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Molecular dynamics (MD) simulation serves as an important and widely used computational tool to study molecular systems at an atomic resolution. No experimental technique is capable of generating a complete description of the dynamical structure of the biomolecules in their native solution environment. MD simulations allow us to study the dynamics and structure of the system and, moreover, helps in the interpretation of experimental observations. MD simulation was first introduced and applied by Alder and Wainwright in 1957 \cite{Alder57}. However, the first MD simulation of a macromolecule of biological interest was published 28 years ago \cite{McCammon77}. The simulation was concerned with the bovine pancreatic trypsin inhibitor (BPTI) protein, which has served as the hydrogen molecule'' of protein dynamics because of its small size, high stability, and relatively accurate X-ray structure available in 1977 \cite{Deisenhofer75}. This method is now widely used to tackle larger and more complex biological systems \cite{Groot01,Roux02} and has been facilitated by the development of fast and efficient methods for treating the long-range electrostatic interactions \cite{Essmann95}, the availability of faster parallel computers, and the continuous development of empirical molecular mechanical force fields \cite{Langley98,Cheatham99,Foloppe00}. It took several years until the first MD simulations of nucleic acid systems were performed \cite{Levitt83,Tidor83,Prabhakaran83,Nilsson86}. These investigations, which were also performed in vacuo, clearly demonstrated the importance of proper handling of electrostatics in a highly charged nucleic acid system, and different approaches, such as reduction of the phosphate charges and addition of hydrated counterions, have been applied to remedy this shortcoming and to maintain stable DNA structures. A few years later, the first MD simulation of a DNA molecule, including explicit water molecules and counterions was published \cite{Seibel85}. Various MD simulations on fully solvated RNA molecules with explicit inclusion of mobile ions indicated the importance of proper treatment of the environment of highly charged nucleic acids \cite{Lee95,Zichi95,Auffinger97,Auffinger99}. Given the central roles of RNA in the life of cells, it is important to understand the mechanism by which RNA forms three dimensional structures endowed with properties such as catalysis, ligand binding, and recognition of proteins. Furthermore, the increasing awareness of the essential role of RNA in controlling viral replication and in bacterial protein synthesis emphazises the potential of ribonucleicacids as targets for developing new antibacterial and new antiviral drugs. Driven by fruitful collaborations in the Sonderforschungsbereich RNA-Ligand interactions" the model RNA systems in this study include various RNA tetraloops and HIV-1 TAR RNA. For the latter system, the binding sites of heteroaromatic compounds have been studied employing automated docking calculations \cite{Goodsell90}. The results show that it is possible to use this tool to dock small rigid ligands to an RNA molecule, while large and flexible molecules are clearly problematic. The main part of this work is focused on MD simulations of RNA tetraloops.
The quinol:fumarate reductase (QFR) is the terminal reductase of anaerobic fumarate respiration, the most commonly occurring type of anaerobic respiration. This membrane protein complex couples the oxidation of menaquinol to menaquinone to the reduction of fumarate to succinate. The three-dimensional crystal structure of the QFR from Wolinella succinogenes has previoulsy been solved at 2.2 Å resolution. Although the diheme-containing QFR from W. succinogenes is known to catalyze an electroneutral process, structural and functional characterization of parental and variant enzymes has revealed active site locations which indicate electrogenic catalysis across the membrane. A solution to this apparent controversy was proposed with the so-called “Epathway hypothesis”. According to this, transmembrane electron transfer via the heme groups is strictly coupled to a parallel, compensatory transfer of protons via a transiently established pathway, which is inactive in the oxidized state of the enzyme. Proposed constituents of the E-pathway are the side chain of Glu C180, and the ring C propionate of the distal heme. Previous experimental evidence strongly supports such a role for the former constituent. One aim of this thesis is to investigate by a combination of specific 13C-heme propionate labeling and FTIR difference spectroscopy whether the ring C propionate of the distal heme is involved in redox-coupled proton transfer in the QFR from W. succinogenes. In addition to W. succinogenes, the primary structures of the QFR enzymes of two other e- proteobacteria are known. These are Campylobacter jejuni and Helicobacter pylori, which unlike W. succinogenes are human pathogens. The QFR from H. pylori has previously been established to be a potential drug target, and the same is likely for the QFR from C. jejuni. The two pathogenic species colonize mucosal surfaces causing several diseases. The possibility of studying these QFRs from these bacteria and creating more efficient drugs specifically active for this enzyme depends substantially on the availability of large amounts of high-quality protein. Further, biochemical and structural studies on QFR enzymes from e- proteobacteria species other than W. succinogenes can be valuable to enlighten new aspects or corroborate the current understanding of this class of membrane proteins.
Im ersten Teil dieser Studie wurde zunächst untersucht, welche Mechanismen für die akute und chronische Desensitivierung der glattmuskulären löslichen Guanylylcyclase (GC) gegenüber NO bei intakter Gefäßfunktion verantwortlich sind. Das Kontraktions- und Relaxationsverhalten von isolierten Rattenaorten im Organbad diente als Maß für die GC-Aktivität. Es wurden sowohl der Einfluß des endogen gebildeten NO als auch der Einfluß von exogen zugeführtem NO untersucht. Hierbei wurde ermittelt, ob die Sensitivitätsänderung der GC gegenüber NO direkt durch NO vermittelt wird oder ob eine gesteigerte cGMP-Bildung die indirekte Ursache für die Desensitivierung des Rezeptorproteins ist. Es konnte gezeigt werden, daß die Desensitivierung aufgrund der basalen NO-Freisetzung erfolgte. Wir konnten weiterhin zeigen, daß exogen zugeführtes NO die glatte Gefäßmuskulatur der Ratte gegenüber NO in gleichem Maße desensitiviert wie endogen gebildetes NO. Durch Untersuchungen mit dem Atrialen Natriuretischen Faktor konnten wir den Signaltransduktionsweg näher charakterisieren und zeigen, daß sehr wahrscheinlich eine gesteigerte cGMP-Bildung für die akute Desensitivierung der GC verantwortlich ist. Ergänzend führten wir Analysen über das Redoxgleichgewicht der GC durch. Hierzu wurden neu entwickelte selektive Aktivatoren der Eisen (III)-Form der GC - S973448 und HMR1766 (schwefelsubstituierte Sulfonylamino-carbonsäure-N-arylamide) - verwendet. Wir konnten in unseren Befunden zeigen, daß die akute Desensitivierung der GC durch physiologische Konzentrationen von NO nicht auf einer Oxidation des Hämeisens des Enzyms beruht. In Tiermodellen wurden die Auswirkungen einer chronischen Aktivierung der Eisen (II)-Form und der Eisen (III)-Form der GC auf die NO-Sensitivität, den Redoxstatus und die Proteinexpression der GC analysiert. Außerdem wurde untersucht, ob Aktivatoren der Häm- oxidierten GC bei chronischer in vivo Anwendung eine Toleranz induzieren. Hierbei wurde insbesondere die Frage berücksichtigt, inwieweit diese Substanzen langfristig in der Lage wären, organische Nitrate bei der Behandlung von Krankheitsbildern mit endothelialer Dysfunktion, wie z. B. Atherosklerose und Bluthochdruck, zu ersetzen. Wir konnten erstmals zeigen, daß die Aktivatoren der Eisen (III)-Form der GC wesentliche Vorteile gegenüber den organischen Nitraten aufweisen, da dieBehandlung der Ratten mit S973448 und HMR1766 weder über einen Zeitraum von drei Tagen noch über vier Wochen zu einer Wirkungsabschwächung dieser Substanzen (Eigentoleranz) führt. Auch gegenüber organischen Nitraten sowie endogenem NO (Kreuztoleranz) konnten wir trotz der chronischen Aktivierung der Häm-oxidierten GC keinen Wirkungsverlust dieser Pharmaka beobachten. Expressionsänderungen der GC konnten wir ebenfalls nicht feststellen. Es ist daher anzunehmen, daß die neuen, selektiven Aktivatoren günstigere Eigenschaften als die bisher verwendeten organischen Nitrate aufweisen und therapeutisch zur Behandlung der genannten Herz- Kreislauf- Erkrankungen geeignet sind. Im zweiten Teil der Arbeit untersuchten wir in Tiermodellen mit einer experimentell induzierten Störung der Funktion des glatten Gefäßmuskels, ob die chronische Aktivierung der Eisen (II)-Form der GC zu einer Veränderung der NO-Empfindlichkeit, des Oxidationsstatus des Enzyms und der Expression der GC-Untereinheiten a (alpha) 1 und ß(beta) 1 führt. Wir konnten im Tiermodell der nitrattoleranten Ratte sowohl eine Toleranz gegenüber Nitroglycerol als auch gegenüber endothelabhänigen Dilatatoren und - wenn auch nicht so ausgeprägt - gegenüber Natriumnitroprussid (Kreuztoleranz) beobachten. Einen Wirkungsverlust gegenüber den Aktivatoren der Eisen (III)-Form der GC konnten wir nicht feststellen. Weiterhin zeigten wir, daß die chronische Aktivierung des Renin-Angiotensin-Systems zu einer gesteigerten Superoxidbildung führt, die wiederum eine verminderte Bioverfügbarkeit von NO bewirkt. Dies führt zu einer kompensatorisch gesteigerten Expression der GC-Untereinheiten ( a(alpha) 1 / ß (beta) 1 ) in nitrattoleranten Rattten. Im Tiermodell der genetisch salzsensitiven Dahl-S-Ratte konnten wir nachweisen, daß die durch den renalen Bluthochdruck hervorgerufene Gefäßdysfunktion in den Rattenaorten zu einer Abnahme der Sensitivität gegenüber Acetylcholin und Natriumnitroprussid sowie dem NO- unabhängigen, direkten Aktivator der GC, YC-1, führt. Auch war die Expression beider GC-Untereinheiten in den Aorten der hypertensiven Ratten vermindert.
Der Glycinrezeptor (GlyR) ist ein inhibitorischer Chloridkanal, der u.a. im Rückenmark, im Hirnstamm und in der Retina exprimiert wird und dort maßgeblich an der Prozessierung von motorischen und/oder sensorischen Signalen beteiligt ist. Als Mitglied der Superfamilie der nikotinischen Acetylcholinrezeptoren ist der GlyR ein Pentamer, dessen Untereinheiten jeweils aus einer extrazellulären N-terminalen Domäne, vier Transmembranregionen und einer großen intrazellulären Schleife bestehen. Bislang wurden vier ligandenbindende alpha-Untereinheiten (alpha 1-4) und eine für die synaptische Verankerung verantwortliche beta-Untereinheit identifiziert. Die beta-Untereinheit bildet im Gegensatz zu den alpha-Untereinheiten keine Homooligomere; sie ist nur in heterooligomeren GlyRs mit einer bisher angenommenen Stöchiometrie von 3alpha:2beta zu finden. Wie bei allen Mitgliedern der Superfamilie erfolgt die Ligandenbindung innerhalb der extrazellulären Domänen an der Kontaktstelle zwischen zwei benachbarten Untereinheiten. Um den Mechanismus der Ligandenbindung am homo- und heterooligomeren GlyR in dieser Arbeit aufzuklären, wurden Modelle der N-terminalen Domänen der alpha1- und beta-Untereinheiten basierend auf der Kristallstruktur des Acetylcholin-Bindeproteins generiert. Zur Verifizierung der Rolle aller im Modell in der Bindungstasche lokalisierten Aminosäureseitenketten wurden diese durch zielgerichtete PCR-Mutagenese substituiert, anschließend die mutierten Untereinheiten in Xenopus laevis Oozyten exprimiert und elektrophysiologisch charakterisiert. So konnten die wichtigsten Seitenketten der alpha1-Ligandenbindungstasche identifiziert werden, die an der Bindung der Agonisten Glycin und Taurin, des Antagonisten Strychnin und des Modulators 3alpha-(3’-Methoxybenzoyloxy)nortropan beteiligt sind. Die anschließende Untersuchung des heterooligomeren alpha1beta-GlyRs konnte zum ersten Mal eine direkte Beteiligung der beta-Untereinheit an der Ligandenbindung aufzeigen, wobei die Stabilisierung der Liganden in der Bindungstasche mit den zur alpha1-Untereinheit homologen Resten erfolgt. Zusätzlich ergab ein Vergleich der Affinitätsveränderungen nach Substitution homologer Reste in der alpha1- und der beta-Untereinheit Hinweise auf eine neue Stöchiometrie heterooligomerer GlyRs. Nur die Koexpression einer alpah1beta-Tandemuntereinheit mit der beta-Untereinheit resultierte in einem Rezeptor mit den gleichen pharmakologischen Eigenschaften wie der heterooligomere Wildtyp-GlyR. Dieses Ergebnis bestätigte die neue 2alpha:3beta Stöchiometrie heterooligomerer GlyRs. Damit wurde in dieser Arbeit eine dominante Rolle der beta-Untereinheit in heterooligomeren GlyRs aufgezeigt, welche für das Verständnis der synaptischen Verankerung und insbesondere der Pharmakologie des Rezeptors wichtig ist. Mit der neuen Stöchiometrie wurde gleichzeitig eine neue betabeta-Kontaktstelle in heterooligomeren GlyRs identifiziert, die als Wirkungsort neuer Therapeutika genutzt werden könnte.
Das bioanalytische Arbeiten mit integralen Membranproteinen ist aufgrund der hohen Hydrophobizität dieser Proteine stark eingeschränkt. Allgemein anwendbare Arbeitsvorschriften für die Analyse mittels Gelelektrophorese und Massenspektrometrie lassen sich für diese besonderen Proteine bislang nicht angeben. Infolge ihrer Schwerlöslichkeit in typischen wäßrigen Lösungsmittelsystemen erfordert die Isolierung von integralen Membranproteinen stets den Einsatz von Detergentien und häufig eine individuelle Anpassung der Solubilisierungsprotokolle. Hydrophobe Membranproteine mit einer hohen Anzahl an Transmembran-Helices und somit einem hohen Gravy-Score können unter den Bedingungen der für die Proteomanalyse eingesetzten zweidimensionalen IEF/SDS-Gelelektrophorese häufig nicht aufgetrennt werden. Ihre hohe Aggregationsneigung und die Inkompatibilität zu den Lösungsmittelsystemen der isoelektrischen Fokussierung sind unter anderem der Grund, weshalb Membranproteine bei der Gesamtstatistik von Proteomanalysen häufig unterrepräsentiert sind. Neben den Limitierungen bei der gelelektrophoretischen Auftrennung stellen Membranproteine auch für die massenspektrometrische Analyse und Identifizierung eine besondere Herausforderung dar. Hohe Sequenzabdeckungen und damit eindeutige Datenbankidentifizierungen, wie sie nach einem enzymatischen Verdau von wasserlöslichen Proteinen häufig erreichbar sind, werden bei Membranproteinen in der Regel nicht beobachtet. Insbesondere integrale Membranproteine mit einem hohen Anteil an Transmembran-Helices haben häufig nur wenige Schnittstellen für die routinemäßig eingesetzte Protease Trypsin; dies führt zu wenigen und großen Peptiden, die darüber hinaus in den verwendeten Lösungsmittelsystemen schwerlöslich sind. Verstärkt wirkt sich dieses Problem bei kleinen Membranproteinen aus. Oftmals erlaubt nur der Einsatz von Fragmentierungstechniken der Massenspektrometrie die Identifizierung eines solchen Proteins anhand eines oder zweier Peptide. Ziel der vorliegenden Arbeit ist es deshalb, durch die Entwicklung und Etablierung von neuen Protokollen und Methoden eine verbesserte gelelektrophoretische Trennung und massenspektrometrische Identifizierung dieser besonderen Proteine zu erreichen.
Mit kombinatorisch-chemischer Synthese und einem Gel-shift Test wurden niedermolekulare, peptidische RNA-Liganden gefunden. Als Target-Moleküle dienten ein 23mer RNA-Oligonukleotid (CETP-RNA) aus der Cholesterol Ester Transfer Protein mRNA und ein 27mer RNA-Oligonukleotid aus der HIV-1 Transactivation response region (TAR) RNA (delta-TAR-RNA). Zudem wurde erstmals die Methode des Phage Display angewendet, um RNA-Liganden zu finden. Die aus beiden Screeningmethoden erhaltenen Liganden wurden mit verschiedenen biophysikalischen Methoden, insbesonders der NMR-Spektroskopie auf ihre Bindungseigenschaften und mittels in vitro und in vivo-Tests auf ihre physiologische Aktivität hin untersucht. Ein 16mer Peptid der Antennapedia Homeodomäne internalisiert rasch in Zellen verschiedener Kulturen. Im Screening gefundene Peptidliganden wurde über flexible Spacer (2 beta-Ala-Einheiten) mit diesen 16mer synthetisiert. Es wurde gezeigt, daß diese Peptide so in die Zielzellen und besonders in deren Zellkern gelangen. Basische delta-TAR-RNA-Liganden zeigen diese Verhalten auch ohne Transportersequenz. Die Ergebnisse des Phage-Display-Screenings sind widersprüchlich, da die so gefundenen RNA-Liganden mit den genutzen biophysikalischen Methoden (NMR, CD, Gelelektrophorese) keine größere Affinität an die delta-TAR-RNA zeigen. Im physiologischen Test haben diese Liganden dennoch eine HIV-1 inhibitorische Aktivität gezeigt. In einer humanen Makrophagenkultur, der Wirtszelle von HIV, wurden mit den Peptiden Thr-Pro- Glu-Leu-Pro-Trp-His-NH2 und Phe-His-Ser-Val-Gln-Ala-Leu das HIV-1 Wachstum um 20- 30% inhibiert. Diese Ergebnisse widersprechen den strukturellen Bindungsinfornmationen und sind deshalb fraglich. Ein Monitoring während der Panning-Prozedur wurde nicht durchgeführt. Es wurde auch nicht überprüft, wieviel RNA wirklich immobilisiert wurde. Aufgrund der sehr geringen Substanzmengen was das nicht möglich. In einem deutlich größerem Maßstab, könnten in Zukunft strukturelle Informationen über die immobilisierte RNA gewonnen werden, z. B. mit HR-MAS-NMR-Techniken. Die im Gel-shift-Screening gefundenen delta-TAR-RNA-Liganden des Gel-shift-Screening zeigen keine HIV-1 inhibitorische Aktivität. Die gefundenen Bindungskonstanten sind allerdings um eine Größenordnung kleiner als die der natürliche Bindungsregion Tat10, welche eine HIV-1 inhibitorische Wirkung besitzt. Die im Gel-Shift-Screening gefundenen CETP-RNA/Peptid-Paare mit den stärksten Affinitäten wurden mittels NMR-Spektroskopie und CD- und Gel-shift-Experimenten charakterisiert. Die Bindungskonstanten lagen im niedrig mikromolaren Bereich. Wie in 1D Jump Return-Experimenten gezeigt wurde, verschoben sich die Signale verschiedener Liganden in Gegenwart der CETP-RNA unterschiedlich stark. Zudem konnte eine Verbreiterung der Signale der Liganden festgestellt werden. Das Peptid Lys-Tyr-Lys-Leu- Tyr-Lys-Cys-NH2 zeigte bei der CETP-RNA den stärksten Effekt mit Bindungsaffinitäten von Kd = 32±2 mikro-M (CD-Titration). In 2D NOESY Experimenten zeigt der Peptid-Ligand Kreuz-Signale zu den Iminoprotonen der CETP-RNA. Da die Sekundärstruktur der CETPRNA ein Hairpin ist, sollte das Peptid somit Kontakt zu der Doppelstrang-Region haben. Dieses Peptid zeigt zudem einen deutlichen Effekt auf das CD-Verhalten seiner CETP-RNA. Offenbar wird die Basenpaarung der Sekundärstruktur unter Peptideinfluß geschwächt. Im physiologischem Test am Tiermodell einer transgenen Maus zeigt dieser Ligand eine Erniedrigung des Cholesterolester Transfers. In Zukunft könnte das Peptid Lys-Tyr-Lys-Leu- Tyr-Lys-Cys-NH2 mit z. B. unnatürlichen Aminosäuren modifiziert werden, um eine bessere physiologische Stabilität zu erhalten und dadurch möglicherweise die physiologische Aktivität zu erhöhen. Auch eine Leitstrukturoptimierung kann durchgeführt werden.
Prion diseases, also called transmissible spongiform encephalopathies, are a group of fatal neurodegenerative conditions that affect humans and a wide variety of animals. To date there is no therapeutic or prophylactic approach against prion diseases available. The causative infectious agent is the prion, also termed PrPSc, which is a pathological conformer of a cellular protein named prion protein PrPc. Prions are thought to multiply upon conversion of PrPc to PrPSc in a self-propagating manner. Immunotherapeutic strategies directed against PrPc represent a possible approach in preventing or curing prion diseases. Accordingly, it was already shown in animal models, that passive immunization delays the onset of prion diseases. The present thesis aimed at the development of a candidate vaccine towards the active immunization against prion diseases, an immune response, which has to be accompanied by the circumvention of host tolerance to the self-antigen PrPc. The vaccine development was approached using virus-like particles (retroparticles) derived from either the murine leukemia (MLV) or the human immunodeficiency virus (HIV). The display of PrP on the surface of such particles was addressed for both the cellular and the pathogenic form of PrP. The display of PrPc was achieved by either fusion to the transmembrane domain of the platelet derived growth factor receptor (PDGFR) or to the N-terminal part of the viral envelope protein (Env). In both cases, the corresponding PrPD- and PrPE-retroparticles were successfully produced and analyzed via immune fluorescence, Western Blot analysis, immunogold electron microscopy as well as by ELISA methods. Both, PrPD- and PrPE-retroparticles showed effective incorporation of N-terminally truncated forms of PrPc but not for the complete protein. PrPc at this revealed the typical glycosylation pattern, which was specifically removed by a glycosidase enzyme. Upon display of PrPc on retroparticles the protein remained detectable by PrP-specific antibodies under native conditions. Electron microscopy analysis of PrPc-variants revealed no alteration of the characteristic retroviral morphology of the generated particles. MLV-derived PrPD-retroparticles were successfully used in immunization studies. Contrary to approaches using bacterially expressed PrPc, the immunization of mice resulted in a specific antibody response. The display of the pathogenic isoform was aimed by two different strategies. The first one was directed at the conversion of the proteinase K (PK) sensitive from of PrP on the surface of PrPD-retroparticles into the PK resistant form. Albeit specific adaption of the PK digestion assay detecting resistant PrP, no PrP conversion was observed for PrPD-retroparticles. The second approach utilized a replication competent variant of the ecotropic MLV displaying PrPc on the viral Env protein. This MLV variant was stable in cell culture for six passages but did not replicate on scrapie-infected, PrPSc-propagating neuroblastoma cells. Thus, besides PrPc-displaying virus-like particles a replication competent MLV variant was obtained, which stably incorporated PrPc at the N-terminus of the viral Env protein. The incorporation of the cell-surface located PrPc into particles was expected from previously obtained data on protein display in the context of retrovirus-derived particles. Thus, the lack of incorporation observed for the complete PrPc sequence was rather unexpected and was found to be inhibited at both, fusion to PDGFR and the viral Env. In contrast to N-terminally truncated PrPc, the complete PrPc was shown to exhibit increased cell surface internalization rates and half-life times eventually contributing to the observed results. The PrP-vaccination approach described in this work represents the first successful system inducing PrP-specific antibody responses against the prion protein in wt mice. Explanations at this are based on the induction of specific T cell help or effects of the innate immunity, respectively. MLV-and HIV-derived particles bearing the PrP-coding sequence or being replication competent variants generated during this thesis might help to further improve the PrP-specific immune response.
