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Die vorliegende Arbeit stellt die Phonologie, Morphologie und Syntax des Nyam, einer westtschadischen Minoritätensprache Nordostnigerias, dar. Es handelt sich um eine Erstbeschreibung, die im Zuge eines von der DFG finanzierten Projekts mit dem Titel „Das Nyam – Dokumentation einer westtschadischen Minoritätensprache“ durchgeführt werden konnte.
Ziel dieser Arbeit ist es, eine grammatische Beschreibung des Nyam – eine bis dato unbekannte Sprache – vorzulegen. Mit nur ca. 5000 Sprechern ist sie schon im Hinblick auf die geringe Zahl, vor allem aber durch die regionale Dominanz der mit ihr genetisch verwandten Verkehrssprache Hausa, akut in ihrer Existenz bedroht. Zudem befindet sich diese Sprache in einer geographisch exponierten Lage, d.h. sie ist weitgehend von Benue-Kongo-Sprachen umgeben. Vor diesem Hintergrund kann die Dokumentation des Nyam einerseits den Nyam-Sprechern selbst zur Erhaltung ihrer kulturellen Identität und der damit verbundenen Traditionen dienen. Andererseits ist dieser wissenschaftliche Beitrag als Ergänzung zu den noch fehlenden Grammatiken innerhalb der tschadischen Sprachfamilie und im Besonderen der Bole-Tangale-Sprachgruppe zu sehen und kann als Grundstein zukünftiger Forschungen für vergleichende Arbeiten mit den benachbarten Benue-Kongo-Sprachen betrachtet werden.
The scope of this thesis is to elaborate on the use cases of the EEG in pain research. It has been submitted as a cumulative dissertation, meaning that the main part of this thesis has been previously published in international peer-reviewed journals. The first part of this thesis begins with an introduction which describes the general methodoligcal considerations and theoretical background information that is needed to perform pain research using the EEG. Then, I will give a summary of the results of all three studies and the subsequently published manuscripts. The discussion will give an outlook on two ongoing projects and elaborate how the methodology that has been compiled throughout my time as a PhD student can be further applied to scientific problems in pain research. I will conclude with the possibilities and the limitations of the EEG in pain research. The second part of this thesis consists of three publications that cover three individual studies, of which I am the lead/first author. These publications describe different use cases for the EEG in pain research. The first publication lays out the methodological backbone of this thesis, analyzing the exact EEG parameters that are needed to achieve the results in the following projects. Then, I present two additional studies. The first study describes the usefulness of pain-related evoked signatures after standardized noxious stimulation in the EEG in patients undergoing general anesthesia. The second study outlines differences in the pain processing of elite endurance athletes versus a normally active control group. Furthermore, it outlines how the function of the endogenous pain modulatory system can be measured in the EEG using CPM. All studys are discussed individually as per the journal guidelines.
Strukturelle und funktionelle Untersuchungen am Cytochrom-bc1-Komplex aus Paracoccus denitrificans
(2005)
Cytochrom bc-Komplexe sind zentrale Enzyme energietransduzierender Elektronen-transportketten. Anerkanntes Funktionsprinzip ist der Q-Zyklus; mechanistische Details insbesondere der Chinoloxidation am Qo-Zentrum sind noch unklar. Ein Verständnis des Qo-Zentrums ist auch von Interesse, da hier Inhibitoren in Form von Fungiziden und Malariatherapeutika wichtige Anwendung finden. In den vergangenen Jahren wurde eine Reihe mitochondrialer Komplexe kristallographisch charakterisiert, die Struktur eines bakteriellen Enzyms steht jedoch aus. Hauptziel dieser Arbeit war es, Ansätze zur Strukturaufklärung des bc1-Komplexes aus Paracoccus denitrificans (P.d.) zu finden, der als homologes Enzym mitochondrialer Komplexe bei einfacher genetischer Zugänglichkeit ein wichtiges Modellsystem darstellt. In der vorliegenden Arbeit wurde auf die Kristallisation