrschbaren Infektsituation ist eine konsequent aggressive, definitive und zuverlässige Versorgung der infizierten Wunden von höchster Priorität. Dabei spielt es keine Rolle, ob es sich dabei um Wundheilungsstörungen im Bereich der Haut- und Unterhautweichteile, des Sternums oder des Mediastinums handelt. Zur Behandlung der Wundheilungsstörung nach medianer Sternotomie existieren verschiedene Behandlungsansätze und Therapieoptionen. Diese reichen von einfachen Debridements mit Sekundärvernähungen über Spül-Saug-Drainagen mit Antibiotika versetzen Lösungen bis hin zu Sternumteilresektionen, Vakuumverbänden und komplexen Lappenplastiken. ...
ADAM15, which belongs to the family of the disintegrin and metalloproteinases, is a multi-domain transmembrane protein. A strongly upregulated expression of ADAM15 is found in inflamed synovial membranes from articular joints affected by osteoarthritis and especially rheumatoid arthritis (RA). During the chronic inflammatory process in RA the synovial membrane gets hyperplastic, resulting eventually in the formation of a pannus tissue, which can invade into the adjacent cartilage and bone thereby destroying their integrity. Previously, the expression of ADAM15 in fibroblasts of the RA synovial membrane was found to confer a significant anti-apoptotic response upon triggering of the Fas receptor, which resulted in the activation of two survival kinases, focal adhesion kinase (FAK) and Src. The Fas receptor, also named CD95, belongs to the death receptor family of the tumor necrosis factor receptors and stimulation of Fas/CD95 by its ligand FasL results in the execution of apoptotic cell death in synovial membranes of RA patients. However, the occurrence of apoptotic cell death in vivo in RA synovial tissues is considerably low despite the presence of FasL at high concentrations in the chronically inflamed joint. Accordingly, a general apoptosis resistance is a characteristic of RA-synovial fibroblasts that contributes considerably to the formation the hyperplastic aggressive pannus tissue. The objective of this study was to investigate the mechanisms underlying the capability of ADAM15 to transform FasL-mediated death- inducing signals into pro-survival activation of Src and FAK in rheumatoid arthritis fibroblasts (RASFs).
In the present study, the down-regulation of ADAM15 by RNA interference resulted in a significant increase of caspase 3/7 activity upon stimulation of the Fas receptor in RASFs. Likewise, chondrocytes expressing a deletion mutant of ADAM15 (ΔC), lacking the cytoplasmic domain, revealed increased caspase activities upon Fas ligation in comparison to cells transfected with full-length ADAM15, clearly demonstrating the importance of the cytoplasmic domain for an increased apoptosis resistance. Furthermore, activation of the Fas receptor triggered the phosphorylation of Src at Y416, which results in the active conformation of Src, as well as the phosphorylation of FAK at Y576/577 and Y861 – the target tyrosines phosphorylated by Src - in full-length ADAM15-transfected chondrocytes. However, cells transfected with ADAM15 mutant (ΔC) or with vector control did not exhibit any activation of Src and FAK upon Fas ligation. This suggested the presence of an as yet unknown protein interaction mediating the Fas triggered activation of the two kinases.
In order to identify this mechanism, the application of signal transduction inhibitors interfering with Calcium signaling either by inhibiting calmodulin with trifluoperazine (TFP) or the Calcium release-activated channel (CRAC/Orai1) with BTP-2 efficiently inhibited the phosphorylation of FAK and Src, revealing a role of calmodulin, the major Ca2+ sensor in cells, in ADAM15-dependent and Fas-elicited activation of the two survival kinases. Also, a direct Ca2+ -dependent binding of calmodulin to ADAM15 could be demonstrated by pull-down assays using calmodulin-conjugated sepharose and by protein binding assays using the recombinant cytoplasmic domain of ADAM15 and calmodulin.
Furthermore, it could be demonstrated in living synovial fibroblasts by double immunofluorescence stainings that triggering the Fas receptor by its ligand FasL or a Fas-activating antibody resulted in the recruitment of calmodulin to ADAM15 as well as to the Fas receptor in patch-like structures at the cell membrane. Simultaneously, Src associated with calmodulin was shown to become engaged in an ADAM15 complex, also containing cytoplasmic-bound FAK, by co-immunoprecipitations.
Additional studies were performed to analyze the efficacy of TFP and BTP-2 on apoptosis induction in synovial fibroblasts from 10 RA patients. Using caspase 3/7 and annexin V stainings for determining apoptosis, it could be shown that both inhibitors did not possess any apoptosis inducing capacity. However, when co-incubated with FasL both compounds synergistically enhanced apoptosis rates in the RASFs. Moreover, an additional silencing of ADAM15 revealed a further significant rise in apoptosis rates upon incubation with FasL/TFP or FasL/BTP-2, providing unequivocal evidence for an involvement of ADAM15 in facilitating apoptosis resistance in RASFs.
Taken together, these results demonstrate that ADAM15 provides a scaffold for the formation of calmodulin-dependent pro-survival signaling complexes upon CRAC/Orai1 coactivation by Fas ligation, which provides a new potential therapeutic target to break the apoptosis resistance in RASFs that critically contributes to joint destruction in RA.
The mechanism of peptide transport has been studied on two different ABC transporters of S. cerevisiae. Thereby, the aim of this PhD thesis was to characterise the transporter function on molecular level and shed light on the physiological role of these transporters. The ABC gene YLL048 encodes a novel intracellular transporter translocating peptides from the cytosol to the lumen of the ER. Deletion of the gene resulted in loss of peptide transport activity. The transport activity was fully restored after transformation of the deletion mutant by plasmid-encoded YLL048. Studying the substrate specificity using randomized peptide libraries it was demonstrated that peptides of the size from 6 to 56 amino acids are recognized. So far, no upper limit of the substrate size was obtained. Introduction of D-amino acids in various positions of a nonamer peptide did not impair transport activity. The physiological function of YLL048p is not well understood. The gene product is not essential for cell viability as the deletion mutant did not show any growth phenotype. To examine the possibility that YLL048 encoded protein is part of a quality control of yeast cells involved in the unfolded protein response (UPR), upregulation of YLL048 transcription by heat shock and stress conditions were investigated. We could not observe an influence of stress factors on YLL048 mRNA level. Upregulation of gene expression by the transcription factors Pdr1p and Pdr3p was excluded. The ABC transporter Mdl1p has been identified as peptide transporter of the inner mitochondrial membrane. This protein is required for the export of peptides with the size of 6 to 21 amino acids from the matrix into the intermembrane space. These peptides are generated by m-AAA proteases degrading non-assembled or missfolded membrane proteins. In order to understand the transport mechanism in detail, Mdl1p was expressed in S. cerevisiae and E. coli. Partially enriched protein was reconstituted into liposomes and was active in ATP binding. The association of the NBDs has been described as a central step of the ATPase cycle of ABC transporters, but it is still controversial how both motor domains cooperate and coordinate ATP hydrolysis. To address this question, the Mdl1p-NBD was overexpressed in E. coli and purified to homogeneity. The isolated NBD was active in ATP binding and hydrolysis with a turnover of 0.5 ATP per min and a Km value of 0.2 mM. Isolated NBDs did not show cooperativity in ATPase activity. However, the ATPase activity was observed to be non-linearly dependent on protein concentration suggesting the active form of this enzyme is not a monomer. Very importantly, for the first time an ATP-induced dimer was observed after trapping the NBD by ortho-vanadate or BeFx. The nucleotide composition of the trapped intermediate state was determined and two ADP molecules were simultaneously bound per dimer. An ATP-induced dimer of the ATPase inactive mutant (E559Q) was observed already in the absence of ATPase inhibitor. The E599Q dimer contained two ATP molecules in the absence of Mg2+ at 4°C. Prolonged incubation at 30°C in the presence of Mg2+ induced a stable dimer in which one ATP and ADP molecule were trapped at the same time. Based on these experiments, a new cycle for ATPase activity of ABC transporters was proposed. Binding of ATP to two NBD monomers induces dimerization. Both nucleotides are hydrolysed sequentially. During the hydrolysis cycle the nucleotides cannot be released from the dimer. After hydrolysis of two ATP molecules the domains dissociate and start a new cycle.
In der vorliegenden Arbeit konnte die Entwicklung und Evaluierung einer neuen Apparatur zur Untersuchung der Freisetzungseigenschaften von kolloidalen Arzneiträgern erfolgreich umgesetzt werden. Verschiedene Prototypen und Versionen des Dispersion Releasers konnten entwickelt und mit Hilfe der Werkstatt des Fachbereiches 14 umgesetzt werden. Dabei ermöglicht die letzte Optimierung (Version 3) den Einsatz beider relevanter Dialysemembranen. Sowohl regenerierte Cellulose als auch Celluloseacetat konnten zur Freisetzungsuntersuchung eingesetzt werden. Vorteilhaft ist diese Optionalität vor allem, da auf diese Weise Partikelsysteme und Wirkstoffe mit unterschiedlichen physiko-chemischen Eigenschaften in der gleichen Apparatur auf das Freigabeverhalten untersucht werden können. Darüber hinaus hat der Dispersion Releaser das Potential, sich im Bereich der Freisetzungsuntersuchungen kolloidaler Arzneiträger über den Arbeitskreis von Dr. Wacker hinaus zu einem bevorzugten Testsystem zu entwickeln. In diesem speziellen Gebiet der Freisetzungsuntersuchung von kolloidalen Arzneiträgern wie Nanopartikeln oder Liposomen existiert bisher keine Apparatur, die als sogenannter Gold-Standard angesehen werden kann. Untersuchungen mittels der Durchflusszelle, dem A4D oder Sample & Separate Methoden im Labormaßstab unterliegen kaum standardisierbaren Bedingungen und diversen Limitierungen. Der Dispersion Releaser ist einfach zu handhaben und mit wenig Aufwand in die Freisetzungsapparatur 2 nach Ph. Eur. einzubauen. Zu den zahlreichen Vorteilen gehören außerdem die Kontrolle der Rührgeschwindigkeit sowie der Temperatur und der mögliche Probenzug in beiden Kompartimenten der Dialysezelle. Würden mehr Freisetzungsuntersuchungen von kolloidalen Arzneiträgern mit der gleichen, im besten Falle standardisierten, Apparatur durchgeführt, so würde dies die Vergleichbarkeit der Resultate erheblich verbessern.
Die präparierten Modellarzneiformen der beiden Arzneistoffe mTHPC und Flurbiprofen konnten die Funktionalität des Dispersion Releasers mittels der erhobenen Freisetzungsprofile belegen. Es konnten sowohl schnell als auch langsamer freisetzende kolloidale Formulierungen produziert und identifiziert werden. Als Standard-Freisetzungsmedium diente ein 10 mM Phosphatpuffer versetzt mit Natrium- und Kaliumchlorid bei pH 7,4. Dieser im Hinblick auf pH-Wert, Osmolalität und Pufferkapazität dem Blut angepasste Puffer lieferte reproduzierbare Freisetzungsprofile für alle untersuchten Partikelsysteme. Der Zusatz von Plasmaproteinen erfolge durch Zufügen von FBS zu diesem Standardpuffersystem oder durch Verwendung des im Ph. Eur. gelisteten Phosphatpuffers pH 7,2 mit Rinderalbumin. Der Effekt der im Plasma natürlicherweise enthaltenen Komponenten, insbesondere der Plasmaproteine, auf das Freisetzungsprofil zeigt in dieser Arbeit, dass -wie erwartet- die Freisetzungseigenschaften in komplexen, bzw. physiologischen Medien deutlich von denen in einfachen Puffersystemen abweichen können. Die Anwesenheit von Plasmaproteinen führte zu einer veränderten Freisetzungsrate, sowohl im Falle von Flurbiprofen als auch im Falle von mTHPC. Für mTHPC konnte außerdem der Zusatz von lösungsvermittelndem Methyl-ß-cyclodextrin zum Freisetzungsmedium etabliert werden. Gegenüber üblicherweise eingesetzten Tensiden verändert dieses cyclische Zuckermolekül die Oberflächenspannung des Mediums und damit die Benetzbarkeit der Partikel nicht.
Die mittels Dispersion Releaser und Dialysesack erhobenen Freisetzungsdaten des Wirkstoffes Flurbiprofen wurden in Zusammenarbeit mit Frau Dr. Li Kirsamer einer mathematischen Auswertung unterzogen. Auf diese Weise konnte zunächst das Freisetzungsprofil beider Kompartimente der Dialyse dargestellt werden, wodurch weitere Erkenntnisse der Qualität des kolloidalen Trägers und seiner Eignung für den jeweiligen Arzneistoff abgeleitet werden können. Die Auswertung an Hand dieses Modells berücksichtigt zwar die Fraktion des freigesetzten Wirkstoffes in beiden Kompartimenten, ermittelt jedoch keine theoretische Freisetzungsrate welche ohne Membrankinetik messbar wäre. Dies wäre in der Auswertung von Freisetzungsdaten ebenfalls von Interesse, konnte jedoch im Rahmen dieser Arbeit nicht näher untersucht werden. Berechnungen wie diese können in weiterführenden Arbeiten möglicherweise dazu dienen, in vitro Freisetzungsdaten mit Plasmaprofilen zu korrelieren. Mit dem Erwerb der Rechte an dem Dispersion Releaser durch die Firma Pharma Test Apparatebau AG im Jahr 2016 wurde der Weg für eine mögliche breite und auch kommerzielle Nutzung der neuartigen Apparatur eingeleitet. Diese Transaktion und die andauernde Kooperation zwischen Pharmatest und dem Arbeitskreis von Herrn Prof. Dr. Wacker soll die erfolgreiche Beantwortung der Fragestellungen innerhalb der vorliegenden Arbeit mit dem Titel „Entwicklung einer Apparatur zur in vitro Testung der Wirkstofffreisetzung aus kolloidalen Arzneistoffträgern“ hervorheben.
In dieser Arbeit werden grundlegende Untersuchungen zum Verständnis der dynamischen Wechselwirkungsmechanismen atomarer Projektile mit Festkörperoberflächen vorgestellt, die zur Emission von Sekundärionen führen. Der zentrale Ansatzpunkt ist dabei die Vermessung der Dynamik über die geschwindigkeits- und winkeldifferentielle Verteilung der emittierten Sekundärionen. Dazu wurde ein neuartiges Spektrometer entwickelt, in dem jedes in einem homogenen elektrischen Feld abgelenkte Sekundärion durch seine Flugzeit (TOF) und den Auftreffort auf einen 2-dimensionalen (XY) ortsempfindlichen Detektor charakterisiert wird. Das Prinzip basiert auf dem in Gastargetexperimenten erfolgreich eingesetzten Frankfurter Meßsystem COLTRIMS (COLd Target Recoil Ion Momentum Spectroscopy). Dieses System wurde weiterentwickelt und erstmalig in Frankfurt in einem Festkörperexperiment zur geschwindigkeits- und winkeldifferentiellen Spektrometrie von Sekundärionen angewendet. Ein zusätzliches Merkmal gegenüber herkömmlichen Spektrometern ist die Möglichkeit der einfachen Variation des Einfallswinkels 0p vom Projektil zum Target. Die korrekte Transformation der gemessenen Daten in eine 3-dimensionale Anfangsgeschwindigkeitsverteilung bedingt eine möglichst präzise Eichung des Spektrometers. Dazu wurde die in diesem Zusammenhang neuartige Methode des Strahlprofilmonitors entwickelt und eingesetzt. Durch die Wechselwirkung des Projektils mit einem nicht lokalisierten Gastarget erzeugt es auf seinem Weg durch das Spektrometer eine Spur aus Ionen. Die Gasionen befinden sich im Verhältnis zu den von dem Festkörper emittierten Sekundärionen nahezu in Ruhe. Daher kann über die Analyse der Projektilspur auf die zur Eichung notwendigen, aber im Experiment nicht direkt zugänglichen Parameter, wie Flugzeit (T0) und Auftreffort (x0/y0) für Teilchen mit der Geschwindigkeit v0z = v0x = v0y = 0, geschlossen werden. Die systematische Variation von Projektil- (He0/N0/Ar0, Ep = 0.2 - 2.2 MeV, 0p = 37°-78° relativ zur Oberflächennormalen) und Targeteigenschaften (Au/C/LiF/Al) erlaubt ein gezieltes Studium der dynamischen Wechselwirkung zwischen Projektilen und Festkörperoberflächen. Das untersuchte H+-Sekundärion entstammt einer Festkörperoberfläche bedeckenden quasistabilen Kontaminationsschicht, die im wesentlichen aus den Adsorbaten H2, H2O, CxHy besteht. Die gemessenen H+-Geschwindigkeitsverteilungen besitzen ein Maximum etwa bei v0 ungefähr gleich 25-35 km/s mit Ausläufern (abhängig von 0p) bis hin zu 240 km/s. Bei sinkender Projektilgeschwindigkeit zeigt die Verteilung der emittierten H+-Sekundärionen bei hohen Emissionsgeschwindigkeiten (v0 > 60 km/s) eine stark ausgeprägte Asymmetrie in der von dem einfallenden Projektil und der Oberflächennormalen definierten Ebene. Ionen werden mit einer hohen Geschwindigkeit (bis zu 140 km/s bei 0p = 45°) unter einem Winkel von ca. 90° zum Projektil, unabhängig von 0p, emittiert. Diese Asymmetrie wird durch eine binäre Kollision des Projektils mit dem Wasserstoff verursacht. Die Variation der Projektilgeschwindigkeit ist korreliert mit der deponierten Energie des Projektils im Festkörper. Daher kann in der Dynamik der Sekundärionen deutlich der Beitrag des nuklearen Anteils an der totalen Energiedeposition aufgezeigt und getrennt werden. Bei Emissionsgeschwindigkeiten v0 < 60 km/s zeigt sich eine starke Abhängigkeit von den Targeteigenschaften. Bei konstantem Einfallswinkel beobachten wir eine Verschiebung der Maxima von v0 max ungefähr gleich 26.5 km/s bei Au-, über 27.9 km/s bei Al- bis hin zu 32.5 km/s bei LiF-Targets. Es zeigt sich keine meßbare Abhängigkeit vom Einfallswinkel des Projektils bei Auund C-Targets, dagegen eine deutliche Verschiebung der Maxima hin zu größeren Geschwindigkeiten bei dem Al- (v0 max ungefähr gleich 27.5 km/s - 30 km/s) und dem LiF-Target (v0 max ungefähr gleich 32.5 km/s - 35.5 km/s) mit einer Vergrößerung von 0p. Ionen mit v0 < 30 km/s werden zum Großteil rückwärts in Richtung des einfallenden Projektils emittiert. Au und C sind gute, LiF und das mit einer Al2O3-Schicht überzogene Al dagegen schlechte elektrische Oberflächenleiter. Die Verschiebung der Verteilungen bei einem schlechten elektrischen Leiter ist ein Hinweis auf den zeitabhängigen Zerfall des Projektilspurpotentials im Festkörper. Die Zunahme der Emissionsgeschwindigkeit v0 bei Vergrößerung von 0p ist in der Vergrößerung der effektiven Targetdicke begründet und ein Hinweis auf eine targetdickenabhängige Neutralisationszeit des geladenen Spurkerns durch Elektronen des Substrats. Korrelationen im Sekundärionenemissionsprozeß bezüglich Impuls- und Energieerhaltung zwischen einem emittierten H+-Sekundärion und einem möglichen zweiten Sekundärion wurden nicht beobachtet. Über die Eichung hinaus eröffnen sich zusätzlich noch einige vielversprechende Anwendungsmöglichkeiten des Strahlprofilmonitors. Zum einen ermöglicht er a) in der Gasmassenspektrometrie eine exakte Korrektur der Ionenflugzeit unabhängig vom Ort der Ionisation und zum anderen bildet er b) eine innovative Methode zur Kartographie lokaler elektrischer Felder und c) ferner einen alternativen Zugang zur Vermessung von Projektilstreuwinkeln. Die Verwendung eines ortsempfindlichen Detektors in der „kinematischen“ Materialanalyse verbindet simultan gute Tiefenprofilauflösung mit dem Nachweis eines großen Raumwinkels zugunsten einer besseren Statistik. Die Kenntnis der Emissionscharakteristik bewährt sich zudem in der Massenanalyse in der Unterscheidung von Ionen fast identischer Massen.
Discrepancies between knockdown and knockout animal model phenotypes have long stood as a perplexing phenomenon. Several mechanisms explaining such observations have been proposed, namely the toxicity or the off-target effects of the knockdown reagents, as well as, in certain cases, genetic robustness – an organism's ability to maintain its phenotype despite genetic perturbations. In addition to these explanations, transcriptional adaptation (TA), a phenomenon defined as an event whereby a mutation in one gene leads to transcriptional upregulation or downregulation of another, adapting, gene or genes expression, has been recently proposed as an alternative explanation for the conflicting knockdown and knockout phenotype paradox.
Since its discovery in 2015, TA's precise mechanism remains a subject of ongoing research. Majority of evidence suggests that mutant mRNA degradation plays a central in TA. Epigenetic remodeling is also thought to play a role, as evidenced by an increase in active histone marks at the transcription start sites of the adapting genes. Whether mRNA degradation is indeed the key player in TA remains debated. Furthermore, it is still unknown how exactly TA develops, what adapting genes it targets, and whether genomic mutations that render mutant mRNA sensitive to degradation are required for TA to occur.
Throughout the experiments described in this Dissertation, I have designed an inducible TA system where TA can be triggered on demand and its effects on the cell’s transcriptome followed through time. I have demonstrated that degradation-prone transgenes, once induced and expressed, can be efficiently degraded, resulting in the protein loss-independent upregulation of adapting genes via TA. Adapting genes with higher degree of sequence similarity become upregulated faster than genes with lower degree of sequence similarity. Further functionality of this approach to study TA is limited by the leakiness of the inducible gene expression system; however, constitutively expressed degradation-prone transgenes were used to demonstrate TA in human cells.
In addition, I have developed an approach to target wild-type cytoplasmic mRNAs without altering the cell’s genome and reported a TA-like phenomenon, which manifested as adapting gene upregulation not relying on mutations in other genes. Cytoplasmic mRNA cleavage with CRISPR-Cas13d triggered a TA-like response in three different gene models: Actg1 knockdown, Ctnna1 knockdown, and Nckap1 knockdown. After comparing two different modes of triggering TA, CRISPR-Cas9 knockout versus CRISPR-Cas13d knockdown, I reported little overlap between the dysregulated genes and suggested that diverse mRNA degradation modes led to distinct TA responses. In addition, the transcriptional increase of Actg2 caused by CRISPR-Cas13d-mediated Actg1 mRNA cleavage did not require chromatin accessibility changes.
Experiments and genetic tools described in this dissertation investigated how TA develops from its earliest onset, how it affects the global transcriptome of the cell, as well as provided compelling evidence for an mRNA degradation-central TA mechanism. I have created tools to study both direct and indirect TA gene targets and unveiled important insights into the temporal dynamics of TA. Genes with higher sequence similarity were found to be upregulated more rapidly than those with lower similarity. Furthermore, it was revealed that the epigenetic properties of TA responses vary depending on the triggering mechanism. Cas13d-mediated degradation of wild-type mRNAs led to immediate transcriptional enhancement independent of epigenetic changes, which stood in contrast to previously measured alterations in chromatin accessibility in CRISPR-Cas9 mutants. This research has thus significantly advanced our knowledge of TA and provided valuable tools and findings that contribute to the broader understanding of gene expression regulation in response to mRNA degradation.
Induktion verschiedener Aktivitätsmuster über differentielle Rezeptor-Rekrutierung von Typ I IFN
(2006)
Für die grundlagenorientierte Forschung sowie für die Entwicklung neuer Wirkstoffe spielt der Mechanismus der interzellullären Kommunikation über Botenstoffe, wie Cytokine, eine einflussreiche Rolle. Cytokine sind Proteine, welche von Leukozyten sekretiert werden und von großer Bedeutung für die Stimulierung des angeborenen Immunsystems sind. Hierbei bewirken die Typ I Interferone (Interferone, IFN) durch ihre antivirale, immunmodulatorische, antiproliferative und antiflammatorische Wirkung. Zudem stellen sie eine Verbindung zu der zellulären Immunantwort dar, wirken bei antionkogenen Prozessen mit und aktivieren eine Vielzahl an weiteren Funktionen in der Zelle. Bekannt sind bisher eine Vielzahl verschiedener humaner Interferone (verschiedene IFNa-Subtypen, b, w und e), die über einen gemeinsamen Rezeptor wirken, der sich aus den Untereinheiten ifnar1 und ifnar2 zusammensetzt. Auffallend ist, dass verschiedene Interferone unterschiedliche zelluläre Aktivitätsmuster induzieren. Mit dieser Arbeit sollte daher ein möglicher Zusammenhang zwischen der differentiellen Rezeptor-Rekrutierung verschiedener Interferone und der Induktion verschiedener Aktivitäten geklärt werden. Voraussetzung hierfür war die Aufreinigung verschiedener Interferone (IFNa1, IFNa2, IFNa8, IFNa21, IFNb), Mutanten sowie Cystein-Mutanten zur selektiven Fluoreszenzmarkierung in ausreichender Menge und Reinheit. Um den Einfluss der Bindungsaffinität auf die Aktivität zu untersuchen, wurden Aminosäuren innerhalb der Bindungsstellen zu den Rezeptoruntereinheiten ausgetauscht. Die Änderung der Bindungsaffinität sowie deren Effekt auf die Aktivität wurden überprüft. Mit Hilfe der Cystein-Mutanten an der Position a2S136C / a/wS137C konnte eine ortsspezifische Fluoreszenzmarkierung durchgeführt werden. Für die Untersuchung der Interaktion wurden die extrazellulären Domänen von ifnar1 (ifnar1-EC) und ifnar2 (ifnar2-EC) über einen Deka-Histidin-tag immobilisiert wurden. Die Interaktion wurde in Echtzeit mit der markierungsfreien reflektometrische Interferenzspektroskopie (RIfS) und der totalinternen Reflektions-Fluoreszenzspektroskopie (TIRFS) detektiert. Hierzu wurden die Stöchiometrie, die Kinetik der Interaktion sowie die Bindungsstelle durch Kompetition zu den Rezeptoruntereinheiten charakterisiert. Dabei zeigten sich in der Stöchiometrie (binärer/ternärer Komplex), den Bindungsstellen oder der Konformationsänderung durch ifnar1 keine Unterschiede zwischen den IFN. Als einziges Unterscheidungsmerkmal konnten signifikant unterschiedliche Bindungsaffinitäten an die Rezeptoruntereinheiten ifnar1 und ifnar2 nachgewiesen werden. Dabei war die Rezeptoruntereinheit ifnar2 gegenüber ifnar1 stets die höher affine Komponente mit deutlichen Affinitätsunterschieden von bis zu drei Größenordnungen. Ebenfalls wurde die Assemblierung eines ternären Komplexes untersucht, für den eine 1:1:1-Stöchiometrie für alle IFN beobachtet wurde. Für Assemblierung ternärer Komplexe konnte ein Einfluss durch die Bindungsaffinitäten sowie den relativen sowie absoluten Konzentration der Rezeptoruntereinheiten nachgewiesen werden. Für die Untersuchung verschiedener zellulärer Aktivitäten, die durch die IFN induziert werden, wurde die Assemblierung des Transkriptionsfaktors ISGF3 (Interferon stimulierten Genfaktors 3), die antivirale Aktivität gegen vesikuläre Stomatitis Viren (VSV) sowie die antiproliferative Aktivität überprüft. Für die ISGF3-Aktivität konnten große Unterschiede für die effektiven Konzentrationen (EC50) zwischen den IFN beobachtet werden (pM- bis nM-Bereich). Für eine antiproliferative Aktivität wurde Konzentrationen im nM-Bereich benötigt. Insbesondere konnten Unterschiede zwischen den Aktivitätsmustern beobachtet werden. Durch die Korrelation der Bindungsaffinitäten mit den jeweiligen Aktivitäten konnte ein deutlicher Zusammenhang beobachtet werden. So wurde für die Induktion der ISGF3-Assemblierung eine Abhängigkeit zu der ifnar2-Affinität nachgewiesen. Bei niedrigen IFN-Konzentrationen wird über die ifnar2-Affinität die Verweildauer der Interferone auf der Oberfläche beeinflusst, wodurch Einfluss auf die Anzahl an ternären Komplexen genommen wird. Im Gegensatz hierzu zeigte sich für die antiproliferative Aktivität eine Korrelation zu der Affinität an ifnar1. Auffällig war zudem die Korrelation der differentiellen antiproliferativen Aktivität zu der relativen Bindungsaffinität von ifnar1 zu ifnar2. Dies lässt sich durch eine mögliche Adaption der Zellen gegenüber IFN erklären, die eine Regulation der Rezeptorkonzentration auf der Membran bewirkt. Durch die Modulation der Bindungsaffinität zu ifnar2 und ifnar1 konnte der Einfluss auf die Aktivität bestätigt werden. In der Medizin könnte dies für eine verbesserte therapeutische Anwendung von Bedeutung sein, da der Einsatz von Interferonen zurzeit durch eine Vielzahl an Nebenwirkungen eingeschränkt ist.