Tunikaten produzieren eine Vielzahl an cytotoxischen und antimikrobiellen Verbindungen, die ihnen in ihrem Ökosystem zu überlebenswichtigen Vorteilen verhelfen. Wegen ihrer strukturellen Diversität und ihrer spezifischen Eigenschaften haben bislang einige dieser Sekundärstoffe Eingang in die pharmazeutische Industrie gefunden. Ziel der vorliegenden Arbeit war eine umfassende Untersuchung des chemischen Potentials benthischer Ascidien der Nordsee. Die Eigenschaften der organischen Ascidienextrakte wurden anhand von vier Bioassays beschrieben. Die Assays fungierten gleichzeitig als Wegweiser zur Isolierung der aktiven Sekundärmetaboliten, der sich eine Strukturaufklärung mit spektroskopischen Methoden (NMR, MS, IR) anschloss. Es wurden Tests auf bewuchshemmende, antimikrobielle, cytotoxische und enzymhemmende Eigenschaften durchgeführt. Eingesetzt wurden organische Extrakte von 13 solitären und koloniebildenden Ascidienarten der nördlichen und südlichen Nordsee. In allen vier Assays zeigten mehrere oder alle Ascidienarten Aktivität. Es ließen sich keine Hinweise auf eine mit der Wuchsform der Arten korrelierte biologische Aktivität sammeln. In einem Freilandversuch zur Untersuchung der besiedlungshemmenden Wirkung der Extrakte konnte gezeigt werden, dass einige Ascidien eine chemische Abwehr von Algensporen oder Epibionten aufweisen, die artspezifisch unterschiedlich stark ausgeprägt ist. Alle Ascidienarten bewiesen antimikrobielle Aktivität, es ergaben sich aber sowohl in der Hemmhofbreite als auch in der Anzahl der gehemmten Bakterienstämme große artspezifische Unterschiede. Auffallend war, dass deutlich mehr Gram-positive sowie marine Bakterienstämme als Gram-negative bzw. nicht-marine Bakterienstämme inhibiert wurden. Im Gegensatz zur antimikrobiellen Aktivität wurden in den Assays zur Cytotoxizität und zur spezifischen Enzymhemmung lediglich bei jeweils vier Ascidienarten positive Effekte festgestellt. Durch die spezifische Anfärbung von Zellorganellen konnten morphologische Veränderungen, die durch die Ascidienmetaboliten in den Mausfibroblasten induziert wurden, sichtbar gemacht und der Einfluß der Extrakte auf das Cytoskelett und spezifische Zellfunktionen dokumentiert werden. Im Protein-Tyrosin-Kinase-Assay führte eine Bioassay-guided Fractionation von Extrakten der Ascidie Dendrodoa grossularia zur Isolierung der aktiven Substanz. Über spektroskopische Methoden sowie den Vergleich mit Literaturdaten konnte der enzymhemmende Metabolit als das Guanidinostyren Tubastrin identifiziert werden. Tubastrin wurde im Rahmen dieser Arbeit erstmals in Tunikaten nachgewiesen. Der Metabolit zeigte als Reinsubstanz nur geringe cytotoxische Effekte und keine antimikrobiellen Eigenschaften. Als weitere Metaboliten der Ascidien Dendrodoa grossularia und Ascidiella aspersa wurden Homarin, Betain, Adenosin und Inosin identifiziert. Keiner dieser Substanzen konnte in der vorliegenden Arbeit eine biologische Aktivität zugeordnet werden. Während Betain, Adenosin und Inosin Funktionen innerhalb des Primärmetabolismus besitzen oder als Zwischenprodukte in Synthesewege eingebunden sein können, stellt Homarin einen Sekundärmetaboliten dar, der in einer Vielzahl von marinen Organismen unterschiedliche Funktionen erfüllt. Seine Aufgabe in Tunikaten muss durch weitere Untersuchungen geklärt werden. Dass antimikrobielle Aktivität bei allen Ascidienarten gefunden wird, lässt auf eine grundlegende Bedeutung prokaryontischer Abwehr schließen. Die Unterschiede in der Stärke der Effekte aller Bioassays legen nahe, dass jede Ascidienart eine eigene Gesamtstrategie zur Verteidigung gegen Bewuchs und Fraßfeinde ausgebildet hat. Die aus den Laborversuchen erhaltenen Daten verdeutlichen eine weitreichende biologisch-chemische Aktivität von Aplidium punctum, Dendrodoa grossularia und Didemnum candidum, die neben der antimikrobiellen auch starke cytotoxische und/oder enzymhemmende Wirkung gezeigt haben. Die Lokalisation der aktiven Substanzen im Tier sowie eingehendere Versuche zur molekularen Wirkungsweise sind notwendig, die beobachteten Aktivitäten umfassend zu deuten und ihre Nutzbarkeit unter pharmakologischen Gesichtspunkten zu evaluieren.
Auxiliar-vermittelte Synthese von nicht-natürlichen Aminosäuren als Bausteine für RNA-Liganden
(2005)
In den letzten Jahren wurde deutlich, daß mRNAs regulatorische Elemente aufweisen.Ein Beispiel hierfür ist z. B. die Transkription des Human Immunodeficiency Virus Typ1 (HIV-1). Die Arginin-reiche Domäne des Tat-Proteins interagiert hierbei mit einer Bindungstelle innerhalb der Bulge-Region der TAR-RNA. Das Vorliegen des hochkonservierten Tat-TAR-Komplexes ist die Voraussetzung für die effiziente Transkription viraler Gene. Eine kompetitive Bindung synthetischer Liganden an die Bulge-Region sollte daher den viralen Vermehrungszyklus unterbrechen. Hochspezifische Liganden mit inhibitorischem Potential sind somit von größtem Interesse. Für eine hohe Liganden-Affinität sind neben ionischen Wechselwirkungen und HBrücken-Interaktionen vor allem auch Stapelwechselwirkungen (stacking) von entscheidender Bedeutung. Die Ligandensuche wurde auf Tripeptide fokussiert. Da die Anzahl natürlich vorkommender aromatischer Aminosäuren sehr limitiert ist,erfolgte im Rahmen dieser Arbeit zunächst eine stereoselektive Synthese von neuen,nicht-natürlichen Aminosäuren mit heteroaromatischen Seitenketten. Um den generellen Einsatz dieser Bausteine in kombinatorischen Bibliotheken zu demonstrieren,wurden zunächst Tripeptide des Musters Arg-X-Arg hergestellt. Bereits diese Tripeptide zeigten in einem Fluoreszenz-Assay inhibierende Effekte auf den Tat- TAR-Komplex von HIV-1 mit IC50-Werten von 2 - 80 µM. Diese vielversprechenden Liganden wiesen auch in einem Tat-TAR kontrollierten Reportergen-Assay stark inhibierende Wirkung in den Zellkulturen auf. Am Beispiel eines Peptides ließ sich mittels NMR-Spektroskopie eine Komplexkonformation bestimmen, die der des bekannten TAR-Argininamid-Komplexes entspricht. Durch den Einsatz von nichtnatürlichen und Standard-Aminosäuren in kombinatorischen Tripeptidbibliotheken (split and combine-Methode) konnte die Suche von potentiellen Peptid-Liganden um ein Vielfaches erweitert werden. Über ein on-bead-Screening ließen sich weitere vielversprechende TAR-bindende Tripeptide identifizieren. Die RNA-Ligandensuche wurde desweiteren auf die psi-RNA (HIV-1) und auf die mRNA des onkogenen bcr-abl Proteins ausgeweitet. Auch hier konnten einige RNA-bindende Tripeptide isoliert werden.
Synthese von modifizierten Nukleotiden und modifizierten Oligodesoxynukleotiden zur DNA-Analytik
(2004)
1.) Entwicklung eines Verfahrens zum Nachweis von Wechselwirkungen zwischen Sondenmolekülen und Targetmolekülen auf einem Sonden-Array Innerhalb des Projektes sollte ein Verfahren entwickelt werden, dass zum Nachweis von Wechselwirkungen zwischen Sondenmolekülen und Targetmolekülen auf Sonden-Arrays genutzt werden kann. Der prinzipielle Aufbau dieses Testsystems wird in der vorliegenden Arbeit beschrieben. Einer der entscheidenden Schritte zur Entwicklung dieses Verfahrens, ist die Einführung einer selektiv spaltbaren Bindung innerhalb der DNA. Die von uns hierfür präferierte Bindung ist die 5´-O-P-S-3´ Bindung. Das erste zu realisierende Ziel bestand damit in der Synthese der entsprechend 5´-Thio-modifizierten Amidite. Die Synthese von 4,4´-Dimethoxytriphenylmethanthiol, als alternative Schwefel-Quelle und gleichzeitig temporäre 5´-Schutzgruppe stellt den Schlüsselschritt der erfolgreichen Synthese dar. Mit Hilfe dieser Strategie gelingt es, die entsprechend benötigten modifizierten Amidite in zufriedenstellender Ausbeute herzustellen. Durch die Anwendung eines modifizierten Synthesezyklus ist die Synthese eines entsprechend Schwefel-modifizierten Modelloligodesoynukleotids möglich. Mit Hilfe dieser Verbindung wurde die erwünschte Spaltung der 5´-O-P-S-3´ Bindung mit Silbernitrat in Lösung und an verschiedenen Oberflächen (Chip, Biacore-Chip und Magnetic Beads) untersucht. 2.) Punktmutationsdetektion durch festphasenvermittelte Single Nucleotide Primer Extension (SNuPE) und MALDI-MS Ziel dieses Projektes war die Entwicklung eines neuen, elektrophoresefreien Verfahrens zur Detektion von bekannten Punktmutationen mittels fester Phase und der MALDI-Massenspektrometrie. Hierfür wird zunächst ein synthetisches Oligodesoxynukleotid, welches später als Primer fungiert, über einen photolytisch spaltbaren Linker an eine feste Phase gebunden. Dessen Oligodesoxynukleotid-Sequenz wird dabei so ausgewählt, daß sie komplementär zur Zielsequenz einer mutierten DNA ist und direkt vor der zu detektierenden Punktmutation endet. Durch eine enzymatische Polymerasereaktion wird der Primer dann um eine Base, die entweder komplementär zur korrekten DNA oder zur Mutation ist, verlängert. Das Reaktionsprodukt kann dann direkt mittels MALDI-MS photolytisch von der festen Phase getrennt und analysiert werden. Die Masse des Reaktionsproduktes ist festgelegt durch den erfolgten Einbau einer von vier Nukleobasen und gibt daher unmittelbar Auskunft über das Vorhandensein einer Punktmutation. Zunächst sollte die prinzipielle Durchführbarkeit des Projekts erarbeitet werden. Wesentliche Vorteile dieser neuen Methode im Vergleich zu bestehenden Verfahren wären der außerordentlich geringe Zeitaufwand und die unmittelbare Detektion ohne Label. Das hier entwickelte Konstrukt gestaltete sich allerdings für die Anwendung als ein Standardanalyseverfahren zu komplex, da für die Detektion von Punktmutationen aussagekräftigere und einfachere Verfahren bereits zur Verfügung stehen, der hier beobachtete Spaltungs-mechanismus wirft jedoch einige Fragen auf. Für einen Einsatz als photolabiles Trägermaterial ist dieses Konstrukt jedoch ebenfalls zu kompliziert. 3.) Verknüpfungsreaktionen von Acetal-geschützten Oligodesoxynukleotiden mit Hydrazin-modifizierten Derivaten Die effektive Konjugation von modifizierten Oligodesoxynukleotiden und Hydrazin-Derivaten durch die Verwendung einer 5´-Acetalfunktion konnte hier durch die Verwendung eines aromatischen Phosphitylierungsreagenz gezeigt werden. Das hergestellte 5´-Acetal-modifizierte Oligodesoxynukleotid fungiert hier als ein maskiertes 5´-Aldehyd. Der Einsatz des maskierten Acetals weist gegenüber dem reaktiven Aldehyd-Derivat mehrere Vorteile auf: es ist lagerstabil, gut handhabbar und stabil gegenüber den Bedingungen der Oligodesoxynukleotid-Synthese. Ein aromatisches Acetal-geschützte Oligodesoxynukleotid kann in einer Eintopfreaktion mit einem entsprechenden Hydrazin-Derivat umgesetzt werden. Das verwendete Hydrazin-Derivat muß jedoch als Hydrochlorid oder als Trifluoracetat eingesetzt werden. Die Reaktion erfolgt in wässriger methanolischer Lösung durch den Zusatz von Natriumacetat, dieses katalysiert die Reaktion. Durch den Einsatz von Methanol als Lösungsmittel kann der Reaktionsansatz direkt mit Hilfe der HPL-Chromatographie gereinigt werden. Die Umsetzung des Acetal-modifizierten Oligodesoxynukleotids wurde mit verschiedenen Hydrazinen durchgeführt. Die mit den Hydrazinen erreichten Ausbeuten übersteigen bei weitem (Ausnahme Biotin) die der entsprechenden Aktivester. Vorallem das Arbeiten in wässriger Lösung erleichtert die Synthese und die Aufreinigung. Hiermit steht eine 5´-Modifikation zur Verfügung, die eine Konjugation mit Hydrazin-Derivaten in sehr guten Ausbeuten ermöglicht.
Die chemische Analyse von 17 abundanten Nordseeschwammarten zeigte, dass die Metabolitenzusammensetzung und -konzentration standortbedingt nur geringfügig schwanken. Den Großteil der Schwammmetaboliten bilden mittelpolare bis polare Substanzen ohne UV-Absorption. Allgemein scheinen in Nordseeschwämmen aromatische und olefinische Verbindungen seltener vorzukommen als in tropischen Arten. Die Chemie der einzelnen Nordseeschwämme ist oft ähnlich und wird von kleinen, stickstoffhaltigen Molekülen dominiert. Ubiquitär verbreitete, vermutlich phylogenetisch alte Substanzen wie Inosin, Allantoin, Homarin und Trigonellin wurden in zahlreichen untersuchten Arten nachgewiesen. Trigonellin und Homarin üben, wie für andere marine Organismen bereits dokumentiert, auch in den Nordseeschwämmen Schutzfunktion gegen Konkurrenten und Fouling-Organismen aus. Die identifizierten Verbindungen weisen darauf hin, dass den mit dem Aminosäure- und Purinstoffwechsel verbundenen Biosynthesewegen eine große Bedeutung in der Naturstoffsynthese der untersuchten Schwammarten zukommt. Diese Vermutung wird dadurch untermauert, dass auch die Bildung von Imidazolen (aus Phakellia ventilabrum isoliert) aus Histidin eng mit dem Purinstoffwechsel verbunden ist. Durch den Abbau von Histidin können wiederum Substanzen entstehen, die als Methyldonatoren in Frage kommen (methylierte Verbindungen, vgl. Pachymatisma johnstonia). Biologische Aktivität wurde anhand von Biotests zur antilarvalen, cytotoxischen, antibakteriellen, enzyminhibitorischen und bewuchshemmenden Wirkung in Extrakten der untersuchten Nordseeschwämme nachgewiesen. Dabei zeigten alle Schwammarten Effekte in mehr als einem Biotest. Diese Untersuchungen bestätigen das Vorkommen biologisch aktiver Substanzen in Schwämmen kaltgemäßigter Habitate und widerlegen damit die Latitudinalhypothese. Unabhängig von der geographischen Breite sind Schwämme weltweit einem selektiven Druck ausgesetzt, der die Entwicklung biologisch aktiver Metaboliten begünstigt. Die Art der Selektionsfaktoren scheint jedoch habitatbedingt unterschiedlich zu sein. Während in wärmeren Gewässern vor allem Prädatoren (Fische) das Überleben der Schwämme beeinflussen, sind in kälteren Gebieten Aufwuchsorganismen und Bakterien von entscheidender Bedeutung. Diese Annahme wird durch die Beobachtung der assoziierten Organismen ebenso unterstützt, wie durch die Tatsache, dass in allen untersuchten Nordseeschwammarten (Esperiopsis fucorum, Phakellia ventilabrum, Leucosolenia complicata, Cliona celata, Pachymatisma johnstonia) Bakterien nachgewiesen werden konnten. Neben den ökologischen Beobachtungen bekräftigt auch die starke antibakterielle Wirkung der Schwammmetaboliten diese Hypothese. Während Toxizität seltener beobachtet wurde, zeigten viele Schwämme auch enzyminhibitorische Wirkung. Zusammenhänge zwischen biologischer Aktivität und morphologischen bzw. taxonomischen Kriterien, Lebensweise, Habitatcharakteristika oder assoziierten Organismen waren nicht durch Clusteranalysen aufzudecken. Es konnten jedoch Unterschiede im Metabolitengehalt und der Art der assoziierten Organismen zwischen langlebigen, großen Kieselschwammarten und kleineren, saisonal wachsenden Kalkschwämmen hervorgehoben werden. Leucosolenia compl icata (Calcarea) ist sowohl qualitativ als auch quantitativ relativ metabolitenarm, biologisch sehr aktiv und mit einer großen Zahl an Bakterien assoziiert. Die Mikroorganismen scheinen für diese Art von größerer Bedeutung zu sein als bei den untersuchten Demospongiae. Einige Kieselschwämme (z.B. Cliona celata, Phakellia ventilabrum) sind besonders metabolitenreich, enthalten weniger Bakterien und verfügen ebenfalls über biologisch aktive Substanzen. Um diese Beobachtungen in einem ökologischen Zusammenhang zu sehen, sind eingehendere Studien, wie sie mit Pachymatisma johnstonia durchgeführt wurden, notwendig. Die Isolierung der Hauptmetaboliten von Pachymatisma johnstonia führte zur Identifizierung der methylierten Substanzen Betain, N,N,N-Trimethyl-ß-alanin, L-6-Bromohypaphorin und dem Pyridinalkaloid Trigonellin. Anhand verschiedener biologischer Tests konnte ein Einblick in die Wirkungsweise und Funktion der aktiven Metaboliten gewonnen werden. Die Aminosäure L-6-Bromohypaphorin und eine noch nicht identifizierte Substanz zeigten starke Enzyminhibition gegenüber einer Protein-Tyrosin-Kinase. L-6-Bromohypaphorin wurde im Pinacoderm unbewachsener Individuen in einer höheren Konzentration nachgewiesen als in Schwämmen mit Bryozoenbewuchs, und spielt demnach vermutlich bei der Abwehr von Fouling-Organismen eine Rolle. Bakterien wurden als Produzenten der aktiven Substanzen ausgeschlossen. Eine Abgabe der Metaboliten nach außen ist eher unwahrscheinlich. Die Extrakte von P. johnstonia zeigten starke antibakterielle Wirkung mit einer Breitbandaktivität, vor allem gegen marine Bakterien. Welche Substanzen für diese Effekte verantwortlich sind, ist nicht bekannt. Eine Hälterung von P. johnstonia war möglich. Ebenso wie Cliona celata passte sich der Schwamm an veränderte abiotische und biotische Faktoren an. Verletztes Gewebe wurde regeneriert und Hauptmetaboliten weiter produziert. Die Synthesetätigkeit von P. johnstonia schwankte, die biologische Aktivität blieb über neun Monate hinweg erhalten. Durch eine Optimierung der Hälterungsbedingungen könnte die Naturstoffproduktion vermutlich konstant gehalten werden. Mit P. johnstonia wurde somit ein gutes Beispiel für die Interaktion zwischen Naturstoffchemie, Ökologie und pharmakologischem Potential bzw. biotechnologischer Nutzbarkeit geliefert. Bedingt durch das Ziel der Arbeit, einen Überblick über die Chemie und biologische Aktivität der Nordseeschwämme zu gewinnen, wurde weniger Augenmerk auf die Isolierung neuer Strukturen gelegt. Im Zuge von intensiveren Studien wäre eine Optimierung der chemischen Methodik anzustreben. Die Aufklärung der in geringerer Konzentration vorkommenden Substanzen könnte hilfreich sein, um den ersten Eindruck der Metabolitenzusammensetzung zu überprüfen. Außerdem wird aufgrund der Biotestergebnisse die Existenz zahlreicher biologisch aktiver Substanzen, vor allem antibiotischer Wirkstoffe, vermutet, deren Isolierung eine Herausforderung darstellt. Besonders interessant ist in diesem Zusammenhang auch die Tatsache, dass bisher sämtliche medizinisch genutzten Antibiotika aus Mikroorganismen stammen, Schwämme aber weltweit über ein hohes antibiotisches Potential verfügen. Dadurch stellt sich erneut die Frage, ob Schwämme tatsächlich selbst in der Lage sind, wirksame Substanzen zu produzieren. Diese Ungewissheit zusammen mit der Tatsache, dass alle aus den Nordseeschwämmen isolierten und identifizierten Verbindungen aus Stoffwechselwegen stammen, die bisher als für Mikroorganismen typisch beschrieben wurden, bietet interessante Ansatzmöglichkeiten für weitere Untersuchungen. Auch wenn Schwämme zu den am besten untersuchten Organismen in der marinen Naturstoffchemie zählen, ist das Wissen im Bereich der chemischen Ökologie noch begrenzt. Um mehr über die Beziehung zwischen Schwämmen und ihrer belebten Umwelt zu erfahren und die Rolle der Naturstoffe dabei aufzudecken, müssen geeignete Untersuchungsmethoden bzw. Biotests etabliert werden. Abbildung 4.1 soll die Bedeutung der Schwämme für ihren Lebensraum und den Menschen hervorheben und die komplexen Zusammenhänge, welche durch die Wirkung der Naturstoffe vermittelt werden, verdeutlichen. Häufig werden Schwämme als primitive Organismen beschrieben, da sie sich durch das Fehlen eines Nervensystems und anderer Organe von höheren Tieren unterscheiden. Tatsächlich sind diese Lebewesen aber hochentwickelte Spezialisten. Optimal an eine sessile Lebensweise angepasst, bewohnen sie seit Millionen von Jahren erfolgreich vor allem marine Habitate in großer Artendiversität und Abundanz. Aufgrund der Produktion von aktiven Metaboliten zur Abwehr schädlicher Organismen stellen die Schwämme aus menschlicher Perspektive eine wertvolle Ressource dar. Nicht nur aus diesem Grund sollten wir Ihnen mit Respekt begegnen und versuchen, die (Naturstoff-)forschung nachhaltig zu betreiben, die Beeinträchtigung der Tiere auf ein vertretbares Maß zu reduzieren und ihren Lebensraum zu schützen.
Paläobotanische Untersuchungen an Euramerischen Kohlenbecken haben an der Westfal/Stefan-Grenze in früheren Arbeiten einen deutlichen, weitgehend klimatisch gesteuerten Florenwechsel erkennen lassen. Desweiteren wurden in Kohlen aus dem Saar/Nahe-Becken beginnend mit dem obersten Westfal D erstmals Diageneseprodukte von Isoarborinol bzw. Fernen/Fernenol nachgewiesen, für die Koniferen, Cordaiten oder Farnsamer als mögliche Bioproduzenten vorgeschlagen wurden. Im Rahmen der vorliegenden Arbeit konnten die Arboran-/Fernanderivate MAPH, MATH, DAPH 1 und DAPH 2 in den Gesamtextrakten von Kohlen und Sedimenten aus dem Stefan des Saar/Nahe-Beckens durchgängig identifiziert werden, während die Verbindungen im Westfal lediglich in Proben aus dem obersten Westfal D auftraten. Folglich sind die Arboran-/Fernanderivate tatsächlich in besonderem Maße dazu geeignet, den Florenwechsel an der Westfal/Stefan-Grenze auf molekularer Basis zu beschreiben. Um einzugrenzen, zu welcher Pflanzengruppe die Bioproduzenten der Ausgangsverbindungen der Arboran-/Fernanderivate gehören, wurden isolierte Makrofossilien verschiedener Pflanzengruppen aus verschiedenen Euramerischen Kohlenbecken organisch-geochemisch analysiert. Dabei konnten MATH, MAPH, DAPH 1 und DAPH 2 in nahezu allen Gesamtextrakten fossiler Cordaiten-Reste identifiziert werden. In den Extrakten von Sediment-Vergleichsproben, die in unmittelbarer Nähe der Cordaiten-Reste entnommen wurden, konnten die Verbindungen dagegen nicht bzw. nur in vergleichsweise geringen Konzentrationen identifiziert werden. Ebenso waren die Arboran-/Fernanderivate in den Gesamtextrakten fossiler Koniferen-Reste sowie in den Extrakten verschiedener Farnsamerarten (Alethopteris, Dicroidium, Lescuropteris, Macroneuropteris, Neuropteris) nicht enthalten. Lediglich in der extrahierbaren organischen Substanz einiger fossiler Odontopteris-Reste aus dem Blanzy-Montceau-Becken (Frankreich) konnten MAPH und MATH (sowie teilweise DAPH 1 und DAPH 2) identifiziert werden. Allerdings ist das Auftreten der Verbindungen in diesen Odontopteris-Extrakten wahrscheinlich auf eine Überprägung des Pflanzenmaterials durch das umgebende Sediment zurückzuführen, da die Verbindungen in den Sediment-Vergleichsproben in höheren bzw. ähnlichen Konzentrationen enthalten sind. Insgesamt sind daher in den oberkarbonischen Kohlenbecken die Cordaiten als einer, möglicherweise sogar als „die“ Bioproduzenten der Ausgangsverbindungen der Arboran-/Fernanderivate MATH, MAPH, DAPH 1 und DAPH 2 anzusehen. Die deutlich negativere Kohlenstoffisotopie (-31,68 ‰) einer Sedimentprobe aus der Bohrung Wemmetsweiler-Nord, die gleichzeitig die höchsten Arboran-/Fernanderivat-Konzentrationen enthält, weist auf eine verstärkte mikrobielle Überarbeitung des organischen Materials hin. Fluoreszenz- und Auflichtmikroskopie-Untersuchungen zeigen zudem einen erheblichen, ebenfalls auf bakterielle Aktivität hindeutenden Bituminitanteil, während Relikte von höheren Landpflanzen nur geringfügig vertreten sind. Dies legt den Schluß nahe, daß die Arboran-/Fernanderivate in dieser Probe nicht von Cordaiten, sondern alternativ von Bakterien (oder Algen) abstammen. In diesem Fall ist Isoarborinol als biologischer Vorläufer anzunehmen und es tritt eine deutliche Verschiebung der Kohlenstoffisotopie-Werte zu negativeren Werten auf. Bei den Cordaiten ist eine derartige Isotopenverschiebung dagegen nicht zu beobachten, so daß für MATH, MAPH, DAPH 1 und DAPH 2 Fernen bzw. Fernenol als biologische Vorläufer anzunehmen sind.
Analytik von Kontaminationen auf Siliciumoberflächen : Möglichkeiten und Grenzen des VPD-Verfahrens
(2004)
In der Halbleiterindustrie führen in der Massenproduktion von Mikroelektronik-Bauelementen bereits geringfügige Mengen an metallischen Verunreinigungen zu einer erheblichen Verminderung der Ausbeuten und setzen die Zuverlässigkeit der Bauelemente drastisch herab. Deshalb müssen nicht nur die als Ausgangsmaterial verwendeten Siliciumscheiben bezüglich des Kontaminationsgrades durch Fremdatome höchsten Ansprüchen genügen, sondern auch die einzelnen Fertigungsschritte für die Produktion von elektronischen Bauelementen. Für die Detektion der Oberflächenverunreinigungen kommt in der Halbleiterindustrie die Totalreflexions-Röntgenfluoreszenz-Spektrometrie (TXRF) mit einer Empfindlichkeit von 1010 Atomen/cm2 zum Einsatz. Mittlerweile liegen die Anforderungen deutlich unterhalb dieser Nachweisgrenze. Durch Anwendung des Aufkonzentrierungsverfahrens VPD (Vapour-Phase-Decomposition) in Kombination mit etablierten Analysemethoden wie TXRF oder GF-AAS (Graphitrohr-Atom- Absorptions-Spektrometrie) können die in der Halbleiterindustrie notwendigen Nachweisgrenzen zur Detektion der Metalloberflächenbelegungen erreicht werden. VPD ist ein Verfahren, das thermische, chemische oder native Oxide auf Siliciumscheiben durch HFDampf ätzt. Metallische Verunreinigungen, die sich auf oder in der Oxidschicht befinden, können anschließend durch Abscannen der hydrophoben Oberfläche mit einem Tropfen eingesammelt werden. Zwei wichtige Begriffe, die unmittelbar im Zusammenhang mit dem VPD-Verfahren stehen, sind die Einsammelrate (Collecting Efficiency CE) und die Wiederfindungsrate (Recovery Rate RR) des Analyten. Die vorliegende Arbeit beschäftigt sich mit der Bestimmung der beiden Größen am Beispiel des Mangans und des Eisens. Dabei spielt die Frage nach der Zuverlässigkeit und Reproduzierbarkeit der verwendeten Analysemethode eine wichtige Rolle. Inwiefern beeinträchtigt das Silicium, das aus der SiO2-Schicht in Lösung geht und nach einem Trocknungsprozess im Rückstand verbleibt, die mittels TXRF erhaltenen Wiederfindungsraten des Analyten. Da die Antworten auf diese Fragen nur in Verbindung mit anderen Analyseverfahren gefunden werden konnten, kamen neben TXRF, GF-AAS und Photometrie auch radiochemische Methoden zum Einsatz. Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurde zunächst das Adsorptionsverhalten des Mangans auf der Silicium (100)-Oberfläche in verdünnter ammoniakalischer Wasserstoffperoxid- Lösung (SC1) untersucht. Zwischen der Mangan-Konzentration in der SC1-Lösung und der Oberflächenbelegung auf den Siliciumscheiben besteht ein deutlicher Zusammenhang. Mit zunehmender Konzentration in der Lösung steigen die mit TXRF ermittelten Oberflächenbelegungen an. Eine Sättigung der Manganbelegung war im untersuchten Konzentrationsbereich nicht nachweisbar. XPS-Spektren zufolge handelt es sich bei der adsorbierten Mn-Spezies um Mn(III)- und/oder Mn(IV)-Oxide. Winkelabhängige TXRF-Untersuchungen dokumentieren die Filmeigenschaften der Mn- Kontaminationen der aus SC1-Lösungen präparierten Siliciumscheiben. Erst ab hohen Mangankonzentrationen von 15 ppmw im SC1-Bad sinkt der Filmanteil der Adsorption auf 42 %. Auch die aus wässrigen sauren Mn-Lösungen kontaminierten Proben zeigen überwiegend einen filmartigen Charakter der Metalladsorption. VPD-TXRF Analysen wurden zunächst mit SC1 behandelten Siliciumscheiben durchgeführt, deren Mn-Oberflächenbelegungen im Bereich von 1 10 x 1012 Atomen/cm2 lagen. Die ermittelten Mn-TRR-Werte (TRR (totale Wiederfindungsrate) = CE X RR) zeigten deutliche Differenzen zum Maximalwert von 1 und dehnten sich über einen Bereich von 0,55 0,68 aus. Durch den Vergleich mit AAS und TXRF (Gerät EXTRA IIA) konnten die Ursachen für die Minderbefunde der TRR-Werte u.a. auf die direkten TXRF-Messungen (Gerät 8010) zurückgeführt werden, welche die Mn-Ausgangsbelegungen um etwa 20 % überbewerten. Wie sich herausstellte, führt die Quantifizierung von filmartigen Oberflächenbelegungen mit Hilfe eines externen Partikelstandards zu einer Überbewertung der Kontamination. Diese Feststellung wird durch den Vergleich zwischen TXRF 8010 und radiochemischen Messmethoden untermauert. Generell kann es bei der Quantifizierung der Oberflächenbelegungen mittels TXRF 8010 zu Fehlinterpretationen kommen, wenn der Analyt und der Standard ein unterschiedliches Fluoreszenzverhalten in Abhängigkeit des Einfallswinkels aufweisen. Es kommt dadurch zu einer Unterbewertung von partikelartigen Mangan- und Eisenkontaminationen, die nach eigenen Einschätzungen 10 % betragen kann. Weiterhin dokumentieren die Mn-TRR-Werte deutlich die Unterschiede zwischen externer und interner TXRF-8010 Kalibrierung. Die Differenzen der TRR-Werte von durchschnittlich 0,35 ergeben sich aus der verminderten Fluoreszenzstrahlung des internen Standards Rubidium. Die aus den TXRF-Spektren entnommenen Netto-counts des Rubidiums liegen deutlich unterhalb des Erwartungswertes der 1 ng entsprechenden Menge. Die TRR-Werte des Mangans von TXRF (Gerät EXTRA IIA) und AAS liefern vergleichbare und vor allem reproduzierbare Ergebnisse. Die Übereinstimmung der Ergebnisse zeigt deutlich, dass die beiden Analysemethoden als Vergleichsmethoden zu TXRF 8010 geeignet sind. Die Zuverlässigkeit der beiden Methoden dokumentiert sich auch in den übereinstimmenden Ergebnissen der Mn- und Fe-Wiederfindungsraten. Für diesen Vergleich wurden unterschiedlich konzentrierte Mn- und Fe-Lösungen in verschiedenen Matrices angesetzt. Die im Vergleich zu AAS und TXRF EXTRA IIA niedrigeren Wiederfindungsraten von TXRF 8010 sind u.a. auf die Kalibrierung mit dem 1 ng Ni-Standard zurückzuführen. Weiterhin konnte festgestellt werden, dass die TXRF-Messungen der in Siliciummatrix vorliegenden Mn- und Eisenproben noch deutlichere Minderbefunde aufweisen. Die Ursachen dafür sind Streueffekte, die durch die Siliciummatrix im Rückstand hervorgerufen werden (s.u.). Wie aus den radioaktiven Tracer-Experimenten hervorgeht, kann der überwiegende Teil der Gesamtkontamination des Mangans und des Eisens auf der Siliciumscheibe durch den ersten Abrollvorgang eingesammelt werden. Anhand der Mangan- und Eisenmengen, die im ersten DSE-Tropfen mittels ³-Messung detektiert werden, errechnen sich die durchschnittlichen Collecting Efficiencies von Mangan und Eisen zu 96,5 bzw. 98,5 %. Die Einsammelraten sind in dem untersuchten Konzentrationsbereich unabhängig von der Ausgangsbelegung. Collecting Efficiencies können auch ohne Kenntnis der Ausgangsbelegung bestimmt werden, wenn die Gesamtmenge der Kontamination durch die Analyse der VPD-Rückstände und der Restbelegung auf der Siliciumscheibe ermittelt wird. Die Bestimmung der Collecting Efficiency nach dieser Methode ist sinnvoll, da eine fehlerhafte Analyse der Ausgangsbelegung - wie am Beispiel der direkten TXRF-Messung gezeigt - zu verfälschten Resultaten führt. Die Anwendbarkeit beschränkt sich jedoch nur auf nichtflüchtige Analyten. Im Vergleich zur ³-Analyse zeigen die Mn-Wiederfindungsraten von TXRF 8010 deutliche Minderbefunde. Auch in diesem Beispiel liegen die Ursachen für die Unstimmigkeiten u.a. in der Kalibrierung durch den 1 ng Ni-Standard begründet. Beim Eisen deutet sich ein konzentrationsabhängiger Trend an. Die höchsten Fe-Wiederfindungsraten erhält man von den Proben mit den niedrigsten Ausgangsbelegungen. Ein Erklärungsansatz beruht auf der Annahme, dass hohe Konzentrationen an Kationen (>1015 Fe-Atome pro Siliciumscheibe) die Verflüchtigung des Siliciums als SiF4 verstärkt unterbinden und somit zu einer massiven Siliciummatrix im VPD-Rückstand führen. Daraus resultieren Streueffekte durch die Matrix, die ein vermindertes Fluoreszenzsignal des Analyten zur Folge haben. VPD-Experimente an SC1-gereinigten Siliciumscheiben belegen, dass der eingetrocknete Rückstand im Wesentlichen aus Silicium besteht. Die Summe der Metallverunreinigungen der SC1- gereinigten Proben liegt deutlich unterhalb 1015 Atomen pro Siliciumscheibe. Wie am Beispiel des Mangans und des Eisens gezeigt werden konnte, liegt die Zuverlässigkeit des VPD-Verfahrens in den hohen und vor allem reproduzierbaren Einsammelraten. Die festgestellten Differenzen der TRR-Ergebnisse sind ausschließlich auf die unterschiedlichen Wiederfindungsraten der eingesetzten Analysemethoden zurückzuführen. Radiochemische Messmethoden wurden bis auf wenige Ausnahmen für derartige Untersuchungen noch nicht angewendet. Die übereinstimmenden Ergebnisse mit den etablierten Analysemethoden und die hohe Empfindlichkeit der ²- und ³-Analyse zeigen ihr Potenzial als Ergänzungsmethode auf diesem Anwendungsgebiet. Die chemischen Wechselwirkungen zwischen Flusssäure und der SiO2-Schicht während des Ätzprozesses im VPD-Reaktor sind abhängig von der relativen Luftfeuchtigkeit. Anhand der Siliciummengen, die nach dem Ätzprozess mit Hilfe unterschiedlicher DSE-Lösungen eingesammelt wurden, konnten viele neue Informationen erarbeitet werden. Das entwickelte qualitative Modell beschreibt in Abhängigkeit von der relativen Luftfeuchtigkeit, in welcher Phase (fest/flüssig/gasförmig) das aus der SiO2-Schicht geätzte Silicium vorliegt.
Im Mittelpunkt der Arbeit steht die theoretische Beschreibung von ultraschnellen nichtadiabatischen cis-trans-Photoisomerisierunen in kondensierter Phase. Zu diesem Zweck wurde auf einen etablierten Modell-Hamilton-Operator zur Darstellung des isomerisierenden Systems zurückgegriffen und die Wechselwirkung mit der Umgebung im Rahmen der Redfield-Theorie behandelt. Eine gängige Näherung im Rahmen der Redfield-Theorie ist die Säkularnäherung, welche eine deutliche Reduktion des numerischen Aufwands bewirkt. Allerdings liefert die Säkularnäherung keine korrekte Beschreibung der Dynamik für Systeme, welche Regelmäßigkeiten im Eigenwertspektrum aufweisen, was für die in dieser Arbeit benutzten Isomerisierungsmodelle mit harmonischen Schwingungsmoden zutrifft. Andererseits verbietet sich für diese Systeme aus numerischer Sicht der Redfield-Algorithmus mit vollem Relaxationstensor. Daher wurde in dieser Arbeit ein nichtsäkularer Algorithmus entwickelt, der durch die Berücksichtigung der wichtigsten nichtsäkularen Terme eine adäquate Beschreibung der Dynamik im Rahmen der Redfield-Theorie liefert und gleichzeitig zu einer durchschnittlichen Reduktion der Rechenzeit auf ein Zehntel gegenüber der vollen Redfield-Rechnung führt. Im Rahmen der Redfield-Theorie wurden dann Dekohärenz- und dissipative Effekte für ein zweidimensionales Isomerisierungsmodell untersucht, wobei die unterschiedliche nichtadiabtische Dynamik an einer konischen Durchschneidung versus einer vermiedenen Kreuzung im Mittelpunkt des Interesses stand. Fazit dieser Studie ist, dass die konische Durchschneidung ein schnelles Abklingen anfänglicher Kohärenzen und eine effiziente Energieabgabe an die Umgebung bewirkt, was zu einer um eine Größenordnung schnelleren Isomerisierung gegenüber der vermiedenen Kreuzung führt. Daraus kann gefolgert werden, dass der photochemische Trichter tatsächlich der bevorzugte Reaktionsweg bei ultraschnellen internen Konversionsprozessen ist. Ein weiteres Anliegen dieser Arbeit war die Simulation von zeit- und frequenzaufgelösten Pump-Probe-Spektren für Photoreaktionen in dissipativer Umgebung. Hierzu wurde der Doorway-Window-Formalismus herangezogen, bei dem die Wechselwirkung der Pump- und Probepulse mit dem System im Doorway- bzw. Window-Operator enthalten ist. Für diese wurden unter der Annahme gaussförmiger Laserpulse durch analytische Integration der zweizeitigen Antwortfunktionen explizite Ausdrücke erhalten, die in den Redfield-Algorithmus integriert wurden. Somit existiert nun eine Methode zur Berechnung von Pump-Probe-Spektren, deren Skalierungsverhalten durch den Redfield-Algorithmus bestimmt wird. Diese Methode wurde dann angewandt für eine umfangreiche Modellstudie zu PumpProbe-Spektren von Isomerisierungsreaktionen in dissipativer Umgebung. Dabei wurden potentielle Probleme bei der Interpretation von transienten Spektren durch die Überlagerung und teilweisen Auslöschung der spektralen Beiträge zum Gesamtsignal aufgezeigt und diskutiert. In einer weiteren Studie wurde die Methode benutzt, um am Beispiel eines Morse-Oszillators zeitaufgelöste IR-Experimente zu simulieren, wie sie zur Gewinnung von modenselektiven Informationen über eine Reaktion durchgeführt werden.
NMDA-Rezeptoren sind als ionotrope Glutamatrezeptoren (iGluRs) an der Signalübertragung durch den wichtigen Neurotransmitter L-Glutamat beteiligt. Vor allem aufgrund ihrer Bedeutung für das Phänomen der neuronalen Plastizität sind NMDA-Rezeptoren außerordentlich gründlich untersucht worden. Dennoch sind auch heute noch zentrale Fragen zu ihrer Funktionsweise ungeklärt, darunter auch diejenige, wie auf molekularer Ebene die Umsetzung der Glutamatbindung in die Öffnung des Ionenkanals erfolgt. Publizierte Kristallstrukturen der Liganden-bindungsdomänen zweier iGluRs haben die Grundlage für ein Modell der ligandeninduzierten und der Kanalöffnung vorausgehenden Vorgänge in der Bindungsdomäne geschaffen. Diesem zufolge schließt sich die aus zwei Teildomänen bestehende Bindungsdomäne venusfliegenfallenartig um den Liganden und die dabei entstehende mechanische Spannung führt zur Öffnung des Ionenkanals. Dieses Modell wurde in der vorliegenden Arbeit überprüft. Hierzu wurden verschiedene in der Ligandenbindungsdomäne punktmutierte NR1/NR2A-Rezeptoren heterolog in Säugerzellen exprimiert und durch Glutamat hervorgerufene Gesamtzellströme elektrophysiologisch gemessen. Mittels kinetischer Auswertung wurden dann Aminosäurereste in der Bindungsdomäne identifiziert, die einen Beitrag zur Kanalöffnung leisten. Die notwendige Schnelligkeit der Ligandenzugabe wurde dabei durch dessen photochemische Freisetzung aus einer maskierten und dadurch inaktiven Vorstufe (caged compound) erreicht. Die Ergebnisse bestätigen das Modell der Kopplung der Kanalöffnung an das Schließen der Bindungsdomäne und erweitern das Verständnis der genauen zeitlichen Abfolge der ligandeninduzierten Konformationsänderungen in der Bindungsdomäne. Intramolekulare Wechselwirkungen zwischen den Teildomänen S1 und S2 spielen demnach erst relativ spät im Aktivierungsprozeß eine Rolle und dienen vor allem der Stabilisierung des geschlossenen Zustandes der Bindungsdomäne und damit des offenen Ionenkanals.
Die antivirale Funktion der RNA-abhängigen Adenosin-Desaminase bei der angeborenen Immunantwort
(2004)
Die angeborene Immunantwort von Säugetieren ist die erste wirkungsvolle Barriere gegen eindringende Pathogene, die sowohl Infektionen als auch die Entstehung von Neoplasien verhindern kann. Insbesondere wird durch sie die Ausbreitung und Replikation von Viren wirksam bekämpft. Bei RNA-Viren wird die angeborene Immunabwehr in infizierten Zellen von der doppelsträngigen RNA aktiviert, die während der Replikation oder Transkription dieser Viren entsteht. Es kommt zur Sezernierung von Interferon-alpha und -beta (IFN-alpha/beta), die wiederum die Expression einer Reihe von antiviralen Proteinen stimulieren. Eines dieser Proteine ist die IFN-alpha-induzierbare RNA-abhängige Adenosin Desaminase (iADAR-1). Ziel dieser Arbeit war es, die Rolle der iADAR-1 in der Immunabwehr näher zu charakterisieren. Bisher wurde die antivirale Aktivität der iADAR-1 gegen verschiedene Virusstämme, deren Genome Adenosin zu Guanosin (A->G) Hypermutationen aufweisen, nur angenommen, jedoch noch nicht direkt gezeigt [4]. In dieser Arbeit wurde am Beispiel des Glykoproteins (GP) des lymphozytären Choriomeningitis Virus (LCMV) untersucht, ob solche A->G Mutationen im viralen Genom tatsächlich durch die iADAR-1 verursacht werden und ob dadurch die Funktion der viralen Proteine und damit die Infektiösität von LCMV reduziert wird. Des Weiteren wurde die Induktion der iADAR-1 durch die Infektion mit LCMV und die Wirkung der iADAR-1 auf die Replikation von LCMV analysiert. Bekannt war nur, dass die iADAR-1 durch IFN-alpha selbst oder durch die Infektion von Makrophagen mit Adenoviren induziert wird. In dieser Arbeit wurde erstmals für Fibroblasten, neuronale Zellen und in vivo in Mäusen nachgewiesen, dass die iADAR-1 direkt durch die Infektion mit LCMV hochreguliert wird. Dies ist ein weiterer Hinweis, dass die iADAR-1 zu den antiviralen Effektormolekülen der angeborenen Immunabwehr zählt. LCMV induzierte die Expression der iADAR-1 sowohl auf mRNA- als auch auf Proteinebene. Im Gegensatz zu Vaccinia- und Adenoviren, die die Aktivität der iADAR-1 inhibieren [5, 6], konnte bei der Infektion von SH-SY5Y-Zellen mit LCMV keine reduzierte Aktivität der iADAR-1 festgestellt werden. Ferner konnte das schon in anderen Viren beobachtete A->G Hypermutationsmuster nun auch für LCMV bestätigt werden. Sowohl in vitro in L929-Zellen als auch in vivo in Mäusen wurde eine erhöhte A->G Mutationsfrequenz gefunden, die zwischen 50 und 75 % aller Mutationen in der S-RNA von LCMV ausmacht. Dies zeigte sich vor allem in der späten Phase der Infektion, also zu Beginn der Persistenz. Insgesamt wurden zu diesem Zeitpunkt in L929-Zellen 27 % und in der Maus 15 % nicht funktionelles LCMV-GP synthetisiert. Zudem wurde die Relevanz der A->G Hypermutationen für die beeinträchtigte Funktion des GPs deutlich, da sie 62 % der nicht infektiösen GP-Moleküle verursachen. Die desaminierende Wirkung der iADAR-1 auf das virale Genom von LCMV wurde in 293T-Zellen direkt gezeigt. A->G Mutationen in der S-RNA von LCMV nahmen durch die Überexpression der iADAR-1 in 293T-Zellen um 40 % zu. Ebenso wurde die Replikation bzw. das Assembly von Virionen durch die iADAR-1 reduziert, da im Vergleich zu Kontrollzellen der LCMV-Titer im Überstand von iADAR-1-überexprimierenden Zellen wesentlich niedriger war. Des Weiteren konnte bestätigt werden, dass die A->G Mutationen nicht durch die virale Polymerase induziert werden. Hierfür wurden iADAR-1 „knockout“ murine embryonale Fibroblasten (MEF) isoliert und als stabile Zelllinie etabliert. In diesen Zellen war kein A->G Hypermutationsmuster in der LCMV-RNA zu erkennen. In MEF wt war ebenfalls kein A->G Hypermutationsmuster nachweisbar. Der Grund hierfür könnte die im Vergleich zu L929-Zellen deutlich geringere basale iADAR-1-Expression der nicht völlig ausdifferenzierten MEFs sein.
In dieser Arbeit werden Untersuchungen über die Anwendbarkeit von vier Methoden zur selektiven Einführung von Radikalen in DNA vorgestellt. Hierzu wurde die EPR-Spektroskopie (Elektronen-paramagnetische Resonanz) benutzt. Die selektive Einführung und Erzeugung von Radikalen in DNA ist nötig, um J-Kopplungen in DNA zu untersuchen. Vor dem Fernziel der Bestimmung der Austauschkopplungskonstanten J in biradikalischer DNA und deren Korrelation mit der charge-transfer-Geschwindigkeitskonstanten kCT stellen diese Untersuchungen einen wichtigen Ausgangspunkt dar. Stabile aromatische Nitroxide. Simulationen von Raumtemperatur-CW-X-Band-EPRSpektren fünf verschiedener aromatischer Nitroxide, welche potentielle DNA-Interkalatoren sind, wurden durchgeführt. Die aromatischen Nitroxide zeigen aufgelöste Hyperfeinkopplungen, welche zu dem Schluss führen, dass die Spindichte in hohem Maße delokalisiert ist, was die Verwendung dieser Verbindungen zur Messung von J-Kopplungen in biradikalischer DNA erlaubt. Transiente Guanin-Radikale. Transiente Guanin-Radikale werden in DNA selektiv durch die Flash-Quench-Technik erzeugt, bei der optisch anregbare Ruthenium-Interkalatoren verwendet werden. Transiente Thymyl-Radikale aus UV-bestrahltem 4'-Pivaloyl-Thymidin. Es werden photoinduzierte Prozesse untersucht, welche durch Bestrahlung von Thymin-Nukleosiden, die an der 4’-Position die optisch spaltbare Pivaloyl-Gruppe tragen, erzeugt werden. Dieses Nukleosid wurde speziell dafür entworfen, um Elektronenlöcher in DNA zu injizieren. In dieser Arbeit wird gezeigt, dass diese Verbindung benutzt werden kann, um selektiv eine Thymin-Base zu reduzieren. Transiente Thymyl-Radikale erzeugt durch ein neuartig modifiziertes Thymin nach UV-Bestrahlung. Photoinduzierte Prozesse, welche durch Bestrahlung eines ähnlichen Thymidin-Nukleosids erzeugt wurden, werden hier untersucht. Dieses Thymidin- Nukleosid wurde modifiziert, indem die optisch spaltbare Pivaloyl-Gruppe an eine Seitenkette angehängt wurde, welche an der C6-Position der Thymin-Base sitzt. Die Thymin-Base wurde speziell dafür entworfen, um Elektronen in DNA zu injizieren. In dieser Arbeit wurde bestätigt, dass ein Überschuss-Elektron selektiv auf eine Thymin-Base transferiert werden kann.
Im Rahmen der Arbeit wurde eine Methodik zur umfassenden und automatischen Identifizierung von nativen Peptiden aus Extrakten komplexer biologischer Quellen entwickelt und am Beispiel des humanen Hämofiltrats angewendet. Die Firma BioVisioN führt seit der Gründung Forschung auf dem Gebiet der Peptide und kleinen Proteine mit dem Ziel, diagnostisch und therapeutisch relevante Substanzen zu finden, durch. Die Analyse sogenannter Peptidome, der qualitativen und quantitativen Beschreibung aller nativen Peptide und kleinen Proteinen bis ca. 15 kDa, ist als Analogon zur Proteom-Analytik zu verstehen, welche sich umfassend mit Proteinen beschäftigt. Quantitativ wird ein Peptidom über die Kombination chromatographischer Trennung und Fraktionierung mit der massenspektrometrischen „Inventarisierung“ der einzelnen Peptidspezies sowie den relativen Konzentrationen in der Probe erfasst, welches an anderer Stelle ausführlich beschrieben ist. Das Ergebnis einer solchen Peptidomanalyse besteht aus einer Peptidkarte, die die Peptide der Probe repräsentativ abbildet. Die Qualität eines Peptidoms wird über die Massen der Peptide, deren Aminosäuresequenzen und Elutionsverhalten und weitere biologische Informationen beschrieben. Zu diesen Zweck wird der Begriff des Peptide-Inventory eingeführt. Ein Inventory besteht aus allen verfügbaren Informationen nativer Peptide einer Quelle. Zu Beginn der Arbeit standen mit der reproduzierbaren Erstellung von Peptidbanken und deren systematischer Kartierung über MALDI-MS bereits zwei Werkzeuge zur Verfügung, um Daten eines Inventories zu erheben. Lediglich für die Erzeugung der Sequenzdaten wurde mit dem Edman-Abbau zwar eine etablierte, aber viel zu langsame und wenig sensitive Methode eingesetzt. Hier wurde der Ersatz durch eine schnelle und leicht zu automatisierenden Methode angestrebt. Die massenspektrometrische Sequenzierung über MS/MS mit anschließender Datenbanksuche ist ein aus der Proteom-Analytik durchaus bekanntes Verfahren, musste aber für die Analyse der nativen Peptide in einigen Bereichen modifiziert werden. Obwohl die Massenspektrometrie Peptide direkt aus komplexen Mischungen heraus identifizieren kann, stellte sich schnell heraus, dass die vorliegende biologische Beispielprobe (humanes Blutfiltrat) zu komplex war, um sie direkt für die geplante Sequenzierung einzusetzen. Es wurde eine erneute Auftrennung und Feinkartierung der Peptidbank notwendig. Jede dritte Fraktion wurde rechromatographiert und anschließend wiederum kartiert. Die entstandenen 97 Peptidkarten enthalten im Linear Modus ca. 100.000 Signale und im Reflektron Modus ca. 30.000 Signale, so dass nach der Feinkartierung > 10.000 native, im menschlichen Körper zirkulierende Peptide durch diese Methode dargestellt werden können. Zur Automatisierung der Kartierungsmessungen mit MALDI-MS wurde im Laufe dieser Arbeit ein Autosampler für ein MALDI-TOF-MS-System entwickelt und implementiert (DiskJockey). Das System hat eine Kapazität von 20 MALDI-Targets und ist vollständig über die Gerätesoftware steuerbar, so dass MALDI-MS-Messungen vollständig automatisiert über mehrere Tage ablaufen können. Zur Erzeugung der Sequenzdaten wurde eine Kombination aus elektrischer Ionenfalle und Datenbanksuche angewendet. Um zu gewährleisten, dass nur die zuvor kartierten Peptide einer MS/MS-Messung unterzogen werden, wurde das Softwaretool Alcatrap entwickelt. Diese Software übernimmt aus MALDI-MS-Messungen die Werte der monoisotopischen Peaks, überführt sie in mehrfach geladene Spezies und erstellt sowohl eine Methode für das MS-Gerät, als auch eine in die Gerätesoftware importierbare Arbeitsliste. Hierbei wird jeweils die Kollisionsenergie in Abhängigkeit der m/z-Wertes dynamisch gesetzt. Um den Datentransfer vom Fragmentspektrum zur Datenbanksuchmaschine zu gewährleisten, wurde mit „D2M“ eine weitere Softwareschnittstelle entwickelt. Die Erstellung des Inventories aus humanem Hämofiltrat liefert 1.225 verschiedene native, im menschlichen Blut zirkulierende Peptide aus 146 Proteinvorläufern. Darunter befinden sich mehrere Peptide, die neben ihrer physiologischen Bedeutung auch eine potenzielle medizinische Relevanz besitzen. Weiterhin ist auch der dynamische Bereich von acht Größenordnungen, in dem Sequenzen erzeugt wurden, vergleichbar mit dem des menschlichen Blutes. Eine Charakterisierung von Peptidomen ist in diesem Umfang bisher noch nicht durchgeführt worden und stellt eine Neuerung in der Proteomforschung dar. Die Studie ist durchaus vergleichbar mit kürzlich veröffentlichten umfangreichen Proteomstudien aus menschlichem Plasma und Serum und stellt eine Ergänzung dieser für den Bereich der Peptide und kleinen Proteine dar. Limitierungen bei der Identifizierung von Peptiden mit der Ionenfalle wurden analysiert und mit der Adaptierung des Peptide-Inventory Konzepts auf hochauflösende Quadrupol-Time-of-Flight Massenspektrometer zufriedenstellend gelöst. In diesem Rahmen wurde eine Methode entwickelt, die es ermöglicht, native Peptide bis zu einem Molekulargewicht von bis zu 8.500 Da direkt aus der komplexen Mischung zu fragmentieren und über eine Datenbanksuche zu identifizieren. Außerdem konnte exemplarisch gezeigt werden, dass durch die größere Massengenauigkeit und das größere Auflösungsvermögen des QTOF die Datenbanksuche wesentlich effektiver ist und durch die Kombination von Rechromatographie und QTOF-MS/MS nahezu jedes Signal einer Peptidbank der Identifizierung zugänlich gemacht werden kann. Sowohl die integrierte Methodik der Herstellung eines Peptide-Inventories, als auch die in dieser Arbeit erzielten Ergebnisse von nativen Peptiden in humanem Blut stellen wissenschaftliche Neuerungen dar, auf denen eine weitergehende Peptidom-Analytik aufsetzen kann.
Die Ermittlung von Proteinstukturen mittels NMR-Spektroskopie ist ein komplexer Prozess, wobei die Resonanzfrequenzen und die Signalintensitäten den Atomen des Proteins zugeordnet werden. Zur Bestimmung der räumlichen Proteinstruktur sind folgende Schritte erforderlich: die Präparation der Probe und 15N/13C Isotopenanreicherung, Durchführung der NMR Experimente, Prozessierung der Spektren, Bestimmung der Signalresonanzen ('Peak-picking'), Zuordnung der chemischen Verschiebungen, Zuordnung der NOESY-Spektren und das Sammeln von konformationellen Strukturparametern, Strukturrechnung und Strukturverfeinerung. Aktuelle Methoden zur automatischen Strukturrechnung nutzen eine Reihe von Computeralgorithmen, welche Zuordnungen der NOESY-Spektren und die Strukturrechnung durch einen iterativen Prozess verbinden. Obwohl neue Arten von Strukturparametern wie dipolare Kopplungen, Orientierungsinformationen aus kreuzkorrelierten Relaxationsraten oder Strukturinformationen, die sich in Gegenwart paramagnetischer Zentren in Proteinen ergeben, wichtige Neuerungen für die Proteinstrukturrechnung darstellen, sind die Abstandsinformationen aus NOESY-Spektren weiterhin die wichtigste Basis für die NMR-Strukturbestimmung. Der hohe zeitliche Aufwand des 'peak-picking' in NOESY-Spektren ist hauptsächlich bedingt durch spektrale Überlagerung, Rauschsignale und Artefakte in NOESY-Spektren. Daher werden für das effizientere automatische 'Peak-picking' zuverlässige Filter benötigt, um die relevanten Signale auszuwählen. In der vorliegenden Arbeit wird ein neuer Algorithmus für die automatische Proteinstrukturrechnung beschrieben, der automatisches 'Peak-picking' von NOESY-Spektren beinhaltet, die mit Hilfe von Wavelets entrauscht wurden. Der kritische Punkt dieses Algorithmus ist die Erzeugung inkrementeller Peaklisten aus NOESY-Spektren, die mit verschiedenen auf Wavelets basierenden Entrauschungsprozeduren prozessiert wurden. Mit Hilfe entrauschter NOESY-Spektren erhält man Signallisten mit verschiedenen Konfidenzbereichen, die in unterschiedlichen Schritten der kombinierten NOE-Zuordnung/Strukturrechnung eingesetzt werden. Das erste Strukturmodell beruht auf stark entrauschten Spektren, die die konservativste Signalliste mit als weitgehend sicher anzunehmenden Signalen ergeben. In späteren Stadien werden Signallisten aus weniger stark entrauschten Spektren mit einer größeren Anzahl von Signalen verwendet. Die Auswirkung der verschiedenen Entrauschungsprozeduren auf Vollständigkeit und Richtigkeit der NOESY Peaklisten wurde im Detail untersucht. Durch die Kombination von Wavelet-Entrauschung mit einem neuen Algorithmus zur Integration der Signale in Verbindung mit zusätzlichen Filtern, die die Konsistenz der Peakliste prüfen ('Network-anchoring' der Spinsysteme und Symmetrisierung der Peakliste), wird eine schnelle Konvergenz der automatischen Strukturrechnung erreicht. Der neue Algorithmus wurde in ARIA integriert, einem weit verbreiteten Computerprogramm für die automatische NOE-Zuordnung und Strukturrechnung. Der Algorithmus wurde an der Monomereinheit der Polysulfid-Schwefel-Transferase (Sud) aus Wolinella succinogenes verifiziert, deren hochaufgelöste Lösungsstruktur vorher auf konventionelle Weise bestimmt wurde. Neben der Möglichkeit zur Bestimmung von Proteinlösungsstrukturen bietet sich die NMR-Spektroskopie auch als wirkungsvolles Werkzeug zur Untersuchung von Protein-Ligand- und Protein-Protein-Wechselwirkungen an. Sowohl NMR Spektren von isotopenmarkierten Proteinen, als auch die Spektren von Liganden können für das 'Screening' nach Inhibitoren benutzt werden. Im ersten Fall wird die Sensitivität der 1H- und 15N-chemischen Verschiebungen des Proteinrückgrats auf kleine geometrische oder elektrostatische Veränderungen bei der Ligandbindung als Indikator benutzt. Als 'Screening'-Verfahren, bei denen Ligandensignale beobachtet werden, stehen verschiedene Methoden zur Verfügung: Transfer-NOEs, Sättigungstransferdifferenzexperimente (STD, 'saturation transfer difference'), ePHOGSY, diffusionseditierte und NOE-basierende Methoden. Die meisten dieser Techniken können zum rationalen Design von inhibitorischen Verbindungen verwendet werden. Für die Evaluierung von Untersuchungen mit einer großen Anzahl von Inhibitoren werden effiziente Verfahren zur Mustererkennung wie etwa die PCA ('Principal Component Analysis') verwendet. Sie eignet sich zur Visualisierung von Ähnlichkeiten bzw. Unterschieden von Spektren, die mit verschiedenen Inhibitoren aufgenommen wurden. Die experimentellen Daten werden zuvor mit einer Serie von Filtern bearbeitet, die u.a. Artefakte reduzieren, die auf nur kleinen Änderungen der chemischen Verschiebungen beruhen. Der am weitesten verbreitete Filter ist das sogenannte 'bucketing', bei welchem benachbarte Punkte zu einen 'bucket' aufsummiert werden. Um typische Nachteile der 'bucketing'-Prozedur zu vermeiden, wurde in der vorliegenden Arbeit der Effekt der Wavelet-Entrauschung zur Vorbereitung der NMR-Daten für PCA am Beispiel vorhandener Serien von HSQC-Spektren von Proteinen mit verschiedenen Liganden untersucht. Die Kombination von Wavelet-Entrauschung und PCA ist am effizientesten, wenn PCA direkt auf die Wavelet-Koeffizienten angewandt wird. Durch die Abgrenzung ('thresholding') der Wavelet-Koeffizienten in einer Multiskalenanalyse wird eine komprimierte Darstellung der Daten erreicht, welche Rauschartefakte minimiert. Die Kompression ist anders als beim 'bucketing' keine 'blinde' Kompression, sondern an die Eigenschaften der Daten angepasst. Der neue Algorithmus kombiniert die Vorteile einer Datenrepresentation im Wavelet-Raum mit einer Datenvisualisierung durch PCA. In der vorliegenden Arbeit wird gezeigt, dass PCA im Wavelet- Raum ein optimiertes 'clustering' erlaubt und dabei typische Artefakte eliminiert werden. Darüberhinaus beschreibt die vorliegende Arbeit eine de novo Strukturbestimmung der periplasmatischen Polysulfid-Schwefel-Transferase (Sud) aus dem anaeroben gram-negativen Bakterium Wolinella succinogenes. Das Sud-Protein ist ein polysulfidbindendes und transferierendes Enzym, das bei niedriger Polysulfidkonzentration eine schnelle Polysulfid-Schwefel-Reduktion katalysiert. Sud ist ein 30 kDa schweres Homodimer, welches keine prosthetischen Gruppen oder schwere Metallionen enthält. Jedes Monomer enhält ein Cystein, welches kovalent bis zu zehn Polysulfid-Schwefel (Sn 2-) Ionen bindet. Es wird vermutet, dass Sud die Polysulfidkette auf ein katalytischen Molybdän-Ion transferiert, welches sich im aktiven Zentrum des membranständigen Enzyms Polysulfid-Reduktase (Psr) auf dessen dem Periplasma zugewandten Seite befindet. Dabei wird eine reduktive Spaltung der Kette katalysiert. Die Lösungsstruktur des Homodimeres Sud wurde mit Hilfe heteronuklearer, mehrdimensionaler NMR-Techniken bestimmt. Die Struktur beruht auf von NOESY-Spektren abgeleiteten Distanzbeschränkungen, Rückgratwasserstoffbindungen und Torsionswinkeln, sowie auf residuellen dipolaren Kopplungen, die für die Verfeinerung der Struktur und für die relative Orientierung der Monomereinheiten wichtig waren. In den NMR Spektren der Homodimere haben alle symmetrieverwandte Kerne äquivalente magnetische Umgebungen, weshalb ihre chemischen Verschiebungen entartet sind. Die symmetrische Entartung vereinfacht das Problem der Resonanzzuordnung, da nur die Hälfte der Kerne zugeordnet werden müssen. Die NOESY-Zuordnung und die Strukturrechnung werden dadurch erschwert, dass es nicht möglich ist, zwischen den Intra-Monomer-, Inter-Monomer- und Co-Monomer- (gemischten) NOESY-Signalen zu unterscheiden. Um das Problem der Symmetrie-Entartung der NOESY-Daten zu lösen, stehen zwei Möglichkeiten zur Verfügung: (I) asymmetrische Markierungs-Experimente, um die intra- von den intermolekularen NOESY-Signalen zu unterscheiden, (II) spezielle Methoden der Strukturrechnung, die mit mehrdeutigen Distanzbeschränkungen arbeiten können. Die in dieser Arbeit vorgestellte Struktur wurde mit Hilfe der Symmetrie-ADR- ('Ambigous Distance Restraints') Methode in Kombination mit Daten von asymetrisch isotopenmarkierten Dimeren berechnet. Die Koordinaten des Sud-Dimers zusammen mit den NMR-basierten Strukturdaten wur- den in der RCSB-Proteindatenbank unter der PDB-Nummer 1QXN abgelegt. Das Sud-Protein zeigt nur wenig Homologie zur Primärsequenz anderer Proteine mit ähnlicher Funktion und bekannter dreidimensionaler Struktur. Bekannte Proteine sind die Schwefeltransferase oder das Rhodanese-Enzym, welche beide den Transfer von einem Schwefelatom eines passenden Donors auf den nukleophilen Akzeptor (z.B von Thiosulfat auf Cyanid) katalysieren. Die dreidimensionalen Strukturen dieser Proteine zeigen eine typische a=b Topologie und haben eine ähnliche Umgebung im aktiven Zentrum bezüglich der Konformation des Proteinrückgrades. Die Schleife im aktiven Zentrum umgibt das katalytische Cystein, welches in allen Rhodanese-Enzymen vorhanden ist, und scheint im Sud-Protein flexibel zu sein (fehlende Resonanzzuordnung der Aminosäuren 89-94). Das Polysulfidende ragt aus einer positiv geladenen Bindungstasche heraus (Reste: R46, R67, K90, R94), wo Sud wahrscheinlich in Kontakt mit der Polysulfidreduktase tritt. Das strukturelle Ergebnis wurde durch Mutageneseexperimente bestätigt. In diesen Experimenten konnte gezeigt werden, dass alle Aminosäurereste im aktiven Zentrum essentiell für die Schwefeltransferase-Aktivität des Sud-Proteins sind. Die Substratbindung wurde früher durch den Vergleich von [15N,1H]-TROSY-HSQC-Spektren des Sud-Proteins in An- und Abwesenheit des Polysulfidliganden untersucht. Bei der Substratbindung scheint sich die lokale Geometrie der Polysulfidbindungsstelle und der Dimerschnittstelle zu verändern. Die konformationellen Änderungen und die langsame Dynamik, hervorgerufen durch die Ligandbindung können die weitere Polysulfid-Schwefel-Aktivität auslösen. Ein zweites Polysulfid-Schwefeltransferaseprotein (Str, 40 kDa) mit einer fünffach höheren nativen Konzentration im Vergleich zu Sud wurde im Bakterienperiplasma von Wolinella succinogenes entdeckt. Es wird angenommen, dass beide Protein einen Polysulfid-Schwefel-Komplex bilden, wobei Str wässriges Polysulfid sammelt und an Sud abgibt, welches den Schwefeltransfer zum katalytischen Molybdän-Ion auf das aktive Zentrum der dem Periplasma zugewandten Seite der Polysulfidreduktase durchführt. Änderungen chemischer Verschiebungen in [15N,1H]-TROSY-HSQC-Spektren zeigen, dass ein Polysulfid-Schwefeltransfer zwischen Str und Sud stattfindet. Eine mögliche Protein-Protein-Wechselwirkungsfläche konnte bestimmt werden. In der Abwesenheit des Polysulfidsubstrates wurden keine Wechselwirkungen zwischen Sud und Str beobachtet, was die Vermutung bestätigt, dass beide Proteine nur dann miteinander wechselwirken und den Polysulfid-Schwefeltransfer ermöglichen, wenn als treibende Kraft Polysulfid präsent ist.
Der Transport von antigenen Peptiden in das Lumen des endoplasmatischen Retikulums ist ein zentraler Vorgang bei der Antigenprozessierung und ihrer MHC-Klasse-I-vermittelten Präsentation auf der Zelloberfläche. Intrazelluläre Translokation über die ER-Membran erfolgt mit Hilfe von TAP, eines ATP-abhängigen ABC-Transporters. Einer ATP-unabhängigen Substratbindung folgt der eigentliche Transportschritt, dessen Energetisierung einer ATP-Spaltung bedarf. In der vorliegenden Dissertation wurde die ATPase-Aktivität des TAP-Komplexes aufgeklärt und detailliert charakterisiert. Es wurde eine schnelle und schonende Isolierungs- und Rekonstitutionsmethode entwickelt, die es erlaubt, den partiell aufgereinigten TAP-Komplex in Liposomen einzubauen und Funktionsstudien in vitro durchzuführen. Zum ersten Mal war es damit möglich, die Peptid-stimulierte TAP-spezifische ATP-Hydrolyse direkt zu beobachten und deren kinetische Parameter zu bestimmen. Eine direkte Korrelation zwischen Bindungsaffinität des Peptides zu TAP (Bindungskonstante KD) und der halbmaximalen Stimulation der ATPase-Aktivität von TAP (Km,pep) wurde festgestellt. Die Versuche mit den verzweigten Peptiden zeigten, dass Peptide, die nicht transportiert werden können, keine Stimulation der ATPase-Aktivität hervorrufen. Somit wurde die allosterische Interaktion zwischen Peptidbindung, ATP-Hydrolyse und Peptidtransport nachgewiesen. Nach der Entfernung des peptidexportierenden Sec61-Komplexes aus den Proteoliposomen konnte die vorläufige Stöchiometrie des Transportschrittes bestimmt werden. Eine weitere Anwendung fand die Rekonstitutionsmethode bei der Aufklärung des molekularen Wirkungsmechanismus des TAP-Inhibitors US6, indem der TAP-Komplex zusammen mit der aktiven ER-luminalen Domäne von US6 in die Proteoliposomen rekonstituiert wurde. Die Bindung von US6(delta147-183) an die ER-luminalen Bereiche von TAP blockiert die ATP-Bindung an die zytoplasmatischen NBD des Transporters. Die Peptid-induzierte ATP-Hydrolyse wird durch die Inhibition der ATP-Bindung unterbunden, wohingegen die Peptid- und ADP-Bindung von TAP nicht beeinflusst sind.
Der Einbau von Übergangsmetallionen in Polymerketten kann zu Materialien mit vielversprechenden optischen, elektronischen oder magnetischen Eigenschaften führen, wie sie auf der Basis konventioneller organischer Polymere nicht zu erzielen sind. Die für metallorganische Makromoleküle charakteristischen Eigenschaften resultieren vor allem aus der Vielfalt der Strukturtypen, die für Metallkomplexe auftreten, und in vielen Fällen aus kooperativen Effekten zwischen den Übergangsmetallzentren eines Polymerstranges. Gezieltes Materialdesign setzt daher neben einem grundlegenden Verständnis der Interaktion zwischen den Metallkomplexfragmenten die Fähigkeit voraus, diese durch geeignete Verknüpfungseinheiten so miteinander zu verbinden, dass Wechselwirkungen zwischen ihnen auftreten. Kooperative Phänomene lassen sich häufig bereits an kurzkettigen Oligomeren beobachten, die daher als Modellsysteme für die entsprechenden Polymere dienen. Vor diesem Hintergrund lag der Schwerpunkt der vorliegenden Arbeit auf der Synthese und Charakterisierung di- und trinuclearer Metallkomplexe. Darüber hinaus wurden aber auch entscheidende Fortschritte in Bezug auf die Synthese metallhaltiger Polymere auf der Basis ausgewählter Ferrocenderivate erzielt. Zur Darstellung der Zielverbindungen wurden sowohl etablierte Verknüpfungs-Konzepte genutzt als auch neue Syntheserouten entwickelt. Als wichtige Startverbindungen wurden die Ferrocenylborane FcBR2 und 1,1‘-fc(BR2)2 [Fc = (C5H5)Fe(C5H4), fc = Fe(C5H4)2, R = Br, H, CR‘3] eingesetzt, da sich deren Borylsubstituenten in vielfältiger Weise zur Verknüpfung der metallorganischen Bausteine nutzen lassen. Aufgrund der Lewis-sauren Eigenschaften der Borylsubstituenten können Ferrocenylborane mit difunktionellen organischen Lewis-Basen wie 4,4‘-Bipyridin oder Pyrazin zu Polymeren verknüpft werden. Um die Anzahl der Metallatome innerhalb derartiger Makromoleküle zu erhöhen, wurden im Rahmen dieser Arbeit erstmals metallorganische Lewis-Basen als Verknüpfungseinheiten eingesetzt. In dieser Hinsicht bieten sich 3,4-Dimethyl-1-phosphaferrocen und 3,3‘,4,4‘-Tetramethyl-1,1‘-diphosphaferrocen sowie Ferrocenyllithium und 1,1‘-Dilithioferrocen an, da in diesen Verbindungen das Lewis-basische Zentrum Bestandteil des Cyclopentadienylrings ist. Im Gegensatz zu Phosphaferrocenen bilden die starken Lewis-Basen Ferrocenyllithium und 1,1‘-Dilithioferrocen mit dem Ferrocenylboran FcBMe2 selbst in Lösung stabile Addukte (z. B. Fc2BMe2Li). Polymerisationsversuche mit den Edukten 1,1‘-(fcBMe2)2 und 1,1‘-Dilithioferrocen führen entgegen den Erwartungen jedoch nicht zu polymerem Material, sondern ergeben das borverbrückte [1.1]Ferrocenophan [{Fe-(C5H4)2}2{BMe2}2]Li2. Die Struktur von [{Fe-(C5H4)2}2{BMe2}2]Li2 im festen Zustand weist als hervorstechendstes Merkmal ein nacktes Lithium-Ion auf, das sich im Zentrum des Käfigs befindet. Dieses supramolekulare Aggregat ist auch in Lösung beständig. Werden jedoch beide Ferroceneinheiten oxidiert, verlässt das Li+-Ion den Makrozyklus, um nach vollständiger Reduktion von [{Fe-(C5H4)2}2{BMe2}2] wieder an seinen ursprünglichen Platz zurückzukehren. Komplementär zum Verknüpfungskonzept über dative Bor-Stickstoff-, Bor-Phosphor- und Bor-Kohlenstoff-Bindungen wurde im Rahmen dieser Arbeit eine Kondensationsreaktion erarbeitet, die auf einfachem Wege zu kovalent verknüpften di- und oligonuclearen Ferrocenkomplexen führt. Bei der Umsetzung von FcBBr2 mit HSiEt3 beobachtet man eine Dimerisierungsreaktion, die unter Bildung von Fc2BBr verläuft. Einer entsprechenden Reaktion lässt sich auch 1,1‘-fc(BBr2)2 unterziehen, womit sich ein Weg zu Poly(ferrocenylenen) eröffnet, in denen die Ferroceneinheiten über dreifach koordiniertes Bar verknüpft sind ([-fcB(R)-]n, R = Br). Weitere Wege zu ferrocenhaltigen Polymeren mit Bar im Polymerrückgrat wurden durch die erfolgreiche Synthese der Ferrocenylborane FcBH2 und 1,1‘-fc(BH2)2 eröffnet, die in Form ihrer Lewis-Säure-Base-Addukte mit Dimethylethylamin [FcBH2 . NMe2Et; 1,1‘-fc(BH2 . NMe2Et)2] oder Dimethylsulfid [FcBH2 . SMe2; 1,1‘-fc(BH2.SMe2)2] isoliert werden konnten. FcBH2 . NMe2Et und FcBH2 . SMe2 erwiesen sich als aktive und selektive Hydroborierungsreagenzien. Durch Umsetzung mit aromatischen Dialkinen werden dadurch konjugierte Polymere zugänglich, welche mit Polyolefinen verwandt sind, in denen einige der Kohlenstoffatome durch Boratome ersetzt wurden. Diese Materialien zeichnen sich durch ausgeprägt pi-Delokalisation aus, die sich über das Bor hinweg erstreckt, und weckten unser Interesse, da Oxidation der Ferrocenyl-Seitenketten eine elektrochemische Modifizierung der Ladungsdichte an den Borzentren erlauben sollte. Gleichzeitig ließen sich auf diese Weise paramagnetische Fe(III)-Ionen in unmittelbarer Nachbarschaft zu einem elektrisch leitfähigen Polymer generieren. Überdies erhält man Polymere des Typs [-fcB(R)-]n nicht nur über die Reaktion von 1,1‘-fc(BBr2)2 mit HSiEt3 (R = Br) sondern auch über die Kondensationsreaktion von 1,1‘-fc(BH2)2, die unter Abspaltung von BH3 verläuft (R = H).
Der T-Zell-Wachstumsfaktor Interleukin-2 (IL-2) wird von Antigen-stimulierten T-Zellen sezerniert und spielt eine wichtige Rolle bei der zellulären Immunantwort. Dabei tragen in aktivierten T-Zellen die MAPK-Signalwege, der Calcineurin/NF-AT-Signalweg und der NF-KB-Signalweg kooperativ zur IL-2-lnduktion bei. In den letzten Jahren wurden mehrere Hinweise gefunden, dass IL-2 möglicherweise bei der HIV- und SIV-Pathogenese eine Rolle spielt. Zwei Publikationen konnten bereits eine verstärkte IL-2-Sekretion HIV-1-infizierter T-Zellen nachweisen, die molekularen Mechanismen dieser IL-2-Induktion sind bisher allerdings kaum untersucht. In der vorliegenden Arbeit konnte gezeigt werden, dass das apathogene simiane Immundefizienzvirus der Afrikanischen Grünen Meerkatze (SIVagm3) in suboptimal stimulierten PBMC ebenfalls die Interleukin-2-Sekretion verstärken kann. In der humanen T-Zelllinie A3.01 wurde nach Transfektion des Volllängenplasmids des SIVagm3 eine bis zu 38-fach verstärkte transkriptionelle Aktivierung des IL-2-Promotors beobachtet. Die Untersuchung der beteiligten Signalwege zeigte, dass die MAP-Kinasen ERK, JNK/SAPK und p38 für die IL-2-Induktion durch SIVagm3 notwendig sind, während die Inhibition der Calcineurin-Aktivität durch das Immunsuppressivum Cyclosporin A keinen Einfluss hatte. In Übereinstimmung mit diesem Ergebnis zeigte die Analyse der Transkriptionsfaktorbindungsstellen des IL-2-Promotors keine Aktivierung der NF-AT-kontrollierten Genexpression durch SIVagm3, womit zum ersten Mal ein Calcineurin/NF-AT-unabhängiger Weg der IL-2-Induktion beschrieben wurde. Dagegen erhöhte SIVagm3 die transkriptionelle Aktivität des NF-KB-responsiven Elements und die Aktivität des CD28/AP-1-responsiven Elements, die auch bei der klassischen T-Zellaktivierung eine Rolle spielen. Eine Aktivierung der CD28/AP-1-kontrollierten Genexpression konnte auch durch Expression des viralen Transaktivator-Proteins Tat induziert werden, das in stimulierten Zellen in der Lage war, die IL-2-Expression zu verstärken. Die Beschränkung dieser Tat-Funktion auf stimulierte Zellen konnte aber nicht auf eine Phosphorylierung von SIVagm3-Tat durch die MAP-Kinasen ERK, JNK/SAPK oder p38 zurückgeführt werden. Weitere Analysen zeigten dagegen, dass SIVagm3-Tat durch die Cyclin-abhängige Proteinkinase 9 (CDK9) phosphoryliert wird, die mit Tat koimmunpräzipitiert. Darüberhinaus konnte eine weitere nicht-identifizierte Tat-assoziierte Kinase nachgewiesen werden, die SIVagm3-Tat ebenfalls phosphorylieren kann. Aktuelle Publikationen zeigen, dass das lentivirale Vif-Protein die Degradation von Apobec3G im Proteasom induziert, da dieser zelluläre Faktor die Infektiosität der entstehenden Viruspartikel stark reduziert. Die antivirale Funktion von Apobec3G, die in der Deaminierung der Minusstrang-DNA während der reversen Transkription besteht, ist bereits weitgehend aufgeklärt, aber über die Regulation von Apobec3G ist noch wenig bekannt. In dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass die Aktivierung der mitogenen Raf/MEK/ERK-Signalkaskade durch den Phorbolester TPA zu einer verstärkten Apobec3G-Expression führt. Dieser Effekt konnte durch den Proteinkinase C (PKC)-Inhibitor Staurosporin und den MEK-Inhibitor U0126 inhibiert werden, wodurch gezeigt wurde, dass die Aktivität der MAP-Kinase ERK für die Verstärkung der Apobec3G-Expression notwendig ist. Eine Phosphorylierung von Apobec3G durch ERK wurde im Kinase-Assay jedoch nicht beobachtet. Dagegen konnte durch radioaktive in-vivo-Markierung nachgewiesen werden, dass es sich bei Apobec3G nicht um ein Phosphoprotein handelt. Neben den Untersuchungen zur Regulation von Apobec3G, konnten neue Erkenntnisse zu den Apobec3G/Vif-Interaktionen gewonnen werden. Durch Koimmunpräzipitationsstudien wurde die physikalische Interaktion von Vif und Apobec3G nachgewiesen. Zudem konnte gezeigt werden, dass in Gegenwart von Vif der Einbau von Apobec3G in die Viruspartikel gehemmt wird. Damit wurden erste Hinweise gefunden, dass Vif neben der Induktion des proteolytischen Abbaus von Apobec3G weitere Strategien anwendet, um die Inkorporation des antiviralen Faktors zu verhindern.
The cytochrome bc1 complex is a cornerstone in bioenergetic electron transfer chains, where it carries out tasks as diverse as respiration, photosynthesis, and nitrogen fixation. This homodimeric multisubunit membrane protein has been studied extensively for several decades and the enzyme mechanism is described with the modified protonmotive Q cycle. Still, the molecular and kinetic description of the catalytic cycle is not complete and questions remain regarding the bifurcation of electron transfer at the quinol oxidation (Qo) site, substrate occupancy, pathways of proton conduction, and the nature of the Rieske protein domain movement. We used competitive inhibitors to study the molecular architecture at the Qo site with X-ray crystallography. The structure of the enzyme with the substrate analog 5-n-heptyl-6-hydroxy-4,7-dioxobenzothiazole (HHDBT) bound at the Qo site was determined at 2.5 Å resolution. Spectroscopic studies showed that HHDBT is negatively charged when bound at the active site. Mechanistic interpretations from inhibitor binding are in line with single occupancy model for quinol oxidation and structural analysis supports the proposed proton transfer pathway. For functional insight into the enzyme mechanism, redox-sensitive protonation changes were studied by Fourier transform infrared spectroscopy. The protein purification procedure was optimized for less delipidation and the isolated enzyme was more active. Furthermore, two new phospholipids were identified in the X-ray structures, including a cardiolipin. Strikingly, conserved lipid binding cavities were observed in structural comparison with homologous enzymes. The functional role of tightly bound phospholipids will be discussed. Finally, the Qo site is a target for various compounds of agricultural and pharmaceutical importance. Importantly, the X-ray structures permit detailed analysis of the molecular reasons for acquired resistance to and treatment failure of Qo site inhibitors, such as atovaquone, that is used to treat malaria and pneumonia, as discussed herein.
The cytochrome bc1 complex or ubiquinol:cytochrome c oxidoreductase (QCR) catalyses electron transfer from ubiquinol to cytochrome c in respiration and photosynthesis coupled to a vectorial proton transport across the membrane, in which the enzyme resides. In both bacteria and eukaryotic organisms, QCR participates in supramolecular assembly of membrane proteins that comprise the respiratory or photosynthetic chain. In the present work, proton transfer pathways, substrate binding and the supramolecular assembly of the respiratory chain in yeast were probed by structure-based site-directed mutagenesis and characterization of the variants. Both active sites centre P, the place of quinol oxidation, and centre N, where quinone reduction takes place, lack direct access to the bulk solvent necessary for proton release and uptake. Based on the X-ray structure, proton transfer pathways were postulated. Analysis at centre P showed, that E272 and Y132 of cytochrome b are important for QCR catalysis as indicated by increased superoxide production and lowered Cyc1p reductase activity in these variants. Pre-steady state heme reduction kinetics in combination with stigmatellin resistance indicated that charge and length of the side chain at position 272 are crucial for efficient docking of the ISP to form the enzyme substrate complex and for electron bifurcation at centre P. Variants of Y312 and F129, both residues of cytochrome b, showed an increased Km indicating participation of these residues in coordination of ubiquinol or the possible intermediate semiquinone anion radical. F129 proved to be crucial for a functional Q-cycle as indicated by respiratory negative growth phenotype and a lowered H+/e- stoichiometry of F129 variants. At centre N, the postulated CL/K and E/R proton transfer pathways are located at opposite sites of the bound ubiquinone. Variants in the surface residues R218 (cytochrome b) and E52 (Qcr7) of the E/R pathway and E82 (Qcr7) of the CL/K pathway showed instability upon purification indicating an important role of these residues for QCR integrity. The slowed down centre N reduction kinetics in H85 (CL/K), R218 and N208 (both E/R) variant was attributed to a destabilised semiquinone anion consistent with the observed decreased sensitivity towards the site-specific inhibitor antimycin and an increased Km. Variants of residues of both pathway, E82Q and R218M, exhibited a decreased H+/e- stoichiometry indicating a crucial role of both residue for maintaining a working Q-cycle and supporting the proposed protonation of the substrate via the Cl/K and the E/R pathway. Long-range interaction between centre N and centre P were observed by altered reduction kinetics of the high potential chain and increased superoxide production in the centre N variants. The role of the cation-pi-interaction between F230 of Cyt1p and R19 of cytochrome c in binding of the redox carrier to QCR was analysed. In F230L hydrophobic interaction were partially lost as was deduced from the ionic strength dependence of Cyc1p reductase activity and Cycp1 binding, as detected by ionic strength sensitive Kd and Km for Cyc1p. The decreased enzymatic rate of F230W could be explained by a disturbed binding of Cyc1p to the variant enzyme. F230 may influence the heme mid point potential and thereby the electron transfer rate to Cyc1p. Reduction of Cobp via both centre P and centre N was disturbed suggesting an interaction between high and low potential chain. Supramolecular association between QCR and cytochrome c oxidase (COX) in yeast mitochondria was probed by affinity chromatography of a his-tagged QCR in the presence of the mild detergent digitonin. In comparison to purification with laurylmaltoside, the presence of both QCR and COX subunits was detected in the elution fractions by SDS-PAGE, Cyc1p reductase and TMPD oxidase activity assays and immunoblot analysis. The CL-dependent formation of the supercomplex between QCR and COX was analysed by replacement variants in the CL-binding site of QCR in CL containing and CL free environment. With an increasing number of replacements of the three lysines the CL-binding pocket supercomplex formation was not abolished, when CL is present as shown by BN-PAGE analysis. This was supported by the synergetic decrease in enzyme activity for both enzymes upon increased number of replacements. In the CL-free environment, no supracomplex formation was observed for a wildtype CL binding site. By replacements of two lysines in the CL-binding pocket, supercomplex formation could be recovered as revealed by BN-PAGE. This indicates, that CL may serve as a charge neutralizer for the lysines near the presumed interaction domain between complex III and complex IV. The obtained results for centre P provide new information of residues critical for stabilisation of ubiquinol and controlling electron short circuit reactions. The observations for centre N variants clearly support the proposed two proton transfer pathways and the role of the bound phospholipids in centre N kinetics. Variants in the Cyc1p binding site suggest a role for F230 both in Cyc1p binding and electron transfer. Clear interaction between the high and low potential chain in both Cyt1p and centre N variants strongly support long-range interactions in the complex. Studies on the supramolecular association of complex III and complex IV indicate a new role of Cl in stabilising a supracomplex.
Im Laufe der letzten Jahre hat sich die Aufmerksamkeit auf die Entwicklung von neuen RNA-bindenden Molekülen gerichtet. Grund dafür waren neue Erkenntnisse über die strukturelle und funktionelle Komplexität der RNA. So spielen spezifische RNA-Protein-Wechselwirkungen eine essentielle Rolle bei regulatorischen Prozessen. Die Spezifität dieser Interaktionen wird durch die dreidimensionale RNA-Struktur bestimmt. Somit bieten diese Wechselwirkungen ein attraktives Angriffsziel für die Suche nach niedermolekularen Substanzen, die in die regulatorischen Prozesse pathogener Organismen eingreifen. So gibt es im Replikationszyklus des HI-Virus mehrere essentielle Schritte, die der Interaktion zwischen charakteristischen, viralen RNA-Strukturen und der viralen Proteine bedürfen. Ein prominentes Beispiel ist die Verpackung der viralen RNA. Es handelt sich um einen hochspezifischen Prozess, bei dem aus einer Vielzahl von zellulären, viralen, gespleißten und ungespleißten RNA-Fragmenten, spezifisch die virale genomische RNA in die neu entstehende Partikel verpackt wird. Die Spezifität der Verpackung basiert auf der Erkennung der dreidimensionalen ps-Verpackungsstruktur am 5´-Ende der ungespleißten, viralen RNA durch die NCp7-Domäne des p55Gag- Vorläuferproteins. Die NCp7-Domäne ist durch zwei Zinkfingermotive, die in allen Onko- und Lentiviren mit Ausnahme der Spumaviren konserviert sind, gekennzeichnet. Durch die zentrale Rolle im HIV-1 Replikationszyklus bietet die ps-NCp7-Interaktion ein potentielles Angriffziel für antivirale Interventionen. Das langfristige Ziel des Projektes war die Identifizierung von Peptidliganden für das HIV-1 ps-Signal mittels der Phage-Display-Methode, welche die Basis für die Entwicklung antiviraler Moleküle liefern sollen. Die Methode des Phage-Display basiert auf der Affinitätsselektion von Peptiden, die als Fusionsproteine mit dem Hüllprotein an der Oberfläche eines Bakteriophagen exprimiert werden. Sie wurde sehr erfolgreich für die Selektion von Peptidliganden für Antikörper oder andere Proteindomänen eingesetzt. Für RNA-Targets gibt es nur gelegentliche Hinweise. Im Vordergrund des Projektes standen strukturelle Erkennungsmerkmale der Ligand-RNAWechselwirkung. Zur Identifizierung von Peptidliganden für das ps-Verpackungssignal sowie deren Teilelement SL3, das ebenfalls Verpackungsaktivitäten aufweist, wurden kommerzielle Phagen-Banken mit zufälliger Aminosäuresequenz eingesetzt. Im Rahmen des ersten Teilabschnitts konnten Phagen selektiert werden, die spezifisch an die Targetstrukturen gebunden haben und die Grundlage für die Ableitung von Peptidmotiven bildeten. Insgesamt konnten neun Motive abgeleitet werden, darunter das tryptophanreiche HXWPWW-Motiv, das Aminosäurehomologien zum nativen Liganden, dem NCp7-Protein, zeigte. Die Spezifität zur Ziel-RNA wurde mittels ELISA, CD-Spektroskopie und Peptidfilter-Bindungsstudien analysiert. Für die tryptophanreichen Peptide wurde die Affinität zur ps- und SL3-RNA ermittelt. Sie lag für das HWWPWWPeptid bei ca. 25 ± 2µM zur ps-RNA und bei ca. 34 ± 2µM zur SL3, also deutlich unter der Affinität des NCp7 (ca. 30nM). Entsprechend ließ sich das HWWPWW-Peptid in einem Kompetitions-ELISA mit ps-RNA als Target durch das native p55Gag- und NCp7-Protein, jedoch nicht durch ein unrelevantes RNA-bindendes Protein, verdrängen. Anschließend wurden mittels der CDspektroskopischen Mutationsanalyse die Bindungseigenschaften der Peptide optimiert, so dass zwei weitere Liganden, das HWWAWW- und HAWPWWPeptid, als potentielle ps-Liganden ermittelt werden konnten. Im zweiten Teil der Arbeit erfolgte die funktionelle Analyse der identifizierten Peptide hinsichtlich ihrer inhibitorischen Eigenschaften. Dazu wurden in HR´YFP-Zellen Pseudoviren, die das verpackbare Konstrukt ps-Yfp, sowie HIV-1 Gag-Pol und das Env des VSV-G enthielten, in Gegenwart des ps-bindenden Peptides, das als Rfp-Vpr-Fusionprotein vorlag, generiert. Eine Hemmung der Peptide auf die Verpackung der viralen RNA sollte dadurch messbar sein, dass die produzierten Pseudoviren weniger von der verpackbaren ps-Yfp-RNA enthielten als die Kontrollviren, die in Gegenwart eines Kontrollpeptids generiert wurden. Die Menge der Virus-RNA in den Partikeln wurde mittels einer quantitativen PCR-Methode, der Real-time-PCR, bestimmt. Einen hemmenden Einfluss auf die Verpackung der ps-Yfp-RNA und somit eine Inhibition der ps-NCp7-Interaktion hatte das HWWAWW-Peptid. Durch den Einsatz von 3 µg der HWWAWW-Rfp-Vpr-Vektors konnte die RNA-Menge um das fast 4000-fache im Vergleich zum Kontrollansatz reduziert werden.
Bei der in vitro Rückfaltung von entfaltetem, reduziertem Hirudin entstehen neben dem nativen Protein hauptsächlich zwei nicht-nativ gefaltete Konformere. Das Verhältnis von nativem und nicht-nativem Konformer lässt sich während der Rückfaltung durch verschiedene Parameter beeinflussen. Thiole wie reduziertes Glutathion (GSH), N-Acetylcystein (NAC) und Dithioerytritol (DTE) beeinflussten die in dieser Arbeit untersuchten Rückfaltungen auf verschiedene Weise. Während beim Zusatz von GSH sehr verstärkt die Bildung des nativen Konformers auftrat, wurde bei einem Zusatz von NAC und DTE einerseits ein leicht verbessertes Verhältnis von nativem zu nicht-nativem Konformer festgestellt, andererseits wurde aber eine stark vermehrte Oligomerbildung beobachtet. Die aufgestellte Theorie der Oligomerbildung konnte anhand graphischer Auswertung der zusätzlich auftretenden, im Nativgel höher laufenden Banden bestätigt werden. Bei Zusatz von GSH und GSSG (oxid. Glutathion) als Redoxpuffer im Molekülverhältnis 2:1 (10 mM) wurde bei 4°C eine vollständige Rückfaltung zum nativen Hirudin erreicht. Der Zusatz von 1 mM GSH bewirkte dagegen bei 28°C (höchste gewählte Temperatur) ebenfalls eine vollständige Rückfaltung zum nativen Hirudin-Konformer. Die Temperaturabhängigkeit der Rückfaltung zeigte sich auch in weiteren Untersuchungen. So ergaben die Rückfaltungen unter Zusatz von 1 mM DTE, NAC und 10 mM GSH bei 4°C eine wesentlich höhere Ausbeute an nativ gefaltetem Hirudin als bei höheren Temperaturen. Der pH-Wert im Bereich von 4,0 bis 8,0 veränderte das Rückfaltungsmuster von Hirudin in den durchgeführten Untersuchungen nicht, obwohl Literaturdaten auf ein pH-Optimum von 8-9 für erfolgreiche Rückfaltungen hindeuten. Nativ und nicht-nativ gefaltetes Hirudin sowie die ebenfalls während der Rückfaltung entstandenen Oligomere ließen sich HPLC-chromatographisch trennen. Die in den Nativgelen auftretende, sehr übereinanderliegende Doppelbande des nicht-nativen Hirudins konnte per HPLC in zwei verschiedenen Konformere getrennt werden. Eine positive Beeinflussung der in vitro-Rückfaltung von Hirudin durch einen Zusatz der Oxidoreduktase Thioredoxin konnte eindeutig nachgewiesen werden. Bei einem äquivalenten Gehalt an Tioredoxin wurde die Rückfaltung zum nativen Konformer eindeutig begünstigt. Ein katalytischer Gehalt an Thioredoxin (Thioredoxin:Hirudin im Verhältnis 1:10) bewirkte die Rückfaltung ausschließlich zu nativem Hirudin. Auch bei einem Zwanzigstel Äquivalent Thioredoxin war noch eine positive Beeinflussung feststellbar. Bei einer S. lividans-Expression von Hirudin über ein pAX5a-Derivat wurde fast ausschließlich nicht-nativ gefaltetes Hirudin produziert. Die nicht-native Faltung war in einem Nativgel deutlich von der nativen, aktiven Form des Inhibitors zu unterscheiden. Durch Zusätze von reduziertem (GSH) und oxidiertem Glutathion (GSSG) zum Wachstumsmedium konnte der Anteil an nativem Hirudin erhöht werden. Die Zusätze beeinflussten aber stark die Gesamtausbeute des sekretierten Proteins. So wurden unter Zugabe von 1 mM GSH Ausbeuten von 200 mg/L Hirudin erreicht, davon 2 mg/L natives Protein. Die Gegenwart von verschiedenen Verhältnissen von GSH und GSSG (Gesamtkonzentration 1mM Thiol) reduzierte die Hirudinproduktion auf 20 – 32 mg/L, darunter war kein erkennbarer Anteil an nativem Hirudin. Ein Zusatz von gleichen Verhältnissen von GSH und GSSG in höherer Konzentration (10 mM) resultierte in einer Steigerung des Anteils an nativem Inhibitor auf 14 %, die Gesamtausbeute an Hirudin sinkt aber deutlich (15 mg/L insgesamt, 2 mg/L natives Protein). Die Oxidoreduktase Thioredoxin wurde ebenfalls über ein pAX5a-Derivat in S. lividans-Kultivierungen mit einer Ausbeute von 65 mg/L gewonnen. Eine Coexpression von Thioredoxin und Hirudin über ein bicistronisches Gen in einem pAX5a-Derivat resultierte in einer Proteinproduktion von 4 mg/L Thioredoxin und 20 mg/L Hirudin. Obwohl ein Verhältnis von 0,2:1 Moläquivalenten (Thioredoxin:Hirudin) in den in vitro-Rückfaltungen zu 100 % nativ gefaltetem Inhibitor führte, war in den Kultivierungen kein positiver Einfluß des Thioredoxins auf die Hirudinfaltung erkennbar. Die Expression von Thioredoxin setzte zeitlich sehr viel früher als die Hirudin-Expression. Die Produktion von Hirudin über einen integrativen Vektor erzielte 600 - 700 mg/L Protein. Wie in anderen Hirudinkultivierungen ohne Thiolzusatz wurde Hirudin ausschließlich in der inaktiven, nicht-nativen Struktur produziert. Kultivierungen der mit dem integrativen Thioredoxin-Vektor infizierten S. lividans-Zellen erzielten dagegen kein Protein. Die Coexpression von Hirudin und Thioredoxin scheiterte an dem nicht zu generierenden, bicistronischen integrativen Vektor. Um die Isomeraseaktivität des Thioredoxins zu erhöhen und somit eine größere Beeinflussung der Hirudinfaltung zu erzielen, wurden Thioredoxinmutanten hergestellt. Die redoxaktiven CXXC-Zentren der generierten Thioredoxine enthalten die Aminosäuresequenzen der CXXC-Motive von E. coli DsbA und DsbC und humanem PDI. Die Expression aller Mutanten gelang in zwei verschiedenen Medien. Eine Isolierung und Anwendung der gereinigten Mutanten in der Hirudinfaltung wurde im Rahmen dieser Arbeit nicht mehr durchgeführt. Die Konstrukte stehen für weitere Arbeiten zur Verfügung. In vergleichenden Expressionen mit fünf verschiedenen Signalsequenzen wurden sowohl das homologe Streptomyces-Protein Tendamistat als auch das heterologe Hirudin über jeweils alle Signalpeptide exprimiert. Tendamistat wurde schon zu Beginn der exponentiellen Wachstumsphase exprimiert Innerhalb der verschiedenen Kultivierungen wurden unterschiedlich hohe Expressionswerte erreicht. Eine ausgeprägte Anreicherung von Vorläufer-Proteinen in der Zelle fand nicht statt. Neben dem vorwiegend nativ prozessierten Tendamiastat zeigte eine Analyse der Massendaten eine teilweise falsche Prozessierung der AxeA-, CelB- und SnpA-Signalpeptide. Hirudin konnte ebenfalls über alle fünf Signalpeptide exprimiert werden. Dabei wurde fast quantitativ nicht-nativ gefaltetes Hirudin sekretiert. Die Höhe der Expression über die verschiedenen Signalpeptiden war unterschiedlich hoch, wobei die Unterschiede geringer als bei der Tendamistat-Expression waren. Die Massenanalytik belegte, dass die Prozessierung des heterologen Hirudins wesentlich uneinheitlicher erfolgte als die Prozessierung des homologen Tendamistats. Ein Zusammenhang zwischen der Expressionshöhe beider Proteine und verschiedener Strukturmerkmale der Signalpeptide konnte nicht festgestellt werden. So wurde die in der Literatur aufgestellte These, dass in der n-Domäne mindestens zwei Ladungen enthalten sein müssen, in dieser Arbeit nicht bestätigt. Weder die Struktur noch die unterschiedliche Ladung der n-Domäne der Signalpeptide zeigten einen eindeutigen Zusammenhang mit der Expressionshöhe der Proteine. Auch eine Verknüpfung zwischen der Länge der h-Domäne und der Expressionshöhe konnte weder für die Tendamistat- noch für die Hirudinexpression erstellt werden. Die Positionierung von Glutamin an Position –2 innerhalb der c-Domäne schien in der Tendamistatexpression bezüglich der Proteinausbeute von Vorteil zu sein. Bei der Expression von Hirudin wurde ein ähnlicher Trend nicht gefunden. Die Proteinproduktion über ein Signalpeptid mit enthaltenem TTALeu-Codon war entgegen Literaturaussagen möglich und verminderte - wie in der Hirudinexpression gezeigt - nicht automatisch die Expressionshöhe. Bei den Tendamistatkultivierungen wurde dieser Einfluss jedoch deutlich. Theoretische Betrachtungen zur Prozessierung anhand von Rechenmodellen waren hilfreich, um Beobachtungen zu erklären oder zu deuten. So wurde eine Erklärung der zusätzlichen falschen Prozessierung der Sigalpeptide vom homologen und auch vom heterologen Protein über theoretische Modelle wie z. B. eine Schnittstellenberechnung teilweise möglich. Die Überlegungen zum Transmembran-Bereich der Signalpeptide zeigen im Vergleich der Berechnungen für Tendamisitat und Hirudin, dass die Ladung des N-Terminus des anhängenden Proteins ein Rolle bei die Positionierung des Signalpaptids innerhalb der Membran spielt und somit auch für die Präsentation der Schnittstelle und eine erfolgreiche Prozessierung verantwortlich ist. Die bisher verfügbaren Literaturdaten lassen darauf schließen, dass es allgemeine Richtlinien in Bezug auf Aminosäurezusammensetzung, sowie Ladung und Länge der Signalpeptide gibt, deren Mißachtung eine Verringerung der Expressionshöhe von Proteinen bewirken. Diese Richtlinien scheinen aber hauptsächlich bei einzeln eingefügten Mutationen zu bestehen. Werden, wie in dieser Arbeit vorgestellt, ganze Signalpeptide ausgetauscht und die resultierende Expression beobachtet, können viele dieser Vorgaben nicht verifiziert werden oder stimmen nur in Einzelfällen überein. Trotzdem zeigt diese Arbeit, dass theoretische Betrachtungen für Vorhersagen zur Proteinexpression unabdingbar sind.
Die Reinigung von Siliciumoberflächen verbraucht große Mengen von hochreinen und teueren Chemikalien. Komplexbildner dienen der Maskierung von Metallionen in den Reinigungschemikalien mit dem Ziel, die vorhandenen Reinigungsverfahren zu vereinfachen, den Reinigungsvorgang zu beschleunigen und Chemikalien und Kosten zu sparen. Zur Beurteilung, ob ein Komplexbildner für diese Anwendung geeignet ist, bedarf es eines analytischen Verfahrens zur Bestimmung seiner Stabilität in Halbleitersilicium-Reinigungsbädern. In der vorliegenden Arbeit sollte untersucht werden ob die HPLC für diese Aufgabe eingesetzt werden kann. Zusätzlich sollte versucht werden, über die Detektion und die Identifizierung von Zersetzungsprodukten Informationen über die Zersetzungsreaktion zu gewinnen. Es wurden Untersuchungen zur Komplexbildnerstabilität in verschiedenen Reinigungsbädern und in 30% H2O2 durchgeführt. Vier strukturell unterschiedliche Komplexbildner wurden untersucht. Pyrinan (N, N´, N´´-Tris (3-hydroxy-6-methyl-2-pyridylmethyl) 1, 4, 7-Triazacyclononan), ABS-BAMTPH (N,N’,N’’-tris [2-(N-hydroxycarbamoyl) propyl]-1,3,5-benzentricarboxamid), Tiron (Dinatrium-1,2-Dihydroxybenzen-3,5-Disulfonsäure) und die Pyridinone (3-Hydroxy-4(1H)-pyridinone). Bei den Pyridinonen handelte es sich um eine Gruppe von Komplexbildnern mit dem gleichen Grundgerüst, welches mit unterschiedlichen Substituenten verbunden war. Das Verhalten der Pyridinone in 30% H2O2 zeigt, dass es möglich ist mit relativ geringen Modifikationen der Molekülstruktur die Stabilität dieser Komplexbildner gegen Zersetzung zu steigern. Die auftretenden Zersetzungsprodukte wurden mit HPLC-MS untersucht. Die Beobachtung, dass in 30% H2O2 und in dem Reinigungsbad APM (H2O2/NH3/H2O-Gemisch) jeweils identische Zersetzungsprodukte auftraten deutet darauf hin, dass in beiden Fällen eine Oxidation durch H2O2 stattfindet. Die in 30% H2O2 beständigsten Komplexbildner waren ESEHP (Sulfoniumsubstituent) und BMHP (Alkylsubstituent). In APM war ECEHP am stabilsten (Carboxylsubstituent). Tiron wurde nur in 30% H2O2 untersucht. Seine Stabilität wird in dieser Lösung nur von 2 der 13 untersuchten Pyridinone, ESEHP und BMHP, übertroffen. Es wurden keine Zersetzungsprodukte detektiert. ABS-BAMTPH hingegen wurde nur in APM untersucht. In APM erwies sich ABS-BAMTPH als der am wenigsten stabile von allen untersuchten Komplexbildnern. Die Brauchbarkeit von ABS-BAMTPH wurde zusätzlich durch einen hohen Anteil an Nebenprodukten eingeschränkt, die bei der Synthese des Komplexbildners entstanden waren. Die Nebenprodukte konnten mittels HPLC-MS und Kenntnis des Syntheseweges identifiziert werden. Über die Zersetzungsreaktion(en) des Pyrinan konnte mit Hilfe von HPLC-MS und MS/MS eine Reihe von Informationen gewonnen werden. Eine Abfolge von Reaktionen wird zur Erklärung der beobachteten Zersetzung vorgeschlagen. Alle Reaktionen laufen an den 3 tertiären Amin-Stickstoffatomen des Pyrinans ab. Diese stellen den Schwachpunkt der Pyrinanstruktur dar. Die Bildung von Aminoxiden leitet die Zersetzung ein. Die Aminoxide reagieren über eine Meisenheimer-Umlagerung weiter. Eine komplexierende Wirkung der Zersetzungsprodukte kann aufgrund der beobachteten Stabilisierung des H2O2 gegen die durch Übergangsmetallionen katalysierte Disproportionierung angenommen werden. Die vorliegende Arbeit zeigt, das die HPLC zur Untersuchung der Stabilität von Komplexbildnern in Halbleiter-Reinigungschemikalien geeignet ist. Die HPLC-MS und die MS/MS lieferten zusätzliche Informationen über Zersetzungsprodukte und die stattfindenden Zersetzungsreaktionen. Die HPLC-MS ist darin den bisher in der Halbleiterindustrie für diese Fragestellung benutzten analytischen Methoden überlegen.
Proton-translocating NADH:ubiquinone oxidoreductase (complex I) transports two electrons from NADH to membranal ubiquinone: in this process protons are translocated across the membrane, producing 40% of the total proton gradient between matrix side and intermembrane space. Mitochondrial complex I contains at least 46 subunits in mammals, and has a molecular weight of around 1000 kDa. Electronic microscopy analysis showed that complex I has an L-form, which consists of two domains: a peripheral “arm” (hydrophilic domain) and a membrane “arm” (hydrophobic domain). The peripheral domain, which protrudes into the matrix, contains one non-covalently bound flavin mononucleotide (FMN) and the iron-sulfur clusters N1a, N1b, N2, N3, N4 and N5 as redox active groups. They transport electrons from NADH to ubiquinone. Cluster N2 is supposed to be the immediate electron donor to ubiquinone by virtue of its highest and pH dependent redox midpoint potential (Em,7 –150 mV). The exact location of the tetra-nuclear cluster N2 is still object of discussion. The TYKY and the PSST subunits contain three binding motifs for tetranuclear clusters which are formed by twelve cysteins. In an effort to investigate the “ubiquinone reduction module” of complex I, in the first part of this work site directed mutagenesis of the TYKY and PSST subunits has been carried out. Mutant strains were characterised in terms of complex I content, catalytic activity and EPR signature of cluster N2. The second part of this work was aimed at developing a substrate inducible version of the internal alternative NADH:ubiquinone oxidoreductase (NDH2i). A substrate inducible NDH2i is expected to offer a “switch” between complex I activity dependent (no NDH2i activity) and independent (NDH2i activity) cell growth, by changing between activating and non-activating substrates. This strategy would allow the screening for two types of complex I mutants, which is a prerequisite for realising a random PCR mutagenesis of single subunits of complex I, that allows the production of a high number of point mutations in relatively short time. Y. lipolytica complex I deficiency mutant strains could be easily identified, by virtue of their inability to survive under complex I dependent growth conditions (no NDH2i activity). By this way, amino acids that have an important role for complex I structure or function could be identified by subsequent sequence analysis. Each of the twelve cysteines that form the above mentioned three binding motifs for iron-sulfur cluster have been mutagenised. In mutant mitochondrial membranes, no assembled complex I could be detected. From these data one may conclude that the mutagenised 6 SUMMARY 92 cysteines play an important role for complex I stability, or that are a prerequisite for complex I assembly in Y. lipolytica, but there is not direct evidence indicating that any of the four mutagenised residues acts as a ligand. Two aspartates in the PSST subunit, Asp-99 and Asp-115, were found to be essential for complex I catalytic activity. EPR spectroscopic analysis indicated that the electron transfer to N2 cluster was not blocked and implied that this was not the reason for the loss of catalytic activity. From these data it can be concluded that D99 and D115 play a vital role for complex I NADH:ubiquinone reductase activity, but are not ligands for cluster N2 and that their position is not close enough to the cluster to influence directly its electromagnetic environment. Three mutations, identified in the PSST and TYKY homologous subunits of patients affected with Leigh syndrome (V119M in PSST, P78L and R101H in TYKY) were reconstructed in the obligate aerobic yeast Y. lipolytica. This approach may help to understand the aetiology of the Leigh syndrome, in terms of the ability of complex I to oxidize NADH and to transport electrons. In fact, all three mutations showed effects on electron transport, reducing the VMax by about 50%. Mutant V119M in the PSST subunit, which had a lethal effect in two patients that were homozygous for this mutation, affects a fully conserved residue. Overall, the results from site directed mutagenesis carried out so far support the theory that the “catalytic core ” (N2 cluster and quinone binding site) of complex I has been evolved from the electron transfer module of the [Ni-Fe] hydrogenases. In fact, mutagenesis of residues that are fully conserved between complex I and [Ni-Fe] hydrogenases, showed dramatic effects on complex I in terms of assembly (cysteine mutants) or catalytic activity (D99-D115). Differently, changing aspartate 174 and glutamic acid 185 (not fully conserved, Fig 4.1A) had little or no effect on the Michaelis-Menten parameters and N2 EPR signal. In recent years Y. lipolytica has been developed as a yeast genetic system to study mitochondrial complex I. The present work introduced the promoter for the isocitrate lyase (pICL1) as a useful tool for the substrate selective expression of the internal version of the alternative NADH:ubiquinone oxidoreductase (pICL1-NDH2i). This allows to rescue complex I deficiencies “in vivo” selectively by growth on acetate (or ethanol) medium. The integration of the pICL1-NDH2i construct into the genome of Y. lipolytica and subsequent deletion of nuclear-coded subunits like PSST, TYKY and 49 kDa, would contribute to further develop this organism as a useful genetic model for studying subunits of mitochondrial complex I by site directed mutagenesis.
Charakterisierung der alternativen NADH-Ubichinon-Oxidoreduktase (NDH2) aus Yarrowia lipolytica
(2004)
Neben dem protonenpumpenden Komplex I (NDH-1) der Atmungskette besitzt die obligat aerobe Hefe Yarrowia lipolytica eine alternative NADH:Ubichinon Oxidoreduktase (NDH-2). Diese Enzyme, die in den Atmungsketten von Pflanzen, Pilzen und Bakterien vorkommen, bestehen aus nur einer Untereinheit, führen jedoch dieselbe Reaktion aus wie Komplex I, nämlich die Elektronenübertragung von NADH auf Ubichinon, wobei allerdings keine Protonen über die Membran transloziert werden. Nur peripher mit der Membran assoziiert, können alternative Dehydrogenasen entweder zur cytosolischen Seite (extern) oder zur Matrixseite (intern) orientiert sein. Y. lipolytica besitzt im Gegensatz zu anderen Ascomyceten nur eine einzige extern orientierte alternative Dehydrogenase mit einer vorhergesagten Masse von ca. 60 kD und einem nicht kovalent gebundenem Molekül FAD als Cofaktor. Durch Fusion des Leserasters mit der Präsequenz der 75 kD Untereinheit von Komplex I war die interne Expression des Enzyms (NDH2i) gelungen, die das Überleben von Komplex I Deletionsmutanten ermöglichte. Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurde die alternative Dehydrogenase von Y. lipolytica innerhalb ihrer natürlichen Membranumgebung charakterisiert. Das Enzym reagierte mit verschiedenen Chinonanaloga, wobei mit dem hydrophilen Q1 eine höhere katalytische Rate erzielt wurde als mit DBQ, das dem natürlich vorkommenden Q9 am ähnlichsten ist. Da hydrophobe Substrate fast ausschließlich in der Lipidphase der Membranen gelöst vorliegen, musste bei der Bestimmung von kinetischen Parametern (ebenso wie bei Komplex I) auf eine gleichbleibend große Membranphase im Messvolumen geachtet werden. Mit dem standardmäßig benutzten Substrat DBQ reagierte YLNDH2 nach einem Ping-Pong Reaktionsmechanismus. Dieser beschreibt eine abwechselnde Bindung der beiden Substrate, wobei das Enzym die Elektronen von NADH aufnimmt (E-FADH2) und an Ubichinon weitergibt (E-FAD); es existiert kein ternärer Enzym-Substrat Komplex. Gestützt durch Kristallstrukturen des analogen Enzyms QR1 mit NADPH bzw. mit Durochinon, liegt die Vermutung nahe, dass beide Substrate in ähnlicher Weise und sehr wahrscheinlich in der gleichen Bindungstasche binden. Ein Ping-Pong Reaktionsmechanismus wurde bereits für die NADH:DCPIP Oxidoreduktase Aktivität von zwei weiteren alternativen Enzymen postuliert, jedoch noch nie für ein physiologisches Substrat. Als bislang wirksamster Inhibitor für alternative Dehydrogenasen wurde 1-hydroxy-2-dodecyl-4(1H)chinolon (HDQ) entdeckt. HDQ hemmte NDH2 in Membranen aus Y. lipolytica mit einer I50 von 200 nM, was der 500fachen Hemmwirkung des gängig verwendeten Flavon auf das isolierte Enzym NDI1 von S. cerevisiae entspricht. Allerdings hemmte HDQ auch Komplex I mit einer I50 von 2 µM, ähnlich wie es bei Platanetin in Pflanzenmitochondrien der Fall war [Roberts et al., 1996]. Mit dem Ziel, ein polyklonales Antiserum gegen die native YLNDH2 zu generieren, wurde das Enzym in E. coli heterolog exprimiert. Die Expression führte zur Bildung von Einschlusskörpern, aus denen das rekombinante Enzym unter denaturierenden Bedingungen gereinigt und zur Immunisierung eines Kaninchens verwendet werden konnte. Das Antiserum kreuzreagierte mit der nativen und der internen Version von YLNDH2 und zeigte nur wenige unspezifische Bindungen. Es wurde gezeigt, dass Y. lipolytica Stämme ohne NDH2 und Komplex I mit NDH2i als einziger Dehydrogenase erzeugt werden konnten. In N. crassa war der Versuch, NDE2 und Komplex I gleichzeitig zu deletieren, gescheitert, was zu der Schlussfolgerung führte, dass sich die beiden Enzyme in diesem Organismus möglicherweise kompensieren könnten. Dies war in Y. lipolytica ausgeschlossen worden, da wahrscheinlich kein (oder nur unzureichender) Austausch zwischen matrixständigem und cytosolischem NADH stattfindet. Die zielgerichtete Mutagenese hochkonservierter Bereiche im offenen Leserahmen von YLNDH2 lieferte das eindeutige Ergebnis, dass die zweite der beiden beta-alpha-beta-Bindungsdomänen NADH binden muß, da sich der KM Wert für NADH bei Mutation des essentiellen sauren Restes E320 dratisch erhöhte. Alle Mutationen, die die Dinukleotid Bindungsdomäne I betrafen, die danach folgerichtig den Cofaktor FAD binden muß, führten zu einem vollständigen Verlust von NDH2. Dieselbe Zuordnung der Bindungsstellen war bereits von Björklöf et al. [2000] vorgeschlagen worden. Eine Chinonbindungstelle konnte durch Mutagenese der beiden apolar/aromatischen Bereiche der Sequenz nicht identifiziert werden. Die Modifikation des C-Terminus von NDH2i führte zu nicht mehr messbarer Aktivität und stark verringerter Expression des Enzyms in mitochondrialen Membranen (siehe Anhang 7.5.1.1). Es kann daher vermutet werden, dass der C-Terminus für die korrekte Faltung eine wichtige Rolle spielt, möglicherweise sogar bei der Membranassoziation, wie bei Rasmusson [1999] vorgeschlagen wurde. Interessant war in diesem Zusammenhang, dass die C-terminal modifizierte NDH2i trotzdem das Überleben von Komplex I Deletionsmutanten bzw. das Wachstum auf DQA ermöglichte. In Membranen, die einen unterschiedlichen Gehalt an NDH2, jedoch die gleiche Gesamtmenge an Protein enthielten, wurde eine unerwartete lineare Abhängigkeit zwischen KM und Vmax Werten beobachtet. Dieses Phänomen wurde mit dem Modell der externen Diffusionslimitierung beschrieben, die in ähnlicher Weise auch bei immobilisierten Enzymen auftritt. Danach wird die Geschwindigkeit der enzymatischen Reaktion von YLNDH2 sowohl durch die kinetisch kontrollierte Rate, als auch durch die Transportrate des Ubichinons bestimmt, das aus der Membran heraus in die wässrige Umgebung des katalytischen Zentrums gelangen muss. Aus diesem Grund ist nicht nur die Maximalgeschwindigkeit, sondern auch die Michaelis Menten Konstante KM abhängig vom Gehalt des Enzyms in Membranen. Dies führte bei niedrig exprimierten mutanten Enzymen zur gleichzeitigen Abnahme von KM und Vmax. Eine externe Diffusionskontrolle der enzymatischen Reaktion wurde auch für Komplex I, dessen Reaktionszentrum im peripheren Arm vermutet werden kann, aber nicht für Komplex III aus S. cerevisiae, dessen Chinonbindungsstellen sich definitiv in hydrophober Umgebung befinden, beobachtet.
Wasserstoffbrücken als strukturbildendes Element : Synthese und Berechnung supramolekularer Komplexe
(2004)
Die nicht-kovalente Synthese sowie die Berechnung der supramolekularen Komplexe wurden anhand dreier unterschiedlicher Stoffklassen demonstriert. Ziel war es, supramolekulare Dimere zu kristallisieren, die durch zwei Wasserstoffbrücken zusammengehalten werden. Die zuerst untersuchten Indol-Derivate waren potentiell selbstkomplementär. Während der Donor im starren Indol-Ring lag, befand sich der Akzeptor in der Seitenkette, was zu konformationell flexiblen Verbindungen führte. Durch Variation des Abstandes von Donor und Akzeptor, was einer Verlängerung der Seitenkette durch zusätzliche CH2-Gruppen entsprach, sollte herausgefunden werden, bei welcher geometrischen Anordnung dimere Komplexe entstehen Die Ergebnisse zeigten, daß die gewünschten Dimere erst bei einer Kettenlänge von drei CH2-Gruppen um Kristall zu beobachten waren. Diese konformationell flexiblen Verbindungen wiesen somit große Unterschiede zwischen berechneter und realer Komplexgeometrie auf, die darauf zurückzuführen sind, daß im Kristall eine Vielzahl von Molekülen wechselwirken, während in der Rechnung mit dem Kraftfeldprogramm MOMO nur zwei Moleküle berücksichtigt werden. Somit führt die „Sandwich“-Form zu einer günstigeren van-der-Waals-Energie als die planare Form. Im zweiten Abschnitt dieser Arbeit konzentrierten sich unsere Untersuchungen auf die Substanzklasse der Acetylhydrazone, welche ebenfalls potentiell selbstkomplementäre Verbindungen darstellen. Im Gegensatz zu den Indol-Derivaten wurde hier der Abstand zwischen Donor und Akzeptor konstant gehalten, um zu untersuchen, wie sich unterschiedliche Reste der Acetylhydrazone auf die Konformation der Moleküle und somit auch auf die Komplexgeometrie auswirken. Zu diesem Zweck wurde eine Reihe von Verbindungen mit Resten unterschiedlicher sterischer Hinderung synthetisiert. Ziel war es auch in dieser Verbindungsklasse gezielt Dimere mit zwei Wasserstoffbrücken zu kristallisieren. Eine Suche in der CSD zeigte schnell, daß Acetylhydrazone zwei Vorzugskonformationen besitzen: eine, in der Donor und Akzeptor eine anti-Anordnung besitzen, was in der Regel zu kettenförmigen Wasserstoffbrücken führt, und eine syn-Anordnung, die zu den gewünschten Dimeren führen sollte. Es galt nun zu untersuchen, welche dieser Reste zur syn-Konformation führt und welches die Vorzugskonformation der Acetylhydrazone ist. Die Untersuchungen zeigten, daß zwei sterisch anspruchsvolle Reste zur syn-Anordnung von Donor und Akzeptor führen und somit zu Dimeren im Kristall. Verbindungen mit zwei sterisch wenig anspruchsvollen Resten lagen hingegen in der anti-Konformation vor und bildeten wie erwartet Polymere. Für die Acetylhydrazone konnte folgende These aufgestellt werden: Die syn-Konformation entsteht, wenn beide Reste drei oder mehr (Kohlenstoff-) Atome besitzen, anderenfalls entsteht die anti-Anordnung. Die Rechnungen lieferten, bis auf eine Ausnahme, supramolekulare Dimere mit zwei Wasserstoffbrücken. Für jene Verbindungen, die ebenfalls in der syn-Konformation in Dimeren kristallisieren, ist die Übereinstimmung zwischen der berechneten und der realen Komplexgeometrie sehr gut. Im letzten Kapitel dieser Arbeit sollten heteromolekulare Komplexe, also solche, die aus zwei unterschiedlichen Molekülen bestehen, untersucht werden. Die erste der eingesetzten Verbindungen sollte zwei Donor-Gruppen enthalten, während die zweite Verbindung zwei Akzeptoren besitzen sollte. Dabei wurde eine Reihe von Diol-Dion-Komplexen untersucht. Dabei gelang es nur einen dieser Komplexe zu kristallisieren und experimentell zu untersuchen. Leider lagen keine Dimere vor, sondern es bildete sich ein 2:1-Komplex (Diol/Dion), der kettenförmige Wasserstoffbrücken ausbildete. Erfreulich war hingegen, daß eine Konformationänderung des Dions zu beobachten war; denn gegenüber der Kristallstruktur der reinen Verbindung lag 25 im Komplex als planare Verbindung vor. Gleichzeitig wurden die möglichen Komplexgeometrien mit MOMO berechnet. Die meisten der berechneten Komplexe wiesen Dimere mit den gewünschten zwei Wasserstoffbrücken auf.
A new experimental setup, for pump-probe fs DFWM measurements, which is based on a femtosecond laser system, has been constructed. It allows for the investigation of molecular species in the gas phase at different temperatures, from ~30 K in a seeded supersonic jet up to ~500 K in a heat-pipe oven. In comparison to other RCS methods the employed fs DFWM technique is less complicated and gives much higher signal-to-noise ratio [BFZ86, FeZ95a, CKS89, CCH90, HCF91, WRM02, Rie02]. A general computer code for the simulation of fs DFWM spectra of nonrigid asymmetric top molecules has been developed. This new DFWM code in combination with a non-linear fitting routine allows one to determine rotational and centrifugal distortion constants and obtain information on the polarizability tensor components from the experimental spectra. Fs DFWM spectroscopy was successfully applied to the medium-sized molecules benzene and benzene-d6 in a gas cell and in a supersonic jet. The spectrum from a seeded expansion has been measured up to delay time of 3.9 ns (restricted by the length of the delay stage) with excellent signal-to-noise ratio (102-103). In that way 87 and 72 J-type transients have been recorded for benzene and benzene-d6, correspondingly. A relative accuracy on the order of 10-5 has been achieved for the rotational constant. From the room temperature experiments, precise values of centrifugal distortion constants DJ and DJK have been extracted. The literature data for cyclohexane have been revised and a new precise rotational constant B0 has been obtained, which is (+5.5 MHz) shifted from the one reported in the former Raman investigation by Peters et al. [PWW73]. Additionally, high-level ab initio calculations of cyclohexane have been carried out using a large number of basis sets at several levels of theory. In particular, the vibrational averaging effects have been examined in order to critically compare the experimentally determined and theoretically evaluated rotational constants. The contribution of highly symmetric vibrational modes to vibrational averaging effects was clarified. More structural information could be obtained from fs DFWM measurements of asymmetric top species, since different type of rotational recurrences can appear, and all three rotational constants (A, B, C) can be extracted. On the other hand the analysis of the asymmetric top spectra is no longer trivial. In fact the simple formula for rotational recurrence periods of symmetric top species (Tab. 2.1) can not be applied to asymmetric top molecules. Thus, in order to extract high-resolution data for asymmetric species, a complete fitting of the experimental spectra is necessary. The fs DFWM and (1+2') PPI method have been applied to the asymmetric top molecules pyridine in the ground (S0) and pDFB in the S0 and electronically excited (S1) states. By fitting the measured fs DFWM spectra the rotational and centrifugal distortion constants have been extracted with good precision and the value of the parametrized polarizability angle of pDFB was obtained. In this work, the first application of fs DFWM spectroscopy to a molecular cluster has been reported. Also, the chemical equilibrium between monomeric and dimeric species was studied. In particular formic and acetic acid have been investigated in a gas cell and in a supersonic expansion. Many spectral features have been observed and analized in the fs DFWM spectrum of formic acid vapor in a gas cell at room temperature. Most of them were attributed to rotational recurrences of the formic acid monomer, but also spectral feature originating from the formic acid dimer of O-H×××O/O×××H-O type have been detected and analyzed. From the fitted simulation, the rotational and centrifugal distortion constants, and parametrized polarizability angle were extracted for the dimeric structure of O-H×××O/O×××HO type. With the assumption of unperturbed monomers a center-of-mass distance of R = 2.990 ± 0.001 Å for the monomers within the dimer has been calculated from the spectroscopic results. This distance is 0.028 Å smaller than that reported from electron diffraction [ABM69]. Thus, the centers-of-mass distance was assigned as the main point of disagreement between results of fs DFWM and electron diffraction experiments. In contrast to formic acid, acetic acid shows strong recurrences from dimeric species even in the fs DFWM spectra at room temperature. This is explained in terms of different symmetry of the moments-of-inertia tensor, which modulates the intensity of RRs (the fs DFWM signal is in general stronger from symmetric species). Due to the symmetric nature of the acetic acid dimer, only the sum (B+C) of the rotational constants has been extracted. The changes of geometrical parameters upon dimer formation have been analyzed for, both, formic and acetic acid. A heat-pipe oven has been used in order to overcome the main drawback of fs DFWM spectroscopy – the square dependence of the signal intensity on the sample number density. Two-ring molecules (cyclohexylbenzene, para-cyclohexylaniline and nicotine) with low vapor pressure (<0.1 mbar) at room temperature have been investigated. From the analysis of the experimental and ab-initio results for CHB and pCHA a nearly perpendicular conformation of the aromatic vs. cyclohexane ring for both system is inferred. The enlargement of the benzene ring of CHB in the electronically excited state (S1) has been found to cause the smaller rotational constants in S1. This conclusion has been drawn from the comparison of the ground and electronically excited state experimental rotational constants in combination with ab-initio calculations. The extraction of precise structural information for nicotine was not possible due to it weak fs DFWM signal. However, the fact that fs DFWM technique can be applied to conformational analysis of molecular species in an equilibrium mixture opens other applications for this kind of spectroscopy. In general the results obtained in this work show that the fs DFWM technique, being an experimental implementation of RCS, provides one with an important tool for structural analysis of molecular species in the gas phase in particular for the species to which microwave spectroscopy can not be applied. It gives spectra with excellent signal-to-noise ratio even at low number density samples expanded in a seeded supersonic jet. It provides an alternative and innovative approach towards rotational Raman spectroscopy of large polyatomic molecules applicable under various experimental conditions (broad temperature and pressure range). With the introduction of femtosecond (10-15s) laser pulses (usually picosecond (10-12s) laser pulses were used in RCS) an improvement in time-resolution and therefore in precision for the rotational constants by more than one order of magnitude has been achieved. Molecular systems in the ground electronic state without permanent dipole moment and chromophore can be studied with high precision, providing thereby molecular benchmark systems for the electronic structure theory. As has been shown, the study of molecular clusters by fs DFWM spectroscopy is possible, but its potential are restricted by the square dependence of the fs DFWM signal from the sample number density, which is even more important for supersonic jet expansions. Here, the application of near-resonant and resonant FWM schemes should help in order to compensate for the low sample concentration. With the introduction of the heat pipe oven for fs DFWM experiments, the investigation of large nonvolatile molecules under equilibrium conditions is possible now. In our laboratory the first results on the structural analysis of different conformers of pyrrolidine in the gas phase have been obtained [MaR04]. This method can have even more prospects for the structural investigations of large molecular species in combination with new non-thermal gas phase sources for nonvolatile molecules, like laser desorption [CTL89], laser oblation [MHL83], electrospray [FMM90], laser induced liquid beam ion desorption [KAB96, Sob00] etc. A very recent application of the fs DFWM technique is the investigation of the influence of strong laser fields on molecular gas phase sample, which could range from active alignment [PPB03] over molecular deformation to field ionization [CSD03]. In regards to future development in fs DFWM spectroscopy for more complex molecules one has to take into account, how large amplitude motions such as the van der Waals vibrations or internal rotation (see section 6.4.2) affect the rotational coherences. In any case, femtosecond Degenerate Four-Wave Mixing as experimental implementation of Rotational Coherence Spectroscopy can be considered as an innovative, developing, and powerful method for the structural investigation of the molecular species, which are hard to study by classical frequency-resolved spectroscopy [FeZ95a, Dan01, Rie02].
Nitric oxide (NO) represents a short-lived mediator that pivotally drives keratinocyte movements during cutaneous wound healing. In this study, we have identified p68 DEAD box RNA helicase (p68) from a NO-induced differential keratinocyte cDNA library. Subsequently, we have analyzed regulation of p68 by wound-associated mediators in the human keratinocyte cell line HaCaT. NO, serum, growth factors and pro-inflammatory cytokines were potent inducers of p68 expression in the cells. p68 was constitutively expressed in murine skin, but rapidly down-regulated upon injury. The down-regulation appeared to be transient, as p68 protein expression increased again after the inflammatory phase of repair. However, p68 protein expression did not completely disappear during wound inflammation, as immunohistochemistry and cell fractiona tion analysis revealed a restricted localization of p68 in keratinocyte nuclei of the developing epithelium. In line, cultured human (HaCaT) and murine (PAM 212) keratinocyte cell lines showed a nuclear localization of the helicase. Moreover, confocal microscopy revealed a strong localization of p68 protein within the nucleoli of the keratinocytes. Functional analyses demonstrated that p68 strongly participates in keratinocyte proliferation and gene expression. Keratinocytes that constitutively overexpressed p68 protein were characterized by a marked increase in serum-induced proliferation and vascular endothelial growth factor (VEGF) expression, whereas down-regulation of endogenous p68 using small interfering RNA (siRNA) markedly attenuated serum-induced proliferation and VEGF expression. Altogether, our results suggest a tightly controlled expression and nucleolar localization of p68 in keratinocytes in vitro and during skin repair in vivo that functionally contributes to keratinocyte proliferation and gene expression.
Isolierung und Charakterisierung der Atmungsketten-Superkomplexe aus Paracoccus denitrificans
(2004)
Isolierung von Atmungsketten-Superkomplexen aus Paracoccus denitrificans: Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurde ein Reinigungsprotokoll zur Präparation der Atmungskettenkomplexe I, III und IV des Gram-negativen, fakultativ anaeroben Bodenbakteriums Paracoccus denitrificans in Form eines NADH Oxidase Komplexes erstellt. Bisher konnten stabile Superkomplexe bakterielle Atmungskettenkomplexe nur in Gestalt einer Chinol Oxidase, bestehend aus den Komplexen III (Ubichinol:Cytochrom c Oxidoreduktase) und IV (Cytochrom c Oxidase), isoliert werden (Berry, et al., 1985). Jedoch enthielten diese Assemblierungen keinen Komplex I (NADH: Ubichinon Oxidoreduktase). Dies ist die erste chromatographische Isolierung eines kompletten "Respirasoms" aus Paracoccus denitrificans. Unter der Verwendung des milden Detergenz Digitonin zur Solubilisierung von Paracoccus denitrificans Membranen gefolgt von zwei chromatographischen Reinigungsschritten, der Hydroxylapatit-Chromatographie und der Gelfiltration, konnte eine NADH Oxidase, bestehend aus den Komplexen I, III und IV in einer 1:4:4 Stöchiometrie isoliert werden. Neben der Isolierung der NADH Oxidase konnten weitere kleine Superkomplexe identifiziert werden, die aus vier Komplex III und vier Komplex IV (III4IV4) sowie vier Komplex III und zwei Komplex IV (III4IV2) assoziiert waren. Charakterisierung der Superkomplexe aus Paracoccus denitrificans: Die isolierten Atmungskettenkomplexe wurden zur Charakterisierung bezüglich ihrer Funktion, enzymatischen Aktivität, Stöchiometrie und Untereinheiten-Zusammensetzung aus Paracoccus denitrificans Wildtyp-Membranen analysiert. Proben aller Präparationsstufen wurden parallel zur BN-Gelelektrophorese und für enzymatische Einzel- und kombinierte Aktivitäten der Komplexe I-IV eingesetzt. Mittels BN-Gelelektrophorese konnten die apparenten Massen der Komplexe bestimmt werden. Im folgenden denaturierenden SDS-Gel wurde die Untereinheiten-Zusammensetzung der Superkomplexe durch Immunodetektion mit Antikörpern gegen die Komplexe I, III, IV und Cytochrom c552 analysiert. Abschließend konnte nach der Gelfiltration festgestellt werden, das Komplex II eindeutig nicht Teil des Superkomplexes (I1III4IV4) war. Die Stöchiometrie des Superkomplexes a wurde mit Hilfe der fluorimetrischen Bestimmung von FMN (Flavin) als Marker für Komplex I und mittels Pyridin Hämochromogen Spektren für Häm a, b und c bestimmt. Da Komplex III physiologisch als Dimer vorliegt (Mayer et al. 2002), müsste die Stöchiometrie der funktionellen Einheit des Superkomplex a folgendermaßen lauten: I1 (III2)2 IV4. In diesem Fall diente der Vergleich der Wechselzahl einzelner Präparationsstufen als Maß der Verunreinigung der ergab, dass Fremdkomplexe mit Flavin und Cytochrom b im Ausgangsmaterial der Präparation vorhanden waren. Nur die Wechselzahl des Komplexes IV blieb während der Präparation konstant. Um den Gehalt an Komplex I und die Qualität der Präparation abzuschätzen, wurde das Verhältnis der HAR zu dNADH:DBQ Oxidoreduktase Aktivität in Membranen und isoliertem Superkomplex a bestimmt. Es war während der Präparation konstant. Die Bestimmung des Phospholipidgehalts aus isoliertem Superkomplex a im Vergleich zu P. denitrificans Membranen ergab eine Abnahme von 980 ± 80 nmol PL / mg Protein in Membranen auf 290 ± 10 nmol / mg Protein in isoliertem Superkomplex a, wohingegen der Ubichinongehalt von 2,7 ± 0,3 nmol / mg auf 6,7 ± 0,8 nmol / mg in isolierter Oxidase anstieg. Katalytische Aktivitäten von P. denitrificans Membranen des Parentalstamms und verschiedener Mutantenstämme zeigten, dass die Inaktivierung des Gens für fest gebundenes Cytochrom c552 die Bildung eines Superkomplexes nicht verhindern konnte, was ein Hinweis dafür ist, dass dieses Elektronen Carrier Protein nicht essentiell für die strukturelle Verbindung zwischen den Komplexen III und KIV ist. Komplex I Aktivität wurde ebenfalls in Membranen von Mutanten-Stämmen, denen Komplex III oder Komplex IV fehlte, gefunden. Jedoch enthielten diese Stämme keinen assemblierten Komplex I, sondern nur dissoziierte Untereinheiten des Komplexes. Trotz der Verwendung der selben Protokolle für die elektrophoretische Trennung und chromatographische Isolierung wie für Superkomplexe aus dem Wildtyp-Stamm, führte die Isolierung aus Mutantenstämmen, denen Komplex III oder IV fehlte, zum vollständigen Verlust der NADH:DBQ Oxidoreduktaseaktivität. Dies weist darauf hin, dass Paracoccus denitrificans Komplex I durch die Assemblierung in Form eines NADH Oxidase Superkomplex stabilisiert wird. Zusätzlich zum Substrat Channeling scheint die strukturelle Stabilisierung von Membran Protein Komplexen die Hauptaufgabe von respiratorischen Superkomplexen zu sein.
The detailed mechanism of the 20 S proteasome from Thermoplasma acidophilum is unknown. Substrates are degraded processively to small fragments without the release of intermediates, but the basis for this unique degradation mode remains obscure. The proteasome is a molecular machine, but how the different nanocompartments interplay and whether more than one substrate can be treated simultaneously has not been elucidated yet. To address these questions we had to disable the functionality of one aperture in order to dissect whether the other pore can compensate for the loss. As it is challenging to introduce mutations solely around one pore aperture of the highly symmetrical construct, we chose a novel approach by unique orientation of the proteasome at interfaces. For this purpose we purified recombinant 20 S proteasomes, where hexahistidine tags were fused either around the entrances or at the sides. According to electron microscopic studies we immobilized these constructs uniformly either end-on or side-on at metal-chelating interfaces (lipid vesicles, lipid monolayers and self-assembled thiol monolayers). Degradation of small fluorogenic peptides and large proteins like casein was analyzed. Small substrates were degraded with comparable activity by free and immobilized proteasomes, irrespective of their orientation. Thus it can be assumed that peptides can pass the sealed entrance of the 'dead-end' proteasome. However, larger substrates like fluorescently labeled casein were processed near the temperature optimum by side-on immobilized and soluble proteasomes with threefold activity compared to end-on immobilized proteasomes. Hence it can be concluded that one pore is sufficient for substrate entry and product release. In other words, the pore and antechamber can fulfil a triple function in the import and unwinding of substrates and the egress of products. With means of surface plasmon resonance the exact substrate/proteasome stoichiometry could be determined to ~1 for 'dead-end' proteasomes and ~2 for side-on immobilized (active and inactive) proteasomes. Most importantly, a fit with the Hill equation revealed positive cooperativity for side-on immobilized (Hill coefficient ~2) in contrast to end-on immobilized proteasomes (Hill coefficient ~1). Thus in case of soluble proteasomes two substrates bind presumably in opposite antechambers with positive cooperativity. The off-rate of casein as substrate is twofold for the active side-on immobilized proteasome in comparison to the end-on immobilized proteasome. The exact 2:1 stoichiometry of the off-rates equals the ratio of exit pathways amenable in case of side-on orientated versus 'dead-end' immobilized proteasomes. Thus crevices along the cylindrical body of the 20 S proteasome seem not to participate in the egress of small products. An inactive proteasome mutant displays a concentration-dependent off-kinetic against casein. Accordingly, the off-rate of the bisubstrate:proteasome complex can be attributed around half the value of the monosubstrate:proteasome complex. Consequently, substrates exit the inactive proteasome via the route of access due to obstruction of the trans side with an entering substrate. Hence the active proteasomes have to chop substrates down to small fragments prior to release through both pores. Thus the processive degradation mode might result from positive binding cooperativity. The on-rate constants for casein suggested that substrate association represents a two-step process comprising a rate-limiting translocation step and a fast binding step. As fluorescence cross-correlation revealed that two substrates can be co-localized in the proteasome and bind successively with increasing affinity (KD,1 = 8 µM versus KD,2 = 700 nM), an allosteric transition in the proteasome can be assumed. Combining our results with the data from other research groups led to a mechanistic model for the 20 S proteasome. Accordingly, the first substrate undergoes a slow translocation step, binds in the antechamber and diffuses subsequently to the catalytic centers, where it is degraded. By switching on the catalytic activity, the pores at both termini are dilated via conformational changes. Hence entry of the second substrate into the proteasome is facilitated due to omission of the rate-determining translocation step. The second substrate is either accommodated in the antechamber before it is processed (alternating degradation) or, most probably, is directly threaded into the central cavity (simultaneous degradation). As effusing peptides compete with entering proteins for binding in the antechamber, the pores are kept in an open state. After finishing digestion the pores are closed and a new degradation cycle can be reinitiated. In summary, substrate association with the proteasome underlies an ordered alternating binding mechanism in contrast to the random mode of degradation. Thus the two-stroke engine offers the advantage of speeding up degradation without enhancing complexity.
Im Rahmen dieser Arbeit sollte untersucht werden, ob eine Zellzyklusabhängigkeit der CD95- vermittelten Apoptose besteht. Dazu wurde ein ecdysoninduzierbares Genexpressionsystem für die induzierte Überexpression der CDK-Inhibitoren p21 und p27 in RKO-Zellen (Kolonkarzinomzellen) zur Herbeiführung eines Zellzyklusarrests in der G1-Phase benutzt. Nach Induktion mit dem Ecdysonhomolog Muristeron wurde durch Zugabe von rekombinanten hCD95-Liganden Apoptose ausgelöst und anschließend untersucht. Die erzielten Ergebnisse zeigen, dass der Induktor Muristeron an sich und nicht die p21- bzw. p27-Überexpression die anti-apoptotische Akt-Kinase aktiviert, die Expression des anti-apoptotischen Bcl-xL erhöht, die Caspase-8-Aktivierung (entweder am CD95-DISC oder durch "Feedback"-Aktivierung durch Caspase-3) und die darauf folgenden Ereignisse verhindert und somit die hCD95L-induzierte Apoptose blockiert. Zusätzlich beeinflusst der Induktor auch das Genexpressionsmuster der behandelten Zellen, was ebenfalls für die Hemmung der Apoptose mit verantwortlich sein könnte. Somit ist das ecdysoninduzierbare Genexpressionsystem zur Apoptoseuntersuchung in RKO-Zellen nicht verwendbar. Mit der Untersuchung des Apoptoseverhaltens proliferierender RKO-Zellen konnte gezeigt werden, dass überlebende Zellen nach hCD95L-Behandlung vermehrt in der G0/G1-Zellzyklusphase nachweisbar sind, während apoptotische (Caspase-3-positive) Zellen aus der G2/M-Phase heraus sterben. Allerdings weisen die apoptotischen Zellen kaum Cyclin B1 auf, ein für die G2-Phase wichtiges und typisches Cyclin. Somit bleibt die genaue Verknüpfung von Zellzyklusregulation und Apoptose auch nach diesen Analysen ungeklärt. In einem dritten Ansatz - Zellzyklusarrest durch Dichtearretierung - konnte eine Hemmung der CD95- vermittelten Apoptose in der arretierten Zellpopulation nachgewiesen werden. Allerdings sekretieren RKO-Zellen einen anti-apoptotischen Faktor in ihr Medium, dessen Konzentration und Wirkung mit größerer Zelldichte zunimmt und somit für die Protektion, unabhängig von Zellzyklusarrest oder Proliferation, verantwortlich ist. Konfluente und auch mit konditioniertem Medium behandelte RKO-Zellen zeigen im Vergleich zu dünn ausgesäten RKO-Zellen Veränderungen, die denen sehr ähnlich sind die beim Übergang einer epithelverankerten Zelle zu einer migrierenden Einzelzelle (EMT) auftreten. Beispielsweise verändert sich die Zusammensetzung des Zytoskeletts, die Zellen verlieren den Zell-Zell-Kontakt und lösen sich ab, bleiben aber am Leben. Zusätzlich steigt die Sekretion von Zytokinen an, die Angiogenese, Migration und Invasion positiv beeinflussen. Sowohl konfluente als auch mit konditioniertem Medium behandelte sub-konfluente Zellen sind apoptoseresistent (hCD95L, TRAIL, UV, Staurosporin), woran u.a. die Kinasen PKC und PI3K, aber auch das anti-apoptotische Bcl-xL beteiligt sind. Die Zellen sterben interessanterweise, wenn ein agonistischer anti-CD95-Antikörper statt des rekombinanten CD95-Liganden verwendet wird, was vermuten lässt, dass eine mangelhafte Vernetzung der einzelnen DISC-Komplexe zur Apoptosehemmung führt, welche durch den Antikörper dann aber erzwungen wird. Zwar handelt es sich hierbei um ein reines Zellkulturmodell, dennoch könnte es bedeuten, dass die Umgebung in einer dichten RKO-Zellkultur vergleichbar ist mit der in größeren soliden Tumoren. Die Zellen brauchen Nährstoffe, versuchen über eine Neovaskularisierung Anschluss an ein Blutsystem zu finden und sekretieren Lockstoffe, Wachstumsfaktoren sowie Proteasen, um die Metastasierung zu erleichtern. PI3K, cPKCs und Bcl-xL tragen dabei zu einer Apoptoseresistenz bei, welche die Zellen zum einen resistent gegenüber Anoikis, Nährstoffmangel, aber auch gegen angreifende zytotoxische T-Zellen macht. Eine weitere Aufklärung der hier ablaufenden Prozesse würde es erleichtern, Möglichkeiten zu finden, in diese Signalwege einzugreifen, um die Apoptosesensitivität wieder herzustellen und die Metastasierung zu verhindern. Insbesondere ist die Identifizierung des für die Apoptoseprotektion verantwortlichen Zytokins das nächste wichtige Ziel bei der Fortsetzung dieser Arbeiten.
Die Familie der ubiquitären ATP binding cassette (ABC)-Membranproteine katalysiert unter Hydrolyse von ATP die Translokation von Substraten über biologische Membranen. In der hier vorliegenden Arbeit wurde die Struktur und Funktion des osmoprotectant uptake (Opu) Systems A aus B. subtilis untersucht, das aus drei Untereinheiten, der ATPase OpuAA, dem integralen Membranprotein OpuAB und dem Substrat-Bindeprotein OpuAC, besteht und unter hyperosmolaren Bedingungen die kompatiblen Solute Glycin-Betain (GB) und Prolin-Betain (PB) in die Zelle importiert, um eine Plasmolyse zu verhindern. Sämtliche Untereinheiten wurden getrennt oder als OpuAA/AB Komplex in E. coli überproduziert und bis zur Homogenität isoliert. OpuAA zeigte ein dynamisches Monomer-Dimer Gleichgewicht (KD= 6 µM), das durch Nukleotide beeinflusst wurde. Unter Bedingungen hoher Ionenstärke konnten Monomer und Dimer getrennt isoliert und analysiert werden. Die Affinitäten und Stöchiometrien der OpuAA/Nukleotid Komplexe wurden unter Verwendung des fluoreszierenden TNP-ATP bzw. einer Nukleotid-sensitiven Trp-Mutante des OpuAA untersucht. Das Monomer hatte ein Molekül TNP-ATP gebunden, während zwei Moleküle TNP-ATP in dimerem OpuAA detektiert wurden. Die Affinität von Nukleotiden zu OpuAA nahm in folgender Reihe zu: ATP<ATP/Mg2+<ADP/Mg2+. Eine Erhöhung der Ionenstärke bewirkte nicht nur eine Erniedrigung der KD-Werte von OpuAA/Nukleotid Komplexen, sondern auch eine Steigerung der ATPase Aktivität. In 1 M NaCl zeigte das Monomer basale ATPase Aktivität, während das Dimer nur sehr geringe Aktivität hatte, jedoch durch Zugabe von OpuAB und OpuAC aktiviert wurde. K+ wurde als ein Modulator der ATPase Aktivität von OpuAA identifiziert. Die Zugabe von TNP-ADP/Mg2+ induzierte in dimeren OpuAA einen konformellen Wechsel, der zu einem Zerfall des Dimers führte. Monomer und Dimer hatten gegenüber Nukleotiden unterschiedliche Affinitäten, was eine unterschiedliche Architektur der Nukleotid-Bindetasche implizierte. Die Architektur des OpuAA Dimers wurde mittels FRET untersucht. Dazu wurde OpuAA ortspezifisch mit Fluorophoren markiert und ein Verfahren etabliert, in dem die intermolekularen Distanzen des Dimers bestimmt werden konnten. Ein Vergleich der Distanzen mit anderen NBD Dimeren zeigte, dass OpuAA eine zu BtuD oder MalKE. coli vergleichbare Dimer Architektur mit einer head-to-tail Orientierung hat. Die Struktur des OpuAC/GB und OpuAC/PB Komplexes wurde durch Röntgenstrukturanalyse mit einer Auflösung von 2,7 Å bzw. 2,8 Å aufgeklärt und zeigte zwei globuläre Domänen, die über zwei Peptidsegmente miteinander verbunden waren. Die delokalisierte positive Ladung des Liganden war von einem cluster aus drei Trp-Resten, dem sog. "Tryptophan-Prisma", über kationische-p-Interaktion komplexiert. Nach Ligandenbindung wurden beide Domänen durch eine Wasserstoffbrücke zwischen den konservierten Asp22 und Trp178 überbrückt. Dieser molekulare Schalter wurde von OpuAC genutzt, um Affinitäten von GB und PB zu regulieren.
Schichten V/Al-Intermetallischer Phasen und Schichten aus V(Al) (Schichtdicken 150- 300 nm) wurden durch Interdiffusion von V/Al- und V5Al8/V-Mehrfachschichten bei 400-800°C im Vakuum bei 3 x 10-8 mbar hergestellt. Des Weiteren wurden V5Al8-Schichten durch Sputtern einer V5Al8-Legierung erzeugt. Die Gesamtstöchiometrie der Schichten lag zwischen Al0,86V0,14 und Al0,19V0,81. Als Substrat dienten einkristalline (012) Saphirwafer. Die V/Al-Intermetallischen Phasen und V(Al) wurden im RTP-System bei 600-1250°C mit NH 3 umgesetzt. Zum Vergleich der Reaktivität wurden die V/Al- und V5Al8/V-Mehrfachschichten auch ohne vorherige Vakuumtemperung in NH3 getempert. Die Proben wurden mittels XRD, SNMS, TEM/EFTEM, ESCA, XRR und AFM untersucht. Die V/Al-Mehrfachschichten besaßen eine starke Welligkeit, die von der starken Al-Schichtdickenschwankung herrührte. Trotz dieser Welligkeit zeigten die V- und Al-Schichten der V/Al-Mehrfachschicht eine ausgeprägte Textur. Die V-Schichten waren (110) und die Al-Schichten (111) texturiert. Die Bildung von (112) texturiertem Al3V erfolgte bereits bei 400°C, die Bildung von (110) texturiertem V 5Al8 und V(Al) bei 700°C. In der Nähe der Oberfläche durchmischten sich die V- und Al-Schichten aufgrund von O- und C-Einlagerung während der Vakuumtemperung nicht vollständig, und man beobachtete die Bildung von V-Oxiden. Je größer der V-Gehalt der Intermetallischen Verbindung bzw. V(Al), desto größer war die Reaktivität gegenüber Sauerstoff. Bei der Nitridierung der durch Interdiffusion gewonnen Intermetallischen Phasen Al3V und V5Al8 beobachtete man die Bildung von (001) texturiertem AlN an der Oberfläche. Durch die Nitridierung verarmte die Intermetallische Phase an Aluminium und es bildeten sich die V-reicheren Intermetallischen Verbindungen. Weitere Nitridierung führte zur Bildung von (001) texturiertem V2N. Bei der Nitridierung von V0,81(Al)0,19 bildete sich zunächst V(Al)(N), das bei weiterer Nitridierung zunächst in V2N und schließlich in VN und AlN überging. Das Reaktionsverhalten der Intermetallischen Phasen und der V(Al)-Phase stimmte weitestgehend mit dem von Yong Du et al. berechneten ternären Al/V/N-Phasendiagramm überein. Bei der Nitridierung von V0,61(Al)0,39 beobachtete man jedoch ebenfalls die Bildung von V2N. Dies widerspricht dem berechneten V/Al/N-Phasendiagramm, nachdem sich bei dieser Zusammensetzung auch AlN bilden sollte. Möglicherweise ist das Zweiphasengebiet V(Al)(N) + V2N breiter. Die Intermetallischen Phasen Al3V und V5Al8 zeigten im Vergleich zu reinem Vanadium eine stark verminderte Reaktivität gegenüber NH3. Dies ist auf die Passivierung der Oberfläche durch die AlN-Bildung zurückzuführen. Die ebenfalls schwächere Reaktivität der V(Al)-Phase lässt sich mit der geringen Löslichkeit an Stickstoff in V(Al) und der sehr wahrscheinlich höheren Aktivierungsenergie für die V2N-Bildung erklären. Die Reaktivität der V/Al-Mehrfachschichten war deutlich größer als die der Intermetallischen Phasen. Hierfür ist mit Sicherheit der höhere Anteil an Korngrenzendiffusion verantwortlich. Zum anderen könnte Vanadium die AlN-Bildung katalysieren. Bei der direkten Nitridierung wurde die oberste V-Schicht zu einer VN-Schicht umgesetzt. Die Nitridierung ist also nahe der Oberfläche schneller als die Interdiffusion der Metalle. In Richtung der Oberfläche beobachtete man eine stark ansteigende Al-Konzentration, wofür die im Vergleich zu VN höhere Freie Enthalpie von AlN verantwortlich ist. Durch das Sputtern einer V5Al8-Legierung konnte das Problem der Oxidbildung bei der Interdiffusion umgangen werden. Eine dünne Aluminiumoxidschicht bildete sich jedoch bereits schon bei der Lagerung an Luft. Die Reaktivität der gesputterten V5Al8-Schichten unterschied sich nicht wesentlich von der interdiffundierter V/Al-Mehrfachschichten vergleichbarer Stöchiometrie. Tiefenprofilanalysen an nitridierten V5Al8-Schichten machten deutlich, dass zwischen 600 und 900°C eine bemerkenswerte Menge an Sauerstoff in die AlN-Schicht eingebaut wurde. Ab 900°C stieg die Dicke der Aluminiumoxinitridschicht stark an. Eine weitere Temperaturerhöhung auf 1250°C führte zu keiner sign ifikanten Zunahme der AlN-Schichtdicke, jedoch zu einer starken Reduktion des O-Gehalts im AlN. Gleichzeitig beobachtete man bei 1250°C eine partielle Ablösung der AlN-Schicht.
Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurden auf dem Gebiet reaktiver Silicium-Spezies folgende apparative und experimentelle Forschungsergebnisse erzielt: Zunächst wurde eine Hochtemperatur-Pyrolyse Anlage entworfen, die mit Hilfe von Hochvakuum-Bedingungen (p< 5x10 hoch -9 mbar) Verdünnungseffekte simuliert, um die in der Gasphase erzeugten Moleküle unter solchen Bedingungen zu studieren, bei denen sie keine Folgereaktionen mit weiteren Partnern eingehen können. In die Apparatur integriert wurde ein Ofen (Tmax ungefähr gleich 1200°C) für die Pyrolyse von Stoffgemischen sowie zur Analyse des erzeugten Molekularstrahls ein Quadrupol-Massenspektrometer (0-300 amu, EI-Quelle, SEV). