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Zwei der wichtigsten Leistungen eines sich entwickelnden Embryos sind der Aufbau des Blutkreislauf- und des Nervensystems. Beide Systeme sind hierarchisch organisierte Strukturen, deren Verzweigungen nahezu alle Teile des Körpers erreichen. Es gibt eine zunehmende Zahl von Hinweisen darauf, dass ihre Entwicklung eng miteinander verknüpft ist, nach ähnlichen Prinzipien verläuft und verwandte molekulare Mechanismen verwendet. Die Entstehung eines funktionellen vaskulären Netzwerks erfordert Signale, die Prozesse wie die Lenkung und die Verzweigung von Gefäßen in den Zielgeweben kontrollieren. Ähnliche Anforderungen werden an wachsende Axone bei der Knüpfung der Verbindungen des Nervensystems während der Embryonalentwicklung gestellt. Einige der Faktoren, die die Lenkung der Axone kontrollieren, spielen auch eine ähnliche Rolle in der vaskulären Entwicklung. Lenkungsmoleküle, die eine Richtungsinformation vermitteln, sind für die Wegfindung der Axone besonders wichtig. Die größte Familie solcher Lenkungsmoleküle wird durch die Semaphorine gebildet. Semaphorine können in acht Klassen unterteilt werden, deren gemeinsames Merkmal eine konservierte Semaphorin-Domäne ist und die unterschieden werden anhand ihrer Klassen-spezifischen carboxyterminalen Domänen. Die Semaphorin-Familie umfasst sowohl sekretierte als auch membrangebundene Proteine. Die am besten charakterisierten hiervon sind die sekretierten Klasse 3 Semaphorine. Eine Kombination von in vitro und in vivo Ansätzen zeigte, dass die Klasse 3 Semaphorine an der Steuerung der Axon- und Dendritenlenkung, der Bildung von Axonbündeln und der neuronalen Migration während der Entwicklung des Nervensystems beteiligt sind. Sie agieren hauptsächlich als repulsiv wirkende Signale, die Axone aus Regionen ausschließen, von den Geweben weg, in denen sie exprimiert sind. Diese Wirkung wird über die Semaphorin-Domäne vermittelt. Verschiedene Hinweise deuten auf eine Beteiligung von Semaphorinen an der Entwicklung des vaskulären Systems. Sowohl homozygote Sema3a- als auch Sema3c-Mausnullmutanten sterben nach der Geburt aufgrund kardiovaskulärer Defekte. Darüber hinaus binden die Rezeptoren für die Klasse 3 Semaphorine, Neuropilin-1 (Nrp-1) und –2 (Nrp-2), einige Isoformen des vaskulären endothelialen Wachstumsfaktors (Vascular Endothelial Growth Factor, VEGF). Neuropilin-1 und Neuropilin-2-defiziente Mäuse und Neuropilin-1/-2-Doppelmutanten weisen Defekte des Gefäßsystems auf, wie z.B. eine Rückbildung der neuralen Vaskularisierung und Abweichungen in der Entwicklung des Herzens und der großen Gefäße. Die membrangebundenen Semaphorine sind bisher nur wenig untersucht, da zuverlässige in vitro Assays fehlen. Somit ist ein genetischer Ansatz der beste Weg, die physiologische Funktion dieser Proteine zu untersuchen. Aus diesen Gründen war die Zielsetzung dieser Arbeit, durch homologe Rekombination in embryonalen Stammzellen eine Mauslinie herzustellen, die ein Nullallel des membrangebundenen Sema5a-Gens trägt. Für diesen Ansatz wurde ein Mitglied der Klasse 5 Semaphorine gewählt, da es nur zwei Mitglieder dieser Klasse im Mausgenom gibt, die weitgehend komplementäre Expressionsmuster aufweisen. Damit unterscheiden sie sich von den anderen Klassen der Semaphorine, deren Mitglieder stark überlappende Expressionsmuster zeigen. Dies verringert die Wahrscheinlichkeit einer gegenseitigen funktionellen Kompensation nach Mutation eines Gens. Die Klasse 5 Semaphorine sind auch deshalb besonders interessant, da sie die einzigen sind, die sowohl in Vertebraten als auch in Invertebraten vertreten sind. Sie sind gekennzeichnet durch sieben carboxyterminale Typ 1-Thrombospondinmodule (TSP) in ihrer extrazellulären Domäne. TSPs wurden ursprünglich in den Proteinen Thrombospondin 1 und 2 gefunden, in denen sie das Auswachsen von Neuriten verschiedener Nervenzelltypen fördern. Dies lässt vermuten, dass Klasse 5 Semaphorine sowohl inhibierende als auch stimulierende Effekte haben könnten, in dem sie unterschiedliche Rezeptoren mit der Semaphorin-Domäne oder der TSPs aktivieren. Das Expressionsmuster von Sema5A und die bekannte Funktion von Semaphorinen in der Ausbildung neuronaler Verbindungen lassen es sinnvoll erscheinen, bei der Untersuchung der mutanten Tiere den Schwerpunkt auf die Entwicklung des Nerven- und des Gefäßsystems zu legen. Aufgrund technischer Schwierigkeiten konnte innerhalb der Bearbeitungszeit dieser Doktorarbeit nur der Phänotyp des vaskulären Systems untersucht werden. Die Inaktivierung des Sema5a-Gens wurde durch die Verwendung eines ‚Targeting’-Vektors erreicht, welcher die Exone 4 und 5 des Sema5a-Gens durch eine Neomycin-Selektionskassette ersetzte. Aus 144 untersuchten ES-Zellklonen wurden drei ES-Zellinien mit einem rekombinierten Sema5a-Locus identifiziert. Zwei der positiven Klone wurden zur Herstellung einer chimären Maus durch die Morula-Aggregationsmethode verwendet. Mit einem der Klone konnte eine männliche Chimäre erzeugt werden, die nach Kreuzung mit NMRI-Wildtyptieren die Mutation an die Nachkommen weitergab. Der Verlust der Proteinexpression in homozygoten Sema5a-Mutanten wurde durch Westernblot-Analyse von Zellmembranpräparationen homozygoter Embryonen unter Verwendung eines Antikörpers gegen das zytoplasmatische Ende von Sema5A bestätigt. Dieses Ergebnis bestätigte, dass die Deletion des vierten und fünften Exons des Sema5a-Gens ein Nullallel hervorbringt. Nach Verpaarungen heterozygoter Mutanten konnten keine Neugeborenen identifiziert werden, die homozygot für das mutierte Allel waren. Homozygte Mutanten starben zwischen E11,5 und E12,5 der Embryonalentwicklung, der Verlust von Sema5A ist also embryonal letal. Die Morphologie der homozygoten Tiere zeigte keinen offensichtlichen Unterschied zu den heterozygoten Embryonen oder zu Wildtyp-Geschwistern auf. Frühe embryonale Musterbildungsprozesse in Sema5a-Nullmutanten sind also nicht gestört. Ein Tod bei dieser Entwicklungsstufe deutet auf einen Defekt in der Entwicklung des Blutgefäßsystems hin, da die Embryonalstadien zwischen E9 und E13 besonders wichtig für die Ausbildung dieser Gefäße sind und viele Mutationen, die Herz und Blutgefäßen beeinträchtigen, den Tod der Embryonen in diesem Stadium bewirken. Das embryonale Blutgefäßsystem in E10,5 und E11,5 Embryonen wurde durch immunhistochemische Färbungen ganzer Embryonen unter Verwendung eines spezifischen gegen das Platelet Endothelial Cell Adhesion Molecule (PECAM) gerichteten Antikörpers dargestellt, welches in vaskulären Endothelzellen exprimiert ist. Die allgemeine Architektur des Gefäßsystems war in homo- und heterozygoten Mutanten ähnlich und wies weder an E10,5 noch an E11,5 besondere Abweichungen auf. Es wurden bei der Lage und der Anzahl intersomitischer Gefäße, der Entwicklung der dorsalen Aorta oder der Vaskularisierung der Extremitätenanlagen keine Abweichungen festgestellt. Morphologische Defekte konnten jedoch bei E10,5 in den Verästelungen der Blutgefäße detektiert werden, die von den Hauptvenen der Cranialregion abzweigen. Die Verzweigungen waren geringer ausgeprägt als in heterozygoten oder Wildtyp-Vergleichstieren. Insbesondere zeigte sich eine Verringerung der Anzahl sekundärer und tertiärer Verzweigungen. In dem sich entwickelnden Embryo führt die wiederholte Verzweigung von Ästen der Hauptvenen zu einem hierarchisch gegliederten Netzwerk großer Gefäße in der Region des medialen Kopfes. Während die Ausbildung dieses Netzwerkes in den Sema5a-/--Tieren beeinträchtigt ist, erscheint die Organisation der kleinen Gefäße in den mehr dorsal und peripher gelegenen Regionen des Kopfes normal. In heterozygoten und homozygoten Mutanten bilden die kleineren Gefäße ein dicht verzweigtes Netzwerk. Die Verminderung der Komplexität der größeren Gefäße konnte in allen untersuchten Nullmutanten beobachtet werden. Es variierte jedoch die Penetranz des Phänotyps. In allen Fällen war die Anzahl primärer Verzweigungen unverändert, während die Anzahl der sekundären und der tertiären Verzweigungen zu unterschiedlichen Graden reduziert war. Im Gegensatz dazu zeigte sich im Verzweigungsmuster von heterozygoten Mutanten und beim Wildtyp nur eine geringe Variabilität zwischen individuellen Embryonen. Dies belegt, dass die Verminderung des Verzweigungsgrades größerer Gefäße nicht innerhalb der normalen Variabilität liegt, sondern durch die Inaktivierung des Sema5a-Gens verursacht wird. Dieser Phänotyp ist in späteren Stadien sogar deutlicher ausgeprägt. In E11,5 Embryonen waren die Stämme der großen Blutgefäße in den Nullmutanten weniger komplex und in einigen Fällen trat sogar eine Reduzierung der Anzahl primärer Verzweigungen auf. Diese spätere Verminderung der Anzahl bereits ausgebildeter primärer Verzweigungen legt nahe, dass der Phänotyp durch eine Rückbildung von Verzweigungen aufgrund möglicher Defizite in deren Reifung und/oder Stabilisierung erfolgt. Die interessanteste Besonderheit der vaskulären Defekte in den Nullmutanten liegt in ihrer regionalen Spezifität. Bis hier ist das Netzwerk großer Gefäße, welches der anterioren Hauptvene entspringt, das einzige Gefäßsystem, in dem Abweichungen entdeckt wurden. Dieses Netzwerk wird durch die strukturelle Umbildung des primären kapillaren Plexuses gebildet. Zwischen E9,5 und E12 sprießen Zweige rostral aus der Hauptvene, um ein hierarchisch organisiertes Netzwerk von Gefäßen zu bilden. Die Umbildung des primären kapillaren Plexus in den mehr rostral und ventral gelegenen Kopfregionen führt zu der Bildung eines hochverzweigten vaskulären Netzwerkes, welches jedoch bei E10,5 noch nicht hierarchisch organisiert erscheint. Die Signale, die für diesen unterschiedlichen Ablauf der Musterbildung während der Entwicklung des Gefäßsystems des Kopfes verantwortlich sind, sind noch unbekannt. Die besonderen Defekte in der stereotypischen Organisation der cranialen Gefäße in Sema5a-Mutanten legt nahe, dass Sema5A eines dieser Signale sein könnte. Es könnte Teil eines Rezeptor/Ligandenkomplexes sein, welcher positionelle Signale für das Verzweigen und das Wachstum großer Gefäße in rostraler Richtung liefert. Sema5A könnte die Bildung von Verzweigungen durch die Regulierung der Wanderung endothelialer Zellen, ihrer Proliferation oder ihrer Interaktion mit unterstützenden Zellen oder der extrazellulären Matrix kontrollieren. Sema5A könnte Teil eines neuen Signalweges sein oder als Teil eines der bekannten Signalwegs wirken, welcher die Entwicklung des Gefäßsystems reguliert. Einer der Signalwege, die essentiell für die Gefäßbildung sind, wird durch VEGF und Angiopoietin (Ang-1) reguliert. Sowohl in VEGF-, als auch in Ang-1-Mutanten ist die Gefäßumbildung im Kopf beeinträchtigt. Insbesondere erscheint das Netzwerk kleiner Gefäße in den Ang-1 Nullmutanten als nur nur teilweise restrukturiert und die großen Gefäße als weniger komplex. Das Verzweigungsmuster der großen Gefäße in den Ang-1- Nullmutanten ähnelt auffallend dem der Sema5a-Nullmutanten. Eine zweite Ähnlichkeit in den Phänotypen von Ang-1- und Sema5a-Mutanten zeigt sich in der Reduzierung der primären Verzweigungen, welche in den Sema5a-Nullmutanten bei E11,5 beobachtet wird. Hier könnte die Verminderung aus einer Rückbildung von Gefäßen resultieren, wie sie auch typischerweise in Mutanten für Ang-1 oder dessen Rezeptor auftritt. Diese Beobachtung legt nahe, dass Sema5A ein neuer Teilnehmer innerhalb des Ang-1-Signalweges ist, welcher die Auswirkung von Ang-1 auf die endothelialen Zellen der großen Gefäße entweder vermittelt oder moduliert und dadurch das spezifische Muster der Blutgefäße des Kopfes beeinflußt. Mit dieser Doktorarbeit wird zum ersten Mal eine funktionelle Untersuchung des Klasse 5 Semaphorins Sema5A vorgestellt. Die phänotypische Untersuchung von Mäusen, die Nullallele für Sema5a-Gens tragen ergab, dass dieses membrangebundene Protein essentiell für die embryonale Entwicklung ist. Es ist an der Musterbildung des Gefäßsystems beteiligt. Seine Aufgabe besteht möglicherweise darin, die Bereitstellung positioneller Signale für die Ausbildung von Gefäßverzweigungen zu gewährleisten. Einige grundlegende Fragen werden durch diesen Phänotyp aufgeworfen. Sowohl die Ursache für die embryonale Sterblichkeit als auch die zellulären Prozesse, welche in den Sema5a-Nullmutanten beeinträchtigt sind, müssen noch beschrieben werden. Unbekannt ist ebenfalls, ob zusätzlich zu der hier beschriebenen Rolle von Sema5A in der Gefäßbildung dieses an der Entwicklung des Nervensystems beteiligt ist. Die ersten Daten über die physiologische Rolle von Sema5A, welche mit dieser Arbeit vorgelegt werden, öffnen den Weg für weitergehende Untersuchungen über die Funktion des Proteins während der Embrionalentwicklung. Das hier erstmals vorgestellte Modellsystem ermöglicht es, Sema5A regulierte zelluläre Mechanismen zu untersuchen. Zusätzlich stellt es ein Werkzeug zur Verfügung, um die funktionelle Beziehung zwischen der Entwicklung des kardiovaskulären Systems und des Nervensystems zu untersuchen. Damit können die Aufgaben der Semaphorin-Proteinfamilie, die an diesen beiden wichtigen Prozessen beteiligt sind, näher charakterisiert werden.
Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurden verschiedene proteomanalytische Methoden untersucht und evaluiert, die, basierend auf der Verwendung 2D-gelelektrophoretischer, 2D-chromatographischer und massenspektrometrischer Techniken, die differentielle, quantitative Proteinanalyse zweier unterschiedlicher muriner Fibroblasten-Zelllinien ermöglichen. Hierfür wurden zunächst unterschiedliche Methoden für die 2D-elektrophoretische Proteinauftrennung analysiert. Im Hinblick auf eine größtmögliche Auflösung und Gel-zu- Gel-Reproduzierbarkeit wurden innerhalb der ersten Dimension (IEF) die Lademethode, die Fokussierungszeiten und der Reduktionsschritt (DTT oder HED) optimiert. Desweiteren wurde eine auf isoelektrischer Fokussierung basierende Vorfraktionierungsmethode auf ihre Anwendbarkeit bei einer quantitativen Proteomanalyse getestet. Für die Proteingelfärbung wurde unter anderem ein selbst synthetisierter Fluoreszenzfarbstoff eingesetzt, der hinsichtlich Färbesensitivität und MS-Kompatibilität mit etablierten Protokollen verglichen wurde. Eine Doppelfärbungs-Methode von Proteingelen (Silberfärbung nach Fluoreszenzfärbung) wurde auf ihre MS-Kompatibilität nach tryptischen Verdau untersucht. Desweiteren wurden manuelle und automatisierte Verdauprotokolle für eine möglichst hohe Peptide Recovery optimiert. Die zunächst durch die Anwendung von klassischen Färbe- und Quantifizierungsmethoden nach 2DE gewonnenen Ergebnisse wurden mit neueren Labelling-Methoden zur relativen Proteinquantifizierung verglichen. Dabei kamen zwei unterschiedliche Multiplexing-Verfahren zum Einsatz, die sich in der Proteinquantifizierung grundlegend unterscheiden (DIGE: gelbasierte Proteinquantifizierung; iTRAQ: LC-MS/MS basierte Peptidquantifizierung). Die für diese beiden Methoden bestehenden Protokolle wurden für die Anwendbarkeit auf die Fibroblasten-Proteinextrakte angepasst. Es konnte gezeigt werden, daß diese beiden Labelling-Methoden in Bezug auf Reproduzierbarkeit und quantitativer Aussagekraft dem klassischen 2DE-Experiment (Proteinfärbung nach der Auftrennung auf einzelnen Gelen) überlegen sind. Die statistische Absicherung der analysierten relativen Quantitätsunterschiede verbesserte sich durch die zusätzliche Anwendung der beiden neuen Labelling-Methoden erheblich. Dabei stützt sich die Signifikanz der quantitativen Bestimmung sowohl auf die große statistische Sicherheit, die innerhalb dieser beiden Multiplexing-Methoden erreicht wird, als auch auf die Wiederholbarkeit in unterschiedlichen Experimenten (21 Proteine wurden in unterschiedlichen Ansätzen bestätigt). Die beiden Labelling-Methoden DIGE und iTRAQ unterscheiden sich außer in der Quantifizierungsstrategie auch grundsätzlich in dem Ansatz der Auftrennung (DIGE: Proteine, 2DElektrophorese; iTRAQ: Peptide, 2D-Flüssigchromatographie). Damit besitzen sie unterschiedliche Limitierungen in Bezug auf die physiko-chemischen Eigenschaften der Peptide/Proteine, die mit der jeweiligen Methode aufgetrennt werden können. Der daraus resultierende komplementäre Charakter beider Methoden konnte anhand mehrerer Proteine verdeutlicht werden. Durch die relative Quantifizierung konnten insgesamt 30 Proteine identifiziert werden, die aufgrund der An- oder Abwesenheit des MLL-Proteins in den beiden murinen Zelllinien differentiell reguliert sind. Die alleine schon durch die unterschiedliche Morphologie der untersuchten murinen Fibroblasten vermutete Deregulation von Struktur- und Stressproteinen (Actin, HSP27, HSP70) konnte bestätigt werden. Weitere Expressionsunterschiede zwischen Mll-/-- und Mll+/+-Fibroblasten zeigten sich vor allem bei Proteinen, die funktionell der Gruppe RNA-prozessierender Proteine (Polyadenylate Binding Protein, PTB-associated Splicing Factor, hnRNPs) zugeordnet werden können. Ein Vergleich der quantitativen Proteomdaten dieser Arbeit mit den mRNA-Expressionsprofilen der gleichen Zellen zeigt nur eine sehr geringe Korrelation bezüglich der Regulationen einzelner Gene/Proteine. Die meisten der bisherigen Studien, die eine Untersuchung des mRNA/Protein-Verhältnisses zum Gegenstand haben, bestätigen das Fehlen einer Korrelation. Diese Tatsache unterstreicht die Wichtigkeit der Kombination genomischer und proteinanalytischer Daten zur Aufklärung zellulärer molekularer Prozesse.
Die somatische Gentherapie ist eine neuartige Therapieform, bei der Gensequenzen in Zielzellen eingebracht werden, um die verschiedensten Defekte auf molekularer Ebene zu beheben. Für die Entwicklung von Vehikeln, mit denen dieser Gentransfer effizient durchzuführen ist, werden in vielen Studien modifizierte Retroviren verwendet. Mit Hilfe des Transport- und Integrationsmechanismus der Retroviren ist es möglich das genetische Material stabil in das Genom der Zielzellen zu integrieren. Im Hinblick auf eine lebenslange Heilung bestimmter Erbkrankheiten können die retroviralen Vehikel auch zum Gentransfer in Stammzellen verwendet werden. Eine wichtige Rolle spielt die stabile Genexpression der eingeschleusten Sequenzen, um einen Therapieerfolg auf lange Sicht zu erreichen. In vielen Studien erfolgte jedoch eine Erniedrigung der Genexpression nach mehreren Wochen und auch das Ausbleiben der Transkription oder Translation des therapeutischen Gens konnte beobachtet werden. Das Abschalten therapeutischer Gene wird meist durch zelluläre Mechanismen hervorgerufen, hierzu gehören Methylierungen bestimmter Chromosomenabschnitte oder die Bindung von Repressormolekülen an Promotorregionen. Die Sequenzumgebung mit der das therapeutische Genmaterial in das Genom der Zielzellen integriert, ist somit besonders wichtig. Die viralen Sequenzen, die zum Einschleusen und für die Integration des therapeutischen Gens notwendig sind, tragen oft erheblich zur Expressionshemmung bei. Ein retroviraler Vektor, der nach Integration der proviralen DNA alle nicht benötigten viralen Sequenzen selbständig deletiert, würde störende Einflüsse durch umgebende Sequenzen vermindern. Das therapeutische Gen verbliebe mit wenigen viralen Sequenzen in der Zelle. Ein System, das nach Integration des therapeutischen Gens alle nicht erwünschten viralen Sequenzen selbständig und gezielt entfernt, stellt das entwickelte Cre/loxPVektorsystem dar. Dieser retrovirale Vektor enthält ein spezifisches Rekombinationssystem, das nach Integration der proviralen DNA in das Genom einer Zelle alle nicht benötigten viralen Sequenzen selbständig deletiert. Das therapeutische Gen verbleibt mit wenigen Sequenzen im Zielzellgenom. Störende Einflüsse durch transkriptionelles Silencing oder Translationshemmung durch umgebende Sequenzen werden damit vermindert. Die Anordnung der Gene und Sequenzen zur Entwicklung eines selbstdeletierenden Cre/loxP-Vektors wurde für die stabile Expression eines Markergenproduktes untersucht. Das modifizierte Gen des Nervenwachstumsfaktors LNGFR (LNGFR, engl. – Low Affinity Nerve Growth Factor Receptor) diente anstelle eines therapeutischen Gens als Modell für eine Proteinexpression in verschiedenen Zielzellen. In dieser Studie wurde ein konventionelles retrovirales Vektorsystem mit den entwickelten Cre/loxP-Vektoren verglichen. Beide Vektorsysteme integrierten das LNGFRD-Gen zusammen mit den nötigen viralen Sequenzen in das Genom der Zielzellen. Nach Integration des konventionellen Vektors blieb die Sequenzumgebung des LNGFRD-Gens erhalten. Durch das Cre/loxPVektorsystem konnten die störenden viralen Sequenzen durch den spezifischen Rekombinationsmechanismus entfernt werden und nur die LNGFRD-Expressionskassette verblieb mit wenigen Elementen im Genom der Zielzellen. Mit beiden Vektorsystemen konnte eine Expression des LNGFD-Rezeptors erreicht werden, wobei die zu erreichende Expressionshöhe des Rezeptor mit dem Cre/loxP-Vektorsystem zum Teil erhöht war, im Vergleich zum Kontrollsystem. Der Anteil an Zellen, die nach Gentransfer den LNGF-Rezeptor exprimierten, war nach einigen Modifikationen ebenfalls vergleichbar mit dem System des konventionellen Gentransfervektors. Die Verwendungsmöglichkeiten des entwickelten Cre/loxPVektorsystems sind auf vielen Gebieten denkbar. Retrovirale Vektoren werden zum einem zur Behandlung von monogenen Erbkrankheiten verwendet, bei denen das therapeutische Gen den Defekt des fehlerhaften Gens ausgleicht. Ein retroviraler Cre/loxP-Vektor könnte hierbei zu einer lebenslangen Expression des Genprodukts genutzt werden. Außerdem könnten Gene transferiert werden, die nur temporär exprimiert werden sollen. Hierzu könnte ein induzierbarer Cre/loxP-Vektor verwendet werden. Zur Bekämpfung von Krebs oder HIV werden Untersuchungen mit Apoptose-Genen und Suizid-Genen durchgeführt, die bei einer unerwünschten Immunreaktion mit Hilfe des Cre/loxPSystems eliminiert werden könnten. Für die Zell- und Gentherapie werden zur Zeit Studien zur kontrollierten Expansion von Stammzellen und Endothelzellen durchgeführt, wobei Genen verwendet werden, die diesen Zellen einen Proliferationsvorteil verschaffen. Die vollständige Abschaltung dieser Gene nach der Zellexpansion ist wünschenswert. Mit dem Cre/loxP-Vektorsystem könnte eine reversible Immortalisierung erzielt werden, was die Sicherheit einer späteren Transplantation erhöhen würde. Die Deletion weiterer viraler Sequenzen erhöht außerdem die Sicherheit des Gentransfers für eine erstrebenswerte lebenslange Integration von Gensequenzen. Die Möglichkeiten zur Mobilisierung eingeführter retroviraler Sequenzen durch Mutationen oder Rekombinationen mit endogenen Viren wird stark vermindert, da Elemente, wie das virale Verpackungssignal oder virale Genkassetten entfernt werden können. Der entwickelte Cre/loxP-Vektor ist außerdem ein selbstdeletierender Vektor, der nicht nur die spezifischen Bindestellen der loxP-Elemente enthält, sondern auch das CreGen zur Rekombination. Die spezielle Anordnung der Elemente zur Rekombination erlaubt nicht nur eine spezifische Rekombination, sondern auch die Deletion des Gens der CreRekombinase. Das Cre/loxPSystem deletiert sich somit selbständig, was einen weiteren Sicherheitsaspekt darstellt.
Der bc1-Komplex ist eine Komponente der Atmungskette und damit essentiell für den Energiestoffwechsel vieler Organismen, die zum aeroben Wachstum befähigt sind. Im Vergleich zu mitochondrialen bc1-Komplexen, die bis zu elf unterschiedliche Untereinheiten besitzen, ist das Enzym aus Paracoccus denitrificans mit nur drei Untereinheiten einfach aufgebaut. Vergleicht man die Sequenz des P. denitrificans Cytochrom c1 Genproduktes mit denen anderer prokaryotischer und mitochondrialer Cytochrom c1 Untereinheiten, so fällt auf, dass dieses prokaryotische Protein eine für Paracoccus charakteristische zusätzliche N-terminale Domäne von ca. 150 Aminosäuren trägt, die zudem eine sehr auffällige Zusammensetzung besitzt (40% saure Reste, 40% Alanine, keine einzige positiv geladene Aminosäure). Diese saure Domäne wird in anderen Organismen durch zusätzliche Untereinheiten innerhalb des bc1-Komplexes dargestellt, die in direkter Assoziation mit dem Cytochrom c1 vorliegen. Bis dato konnte für Paracoccus jedoch noch kein eindeutiger Beweis für eine Beteiligung dieser sauren Domäne an der Wechselwirkung zwischen bc1 und den Substraten des Komplexes geführt werden. Ziel dieser Arbeit war es zunächst, zwei lösliche Fragmente des Cytochrom c1 aus P. denitrificans zu konstruieren und in E. coli heterolog zu exprimieren. Durch zielgerichtete Mutagenese am Cytochrom c1 und anschließende kinetische Charakterisierung der Produkte sollte die funktionelle Bedeutung einzelner Aminosäurereste dargestellt werden. Es ist im Rahmen dieser Arbeit gelungen, zwei lösliche Fragmente des Cytochrom c1 aus P. denitrificans zu exprimieren. Für das saure Fragment (SF) wurde lediglich der Membrananker deletiert, während das Kernfragment (KF) durch die zusätzliche Deletion der sauren Domäne als eine Art minimalisiertes Cytochrom c1 anzusehen ist. Beide Fragmente konnten nach erfolgreicher Aufreinigung durch pre-steady-state-Kinetiken in ihrer Wechselwirkung mit dem homologen Reaktionspartner Cytochrom c552 sowie mit drei weiteren c-Typ Cytochromen funktionell charakterisiert werden. Des weiteren wurden zahlreiche Mutanten von KF hergestellt und ebenfalls hinsichtlich ihrer Wechselwirkung mit Cytochrom c552 getestet. Die Untersuchungen zur Ionenstärkeabhängigkeit des Cytochrom c1 zeigten, dass das saure Fragment unter den gewählten Versuchsbedingungen im Vergleich zu KF keine erhöhte Spezifität gegenüber Cytochrom c552 besitzt. Es konnte jedoch eindeutig gezeigt werden, dass die Interaktion der beiden untersuchten Elektronentransportpartner von der Wechselwirkung geladener Aminosäureseitenketten auf beiden Proteinen abhängt und somit elektrostatischer Natur ist. Dieser Sachverhalt wird zusätzlich durch die Ergebnisse bestätigt, die mit der Negativkontrolle (Cytochrom c551 aus Ps. aeruginosa) erzielt wurden. Dieses negativ geladene Protein zeigte nur eine schwach affine Wechselwirkung mit dem ebenfalls stark negativ geladenen Cytochrom c1 aus P. denitrificans. Zusätzliche kinetische Untersuchungen mit weiteren Cytochromen im Bereich mittlerer Ionenstärke zeigten, dass die beiden löslichen Fragmente SF und KF keine erhöhte Spezifität gegenüber homologen Elektronenakzeptoren (Cyt c552 und Cyt c550 aus P. denitrificans) im Vergleich zu dem nicht-homologen Reaktionspartner (Pferdeherz Cyt c) besitzen. Bei diesen drei Cytochromen handelt es sich um Proteine, die eine basische Interaktionsfläche aufweisen. In Hinblick auf die Ergebnisse zur Wechselwirkung von KF und SF mit dem löslichen Cytochrom c551 aus Ps. aeruginosa wird jedoch deutlich, dass die Spezifität des Cytochrom c1 gegenüber möglicher Substrate alleinig durch das Kriterium des Oberflächenpotentials bedingt ist. Keine der eingeführten Punktmutationen führte zu einem vollständigen Aktivitätsverlust des Proteins. Vielmehr zeigten die meisten Mutanten eine im Vergleich zum Wildtyp leicht herabgesetzte Geschwindigkeitskonstante der Elektronentransport-Reaktion. Der deutlichste Effekt wurde für die Mutanten E243K (36 % der WT-Aktivität) und E243Q (78 % der WT-Aktivität) bestimmt. Dieser Rest ist am oberen, dem Periplasma zugewandten Rand der Hämspalte positioniert, wodurch eine direkte Interaktion mit dem Cytochrom c552 während der Elektronentransport-Reaktion sehr gut möglich ist. Die im Rahmen dieser Arbeit bestimmten Geschwindigkeitskonstanten der Reaktion zwischen Cytochrom c1 und Cytochrom c552 lassen eindeutig auf einen diffusionskontrollierten Prozess schließen. Ein solches Verhalten schließt eine spezifische Oberflächen-Wechselwirkung der beiden Proteine nicht aus Die Ergebnisse der Mutagenesestudie verdeutlichen jedoch, dass die Substratspezifität nicht primär durch definierte gegensätzliche Ladungspaare auf der Oberfläche von Cytochrom c1 und Cytochrom c552 definiert wird.
Protonen gekoppelter Elektronentransfer ist ein zentraler Bestandteil der chemiosmotischen Theorie. Die Beschreibung seiner Natur ist aufgrund seines transienten Charakters eine komplexe Aufgabe. Elektrometrische Messungen stellen hier eine große Hilfe in der Erfassung von Ladungsverschiebungen dar. Sie erlauben die zeitliche Beschreibung des Elektronen- und Protonentransportes, der mit kaum einer geeigneten Methode beobachtet werden kann, und geben Einblick in deren molekularen Mechanismus. Diese Technik wurde hier an drei verschiedenen Membrankomplexen der Atmungskette angewandt: der Cytochrom c Oxidase (COX) aus Paracoccus denitrificans, der Quinol-Fumarat-Reduktase (QFR) aus Wolinella succinogenes und dem bc(1)-Komplex aus Saccharomyces cerevisiae. Hinsichtlich der experimentellen Vorgehensweise für kinetische Untersuchungen stellte sich ein übergreifendes Problem. Neben einer schnellen Aktivierung der Enzymsysteme bedurfte es eines definierten Ausgangszustands. Ziel dieser Arbeit war das Etablieren von Bedingungen, die elektrometrische Messungen am bc(1) und der QFR erlauben, sowie die Fortführung dieser Methodik am bereits vorhandenen System der COX. Cytochrom c Oxidase Elektrometrische Untersuchungen an der COX wurden basierend auf Vorarbeiten weitergeführt. Insbesondere die Ladungsverschiebungen nach Photoreduktion ausgehend vom völlig oxidierten Zustand rückten in den Fokus. In diesem Schritt wird ein Proton aufgenommen, während Häm a vom angeregten Zustand eines Rutheniumkomplexes reduziert wird. Dieses Verhalten ist unabhängig vom heterogenen Ausgangszustand der COX, er wird jedoch durch eine Änderung des pH-Wertes beeinflußt. Der heterogene Ausgangszustand im O-E-Übergang wurde in einem sequentiellen Modell diskutiert. Dabei wurde auf die Diskrepanz zwischen den elektrometrischen und den publizierten spektroskopischen Messungen hingewiesen. Während spektroskopisch die Cu(A)-Oxidation und Häm a-Reduktion in einer Phase verliefen, wurde in den elektrometrischen Messungen eine zweite deutlich langsamere Phase für den Protonentransfer beobachtet. Ein sequentielles Reaktionsmodell führte hier zu einem Widerspruch. Die Auswirkungen auf die Natur der Kopplung von Häm a und dem aufgenommenen Proton wurden diskutiert. Die Kinetik der Ladungsverschiebung wurde detailliert anhand der Temperaturabhängigkeit und des Isotopeneffektes untersucht und mit den Ergebnissen aus den Messungen an einem thermophilen Enzym, der ba(3)-Oxidase aus Thermus thermophilus, verglichen. Quinol-Fumarat-Reduktase Für eine schnelle Aktivierung der QFR wurde ein caged Fumarat synthetisiert, das nach Photolyse zu einer schnellen Erhöhung der Fumaratkonzentration führte. Die neue Substanz wurde bezüglich einer möglichen Verwendung für die QFR charakterisiert. Die Freisetzung erfolgte mit einer Zeitkonstante von 0,1 ms und aktivierte die QFR nur im photolysierten Zustand. Aufgrund der Photochemie der metallischen Kofaktoren in der QFR konnten jedoch keine kinetischen Messungen durchgeführt werden. Da die photochemisch induzierten Elektronenbewegungen in der QFR mit zunehmender Wellenlänge abnahmen, wurde eine neue Substanz vorgeschlagen, die im sichtbaren Spektralbereich gespalten werden kann. bc(1)-Komplex Der bc(1)-Komplex kann wie die COX durch einen Rutheniumkomplex aktiviert werden. Ein dimerer sowie ein an Cytochrom c gekoppelter Rutheniumkomplex wurde hierfür anhand von Literaturdaten synthetisiert, und die Verbindungen wurden hinsichtlich ihrer Eigenschaften nach Lichtanregung charakterisiert. Für die elektrometrischen Messungen wurde der bc(1)-Komplex in Proteoliposomen rekonstituiert, und der Ausgangszustand des bc(1)-Komplexes unter reduktiven und oxidativen Bedingungen eingestellt. Mit dem dimeren Rutheniumkomplex wurden elektrometrische Experimente durchgeführt, die zu zwei Phasen in der Spannungsantwort führten. Die Daten wurden zusammen mit den publizierten spektroskopischen diskutiert. Dabei wurde eine schnelle elektrogene Phase einem Elektronentransfers zwischen Häm c(1) und dem Eisen-Schwefel-Cluster des Rieske-Proteins zugeordnet. Eine langsamere Phase erwies sich sensitiv gegenüber Antimycin und spiegelt Vorgänge unter der Kontrolle der Q(i)-Bindungsstelle wider.
The development of resistance to multiple drugs is a major problem in treatment of number of infectious diseases and cancer. The phenomenon of multidrug resistance (MDR) is based on the synergetic interplay of a number of mechanisms such as target inactivation, target alteration, prevention of drug influx as well as active extrusion of drugs from the cell. The latter is mediated by over-expression of multidrug efflux pumps. The first discovered and the best characterized until now the human MDR transporter is P-glycoprotein. It is a member of the ATP binding cassette (ABC) superfamily and acts as an active transporter for a variety of anticancer agents using the energy released by ATP hydrolysis. The closest structure and functional homologue of P-glycoprotein found in bacteria is LmrA from Lactococcus lactis. The major goals of this work are to establish the selective isotope labelling of LmrA in Lactococcus lactis, to optimize LmrA sample preparation for solid-state NMR, and finally to perform first solidstate NMR investigations on LmrA shedding light on its catalytic cycle and substrate binding. For a long time the solid-state NMR applications to biological science has been limited to investigation of small molecules mostly. Recently, the solid-state NMR methods have shown potential for structuraland non-perturbing, site directed functional studies of large membrane proteins as well as ligands bound to them. However, to our knowledge neither selective isotope amino acid labelling of any ABC transporter, nor NMR investigations on full-length ABC transporter have been reported to date. Solidstate NMR experiments on a membrane protein require reconstitution of purified proteins into a membrane environment at a high density and either isotopic enrichment of the protein or bound drugs or inhibitors. Therefore, the large quantities of LmrA reconstituted at a high density in lipid membranes, sufficient for advanced NMR studies have been produced and its functional state in reconstituted form has been assessed. In the next step, a procedure for cost effective selective amino acids isotope labelling of LmrA in Lactococcus lactis has been established. Using this protocol deuterium alanine labelled LmrA reconstituted into E. coli liposomes has been prepared. Deuterium NMR has been used extensively to assess the proteins dynamics in past. However, it has never been applied to ABC transporter. Here, we report 2H NMR on selective alanine isotope labelled LmrA which has been used to shed light on the dynamics changes in the protein occurred under AMP-PNP, non-hydrolysable ATP analogue, binding and in ATP/ADP-Vanadate trapped state. It has been found that the major conformation changes affecting the protein motional characteristics occur in the ATP binding domains but not in the transmembrane domains. Additionally, the binding of several substrates to LmrA has been studied by fluorescence spectroscopy as well as by 19F and 31P solid-state NMR. The binding constants for several LmrA substrates have been obtained by fitting the concentration dependant tryptophan intrinsic fluorescence quenching curves. Based on the fluorescence studies and solid-state NMR data, the conformation changes in LmrA under substrate binding have been discussed. In addition, the preferable location of nine LmrA and P-glycoprotein substrates within the model membrane has been studied via 1H-MAS-NOESY-NMR. The results have been interpreted with respect to LmrA and P-glycoprotein binding site accessibility from the membrane interface region.
The Na+/proline transporter of E. Coli (PutP) is responsible for the uptake of proline which is subsequently used not only as a carbon and nitrogen source and a constituent of proteins but also as a particularly effective osmoprotectant. However, for a long time there was little known about the single steps in the reaction cycle of this transporter and only few details about its structure-function relationship are available. Aim of the present work was to achieve a deeper understanding about the kinetic properties of the Na+/proline transporter and to get insights into the structure-function relationship of the substrate binding. To answer these questions different techniques were used. By using the novel SSM technique combining the preparation of PutP proteoliposomes it was possible to demonstrate for the first time the electrogenic substrate binding to PutP transporter. Due to rapid solution exchange measurements on the SSM it was additionally possible to obtain time resolved information about the kinetic details of the cytoplasmic substrate binding sites which were not available by previous steady state and equilibrium binding measurements. Pre-steady-state charge translocation was observed after rapid addition of one or both of the cosubstrates Na+ and/or proline to the PutP-WT proteoliposomes adsorbed on the SSM. Thereby it was possible to link the observed electrical signals with the binding activity of PutP. The observed Na+ and/or proline induced charge displacement were assigned to an electrogenic Na+ and/or proline binding process at the cytoplasmic face of the enzyme with a rate constant of k > 50 s-1 proceeding the rate limiting step of the reaction cycle. Furthermore, based on the kinetic analysis of the electrical signals obtained from the measurements of PutP on SSM, the following characteristics of the substrates binding in PutP were deduced: (1) both Na+ and proline can bind individually to the transporter. Under physiological conditions, an ordered binding mechanism prevails; while at sufficiently high concentrations, each substrate can bind in the absence of the other; (2) substrate binding is electrogenic not only for Na+, but also for the uncharged cosubstrate proline. The charge displacement associated with Na+ binding and proline binding is of comparable size and independent of the presence of the respective cosubstrate. In addition, it was concluded that Na+ accesses its binding site through a high-field access channel resulting in a charge translocation, whereas the binding of the electroneutral proline induces a conformation alteration involving the displacement of charged amino acid residue(s) of the protein; (3) Na+ and proline binding sites interact cooperatively with each other by increasing the affinity and/or the speed of binding of the respective cosubstrate; (4) proline binding proceeds in a two step process: low affinity (~ 0.9 mM) electroneutral substrate binding followed by a nearly irreversible electrogenic conformational transition; (5) membrane impermeable PCMBS inhibits both Na+ and proline binding to the inside-out orientated PutP transporter, indicating that rather than selectively blocking a specific binding site, PCMBS probably locks the enzyme in an inactive state. The possible targets for this SH-reagent are cysteines 281 and 344 located close to the cytoplasmic surface of the protein. Beyond it, transient electrical currents of PutP were also observed on the BLM after rapid addition of proline in the presence of Na+. This was possible by combining the conventional BLM technique with high-speed flash-photolysis of caged-proline. Indeed the signals on the BLM indicate the detection of a different underlying reaction process in comparison to the data achieved by the SSM technique. This has paved the way for supplemental information about the reaction cycle since it was possible to assign the flash-photolysis BLM signals to the proline binding step followed by the internalization of Na+ and proline into the liposome. Thereby it was found, that the presence of Na+ is indispensable and the time constant for the process is ~ 63 ms. Moreover, structure-function information about the Na+ and proline binding sites of PutP was obtained by investigating the functionally important amino acid residues Asp55, Gly63 and Asp187 with site-directed mutagenesis and the combined SSM technique. One finding is that the mutated proteins PutP-D55C and PutP-G63C showed no activity on the SSM. Therefore, it can be assumed that either both Asp55 and Gly63 are crucial for the structure of PutP protein, or they are located at or close to the Na+ and proline binding sites. Furthermore, the results obtained from PutP-D187N and PutP-D187C mutants on SSM suggest that Asp187 of PutP is likely to be involved in the Na+ binding at the cytoplasmic side of the backward running carrier. Taken together the results of the present work have substantially broadened the known picture of the Na+/proline transporter PutP thereby several steps of the reaction cycle were elucidated, and moreover, valuable insights into the structure-function relationship of the transporter have become available.
The technique of site-specific fluorescence labelling with Tetramethylrhodaminemaleimide (TMRM) in combination with two electrode voltage-clamp technique (TEVC), an approach that has been named voltage clamp fluorometry (VCF), has been used in this work to study the Na,K-ATPase. The TMRM dye has the ability to attach covalently to cysteine residues and it responds to changes in the hydrophobicity of its local environment. We exploited this property using a construct of the Na-pump in which the native, extracellularly accessible cysteines were removed and cysteine residues were introduced by site-directed mutagenesis in specific positions of the Na-pump. In this way it was possible to detect site-specific conformational rearrangements of the Na-pump in a time-resolved fashion within a native membrane environment. In particular this technique allows to resolve reactions with low electrogenicity that cannot be satisfactorily analyzed with purely electrophysiological techniques and to identify the conformations of the enzyme under specific ionic composition of the measuring buffers. We used VCF to study the influence that several cations like Na+, K+, NMG+, TEA+ and BTEA+ exert on the distribution of the Na,K-ATPase between several enzymatic intermediates and on some of the reactions related to cation transport. To this end we utilized the mutants N790C in the loop M5-M6 and the mutant E307C, T309C, L311C and E312C in the loop M3-M4. From the correspondence of the fluorescence changes with the activation and inhibition of pumping current, by K+ and ouabain respectively, and from the fact that in Na+/Na+ exchange conditions the voltage distribution of charge movement and fluorescence changes evoked by voltage jumps are in reasonable agreement we conclude that through the fluorescence signals measured from these mutants, we can indeed monitor conformational changes linked to transport activity of the enzyme. For the mutants N790 and L311, it was found that the Na+ dependence of the amplitude and kinetics of the fluorescence signal associated with the E1P-E2P transition is in agreement with the prediction of an access channel model describing the regulation of the access of extracellular Na+ to its binding site. In particular for the mutants E307 and T309 it was found that in Na+/Na+ exchange conditions, the conformational change tracked by the fluorescence was much slower than the charge relaxation at hyperpolarized potentials while the kinetics was very similar at depolarized potentials. This implies that at hyperpolarized potentials the conformational change connected to the E1P-E2P transition does not give a large contribution to the electrogenicity of the process which is also consistent with the access channel model. On the mutant N790C it was found that the external pH does not seem to have any effect on the E1P-E2P equilibrium even if it seems to modulate the fluorescence quantum yield of the dye. Fluorescence quenching experiments with iodide and D2O indicate that at hyperpolarized potentials the local environment of the mutant N790C, experiences a small change in the accessibility to water without major changes in the local electrostatic field ...
Sodium proton antiporters are ubiquitous membrane proteins found in the cytoplasmic and organelle membranes of cells of many different origins, including plants, animals and microorganisms. They are involved in cell energetics, and play primary roles in the homeostasis of intracellular pH, cellular Na+ content and cell volume. Adaptation to high salinity and/or extreme pH in plants and bacteria or in human heart muscles requires the action of such Na+/H+ antiporters. NhaA is the essential Na+/H+ antiporter for pH and Na+ homeostasis (at alkaline pH) in Escherichia coli and many other enterobacteria. NhaA is an electrogenic Na+/H+ antiporter that exchanges 2H+ for 1Na+ (or Li+). NhaA shares with many other prokaryotic and eukaryotic antiporters a very strong dependence on pH. In order to achieve three-dimensional structure of NhaA, the previously described NhaA protein preparation was modified: (i) the wild type bacterial strain (TA16) used for homologous over-expression of NhaA was replaced with a delta nhaA strain (RK20). As a result, the purity and homogeneity of the sample was significantly improved; (ii) the previously two-step purification procedure was shortened to a single step affinity chromatography purification; (iii) a wide-range screening of crystallisation conditions, more than 20,000, was performed; (iv) a Seleno-L-methionine (SeMet) NhaA derivative was produced in order to solve the phases during structure determination. In parallel, attempts of production and crystallisation of co-complexes composed of NhaA and antibody fragments have been made. Four different monoclonal antibodies were available against NhaA. Selected antibody fragments were produced and the stability of the complex analysed. Here, the crystal structure of the pH down-regulated secondary transporter NhaA of Escherichia coli is presented at 3.45 Å resolution. A negatively charged ion funnel opens to the cytoplasm and ends in the middle of the membrane at the putative ion-binding site. There, a unique assembly of two pairs of short helices connected by crossed, extended chains creates a balanced electrostatic environment. A possible mechanism is proposed: the binding of charged substrates causes electric imbalance inducing movements, which allow for a rapid alternating access mechanism. This ion exchange machinery is regulated by a conformational change elicited by a pH signal perceived at the cytoplasmic funnel entry. The structure represents a novel fold that provides two major insights: it reveals the structural basis for the mechanism of Na+/H+ exchange and its unique regulation by pH in NhaA and in many other similar antiporters. Furthermore, it is also important for the understanding of the architecture of membrane proteins in general. However, although many aspects of the ion-translocation mechanism and pH regulation are clarified by the NhaA structure, higher resolution structures with Li+ or Na+ bound are required for understanding the ligand binding and the translocation mechanism at the atomic level. The alkaline pH-induced conformation is essential to further understand the pH-control and proton access to the binding site.