In this study, I investigate the crustal and upper mantle velocity structure beneath the Rwenzori Mountains in western Uganda. This mountain range is situated within the western branch of the East African Rift and reaches altitudes of more than 5000 m. I use four different approaches that belong to the travel-time tomography method. The first approach is based on the isotropic tomographic inversion of local data, which contain information about 2053 earthquakes recorded by a network of up to 35 stations covering an area of 140×90 km2. The LOTOS-09 algorithm described here is used to realize this approach. The second approach is based on the anisotropic tomographic inversion of the same local dataset. This method employs the tomographic code ANITA, developed with my participation, which provides 3D anisotropic P and isotropic S velocity distributions based on P and S travel-times from local seismicity. For the P anisotropic model, four parameters for each parameterization cell are determined. This represents an orthorhombic anisotropy with one vertically-oriented predefined direction. Three of the parameters describe slowness variations along three horizontal orientations with azimuths of 0°, 60° and 120°, and one is a perturbation along the vertical axis. The third approach is based on tomographic inversion of the teleseismic data, which contain information about the traveltimes of P-waves coming from 284 teleseismic events recorded by the seismic network stations. The TELELOTOS code, which is my own modification of the LOTOS-09 algorithm, is used in this approach. The TELELOTOS code is designed to iteratively invert the local and/or teleseismic datasets. Finally, I present the results of the new tomographic approach, which is based on the simultaneous inversion of the joint local and teleseismic data. The simultaneous use of these datasets for the tomographic inversion has several advantages. In this case, the velocity structure in the study area can be resolved as deep as in the teleseismic approach. At the same time, in the upper part of the study volume, the resolution of the obtained models is as good as in the local tomography. The TELELOTOS algorithm is used to perform the joint tomographic inversion. Special attention is paid in this work to synthetic testing. A number of different synthetic and real data tests are performed to estimate the resolution ability and robustness of the obtained models. In particular, synthetic tests have shown that the results of the anisotropic tomographic inversion of the local data have to be considered as unsatisfactory. For all approaches used in this study, I present synthetic models that reproduce the same pattern of anomalies as that obtained by inverting the real data. These models are used to interpret the results and estimate the real amplitudes of the obtained anomalies. The obtained models exhibit a relatively strong negative P anomaly (up to -10%) beneath the Rwenzori Mountains. Low velocities are found in the northeastern part of the array at shallower depths and are most likely related to sedimentary deposits, while higher velocities are found beneath the eastern rift shoulder and are thought to be related to old cratonic crust. The presence of low velocities in the northwestern part of the array may be caused by a magmatic intrusion beneath the Buranga hot springs. Relatively low velocities were observed within the lower crust and upper mantle in the western and southern parts of the study area (beneath the rift valley and the entire length of the Rwenzori range). The higher amplitude of the low-velocity anomaly in the south can be related to the thinner lithosphere in the southern part of the Albertine rift. In the center of the study area, a small negative anomaly is observed, with the intensity increasing with depth. This anomaly is presumably related to a fluids rising up from a plume branch in the deeper part of the mantle. According to the interpretation of the local earthquake distribution, the Rwenzori Mountains are located between two rift valleys with flanks marked by normal faults. The Rwenzori block is bounded by thrust faults that are probably due to compression.
Da HRS-Zellen im cHL nur eine Minderheit und CD4+ T-Zellen die Mehrheit im Begleitinfiltrat ausmachen, wurde innerhalb der vorliegenden Dissertation das Begleitinfiltrat und der Tumorzellgehalt von 24 HIV-assoziierten cHL-Fällen mit 15 HIV-negativen cHL-Fällen immunhistochemisch verglichen. Das reaktive Begleitinfiltrat im HIV-assoziierten cHL zeigte eine deutlich geringere Anzahl an CD4+ T-Zellen und einen höheren Gehalt an CD163+ Makrophagen als das HIV-negative cHL. Es konnte kein Unterschied in der Anzahl der CD30+ HRS-Zellen und S100+ dendritischen Zellen zwischen beiden Gruppen festgestellt werden. Mit Kokultur-Versuchen im Labor und darauf folgenden Zellausstrichen dieser Kokulturen konnte bestätigt werden, dass sich CD14+ Monozyten ebenso gut wie CD4+ T-Zellen als Rosetten um HRS-Zellen anordnen können. Im immunkomprimierten HIV-Patienten ersetzen die langlebigen CD163+ Makrophagen die CD4+ T-Zellen. Die Makrophagen werden vermutlich ebenso wie CD4+ T-Zellen mittels Zytokine/Chemokine (z. B. CCL5) zum Tumorgewebe rekrutiert, bilden Rosetten um die Tumorzellen und unterstützen diese in ihrer Proliferation.
Aufgrund der besonderen Zusammensetzung des Begleitinfiltrats sollte das HIV-assoziierte cHL von Pathologen als eigenständiger Subtyp des cHL betrachtet werden.
Des Weiteren wurde das Begleitinfiltrat der typisch knotigen NLPHL Typen A und C mit dem des diffusen NLPHL Typen E (THRLBCL-like NLPHL) und dem THRLBCL immunhistochemisch verglichen. Aufgrund histologischer und klinischer Ähnlichkeiten zwischen dem diffusen NLPHL und dem THRLBCL fällt eine Differenzierung dieser Entitäten schwer. Es konnte festgestellt werden, dass das Begleitinfiltrat im THRLBCL-like NLPHL dem Begleitinfiltrat im THRLBCL mehr ähnelt als dem typischen NLPHL und zwar in Bezug auf Makrophagengehalt und Anzahl der follikulären TFH-Zellen. Es konnten Rosetten im Begleitinfiltrat von THRLBCL nachgewiesen werden, obwohl Rosettenformationen um Tumorzellen im THRLBCL in der Literatur kein charakteristisches Merkmal darstellen. Es ist naheliegend, dass das THRLBCL-like NLPHL und das THRLBCL ein und dieselbe Krankheit ist und möglicherweise eine aggressivere Variante des NLPHL darstellt.
Im Anbetracht aller Ergebnisse kommt dem Immunstatus eines Patienten eine ausschlaggebende Rolle auf das Begleitinfiltrat im Tumorgewebe zu und dieser beeinflusst so auch den klinischen Verlauf der Lymphomerkrankung.
Das Hepatozelluläre Karzinom (HCC) ist die sechsthäufigste Krebsart mit der zweithäufigsten krebsbedingten Letalität. Sorafenib ist bereits seit über 10 Jahren die einzige verfügbare und zugelassene systemische Chemotherapie. Allerdings zeigen Patienten oft eine Resistenz gegenüber Sorafenib.
In zahlreichen Krebsarten konnte bereits gezeigt werden, dass Sphingolipide bei der Tumorentwicklung und Chemoresistenz eine wichtige Rolle spielen. Sphingolipide sind bioaktive Lipidmoleküle, welche unteranderem für die Beeinflussung verschiedener Signalwege intra- und extrazellulär verantwortlich sind. So konnte gezeigt werden, dass das Verhältnis zwischen Sphingosin-1-Phosphat (S1P) und Ceramiden eine wichtige Rolle für das Überleben von Zellen spielt, wobei eine Verschiebung des Verhältnisses zugunsten des S1P meist eine proliferative Wirkung auf Zellen hat. Für die Phosphorylierung des Sphingosins zu S1P sind die zwei Enzyme Sphingosinkinase 1 und 2 (SPHK1/2) verantwortlich.
Es gibt bereits Studien, die nachweisen konnten, dass diese Enzyme gerade in Tumorzellen verstärkt exprimiert werden. Auf der anderen Seite kann eine verstärkte Bildung von Ceramiden die Apoptose der Tumorzellen verstärken. Daher ist es nicht verwunderlich, dass der Sphingolipid-Stoffwechsel einen interessanten Angriffspunkt für die Krebstherapie darstellt. Aus diesem Grund sollte in der vorliegenden Arbeit zunächst untersucht werden, ob Sorafenib einen Einfluss auf den Sphingolipid Stoffwechsel hat. Weiter sollte untersucht werden, ob die Beeinflussung des Sphingolipid-Stoffwechsels die Effekte von Sorafenib potenzieren könnte.
Es konnte zunächst gezeigt werden, dass Sorafenib die mRNA-Expression verschiedener Enzyme, die das Verhältnis zwischen Ceramiden und S1P regulieren, beeinflussen kann. Es wurde weiter untersucht, wie sich der Ceramidsynthase Inhibitor FB1 auf die Proliferation und die Induktion der Apoptose auswirkt. Dies wurde ebenfalls mit SLP (SPHK1 Inhibitor), SLM (SPHK2 Inhibitor) und SKI II, einem unspezifischen Inhibitor beider Sphingosinkinasen, untersucht. Es wurden weiter die Einflüsse aller verwendeten Substanzen auf die Bildung verschiedener Sphingolipide untersucht.
Hierbei konnte gezeigt werden, dass Sorafenib in der Lage ist, die Proliferation der Zellen zu hemmen und die Apoptose-Induktion zu fördern. Weiter führte Sorafenib zu einer Akkumulation der Dihydroceramide. Was wiederrum weder mit SKI II, FB1; SLP noch SLM beobachtet werden konnte. Der signifikante Anstieg der Dihydroceramid-Konzentrationen konnte mit dem durch Sorafenib induzierten oxidativen Stress in Verbindung gebracht werden.
SLP und SLM waren nicht in der Lage, die Effekte von Sorafenib auf die Proliferation zu potenzieren. Die Kombination von Sorafenib mit SLP oder SLM führte jedoch in den Huh7.5 Zellen zu einer drastischen Reduktion des S1P-Spiegel.
FB1 und SKI II führten zu einer stärkeren Hemmung der Proliferation als Sorafenib. Wobei gezeigt werden konnte, dass beide Substanzen die Ceramid-Spiegel tendenziell eher vermindern und die S1P-Spiegel erhöhen. Durch die Stimulation mit FB1 kam es sogar zu einer signifikanten Erhöhung der S1P-Spiegel. Es scheint, dass der Einfluss von FB1 und SKI II auf die Proliferation der Zellen unabhängig vom Sphingolipid-Stoffwechsel ist. Diese scheinen eher über andere Mechanismen zu wirken. Es könnte von Interesse sein, gerade diese Signalwege von SKI II im HCC weiter zu untersuchen, da SKI II bereits in Mausmodellen anderer Krebsarten vielversprechende Ergebnisse zeigte.
Das Studium der Medizin umfasst eine sehr heterogene Zusammenstellung von Fächern. Die große Anzahl unterschiedlicher Leistungsnachweise im klinischen Studium macht es dabei fast unmöglich, sich auf alle Fächer intensiv vorzubereiten, so dass vom Studenten eine Auswahl getroffen werden muss. Bisher liegen keine Untersuchungen dazu vor, nach welchen Kriterien Studenten ihren Lernaufwand einteilen. Anhand der fachspezifischen Prüfungsleistungen von etwa 1000 Medizinstudenten der Johann Wolfgang Goethe-Universität Frankfurt/Main mit dem Beginn des klinischen Studiums zwischen dem Sommersemester 2003 und dem Wintersemester 2005/2006 wurde untersucht, welche Korrelationen zwischen den 33 Fachnoten des klinischen Studienabschnitts vorliegen, die durch schriftliche Prüfungen ermittelt wurden. Dazu wurden die Noten der Erstprüfung verwendet, bei erst im Wiederholungsversuch bestandenen Fächern wurde für Korrelationen die Note auf 5 gesetzt. Zusätzlich wurde untersucht, ob es Unterschiede der Prüfungsleistungen zwischen den Studentenkohorten gibt, die zum Wintersemester (überwiegend Regelzeitstudenten) oder Sommersemester (keine Regelzeitstudenten) den klinischen Studienabschnitt beginnen. Für diese Berechnungen wurden alle Studenten in Kohorten zusammengefasst, die zum gleichen Zeitpunkt mit dem klinischen Studium begannen. Zur Klassifizierung von Fächern wurden diese nach inhaltlichen Gesichtspunkten zusammengefasst (internistische Fächer, operative Fächer, neurologische Fächer, Reproduktionsblock); daneben wurde eine Gruppierung nach Relevanz im Staatsexamen vorgenommen (Kernfächer des Studiums, Nebenfächer). Die Ergebnisse legen nahe, dass die Studenten kein interessensgesteuertes Lernen anwenden, wie sich an den relativ niedrigen Korrelationen zwischen inhaltlich ähnlichen Fächern zeigt. Dagegen zeigen sich hohe Korrelationen zwischen den Kernfächern des Curriculums, die eine große Fragenanzahl im Staatsexamen besitzen, sowie zwischen Fächern, die im gleichen Zeitraum gelehrt und geprüft wurden. Niedrige Korrelationen (auch negativ) wurden nur für wenige Fächer gefunden, bei denen keine inhaltliche Übereinstimmung vorliegt und offensichtlich keine Bedeutung für das Staatsexamen angenommen wird. Andererseits spricht die deutliche Korrelation zwischen Innerer Medizin und Pädiatrie dafür, dass eine inhaltliche Übereinstimmung in relevanten Fächern den Prüfungserfolg beeinflussen kann, auch wenn die Prüfungen zu unterschiedlichen Zeitpunkten stattfinden. Als Nebenergebnis wird ein deutlicher Leistungsunterschied zwischen den Kohorten gefunden, die im Wintersemester bzw. im Sommersemester ihr klinisches Studium beginnen; hierbei haben die Kohorten ohne Studenten in der Regelstudienzeit deutlich schlechtere Noten. Diese Leistungsunterschiede sind in den Kernfächern mit einer angenommenen großen Relevanz für das Staatsexamen besonders ausgeprägt. Insgesamt bestätigen die Ergebnisse die aus anderen Fächern bekannten Daten, dass von den Charaktereigenschaften nur der Parameter „Fleiß/Gewissenhaftigkeit“ mit einem schnellen, erfolgreichen Studium korreliert, während andere Persönlichkeitseigenschaften keinen Bezug zum Studienerfolg haben. Die Lernsteuerung durch Fleiß mit dem Kriterium „Prüfung zum gleichen Zeitpunkt“ steht in einem Gegensatz zur Tatsache, dass etwa 50% der Studenten bereits zum Studienbeginn genaue Vorstellungen über ihr späteres ärztliches Tätigkeitsfeld haben.
In der vorliegenden Arbeit sollte das basolaterale Targeting des Transmembranproteins shrew-1 in polarisierten Epithelzellen analysiert werden. Es konnte gezeigt werden, dass die cytoplasmatische Domäne von shrew-1 mehrere spezifische basolaterale Sortingmotive enthält. Die Funktionalität dieser Motive wurde anhand Mutationsanalysen von Schlüsselaminosäuren untersucht. Substitution dieser Aminosäuren führt zu einer apikalen Lokalisation von shrew-1 in polarisierten MDCK Zellen. Durch Analyse der Proteinverteilung von shrew-1 Varianten in polarisierten LLC-PK1 Zellen wurde deutlich, dass das Sorting von shrew-1 in die basolaterale Plasmamembran ein AP-1B-abhängiger Prozess ist. Außerdem konnte mittels Coimmunopräzipitation eine Interaktion zwischen shrew-1 und der Untereinheit my1B aus dem Adapterproteinkomplex AP-1B nachgewiesen werden. Untersuchungen des Targetings von shrew-1 Varianten in polarisierten MDCK und LLCPK1 Zellen mit Hilfe der Transzytoseexperimente zeigten, dass die apikal lokalisierte Mutante shrew-1-NTD5 auf dem Weg zur apikalen Membranregion, trotz fehlender Sortinginformation, die basolaterale Plasmamembran durchquert. Durch Inhibition der Membranfusion mittels Tanninsäure konnte zusätzlich gezeigt werden, dass die Passage der basolateralen Plasmamembran für das Targeting von sowohl shrew-1 als auch von shrew-1-NTD5 essentiell ist. Die Beobachtungen des Turnovers von shrew-1 in der Plasmamembran von lebenden Zellen zeigten, dass shrew-1 aktiv endozytiert wird und dass nachfolgend ein Recycling des Proteins zur Plasmamembran stattfindet. Anhand der durchgeführten Untersuchungen lässt sich zusammenfassend ein Targetingmodell für shrew-1 in polarisierten Epithelzellen aufstellen, das ein postendozytotisches Sorting beschreibt: Dabei wird shrew-1 zunächst in Post-Golgi-Carriern auf unbekanntem Weg zur basolateralen Plasmamembran gebracht, wo seine unmittelbare Internalisierung und ein Weitertransport zum Recyclingendosom stattfinden. Der im Recyclingendosom lokalisierte und am Sorting beteiligte Adapterproteinkomplex AP-1B vermittelt dann den Rücktransport von shrew-1 zur basolateralen Plasmamembran.
Probing the photointermediates of light-driven sodium ion pump KR2 by DNP-enhanced solid-state NMR
(2021)
KR2 is a light-driven sodium ion pump found in marine flavobacterium Krokinobacter Eikastus. The protein belongs to the microbial rhodopsin family, which is characterized by seven transmembrane helices and a retinal cofactor covalently bound to a conserved lysine residue through a Schiff base linkage. Specific features of KR2 and other sodium pumping rhodopsins are the NDQ motif, the N-terminal helix capping the protein at the extracellular side, and the sodium ion bound at the protomer interface in the pentameric structure. The ability to pump sodium ions was a surprising discovery since the positive charge at the Schiff base was long thought to hinder the transport of non-proton cations and the Grotthuss mechanism could not be applied to explain the Na+ transport. The photocycle of KR2 revealed by flashed photolysis and ultrafast femtosecond absorption spectroscopy consists of consecutive intermediates, named K, L, M, and O.
Here, DNP-enhanced ssNMR was used to analyze various aspects of these intermediate states. The K/L-state can be generated and trapped by in-situ illumination inside the magnet at 110 K. The trapping of L-state together with the K-state at this temperature is unexpected as this usually leads to the trapping of only K-state in bacteriorhodopsin (BR), proteorhodopsin (PR), and channelrhodopsin 2 (ChR2). This observation suggests a lower energy barrier between K- and L-state in KR2. For the O-state, the intermediate was generated by illuminating outside the magnet, followed by rapid freezing in liquid nitrogen and transfer to the magnet. Based on these procedures, the retinal conformation, and the electrostatic environment at the Schiff base in KR2 dark, K-, L- and O-intermediates were probed using 13C-labeled retinals bound to 15N-labeled KR2 by both 1D and 2D magic angle spinning (MAS) NMR experiments.
The obtained data show an all-trans retinal conformation with the distortion of 150° at H-C14-C15-H in the dark state whereas the retinal has a 13-cis, 15-anti conformation in the K- and L-state after light activation. Differences between K- and L-intermediates were observed. The retinal chemical shifts of the K-state show a large deviation from the model compound behavior between the middle and end part of the polyene chain. In the L-state, these differences are much less pronounced. These observations indicate that the light energy stored in the K-state dissipates into the protein in the subsequent photointermediate states. Furthermore, an additional shielding observed for C14 in L-state indicates the slight rotation toward a more compact 13-cis, 15-syn conformation. The distortion of the H-C14-C15-H angle in the L-state (136°) is larger than in the dark state. This twist of the retinal in the L-state would play an important role in lowering the pKa of the Schiff base, which is a prerequisite for the proton transfer from the Schiff base to the proton acceptor (D116). The electrostatic environments at the Schiff base in K- and L-states cause a de-shielding of the 15N nitrogen compared to the dark state. This indicates a stepwise stronger interaction with the counterion as the Schiff base proton moves away from the Schiff base and comes closer to the D116 in the transition from K- to L-state and approaches the proton transfer step during the M-state formation. In the O-state, the retinal was found to be in the all-trans conformation but differed to the dark state in the C13, C20, and Schiff base nitrogen chemical shifts. The largest effect (9 ppm) was observed for the Schiff base nitrogen, which could be explained by the effect of the positive charge of bound Na+ near the Schiff base in the O-state, coordinated by N112 and D116 as observed in the O-state crystal structure in the pentameric form.
The structural change at the opsin followed the retinal isomerization and the energy transfer from the chromophore to the surrounding were also investigated in this thesis using various amino acids labeling schemes. Moreover, 1H-13C hNOE in combination with CE-DNP was applied to probe the dynamics of retinylidene methyl groups and 23Na MAS NMR was employed to detect the bound sodium ion at the protomer interface in KR2 dark state.
Thermoanaerobacter kivui ist ein thermophiles acetogenes Bakterium, das chemolithoautotroph auf CO2 unter Verwendung von molekularem H2 als Elektronendonor wächst und Acetat als Produkt über den Wood-Ljungdahl-Weg (WLP) bildet. Im WLP werden 2 Mol CO2 reduziert, um ein Mol Acetyl-CoA zu bilden. Erste Studien wurden durchgeführt, um die Physiologie von T. kivui zu verstehen. T. kivui wächst autotroph auf H2 + CO2 und nach Adaptation auch auf CO oder Syngas. T. kivui wächst ebenfalls auch in Minimalmedium ohne weitere Zugabe von Vitaminen, was es zu einem Biokatalysator mit hohem Potenzial für die Produktion von Chemikalien mit hohem Mehrwert macht. Heterotroph wächst T. kivui auf Glucose, Fructose, Mannose, Pyruvat oder Formiat. Kürzlich wurde beschrieben, dass T. kivui in der Lage ist, auf dem Zuckeralkohol Mannitol in Gegenwart und Abwesenheit von HCO3- (oder externem CO2) zu wachsen. Allerdings war das Wachstum in Abwesenheit von externem CO2 deutlich verlangsamt. Daher wurde in dieser Studie getestet, ob eine Zugabe von externem Formiat das "fehlende" CO2 kompensieren kann. In Kombination mit Formiat wurde das Wachstum auf Mannitol in CO2 und HCO3- freien definierten Medien bis zu einer maximalen OD600 von 2,34 und mit einer Verdopplungszeit von 2,0 ± 0,0 stimuliert, was dem Wachstumsverhalten auf Mannitol in Anwesenheit von CO2/HCO3- entsprach. In Abwesenheit von Formiat (oder CO2) erreichte T. kivui nur eine endgültige optische Dichte von bis zu 0,7 mit einer verlängerten Verdoppelungszeit von 5,2 ± 0,2 Stunden. Dieses Experiment zeigte die höhe metabolische Flexibilität von T. kivui durch die Nutzung von Formiat als Elektronenakzeptor, wenn kein oder nur wenig CO2 vorhanden ist.
Genomanalysen ergaben, dass T. kivui ein Trehalose- und Maltose-Transportsystem-Permeaseprotein (MalF) besitzt. Darüber hinaus verfügt T. kivui über Trehalose- und Maltosehydrolase-Gene, die als Kojibiose-Phosphorylase annotiert sind. Obwohl in der Originalveröffentlichung beschrieben wurde, dass der Organismus nicht auf Maltose oder Trehalose wachsen kann, konnte T. kivui im Laufe dieser Arbeit an das Wachstum auf Maltose und Trehalose adaptiert werden. Nach dem Transfer von einer Glukose-Vorkultur auf ein Medium mit 25 mM Maltose oder 25 mM Trehalose als alleinige C-Quelle wurde kein Wachstum erzielt. Bei Verwendung der gleichen Vorkultur in einem Medium mit höherer Konzentration (50 mM) Maltose oder Trehalose, begannen die Zellen zu wachsen. Bei Verwendung dieser adaptierten kulturen als Vorkultur wuchsen die Zellen in Gegenwart von in 25 mM Maltose oder Trehalose bis zu einer maximalen OD600 von 1,12 bzw. 0,73. Die Adaptation hing mit der Tatsache zusammen, dass der Organismus eine höhere Konzentration benötigt, um sich an diese Kohlenstoffquellen zu gewöhnen. Durch diese Daten wird das heterotrophe Potenzial von T. kivui erhöht.
Um die Bedeutung der wasserstoffabhängigen Kohlendioxidreduktase (HDCR) während des Wachstums auf Formiat oder auf H2 + CO2 im Stoffwechsel von T. kivui zu verstehen, wurden Studien auf molekularer Ebene durchgeführt. Die HDCR nutzt H2 direkt für die Reduktion von CO2 zu Formiat im ersten Schritt des Wood-Ljungdahl-Wegs (WLP). Um die Rolle der HDCR in dieser Reaktion zu untersuchen, wurde das hdcr-Gencluster mit Hilfe des kürzlich entwickelten Mutagenesytems für T. kivui deletiert. In Wachstumstudien konnte anschliessend gezeigt werden, dass die ߡhdcr-Deletionsmutante nicht mehr auf Formiat oder H2 + CO2 als alleiniger Kohlenstoffquelle wachsen konnte. Nach Komplementation der Mutante mit dem hdcr-Gene in cis wuchsen die Kulture wieder auf Formiat oder H2 + CO2. Diese Experimente zeigten, dass die HDCR für das Wachstum auf H2 + CO2 oder Formiat essentiell ist. Interessanterweise konnte in der ߡhdcr-Mutante ebenfalls ein verändertes Wachstum auf Glukose als alleiniger C-Quelle festgestellt werden. Die T. kivui ߡhdcr-Mutante wuchs nur bis zu einer OD600 von 0,2, während der Wildtyp und der hdcr-komplementierte Stamm bis zu einer OD600 von 2,64 bzw. 2,4 wuchsen. Damit wurde bewiesen, dass die HDCR auch für die vollständige Glukoseoxidation in T. kivui erforderlich ist. Durch die Zugabe von Formiat wurde das Wachstum vollständig wiederhergestellt, ähnlich wie beim Wildtyp. Dies belegt wieder die Nutzung Formiat als terminalen Elektronenakzeptor. Auch auf Mannitol oder Pyruvat konnte die Mutanten nur in Gegenwart von Formiat wachsen. Der Substratverbrauch und die Produktbildung der T. kivui ߡhdcr-Mutante wurden in einem Zellsuspensionsexperiment untersucht. Die Zellen verbrauchten Formiat nur in Gegenwart von Glukose und produzierten Acetat mit einem Acetat/Substrat-Verhältnis von etwas mehr als 3,0, während die Acetatproduktion nur 12 mM betrug, wenn Glukose als alleiniges Substrat verwendet wurde. Diese Ergebnisse zeigen eine enge Kopplung der Oxidation von Multikohlenstoffsubstraten an den WLP.
T. kivui ist eines der wenigen Acetogenen, die CO als einzige Kohlenstoff- und Energiequelle nutzen können. ...
Ziel dieser Arbeit war die Untersuchung, inwieweit sich die Expression bestimmter Oberflächenmerkmale auf Lymphozyten im peripheren Blut nach einer Transplantation im Rahmen der chronischen Abstoßungsreaktion verändert. Dazu wurde ein etabliertes Modell zur chronischen Abstoßung mit zwei sich genetisch nur gering differierenden Rattenspezies verwendet. Dabei wurden Herzen von Lewis-Ratten heterotop auf Fischer 344-Ratten transplantiert. Die Untersuchung wurde vergleichend unter der immunsuppressiven Behandlung von Cyclosporin A (CsA), Tacrolimus (FK-506) und Mycophenolate mofetil (MMF) sowie einer unbehandelten Gruppe durchgeführt. Über den Zeitraum von 60 Tagen wurden die Oberflächenmerkmale mit durchflusszytometrischen Messungen bestimmt.
Aufgrund einer Vielzahl an Patienten mit sekundären Lebertumoren sind aus medizinischen oder technischen Gründen nicht operabel sind, erfahren alternative lokalablative Behandlungsformen in den letzten beiden Jahrzehnten zunehmende Verbreitung.
Das Ziel der hier vorliegenden Studie ist es, das Therapieansprechen und die Sicherheit von Mikrowellen- (MWA) und Radiofrequenzablation (RFA) von Lebermetastasen in einer randomisierten Studie zu bestimmen und prospektiv zu vergleichen.
Es unterzogen sich 50 Patienten (27 Frauen, 23 Männer, mittleres Alter 62,8 Jahre) einer CT-gesteuerten perkutanen thermischen Ablation von 50 Lebermetastasen. Davon erhielten 26 Patienten eine MWA und 24 Patienten eine Behandlung mit RFA. Das kolorektale Karzinom war in 54 % der Fälle ein Primärtumor, das Mammakarzinom in 20 %, das Pankreaskarzinom und das Gallenblasenkarzinom jeweils in 6 %, der Ovarialtumor in 4 %, das Ösophaguskarzinom und andere Tumorentitäten jeweils in 2 % der Fälle. Die Lage der Lebermetastasen und die morphologische Veränderung der Läsionen in Größe, Volumen, nekrotischem Bereich, Diffusion und ADC-Wert wurden durch Magnetresonanztomo-graphie (MRT) bewertet. Die erste MRT-Kontrolle erfolgte vor der Behandlung mit thermischer Ablation. Das Follow-up beinhaltet MRT-Kontrollen 24 Stunden nach der Ablation und 4 Kontrolluntersuchungen im Abstand von 3 Monaten innerhalb von einem Jahr.
50 Läsionen mit einem mittleren Durchmesser von 1,63 cm (Range: 0,6 - 3,7 cm; MWA 1,72 cm, RFA 1,53 cm) wurden mit thermischer Ablation behandelt. Die lokale Rezidivrate innerhalb eines Jahres betrug für beide Versuchsarme 4 % (2/50), 0 % (0/26) in der MWA-Gruppe und 8,3 % (2/24) in der RFA-Gruppe. Die Rate für neu entstandene maligne Formationen, die sich an einem anderen Ort als die behandelte Läsion befanden, betrug in beiden Gruppen etwa 38 % (19/50), in der MWA-Gruppe 38,4 % und in der RFA-Gruppe 37,5 %. Die Sterblichkeitsrate für diese Studie betrug 14,0 %. 15,4 % der Patienten im Behandlungsarm der MWA-Gruppe und 12,5 % im RFA-Behandlungsarm verstarben im Rahmen dieser Studie. Es konnten keine größeren Komplikationen festgestellt werden.
Zusammenfassend zeigt die MIRA-Studie zur thermischen Ablation von Lebermetastasen keine signifikanten Unterschiede in der Mortalität, malignen Neubildungen oder Komplikationsraten zwischen MWA und RFA. Die Studie stellt fest, dass die thermische Behandlung mit MWA im Rahmen des 1-Jahres-Follow-ups größere Volumina im Ablationsgebiet und eine gering höhere Mortalität hervorruft, wobei man die höhere Pankreaskarzinomrate in diesem Studienzweig berücksichtigen sollte. Im RFA-Studienarm wurden hingegen 2 Lokalrezidive erfasst.
Vor dem Hintergrund der hier vorliegenden Ergebnisse und in Zusammenschau mit der aktuellen Literatur sind beide thermischen Verfahren mehrheitlich sicher durchführbare und effektive Methoden zur Behandlung von Patienten mit nicht operablen sekundären Lebermalignomen. Unterschiede zeigen sich in den physikalischen, technischen Voraussetzungen und damit in der Größe der erzeugten Ablations- und Nekrosezonen. Diese spielen vorrangig in der Behandlung von großen und gefäß- sowie gallengangsnahen Läsionen eine differenzierte Rolle. Die Größe und die Heterogenität des Patientenkollektivs in Bezug auf Tumorentität, die unterschiedlichen Vorbehandlungen sowie der Nachbeobachtungszeit-raum von nur 12 Monaten mindern die Aussagekraft der Studie. Um die vorliegenden Ergebnisse zu stützen, sollten weitere Untersuchungen mit einem größe-ren Patientenkollektiv folgen, beispielsweise in Form einer multizentrischen Studie, in welcher differenzierter bezüglich Tumorentität und Vorbehandlungen unterteilt wird.
Mit der vorliegenden Arbeit ist der eindeutige experimentelle Nachweis für die Existenz eines 1997 [Ced97] vorhergesagten, neuartigen Zerfallskanals für Van-der-Waals-gebundene Systeme erbracht worden. Die Untersuchungen wurden an einem Neondimer durchgeführt. Erzeugt man in einem Atom dieses Dimers durch Synchrotronstrahlung eine 2s-Vakanz, so wird diese durch ein 2p-Elektron aufgefüllt. Die hierbei freiwerdende Energie wird an das zweite Atom des Dimers in Form eines virtuellen Photons übertragen und löst dort ein Elektron aus einer äußeren Schale. Untersucht wurde dieser Zerfall namens „Interatomic Coulombic Decay” (ICD) durch Koinzidenzimpulsspektroskopie (COLTRIMS) [Doe00, Ull03, Jah04b]. Der Nachweis der Existenz des Effekts erfolgte dadurch, dass die Summe der Energien der Photofragmente - und im Speziellen des ICD-Elektrons und der beiden im Zerfall entstehenden Ne+-Ionen - eine Konstante ist. Durch die koinzidente Messung der Impulse, der im Zerfall entstehenden Teilchen, konnte hierdurch ICD eindeutig identifiziert werden. Die Übereinstimmung der gemessenen Energiespektren mit aktuellen theoretischen Vorhersagen [Sche04b, Jah04c] ist exzellent. Dadurch, dass das Dimer nach dem IC-Zerfall in einer Coulomb-Explosion fragmentiert, konnten des Weiteren Untersuchungen, wie sie in den letzten Jahren an einfachen Molekülen durchgeführt wurden [Web01, Lan02, Jah02, Web03b, Osi03b, Jah04a], auch am Neondimer erfolgen: Durch die Messung der Ausbreitungsrichtung der ionischen Fragmente des Dimers nach der Coulomb-Explosion wird die räumliche Ausrichtung des Dimers zum Zeitpunkt der Photoionisation bestimmt. Die gemessenen Impulse der emittierten Elektronen können dadurch im Bezug zur Dimerachse dargestellt werden. In dieser Arbeit wurden somit Messungen der Winkelverteilung der 2s-Photoelektronen und des ICD-Elektrons im laborfesten und auch dimerfesten Bezugssystem vorgestellt und mit vorhandenen theoretischen Vorhersagen verglichen. Die Winkelverteilung des Photoelektrons ähnelt stark der Verteilung, die man nach der Photoionisation eines einzelnen Neonatoms erhält und hat somit fast reinen Dipolcharakter. Die Präsenz des zweiten Atoms des Dimers verursacht nur leichte Modulationen, so dass auch die Änderung der Ausrichtung der Dimerachse im Bezug zur Polarisationsrichtung des linear polarisierten Lichtes nur geringe Auswirkungen hat. Durch die koinzidente Messung aller vier nach der Photoionisation entstehenden Teilchen konnte außerdem ein weiterer Doppelionisationsmechanismus des Dimers nachgewiesen werden: Ähnlich wie in einzelnen Atomen [Sam90] gibt es auch in Clustern den TS1-Prozess. Hierbei wird ein 2p-Elektron aus dem einen Atom des Dimers herausgelöst. Es streut dann an einem 2p-Elektron des anderen Atoms, das hierdurch ionisiert wird. Diese etwas andere Form des TS1 im Cluster ist also genau wie ICD ein interatomarer Vorgang. Die Summe der Energien der beiden, in diesem Prozess entstehenden Elektronen hat einen festen Wert von h... − 2 · IP(2p) − KER = 12 eV, so dass dieser Prozess hierdurch im Experiment gefunden werden konnte. Die gemessenen Zwischenwinkel zwischen den beiden Elektronen zeigen des Weiteren genau die für zwei sich abstoßende Teilchen typische Verteilung einer Gauss-Kurve mit einem Maximum bei 180 Grad. Da im Falle von interatomarem TS1 die Potentialkurve der Coulomb-Explosion direkt aus dem Grundzustand populiert wird, konnte im Rahmen der „Reflexion Approximation” die Wahrscheinlichkeitsverteilung der Abstände der beiden Dimeratome experimentell visualisiert werden. Das Betragsquadrat des Kernanteils der Dimergrundzustandswellenfunktion wurde somit direkt vermessen. Die Messungen wurden bei drei verschiedenen Photonenenergien durchgeführt, um die Ergebnisse weiter abzusichern und robuster gegen eventuelle systematische Fehler zu machen. Da kein isotopenreines Neongas im Experiment eingesetzt wurde, konnten genauso Ionisations- und ICD-Ereignisse von isotopischen Dimeren (20Ne22Ne) beobachtet und ausgewertet werden. Die gemessenen Spektren sind innerhalb der Messtoleranzen identisch zu denen für 20Ne2.
Einige Vogelarten verstecken im Herbst Samen, um die Samenverstecke im darauffolgenden Winter wieder auszubeuten. In der vorliegenden Arbeit wurde untersucht, wie sich der Kiefernhäher (Nucifraga columbiana), der Eichelhäher (Garrulus glandarius) und die Sumpfmeise (Parus palustris) beim Schaffen und Ausbeuten ihrer Wintervorräte orientieren. Bei den beiden Häherarten sollte herausgefunden werden, ob der Sonnenkompaß eine Rolle bei der Orientierung spielt, wie schon bei dem Buschblauhäher (WILTSCHKO & BALDA 1989) gezeigt werden konnte. Bei den Sumpfmeisen wurde zum einen untersucht, ob eine experimentelle Veränderung des Erdmagnetfeldes eine Rolle bei der Orientierung spielt. Weiterhin wurde untersucht, ob eine Veränderung der Position von zwei starken Scheinwerfern eine Rolle bei der Orientierung der Meisen spielt. Die Versuche mit Kiefernhähern wurden in Flagstaff (Arizona), die mit Eichelhähern und Sumpfmeisen in Frankfurt am Main durchgeführt. Die Versuche mit Kiefernhähern und Eichelhähern fanden in gleichartigen Volieren unter der natürlichen Sonne statt. Die Vögel durchliefen eine Serie von klassischen Zeitumstellungsversuchen. Die Kiefernhäher wurden darüber hinaus unter verschiedenen Licht- und Schattenverhältnissen getestet. Die Sumpfmeisen wurden in einem Versuchskäfig in einer Holzhütte unter Kunstlichtbedingungen getestet. In einer Versuchsserie wurde die Horizontalkomponete des den Versuchskäfig umgebenden Erdmagnetfeldes um 120° gedreht. In einer weiteren Versuchsserie wurde mit zwei Halogenscheinwerfern gearbeitet, deren Position während der Versuche verändert wurde. Es konnte gezeigt werden, daß sowohl beim Kiefernhäher als auch beim Eichelhäher die Sonne eine entscheidende Rolle bei der Orientierung beim Samenverstecken und der Samensuche spielt. Bei beiden Corvidenarten ist die Sonne hier in einem redundanten, multifaktoriellen System eingebunden wie es auch schon für Zugvögel und Brieftauben nachgewiesen werden konnte. Es gibt Anzeichen dafür, daß Kiefernhäher, die den Tageslauf der Sonne länger nicht mehr mitverfolgen konnten, den Sonnenkompaß erst wieder erlernen müssen. Es konnte gezeigt werden, daß die Genauigkeit, mit der die Kiefernhäher ihre versteckten Samen finden, in mehreren, aufeinander folgenden Versuchen abnimmt. Kiefernhäher besitzen ein komplizierteres Orientierungssystem als der in der Vorstudie (WILTSCHKO & BALDA 1989) untersuchte Buschblauhäher, da sie auch ökologisch mehr auf die versteckten Samen angewiesen sind, als die Buschblauhäher. Desweiteren konnte gezeigt werden, daß Eichelhäher in der Lage sind, die Position von Orten, die ihnen in einer Trainigsphase antrainiert wurde, auch nach einer versuchsfreien Phase von drei Monaten fehlerfrei wiederzufinden. Bei Sumpfmeisen konnte gezeigt werden, daß sie in der Lage sind, sich nichtvisuell zu orientieren. Ob das Erdmagnetfeld hierbei eine Rolle spielt, konnte weder bestätigt noch ausgeschlossen werden. Es konnte gezeigt werden, daß die Position der Halogenscheinwerfer bei der Orientierung der Sumpfmeisen während der Samensuche eine Rolle spielt. Es gelang in dieser Arbeit, die Hypothese zu bestätigen, daß Vögel Kompaßmechanismen nicht nur zur Orientierung während des Vogelzuges oder dem Rückflug zum Nest sondern auch in ihrem unmittelbaren Umgebungsbereich benutzen.
Synthese von modifizierten Nukleotiden und modifizierten Oligodesoxynukleotiden zur DNA-Analytik
(2004)
1.) Entwicklung eines Verfahrens zum Nachweis von Wechselwirkungen zwischen Sondenmolekülen und Targetmolekülen auf einem Sonden-Array Innerhalb des Projektes sollte ein Verfahren entwickelt werden, dass zum Nachweis von Wechselwirkungen zwischen Sondenmolekülen und Targetmolekülen auf Sonden-Arrays genutzt werden kann. Der prinzipielle Aufbau dieses Testsystems wird in der vorliegenden Arbeit beschrieben. Einer der entscheidenden Schritte zur Entwicklung dieses Verfahrens, ist die Einführung einer selektiv spaltbaren Bindung innerhalb der DNA. Die von uns hierfür präferierte Bindung ist die 5´-O-P-S-3´ Bindung. Das erste zu realisierende Ziel bestand damit in der Synthese der entsprechend 5´-Thio-modifizierten Amidite. Die Synthese von 4,4´-Dimethoxytriphenylmethanthiol, als alternative Schwefel-Quelle und gleichzeitig temporäre 5´-Schutzgruppe stellt den Schlüsselschritt der erfolgreichen Synthese dar. Mit Hilfe dieser Strategie gelingt es, die entsprechend benötigten modifizierten Amidite in zufriedenstellender Ausbeute herzustellen. Durch die Anwendung eines modifizierten Synthesezyklus ist die Synthese eines entsprechend Schwefel-modifizierten Modelloligodesoynukleotids möglich. Mit Hilfe dieser Verbindung wurde die erwünschte Spaltung der 5´-O-P-S-3´ Bindung mit Silbernitrat in Lösung und an verschiedenen Oberflächen (Chip, Biacore-Chip und Magnetic Beads) untersucht. 2.) Punktmutationsdetektion durch festphasenvermittelte Single Nucleotide Primer Extension (SNuPE) und MALDI-MS Ziel dieses Projektes war die Entwicklung eines neuen, elektrophoresefreien Verfahrens zur Detektion von bekannten Punktmutationen mittels fester Phase und der MALDI-Massenspektrometrie. Hierfür wird zunächst ein synthetisches Oligodesoxynukleotid, welches später als Primer fungiert, über einen photolytisch spaltbaren Linker an eine feste Phase gebunden. Dessen Oligodesoxynukleotid-Sequenz wird dabei so ausgewählt, daß sie komplementär zur Zielsequenz einer mutierten DNA ist und direkt vor der zu detektierenden Punktmutation endet. Durch eine enzymatische Polymerasereaktion wird der Primer dann um eine Base, die entweder komplementär zur korrekten DNA oder zur Mutation ist, verlängert. Das Reaktionsprodukt kann dann direkt mittels MALDI-MS photolytisch von der festen Phase getrennt und analysiert werden. Die Masse des Reaktionsproduktes ist festgelegt durch den erfolgten Einbau einer von vier Nukleobasen und gibt daher unmittelbar Auskunft über das Vorhandensein einer Punktmutation. Zunächst sollte die prinzipielle Durchführbarkeit des Projekts erarbeitet werden. Wesentliche Vorteile dieser neuen Methode im Vergleich zu bestehenden Verfahren wären der außerordentlich geringe Zeitaufwand und die unmittelbare Detektion ohne Label. Das hier entwickelte Konstrukt gestaltete sich allerdings für die Anwendung als ein Standardanalyseverfahren zu komplex, da für die Detektion von Punktmutationen aussagekräftigere und einfachere Verfahren bereits zur Verfügung stehen, der hier beobachtete Spaltungs-mechanismus wirft jedoch einige Fragen auf. Für einen Einsatz als photolabiles Trägermaterial ist dieses Konstrukt jedoch ebenfalls zu kompliziert. 3.) Verknüpfungsreaktionen von Acetal-geschützten Oligodesoxynukleotiden mit Hydrazin-modifizierten Derivaten Die effektive Konjugation von modifizierten Oligodesoxynukleotiden und Hydrazin-Derivaten durch die Verwendung einer 5´-Acetalfunktion konnte hier durch die Verwendung eines aromatischen Phosphitylierungsreagenz gezeigt werden. Das hergestellte 5´-Acetal-modifizierte Oligodesoxynukleotid fungiert hier als ein maskiertes 5´-Aldehyd. Der Einsatz des maskierten Acetals weist gegenüber dem reaktiven Aldehyd-Derivat mehrere Vorteile auf: es ist lagerstabil, gut handhabbar und stabil gegenüber den Bedingungen der Oligodesoxynukleotid-Synthese. Ein aromatisches Acetal-geschützte Oligodesoxynukleotid kann in einer Eintopfreaktion mit einem entsprechenden Hydrazin-Derivat umgesetzt werden. Das verwendete Hydrazin-Derivat muß jedoch als Hydrochlorid oder als Trifluoracetat eingesetzt werden. Die Reaktion erfolgt in wässriger methanolischer Lösung durch den Zusatz von Natriumacetat, dieses katalysiert die Reaktion. Durch den Einsatz von Methanol als Lösungsmittel kann der Reaktionsansatz direkt mit Hilfe der HPL-Chromatographie gereinigt werden. Die Umsetzung des Acetal-modifizierten Oligodesoxynukleotids wurde mit verschiedenen Hydrazinen durchgeführt. Die mit den Hydrazinen erreichten Ausbeuten übersteigen bei weitem (Ausnahme Biotin) die der entsprechenden Aktivester. Vorallem das Arbeiten in wässriger Lösung erleichtert die Synthese und die Aufreinigung. Hiermit steht eine 5´-Modifikation zur Verfügung, die eine Konjugation mit Hydrazin-Derivaten in sehr guten Ausbeuten ermöglicht.
Diese Arbeit beschäftigt sich mit linearen inversen Problemen, wie sie in einer Vielzahl an Anwendungen auftreten. Diese Probleme zeichnen sich dadurch aus, dass sie typischerweise schlecht gestellt sind, was in erster Linie die Stabilität betrifft. Selbst kleinste Messfehler haben enorme Konsequenzen für die Rekonstruktion der zu bestimmenden Größe.
Um eine robuste Rekonstruktion zu ermöglichen, muss das Problem regularisiert, dass heißt durch eine ganze Familie abgeänderter, stabiler Approximationen ersetzt werden. Die konkrete Wahl aus der Familie, die sogenannte Parameterwahlstrategie, stützt sich dann auf zusätzliche ad hoc Annahmen über den Messfehler. Typischerweise ist dies im deterministischen Fall die Kenntnis einer oberen Schranke an die Norm des Datenfehlers, oder im stochastischen Fall, die Kenntnis der Verteilung des Fehlers, beziehungsweise die Einschränkung auf eine bestimmte Klasse von Verteilungen, zumeist Gaußsche. In der vorliegenden Arbeit wird untersucht, wie sich diese Informationen unter der Annahme der Wiederholbarkeit der Messung gewinnen lassen. Die Daten werden dabei aus mehreren Messungen gemittelt, welche einer beliebigen, unbekannten Verteilung folgen, wobei die zur Lösung des Problems unweigerlich notwendige Fehlerschranke geschätzt wird. Auf Mittelwert und Schätzer wird dann ein klassisches Regularisierungsverfahren angewandt. Als Regularisierungen werden größtenteils Filter-basierte Verfahren behandelt, die sich auf die Spektralzerlegung des Problems stützen. Als Parameterwahlstrategien werden sowohl einfache a priori-Wahlen betrachtet, als auch das Diskrepanzprinzip als adaptives Verfahren. Es wird Konvergenz für unbekannte beliebige Fehlerverteilungen mit endlicher Varianz sowie für Weißes Rauschen (bezüglich allgemeiner Diskretisierungen) nachgewiesen. Schließlich wird noch die Konvergenz des Diskrepanzprinzips für ein stochastisches Gradientenverfahren gezeigt, als erste rigorose Analyse einer adaptiven Stoppregel für ein solches nicht Filter-basiertes Regularisierungsverfahren.
Die vorliegende Untersuchung wurde mit dem Ziel durchgeführt, fördernde und hemmende Einflussfaktoren auf die Entstehung und Durchführung von translationaler Forschung näher bestimmen zu können. Dazu wurden im Verlauf der Forschung sechs Gruppen von möglichen Einflussfaktoren untersucht. Diese waren 1) externe politische, 2) institutsbezogene, 3) soziale (auf soziale Rollen und sozialen Status bezogene), 4) epistemische, 5) forschungskulturelle und 6) individuelle Faktoren.
Translationale Forschung wurde als Spezialform interdisziplinärer Forschung konzeptualisiert. Auch bei dieser wird Wissen aus mehr als einer wissenschaftlichen Disziplin herangezogen, um ein disziplinübergreifendes Problem zu lösen. Das Besondere an der translationalen Forschung ist jedoch, dass zusätzlich mindestens eine der beteiligten Disziplinen grundlagenorientiert und eine andere anwendungsorientiert ist. Der Vorteil besteht darin, dass fortan der Wissensbestand beider Disziplinen kombiniert werden kann. Ein Nachteil ergibt sich daraus, dass die Wissensbestände untereinander nicht ohne Weiteres anschlussfähig sind und eine „Übersetzung“ durch die unterschiedlichen Praxisbezüge der beteiligten Disziplinen erschwert wird. Die translationalen Forschung muss neben dieser noch einer weiteren Herausforderung begegnen: Denn sie gewinnt ihre Erkenntnisse unter Laborbedingungen, wo Umweltfaktoren praktisch keine Rolle spielen. Dadurch lassen sich ihre Ergebnisse nicht unbedingt in die klinische Praxis transferieren. Kurz gesagt: Was im Labor eine bestimmte Wirkung erzielt hat, entfaltet diese Wirkung nicht automatisch am Patienten.
Im Rahmen der Dissertation wurden sechs translationale Forschungsprojekte aus Berlin-Buch aus der Zeit zwischen 1959 und 1989 untersucht. Aufgrund der in der DDR etablierten, staatlichen Überführungspolitik konnte insbesondere der Einfluss externen politischen Drucks auf diese Forschungsprojekte untersucht werden. Als Quellen dienten archivierte Akten, graue Literatur, zur damaligen Zeit publizierte Fachliteratur und Interviews mit Forschern, die damals an diesen Projekten beteiligt waren. Da es an soziologischer Literatur spezifisch zu translationaler Forschung bisher mangelt, wurden mehrere Einzelstudien aus der soziologischen und wissenschaftshistorischen Forschung herangezogen. Die Untersuchungsergebnisse erweitern den Forschungsstand zur interdisziplinären Forschung und zu Praxisbezügen von Forschung.
Die untersuchten Fallstudien zeigen exemplarisch, dass es die von der Staatsführung der DDR gewollten anwendungsorientierten medizinischen Forschungsprojekte auch in Berlin-Buch gegeben hat. Entgegen der Erwartung zeigen sie aber auch, dass translationale Forschung nicht speziell gefördert (mit Ressourcen oder einem besonderen Commitment) wurde und es somit oft vom Zufall abhängig war, ob diese (vorzeitig) beendet wurde oder nicht. Darüber hinaus konnten Anhaltspunkte dafür gefunden werden, dass translationale Forschung im Wesentlichen auf epistemischen (fachlichen) Schnittstellen beruht, die von anwendungsorientierten Biomedizinern meist aus persönlichem Interesse aufgegriffen werden, wenn sie als solche erkannt werden und wenn entsprechende Ressourcen zur Forschung zur Verfügung stehen.
Somit konnte widerlegt werden, dass das so genante „Translationsproblem“ darauf zurückzuführen ist, dass Kliniker und Forscher kein Interesse haben, miteinander zu kommunizieren oder zu forschen. Ein Problem stellt lediglich dar, dass epistemische Schnittstellen meist zufällig (oft als Nebenprodukte von disziplinärer Forschung) sichtbar werden und es an kurzfristig verfügbaren Ressourcen fehlen kann, um diesen nachzugehen. Hinzu kommt der erhöhte Aufwand, der sich durch das Einbeziehen von Forschern aus anderen Disziplinen ergibt und das vergleichsweise hohe Risiko, dass medizinische Anwendungen, die auf translationaler Forschung aufbauen, unter komplexen Umweltbedingungen (am Patienten) nicht mehr die gewünschte Wirkung entfalten. Die untersuchten Fallstudien haben jedoch auch gezeigt, dass translationale Infrastrukturen und regelmäßiges Peer Review Forschern dabei helfen können, Ergebnisse translationaler Forschung auf ihre Tauglichkeit in der Klinik zu prüfen. Das Risiko des Scheiterns lässt sich jedoch nicht vollständig ausschließen.