des bc1-Komplexes aus S. cerevisiae aufgebaut, die mit Hilfe monoklonaler Antikörperfragmente (Fv) gegen die Rieske-Untereinheit (ISP) erreicht wurde; die Fv-Fragmente erleichtern die Ausbildung von Kristallkontakten. Die Epitopregion des Hefeenzyms wurde genetisch auf den bakteriellen Komplex übertragen, um dessen Ko-Kristallisation mit dem bereits verfügbaren Fv zu ermöglichen. Punktuelle Anpassungen führten zu keiner signifikanten Bindung, ein weitergehender Austausch des entsprechenden ISP-Bereichs verbesserte die Bindung hingegen deutlich. Die besten Ergebnisse konnten mit chimären Enzymen erzielt werden, bei denen die gesamte ISP-Ektodomäne durch das Hefe-Homologe ersetzt wurde. Aufbauend auf dieser Arbeit scheint die Fv-vermittelte Kristallisation des Enzyms ein greifbares Ziel. Eine komplementäre Strategie zielte auf die strukturelle Charakterisierung der Rieske-Ektodomäne (ISF). Das klonierte ISF wurde in E. coli überexprimiert, lag jedoch fast vollständig in inclusion bodies vor. Das ISF konnte in eine lösliche Form rückgefaltet werden, die anschließende chemische Rekonstitution zum Holo-Protein gelang jedoch nur mit einer Ausbeute von ~ 1 %. Die geringe Menge an löslichem ISF, die sich nach Expression in E. coli isolieren lässt, trägt kein [2Fe-2S]-Zentrum. Durch Koexpression der für die Biogenese von Eisen-Schwefel-Zentren relevanten Gencluster konnte die lösliche ISF-Fraktion in vivo in die Holo-Form konvertiert werden. Auch hier war aber die Gesamtausbeute für strukturelle Untersuchungen zu gering. Eine homologe Expression in P.d. war nur für das komplette ISP nachweisbar, nicht für das verkürzte ISF. Durch gerichtete Mutagenese konnte hier erstmals gezeigt werden, dass das bakterielle Rieske-Protein über den Tat-Translokationsweg in die Membran inseriert. Die Kristallstrukturen mitochondrialer bc1-Komplexe zeigen ein dimeres Enzym. Die Assoziation des bakteriellen Komplexes wurde in dieser Arbeit mit der analytischen Ultrazentrifugation untersucht, und auch hier wurde eindeutig ein Dimer nachgewiesen. Dynamische Messverfahren deuteten jedoch auf einen höheren Assoziationszustand hin. Es bleibt unklar, ob diese Diskrepanz durch Formparameter oder die Detergenzbindung begründet ist oder ob unter bestimmten Versuchsbedingungen möglicherweise Tetramere vorliegen. In situ ist der bc1-Komplex strukturell mit den Komplexen I und IV sowie dem Elektronenüberträger Cyt c552 assoziiert. Die Analyse verschiedener Deletionsstämme zeigte, dass Komplex I der Atmungskette durch diesen Superkomplex stabilisiert wird. Dieser Befund konnte kürzlich in anderen Arbeiten auch an menschlichen Mitochondrien bestätigt werden. Neben strukturellen Aspekten wurden am bc1-Komplex auch die H+-Translokation und die Chinonbindung untersucht. Da chemische Modifikationsexperimente zeigen, dass ein saurer Rest im ISP eine kritische Rolle für die Kopplung von H+-Translokation und Elektronentransport spielt, wurden durch gerichtete Mutagenese kombinatorisch saure Reste gegen entsprechende Säureamide ersetzt. Die biochemische Charakterisierung wurde nur für eine Fünffach-Mutante durchgeführt; diese erwies sich jedoch als zu instabil, um verlässliche Daten aus H+-Pumpexperimenten zu gewinnen. Die Charakterisierung der übrigen Mutanten scheint lohnenswert, da der relevante Aminosäurerest auch in anderen Arbeiten noch nicht identifiziert werden konnte. Der Gehalt des aufgereinigten Enzyms an spezifisch gebundenem Chinon wurde FTIR-spektroskopisch quantifiziert. Eine Stöchiometrie von ~ 3 Chinonmolekülen/Monomer stützt das double occupancy-Modell, demzufolge zwei Substratmoleküle am Qo-Zentrum binden; das dritte Chinon bindet am Qi-Zentrum. Partielle Extraktion des Chinons und Messungen bei verschiedenen pH-Werten zeigten, dass die Substratbindung mit Protonierung eines sauren Rests einhergeht. Möglicherweise handelt es sich dabei um Glu295 des Cytochrom b, das auf Basis der Kristallstrukturen als primärer H+-Akzeptor am Qo-Zentrum diskutiert wird. Aufbauend auf dieser Arbeit können die an der Chinonbindung beteiligten Reste durch Mutagenese identifiziert werden.
Die Theorie der Quantenelektrodynamik (QED) starker Felder sagt vorher, dass sich unter dem Einfluss sehr starker elektromagnetischer Felder der Vakuumzustand verändert. Überschreitet das äußere (im einfachsten Fall elektrostatische) Feld eine gewisse kritische Stärke, dann kommt es zur spontanen Erzeugung von Elektron-Positron-Paaren und im Gefolge zur Ausbildung eines geladenen Vakuums. Charakteristisch dafür sind gebundene Elektronenzustände mit einer Bindungsenergie von mehr als der doppelten Ruhenergie. Dieser Effekt wurde bisher meist für sphärisch symmetrische Systeme untersucht, insbesondere für das Coulombpotential eines schweren Kerns. In der vorliegenden Arbeit wird erkundet, wie sich das überkritische Phänomen beim Übergang von sphärischer zu zylindrischer Geometrie verhält. Dazu werden die Lösungen der Dirac-Gleichung für Elektronen im elektrostatischen Potential eines langen dünnen geladenen Zylinders ("geladener String") berechnen und darauf aufbauend das überkritische Phänomen untersucht. Da das logarithmische Potential eines unendlich langen Strings unbegrenzt anwächst, sollten alle Elektronzustände überkritisch sein (Möglichkeit des Tunnelns durch den Teilchen-Antiteilchen-Gap). Die Zentralladung sollte sich dann mit einer entgegengesetzt geladenen Hülle aus Vakuumelektronen umgeben und damit neutralisieren. Um diese Phänomene quantitativ zu beschreiben untersuchen wir die Lösungen der Poisson-Gleichung und der der Dirac-Gleichung in Zylindersymmetrie. Zunächst wird eine Reihenentwicklung für das elektrostatische Potential in der Mittelebene eines homogen geladenen Zylinders von endlicher Länge und endlichem Radius hergeleitet. Anschließend benutzen wir den Tetraden- (Vierbein-) Formalismus zur Separation der Dirac-Gleichung in Zylinderkoordinaten. Die resultierende entkoppelte radiale Dirac-Gleichung wird in eine Schrödinger-artige Form transformiert. Die gebundenen Zustände werden mit der Methode der uniformen Approximation, einer Variante der WKB-Näherung, berechnet und ihre Abhängigkeit von den Parametern Stringlänge, Stringradius und Potentialstärke wird studiert. Die Näherungsmethode wird auch benutzt, um den überkritischen Fall zu untersuchen, bei dem sich die gebundenen Zustände in Resonanzen im Antiteilchen-Kontinuum verwandeln. Der zugehörige Tunnelprozess wird studiert und die Resonanz-Lebensdauer abgeschätzt. Schließlich wird das Problem der Vakuumladung und Selbstabschirmung angegangen. Die Vakuumladung wird durch Aufsummation der Ladungsdichten aller überkritischen (quasi-)gebundenen Zustände berechnet. Die Vakuumladung tritt als Quellterm in der Poisson-Gleichung für das elektrostatische Potential auf, welches wiederum die Wellenfunktionen bestimmt. Auf die volle selbstkonsistente Lösung dieses Problems wird verzichtet. Wir zeigen jedoch dass die Vakuumladung wie erwartet gross genug ist, um eine Totalabschirmung des geladenen Strings zu bewirken.
Die Schwerpunkte dieser Arbeit sind elektrische, stationäre und zeitaufgelöste Transportmessungen an EuB6 sowie die Weiterentwicklung von Messmethoden und Analyseverfahren der Fluktuationsspektroskopie. Durch die Verwendung von
modernen Computern und Datenerfassungskarten konnten die Messmethoden effektiver eingesetzt werden.
Die ersten beiden Kapitel stellen die Grundlagen dar, die für diese Arbeit von Bedeutung sind. Der erste Teil dieser Arbeit wurde der Weiterentwicklung der bereits bekannten Messmethoden unter Verwendung einer schnellen Datenerfassungskarte gewidmet. Im Gegensatz zur Verwendung eines Signalanalysators bietet die Karte die Möglichkeit, auf die Rohdaten im Zeitraum zuzugreifen und sie anschließend mit einer selbst programmierten Software auszuwerten. Die technischen Methoden und der Aufbau der Software wurden in den Kapiteln 3 und 4 vorgestellt. Durch das Ersetzen des Signalanalysators kann bis zu 50% der Messzeit eingespart werden.
Durch die Code-Erweiterung kann bereits nach zwei hintereinander gemessenen Spektren vorläufig bei tiefen Frequenzen ausgewertet und somit frühzeitig entschieden werden, ob eine längere Messzeit aussichtsreich ist. Außerdem wird durch Verwendung der Code-Erweiterung eine sehr viel höhere Spektrendichte (Anzahl von Messpunkten) erreicht. Da im Gegensatz zum Signalanalysator alle gemessenen Spektren gespeichert werden, können in jeder Messung die Spektren auf ihre Korrelation (Korrelationskoeffizient und Zweites Spektrum) hin untersucht werden, ohne zusätzliche Messzeit zu benötigen.
Der zweite Teil dieser Arbeit befasst sich mit den elektrischen Transporteigenschaften von EuB6 und dem Verständnis der Kopplung zwischen Ladungs- und magnetischen Freiheitsgraden. Mittels Widerstands- und nichtlinearer Transportmessungen sowie Fluktuationsspektroskopie wurden Hypothesen von anderen Wissenschaftlern systematisch verifiziert, sowie neue, weiterführende Erkenntnisse gewonnen.
Direkte experimentelle Hinweise für die Phasenseparation sowie das Auftreten von Perkolation aus Transportmessungen fehlten bisher. In dieser Arbeit wurden daher systematisch die elektrischen Transportseigenschaften des Systems in Abhängigkeit von der Temperatur und vom Magnetfeld untersucht. Mittels Fluktuationsspektroskopie konnte erstmals ein direkter Hinweis auf perkolatives Verhalten in den Transporteigenschaften beobachtet werden. Ein starkes nichtlineares Transportsignal (dritter harmonischer Widerstand, DHW) im Bereich von TMI und TC ist eine Signatur einer räumlich inhomogenen Stromverteilung auf der Mikroskala und ein weiterer deutlicher Hinweis auf magnetisch induzierte elektronische Phasenseparation. Insbesondere tritt nichtlinearer Transport bei H = 0 im FM Bereich auf und kann im PM-Bereich bei T > TMI durch externe Magnetfelder induziert werden.
Biologische Signalwege bilden komplexe Netzwerke aus, um die Zellantwort sensibel regulieren zu können. Systembiologische Ansätze werden eingesetzt, um biologische Systeme anhand von Computer-gestützten Modellen zu untersuchen. Ein mathematisches Modell erlaubt, neben der logischen Erfassung der Regulation des biologischen Systems, die systemweite Simulation des dynamischen Verhaltens und Analyse der Robustheit und Anfälligkeit.
Der TNFR1-vermittelte Signalweg reguliert essenzielle Zellvorgänge wie Entzündungsantworten,
Proliferation und Zelltod. TNFR1 wird von dem Zytokin TNF-α stimuliert und fördert daraufhin die Bildung verschiedener makromolekularer Komplexe, welche unterschiedliche Zellantworten einleiten, von der Aktivierung des Transkriptionsfaktors NF-κB, welcher die Expression von proliferationsfördernden Genen reguliert, bis zu zwei Formen des Zelltods, der Apoptose und der Nekroptose. Die Regulation der verschiedenen Zellantworten wird auch als molekularer Schalter bezeichnet. Die exakten molekularen Vorgänge, welche die Zellantwort modulieren, sind noch nicht vollständig entschlüsselt. Eine Fehlregulation des Signalwegs kann chronische Entzündungen hervorrufen oder die Entstehung von Tumoren fördern.
In dieser Thesis haben wir die neuesten Erkenntnisse der Forschung des TNFR1-Signalwegs anhand von umfangreichen Interaktionsdaten aus der Literatur erstmals in einem Petrinetz-Modell erfasst und analysiert. Das manuell kuratierte Modell umfasst die sequenziellen Prozesse der NF-κB-Aktivierung, Apoptose und Nekroptose und berücksichtigt den Einfluss posttranslationaler Modifikationen.
Weiterhin wurden Analysemethoden für Signalwegs-Modelle entwickelt, welche die spezifischen Anforderungen dieser biologischen Systeme berücksichtigen und eine biologisch motivierte Netzwerkanalyse ermöglichen. Die Manatee-Invarianten identifizieren Signalflüsse im Gleichgewichtszustand in Modellen, die Zyklen aufweisen, und werden als Linearkombination von Transitions-Invarianten gebildet. Diese Signalflüsse erfassen idealerweise einen Prozess von der Rezeptorstimulation zur Zellantwort in einem Modell eines Signalwegs. Die Bestimmung aller möglichen Signalflüsse in Modellen von Signalwegen ist eine notwendige Voraussetzung für weitere biologisch motivierte Analysen, wie die in silico-Knockout Analyse. Wir haben ebenfalls ein neues Konzept zur Untersuchung von in silico-Knockouts vorgestellt. Die Effekte der in silico-Knockouts auf einzelne Komplexe und Prozesse des Signalwegs werden in der in silico-Knockout-Matrix repräsentiert. Wir haben die Software-Anwendung isiKnock entwickelt, welche beide Konzepte kombiniert und eine systematische Knockout-Analyse von Petrinetz-Modellen unterstützt.
Das Petrinetz-Modell des TNFR1-Signalwegs wurde auf seine elementaren Eigenschaften geprüft und die etablierten Analysen wie Platz-Invarianten und Transitions-Invarianten durchgeführt. Hierbei konnten die Transitions-Invarianten nicht in allen Fällen komplette biologische Signalflüsse beschreiben. Wir haben ebenfalls die neu vorgestellten Methoden auf das Petrinetz-Modell angewandt. Anhand der Manatee-Invarianten konnten wir die zusammenhängenden Signalflüsse identifizieren und nach ihrem biologischen Ausgang klassifizieren sowie die Auswirkungen der Rückkopplungen untersuchen. Wir konnten zeigen, dass die survival-Antwort durch die Aktivierung von NF-κB am häufigsten auftritt, danach die Apoptose, gefolgt von der Nekroptose. Die alternativen Signalflüsse in Form der Manatee-Invarianten spiegeln die Robustheit des biologischen Systems wider. Wir führten eine ausgiebige in silico-Knockout-Analyse basierend auf den Manatee-Invarianten durch, um die Proteine des Signalwegs nach ihrem Einfluss einzustufen und zu gruppieren. Die Proteine des Komplex I wiesen hierbei den größten Einfluss auf, angeführt von der Rezeptorstimulation und RIP1. Wir betrachteten und diskutierten die Regulation des molekularen Schalters anhand der Knockout-Analyse von selektierten Proteinen und deren Auswirkung auf wichtige Komplexe im Modell. Wir identifizierten die Ubiquitinierung in Komplex I sowie die NF-κB-abhängige Genexpression als die wichtigen Kontrollpunkte des TNFR1-Signalwegs. In Komplex II ist die Regulation der Aktivierung der Caspase-Aktivität entscheidend.
Die umfangreiche Netzwerkanalyse basierend auf Manatee-Invarianten und systematischer in silico-Knockout-Analyse verifizierte das Petrinetz-Modell und erlaubte die Untersuchung der Robustheit und Anfälligkeit des Systems. Die neu entwickelten Methoden ermöglichen eine fundierte, biologisch relevante Untersuchung von in silico-Modellen von Signalwegen. Der systembiologische Ansatz unterstützt die Aufklärung der Regulation und Funktion des verflochtenen Netzwerks des TNFR1-Signalwegs.
This thesis comprises the usage of two commonly known hinge-binding moieties in drug discovery. First, the quinazoline scaffold of gefitinib (5) was utilized in a macrocyclization strategy to introduce selectivity. In general, the quinazoline hinge-binding moiety is a commonly used scaffold which can be found in 14% of approved kinase inhibitors. The most familiar applications are EGFR inhibitors such as gefitinib (5), erlotinib (6), afatinib, or dacomitinib for the treatment of NSCLC. But other kinases like CDK2, CDK4, or p38 are reported targets as well.
The N-phenylquinazolin-4-amine moiety of gefitinib (5) was conserved however, the residues at the aromatic ring in the linker were modified, the residue targeting the solvent-exposed region was varied, and the linker at the C6 position of the quinazoline was adjusted to enable the macrocyclization. An overview of the structural modifications is shown in Figure 35A.
Kinome-wide screening of gefitinib (5) revealed several off-targets besides EGFR (Figure 35B), making it an excellent starting point for a macrocyclization strategy. Introducing a linker to the N phenylquinazoline-4-amine scaffold and retaining the residues on the aromatic ring as well as the methoxy group targeting the solvent-exposed region improved the selectivity profile and the efficacy towards EGFR WT and its mutants. Truncation of the linker moiety led to the mutant selective macrocycle 26f with an excellent kinome-wide selectivity profile (Figure 35B). An inhibitor that is effective on EGFR mutations while ineffective on the EGFR WT could represent an enhancement of patient treatment, as it potentially causes less side effects. Further studies could determine the effect of the most promising macrocycles in lung cancer cell lines. Additionally, the pharmacokinetic properties could be optimized, e.g. by introducing solubilizing groups, targeting the solvent-exposed region.
The second scaffold comprises the 3-aminopyrazole-based hinge-binding moiety. It is a privileged scaffold in medicinal chemistry for the development of kinase inhibitors. Previous publications report the anti-proliferative and anti-cancer potential of pyrazole-based molecules. They play a crucial role in the treatment of various diseases and cancer types like inflammation disorders, lymphoma, or breast cancer. This scaffold can be found e.g. in the aurora kinase inhibitor tozasertib or in the promiscuous kinase inhibitor 23, published by Statsuk et. al. Rescreening compound 23 in a comprehensive kinase panel against 468 human protein kinases confirmed the unselective behavior with a selectivity score of S35 = 0.56 (Figure 36B), making it a great starting point for further optimizations. The N-(1H-pyrazol-3-yl)pyrimidin-4-amine scaffold was conserved however, the residues targeting the solvent-exposed region were varied and different linkers were attached.
The introduction of different residues at the pyrazole dramatically influenced the selectivity profile of the desired kinases. Ester moieties caused to a favorable combination of selectivity and potency towards the kinase of interest CDK16. The removal of additional residues at the pyrimidine, targeting the solvent-exposed region, increased the efficiency towards CDK16. Further optimization led to the highly potent and selective CDK16 inhibitor 98d (IC50 = 33 nM). NanoBRETTM screening against the complete CDK family revealed a preferred inhibition of the PCTAIRE and PFTAIRE subfamily with cellular IC50 values of 20 nM – 120 nM and 50 nM – 180 nM, respectively. A FUCCI cell cycle assay and viability assessment of 98d confirmed previously published results, reporting a G2/M cell cycle arrest followed by apoptosis and accumulation of p27 through knockout of CDK16 in SCC cells. Consequently, further studies could evaluate the anti-tumor activity of 98d in SCC and NSCLC or elucidate the effect of 98d in AMPK-related macroautophagy. 98d represents a novel tool compound to investigate the understudied kinases of the PCTAIRE family and enable to enlighten the biological role of those kinases.
Macrocyclization of the N-(1H-pyrazol-3-yl)pyrimidin-4-amine core resulted in the selective BMPR2 inhibitor 110a. It showed a good binding affinity towards BMPR2 with a KD value of 205 nM as well as a good potency with an IC50 value of 506 nM. A comprehensive selectivity screen against 468 kinases revealed an excellent selectivity profile with S35 = 0.01. As no BMPR2 inhibitors have been published so far, 110a represents a novel compound that may provide further insights into the canonical BMP pathway, noncanonical signaling, or its impact on BMPR2-associated diseases like PAH.
The introduction of additional residues targeting the solvent-exposed region shifted the selectivity towards the MST kinases. The exchange from the pyrimidine to a quinazoline moiety resulted in the highly potent and selective macrocyclic MST3 inhibitor 113c. NanoBRETTM measurements demonstrated the preferred inhibition of MST3 with IC50 values of 210 nM and 30 nM for intact and lysed cells, respectively. A weaker activity could be seen for MST4 with 1.8 µM and 510 nM, while MST1 and MST2 were not affected. To date, no selective MST3 inhibitors have been published, making 113c a valuable tool compound for further functional studies. As MST3 is influencing the cell cycle progression, 113c could be tested in a further cell cycle assay to elucidate the inhibitory effect of 113c on MST3 and consequently on the cell cycle. Furthermore, the anti-tumor activity of 113c in breast cancer could be determined, as Madsen et. al. reported a high MST3 and MST4 activity triggered by FAM40B mutations.
MHC Klasse I Moleküle liegen im Endoplasmatischen Reticulum (ER) als Dimer bestehend aus einer schweren Kette mit Transmembrandomäne und einem 12 kDa-Protein, dem ß2-Mikroglobulin vor. Nach der Beladung des MHC-Klasse I-Moleküls mit einem antigenen Peptid, welche vorwiegend im Cytosol durch proteasomalen Abbau generiert und durch den Transportkomplex TAP ins ER transloziert werden, findet der Transport des MHC-Peptid-Komplexes zur Zelloberfläche statt. Dort wird das Antigen cytotoxischen T-Zellen präsentiert. An der Assemblierung und Reifung von MHC-Klasse I-Molekülen sind verschiedene Chaperone beteiligt. Eine wichtige Rolle beim Peptidbeladungsprozess von MHC-Klasse I-Molekülen spielt Tapasin. Dabei handelt es sich um ein 48 kDa, MHC-codiertes Typ I Transmembran-Glycoprotein aus der Immunglobulinsuperfamilie. Es verbrückt den TAP-Komplex mit MHC-Klasse I-Molekülen, hält unbeladene MHC-Klasse I-Moleküle im ER zurück und führt eine Qualitätskontrolle des gebundenen Peptids durch. Bei dieser Peptideditierung werden Peptide wieder selektiv aus der MHC-Bindungstasche entfernt, wenn sie mit einer niedrigen Affinität gebunden sind. Dadurch wird sichergestellt, dass keine leeren oder suboptimal beladenen MHC-Peptid-Komplexe an die Zelloberfläche gelangen. In der vorliegenden Arbeit wurde ein System etabliert, mit dem der Einfluss von Tapasin auf die Peptidbeladung von MHC-Klasse I-Molekülen in vitro untersucht werden kann. Dazu wurde ein Verfahren zur heterologen Expression und Reinigung von funktionalem, löslichem Tapasin aus E. coli-Zellen aufgestellt. Weiterhin wurden ß2m und die schwere Kette von HLA-B*2705 heterolog in E. coli-Zellen exprimiert, isoliert und zusammen mit einem Reporterpeptid zum funktionalen HLA-B*2705 renaturiert. Bei Untersuchungen der Wechselwirkung zwischen Tapasin und HLA-B*2705-Molekülen konnte mittels der Oberflächen-Plasmonen-Resonanz-Spektroskopie eine direkte Interaktion zwischen Tapasin und unbeladenem HLA-B*2705 gezeigt werden. Detailliertere Untersuchungen zur Rolle von Tapasin bei der Peptidbeladung wurden mittels einer Gelfiltration gekoppelt mit der Fluoreszenzdetektion des Reporterpeptids durchgeführt. Dabei konnte festgestellt werden, dass unbeladene MHC-Klasse I-Moleküle in Anwesenheit von Tapasin stabilisiert werden und in einer Konformation gehalten werden, die eine Assoziation mit Peptid fördert. Weiterhin wurde gezeigt, dass durch Tapasin die Assoziationsrate für die Peptidbindung erhöht ist. Somit kann in Anwesenheit von Tapasin eine größere Anzahl an Peptiden auf eine stabile und hochaffine Bindung an MHC-Klasse I-Moleküle überprüft werden. In Experimenten mit bereits beladenen MHC-Klasse I-Molekülen konnte gezeigt werden, dass der neugebildetete Komplex auch nach erfolgter Peptidassoziation durch Tapasin stabilisiert wird. Dies ist vermutlich auf eine Erniedrigung der Dissoziationsrate für das Peptid zurückzuführen. Mit dem in dieser Arbeit etablierten Untersuchungssystem ist die Grundlage zu detaillierten Studien der Rolle von Tapasin bei der Peptidbeladung von MHC-Klasse I-Molekülen geschaffen.
Die Koronare Herzkrankheit (KHK) nimmt die bedeutendste Stellung bei den Todesursachen und den Gesundheitskosten ein. So beträgt die jährliche Sterblichkeitsrate der KHK-Patienten derzeit 5 – 8 %. KHK ist die häufigste Todesursache in Deutschland. Bisher konzentrierte sich die Ursachenforschung und die Therapie hauptsächlich auf physiologische Ursachen. In letzter Zeit entstanden darüber hinausgehende Ansätze zur Hinterfragung der soziologischen und psychologischen Rahmenbedingungen die die Entstehung der KHK begleiten und begünstigen. Eine der anerkannten Methoden zur Analyse und Behandlung von Ungleichgewichten zwischen dem Individuum und seiner Umwelt ist die Methode des ZBKT (Zentrales- Beziehungskonflikt- Thema). Dazu wurden in der vorliegenden Studie exemplarisch von 2 KHK-Patienten Analysen der Therapieverläufe erstellt und auf Entwicklungen hin untersucht. Die Evaluierung veranschaulichte die Beziehungskonflikte und die Subjekt-Objekt-Interaktionen besagter Patienten auf quantitativer und qualitativer Ebene und deren Veränderung durch eine analytisch orientierte Kurzzeit-Psychotherapie. Von beiden Patienten wurden hier die beruflichen und berufsnahen Beziehungskonflikte zur Auswertung herangezogen. In einer weiteren Arbeit sollen anschließend die familiären und familiennahen Themen einer analogen Analyse unterzogen werden. Es soll gezeigt werden, dass die Methode des ZBKT ein extrahiertes Themengebiet valide darstellen kann. Es wurden an Hand von 47 Verbatimprotokollen der therapeutischen Einzelsitzungen gemäß der von Lester Luborsky entwickelten Methode des „Zentralen Beziehungskonflikt-Themas“ die zentralen Beziehungskonfliktmuster extrahiert und deren Veränderungen über die Therapie erfasst. Mit dieser Methode, die 1976 erstmals vorgestellt wurde und unter dem Namen „core conflictual relationship theme method (CCRT)“ bekannt gemacht wurde, ist ein strukturiertes Vorgehen möglich, das den genauen Inhalt der von den Patienten erwähnten Beziehungsmuster widerspiegelt. Es können relativ zeit- und objektstabile Relationen zwischen Wünschen und Reaktionen eines Menschen mit wichtigen Beziehungspersonen erfasst werden, die sich sowohl in der Gegenwart, als auch in der Vergangenheit manifestieren. Entsprechend können auch Veränderungen identifiziert werden. Um die Verlaufuntersuchung zu optimieren wurden beide Therapien in zwei Phasen aufgeteilt und die sich in den Standardkategorien und Clustern abzeichnenden Veränderungen ausgewertet. Zur Beurteilung des Therapieverlaufes wurden einfache und rasch aus den Sitzungs-Transkriptionen zu erfassende Kennzahlen vorgeschlagen. Diese umfassen die Darstellung der Clusterentwicklung über die Zeit in zwei Phasen, sowie die subjektiven Veränderungen der Sichtweise der Patienten an Hand des Positivitätsquotienten. Es zeigt sich, dass im Verlauf der Therapie deutliche Verbesserungen sowohl bei den Reaktionen des Subjektes als auch denen des Objektes zu erkennen waren. In der durchgeführten Studie wurden zwei KHK- Patienten bezogen auf die berufsrelevanten Einflüsse hin untersucht. Einer der Patienten hat die beruflichen Themen als Schwerpunkt, während der andere sich auf familiäre Einflüsse konzentriert. Dabei zeigte sich, dass die Entwicklung im Verlaufe der Therapie umso deutlicher dargestellt werden kann je häufiger der Patient die beruflichen Probleme thematisiert. Primär zeigte sich, dass der eine Patient unerfüllte Wünsche nach Sicherheit, Struktur und Stabilität im beruflichen Umfeld hat, während der andere Patient sich eine bessere Kommunikationsfähigkeit und Extrovertiertheit wünscht. Beide Perönlichkeitsstrukturen basieren auf einer erschwerten Kindheit mit einem gestörten Vater-Sohn-Verhältnis, das sich einer übertriebene Strenge, Mangel an Kommunikation und Zuneigung sowie adäquater Anerkennung seitens des Vaters manifestiert. Dies prägte die Interaktionen beider Patienten mit Ihrer Umgebung und wurde in der Therapie festgestellt. Im affektiven Bereich zeigte sich ein hohes Enttäuschungsniveau mit Hilflosigkeit und Frustration. Diese pathologischen Beziehungsmuster prägten primär die erste Phase der Therapie. Dieses Selbstbild veränderte sich bei beiden Patienten. Es kam zu einer verbesserten Selbstbewertung die das Konzept der positiven Sichtweise bezüglich ihrer Umgebung stark untermauerte. Beide Patienten empfanden demzufolge gegen Ende der Therapie ihre anfängliche Problematik und die Interaktionen mit ihrer Umgebung als weniger frustran bzw. einschränkend. Es hatte den Anschein, als ob eine gewisse Distanz aufgebaut werden konnte, die es beiden Patienten ermöglichte sich im Verlauf der Therapie wohler zu fühlen. Es nahmen sowohl die negativ orientierten Beziehungsepisoden ab als auch die positiven zu, und der Kontrolleindruck („ich bin eingeengt in meiner Entscheidungsfreiheit durch andere“) verringerte sich. Zudem wurde das Bestreben Konflikte zwanghaft zu lösen und sich damit unter Druck zu setzen abgelöst bzw. in den Hintergrund gedrängt durch eine beginnende Autonomie. Es wurde nachgewiesen, dass das ZBKT eine valide Methode ist, die für die Zukunft ein sinnvolles Verfahren zur Verfügung stellt, um nicht nur klassische Therapien im Gesamtverlauf darzustellen, sondern auch themenspezifische Extraktionen vorzunehmen, abzubilden und zu beurteilen. Weitergehende Untersuchungen mit einem größeren Datenfundus und modifizierten Ansätzen der Methode des ZBKT könnten ein Optimierungspotential zeigen, das die Wirksamkeit und den theoretischen Ansatz dieser Studie untermauern und von großem Interesse wären.
One of the main things that we as humans do in our lifetime is the recognition and/or classification of all kind of visual objects. It is known that about fifty percentage of the neocortex is responsible for visual processing. This fact tells us that object recognition (OR) is a complex task in our and in the animal brain, but we do it in a fraction of a second.
The main question is: How does the brain exactly do it? Does the brain use some feature extraction algorithm for OR tasks? The hierarchical structure of the visual cortex and studies on a part of the visual cortex called V1 tell us that our brain uses feature extraction for OR tasks by Gabor filters. We also use our previous knowledge in object recognition to detect and recognize the objects which we never saw before. Also, as we grow up we learn new objects faster than before.
These facts imply that the visual cortex of human and other animals uses some common (universal) features at least in the first stages to distinguish between different objects. In this context, we might ask: Do universal features in images exist, such that by using them we are able to efficiently recognize any unknown object? Is it necessary to extract new special features for any new object? How about using existing features from other tasks for this? Is it possible to efficiently use extracted feature of a specific task for other tasks? Are there some general features in natural and non-natural images which can also be used for specific object recognition? For example, can we use extracted features of natural images also for handwritten digit classification?
In this context, our work proposes a new information-based approach and tries to give some answers to the questions above. As a result, in our case we found that we could indeed extract unique features which are valid in all three different kinds of tasks. They give classification results that are about as good as the results reported by the corresponding literature for the specialized systems, or even better ones.
Another problem of the OR task is the recognition of objects, independently of any perception changes. We as humans or also animals can recognize objects in spite of many deformations (e.g. changes in illumination, rotation in any direction or angles, distortion and scaling up or down) in a fraction of a second. When observing an object which we never saw, we can imagine the rotated or scaled up objectin our mind. Here, also the question arises: How does the brain solve this problem? To do this, does the brain learn some mapping algorithm (transformation), independent of the objects or their features?
There are many approaches to model the mapping task. One of the most versatile ones is the idea of dynamically changing mappings, the dynamic link mapping (DLM). Although the dynamic link mapping systems show interesting results, the DLM system has the problem of a high computational complexity. In addition, because it uses the least mean squared error as risk function, the performance for classification is also not optimal. For random values where outliers are present, this system may not work well because outliers influence the mean squared error classification much more than probability-based systems. Therefore, we would like to complete the DLM system by a modified approach.
In our contribution, we will introduce a new system which employs the information criteria (i.e. probabilities) to overcome the outlier problem of the DLM systems and has a smaller computational complexity. The new information based selforganised system can solve the problem of invariant object recognition, especially in the task of rotation in depth, and does not have the disadvantage of current DLM systems and has a smaller computational complexity.