Die chromosomale Translokation t(4;11) ist mit einer aggressiven pro-B ALL im Kleinkindesalter assoziiert und stellt eine der häufigsten genetischen Veränderungen des MLL Gens dar. Bei bis zu 40 % der untersuchten Translokationen des MLL Gens wurde das AF4 Gen als Translokationspartner identifiziert. Durch Arbeiten in unserer Arbeitsgruppe konnte in Focus Formation Experimenten das wachstumstrans-formierende Potenzial sowohl des Wildtyp AF4 Proteins, als auch des bei der Translokation entstehenden AF4•MLL Fusionsproteins, nachgewiesen werden. Es kann somit als gesichert angesehen werden, daß es sich bei dem Wildtyp-AF4 Protein um ein Proto-Onkoprotein und bei dem AF4•MLL Fusionsprotein um ein Onkoprotein handelt. Der für beide Proteine identische Bereich beschränkt sich auf die ersten 360 Aminosäuren des AF4 Proteins, was der Hypothese führte, daß der N-Terminale Bereich des AF4 Proteins (AF4•N) für das beobachtete onkogene Potential in murinen embryonalen Fibroblasten verantwortlich ist. Ein mit dem AF4•N Protein durchgeführter Hefe-2-Hybrid Screen identifizierte die beiden E3-Ligasen SIAH1 und SIAH2 als Bindungspartner. Hierbei handelt es sich um Tumorsupressor- Proteine, die durch Ubiquitinylierung von Zielproteinen diese dem proteasomalen Abbau zuführen. Unter normalen physiologischen Bedingungen unterliegt das AF4 Protein einem raschen Abbau am Proteasom. Dies ist für das AF4•MLL Fusionsprotein nur noch eingeschränkt möglich, da es wie für das Wildtyp-MLL beobachetet proteolytisch gespalten wird, mit sich selbst dimerisiert und dann nicht mehr über das Proteasom abgebaut werden kann. Eine Bindung der beiden E3-Ligasen SIAH1 und SIAH2 konnte jedoch noch beobachtet werden, deshalb sollte die AF4 und SIAH Protein-Protein-Interaktion genauer untersucht werden. Hierzu wurden Hefe-2-Hybrid Experimente mit Deletionsmutanten durchgeführt, um die minimalen Kontakt-domänen zu identifiziert. Die Stärke der Interaktionen wurde durch ß-Galaktosidasetests ermittelt. Die identifizierte minimale AF4 Proteindomäne enthält das für die Erkennung durch die E3-Ligasen notwendige PxAxVxP Motiv und hat eine Länge von 25 Aminosäuren. Für die E3-Ligasen SIAH1 und SIAH2 konnte der für die Interaktion notwendige Kontaktbereich innerhalb der sogenannten Substrat-Bindungs-Domäne (SBD) lokalisiert werden. Interessanterweise ist nicht die große Furche des Dimerisierungsinterfaces der beiden SIAH Monomere der Kontaktbereich, sondern der proximale Zink-Finger Bereich. Die experimentell ermittelten Proteindomänen wurden in geeignete bakterielle Expressionssysteme kloniert und ihre in vitro Interaktion durch Pulldown-Experimente bestätigt. Die strukturelle Aufklärung der Kontaktdomäne erfolgte dann mit Hilfe der NMR-Fast-Mapping Methode. Mit dieser kombinatorischen Methode wurden die an der AF4 Bindung beteiligten Aminosäuren des SIAH Proteins durch Änderung ihrer chemischen Verschiebung im [15N,1H] HSQC-Spektrum nach Titration mit steigenden AF4 Konzentrationen identifiziert. Aus den erhaltenen Daten und anhand der bekannten SIAH Röntgenstruktur konnte ein Modell für die Bindung des AF4 Proteins an die E3-Ligase SIAH1 erstellt werden. Über die Funktion des Proto-Onkoproteins AF4 ist bis dato wenig bekannt. Es gibt Hinweise, daß alle Vertreter der ALF Proteinfamilie über transkriptionsaktivierende Eigenschaften verfügen. Da posttranslationale Modifikationen von Proteinen, wie z.B. Sumoylierung, häufig zur Regulation von Transkriptionsfaktoren beobachtet werden, wurden Untersuchungen auf posttranslationale Modifikationen des AF4 Proteins durchgeführt. Hierzu wurde durch Mutation der E3-Ligase Erkennungssequenz PxAxVxP eine stabilisierte AF4 Mutante hergestellt. Durch Immunopräzipitations Experimente nach Transfektion in 293T Zellen konnte sowohl die Sumoylierung, als auch Tyrosin Phosphorylierungen des AF4 Proteins nachgewiesen werden.
Die NO-sensitive Guanylat-Cyclase (GC), der wichtigste physiologische Rezeptor für Stickstoffmonoxid (NO), ist an der Produktion des sekundären Botenstoffes cGMP beteiligt. Die GC ist ein obligates Heterodimer bestehend aus je einer alpha- und einer beta-Untereinheit, wobei die alphabeta-Isoform am häufigsten vorkommt. Die Bindung von NO an die prosthetische Häm-Gruppe der beta-Untereinheit führt zur Aktivierung des Enzyms. Das dabei gebildete cGMP bindet an Effektorproteine wie Proteinkinase G, Phosphodiesterasen und Ionenkanäle und vermittelt dadurch seine zellulären Effekte. Der Mechanismus der NO-induzierten Aktivierung der GC ist weitgehend bekannt; hingegen ist bisher nur wenig über alternative Regulationsmodi der GC wie zum Beispiel Phosphorylierung, Protein-Protein-Interaktion oder Translokation bekannt. Aufgabe der vorliegenden Arbeit war es daher, die Phosphorylierung der GC durch Tyrosinkinasen der Src-Familie sowie den GC-Interaktionspartner AGAP1 zu untersuchen. Die Tyrosinphosphorylierung der GC konnte in Gegenwart von Protein-Tyrosinphosphatase-Inhibitoren wie Pervanadat erstmals in endogenen Zellen wie Thrombozyten und vaskulären glatten Muskelzellen nachgewiesen werden. Untersuchungen mit dem Inhibitor SU6656 zeigten, dass Kinasen der Src-Familie an der Pervanadat-induzierten Phosphorylierung beteiligt sind. In Überexpressionssystemen wurde die GC durch Src und Fyn phosphoryliert, wobei Src hier deutlich effektiver war. Zudem kann Src die beta-Untereinheit der GC in vitro direkt phosphorylieren. Die Verwendung von Kinase-knockout-Zellen zeigte, dass neben Src auch andere Kinasen die GC-Phosphorylierung vermitteln können. Src interagiert mit dem Holoenzym der GC, wenn der Tyrosinrest 192 der beta-Untereinheit phosphoryliert ist. Hierbei bindet Src über seine SH2-Domäne an die GC. Mit der GC assoziiertes Src kann mindestens einen weiteren Tyrosinrest der beta-Untereinheit phosphorylieren. Ferner weisen einige Resultate auf eine zweite Bindungsstelle hin, die unabhängig von Tyrosin-192 und der SH2-Domäne ist. Experimente zur Lokalisation deuten auf eine möglicherweise durch Src vermittelte Translokation der Guanylat-Cyclase zur Plasmamembran hin. Ein weiterer Teil dieser Arbeit befasste sich mit AGAP1, einem etablierten Interaktionspartner der GC. AGAP1 ist am endosomalen Vesikeltransport beteiligt, indem es die Aktivität von Arf-GTPasen Phospholipid-abhängig stimulieren kann. In dieser Arbeit zeigte sich, dass AGAP1 über seinen N-Terminus sowie einen oder mehrere Segmente des C-Terminus dimerisiert. Außerdem kann AGAP1 über seine Pleckstrin-Homologie-Domäne an Phosphatidylinositol- Monophosphate und Phosphatidylinositol 3,4-bisphosphat binden. Zusammenfassend betrachtet zeigt diese Arbeit neue potentielle Regulationsmechanismen der NO-sensitiven Guanylat-Cyclase durch Tyrosinphosphorylierung und durch die Interaktion mit der Tyrosinkinase Src und dem Multidomänen-Protein AGAP1 auf. Hierbei wird deutlich, dass der NO/cGMP-Signalweg, die Tyrosinphosphorylierungs-Kaskaden und der Vesikeltransport regulatorisch ineinander greifen.
The N-terminal domain (matrix protein or MA) of a retroviral Gag polyprotein precursor plays a critical role in several stages of the retrovirus life cycle. MA is involved in the effective membrane targeting, assembly and release of the immature viral particles from the infected cell. In order to understand the structural basis of these functions, the full length MA from Moloney Murine Leukemia Virus (MoMuLV) was purified and the solution structure of the MA MoMuLV was determined by means of heteronuclear high-resolution NMR spectroscopy and compared with that of the X-ray diffraction analysis as well as with the structures of several MA proteins from geterologous viruses. Structural features were also obtained from CD spectroscopy, dynamic light scattering, sedimentation velocity, differential scanning calorimetry and other methods. It was found that the MA MoMuLV globular core (residues 8-98) is comprised of 7 well-defined helices (five alpha-helices and two 310 helices), with the general fold typical for MA proteins from other retroviral species. The N-terminus (residues Met1-Leu7) and the C-terminal proline-rich part (residues Pro103-Tyr131) are not structured in solution. Although MA MoMuLV has a low sequence identity compared with other matrix proteins for which the three-dimensional structure is known, it was shown that its overall topology and pattern of secondary structural units is similar to other retroviral matrix proteins. The monomeric state is observed for the correctly folded MA MoMuLV in a variety of external conditions and protein concentrations, indicating that virion assembly starts with the plasma membrane targeting of the nascent Gag precursor. The denaturation of MA MoMuLV is irreversible and is connected with protein aggregation. For Moloney Murine Leukemia Virus (MoMuLV) a proteolytic processing of the R-peptide (last 16 amino acids from the C-terminus of the Envelope protein (Env)) has been described as a second mode of fusion and activation preceding the receptor contact between the viral particle and the cellular membrane. An interaction between the R-peptide and MA MoMuLV has been proposed, since the R-peptide and MA are localized at the inner part of the membrane. Therefore the interaction between 15N labelled purified MA MoMuLV and synthesized R-peptide has been investigated using high-resolution NMR. It was found that in water solution MA MoMuLV and R-peptide do not form a tight complex, but in a mature virion in the presence of membranes or other protein factors it might be possible. In the case of HIV-1 the cytoplasmic part (EnvC) of the Env protein is much longer than in other retroviruses and again as for MoMuLV little is known about the interaction between EnvC and HIV MA. Hence, the full length HIV MA, and the last 150 amino acids from HIV Env have been subcloned with suitable expression vectors, purified and analysed by native gel electrophoresis, a pull down assay and by high resolution NMR for the purpose to detect the complex formation of EnvC and HIV MA. Finally, after all those experiments, it was found that a stable complex is not formed, but a weak interaction between the two proteins can not be excluded.
Massenspektrometrische Untersuchungen von DNA, RNA und nichtkovalenten Oligonukleotid-Komplexen
(2005)
Ziel dieser Dissertation war es, grundlegende Untersuchungen zum massenspektrometrischen Nachweis von DNA und RNA durchzuführen, sowie der spezifische Nachweis von nichtkovalenten Oligonukleotid-Komplexen. Dabei lag der Schwerpunkt auf den folgenden drei Bereichen: - Allgemeiner Vergleich zwischen DNA und RNA sowie den Ionisierungsmethoden nano-ESI und MALDI - Quantitative Untersuchung des Einflusses des Salzgehaltes und der Aufreinigung der Probe auf das Spektrum - Grundlegende Vorraussetzungen zum spezifischen Nachweis nichtkovalenter Komplexe mittels Massenspektrometrie (MS) Dabei zeigte sich beim massenspektrometrischen Vergleich von DNA mit RNA, dass die RNA stets eine höhere Stabilität aufweist, wobei diese bei beiden Oligonukleotiden mit steigender Kettenlänge abnimmt. Gleichzeitig erhöht sich mit steigender Kettenlänge die Tendenz zur Kationenanlagerung im Spektrum. Um diese Anlagerungen zu unterdrücken, ist die Verwendung von ammoniumhaltigen Zusätzen ist bei der MS stets erforderlich. Bei MALDI haben die Matrices einen großen Einfluss auf das Fragmentierungsverhalten der Proben. Für die Oligonukleotide konnte daher folgende Einteilung der Matrices von „hart“ nach „weich“ getroffen werden: HCCA > DHB > THAP ungefähr gleich ATT > HPA. Bei der Untersuchung von Oligonukleotiden mittels nano-ESI konnte gezeigt werden, dass die Verwendung von Quarzkapillaren der Verwendung von Glaskapillaren vorzuziehen ist, da mit Quarz die Anlagerungen der Kationen im Spektrum deutlich unterdrückt werden. Weiterhin wurde festgestellt, dass die Erhöhung des Drucks in der ersten Druckstufe zu einer schonenderen Desolvatisierung und damit zu einer deutlich verbesserten Nachweisgrenze führt. Bei der quantitativen Untersuchung des Salzeinflusses konnte eine maximale Salzkonzentration ermittelt werden, bei der eine massenspektrometrische Untersuchung von DNA und RNA noch möglich ist. Dabei hat sich gezeigt, dass bei direktem Vergleich nano-ESI 1000fach empfindlicher auf Salzverunreinigungen reagiert als MALDI. Generell lässt sich sagen, dass RNA eine höhere Tendenz zur Kationenanlagerung besitzt als DNA, wobei sich dieser Effekt mit steigender Kettenlänge verstärkt und bei nano-ESI deutlicher auftritt als bei MALDI. Das hat zur Folge, dass bei RNA ein höherer Aufreinigungsgrad notwendig ist, um im Vergleich zu DNA vergleichbare Ergebnisse zu erhalten. Dem entsprechend wurden neben der Aufreinigungsmethode mittels Ionenpaar-HPLC auch verschiedene Pipettenspitzen, die mit Chromatographiematerial gefüllt sind, zur Aufreinigung verwendet. Mit beiden Methoden konnte eine vergleichbare Reduktion der Kationenanlagerungen im Spektrum erreicht werden, wobei klar ist das die Verwendung von Pipettenspitzen die zeit- und kosteneffizientere Lösung darstellt. Durch ein neuartiges Aufreinigungsprotokoll für Pipettenspitzen konnte der Zeitaufwand noch einmal deutlich reduziert werden. Für die Untersuchung nichtkovalenter Oligonukleotid-Komplexe wurden „native“ Bedingungen gefunden, bei der die native Struktur des Komplexes soweit erhalten bleibt, dass ein spezifischer Nachweis mittels nano-ESI möglich ist. Diese Bedingungen stellen einen Kompromiss zwischen einerseits der Stabilität des Komplexes in Lösung und andererseits den optimalen Bedingungen für die Elektrospray-Ionisierung dar. Die erste untersuchte Komplexklasse waren Oligonukleotid-Dimere. Es wurden verschiedenste DNA-, RNA- sowie DNA-RNA-Hetero-Dimere mit Bindungsenergien zwischen 0 und -22,1 kcal/mol mittels nano-ESI vermessen. Es wurde eine klare Grenze ermittelt, bei der die Detektion nichtkovalenter Komplexe möglich ist. Spezifischen Dimere können im Spektrum nur dann detektiert werden, wenn deren Bindungsenergie mindestens -11,5 kcal/mol oder mehr beträgt. Als zweite Gruppe wurden Oligonukleotid-Dimere mit „Minor Groove Binding Ligands“ (MGBLs) mittels nano-ESI untersucht. Es konnte gezeigt werden, dass die MGBLs spezifisch und in der entsprechenden Bindungsstöchiometrie an DNA-Dimere binden. Für einen neusynthetisierten Ligand konnte erstmals die Bindungspräferenz an DNA-Dimere mit der Massenspektrometrie bestätigt werden. In allen Fällen wurde keine unspezifische Bindung an RNA-Dimere oder DNA-RNA-Hetero-Dimere beobachtet. Als letztes wurden RNA-Aminoglykosid-Komplexe mit nano-ESI untersucht. Hierbei konnten nur teilweise spezifischen Komplexe im Spektren nachgewiesen werden, da die Bindungsenergie einiger Komplexe deutlich unterhalb der Nachweisgrenze von -11,5 kcal/mol lag. Alle genannten nichtkovalenten Komplexe wurden auch mittels MALDI vermessen, allerdings konnten keine spezifischen Komplexe nachgewiesen werden. Durch direkten Vergleich von MALDI mit nano-ESI und entsprechende Kontrollexperimente konnte erstmals gezeigt werden, dass die nichtkovalenten Komplexe nicht wie vermutet während der MALDIKristallisation zerstört werden. Viel mehr werden die Komplexe im MALDI-Kristall unzerstört eingebaut und eine Zerstörung erfolgt erst während des Desorptions-/Ionisationsprozesses. Es besteht die berechtigte Vermutung, dass bei stärker bindenden Komplexen eine unzersetzte Ionisation mittels MALDI erfolgen kann. Daher sind weitere Untersuchungen in diese Richtung sinnvoll und es werden zur Zeit Komplexe, deren Bindungsenergie weit über -22,1 kcal/mol liegt, in der Arbeitsgruppe untersucht. Abschließend ist festzustellen, dass die Massenspektrometrie eine schnelle und effiziente Möglichkeit zur Analyse von DNA und RNA ist, die allerdings einen hohen Anspruch an die Sauberkeit und damit an die Aufreinigung der Probe stellt. Darüber hinaus ist die MS auch in der Lage nichtkovalente Oligonukleotid-Ligand-Komplexe zu untersuchen. Da in den letzten Jahren DNA und RNA als mögliches Zielmolekül für neue Therapieansätze mehr und mehr an Bedeutung gewonnen haben, bietet sich die Massenspektrometrie als eine Möglichkeit zur Analyse von Oligonukleotid-Wirkstoff- Komplexe an.
In dieser Arbeit wurde der Gentransfer von Todesliganden als Ansatz zur Tumor-Gentherapie untersucht. Dazu wurde ein lentiviraler Vektor der zweiten Generationverwendet, der die Todesliganden CD95L oder TRAIL sowie das Markergen EGFP exprimiert. Dies ist die erste Beschreibung von CD95L- oder TRAILexprimierenden lentiviralen Vektoren. Der TRAIL-exprimierende Vektor erwies sich als geeignet für die therapeutische Induktion von Apoptose in humanen Tumorzelllinien auch bei geringen Vektordosen. Die Transduktion mit diesem Vektor bei niedriger MOI führte zu Todesrezeptor-spezifischer Induktion von Apoptose. Diese wurde ausschließlich durch membranständiges TRAIL bei Zell-Zell-Kontakt vermittelt. Die transduzierten Zellen waren zudem in der Lage, bei Kontakt mit nichttransduzierten Zellen in diesen Apoptose auszulösen. Durch den TRAIL-Gentransfer wurde jedoch spezifisch in den transduzierten Zellen Resistenz gegen TRAIL-induzierte Apoptose ausgelöst, während die CD95- oder Cisplatin-induzierte Apoptose nicht beeinflusst war. Dies führte zum Auswachsen einer vollständig TRAIL-resistenten Population. Bereits 72 Stunden nach Transduktion konnten Anzeichen der Resistenz detektiert werden. Der Grund für diese Resistenzinduktion lag in einer spezifischen Blockade der DISC-Bildung und Caspase-8-Aktivierung durch die TRAIL-Todesrezeptoren. Die Signaltransduktion durch den sehr ähnlichen CD95-Signalweg war gänzlich unbeeinflusst. Durchflusszytometrische und proteinbiochemische Untersuchungen der Expression von TRAIL-R1 und TRAIL-R2, sowie die Untersuchung der mRNA-Expression dieser Rezeptoren ergaben, dass beide TRAIL-Todesrezeptoren noch synthetisiert, jedoch intrazellulär zurückgehalten wurden. In fluoreszenzmikroskopischen Versuchen konnte gezeigt werden, dass TRAIL-R2 intrazellulär in einem Komplex mit TRAIL vorlag, der sich im Bereich des ER/Golgi-Apparates befand. Diese Ergebnisse belegen, dass intrazelluläre Interaktion von TRAIL mit seinen Rezeptoren zur Retention dieser Proteine in der Zelle und damit zur Resistenzentwicklung führte. Bei Versuchen zur in vivo-Gentherapie durch lentivirale TRAIL-Expression in humanen Tumortransplantaten auf Nacktmäusen wurde nur ein transienter Effekt erzielt. Es konnte gezeigt werden, dass mit Vektorpartikeln assoziiertes TRAIL-Protein in den Tumoren Apoptose auslöste. Diese Induktion von Apoptose führte zu einer Wachstumsverzögerung. Dadurch wurde jedoch gleichzeitig eine effiziente Transduktion der Tumorzellen mit dem TRAIL-exprimierenden Vektor und ein langfristiger Effekt der TRAIL-Expression verhindert. Diese Ergebnisse zeigen, dass lentiviraler Gentransfer mit konstitutiv TRAIL-exprimierenden Vektoren ungeeignet zur in vivo-Transduktion von Tumoren ist. Gleichzeitig belegen die Ergebnisse der Transduktion mit einem Kontrollkonstrukt einen effizienten Gentransfer. Der hier charakterisierte Resistenzmechanismus ist zuvor nicht beschrieben worden und stellt eine neuartige Form der Therapie-induzierten Resistenz dar. Die proapoptotische Gentherapie durch konstitutive TRAIL-Expression in Tumoren muss nach diesen Ergebnissen neu bewertet werden. Der lentivirale Gentransfer in Tumore in vivo läuft prinzipiell effizient ab. Bei Verwendung eines regulierbaren Expressionssystems und in Kombination mit Suizidgenen könnte eine therapeutische Nutzung des lentiviralen TRAIL-Gentransfers möglich sein.
Das Rauchen von Kokain („Crack“) hat sich in den letzten Jahren weltweit verbreitet und Crack hat eine wichtige Stellung in der Gruppe der harten Drogen eingenommen. Der inhalative Konsum unterscheidet sich von den anderen Formen der Kokain-Aufnahme durch seine schnelle und intensive Wirkung sowie durch einen sehr starken, unkontrollierten Drang zum erneuten Konsum. Schwere gesundheitliche Schäden sind die Folge sowie auch soziale Isolierung und zwischenmenschliche Konflikte. Da zur Finanzierung der Crack-Sucht häufig Straftaten begangen werden, sind diese Fälle forensisch von besonderem Interesse. Im Gegensatz zum nasalen oder intravenösen Konsum entsteht ausschließlich beim Rauchen das Pyrolyseprodukt Anhydroecgoninmethylester (AEME), welches deshalb als Marker für einen Crack-Konsum angesehen wird. Die toxikologischen Aspekte dieser Substanz sind nicht ausreichend untersucht, um dessen toxikologisches Potential abschätzen zu können. Im Rahmen der vorliegenden Arbeit sollten analytische Methoden entwickelt und der Metabolismus von AEME untersucht werden, um Daten an authentischen Proben von Kokainkonsumenten erheben zu können.
Screening und Charakterisierung von Peptidliganden für den BCR-ABL mRNA Translokationsbereich
(2005)
Die reziproke Translokation t(9;22) ist in 95% der chronischen myeloischen Leukämie vorhanden. Bei der Translokation entsteht ein Fusionsprotein BCR-ABL, welches ausreichend für die Entstehung von Leukämien ist. 30% aller akuten lymphatischen Leukämien sind ebenfalls positiv für diese Translokation. Durch die Translokation entsteht am Translokationsbruchpunkt eine einzigartige RNA-Sequenz, welche als Ziel für eine RNA-Liganden Suche dienen kann. Ziel dieser Arbeit war es, Peptidliganden zu finden, welche die BCR-ABL mRNA binden können. Zunächst wurde die bcr-abl mRNA nach Sekundärstruktur-Elementen durchsucht, welche als Interaktionspartner mit Peptiden in Fragen kommen. Hierzu wurde die BCR-ABL mRNA durch das MFold-Programm von Zuker analysiert. Durch die Auswertung der errechneten Diagramme für die thermodynamische Stabilität und die kinetische Prävelanz der Basenpaarinteraktion, wurden zehn verschiedene BCR-ABL mRNA-Bereiche ausgewählt, welche die Möglichkeit besitzen, sich in stabile Sekundärstruktur-Elemente zu falten. Um diese strukturellen Gegebenheiten am BCR-ABL Translokationsbruchpunkt b2a2 im Experiment zu überprüfen, wurden in Kooperation mit Prof. Göbel und Dr. Scheffer RNase-Mapping und Mapping mit einer künstlichen Nuklease durchgeführt. Es konnte im Experiment das Vorhandensein einer Sekundärstruktur nachgewiesen werden. Diese Struktur wird aus einem Stamm mit einer Fehlpaarung, einem asymmetrischen internen Loop, einem weiteren Stamm und durch einen Loop definiert. Gegen diese b2a2-Struktur und gegen neun weitere mRNA-Bereiche wurde eine Phage-Display-Selektion durchgeführt, welche zum Ziel hat, Peptide zu gewinnen, welche die entsprechende RNA-Struktur spezifisch binden können. Nach der Sequenzierung der Phagen, konnten insgesamt 14 verschiedene Peptid-Sequenzen für die zehn unterschiedlichen RNA-Bereiche gefunden werden, welche die Möglichkeit besitzen, mit der jeweiligen Ziel-RNA zu interagieren. Die Phagen-RNA Interaktion wurde durch Fluoreszenz-Korrelations-Spektroskopie ermittelt. Bei dieser Meßmethode werden Diffusionszeiten von markierten Molekülen in Lösung bestimmt. Zwei von den 14 Phagen-Präsentierten-Peptiden zeigen eine Interaktion mit der Ziel RNA. Die gefundenen Peptide besitzen die folgenden AS-Sequenz: das Peptid 12, KHLHLHK und das Peptid 14, NPEKVKMLYVEF. Die Interaktion mit der RNA wurde in nicht kompetitiven und in kompetitiven FCS Experimenten gezeigt. Kompetiert wurde die Phagen-RNA Interaktion mit kompetitor RNA und in einem weiteren Experiment mit den synthetisierten Peptiden. Beide Peptide zeigten im FCS eine Interaktion mit dem b2a2 BCR-ABL Translokationsbruchpunkt. Die kD-Werte der Peptid-RNA Interaktion wurde durch CDTitration ermittelt. Peptid 12 bindet die b2a2-RNA mit einem kD-Wert von 42 μM und Peptid 14 bindet diese RNA mit einem kD-Wert von 52 μM. Durch die CD-Titration wurde auch der Interaktionsort der beiden Peptide mit der b2a2-RNA ermittelt. Ausgehend von unserem b2a2-Strukturmodell, wurden RNA-Mutanten generiert und in Gegenwart von den Peptiden CD-Spektrometrisch untersucht. Die Interaktion von Peptid 12 mit der RNA findet am Loop und am oberen Stamm statt. Das längere Peptid 14 benötigt alle b2a2-RNA Strukturmerkmale, außer dem unteren Stamm, zur Interaktion. Der Einfluß der Peptide auf die Translation wurde durch ein In-vitro-Translationssystem ermittelt. Demnach bindet Peptid 14 an die b2a2-RNA-Struktur und verringert auf diese Weise die Translation. Peptid 12 bindet zwar ebenfalls an die b2a2-RNA, jedoch konnte eine Verringerung der Translation bei diesem Peptid nicht beobachtet werden.
ATP-binding cassette (ABC) Transporter sind ubiquitäre Membranproteine, die die Hydrolyse von ATP in der Regel an die Translokation unterschiedlichster Substrate über biologische Membranen koppeln. Sie bilden eine der größten Familien von aktiven Transportern, werden in allen drei Reichen des Lebens gefunden und sind an einer Vielzahl physiologischer und pathophysiologischer Vorgänge beteiligt. Auf Grund ihrer zentralen Bedeutung für viele zelluläre Prozesse wurden in der hier vorliegenden Arbeit ausgewählte ABC-Transporter bzw. ihre Komponenten strukturell untersucht, mit dem Ziel einen Beitrag zur Aufklärung ihrer molekularen Mechanismen zu leisten. Das erste untersuchte System war der MDR-ABC-Transporter LmrA aus L. lactis, der auf Grund seiner funktionalen Austauschbarkeit mit dem humanen P-Glykoprotein ein geeignetes Modellsystem zur strukturellen Untersuchung dieser medizinisch relevanten Klasse von ABC-Transportern darstellte. In einem ersten Schritt zu seiner Kristallisation wurde durch die Analyse von 43 Protein-Detergens-Kombinationen eine für strukturbiologische Untersuchungen geeignete Proteinpräparation etabliert. Unter Verwendung von FOS-CHOLINE-16 wurde eine bis zur Homogenität gereinigte, monodisperse und stabile Proteinlösung zur Kristallisation gewonnen, mit der eine breit angelegte Analyse des n-dimensionalen Kristallisationsraums von LmrA durchgeführt wurde. Im Zuge der Analyse von insgesamt 9600 Bedingungen wurden vier verschiedene Kristallformen erhalten. Die Datenaufnahme lieferte für die Kristallform 2 unter Verwendung von Synchrotronstrahlung eine schwache Streuung bis zu einer Auflösung von 20 Å. In einem weiteren Projekt wurden die molekularen Grundlagen der Substratspezifität des ABC-Importers Ehu aus S. meliloti untersucht. Hierfür wurde die Kristallstruktur seines Substratbindeproteins EhuB im Komplex mit den kompatiblen Soluten Ectoin bzw. Hydroxyectoin mit einer Auflösung von 1,9 Å bzw. 2,5 Å gelöst. Die beiden erhaltenen Strukturen zeigten einen für Substratbindeproteine der Gruppe II typischen Aufbau aus zwei globulären Domänen, die durch zwei Segmente der Polypeptidkette verbunden wurden. Die Substratbindungsstelle von EhuB war, wie für Substratbindeproteine erwartet, in der Spalte zwischen den beiden globulären Domänen lokalisiert. Ihre Analyse zeigte eine Interaktion des Proteins mit der negativ geladenen Carboxylat-Gruppe der Substrate durch die Bildung von Salzbrücken mit der Seitenkette von Arg85 sowie mittels Wasserstoffbrückenbindungen mit den Hauptketten-Stickstoffatomen von Phe80 und Thr133. Im Unterschied dazu waren für die Bindung des kationischen Anteils der Substrate wesentlich seine Wechselwirkungen mit den aromatischen Resten Phe24, Tyr60 und Phe80 verantwortlich, die durch ihre räumliche Anordnung eine optimale Bindungsstelle für die delokalisierte positive Ladung der Substrate bildeten. Die Bedeutung dieser wahrscheinlich auf Kation-TT und van der Waals Interaktionen beruhenden Wechselwirkungen für die Substratbindung konnten – aufbauend auf der Kristallstruktur – in Kooperation mit der Arbeitsgruppe von Prof. E. Bremer (Universität Marburg) bestätigt werden. Neben den beschriebenen Interaktionen wurde der kationische Anteil der Substrate durch zwei Salzbrücken mit der Seitenkette von Glu21 sowie durch eine Wasserstoffbrückenbindung mit der Hauptketten-Carbonyl-Funktion von Gly78 gebunden. Bei der Bindung des Substrats Hydroxyectoin wurde im Vergleich zu Ectoin eine zusätzliche Wasserstoffbrückenbindung zwischen der Seitenkette von Glu134 und der lediglich in diesem Substrat vorhandenen Hydroxyl-Gruppe beobachtet, die für die dreieinhalbfach höhere Bindungsaffinität von EhuB für Hydroxyectoin gegenüber Ectoin verantwortlich zu sein scheint. Der Vergleich der an der Substratbindung beteiligten Interaktionen in EhuB mit den ebenfalls für kompatible Solute spezifischen Substratbindeproteinen ProX aus E. coli, ProX aus A. fulgidus und OpuAC aus B. subtilis enthüllte gemeinsame Prinzipen der untersuchten Proteine zur Bindung dieser Klasse von Substraten. Von besonderer Bedeutung waren dabei die von bestimmten aromatischen Resten ausgehenden Wechselwirkungen mit dem kationischen Anteil der Substrate, die wahrscheinlich auf Kation-TT und van der Waals Interaktionen beruhen. Im Detail zeigten die Substratbindungsstellen der untersuchten Proteine jedoch signifikante Unterschiede, die eine Anpassung an die für ihre Aufgabe benötigte Bindungsaffinität und das zu bindende Substrat zu sein scheinen.
Struktur und Bindungsverhalten der N-terminalen p85-src-homology-2-Domäne mittels NMR-Spektroskopie
(2006)
Induktion verschiedener Aktivitätsmuster über differentielle Rezeptor-Rekrutierung von Typ I IFN
(2006)
Für die grundlagenorientierte Forschung sowie für die Entwicklung neuer Wirkstoffe spielt der Mechanismus der interzellullären Kommunikation über Botenstoffe, wie Cytokine, eine einflussreiche Rolle. Cytokine sind Proteine, welche von Leukozyten sekretiert werden und von großer Bedeutung für die Stimulierung des angeborenen Immunsystems sind. Hierbei bewirken die Typ I Interferone (Interferone, IFN) durch ihre antivirale, immunmodulatorische, antiproliferative und antiflammatorische Wirkung. Zudem stellen sie eine Verbindung zu der zellulären Immunantwort dar, wirken bei antionkogenen Prozessen mit und aktivieren eine Vielzahl an weiteren Funktionen in der Zelle. Bekannt sind bisher eine Vielzahl verschiedener humaner Interferone (verschiedene IFNa-Subtypen, b, w und e), die über einen gemeinsamen Rezeptor wirken, der sich aus den Untereinheiten ifnar1 und ifnar2 zusammensetzt. Auffallend ist, dass verschiedene Interferone unterschiedliche zelluläre Aktivitätsmuster induzieren. Mit dieser Arbeit sollte daher ein möglicher Zusammenhang zwischen der differentiellen Rezeptor-Rekrutierung verschiedener Interferone und der Induktion verschiedener Aktivitäten geklärt werden. Voraussetzung hierfür war die Aufreinigung verschiedener Interferone (IFNa1, IFNa2, IFNa8, IFNa21, IFNb), Mutanten sowie Cystein-Mutanten zur selektiven Fluoreszenzmarkierung in ausreichender Menge und Reinheit. Um den Einfluss der Bindungsaffinität auf die Aktivität zu untersuchen, wurden Aminosäuren innerhalb der Bindungsstellen zu den Rezeptoruntereinheiten ausgetauscht. Die Änderung der Bindungsaffinität sowie deren Effekt auf die Aktivität wurden überprüft. Mit Hilfe der Cystein-Mutanten an der Position a2S136C / a/wS137C konnte eine ortsspezifische Fluoreszenzmarkierung durchgeführt werden. Für die Untersuchung der Interaktion wurden die extrazellulären Domänen von ifnar1 (ifnar1-EC) und ifnar2 (ifnar2-EC) über einen Deka-Histidin-tag immobilisiert wurden. Die Interaktion wurde in Echtzeit mit der markierungsfreien reflektometrische Interferenzspektroskopie (RIfS) und der totalinternen Reflektions-Fluoreszenzspektroskopie (TIRFS) detektiert. Hierzu wurden die Stöchiometrie, die Kinetik der Interaktion sowie die Bindungsstelle durch Kompetition zu den Rezeptoruntereinheiten charakterisiert. Dabei zeigten sich in der Stöchiometrie (binärer/ternärer Komplex), den Bindungsstellen oder der Konformationsänderung durch ifnar1 keine Unterschiede zwischen den IFN. Als einziges Unterscheidungsmerkmal konnten signifikant unterschiedliche Bindungsaffinitäten an die Rezeptoruntereinheiten ifnar1 und ifnar2 nachgewiesen werden. Dabei war die Rezeptoruntereinheit ifnar2 gegenüber ifnar1 stets die höher affine Komponente mit deutlichen Affinitätsunterschieden von bis zu drei Größenordnungen. Ebenfalls wurde die Assemblierung eines ternären Komplexes untersucht, für den eine 1:1:1-Stöchiometrie für alle IFN beobachtet wurde. Für Assemblierung ternärer Komplexe konnte ein Einfluss durch die Bindungsaffinitäten sowie den relativen sowie absoluten Konzentration der Rezeptoruntereinheiten nachgewiesen werden. Für die Untersuchung verschiedener zellulärer Aktivitäten, die durch die IFN induziert werden, wurde die Assemblierung des Transkriptionsfaktors ISGF3 (Interferon stimulierten Genfaktors 3), die antivirale Aktivität gegen vesikuläre Stomatitis Viren (VSV) sowie die antiproliferative Aktivität überprüft. Für die ISGF3-Aktivität konnten große Unterschiede für die effektiven Konzentrationen (EC50) zwischen den IFN beobachtet werden (pM- bis nM-Bereich). Für eine antiproliferative Aktivität wurde Konzentrationen im nM-Bereich benötigt. Insbesondere konnten Unterschiede zwischen den Aktivitätsmustern beobachtet werden. Durch die Korrelation der Bindungsaffinitäten mit den jeweiligen Aktivitäten konnte ein deutlicher Zusammenhang beobachtet werden. So wurde für die Induktion der ISGF3-Assemblierung eine Abhängigkeit zu der ifnar2-Affinität nachgewiesen. Bei niedrigen IFN-Konzentrationen wird über die ifnar2-Affinität die Verweildauer der Interferone auf der Oberfläche beeinflusst, wodurch Einfluss auf die Anzahl an ternären Komplexen genommen wird. Im Gegensatz hierzu zeigte sich für die antiproliferative Aktivität eine Korrelation zu der Affinität an ifnar1. Auffällig war zudem die Korrelation der differentiellen antiproliferativen Aktivität zu der relativen Bindungsaffinität von ifnar1 zu ifnar2. Dies lässt sich durch eine mögliche Adaption der Zellen gegenüber IFN erklären, die eine Regulation der Rezeptorkonzentration auf der Membran bewirkt. Durch die Modulation der Bindungsaffinität zu ifnar2 und ifnar1 konnte der Einfluss auf die Aktivität bestätigt werden. In der Medizin könnte dies für eine verbesserte therapeutische Anwendung von Bedeutung sein, da der Einsatz von Interferonen zurzeit durch eine Vielzahl an Nebenwirkungen eingeschränkt ist.
One of the central research topics in the field of biophysical chemistry is the structure and function of membrane proteins involved in energy transduction. Both, the aerobic and the anaerobic respiration include electron transfer and proton translocation across the mitochondrial and bacterial membranes. These electron transfer processes lead to changes in oxidation states of cofactors some of which are paramagnetic. Therefore, EPR spectroscopy is the method of choice to obtain electronic and structural information directly related to the function of the respiratory chain proteins. In this work, multifrequency continuous wave (CW) and pulsed EPR spectroscopy has been used to characterize the molybdenum active site of polysulfide reductase (Psr) from the anaerobic bacterium Wolinella succinogenes and the protein-protein complex between cytochrome c oxidase (CcO) and cytochrome c from the aerobic bacterium Paracoccus denitrificans. Molybdenum in Psr-Psr is an enzyme essential for the sulfur respiration of Wolinella succinogenes. Biochemical studies suggested that the active site of this enzyme contains a mononuclear Mo center, which catalyzes the reduction of the substrate polysulfide to sulfide. Until now there is no crystal structure available for Psr. Consequently, current characterizations of this enzyme have to rely on biochemical and spectroscopic investigations. Within the present work, CW and modern pulsed EPR techniques were applied to investigate its catalytically active site. In the first part of this thesis, different redox agents have been used to generate paramagnetic states of Psr. Multifrequency CW-EPR spectroscopy was applied to identify the Mo(V) states. Using simulations of the experimental spectra, three spectroscopically distinct states have been identified based on the Mo hyperfine- and g-tensor values. Comparison of their EPR parameters with those of related enzymes indicated five or six sulfur ligands at the Mo center depending on the state. The state generated by addition of polysulfide is suggested to be the catalytically active form, in which the Mo is coordinated by a sulfur of the polysulfide chain as the sixth ligand. 33S (I = 3/2) labeled polysulfide was prepared to probe the proximity of the polysulfide to the molybdenum center via its hyperfine coupling. 1D-ESEEM and 2D122 HYSCORE spectroscopy was used to detect these hyperfine and quadrupole interactions, which are too small to be observed in conventional CW EPR spectra. To date there has been only one pulsed-EPR study involving a 33S nucleus [Finazzo et.al. 2003]. The reasons are that this nucleus has a high nuclear spin of I = 3/2 and a large nuclear quadrupole moment in addition to the low Larmor frequency. All these make the detection of sulfur and the extraction of structural information demanding. However, analysis of the 2D-data led to a Mo(V) 33S distance in a range of about 2 to 2.5 Å. Mo-S distances found in molybdenum enzymes of the same family are in a range of 1.8 to 2.8 Å suggesting that the 33S is indeed the sixth ligand of the Mo(V) center and demonstrating that polysulfide is the actual substrate for this enzyme. Thus HYSCORE experiments have been proved to be a powerful technique to gain further insight into the active site structures of molybdenum enzymes and the trafficking of substrate atoms during catalysis. Density functional theory (DFT) calculations together with quantitative numerical simulations of the 2D-data will help to obtain more structural details about the molybdenum binding site in Psr. CcO:cytochrome c complex Protein-protein complex formation is an important step in energy conversion biological processes such as respiration and photosynthesis. These protein-protein complexes are involved in long range electron transfer reactions and are known to be of transient nature. Within the bacterial and mitochondrial respiratory electron transport chains such a complex is formed between CcO and cytochrome c. Upon complex formation cytochrome c donates the electrons required for the CcO catalyzed reduction of dioxygen to water. Here, the protein-protein complex formation between CcO and cytochrome c from Paracoccus denitrificans was investigated by pulsed EPR spectroscopy. The idea was to use the relaxation enhancement due to the distance and orientation dependent magnetic dipole-dipole interaction between the paramagnetic centers in the different CcO constructs and cytochromes. Two-pulse electron spin echo experiments were carried out on mixtures of the CuA containing soluble subunit II or the full size CcO with the physiological partner cytochrome c552 or horse heart cytochrome c. Significantly enhanced relaxation of CuA due to specific protein-protein complex formation has been observed in all four cases. In contrast the non-binding cytochrome c1 showed only a very weak relaxation enhancement due to unspecific protein-protein interactions. The echo decays of the slowly relaxing observer spin (CuA of CcO) measured in the absence and presence of the fast relaxing spin (Fe(III) of cytochrome c) permitted the extraction of the pure dipolar relaxation contributions for the different complexes. Measurements at different temperatures proved the dipolar nature of the relaxation enhancement. Furthermore, it was demonstrated experimentally that this approach also works for the full-size CcO, which contains four paramagnetic metal centers, in complex with cytochrome c. Quantitative simulations of the data suggest a broad distribution in distances (2 - 4 nm) and orientations between the CuA and Fe(III) in the complex between CcO and cytochrome c. High-field EPR spectroscopy will be useful to further analyze and prove these complex structures. Within the present work, it has been shown that pulsed relaxation enhancement experiments can be used to investigate the distance and relative orientation between paramagnetic metal centers. Furthermore, it has been demonstrated on a qualitative level, that this method can be used complimentary to other biophysical approaches to study transient electron transfer protein-protein complexes. Finally, within this work it has been proven that this method can be applied also to biological systems where more than two paramagnetic centers are present. This is particularly interesting for supercomplexes between membrane proteins.
Septine bilden eine neue Klasse filamentbildender kleiner GTPasen, die ursprünglich in der Hefe Saccharomyces cerevisiae aufgrund ihrer Funktion in der Cytokinese entdeckt wurden. Mittlerweile wurde gezeigt, dass Septine nicht nur in Pilzen, sondern auch im gesamten Tierreich vorkommen. In Säugern sind bisher zehn Isoformen, die z. T. in mehreren Spleißvarianten auftreten, beschrieben worden. Die Tatsache, dass Septine auch in postmitotischen Geweben wie dem Hirn exprimiert werden, weist darauf hin, dass Septine zumindest in Säugetieren nicht nur in der Zellteilung eine Rolle spielen. Die nachgewiesene Interaktion eines Säugerseseptins mit dem für die Fusion sekretorischer Vesikel essentiellen Membranprotein Syntaxin-1 (Beites et al., 1999) und die Koimmunopräzipitation eines Septinkomplexes mit Antikörpern gegen den Sec6/8-Komplex (Hsu et al., 1998), der beim zielgerichteten Transport sekretorischer Vesikel eine Rolle spielt, deuten darauf hin, dass Säugerseptine ein Funktion bei Transportprozessen spielen könnten. Um weitere Hinweise über die Wirkungsweisen von Septinen zu erhalten, wurden in dieser Arbeit zwei Screening-Systeme angewendet, um Interaktionspartner von Septinen zu identifizieren. Bei einem Suppressor-Screen mit einer Hefe-Septinmutante (cdc1-11) wurden zwei andere Hefeseptine als Suppressoren identifiziert (Cdc3p und Cdc12p), was auf eine Redundanz in der Funktion dieser Septine hinweist. Außerdem wurden Hefe-Zwei-Hybrid-Screens durchgeführt, bei denen eine cDNA-Bank aus adultem Rattenhirn nach potentiellen Interaktionspartnern des N-Terminus und des C-Terminus des Säuger-Septins rSLPa durchsucht wurde, das wegen der oben genannten Koimmunpräzipitation mit Komponenten des Sec6/8-Komplexes möglicherweise eine Rolle in Transportprozessen spielt. Als möglicher Interaktionspartner des N-Terminus von rSLPa wurde die lange Isoform der Kalzium-unabhängigen Phospholipase A2 identifiziert. Die Interaktion konnte in vitro mittels GST-Fusionsproteinen in Kopräzipitations-Experimenten zwar nicht eindeutig verifiziert werden. Jedoch wurde in Koexpressionsexperimenten eine Kolokalisation von rSLPa mit iPLA2 beobachtet, was zumindest auf eine mögliche Interaktion beider Proteine in vitro hindeutet. Weitere Untersuchungen sind notwendig, um die gefundene Interaktion eindeutig zu verifizieren. Als Interaktionspartner des C-Terminus von rSLPa wurden drei verschiedene Septine identifiziert: KIAA0202, Pntl2 und ein Klon mit hoher Homologie zu Septinen (DKFZp566C224). Die Interaktion von rSLPa und KIAA0202 wurde durch Kolokalisationsstudien in COS-7 Zellen bestätigt. Bei der weiteren Untersuchung verschiedener Säugerseptine und deren Interaktionen wurde die filamentbildende Eigenschaft der Septine näher charakterisiert. Mithilfe von Mutanten, die die Fähigkeit, GTP zu binden, verloren hatten, konnte nachgewiesen werden, dass die GTP-Bindung eine wichtige Funktion in der Filamentbildung hat. Des Weiteren wurde gezeigt, dass der N-Terminus von rSLPa dessen Lokalisation an Aktinstressfasern vermittelt. Mit spezifischen Antiseren, die gegen rSLPa und Septin6 hergestellt wurden, wurde die Expression dieser Septine in verschiedenen Rattengeweben untersucht. Außerdem wurde gezeigt, dass beide Septine während der Entwicklung in etwa gleich bleibenden Mengen in verschiedenen Regionen des Gehirns exprimiert werden, was die Annahme unterstützt, dass diese Septine nicht ausschließlich eine Rolle in der Zellteilung spielen. Die Lokalisation von endogenem sowie überexprimiertem rSLPa wurde in hippocampalen Neuronen untersucht. rSLPa ist nicht synaptisch, sondern in Anreicherungen direkt neben synaptischen Kontakten, bzw. unterhalb von dendritischen Dornfortsätzen lokalisiert. Diese Lokalisation von rSLPa weist neben einer Funktion des Septins in Transportprozessen auch auf eine Rolle in der Kompartimentalisierung der Plasmamembran von Neuronen hin.
Sequenz-spezifische DNA-Rekombination (SSR) bewirkende Systeme aus niederen Organismen, wie z.B. das Cre/loxP-System aus dem P1-Phagen oder das Flp/FRT-System aus Hefe, sind in den letzten Jahren als wichtige und weitverbreitete Werkzeuge zur Modifikation des Säugergenoms etabliert worden. Dies hängt unter anderem mit der Vielfalt an Reaktionen zusammen, welche diese Systeme in der Lage sind durchzuführen. Dazu zählen Exzisions/Deletions-, Integrations-, Inversions- und Translokationsreaktionen. Die hier vorgestellte Arbeit fokussiert auf die Integrationsreaktion, welche aus thermodynamischen Gründen bisher keine breite Anwendung finden konnte, und ihren Einsatz bei der Etablierung allelischer Serien in embryonalen Stammzellen (ES Zellen) oder frühen Embryonen der Maus. Eine solche Methodik wäre ideal für Fragestellungen zu Funktionen von Genen in vivo (Functional Genomics) geeignet. Zur Anwendung kam ein als „Rekombinase vermittelter Kassettenaustausch“ (recombinase-mediated cassette exchange, RMCE) bezeichnetes Verfahren. RMCE ist ein Zwei-Schritt-Verfahren: Zuerst wird der interessierende Genort durch homologe Rekombination derart verändert, daß 5’ und 3’ des Genlocus SSR-Erkennungsstellen eingeführt werden. Durch das Einbringen eines die gleichen Erkennungsstellen tragenden Austauschplasmides und die Bereitstellung der entsprechenden Rekombinase kann die im Genom residierende gegen die eingebrachte Kassette (von Erkennungsstellen flankiertes DNA-Segment) ausgetauscht werden. In dieser Arbeit werden zwei verschiedene Ansätze für RMCE vorgestellt: Der erste Ansatz basiert auf der Verwendung heterospezifischer lox-Sequenzen, welche sich in einer Base unterscheiden (lox511/loxP). Diese Mutation sollte eine effektive Integration durch Verhinderung der Exzision gewährleisten. Es konnte hier gezeigt werden, daß RMCE unter Verwendung einer solchen Methodologie in ES Zellen und frühen Mausembryonen effizient möglich ist, daß das Produkt der Integration jedoch instabil ist und nachfolgender Exzision unterliegt. Diese Deletionsreaktionen sind durch promiskuitive Rekombination der verwendeten lox511 und loxP bedingt. Aus diesen Erkenntnissen wurde ein zweiter Ansatz entwickelt, welcher auf dem simultanen Einsatz des Cre/lox- und des Flp/FRT-Systems basiert. Diese Methodik umgeht die Nachteile promiskuitiver Erkennungssequenzen und ihre Anwendbarkeit, Funktionsfähigkeit und Effizienz in ES Zellen konnten demonstriert werden. Ein solches Verfahren, welches sowohl in Zellkultur als auch in frühen Mausembryonen zum Einsatz kommen könnte, bietet insbesondere im Hinblick auf zukünftige Bedürfnisse in der Functional Genomics viele Optionen.