Stem cells capable of self-renewal and differentiation into multiple tissues are important in medicine to reconstitute the hematopoietic system after myelo-ablative chemo- or radiotherapy. In the present situation, adult stem cells such as Mesenchymal stem cells (MSC) and Hematopoietic stem cells (HSC) are used for therapeutic purposes. For tissue regeneration and tissue constitution, engraftment of transplanted stem cells is a necessary feature. However, in many instances, the transplanted stem cells reach the tissues with low efficiency. Considering the three-step model of leukocyte extravasation by Springer et al, the rolling, adhesion and transmigration form the three major steps for the transplanted stem cells to enter the desired tissues. One of the molecular switches reported to be involved in these mechanisms are the Rho family GTPases. The present study investigates the role of Rho GTPases in adhesion and migration of stem and progenitor cells. Chemotactic and chemokinetic migration assays, transendothelial migration assays, migration of cells under shear stress, microinjection, retroviral and lentiviral gene transfer methods, oligonucleotide microarray analysis and pull down assays were employed in this study for the elucidation of Rho GTPase involvement in migration and adhesion of stem and progenitor cells. The transmigration assay used for the migration determination of the adherent cell type, MSC, was optimized for the efficient and effective assessment of the migrating cells. The involvement of Rho was found to be critical for stem and progenitor cell migration where inactivation of Rho by C2I-C3 transferase toxin and/or overexpression of C3 transferase cDNA increased the migration rate of Hematopoietic progenitor cells (HPC) and MSC. Moreover, modulation of Rho caused predictable cytoskeletal and morphological changes in MSC. Assessment of Rho GTPase involvement in the interacting partner, the endothelial cells during stem cell migration, revealed that active Rho expression induced E-selectin expression. The increased levels of E-selectin were functionally confirmed by the increased adhesion of progenitor cells (HPC) to the Human umbilical vein endothelial cell (HUVEC) layer. Moreover, inhibition of Rac in the migrating endothelial progenitor cells (eEPC) increased their adhesion to HUVEC correlating with the increased percentage expression of cell surface receptor, CD44 in Rac inactivated eEPC. In conclusion, this study shows that Rho GTPases control the adhesion and migration of stem and progenitor cells, HPC and MSC. Rho inhibition drives the cells to migrate in the blood vessels. The substantial increase in the level of active Rho in endothelial layer, manifested by the E-selectin surface expression assists the better adhesion of stem and progenitor cells to the endothelial layer. Serum factors and growth factors in the physiological system influence the Rho GTPase expression in both migrating stem cells and the barrier endothelial cells. Thus, specific modulation of Rho GTPases in the transplanted stem and progenitor cells could be an interesting tool to improve the migration and homing processes of stem cells for cellular therapy in future.
Leben bedeutet eine fortdauernde Anpassung an Umweltbedingungen durch ein hoch entwickeltes Informationsverarbeitungssystem. Diese Anpassung wird durch das neuroendokrine und autonome Nervensystem gewährleistet. Eine tages- und jahreszeitliche Organisation des neuroendokrinen und autonomen Systems findet durch das Photoneuroendokrine System (PNS) statt. Erst in jüngster Zeit konnte gezeigt werden, dass neben peptidergen Substanzen auch lipiderge Signalmoleküle des Endocannabinoidsystems eine essentielle Rolle bei der interzelluären Kommunikation spielen. Hierbei zählen Anandamid (AEA) und 2-Arachidonoylglycerol (2-AG) zu den umfassend erforschten Endocannabinoiden. ...
HINTERGRUND: Die BioPhysio™ (Edwards Lifescience LLC, Irvine, CA) Bioprothese wurde konstruiert um die hämodynamischen Eigenschaften bisher verfügbarer gerüsttragender Aortenklappenprothesen weiter zu verbessern. Ein flexibles Nitinolgerüst, welches die natürlichen Bewegungen der Aortenwurzel während des Herzzyklus zulässt und trotzdem einfach implantiert werden kann, ist die Hauptinnovation dieser Prothese. Das Ziel dieser Studie ist die klinische Evaluation dieser neuen Prothese. METHODEN: Zwischen Dezember 2004 und August 2005 wurden 50 BioPhysio Aortenklappenprothesen implantiert. Das mittlere Alter der Patienten betrug 75,9 ± 5,1 Jahre. Klinische Ergebnisse, Klappenöffnungsflächen, transvalvuläre Gradienten und der Rückgang der Linksventrikelhypertrophie wurden echokardiographisch vor der Entlassung, nach sechs Monaten, zwölf Monaten und 24 Monaten nachuntersucht. ERGEBNISSE: Die Gesamtsterblichkeit betrug 14,3% (n=6), wobei nach zwölf Monaten 9,5% (n=4) und nach 24 Monaten 4,8% (n=2). Alle Todesfälle waren nicht klappenbezogen. Ein Patient erlitt zwei Jahre nach der Operation eine Endokarditis und wurde erneut operiert. Es gab keine Fälle von Herz- oder Nierenversagen. Die Bioprothese zeigte gute hämodynamische Eigenschaften. Eine signifikante Reduktion des mittleren Gradienten auf 15,1 ± 8,3 mmHg konnte erzielt werden. Die mittlere Klappenöffnungsfläche betrug 1,5 ± 0,7 cm² und die mittlere Ejektionsfraktion 60,7 ± 7,2%. Es traten keine Aorteninsuffizienzen auf. Die New York Heart Association Funktionsklasse verbesserte sich bei allen Patienten und es konnte eine signifikante Reduktion des Linksventrikelmasseindex von 185,7 ± 49,6 g/m² festgestellt werden. KONKLUSION: Die klinische Darbietung der neuen BioPhysio Bioprothese ist vergleichbar mit den konventionellen gerüstlosen Herzklappenprothesen. Durch ihr einzigartiges Design ist sie jedoch schneller und einfacher zu implantieren als konventionelle gerüstlose Prothesen.
In dieser Arbeit konnte gezeigt werden, daß die Proteinkinase Akt das
Zellzyklusprotein p21 in Endothelzellen an der Aminosäure Threonin 145
phosphoryliert und auf diese Weise p21 posttranskriptionell reguliert. So führt die Aktabhängige Phosphorylierung zur Aufhebung der PCNA-Bindungsfähigkeit und zu einer Abnahme der Komplexbildung von p21 mit Cdk2 und Cdk4. Dementsprechend reduziert die Akt-Phosphorylierung von p21 an Threonin 145 die Hemmung der Cdk2-Aktivierung durch p21, begünstigt damit die Phosphorylierung von Retinoblastoma-Protein und die Freisetzung des Transkriptionsfaktors E2F. Diese Daten weisen auf einen neuen Signaltransduktionsweg hin, über den Akt die Endothelzellproliferation reguliert.
Außerdem führt die Akt-vermittelte Phosphorylierung von p21 an T145 zur Stabilisierung von p21 gegenüber Caspase-abhängiger Degradation während der pro-apoptotischen Stimulation der Endothelzellen und schützt die Zellen gegenüber der Apoptose-Induktion durch TNFα. Die p21-Phosphorylierung durch Akt stellt dabei einen essentiellen Mechanismus der endothelzellprotektiven Wirkung von Akt dar, denn in Abwesenheit von p21 infolge Antisense-Transfektion vermag die Überexpression von Akt nicht mehr zu einer Senkung der endothelialen Apoptoserate nach TNFα -Stimulation führen.
Die Struktur der innenpolitischen Konflikte in Armenien seit 1988 stand und steht in hohem Maße unter dem Einfluß der geopolitisch schwierigen Lage des Landes. Vor allem in dem Konflikt um BergKarabach manifestiert(e) sich die entscheidende Einengung armenischer außenpolitischer Handlungsoptionen durch äußere Konstellationen.. Jenseits dessen beeinflußt dieser Konflikt auch das Verhältnis der armenischen politischen Akteure zu Rußland als Dritter Macht. Dies galt zunächst in besonderem Maße für die Konflikte zwischen der Kommunistischen Partei Armeniens und dem mainstream im Komitee ''Karabach und auch für die Konflikte innerhalb des Komitees ''Karabach bzw. dessen Nachfolgeorganisation, der AGB: Dem von Nora Dudwick konstatierten ''beeindruckenden Konsens stand die frühe Marginalisierung extrem antisowjetischer Kräfte wie etwa Parujr Hajrikjan ebenso wie die Ausgrenzung moskaufreundlicher armenischer Akteure wie Zorij Balajan oder Sil'va Kaputikjan gegenüber. Der Konflikt zwischen den unterschiedlichen politischen Konzepten, hier subsumiert unter dem Begriffspaar Realpolitik und Identitäts oder Prinzipienpolitik läßt sich gleichsam als Route auf der narrativen Landkarte' von Vernichtung und Gegenwehr verorten. Beide (gegensätzlichen) Entwürfe von Politik, die für sich in Anspruch nehmen, im Dienste des nationalen Interesses zu stehen, begreifen sich jeweils als einzig angemessene Reaktion auf Geschichte, mithin im Kern auf den narrativ verarbeiteten Genozid als Vernichtungserfahrung bzw. die damals für möglich (bzw. eben für unmöglich) gehaltene Gegenwehr. Das Konzept der Gegenwehr gegen erneute Verfolgung und Vernichtung ist somit das prinzipiell vereinende Motiv des armenischen Identitätsentwurfs. Wie jedoch dieser Entwurf unmittelbar in ein konsensuales nationales Interesse und damit in konkrete Politik umgesetzt werden kann, darüber scheiden sich die Meinungen. So steht dem Streben nach realpolitischem Ausgleich mit allen Nachbarn Armeniens ohne Verweis auf die Urheberschaft der Türkei am Genozid 1915, wie ihn die AGB fordert(e), die das Erinnerungsband und die damit verbundene armenische Identität betonende Vorstellung der ARF gegenüber, ohne vorherige Anerkennung des Genozids von 1915 keinen Ausgleich mit der Türkei anstreben zu können oder auch nur zu wollen. All diese internen Auseinandersetzungen um das armenische nationale Interesse fanden vor dem Hintergrund des durch die geopolitische Situation erzeugten Drucks statt, der in Gestalt des Kriegs um BergKarabach auf allen politischen Akteuren lag, und der die Existentialisierung der Wahrnehmung von Handlungsoptionen entscheidend verschärfte. Die tatsächliche Bedrohung von Außen erfuhr dabei eine eklatante Verschärfung durch die narrativen Wahrnehmungsprozesse im Innern, im Verlaufe derer das Motiv der Bedrohung prismatisch konzentriert wurde. Es ist konkret die Frage der Wahrnehmung gleichsam ''objektiver äußerer Strukturen, die die Zwangslage der Armenier nachhaltig verschärft. Auf diese Weise erscheinen in den Augen der Armenier einige Vorschläge zur Beilegung des Karabach Konflikts, wie sie in der Vergangenheit vorgelegt worden waren, eklatant an diesem prinzipiellen Problem vorbeigedacht. Als Beispiel dafür kann der sogenannte ''Goble Plan angesehen werden. Die Tatsache, daß die Ausprägung dessen, welche Handlung als im armenischen Nationalinteresse stehend wahrgenommen wurde, in der Diaspora und in Sowjetarmenien stark unterschiedliche Entwicklungen genommen hat, ließ im postsowjetischen Armenien nach dem Zusammentreffen beider Konzeptionen, prominent vertreten durch die AGB und die ARF, ein explosives Gemisch gegensätzlicher politischer Auffassungen um das Nationalinteresse zusammen mit von beiden Seiten vertretenem Ausschließlichkeitsanspruch entstehen. Hinzu kam, daß ihre Rückkehr nach Armenien die ARF zu einer Partei unter vielen anderen hatte werden lassen. Das jedoch war prinzipiell unvereinbar mit dem ihr eigenen Selbstverständnis, das davon ausging, daß die ARF die Verkörperung der nationalen Aspirationen der Armenier schlechthin sei. Zwar hatte die ARF in der Diaspora eine bestimmende Rolle, doch besaß sie, wie oben gezeigt, keineswegs das Monopol für politische Artikulation unter den Armeniern in der Diaspora. Die politischen Differenzen unter den DiasporaArmeniern fanden ebenfalls Eingang in die Struktur der politischen Auseinandersetzungen in der Republik Armenien: Die ''Situation wird noch dadurch kompliziert, daß alle Ideologien und Spaltungen unter den Armeniern im eigentlichen Armenien reproduziert werden. Die von der ARF favorisierte Option einer Protektion Armeniens durch die Sowjetunion bzw. Rußland als Dritter Macht entsprach, wie oben gezeigt, auch zu weiten Teilen des mainstreams der ersten Stunde der KarabachBewegung, die diese als Unterstützung der perestrojka Gorba!evs begriffen hatte. Zorij Balajan, früh marginalisierter Aktivist der ersten Stunde des Komitees ''Karabach, erwies in diesem Sinne dem Ersten Sekretär der KP der Armenischen SSR von 1976 bis 1988, Karen Demir!jan, seine Reverenz: ''Und doch muß man gerecht sein und einen Menschen nach den Gesetzen seiner Zeit beurteilen. Und Demir!jan nicht zu achten heißt, die eigene Geschichte nicht zu achten. Seit der Suspendierung der Tätigkeiten der ARF im Dezember 1994 haben sich die politischen Konflikte in Armenien erheblich verschärft. Anläßlich der Parlamentswahlen und des Verfassungsreferendums im Sommer 1995 etwa beschrieb der armenische Präsident Levon TerPetrosjan in düsteren Farben die Katastrophe, die seines Erachtens mit einem Wahlsieg der Opposition dem Lande drohen würde, und schloß seine Rede mit den Worten: ''Sie mögen den Eindruck gewinnen, daß ich die Realität in sehr dunklen Farben schildere, aber ich möchte ihnen versichern, daß die Wirklichkeit noch viel dunkler sein kann, noch viel monströser als ich Ihnen heute sagen kann. Wie dem auch sei, ich glaube an Ihre Weisheit, glaube, daß Sie Ihrer Zukunft nicht gleichgültig gegenüberstehen, einer Zukunft, deren Aufbau Ihnen selbst obliegt. Die Existenz unseres Landes, die Sicherheit Ihrer Kinder, alles hängt ab von Ihren Entscheidungen. Und ich bin sicher, daß Sie ein entschiedenes NEIN all jenen Opportunisten und Abenteurern entgegnen, die persönliche Fragen mit dem Blut Ihrer Kinder zu beantworten trachten. Ich bin sicher, daß Sie einstimmig JA zur Verfassung sagen und für den Block Hanrapetutjun' votieren. Ihre Sicherheit, Ihr Wohlstand und der Friede, alles hängt von dieser Entscheidung ab. Auch im Vorfeld der Präsidentschaftswahlen im September 1996 warnte Levon Ter Petrosjan vor ''Faschismus, Tyrannei und Chaos im Falle des Wahlsiegs eines oppositionellen Kandidaten. Im Verlaufe des Jahres 1997 jedoch ließen verschiedene Signale der Konzilianz gegenüber der Opposition den Eindruck entstehen, daß die AGBRegierung und Präsident TerPetrosjan eine konsensualere Politik nach Innen verfolgen würden, möglicherweise auch, um in der Außenpolitik größere Handlungsfähigkeit zu gewinnen. So wurde etwa Robert Ko!arjan, der ehemalige Präsident der nicht anerkannten Republik BergKarabach, zum Premierminister der Republik Armenien, und Suren Zoljan, leitendes Mitglied der oppositionellen WissenschaftlichIndustriellen und Bürgerunion, zum Leiter des renommierten BrjusovInstituts in Erevan ernannt. Ihren Anfang hatte diese Politik des versuchten Ausgleichs mit der Opposition mit der engen Kooperation der armenischen Regierung mit der armenischen Kirche genommen. 1995 wurde der Katholikos von Kilikien zum Katholikos Aller Armenier, Garegin I., gewählt. Der armenische Präsident hatte mit großem Nachdruck die Wahl Garegins unterstützt, obwohl man dem Katholikat von Kilikien eine große Nähe zur ARF nachsagt. Dieser Versuch eines Brückenschlags zu den Teilen der Diaspora, die der armenischen Regierung feindlich gesonnen waren, hat jedoch weder TerPetrosjan, noch dem neugewählten Katholikos ausschließlich Wohlwollen eingebracht. Daß die Spaltung der Diaspora noch lange nicht überwunden ist, zeigte sich dann auch einmal mehr, als Garegin I. gemeinsam mit Papst Johannes Paul II. eine Erklärung unterzeichnete, daß die theologischen Differenzen zwischen beiden Kirchen hinsichtlich der Natur Jesu Christi nicht mehr Gegenstand von Konflikten werden sollten. Für diese Erklärung wurde Garegin I. von hochrangigen armenischen Kirchenvertretern aus der Diaspora heftig angegriffen, die ihm das Recht absprachen, eine solche Erklärung im Namen der armenischen Kirche abzugeben. Die Nagelprobe muß alle Politik der Konsensualisierung oder der Konfrontation jedoch in der KarabachFrage bestehen. Letztlich determiniert der Konflikt um Berg Karabach nach wie vor die armenische Außenpolitik über alle Maßen. So verkündete etwa der ehemalige armenische Außenminister Vahan Papazjan, sollte der Bevölkerung in BergKarabach ein Genozid oder die Deportation drohen, die Republik Armenien zum militärischen Eingreifen in BergKarabach bereit sei. Auf dem OSZEGipfel in Lissabon im Sommer 1997 hatte Levon TerPetrosjan den Versuch unternommen, den Schulterschluß mit der Gesellschaft in Armenien zu schaffen. Hartnäckig weigerte er sich, das Schlußdokument zu unterzeichnen, in dem hinsichtlich des Konflikts um BergKarabach festgehalten werden sollte, daß jede Regelung des Konflikts vom Recht der Republik Azerbajd.an auf territoriale Integrität ausgehen müsse. Mit seiner Weigerung geriet er jedoch unter erheblichen Druck von Seiten der internationalen Gemeinschaft (OSZE, UN, IBRD etc.) wegen dieses ''Rückfalls in die (Sowjet) Zeit, als der Oberste Sowjet Armeniens die Vereinigung BergKarabachs mit Sowjetarmenien beschlossen und damit das Recht der Azerbajd.anischen SSR auf territoriale Integrität verletzt hatte. Lissabon war der Versuch, sich bei der Opposition als harter Verfechter des Rechts BergKarabachs auf Selbstbestimmung zu profilieren. Auch dem außenpolitischen Druck in der Folge von Lissabon mag es geschuldet sein, daß der armenische Präsident im September 1997 eine Pressekonferenz gab, auf der er das von der im KarabachKonflikt vermittelnden Minsker Gruppe der OSZE vorgeschlagene Phasenmodell akzeptierte, bei dem die Tendenz stark in Richtung einer prinzipiellen Akzeptanz azerbajd.anischer zumindest völkerrechtlicher Hoheit über BergKarabach geht. Für dieses ''Einknicken wurde er von zahlreichen armenischen Intellektuellen und ehemaligen Mitstreitern im Komitee ''Karabach scharf kritisiert, die ihm erneut Verrat an den armenischen nationalen Interessen vorwarfen. Für die Opposition ist Levon Ter Petrosjans Schwenk ein Rückfall hinter den Status vom Februar 1988, als der Gebietssowjet von BergKarabach erstmals seinen Wunsch nach Austritt aus dem Staatsverbund Azerbajd.ans bekundet hatte. Mit einem solchen Schritt würden, so die Vorwürfe, alle Pfände, die BergKarabach im Laufe des Krieges gewonnen hätte, die Sicherheit und die Stabilität mit einem Schlag wieder zunichte gemacht. Die innerarmenischen Diskussionen um die KarabachFrage verschärften sich im Winter 1997/98 erneut, als die Minsker Gruppe der OSZE in Gestalt ihres DreierCo Vorsitzes von Frankreich, den U.S.A. und der Rußländischen Föderation um die Zeit des OSZEGipfels in Kopenhagen eine neue Verhandlungsoffensive ankündigte. Hinzu kam, daß die Kompromißbereitschaft Levon TerPetrosjans nicht nur von der innerarmenischen Opposition kritisiert wurde, sondern auch von der karabach armenischen Regierung unter ihrem Präsidenten Arkadij Ghukasjan, der den Ausverkauf karabacher Interessen durch die Regierung Armeniens zu befürchten schien. Damit befindet sich die armenische Regierung und Präsident TerPetrosjan in einer Zwangslage zwischen starkem außenpolitischen Druck in Richtung von Konzessionen in der KarabachFrage, und massivem Druck von Seiten der innerarmenischen Opposition und der karabacharmenischen Regierung, die eine konziliante Haltung vehement ablehnen. Es ist vor allem diese Pattsituation in der KarabachFrage, die alles in allem die Entwicklung regionaler Interaktionsstrukturen behindert, die für den Transkaukasus und damit auch Armenien dringend notwendige Modernisierungspotentiale mit sich brächten und langfristig mit einer Stärkung der Eigenstaatlichkeit einhergingen. Das vorerst letzte Kapitel innerarmenischer Auseinandersetzungen um die KarabachFrage ist die Eskalation der Konflikte innerhalb der AGB. Gegenstand der innerparteilichen Auseinandersetzungen ist wieder das KarabachProblem bzw. die Frage, welche Haltung zu den Kompromißvorschlägen der OSZE in der Konfliktvermittlung einzunehmen sei. Es zeichnet sich hier eine Spaltung in eher kompromißbereite und eher unnachgiebige Kräfte auch in der AGB ab. Es ist vor allem die Heftigkeit, mit der der Konflikt ausgetragen wird, die ein weiteres Mal den Absolutheitsanspruch widerspiegelt, mit dem die unterschiedlichen Entwürfe des vitalen armenischen Nationalinteresses, in dessen Dienst zu stehen, die Antagonisten für sich in Anspruch nehmen, aufeinanderprallen.
Hsp90 ist ein äußerst vielseitiges Protein, welches nicht strikt cytosolisch anzusiedeln ist. Es besitzt eine Vielzahl von Partnerproteinen zu denen stetig neue hinzukommen und deren Interaktionen längst nicht alle hinreichend untersucht und verstanden wurden. Worin der Unterschied in der Funktionalität von Hsp90 in Eukaryoten und HtpG in Prokaryoten besteht, das Hsp90 für Eukaryoten (auch einzellige) derart essentiell werden lässt, ist absolut unklar. Ein möglicher Grund könnte die Beteiligung von Hsp90 an Transportprozessen in und um den Zellkern darstellen. Der Einfluss von Hsp90 auf den Export von 60S rUE aus dem Zellkern konnte manifestiert werden. Die Einwirkung Hsp90 spezifischer Inhibitoren wie Geldanamycin, Radicicol und Novobiocin zeigten deutliche Effekte in den Transportmessungen sowohl in vitro als auch in vivo. Durch Coinjektionen von Novobiocin und Radicicol in die Oocyten von Xenopus laevis ließ sich der Export von 125J markierten 60S rUE aus dem Zellkern gegenüber den Kontrollen deutlich reduzieren. Damit konnte der mittel- oder unmittelbare Zusammenhang zwischen Hsp90 und dem Export von 60S rUE in vivo erneut bewiesen werden. Hsp90 besitzt mehrere potentielle Phosphorylierungsstellen für die Casein Kinase II. Untersuchungen zeigten, dass die Phosphorylierung von Hsp90 den Effekt auf den in vitro Export von 60S rUE aufzuheben vermag. Die Phosphorylierung von Hsp90 durch die CKII könnte somit eine potentielle Regulationsmöglichkeit von Hsp90 darstellen. Die Phosphorylierung von Hsp90 durch die CKII ließ sich durch die Zugabe von Radicicol deutlich reduzieren. Es ist durchaus möglich, dass die potentielle Phosphorylierungsstelle im Bereich der Bindungsstelle von Radicicol am N-Terminus von Hsp90 zu suchen ist, da auch die Phosphorylierung des N-terminalen Fragments über Radicicol beeinflusst werden konnte. Über Quervernetzungsversuche zwischen Hsp90 und isolierten Zellkernen, konnten Proteine der Kernmembran spezifisch markiert werden. Aufgrund der äußerst geringen Proteinausbeute war eine Analyse sehr schwierig. Lediglich eine Proteinbande konnte schließlich partiell N-terminal ansequenziert werden. Die ermittelten Sequenzen deuten auf ein zu scNup57p homologes Protein der Ratte hin, welches bisher jedoch noch nicht über eine der Proteindatenbanken ermittelbar ist. Transmissionselektronenmikrokopische Aufnahmen von isolierten Rattenleberzellkernen, welche mit einem Anti-Hsp90 Antikörper inkubiert wurden, konnten zeigen, dass Hsp90 neben Komponenten im Bereich des Kernporenkomplex auch an Bestandteile im Nukleoplasma bindet. Da aufgrund der in vitro Messungen bisher ein rein cytosolische Effekt von Hsp90 in Bezug auf den Export von 60S rUE vermutet wurde, könnte dieser Befund nahe legen, dass die Einflussnahme von Hsp90 auf den Transport von 60S rUE wesentlich früher bereits im Nukleoplasma oder in den Nukleoli einsetzen könnte. Wenn dies der Fall ist, könnte Hsp90 auch im Zusammenhang mit den ribosomalen Untereinheiten eine Begleiterfunktion zukommen, welche den Transport vom Ort der Biosynthese bis an die spätere Wirkungsstätte unter Aufrechterhaltung der Funktion gewährleistet. Hierfür könnte auch sprechen, dass Hsp90 mit den 60S rUE interagiert, wie es in Copräzipitationsversuchen gezeigt wurde. Zudem konnte Hsp90 gezielt über proteinäre Bestandteile im Transport befindlicher 60S rUE radioaktiv markiert werden. Es spricht demnach vieles dafür, dass Hsp90 unmittelbar in den Transportprozess der großen ribosomalen Untereinheiten eingreift, und hierbei der Effekt nicht lediglich in der Unterstützung bei der Translokation zu suchen wäre, sondern eventuell schon sehr viel früher im inneren des Nukleoplasmas.
Das Stapelrecht in Mainz
(1925)
The lung comprises more than 40 different cell types, from epithelial cells to resident mesenchymal cells. These cells arise from the foregut endoderm and differentiate into specialized cell types that form the respiratory and conducting airways, and the trachea. However, the molecular pathways underlying these differentiation processes are poorly understood, and may be relevant to pathological conditions. According to the World Health Organization (WHO), while the respiratory disease rate is increasing, limited treatment and therapies are available. Thus, there is a growing need for new treatment strategies and alternative therapies. Various in vivo and in vitro studies in the model organism mus musculus have already provided valuable information on lung cell lineages and their differentiation and/ or dedifferentiation during development and pathological conditions. However, there remain many questions regarding the key regulators and molecular machinery driving lung cell differentiation and underlying lung progenitor/stem cell biology.
Aiming to develop new animal models for lung diseases, we used a forward genetic careening approach, which provides an unbiased method for identifying genes with important roles in lung cell differentiation, and thus probable contributors to pathological conditions. We conducted an N-ethyl-N-nitrosourea (ENU) mutagenesis screen in mice and used several histological and immunohistochemical approaches to identify and isolate mutants, focusing on mutations associated with cell differentiation rather than those affecting early development and patterning of the respiratory system. Thus, we screened for phenotypes in the respiratory system of pups from the F2 generation at postnatal day 7 and 0 (P7; P0). I specifically screened 114 families. Each F1 male animal is the founder of 5 to 6 F2 female daughters. For each family, at least 4 F2 females per male founder were analyzed. In total, I screened 630 litters at P7 and P0 with 7 pups on average for each litter. As a result of this extensive screening, 11 different phenotypes in 42 different F2s were discovered at primary screen and later just 2 phenotypes recovered in F3 generation of identified carriers. To identify the causative genes for each of these phenotypes, whole exome sequencing will be conducted in the future to identify recurring SNPs; these can subsequently be linked causatively to the resultant phenotype(s) via complementation studies. In turn, these linkages would enable the creation of mutant mice using CRISPR/Cas9 genomic engineering, which would be invaluable to the further study of respiratory development and disease.
This thesis investigates the structure of research articles in the field of Computational Linguistics with the goal of establishing that a set of distinctive linguistic features is associated with each section type. The empirical results of the study are derived from the quantitative and qualitative evaluation of research articles from the ACL Anthology Corpus. More than 20,000 articles were analyzed for the purpose of retrieving the target section types and extracting the predefined set of linguistic features from them. Approximately 1,100 articles were found to contain all of the following five section types: abstract, introduction, related work, discussion, and conclusion. These were chosen for the purpose of comparing the frequency of occurrence of the linguistic features across the section types. Making use of frameworks for Natural Language Processing, the Stanford CoreNLP Module, and the Python library SpaCy, as well as scripts created by the author, the frequency scores of the features were retrieved and analyzed with state-of-the-art statistical techniques.
The results show that each section type possesses an individual profile of linguistic features which are associated with it more or less strongly. These section-feature associations are shown to be derivable from the hypothesized purpose of each section type.
Overall, the findings reported in this thesis provide insights into the writing strategies that authors employ so that the overall goal of the research paper is achieved.
The results of the thesis can find implementation in new state-of-the-art applications that assist academic writing and its evaluation in a way that provides the user with a more sophisticated, empirically based feedback on the relationship between linguistic mechanisms and text type. In addition, the potential of the identification of text-type specific linguistic characteristics (a text-feature mapping) can contribute to the development of more robust language-based models for disinformation detection.
The endocannabinoids (EC), their synthetizing and metabolizing enzymes, and the cannabinoid (CB) receptors comprise the endocannabinoid system (ECS) that has been detected by Yasuo et al. (2010) in rodent and human brain areas essential for circadian rhythmic control and hormone secretion. The EC are secreted in the pars tuberalis formation (PT) of the pituitary gland and unfold their effect as ligands on cannabinoid receptors type 1 (CB1) in the pars distalis (PD). The CB1 is mostly expressed on folliculo-stellate (fs) cells of the PD. The fs cells execute regulative and supportive functions to adjacent hormone-producing cells (Allaerts and Venkelecom, 2005; Mitsuishi et al., 2013). The lipid and calcium binding protein Annexin A1 (Anx A1) and the cell membrane permeable compound nitric oxide (NO) have been detected in the fs cells (Woods et al., 1990; Devnath and Inoue, 2008). There are published findings indicating strong influence of Anx A1 and NO on hormone production (Taylor et al. 1993; Venkelecom et al, 1997). The hypothesis of this study is that the EC influence hormonal secretion by acting upon CB1 receptors on fs cells and thus activating or inhibiting Anx A1 and NO that directly affect adjacent glandular cells.
Prevalently cell models were used to carry out the experimental work. The TtT/GF and Tpit/F1 cell lines represent the fs cells, the AtT20/D16v stand for the ACTH-producing corticotroph (C) cells, and GH4C1 for the PRL-producing lactotroph (L) cells. Whenever comparison with an integrity model was possible tissue from C3H mice was used. Chemoluminescent and photometrical detection, enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA), fluorescence-activated cell sorting (FACS), immunoblot (IB), immunocyto- and immunohisto-chemical analysis (ICC, IHC), in situ hybridization (ISH), and (q) PCR methods were used as assaying tools to investigate CB1, Anx A1, the Anx A1 receptor - Fpr-rs1, NO, ACTH, and PRL.
CB1 was detected on the fs, C, and L cell models. The presence of fatty acid amide hydrolase (FAAH, an EC degrading enzyme) was confirmed in the fs cells. Incubations of the fs cells with CB1 agonists (2-AG, AEA, WIN) and antagonist (otenabant) were performed and resulting increase of Anx A1, and inhibition of NO were detected. Anx A1 binding sites, known as formyl peptide like receptor – related sequence 1 (Fpr-rs1) were identified on the C and L cells. The hormone-producing cells were treated with a 2-AG, Anx A1, and NO and the resulting changes in the levels of ACTH and PRL were detected. Anx A1 acted stimulatory on ACTH in the C AtT20/D16v cell and inhibitory on PRL in the L GH4C1 cell. NO inhibited both ACTH and PRL release. Additional analysis of the levels of expression of mRNA for Anx A1 and Fpr-rs1 in murine PD tissue demonstrated that while the expression of the first was not influenced by time, the expression of the latter was activated during the subjective day.
The here presented study shows that EC influence the ACTH release stimulatory through activating Anx A1 and inhibiting NO. As for PRL, the EC unfold an inhibition through activating Anx A1, and stimulation through inhibiting NO. A clear regulatory linkeage between the EC and ACTH and PRL control is revealed, involving the fs cells with possible time-dependence.
The thesis is devoted to the study of the Antarctic polar vortex, mainly by analyzing data collected during APE-GAIA (1999) and ASHOE (1994) campaigns and recorded by the ADEOS satellite (1996-1997), and to improvement of the chromato-graphic processing schemes. A general introduction and overview of the campaigns and instruments relevant to the present work are given in Chapters 1 and 2. A relatively large part of the thesis (Chapters 3-5) is on improvement of the analysis of raw chromatographic data recorded during in-flight measurements of the trace gases. A Gaussian non-straight-base-line method, i.e. the Gaussian processing scheme (Chapter 3), is developed for better evaluation of the chromatographic peak size. Furthermore, a statistical cross-correlation method (Chapter 5) based on statistical behaviour of the whole chromatogram series fNchrg recorded, e.g., during a research flight or laboratory calibration, is developed and applied to measure the low-concentration trace gases. As demonstrated for HAGAR's chromatograms (HAGAR - High Altitude Gas Analyzer), the combination of the Gaussian fitting scheme for individual chromatograms and the statistical cross-correlation method for a series of subsequent chromatograms considerably improves and stabilizes quantitative analysis of in-flight chromatographic data. In this case, the detection accuracy of weak and noisy chromatographic signals can be improved by up to 40 %. A particular attention is paid to the in-flight two-standard calibration method. For this method, a special procedure, that allows to evaluate and effectively remove a weak background chromatographic signal associated with residual molecules in the carrier gas N2, is proposed and coded (Chapter 4). The developed approaches and methods are completely automized and, therefore, can be used for processing of in-flight chromatograms of recent and future field campaigns. The main part of the thesis (Chapters 6-8) deals with a two-dimensional quasi-Lagrangian coordinate system ... , based on a long-lived stratospheric trace gas i, and its systematic use for i = N2O in order to describe the structure of a well-developed Antarctic polar vortex, linearization and compactization of the tracer-tracer correlations in the polar vortex core (i.e. the stratospheric dynamics in this area), and the differential ozone losses in the Antarctic polar vortex area. In the coordinate system ... (...-method, Chapter 6), which refers to a well-developed polar vortex, the mixing ratio Âi is the vertical coordinate and ... = .... i is the reference profile in the vortex core) is the meridional coordinate. The quasi-Lagrangian coordinates ... are much more long-lived comparing with the standard quasi-isentropic coordinates, potential temperature ... and equivalent latitude ..e, do not require explicit reference to geographic space, and therefore well-suited for studying the dynamics of the Antarctic polar vortex and the relevant ozone loss processes. By using the introduced coordinate system ... to analyze the well-developed Antarctic vortex investigated in the APE-GAIA campaign, it is shown, in concurrence with the conclusion of A. M. Lee et al. (2001), that the Antarctic vortex area can be described in terms of the well-mixed and well-isolated vortex core, relatively wide vortex boundary region and adjoining surf zone. In this case, the reference profile ... i , which is compact in a well-developed and isolated polar vortex core [J. B. Greenblatt et al. (2002)], can be found by combining airborne (and/or balloon) data with high-altitude satellite measurements. A criterion, which uses the local in-situ measurements of Âi = Âi(£) and attributes the inner vortex edge to a rapid change (±-step) in the meridional pro¯le of the mixing ratio..., is developed in Chapter 6 to determine the (Antarctic) inner vortex edge. In turn, the outer vortex edge of a well-developed Antarctic vortex is proposed to attribute to the position of a local maximum of ...H2O in the polar vortex area. For a well-developed Antarctic vortex, the ...-parametrization of tracer-tracer correlations allows to distinguish the tracer-tracer inter-relationships in the vortex core, vortex boundary region and surf zone (Chapter 7). This is clearly illustrated by analyzing the tracer-tracer relationships Âi ¡ ÂN2O obtained from the in-situ data of the APE-GAIA campaign for i = CFCl3 (CFC-11), CF2Cl2 (CFC-12), CBrClF2 (H-1211) and SF6. The solitary anomalous points in the ...CFC11 ¡ ÂN2O correlation, observed in the Antarctic vortex core during the APE-GAIA and ASHOE campaigns, are interpreted in terms of small-scale localized differential descent. As detailed in Chapter 8, the quasi-Lagrangian coordinate system fÂN2O; ¢ÂN2Og is an effective tool for evaluation of the differential ozone losses in the polar vortex area. With this purpose, a two-parametric reference function ...O3 = F(...), which characterizes the unperturbed O3 distribution in the early winter polar vortex area, is introduced to separate and quantify in terms of the meridional coordinate ...2O the differential ozone losses in the vortex core and vortex boundary region. The method is applied to analyze the ozone depletion in the Antarctic stratosphere during the austral spring 1999 (APE-GAIA campaign). In Chapter 9, the main results of the thesis are summarized.
The main contribution of the thesis is in helping to understand which software system parameters mostly affect the performance of Big Data Platforms under realistic workloads. In detail, the main research contributions of the thesis are:
1. Definition of the new concept of heterogeneity for Big Data Architectures (Chapter 2);
2. Investigation of the performance of Big Data systems (e.g. Hadoop) in virtualized environments (Section 3.1);
3. Investigation of the performance of NoSQL databases versus Hadoop distributions (Section 3.2);
4. Execution and evaluation of the TPCx-HS benchmark (Section 3.3);
5. Evaluation and comparison of Hive and Spark SQL engines using benchmark queries (Section 3.4);
6. Evaluation of the impact of compression techniques on SQL-on-Hadoop engine performance (Section 3.5);
7. Extensions of the standardized Big Data benchmark BigBench (TPCx-BB)(Section 4.1 and 4.3);
8. Definition of a new benchmark, called ABench (Big Data Architecture Stack Benchmark), that takes into account the heterogeneity of Big Data architectures (Section 4.5).
The thesis is an attempt to re-define system benchmarking taking into account the new requirements posed by the Big Data applications. With the explosion of Artificial Intelligence (AI) and new hardware computing power, this is a first step towards a more holistic approach to benchmarking.
R-Flurbiprofen wird als das „inaktive“ Isomer des NSAIDs Flurbiprofen angesehen, weil es in vitro die Cyclooxygenase-Aktivität in therapeutischen Konzentrationen nicht hemmt. Dennoch zeigte sich, dass R-Flurbiprofen antinozizeptive und antikanzerogene Effekte hervorruft, obwohl das R-Enantiomer bei Ratte und Mensch nur marginal zum S-Enantiomer epimerisiert wird. Um diese Effekte näher untersuchen zu können, wurden sowohl in vivo als auch molekularbiologische Experimente durchgeführt: R- und S-Flurbiprofen wurden intraperitoneal in den Do sierungen 1, 3, 9 mg/kg und Dexamethason (Kontrolle) in einer intraperitonealen Dosis von 0.5 mg/kg Ratten verabreicht. Die Effekte von R- und S-Flurbiprofen und Dexamethason wurden in der Zymosan-induzierten Hinterpfotenentzündung im Vergleich zu Vehikel untersucht. Die Gruppengröße umfasste 3 – 6 Ratten pro Behandlung. Außerdem wurden Gewebeproben aus der entzündeten Pfote und dem Rückenmark auf eine PGE2-Freisetzung, Expression von COX mRNA und COX Protein hin untersucht. Weiterhin wurde die Hemmung der Aktivierung von Transkriptionsfaktoren (NFkB und AP-1) in RAW 264.7 Mausmakrophagen gemessen. R-Flurbiprofen zeigte in der Zymosan-induzierten Hinterpfotenentzündung der Ratte eine ähnliche antiinflammatorische Aktivität wie Dexamethason. Dieser beobachtete Effekt läßt sich zumindest teilweise über eine Hemmung der NFkB Aktivität erklären. R-Flurbiprofen hemmte: 1.) die LPS-induzierte NFkB DNA-Bindungsaktivität in RAW 264.7 Makrophagen, 2.) die Translokation der p65 Untereinheit in den Kern dieser Zellen und 3.) die Zymosan induzierte NFkB abhängige Gentranskription in der entzündeten Pfote und dem Rückenmark von Ratten. S-Flurbiprofen zeigte ähnliche Effekte, war jedoch weniger potent. R-Flurbiprofen hemmte ebenfalls die DNA Bindungsaktivität von AP-1, einem anderen wichtigen Transkriptionsfaktor bei Entzündungsprozessen. Da R-Flurbiprofen eine wesentlich geringere gastrointestinale Toxizität aufweist, lässt es sich möglicherweise als antiinflammatorische Substanz bei Erkrankungen einsetzen, in der die vermehrte oder konstitutive NFkB und AP-1 Aktivierung an pathophysiologischen Prozessen beteiligt ist. Zusammengefasst lässt sich der antiinflammatorische Effekt von R-Flurbiprofen über eine verminderte COX-2 Expression und eine Hemmung der Aktivierung der Transkriptions faktoren NFkB und AP-1 erklären.
The number of multilingual texts in the World Wide Web (WWW) is increasing dramatically and a multilingual economic zone like the European Union (EU) requires the availability of multilingual Natural Language Processing (NLP) tools. Due to a rapid development of NLP tools, many lexical, syntactic, semantic and other linguistic features have been used in different NLP applications. However, there are some situations where these features can not be used due the application type or unavailability of NLP resources for some of the languages. That is why an application that is intended to handle multilingual texts must have features that are not dependent on a particular language and specific linguistic tools. In this thesis, we will focus on two such applications: text readability and source and translation classification.
In this thesis, we provide 18 features that are not only suitable for both applications, but are also language and linguistic tools independent. In order to build a readability classifier, we use texts from three different languages: English, German and Bangla. Our proposed features achieve a classification accuracy that is comparable with a classifier using 40 linguistic features. The readability classifier achieves a classification F-score of 74.21% on the English Wikipedia corpus, an F-score of 75.47% on the English textbook corpus, an F-score of 86.46% on the Bangla textbook corpus and an F-score of 86.26% on the German GEO/GEOLino corpus.
We used more than two million sentence pairs from 21 European languages in order to build the source and translation classifier. The classifier using the same eighteen features achieves a classification accuracy of 86.63%. We also used the same features to build a classifier that classifies translated texts based on their origin. The classifier achieves classification accuracy of 75% for texts from 10 European languages. In this thesis, we also provide four different corpora, three for text readability analysis and one for corpus based translation studies.
In der vorliegenden Studie wurde der modulierende Einfluss von Acetylcholin auf die Frequenzabstimmung der Neurone im primären Hörkortex untersucht. Im primären Hörkortex von betäubten Wüstenrennmäusen (Meriones unguiculatus) wurden Einzel- und Mehrzellableitungen in Elektrodenpenetrationen senkrecht zur Kortexoberfläche durchgeführt und die Antworteigenschaften der Neurone vor und während der iontophoretischen Applikation von Acetylcholin, dem Agonisten Carbachol bzw. dem muskarinischen Antagonisten Atropin gemessen. Bei rund der Hälfte der gemessenen Neurone konnte ein cholinerger Einfluss auf die Frequenz-Antwortbereiche gemessen werden. Dabei können sich die Frequenz-Antwortbereiche unter dem Einfluss von Acetylcholin sowohl vergrößern als auch verkleinern, so dass für die gesamte Neuronenpopulation keine signifikante gerichtete Veränderung auftrat. Bereits bei den niedrigsten verwendeten Dosen von Acetylcholin waren maximale Effekte zu beobachten. Cholinerge Einflüsse in Form von Veränderungen der Frequenz-Abstimmkurven von Neuronen konnten in allen kortikalen Schichten gemessen werden. Im zweiten Teil der vorliegenden Arbeit werden die neuronalen Antworten auf repetitive Schallereignisse, d.h. einfache zeitliche Muster, beschrieben. Für die Versuche wurden drei unterschiedlich zeitlich strukturierte Reize ausgewählt. Es handelte sich um sinusamplituden-modulierte (SAM) Reize, sowie repetitive Ton- und Rauschpulse. SAM Reize und repetitive Tonpulse ähnelten sich in ihrem Frequenzgehalt. Die repetitiven Ton- und Rauschpulse wiesen ein identisches zeitliches Muster auf, das sich von SAM Reizen unterschied. Es wurden sowohl die Wiederholfrequenzen, als auch an der besten Wiederholfrequenz die Schalldruckpegel systematisch verändert. Zusätzlich erfolgte die iontophoretische Applikation von Bicucullin (BIC), um den möglichen Einfluss schneller GABAerger Inhibition zu ermitteln. Während die neuronale Aktivitätsrate mit höheren Wiederholfrequenzen annähernd konstant blieb, war die Stärke der zeitlichen Synchronisation der neuronalen Aktivität von der jeweiligen Wiederholfrequenz des repetitiven Reizes abhängig. Die zeitliche Synchronisation der neuronalen Aktivität sank in der Mehrheit der Neurone mit steigender Wiederholfrequenz drastisch ab (Tiefpasscharakteristik) und nur in einem Bruchteil der Neurone fanden sich einzelne Wiederholfrequenzen, die eine maximale Synchronisation auslösten (Bandpasscharakteristik). Die kortikalen Neurone zeigten unabhängig vom benutzten Reiztyp ein gutes neuronales Folgeverhalten auf repetitive Schallreize bis zu Wiederholfrequenzen von 15 – 30 Hz, mit besten Wiederholfrequenzen von 5 -10 Hz. Unter dem Einfluss von BIC war eine deutliche Veränderung der neuronalen Aktivitätsrate zu erkennen. Diese hatte jedoch weder einen Effekt auf die Synchronizität, noch auf die Repräsentation der Reiztypen. Eine einfache Inhibition im auditorischen Kortex fällt damit als Erklärung für die gemessenen neuronalen Aktivitätsmuster aus. In der realen Umwelt können komplexe akustische Reize in sehr unterschiedlichen Schallintensitäten auftreten. Die reizsynchronisierte neuronale Aktivität erlaubt, ein zeitliches Muster innerhalb eines komplexen Reizes zu kodieren. Es wurde untersucht, inwieweit diese zeitliche Kodierung von der Schallintensität abhängt und inwieweit schnelle GABAerge Inhibition darauf einwirkt. Es fand sich kein Zusammenhang zwischen der allgemeinen neuronalen Aktivitätsrate oder der neuronalen Synchronizität in Abhängigkeit vom Schalldruckpegel. Allerdings konnte bei verschiedenen Neuronenpopulationen ein unterschiedliches Verhalten in der Synchronisation mit höheren Schalldruckpegeln bei Stimulation der Neurone mit SAM Reizen und repetitiven Tonpulsen festgestellt werden, das im Hinblick auf die sich verändernde Flankensteilheit bei höheren Schalldruckpegeln und den daraus resultierenden veränderten Interstimulusintervallen diskutiert wird. Die Ergebnisse aus den Experimenten mit BIC und variierenden Schalldruckpegeln zeigten im Mittel keinen Einfluss der kortikalen Inhibition auf die Abhängigkeit der neuronalen Aktivitätsrate und der Synchronisation vom Schalldruckpegel. Allerdings fanden sich im Einzelfall Änderungen in der Synchronisation auf SAM Reize unter BIC. Insgesamt scheint der Einfluss der kortikalen Inhibition auf Veränderungen der neuronalen Antwort im Zusammenhang mit variierenden Schalldruckpegeln gering bzw. nicht vorhanden zu sein.
Mit der Identifizierung des Histamin-H3-Rezeptorsubtyps im Jahr 1983 begann eine umfangreiche Erforschung seiner Bedeutung und die Suche nach spezifischen Liganden. Die genaue Sequenzaufklärung und Klonierung des humanen Histamin-H3-Rezeptors (hH3R) erst 16 Jahre später ermöglichte eine detaillierte Aufklärung molekularer Vorgänge, deren Auswirkungen auf physiologische und pathophysiologische Prozesse sowie die Entwicklung selektiver hH3R-Liganden. Es zeigte sich, dass der Rezeptor nicht nur die zentrale und periphere Histaminkonzentration im Körper reguliert, sondern auch die Ausschüttung weiterer Neurotransmitter moduliert und damit Einfluss auf zahlreiche neurologische Prozesse nimmt. Diese Erkenntnis macht ihn zu einer wichtigen Zielstruktur bei der Erforschung neuer Therapieansätze verschiedener Erkrankungen des zentralen Nervensystems wie Demenz, Schizophrenie, Narkolepsie, Epilepsie, Adipositas oder neuropatischer Schmerz. Obwohl bereits mehrere Liganden bekannt sind, die diesen Rezeptor adressieren, stellt die Entdeckung alternativer Leitstrukturen und neuer Strukturklassen ein wichtiges Ziel für die Entwicklung potentieller Wirkstoffe dar. Auch das Defizit an bildgebenden Liganden und deren stetig wachsende Nachfrage für eine effiziente Wirkstoffentwicklung und eine detaillierte Rezeptoraufklärung machen den Bedarf an neuen hochselektiven hH3R-Liganden deutlich. Ausgehend von der im eigenen Arbeitskreis etablierten antagonistisch/invers agonistisch selektiv wirkenden 1-(3-Phenoxypropyl)piperidin-hH3R-Leitstruktur wurden zunächst rechtsseitige Strukturerweiterungen in para-Position des zentralen Phenylringes durchgeführt (Abb. 4.1). Hauptbestandteile dieser Substituenten waren basische Strukturelemente oder Heterozyklen mit starker Wasserstoffbrücken-Akzeptorfunktion...
In der vorliegenden Arbeit wurden 12 Biopsien von ALS Patienten qualitativ und quantitativ beurteilt. Nur ein Teil der Patienten wies klinisch Sensibilitätsstörungen auf, Patienten mit Erkrankungen, die bekanntermassen polyneuropathische Schädigungen verursachen können, wurden ausgeschlossen. Es zeigte sich, dass einige der Biopsien (9 von 12 Fällen) qualitative und quantitative Veränderungen aufwiesen, die sich als primär neuronale und/oder axonale Schädigungen interpretieren lassen. In 3 von 12 Fällen fand sich quantitativ ein Normalbefund, bei 2 von diesen 3 Fällen auch qualitativ. Die typischerweise bimodalen Faserdurchmesserhistogramme der myelinisierten Fasern waren nach links verschoben. Diese Verschiebung war am ersten Gipfel deutlicher ausgeprägt als am zweiten Gipfel. Die grössten Fasern fehlten oftmals. Auch die als insgesamt noch normal befundete 3 Biopsien von ALS Patienten hatten, den ersten Gipfel betreffend, Veränderungen, die in die gleiche Richtung gingen, sich jedoch statistisch nicht signifikant von den Kontrollen unterschieden. Die Verteilung der Axondurchmesser ist, wenn auch weniger ausgeprägt, ebenfalls nach links verschoben. Die Befunde, mit besonderer Berücksichtigung der auffallenden Veränderungen an den kleinen Fasern, sprechen für ein vermehrtes Vorkommen von Regeneraten und remyelinisierten Fasern, evtl. in Kombination mit axonaler Atrophie. Es ergeben sich im Vergleich mit den dazu veröffentlichten, z. T. untereinander divergierenden Daten von sechs Arbeitsgruppen einige Übereinstimmungen. Dadurch wird deutlich, dass es sich bei den Veränderungen am N. suralis bei ALS um einen Prozess mit axonaler Atrophie, konsekutiver Bildung von Regeneraten und sekundärer De- und Remyelinisierung handelt. Unterschiede zwischen den verschiedenen Studien bestehen in der Beurteilung des Anteils an Regeneraten und Remyelinisierungen an den kleinen Fasern und damit welchen Anteil axonale Veränderungen gegenüber der Neuronopathie an der Ätiologie der ALS haben. Die vorliegenden Ergebnisse betonen die axonale Komponente der Erkrankung. Eine Beteiligung des sensiblen N. suralis am pathologischen Prozess bei ALS konnte somit in den meisten Fällen (9 von 12 Fällen) nachgewiesen werden. Die pathologischen Veränderungen unterscheiden sich qualitativ nicht von den in autoptischen Studien gefundenen Veränderungen im motorischen System; sie sind jedoch viel milder ausgeprägt. Es kann somit davon ausgegangen werden, dass die Veränderungen des N. suralis bei ALS frühere pathomorphologische Krankheitsstadien repräsentiere, als die im motorischen System gefundenen. Da der N. suralis zu diagnostischen Zwecken entnommen wird, sind diese Ergebnisse auch von diagnostischer und differentialdiagnostischer Relevanz, insbesondere in der Abgrenzung zu den Polyneuropathien.
The role of the Ca2+-dependent protease calpain in the diabetes-associated platelet hyperreactivity
(2012)
Platelets from diabetic patients are characterised by hyperreactivity resulting in exaggerated adhesion, aggregation and thrombus formation which contribute to the development of cardiovascular complications known to be one of the main causes of diabetes-related mortality. One of the mechanisms suggested to be involved in the diabetes-related platelet hyperactivation is the increased [Ca2+]i which leads to the overactivation of Ca2+-dependent proteases, the calpains. Among the calpain isoforms expressed in platelets the two ubquitiously expressed μ- and m-calpain are thought to play an important role in physiological and pathophysiological processes. Particularly μ-calpain is known to be involved in many steps of physiological platelet activation such as aggregation, adhesion, secretion, and signalling. However, we could show that diabetes was associated with an enhanced activation of both μ- and m-calpain in platelets
In the first part of the study we focussed on the characterization of the molecular mechanism regulating calpain activity. Indeed, although Ca2+ is considered to be the main regulator of the proteolytic activity of the conventional calpains, other mechanisms such as the presence of phospholipids and phosphorylation have been reported to affect their activity. Since most studies reported the phosphorylation of m-calpain we were interested to see whether μ-calpain activity might be also affected by phosphorylation. We could show that the activity of μ-calpain was enhanced by the PKC activator PMA suggesting its possible regulation by phosphorylation. However, whether PKC directly targeted μ-calpain remains unclear. Given that substrate recognition is important for a protease to process its substrate and since no common consensus could be attributed to calpain substrates, our next interest was to understand the mechanism regulating the recognition of its substrates by calpain. Since phosphorylation has been reported to protect different proteins from calpain degradation we investigated whether the calpain substrate CD31 could be phosphorylated in platelets and whether this could affect its recognition by calpain. Although we could show that the tyrosine phosphorylation of CD31 was increased after activation of platelets by thrombin and that this effect was attenuated in platelets from diabetic patients, tyrosine phosphorylation of CD31 seemed to have no effect on its sensitivity to calpain-mediated proteolysis.
After the analysis of the mechanism regulating calpain activity as well as its interaction with its substrates, our next interest was the identification of new calpain substrates in platelets. Since a previous study from our group showed that PPARγ agonists could indirectly reverse the diabetes-associated calpain activation we performed DIGE analysis of platelet samples from diabetic patients before and after PPARγ agonist treatment. Using this approach we could identify four novel calpain substrates in platelets: Integrin-linked kinase (ILK), α parvin, CLP36 and septin-5. Next, we assessed the effect of calpain-mediated cleavage on the function of these newly identified proteins. We could show that μ-calpain was essential for the dissociation of ILK from the IPP complex and its activation while m-calpain-mediated cleavage led to its cleavage and inactivation. Functionally, we also showed that μ-calpain was involved in platelet adhesion while m-calpain was important for spreading.
The next protein we analysed was septin-5, a small GTPase known to regulate platelet degranulation by association with other septins and syntaxin-4. We found that the interaction between septin-5 and syntaxin-4 was inhibitory for platelet degranulation. We could demonstrate that the μ-calpain-mediated cleavage dissociated septin-5 from syntaxin 4 and led to increased secretion of platelet α-granules. Next, we investigated the in vivo role of calpain in the diabetes-associated platelet hyperreactivity. We induced diabetes in mice and could reproduce calpain activation in platelets such as that found in human. Indeed, calpain activation in murine platelets also led to the cleavage of several calpain substrates including ILK and septin-5. Moreover, platelets from diabetic mice demonstrated an increased aggregation and thrombus formation in vivo. Treatment of the animals with the calpain inhibitor A-705253 (30 mg/kg/day for 10 days) significantly restored platelet function and substrate cleavage. In conclusion, in this part of the study, we could show that the increased calpain-dependent α-granule secretion and platelet adhesion may account for the enhanced vascular proliferation and thrombus formation in diabetes and calpain inhibition represents a promising way to prevent atherothrombosis development.
In the last part of the study we analysed another enzyme known to play a crucial role in diabetes, the AMPK which is an energy-sensing kinase known to be impaired in diabetes. We could show that the two catalytic subunits AMPK α1 and α2 are expressed in platelets. The AMPKα2 seemed to be the subunit involved in platelet activation since AMPKα2-deficient mice demonstrated a defect in clot retraction and the stabilization of the thrombus while the animals showed a normal bleeding time. Mechanistically, we showed in platelets that the upstream kinase of AMPKα2 is LKB1 which was activated by thrombin stimulation via a PI-3K-dependent pathway. AMPKα2 then phosphorylated the Src-family kinase Fyn, which is responsible for the phosphorylation of its substrate β3 integrin on Tyr747. These data indicate that AMPKα2, by affecting Fyn phosphorylation and activity, plays a key role in platelet αIIbβ3 integrin signalling, leading to clot retraction and thrombus stability. Although the effect of diabetes in the AMPK-dependent pathway could not be investigated we assume that the dysregulation of this pathway may account for the thrombus destabilization and enhanced embolization encountered in diabetes.
In light of the global sea-level rise and climate change of the 21th century, it is important to look back into the recent past in order to understand what the future might hold. A multi-proxy data set was compiled to evaluate the influence of geomorphological and environmental factors, such as antecedent topography, subsidence, sea level and climate, on reef, sand apron and lagoon development in modern carbonate platforms through the Holocene. Therefore, a combination of remote sensing and morphological data from 122 modern carbonate platforms and atolls in the Atlantic, Indian and Pacific Oceans were conducted, along with a case study from the oceanic (Darwinian) barrier-reef system of Bora Bora, French Polynesia, South Pacific.
The influence of antecedent topography and platform size as factors controlling Holocene sand apron development and extension in modern atolls and carbonate platforms is hypothesized. Antecedent topography describes the elevation and relief of the underlying Pleistocene topography (karst) and determines the distance from the sea floor to the rising postglacial sea level. Maximum lagoon depth and marginal reef thickness, when available in literature, were used as proxies for antecedent topography. Sand apron proportions of 122 atolls and carbonate platforms from the Atlantic, Indian and Pacific Oceans were quantified and correlated to maximum lagoon depth, total platform area and marginal reef thickness. This study shows that sand apron proportions increase with decreasing lagoon depths. Sand apron proportions also increase with decreasing platform area. The interaction of antecedent topography and Holocene sea-level rise is responsible for variations in accommodation space and at least determines the extension of the lateral expansion of sand aprons. In general, sand apron formation started when marginal reefs approached relative sea level. Spatial and regional variations in sea-level history let sand apron formation start earlier in the Indo-Pacific region (transgressive-regressive) than in the Western Atlantic Ocean (transgressive).
The influence of sea level, antecedent topography and subsidence of a volcanic island on late Quaternary reef development was evaluated based on six rotary core transects on the barrier and fringing reefs of Bora Bora. This study was designed to revalue the Darwinian model, the subsidence theory of reef development, which genetically connects fringing reef, barrier reef and atoll development by continuous subsidence of the volcanic basement. Postglacial sea-level rise, and to a minor degree subsidence, were identified as major factors controlling Holocene reef development in that they have created accommodation space and controlled reef architecture. Antecedent topography was also an important factor because the Holocene barrier reef is located on a Pleistocene barrier reef forming a topographic high. Pleistocene soil and basalt formed the pedestal of the fringing reef. Uranium-Thorium dating shows that barrier and fringing reefs developed contemporaneously during the Holocene.
In the barrier–reef lagoon of Bora Bora, the influence of environmental factors, such as sea level and climate, tsunamis and tropical cyclones controlling Holocene sediment dynamics was evaluated based on sedimentological, paleontological, geochronological and geochemical data. The lagoonal succession comprises mixed carbonate-siliciclastic sediments overlying peat and Pleistocene soil. The multi-proxy data set shows variations in grain-size, total organic carbon (proxy for primary productivity), Ca and Cl element intensities (proxies for carbonate availability and lagoonal salinity) during the mid-late Holocene. These patterns could result from event sedimentation during storms and correlate to event deposits found in nearby Tahaa, probably induced by elevated cyclone activity. Accordingly, elevated erosion and runoff from the volcanic island and lower lagoonal salinity would be a result of rainfall during repeated cyclone landfall. However, Ti/Ca and Fe/Ca ratios as proxies for terrigenous sediment delivery peaked out in the early Holocene and declined since the mid-Holocene. Benthic foraminifera assemblages do not indicate reef-to-lagoon transport. Alternatively, higher and sustained hydrodynamic energy is probably induced by stronger trade winds and a higher-than-present sea level during the mid-late Holocene. The increase in mid-late Holocene sediment dynamics within the back-reef lagoon is supposed to display sediment-load shedding of sand aprons due to the oversteepening of slopes at sand apron/lagoon edges during their progradation rather than an increase in tropical storm activity during that time.
The influence of sea-level and climate changes on sediment import, composition and distribution in the Bora Bora lagoon during the Holocene is validated. Lagoonal facies succession comprises siderite-rich marly wackestones, foraminifera-siderite wackestones, mollusk-foraminifera marly packstones and mollusk-rich wackestones during the early-mid Holocene, and mudstones since the mid-late Holocene. During the early Holocene, enhanced weathering and iron input from the volcanic island due to wetter climate conditions led to the formation of siderite within the lagoonal sediments. The geochemical composition of these siderites shows that precipitation was driven by microbial activity and iron reduction in the presence of dissolved bicarbonate. Chemical substitutions at grain margins illustrate changes in the oxidation state and probably reflect changes in pore water chemistry due to sea-level rise and climate change (rainfall). In the late Holocene, sediment transport into the lagoon is hampered by motus on the windward side of the lagoon, which led to early submarine lithification within the lagoon.
Hofstadter-Hubbard physics
(2020)
The Hofstadter model, besides the Haldane and Kane-Mele models, is the most common tight-binding model which hosts topologically nontrivial states of matter. In its time-reversal-symmetric formulation the model can even describe topological insulators. Experimentally, the Hofstadter model was realized with ultracold quantum gases in optical lattices which is a wellcontrolled way to engineer quantum states of tight-binding Hamiltonians. Another established control parameter in ultracold quantum gases are twoparticle, on-site interactions, also known as Hubbard interactions. This work aims at introducing the reader to the concepts of topological states of matter, a collection of corresponding tight-binding models, and the methodology to treat interacting topological states with dynamical mean-field theory.We present recent results for inhomogeneous, interacting systems, spinimbalanced magnetic systems, propose experimental detection methods, and extensions to three-dimensional topological states.
Winterroggen (Secale cereale L.) erwirbt durch längerfristiges Wachsen bei tiefen Temperaturen eine Anpassung an Kälte und Frost und entwickelt eine erhöhte Toleranz gegenüber kälte-induzierter Photoinhibierung. Diese Anpassung wird als Kältehärtung bezeichnet. Die erworbene Toleranz gegenüber kälteinduzierter Photoinhibierung geht nach drei Tagen Enthärtung bei einer Temperatur von 220C wieder verloren. Die Zielsetzung der Promotion war es, nach differentiell exprimierten Genen zu suchen, die nicht als Antwort auf kurzzeitigen Kältestreß hochreguliert werden, sondern Gene zu isolieren die im Zuge länger einwirkender Kälte in Winterroggenblättern verstärkt exprimiert werden. Werden die mRNAs aus kältegehärteten (CHL) mit den mRNAs aus enthärteten Roggenblättern (DHL) verglichen, so können Gene isoliert werden, die in CHL stärker exprimiert werden. Diese differentiell exprimierten Gene können, da sie nach Enthärtung deutlich seltener exprimiert werden, eine limitierende Funktion bei Kältehärtung einnehmen. Um diese Gene isolieren zu können wurden zwei molekularbiologische Methoden, "Suppression Subtractive Hybridisation"-PCR und "Differential Display"-PCR angewendet. Mit diesen Methoden konnten insgesamt zwölf verschiedene cDNA-Fragmente differentiell exprimierter Gene isoliert werden. Im Vergleich mit DHL sind in CHL die Transkriptmengen für neun cDNA-Fragmente isolierter Gene erhöht. Auch die Transkriptmenge des Chloroplasten-kodierte Gens für LSU ist in CHL bei einem Vergleich mit DHL gesteigert. Die isolierten cDNA-Fragmente von differentiell exprimierten Genen kodieren für Proteine aus den verschiedensten Teilbereichen des pflanzlichen Stoffwechsels und sind nachfolgend aufgelistet. Photosynthesestoffwechsel: SSU und LSU (kleine und große Untereinheit von RubisCO), LHCIIb (Lichtsammelkomplex IIb), Fructose-1,6-bisphosphatase, Transketolase, Genexpression: RNA-bindendes Protein, Transkriptionselongationsfaktor, Nucleotidstoffwechsel: UMP Synthase, Antioxidativ wirkendes Enzym: PMSR (Peptid-Methioninsulfoxidreduktase) Es konnten cDNA-Fragmente dreier bekannter Gene und eines unbekannten Gens (Klon 5C, zeigte Homologie zu einer Sequenz aus Oryza sativa) isoliert werden, deren Expression in DHL spezifisch erhöht ist. Energiestoffwechsel: H+ATPase, Pathogenabwehr/ programmierter Zelltod: Llsl Gen (lethal leaf spot Gen 1), Proteinstoffwechsel: Disulfidisomerase Neben der Analyse der Expression auf RNA-Ebene wurden Untersuchungen zur Expression auf Proteinebene vorgenommen. Western Blut Analysen zeigten, daß die geringeren Transkriptmengen von rbcS und rbcL in DHL und NHL nicht mit einem parallelen Rückgang der Proteinmengen von SSU und LSU korrelieren. Die Proteinmengen an SSU und LSU in CHL, DHL und NHL weisen keine allzu großen Unterschiede auf Sowohl die Transkiptmenge des Gens Lhcb als auch die Menge des LHCIIb-Proteins war in enthärteten Winterrogenblättern in Vergleich zu gehärteten Winterroggenblättern vermindert. Auch für das antioxidativ wirkende Enzym PMSR (Peptid-Methionin-Sulfoxid-Reduktase) konnten in CHL höhere Transkriptmengen als in DHL und in NHL nachgewiesen werden. PMSR ist ein ubiquitär verbreitetes Enzym, das eine nachgewiesene wichtige Funktion bei der Abwehr von reaktiven Sauerstoffformen (ROS) ausübt. Den bislang untersuchten antioxidativen Schutz-Systemen konnte bei der Kältehärtung keine begrenzende Funktion zugeschrieben werden. Ein Schwerpunkt der Promotion lag deshalb auf der Untersuchung vom ScPMSR als antioxidativ wirkendes Enzym im Zusammenhang mit Kältehärtung. Die Transkriptmenge an ScPMSR erhöht sich nach dem längerfristigen Einwirken von Kälte. Zur Durchführung von Immunoblot Analysen mußte zunächst ein Antikörper gegen ScPMSR hergestellt werden. Mittels eines aus einer cDNA-Bank isolierten cDNA-Klons von ScPMSR wurde rekombinantes ScPMSR-Protein in E. coli Zellen produziert und nach der Reinigung zur Herstellung spezifischer Antiseren eingesetzt. Bei dem in dieser Arbeit isolierten ScPMSR handelt es sich um ein cytoplasmatisches Isoenzym. In Western Blot Analysen mit dem ScPMSR-Antikörper konnte in Gesamtproteinextrakten aus CI-IL, DHL und NHL die ScPMSR-Proteinbande (23kDa) nachgewiesen werden. In CHL und in NHL die in niedrige Temperaturen umgesetzt wurden liegt noch eine zusätzliche Proteinbande einer Größe von 68kDa vor. Werden CHL in 220C umgesetzt wird diese Bande innerhalb von 48h deutlich schwächer. Im Gegensatz dazu verstärkt sich die 68kDa-Proteinbande kontinuierlich, wenn NHL bis zu 48h in tiefe Temperaturen gestellt werden. Die Gesamtmengen an PMSR-Protein (23 kDa + 68kDa) zeigen nicht allzu große Unterschiede bei CHL, DHL und NHL und korrelieren damit nicht mit der geringeren Transkriptmenge an PMSR in DHL und NHL. Rechnerisch könnte es sich bei dem bei Kälte gebildeten 68kDa großen Proteinaggregat um ein PMSR-Trimer handeln. Dieses Aggregat konnte allerdings in vitro durch die stark denaturierend wirkenden Stoffe Guanidinhydrochlorid und SDS nicht in nachweisbare Untereinheiten aufgelöst werden. Bei dem bei Kälte gebildeten Proteinaggregat könnte es sich um die enzymatisch aktive Form eines PMSR-Trimers handeln, das bei Kälte der Abwehr von ROS dient. Insgesamt deuten die Resultate darauf hin, daß ScPMSR bei der Kältehärtung von S. cereale von Bedeutung ist. Aufgrund der geringer Substratspezifität kann PMSR bei Kälte als weitgefächertes Reparaturenzym fungieren. Nicht zuletzt wird der zyklische Oxidations- und Reduktionsprozeß von Methionin und Methioninseitenketten auch als "sink" für ROS angesehen. Es bedarf jedoch zusätzlicher Untersuchungen, um die Rolle von ScPMSR bei Kältehärtung von Secale cereale als antioxidativ wirkendes Enzym weiter definieren zu können.
Aus Fruktose-gezogenen Zellen von A. woodii, die in Gegenwart von Caffeat als Elektronenakzeptor gewachsen waren, wurde durch Behandlung mit Lysozym und anschliessendem French-Press-Aufschluß bei niedrigem Druck ein zellfreier Rohextrakt unter strikt anaeroben Bedingungen hergestellt. Dieser katalysierte eine H2-abhängige Caffeatreduktion mit Raten von 8,7 – 18,7 nmol/min x mg Protein. Die Aktivität war strikt ATP-abhängig. Nach einer Auftrennung des Rohextraktes in Cytoplasma- und Membranfraktion war die H2-abhängige Caffeatreduktion ausschliesslich in der cytoplasmatischen Fraktion lokalisiert. Die Zugabe von Membranen führte zu keiner Stimulierung der Aktivität. Die Membranfraktion selbst wies keine Caffeatreduktionsaktivität auf. Verschiedene Verbindungen wurden auf ihre Fähigkeit getestet, als artifizielle Elektronendonatoren für die Caffeatreduktion zu fungieren. TMPD, 1,5-Diphenylcarbazid und reduziertes Methylviologen konnten Caffeat nicht reduzieren. In Gegenwart von Phenylendiamin wurde in zellfreiem Rohextrakt und in der Cytoplasmafraktion Caffeatreduktionsaktivität beobachtet. In der Membranfraktion wurde dagegen keine Reduktion von Caffeat mit Phenylendiamin als Elektronendonor nachgewiesen. NADH + H+ konnte als physiologischer Elektronendonor für die Reduktion von Caffeat fungieren. Die NADH-abhängige Caffeatreduktion war ausschliesslich in der cytoplasmatischen Fraktion lokalisiert und strikt abhängig von ATP. Die Beobachtung, dass NADH + H+ als Elektronendonor für die Caffeareduktion fungieren kann, führte zu der Frage, wie im Zuge H2-abhängiger Caffeatreduktion NADH + H+ gebildet wird und welche Enzyme daran beteiligt sein könnten. NAD+-abhängige Hydrogenaseaktivität wurde an Membranen und im Cytoplasma nachgewiesen. Rund 70% der Aktivität waren in der löslichen Fraktion lokalisiert. Die Gegenwart einer Elektronendonor:NAD+-Oxidoreduktase in A. woodii wurde untersucht. Gewaschene Membranen vermittelten die Oxidation von NADH + H+ mit Kaliumhexacyanoferrat oder Benzylviologen als Elektronenakzeptor. Diese Beobachtung wurde als Hinweis auf eine NAD+-Reduktase gewertet, da solche Enzyme in der Regel reversibel sind. Eine Hydrogenase konnte hierfür ausgeschlossen werden, da die NADH-oxidierende Aktivität Sauerstoff-unempfindlich war. Die Aktivität des NADH-oxidierenden Enzyms konnte durch zugesetztes Na+ nicht stimuliert werden. In Analogie zu Na+-translozierenden NADH:Chinon-Reduktasen wurde die NADH-oxidierende Aktivität an gewaschenen Membranen aber durch Ag+ oder Cu2+ in mikromolaren Konzentrationen vollständig inhibiert. Membranen von A. woodii vermittelten die Reduktion von NAD+ mit reduzierten Ferredoxin als Elektronendonor. Ob diese Aktivität durch das gleiche membranständige Enzyme katalysiert wurde, das auch die NADH-Oxidation bewerkstelligte, konnte nicht geklärt werden. Die Ferredoxin-abhängige NAD+-Reduktion wurde durch micromolare Konzentrationen Ag+ vollständig inhibiert. Die Inihibition war aber wahrscheinlich unspezifischer Natur. Mittels vergleichender 2D-Gelelektrophorese wurden zwei Caffeat-induzierte Proteine identifiziert. Ein Vergleich der Peptidsequenzen, die durch ESI-MS/MS-Analyse der Proteine erhalten wurden, mit in Datenbanken hinterlegten Proteinsequenzen, ergab eine große Übereinstimmung zu der großen alpha- bzw. kleinen beta-Untereinheit von heterodimeren Elektronentransfer-Flavoproteinen (ETFP). Die Proteine wurden mit EtfA und EtfB bezeichnet. Anhand der Peptidsequenzen von EtfA und EtfB wurden degenerierte Oligonukleotide abgeleitet, die zur Amplifikation von Fragmenten der kodierenden Gene herangezogen wurden. Die Analyse der abgeleiteten Aminosäuresequenzen der erhaltenen PCR-Produkte untermauerte die Zuordnung von EtfA und EtfB als Untereinheiten eines ETFP. Die Fähigkeit zur Caffeatreduktion ist in A. woodii nicht konstitutiv vorhanden, sondern wird in erst durch Gegenwart des Phenylacrylats induziert. Die Spezifität dieser Induktion wurde untersucht. Suspensionen ruhender Zellen, die aus Caffeat-induzierten Zellen hergestellt worden waren, reduzierten neben Caffeat auch die Phenylacrylate Ferulat oder p-Cumarsäure mit H2 als Elektronendonor. Analoge Beoabachtungen wurden mit Ferulat-induzierten und p-Cumarsäure-induzierten Zellsuspensionen gemacht. Die Ergebnisse legen den Schluß nahe, dass in A. woodii die Reduktion von Phenylacrylaten durch ein induzierbares enzymatisches System bewerkstelligt wird. EtfA und EtfB wurden als MalE-Fusionsproteine dargestellt und gereinigt. Dagegen wurden Antiseren hergestellt. Immunologische Untersuchungen zeigten, dass die Produktion von EtfA und EtfB durch Gegenwart verschiedener Phenylacrylate induziert wird. Die Induktion war unabhängig vom Wachstumssubstrat. In Gegenwart von zu Phenylacrylaten ähnlichen Verbindungen erfolgte keine Induktion. Für EtfA und EtfB wurde eine Funktion als universeller Elektronenüberträger des Phenylacrylat-Reduktionssystems in A. woodii postuliert. Für die H2-abhängige Reduktion von Caffeat und anderer Phenylacrylate wurde die folgende Reaktionssequenz postuliert: die Oxidation des Elektronendonors H2 durch eine Hydrogenase geht einher mit der Bildung von reduziertem Ferredoxin. Dieses wird durch eine membranständige Ferredoxin-NAD+-Oxidoreduktase oxidiert, die den Transfer der Elektronen auf NAD+ mit der Translokation von Na+ koppelt. Ein aus EtfA und EtfB gebildetes ETFP fungiert dann als Elektronenüberträger zwischen NADH + H+ und einer löslichen Phenylacrylatreduktase.
Die CMV-Infektion ist die häufigste opportunistische Infektion nach Nierentransplantation und wird mit einem erhöhten Risiko für Mortalität und Transplantatverlust assoziiert. Das Risiko an einer CMV-Infektion zu erkranken, wird vom Serostatus des Spenders und Empfängers beeinflusst. Dabei sind besonders Patienten mit Hochrisikokonstellation (D+/R–) betroffen. Bei seropositiven Transplantatempfängern (D+/R+, D–/R+) wird ebenfalls ein erhöhtes Risiko durch Reaktivierung des latent vorkommenden Virus oder Sekundärinfektion mit einem exogenen Virusstamm vermutet. Mithilfe von präventiven Maßnahmen wie der präemptiven und prophylaktischen Therapie kann die Rate an Infektionen gesenkt werden.
In dieser Studie wurden 441 Patienten, die in dem Zeitraum von 2006-2013 am Universitätsklinikum Frankfurt eine Nierentransplantation erhielten, retrospektiv untersucht. Ziel der Studie war es, den Einfluss des CMV-Serostatus, der Infektionsprophylaxe sowie der CMV-Infektion auf die Mortalität, das Transplantatüberleben und die Rejektion zu untersuchen. Da CMV-Infektionen meist in den ersten drei Monaten nach Transplantation oder nach Absetzen einer antiviralen Medikation auftreten, wählten wir eine zweijährige Verlaufsbeobachtung. Unsere Hypothese war, dass der Serostatus trotz regelhafter präventiver Maßnahmen mit einer Verschlechterung der Nierenfunktion assoziiert ist. Aufgrund neuer Empfehlungen wurde ab 2010 bei der Mehrheit der Transplantatempfänger eine Prophylaxe mit (Val)Ganciclovir durchgeführt. Folglich wurden die Zeiträume von 2006-2009 sowie von 2010-2013 miteinander verglichen.
In den Jahren von 2010-2013 konnten wir die höchste Infektionsinzidenz für die Hochrisikogruppe, gefolgt von der intermediären Risikogruppe (D+/R+, D–/R+), nachweisen. Beide Gruppen dokumentierten vermehrt CMV-Erkrankungen und Viruslasten im oberen Bereich (> 10.000 Kopien/ml). Diese zeigten jedoch keinen statistisch signifikanten Unterschied zu den anderen Serostatus-Konstellationen auf. Die Infektionsinzidenz in diesem Zeitraum war wiederum mit einem erhöhten Transplantatverlust assoziiert. Durch den prophylaktischen Einsatz von (Val)Ganciclovir konnte das Transplantatüberleben signifikant verlängert werden.
Im Vergleich der Zeiträume vor und nach 2010 stellte sich die D+/R+ Gruppe mit einem verbesserten Transplantatüberleben, die D–/R+ Gruppe mit verbessertem Patientenüberleben dar. Diese Gruppen konnten vermutlich von einer Ausweitung der Prophylaxe profitieren. Bezüglich der Rejektionen empfehlen wir für eine aussagekräftige Auswertung die Beachtung potenzieller Einflussgrößen wie die Immunsuppression und HLA-Merkmale. Rein deskriptiv lag das Auftreten von Rejektionen zeitlich vor den Infektionsereignissen. Die Niedrigrisikogruppe zeigte das geringste Abstoßungsrisiko.
Der Serostatus alleinig erscheint in unserer Studie keinen ausreichenden Hinweis auf das Outcome nach Transplantation zu geben. Allerdings waren CMV-Infektionen in den verschiedenen Zeiträumen maßgeblich mit einem verringerten Transplantat- oder Patientenüberleben assoziiert und sollten deshalb vermieden werden. Die Prophylaxe mit (Val)Ganciclovir stellte sich im gesamten untersuchten Zeitraum als effektive Therapie für ein verbessertes Transplantatüberleben dar.
Ein limitierender Faktor war die Vergleichbarkeit der Gruppen durch die unterschiedliche Patientenanzahl. Daten zur Infektion lagen uns erst ab dem Jahr 2009 vor. Bezüglich der Mortalität schätzen wir die Nachbeobachtungszeit von zwei Jahren zu gering ein, um signifikante Ergebnisse zu erzielen. Hervorzuheben ist, dass durch die Umstellung der Therapiemaßnahmen zwei interessante Patientenkollektive geschaffen wurden, an welchen die Auswirkungen der Prophylaxe dargestellt werden konnten. Mithilfe unserer Daten aus insgesamt acht Jahren mit zweijähriger Verlaufsbeobachtung, schätzen wir das am Universitätsklinikum Frankfurt durchgeführte Therapieregime nach 2010 als wirksame CMV-Prophylaxe ein. Um die Infektionsrate künftig weiterhin zu reduzieren, sind weitere Studien nötig, mit deren Hilfe Risikopatienten identifiziert, die Diagnostik erweitert und Therapien verbessert werden. Ansätze hierfür gibt es beispielsweise beim Einsatz des mTOR-Inhibitors Everolimus, der mit einer niedrigen Rate an CMV-Infektionen assoziiert wird. Auch die Anwendung neuerer Testmethoden, wie z. B. die Messung CMV-spezifischer T-Zellen, sollen dazu beitragen, Patienten mit erhöhtem Infektionsrisiko frühzeitig zu erkennen.
Die Arbeit thematisiert den postulierten Zusammenhang zwischen Informationstechnologie (IT) und gesellschaftlichem Wandel. Von Interesse ist hier, wie das Paradigma technologiegetriebenen Wandels in unterschiedlichen Gesellschaften aufgenommen wird. Grundlage der vorliegenden Ergebnisse sind ethnographische Forschungen zwischen 1999 und 2002 in der Republik Zypern (Nicosia), Kolumbien (Bogotá), Rumänien (Timisoara), Indien (Mumbai, Pune, Bangalore) und den Vereinigten Staaten (San Francisco, Silicon Valley). Es wurden insgesamt achtzig Experten im IT-Sektor als Mitglieder transnationaler Berufsgemeinschaften in Technologiezentren und Innovationsregionen unter einer vergleichenden Perspektive zur Bedeutung von IT für Wandel in ihren Gesellschaften befragt. Aus kulturanthropologischer Perspektive kann der Begriff Informationstechnologie als Teil eines dichten "konzeptionellen Feldes" betrachtet werden, ausgestattet mit "kulturellen Logiken", in denen Konzepte wie Modernität, Entwicklung und Fortschritt zentral sind. Experten machen Eingaben in "konzeptionelle Konfigurationen" von Informationstechnologie und können als Akteure an "kulturellen Schnittstellen" identifiziert werden, die kulturelle Diskurse über Informationstechnologie als Werkzeug zur gesellschaftlichen Restrukturierung herstellen und transportieren. Unter dem Ansatz von akteursgetriebenen Wandlungsdynamiken können sie als konstitutiv für die Erzeugung kultureller Logiken der Veränderung und der Erneuerung, und damit einer "Kultur des Wandels" gelten. Die Untersuchung versteht sich als Beitrag zum Wissensfortschritt in der Kulturanthropologie zur Analyse von gegenwärtigen Modernisierungs- und Entwicklungsprozessen in gegenwärtigen Gesellschaften unter der Perspektive von Transnationalisierung.
Die vorliegende Arbeit analysierte die Behandlung von Patienten mit Infektionserkrankungen am Zentrum der Zahn-, Mund- und Kieferheilkunde des Klinikums der Johann Wolfgang Goethe-Universität, Frankfurt am Main (Carolinum). Dabei wurde vor allem untersucht, welche Auswirkungen die Reduzierung von Personalressourcen speziell für die Behandlung dieser Patienten ab dem Jahr 2000 hinsichtlich der Betreuung und Versorgung hatte. Die Studie war retrospektiv angelegt und wertete Daten aus den Jahren 1998 bis 2002 aus. Hierfür wurden alle im Archiv lagernden Karteikarten herangezogen und die Daten in eine dafür entwickelte FilemakerPro©-Datenbank übertragen. Im Untersuchungszeitraum nahmen 940 Patienten mit Infektionskrankheiten etwa 3700 Besuche wahr. Regelmäßig erschienen 25% der Patienten, auf sie entfielen 60% aller Besuche. Diese Gruppe wurde einer näheren Betrachtung unterzogen: Die Auswertung der erhobenen Daten zeigte, dass das Ziel der Absenkung der Patientenzahlen und die Anzahl der Behandlungstermine erreicht werden konnte, die systematische Betreuung der Patienten sich jedoch verschlechterte. Der Anteil der sanierten Patienten sank von 34% auf 18% ab, die Zahl der unsystematisch behandelten Patienten verdreifachte sich dagegen von 1999 auf 2000 und blieb bei diesem hohen Wert. Vorsorgebehandlungen nahmen maximal ein fünftel aller Behandlungen ein, mit abnehmender Systematik sank dieser Anteil gegen null. Begünstigender Faktor für eine Sanierung waren ein erstelltes OPG (ersatzweise ein Zahnfilmstatus) und die Erstellung einer Behandlungsplanung. Das Vorhandensein eines OPGs erhöhte aber nicht die Wahrscheinlichkeit für eine folgende Behandlungsplanung. Patienten die an das Carolinum von außerhalb überwiesen wurden, hatten eine größere Chance auf eine Sanierung. Letztlich wurden nur 4% aller regelmäßig erschienenen Patienten systematisch mit Recall betreut, zahnärztlich saniert wurden insgesamt jedoch 30% der behandelten Patienten. Entgegen allgemeiner Annahmen waren kurzfristig abgesagte oder nicht eingehaltene Termine die Ausnahme.
In dieser Dissertation wurde die Rolle des Proteins Carboxypeptidase E (CPE) im Glioblastom (GBM) untersucht. Ursprünglich wurde CPE in der neuroendokrinen Regulation beschrieben, wo es die Reifung der meisten Neuropeptide und Hormone reguliert und somit Einfluss auf Stoffwechsel und humorale Effekte hat (Fricker et al., 1982; Fricker & Snyder, 1982 and 1983; Davidson & Hutton, 1987; Shen & Loh, 1997; Lou et al., 2005). Ab 1989 wurde CPE in unterschiedlichen Tumorentitäten nachgewiesen (Grimwood et al., 1989; Manser et al., 1991), jedoch ohne Hinweise, welche Bedeutung das Protein dort haben könnte. Erst im letzten Jahrzehnt konnten sowohl pro- als auch anti-tumorigene Wirkungen von CPE gezeigt werden. Die beschriebenen Wirkungen von CPE sind jedoch von dessen Isoform abhängig. Das ∂(delta)N-trunkierte CPE zeigte sich mit erhöhtem Tumorwachstum und schlechter Überlebensprognose in verschiedenen Krebsentitäten assoziiert (Murthy et al., 2010; Lee et al., 2011; Zhou et al., 2013). Im Gegensatz dazu verringerte sezerniertes CPE (sCPE) im Fibrosarkom und Glioblastom die Zellmigration, was einen anti-tumorigenen Effekt suggeriert (Höring et al., 2012; Murthy et al., 2013a). Die Molekularmechanismen, die für die Regulation der Migration zuständig sind, sind jedoch kaum untersucht. Die meisten Untersuchungen von sCPE in Normal- und Tumorgewebe beschränken sich hauptsächlich auf Apoptose und Zellüberleben (Skalka et al., 2013; Murthy et al., 2013b; Cheng et al., 2013; Selvaraj et al., 2015; Cheng et al., 2015). Die vorliegende Arbeit ist demzufolge die erste Studie, die sich dem Mechanismus der Migrationsregulation durch sCPE im Glioblastom widmet.
Humane Gliome stellen die größte und bösartigste Gruppe hirneigener Tumore dar. Bösartige Gliome sind höchst resistent gegen alle zurzeit verfügbaren Behandlungsmethoden. Einer der Hauptgründe dafür ist, dass die Tumorzellen durch diffuse Infiltration in das Gehirn einwandern können. Ferner sind Gliomzellen metabolisch sehr aktiv und können sich dadurch an schnell verändertes Milieu anpassen (Fack et al., 2015; Demeure et al., 2016). Über die grundlegenden Mechanismen für diese Art des infiltrierenden Tumorwachstums ist bisher noch nicht viel bekannt. Zurzeit sind nur wenige Schlüsselfaktoren beschrieben, die den sogenannten Mechanismus der Migration oder Proliferation ("go or grow") in bösartigen Tumoren beeinflussen: wenige Transkriptionsfaktoren, miRNAs sowie metabolische Faktoren. Interessanterweise, sind miRNAs zum Teil mit der Regulation des Metabolismus in Tumorzellen assoziiert. Eine vorangehende Studie aus unserem Labor hat sCPE aufgrund seines Potentials, Zellwanderung zu verringern, als einen weiteren Schlüsselfaktor identifiziert. Wir konnten zeigen, dass sCPE in der Gliomzelllinie LNT-229 zur einer differentiellen Regulation von Migration und Proliferation führt (Höring et al., 2012). Die vorliegende Arbeit widmet sich nun der Frage nach den genauen zugrundeliegenden Mechanismen, wie sCPE seine Effekte auf molekularer Ebene vermittelt. Darüber hinaus soll geklärt werden, ob sCPE auch in der metabolischen Adaptation eine Rolle spielt und dadurch ebenfalls die Gliomzellmigration beeinflußen kann.
The cones of nonnegative polynomials and sums of squares arise as central objects in convex algebraic geometry and have their origin in the seminal work of Hilbert ([Hil88]). Depending on the number of variables n and the degree d of the polynomials, Hilbert famously characterizes all cases of equality between the cone of nonnegative polynomials and the cone of sums of squares. This equality precisely holds for bivariate forms, quadratic forms and ternary quartics ([Hil88]). Since then, a lot of work has been done in understanding the difference between these two cones, which has major consequences for many practical applications such as for polynomial optimization problems. Roughly speaking, minimizing polynomial functions (constrained as well as unconstrained) can be done efficiently whenever certain nonnegative polynomials can be written as sums of squares (see Section 2.3 for the precise relationship). The underlying reason is the fundamental difference that checking nonnegativity of polynomials is an NP-hard problem whenever the degree is greater or equal than four ([BCSS98]), whereas checking whether a polynomial can be written as a sum of squares is a semidefinite feasibility problem (see Section 2.2). Although the complexity status of the semidefinite feasibility problem is still an open problem, it is polynomial for fixed number of variables. Hence, understanding the difference between nonnegative polynomials and sums of squares is highly desirable both from a theoretical and a practical viewpoint.
Die Ergebnisse der Studie und die Diversität der Datenbanken ist groß.
Für 12 Datenbanken wurde ein Punktesystem mit elf Items entworfen, um die Qualität der einzelnen Datenbanken zu objektivieren. Keine Datenbank konnte alle Bewertungskriterien erfüllen. Der insgesamt schlechte Punktedurchschnitt ist ein Indikator für die Mängel der aktuell verfügbaren Datenbanken. Außerdem konnten wir einen Qualitätsunterschied zwischen kostenpflichtigen und kostenfreien Datenbanken beweisen und mussten im Zuge dieser Ergebnisse die Frage stellen, ob kostenfreie Datenbanken überhaupt nützlich sind. Zwischen den kostenpflichtigen Datenbanken fallen die Qualitätsunterschiede weniger gravierend aus, wenngleich Stärken und Schwächen sich deutlich unterscheiden. Die häufigsten Wechselwirkungen wurden in allen Datenbanken mit großem Abstand zwischen rein psychiatrischen Interaktionspaaren erfasst. Dieses zeigt, wie wechselwirkungsreich Psychopharmaka sind und dass psychiatrische Patienten besonders vulnerabel sind. Die Nutzung digitaler Hilfsmittel scheint bei Betrachtung der hohen Anzahl ausgegebener Warnmeldungen unabdingbar zu sein, dennoch existiert große Uneinheitlichkeit bei der Bewertung der einzelnen Interaktionen. Die Vorstellung, dass zwei Kliniker bei Nutzung zweier unterschiedlicher Datenbanken zu völlig unterschiedlichen Empfehlungen kommen, fällt nicht schwer. Gleichzeitig könnte die Kooperation von Heilberuflern, die unterschiedliche Datenbanken verwenden, die Chance auf zusätzlichen Informationsgewinn und Austausch erhöhen, was im Umkehrschluss in einer erhöhten Arzneimitteltherapiesicherheit resultiert. In Studien konnte der positive Effekt interdisziplinärer Zusammenarbeit bereits bewiesen werden.
Zusammenfassend konnten umfangreiche Differenzen zwischen allen untersuchten Datenbanken aufgezeigt werden. Um den Anforderungen des klinischen Alltags zu genügen, müssen digitale Unterstützungssysteme weiterentwickelt werden.
Die „ideale Datenbank“ gibt es bisher nicht – das lässt sich durch unser Punktesystem beweisen. Um im klinischen Alltag Patientensicherheit zu gewährleisten ist die Nutzung einer einzelnen Datenbank bisher nicht ausreichend.
Die Gewährung der Patientensicherheit sollte unser oberstes Ziel sein und um dieses zu erreichen, bedarf es vieler Komponenten. Neben der Nutzung und vor allem Weiterentwicklung digitaler Unterstützungssysteme sollte auch der zwischenmenschliche Austausch weiter gefördert werden. Interdisziplinäre Zusammenarbeit im Sinne pharmazeutischer Dienstleistungen zur Medikationsanalyse könnten ein zusätzliches Instrument zur Vermeidung arzneimittelbezogener Probleme werden.
Zukünftig werden unsere Patienten am meisten von optimaler Nutzung weiterentwickelter Technologien, sowie wachsendem zwischenmenschlichem Austausch profitieren.
Die Maillard-Reaktion findet während der Lagerung und thermischen Verarbeitung von Lebensmitteln zwischen den darin enthaltenen Proteinen und reduzierenden Kohlehydraten statt. Als Ergebnis der Reaktion entstehen sogenannte advanced glycation end products (AGEs), Protein-Derivate mit Glykierungs-Strukturen. Da Lebensmittel vor dem Verzehr häufig erhitzt werden, ist der Einfluss von AGEs auf die Pathogenese von Nahrungsmittelallergien von großem Interesse. Die Maillard-Reaktion könnte zur Bildung von neuen, für die Pathogenese der Nahrungsmittelallergie relevanten, Immunepitopen beitragen. Das Ziel dieser Arbeit war es, den Einfluss der Maillard-Reaktion auf die T-Zell-Immunogenität, die Antigenität und die von beiden Eigenschaften abhängige Allergenität von Nahrungsmittelallergenen zu untersuchen. Zunächst wurde der Einfluss der Maillard-Reaktion auf die T-Zell-Immunogenität von Ovalbumin (OVA), einem Allergen des Hühnereiweißes, untersucht. Dafür wurde glykiertes OVA (AGE-OVA) hergestellt indem das Protein zusammen mit Glukose erhitzt wurde. In dieser Arbeit konnte zum ersten Mal gezeigt werden, dass ein AGE-Derivat eines Lebensmittelallergens eine höhere T-Zellen-Immunogenität besitzt, als sein natives Gegenstück. Die Aktivierung und Proliferation von CD4+ T-Zellen durch AGE-OVA wurde in vitro durch Co-Kultivierung der T-Zellen mit dendritischen Zellen (DZ) untersucht. DZ sind professionelle Antigen- präsentierende Zellen, welche im Pathomechanismus der Allergie eine wichtige Rolle spielen. Im Vergleich zu nativen OVA und OVA welches ohne Glukose erhitzt wurde, führte die Stimulierung mit AGE-OVA zu einer deutlich erhöhten Aktivierung von OVA-spezifischen CD4+ T-Zellen. Damit DZ T-Zellen aktivieren können, muss das Allergen zunächst durch die DZ aufgenommen werden. In der vorliegenden Arbeit wurde gezeigt, dass die Aufnahme von AGE-OVA wesentlich höher war als die der Kontrollen. Außerdem konnte der scavenger receptor class A type I and II (SR-AI/II) als einer der hauptverantwortlichen Rezeptoren für die Aufnahme von AGE-OVA identifiziert werden. Zusammenfassend lässt sich aus den Ergebnissen dieser Arbeit die Hypothese aufstellen, dass die Glykierung von OVA eine erhöhte Assoziation des Allergens mit SR-AI/II ermöglicht, welche zu einer verstärkten Aufnahme des Allergens durch die DZ führt. Dadurch können mehr Peptide des Allergens an MHC II gebunden und auf der Zelloberfläche präsentiert werden. Das wiederum führt zur beobachteten stärkeren OVA-spezifischen CD4+ T-Zell-Aktivierung durch AGE-OVA. Als nächstes wurde die T-Zell-Immunogenität und Antigenität von AGE-OVA in vivo in einem Mausmodel untersucht. Es zeigte sich, dass AGE-OVA auch in vivo im Vergleich zu den nicht glykierten OVA-Formen eine erhöhte T-Zell-Immunogenität besitzt. Des weiteren führte die Immunisierung mit AGE-OVA zu einer erhöhten Produktion von IgE-Antikörpern. Somit wurde in dieser Arbeit gezeigt, dass AGE-OVA in vivo nicht nur eine erhöhte CD4+ T-Zell-Immunogenität besitzt, sondern auch eine höhere Antigenität hat als natives und ohne Glukose erhitztes OVA. Diese Ergebnisse harmonieren gut miteinander da CD4+ T-Zellen eine zentrale Rolle in der Aktivierung von B-Zellen und der IgE-Produktion durch selbige Zellen spielen. IgE-Antikörper besitzen eine essentielle Funktion beim Auslösen der klinischen Symptomatik der Allergie. Zusammenfassend lässt deshalb sagen, dass die Maillard-Reaktion die Allergenität von OVA erhöhen könnte. Zum Schluss wurden noch die immunstimulatorischen Eigenschaften des Erdnussallergens (AGE)-Ara h 2 untersucht. Da Erdnüsse häufig ernsthafte allergische Reaktionen hervorrufen und selten roh verzehrt werden, war es vom großen Interesse den Einfluss der Maillard-Reaktion auf Immunogenität und Antigenität von rekombinanten Ara h 2 (rAra h 2) zu untersuchen. Es zeigte sich, dass die Glykierung von rAra h 2 durch die Maillard-Reaktion die T-Zellen-Immunogenität, als auch die Antigenität des Allergens reduziert. Abschließend lässt sich sagen, dass die Maillard-Reaktion die allergenen Eigenschaften von Lebensmittelallergenen erheblich beeinflusst indem es die T-Zell-Immunogenität des Allergens verändert. Die Mechanismen welche die T-Zell-Immunogenität beeinflussen wurden hier näher untersucht. Wenn die Glykierung nicht die Bindung der T-Zellen- und/oder B-Zellen-Rezeptoren inhibiert, wird die Allergen-spezifische CD4+ T-Zell-Aktivierung und die davon abhängige IgE-Produktion dadurch erhöht, dass das glykierte Allergen durch DZ verstärkt über SR-AI/II aufgenommen wird. Die vorliegende Arbeit liefert wertvolle Information über die Allergenität von Proteinen die durch die Maillard-Reaktion modifiziert wurden and trägt dazu bei die Mechanismen von Nahrungsmittelallergien besser zu verstehen.
Bei der 1590 datierten Monstranz mit Reliquien der Passion Christi handelt es sich um das zentrale Stück des ab dem frühen 17. Jahrhunderts in der Geheimen Cammerkapelle der Residenz München aufbewahrten Reliquienschatzes, den die bayerischen Herzöge Wilhelm V. und Maximilian I. als ihren kostbarsten Besitz ansahen. Die über 1,15 m hohe Monstranz aus getriebenen und gegossenem Silberteilen und graviertem Glas ist sehr reich mit goldgeschmelzten Figuren und Ornamentapplikationen, mit gefassten Smaragden, Rubinen, Diamanten und Perlen verziert. Sie kann als ein bedeutendes Monument der süddeutschen Goldschmiedekunst aber auch der konfessionellen Politik der Herzöge von Bayern gelten, die mit der Reliquienverehrung eine von der Reformation verdammte Kultpraxis propagierten. Die Arbeit diskutiert zuerst die relevante kunsthistorische Literatur. Dann wird die Bedeutung der Reliquien, das ikonographische Programm und die Funktion der Monstranz als Kultmittel des kirchlich geleiteten Reliquienkults und dessen Ausprägung am Münchner Hof um 1600 – im Speziellen innerhalb der Geheimen Cammerkapelle – betrachtet. Die Reliquienmonstranz war nicht nur Ausdruck der Frömmigkeit, sondern Teil einer Repräsentationsstrategie der Herzöge und soll daher auch im Zusammenhang mit anderen wichtigen Elementen der fürstlichen Selbstdarstellung gesehen werden. Es schließen sich stilkritische Betrachtungen über die in verschiedenen Goldschmiede- und Juweliertechniken gearbeiteten Bestandteile der Monstranz an. Dabei werden die Treibarbeiten und gegossenen Teile, die Emailkunst und die Art und Weise der Edelsteinfassungen ebenso behandelt, wie die architektonischen oder ornamentalen Verzierungen. Neben der Beurteilung der bisherigen Datierung werden in den stilkritischen Betrachtungen auch eine Gruppe von verwandten Goldschmiedewerken herausarbeitet, die aus derselben Werkstatt stammen dürften. Als Schöpfer der Monstranz wird Georg Bernhard angenommen, der zwar kein zünftiger Meister war, jedoch für den Münchner Hof über viele Jahre meisterliches gearbeitet hat.
Physical soil properties feature high spatial variabilities which are known to affect geophysical measurements. However, these variations are not considered in most cases. The challenging task is to quantify the influence of soil heterogeneities on geophysical data. This question is analysed for DC resistivity and GPR measurements which are frequently used for near-surface explorations. To determine the pattern of electric soil properties in situ with the required high spatial resolution, geophysical measuring techniques are methodically enhanced. High-resolution dipole-dipole resistivity measurements are used to determine the electric conductivity distribution of the topsoil. Due to the small electrode separations, the actual electrode geometry has to be considered and an analytic expression for geometric factors is derived instead of assuming point electrodes. Two methods are used to determine soil permittivity with GPR:(i) the coefficient of reflection at the interface air-soil is measured with an air-launched horn antenna, (ii) the velocity of the groundwave is measured with a new setup using two receiver antennas enhancing the lateral resolution from in the best case 0.5 m for standard techniques to approximately 0.1 m with the new technique. With the optimised measuring techniques, the electric properties of sandy soils are determined in the field. Conductivity and permittivity show high spatial variability with correlation lengths of a few decimetres. Geostatistical simulation techniques are used to generate synthetic random media featuring the same statistical properties as in the field. FD calculations are carried out with this media to provide realistic synthetic data of resistivity and GPR measurements. Conductivity variations as determined in the field generate significant variations of simulated Schlumberger sounding curves resulting in uncertainties of the inverted models. Even in pedologically homogeneous sandy soil, moisture pattern and resulting permittivity variations cause strong GPR diffractions as demonstated by FD calculations. This influences the detectability of small objects such as e.g. landmines or of large reflectors as e.g. the groundwater table. Conductivity variations as typical for soils showed to have a minor effect on GPR measurements than variations of permittivity. In summary, geostatistical analysis and simulation provide a powerful tool to simulate geophysical measurements under field conditions including soil heterogeneity which can be used to quantify the uncertainty of field measurements by geologic noise.
Enantioselective carbon-carbon bond-forming reactions, particularly, using organocatalysts represent one of the most important areas in modern synthetic chemistry. New concepts and methods in organocatalysis are emerging continuously, allowing more selective, economically more appealing and environmentally friendlier transformations. Chiral Brønsted-acid catalysts have recently emerged as a new class of organocatalysts for a number of enantioselective carbon-carbon bond-forming reactions. The first part of this thesis focused on the new development of new Brønsted acid-catalyzed enantioselective Nazarov cyclizations. The Nazarov reaction belongs to the group of electrocyclic reactions and is one of the most versatile methods for the synthesis of five-membered rings, which are the key structural elements of numerous natural products. In general, the Nazarov cyclization can be catalyzed by Brønsted or Lewis acids. However, only a few asymmetric variations have been described, of which most require the use of large amounts of chiral metal complexes. The reactivities of Nazarov cyclizations are also depending on the substituents of the divinyl ketone substrates as described in the first chapter. The substrates to study Brønsted acid-catalyzed enantioselective Nazarov cyclization were prepared following the known procedures. The dihydropyran was treated with tBuLi in THF at –78 oC and then the α,β-unsaturated aldehydes 1 were added to the reaction mixture to afford the corresponding alcohols 2 in moderate to good yields. The alcohols 2 were oxidized to divinyl ketones 3 employing Dess-Martin periodinane/pyridine (DMP/py) in CH2Cl2 at room temperature to obtain the divinyl ketones 3 in moderate to good yields (Scheme 1). Scheme 1. Preparation of substrates in order to study Brønsted acid-catalyzed enantioselective Nazarov cyclization and subsequent transformations. At the starting point, an evaluation of suitable Brønsted acid catalysts for the enantioselective Nazarov cyclization of divinyl ketone 3a was performed. The initial reactions conducted with various BINOL-phosphoric acids 4a-4e in toluene at 60 oC provided the mixture of cis and trans cyclopentenones 5a with enantioselectivities of up to 82% ee (Table 1, entries 1-5). Eventually, improved reactivity could be achieved by using the corresponding N-triflylphosphoramides 4f and 4g, which even at 0 oC gave complete conversion after ten minutes. Additionally, it was shown that the use of these catalysts significantly enhanced both the diastereoselectivity (cis/trans ratio up to 7:1) and the enantioselectivity (up to 96% ee; Table 1, entries 6 and 7). Table 1. Evaluation of Brønsted acids 4a-4g in the enantioselective Nazarov cyclization. The scope of the Brønsted acid-catalyzed enantioselective Nazarov cyclization of various divinyl ketones 3 was explored under an optimized reaction condition (Scheme 2). Treatment of divinyl ketones 3 in CHCl3 in the presence of 2 mol% chiral BINOL-Ntriflylphosphoramide 4g at 0 oC for 1-6 h provided the corresponding cyclopentenone 5 in good yields (45-92%) with excellent enantioselectivities (up to 93% ee) (Scheme 2). Furthermore, the isomerization of cis-cyclopentenone under basic condition led to the corresponding trans-cyclopentenone without loss of enantiomeric purity. This efficient method introduced here was not only the first example of an organocatalytic electrocyclic reaction but also represented the first enantioselective activation of a carbonyl group catalyzed by a chiral BINOL phosphoric acid. Compared to the metal-catalyzed reaction, special features of this new Brønsted acid-catalyzed electrocyclization are the lower catalyst loadings (2 mol%), higher enantioselectivities, accessibility to all possible stereoisomers, as well as the mild conditions. ....
Silicon wafers such as Silicon on Insulator (SOI) and strained silicon on Insulator (sSOI) are the essential and basic materials of advanced microelectronic devices. However, they often show various kinds of crystal defects which impair the function of these devices. The most efficient method to date, for detecting such defects and for determining their density, is to delineate them by etching the wafers with a suitable etching solution and characterise them via light optical microscopy. Etch pits are formed at defect sites which are etched at a faster rate than at the perfect lattice. The standard etching solution used for SOI and sSOI is a dilute version of Secco. As Secco contains carcinogenic and environmentally hazardous chromium (VI), the use of which is or will be restricted by law in many countries, suitable chromium (VI)-free etching solutions like Organic Peracid Etches (OPE), modified Chemical Polishing Etches (CP) like CP4 mod and mixtures with organic oxidizing agents like chloranil (CA) have been developed for the successful delineation of various types of crystal defects.
However there are still nanometer-sized defects which are hard to detect or escape detection by this method. Copper decoration is a well known method to magnify these defects. It consists in applying a copper nitrate solution to the back of the SOI or sSOI wafer. On annealing, copper diffuses through the substrate and the BOX (buried oxide) to the SOI/sSOI film and on quenching to room temperature, copper precipitates as copper silicide, SiCu3, foremost at crystal defects where the lattice strain is greater than at perfect lattice sites. These silicides increase the volume in these parts of the crystal lattice and defect magnification occurs. A considerable disadvantage of this method is its tendency for artefact formation, when the copper concentration used is too high, with the copper precipitating at the film surface. The consequence is a higher density of etch pits whereby true defect etch pits cannot be differentiated from those caused by artefacts.