Die Stat-Proteine liegen als latente Transkriptionsfaktoren im Zytoplasma vor, und spielen eine wichtige Rolle in der Übertragung von Zytokinsignalen von der Zellmembran in den Nukleus. Nach ligandeninduzierter Aktivierung der Zytokinrezeptoren phosphorylieren sich die assoziierten Jak-Kinasen selbst, die intrazellulären Donänen der Rezeptoren und die Mitglieder der Stat-Proteinfamilie. Nach Tyrosinphosphorylierung dimerisieren die Stat Proteine, indem sie Homo- oder Heterodimere bilden und wandern in den Zellkern. Dort können sie spezifische DNASequenzen von Zielgenen binden und deren Transkription steuern. Posttranslationale Modifikationen spielen eine wichtige Rolle in der Aktivierung von Proteinen, Interaktion mit Kofaktoren und in der Proteintranslokation. An einigen zytoplasmatischen und nukleäre Proteinen wie Transkriptionsfaktoren, RNA Polymerase II, Onkoproteinen, Kernporenproteinen und viralen Proteinen wurde eine O-Verknüpfung von einzelnen N-Acetylglukosamin Zuckerresten an Threoninen und Serinen nachgewiesen. Die Rolle dieser posttranslationalen Modifikation beinhaltet unter anderem den Schutz vor Proteolysis, Einfluß auf den Kerntransport, Regulation der Serin- und Tyrosin-Phosphorylierung und Transkriptionskontrolle. Ziel dieser Arbeit war es, eine Modifikation von Stat5a mit einem einzelnen Overknüpften N-Acetylglukosamin (O-GlcNAc) zu identifizieren, und die Funktion dieser Modifikation für Stat5 zu charakterisieren. Es wurde eine O-GlcNAc Modifikation von Stat5a nur im Zellkern nach Zytokinstimulation nachgewiesen. Es konnte auch gezeigt werden, daß andere Stat-Proteine, wie Stat1, Stat3, Stat5b und Stat6, mit O-GlcNAc modifiziert sind, und daß Stat5a auch in Krebs- und Leukämiezellinien glykosyliert vorliegt. Für die Analyse der Glykosylierungsstellen im Massenspektrum und für die weiteren funktionellen Experimente wurde phosphoryliertes, Stat5a rekombinant mit dem Baculovirussystem in Insektenzellen exprimiert. Hierfür wurden die Insektenzellen mit Jak2- und Stat5a-Baculoviren koinfiziert, und die Lysate anschließend chromatographisch aufgereinigt. Es konnte ein O-GlcNAc modifiziertes Peptid am N-Terminus von Stat5a identifiziert werden. Dieses Peptid trägt zwei potentielle Glykosylierungsstellen, Threonin 92 und Threonin 97. Die potentielle Glykosylierungstelle Threonin 92 wurde zu einem Alanin mutiert (Stat5a-T92A) und in funktionellen Experimenten mit glykosyliertem und nicht glykosyliertem Stat5a verglichen. Um den möglichen Einfluß der Stat5a-Glykosylierung auf den Kerntransport zu analysieren, wurden HC11-Zellen mit dem O-GlcNAcase Inhibitor PUGNAc und den Vorstufen von N-Acetylglukosamin, Glukose und Glukosamin, inkubiert. Dadurch wurde der allgemeine Glykosylierungsstatus der Proteine und auch von Stat5a erhöht, und die Kerntranslokation von Stat5a vor und nach Zytokinstimulation untersucht. Dabei konnte kein Unterschied in der Kerntranslokation von Stat5a im Vergleich von behandelten zu unbehandelten Zellen beobachtet werden. Da bekannt ist, daß die O-GlcNAc Modifikation die DNA-Bindung und die Protein-Protein Interaktionen von großen Proteinkomplexen beinflußt, wurde der Einfluß der Stat5-Glykosylierung auf die DNA-Bindung und auf bekannte Stat5a-Interaktionspartner, wie den Glukokortikoid Rezeptor, den Korepressor der Transkription N-CoR (nuclear corepressor receptor) und den Koaktivator der Transkription CBP (CREB binding protein), untersucht. Die in vitro DNA-Bindung am beta-Casein Oligomer zeigte keinen Unterschied hervorgerufen durch die Glykosylierung oder die Mutation von Threonin 92 von Stat5a auf. Die Interaktion mit N-CoR und mit dem Glukokortikoid Rezeptor wurde durch die Stat5a-Glykosylierung nicht beeinflußt, doch CBP interagierte bevorzugt mit glykosyliertem Stat5a. Die Interaktion mit CBP war nach Mutation der potentiellen Glykosylierungsstelle in Stat5a-T92A aufgehoben. In Luciferase-Experimenten konnte nachgewiesen werden, daß Stat5a-T92A keine Transaktivierungsaktivität im Vergleich zu Wildtyp Stat5a am β-Casein Promotor besitzt. Die Ergebnisse sprechen dafür, daß die Glykosylierungsstelle von Stat5a durch die Mutation des Threonins 92 am N-Terminus zerstört wurde, und daß die fehlende Interaktion mit CBP die Transkription von Zielgenen negativ beinflußt.
Mit Hilfe des Modellorganismus S. cerevisiae konnten alle bisher unbekannten Gene der Gluconeogenese und des Glyoxylat-Zyklus des opportunistisch humanpathogenen Pilzes C. albicans isoliert werden. Erste Hinweise führten zu der Annahme, dass diese Stoffwechselwege möglicherweise essentiell für das vegetative Wachstum sind, so dass sie gute Wirkorte für neu zu entwickelnde Antimycotica darstellen könnten. In dieser Arbeit wurde gezeigt, dass diese Stoffwechselwege ungeeignete Wirkorte für Antimycotica sind, da sie weder essentiell für das vegetative Wachstum sind noch von ihnen Virulenzfaktoren von C. albicans beeinflusst werden (z.B. Hyphenentwicklung). Die Regulation der Gluconeogenese und des Glyoxylat-Zyklus in S. cerevisiae ist gut untersucht und alle Ergebnisse mit C. albicans zeigen, dass die Regulation dieser Stoffwechselwege zwischen diesen beiden Hefen sehr konserviert ist. Es wurde eine Methode für die Identifizierung von essentiellen Genen durch funktionelle Komplementation in S. cerevisiae entwickelt. Diese sogenannte Split-Marker-Selektion basiert auf einer Cre/loxP-vermittelten induzierten Deletion eines essentiellen Gens von S. cerevisiae und der Komplementation des resultierenden letalen Phänotyps durch ein heterolog exprimiertes Gen in einer DNS Genbank. Die Methode ist auch für die Funktionsanalyse von essentiellen Genen in S. cerevisiae geeignet (z.B. Identifizierung von Suppressoren, Analyse finaler Phänotypen). Mit Hilfe der Split-Marker-Selektion wurde das putativ essentielle Gen NEP1 ("nuclear essential protein") von C. albicans identifiziert. Die Funktionsanalyse des homologen Gens in S. cerevisiae ergab, dass das Gen für ein Mikrotubuli-assoziiertes Protein kodiert, das in allen Eukaryonten existiert. Es erwies sich, dass das menschliche Homolog in S. cerevisiae funktionell ist und den letalen Phänotyp einer NEP1 Deletion in S. cerevisiae überwindet. Es zeigte sich weiterhin, dass das menschliche Homolog in S. cerevisiae nicht an Mikrotubuli assoziiert ist. Dies deutet darauf hin, dass die Mikrotubuli-Assoziation nicht für die essentielle Funktion von Nep1p nötig ist. Das bisher uncharakterisierte Protein Ydl148p wurde als Interaktionspartner von Nep1p gefunden. Desweitern konnte SAM2 als Multicopy-Suppressor des konditional letalen Phänotyps (Temperatursensitivität) eines NEP1 Mutantenallels (nep1-ts1) identifiziert werden. Die Suppression wurde hierbei über die erhöhte Konzentration an S-Adenosylmethionin vermittelt. Dieser Cofaktor ist an Methylierungsreaktionen beteiligt, so besteht die Möglichkeit, dass Nep1p eine Methyltransferase ist oder an Methylierungsreaktionen beteiligt ist.
Die Aggregation von Thrombocyten ist ein wichtiger physiologischer Schutzmechanismus zur primären Blutstillung nach Gefäßverletzungen. Dieser Vorgang kann jedoch unter pathologischen Bedingungen zu Herzinfarkten und Schlaganfällen führen. Der Aggregationsprozeß ist durch Ausbildung sogenannter "Fibrinogenbrücken" zwischen verschiedenen Thrombocyten gekennzeichnet. Dies wird durch Bindung von Fibrinogen an das aktivierte Integrin alphaIIbbeta3 auf der Thrombocytenoberfläche ausgelöst. Das kleine G-Protein Rap1B aus der Ras-Superfamilie reguliert den Aktivitätszustand von Integrinen und besitzt damit eine zentrale Rolle bei der Aggregation von Thrombocyten. Die Aktivierung von Rap1B wird durch eine Vielzahl von Plättchenagonisten innerhalb von wenigen Sekunden ausgelöst. Der von Thrombocyten und Gefäßendothelzellen gebildete Botenstoff Stickstoffmonoxid (NO) kann die Thrombocytenaggregation über den NO/cGMP-Signalweg hemmen. Das Signalmolekül NO aktiviert in Thrombocyten die NO-sensitive Guanylyl-Cyclase (sGC), hierdurch wird die Synthese des sekundären Botenstoffes cGMP angeregt. Das cGMP-Molekül aktiviert nachfolgend die cGMP-abhängige Proteinkinase-Ibeta (cGK-Ibeta), welche die aggregationshemmende NO-Wirkung vermittelt. Die verantwortlichen Zielproteine der cGK-Ibeta wurden bis heute jedoch nicht hinreichend aufgeklärt. In der vorliegenden Arbeit sollten verschiedene Aspekte der NO-induzierten Hemmung der Thrombocytenaggregation untersucht werden. Dabei wurden neue Mechanismen dieser Inhibition identifiziert. Zum einen konnte eine kinetisch schnelle Hemmung der Rap1B-Aktivierung in Thrombocyten nachgewiesen werden. Zum anderen konnten einer cGK-Ibeta-vermittelten, kinetisch langsamen Rap1B-Phosphorylierung hemmende Effekte auf die Membranlokalisation von Rap1B in MDCK-Zellen und auf die Zellausbreitung von Hela-Zellen zugeordnet werden. Weiterhin wurde im Rahmen dieser Arbeit eine neue Proteininteraktion zwischen dem mitochondrialen CGI-51-Protein und Rap1B identifiziert und verifiziert. Zur Aufklärung eines Einflusses des NO/cGMP-Signalweges auf die Aktivierung von Rap1B in Thrombocyten wurde die NO/sGC/cGMP/cGK-Ibeta-Signalkaskade auf verschiedenen Stufen aktiviert oder gehemmt, bevor anschließend die Rap1GTPBildung mit verschiedenen Plättchenagonisten induziert wurde. Das aktive Rap1B wurde unter Verwendung eines Rap1GTP-bindenden Fusionsproteins präzipitiert und nachgewiesen. Durch NO-freisetzende Substanzen konnte eine Hemmung der Rap1BAktivierung erreicht werden. Auch die Aktivierung der sGC mit einem spezifischen Aktivator führte zur Inhibition von Rap1B. Die direkte Aktivierung der cGK-Ibeta konnte Rap1B ebenfalls hemmen, während eine Blockade der cGK-Ibeta die NO-induzierte Hemmung der Rap1-Aktivierung verhinderte. Die genannten Effekte des NO/cGMP-Signalwegs waren unabhängig vom Stimulus, der zur Rap1B-Aktivierung genutzt wurde, sowohl die Aktivierung über verschiedene G-Protein-gekoppelte Rezeptoren (GPCR) als auch die Aktivierung über Tyrosin-Kinasen wurden gehemmt. Eine detailliertere Untersuchung ergab, daß cGK-Ibeta die Ca2+-unabhängige Aktivierung von Rap1B hemmen konnte. Die Rolle der cGK-Ibeta wurde abschließend im unabhängigen Zellsystem der Megakaryocyten abgesichert. Die Hemmung der Rap1B-Aktivierung durch den NO/cGMP-Signalweg stellt einen schnellen Regulationsmechanismus zur Inhibition der Thrombocytenaggregation dar. Aus der Literatur ist eine kinetisch langsame Phosphorylierung von Rap1B an Serin-179 durch cGK-Ibeta bekannt. Zur Ermittlung ihrer Funktion wurden mikroskopische Untersuchungen der subzellulären Rap1B-Lokalisation in lebenden MDCK-Zellen durchgeführt. Hierbei konnte gezeigt werden, daß eine nicht-phosphorylierbare Rap1BMutante eine ausgeprägte Membranlokalisation aufweist, während eine phosphomimetische Rap1B-Mutante bevorzugt cytoplasmatisch lokalisiert ist. In einer weiterführenden Studie wurde der Effekt dieser Rap1B-Mutanten auf das Zellausbreitungsverhalten von Hela-Zellen analysiert. Die Expression der nichtphosphorylierbaren Rap1B-Mutante führte dabei zu einer signifikant gesteigerten Zellausbreitung, welche hingegen durch eine phosphomimetische Rap1B-Mutante deutlich abgeschwächt war. Dies impliziert einen zusätzlichen Mechanismus, über den der NO/cGMP-Signalweg die Adhäsion bzw. die Aggregation von Thrombocyten regulieren kann. Zur Identifizierung von neuen Interaktionspartnern, die spezifisch an phosphoryliertes Rap1B binden und dessen subzelluläre Verteilung oder Aktivität regulieren, wurde das Yeast-Two-Hybrid-System eingesetzt. Hierbei konnte das mitochondriale CGI-51-Protein als neuer Bindepartner von Rap1B identifiziert und in Säugerzellen verifiziert werden. Eine phosphospezifische Interaktion konnte allerdings nicht nachgewiesen werden. Das CGI-51-Protein spielt eine wichtige Rolle bei der Proteinsortierung in der äußeren Mitochondrienmembran. Die Funktion der Interaktion von CGI-51-Protein mit Rap1B wurde im Rahmen dieser Arbeit nicht untersucht. Zusammenfassend kann gesagt werden, daß in der vorliegenden Arbeit erstmalig neue Erkenntnisse zur Regulation des kleinen G-Proteins Rap1B durch den NO/cGMP-Signalweg dargestellt sind. Dieser Regelmechanismus besitzt eine physioplogische Bedeutung bei der Inhibition der Thrombocytenaggregation.
Erfolgreich wurde die biochemische Synthese eines Kernbereiches der spleißosomalen U4/U6-RNA etabliert und die Sekundärstruktur mittels NMR-spektroskopischer Methoden charakterisiert. Die Konformationen von zwei molekularen Regeleinheiten, des auf Gramicidin A basierenden Ionenkanals Minigramicidin sowie einem aus zwei cis-Dekalinen aufgebautenmolekularen Schalters konnten in unterschiedlichen Umgebungen mit Hilfe der NMR-Spektroskopie erfolgreich bestimmt werden. Die Synthese des RNA-Konstruktes u4u6a46phh2 erfolgte durch Transkription von plasmidischer Templat-DNA mit T7-Polymerase und anschließender Aufreinigung mittels Gelelektrophorese und Homogenisierung am 3’-Ende mit Hilfe eines passenden Hammerhead-Ribozyms. u4u6a46phh2-RNA kann als Konstrukt für die Synthese von 13C/15N-gelabelter RNA dienen, da die Schneidreaktion und die daraus resultierende RNA definiert ist und die Integrale der Iminoprotonen für eine einzige Konformation der RNA sprechen. Das von Dr. Hans-Dieter Arndt in der Arbeitsgruppe von Prof. Dr. Koert an der Humboldt-Universität zu Berlin hergestellte Minigramicidin ist aus zwei verkürzten Gramicidin A-Einheiten aufgebaut, die in einer Kopf-an-Kopf Anordnung durch einen Bernsteinsäure-Linker kovalent verknüpft sind. In dieser Arbeit wurden die Strukturen von Minigramicidin in zwei unterschiedlichen Umgebungen aufgeklärt: in Benzol/Aceton (10:1, v/v) ohne Zusatz von Kationen und in gesättigter Cäsiumchlorid-Chloroform/Methanol (3:1, v/v)-Lösung. Im ersten Fall findet man ein doppelt helikales linksgängiges Dimer von Minigramicidin mit ca. 5.7 Resten pro Windung. Diese Struktur hat eine Länge von ca. 38 Å und einen Durchmesser von ca. 1.2 Å. Mit Cäsium-Kationen liegt die Verbindung als Monomer vor. Sie bildet eine rechtsgängige pi-Helix mit ca. 6.3 Resten pro Windung. Die Struktur hat eine Länge von 17 Å und einen Durchmesser von ca. 4.5 Å. Es konnte erstmals eine zur ionenkanalaktiven Form des gA ähnliche Konformation eines auf gA basierenden künstlichen Ionenkanals in organischen Lösemitteln nachgewiesen werden. Der von Dr. Michael Karle aus der Arbeitsgruppe von Prof. Koert an der Philipps-Universität Marburg synthetisierte molekulare Schalter besteht aus zwei cis-Dekalineinheiten, die durch einen 14-gliedrigen Bislactam-Ring miteinander gekoppelt sind. Der Schaltprozeß wurde dabei durch die saure Spaltung des Ley-Acetals in 13 ausgelöst. Es wurde für die Verbindung 13 eine all-axial Stellung für den Makrozyklus gefunden. Diese Struktur wird auch durch die gefundenen Kopplungskonstanten gestützt. Nach dem Schaltprozeß wurde die Struktur von 16 ermittelt. Wie erwartet, wurde durch das Lösen der konformativen Klammer ein Doppelringflip im linken Dekalingerüst ausgelöst und durch den Makrozyklus auf das rechte Dekalingerüst übertragen. Die gefundenen ROE-Abstände und Kopplungskonstanten für bestimmte Dekalinprotonen bestätigen die umgeschaltete Struktur.
G protein-coupled receptors (GPCRs) play regulatory roles in many different physiological processes and they represent one of the most important class of drug targets. However, due to the lack of three-dimensional structures, structure based drug design has not been possible. The major bottleneck in getting three-dimensional crystal structure of GPCRs is to obtain milligram quantities of pure, homogenous and stable protein. Therefore, during my Ph.D. thesis, I focused on expression, characterization and isolation of three GPCRs namely human bradykinin receptor subtype 2 (B2R), human angiotensin II receptor subtype 1 (AT1aR), and human neuromedin U receptor subtype 2 (NmU2R). These receptors were heterologously produced in three different expression systems (i.e. Pichia pastoris, insect cells and mammalian cells), biochemically characterized and subsequently solubilized and purified for structural studies The human bradykinin receptor subtype 2 (B2R) is constitutively expressed in a variety of cells, including endothelial cells, vascular smooth muscle cells and cardiomyocytes. Activation of B2R is important in pathogenesis of inflammation, pain, tissue injury and cardioprotective mechanisms. During this study, recombinant B2R was produced in methylotrophic yeast Pichia pastoris (3.5 pmol/mg), insect cells (10 pmol/mg) and mammalian cells (60 pmol/mg). The recombinant receptor was characterized in terms of [3H] bradykinin binding, G protein coupling, localization, and glycosylation. Subsequently, it was solubilized and purified using affinity chromatography. Homogeneity and stability of purified B2R was monitored by gel filtration analysis. Milligram amounts of pure and stable receptor were obtained from BHK cells and Sf9 cells, which were used for three-dimensional crystallization attempts. The second receptor, which I worked on, is human angiotensin II receptor subtype 1 (AT1aR). AT1aR is distributed in smooth muscle cells, liver, kidney, heart, lung and testis. Activation of AT1aR is implicated in the regulation of blood pressure, hypertension and cardiovascular diseases. Recombinant AT1aR was produced at high levels in Pichia pastoris (167 pmol/mg), while at moderate levels in insect cells (29 pmol/mg) and mammalian cells (32 pmol/mg). The recombinant receptor was characterized in terms of [3H] angiotensin II binding, localization, and glycosylation. Subsequently, the receptor was solubilized and purified using affinity chromatography. Homogeneity and stability of purified AT1aR was monitored by gel filtration analysis. Milligram amounts of pure and stable receptor were obtained from Pichia pastoris, which were used for threedimensional crystallization attempts. In addition to B2R and AT1aR, I also attempted to produce and isolate the human neuromedin U receptor subtype 2 (NmU2R), which was deorphanized recently. It is found in highest abundance in the central nervous system, particularly the medulla oblongata, spinal cord and thalamus. The distribution of this receptor suggests its regulatory role in sensory transmission and modulation. During this study, recombinant NmU2R was produced in Pichia pastoris (6 pmol/mg) and BHK cells (9 pmol/mg). Recombinant receptor was characterized with regard to [125I] NmU binding, localization and glycosylation. Subsequently, the receptor was solubilized and purified using affinity chromatography. Due to its low expression level, further expression optimization is required in order to obtain milligram amounts for structural studies. The long-term goal of this study was to obtain three-dimensional crystal structure of recombinant GPCRs. However, 3-dimensional crystallization of human recombinant membrane proteins still remains a difficult task. On the other hand, recent advances in the solid-state NMR spectroscopy offer ample opportunities to study receptor-ligand systems, provided milligram quantities of purified receptor are available. Therefore, in parallel to 3-dimensional crystallization trials, purified B2R was also used for solid-state NMR analysis in order to investigate the receptor bound conformation of bradykinin. Preliminary results are promising and indicate significant structural changes in bradykinin upon binding to B2R. Further experiments are ongoing and will hopefully result in the structure of receptor bound bradykinin. One of the challenges in GPCR crystallization is the small hydrophilic surface area that is available to make crystal contacts. One possibility to overcome this problem can be the reconstitution of a GPCR complex with an interacting protein for cocrystallization. For this purpose, I coexpressed B2R and AT1aR, which form a stable heterodimer complex, in BHK cells. I could successfully isolate the heterodimer complex by using two-step affinity purification. Unfortunately, this complex was not stable over time and disassociates within three days of purification. However, during coexpression of B2R and AT1aR in BHK cells, I observed that B2R was localized in the plasma membrane in coexpressing cells while it was retained intracellularly when expressed alone. This coexpression of AT1aR with B2R resulted in a four-fold increase in [3H] bradykinin binding sites on the cell surface. In addition, these two receptors were cointernalized in response to their individual specific ligands. Interestingly, colocalization of B2R and AT1aR was also found in human foreskin fibroblasts (which endogenously express both receptors), in line with the possibility that heterodimerization may be required for surface localization of B2R in native tissues as well. This is the first report where surface localization of a peptide GPCR is triggered by a distantly related peptide GPCR. These data support the hypothesis that heterodimerization may be a prerequisite for cell surface localization of some GPCRs. A second approach that I followed to stabilize the purified B2R was to reconstitute the B2R-β-arrestin complex. β-arrestin is a cytosolic protein that participates in agonist mediated desensitization of GPCRs and therefore dampens the cellular responses initiated by the activation of GPCRs. I tried to reconstitute B2R-β-arrestin complex in vitro by mixing purified B2R and purified β-arrestin. But, no interaction of these two proteins was observed in the pull-down assays. However, a C-terminal mutant of B2R (where a part of the C-terminus of the B2R is exchanged with that of the vasopressin receptor) was found to interact with β-arrestin in vitro as revealed by pull-down assays. In conclusion, this work establishes the production, characterization and isolation of three recombinant human GPCRs. Recombinant receptors were produced in milligram amounts and therefore, pave the way for structural analysis. The heterodimer complex of B2R-AT1aR and B2R-β-arrestin complex can be of great help during crystallization. In addition, it was also found for the first time that the surface localization of a peptide GPCR can be triggered by heterodimerization with a distantly related peptide GPCR.
In der Arbeit wurden neue Komplexbildner für die nasschemische, alkalische Reinigung von Siliciumhalbleiteroberflächen vorgestellt. Dabei handelte es sich neben kommerziell verfügbaren Verbindungen, wie beispielsweise Tiron, um den Chelatbildner Pyrinan und die vielversprechende Gruppe der 3-Hydroxypyridin-4(1H)-on-Komplexbildner („Pyridinone“). Insbesondere Letztere sind als effiziente Eisenkomplexbildner von präklinischen Untersuchungen zur Therapie von Eisenstoffwechselerkrankungen bekannt und haben deshalb großes Interesse hervorgerufen. Die Darstellung von Pyrinan und der Pyridinone war in befriedigenden bis guten Ausbeuten mit herkömmlichen Syntheseschritten möglich. Die Synthese konnte somit die im Abschnitt 1.2.1 erwähnten Anforderungen an die Komplexbildner befriedigen. Hinsichtlich der an die Strukturierung von Halbleitermaterialen geknüpften, jedoch bei der Präparation der Komplexbildner nicht realisierten Reinheitsbedingungen, wiesen diese einen teilweise erheblichen Kontaminationsgrad durch Metalle auf. Demzufolge hätten die Komplexbildner als potentielle Kontaminationsquellen bei der SC1-Reinigung von Siliciumsubstraten wirken können. Letzteres konnte jedoch im Rahmen der zehnminütigen Immersionsdauer in ¼/20 SC1 bei 70 °C weitgehend ausgeschlossen werden. Der Trend bei der nasschemischen Reinigung von Halbleitersubstraten mit immer stärker verdünnten Reinigunslösungen und reduzierten Reinigungsbadtemperaturen zu arbeiten, sollten dieses und die folgend zusammengefassten Ergebnisse noch weiter begünstigen. Es wurden Reinigungsexperimente mit Siliciumsubstraten und mit den Reinigungslösungen absichtlich zugesetzten Kontaminanten durchgeführt, um die Wirkungen der einzelnen Verbindungen besser studieren zu können. Es wurden die Metalle Al, Fe, Zn, Cu, Ni und Cr, die in der Halbleiterproduktion als gängige Kontaminanten auftreten, untersucht. Die Metalle Zn, Ni und Cu spielen in der SC1-Lösung, mit abnehmender Gewichtung in der genannten Reihenfolge, aufgrund deren Amminkomplexbildung keine nennenswerten Rolle als Oberflächenkontaminanten. Cr(III) wird in der SC1-Lösung zu Chromat oxidiert und kontaminiert aus diesem Grund die Oberfläche ebenfalls nicht. Dem gegenüber sind Al und Fe unter den gewählten Bedingungen sehr starke Oberflächenkontaminanten. Prinzipiell eignen sich fast alle untersuchten Komplexbildner, die Siliciumoberfläche vor der Kontamination durch Fe aus SC1 zu schützen. Hinsichtlich ihrer Wirksamkeit gegenüber Al und Zn wurden sie jedoch deutlich diskriminiert. Daraus schlussfolgernd ist der Einsatz mehrerer Komplexbildnern erforderlich, um die Kontaminationsgefahr der Siliciumoberfläche durch alle genannten Metalle gezielt kontrollieren und über einen gewissen Schwellenwert vermeiden zu können. Die Wirkung von Pyrinan und der Pyridinone ist vergleichbar, meistens jedoch deutlich besser, als die herkömmlicher Poly(alpha-aminomethylencarbonsäuren) (z. B. EDTA, Untersuchungen von IMEC). Sie erzielen Oberflächenkonzentrationen kritischer Kontaminanten (z. B. Fe) in der Größenordnung, die für die Prozessierung aktueller und künftiger Generationen von Bauelementen erforderlich sind. Konsequenterweise sind deshalb sowohl Pyrinan als auch die Pyridinonkomplexbildner und deren Verwendungszweck zum Patent angemeldet worden. In einem weiteren Teil der Arbeit wurde die Eignung der Komplexbildner bestimmt, hochkonzentrierte, den Halbleiterspezifikationen entsprechende Lösungen von H2O2 stabilisieren zu können. Die Stabilität wurde in Abhängigkeit von drei vorgegebenen Lagerungstemperaturen verfolgt. Sowohl die vorgestellten Verbindungen als auch die als Referenzsubstanz mituntersuchte Verbindung Dequest® 2060s konnten die an einen geeigneten Stabilisator gestellten Bedingungen nicht befriedigen. Lediglich die nicht stabilisierte Lösung von H2O2, die Referenzprobe, besaß eine, über den gesamten Beobachtungszeitraum ausreichende Stabilität. Das mangelhafte Abschneiden der vorgestellten Verbindungen als potentielle Stabilisatoren wird deren partieller bzw. vollständiger Oxidation durch H2O2 zugeordnet und ist am Beispiel von Dequest® 2060s weiter diskutiert worden. Im Zuge der Oxidation werden die intrinsischen Metallkontaminationen der Komplexbildner freigesetzt, wodurch die Kontaminanten in die Lage versetzt werden können, in das Reaktionsgeschehen katalytisch einzugreifen und die Zersetzung der Proben zu beschleunigen. Die Lagerung der Komplexbildner in konzentriertem NH3 stellt die Alternative zur Lagerung in H2O2 dar, wenn man zu einem fertig einsetzbaren, industriellen Produkt für die nasschemische Reinigung von Halbleiteroberflächen gelangen möchte, welches eine einstufige alkalische Reinigung (APM+®) ermöglicht. Hier konnten bis auf die Proben, welche Tiron als Komplexbildner enthielten, keine Besonderheiten festgestellt werden. Die mit Tiron versetzten Proben führen bereits nach sehr kurzer Lagerungsdauer zu einer intensiv rot gefärbten Lösung, die der im Alkalischen und durch Luftsauerstoff erfolgenden Oxidation von Tiron durch Luftsauerstoff zugerechnet wird. Eine, die Reinigungsexperimente ergänzende und wichtige Information, stellt die Stabilität der Komplexbildner und durch diese bedingt die der gesamten Reinigungslösung dar. Letztere wurde durch die titrimetrische Bestimmung der Konzentration von H2O2 ausgesuchter Reinigungslösungen bestimmt. Die Stabilität des Komplexbildners DEHP wurde stellvertretend für die ganze Gruppe (der einfachen Pyridinone) in verschiedenen, in der Halbleiterfertigung üblichen, alkalischen, H2O2 enthaltenden Reinigungslösungen untersucht. Die Stabilitätsbestimmungen von DEHP, ausgedrückt in Form dessen Halbwertszeit der Zersetzung in den Reinigungslösungen, wurden mit Hilfe der UV/Vis-Spektralphotometrie durchgeführt. Im Zuge der Stabilitätsbestimmungen wurde festgestellt, dass der Komplexbildner DEHP die Reinigungslösungen zwischen drei (im Fall von 1,65/1/5 TPM) bis vier (im Fall von ¼/20 SC1 und von 1,65/1/5 NC) Halbwertszeiten zu stabilisieren vermag. Darüber hinaus wurde festgestellt, dass DEHP die niedrigste Halbwertszeit in Reinigungslösungen mit TMAH als Base und die höchste in solchen mit Cholin besitzt. Die in den ¼/20-SC1-Lösungen, also mit NH3 als Base, nimmt die mittlere Stellung der drei untersuchten Typen von Reinigungslösungen ein. Diese Abstufung der Stabilitäten wird einerseits dem individuellen komplexierenden Potential der einzelnen Basen als auch der von Cholin vermuteten Rolle, in der Reinigungslösung als Opferreduktionsmittel zu wirken und damit die Lebensdauer (Halbwertszeit) des Komplexbildners zu fördern, zugeordnet. Die UV/Vis-Spektralphotometrie hat sich darüber hinaus bei den Untersuchungen als einfach handhabbares und möglicherweise auch leicht automatisierbares Quantifizierungsverfahren zur Implementierung in bereits bestehende Reinigungsanlagen erwiesen.
Die Blut-Hirn-Schranke macht das Gehirn zum streng kontrollierten extraterritorialen Raum. Die sensiblen Hirnfunktionen laufen unabhängig und ungestört von den vielfältigen Prozessen der anderen Organe ab. Neben den wichtigen Funktionen dieser Barriere hält sie jedoch auch nötige Medikamente von ihrem Wirkort, dem Gehirn, fern. Die in-vitro-BHS soll Mechanismen aufklären und Tierversuche ersetzen. In den letzten Jahren konnte so das Bild von einem statischen Computer, Gehirn, durch das Bild eines hoch plastischen Arbeitsspeicher-Netzwerkes mit verschiedensten Verbindungen ersetzt werden. Die vorliegende Arbeit ist ein zwei Bereiche gegliedert: 1. Transportstudien von Nanopartikeln und Substanzen im Transwell-System 2. Aufklärung von Transportmechanismen für Nanopartikel an der BHS Die Transportuntersuchungen erfolgten in einem Zwei-Kammer- Transwell-System. Dieses besteht aus zwei Kompartimenten, die zum einen das Blut-Kreislauf-System und zum anderen das Gehirn darstellen sollen. Diese Kompartimente sind durch eine Membran getrennt, auf welche Gehirn-Kapillar-Endothelzellen ausgebracht werden. Membran und ausgebrachte Zellen stellen die BHS dar. Der Transport von Nanopartikeln oder Substanzen wurde durch den Nachweis von Fluoreszenz im Medium der zwei Kompartimente nachgewiesen. Die fluoreszierenden Nanopartikel oder die fluoreszierende Substanz wurden in das obere Donor-Kompartiment gegeben und zu den Zeitpunkten 2, 4, 6 und 24 Stunden wird die Fluoreszenz in Donor- und Akzeptor-Kompartiment gemessen und beurteilt. Bei diesen Transportstudien konnte gezeigt werden, dass dieses System für den Nachweis von Nanopartikel-Transport ungeeignet ist. So benötigen die Nanopartikel zur Überwindung der Membran ohne Zelllayer schon über 24 Stunden. Die Menge der ankommenden Nanopartikel im Akzeptor-Kompartiment war sehr gering. Substanz-Transport und BHS-charakteristische Eigenschaften lassen sich in diesem Modell jedoch gut nachweisen. So konnte die Aktivität der Efflux-Pumpe PgP anhand des Transportes von Rhodamin, einem PgP-Substrat, belegt werden. Während der Transport von Rhodamin nach Zugabe des PgP-Substrates nur eingeschränkt beobachtbar war, konnte der Transport des Rhodamins vom Donor-Kompartiment in das Akzeptor-Kompartiment nach Zugabe des PgP-Hemmers Verapamil innerhalb 4 Stunden nachgewiesen werden. Auch die TEER-erhöhende Wirkung von Hydrokortisol und somit verbesserter Barriereeigenschaften der Zellschicht konnte an diesem Modell nachgewiesen werden. Zur Aufklärung des Mechanismus eines erfolgreichen Nanopartikel-Transports über die Blut-Hirn-Schranke wurde zunächst der rezeptor-vermittelte Transport über den LDL-Rezeptor untersucht. Der LDL-R ist ein Mitglied der LDL-R-Familie welche neben anderen Organen vermehrt in Gehirn und BHS lokalisiert sind. Als Ligand fungiert bei dieser Rezeptorfamilie und insbesondere bei dem LDL-R das ApoE. Mittels ApoE-modifizierter HSA-Nanopartikel sollte eine spezifische Bindung der Transportsysteme über den gebundenen Liganden ApoE an zielspezifische Transport-Mechanismen wie den LDL-R nachgewiesen werden. Über diesen könnten die Nanopartikel endocytiert und der Arzneistoff an seinen Wirkort gebracht werden. Untersuchungen zu diesem Transport-Mechanismus erfolgten in verschiedenen Arbeitsschritten. So wird erst eine Optimierung des LDL-R-Nachweises auf den Zellen durchgeführt. Eine Leberzelllinie wurde auf LDL-R hin untersucht und die Rezeptorkonzentration durch Mehrfachkultivierung der Zellen optimiert. Nach 2-tägiger Kultivierung in lipidfreiem Serum und dem zweimaligen Sorten der Zellen mit einem Antikörper gegen den LDL-Rezeptor konnte ein Nachweis des Rezeptors von 70-90% erreicht werden. Nächster Schritt war die Untersuchung der Bindung von ApoE-modifizierten Nanopartikeln an verschiedenen Zelllinien mit unterschiedlichem LDL-R-Nachweis, gefolgt von Untersuchungen zur Bindungsspezifität. In diesen Untersuchungen sollte die Spezifität dieser Bindung durch Präinkubationen mit einen Antikörper gegen die Liganden-Bindungsstelle und freiem ApoE nachgewiesen werden. Eine Bindung der ApoE-modifierten HSA-Nanopartikel konnte an Endothelzellen des Gehirns nachgewiesen werden. Sowohl die primär isolierten porcinen brain capillary endothelial cells (pBCEC), als auch die Maus-Gehirn-Endothelzelllinie bEnd3 wiesen eine prozentuale Bindung von ApoE-modifizierten Nanopartikeln von über 70% auf. Eine Bindung dieser Partikel an andere getestete Zelllinien mit BHS-Eigenschaften oder einem hohen Nachweis an LDL-R konnte nicht gezeigt werden. Eine Hemmung der Bindung von ApoEmodifizierten Nanopartikeln an Gehirn-Endothelzellen war nicht oder nur geringfügig möglich. So konnte durch eine Präinkubation mit dem Antikörper keine Reduktion der Bindung erreicht werden. Die Präinkubation mit freiem ApoE führte hingegen zu einer sehr geringen Erniedrigung der Bindungsaffinität der ApoE-modifizierten Nanopartikel. Zu beachten war hierbei noch die geringe nachweisbare Bindung von freiem ApoE an die Zellen. In Versuchen zur Bindung von freiem ApoE war eine prozentuale Bindung von freiem ApoE an die Zellen von nur etwa 20% nachweisbar. Bei einer solch geringen Bindung des freien Liganden kann also auch nicht von einer hohen Hemm-Wirkung ausgegangen werden. Es muß nach diesen Untersuchungen davon ausgegangen werden, dass ein ApoE- und Gehirn-Endothelzell-spezifischer Mechansimus am Transport von ApoEmodifizierten Nanopartikeln beteiligt ist. Der untersuchte LDL-R spielt hierbei keine oder nur eine sehr untergeordnete Rolle. Abschließend wurden noch Nanopartikel mit gebundenen ApoE-Mutanten auf ihre Bindung an Zellen getestet. Die modifizierten ApoE-Liganden unterschieden sich in dem Austausch von Aminosäuren in der Ligand-Bindunsdomäne. In Bindungsuntersuchungen konnte bei diesen ApoE-Varianten kein Unterschied in deren Affinität zu Zellen aufgezeigt werden. Dieser Austausch von Aminosäuren in der Liganden-Bindungsstelle hatte keinerlei Auswirkung auf deren Bindung an die Zellen, was wiederum für einen LDL-R unabhängigen Transport-Mechanismus spricht. Am Ende der vorliegenden Arbeit wurde noch ein alternativer Transport-Mechanismus untersucht. Das Heparansulfat-Proteoglykan (HSPG) als alternativer Mechansimus weist Heparin-Bindungsdomänen auf, die der LDL-R Bindungsdomäne sehr ähnlich sind und bekannterweise in der Lage sind, LDL-Partikel zu internalisiseren. Heparinase I kann die anionischen Heparansulfat-Seitenketten entfernen und somit den Internalisierungsmechanismus über das HSPG beeinträchtigen. Untersuchungen zum HSPG und eine Vorinkubation mit verschiedenen Konzentrationen an Heparinase I deuteten auf eine wichtige Rolle des HSPG im Bindungs- und Internalisierungsmechanismus für ApoE-PEG-HSA-NP hin. Die Affinität der ApoE- modifizierten Nanopartikel konnte durch einen Heparinase-Enzymverdau deutlich erniedrigt werden. Auch führte der Einsatz unterschiedlicher Heparinase I-Konzentrationen zu der Annahme, dass es sich um eine konzentrationsabhängige Beeinträchtigung des Mechanimus handelte. So erreichten 10 Units/ml eine weitaus größere Hemmung der ApoE-PEG-HSA-NP-Bindung als Konzentrationen von 2-5 Units/ml. Strukturelle Ähnlichkeiten des ApoEs mit zellpenetrierenden Peptiden sprechen dafür, dass neben dem HSPG noch andere Translokationsmechanismen von Bedeutung sein könnten.
Im Rahmen der Arbeit wurden eine Reihe C2-symmetrischer chiraler Amidiniumsalze hergestellt und ihre katalytische Wirkung in einer Diels-Alder-Reaktion (Schlüsselschritt der Quinkert-Dane-Estronsynthese) untersucht. Für die Synthese der Amidiniumsalze war es erforderlich, einen synthetischen Zugang zu verschiedenen chiralen 1,2-Diaminen zu schaffen und diese herzustellen. Zur Herstellung von chiralen 1,2-Diaminen wurden zwei Synthesekonzepte verfolgt. Zum einen wurden kommerziell zugängliche Aldehyde in einer McMurry-Reaktion in die entsprechenden (E)-Olefine überführt und durch nachfolgende Sharpless-Dihydroxylierung enantioselektiv zu den (R,R)- bzw. (S,S)-Diolen umgesetzt. Diese wurden nach Überführung der Hydroxylgruppen in Mesylat zu den entsprechenden Diaziden umgesetzt. Die Hydrierung der Diazide lieferte schließlich die chiralen 1,2-Diamine. Eine andere Synthesestrategie ging von kommerziell zugänglicher chiraler Weinsäure aus. Die Hydroxylgruppen wurden zunächst durch Überführen in das Acetonid geschützt. Nach Reduktion der Carboxylgruppen zu den primären Alkoholen und nach Kupplung dieser mit Benzylchlorid zu dem entsprechenden Bisbenzyloxymethylderivat konnten die Hydroxylgruppen durch Öffnen des Acetonids entschützt werden. Die freien Hydroxylgruppen wurden in Mesylat überführt. Nach Umsetzung zum Diazid und Abspaltung der Benzylethergruppen konnten die Diazide zu den chiralen 1,2-Diaminen hydriert werden. Ein weiteres chirales 1,2-Diamin wurde durch Nichtabspaltung der Benzyletherschutzgruppen erhalten. Zur Herstellung der C2-symmetrischen chiralen Amidiniumsalze Durch Kupplung verschiedener chiraler 1,2-Diamine mit aus 5-tert-Butyl-isophthalsäure hergestelltem 5-tert-Butyl-isophthalodiimidsäurediethylester-hydrochlorid konnten eine Reihe C2-symmetrischer chiraler Amidiniumsalze mit aromatischen und „aliphatischen“ Resten hergestellt werden. Es wurden mit verschiedenen Katalysatoren Enantiomerenüberschüsse von bis zu 31 % bei 5 °C und bis zu 47 % bei -78 °C erzielt. Es wurden Katalysexperimente in verschiedenen Lösungsmitteln durchgeführt, um deren Einfluß auf Enantioselektivität und Ausbeute zu untersuchen. Dabei konnte gezeigt werden, daß CH2Cl2 in Bezug auf Enantiomerenüberschüsse und Ausbeuten die besten Werte lieferte.
Heterologe Expression des humanen ß-2-adrenergen Rezeptors in Semliki-Forest-Virus-Expressionssystem
(2005)
Der humane ß2-adrenerge Rezeptor besitzt sieben Transmembrandomänen und gehört zur Superfamilie der G-Protein gekoppelten Rezeptoren (GPCRs). Der Rezeptor ist an der Zelloberfläche lokalisiert und kann nach Bindung extrazellulärer Signalstoffe intrazelluläre Antworten auslösen. Als physiologische Liganden des ß2-adrenergen Rezeptors dienen hauptsächlich die Katecholamine wie Noradrenalin. Nach der Bindung des Liganden kann der Rezeptor an ein stimulatorisches G-Protein (Gs) koppeln und durch Aktivierung der Adenylatzyklase die intrazelluläre cAMP-Konzentration regulieren. Aufgrund der großen pharmakologischen Bedeutung von GPCRs ist es wichtig, die dreidimensionale Struktur dieser Rezeptoren aufzuklären. Da die GPCRs im nativen Gewebe nur in geringen Mengen vorkommen, müssen sie heterolog überproduziert und zur Strukturaufklärung gereinigt werden. In dieser Arbeit wurde das Semliki Forest Virus (SFV)-Expressionssystem zur Produktion des ß2-adrenergen Rezeptors etabliert und optimiert. Die Optimierung des SFV-Expressionssystems erfolgte zunächst bei der Produktion von rekombinanten Viren. Die in vitro Transkriptionsreaktion wurde zur Verbesserung der RNA-Ausbeute untersucht. Anschließend wurde eine optimale Bedingung für die Elektroporation gefunden. Dabei konnte einen Virustiter von 7,5 × 108 infektiöse Partikel pro ml erreicht werden. Zur Produktion des Rezeptors in Säugerzellen wurden sieben rekombinante Viren hergestellt. Verschiedene N- und C-terminale Fusionen wurden im Hinblick auf einen möglichen Einfluss auf die Rezeptorproduktion untersucht. Für das Gen des Kapsid-Proteins (CAP) des Semliki-Forest-Virusgenoms konnte eine deutliche Steigerung der Rezeptorproduktion gefunden werden. Auch die Kozak-Sequenz und das Hämagglutinin (HA)-Signal-Peptid zeigten einen positiven Einfluss auf die Rezeptorproduktion. Die heterologe Proteinexpression wurde in verschiedenen Zelllinien durchgeführt. Es zeigte sich, daß die BHK-21-Zellen für die Produktion in großen Mengen am besten geeignet sind. Die Expressionsrate des Rezeptors in BHK-21-Zellen stieg mit zunehmender Infektionsmultiplizität (MOI). Durch Zugabe von Liganden Alprenolol ins Kulturmedium konnte eine weitere signifikante Steigerung von Rezeptorproduktion erzielt werden. So konnte in adhärenten BHK-21-Zellen 20 Stunden nach der Infektion bei einer MOI von 150 und 2 µM Alprenolol im Medium eine Produktionsrate von 49,6 pmol Rezeptor pro mg Membranprotein erreicht werden. In Suspensionskultur konnte eine Produktionsrate von 36,0 pmol Rezeptor pro mg Membranprotein erreicht werden. Damit konnten 0,2 mg Rezeptoren aus 1 Liter Suspensionskultur produziert werden. Die Rezeptorproduktion in Suspensionskultur könnte jedoch weiter verbessert werden. Mit Immunogoldmarkierung konnte eine überwiegende Lokalisation des Rezeptors im endoplasmatischen Retikulum festgestellt werden. Ein N-Glykosylierung des Rezeptors konnte nachgewiesen werden. Die Glykosylierung gehört zum mannosereichen Typ. Für den Rezeptor wurde eine Dissoziationskonstante von 2,7 nM konnte für Liganden [3H]-CGP-12177 bestimmt. Durch Messung der intrazellulären cAMP-Konzentration wurde die vollständige Funktionalität des rekombinanten Rezeptors nachgewiesen. Für die Membranpräparation wurde ein Protokoll erarbeitet, womit ca. 120 mg Membranprotein aus 1 Liter Zellkultur gewonnen werden konnten. Bei der anschließenden Solubilisierung des Rezeptors mit 1,5 % n-Dodecyl-ß-D-maltosid bei pH 7,4 und 100 mM NaCl konnte eine Ausbeute von ca. 100% erreicht werden. In dieser Arbeit konnte nach verschiedenen Versuchen gezeigt werden, daß eine Reinigung über Immobilisierte Metallchelat-Affinitätschromatographie (IMAC) in einem einzigen Schritt nicht möglich war.
Der mitochondriale Apoptose-Signalübertragungsweg spielt nicht nur bei der Death Rezeptor-induzierten Apoptose in Typ II-Zellen eine Rolle, sondern z.B. auch bei Bestrahlung und Behandlung mit Chemotherapeutika. Über Cytochrom-c Freisetzung, Apoptosombildung und Caspase-9 Aktivierung kommt es zur Spaltung und Aktivierung der Effektorcaspase-3. Die durch Bindung von dATP und zytosolischem Cyt-c induzierte Konformationsänderung von APAF-1 führt nach anschließender ATP-Hydrolyse zur Oligomerisierung von insgesamt sieben APAF-1-Molekülen unter gleichzeitiger Rekrutierung von Caspase-9 über die in beiden Molekülen vorhandene N-terminale Caspase-Rekrutierungsdomänen (CARD). Es entsteht der so genannte Apoptosomkomplex. Die autoproteolytische Prozessierung und Aktivierung von Caspase-9 mit anschließender Spaltung von Caspase-3 im Apoptosomkomplex führt zum Auslösen der apoptotischen Caspasekaskade und zur Spaltung wichtige zellulärer Substrate. Eine wichtige Rolle bei der Regulation der Apoptosom-vermittelten Caspase-9-Aktivierung spielen u.a. die Mitglieder der Bcl-2 Proteinfamilie, die IAPs und Hitzeschockproteine. Die Blockade des intrinsischen Apoptose-Signalübertragungsweges führt in Tumoren zur Resistenzentwicklung gegenüber Chemo- und Strahlentherapie. Deshalb wurde mit Hilfe des Hefe-Two-Hybrid Systems ein Screen nach neuen regulatorischen Proteinen, die an der Apoptosomkomplex-Bildung beteiligt sind, durchgeführt und dabei ein neuer APAF-1 Interaktionspartner entdeckt, den wir CABY („CED-4 and APAF-1 binding protein found in yeast“) genannt haben. CABY ist ein 160 Aminosäuren großes, pro-apoptotisches Protein, das eine so genannte DUF59 Domäne enthält, für die bisher noch keine Funktion beschrieben wurde. Es konnte nachgewiesen werden, daß CABY ein evolutionär hoch konserviertes Protein darstellt und daß die humane CABY cDNA zwei alternative Translations-Initiationsregionen enthält, die zu der Expression der CABYL bzw. der um 32 Aminosäuren verkürzten CABYS Isoformen führen. Im Rahmen dieser Arbeit sollte darüber hinaus eine detaillierte molekulare und funktionelle Analyse von CABY durchgeführt werden. Als Hilfsmittel für die molekularbiologische Analyse wurden sowohl CABY-spezifische polyklonale Antiseren als auch Hybridoma-Zelllinien hergestellt, die monoklonale anti-CABY Antikörper produzieren. Mit biochemischen Untersuchungen wie in vitro GST Pulldown und in vivo Ko-Immunpräzipitationsexperimenten, sowie durch Ko-Lokalisationsstudien mit überexprimierten und endogenen Proteinmengen konnte die Bindung von CABY an APAF-1 verifiziert werden. Mit Hilfe von APAF-1-Deletionsmutanten wurden die Aminosäuren 412-420 der zentralen Linkerdomäne als verantwortlicher Bereich für die Interaktion mit CABY identifiziert. Interessanterweise bindet CABY in vitro zusätzlich sowohl an die N-terminale CARD Domäne von APAF-1 als auch an Pro-Caspase-9. Ko-Immunpräzipitationsexperimente mit endogenen Proteinen konnten zeigen, daß CABY in gesunden Zellen nicht nur mit dem vollständigen APAF-1 Protein, sondern auch mit der verkürzten 84 kDa großen APAF-1-Isoform in einem Komplex assoziiert vorliegt. Zudem konnte nachgewiesen werden, daß CABY-Proteine homophile Interaktionen eingehen und Dimere ausbilden können. Neben den Untersuchungen zur Interaktion von CABY mit APAF-1 wurden auch funktionelle Analysen mit Hilfe dominant negativer CABY Deletionsmutanten sowie mit siRNA Zellkulturexperimenten durchgeführt, um die Bedeutung von CABY für den intrinsischen mitochondrialen Apoptose Signalübertragungsweg untersuchen zu können. Es wurde festgestellt, daß bei Überexpression von CABY die Zellen für Mitomycin C-induzierte Apoptose sensitisiert werden. Die Überexpression einer C-terminal um 20 Aminosäuren deletierten CABY Mutante wie auch der N-terminal verkürzten CABYS Isoform inhibieren jedoch Mitomycin C-induzierte Apoptose. Die Ergebnisse aus CABY siRNA-Knockdown-Experimenten lassen vermuten, daß CABY-ähnliche funktionell redundante Proteine existieren. In den mit CABY siRNA stabil transfizierten K562- und RKO-Zelllinien konnte festgestellt werden, daß der Verlust endogener CABY-Expression in diesen Zelllinien nur einen geringen Einfluss auf das Apoptoseverhalten ausübt, und zwar unabhängig von der Art des eingesetzten apoptotischen Stimulus. Einen Hinweis auf einen möglichen kompensatorischen Mechanismus liefert die Existenz des ribosomalen Proteins S28e, dessen DUF59-Domäne zu über 90% identisch ist mit der CABY-DUF59-Domäne. S28e könnte potentiell CABY-Funktionen ausüben. Ausgehend von mit der pro-apoptotischen Funktion von CABY wurde nach Tumortypen gesucht, in denen die CABY-Expression im Vergleich zum Normalgewebe signifikant herunterreguliert wird. Die Analyse endogener CABY Expressionsmengen in humanen Tumoren konnte dabei einen Verlust an CABY Expression in GIST-Tumoren nachweisen. Dieses Ergebnis weist auf eine mögliche Rolle von CABY als Tumorsuppressorprotein hin.
Prostaglandin E2 is the major prostaglandin involved in colorectal carcinogenesis. The biosynthesis of prostaglandin E2 is accomplished by several terminal prostaglandin E synthases through catalytical conversion of the cyclooxygenase product prostaglandin H2. Among the known terminal prostaglandin E synthases, microsomal prostaglandin E synthase type 1 and type 2 were found to be overexpressed in colorectal cancer, however the role and regulation of these enzymes in this tumor entity are yet not fully understood. Here we report that the cyclopentenone prostaglandins 15-deoxy-D12,14-prostaglandin J2 and prostaglandin A2, which have been shown to modulate cell growth and neoplasia, selectively down-regulate microsomal prostaglandin E synthase type 2 mRNA and protein expression in the human colorectal carcinoma cell lines Caco-2 and HCT 116. This effect appeared to be PPARgamma independent and was not found to require G-protein-coupled receptor activation. Instead, inhibition of microsomal prostaglandin E synthase type 2 by cyclopentenone prostaglandins may be mediated by covalent binding of the cyclopentenone ring to cysteine residues on signalling molecules or via a redox-dependent mechanism. Inhibition of microsomal prostaglandin E synthase type 2 was subsequently followed by decreased prostaglandin E synthase activity, which in turn contributed at least in part to the anti-proliferative action of cyclopentenone prostaglandins in HCT 116 cells. Collectively, these data unravel a novel mechanism for the growth-inhibitory effects of cyclopentenone prostaglandins and expose microsomal prostaglandin E synthase type 2 as a new potential target for pharmacological intervention in the treatment of colorectal cancer.
Nucleotide-binding domains (NBDs), roughly 27 kDa in size, are conservative components of the large family of ABC (ATP-binding cassette) transporters, which includes importers, exporters, and receptors. NBDs or ABC-ATPases supply energy for the translocation of a vast variety of substrates across biological membranes. Despite their hydrophilic sequence, many NBDs tend to aggregate and precipitate in solution upon isolation from the complete transporter. The conditions stabilizing an extremely labile NBD component of the E.coli HlyA transporter, HlyB-NBD, were developed. As a result, the pure highly concentrated enzyme was protected from precipitation for months that allowed screening of the unlimited crystallization conditions in the presence of different substrates and performance of the reproducible functional assays. HlyB-NBD was characterized in regard to its uncoupled ATPase activity, oligomeric state, and stability in solution. Comparative analysis of protein stability and ATPase activity in various buffers suggested an inverse relationship between the two. Kinetic analysis of ATPase activity revealed ATP-induced protein dimerization. Gel-filtration experiments with the wild type protein and H662A-mutant of HlyB-NBD provided further evidence of protein dimerization in the presence of ATP. The crystal structures in post- and pre-hydrolysis nucleotide-bound states of HlyB-NBD were determined at 1.6Å and 2.5Å resolution, respectively. While the hydrolytically deficient H662A mutant of HlyB-NBD was crystallized as a stable dimer in the presence of ATP or ATP-Mg2+, with two nucleotide molecules sandwiched between the two monomers, the same protein was shown to be a monomer in the ADP-loaded state. The wild type protein failed to develop crystals with bound ATP, yet formed ADP-bound crystals identical to those of the H662A-mutant. The X-ray structures of HlyB-NBD in various states of the hydrolytic cycle and the functional studies of the enzyme have provided an opportunity to characterize enzyme-substrate complexes and protein-protein interactions between the NBD subunits in great detail. Comparison of the nucleotide-free, the ADP-, and the ATP-loaded states revealed oligomeric and conformational changes of the protein upon substrate binding and resulted in a molecular picture of the catalytic cycle. The correlated results of the structural and functional investigations of HlyB-NBD are discussed with relation to the mechanism of action of ABC transporters.
In der Abteilung „Medizinische Biotechnologie“ des Paul-Ehrlich-Instituts konnte gezeigt werden, dass ein SIVsmmPBj-abgeleiteter Vektor Vorteile gegenüber HIV-1-abgeleiteten Vektoren aufweist, da auch in der G0-Phase des Zellzyklus arretierte Zelllinien und Fibroblasten sowie primäre humane Monozyten transduziert werden können. Im ersten Teil der hier vorliegenden Arbeit wurden die besonderen Transduktionsfähigkeiten diese SIVsmmPBj Vektors eingehend untersucht. Zunächst wurden die transduzierbaren Monozyten morphologisch und biochemisch genauer charakterisiert; insbesondere wurde gezeigt, dass sich diese Zellen tatsächlich in der G0-Phase des Zellzyklus befinden und auch nach der Transduktion die Fähigkeit aufweisen, sowohl in Makrophagen als auch in Dendritischen Zellen auszudifferenzieren. Bei dem Versuch andere primäre humane Blutzellen zu transduzieren wurde gezeigt, dass SIVsmmPBj Vektoren für die Transduktion unstimulierter CD4+ T-Zellen nicht geeignet sind. Zum besseren Verständnis der zugrunde liegenden Mechanismen die zur Transduktion arretierter Zellen und Monozyten durch SIVsmmPBj-abgeleitete Vektoren führen, wurde der Einfluss der akzessorischen viralen Proteine untersucht. Dazu wurde ein PBj-Knockout- Vektor, bei dem die Expression aller akzessorischen Gene (vif, vpx, vpr und nef) inhibiert war, generiert und zur Transduktion von arretierten Zellen und Monozyten eingesetzt. Keines der akzessorischen Proteine war für die Transduktion der in G0 arretierten Zellen notwendig. Für die Transduktion von Monozyten erwies sich das virale Protein Vpx jedoch als essentiell, da der Knockout-Vektor zur Transduktion von Monozyten nur nach Supplementierung mit diesem Protein in der Lage war. Die Supplementierung von HIV-1 Vektoren mit Vpx des SIVsmmPBj ermöglichte keine Transduktion von Monozyten, was darauf hindeutet, dass weitere Proteine von SIVsmmPBj oder aber auch die Fähigkeit der prinzipiellen Transduktion von Zellen der G0-Phase eine Rolle spielen. Im letzten Teil dieser Arbeit wurde ein auf SIVsmmPBj basierendes Dreiplasmid-Vektorsystem entwickelt. Für das Verpackungskonstrukt wurde das Verpackungssignal charakterisiert. Dabei konnte gezeigt werden, dass der Bereich zwischen dem Promotor und dem Spleißdonor gelegene Bereich für eine effiziente Partikelbildung nötig ist und die Deletion der Region zwischen Spleißdonor und gag-Start-ATG zur Inaktivierung des Verpackungssignals ausreicht. Die aus dem Dreiplasmid-System generierten Vektoren erreichten Titer von bis zu 5 x 105 i.E./ml und waren nach Supplementierung mit Vpx dazu in der Lage, primäre humane Monozyten zu transduzieren. Der hier entwickelte, auf SIVsmmPBj basierende Vektor eröffnet neue Möglichkeiten in der Gentherapie. So sind nun auch Monozyten als wichtige Zielzellen der Tumortherapie einem Gentransfer durch lentivirale Vektoren zugänglich.
Im Mittelpunkt dieser Arbeit steht die Charakterisierung zweier Systeme, bei denen schnelle photoinduzierte Ladungstransferreaktionen auftreten. Mittels Anregungs-Abtast-Spektroskopie im sichtbaren Spektralbereich wurde zum einen die bisher noch nicht charakterisierte Primärreaktion des erst vor wenigen Jahren entdeckten bakteriellen Retinalproteins Proteorhodopsin untersucht. Dieses Protein, das einen signifikanten Beitrag zur Energiebilanz der euphotischen Zone leisten kann, zeigt einen vektoriellen, pH-abhängigen und lichtgetriebenen Protonentransfer über die Zellmembran. Mittels zeitaufgelöster Femtosekundenspektroskopie wurde die Primärdynamik in saurer sowie in alkalischer Umgebung untersucht. Nach Photoanregung von Proteorhodopsin zeigt sich eine konzertierte Schwingung des all-trans-Retinals, die in einer biphasischen Reaktion zu einer Isomerisierung zum 13-cis-Zustand führt. Neben den genauen Zerfallszeiten wird auch das Besetzungsverhältnis des schnellen zum langsamen Zerfallskanal durch den Protonierungszustand des primären Protonenakzeptors gesteuert. In alkalischer Umgebung reagieren mehr Moleküle über den schnellen Reaktionskanal als in saurer Umgebung. Zusätzlich vergrößert sich die Quantenausbeute der Isomerisierungsreaktion vom all-trans- zum 13-cis-Retinal um den Faktor zwei beim Erhöhen des pH-Wertes von 6 auf 9. Durch die Reaktion des Chromophors auf die unterschiedlichen Ladungszustände des primären Protonenakzeptors zeigt sich, dass die Proteinumgebung elementar für die Funktion, speziell auch für die primäre Photodynamik, ist. Eine mögliche Erklärung berücksichtigt die räumliche Nähe der entsprechenden Aminosäure zur C13=C14 Bindung. Durch Deprotonierung an dieser Stelle kommt es zu einer Schwächung der genannten Bindung. Die energetische Barriere für die Isomerisierung wird herabgesetzt und diese Reaktion kann schneller und effizienter ablaufen als bei Gegenwart einer protonierten Aminosäure. Da die Ladung des Akzeptors die Reaktion „steuert“, kann von einer elektrostatischen Kontrolle der Reaktionsdynamik gesprochen werden. Im zweiten Teil dieser Arbeit wurde die photoinduzierte Dynamik von Merocyaninen sowohl frei in Lösung als auch an kolloidale Halbleiter gekoppelt untersucht. Für die freien Farbstoffe lassen sich zwei Deaktivierungskanäle unterscheiden. Nach der Photoanregung kann das Merocyanin an der zentralen konjugierten Polymethinkette isomerisieren. Die Entstehung des daraus resultierenden verdrehten Moleküls konnte innerhalb weniger zehn Pikosekunden beobachtet werden. Die andere Möglichkeit die aufgenommene Energie wieder abzugeben besteht in der Bildung eines angeregten Triplettzustandes. Die Besetzung dieses Zustandes lässt sich innerhalb weniger Pikosekunden beobachten und geht somit signifikant schneller vonstatten als die Isomerisierung. Durch Kopplung der Merocyanine an TiO2-Halbleiterkolloide werden andere Deaktivierungskanäle wichtig. Mit einer Zeitkonstante von wenigen zehn Femtosekunden kommt es zu einem schnellen Ladungstransfer aus dem Farbstoff in den Halbleiter. Parallel zu dieser ultraschnellen Elektroneninjektion bildet sich, wie für das ungekoppelte System auch, der verdrehte Zustand. Die Bindung an den Halbleiter führt jedoch zu einer Beschleunigung der Torsionsbewegung, sodass sich die Geometrieänderung innerhalb weniger Pikosekunden beobachten lässt. Auch aus diesem Zustand kommt es zur Elektroneninjektion aus dem Farbstoff in das Leitungsband des Halbleiters. Die Triplettbildung ist dagegen für das gekoppelte System nicht beobachtbar, was zu einer erhöhten Stabilität führt. Neben der Bildung der ladungsgetrennten Zustände konnte mittels der Femtosekundenspektroskopie auch die partielle Rückreaktion zu neutralen Systemen beobachtet werden. Die Reduktion des Merocyaninkations erfolgt innerhalb weniger 100 ps, ist aber nach einer Nanosekunde noch immer nicht vollständig abgeschlossen, sodass ein signifikanter Teil der Moleküle bzw. Kolloide geladen bleibt. Sämtliche Beobachtungen des Farbstoff-Halbleiter-Systems lassen sich in einem Reaktionsmodell zusammenfassen. Mit diesem lässt sich die Dynamik nach Photoanregung erklären, sowie die energetische Lage der beteiligten Zustände im Verhältnis zueinander betrachten. Ein bereits existierendes Reaktionsmodell des freien Farbstoffes konnte mittels der in dieser Arbeit gewonnenen Erkenntnisse auf den Bereich unterhalb von einer Nanosekunde erweitert werden. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass die Ergebnisse dieser Arbeit zum einen dazu dienen, natürliche Ladungstransferreaktionen zu verstehen. Durch die Aufklärung der Primärdynamik von Proteorhodopsin konnte ein weiterer Baustein zum Verständnis dieses erst kürzlich entdeckten und für die Energiebilanz der Meere wichtigen Proteins hinzugefügt werden. Zum anderen tragen die Resultate dieser Arbeit auch zum Verständnis eines künstlichen Photosynthesesystems (Grätzelzelle) bei und können zur Effizienzsteigerung sowie zur Optimierung genutzt werden.
Group III presynaptic metabotropic glutamate receptors (mGluRs) play a central role in regulating presynaptic activity through G-protein effects on ion channels and signal transducing enzymes. Like all Class C G-protein coupled receptors, mGluR8 has an extended intracellular C-terminal domain (CTD) presumed to allow for modulation of downstream signaling. To elucidate the function and modulation of mGluR8, yeast two-hybrid screens of an adult rat brain cDNA library were performed with the CTDs of mGluR8a and 8b (mGluR8-C) as baits. Different components of the sumoylation cascade (ube2a, sumo-1, Pias1, Pias gamma and Pias xbeta) and some other proteins were identified as mGluR8 interacting proteins. Binding assays using recombinant GST-fusion proteins confirmed that Pias1 interacts not only with mGluR8-C, but all group III mGluR CTDs. Pias1 binding to mGluR8-C required a region N-terminally to a consensus sumoylation motif and was not affected by arginine substitution of the conserved lysine K882 within this motif. Co-transfection of fluorescently tagged mGluR8a-C, sumo-1 and enzymes of the sumoylation cascade into HEK 293 cells showed that mGluR8a-C can be sumoylated in cells. Arginine substitution of lysine K882 within the consensus sumoylation motif, but not of other conserved lysines within the CTD, abolished in vivo sumoylation. The results are consistent with post-translational sumoylation providing a novel mechanism of group III mGluR regulation.
In der vorliegenden Arbeit wurden die Strukturen der Excisionase (Xis) aus dem Bakteriophagen HK022 sowie des Proteinkomplexes zwischen Cytochrom c552 und der CuA-Domäne aus T. thermophilus mittels NMR in wässriger Lösung bestimmt. Im Falle der Excisionase wurde mit Hilfe isotopenmarkierter Proteinproben die vollständige Zuordnung der 1H-, 15N- und 13C-Resonanzen durchgeführt. Hierauf basierend wurden anhand verschiedener zwei- und dreidimensionaler NOESY Spektren insgesamt 902 Abstandsbeschränkungen identifiziert, mit deren Hilfe die räumliche Struktur des Proteins bestimmt werden konnte. Die Strukturrechnungen ergaben letztendlich ein Strukturensemble von 20 Konformeren, die aus 2 alpha-Helices und 5 beta-Faltblattsträngen aufgebaut sind. Die beta-Faltblattstränge bilden 2 antiparalelle beta-Faltblätter, während die beiden alpha-Helices eine L-Formation darstellen. Die letzten 12 Aminosäurereste am C-Terminus zeigten keine NOEs und besaßen folglich auch keine geordnete Struktur. Dennoch ist dieser C-terminale Teil der Sequenz möglicherweise von physiologischem Interesse, da für den Rest 66 eine Asn/IsoAsp- Isomerisierung beobachtet wurde, welche eine Rolle bei der Autoregulation dieses Proteins in vivo spielen könnte. Ein weiteres markantes Strukturelement der Excisionase ist das Triprolinsegment Pro32-Pro33-Pro34, das die beiden beta-Faltblätter miteinander verbindet. Diese drei Prolinreste liegen in einer cis-trans-trans Konformation vor; aufgrund von Ligandenwechselwirkungen verschiedener anderer Proteine, die ein solches Motiv besitzen, liegt die Vermutung nahe, daß diese Region in der spezifischen Protein-Protein-Interaktion, die während der exzisiven Rekombination stattfindet, eine Schlüsselrolle spielen könnte. Zur Untersuchung der Wechselwirkung von Cytochrom c552 mit der CuA-Domäne wurden beide löslichen Fragmente mit dem 15N-Isotop angereichert. Daraufhin konnten für jedes Protein heteronukleare NMR-Experimente durchgeführt werden, die eine vollständige Zuordnung der Amidresonanzen sowohl im reduzierten als auch im paramagnetischen oxidierten Zustand ermöglichte. Basierend auf diesen Resonanzzuordnungen konnten Veränderungen der chemischen Verschiebungswerte aufgrund von Oberflächenkontakten mit dem jeweiligen Redoxpartner mittels 2D [15N, 1H]-TROSY Experimenten in beiden Redoxzuständen ermittelt werden. Die betroffenen Aminosäurereste, welche an der Moleküloberfläche die Kontaktzone definieren, wurden für eine Docking-Rechnung herausgezogen, um letztendlich die räumliche Struktur des Elektronentransferkomplexes zwischen Cytochrom c552 und der ba3-Oxidase zu bestimmen. Interessanterweise traten beim Cytochrom c552 zusätzlich zu den Verschiebungseffekten auf der Moleküloberfläche im reduzierten Zustand auch noch sehr dominante Sekundäreffekte im hinteren Teil der Hämspalte an der Stelle auf, wo das Propionat A über Wasserstoffbrückenbindungen mit dem Protein verbunden ist. Analog zu dem System aus P. denitrificans befindet sich auch im Cytochrom c552 aus T. thermophilus in dieser Position ein aromatischer Ring, der vermutlich von elektronischen Veränderungen im Hämring beeinflußt wird und diese Effekte durch seinen somit veränderten Ringstrom an die unmittelbare Umgebung weitergibt. Diese experimentellen Daten unterstützen die Elektronendelokalisierungstheorie von Wikström und Mitarbeitern (Johansson et al., 2002a und b), wonach im reduzierten Häm ein Teil der Elektronenladung bis in die Peripherie des Hämrings delokalisiert ist, einschließlich der nichtkonjugierten Propionatreste. Aus vorangegangenen Studien ergab sich bereits, daß der Elektronentransferkomplex in T. thermophilus auf hydrophoben Wechselwirkungen beruht, im Gegensatz zum P. denitrificans System, in dem die Interaktion elektrostatischer Natur ist (Maneg et al., 2003). Tatsächlich weist die in dieser Arbeit bestimmte Struktur des Elektronentranferkomplexes einen hohen Anteil (ca. 40%) an unpolaren Kontaktoberflächen auf. Das Cytochrom c552 bindet dabei an die CuA-Domäne nahe dem CuA-Zentrum, so daß der Abstand zwischen den Metallzentren von Donor und Akzeptor 15,6 Å beträgt. Der Hämring des Cytochrom c552 berührt die CuA-Domäne im Bereich von Phe86 und Phe88, wie bereits von Soulimane et al. (2000) aufgrund der Sequenzhomologie mit dem P. denitrificans System postuliert worden war. Wie jedoch aus dem berechneten Elektronentransferweg hervorgeht, ist die aromatische Seitenkette des Phe88 nicht unbedingt in die Elektronenübertragung einbezogen. Der ca. 19-20 Å lange Weg des Elektrons führt wahrscheinlich vom Häm über das Proteinrückgrat der CuAReste Ala87 und Phe88 zum CuA-Zentralliganden His114 und schließlich zum binuklearen Kupferzentrum. Dies erklärt auch, wieso eine F88L Mutation der CuA-Domäne (Maneg et al., 2003) nur zu einer 50%igen Abnahme der Aktivität geführt hat. Hiermit ist nun für das T. thermophilus System der gesamte Weg der Elektronenübertragung vom Cytochrom c552 über die CuA-Domäne zur Untereinheit I der ba3-Oxidase in den Grundzügen aufgeklärt, da der Elektronentransfer vom CuA- zum CuB-Zentrum bereits zuvor beschrieben worden war (Soulimane et al., 2000).
In einer Vielzahl von Tumoren begründet sich die maligne Transformation der Zellen in einer Überexpression der ErbB2-Rezeptortyrosinkinase. Aufgrund der erhöhten ErbB2-Rezeptordichte auf der Zelloberfläche wird durch die Aktivierung des Rezeptors eine starke Proliferation der Zellen ausgelöst, welche invasiv in gesundes Gewebe eindringen. Dieses starke Wachstum wird über die Aktivierung ErbB2-vermittelter Angiogenese sichergestellt und lässt sich durch die Verwendung von Chemotherapeutika nicht aufhalten. Auf diese Weise können sich diese malignen Zellen durch Metastasierung im ganzen Körper verteilen, was sich in einer 5 Jahres-Überlebensrate der Patienten von 5 % widerspiegelt. Die Inhibition der ErbB2-Rezeptor-Tyrosinkinase stellt somit durch ihre Rolle in der Tumorprogression, ein relevantes Ziel der modernen Tumormedizin dar. In der vorliegenden Arbeit wurde die ErbB2-Tyrosinkinasedomäne in einem Hefe Zwei-Hybrid System verwendet, um spezifische Interaktionspartner zu isolieren, die mit der Funktion der Kinase interferieren. Bei den potentiellen Inhibitoren handelt es sich um Peptid-Aptamere. Dies sind randomisierte Peptide aus 12 bis 42 Aminosäuren, die in einer konstringierten Konformation in ein Gerüstprotein eingebaut sind. Als Gerüstprotein wurde das intrazelluläre Protein Thioredoxin verwendet, dessen aktives Zentrum als Schleife aus der Proteinstruktur ragt. In dieses aktive Zentrum wurden die randomisierten Peptide inseriert und für die Interaktion mit der Tyrosinkinase präsentiert. Durch die Klonierung einer optimierten PeptidAptamer Bibliothek gelang es einen Pool von 2 x 108 unterschiedlichen Peptiden zu konstruieren. Aus dieser Bibliothek konnten durch das Hefe Zwei-Hybrid System Peptid-Aptamere isoliert werden, die spezifisch mit dem ErbB2-Rezeptor interagierten. Diese in der Hefe gezeigte Interaktion wurde in vitro in GST-Pulldown und in vitro Co-IP Experimenten bestätigt. Damit die Funktion der Aptamere in Krebszellen analysiert werden konnte, wurden die Peptid-Aptamere über die lentivirale Transduktion und Proteintransduktion effizient in Zielzellen eingebracht. Mit Hilfe der Aptamer-Transduktion konnte die Rezeptor-Aptamer Interaktion durch Co-IP und Co-Lokalisationsuntersuchungen auch in ErbB2-exprimierende Zellen, wie SKBr3 und NIH#3.7, bestätigt werden. Zur Funktionsanalyse wurden die Aptamere ferner in MCF7 Zellen eingebracht und dort durch HRG die Aktivierung von ErbB2/ErbB3-Heterodimeren induziert. Diese Heterodimere übertragen über den PKB/AKT-Signalweg ein anti-apoptotischen Signal in die Zelle, welches zur Chemoresistenz-Entwicklung dieser Zellen beiträgt. Die ErbB2-induzierte Aktivierung des PKB/AKT-Signalweges konnte durch die Aptamer-Applikation verhindert werden. Im Folgenden wurden die Aptamere in MCF7 her2 Zellen transduziert. Bei MCF7 her2 Zellen handelt es sich um MCF7 Zellen, die stabil mit ErbB2 transfiziert wurden. Die daraus resultierende Überexpression des ErbB2 Rezeptors führt über die Induktion des AKT-Signalweges zur Resistenz der Zellen gegenüber Chemotherapeutika-Behandlung, wie Taxol. Durch Applikation der Aptamer wurden MCF7 her2 Zellen für die Taxol-Behandlung resensitiviert. Auf diese Weise wurden in der vorliegenden Arbeit Peptid-Aptamere isoliert, die mit der ErbB2-induzierter Chemoresistenz interferierten und damit in Kombination mit einer Taxol-Behandlung eine alternative Therapiemöglichkeit bieten.
In den letzten zwei Dekaden wurde die Rolle der RNA in biologischen Prozessen intensiv untersucht. Man erkannte immer deutlicher, dass ihre Funktion über die einfache Vermittlung von Information von der DNA hin zum Protein weit hinausgeht. So spielt sie eine entscheidende Rolle bei der Genexpression und besitzt darüber hinaus auch katalytische Eigenschaften. Die Entdeckung der reversen Transcriptase beim HI-Virus konnte zeigen, dass genetische Informationen nicht nur in Richtung von DNA zu RNA, sondern auch in Entgegengesetzter Richtung übertragen werden kann. Diese Schlüsselrolle in vielen wichtigen biochemischen Prozessen macht die RNA zu einem viel versprechenden Ziel für die Entwicklung neuer Wirkstoffe, um in diese Prozesse eingreifen zu können. RNA bildet eine Vielzahl von stabilen Sekundär- und Tertiärstrukturen aus, die es Proteinen und Antibiotika ermöglicht, sie zu adressieren. Die bis heute wohl mit Ausnahme des Ribosoms und der tRNAs am besten aufgeklärte Struktur einer RNA ist die der HIV TAR-RNA (transaktivierende Region). Ein essentieller Bestandteil für die virale Genexpression ist die so genannte TAR-RNA. Diese befindet sich am 5-Ende aller viraler Transcripte und bildet eine aus 59 Basen bestehende stem-bulge-loop hairpin Struktur. Diese tritt in Wechselwirkung mit dem tat-Protein. Die Grundlage für die Erkennung des hierbei entstehenden Komplexes ist eine Wechselwirkung von tat mit der bulge- und loop-Region von TAR. Durch Interaktion mit der loop- Region kommt es zur Ausbildung eines CyclinT1/tat Komplexes, der im weiteren dafür verantwortlich ist, dass sich die Rate der Transkription um das mehrere hundertfache erhöht. Ziel der vorliegenden Arbeit war es, Liganden zu synthetisieren, die spezifische Bindungen mit der TAR-RNA aus HIV-1 eingehen. Durch eine solche Bindung ist es möglich, den viralen Replikationszyklus zu unterbrechen. Ausgehend von einem relativ rudimentären Design, basierend auf dem Arginin-Fork-Model von Frankel, gelang es, mit Triaminopyrazol und verschiedenen seiner Derivaten dieses Ziel zu erreichen. Nach erfolgreicher Synthese der Zielstrukturen wurden diese in einem FRET-Assay im Hinblick auf ihre Affinität zu der TAR-RNA getestet. 3,4,5-Triaminopyrazol übertraf trotz seiner geringen Größe und Ladung mit einem IC50-Wert von 30 µM die Werte vieler tetrakationischer Tripeptide (FRET). Nach erfolgreicher Bestimmung der TAR-Affinität von Triaminopyrazol wurde seine Wirkung auf HIV-infizierte Hela P4-Zellen untersucht, die ein Tat-TAR-kontrolliertes Reportergen exprimierten. Dabei zeigte Triaminopyrazol eine Inhibierung mit IC50 = 50 µM. Bis zu einer Konzentration von 500 µM traten hierbei keine toxischen Effekte auf. Dies legt die Vermutung nahe, dass es sich bei Triaminopyrazol tatsächlich um einen tat- Antagonisten handelt. Ebenso konnte gezeigt werden, dass die Wirkung von Triaminopyrazol nicht die eines Entryinhibitors ist, sondern dass die Verbindung in der Lage ist, die Zellmembran zu durchdringen.
Metalle, die mit kubisch innenzentrierter Struktur oder in dichtesten Kugelpackungen kristallisieren, wandeln sich in guter Näherung ohne Volumenänderung ineinander um. Dieser bereits von Pearson 1972 beschriebene Sachverhalt wird hier als Volumenregel formuliert. Elemente in den genannten Strukturen haben die gleiche Dichte. Mit der für die Abhängigkeit des Bindungsgrades s vom Atomabstand r von Pauling 1947 angegebenen Funktion s(r) = exp((R1 - r)/b) wird aus den Kristallstrukturen der festen Elemente das Atomvolumen berechnet, das das jeweilige Element bei gleicher Bindungswertigkeit in einer dieser Strukturen hat. Dabei werden Strukturen mit höherer Dichte als die kubisch innenzentrierte Struktur oder die dichtesten Kugelpackungen nicht gefunden. Diese und einige weitere Strukturen gleicher Dichte (+- 1%) werden hier als dichte Strukturen bezeichnet. Außer den Edelgasen sind alle Elemente, die mit dichten Strukturen kristallisieren, Metalle, doch haben eine Reihe von Metallen (Mangan, Zink, Cadmium, Quecksilber, Gallium und Zinn) nichtdichte Strukturen. Für diese und für die nichtmetallischen Elemente wird das Atomvolumen ihrer dichten Formen berechnet, d.h. das Volumen, das sie unter Normalbedingungen im dichten (metallischen) Zustand einehmen würden. Ist für ein Element der Bindungsgrad für eine Bindungslänge bekannt, so kann aus diesem das Atomvolumen im dichten Zustand abgeschätzt werden. Aus verschiedenen Strukturen von Nichtmetallen (Phosphor und Schwefel etc.) berechnet sich jeweils in guter Näherung das gleiche Atomvolumen für den dichten Zustand VD. Dies bestätigt die Gültigkeit der Pauling-Funktion. Eine weitere Bestätigung liegt darin, dass für Mangan, Kupfer und Technetium in verschiedenen Strukturen quantenmechanisch berechnete Volumenverhältnisse nach den hier abgeleiteten Beziehungen ebenfalls erhalten werden. Der dichte Zustand der Elemente erscheint hier als ein von der Kristallstruktur unabhängiger Grenzzustand der kondensierten Materie. Bei bekannter Bindungswertigkeit eines Elements können die Parameter R1 und b der Paulingfunktion (Bindungsgrad-Parameter) und damit die Abstandsabhängigkeit des Bindungsgrades berechnet werden. Dies wird für alle s-, p- und d-Elemente durchgeführt. Dabei ergeben sich für die Länge der Einfachbindung R1 Werte, die zum Teil erheblich von den Literaturdaten abweichen. Der Parameter b ist im Gegensatz zu den Literaturangaben nicht konstant, sondern der dritten Wurzel aus VD proportional. Aufgrund derBindungsgrad-Parameter kann derBeitrag vonMetall-Metall-Bindungen zur Wertigkeit in Verbindungen bestimmt werden. Die Volumenverhältnisse von intermetallischen Phasen sowie Hochdruckformen der Elemente werden aufgrund der hier abgeleiteten Beziehungen diskutiert.
Ziel dieser Arbeit war die Bestimmung und Verfeinerung der Lösungsstruktur der rekombinanten pI=5,1 Isoform des H-FABPs aus Rinderherz. Dabei wurde von Proben mit einem Fettsäuregemisch ausgegangen und somit die HOLO–Form des Proteins untersucht. Der Einsatz von mehrdimensionaler NMR–Spektroskopie zur Bestimmung von Abstandsrandbedingungen, stereospezi…schen Zuordnungen und Diederwinkeln aus 3J–Kopplungskonstanten ermöglichte die Verwendung von 1877 Abstandsrandbedingungen, 52 stereospezifischen Zuordnungen und 81 Diederwinkelbeschränkungen. Die Struktur basiert im Schnitt auf 15 geometrischen Beschränkungen je Aminosäurerest. Mit einem mittleren globalen RMSD–Wert der Rückgratatome von 1,07+-0,15Å und den relativ niedrigen berechneten Energiewerten sind die Ansprüche an eine hochaufgelöste Struktur erfüllt. Vergleiche mehrerer struktureller Kriterienmit 160 Proteinkristallstrukturen haben ergeben, daß die hier bestimmte Lösungsstruktur in ihrer Güte einer Kristallstruktur mit einer Auflösung von etwa 2,4 Å entspricht. Die Molekulardynamiksimulation der energetisch niedrigsten Lösungsstruktur in einer Wassersimulation führte anfangs zu einer raschen Konformationsänderung der Struktur. Diese war gekennzeichnet durch eine Vergrößerung des als Eingangsportal für den Fettsäureliganden postulierten Bereiches. Zugleich wurden zwei weitere kleine Öffnungen erkennbar, welche als Austrittsöffnungen für Wassermoleküle dienen könnten.
Die Dissertation liefert einen Beitrag zur Identifizierung und Charakterisierung der an der Komplementresistenz von Borrelien beteiligten CRASP-Proteine aus Isolaten der Genospezies B. burgdorferi s.s. und B. afzelii. Im Rahmen der Arbeit gelang es mittels Identifizierung und immunologischer Charakterisierung die Zugehörigkeit der spezifisch Faktor H-bindenden BbCRASP-Proteine BbCRASP-3, BbCRASP-4 und BbCRASP-5 zur Erp-Proteinfamilie zu beweisen. Weiterhin konnten die Faktor H- und FHL-1-bindenden BbCRASP-Proteine BbCRASP-1 und BbCRASP-2 von B. burgdorferi s.s. identifiziert werden. Mit dem BbCRASP-2-Protein wurde ein bis dahin unbekanntes Faktor H- und FHL-1-bindendes CRASP-Protein aus den äußeren Membranen des B. burgdorferi s.s.-Isolates B31 isoliert und charakterisiert. BbCRASP-2 stellt innerhalb der CRASP-Proteinfamilie ein neues eigenständiges Lipoprotein dar und unterscheidet sich deutlich von den Sequenzen der anderen CRASP-Proteine. Es ist weder ein Mitglied der gbb54- oder der Erp-Proteinfamilie, noch gehört es zu einer anderen bekannten Proteinfamilie von B. burgdorferi s.s. In Ligandenaffinitätsblot-Analysen konnte mit Hilfe von rekombinantem FHL-1 sowie Deletionsmutanten von Faktor H und FHL-1 gezeigt werden, dass die Bindung von Faktor H und FHL-1 an das BbCRASP-2-Protein ausschließlich über die SCR 7-Domäne vermittelt wird. Die Analysen C terminaler Deletionsmutanten von BbCRASP-2 unterstrichen die Bedeutung der letzten 16 Aminosäuren des BbCRASP-2-Proteins für die Interaktion mit Faktor H und FHL-1.
Der humane ABC-Transporter TAP (transporter associated with antigen processing) spielt in der Antigenprozessierung und in der MHC Klasse I-vermittelten Antigenpräsentation eine zentrale Rolle. Unter ATP-Hydrolyse katalysiert der heterodimere TAP-Komplex den Transport von proteosomal degradierten Peptiden aus dem Cytosol in das ER-Lumen. Diese werden im Peptidbeladungskomplex (PLC) auf MHC Klasse I-Moleküle geladen und zur Zelloberfläche transportiert, wo sie zytotoxischen T-Zellen präsentiert werden. Die Assemblierung eines funktionalen Komplexes hängt dabei von der korrekten intra- und intermolekularen Anordnung seiner Transmembransegmente (TMS) ab. Die strukturelle Organisation des TAP-Komplexes ist schon seit vielen Jahren Gegenstand intensiver Forschung und wird in der Literatur kontrovers diskutiert. Cystein-freie Proteinvarianten dienen bei der Untersuchung der Topologie als sehr gute Hilfsmittel und wurden bereits erfolgreich zur Aufklärung der Membrantopologie von komplexen Membranproteinen, wie P-glycoprotein oder der Lactose-Permease LacY, eingesetzt (Kaback et al., 2001; Loo und Clarke, 1995). Im ersten Teil der vorliegenden Arbeit wurden humane TAP1- und TAP2-defiziente Fibroblasten, die ansonsten alle anderen Komponenten der Antigenpräsentationsmaschinerie besitzen, stabil mit der jeweiligen humanen Cystein-freien TAP1- oder TAP2-Untereinheiten transfiziert. Alle 19 natürlichen Cysteine von TAP1 und TAP2 konnten vorher durch de novo Gensynthese ausgetauscht werden. Nach erfolgreicher Expression konnte ein ATP-abhängiger Peptidtransport, der spezifisch durch den viralen Inhibitor ICP47 inhibiert wurde, nachgewiesen werden. Außerdem konnte die MHC Klasse I-Oberflächenexpression der Zellen, ein Indikator einer funktionsfähigen Antigenpräsentierung, nach Transfektion mit den Cystein-freien TAP-Untereinheiten wiederhergestellt werden. Im zweiten Abschnitt wurde die Membrantopologie des humane TAP-Transporters in einem funktionalen Peptidbeladungskomplex durch ortsspezifische Mutagenese in Kombination mit der Markierung mittels thiolspezifischer Fluorophore untersucht. Durch Co-Immunpräzipitationen und Transportstudien mit radioaktiv-markierten Peptiden konnte die Funktionalität des, in Sf9 Zellen exprimierten, Cystein-freien TAP-Komplexes gezeigt werden. Einzelne Cysteine wurden aufgrund von Hydrophobizitätsanalysen in Kombination mit Sequenzvergleichen von anderen ABC-Transportern in vorhergesagte cytosolische oder ER-luminale Schleifen der TAP1-Untereinheit eingeführt und deren Zugänglichkeit mit dem thiolspezifischen, membran-impermeablen Fluorophor Fluoreszein-5-Maleimid in semi-permeabilisierten Zellen untersucht. Es konnte zum ersten Mal experimentell gezeigt werden, dass die Transmembrandomäne (TMD) der TAP1-Untereinheit in einem funktionalen Komplex aus zehn Transmembranhelices aufgebaut ist. Die TMD lässt sich in eine für die Heterodimerisierung, die Peptidbindung und den Transport essentielle und für viele ABC-Transporter charakteristische Core-Domäne, und zusätzliche N-terminale Domänen, die für die Bindung von Tapasin und die Assemblierung des PLCs verantwortlich sind, unterteilen. Somit konnte experimentell die Membrantopologie des ABC-Transporters TAP in einem funktionalen Peptidbeladungskomplex aufgeklärt werden. Der dritte Teil der Arbeit befasste sich mit der Untersuchung der veränderten Peptidbeladungskapazität, die in Kombinationen aus wildtyp TAP1 und Cystein-freiem TAP2 beobachtet wurde. Durch ortsspezifische Mutagenese wurden einzelne Cysteine in TAP2 wiedereingeführt und deren Funktionalität in Transportstudien analysiert. Es konnte ein einzelnes Cystein in TAP2 identifiziert werden, welches die Peptidbeladungskapazität beeinflusst und durch Modifikation mit thiolspezifischen Reagenzien zum Schalter für die Peptidbindung wird. Durch Quervernetzungsstudien mit radioaktiv-markierten Peptiden konnte weiterhin ein direkter Kontakt zwischen dem Cystein und dem gebundenen und somit transportierten Peptid des TAP-Transporters nachgewiesen werden.
My graduate thesis is on the "Structural studies of membrane transport proteins". Transporters are membrane proteins that have multiple membrane-spanning a-helices. They are dynamic and diverse proteins, undergoing a large conformational change and transporting wide range of susbtrates. Based on their energy source they can be classified into primary and secondary transport systems. Primary transport systems are driven by the use of chemical (ATP) or light energy, while secondary transporters utilize ion gradients to transport substrates. I began my PhD dissertation on secondary transporters by two-dimensional crystallization and electron crystallographic analysis and recently my focus also has shifted towards 3D crystallization. The following projects constitute my PhD thesis: 1) 2D crystallization of MjNhaP1 and pH induced structural change: MjNhaP1, a Na+/H+ antiporter that is regulated by pH has been implicated in homeostasis of H+ and Na+ in Methanococcus jannaschii, a hyperthermophilic archaeon that grows optimally at 85°C. MjNhaP1 was cloned and expressed in E. coli. Two-dimensional crystals were obtained from purified protein at pH4. Electron cryo-microscopy yielded an 8Å projection map. The map of MjNhaP1 shows elongated densities in the centre of the dimer and a cluster of density peaks on either side of the dimer core, indicative of a bundle of 4-6 membrane-spanning helices. The effect of pH on the structure of MjNhaP1was studied in situ in 2D crystals revealing a major change in density within the helix bundle relative to the dimer interface. This change occurred at pH6 and above. The two conformations at low and high pH most likely represent the closed and open states of the antiporter, respectively. This is the first instance where a conformational change associated with the regulation of a secondary transporter appears to map structurally. Reconstruction of 3D map and high-resolution structure by x-ray crystallography would be necessary to understand the mechanism of ion transport and regulation by pH. 2) 2D crystallization of Proline transporter: Proline transporter (PutP) from E.coli belongs the sodium-solute symporter family that includes disease related sodium dependent glucose and iodide transporter in humans. Sodium and proline are co-transported with a stoichiometry of 1:1. Purified PutP was reconstituted to yield 2D crystals that were hexagonal in nature. The 2D crystals had tendency to stack indicating their willingness to form 3D crystals. A projection map of PutP from negatively stained crystals showed trimeric arrangement of protein. Other members of the SSF family have been shown to be monomers. My analysis of oligomeric state of PutP in detergent by blue native gel indicates a monomer in detergent solution. It is likely that PutP can function as a monomer but at higher concentration and in lipid bilayer it tends to form trimer. 3) Oligomeric state and crystallization of carnitine transporter from E.coli: E.coli carnitine transporter (CaiT) belongs to the BCCT (Betaine, Carnitine and Choline) superfamily that transports molecules with quaternary amine groups. CaiT is predicted to span the membrane 12 times and acts as a L-carnitine/g-butyrobetaine exchanger. Unlike other members in this transporter family, it does not require an ion gradient and does not respond to osmotic stress. Over-expression of the protein yielded ~2mg of protein/L of culture. The structure and oligomeric state of the protein were analyzed in detergent and lipid bilayers. Blue native gel electrophoresis indicated that CaiT was a trimer in detergent solution. Gel filtration and cross-linking studies further support this. Reconstitution of CaiT into lipid bilayers resulted in 2D crystals. Analysis of negatively stained 2D crystals confirmed that CaiT is a trimer in the membrane. Initial 3D crystallization trials have been successful and currently, the crystals diffract to 6Å and are being improved. 4) Monomeric porin OmpG: OmpG is a bacterial outer membrane b-barrel protein. It is monomeric and its size (33kDa) places it as a prime candidate for a structural solution, using the recently developed method of solid state NMR (work in collaboration with Prof.Hartmut Oskinat, FMP, Berlin). A long-term aim would be to study porins as templates for designing nanopores, for DNA sequencing and identification. I have expressed OmpG in inclusion bodies and refolded at an efficiency of >90% into a functional form using detergent. OmpG was then crystallized by 2D crystallization yielding an 8Å projection map whose structure was similar to native protein. In addition, these crystals were used for structure determination by solid state NMR. An initial spectrum of heavy isotopically labeled OmpG has allowed identification of specific amino acid residues including threonine and proline. Additionally, I obtained 3D crystals in detergent that diffract to 5.5Å and are being improved.
Die thermische Zersetzung von Vitriolen MIISO4 H2O (M = Fe, Mn, Co, Ni, Zn und Mg) und von anderen Sulfathydraten wurde untersucht, um zu klären, ob sie für die Entdeckung der Schwefelsäure und deren Gewinnung nach dem früher üblichen Verfahren der Vitriolbrennerei in Betracht kommen. Eisenvitriol wird beim Erhitzen entwässert, durch Luft oxidiert und zerfällt bei etwa 550°C in ein Eisen(III)-oxidsulfat der wahrscheinlichen Zusammensetzung Fe16O9(SO4)15, aus dem bis 650°C alles Schwefeltrioxid abgespalten wird. Bei diesen Temperaturen zerfällt nur ein kleiner Teil des Schwefeltrioxids in Schwefeldioxid und Sauerstoff. Alle anderen Vitriole zersetzen sich erst bei 800-850°C vollständig, d.h. unter Bedingungen, unter denen überwiegend Schwefeldioxid gebildet wird. Die partielle Oxidation von Mangan und Cobalt, durch die Mn3O4 bzw.Co3O4 entstehen, findet ebenfalls bei 600-700°C statt. Die Zersetzung von Aluminium- und Eisen(III)-sulfat beginnt bei niedrigen Temperaturen und ist beim Eisen(III)-sulfat bei 600-700°C abgeschlossen. Aluminiumsulfat wird aber erst bei über 800°C vollständig zersetzt. Die Untersuchung der Zersetzungsreaktionen ließ verschiedene Zwischenprodukte erkennen, insbesondere Oxidsulfate, von denen einige – wie Fe16O9(SO4)15 – näher charakterisiert wurden. Die Schwefelsäure ist wahrscheinlich beim Erhitzen von Eisenvitriol entdeckt worden, der schon seit der Antike bekannt war. Mehrere Vorschriften zum Erhitzen von Eisenvitriol allein oder im Gemisch mit anderen Sulfaten sind aus der arabischen Alchemie des frühen Mittelalters bekannt. In Europa erscheinen solche Vorschriften im 13. Jahrhundert. Auch dem frühen technischen Verfahren seit dem 17. Jahrhundert lag die Zersetzung von Eisenvitriol unter Luftzutritt zu Grunde. Verunreinigungen durch andere Vitriole, insbesondere des Zinks und Mangans, haben vermutlich die Ausbeute verringert. Das neuere technische Verfahren, das bis 1900 betrieben wurde, ging von „Vitriolstein“ aus. Dieses Gemisch von Eisen(III)- und Eisen(II)-sulfat mit wenig Aluminiumsulfat und sehr geringen Mengen anderer Sulfate wurde durch Auslaugen von Vitriol- bzw. Alaunschiefer gewonnen. Welche Eisenverbindungen es enthielt, ist nicht sicher. Ihre Zersetzung lief aber wahrscheinlich ähnlich ab wie die von Eisen(III)-sulfat. Auch bei diesem Verfahren war der Eisensulfatgehalt des Rohstoffes entscheidend für den Erfolg.
Protein-protein interactions within the plane of cellular membranes play a key role for many biological processes and in particular for transmembrane signaling. A prominent example is the ligand-induced crosslinking of cytokine receptors, where 3- dimensional cytokine binding followed by 2-dimensional interaction between the receptor subunits have been recognized to be important for regulating signaling specificity. The fundamental importance of such coupled interactions for cell-surface receptor activation has stimulated numerous theoretical studies, which have hardly been confirmed experimentally. An experimental approach to measure interactions and real time kinetics of type I interferon (IFN) induced assembly between interferon receptor subunits ifnar2 and ifnar1 on membrane was developed and determinants of the 2-dimensional interactions, such as dimensionality, size, valency, orientation, membrane fluidity and receptor density were quantitatively addressed The C-terminal decahistidine tagged extracellular domains (EC) of ifnar1 and ifnar2 were site- specifically tethered onto solid-supported fluid lipid membrane, which carried covalently attached chelator bis-nitrilotriacetic acid (bis-NTA) groups. Interactions on the lipid bilayer were detected with a novel solid phase detection technique, which allows simultaneous detection of ligand binding to a membrane anchored receptors and lateral interaction between them in the real time. This was achieved by combining two optical techniques: label-free reflectance interferometry (RIf) and total internal reflection fluorescence spectroscopy (TIRFS). Fluorescence signals, in the order of 10 fluorophores/µm2, were detected without substantial photobleaching. The sensitivity of the label-free interferometric detection was in the range of 10 pg/mm2. The crosstalk between the two signals was eliminated by means of spectral separation. Fluorescence was detected in the visible region and RIf was performed at 800 nm in the near infrared. Flow through conditions allowed to automate experiments and measure binding events as fast as ~ 5 s-1. Using this technique we have dissected the interactions involved in IFN-induced ifnar crosslinking. 2-dimensional association and dissociation rate constants were independently determined by tethering high stoichiometric excess of one of the receptor subunits and comparing dissociation of the labelled ligand away from the membrane in the absence and presence of the non-labelled high affinity competitor. Dissociation traces were fitted with the two-step dissociation model: the first step being the 2-dimensional separation of the ternary complex followed by the 3- dimensional ligand dissociation into solution. Label-free RIf detection allowed absolute parameterization of the 2-dimensional concentrations of the ifnar subunits on the membrane. The TIRFS signal provided high sensitivity of the ligand dissociation and was correlated against the RIf signal before fitting. These features of the detection system allowed us to parameterize the model, and the 2-dimensional association or dissociation rate constants were the only variables during the fitting. Another FRET based binding assay was developed to determine the 2- dimensional dissociation rate constant using a pulse-chase approach. The donor fluorescence from ifnar2-EC was quenched upon the ternary complex formation with the acceptor-labelled IFN and the nonlabelled ifnar1-EC. The equilibrium was perturbed by rapid tethering of substantial excess of the nonlabelled ifnar2-EC onto the membrane. The exchange of the labelled ifnar2-EC with the nonlabelled one was monitored as the decrease in the FRET signal with the 2-dimensional dissociation of ifnar2-EC from the ternary complex being the rate limiting step. Based on the several mutants and variants of the interacting proteins, the effect of different rate constants and receptor orientation on the 2-dimensional crosslinking dynamics was studied. We have identified several critical features of the 2- dimensional interactions on membranes, which cannot be readily concluded from the solution binding assays. The restricted rotation and the increased lifetime of the encounter complex due to high membrane viscosity are the main determinants of the 2-dimensional association. Tethering ifnar1-EC to the membrane via N-terminal decahistidine tag decreased the 2-dimensional association rate constant 4-5 fold. Electrostatic attraction and steering, the important mechanism to enhance association rate constant between the soluble proteins, are not pronounced for interactions on the membrane. Protein orientation due to membrane anchoring dominates over electrostatic effects and together with the increased lifetime of the encounter complex consequence that 2-dimensional association rate constants are quite similar and do not correlate with association rate constants in solution. The 2- dimensional dissociation rate constants were generally 2-5-fold lower compared to the corresponding 3-dimensional dissociation rate constants in solution. Possible explanations for this are that long lifetime of the encounter complex stabilizes the ternary complex or that membrane tethering affects the interaction diagram. In conclusion, combined TIRFS-RIf detection turn to be powerful and versatile technique to characterize protein-protein interactions on membranes.
Virtual screening of potential bioactive substances using the support vector machine approach
(2005)
Die vorliegende Dissertation stellt eine kumulative Arbeit dar, die in insgesamt acht wissenschaftlichen Publikationen (fünf publiziert, zwei eingerichtet und eine in Vorbereitung) dargelegt ist. In diesem Forschungsprojekt wurden Anwendungen von maschinellem Lernen für das virtuelle Screening von Moleküldatenbanken durchgeführt. Das Ziel war primär die Einführung und Überprüfung des Support-Vector-Machine (SVM) Ansatzes für das virtuelle Screening nach potentiellen Wirkstoffkandidaten. In der Einleitung der Arbeit ist die Rolle des virtuellen Screenings im Wirkstoffdesign beschrieben. Methoden des virtuellen Screenings können fast in jedem Bereich der gesamten pharmazeutischen Forschung angewendet werden. Maschinelles Lernen kann einen Einsatz finden von der Auswahl der ersten Moleküle, der Optimierung der Leitstrukturen bis hin zur Vorhersage von ADMET (Absorption, Distribution, Metabolism, Toxicity) Eigenschaften. In Abschnitt 4.2 werden möglichen Verfahren dargestellt, die zur Beschreibung von chemischen Strukturen eingesetzt werden können, um diese Strukturen in ein Format zu bringen (Deskriptoren), das man als Eingabe für maschinelle Lernverfahren wie Neuronale Netze oder SVM nutzen kann. Der Fokus ist dabei auf diejenigen Verfahren gerichtet, die in der vorliegenden Arbeit verwendet wurden. Die meisten Methoden berechnen Deskriptoren, die nur auf der zweidimensionalen (2D) Struktur basieren. Standard-Beispiele hierfür sind physikochemische Eigenschaften, Atom- und Bindungsanzahl etc. (Abschnitt 4.2.1). CATS Deskriptoren, ein topologisches Pharmakophorkonzept, sind ebenfalls 2D-basiert (Abschnitt 4.2.2). Ein anderer Typ von Deskriptoren beschreibt Eigenschaften, die aus einem dreidimensionalen (3D) Molekülmodell abgeleitet werden. Der Erfolg dieser Beschreibung hangt sehr stark davon ab, wie repräsentativ die 3D-Konformation ist, die für die Berechnung des Deskriptors angewendet wurde. Eine weitere Beschreibung, die wir in unserer Arbeit eingesetzt haben, waren Fingerprints. In unserem Fall waren die verwendeten Fingerprints ungeeignet zum Trainieren von Neuronale Netzen, da der Fingerprintvektor zu viele Dimensionen (~ 10 hoch 5) hatte. Im Gegensatz dazu hat das Training von SVM mit Fingerprints funktioniert. SVM hat den Vorteil im Vergleich zu anderen Methoden, dass sie in sehr hochdimensionalen Räumen gut klassifizieren kann. Dieser Zusammenhang zwischen SVM und Fingerprints war eine Neuheit, und wurde von uns erstmalig in die Chemieinformatik eingeführt. In Abschnitt 4.3 fokussiere ich mich auf die SVM-Methode. Für fast alle Klassifikationsaufgaben in dieser Arbeit wurde der SVM-Ansatz verwendet. Ein Schwerpunkt der Dissertation lag auf der SVM-Methode. Wegen Platzbeschränkungen wurde in den beigefügten Veröffentlichungen auf eine detaillierte Beschreibung der SVM verzichtet. Aus diesem Grund wird in Abschnitt 4.3 eine vollständige Einführung in SVM gegeben. Darin enthalten ist eine vollständige Diskussion der SVM Theorie: optimale Hyperfläche, Soft-Margin-Hyperfläche, quadratische Programmierung als Technik, um diese optimale Hyperfläche zu finden. Abschnitt 4.3 enthält auch eine Diskussion von Kernel-Funktionen, welche die genaue Form der optimalen Hyperfläche bestimmen. In Abschnitt 4.4 ist eine Einleitung in verschiede Methoden gegeben, die wir für die Auswahl von Deskriptoren genutzt haben. In diesem Abschnitt wird der Unterschied zwischen einer „Filter“- und der „Wrapper“-basierten Auswahl von Deskriptoren herausgearbeitet. In Veröffentlichung 3 (Abschnitt 7.3) haben wir die Vorteile und Nachteile von Filter- und Wrapper-basierten Methoden im virtuellen Screening vergleichend dargestellt. Abschnitt 7 besteht aus den Publikationen, die unsere Forschungsergebnisse enthalten. Unsere erste Publikation (Veröffentlichung 1) war ein Übersichtsartikel (Abschnitt 7.1). In diesem Artikel haben wir einen Gesamtüberblick der Anwendungen von SVM in der Bio- und Chemieinformatik gegeben. Wir diskutieren Anwendungen von SVM für die Gen-Chip-Analyse, die DNASequenzanalyse und die Vorhersage von Proteinstrukturen und Proteininteraktionen. Wir haben auch Beispiele beschrieben, wo SVM für die Vorhersage der Lokalisation von Proteinen in der Zelle genutzt wurden. Es wird dabei deutlich, dass SVM im Bereich des virtuellen Screenings noch nicht verbreitet war. Um den Einsatz von SVM als Hauptmethode unserer Forschung zu begründen, haben wir in unserer nächsten Publikation (Veröffentlichung 2) (Abschnitt 7.2) einen detaillierten Vergleich zwischen SVM und verschiedenen neuronalen Netzen, die sich als eine Standardmethode im virtuellen Screening etabliert haben, durchgeführt. Verglichen wurde die Trennung von wirstoffartigen und nicht-wirkstoffartigen Molekülen („Druglikeness“-Vorhersage). Die SVM konnte 82% aller Moleküle richtig klassifizieren. Die Klassifizierung war zudem robuster als mit dreilagigen feedforward-ANN bei der Verwendung verschiedener Anzahlen an Hidden-Neuronen. In diesem Projekt haben wir verschiedene Deskriptoren zur Beschreibung der Moleküle berechnet: Ghose-Crippen Fragmentdeskriptoren [86], physikochemische Eigenschaften [9] und topologische Pharmacophore (CATS) [10]. Die Entwicklung von weiteren Verfahren, die auf dem SVM-Konzept aufbauen, haben wir in den Publikationen in den Abschnitten 7.3 und 7.8 beschrieben. Veröffentlichung 3 stellt die Entwicklung einer neuen SVM-basierten Methode zur Auswahl von relevanten Deskriptoren für eine bestimmte Aktivität dar. Eingesetzt wurden die gleichen Deskriptoren wie in dem oben beschriebenen Projekt. Als charakteristische Molekülgruppen haben wir verschiedene Untermengen der COBRA Datenbank ausgewählt: 195 Thrombin Inhibitoren, 226 Kinase Inhibitoren und 227 Faktor Xa Inhibitoren. Es ist uns gelungen, die Anzahl der Deskriptoren von ursprünglich 407 auf ungefähr 50 zu verringern ohne signifikant an Klassifizierungsgenauigkeit zu verlieren. Unsere Methode haben wir mit einer Standardmethode für diese Anwendung verglichen, der Kolmogorov-Smirnov Statistik. Die SVM-basierte Methode erwies sich hierbei in jedem betrachteten Fall als besser als die Vergleichsmethoden hinsichtlich der Vorhersagegenauigkeit bei der gleichen Anzahl an Deskriptoren. Eine ausführliche Beschreibung ist in Abschnitt 4.4 gegeben. Dort sind auch verschiedene „Wrapper“ für die Deskriptoren-Auswahl beschrieben. Veröffentlichung 8 beschreibt die Anwendung von aktivem Lernen mit SVM. Die Idee des aktiven Lernens liegt in der Auswahl von Molekülen für das Lernverfahren aus dem Bereich an der Grenze der verschiedenen zu unterscheidenden Molekülklassen. Auf diese Weise kann die lokale Klassifikation verbessert werden. Die folgenden Gruppen von Moleküle wurden genutzt: ACE (Angiotensin converting enzyme), COX2 (Cyclooxygenase 2), CRF (Corticotropin releasing factor) Antagonisten, DPP (Dipeptidylpeptidase) IV, HIV (Human immunodeficiency virus) protease, Nuclear Receptors, NK (Neurokinin receptors), PPAR (peroxisome proliferator-activated receptor), Thrombin, GPCR und Matrix Metalloproteinasen. Aktives Lernen konnte die Leistungsfähigkeit des virtuellen Screenings verbessern, wie sich in dieser retrospektiven Studie zeigte. Es bleibt abzuwarten, ob sich das Verfahren durchsetzen wird, denn trotzt des Gewinns an Vorhersagegenauigkeit ist es aufgrund des mehrfachen SVMTrainings aufwändig. Die Publikationen aus den Abschnitten 7.5, 7.6 und 7.7 (Veröffentlichungen 5-7) zeigen praktische Anwendungen unserer SVM-Methoden im Wirkstoffdesign in Kombination mit anderen Verfahren, wie der Ähnlichkeitssuche und neuronalen Netzen zur Eigenschaftsvorhersage. In zwei Fällen haben wir mit dem Verfahren neuartige Liganden für COX-2 (cyclooxygenase 2) und dopamine D3/D2 Rezeptoren gefunden. Wir konnten somit klar zeigen, dass SVM-Methoden für das virtuelle Screening von Substanzdatensammlungen sinnvoll eingesetzt werden können. Es wurde im Rahmen der Arbeit auch ein schnelles Verfahren zur Erzeugung großer kombinatorischer Molekülbibliotheken entwickelt, welches auf der SMILES Notation aufbaut. Im frühen Stadium des Wirstoffdesigns ist es wichtig, eine möglichst „diverse“ Gruppe von Molekülen zu testen. Es gibt verschiedene etablierte Methoden, die eine solche Untermenge auswählen können. Wir haben eine neue Methode entwickelt, die genauer als die bekannte MaxMin-Methode sein sollte. Als erster Schritt wurde die „Probability Density Estimation“ (PDE) für die verfügbaren Moleküle berechnet. [78] Dafür haben wir jedes Molekül mit Deskriptoren beschrieben und die PDE im N-dimensionalen Deskriptorraum berechnet. Die Moleküle wurde mit dem Metropolis Algorithmus ausgewählt. [87] Die Idee liegt darin, wenige Moleküle aus den Bereichen mit hoher Dichte auszuwählen und mehr Moleküle aus den Bereichen mit niedriger Dichte. Die erhaltenen Ergebnisse wiesen jedoch auf zwei Nachteile hin. Erstens wurden Moleküle mit unrealistischen Deskriptorwerten ausgewählt und zweitens war unser Algorithmus zu langsam. Dieser Aspekt der Arbeit wurde daher nicht weiter verfolgt. In Veröffentlichung 6 (Abschnitt 7.6) haben wir in Zusammenarbeit mit der Molecular-Modeling Gruppe von Aventis-Pharma Deutschland (Frankfurt) einen SVM-basierten ADME Filter zur Früherkennung von CYP 2C9 Liganden entwickelt. Dieser nichtlineare SVM-Filter erreichte eine signifikant höhere Vorhersagegenauigkeit (q2 = 0.48) als ein auf den gleichen Daten entwickelten PLS-Modell (q2 = 0.34). Es wurden hierbei Dreipunkt-Pharmakophordeskriptoren eingesetzt, die auf einem dreidimensionalen Molekülmodell aufbauen. Eines der wichtigen Probleme im computerbasierten Wirkstoffdesign ist die Auswahl einer geeigneten Konformation für ein Molekül. Wir haben versucht, SVM auf dieses Problem anzuwenden. Der Trainingdatensatz wurde dazu mit jeweils mehreren Konformationen pro Molekül angereichert und ein SVM Modell gerechnet. Es wurden anschließend die Konformationen mit den am schlechtesten vorhergesagten IC50 Wert aussortiert. Die verbliebenen gemäß dem SVM-Modell bevorzugten Konformationen waren jedoch unrealistisch. Dieses Ergebnis zeigt Grenzen des SVM-Ansatzes auf. Wir glauben jedoch, dass weitere Forschung auf diesem Gebiet zu besseren Ergebnissen führen kann.
In the present study possible sources and pathways of the gasoline additive methyl tertiary-butyl ether (MTBE) in the aquatic environment in Germany were investigated. The objective of the present study was to clarify some of the questions raised by a previous study on the MTBE situation in Germany. In the USA and Europe 12 million t and 3 million t of MTBE, respectively, are used as gasoline additive. The detection of MTBE in the aquatic environment and the potential risk for drinking water resources led to a phase-out of MTBE as gasoline additive in single states of the USA. Meanwhile there is also an ongoing discussion about the substitution of MTBE in Europe and Germany. The annual usage of MTBE in Germany is about 600,000 t. However, compared to the USA, significant less data exists on the occurrence of MTBE in the aquatic environment in Europe. Because of its physico-chemical properties, MTBE readily vaporizes from gasoline, is water soluble, adsorbs only weakly to the underground matrix and is largely persistent to biological degradation. The toxicity of MTBE remains to be completely investigated, but MTBE in drinking water has low taste- and odor thresholds of 20-40 microgram/L. The present study was conducted by collecting water samples and analyzing them for their MTBE concentrations through a combination of headspace-solid phase microextraction (HS-SPME) and gas chromatography-mass spectrometry (GC-MS). The detection limit was 10 ng/L. The method was successfully tested in the framework of an interlaboratory study and showed recoveries of reference values of 89% (74 ng/L) and 104% (256 ng/L). The relative standard deviations were 12% and 6%. The investigation of 83 water samples from 50 community water systems (CWSs) in Germany revealed a detection frequency of 40% and a concentration range of 17-712 ng/L. The detection of MTBE in the drinking water samples could be explained by a groundwater pollution and the pathway river - riverbank filtration - waterworks. Rivers are important drinking water sources. MTBE is emitted into rivers through a variety of sources. In the present study, potential point sources were investigated, i.e. MTBE production sites/refineries/tank farms and groundwater pollutions. For this purpose, the spatial distribution of MTBE in three German rivers with the named potential emission sources located close to the rivers was investigated by analyzing 49 corresponding river water samples. The influence of the potential emission sources groundwater pollution and refinery/tank farm was successfully demonstrated in certain parts of the River Saale and the River Rhine. Increasing MTBE concentrations from 24 ng/L to 379 ng/L and from 73 ng/L to 5 microgram/L, respectively, could be observed in the parts investigated in these two rivers. The identification of such emission sources is important for future modeling. Further sources of MTBE emission into surface water are industrial (non-petrochemical) and municipal sewage plant effluents. In the present study long-term monitoring of water from the River Main (n=67 samples), precipitation (n=89) and industrial (n=34) and municipal sewage plant effluents (n=66) was conducted. The comparison of the data sets revealed that maximum MTBE concentrations in the River Main of up to 1 microgram/L were most possibly due to single industrial effluents with MTBE concentrations of up to 28 microgram/L (measured in this study). The average MTBE content of 66 ng/L in the River Main most probably originated from municipal sewage plant effluents and further industrial effluents. Background concentrations of <30 ng/L could be related to the direct atmospheric input via precipitation. A certain aspect of the atmospheric MTBE input is represented by the input of MTBE into river water or groundwater through snow. In the present study 43 snow samples from 13 different locations were analyzed for their MTBE content. MTBE could be detected in 65% of the urban and rural samples. The concentrations ranged from 11-613 ng/L and were higher than the concentrations in rainwater samples formerly analyzed. Furthermore, a temperature dependency and wash-out effects could be observed. The atmospheric input of MTBE was in part also visible in the analyzed groundwater samples (n=170). The detection frequencies in non-urban and urban wells were 24% and 63%, respectively. The median concentrations were 177 ng/L and 57 ng/L. In wells located in the vicinity of sites with gasoline contaminated groundwater, MTBE concentrations of up to 42 mg/L could be observed. The MTBE emission sources and the different pathways of MTBE in the aquatic environment demonstrated in the present study and other works raise the question whether the use of MTBE in a bulk product like gasoline should be continued in the future. Currently, possible substitutes like ethyl tertiary-butyl ether (ETBE) or ethanol are being discussed.
Ziel dieser Arbeit ist es, Möglichkeiten darzustellen, wie die Thematik Mikrowellenstrahlung und Ultraschall als nichtklassische Energieeintragsformen im Chemieunterricht allgemeinbildender Schulen behandelt werden kann. Technologien, die Mikrowellenstrahlung und Ultraschall nutzen, gewinnen immer mehr an Alltags- und Lebensweltbedeutung. Deshalb ist die experimentelle Erschließung dieser Thematik für den modernen Chemieunterricht, der sich an der praktischen Lebenswelt orientiert, von fachdidaktischem Interesse. Für den Chemieunterricht wurden einfache Experimente entwickelt, die mit haushaltsüblichen Geräten und Materialien durchgeführt werden können. Die Experimente demonstrieren die unterschiedlichen Eigenschaften und Wirkungen der beiden nichtklassischen Energieeintragsformen. Es wurde bei der Entwicklung der Experimente besonderer Wert darauf gelegt, dass sie von Schülern (1) selbst durchgeführt werden können. Für den Experimentalunterricht wurde eine Experimentiertechnik entwickelt, die es ermöglicht, durch Eintrag von Mikrowellenenergie zeit- und kostensparend Hochtemperaturprozesse in einem Temperaturbereich um 1.200 °C durchzuführen. Mit dieser Technik eröffnen sich vielfältige neue schulexperimentelle Möglichkeiten in diesem Temperaturbereich. In unterschiedlichen Schülerprojekten und Lehrerfortbildungsveranstaltungen wurde die Thematik eingeführt. Die entwickelten Experimente stießen dabei auf großes Interesse bei Schülern und Lehrern und wurden häufig in den Chemieunterricht übernommen. Im Experimentalunterricht kann die Thematik des nichtklassischen Energieeintrags durch Ultraschall und Mikrowelle sehr erfolgreich in der Sekundarstufe I und II vermittelt werden. (1) Aus Gründen der Kürze und besseren Lesbarkeit wird in dieser Arbeit bei geschlechtsbezogenen Begriffen nur eine Form verwendet. Es sind aber dennoch immer beide Geschlechter gleichberechtigt angesprochen.
Biophysical investigation of the ligand-induced assembling of the human type I interferon receptor
(2005)
Type I interferons (IFNs) elicit antiviral, antiproliferative and immunmodulatory responses through binding to a shared receptor consisting of the transmembrane proteins ifnar1 and ifnar2. Differential signaling by different interferons – in particular IFNalpha´s and IFNbeta – suggest different modes of receptor engagement. In this work either single ligand-receptor interactions or the formation of the extracellular part of a signaling complex were investigated referring to thermodynamics, kinetics, stoichiometry and structural organization. Initially an expression and purification strategy for the extracellular domain of ifnar1 (ifnar1-EC) using Sf9 insect cells yielding in mg amounts of glycosylated protein was established. Using reflectometric interference spectroscopy (RIfS) the interactions between IFNalpha2/beta and ifnar1-EC and ifnar2-EC was studied in order to understand the individual energetic contributions within the ternary complex. For IFNalpha2 a Kd of 5 µM for the interaction with ifnar1-EC was determined. Substantially tighter binding of IFNbeta with both ifnar2-EC and ifnar1-EC compared to IFNalpha2 was observed. For neither IFNalpha2 nor IFNbeta stabilization of the complex with ifnar1-EC in presence of soluble ifnar2-EC was detectable. In addition, no direct interaction between ifnar2 and ifnar1 was could be shown. Thus, stem-stem interactions between the extracellular domains of ifnar1 and ifnar2 do not seem to play a role for ternary complex formation. Furthermore, ligand-induced cross-talk between ifnar1-EC and ifnar2-EC being tethered onto solid-supported, fluid lipid bilayers was investigated by RIfS and total internal reflection fluorescence spectroscopy. A very stable binding of IFNalpha2 at high receptor surface concentrations was observed with an apparent kd approximately 200-times lower than for ifnar2-EC alone. This apparent kd was strongly dependent on the surface concentration of the receptor components, suggesting kinetic rather than static stabilization, which was corroborated by competition experiments. These results indicate that signaling is activated by transient cross-talk between ifnar1 and ifnar2, which is by several orders of magnitude more efficiently engaged by IFNbeta than by IFNalpha2. With respect to differential recognition of different IFNs ifnar1-EC was dissected into sub-fragments containing different of the four Ig-like domains. The appropriate folding and glycosylation of these proteins, also purified in mg amounts were confirmed by SDS-PAGE, size exclusion chromatography and CD-spectroscopy. Surprisingly, only one construct containing all three N-terminal Ig-like domains was active in terms of ligand binding, indicating that these domains were required. Competitive binding of IFNalpha2 and IFNbeta to both this fragment and ifnar1-EC was demonstrated. Cellular binding assays with different fragments, however, highlight the key role of the membrane-proximal Ig-like domain for the formation of an in situ IFN-receptor complex and the ensuing signal activation. Even substitution with Ig-like domains from homologous cytokine receptors did not restore high-affinity ligand binding. Receptor assembling analysis on supported lipid bilayer revealed that appropriate orientation of the receptor is required, which is controlled by the membrane-proximal Ig-domain. All results indicate that differential signalling is encoded by the efficiency of signalling complex formation, which is controlled by the binding affinity of IFNs to the extracellular domains of ifnar1 and 2.
Strukturelle und funktionelle Untersuchungen am Cytochrom-bc1-Komplex aus Paracoccus denitrificans
(2005)
Cytochrom bc-Komplexe sind zentrale Enzyme energietransduzierender Elektronen-transportketten. Anerkanntes Funktionsprinzip ist der Q-Zyklus; mechanistische Details insbesondere der Chinoloxidation am Qo-Zentrum sind noch unklar. Ein Verständnis des Qo-Zentrums ist auch von Interesse, da hier Inhibitoren in Form von Fungiziden und Malariatherapeutika wichtige Anwendung finden. In den vergangenen Jahren wurde eine Reihe mitochondrialer Komplexe kristallographisch charakterisiert, die Struktur eines bakteriellen Enzyms steht jedoch aus. Hauptziel dieser Arbeit war es, Ansätze zur Strukturaufklärung des bc1-Komplexes aus Paracoccus denitrificans (P.d.) zu finden, der als homologes Enzym mitochondrialer Komplexe bei einfacher genetischer Zugänglichkeit ein wichtiges Modellsystem darstellt. In der vorliegenden Arbeit wurde auf die Kristallisation des bc1-Komplexes aus S. cerevisiae aufgebaut, die mit Hilfe monoklonaler Antikörperfragmente (Fv) gegen die Rieske-Untereinheit (ISP) erreicht wurde; die Fv-Fragmente erleichtern die Ausbildung von Kristallkontakten. Die Epitopregion des Hefeenzyms wurde genetisch auf den bakteriellen Komplex übertragen, um dessen Ko-Kristallisation mit dem bereits verfügbaren Fv zu ermöglichen. Punktuelle Anpassungen führten zu keiner signifikanten Bindung, ein weitergehender Austausch des entsprechenden ISP-Bereichs verbesserte die Bindung hingegen deutlich. Die besten Ergebnisse konnten mit chimären Enzymen erzielt werden, bei denen die gesamte ISP-Ektodomäne durch das Hefe-Homologe ersetzt wurde. Aufbauend auf dieser Arbeit scheint die Fv-vermittelte Kristallisation des Enzyms ein greifbares Ziel. Eine komplementäre Strategie zielte auf die strukturelle Charakterisierung der Rieske-Ektodomäne (ISF). Das klonierte ISF wurde in E. coli überexprimiert, lag jedoch fast vollständig in inclusion bodies vor. Das ISF konnte in eine lösliche Form rückgefaltet werden, die anschließende chemische Rekonstitution zum Holo-Protein gelang jedoch nur mit einer Ausbeute von ~ 1 %. Die geringe Menge an löslichem ISF, die sich nach Expression in E. coli isolieren lässt, trägt kein [2Fe-2S]-Zentrum. Durch Koexpression der für die Biogenese von Eisen-Schwefel-Zentren relevanten Gencluster konnte die lösliche ISF-Fraktion in vivo in die Holo-Form konvertiert werden. Auch hier war aber die Gesamtausbeute für strukturelle Untersuchungen zu gering. Eine homologe Expression in P.d. war nur für das komplette ISP nachweisbar, nicht für das verkürzte ISF. Durch gerichtete Mutagenese konnte hier erstmals gezeigt werden, dass das bakterielle Rieske-Protein über den Tat-Translokationsweg in die Membran inseriert. Die Kristallstrukturen mitochondrialer bc1-Komplexe zeigen ein dimeres Enzym. Die Assoziation des bakteriellen Komplexes wurde in dieser Arbeit mit der analytischen Ultrazentrifugation untersucht, und auch hier wurde eindeutig ein Dimer nachgewiesen. Dynamische Messverfahren deuteten jedoch auf einen höheren Assoziationszustand hin. Es bleibt unklar, ob diese Diskrepanz durch Formparameter oder die Detergenzbindung begründet ist oder ob unter bestimmten Versuchsbedingungen möglicherweise Tetramere vorliegen. In situ ist der bc1-Komplex strukturell mit den Komplexen I und IV sowie dem Elektronenüberträger Cyt c552 assoziiert. Die Analyse verschiedener Deletionsstämme zeigte, dass Komplex I der Atmungskette durch diesen Superkomplex stabilisiert wird. Dieser Befund konnte kürzlich in anderen Arbeiten auch an menschlichen Mitochondrien bestätigt werden. Neben strukturellen Aspekten wurden am bc1-Komplex auch die H+-Translokation und die Chinonbindung untersucht. Da chemische Modifikationsexperimente zeigen, dass ein saurer Rest im ISP eine kritische Rolle für die Kopplung von H+-Translokation und Elektronentransport spielt, wurden durch gerichtete Mutagenese kombinatorisch saure Reste gegen entsprechende Säureamide ersetzt. Die biochemische Charakterisierung wurde nur für eine Fünffach-Mutante durchgeführt; diese erwies sich jedoch als zu instabil, um verlässliche Daten aus H+-Pumpexperimenten zu gewinnen. Die Charakterisierung der übrigen Mutanten scheint lohnenswert, da der relevante Aminosäurerest auch in anderen Arbeiten noch nicht identifiziert werden konnte. Der Gehalt des aufgereinigten Enzyms an spezifisch gebundenem Chinon wurde FTIR-spektroskopisch quantifiziert. Eine Stöchiometrie von ~ 3 Chinonmolekülen/Monomer stützt das double occupancy-Modell, demzufolge zwei Substratmoleküle am Qo-Zentrum binden; das dritte Chinon bindet am Qi-Zentrum. Partielle Extraktion des Chinons und Messungen bei verschiedenen pH-Werten zeigten, dass die Substratbindung mit Protonierung eines sauren Rests einhergeht. Möglicherweise handelt es sich dabei um Glu295 des Cytochrom b, das auf Basis der Kristallstrukturen als primärer H+-Akzeptor am Qo-Zentrum diskutiert wird. Aufbauend auf dieser Arbeit können die an der Chinonbindung beteiligten Reste durch Mutagenese identifiziert werden.
Mitochondial NADH:ubiquinone oxidoreductase (complex I) the largest multiprotein enzyme of the respiratory chain, catalyses the transfer of two electrons from NADH to ubiquinone, coupled to the translocation of four protons across the membrane. In addition to the 14 strictly conserved central subunits it contains a variable number of accessory subunits. At present, the best characterized enzyme is complex I from bovine heart with a molecular mass of about 980 kDa and 32 accessory proteins. In this study, the subunit composition of mitochondrial complex I from the aerobic yeast Y. lipolytica has been analysed by a combination of proteomic and genomic approaches. The sequences of 37 complex I subunits were identified. The sum of their individual molecular masses (about 930 kDa) was consistent with the native molecular weight of approximately 900 kDa for Y. lipolytica complex I obtained by BN-PAGE. A genomic analysis with Y. lipolytica and other eukaryotic databases to search for homologues of complex I subunits revealed 31 conserved proteins among the examined species. A novel protein named “X” was found in purified Y. lipolytica complex I by MALDI-MS. This protein exhibits homology to the thiosulfate sulfurtransferase enzyme referred to as rhodanese. The finding of a rhodanese-like protein in isolated complex I of Y. lipolytica allows to assume a special regulatory mechanism of complex I activity through control of the status of its iron-sulfur clusters. The second part of this study was aimed at investigating the possible role of one of these extra subunits, 39 kDa (NUEM) subunit which is related to the SDRs-enzyme family. The members of this family function in different redox and isomerization reactions and contain a conserved NAD(P)H-binding site. It was proposed that the 39 kDa subunit may be involved in a biosynthetic pathway, but the role of this subunit in complex I is unknown. In contrast to the situation in N. crassa, deletion of the 39 kDa encoding gene in Y. lipolytica led to the absence of fully assembled complex I. This result might indicate a different pathway of complex I assembly in both organisms. Several site-directed mutations were generated in the nucleotide binding motif. These had either no effect on enzyme activity and NADPH binding, or prevented complex I assembly. Mutations of arginine-65 that is located at the end of the second b-strand and responsible for selective interaction with the 2’-phosphate group of NADPH retained complex I activity in mitochondrial membranes but the affinity for the cofactor was markedly decreased. Purification of complex I from mutants resulted in decrease or loss of ubiquinone reductase activity. It is very likely that replacement of R65 not only led to a decrease in affinity for NADPH but also caused instability of the enzyme due to steric changes in the 39 kDa subunit. These data indicate that NADPH bound to the 39 kDa subunit (NUEM) is not essential for complex I activity, but probably involved in complex I assembly in Y. lipolytica.
Die bei der Photosynthese verwendete Lichtenergie wird zu einem großen Anteil von Lichtsammlersystemen bereitgestellt. In der pflanzlichen Photosynthese wird unterschieden zwischen Lichtsammlersytem I (light harvesting complex I, LHC-I), assoziiert mit Photosystem I (PS-I) und Lichtsammlersystem II (light harvesting complex II, LHC-II), assoziiert mit Photosystem II (PS-II). LHC-II ist der häufigste Protein-Pigment Komplex der Chloroplasten und bindet bis zu 50% aller Chlorophylle in der Thylakoidmembran. Der Protein-Pigment Komplex LHC-II hat vier, teils miteinander verwandte Funktionen in der Photosynthese. I) Die Sammlung und Weiterleitung von Lichtenergie, II) Stabilisierung der Granastapel, III) Ausgleich der Anregungsenergie von PS-I und PS-II, IV) Schutz der Photosynthese vor Überanregung mittels nichtphotochemischer Eliminierung von Anregungsenergie (NPQ). In der Pflanze bildet LHC-II Trimere in verschiedenen Kombinationen dreier Isoformen (Lhcb1, Lhcb2 und Lhcb3), wobei Lhcb1 mit 70-90% den Hauptteil des LHC-II stellt. Jedes Monomer bindet 8 verschiedene Co-Faktoren in unterschiedlichen Mengen, die ca. 30% seiner Masse ausmachen. Die drei Isoformen des LHC-II sind in allen Pflanzen stark konserviert. Die funktionelle Bedeutung der Isoformen ist jedoch weitestgehend unklar. Dies liegt vor allem an der schwierigen Isolierung reiner Isoformen aus Pflanzenmaterial. Im ersten Teil dieser Arbeit wurden deshalb alle drei Isoformen rekombinant hergestellt und mit getrennt isolierten Lipiden und photosynthetischen Pigmenten in ihre native Form gefaltet. Die anschließende biochemische und spektroskopische Charakterisierung zeigte einen hohen Grad an Homologie zwischen den drei Isoformen, wobei Lhcb3 die größten Unterschiede aufwies (Standfuss und Kühlbrandt 2004). Die wahrscheinlichsten Funktionen für Lhcb1 und Lhcb2 ist die Anpassung der Photosynthese an variierende Lichtbedingungen. LHC-II Heterotrimere mit Lhcb3 Anteil könnten an der Weiterleitung von Lichtenergie von der Haupt Lhcb1/Lhcb2 Antenne zum PS-II Reaktionszentrum beteiligt sein. Für die Erforschung des LHC-II war das mittels Cryo-Elektronenmikroskopie an 2D Kristallen erstellte atomare Modell des Komplexes von enormer Bedeutung. Ein tiefes Verständnis der Funktionen des LHC-II benötigt jedoch eine Struktur von höherer Auflösung, welche mit 2D Kristallen nur schwer zu erreichen ist. Im Verlauf der Arbeit wurden deshalb mehr als 100000 3D Kristallisationsexperimente durchgeführt, wodurch die Kristallisation von aus Erbsenblättern isoliertem und in vitro gefaltetem LHC-II gelang. Die 3D Kristalle aus nativem Material zeigten einen für die röntgenkristallographische Strukturaufklärung ausreichenden Ordnungsgrad und führten zu einer Struktur des LHC-II bei 2.5 Å Auflösung (Standfuss et al., eingereicht). Die Struktur zeigt 223 der 232 Aminosäuren und die Position und Orientierung von 4 Carotinoiden (2 Luteine, 1 Neoxanthin und 1 Violaxanthin), 14 Chlorophyllen (8 Chl a und 6 Chl b) und zwei Lipiden (PG und DGDG) pro Monomer. Diese Informationen sind essentiell für das Verständnis des Energietransfers innerhalb des LHC-II und zu den Photoreaktionszentren und sollten zusammen mit der großen Anzahl von spektroskopischen Untersuchungen eine zukünftige detaillierte Modellierung dieser ultraschnellen und extrem effizienten Energietransfer Prozesse ermöglichen. Auf Basis der Ladungsverteilung der stromalen Seite des Komplexes konnte ein Modell für die Beteiligung des LHC-II an der Stapelung von Grana in Chloroplasten erstellt werden. Dieses liefert außerdem eine plausible Erklärung für den mittels Phosphorylierung des N-Terminus gesteuerten Ausgleich von Anregungsenergie zwischen PS-I und PS-II. Die 2.5 Å Struktur des LHC-II zeigt schließlich einen einfachen aber effektiven Mechanismus zur Optimierung und Schutz des Photosyntheseapparates mittels NPQ. Dieser benötigt keine Strukturänderungen des LHC-II oder der restlichen Lichtsammelantenne und beruht auf der reversiblen Bindung der Xanthophylle Violaxanthin und Zeaxanthin an LHC-II. Diese Arbeit liefert damit Beiträge zu allen Funktionen des LHC-II Komplexes und hilft damit grundlegende Regulationsmechanismen und die Bereitstellung von solarer Energie für die pflanzliche Photosynthese zu verstehen.
Calcium-activated potassium channels are fundamental regulators of neuron excitability. SK channels are activated by an intracellular increase of Ca++ (such as occurs during an action potential). They have a small single channel conductance (less than 20pS) and show no voltage dependence of activation. To date, there are only a few examples of high-resolution structures of eukaryotic membrane proteins. All of them were purified from natural sources. Since no abundant natural sources of eukaryotic K+ channels are available we overexpressed rSK2 in order to produce the quantities necessary for structural analysis. Unfortunately the Pichia pastoris expression system did not yield sufficient amount of pure protein, mainly because most of the protein was retained by in the ER and was only partially soluble. Subsequently, two constructs were expressed: SK2-FCYENE (containing a specific sequence that promotes surface expression), and SK2-q-CaM a concatamer of SK2 and calmodulin. Although these proved an improvement in terms of solubilisation, little improvement was found in terms of amounts of purified material obtained. For this reason we tested the Semliki Forest virus expression system, since the protein is expressed in a mammalian system where we hoped that it would be trafficked in the same way as in vivo. Using this system it was possible to express rSK2 and solubilise it with several detergents and to achieve much better purification. However, the levels were still not sufficient for high-resolution structural studies, although sufficient for single particle electron microscopy analysis.
Molecular dynamics (MD) simulation serves as an important and widely used computational tool to study molecular systems at an atomic resolution. No experimental technique is capable of generating a complete description of the dynamical structure of the biomolecules in their native solution environment. MD simulations allow us to study the dynamics and structure of the system and, moreover, helps in the interpretation of experimental observations. MD simulation was first introduced and applied by Alder and Wainwright in 1957 \cite{Alder57}. However, the first MD simulation of a macromolecule of biological interest was published 28 years ago \cite{McCammon77}. The simulation was concerned with the bovine pancreatic trypsin inhibitor (BPTI) protein, which has served as the hydrogen molecule'' of protein dynamics because of its small size, high stability, and relatively accurate X-ray structure available in 1977 \cite{Deisenhofer75}. This method is now widely used to tackle larger and more complex biological systems \cite{Groot01,Roux02} and has been facilitated by the development of fast and efficient methods for treating the long-range electrostatic interactions \cite{Essmann95}, the availability of faster parallel computers, and the continuous development of empirical molecular mechanical force fields \cite{Langley98,Cheatham99,Foloppe00}. It took several years until the first MD simulations of nucleic acid systems were performed \cite{Levitt83,Tidor83,Prabhakaran83,Nilsson86}. These investigations, which were also performed in vacuo, clearly demonstrated the importance of proper handling of electrostatics in a highly charged nucleic acid system, and different approaches, such as reduction of the phosphate charges and addition of hydrated counterions, have been applied to remedy this shortcoming and to maintain stable DNA structures. A few years later, the first MD simulation of a DNA molecule, including explicit water molecules and counterions was published \cite{Seibel85}. Various MD simulations on fully solvated RNA molecules with explicit inclusion of mobile ions indicated the importance of proper treatment of the environment of highly charged nucleic acids \cite{Lee95,Zichi95,Auffinger97,Auffinger99}. Given the central roles of RNA in the life of cells, it is important to understand the mechanism by which RNA forms three dimensional structures endowed with properties such as catalysis, ligand binding, and recognition of proteins. Furthermore, the increasing awareness of the essential role of RNA in controlling viral replication and in bacterial protein synthesis emphazises the potential of ribonucleicacids as targets for developing new antibacterial and new antiviral drugs. Driven by fruitful collaborations in the Sonderforschungsbereich RNA-Ligand interactions" the model RNA systems in this study include various RNA tetraloops and HIV-1 TAR RNA. For the latter system, the binding sites of heteroaromatic compounds have been studied employing automated docking calculations \cite{Goodsell90}. The results show that it is possible to use this tool to dock small rigid ligands to an RNA molecule, while large and flexible molecules are clearly problematic. The main part of this work is focused on MD simulations of RNA tetraloops.
The quinol:fumarate reductase (QFR) is the terminal reductase of anaerobic fumarate respiration, the most commonly occurring type of anaerobic respiration. This membrane protein complex couples the oxidation of menaquinol to menaquinone to the reduction of fumarate to succinate. The three-dimensional crystal structure of the QFR from Wolinella succinogenes has previoulsy been solved at 2.2 Å resolution. Although the diheme-containing QFR from W. succinogenes is known to catalyze an electroneutral process, structural and functional characterization of parental and variant enzymes has revealed active site locations which indicate electrogenic catalysis across the membrane. A solution to this apparent controversy was proposed with the so-called “Epathway hypothesis”. According to this, transmembrane electron transfer via the heme groups is strictly coupled to a parallel, compensatory transfer of protons via a transiently established pathway, which is inactive in the oxidized state of the enzyme. Proposed constituents of the E-pathway are the side chain of Glu C180, and the ring C propionate of the distal heme. Previous experimental evidence strongly supports such a role for the former constituent. One aim of this thesis is to investigate by a combination of specific 13C-heme propionate labeling and FTIR difference spectroscopy whether the ring C propionate of the distal heme is involved in redox-coupled proton transfer in the QFR from W. succinogenes. In addition to W. succinogenes, the primary structures of the QFR enzymes of two other e- proteobacteria are known. These are Campylobacter jejuni and Helicobacter pylori, which unlike W. succinogenes are human pathogens. The QFR from H. pylori has previously been established to be a potential drug target, and the same is likely for the QFR from C. jejuni. The two pathogenic species colonize mucosal surfaces causing several diseases. The possibility of studying these QFRs from these bacteria and creating more efficient drugs specifically active for this enzyme depends substantially on the availability of large amounts of high-quality protein. Further, biochemical and structural studies on QFR enzymes from e- proteobacteria species other than W. succinogenes can be valuable to enlighten new aspects or corroborate the current understanding of this class of membrane proteins.
Im ersten Teil dieser Studie wurde zunächst untersucht, welche Mechanismen für die akute und chronische Desensitivierung der glattmuskulären löslichen Guanylylcyclase (GC) gegenüber NO bei intakter Gefäßfunktion verantwortlich sind. Das Kontraktions- und Relaxationsverhalten von isolierten Rattenaorten im Organbad diente als Maß für die GC-Aktivität. Es wurden sowohl der Einfluß des endogen gebildeten NO als auch der Einfluß von exogen zugeführtem NO untersucht. Hierbei wurde ermittelt, ob die Sensitivitätsänderung der GC gegenüber NO direkt durch NO vermittelt wird oder ob eine gesteigerte cGMP-Bildung die indirekte Ursache für die Desensitivierung des Rezeptorproteins ist. Es konnte gezeigt werden, daß die Desensitivierung aufgrund der basalen NO-Freisetzung erfolgte. Wir konnten weiterhin zeigen, daß exogen zugeführtes NO die glatte Gefäßmuskulatur der Ratte gegenüber NO in gleichem Maße desensitiviert wie endogen gebildetes NO. Durch Untersuchungen mit dem Atrialen Natriuretischen Faktor konnten wir den Signaltransduktionsweg näher charakterisieren und zeigen, daß sehr wahrscheinlich eine gesteigerte cGMP-Bildung für die akute Desensitivierung der GC verantwortlich ist. Ergänzend führten wir Analysen über das Redoxgleichgewicht der GC durch. Hierzu wurden neu entwickelte selektive Aktivatoren der Eisen (III)-Form der GC - S973448 und HMR1766 (schwefelsubstituierte Sulfonylamino-carbonsäure-N-arylamide) - verwendet. Wir konnten in unseren Befunden zeigen, daß die akute Desensitivierung der GC durch physiologische Konzentrationen von NO nicht auf einer Oxidation des Hämeisens des Enzyms beruht. In Tiermodellen wurden die Auswirkungen einer chronischen Aktivierung der Eisen (II)-Form und der Eisen (III)-Form der GC auf die NO-Sensitivität, den Redoxstatus und die Proteinexpression der GC analysiert. Außerdem wurde untersucht, ob Aktivatoren der Häm- oxidierten GC bei chronischer in vivo Anwendung eine Toleranz induzieren. Hierbei wurde insbesondere die Frage berücksichtigt, inwieweit diese Substanzen langfristig in der Lage wären, organische Nitrate bei der Behandlung von Krankheitsbildern mit endothelialer Dysfunktion, wie z. B. Atherosklerose und Bluthochdruck, zu ersetzen. Wir konnten erstmals zeigen, daß die Aktivatoren der Eisen (III)-Form der GC wesentliche Vorteile gegenüber den organischen Nitraten aufweisen, da dieBehandlung der Ratten mit S973448 und HMR1766 weder über einen Zeitraum von drei Tagen noch über vier Wochen zu einer Wirkungsabschwächung dieser Substanzen (Eigentoleranz) führt. Auch gegenüber organischen Nitraten sowie endogenem NO (Kreuztoleranz) konnten wir trotz der chronischen Aktivierung der Häm-oxidierten GC keinen Wirkungsverlust dieser Pharmaka beobachten. Expressionsänderungen der GC konnten wir ebenfalls nicht feststellen. Es ist daher anzunehmen, daß die neuen, selektiven Aktivatoren günstigere Eigenschaften als die bisher verwendeten organischen Nitrate aufweisen und therapeutisch zur Behandlung der genannten Herz- Kreislauf- Erkrankungen geeignet sind. Im zweiten Teil der Arbeit untersuchten wir in Tiermodellen mit einer experimentell induzierten Störung der Funktion des glatten Gefäßmuskels, ob die chronische Aktivierung der Eisen (II)-Form der GC zu einer Veränderung der NO-Empfindlichkeit, des Oxidationsstatus des Enzyms und der Expression der GC-Untereinheiten a (alpha) 1 und ß(beta) 1 führt. Wir konnten im Tiermodell der nitrattoleranten Ratte sowohl eine Toleranz gegenüber Nitroglycerol als auch gegenüber endothelabhänigen Dilatatoren und - wenn auch nicht so ausgeprägt - gegenüber Natriumnitroprussid (Kreuztoleranz) beobachten. Einen Wirkungsverlust gegenüber den Aktivatoren der Eisen (III)-Form der GC konnten wir nicht feststellen. Weiterhin zeigten wir, daß die chronische Aktivierung des Renin-Angiotensin-Systems zu einer gesteigerten Superoxidbildung führt, die wiederum eine verminderte Bioverfügbarkeit von NO bewirkt. Dies führt zu einer kompensatorisch gesteigerten Expression der GC-Untereinheiten ( a(alpha) 1 / ß (beta) 1 ) in nitrattoleranten Rattten. Im Tiermodell der genetisch salzsensitiven Dahl-S-Ratte konnten wir nachweisen, daß die durch den renalen Bluthochdruck hervorgerufene Gefäßdysfunktion in den Rattenaorten zu einer Abnahme der Sensitivität gegenüber Acetylcholin und Natriumnitroprussid sowie dem NO- unabhängigen, direkten Aktivator der GC, YC-1, führt. Auch war die Expression beider GC-Untereinheiten in den Aorten der hypertensiven Ratten vermindert.
Der Glycinrezeptor (GlyR) ist ein inhibitorischer Chloridkanal, der u.a. im Rückenmark, im Hirnstamm und in der Retina exprimiert wird und dort maßgeblich an der Prozessierung von motorischen und/oder sensorischen Signalen beteiligt ist. Als Mitglied der Superfamilie der nikotinischen Acetylcholinrezeptoren ist der GlyR ein Pentamer, dessen Untereinheiten jeweils aus einer extrazellulären N-terminalen Domäne, vier Transmembranregionen und einer großen intrazellulären Schleife bestehen. Bislang wurden vier ligandenbindende alpha-Untereinheiten (alpha 1-4) und eine für die synaptische Verankerung verantwortliche beta-Untereinheit identifiziert. Die beta-Untereinheit bildet im Gegensatz zu den alpha-Untereinheiten keine Homooligomere; sie ist nur in heterooligomeren GlyRs mit einer bisher angenommenen Stöchiometrie von 3alpha:2beta zu finden. Wie bei allen Mitgliedern der Superfamilie erfolgt die Ligandenbindung innerhalb der extrazellulären Domänen an der Kontaktstelle zwischen zwei benachbarten Untereinheiten. Um den Mechanismus der Ligandenbindung am homo- und heterooligomeren GlyR in dieser Arbeit aufzuklären, wurden Modelle der N-terminalen Domänen der alpha1- und beta-Untereinheiten basierend auf der Kristallstruktur des Acetylcholin-Bindeproteins generiert. Zur Verifizierung der Rolle aller im Modell in der Bindungstasche lokalisierten Aminosäureseitenketten wurden diese durch zielgerichtete PCR-Mutagenese substituiert, anschließend die mutierten Untereinheiten in Xenopus laevis Oozyten exprimiert und elektrophysiologisch charakterisiert. So konnten die wichtigsten Seitenketten der alpha1-Ligandenbindungstasche identifiziert werden, die an der Bindung der Agonisten Glycin und Taurin, des Antagonisten Strychnin und des Modulators 3alpha-(3’-Methoxybenzoyloxy)nortropan beteiligt sind. Die anschließende Untersuchung des heterooligomeren alpha1beta-GlyRs konnte zum ersten Mal eine direkte Beteiligung der beta-Untereinheit an der Ligandenbindung aufzeigen, wobei die Stabilisierung der Liganden in der Bindungstasche mit den zur alpha1-Untereinheit homologen Resten erfolgt. Zusätzlich ergab ein Vergleich der Affinitätsveränderungen nach Substitution homologer Reste in der alpha1- und der beta-Untereinheit Hinweise auf eine neue Stöchiometrie heterooligomerer GlyRs. Nur die Koexpression einer alpah1beta-Tandemuntereinheit mit der beta-Untereinheit resultierte in einem Rezeptor mit den gleichen pharmakologischen Eigenschaften wie der heterooligomere Wildtyp-GlyR. Dieses Ergebnis bestätigte die neue 2alpha:3beta Stöchiometrie heterooligomerer GlyRs. Damit wurde in dieser Arbeit eine dominante Rolle der beta-Untereinheit in heterooligomeren GlyRs aufgezeigt, welche für das Verständnis der synaptischen Verankerung und insbesondere der Pharmakologie des Rezeptors wichtig ist. Mit der neuen Stöchiometrie wurde gleichzeitig eine neue betabeta-Kontaktstelle in heterooligomeren GlyRs identifiziert, die als Wirkungsort neuer Therapeutika genutzt werden könnte.
Das bioanalytische Arbeiten mit integralen Membranproteinen ist aufgrund der hohen Hydrophobizität dieser Proteine stark eingeschränkt. Allgemein anwendbare Arbeitsvorschriften für die Analyse mittels Gelelektrophorese und Massenspektrometrie lassen sich für diese besonderen Proteine bislang nicht angeben. Infolge ihrer Schwerlöslichkeit in typischen wäßrigen Lösungsmittelsystemen erfordert die Isolierung von integralen Membranproteinen stets den Einsatz von Detergentien und häufig eine individuelle Anpassung der Solubilisierungsprotokolle. Hydrophobe Membranproteine mit einer hohen Anzahl an Transmembran-Helices und somit einem hohen Gravy-Score können unter den Bedingungen der für die Proteomanalyse eingesetzten zweidimensionalen IEF/SDS-Gelelektrophorese häufig nicht aufgetrennt werden. Ihre hohe Aggregationsneigung und die Inkompatibilität zu den Lösungsmittelsystemen der isoelektrischen Fokussierung sind unter anderem der Grund, weshalb Membranproteine bei der Gesamtstatistik von Proteomanalysen häufig unterrepräsentiert sind. Neben den Limitierungen bei der gelelektrophoretischen Auftrennung stellen Membranproteine auch für die massenspektrometrische Analyse und Identifizierung eine besondere Herausforderung dar. Hohe Sequenzabdeckungen und damit eindeutige Datenbankidentifizierungen, wie sie nach einem enzymatischen Verdau von wasserlöslichen Proteinen häufig erreichbar sind, werden bei Membranproteinen in der Regel nicht beobachtet. Insbesondere integrale Membranproteine mit einem hohen Anteil an Transmembran-Helices haben häufig nur wenige Schnittstellen für die routinemäßig eingesetzte Protease Trypsin; dies führt zu wenigen und großen Peptiden, die darüber hinaus in den verwendeten Lösungsmittelsystemen schwerlöslich sind. Verstärkt wirkt sich dieses Problem bei kleinen Membranproteinen aus. Oftmals erlaubt nur der Einsatz von Fragmentierungstechniken der Massenspektrometrie die Identifizierung eines solchen Proteins anhand eines oder zweier Peptide. Ziel der vorliegenden Arbeit ist es deshalb, durch die Entwicklung und Etablierung von neuen Protokollen und Methoden eine verbesserte gelelektrophoretische Trennung und massenspektrometrische Identifizierung dieser besonderen Proteine zu erreichen.
Mit kombinatorisch-chemischer Synthese und einem Gel-shift Test wurden niedermolekulare, peptidische RNA-Liganden gefunden. Als Target-Moleküle dienten ein 23mer RNA-Oligonukleotid (CETP-RNA) aus der Cholesterol Ester Transfer Protein mRNA und ein 27mer RNA-Oligonukleotid aus der HIV-1 Transactivation response region (TAR) RNA (delta-TAR-RNA). Zudem wurde erstmals die Methode des Phage Display angewendet, um RNA-Liganden zu finden. Die aus beiden Screeningmethoden erhaltenen Liganden wurden mit verschiedenen biophysikalischen Methoden, insbesonders der NMR-Spektroskopie auf ihre Bindungseigenschaften und mittels in vitro und in vivo-Tests auf ihre physiologische Aktivität hin untersucht. Ein 16mer Peptid der Antennapedia Homeodomäne internalisiert rasch in Zellen verschiedener Kulturen. Im Screening gefundene Peptidliganden wurde über flexible Spacer (2 beta-Ala-Einheiten) mit diesen 16mer synthetisiert. Es wurde gezeigt, daß diese Peptide so in die Zielzellen und besonders in deren Zellkern gelangen. Basische delta-TAR-RNA-Liganden zeigen diese Verhalten auch ohne Transportersequenz. Die Ergebnisse des Phage-Display-Screenings sind widersprüchlich, da die so gefundenen RNA-Liganden mit den genutzen biophysikalischen Methoden (NMR, CD, Gelelektrophorese) keine größere Affinität an die delta-TAR-RNA zeigen. Im physiologischen Test haben diese Liganden dennoch eine HIV-1 inhibitorische Aktivität gezeigt. In einer humanen Makrophagenkultur, der Wirtszelle von HIV, wurden mit den Peptiden Thr-Pro- Glu-Leu-Pro-Trp-His-NH2 und Phe-His-Ser-Val-Gln-Ala-Leu das HIV-1 Wachstum um 20- 30% inhibiert. Diese Ergebnisse widersprechen den strukturellen Bindungsinfornmationen und sind deshalb fraglich. Ein Monitoring während der Panning-Prozedur wurde nicht durchgeführt. Es wurde auch nicht überprüft, wieviel RNA wirklich immobilisiert wurde. Aufgrund der sehr geringen Substanzmengen was das nicht möglich. In einem deutlich größerem Maßstab, könnten in Zukunft strukturelle Informationen über die immobilisierte RNA gewonnen werden, z. B. mit HR-MAS-NMR-Techniken. Die im Gel-shift-Screening gefundenen delta-TAR-RNA-Liganden des Gel-shift-Screening zeigen keine HIV-1 inhibitorische Aktivität. Die gefundenen Bindungskonstanten sind allerdings um eine Größenordnung kleiner als die der natürliche Bindungsregion Tat10, welche eine HIV-1 inhibitorische Wirkung besitzt. Die im Gel-Shift-Screening gefundenen CETP-RNA/Peptid-Paare mit den stärksten Affinitäten wurden mittels NMR-Spektroskopie und CD- und Gel-shift-Experimenten charakterisiert. Die Bindungskonstanten lagen im niedrig mikromolaren Bereich. Wie in 1D Jump Return-Experimenten gezeigt wurde, verschoben sich die Signale verschiedener Liganden in Gegenwart der CETP-RNA unterschiedlich stark. Zudem konnte eine Verbreiterung der Signale der Liganden festgestellt werden. Das Peptid Lys-Tyr-Lys-Leu- Tyr-Lys-Cys-NH2 zeigte bei der CETP-RNA den stärksten Effekt mit Bindungsaffinitäten von Kd = 32±2 mikro-M (CD-Titration). In 2D NOESY Experimenten zeigt der Peptid-Ligand Kreuz-Signale zu den Iminoprotonen der CETP-RNA. Da die Sekundärstruktur der CETPRNA ein Hairpin ist, sollte das Peptid somit Kontakt zu der Doppelstrang-Region haben. Dieses Peptid zeigt zudem einen deutlichen Effekt auf das CD-Verhalten seiner CETP-RNA. Offenbar wird die Basenpaarung der Sekundärstruktur unter Peptideinfluß geschwächt. Im physiologischem Test am Tiermodell einer transgenen Maus zeigt dieser Ligand eine Erniedrigung des Cholesterolester Transfers. In Zukunft könnte das Peptid Lys-Tyr-Lys-Leu- Tyr-Lys-Cys-NH2 mit z. B. unnatürlichen Aminosäuren modifiziert werden, um eine bessere physiologische Stabilität zu erhalten und dadurch möglicherweise die physiologische Aktivität zu erhöhen. Auch eine Leitstrukturoptimierung kann durchgeführt werden.
Prion diseases, also called transmissible spongiform encephalopathies, are a group of fatal neurodegenerative conditions that affect humans and a wide variety of animals. To date there is no therapeutic or prophylactic approach against prion diseases available. The causative infectious agent is the prion, also termed PrPSc, which is a pathological conformer of a cellular protein named prion protein PrPc. Prions are thought to multiply upon conversion of PrPc to PrPSc in a self-propagating manner. Immunotherapeutic strategies directed against PrPc represent a possible approach in preventing or curing prion diseases. Accordingly, it was already shown in animal models, that passive immunization delays the onset of prion diseases. The present thesis aimed at the development of a candidate vaccine towards the active immunization against prion diseases, an immune response, which has to be accompanied by the circumvention of host tolerance to the self-antigen PrPc. The vaccine development was approached using virus-like particles (retroparticles) derived from either the murine leukemia (MLV) or the human immunodeficiency virus (HIV). The display of PrP on the surface of such particles was addressed for both the cellular and the pathogenic form of PrP. The display of PrPc was achieved by either fusion to the transmembrane domain of the platelet derived growth factor receptor (PDGFR) or to the N-terminal part of the viral envelope protein (Env). In both cases, the corresponding PrPD- and PrPE-retroparticles were successfully produced and analyzed via immune fluorescence, Western Blot analysis, immunogold electron microscopy as well as by ELISA methods. Both, PrPD- and PrPE-retroparticles showed effective incorporation of N-terminally truncated forms of PrPc but not for the complete protein. PrPc at this revealed the typical glycosylation pattern, which was specifically removed by a glycosidase enzyme. Upon display of PrPc on retroparticles the protein remained detectable by PrP-specific antibodies under native conditions. Electron microscopy analysis of PrPc-variants revealed no alteration of the characteristic retroviral morphology of the generated particles. MLV-derived PrPD-retroparticles were successfully used in immunization studies. Contrary to approaches using bacterially expressed PrPc, the immunization of mice resulted in a specific antibody response. The display of the pathogenic isoform was aimed by two different strategies. The first one was directed at the conversion of the proteinase K (PK) sensitive from of PrP on the surface of PrPD-retroparticles into the PK resistant form. Albeit specific adaption of the PK digestion assay detecting resistant PrP, no PrP conversion was observed for PrPD-retroparticles. The second approach utilized a replication competent variant of the ecotropic MLV displaying PrPc on the viral Env protein. This MLV variant was stable in cell culture for six passages but did not replicate on scrapie-infected, PrPSc-propagating neuroblastoma cells. Thus, besides PrPc-displaying virus-like particles a replication competent MLV variant was obtained, which stably incorporated PrPc at the N-terminus of the viral Env protein. The incorporation of the cell-surface located PrPc into particles was expected from previously obtained data on protein display in the context of retrovirus-derived particles. Thus, the lack of incorporation observed for the complete PrPc sequence was rather unexpected and was found to be inhibited at both, fusion to PDGFR and the viral Env. In contrast to N-terminally truncated PrPc, the complete PrPc was shown to exhibit increased cell surface internalization rates and half-life times eventually contributing to the observed results. The PrP-vaccination approach described in this work represents the first successful system inducing PrP-specific antibody responses against the prion protein in wt mice. Explanations at this are based on the induction of specific T cell help or effects of the innate immunity, respectively. MLV-and HIV-derived particles bearing the PrP-coding sequence or being replication competent variants generated during this thesis might help to further improve the PrP-specific immune response.
Tunikaten produzieren eine Vielzahl an cytotoxischen und antimikrobiellen Verbindungen, die ihnen in ihrem Ökosystem zu überlebenswichtigen Vorteilen verhelfen. Wegen ihrer strukturellen Diversität und ihrer spezifischen Eigenschaften haben bislang einige dieser Sekundärstoffe Eingang in die pharmazeutische Industrie gefunden. Ziel der vorliegenden Arbeit war eine umfassende Untersuchung des chemischen Potentials benthischer Ascidien der Nordsee. Die Eigenschaften der organischen Ascidienextrakte wurden anhand von vier Bioassays beschrieben. Die Assays fungierten gleichzeitig als Wegweiser zur Isolierung der aktiven Sekundärmetaboliten, der sich eine Strukturaufklärung mit spektroskopischen Methoden (NMR, MS, IR) anschloss. Es wurden Tests auf bewuchshemmende, antimikrobielle, cytotoxische und enzymhemmende Eigenschaften durchgeführt. Eingesetzt wurden organische Extrakte von 13 solitären und koloniebildenden Ascidienarten der nördlichen und südlichen Nordsee. In allen vier Assays zeigten mehrere oder alle Ascidienarten Aktivität. Es ließen sich keine Hinweise auf eine mit der Wuchsform der Arten korrelierte biologische Aktivität sammeln. In einem Freilandversuch zur Untersuchung der besiedlungshemmenden Wirkung der Extrakte konnte gezeigt werden, dass einige Ascidien eine chemische Abwehr von Algensporen oder Epibionten aufweisen, die artspezifisch unterschiedlich stark ausgeprägt ist. Alle Ascidienarten bewiesen antimikrobielle Aktivität, es ergaben sich aber sowohl in der Hemmhofbreite als auch in der Anzahl der gehemmten Bakterienstämme große artspezifische Unterschiede. Auffallend war, dass deutlich mehr Gram-positive sowie marine Bakterienstämme als Gram-negative bzw. nicht-marine Bakterienstämme inhibiert wurden. Im Gegensatz zur antimikrobiellen Aktivität wurden in den Assays zur Cytotoxizität und zur spezifischen Enzymhemmung lediglich bei jeweils vier Ascidienarten positive Effekte festgestellt. Durch die spezifische Anfärbung von Zellorganellen konnten morphologische Veränderungen, die durch die Ascidienmetaboliten in den Mausfibroblasten induziert wurden, sichtbar gemacht und der Einfluß der Extrakte auf das Cytoskelett und spezifische Zellfunktionen dokumentiert werden. Im Protein-Tyrosin-Kinase-Assay führte eine Bioassay-guided Fractionation von Extrakten der Ascidie Dendrodoa grossularia zur Isolierung der aktiven Substanz. Über spektroskopische Methoden sowie den Vergleich mit Literaturdaten konnte der enzymhemmende Metabolit als das Guanidinostyren Tubastrin identifiziert werden. Tubastrin wurde im Rahmen dieser Arbeit erstmals in Tunikaten nachgewiesen. Der Metabolit zeigte als Reinsubstanz nur geringe cytotoxische Effekte und keine antimikrobiellen Eigenschaften. Als weitere Metaboliten der Ascidien Dendrodoa grossularia und Ascidiella aspersa wurden Homarin, Betain, Adenosin und Inosin identifiziert. Keiner dieser Substanzen konnte in der vorliegenden Arbeit eine biologische Aktivität zugeordnet werden. Während Betain, Adenosin und Inosin Funktionen innerhalb des Primärmetabolismus besitzen oder als Zwischenprodukte in Synthesewege eingebunden sein können, stellt Homarin einen Sekundärmetaboliten dar, der in einer Vielzahl von marinen Organismen unterschiedliche Funktionen erfüllt. Seine Aufgabe in Tunikaten muss durch weitere Untersuchungen geklärt werden. Dass antimikrobielle Aktivität bei allen Ascidienarten gefunden wird, lässt auf eine grundlegende Bedeutung prokaryontischer Abwehr schließen. Die Unterschiede in der Stärke der Effekte aller Bioassays legen nahe, dass jede Ascidienart eine eigene Gesamtstrategie zur Verteidigung gegen Bewuchs und Fraßfeinde ausgebildet hat. Die aus den Laborversuchen erhaltenen Daten verdeutlichen eine weitreichende biologisch-chemische Aktivität von Aplidium punctum, Dendrodoa grossularia und Didemnum candidum, die neben der antimikrobiellen auch starke cytotoxische und/oder enzymhemmende Wirkung gezeigt haben. Die Lokalisation der aktiven Substanzen im Tier sowie eingehendere Versuche zur molekularen Wirkungsweise sind notwendig, die beobachteten Aktivitäten umfassend zu deuten und ihre Nutzbarkeit unter pharmakologischen Gesichtspunkten zu evaluieren.
Auxiliar-vermittelte Synthese von nicht-natürlichen Aminosäuren als Bausteine für RNA-Liganden
(2005)
In den letzten Jahren wurde deutlich, daß mRNAs regulatorische Elemente aufweisen.Ein Beispiel hierfür ist z. B. die Transkription des Human Immunodeficiency Virus Typ1 (HIV-1). Die Arginin-reiche Domäne des Tat-Proteins interagiert hierbei mit einer Bindungstelle innerhalb der Bulge-Region der TAR-RNA. Das Vorliegen des hochkonservierten Tat-TAR-Komplexes ist die Voraussetzung für die effiziente Transkription viraler Gene. Eine kompetitive Bindung synthetischer Liganden an die Bulge-Region sollte daher den viralen Vermehrungszyklus unterbrechen. Hochspezifische Liganden mit inhibitorischem Potential sind somit von größtem Interesse. Für eine hohe Liganden-Affinität sind neben ionischen Wechselwirkungen und HBrücken-Interaktionen vor allem auch Stapelwechselwirkungen (stacking) von entscheidender Bedeutung. Die Ligandensuche wurde auf Tripeptide fokussiert. Da die Anzahl natürlich vorkommender aromatischer Aminosäuren sehr limitiert ist,erfolgte im Rahmen dieser Arbeit zunächst eine stereoselektive Synthese von neuen,nicht-natürlichen Aminosäuren mit heteroaromatischen Seitenketten. Um den generellen Einsatz dieser Bausteine in kombinatorischen Bibliotheken zu demonstrieren,wurden zunächst Tripeptide des Musters Arg-X-Arg hergestellt. Bereits diese Tripeptide zeigten in einem Fluoreszenz-Assay inhibierende Effekte auf den Tat- TAR-Komplex von HIV-1 mit IC50-Werten von 2 - 80 µM. Diese vielversprechenden Liganden wiesen auch in einem Tat-TAR kontrollierten Reportergen-Assay stark inhibierende Wirkung in den Zellkulturen auf. Am Beispiel eines Peptides ließ sich mittels NMR-Spektroskopie eine Komplexkonformation bestimmen, die der des bekannten TAR-Argininamid-Komplexes entspricht. Durch den Einsatz von nichtnatürlichen und Standard-Aminosäuren in kombinatorischen Tripeptidbibliotheken (split and combine-Methode) konnte die Suche von potentiellen Peptid-Liganden um ein Vielfaches erweitert werden. Über ein on-bead-Screening ließen sich weitere vielversprechende TAR-bindende Tripeptide identifizieren. Die RNA-Ligandensuche wurde desweiteren auf die psi-RNA (HIV-1) und auf die mRNA des onkogenen bcr-abl Proteins ausgeweitet. Auch hier konnten einige RNA-bindende Tripeptide isoliert werden.
Synthese von modifizierten Nukleotiden und modifizierten Oligodesoxynukleotiden zur DNA-Analytik
(2004)
1.) Entwicklung eines Verfahrens zum Nachweis von Wechselwirkungen zwischen Sondenmolekülen und Targetmolekülen auf einem Sonden-Array Innerhalb des Projektes sollte ein Verfahren entwickelt werden, dass zum Nachweis von Wechselwirkungen zwischen Sondenmolekülen und Targetmolekülen auf Sonden-Arrays genutzt werden kann. Der prinzipielle Aufbau dieses Testsystems wird in der vorliegenden Arbeit beschrieben. Einer der entscheidenden Schritte zur Entwicklung dieses Verfahrens, ist die Einführung einer selektiv spaltbaren Bindung innerhalb der DNA. Die von uns hierfür präferierte Bindung ist die 5´-O-P-S-3´ Bindung. Das erste zu realisierende Ziel bestand damit in der Synthese der entsprechend 5´-Thio-modifizierten Amidite. Die Synthese von 4,4´-Dimethoxytriphenylmethanthiol, als alternative Schwefel-Quelle und gleichzeitig temporäre 5´-Schutzgruppe stellt den Schlüsselschritt der erfolgreichen Synthese dar. Mit Hilfe dieser Strategie gelingt es, die entsprechend benötigten modifizierten Amidite in zufriedenstellender Ausbeute herzustellen. Durch die Anwendung eines modifizierten Synthesezyklus ist die Synthese eines entsprechend Schwefel-modifizierten Modelloligodesoynukleotids möglich. Mit Hilfe dieser Verbindung wurde die erwünschte Spaltung der 5´-O-P-S-3´ Bindung mit Silbernitrat in Lösung und an verschiedenen Oberflächen (Chip, Biacore-Chip und Magnetic Beads) untersucht. 2.) Punktmutationsdetektion durch festphasenvermittelte Single Nucleotide Primer Extension (SNuPE) und MALDI-MS Ziel dieses Projektes war die Entwicklung eines neuen, elektrophoresefreien Verfahrens zur Detektion von bekannten Punktmutationen mittels fester Phase und der MALDI-Massenspektrometrie. Hierfür wird zunächst ein synthetisches Oligodesoxynukleotid, welches später als Primer fungiert, über einen photolytisch spaltbaren Linker an eine feste Phase gebunden. Dessen Oligodesoxynukleotid-Sequenz wird dabei so ausgewählt, daß sie komplementär zur Zielsequenz einer mutierten DNA ist und direkt vor der zu detektierenden Punktmutation endet. Durch eine enzymatische Polymerasereaktion wird der Primer dann um eine Base, die entweder komplementär zur korrekten DNA oder zur Mutation ist, verlängert. Das Reaktionsprodukt kann dann direkt mittels MALDI-MS photolytisch von der festen Phase getrennt und analysiert werden. Die Masse des Reaktionsproduktes ist festgelegt durch den erfolgten Einbau einer von vier Nukleobasen und gibt daher unmittelbar Auskunft über das Vorhandensein einer Punktmutation. Zunächst sollte die prinzipielle Durchführbarkeit des Projekts erarbeitet werden. Wesentliche Vorteile dieser neuen Methode im Vergleich zu bestehenden Verfahren wären der außerordentlich geringe Zeitaufwand und die unmittelbare Detektion ohne Label. Das hier entwickelte Konstrukt gestaltete sich allerdings für die Anwendung als ein Standardanalyseverfahren zu komplex, da für die Detektion von Punktmutationen aussagekräftigere und einfachere Verfahren bereits zur Verfügung stehen, der hier beobachtete Spaltungs-mechanismus wirft jedoch einige Fragen auf. Für einen Einsatz als photolabiles Trägermaterial ist dieses Konstrukt jedoch ebenfalls zu kompliziert. 3.) Verknüpfungsreaktionen von Acetal-geschützten Oligodesoxynukleotiden mit Hydrazin-modifizierten Derivaten Die effektive Konjugation von modifizierten Oligodesoxynukleotiden und Hydrazin-Derivaten durch die Verwendung einer 5´-Acetalfunktion konnte hier durch die Verwendung eines aromatischen Phosphitylierungsreagenz gezeigt werden. Das hergestellte 5´-Acetal-modifizierte Oligodesoxynukleotid fungiert hier als ein maskiertes 5´-Aldehyd. Der Einsatz des maskierten Acetals weist gegenüber dem reaktiven Aldehyd-Derivat mehrere Vorteile auf: es ist lagerstabil, gut handhabbar und stabil gegenüber den Bedingungen der Oligodesoxynukleotid-Synthese. Ein aromatisches Acetal-geschützte Oligodesoxynukleotid kann in einer Eintopfreaktion mit einem entsprechenden Hydrazin-Derivat umgesetzt werden. Das verwendete Hydrazin-Derivat muß jedoch als Hydrochlorid oder als Trifluoracetat eingesetzt werden. Die Reaktion erfolgt in wässriger methanolischer Lösung durch den Zusatz von Natriumacetat, dieses katalysiert die Reaktion. Durch den Einsatz von Methanol als Lösungsmittel kann der Reaktionsansatz direkt mit Hilfe der HPL-Chromatographie gereinigt werden. Die Umsetzung des Acetal-modifizierten Oligodesoxynukleotids wurde mit verschiedenen Hydrazinen durchgeführt. Die mit den Hydrazinen erreichten Ausbeuten übersteigen bei weitem (Ausnahme Biotin) die der entsprechenden Aktivester. Vorallem das Arbeiten in wässriger Lösung erleichtert die Synthese und die Aufreinigung. Hiermit steht eine 5´-Modifikation zur Verfügung, die eine Konjugation mit Hydrazin-Derivaten in sehr guten Ausbeuten ermöglicht.
Die chemische Analyse von 17 abundanten Nordseeschwammarten zeigte, dass die Metabolitenzusammensetzung und -konzentration standortbedingt nur geringfügig schwanken. Den Großteil der Schwammmetaboliten bilden mittelpolare bis polare Substanzen ohne UV-Absorption. Allgemein scheinen in Nordseeschwämmen aromatische und olefinische Verbindungen seltener vorzukommen als in tropischen Arten. Die Chemie der einzelnen Nordseeschwämme ist oft ähnlich und wird von kleinen, stickstoffhaltigen Molekülen dominiert. Ubiquitär verbreitete, vermutlich phylogenetisch alte Substanzen wie Inosin, Allantoin, Homarin und Trigonellin wurden in zahlreichen untersuchten Arten nachgewiesen. Trigonellin und Homarin üben, wie für andere marine Organismen bereits dokumentiert, auch in den Nordseeschwämmen Schutzfunktion gegen Konkurrenten und Fouling-Organismen aus. Die identifizierten Verbindungen weisen darauf hin, dass den mit dem Aminosäure- und Purinstoffwechsel verbundenen Biosynthesewegen eine große Bedeutung in der Naturstoffsynthese der untersuchten Schwammarten zukommt. Diese Vermutung wird dadurch untermauert, dass auch die Bildung von Imidazolen (aus Phakellia ventilabrum isoliert) aus Histidin eng mit dem Purinstoffwechsel verbunden ist. Durch den Abbau von Histidin können wiederum Substanzen entstehen, die als Methyldonatoren in Frage kommen (methylierte Verbindungen, vgl. Pachymatisma johnstonia). Biologische Aktivität wurde anhand von Biotests zur antilarvalen, cytotoxischen, antibakteriellen, enzyminhibitorischen und bewuchshemmenden Wirkung in Extrakten der untersuchten Nordseeschwämme nachgewiesen. Dabei zeigten alle Schwammarten Effekte in mehr als einem Biotest. Diese Untersuchungen bestätigen das Vorkommen biologisch aktiver Substanzen in Schwämmen kaltgemäßigter Habitate und widerlegen damit die Latitudinalhypothese. Unabhängig von der geographischen Breite sind Schwämme weltweit einem selektiven Druck ausgesetzt, der die Entwicklung biologisch aktiver Metaboliten begünstigt. Die Art der Selektionsfaktoren scheint jedoch habitatbedingt unterschiedlich zu sein. Während in wärmeren Gewässern vor allem Prädatoren (Fische) das Überleben der Schwämme beeinflussen, sind in kälteren Gebieten Aufwuchsorganismen und Bakterien von entscheidender Bedeutung. Diese Annahme wird durch die Beobachtung der assoziierten Organismen ebenso unterstützt, wie durch die Tatsache, dass in allen untersuchten Nordseeschwammarten (Esperiopsis fucorum, Phakellia ventilabrum, Leucosolenia complicata, Cliona celata, Pachymatisma johnstonia) Bakterien nachgewiesen werden konnten. Neben den ökologischen Beobachtungen bekräftigt auch die starke antibakterielle Wirkung der Schwammmetaboliten diese Hypothese. Während Toxizität seltener beobachtet wurde, zeigten viele Schwämme auch enzyminhibitorische Wirkung. Zusammenhänge zwischen biologischer Aktivität und morphologischen bzw. taxonomischen Kriterien, Lebensweise, Habitatcharakteristika oder assoziierten Organismen waren nicht durch Clusteranalysen aufzudecken. Es konnten jedoch Unterschiede im Metabolitengehalt und der Art der assoziierten Organismen zwischen langlebigen, großen Kieselschwammarten und kleineren, saisonal wachsenden Kalkschwämmen hervorgehoben werden. Leucosolenia compl icata (Calcarea) ist sowohl qualitativ als auch quantitativ relativ metabolitenarm, biologisch sehr aktiv und mit einer großen Zahl an Bakterien assoziiert. Die Mikroorganismen scheinen für diese Art von größerer Bedeutung zu sein als bei den untersuchten Demospongiae. Einige Kieselschwämme (z.B. Cliona celata, Phakellia ventilabrum) sind besonders metabolitenreich, enthalten weniger Bakterien und verfügen ebenfalls über biologisch aktive Substanzen. Um diese Beobachtungen in einem ökologischen Zusammenhang zu sehen, sind eingehendere Studien, wie sie mit Pachymatisma johnstonia durchgeführt wurden, notwendig. Die Isolierung der Hauptmetaboliten von Pachymatisma johnstonia führte zur Identifizierung der methylierten Substanzen Betain, N,N,N-Trimethyl-ß-alanin, L-6-Bromohypaphorin und dem Pyridinalkaloid Trigonellin. Anhand verschiedener biologischer Tests konnte ein Einblick in die Wirkungsweise und Funktion der aktiven Metaboliten gewonnen werden. Die Aminosäure L-6-Bromohypaphorin und eine noch nicht identifizierte Substanz zeigten starke Enzyminhibition gegenüber einer Protein-Tyrosin-Kinase. L-6-Bromohypaphorin wurde im Pinacoderm unbewachsener Individuen in einer höheren Konzentration nachgewiesen als in Schwämmen mit Bryozoenbewuchs, und spielt demnach vermutlich bei der Abwehr von Fouling-Organismen eine Rolle. Bakterien wurden als Produzenten der aktiven Substanzen ausgeschlossen. Eine Abgabe der Metaboliten nach außen ist eher unwahrscheinlich. Die Extrakte von P. johnstonia zeigten starke antibakterielle Wirkung mit einer Breitbandaktivität, vor allem gegen marine Bakterien. Welche Substanzen für diese Effekte verantwortlich sind, ist nicht bekannt. Eine Hälterung von P. johnstonia war möglich. Ebenso wie Cliona celata passte sich der Schwamm an veränderte abiotische und biotische Faktoren an. Verletztes Gewebe wurde regeneriert und Hauptmetaboliten weiter produziert. Die Synthesetätigkeit von P. johnstonia schwankte, die biologische Aktivität blieb über neun Monate hinweg erhalten. Durch eine Optimierung der Hälterungsbedingungen könnte die Naturstoffproduktion vermutlich konstant gehalten werden. Mit P. johnstonia wurde somit ein gutes Beispiel für die Interaktion zwischen Naturstoffchemie, Ökologie und pharmakologischem Potential bzw. biotechnologischer Nutzbarkeit geliefert. Bedingt durch das Ziel der Arbeit, einen Überblick über die Chemie und biologische Aktivität der Nordseeschwämme zu gewinnen, wurde weniger Augenmerk auf die Isolierung neuer Strukturen gelegt. Im Zuge von intensiveren Studien wäre eine Optimierung der chemischen Methodik anzustreben. Die Aufklärung der in geringerer Konzentration vorkommenden Substanzen könnte hilfreich sein, um den ersten Eindruck der Metabolitenzusammensetzung zu überprüfen. Außerdem wird aufgrund der Biotestergebnisse die Existenz zahlreicher biologisch aktiver Substanzen, vor allem antibiotischer Wirkstoffe, vermutet, deren Isolierung eine Herausforderung darstellt. Besonders interessant ist in diesem Zusammenhang auch die Tatsache, dass bisher sämtliche medizinisch genutzten Antibiotika aus Mikroorganismen stammen, Schwämme aber weltweit über ein hohes antibiotisches Potential verfügen. Dadurch stellt sich erneut die Frage, ob Schwämme tatsächlich selbst in der Lage sind, wirksame Substanzen zu produzieren. Diese Ungewissheit zusammen mit der Tatsache, dass alle aus den Nordseeschwämmen isolierten und identifizierten Verbindungen aus Stoffwechselwegen stammen, die bisher als für Mikroorganismen typisch beschrieben wurden, bietet interessante Ansatzmöglichkeiten für weitere Untersuchungen. Auch wenn Schwämme zu den am besten untersuchten Organismen in der marinen Naturstoffchemie zählen, ist das Wissen im Bereich der chemischen Ökologie noch begrenzt. Um mehr über die Beziehung zwischen Schwämmen und ihrer belebten Umwelt zu erfahren und die Rolle der Naturstoffe dabei aufzudecken, müssen geeignete Untersuchungsmethoden bzw. Biotests etabliert werden. Abbildung 4.1 soll die Bedeutung der Schwämme für ihren Lebensraum und den Menschen hervorheben und die komplexen Zusammenhänge, welche durch die Wirkung der Naturstoffe vermittelt werden, verdeutlichen. Häufig werden Schwämme als primitive Organismen beschrieben, da sie sich durch das Fehlen eines Nervensystems und anderer Organe von höheren Tieren unterscheiden. Tatsächlich sind diese Lebewesen aber hochentwickelte Spezialisten. Optimal an eine sessile Lebensweise angepasst, bewohnen sie seit Millionen von Jahren erfolgreich vor allem marine Habitate in großer Artendiversität und Abundanz. Aufgrund der Produktion von aktiven Metaboliten zur Abwehr schädlicher Organismen stellen die Schwämme aus menschlicher Perspektive eine wertvolle Ressource dar. Nicht nur aus diesem Grund sollten wir Ihnen mit Respekt begegnen und versuchen, die (Naturstoff-)forschung nachhaltig zu betreiben, die Beeinträchtigung der Tiere auf ein vertretbares Maß zu reduzieren und ihren Lebensraum zu schützen.
Paläobotanische Untersuchungen an Euramerischen Kohlenbecken haben an der Westfal/Stefan-Grenze in früheren Arbeiten einen deutlichen, weitgehend klimatisch gesteuerten Florenwechsel erkennen lassen. Desweiteren wurden in Kohlen aus dem Saar/Nahe-Becken beginnend mit dem obersten Westfal D erstmals Diageneseprodukte von Isoarborinol bzw. Fernen/Fernenol nachgewiesen, für die Koniferen, Cordaiten oder Farnsamer als mögliche Bioproduzenten vorgeschlagen wurden. Im Rahmen der vorliegenden Arbeit konnten die Arboran-/Fernanderivate MAPH, MATH, DAPH 1 und DAPH 2 in den Gesamtextrakten von Kohlen und Sedimenten aus dem Stefan des Saar/Nahe-Beckens durchgängig identifiziert werden, während die Verbindungen im Westfal lediglich in Proben aus dem obersten Westfal D auftraten. Folglich sind die Arboran-/Fernanderivate tatsächlich in besonderem Maße dazu geeignet, den Florenwechsel an der Westfal/Stefan-Grenze auf molekularer Basis zu beschreiben. Um einzugrenzen, zu welcher Pflanzengruppe die Bioproduzenten der Ausgangsverbindungen der Arboran-/Fernanderivate gehören, wurden isolierte Makrofossilien verschiedener Pflanzengruppen aus verschiedenen Euramerischen Kohlenbecken organisch-geochemisch analysiert. Dabei konnten MATH, MAPH, DAPH 1 und DAPH 2 in nahezu allen Gesamtextrakten fossiler Cordaiten-Reste identifiziert werden. In den Extrakten von Sediment-Vergleichsproben, die in unmittelbarer Nähe der Cordaiten-Reste entnommen wurden, konnten die Verbindungen dagegen nicht bzw. nur in vergleichsweise geringen Konzentrationen identifiziert werden. Ebenso waren die Arboran-/Fernanderivate in den Gesamtextrakten fossiler Koniferen-Reste sowie in den Extrakten verschiedener Farnsamerarten (Alethopteris, Dicroidium, Lescuropteris, Macroneuropteris, Neuropteris) nicht enthalten. Lediglich in der extrahierbaren organischen Substanz einiger fossiler Odontopteris-Reste aus dem Blanzy-Montceau-Becken (Frankreich) konnten MAPH und MATH (sowie teilweise DAPH 1 und DAPH 2) identifiziert werden. Allerdings ist das Auftreten der Verbindungen in diesen Odontopteris-Extrakten wahrscheinlich auf eine Überprägung des Pflanzenmaterials durch das umgebende Sediment zurückzuführen, da die Verbindungen in den Sediment-Vergleichsproben in höheren bzw. ähnlichen Konzentrationen enthalten sind. Insgesamt sind daher in den oberkarbonischen Kohlenbecken die Cordaiten als einer, möglicherweise sogar als „die“ Bioproduzenten der Ausgangsverbindungen der Arboran-/Fernanderivate MATH, MAPH, DAPH 1 und DAPH 2 anzusehen. Die deutlich negativere Kohlenstoffisotopie (-31,68 ‰) einer Sedimentprobe aus der Bohrung Wemmetsweiler-Nord, die gleichzeitig die höchsten Arboran-/Fernanderivat-Konzentrationen enthält, weist auf eine verstärkte mikrobielle Überarbeitung des organischen Materials hin. Fluoreszenz- und Auflichtmikroskopie-Untersuchungen zeigen zudem einen erheblichen, ebenfalls auf bakterielle Aktivität hindeutenden Bituminitanteil, während Relikte von höheren Landpflanzen nur geringfügig vertreten sind. Dies legt den Schluß nahe, daß die Arboran-/Fernanderivate in dieser Probe nicht von Cordaiten, sondern alternativ von Bakterien (oder Algen) abstammen. In diesem Fall ist Isoarborinol als biologischer Vorläufer anzunehmen und es tritt eine deutliche Verschiebung der Kohlenstoffisotopie-Werte zu negativeren Werten auf. Bei den Cordaiten ist eine derartige Isotopenverschiebung dagegen nicht zu beobachten, so daß für MATH, MAPH, DAPH 1 und DAPH 2 Fernen bzw. Fernenol als biologische Vorläufer anzunehmen sind.
Analytik von Kontaminationen auf Siliciumoberflächen : Möglichkeiten und Grenzen des VPD-Verfahrens
(2004)
In der Halbleiterindustrie führen in der Massenproduktion von Mikroelektronik-Bauelementen bereits geringfügige Mengen an metallischen Verunreinigungen zu einer erheblichen Verminderung der Ausbeuten und setzen die Zuverlässigkeit der Bauelemente drastisch herab. Deshalb müssen nicht nur die als Ausgangsmaterial verwendeten Siliciumscheiben bezüglich des Kontaminationsgrades durch Fremdatome höchsten Ansprüchen genügen, sondern auch die einzelnen Fertigungsschritte für die Produktion von elektronischen Bauelementen. Für die Detektion der Oberflächenverunreinigungen kommt in der Halbleiterindustrie die Totalreflexions-Röntgenfluoreszenz-Spektrometrie (TXRF) mit einer Empfindlichkeit von 1010 Atomen/cm2 zum Einsatz. Mittlerweile liegen die Anforderungen deutlich unterhalb dieser Nachweisgrenze. Durch Anwendung des Aufkonzentrierungsverfahrens VPD (Vapour-Phase-Decomposition) in Kombination mit etablierten Analysemethoden wie TXRF oder GF-AAS (Graphitrohr-Atom- Absorptions-Spektrometrie) können die in der Halbleiterindustrie notwendigen Nachweisgrenzen zur Detektion der Metalloberflächenbelegungen erreicht werden. VPD ist ein Verfahren, das thermische, chemische oder native Oxide auf Siliciumscheiben durch HFDampf ätzt. Metallische Verunreinigungen, die sich auf oder in der Oxidschicht befinden, können anschließend durch Abscannen der hydrophoben Oberfläche mit einem Tropfen eingesammelt werden. Zwei wichtige Begriffe, die unmittelbar im Zusammenhang mit dem VPD-Verfahren stehen, sind die Einsammelrate (Collecting Efficiency CE) und die Wiederfindungsrate (Recovery Rate RR) des Analyten. Die vorliegende Arbeit beschäftigt sich mit der Bestimmung der beiden Größen am Beispiel des Mangans und des Eisens. Dabei spielt die Frage nach der Zuverlässigkeit und Reproduzierbarkeit der verwendeten Analysemethode eine wichtige Rolle. Inwiefern beeinträchtigt das Silicium, das aus der SiO2-Schicht in Lösung geht und nach einem Trocknungsprozess im Rückstand verbleibt, die mittels TXRF erhaltenen Wiederfindungsraten des Analyten. Da die Antworten auf diese Fragen nur in Verbindung mit anderen Analyseverfahren gefunden werden konnten, kamen neben TXRF, GF-AAS und Photometrie auch radiochemische Methoden zum Einsatz. Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurde zunächst das Adsorptionsverhalten des Mangans auf der Silicium (100)-Oberfläche in verdünnter ammoniakalischer Wasserstoffperoxid- Lösung (SC1) untersucht. Zwischen der Mangan-Konzentration in der SC1-Lösung und der Oberflächenbelegung auf den Siliciumscheiben besteht ein deutlicher Zusammenhang. Mit zunehmender Konzentration in der Lösung steigen die mit TXRF ermittelten Oberflächenbelegungen an. Eine Sättigung der Manganbelegung war im untersuchten Konzentrationsbereich nicht nachweisbar. XPS-Spektren zufolge handelt es sich bei der adsorbierten Mn-Spezies um Mn(III)- und/oder Mn(IV)-Oxide. Winkelabhängige TXRF-Untersuchungen dokumentieren die Filmeigenschaften der Mn- Kontaminationen der aus SC1-Lösungen präparierten Siliciumscheiben. Erst ab hohen Mangankonzentrationen von 15 ppmw im SC1-Bad sinkt der Filmanteil der Adsorption auf 42 %. Auch die aus wässrigen sauren Mn-Lösungen kontaminierten Proben zeigen überwiegend einen filmartigen Charakter der Metalladsorption. VPD-TXRF Analysen wurden zunächst mit SC1 behandelten Siliciumscheiben durchgeführt, deren Mn-Oberflächenbelegungen im Bereich von 1 10 x 1012 Atomen/cm2 lagen. Die ermittelten Mn-TRR-Werte (TRR (totale Wiederfindungsrate) = CE X RR) zeigten deutliche Differenzen zum Maximalwert von 1 und dehnten sich über einen Bereich von 0,55 0,68 aus. Durch den Vergleich mit AAS und TXRF (Gerät EXTRA IIA) konnten die Ursachen für die Minderbefunde der TRR-Werte u.a. auf die direkten TXRF-Messungen (Gerät 8010) zurückgeführt werden, welche die Mn-Ausgangsbelegungen um etwa 20 % überbewerten. Wie sich herausstellte, führt die Quantifizierung von filmartigen Oberflächenbelegungen mit Hilfe eines externen Partikelstandards zu einer Überbewertung der Kontamination. Diese Feststellung wird durch den Vergleich zwischen TXRF 8010 und radiochemischen Messmethoden untermauert. Generell kann es bei der Quantifizierung der Oberflächenbelegungen mittels TXRF 8010 zu Fehlinterpretationen kommen, wenn der Analyt und der Standard ein unterschiedliches Fluoreszenzverhalten in Abhängigkeit des Einfallswinkels aufweisen. Es kommt dadurch zu einer Unterbewertung von partikelartigen Mangan- und Eisenkontaminationen, die nach eigenen Einschätzungen 10 % betragen kann. Weiterhin dokumentieren die Mn-TRR-Werte deutlich die Unterschiede zwischen externer und interner TXRF-8010 Kalibrierung. Die Differenzen der TRR-Werte von durchschnittlich 0,35 ergeben sich aus der verminderten Fluoreszenzstrahlung des internen Standards Rubidium. Die aus den TXRF-Spektren entnommenen Netto-counts des Rubidiums liegen deutlich unterhalb des Erwartungswertes der 1 ng entsprechenden Menge. Die TRR-Werte des Mangans von TXRF (Gerät EXTRA IIA) und AAS liefern vergleichbare und vor allem reproduzierbare Ergebnisse. Die Übereinstimmung der Ergebnisse zeigt deutlich, dass die beiden Analysemethoden als Vergleichsmethoden zu TXRF 8010 geeignet sind. Die Zuverlässigkeit der beiden Methoden dokumentiert sich auch in den übereinstimmenden Ergebnissen der Mn- und Fe-Wiederfindungsraten. Für diesen Vergleich wurden unterschiedlich konzentrierte Mn- und Fe-Lösungen in verschiedenen Matrices angesetzt. Die im Vergleich zu AAS und TXRF EXTRA IIA niedrigeren Wiederfindungsraten von TXRF 8010 sind u.a. auf die Kalibrierung mit dem 1 ng Ni-Standard zurückzuführen. Weiterhin konnte festgestellt werden, dass die TXRF-Messungen der in Siliciummatrix vorliegenden Mn- und Eisenproben noch deutlichere Minderbefunde aufweisen. Die Ursachen dafür sind Streueffekte, die durch die Siliciummatrix im Rückstand hervorgerufen werden (s.u.). Wie aus den radioaktiven Tracer-Experimenten hervorgeht, kann der überwiegende Teil der Gesamtkontamination des Mangans und des Eisens auf der Siliciumscheibe durch den ersten Abrollvorgang eingesammelt werden. Anhand der Mangan- und Eisenmengen, die im ersten DSE-Tropfen mittels ³-Messung detektiert werden, errechnen sich die durchschnittlichen Collecting Efficiencies von Mangan und Eisen zu 96,5 bzw. 98,5 %. Die Einsammelraten sind in dem untersuchten Konzentrationsbereich unabhängig von der Ausgangsbelegung. Collecting Efficiencies können auch ohne Kenntnis der Ausgangsbelegung bestimmt werden, wenn die Gesamtmenge der Kontamination durch die Analyse der VPD-Rückstände und der Restbelegung auf der Siliciumscheibe ermittelt wird. Die Bestimmung der Collecting Efficiency nach dieser Methode ist sinnvoll, da eine fehlerhafte Analyse der Ausgangsbelegung - wie am Beispiel der direkten TXRF-Messung gezeigt - zu verfälschten Resultaten führt. Die Anwendbarkeit beschränkt sich jedoch nur auf nichtflüchtige Analyten. Im Vergleich zur ³-Analyse zeigen die Mn-Wiederfindungsraten von TXRF 8010 deutliche Minderbefunde. Auch in diesem Beispiel liegen die Ursachen für die Unstimmigkeiten u.a. in der Kalibrierung durch den 1 ng Ni-Standard begründet. Beim Eisen deutet sich ein konzentrationsabhängiger Trend an. Die höchsten Fe-Wiederfindungsraten erhält man von den Proben mit den niedrigsten Ausgangsbelegungen. Ein Erklärungsansatz beruht auf der Annahme, dass hohe Konzentrationen an Kationen (>1015 Fe-Atome pro Siliciumscheibe) die Verflüchtigung des Siliciums als SiF4 verstärkt unterbinden und somit zu einer massiven Siliciummatrix im VPD-Rückstand führen. Daraus resultieren Streueffekte durch die Matrix, die ein vermindertes Fluoreszenzsignal des Analyten zur Folge haben. VPD-Experimente an SC1-gereinigten Siliciumscheiben belegen, dass der eingetrocknete Rückstand im Wesentlichen aus Silicium besteht. Die Summe der Metallverunreinigungen der SC1- gereinigten Proben liegt deutlich unterhalb 1015 Atomen pro Siliciumscheibe. Wie am Beispiel des Mangans und des Eisens gezeigt werden konnte, liegt die Zuverlässigkeit des VPD-Verfahrens in den hohen und vor allem reproduzierbaren Einsammelraten. Die festgestellten Differenzen der TRR-Ergebnisse sind ausschließlich auf die unterschiedlichen Wiederfindungsraten der eingesetzten Analysemethoden zurückzuführen. Radiochemische Messmethoden wurden bis auf wenige Ausnahmen für derartige Untersuchungen noch nicht angewendet. Die übereinstimmenden Ergebnisse mit den etablierten Analysemethoden und die hohe Empfindlichkeit der ²- und ³-Analyse zeigen ihr Potenzial als Ergänzungsmethode auf diesem Anwendungsgebiet. Die chemischen Wechselwirkungen zwischen Flusssäure und der SiO2-Schicht während des Ätzprozesses im VPD-Reaktor sind abhängig von der relativen Luftfeuchtigkeit. Anhand der Siliciummengen, die nach dem Ätzprozess mit Hilfe unterschiedlicher DSE-Lösungen eingesammelt wurden, konnten viele neue Informationen erarbeitet werden. Das entwickelte qualitative Modell beschreibt in Abhängigkeit von der relativen Luftfeuchtigkeit, in welcher Phase (fest/flüssig/gasförmig) das aus der SiO2-Schicht geätzte Silicium vorliegt.
Im Mittelpunkt der Arbeit steht die theoretische Beschreibung von ultraschnellen nichtadiabatischen cis-trans-Photoisomerisierunen in kondensierter Phase. Zu diesem Zweck wurde auf einen etablierten Modell-Hamilton-Operator zur Darstellung des isomerisierenden Systems zurückgegriffen und die Wechselwirkung mit der Umgebung im Rahmen der Redfield-Theorie behandelt. Eine gängige Näherung im Rahmen der Redfield-Theorie ist die Säkularnäherung, welche eine deutliche Reduktion des numerischen Aufwands bewirkt. Allerdings liefert die Säkularnäherung keine korrekte Beschreibung der Dynamik für Systeme, welche Regelmäßigkeiten im Eigenwertspektrum aufweisen, was für die in dieser Arbeit benutzten Isomerisierungsmodelle mit harmonischen Schwingungsmoden zutrifft. Andererseits verbietet sich für diese Systeme aus numerischer Sicht der Redfield-Algorithmus mit vollem Relaxationstensor. Daher wurde in dieser Arbeit ein nichtsäkularer Algorithmus entwickelt, der durch die Berücksichtigung der wichtigsten nichtsäkularen Terme eine adäquate Beschreibung der Dynamik im Rahmen der Redfield-Theorie liefert und gleichzeitig zu einer durchschnittlichen Reduktion der Rechenzeit auf ein Zehntel gegenüber der vollen Redfield-Rechnung führt. Im Rahmen der Redfield-Theorie wurden dann Dekohärenz- und dissipative Effekte für ein zweidimensionales Isomerisierungsmodell untersucht, wobei die unterschiedliche nichtadiabtische Dynamik an einer konischen Durchschneidung versus einer vermiedenen Kreuzung im Mittelpunkt des Interesses stand. Fazit dieser Studie ist, dass die konische Durchschneidung ein schnelles Abklingen anfänglicher Kohärenzen und eine effiziente Energieabgabe an die Umgebung bewirkt, was zu einer um eine Größenordnung schnelleren Isomerisierung gegenüber der vermiedenen Kreuzung führt. Daraus kann gefolgert werden, dass der photochemische Trichter tatsächlich der bevorzugte Reaktionsweg bei ultraschnellen internen Konversionsprozessen ist. Ein weiteres Anliegen dieser Arbeit war die Simulation von zeit- und frequenzaufgelösten Pump-Probe-Spektren für Photoreaktionen in dissipativer Umgebung. Hierzu wurde der Doorway-Window-Formalismus herangezogen, bei dem die Wechselwirkung der Pump- und Probepulse mit dem System im Doorway- bzw. Window-Operator enthalten ist. Für diese wurden unter der Annahme gaussförmiger Laserpulse durch analytische Integration der zweizeitigen Antwortfunktionen explizite Ausdrücke erhalten, die in den Redfield-Algorithmus integriert wurden. Somit existiert nun eine Methode zur Berechnung von Pump-Probe-Spektren, deren Skalierungsverhalten durch den Redfield-Algorithmus bestimmt wird. Diese Methode wurde dann angewandt für eine umfangreiche Modellstudie zu PumpProbe-Spektren von Isomerisierungsreaktionen in dissipativer Umgebung. Dabei wurden potentielle Probleme bei der Interpretation von transienten Spektren durch die Überlagerung und teilweisen Auslöschung der spektralen Beiträge zum Gesamtsignal aufgezeigt und diskutiert. In einer weiteren Studie wurde die Methode benutzt, um am Beispiel eines Morse-Oszillators zeitaufgelöste IR-Experimente zu simulieren, wie sie zur Gewinnung von modenselektiven Informationen über eine Reaktion durchgeführt werden.
NMDA-Rezeptoren sind als ionotrope Glutamatrezeptoren (iGluRs) an der Signalübertragung durch den wichtigen Neurotransmitter L-Glutamat beteiligt. Vor allem aufgrund ihrer Bedeutung für das Phänomen der neuronalen Plastizität sind NMDA-Rezeptoren außerordentlich gründlich untersucht worden. Dennoch sind auch heute noch zentrale Fragen zu ihrer Funktionsweise ungeklärt, darunter auch diejenige, wie auf molekularer Ebene die Umsetzung der Glutamatbindung in die Öffnung des Ionenkanals erfolgt. Publizierte Kristallstrukturen der Liganden-bindungsdomänen zweier iGluRs haben die Grundlage für ein Modell der ligandeninduzierten und der Kanalöffnung vorausgehenden Vorgänge in der Bindungsdomäne geschaffen. Diesem zufolge schließt sich die aus zwei Teildomänen bestehende Bindungsdomäne venusfliegenfallenartig um den Liganden und die dabei entstehende mechanische Spannung führt zur Öffnung des Ionenkanals. Dieses Modell wurde in der vorliegenden Arbeit überprüft. Hierzu wurden verschiedene in der Ligandenbindungsdomäne punktmutierte NR1/NR2A-Rezeptoren heterolog in Säugerzellen exprimiert und durch Glutamat hervorgerufene Gesamtzellströme elektrophysiologisch gemessen. Mittels kinetischer Auswertung wurden dann Aminosäurereste in der Bindungsdomäne identifiziert, die einen Beitrag zur Kanalöffnung leisten. Die notwendige Schnelligkeit der Ligandenzugabe wurde dabei durch dessen photochemische Freisetzung aus einer maskierten und dadurch inaktiven Vorstufe (caged compound) erreicht. Die Ergebnisse bestätigen das Modell der Kopplung der Kanalöffnung an das Schließen der Bindungsdomäne und erweitern das Verständnis der genauen zeitlichen Abfolge der ligandeninduzierten Konformationsänderungen in der Bindungsdomäne. Intramolekulare Wechselwirkungen zwischen den Teildomänen S1 und S2 spielen demnach erst relativ spät im Aktivierungsprozeß eine Rolle und dienen vor allem der Stabilisierung des geschlossenen Zustandes der Bindungsdomäne und damit des offenen Ionenkanals.
Die antivirale Funktion der RNA-abhängigen Adenosin-Desaminase bei der angeborenen Immunantwort
(2004)
Die angeborene Immunantwort von Säugetieren ist die erste wirkungsvolle Barriere gegen eindringende Pathogene, die sowohl Infektionen als auch die Entstehung von Neoplasien verhindern kann. Insbesondere wird durch sie die Ausbreitung und Replikation von Viren wirksam bekämpft. Bei RNA-Viren wird die angeborene Immunabwehr in infizierten Zellen von der doppelsträngigen RNA aktiviert, die während der Replikation oder Transkription dieser Viren entsteht. Es kommt zur Sezernierung von Interferon-alpha und -beta (IFN-alpha/beta), die wiederum die Expression einer Reihe von antiviralen Proteinen stimulieren. Eines dieser Proteine ist die IFN-alpha-induzierbare RNA-abhängige Adenosin Desaminase (iADAR-1). Ziel dieser Arbeit war es, die Rolle der iADAR-1 in der Immunabwehr näher zu charakterisieren. Bisher wurde die antivirale Aktivität der iADAR-1 gegen verschiedene Virusstämme, deren Genome Adenosin zu Guanosin (A->G) Hypermutationen aufweisen, nur angenommen, jedoch noch nicht direkt gezeigt [4]. In dieser Arbeit wurde am Beispiel des Glykoproteins (GP) des lymphozytären Choriomeningitis Virus (LCMV) untersucht, ob solche A->G Mutationen im viralen Genom tatsächlich durch die iADAR-1 verursacht werden und ob dadurch die Funktion der viralen Proteine und damit die Infektiösität von LCMV reduziert wird. Des Weiteren wurde die Induktion der iADAR-1 durch die Infektion mit LCMV und die Wirkung der iADAR-1 auf die Replikation von LCMV analysiert. Bekannt war nur, dass die iADAR-1 durch IFN-alpha selbst oder durch die Infektion von Makrophagen mit Adenoviren induziert wird. In dieser Arbeit wurde erstmals für Fibroblasten, neuronale Zellen und in vivo in Mäusen nachgewiesen, dass die iADAR-1 direkt durch die Infektion mit LCMV hochreguliert wird. Dies ist ein weiterer Hinweis, dass die iADAR-1 zu den antiviralen Effektormolekülen der angeborenen Immunabwehr zählt. LCMV induzierte die Expression der iADAR-1 sowohl auf mRNA- als auch auf Proteinebene. Im Gegensatz zu Vaccinia- und Adenoviren, die die Aktivität der iADAR-1 inhibieren [5, 6], konnte bei der Infektion von SH-SY5Y-Zellen mit LCMV keine reduzierte Aktivität der iADAR-1 festgestellt werden. Ferner konnte das schon in anderen Viren beobachtete A->G Hypermutationsmuster nun auch für LCMV bestätigt werden. Sowohl in vitro in L929-Zellen als auch in vivo in Mäusen wurde eine erhöhte A->G Mutationsfrequenz gefunden, die zwischen 50 und 75 % aller Mutationen in der S-RNA von LCMV ausmacht. Dies zeigte sich vor allem in der späten Phase der Infektion, also zu Beginn der Persistenz. Insgesamt wurden zu diesem Zeitpunkt in L929-Zellen 27 % und in der Maus 15 % nicht funktionelles LCMV-GP synthetisiert. Zudem wurde die Relevanz der A->G Hypermutationen für die beeinträchtigte Funktion des GPs deutlich, da sie 62 % der nicht infektiösen GP-Moleküle verursachen. Die desaminierende Wirkung der iADAR-1 auf das virale Genom von LCMV wurde in 293T-Zellen direkt gezeigt. A->G Mutationen in der S-RNA von LCMV nahmen durch die Überexpression der iADAR-1 in 293T-Zellen um 40 % zu. Ebenso wurde die Replikation bzw. das Assembly von Virionen durch die iADAR-1 reduziert, da im Vergleich zu Kontrollzellen der LCMV-Titer im Überstand von iADAR-1-überexprimierenden Zellen wesentlich niedriger war. Des Weiteren konnte bestätigt werden, dass die A->G Mutationen nicht durch die virale Polymerase induziert werden. Hierfür wurden iADAR-1 „knockout“ murine embryonale Fibroblasten (MEF) isoliert und als stabile Zelllinie etabliert. In diesen Zellen war kein A->G Hypermutationsmuster in der LCMV-RNA zu erkennen. In MEF wt war ebenfalls kein A->G Hypermutationsmuster nachweisbar. Der Grund hierfür könnte die im Vergleich zu L929-Zellen deutlich geringere basale iADAR-1-Expression der nicht völlig ausdifferenzierten MEFs sein.
In dieser Arbeit werden Untersuchungen über die Anwendbarkeit von vier Methoden zur selektiven Einführung von Radikalen in DNA vorgestellt. Hierzu wurde die EPR-Spektroskopie (Elektronen-paramagnetische Resonanz) benutzt. Die selektive Einführung und Erzeugung von Radikalen in DNA ist nötig, um J-Kopplungen in DNA zu untersuchen. Vor dem Fernziel der Bestimmung der Austauschkopplungskonstanten J in biradikalischer DNA und deren Korrelation mit der charge-transfer-Geschwindigkeitskonstanten kCT stellen diese Untersuchungen einen wichtigen Ausgangspunkt dar. Stabile aromatische Nitroxide. Simulationen von Raumtemperatur-CW-X-Band-EPRSpektren fünf verschiedener aromatischer Nitroxide, welche potentielle DNA-Interkalatoren sind, wurden durchgeführt. Die aromatischen Nitroxide zeigen aufgelöste Hyperfeinkopplungen, welche zu dem Schluss führen, dass die Spindichte in hohem Maße delokalisiert ist, was die Verwendung dieser Verbindungen zur Messung von J-Kopplungen in biradikalischer DNA erlaubt. Transiente Guanin-Radikale. Transiente Guanin-Radikale werden in DNA selektiv durch die Flash-Quench-Technik erzeugt, bei der optisch anregbare Ruthenium-Interkalatoren verwendet werden. Transiente Thymyl-Radikale aus UV-bestrahltem 4'-Pivaloyl-Thymidin. Es werden photoinduzierte Prozesse untersucht, welche durch Bestrahlung von Thymin-Nukleosiden, die an der 4’-Position die optisch spaltbare Pivaloyl-Gruppe tragen, erzeugt werden. Dieses Nukleosid wurde speziell dafür entworfen, um Elektronenlöcher in DNA zu injizieren. In dieser Arbeit wird gezeigt, dass diese Verbindung benutzt werden kann, um selektiv eine Thymin-Base zu reduzieren. Transiente Thymyl-Radikale erzeugt durch ein neuartig modifiziertes Thymin nach UV-Bestrahlung. Photoinduzierte Prozesse, welche durch Bestrahlung eines ähnlichen Thymidin-Nukleosids erzeugt wurden, werden hier untersucht. Dieses Thymidin- Nukleosid wurde modifiziert, indem die optisch spaltbare Pivaloyl-Gruppe an eine Seitenkette angehängt wurde, welche an der C6-Position der Thymin-Base sitzt. Die Thymin-Base wurde speziell dafür entworfen, um Elektronen in DNA zu injizieren. In dieser Arbeit wurde bestätigt, dass ein Überschuss-Elektron selektiv auf eine Thymin-Base transferiert werden kann.
Im Rahmen der Arbeit wurde eine Methodik zur umfassenden und automatischen Identifizierung von nativen Peptiden aus Extrakten komplexer biologischer Quellen entwickelt und am Beispiel des humanen Hämofiltrats angewendet. Die Firma BioVisioN führt seit der Gründung Forschung auf dem Gebiet der Peptide und kleinen Proteine mit dem Ziel, diagnostisch und therapeutisch relevante Substanzen zu finden, durch. Die Analyse sogenannter Peptidome, der qualitativen und quantitativen Beschreibung aller nativen Peptide und kleinen Proteinen bis ca. 15 kDa, ist als Analogon zur Proteom-Analytik zu verstehen, welche sich umfassend mit Proteinen beschäftigt. Quantitativ wird ein Peptidom über die Kombination chromatographischer Trennung und Fraktionierung mit der massenspektrometrischen „Inventarisierung“ der einzelnen Peptidspezies sowie den relativen Konzentrationen in der Probe erfasst, welches an anderer Stelle ausführlich beschrieben ist. Das Ergebnis einer solchen Peptidomanalyse besteht aus einer Peptidkarte, die die Peptide der Probe repräsentativ abbildet. Die Qualität eines Peptidoms wird über die Massen der Peptide, deren Aminosäuresequenzen und Elutionsverhalten und weitere biologische Informationen beschrieben. Zu diesen Zweck wird der Begriff des Peptide-Inventory eingeführt. Ein Inventory besteht aus allen verfügbaren Informationen nativer Peptide einer Quelle. Zu Beginn der Arbeit standen mit der reproduzierbaren Erstellung von Peptidbanken und deren systematischer Kartierung über MALDI-MS bereits zwei Werkzeuge zur Verfügung, um Daten eines Inventories zu erheben. Lediglich für die Erzeugung der Sequenzdaten wurde mit dem Edman-Abbau zwar eine etablierte, aber viel zu langsame und wenig sensitive Methode eingesetzt. Hier wurde der Ersatz durch eine schnelle und leicht zu automatisierenden Methode angestrebt. Die massenspektrometrische Sequenzierung über MS/MS mit anschließender Datenbanksuche ist ein aus der Proteom-Analytik durchaus bekanntes Verfahren, musste aber für die Analyse der nativen Peptide in einigen Bereichen modifiziert werden. Obwohl die Massenspektrometrie Peptide direkt aus komplexen Mischungen heraus identifizieren kann, stellte sich schnell heraus, dass die vorliegende biologische Beispielprobe (humanes Blutfiltrat) zu komplex war, um sie direkt für die geplante Sequenzierung einzusetzen. Es wurde eine erneute Auftrennung und Feinkartierung der Peptidbank notwendig. Jede dritte Fraktion wurde rechromatographiert und anschließend wiederum kartiert. Die entstandenen 97 Peptidkarten enthalten im Linear Modus ca. 100.000 Signale und im Reflektron Modus ca. 30.000 Signale, so dass nach der Feinkartierung > 10.000 native, im menschlichen Körper zirkulierende Peptide durch diese Methode dargestellt werden können. Zur Automatisierung der Kartierungsmessungen mit MALDI-MS wurde im Laufe dieser Arbeit ein Autosampler für ein MALDI-TOF-MS-System entwickelt und implementiert (DiskJockey). Das System hat eine Kapazität von 20 MALDI-Targets und ist vollständig über die Gerätesoftware steuerbar, so dass MALDI-MS-Messungen vollständig automatisiert über mehrere Tage ablaufen können. Zur Erzeugung der Sequenzdaten wurde eine Kombination aus elektrischer Ionenfalle und Datenbanksuche angewendet. Um zu gewährleisten, dass nur die zuvor kartierten Peptide einer MS/MS-Messung unterzogen werden, wurde das Softwaretool Alcatrap entwickelt. Diese Software übernimmt aus MALDI-MS-Messungen die Werte der monoisotopischen Peaks, überführt sie in mehrfach geladene Spezies und erstellt sowohl eine Methode für das MS-Gerät, als auch eine in die Gerätesoftware importierbare Arbeitsliste. Hierbei wird jeweils die Kollisionsenergie in Abhängigkeit der m/z-Wertes dynamisch gesetzt. Um den Datentransfer vom Fragmentspektrum zur Datenbanksuchmaschine zu gewährleisten, wurde mit „D2M“ eine weitere Softwareschnittstelle entwickelt. Die Erstellung des Inventories aus humanem Hämofiltrat liefert 1.225 verschiedene native, im menschlichen Blut zirkulierende Peptide aus 146 Proteinvorläufern. Darunter befinden sich mehrere Peptide, die neben ihrer physiologischen Bedeutung auch eine potenzielle medizinische Relevanz besitzen. Weiterhin ist auch der dynamische Bereich von acht Größenordnungen, in dem Sequenzen erzeugt wurden, vergleichbar mit dem des menschlichen Blutes. Eine Charakterisierung von Peptidomen ist in diesem Umfang bisher noch nicht durchgeführt worden und stellt eine Neuerung in der Proteomforschung dar. Die Studie ist durchaus vergleichbar mit kürzlich veröffentlichten umfangreichen Proteomstudien aus menschlichem Plasma und Serum und stellt eine Ergänzung dieser für den Bereich der Peptide und kleinen Proteine dar. Limitierungen bei der Identifizierung von Peptiden mit der Ionenfalle wurden analysiert und mit der Adaptierung des Peptide-Inventory Konzepts auf hochauflösende Quadrupol-Time-of-Flight Massenspektrometer zufriedenstellend gelöst. In diesem Rahmen wurde eine Methode entwickelt, die es ermöglicht, native Peptide bis zu einem Molekulargewicht von bis zu 8.500 Da direkt aus der komplexen Mischung zu fragmentieren und über eine Datenbanksuche zu identifizieren. Außerdem konnte exemplarisch gezeigt werden, dass durch die größere Massengenauigkeit und das größere Auflösungsvermögen des QTOF die Datenbanksuche wesentlich effektiver ist und durch die Kombination von Rechromatographie und QTOF-MS/MS nahezu jedes Signal einer Peptidbank der Identifizierung zugänlich gemacht werden kann. Sowohl die integrierte Methodik der Herstellung eines Peptide-Inventories, als auch die in dieser Arbeit erzielten Ergebnisse von nativen Peptiden in humanem Blut stellen wissenschaftliche Neuerungen dar, auf denen eine weitergehende Peptidom-Analytik aufsetzen kann.
Die Ermittlung von Proteinstukturen mittels NMR-Spektroskopie ist ein komplexer Prozess, wobei die Resonanzfrequenzen und die Signalintensitäten den Atomen des Proteins zugeordnet werden. Zur Bestimmung der räumlichen Proteinstruktur sind folgende Schritte erforderlich: die Präparation der Probe und 15N/13C Isotopenanreicherung, Durchführung der NMR Experimente, Prozessierung der Spektren, Bestimmung der Signalresonanzen ('Peak-picking'), Zuordnung der chemischen Verschiebungen, Zuordnung der NOESY-Spektren und das Sammeln von konformationellen Strukturparametern, Strukturrechnung und Strukturverfeinerung. Aktuelle Methoden zur automatischen Strukturrechnung nutzen eine Reihe von Computeralgorithmen, welche Zuordnungen der NOESY-Spektren und die Strukturrechnung durch einen iterativen Prozess verbinden. Obwohl neue Arten von Strukturparametern wie dipolare Kopplungen, Orientierungsinformationen aus kreuzkorrelierten Relaxationsraten oder Strukturinformationen, die sich in Gegenwart paramagnetischer Zentren in Proteinen ergeben, wichtige Neuerungen für die Proteinstrukturrechnung darstellen, sind die Abstandsinformationen aus NOESY-Spektren weiterhin die wichtigste Basis für die NMR-Strukturbestimmung. Der hohe zeitliche Aufwand des 'peak-picking' in NOESY-Spektren ist hauptsächlich bedingt durch spektrale Überlagerung, Rauschsignale und Artefakte in NOESY-Spektren. Daher werden für das effizientere automatische 'Peak-picking' zuverlässige Filter benötigt, um die relevanten Signale auszuwählen. In der vorliegenden Arbeit wird ein neuer Algorithmus für die automatische Proteinstrukturrechnung beschrieben, der automatisches 'Peak-picking' von NOESY-Spektren beinhaltet, die mit Hilfe von Wavelets entrauscht wurden. Der kritische Punkt dieses Algorithmus ist die Erzeugung inkrementeller Peaklisten aus NOESY-Spektren, die mit verschiedenen auf Wavelets basierenden Entrauschungsprozeduren prozessiert wurden. Mit Hilfe entrauschter NOESY-Spektren erhält man Signallisten mit verschiedenen Konfidenzbereichen, die in unterschiedlichen Schritten der kombinierten NOE-Zuordnung/Strukturrechnung eingesetzt werden. Das erste Strukturmodell beruht auf stark entrauschten Spektren, die die konservativste Signalliste mit als weitgehend sicher anzunehmenden Signalen ergeben. In späteren Stadien werden Signallisten aus weniger stark entrauschten Spektren mit einer größeren Anzahl von Signalen verwendet. Die Auswirkung der verschiedenen Entrauschungsprozeduren auf Vollständigkeit und Richtigkeit der NOESY Peaklisten wurde im Detail untersucht. Durch die Kombination von Wavelet-Entrauschung mit einem neuen Algorithmus zur Integration der Signale in Verbindung mit zusätzlichen Filtern, die die Konsistenz der Peakliste prüfen ('Network-anchoring' der Spinsysteme und Symmetrisierung der Peakliste), wird eine schnelle Konvergenz der automatischen Strukturrechnung erreicht. Der neue Algorithmus wurde in ARIA integriert, einem weit verbreiteten Computerprogramm für die automatische NOE-Zuordnung und Strukturrechnung. Der Algorithmus wurde an der Monomereinheit der Polysulfid-Schwefel-Transferase (Sud) aus Wolinella succinogenes verifiziert, deren hochaufgelöste Lösungsstruktur vorher auf konventionelle Weise bestimmt wurde. Neben der Möglichkeit zur Bestimmung von Proteinlösungsstrukturen bietet sich die NMR-Spektroskopie auch als wirkungsvolles Werkzeug zur Untersuchung von Protein-Ligand- und Protein-Protein-Wechselwirkungen an. Sowohl NMR Spektren von isotopenmarkierten Proteinen, als auch die Spektren von Liganden können für das 'Screening' nach Inhibitoren benutzt werden. Im ersten Fall wird die Sensitivität der 1H- und 15N-chemischen Verschiebungen des Proteinrückgrats auf kleine geometrische oder elektrostatische Veränderungen bei der Ligandbindung als Indikator benutzt. Als 'Screening'-Verfahren, bei denen Ligandensignale beobachtet werden, stehen verschiedene Methoden zur Verfügung: Transfer-NOEs, Sättigungstransferdifferenzexperimente (STD, 'saturation transfer difference'), ePHOGSY, diffusionseditierte und NOE-basierende Methoden. Die meisten dieser Techniken können zum rationalen Design von inhibitorischen Verbindungen verwendet werden. Für die Evaluierung von Untersuchungen mit einer großen Anzahl von Inhibitoren werden effiziente Verfahren zur Mustererkennung wie etwa die PCA ('Principal Component Analysis') verwendet. Sie eignet sich zur Visualisierung von Ähnlichkeiten bzw. Unterschieden von Spektren, die mit verschiedenen Inhibitoren aufgenommen wurden. Die experimentellen Daten werden zuvor mit einer Serie von Filtern bearbeitet, die u.a. Artefakte reduzieren, die auf nur kleinen Änderungen der chemischen Verschiebungen beruhen. Der am weitesten verbreitete Filter ist das sogenannte 'bucketing', bei welchem benachbarte Punkte zu einen 'bucket' aufsummiert werden. Um typische Nachteile der 'bucketing'-Prozedur zu vermeiden, wurde in der vorliegenden Arbeit der Effekt der Wavelet-Entrauschung zur Vorbereitung der NMR-Daten für PCA am Beispiel vorhandener Serien von HSQC-Spektren von Proteinen mit verschiedenen Liganden untersucht. Die Kombination von Wavelet-Entrauschung und PCA ist am effizientesten, wenn PCA direkt auf die Wavelet-Koeffizienten angewandt wird. Durch die Abgrenzung ('thresholding') der Wavelet-Koeffizienten in einer Multiskalenanalyse wird eine komprimierte Darstellung der Daten erreicht, welche Rauschartefakte minimiert. Die Kompression ist anders als beim 'bucketing' keine 'blinde' Kompression, sondern an die Eigenschaften der Daten angepasst. Der neue Algorithmus kombiniert die Vorteile einer Datenrepresentation im Wavelet-Raum mit einer Datenvisualisierung durch PCA. In der vorliegenden Arbeit wird gezeigt, dass PCA im Wavelet- Raum ein optimiertes 'clustering' erlaubt und dabei typische Artefakte eliminiert werden. Darüberhinaus beschreibt die vorliegende Arbeit eine de novo Strukturbestimmung der periplasmatischen Polysulfid-Schwefel-Transferase (Sud) aus dem anaeroben gram-negativen Bakterium Wolinella succinogenes. Das Sud-Protein ist ein polysulfidbindendes und transferierendes Enzym, das bei niedriger Polysulfidkonzentration eine schnelle Polysulfid-Schwefel-Reduktion katalysiert. Sud ist ein 30 kDa schweres Homodimer, welches keine prosthetischen Gruppen oder schwere Metallionen enthält. Jedes Monomer enhält ein Cystein, welches kovalent bis zu zehn Polysulfid-Schwefel (Sn 2-) Ionen bindet. Es wird vermutet, dass Sud die Polysulfidkette auf ein katalytischen Molybdän-Ion transferiert, welches sich im aktiven Zentrum des membranständigen Enzyms Polysulfid-Reduktase (Psr) auf dessen dem Periplasma zugewandten Seite befindet. Dabei wird eine reduktive Spaltung der Kette katalysiert. Die Lösungsstruktur des Homodimeres Sud wurde mit Hilfe heteronuklearer, mehrdimensionaler NMR-Techniken bestimmt. Die Struktur beruht auf von NOESY-Spektren abgeleiteten Distanzbeschränkungen, Rückgratwasserstoffbindungen und Torsionswinkeln, sowie auf residuellen dipolaren Kopplungen, die für die Verfeinerung der Struktur und für die relative Orientierung der Monomereinheiten wichtig waren. In den NMR Spektren der Homodimere haben alle symmetrieverwandte Kerne äquivalente magnetische Umgebungen, weshalb ihre chemischen Verschiebungen entartet sind. Die symmetrische Entartung vereinfacht das Problem der Resonanzzuordnung, da nur die Hälfte der Kerne zugeordnet werden müssen. Die NOESY-Zuordnung und die Strukturrechnung werden dadurch erschwert, dass es nicht möglich ist, zwischen den Intra-Monomer-, Inter-Monomer- und Co-Monomer- (gemischten) NOESY-Signalen zu unterscheiden. Um das Problem der Symmetrie-Entartung der NOESY-Daten zu lösen, stehen zwei Möglichkeiten zur Verfügung: (I) asymmetrische Markierungs-Experimente, um die intra- von den intermolekularen NOESY-Signalen zu unterscheiden, (II) spezielle Methoden der Strukturrechnung, die mit mehrdeutigen Distanzbeschränkungen arbeiten können. Die in dieser Arbeit vorgestellte Struktur wurde mit Hilfe der Symmetrie-ADR- ('Ambigous Distance Restraints') Methode in Kombination mit Daten von asymetrisch isotopenmarkierten Dimeren berechnet. Die Koordinaten des Sud-Dimers zusammen mit den NMR-basierten Strukturdaten wur- den in der RCSB-Proteindatenbank unter der PDB-Nummer 1QXN abgelegt. Das Sud-Protein zeigt nur wenig Homologie zur Primärsequenz anderer Proteine mit ähnlicher Funktion und bekannter dreidimensionaler Struktur. Bekannte Proteine sind die Schwefeltransferase oder das Rhodanese-Enzym, welche beide den Transfer von einem Schwefelatom eines passenden Donors auf den nukleophilen Akzeptor (z.B von Thiosulfat auf Cyanid) katalysieren. Die dreidimensionalen Strukturen dieser Proteine zeigen eine typische a=b Topologie und haben eine ähnliche Umgebung im aktiven Zentrum bezüglich der Konformation des Proteinrückgrades. Die Schleife im aktiven Zentrum umgibt das katalytische Cystein, welches in allen Rhodanese-Enzymen vorhanden ist, und scheint im Sud-Protein flexibel zu sein (fehlende Resonanzzuordnung der Aminosäuren 89-94). Das Polysulfidende ragt aus einer positiv geladenen Bindungstasche heraus (Reste: R46, R67, K90, R94), wo Sud wahrscheinlich in Kontakt mit der Polysulfidreduktase tritt. Das strukturelle Ergebnis wurde durch Mutageneseexperimente bestätigt. In diesen Experimenten konnte gezeigt werden, dass alle Aminosäurereste im aktiven Zentrum essentiell für die Schwefeltransferase-Aktivität des Sud-Proteins sind. Die Substratbindung wurde früher durch den Vergleich von [15N,1H]-TROSY-HSQC-Spektren des Sud-Proteins in An- und Abwesenheit des Polysulfidliganden untersucht. Bei der Substratbindung scheint sich die lokale Geometrie der Polysulfidbindungsstelle und der Dimerschnittstelle zu verändern. Die konformationellen Änderungen und die langsame Dynamik, hervorgerufen durch die Ligandbindung können die weitere Polysulfid-Schwefel-Aktivität auslösen. Ein zweites Polysulfid-Schwefeltransferaseprotein (Str, 40 kDa) mit einer fünffach höheren nativen Konzentration im Vergleich zu Sud wurde im Bakterienperiplasma von Wolinella succinogenes entdeckt. Es wird angenommen, dass beide Protein einen Polysulfid-Schwefel-Komplex bilden, wobei Str wässriges Polysulfid sammelt und an Sud abgibt, welches den Schwefeltransfer zum katalytischen Molybdän-Ion auf das aktive Zentrum der dem Periplasma zugewandten Seite der Polysulfidreduktase durchführt. Änderungen chemischer Verschiebungen in [15N,1H]-TROSY-HSQC-Spektren zeigen, dass ein Polysulfid-Schwefeltransfer zwischen Str und Sud stattfindet. Eine mögliche Protein-Protein-Wechselwirkungsfläche konnte bestimmt werden. In der Abwesenheit des Polysulfidsubstrates wurden keine Wechselwirkungen zwischen Sud und Str beobachtet, was die Vermutung bestätigt, dass beide Proteine nur dann miteinander wechselwirken und den Polysulfid-Schwefeltransfer ermöglichen, wenn als treibende Kraft Polysulfid präsent ist.
Der Transport von antigenen Peptiden in das Lumen des endoplasmatischen Retikulums ist ein zentraler Vorgang bei der Antigenprozessierung und ihrer MHC-Klasse-I-vermittelten Präsentation auf der Zelloberfläche. Intrazelluläre Translokation über die ER-Membran erfolgt mit Hilfe von TAP, eines ATP-abhängigen ABC-Transporters. Einer ATP-unabhängigen Substratbindung folgt der eigentliche Transportschritt, dessen Energetisierung einer ATP-Spaltung bedarf. In der vorliegenden Dissertation wurde die ATPase-Aktivität des TAP-Komplexes aufgeklärt und detailliert charakterisiert. Es wurde eine schnelle und schonende Isolierungs- und Rekonstitutionsmethode entwickelt, die es erlaubt, den partiell aufgereinigten TAP-Komplex in Liposomen einzubauen und Funktionsstudien in vitro durchzuführen. Zum ersten Mal war es damit möglich, die Peptid-stimulierte TAP-spezifische ATP-Hydrolyse direkt zu beobachten und deren kinetische Parameter zu bestimmen. Eine direkte Korrelation zwischen Bindungsaffinität des Peptides zu TAP (Bindungskonstante KD) und der halbmaximalen Stimulation der ATPase-Aktivität von TAP (Km,pep) wurde festgestellt. Die Versuche mit den verzweigten Peptiden zeigten, dass Peptide, die nicht transportiert werden können, keine Stimulation der ATPase-Aktivität hervorrufen. Somit wurde die allosterische Interaktion zwischen Peptidbindung, ATP-Hydrolyse und Peptidtransport nachgewiesen. Nach der Entfernung des peptidexportierenden Sec61-Komplexes aus den Proteoliposomen konnte die vorläufige Stöchiometrie des Transportschrittes bestimmt werden. Eine weitere Anwendung fand die Rekonstitutionsmethode bei der Aufklärung des molekularen Wirkungsmechanismus des TAP-Inhibitors US6, indem der TAP-Komplex zusammen mit der aktiven ER-luminalen Domäne von US6 in die Proteoliposomen rekonstituiert wurde. Die Bindung von US6(delta147-183) an die ER-luminalen Bereiche von TAP blockiert die ATP-Bindung an die zytoplasmatischen NBD des Transporters. Die Peptid-induzierte ATP-Hydrolyse wird durch die Inhibition der ATP-Bindung unterbunden, wohingegen die Peptid- und ADP-Bindung von TAP nicht beeinflusst sind.
Der Einbau von Übergangsmetallionen in Polymerketten kann zu Materialien mit vielversprechenden optischen, elektronischen oder magnetischen Eigenschaften führen, wie sie auf der Basis konventioneller organischer Polymere nicht zu erzielen sind. Die für metallorganische Makromoleküle charakteristischen Eigenschaften resultieren vor allem aus der Vielfalt der Strukturtypen, die für Metallkomplexe auftreten, und in vielen Fällen aus kooperativen Effekten zwischen den Übergangsmetallzentren eines Polymerstranges. Gezieltes Materialdesign setzt daher neben einem grundlegenden Verständnis der Interaktion zwischen den Metallkomplexfragmenten die Fähigkeit voraus, diese durch geeignete Verknüpfungseinheiten so miteinander zu verbinden, dass Wechselwirkungen zwischen ihnen auftreten. Kooperative Phänomene lassen sich häufig bereits an kurzkettigen Oligomeren beobachten, die daher als Modellsysteme für die entsprechenden Polymere dienen. Vor diesem Hintergrund lag der Schwerpunkt der vorliegenden Arbeit auf der Synthese und Charakterisierung di- und trinuclearer Metallkomplexe. Darüber hinaus wurden aber auch entscheidende Fortschritte in Bezug auf die Synthese metallhaltiger Polymere auf der Basis ausgewählter Ferrocenderivate erzielt. Zur Darstellung der Zielverbindungen wurden sowohl etablierte Verknüpfungs-Konzepte genutzt als auch neue Syntheserouten entwickelt. Als wichtige Startverbindungen wurden die Ferrocenylborane FcBR2 und 1,1‘-fc(BR2)2 [Fc = (C5H5)Fe(C5H4), fc = Fe(C5H4)2, R = Br, H, CR‘3] eingesetzt, da sich deren Borylsubstituenten in vielfältiger Weise zur Verknüpfung der metallorganischen Bausteine nutzen lassen. Aufgrund der Lewis-sauren Eigenschaften der Borylsubstituenten können Ferrocenylborane mit difunktionellen organischen Lewis-Basen wie 4,4‘-Bipyridin oder Pyrazin zu Polymeren verknüpft werden. Um die Anzahl der Metallatome innerhalb derartiger Makromoleküle zu erhöhen, wurden im Rahmen dieser Arbeit erstmals metallorganische Lewis-Basen als Verknüpfungseinheiten eingesetzt. In dieser Hinsicht bieten sich 3,4-Dimethyl-1-phosphaferrocen und 3,3‘,4,4‘-Tetramethyl-1,1‘-diphosphaferrocen sowie Ferrocenyllithium und 1,1‘-Dilithioferrocen an, da in diesen Verbindungen das Lewis-basische Zentrum Bestandteil des Cyclopentadienylrings ist. Im Gegensatz zu Phosphaferrocenen bilden die starken Lewis-Basen Ferrocenyllithium und 1,1‘-Dilithioferrocen mit dem Ferrocenylboran FcBMe2 selbst in Lösung stabile Addukte (z. B. Fc2BMe2Li). Polymerisationsversuche mit den Edukten 1,1‘-(fcBMe2)2 und 1,1‘-Dilithioferrocen führen entgegen den Erwartungen jedoch nicht zu polymerem Material, sondern ergeben das borverbrückte [1.1]Ferrocenophan [{Fe-(C5H4)2}2{BMe2}2]Li2. Die Struktur von [{Fe-(C5H4)2}2{BMe2}2]Li2 im festen Zustand weist als hervorstechendstes Merkmal ein nacktes Lithium-Ion auf, das sich im Zentrum des Käfigs befindet. Dieses supramolekulare Aggregat ist auch in Lösung beständig. Werden jedoch beide Ferroceneinheiten oxidiert, verlässt das Li+-Ion den Makrozyklus, um nach vollständiger Reduktion von [{Fe-(C5H4)2}2{BMe2}2] wieder an seinen ursprünglichen Platz zurückzukehren. Komplementär zum Verknüpfungskonzept über dative Bor-Stickstoff-, Bor-Phosphor- und Bor-Kohlenstoff-Bindungen wurde im Rahmen dieser Arbeit eine Kondensationsreaktion erarbeitet, die auf einfachem Wege zu kovalent verknüpften di- und oligonuclearen Ferrocenkomplexen führt. Bei der Umsetzung von FcBBr2 mit HSiEt3 beobachtet man eine Dimerisierungsreaktion, die unter Bildung von Fc2BBr verläuft. Einer entsprechenden Reaktion lässt sich auch 1,1‘-fc(BBr2)2 unterziehen, womit sich ein Weg zu Poly(ferrocenylenen) eröffnet, in denen die Ferroceneinheiten über dreifach koordiniertes Bar verknüpft sind ([-fcB(R)-]n, R = Br). Weitere Wege zu ferrocenhaltigen Polymeren mit Bar im Polymerrückgrat wurden durch die erfolgreiche Synthese der Ferrocenylborane FcBH2 und 1,1‘-fc(BH2)2 eröffnet, die in Form ihrer Lewis-Säure-Base-Addukte mit Dimethylethylamin [FcBH2 . NMe2Et; 1,1‘-fc(BH2 . NMe2Et)2] oder Dimethylsulfid [FcBH2 . SMe2; 1,1‘-fc(BH2.SMe2)2] isoliert werden konnten. FcBH2 . NMe2Et und FcBH2 . SMe2 erwiesen sich als aktive und selektive Hydroborierungsreagenzien. Durch Umsetzung mit aromatischen Dialkinen werden dadurch konjugierte Polymere zugänglich, welche mit Polyolefinen verwandt sind, in denen einige der Kohlenstoffatome durch Boratome ersetzt wurden. Diese Materialien zeichnen sich durch ausgeprägt pi-Delokalisation aus, die sich über das Bor hinweg erstreckt, und weckten unser Interesse, da Oxidation der Ferrocenyl-Seitenketten eine elektrochemische Modifizierung der Ladungsdichte an den Borzentren erlauben sollte. Gleichzeitig ließen sich auf diese Weise paramagnetische Fe(III)-Ionen in unmittelbarer Nachbarschaft zu einem elektrisch leitfähigen Polymer generieren. Überdies erhält man Polymere des Typs [-fcB(R)-]n nicht nur über die Reaktion von 1,1‘-fc(BBr2)2 mit HSiEt3 (R = Br) sondern auch über die Kondensationsreaktion von 1,1‘-fc(BH2)2, die unter Abspaltung von BH3 verläuft (R = H).
Der T-Zell-Wachstumsfaktor Interleukin-2 (IL-2) wird von Antigen-stimulierten T-Zellen sezerniert und spielt eine wichtige Rolle bei der zellulären Immunantwort. Dabei tragen in aktivierten T-Zellen die MAPK-Signalwege, der Calcineurin/NF-AT-Signalweg und der NF-KB-Signalweg kooperativ zur IL-2-lnduktion bei. In den letzten Jahren wurden mehrere Hinweise gefunden, dass IL-2 möglicherweise bei der HIV- und SIV-Pathogenese eine Rolle spielt. Zwei Publikationen konnten bereits eine verstärkte IL-2-Sekretion HIV-1-infizierter T-Zellen nachweisen, die molekularen Mechanismen dieser IL-2-Induktion sind bisher allerdings kaum untersucht. In der vorliegenden Arbeit konnte gezeigt werden, dass das apathogene simiane Immundefizienzvirus der Afrikanischen Grünen Meerkatze (SIVagm3) in suboptimal stimulierten PBMC ebenfalls die Interleukin-2-Sekretion verstärken kann. In der humanen T-Zelllinie A3.01 wurde nach Transfektion des Volllängenplasmids des SIVagm3 eine bis zu 38-fach verstärkte transkriptionelle Aktivierung des IL-2-Promotors beobachtet. Die Untersuchung der beteiligten Signalwege zeigte, dass die MAP-Kinasen ERK, JNK/SAPK und p38 für die IL-2-Induktion durch SIVagm3 notwendig sind, während die Inhibition der Calcineurin-Aktivität durch das Immunsuppressivum Cyclosporin A keinen Einfluss hatte. In Übereinstimmung mit diesem Ergebnis zeigte die Analyse der Transkriptionsfaktorbindungsstellen des IL-2-Promotors keine Aktivierung der NF-AT-kontrollierten Genexpression durch SIVagm3, womit zum ersten Mal ein Calcineurin/NF-AT-unabhängiger Weg der IL-2-Induktion beschrieben wurde. Dagegen erhöhte SIVagm3 die transkriptionelle Aktivität des NF-KB-responsiven Elements und die Aktivität des CD28/AP-1-responsiven Elements, die auch bei der klassischen T-Zellaktivierung eine Rolle spielen. Eine Aktivierung der CD28/AP-1-kontrollierten Genexpression konnte auch durch Expression des viralen Transaktivator-Proteins Tat induziert werden, das in stimulierten Zellen in der Lage war, die IL-2-Expression zu verstärken. Die Beschränkung dieser Tat-Funktion auf stimulierte Zellen konnte aber nicht auf eine Phosphorylierung von SIVagm3-Tat durch die MAP-Kinasen ERK, JNK/SAPK oder p38 zurückgeführt werden. Weitere Analysen zeigten dagegen, dass SIVagm3-Tat durch die Cyclin-abhängige Proteinkinase 9 (CDK9) phosphoryliert wird, die mit Tat koimmunpräzipitiert. Darüberhinaus konnte eine weitere nicht-identifizierte Tat-assoziierte Kinase nachgewiesen werden, die SIVagm3-Tat ebenfalls phosphorylieren kann. Aktuelle Publikationen zeigen, dass das lentivirale Vif-Protein die Degradation von Apobec3G im Proteasom induziert, da dieser zelluläre Faktor die Infektiosität der entstehenden Viruspartikel stark reduziert. Die antivirale Funktion von Apobec3G, die in der Deaminierung der Minusstrang-DNA während der reversen Transkription besteht, ist bereits weitgehend aufgeklärt, aber über die Regulation von Apobec3G ist noch wenig bekannt. In dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass die Aktivierung der mitogenen Raf/MEK/ERK-Signalkaskade durch den Phorbolester TPA zu einer verstärkten Apobec3G-Expression führt. Dieser Effekt konnte durch den Proteinkinase C (PKC)-Inhibitor Staurosporin und den MEK-Inhibitor U0126 inhibiert werden, wodurch gezeigt wurde, dass die Aktivität der MAP-Kinase ERK für die Verstärkung der Apobec3G-Expression notwendig ist. Eine Phosphorylierung von Apobec3G durch ERK wurde im Kinase-Assay jedoch nicht beobachtet. Dagegen konnte durch radioaktive in-vivo-Markierung nachgewiesen werden, dass es sich bei Apobec3G nicht um ein Phosphoprotein handelt. Neben den Untersuchungen zur Regulation von Apobec3G, konnten neue Erkenntnisse zu den Apobec3G/Vif-Interaktionen gewonnen werden. Durch Koimmunpräzipitationsstudien wurde die physikalische Interaktion von Vif und Apobec3G nachgewiesen. Zudem konnte gezeigt werden, dass in Gegenwart von Vif der Einbau von Apobec3G in die Viruspartikel gehemmt wird. Damit wurden erste Hinweise gefunden, dass Vif neben der Induktion des proteolytischen Abbaus von Apobec3G weitere Strategien anwendet, um die Inkorporation des antiviralen Faktors zu verhindern.
The cytochrome bc1 complex is a cornerstone in bioenergetic electron transfer chains, where it carries out tasks as diverse as respiration, photosynthesis, and nitrogen fixation. This homodimeric multisubunit membrane protein has been studied extensively for several decades and the enzyme mechanism is described with the modified protonmotive Q cycle. Still, the molecular and kinetic description of the catalytic cycle is not complete and questions remain regarding the bifurcation of electron transfer at the quinol oxidation (Qo) site, substrate occupancy, pathways of proton conduction, and the nature of the Rieske protein domain movement. We used competitive inhibitors to study the molecular architecture at the Qo site with X-ray crystallography. The structure of the enzyme with the substrate analog 5-n-heptyl-6-hydroxy-4,7-dioxobenzothiazole (HHDBT) bound at the Qo site was determined at 2.5 Å resolution. Spectroscopic studies showed that HHDBT is negatively charged when bound at the active site. Mechanistic interpretations from inhibitor binding are in line with single occupancy model for quinol oxidation and structural analysis supports the proposed proton transfer pathway. For functional insight into the enzyme mechanism, redox-sensitive protonation changes were studied by Fourier transform infrared spectroscopy. The protein purification procedure was optimized for less delipidation and the isolated enzyme was more active. Furthermore, two new phospholipids were identified in the X-ray structures, including a cardiolipin. Strikingly, conserved lipid binding cavities were observed in structural comparison with homologous enzymes. The functional role of tightly bound phospholipids will be discussed. Finally, the Qo site is a target for various compounds of agricultural and pharmaceutical importance. Importantly, the X-ray structures permit detailed analysis of the molecular reasons for acquired resistance to and treatment failure of Qo site inhibitors, such as atovaquone, that is used to treat malaria and pneumonia, as discussed herein.
The cytochrome bc1 complex or ubiquinol:cytochrome c oxidoreductase (QCR) catalyses electron transfer from ubiquinol to cytochrome c in respiration and photosynthesis coupled to a vectorial proton transport across the membrane, in which the enzyme resides. In both bacteria and eukaryotic organisms, QCR participates in supramolecular assembly of membrane proteins that comprise the respiratory or photosynthetic chain. In the present work, proton transfer pathways, substrate binding and the supramolecular assembly of the respiratory chain in yeast were probed by structure-based site-directed mutagenesis and characterization of the variants. Both active sites centre P, the place of quinol oxidation, and centre N, where quinone reduction takes place, lack direct access to the bulk solvent necessary for proton release and uptake. Based on the X-ray structure, proton transfer pathways were postulated. Analysis at centre P showed, that E272 and Y132 of cytochrome b are important for QCR catalysis as indicated by increased superoxide production and lowered Cyc1p reductase activity in these variants. Pre-steady state heme reduction kinetics in combination with stigmatellin resistance indicated that charge and length of the side chain at position 272 are crucial for efficient docking of the ISP to form the enzyme substrate complex and for electron bifurcation at centre P. Variants of Y312 and F129, both residues of cytochrome b, showed an increased Km indicating participation of these residues in coordination of ubiquinol or the possible intermediate semiquinone anion radical. F129 proved to be crucial for a functional Q-cycle as indicated by respiratory negative growth phenotype and a lowered H+/e- stoichiometry of F129 variants. At centre N, the postulated CL/K and E/R proton transfer pathways are located at opposite sites of the bound ubiquinone. Variants in the surface residues R218 (cytochrome b) and E52 (Qcr7) of the E/R pathway and E82 (Qcr7) of the CL/K pathway showed instability upon purification indicating an important role of these residues for QCR integrity. The slowed down centre N reduction kinetics in H85 (CL/K), R218 and N208 (both E/R) variant was attributed to a destabilised semiquinone anion consistent with the observed decreased sensitivity towards the site-specific inhibitor antimycin and an increased Km. Variants of residues of both pathway, E82Q and R218M, exhibited a decreased H+/e- stoichiometry indicating a crucial role of both residue for maintaining a working Q-cycle and supporting the proposed protonation of the substrate via the Cl/K and the E/R pathway. Long-range interaction between centre N and centre P were observed by altered reduction kinetics of the high potential chain and increased superoxide production in the centre N variants. The role of the cation-pi-interaction between F230 of Cyt1p and R19 of cytochrome c in binding of the redox carrier to QCR was analysed. In F230L hydrophobic interaction were partially lost as was deduced from the ionic strength dependence of Cyc1p reductase activity and Cycp1 binding, as detected by ionic strength sensitive Kd and Km for Cyc1p. The decreased enzymatic rate of F230W could be explained by a disturbed binding of Cyc1p to the variant enzyme. F230 may influence the heme mid point potential and thereby the electron transfer rate to Cyc1p. Reduction of Cobp via both centre P and centre N was disturbed suggesting an interaction between high and low potential chain. Supramolecular association between QCR and cytochrome c oxidase (COX) in yeast mitochondria was probed by affinity chromatography of a his-tagged QCR in the presence of the mild detergent digitonin. In comparison to purification with laurylmaltoside, the presence of both QCR and COX subunits was detected in the elution fractions by SDS-PAGE, Cyc1p reductase and TMPD oxidase activity assays and immunoblot analysis. The CL-dependent formation of the supercomplex between QCR and COX was analysed by replacement variants in the CL-binding site of QCR in CL containing and CL free environment. With an increasing number of replacements of the three lysines the CL-binding pocket supercomplex formation was not abolished, when CL is present as shown by BN-PAGE analysis. This was supported by the synergetic decrease in enzyme activity for both enzymes upon increased number of replacements. In the CL-free environment, no supracomplex formation was observed for a wildtype CL binding site. By replacements of two lysines in the CL-binding pocket, supercomplex formation could be recovered as revealed by BN-PAGE. This indicates, that CL may serve as a charge neutralizer for the lysines near the presumed interaction domain between complex III and complex IV. The obtained results for centre P provide new information of residues critical for stabilisation of ubiquinol and controlling electron short circuit reactions. The observations for centre N variants clearly support the proposed two proton transfer pathways and the role of the bound phospholipids in centre N kinetics. Variants in the Cyc1p binding site suggest a role for F230 both in Cyc1p binding and electron transfer. Clear interaction between the high and low potential chain in both Cyt1p and centre N variants strongly support long-range interactions in the complex. Studies on the supramolecular association of complex III and complex IV indicate a new role of Cl in stabilising a supracomplex.
Im Laufe der letzten Jahre hat sich die Aufmerksamkeit auf die Entwicklung von neuen RNA-bindenden Molekülen gerichtet. Grund dafür waren neue Erkenntnisse über die strukturelle und funktionelle Komplexität der RNA. So spielen spezifische RNA-Protein-Wechselwirkungen eine essentielle Rolle bei regulatorischen Prozessen. Die Spezifität dieser Interaktionen wird durch die dreidimensionale RNA-Struktur bestimmt. Somit bieten diese Wechselwirkungen ein attraktives Angriffsziel für die Suche nach niedermolekularen Substanzen, die in die regulatorischen Prozesse pathogener Organismen eingreifen. So gibt es im Replikationszyklus des HI-Virus mehrere essentielle Schritte, die der Interaktion zwischen charakteristischen, viralen RNA-Strukturen und der viralen Proteine bedürfen. Ein prominentes Beispiel ist die Verpackung der viralen RNA. Es handelt sich um einen hochspezifischen Prozess, bei dem aus einer Vielzahl von zellulären, viralen, gespleißten und ungespleißten RNA-Fragmenten, spezifisch die virale genomische RNA in die neu entstehende Partikel verpackt wird. Die Spezifität der Verpackung basiert auf der Erkennung der dreidimensionalen ps-Verpackungsstruktur am 5´-Ende der ungespleißten, viralen RNA durch die NCp7-Domäne des p55Gag- Vorläuferproteins. Die NCp7-Domäne ist durch zwei Zinkfingermotive, die in allen Onko- und Lentiviren mit Ausnahme der Spumaviren konserviert sind, gekennzeichnet. Durch die zentrale Rolle im HIV-1 Replikationszyklus bietet die ps-NCp7-Interaktion ein potentielles Angriffziel für antivirale Interventionen. Das langfristige Ziel des Projektes war die Identifizierung von Peptidliganden für das HIV-1 ps-Signal mittels der Phage-Display-Methode, welche die Basis für die Entwicklung antiviraler Moleküle liefern sollen. Die Methode des Phage-Display basiert auf der Affinitätsselektion von Peptiden, die als Fusionsproteine mit dem Hüllprotein an der Oberfläche eines Bakteriophagen exprimiert werden. Sie wurde sehr erfolgreich für die Selektion von Peptidliganden für Antikörper oder andere Proteindomänen eingesetzt. Für RNA-Targets gibt es nur gelegentliche Hinweise. Im Vordergrund des Projektes standen strukturelle Erkennungsmerkmale der Ligand-RNAWechselwirkung. Zur Identifizierung von Peptidliganden für das ps-Verpackungssignal sowie deren Teilelement SL3, das ebenfalls Verpackungsaktivitäten aufweist, wurden kommerzielle Phagen-Banken mit zufälliger Aminosäuresequenz eingesetzt. Im Rahmen des ersten Teilabschnitts konnten Phagen selektiert werden, die spezifisch an die Targetstrukturen gebunden haben und die Grundlage für die Ableitung von Peptidmotiven bildeten. Insgesamt konnten neun Motive abgeleitet werden, darunter das tryptophanreiche HXWPWW-Motiv, das Aminosäurehomologien zum nativen Liganden, dem NCp7-Protein, zeigte. Die Spezifität zur Ziel-RNA wurde mittels ELISA, CD-Spektroskopie und Peptidfilter-Bindungsstudien analysiert. Für die tryptophanreichen Peptide wurde die Affinität zur ps- und SL3-RNA ermittelt. Sie lag für das HWWPWWPeptid bei ca. 25 ± 2µM zur ps-RNA und bei ca. 34 ± 2µM zur SL3, also deutlich unter der Affinität des NCp7 (ca. 30nM). Entsprechend ließ sich das HWWPWW-Peptid in einem Kompetitions-ELISA mit ps-RNA als Target durch das native p55Gag- und NCp7-Protein, jedoch nicht durch ein unrelevantes RNA-bindendes Protein, verdrängen. Anschließend wurden mittels der CDspektroskopischen Mutationsanalyse die Bindungseigenschaften der Peptide optimiert, so dass zwei weitere Liganden, das HWWAWW- und HAWPWWPeptid, als potentielle ps-Liganden ermittelt werden konnten. Im zweiten Teil der Arbeit erfolgte die funktionelle Analyse der identifizierten Peptide hinsichtlich ihrer inhibitorischen Eigenschaften. Dazu wurden in HR´YFP-Zellen Pseudoviren, die das verpackbare Konstrukt ps-Yfp, sowie HIV-1 Gag-Pol und das Env des VSV-G enthielten, in Gegenwart des ps-bindenden Peptides, das als Rfp-Vpr-Fusionprotein vorlag, generiert. Eine Hemmung der Peptide auf die Verpackung der viralen RNA sollte dadurch messbar sein, dass die produzierten Pseudoviren weniger von der verpackbaren ps-Yfp-RNA enthielten als die Kontrollviren, die in Gegenwart eines Kontrollpeptids generiert wurden. Die Menge der Virus-RNA in den Partikeln wurde mittels einer quantitativen PCR-Methode, der Real-time-PCR, bestimmt. Einen hemmenden Einfluss auf die Verpackung der ps-Yfp-RNA und somit eine Inhibition der ps-NCp7-Interaktion hatte das HWWAWW-Peptid. Durch den Einsatz von 3 µg der HWWAWW-Rfp-Vpr-Vektors konnte die RNA-Menge um das fast 4000-fache im Vergleich zum Kontrollansatz reduziert werden.
Bei der in vitro Rückfaltung von entfaltetem, reduziertem Hirudin entstehen neben dem nativen Protein hauptsächlich zwei nicht-nativ gefaltete Konformere. Das Verhältnis von nativem und nicht-nativem Konformer lässt sich während der Rückfaltung durch verschiedene Parameter beeinflussen. Thiole wie reduziertes Glutathion (GSH), N-Acetylcystein (NAC) und Dithioerytritol (DTE) beeinflussten die in dieser Arbeit untersuchten Rückfaltungen auf verschiedene Weise. Während beim Zusatz von GSH sehr verstärkt die Bildung des nativen Konformers auftrat, wurde bei einem Zusatz von NAC und DTE einerseits ein leicht verbessertes Verhältnis von nativem zu nicht-nativem Konformer festgestellt, andererseits wurde aber eine stark vermehrte Oligomerbildung beobachtet. Die aufgestellte Theorie der Oligomerbildung konnte anhand graphischer Auswertung der zusätzlich auftretenden, im Nativgel höher laufenden Banden bestätigt werden. Bei Zusatz von GSH und GSSG (oxid. Glutathion) als Redoxpuffer im Molekülverhältnis 2:1 (10 mM) wurde bei 4°C eine vollständige Rückfaltung zum nativen Hirudin erreicht. Der Zusatz von 1 mM GSH bewirkte dagegen bei 28°C (höchste gewählte Temperatur) ebenfalls eine vollständige Rückfaltung zum nativen Hirudin-Konformer. Die Temperaturabhängigkeit der Rückfaltung zeigte sich auch in weiteren Untersuchungen. So ergaben die Rückfaltungen unter Zusatz von 1 mM DTE, NAC und 10 mM GSH bei 4°C eine wesentlich höhere Ausbeute an nativ gefaltetem Hirudin als bei höheren Temperaturen. Der pH-Wert im Bereich von 4,0 bis 8,0 veränderte das Rückfaltungsmuster von Hirudin in den durchgeführten Untersuchungen nicht, obwohl Literaturdaten auf ein pH-Optimum von 8-9 für erfolgreiche Rückfaltungen hindeuten. Nativ und nicht-nativ gefaltetes Hirudin sowie die ebenfalls während der Rückfaltung entstandenen Oligomere ließen sich HPLC-chromatographisch trennen. Die in den Nativgelen auftretende, sehr übereinanderliegende Doppelbande des nicht-nativen Hirudins konnte per HPLC in zwei verschiedenen Konformere getrennt werden. Eine positive Beeinflussung der in vitro-Rückfaltung von Hirudin durch einen Zusatz der Oxidoreduktase Thioredoxin konnte eindeutig nachgewiesen werden. Bei einem äquivalenten Gehalt an Tioredoxin wurde die Rückfaltung zum nativen Konformer eindeutig begünstigt. Ein katalytischer Gehalt an Thioredoxin (Thioredoxin:Hirudin im Verhältnis 1:10) bewirkte die Rückfaltung ausschließlich zu nativem Hirudin. Auch bei einem Zwanzigstel Äquivalent Thioredoxin war noch eine positive Beeinflussung feststellbar. Bei einer S. lividans-Expression von Hirudin über ein pAX5a-Derivat wurde fast ausschließlich nicht-nativ gefaltetes Hirudin produziert. Die nicht-native Faltung war in einem Nativgel deutlich von der nativen, aktiven Form des Inhibitors zu unterscheiden. Durch Zusätze von reduziertem (GSH) und oxidiertem Glutathion (GSSG) zum Wachstumsmedium konnte der Anteil an nativem Hirudin erhöht werden. Die Zusätze beeinflussten aber stark die Gesamtausbeute des sekretierten Proteins. So wurden unter Zugabe von 1 mM GSH Ausbeuten von 200 mg/L Hirudin erreicht, davon 2 mg/L natives Protein. Die Gegenwart von verschiedenen Verhältnissen von GSH und GSSG (Gesamtkonzentration 1mM Thiol) reduzierte die Hirudinproduktion auf 20 – 32 mg/L, darunter war kein erkennbarer Anteil an nativem Hirudin. Ein Zusatz von gleichen Verhältnissen von GSH und GSSG in höherer Konzentration (10 mM) resultierte in einer Steigerung des Anteils an nativem Inhibitor auf 14 %, die Gesamtausbeute an Hirudin sinkt aber deutlich (15 mg/L insgesamt, 2 mg/L natives Protein). Die Oxidoreduktase Thioredoxin wurde ebenfalls über ein pAX5a-Derivat in S. lividans-Kultivierungen mit einer Ausbeute von 65 mg/L gewonnen. Eine Coexpression von Thioredoxin und Hirudin über ein bicistronisches Gen in einem pAX5a-Derivat resultierte in einer Proteinproduktion von 4 mg/L Thioredoxin und 20 mg/L Hirudin. Obwohl ein Verhältnis von 0,2:1 Moläquivalenten (Thioredoxin:Hirudin) in den in vitro-Rückfaltungen zu 100 % nativ gefaltetem Inhibitor führte, war in den Kultivierungen kein positiver Einfluß des Thioredoxins auf die Hirudinfaltung erkennbar. Die Expression von Thioredoxin setzte zeitlich sehr viel früher als die Hirudin-Expression. Die Produktion von Hirudin über einen integrativen Vektor erzielte 600 - 700 mg/L Protein. Wie in anderen Hirudinkultivierungen ohne Thiolzusatz wurde Hirudin ausschließlich in der inaktiven, nicht-nativen Struktur produziert. Kultivierungen der mit dem integrativen Thioredoxin-Vektor infizierten S. lividans-Zellen erzielten dagegen kein Protein. Die Coexpression von Hirudin und Thioredoxin scheiterte an dem nicht zu generierenden, bicistronischen integrativen Vektor. Um die Isomeraseaktivität des Thioredoxins zu erhöhen und somit eine größere Beeinflussung der Hirudinfaltung zu erzielen, wurden Thioredoxinmutanten hergestellt. Die redoxaktiven CXXC-Zentren der generierten Thioredoxine enthalten die Aminosäuresequenzen der CXXC-Motive von E. coli DsbA und DsbC und humanem PDI. Die Expression aller Mutanten gelang in zwei verschiedenen Medien. Eine Isolierung und Anwendung der gereinigten Mutanten in der Hirudinfaltung wurde im Rahmen dieser Arbeit nicht mehr durchgeführt. Die Konstrukte stehen für weitere Arbeiten zur Verfügung. In vergleichenden Expressionen mit fünf verschiedenen Signalsequenzen wurden sowohl das homologe Streptomyces-Protein Tendamistat als auch das heterologe Hirudin über jeweils alle Signalpeptide exprimiert. Tendamistat wurde schon zu Beginn der exponentiellen Wachstumsphase exprimiert Innerhalb der verschiedenen Kultivierungen wurden unterschiedlich hohe Expressionswerte erreicht. Eine ausgeprägte Anreicherung von Vorläufer-Proteinen in der Zelle fand nicht statt. Neben dem vorwiegend nativ prozessierten Tendamiastat zeigte eine Analyse der Massendaten eine teilweise falsche Prozessierung der AxeA-, CelB- und SnpA-Signalpeptide. Hirudin konnte ebenfalls über alle fünf Signalpeptide exprimiert werden. Dabei wurde fast quantitativ nicht-nativ gefaltetes Hirudin sekretiert. Die Höhe der Expression über die verschiedenen Signalpeptiden war unterschiedlich hoch, wobei die Unterschiede geringer als bei der Tendamistat-Expression waren. Die Massenanalytik belegte, dass die Prozessierung des heterologen Hirudins wesentlich uneinheitlicher erfolgte als die Prozessierung des homologen Tendamistats. Ein Zusammenhang zwischen der Expressionshöhe beider Proteine und verschiedener Strukturmerkmale der Signalpeptide konnte nicht festgestellt werden. So wurde die in der Literatur aufgestellte These, dass in der n-Domäne mindestens zwei Ladungen enthalten sein müssen, in dieser Arbeit nicht bestätigt. Weder die Struktur noch die unterschiedliche Ladung der n-Domäne der Signalpeptide zeigten einen eindeutigen Zusammenhang mit der Expressionshöhe der Proteine. Auch eine Verknüpfung zwischen der Länge der h-Domäne und der Expressionshöhe konnte weder für die Tendamistat- noch für die Hirudinexpression erstellt werden. Die Positionierung von Glutamin an Position –2 innerhalb der c-Domäne schien in der Tendamistatexpression bezüglich der Proteinausbeute von Vorteil zu sein. Bei der Expression von Hirudin wurde ein ähnlicher Trend nicht gefunden. Die Proteinproduktion über ein Signalpeptid mit enthaltenem TTALeu-Codon war entgegen Literaturaussagen möglich und verminderte - wie in der Hirudinexpression gezeigt - nicht automatisch die Expressionshöhe. Bei den Tendamistatkultivierungen wurde dieser Einfluss jedoch deutlich. Theoretische Betrachtungen zur Prozessierung anhand von Rechenmodellen waren hilfreich, um Beobachtungen zu erklären oder zu deuten. So wurde eine Erklärung der zusätzlichen falschen Prozessierung der Sigalpeptide vom homologen und auch vom heterologen Protein über theoretische Modelle wie z. B. eine Schnittstellenberechnung teilweise möglich. Die Überlegungen zum Transmembran-Bereich der Signalpeptide zeigen im Vergleich der Berechnungen für Tendamisitat und Hirudin, dass die Ladung des N-Terminus des anhängenden Proteins ein Rolle bei die Positionierung des Signalpaptids innerhalb der Membran spielt und somit auch für die Präsentation der Schnittstelle und eine erfolgreiche Prozessierung verantwortlich ist. Die bisher verfügbaren Literaturdaten lassen darauf schließen, dass es allgemeine Richtlinien in Bezug auf Aminosäurezusammensetzung, sowie Ladung und Länge der Signalpeptide gibt, deren Mißachtung eine Verringerung der Expressionshöhe von Proteinen bewirken. Diese Richtlinien scheinen aber hauptsächlich bei einzeln eingefügten Mutationen zu bestehen. Werden, wie in dieser Arbeit vorgestellt, ganze Signalpeptide ausgetauscht und die resultierende Expression beobachtet, können viele dieser Vorgaben nicht verifiziert werden oder stimmen nur in Einzelfällen überein. Trotzdem zeigt diese Arbeit, dass theoretische Betrachtungen für Vorhersagen zur Proteinexpression unabdingbar sind.
Die Reinigung von Siliciumoberflächen verbraucht große Mengen von hochreinen und teueren Chemikalien. Komplexbildner dienen der Maskierung von Metallionen in den Reinigungschemikalien mit dem Ziel, die vorhandenen Reinigungsverfahren zu vereinfachen, den Reinigungsvorgang zu beschleunigen und Chemikalien und Kosten zu sparen. Zur Beurteilung, ob ein Komplexbildner für diese Anwendung geeignet ist, bedarf es eines analytischen Verfahrens zur Bestimmung seiner Stabilität in Halbleitersilicium-Reinigungsbädern. In der vorliegenden Arbeit sollte untersucht werden ob die HPLC für diese Aufgabe eingesetzt werden kann. Zusätzlich sollte versucht werden, über die Detektion und die Identifizierung von Zersetzungsprodukten Informationen über die Zersetzungsreaktion zu gewinnen. Es wurden Untersuchungen zur Komplexbildnerstabilität in verschiedenen Reinigungsbädern und in 30% H2O2 durchgeführt. Vier strukturell unterschiedliche Komplexbildner wurden untersucht. Pyrinan (N, N´, N´´-Tris (3-hydroxy-6-methyl-2-pyridylmethyl) 1, 4, 7-Triazacyclononan), ABS-BAMTPH (N,N’,N’’-tris [2-(N-hydroxycarbamoyl) propyl]-1,3,5-benzentricarboxamid), Tiron (Dinatrium-1,2-Dihydroxybenzen-3,5-Disulfonsäure) und die Pyridinone (3-Hydroxy-4(1H)-pyridinone). Bei den Pyridinonen handelte es sich um eine Gruppe von Komplexbildnern mit dem gleichen Grundgerüst, welches mit unterschiedlichen Substituenten verbunden war. Das Verhalten der Pyridinone in 30% H2O2 zeigt, dass es möglich ist mit relativ geringen Modifikationen der Molekülstruktur die Stabilität dieser Komplexbildner gegen Zersetzung zu steigern. Die auftretenden Zersetzungsprodukte wurden mit HPLC-MS untersucht. Die Beobachtung, dass in 30% H2O2 und in dem Reinigungsbad APM (H2O2/NH3/H2O-Gemisch) jeweils identische Zersetzungsprodukte auftraten deutet darauf hin, dass in beiden Fällen eine Oxidation durch H2O2 stattfindet. Die in 30% H2O2 beständigsten Komplexbildner waren ESEHP (Sulfoniumsubstituent) und BMHP (Alkylsubstituent). In APM war ECEHP am stabilsten (Carboxylsubstituent). Tiron wurde nur in 30% H2O2 untersucht. Seine Stabilität wird in dieser Lösung nur von 2 der 13 untersuchten Pyridinone, ESEHP und BMHP, übertroffen. Es wurden keine Zersetzungsprodukte detektiert. ABS-BAMTPH hingegen wurde nur in APM untersucht. In APM erwies sich ABS-BAMTPH als der am wenigsten stabile von allen untersuchten Komplexbildnern. Die Brauchbarkeit von ABS-BAMTPH wurde zusätzlich durch einen hohen Anteil an Nebenprodukten eingeschränkt, die bei der Synthese des Komplexbildners entstanden waren. Die Nebenprodukte konnten mittels HPLC-MS und Kenntnis des Syntheseweges identifiziert werden. Über die Zersetzungsreaktion(en) des Pyrinan konnte mit Hilfe von HPLC-MS und MS/MS eine Reihe von Informationen gewonnen werden. Eine Abfolge von Reaktionen wird zur Erklärung der beobachteten Zersetzung vorgeschlagen. Alle Reaktionen laufen an den 3 tertiären Amin-Stickstoffatomen des Pyrinans ab. Diese stellen den Schwachpunkt der Pyrinanstruktur dar. Die Bildung von Aminoxiden leitet die Zersetzung ein. Die Aminoxide reagieren über eine Meisenheimer-Umlagerung weiter. Eine komplexierende Wirkung der Zersetzungsprodukte kann aufgrund der beobachteten Stabilisierung des H2O2 gegen die durch Übergangsmetallionen katalysierte Disproportionierung angenommen werden. Die vorliegende Arbeit zeigt, das die HPLC zur Untersuchung der Stabilität von Komplexbildnern in Halbleiter-Reinigungschemikalien geeignet ist. Die HPLC-MS und die MS/MS lieferten zusätzliche Informationen über Zersetzungsprodukte und die stattfindenden Zersetzungsreaktionen. Die HPLC-MS ist darin den bisher in der Halbleiterindustrie für diese Fragestellung benutzten analytischen Methoden überlegen.
Proton-translocating NADH:ubiquinone oxidoreductase (complex I) transports two electrons from NADH to membranal ubiquinone: in this process protons are translocated across the membrane, producing 40% of the total proton gradient between matrix side and intermembrane space. Mitochondrial complex I contains at least 46 subunits in mammals, and has a molecular weight of around 1000 kDa. Electronic microscopy analysis showed that complex I has an L-form, which consists of two domains: a peripheral “arm” (hydrophilic domain) and a membrane “arm” (hydrophobic domain). The peripheral domain, which protrudes into the matrix, contains one non-covalently bound flavin mononucleotide (FMN) and the iron-sulfur clusters N1a, N1b, N2, N3, N4 and N5 as redox active groups. They transport electrons from NADH to ubiquinone. Cluster N2 is supposed to be the immediate electron donor to ubiquinone by virtue of its highest and pH dependent redox midpoint potential (Em,7 –150 mV). The exact location of the tetra-nuclear cluster N2 is still object of discussion. The TYKY and the PSST subunits contain three binding motifs for tetranuclear clusters which are formed by twelve cysteins. In an effort to investigate the “ubiquinone reduction module” of complex I, in the first part of this work site directed mutagenesis of the TYKY and PSST subunits has been carried out. Mutant strains were characterised in terms of complex I content, catalytic activity and EPR signature of cluster N2. The second part of this work was aimed at developing a substrate inducible version of the internal alternative NADH:ubiquinone oxidoreductase (NDH2i). A substrate inducible NDH2i is expected to offer a “switch” between complex I activity dependent (no NDH2i activity) and independent (NDH2i activity) cell growth, by changing between activating and non-activating substrates. This strategy would allow the screening for two types of complex I mutants, which is a prerequisite for realising a random PCR mutagenesis of single subunits of complex I, that allows the production of a high number of point mutations in relatively short time. Y. lipolytica complex I deficiency mutant strains could be easily identified, by virtue of their inability to survive under complex I dependent growth conditions (no NDH2i activity). By this way, amino acids that have an important role for complex I structure or function could be identified by subsequent sequence analysis. Each of the twelve cysteines that form the above mentioned three binding motifs for iron-sulfur cluster have been mutagenised. In mutant mitochondrial membranes, no assembled complex I could be detected. From these data one may conclude that the mutagenised 6 SUMMARY 92 cysteines play an important role for complex I stability, or that are a prerequisite for complex I assembly in Y. lipolytica, but there is not direct evidence indicating that any of the four mutagenised residues acts as a ligand. Two aspartates in the PSST subunit, Asp-99 and Asp-115, were found to be essential for complex I catalytic activity. EPR spectroscopic analysis indicated that the electron transfer to N2 cluster was not blocked and implied that this was not the reason for the loss of catalytic activity. From these data it can be concluded that D99 and D115 play a vital role for complex I NADH:ubiquinone reductase activity, but are not ligands for cluster N2 and that their position is not close enough to the cluster to influence directly its electromagnetic environment. Three mutations, identified in the PSST and TYKY homologous subunits of patients affected with Leigh syndrome (V119M in PSST, P78L and R101H in TYKY) were reconstructed in the obligate aerobic yeast Y. lipolytica. This approach may help to understand the aetiology of the Leigh syndrome, in terms of the ability of complex I to oxidize NADH and to transport electrons. In fact, all three mutations showed effects on electron transport, reducing the VMax by about 50%. Mutant V119M in the PSST subunit, which had a lethal effect in two patients that were homozygous for this mutation, affects a fully conserved residue. Overall, the results from site directed mutagenesis carried out so far support the theory that the “catalytic core ” (N2 cluster and quinone binding site) of complex I has been evolved from the electron transfer module of the [Ni-Fe] hydrogenases. In fact, mutagenesis of residues that are fully conserved between complex I and [Ni-Fe] hydrogenases, showed dramatic effects on complex I in terms of assembly (cysteine mutants) or catalytic activity (D99-D115). Differently, changing aspartate 174 and glutamic acid 185 (not fully conserved, Fig 4.1A) had little or no effect on the Michaelis-Menten parameters and N2 EPR signal. In recent years Y. lipolytica has been developed as a yeast genetic system to study mitochondrial complex I. The present work introduced the promoter for the isocitrate lyase (pICL1) as a useful tool for the substrate selective expression of the internal version of the alternative NADH:ubiquinone oxidoreductase (pICL1-NDH2i). This allows to rescue complex I deficiencies “in vivo” selectively by growth on acetate (or ethanol) medium. The integration of the pICL1-NDH2i construct into the genome of Y. lipolytica and subsequent deletion of nuclear-coded subunits like PSST, TYKY and 49 kDa, would contribute to further develop this organism as a useful genetic model for studying subunits of mitochondrial complex I by site directed mutagenesis.
Charakterisierung der alternativen NADH-Ubichinon-Oxidoreduktase (NDH2) aus Yarrowia lipolytica
(2004)
Neben dem protonenpumpenden Komplex I (NDH-1) der Atmungskette besitzt die obligat aerobe Hefe Yarrowia lipolytica eine alternative NADH:Ubichinon Oxidoreduktase (NDH-2). Diese Enzyme, die in den Atmungsketten von Pflanzen, Pilzen und Bakterien vorkommen, bestehen aus nur einer Untereinheit, führen jedoch dieselbe Reaktion aus wie Komplex I, nämlich die Elektronenübertragung von NADH auf Ubichinon, wobei allerdings keine Protonen über die Membran transloziert werden. Nur peripher mit der Membran assoziiert, können alternative Dehydrogenasen entweder zur cytosolischen Seite (extern) oder zur Matrixseite (intern) orientiert sein. Y. lipolytica besitzt im Gegensatz zu anderen Ascomyceten nur eine einzige extern orientierte alternative Dehydrogenase mit einer vorhergesagten Masse von ca. 60 kD und einem nicht kovalent gebundenem Molekül FAD als Cofaktor. Durch Fusion des Leserasters mit der Präsequenz der 75 kD Untereinheit von Komplex I war die interne Expression des Enzyms (NDH2i) gelungen, die das Überleben von Komplex I Deletionsmutanten ermöglichte. Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurde die alternative Dehydrogenase von Y. lipolytica innerhalb ihrer natürlichen Membranumgebung charakterisiert. Das Enzym reagierte mit verschiedenen Chinonanaloga, wobei mit dem hydrophilen Q1 eine höhere katalytische Rate erzielt wurde als mit DBQ, das dem natürlich vorkommenden Q9 am ähnlichsten ist. Da hydrophobe Substrate fast ausschließlich in der Lipidphase der Membranen gelöst vorliegen, musste bei der Bestimmung von kinetischen Parametern (ebenso wie bei Komplex I) auf eine gleichbleibend große Membranphase im Messvolumen geachtet werden. Mit dem standardmäßig benutzten Substrat DBQ reagierte YLNDH2 nach einem Ping-Pong Reaktionsmechanismus. Dieser beschreibt eine abwechselnde Bindung der beiden Substrate, wobei das Enzym die Elektronen von NADH aufnimmt (E-FADH2) und an Ubichinon weitergibt (E-FAD); es existiert kein ternärer Enzym-Substrat Komplex. Gestützt durch Kristallstrukturen des analogen Enzyms QR1 mit NADPH bzw. mit Durochinon, liegt die Vermutung nahe, dass beide Substrate in ähnlicher Weise und sehr wahrscheinlich in der gleichen Bindungstasche binden. Ein Ping-Pong Reaktionsmechanismus wurde bereits für die NADH:DCPIP Oxidoreduktase Aktivität von zwei weiteren alternativen Enzymen postuliert, jedoch noch nie für ein physiologisches Substrat. Als bislang wirksamster Inhibitor für alternative Dehydrogenasen wurde 1-hydroxy-2-dodecyl-4(1H)chinolon (HDQ) entdeckt. HDQ hemmte NDH2 in Membranen aus Y. lipolytica mit einer I50 von 200 nM, was der 500fachen Hemmwirkung des gängig verwendeten Flavon auf das isolierte Enzym NDI1 von S. cerevisiae entspricht. Allerdings hemmte HDQ auch Komplex I mit einer I50 von 2 µM, ähnlich wie es bei Platanetin in Pflanzenmitochondrien der Fall war [Roberts et al., 1996]. Mit dem Ziel, ein polyklonales Antiserum gegen die native YLNDH2 zu generieren, wurde das Enzym in E. coli heterolog exprimiert. Die Expression führte zur Bildung von Einschlusskörpern, aus denen das rekombinante Enzym unter denaturierenden Bedingungen gereinigt und zur Immunisierung eines Kaninchens verwendet werden konnte. Das Antiserum kreuzreagierte mit der nativen und der internen Version von YLNDH2 und zeigte nur wenige unspezifische Bindungen. Es wurde gezeigt, dass Y. lipolytica Stämme ohne NDH2 und Komplex I mit NDH2i als einziger Dehydrogenase erzeugt werden konnten. In N. crassa war der Versuch, NDE2 und Komplex I gleichzeitig zu deletieren, gescheitert, was zu der Schlussfolgerung führte, dass sich die beiden Enzyme in diesem Organismus möglicherweise kompensieren könnten. Dies war in Y. lipolytica ausgeschlossen worden, da wahrscheinlich kein (oder nur unzureichender) Austausch zwischen matrixständigem und cytosolischem NADH stattfindet. Die zielgerichtete Mutagenese hochkonservierter Bereiche im offenen Leserahmen von YLNDH2 lieferte das eindeutige Ergebnis, dass die zweite der beiden beta-alpha-beta-Bindungsdomänen NADH binden muß, da sich der KM Wert für NADH bei Mutation des essentiellen sauren Restes E320 dratisch erhöhte. Alle Mutationen, die die Dinukleotid Bindungsdomäne I betrafen, die danach folgerichtig den Cofaktor FAD binden muß, führten zu einem vollständigen Verlust von NDH2. Dieselbe Zuordnung der Bindungsstellen war bereits von Björklöf et al. [2000] vorgeschlagen worden. Eine Chinonbindungstelle konnte durch Mutagenese der beiden apolar/aromatischen Bereiche der Sequenz nicht identifiziert werden. Die Modifikation des C-Terminus von NDH2i führte zu nicht mehr messbarer Aktivität und stark verringerter Expression des Enzyms in mitochondrialen Membranen (siehe Anhang 7.5.1.1). Es kann daher vermutet werden, dass der C-Terminus für die korrekte Faltung eine wichtige Rolle spielt, möglicherweise sogar bei der Membranassoziation, wie bei Rasmusson [1999] vorgeschlagen wurde. Interessant war in diesem Zusammenhang, dass die C-terminal modifizierte NDH2i trotzdem das Überleben von Komplex I Deletionsmutanten bzw. das Wachstum auf DQA ermöglichte. In Membranen, die einen unterschiedlichen Gehalt an NDH2, jedoch die gleiche Gesamtmenge an Protein enthielten, wurde eine unerwartete lineare Abhängigkeit zwischen KM und Vmax Werten beobachtet. Dieses Phänomen wurde mit dem Modell der externen Diffusionslimitierung beschrieben, die in ähnlicher Weise auch bei immobilisierten Enzymen auftritt. Danach wird die Geschwindigkeit der enzymatischen Reaktion von YLNDH2 sowohl durch die kinetisch kontrollierte Rate, als auch durch die Transportrate des Ubichinons bestimmt, das aus der Membran heraus in die wässrige Umgebung des katalytischen Zentrums gelangen muss. Aus diesem Grund ist nicht nur die Maximalgeschwindigkeit, sondern auch die Michaelis Menten Konstante KM abhängig vom Gehalt des Enzyms in Membranen. Dies führte bei niedrig exprimierten mutanten Enzymen zur gleichzeitigen Abnahme von KM und Vmax. Eine externe Diffusionskontrolle der enzymatischen Reaktion wurde auch für Komplex I, dessen Reaktionszentrum im peripheren Arm vermutet werden kann, aber nicht für Komplex III aus S. cerevisiae, dessen Chinonbindungsstellen sich definitiv in hydrophober Umgebung befinden, beobachtet.
Wasserstoffbrücken als strukturbildendes Element : Synthese und Berechnung supramolekularer Komplexe
(2004)
Die nicht-kovalente Synthese sowie die Berechnung der supramolekularen Komplexe wurden anhand dreier unterschiedlicher Stoffklassen demonstriert. Ziel war es, supramolekulare Dimere zu kristallisieren, die durch zwei Wasserstoffbrücken zusammengehalten werden. Die zuerst untersuchten Indol-Derivate waren potentiell selbstkomplementär. Während der Donor im starren Indol-Ring lag, befand sich der Akzeptor in der Seitenkette, was zu konformationell flexiblen Verbindungen führte. Durch Variation des Abstandes von Donor und Akzeptor, was einer Verlängerung der Seitenkette durch zusätzliche CH2-Gruppen entsprach, sollte herausgefunden werden, bei welcher geometrischen Anordnung dimere Komplexe entstehen Die Ergebnisse zeigten, daß die gewünschten Dimere erst bei einer Kettenlänge von drei CH2-Gruppen um Kristall zu beobachten waren. Diese konformationell flexiblen Verbindungen wiesen somit große Unterschiede zwischen berechneter und realer Komplexgeometrie auf, die darauf zurückzuführen sind, daß im Kristall eine Vielzahl von Molekülen wechselwirken, während in der Rechnung mit dem Kraftfeldprogramm MOMO nur zwei Moleküle berücksichtigt werden. Somit führt die „Sandwich“-Form zu einer günstigeren van-der-Waals-Energie als die planare Form. Im zweiten Abschnitt dieser Arbeit konzentrierten sich unsere Untersuchungen auf die Substanzklasse der Acetylhydrazone, welche ebenfalls potentiell selbstkomplementäre Verbindungen darstellen. Im Gegensatz zu den Indol-Derivaten wurde hier der Abstand zwischen Donor und Akzeptor konstant gehalten, um zu untersuchen, wie sich unterschiedliche Reste der Acetylhydrazone auf die Konformation der Moleküle und somit auch auf die Komplexgeometrie auswirken. Zu diesem Zweck wurde eine Reihe von Verbindungen mit Resten unterschiedlicher sterischer Hinderung synthetisiert. Ziel war es auch in dieser Verbindungsklasse gezielt Dimere mit zwei Wasserstoffbrücken zu kristallisieren. Eine Suche in der CSD zeigte schnell, daß Acetylhydrazone zwei Vorzugskonformationen besitzen: eine, in der Donor und Akzeptor eine anti-Anordnung besitzen, was in der Regel zu kettenförmigen Wasserstoffbrücken führt, und eine syn-Anordnung, die zu den gewünschten Dimeren führen sollte. Es galt nun zu untersuchen, welche dieser Reste zur syn-Konformation führt und welches die Vorzugskonformation der Acetylhydrazone ist. Die Untersuchungen zeigten, daß zwei sterisch anspruchsvolle Reste zur syn-Anordnung von Donor und Akzeptor führen und somit zu Dimeren im Kristall. Verbindungen mit zwei sterisch wenig anspruchsvollen Resten lagen hingegen in der anti-Konformation vor und bildeten wie erwartet Polymere. Für die Acetylhydrazone konnte folgende These aufgestellt werden: Die syn-Konformation entsteht, wenn beide Reste drei oder mehr (Kohlenstoff-) Atome besitzen, anderenfalls entsteht die anti-Anordnung. Die Rechnungen lieferten, bis auf eine Ausnahme, supramolekulare Dimere mit zwei Wasserstoffbrücken. Für jene Verbindungen, die ebenfalls in der syn-Konformation in Dimeren kristallisieren, ist die Übereinstimmung zwischen der berechneten und der realen Komplexgeometrie sehr gut. Im letzten Kapitel dieser Arbeit sollten heteromolekulare Komplexe, also solche, die aus zwei unterschiedlichen Molekülen bestehen, untersucht werden. Die erste der eingesetzten Verbindungen sollte zwei Donor-Gruppen enthalten, während die zweite Verbindung zwei Akzeptoren besitzen sollte. Dabei wurde eine Reihe von Diol-Dion-Komplexen untersucht. Dabei gelang es nur einen dieser Komplexe zu kristallisieren und experimentell zu untersuchen. Leider lagen keine Dimere vor, sondern es bildete sich ein 2:1-Komplex (Diol/Dion), der kettenförmige Wasserstoffbrücken ausbildete. Erfreulich war hingegen, daß eine Konformationänderung des Dions zu beobachten war; denn gegenüber der Kristallstruktur der reinen Verbindung lag 25 im Komplex als planare Verbindung vor. Gleichzeitig wurden die möglichen Komplexgeometrien mit MOMO berechnet. Die meisten der berechneten Komplexe wiesen Dimere mit den gewünschten zwei Wasserstoffbrücken auf.
A new experimental setup, for pump-probe fs DFWM measurements, which is based on a femtosecond laser system, has been constructed. It allows for the investigation of molecular species in the gas phase at different temperatures, from ~30 K in a seeded supersonic jet up to ~500 K in a heat-pipe oven. In comparison to other RCS methods the employed fs DFWM technique is less complicated and gives much higher signal-to-noise ratio [BFZ86, FeZ95a, CKS89, CCH90, HCF91, WRM02, Rie02]. A general computer code for the simulation of fs DFWM spectra of nonrigid asymmetric top molecules has been developed. This new DFWM code in combination with a non-linear fitting routine allows one to determine rotational and centrifugal distortion constants and obtain information on the polarizability tensor components from the experimental spectra. Fs DFWM spectroscopy was successfully applied to the medium-sized molecules benzene and benzene-d6 in a gas cell and in a supersonic jet. The spectrum from a seeded expansion has been measured up to delay time of 3.9 ns (restricted by the length of the delay stage) with excellent signal-to-noise ratio (102-103). In that way 87 and 72 J-type transients have been recorded for benzene and benzene-d6, correspondingly. A relative accuracy on the order of 10-5 has been achieved for the rotational constant. From the room temperature experiments, precise values of centrifugal distortion constants DJ and DJK have been extracted. The literature data for cyclohexane have been revised and a new precise rotational constant B0 has been obtained, which is (+5.5 MHz) shifted from the one reported in the former Raman investigation by Peters et al. [PWW73]. Additionally, high-level ab initio calculations of cyclohexane have been carried out using a large number of basis sets at several levels of theory. In particular, the vibrational averaging effects have been examined in order to critically compare the experimentally determined and theoretically evaluated rotational constants. The contribution of highly symmetric vibrational modes to vibrational averaging effects was clarified. More structural information could be obtained from fs DFWM measurements of asymmetric top species, since different type of rotational recurrences can appear, and all three rotational constants (A, B, C) can be extracted. On the other hand the analysis of the asymmetric top spectra is no longer trivial. In fact the simple formula for rotational recurrence periods of symmetric top species (Tab. 2.1) can not be applied to asymmetric top molecules. Thus, in order to extract high-resolution data for asymmetric species, a complete fitting of the experimental spectra is necessary. The fs DFWM and (1+2') PPI method have been applied to the asymmetric top molecules pyridine in the ground (S0) and pDFB in the S0 and electronically excited (S1) states. By fitting the measured fs DFWM spectra the rotational and centrifugal distortion constants have been extracted with good precision and the value of the parametrized polarizability angle of pDFB was obtained. In this work, the first application of fs DFWM spectroscopy to a molecular cluster has been reported. Also, the chemical equilibrium between monomeric and dimeric species was studied. In particular formic and acetic acid have been investigated in a gas cell and in a supersonic expansion. Many spectral features have been observed and analized in the fs DFWM spectrum of formic acid vapor in a gas cell at room temperature. Most of them were attributed to rotational recurrences of the formic acid monomer, but also spectral feature originating from the formic acid dimer of O-H×××O/O×××H-O type have been detected and analyzed. From the fitted simulation, the rotational and centrifugal distortion constants, and parametrized polarizability angle were extracted for the dimeric structure of O-H×××O/O×××HO type. With the assumption of unperturbed monomers a center-of-mass distance of R = 2.990 ± 0.001 Å for the monomers within the dimer has been calculated from the spectroscopic results. This distance is 0.028 Å smaller than that reported from electron diffraction [ABM69]. Thus, the centers-of-mass distance was assigned as the main point of disagreement between results of fs DFWM and electron diffraction experiments. In contrast to formic acid, acetic acid shows strong recurrences from dimeric species even in the fs DFWM spectra at room temperature. This is explained in terms of different symmetry of the moments-of-inertia tensor, which modulates the intensity of RRs (the fs DFWM signal is in general stronger from symmetric species). Due to the symmetric nature of the acetic acid dimer, only the sum (B+C) of the rotational constants has been extracted. The changes of geometrical parameters upon dimer formation have been analyzed for, both, formic and acetic acid. A heat-pipe oven has been used in order to overcome the main drawback of fs DFWM spectroscopy – the square dependence of the signal intensity on the sample number density. Two-ring molecules (cyclohexylbenzene, para-cyclohexylaniline and nicotine) with low vapor pressure (<0.1 mbar) at room temperature have been investigated. From the analysis of the experimental and ab-initio results for CHB and pCHA a nearly perpendicular conformation of the aromatic vs. cyclohexane ring for both system is inferred. The enlargement of the benzene ring of CHB in the electronically excited state (S1) has been found to cause the smaller rotational constants in S1. This conclusion has been drawn from the comparison of the ground and electronically excited state experimental rotational constants in combination with ab-initio calculations. The extraction of precise structural information for nicotine was not possible due to it weak fs DFWM signal. However, the fact that fs DFWM technique can be applied to conformational analysis of molecular species in an equilibrium mixture opens other applications for this kind of spectroscopy. In general the results obtained in this work show that the fs DFWM technique, being an experimental implementation of RCS, provides one with an important tool for structural analysis of molecular species in the gas phase in particular for the species to which microwave spectroscopy can not be applied. It gives spectra with excellent signal-to-noise ratio even at low number density samples expanded in a seeded supersonic jet. It provides an alternative and innovative approach towards rotational Raman spectroscopy of large polyatomic molecules applicable under various experimental conditions (broad temperature and pressure range). With the introduction of femtosecond (10-15s) laser pulses (usually picosecond (10-12s) laser pulses were used in RCS) an improvement in time-resolution and therefore in precision for the rotational constants by more than one order of magnitude has been achieved. Molecular systems in the ground electronic state without permanent dipole moment and chromophore can be studied with high precision, providing thereby molecular benchmark systems for the electronic structure theory. As has been shown, the study of molecular clusters by fs DFWM spectroscopy is possible, but its potential are restricted by the square dependence of the fs DFWM signal from the sample number density, which is even more important for supersonic jet expansions. Here, the application of near-resonant and resonant FWM schemes should help in order to compensate for the low sample concentration. With the introduction of the heat pipe oven for fs DFWM experiments, the investigation of large nonvolatile molecules under equilibrium conditions is possible now. In our laboratory the first results on the structural analysis of different conformers of pyrrolidine in the gas phase have been obtained [MaR04]. This method can have even more prospects for the structural investigations of large molecular species in combination with new non-thermal gas phase sources for nonvolatile molecules, like laser desorption [CTL89], laser oblation [MHL83], electrospray [FMM90], laser induced liquid beam ion desorption [KAB96, Sob00] etc. A very recent application of the fs DFWM technique is the investigation of the influence of strong laser fields on molecular gas phase sample, which could range from active alignment [PPB03] over molecular deformation to field ionization [CSD03]. In regards to future development in fs DFWM spectroscopy for more complex molecules one has to take into account, how large amplitude motions such as the van der Waals vibrations or internal rotation (see section 6.4.2) affect the rotational coherences. In any case, femtosecond Degenerate Four-Wave Mixing as experimental implementation of Rotational Coherence Spectroscopy can be considered as an innovative, developing, and powerful method for the structural investigation of the molecular species, which are hard to study by classical frequency-resolved spectroscopy [FeZ95a, Dan01, Rie02].
Nitric oxide (NO) represents a short-lived mediator that pivotally drives keratinocyte movements during cutaneous wound healing. In this study, we have identified p68 DEAD box RNA helicase (p68) from a NO-induced differential keratinocyte cDNA library. Subsequently, we have analyzed regulation of p68 by wound-associated mediators in the human keratinocyte cell line HaCaT. NO, serum, growth factors and pro-inflammatory cytokines were potent inducers of p68 expression in the cells. p68 was constitutively expressed in murine skin, but rapidly down-regulated upon injury. The down-regulation appeared to be transient, as p68 protein expression increased again after the inflammatory phase of repair. However, p68 protein expression did not completely disappear during wound inflammation, as immunohistochemistry and cell fractiona tion analysis revealed a restricted localization of p68 in keratinocyte nuclei of the developing epithelium. In line, cultured human (HaCaT) and murine (PAM 212) keratinocyte cell lines showed a nuclear localization of the helicase. Moreover, confocal microscopy revealed a strong localization of p68 protein within the nucleoli of the keratinocytes. Functional analyses demonstrated that p68 strongly participates in keratinocyte proliferation and gene expression. Keratinocytes that constitutively overexpressed p68 protein were characterized by a marked increase in serum-induced proliferation and vascular endothelial growth factor (VEGF) expression, whereas down-regulation of endogenous p68 using small interfering RNA (siRNA) markedly attenuated serum-induced proliferation and VEGF expression. Altogether, our results suggest a tightly controlled expression and nucleolar localization of p68 in keratinocytes in vitro and during skin repair in vivo that functionally contributes to keratinocyte proliferation and gene expression.
Isolierung und Charakterisierung der Atmungsketten-Superkomplexe aus Paracoccus denitrificans
(2004)
Isolierung von Atmungsketten-Superkomplexen aus Paracoccus denitrificans: Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurde ein Reinigungsprotokoll zur Präparation der Atmungskettenkomplexe I, III und IV des Gram-negativen, fakultativ anaeroben Bodenbakteriums Paracoccus denitrificans in Form eines NADH Oxidase Komplexes erstellt. Bisher konnten stabile Superkomplexe bakterielle Atmungskettenkomplexe nur in Gestalt einer Chinol Oxidase, bestehend aus den Komplexen III (Ubichinol:Cytochrom c Oxidoreduktase) und IV (Cytochrom c Oxidase), isoliert werden (Berry, et al., 1985). Jedoch enthielten diese Assemblierungen keinen Komplex I (NADH: Ubichinon Oxidoreduktase). Dies ist die erste chromatographische Isolierung eines kompletten "Respirasoms" aus Paracoccus denitrificans. Unter der Verwendung des milden Detergenz Digitonin zur Solubilisierung von Paracoccus denitrificans Membranen gefolgt von zwei chromatographischen Reinigungsschritten, der Hydroxylapatit-Chromatographie und der Gelfiltration, konnte eine NADH Oxidase, bestehend aus den Komplexen I, III und IV in einer 1:4:4 Stöchiometrie isoliert werden. Neben der Isolierung der NADH Oxidase konnten weitere kleine Superkomplexe identifiziert werden, die aus vier Komplex III und vier Komplex IV (III4IV4) sowie vier Komplex III und zwei Komplex IV (III4IV2) assoziiert waren. Charakterisierung der Superkomplexe aus Paracoccus denitrificans: Die isolierten Atmungskettenkomplexe wurden zur Charakterisierung bezüglich ihrer Funktion, enzymatischen Aktivität, Stöchiometrie und Untereinheiten-Zusammensetzung aus Paracoccus denitrificans Wildtyp-Membranen analysiert. Proben aller Präparationsstufen wurden parallel zur BN-Gelelektrophorese und für enzymatische Einzel- und kombinierte Aktivitäten der Komplexe I-IV eingesetzt. Mittels BN-Gelelektrophorese konnten die apparenten Massen der Komplexe bestimmt werden. Im folgenden denaturierenden SDS-Gel wurde die Untereinheiten-Zusammensetzung der Superkomplexe durch Immunodetektion mit Antikörpern gegen die Komplexe I, III, IV und Cytochrom c552 analysiert. Abschließend konnte nach der Gelfiltration festgestellt werden, das Komplex II eindeutig nicht Teil des Superkomplexes (I1III4IV4) war. Die Stöchiometrie des Superkomplexes a wurde mit Hilfe der fluorimetrischen Bestimmung von FMN (Flavin) als Marker für Komplex I und mittels Pyridin Hämochromogen Spektren für Häm a, b und c bestimmt. Da Komplex III physiologisch als Dimer vorliegt (Mayer et al. 2002), müsste die Stöchiometrie der funktionellen Einheit des Superkomplex a folgendermaßen lauten: I1 (III2)2 IV4. In diesem Fall diente der Vergleich der Wechselzahl einzelner Präparationsstufen als Maß der Verunreinigung der ergab, dass Fremdkomplexe mit Flavin und Cytochrom b im Ausgangsmaterial der Präparation vorhanden waren. Nur die Wechselzahl des Komplexes IV blieb während der Präparation konstant. Um den Gehalt an Komplex I und die Qualität der Präparation abzuschätzen, wurde das Verhältnis der HAR zu dNADH:DBQ Oxidoreduktase Aktivität in Membranen und isoliertem Superkomplex a bestimmt. Es war während der Präparation konstant. Die Bestimmung des Phospholipidgehalts aus isoliertem Superkomplex a im Vergleich zu P. denitrificans Membranen ergab eine Abnahme von 980 ± 80 nmol PL / mg Protein in Membranen auf 290 ± 10 nmol / mg Protein in isoliertem Superkomplex a, wohingegen der Ubichinongehalt von 2,7 ± 0,3 nmol / mg auf 6,7 ± 0,8 nmol / mg in isolierter Oxidase anstieg. Katalytische Aktivitäten von P. denitrificans Membranen des Parentalstamms und verschiedener Mutantenstämme zeigten, dass die Inaktivierung des Gens für fest gebundenes Cytochrom c552 die Bildung eines Superkomplexes nicht verhindern konnte, was ein Hinweis dafür ist, dass dieses Elektronen Carrier Protein nicht essentiell für die strukturelle Verbindung zwischen den Komplexen III und KIV ist. Komplex I Aktivität wurde ebenfalls in Membranen von Mutanten-Stämmen, denen Komplex III oder Komplex IV fehlte, gefunden. Jedoch enthielten diese Stämme keinen assemblierten Komplex I, sondern nur dissoziierte Untereinheiten des Komplexes. Trotz der Verwendung der selben Protokolle für die elektrophoretische Trennung und chromatographische Isolierung wie für Superkomplexe aus dem Wildtyp-Stamm, führte die Isolierung aus Mutantenstämmen, denen Komplex III oder IV fehlte, zum vollständigen Verlust der NADH:DBQ Oxidoreduktaseaktivität. Dies weist darauf hin, dass Paracoccus denitrificans Komplex I durch die Assemblierung in Form eines NADH Oxidase Superkomplex stabilisiert wird. Zusätzlich zum Substrat Channeling scheint die strukturelle Stabilisierung von Membran Protein Komplexen die Hauptaufgabe von respiratorischen Superkomplexen zu sein.