The aim of this thesis is to show that the processes of decorating and etching can be combined successfully to delineate all crystal defects in SOI and sSOI. An ideal result would have been to find a copper decoration procedure that decorates all existing crystal defects at a copper concentration that avoids artefact formation.
Einleitung
APP und die Alzheimersche Krankheit
Das Alzheimer Amyloid Precursor Protein (APP) ist ein Typ-1 Transmembranprotein mit einem Molekulargewicht von 110-135 kDa [Selkoe et al. 1988, Weidemann et al. 1989]. Es wird in allen bisher untersuchten Geweben exprimiert und weist in mehrzelligen Organismen einen hohen Konservierungsgrad auf [Robakis et al. 1987, Rosen et al. 1989]. APP ist unter anderem Vorläufer des β-A4-Peptides (Aβ), das in extrazellulären Aggregaten (Plaques) im Zentralen Nervensystem von Alzheimer-Patienten akkumuliert [Masters et al. 1985]. Die sogenannte „Amyloid-Hypothese der Alzheimerschen Erkrankung“ besagt, dass das Aβ-Peptid eine pathologische Kaskade initiiert, die zur Bildung von amyloiden Plaques, neuronaler Funktionsstörung und letztendlich Demenz führt [Hardy 1997, Selkoe 1999].
Prozessierung des APP
Der Hauptanteil des zellulären APP wird über den (nicht pathogenen) α-Sekretase-Weg prozessiert, wobei das sekretorische APP (α-sAPP) freigesetzt wird, das beinahe der gesamten N-terminalen Ektodomäne des APP entspricht. Die α-Sekretase spaltet APP innerhalb der Aβ-Domäne und verhindert somit die Bildung des pathogenen Aβ-Peptides. Kandidaten für die Katalyse dieser Spaltung sind Proteasen der ADAM-Familie [Buxbaum et al. 1998, Hooper et al. 1997, Koike et al. 1999, Lammich et al. 1999, Loechel et al. 1998].
Das Aβ-Peptid entsteht bei der sukzessiven proteolytischen Spaltung des APP durch die sogenannten β- und γ-Sekretasen. Bei der β-Sekretase handelt es sich um die Aspartat-Protease BACE (β-site APP cleaving enzyme) [Hussain et al. 1999, Sinha et al. 1999, Vassar et al. 1999, Yan et al. 1999]. Die Identität der γ-Sekretase ist noch nicht endgültig geklärt, jedoch spielen Presenilin-1 und -2 sowie Nicastrin eine Rolle bei der γ-Spaltung des APP [de Strooper et al. 1998, 1999, Struhl et al. 2000, Wolfe et al. 1999].
Unter physiologischen Bedingungen wird ca. 30% des APP durch α-Sekretasen prozessiert, ein viel geringerer Anteil dagegen durch die β-Sekretasen. Mehr als die Hälfte des zellulären APP bleibt ungespalten [Koo 2002].
Biologische Funktionen des APP
Die Funktionen des APP lassen sich unterscheiden nach Funktionen der kurzen zytoplasmatischen Domäne und der ca. 100 kDa großen Ektodomäne (α-sAPP). Die zytoplasmatische Domäne des APP stellt eine Plattform für die Bindung verschiedener Interaktionspartner dar. In Kooperation mit den Bindungspartnern spielt APP eine Rolle in unterschiedlichsten zellulären Prozessen wie vesikulärem Transport, Zellmotilität oder Genaktivierung [Review siehe Annaert und de Strooper 2002]. Die meisten Interaktionspartner der zytoplasmatischen Domäne des APP binden an die YENPTY-Sequenz nahe des C-Terminus des APP, die auch als Signal für die Endozytose des APP dient [Perez et al. 1999].
Die sekretorische Ektodomäne des APP hat eine wachstumsfördernde und neuroprotektive Wirkung. Um diese Wirkung auszuüben, bindet α-sAPP an einen bisher unbekannten Rezeptor, der auf der Zelloberfläche diverser Zelltypen wie Neuronen, Fibroblasten, Thyreozyten und Keratinozyten exprimiert wird [Review siehe Schmitz et al. 2002].
Polarer Transport des APP
In polaren MDCK Zellen wird das APP-Holoprotein fast ausschließlich zur basolateralen Zelloberfläche transportiert [Haass et al. 1994]. Es wurde gezeigt, dass dieser polare Transport des APP durch Tyrosin 653 in der zytoplasmatischen Domäne des APP beeinflusst wird. Mutation dieses Tyrosins zu Alanin führte zu partieller Fehlsortierung von ca. 50% des APP zur apikalen Plasmamembran. Die Sekretion von α-sAPP dagegen fand in MDCK-Zellen unabhängig von Tyrosin 653 basolateral statt [Haass et al. 1995].
Intrazellulärer Proteintransport durch Adaptor-Protein-Komplexe
Am intrazellulären Proteintransport sind Adaptor-Protein-Komplexe (APs) beteiligt, die bestimmte Sortierungssignale in der zytoplasmatischen Domäne von Frachtproteinen erkennen. Bis heute sind vier dieser tetrameren AP-Komplexe (AP-1 bis AP-4) bekannt, die zum Teil verschiedene Isoformen einzelner Untereinheiten aufweisen, z.B. AP-1A und AP-1B [Review: Boehm und Bonifacino 2001]. Jeder AP-Komplex spielt eine Rolle in einem bestimmten Schritt des intrazellulären Proteintransportes. Für AP-1A wird eine Funktion im anterograden und retrograden Transport zwischen Endosomen und TGN beschrieben [Review: Hinners und Tooze 2003]. AP-2 vermittelt Endozytose verschiedener Transmembranproteine von der Plasmamembran [Review: Kirchhausen 2002]. AP-3 spielt eine Rolle im Proteintransport zu Lysosomen und Lysosom-ähnlichen Organellen wie Melanosomen [Robinson und Bonifacino 2001]. AP-4 sowie AP1-B sortieren Proteine zur basolateralen Plasmamembran polarer Epithelzellen [Fölsch et al. 1999, Simmen etal. 2002].
Die Sortierungsmotive, die von Adaptor-Komplexen in der zytoplasmatischen Domäne der Fracht-Proteine gebunden werden, enthalten in den meisten Fällen entweder ein Tyrosin oder zwei Leucine. Das gesamte Motiv besteht aus jeweils vier bis zehn Aminosäuren [Review siehe Bonifacino und Traub 2003].
Ziele der Arbeit
In der vorliegenden Arbeit wurde der polare Transport des APP in Epithelzellen untersucht. Ein Ziel war es, Faktoren zu finden, die den basolateralen Transport des APP in Abhängigkeit von Tyrosin 653 vermitteln. Des weiteren sollte der Transport von APP und sAPP in verschiedenen Epithelzelllinien analysiert werden. Um ein gutes Werkzeug zur Detektion von APP zu haben, wurden GFP-APP-Fusionsproteine hergestellt und charakterisiert.
Ergebnisse und Diskussion
GFP-APP-Fusionsproteine wurden hergestellt und in MDCK-, FRT- und LLC-PK1-Zellen stabil exprimiert. Die Charakterisierung der GFP-APP-Fusionsproteine durch Immunfluoreszenzanalysen zeigte, dass die chimeren Proteine im TGN sowie in peripheren Vesikeln lokalisiert sind und mit endogenem APP stark kolokalisieren. GFPAPP war somit gut geeignet, um den intrazellulären Transport des APP zu untersuchen.
Eine Analyse der zytoplasmatischen Domäne des APP im Bereich des Tyrosin 653 zeigte, dass dieses Tyrosin und die drei folgenden Aminosäuren (YTSI) ein Konsensus-Motiv für die Bindung von tetrameren Adaptor-Protein-Komplexen darstellen.
Zu Beginn dieser Arbeit waren AP-1 bis AP-3 bereits gut charakterisiert, wohingegen für AP-4 keine Funktion bekannt war. In Kollaboration mit Simmen et al. konnte gezeigt werden, dass AP-4 den basolateralen Transport einiger Proteine vermittelt [Simmen et al. 2002]. Immunfluoreszenzanalysen lokalisierten AP-4 im TGN und peripheren Vesikeln, die unterschiedlich von AP-1A/B markierten Strukturen waren. Da kaum Kolokalisation von AP-4 und AP-1A/B zu beobachten war, ist die Lokalisation von AP-4 und AP-1B, das auch eine Rolle im basolateralen Proteintransport spielt, in unterschiedlichen Subdomänen des TGN und unterschiedlichen vesikulären Strukturen anzunehmen.
Polarer Transport des APP durch Adaptor-Protein-Komplexe
Die mögliche Funktion von AP-1 und AP-4 im Transport von APP wurde zunächst mit Hilfe von in vitro-Bindungsstudien untersucht. Dazu wurde die zytoplasmatische Domäne des APP als GST-Fusionsprotein kloniert und exprimiert. Die Frachtproteinbindenden Untereinheiten von AP-1 und AP-4 wurden unter Verwendung von radioaktiv markiertem Methionin durch in vitro-Transkription und -Translation hergestellt. In Bindungsstudien interagierten AP-1A und AP-1B mit der zytoplasmatischen Domäne des APP, nicht aber AP-4. Diese Ergebnisse deuten an, dass AP-1A und AP-1B eine Rolle im intrazellulären Transport von APP spielen könnten. AP-4 dagegen scheint nicht an diesem Prozess beteiligt zu sein.
Durch Mutation des Tyrosin 653 in APP zu Alanin (Y653A) wurde die Interaktion zwischen AP-1B und APP stark verringert, was darauf hindeutet, dass dieses Tyrosin einen Teil des Bindungsmotivs für AP-1B darstellt. Übereinstimmend damit entspricht die genaue Aminosäureabfolge des Y653TSI-Motivs den Sotierungsmotiv-Präferenzen von AP-1B [Ohno et al. 1999]. Die Interaktion von AP-1A dagegen war mit WildtypAPP und der Tyrosin-Mutante vergleichbar und scheint somit auf einem anderen Interaktions-Motiv zu basieren. AP-1A und AP-1B erkennen somit unterschiedliche Sortierungsmotive in der zytoplasmatischen Domäne des APP und kooperieren möglicherweise im intrazellulären Transport des APP. Diese Ergebnisse sind der erste Bericht über eine Interaktion von Adaptor-Protein-Komplexen mit der zytoplasmatischen Domäne des APP.
Die Rolle von AP-1B im basolateralen Transport von APP wurde genauer untersucht mit Hilfe der LLC-PK1 Zelllinie, die kein AP-1B exprimiert [Ohno et al. 1999]. In LLCPK1-Zellen werden verschiedene Proteine unpolar zur apikalen und basolateralen Membran verteilt, die in MDCK-Zellen durch Interaktion mit AP-1B basolateral transportiert werden [Fölsch et al. 1999, Sugimoto et al. 2002]. Um den Transport von APP in polaren LLC-PK1-Zellen zu untersuchen, wurde Plasmamembran-ständiges GFP-APP durch zwei unabhängige Methoden nachgewiesen: die apikale oder basolaterale Oberfläche der Zellen wurde selektiv entweder biotinyliert oder mit GFPAntikörpern markiert. Beide Methoden zeigten, dass GFP-APP in LLC-PK1-Zellen sowohl an der apikalen als auch an der basolateralen Zelloberfläche lokalisiert ist. Somit wird auch APP in diesen Zellen im Vergleich zu MDCK-Zellen anders sortiert. Dieses Ergebnis festigt die Hypothese einer Funktion von AP-1B im Transport von APP, die aufgrund der Daten der in vitro-Bindungsstudien aufgestellt wurde.
Polare Sekretion des sAPP ist unabhängig vom Transport des Holoproteins
Neben dem Transport des APP-Holoproteins war auch die polare Sekretion des sAPP Thema dieser Arbeit. Es war gezeigt worden, dass basolaterale Sekretion des sAPP in MDCK-Zellen unabhängig vom Transport des APP-Holoproteins ist [Haass et al. 1995]. Dieses Ergebnis konnte in der vorliegenden Arbeit bestätigt und auf andere Zelllinien erweitert werden. Um die korrekte Sekretion von GFP-sAPP nachzuweisen, wurde die GFP-sAPP-Sekretion zunächst in polaren MDCK-Zellen untersucht, die stabil GFP-APP exprimierten. Da GFP am N-Terminus des APP angefügt ist, trägt auch das sezernierte APP die GFP-Markierung. GFP-sAPP konnte mittels Immunpräzipitation mit GFP-spezifischen Antikörpern lediglich im basolateralen Medium nachgewiesen werden. Somit sezernieren MDCK-Zellen GFP-sAPP in gleicher Polarität wie von Haass et al. für endogenes sAPP gezeigt wurde [Haass et al. 1995].
Experimente in GFP-APP exprimierenden LLC-PK1- und FRT-Zellen zeigten, dass auch hier die polare Sekretion des GFP-sAPP und der Transport des APPHoloproteins zwei unabhängige Prozesse sind. Polare LLC-PK1-Zellen transportierten GFP-APP zur apikalen und basolateralen Plasmamembran (siehe oben). GFP-sAPP-Sekretion aus polaren LLC-PK1-Zellen dagegen fand ausschließlich basolateral statt. In FRT-Zellen wurde GFP-sAPP im Gegensatz zu MDCK- und LLCPK1-Zellen apikal sezerniert. Kolokalisation des GFP-APP mit Transferrin-Rezeptor in FRT-Zellen deutete dagegen an, dass das Holoprotein wie in MDCK-Zellen basolateral transportiert wird. Dies ist auch zu erwarten, da FRT-Zellen AP-1B exprimieren und es auch in dieser Zelllinie basolateralen Transport vermittelt [A. Gonzalez, persönlich, ASCB 2003]. Nach diesen Ergebnissen zu urteilen, finden auch in FRT und LLC-PK1-Zellen APP-Transport und sAPP-Sekretion unabhängig voneinander statt.
Basolaterale sAPP-Sekretion ist unabhängig von der Ektodomäne
In MDCK-Zellen wurde zusätzlich die Sekretion eines GFP-APP untersucht, in dem der Großteil der Ektodomäne deletiert und durch GFP ersetzt wurde, die SekretaseSchnittstellen jedoch noch vorhanden waren. Durch Immunfluoreszenzanalyse wurde zunächst nachgewiesen, dass die subzelluläre Lokalisation dieser Deletionsmutante der des endogenen APP entspricht. Die Sekretion dieses stark verkürzten sAPP erfolgte wie die des Wildtyps basolateral. Dieses Ergebnis deutet an, dass die Determinante für die basolaterale Sekretion des sAPP nicht innerhalb der Ektodomäne liegt, wie in einigen älteren Publikationen angenommen wird [Haass et al. 1995, de Strooper et al. 1995]. Neuere Ergebnisse dagegen führen die polare Sekretion des sAPP auf die basolaterale Lokalisation der α-Sekretase zurück [Capell et al. 2002], was die basolaterale Sekretion der Deletionsmutante erklären könnte.
sAPP-Bindung an polaren Zellen
Durch Interaktion mit einem bisher unbekannten Rezeptorprotein erfüllt sAPP für verschiedene Zelltypen die Funktion eines Wachstumsfaktors [Saitoh et al., 1989, Pietrzik et al., 1998, Hoffmann et al., 2000]. Da viele Wachstumsfaktor-Rezeptoren selektiv entweder an der apikalen oder basolateralen Plasmamembran von Epithelzellen lokalisiert sind, wurden Bindungsstudien mit rekombinant exprimiertem sAPP (sAPPrec) an polaren FRT und MDCK-Zellen durchgeführt. Analyse der Bindung mit einem sAPPrec-spezifischen Antikörper zeigte, dass sAPP ausschließlich an der apikalen Plasmamembran beider Zelllinien bindet. Da die Sekretion des sAPP in FRT-Zellen ebenso apikal erfolgt, ist in dieser Zelllinie eine autokrine Regulation durch sAPP vorstellbar, was auch durch vorherige Ergebnisse angedeutet wurde [Pietrzik et al. 1998]. Für MDCK-Zellen, die sAPP basolateral sezernieren und apikal binden, muss ein anderer Regulationsmechanismus vorliegen. Es könnte sich um parakrine Regulation handeln, was jedoch noch bestätigt werden muss.
Fazit: In dieser Arbeit wurde zum ersten Mal gezeigt, dass tetramere Adaptor-ProteinKomplexe eine Rolle im intrazellulären Transport von APP spielen. In diesem Zusammenhang wurde die Funktion des AP-4-Komplexes in einer Kollaboration analysiert. Es wurde gezeigt, dass AP-1A und AP-1B eine Rolle im Transport von APP spielen. Eine Funktion von AP-4 im Transport von APP ist nach den vorliegenden Ergebnissen unwahrscheinlich. Untersuchungen zur APP-Sortierung in verschiedenen Epithelzelllinien zeigten, dass die Hypothese der Unabhängigkeit von APP-Transport und sAPP-Sekretion als genereller Mechanismus angesehen werden kann. Durch Analyse der sAPP-Bindung an polaren FRT- und MDCK-Zellen wurde erstmals die polare Lokalisation des putativen sAPP-Rezeptors untersucht, was einen ersten Einblick in den Mechanismus der sAPP-vermittelten Regulation in polaren Zellen ermöglichte.
The translocation of nuclear-encoded precursor proteins into chloroplasts is a highly ordered process involving the action of several components to regulate this molecular ensemble. Not only GTP hydrolysis and GDP release but also the phosphorylation of TOC GTPases is a widely discussed mechanism to regulate protein import. The receptor component (Toc34) and its isoform of A. thaliana (atToc33) were found to be regulated by phosphorylation. Although the phosphorylation of Toc33 is already known for several years, several questions regarding the molecular components involved in the regulation of the phosphorylation process, precisely what is the protein kinase and where this kinase is initially localized, so far remained unclear.
This thesis aimed at the defining of the phosphorylation status of TOC GTPases in monomeric and/or dimeric states, the identification of the nature of Toc33-PK (protein kinase), and in the same context it aimed at gaining first insights into the physiological significance of Toc33 phosphorylation. To this end, (I) An in vitro and in vivo system for investigating of TOC GTPases Phosphorylation (in monomeric or dimeric state) was developed. Since no information is available about the phosphorylation status of the Toc159 isoforms, the second receptor of the TOC complex, it was interesting to investigate whether these isoforms undergo phosphorylation or not. The results indicated that atToc159 isoforms are able to be phosphorylated by the kinase activity in purified outer envelope membranes (OEMs) of pea, but not atToc132. Moreover, an artificial dimer of psToc34 based on the interaction of a C-terminally fused leucine zipper was not phosphorylated. This result reflected the inability of the OEM kinase to phosphorylate the dimers of TOC GTPases. Also, In vivo labeling of atToc33 was developed and occurred in a dose-dependent manner. Therefore, this results evidenced that in vitro phosphorylation of atToc33 (both endogenous wild type and recombinant expressed proteins) is not artificial labeling but represents a physiological relevance. CD (circular dichroism) measurements revealed that recombinant GTPase domain of atToc33 is preferentially phosphorylated in its folded state. Therefore, it could be suggested that folding of atToc33rec is a prerequisite for its phosphorylation and the phosphorylation event occurs as a posttranslational modification most likely after insertion of Toc33 (Toc34) into the OE of chloroplasts.
Secondly, (II) Isolation and identification of Toc33-PK from OEMs of chloroplasts was performed. Four independent strategies were developed to identify the Toc33-protein kinase: UV-induced and chemically-based crosslinking, different applied chromatographic techniques, identification of PK-Toc33 interaction by means of HDN-PAGE (histidine- and deoxycholate-based native PAGE), and finally mass spectrometric approaches were performed on fractions including the potential kinase activity. UV-induced crosslinking procedure was developed and resulted in covalent bonding of nine proteins to [a-32P] ATP, while chemically-based one was not significant. The applied chromatographic and HDN-PAGE approaches, including mass spectrometry, have revealed the identification of 13 protein kinases. Of these identified kinases, phototropin2 (Phot2, AT5G58140), leucine-rich repeat PK (LRR-PK, AT4G28650.1), and receptor-like transmembrane PK (RLK, AT5G56040.2) were selected as the most promising candidates (ca. kinase type and one transmembrane helix for membrane localization).
(III) The physiological significance of Toc33 phosphoryation was shown to link this process with the environmental changes (especially, the light conditions). Identification of chloroplast OE-located PKs performed by nLC-MALDI-MS/MS resulted in the detection of Phot2. Furthermore, the subcellular localization of Phot2 in OEM of chloroplasts was confirmed by immunoblotting experiments using a-Phot2 antibody. The kinase activity of Phot2 towards TOC GTPases was characterized and revealed that fused GST-KD (kinase domain) protein able to specifically phosphorylate atToc33rec, but not atToc159rec. Also, endogenous atPhot2 was upregulated and heavily detected in the ppi1-S181A plant line (where serine to alanine exchange was performed to abolish the phosphorylation of atToc33). Hence, we suggested that certain signal cascades may directly or indirectly link Toc33 receptor phosphorylation, protein levels of Phot2 (as promising PK candidate), and irradiation conditions (as an inducing signal of the subsequent phosphorylation events). Light-dependent phosphorylation of Toc33 was shown either after de-etiolation conditions or after high light intensities of blue light was performed. Therefore, phosphorylation of Toc33 might be identified as an external regulatory signal to regulate preproteins import into chloroplasts in response to environmental conditions (e.g. light changes) or as a signal of chloroplast biogenesis.
Schätzungen zufolge sind weltweit etwa 71 Millionen Menschen chronisch mit dem Hepatitis-C-Virus (HCV) infiziert. Im Jahre 2016 sind rund 400.000 Menschen an einer HCV-bedingten Lebererkrankung gestorben, insbesondere aufgrund der Entwicklung von Leberzirrhose und Lebertumoren. Trotz der großen Unterschiede in den Prävalenzschätzungen und der Qualität der epidemiologischen Daten zeigt die jüngste weltweite Bewertung, dass die virämische Ausbreitung der HCV-Infektion (Prävalenz der HCV-RNA) in den meisten Industrieländern, einschließlich der USA, weniger als 1,0% beträgt (www .cdc.gov / Hepatitis / HCV). In einigen osteuropäischen Ländern wie Lettland (2,2%) oder Russland (3,3%) und bestimmten Ländern in Afrika, Ägypten (6,3%) und Gabun (7,0%) oder im Nahen Osten Syriens (3,0%) ist die Prävalenz bemerkenswert höher. In den USA und den am weitesten entwickelten Ländern gilt die gemeinsame Nutzung von Werkzeugezur Herstellung von Arzneimitteln und zur Injektion von Medikamenten (Nadeln) als die häufigste derzeitige Übertragungsart. Die vorherrschende Übertragungsart in Ländern, in denen die Ausbreitung von HCV-Infektionen im Vergleich zu den Industrieländern höher ist, beruht jedoch auf schlechten Methoden zur Infektionskontrolle und unsicherer Handhabung von Injektionsnadeln.
Wenn die chronische Infektion unbehandelt bleibt, kann sich im fortschreitenden Verlauf eine Zirrhose oder ein hepatozelluläres Karzinom bilden (Alter H. J. und Seef L. B. 2000). Die Doppeltherapie, bei der es sich um eine Kombination aus pegyliertem Interferon-α (PEG IFNα) und Ribavirin (riba) handelt, war in einigen Ländern der Dritten Welt bis vor kurzem der goldene Standard für die Behandlung von Patienten mit chronischer Hepatitis C und hat eine anhaltende virologische Reaktion erzielt. Mit nur 50% der mit HCV-Genotyp 1 infizierten Patienten (der häufigere) im Vergleich zu 80% mit Genotyp 2 oder 3, obwohl sie kostspielig und langwierig sind (z. B. 24-48 Wochen) und zahlreiche harte Nebenwirkungen aufweisen, die schwer zu bekämpfen sind tolerieren (Erklärung der National Institutes of Health Consensus Development Conference: Management von Hepatitis C: 2002 - 10.-12. Juni 2002 2002). Die Identifizierung des JFH1 (japanische fulminante Hepatitis Typ 1) -Isolats wurde in einigen in vitro-Studien zu HCV als wichtiger Durchbruch bei der HCV-Behandlung angesehen. Die Verwendung dieses Isolats führte nachfolgend zu einem besseren Verständnis des HCV-Lebenszyklus und der 3D-Strukturen der viralen Proteine. Basierend auf dieser Erkenntnis konnten die ersten direkt wirkenden antiviralen Mittel (DAAs) entwickelt werden, die spezifisch virale Proteine beeinflussen. Die beiden Proteasehemmer (PI) Telaprevir und Boceprevir hemmen die virale NS3-4A-Protease und wurden 2011 als Kombinationstherapie mit PEG IFNα und Ribavirin zugelassen, was die anhaltende virologische Reaktion auf 67-75% erhöhte (Pawlotsky et al. 2015).
Die Optimierung der gegenwärtigen Arzneimittelregime, die Einschränkung des Problems der Mutationsresistenz, die Gestaltung einer individualisierten Therapie, der Zugang zu diesen therapeutischen antiviralen Arzneimitteln und ihr hoher Preis bleiben weiterhin eine Herausforderung (Pawlotsky 2016; Pawlotsky et al. 2015; Sarrazin 2016). Die Entwicklung eines Impfstoffs wird jedoch als größte Herausforderung für die weltweite Kontrolle von HCV angesehen (Bukh 2016). Aus diesem Grund ist es wichtig, weiterhin mehr über den HCV-Lebenszyklus und die Faktoren zu erfahren, die sich auf die Replikation und den gesamten Lebenszyklus auswirken können, um effiziente, qualitativ hochwertige und vor allem leicht zugängliche Behandlungen für alle Menschen weltweit zu entwickeln.
Der Lipidstoffwechsel und insbesondere das Cholesteringleichgewicht werden durch die HCV-Infektion beeinflusst. Die Korrelation zwischen Lipidstoffwechsel und HCV wurde klinisch seit langem beobachtet. In den Leberbiopsien von mit HCV infizierten Patienten wurde ein Anstieg der in den Lipidtröpfchen im Cytosol akkumulierten neutralen Lipide festgestellt (Dienes et al. 1982). Das Hepatitis-C-Virus wurde auch von Hypobetalipoproteinämie, Hypocholesterinämie und Lebersteatose begleitet (Schaefer und Chung 2013). Die Leber ist der primäre Ort für die Synthese, Speicherung und Oxidation von Lipiden und anderen Makromolekülen. Daher ist der Fettstoffwechsel in der Leber für die Aufrechterhaltung der systemischen Nährstoffhomöostase von wesentlicher Bedeutung. Eine Dysregulation des Leberlipidstoffwechsels ist ein Kennzeichen mehrerer Krankheiten wie Diabetes, alkoholische und nichtalkoholische Fettlebererkrankungen sowie parasitäre und virale Infektionen, einschließlich einer HCV-Infektion. (Erklärung der National Institutes of Health Consensus Development Conference: Management von Hepatitis C: 2002 - 10.-12. Juni 2002 2002; Fon Tacer und Rozman 2011; Chen et al. 2013; Reddy und Rao 2006; Visser et al. 2013; Wu und Parhofer 2014)
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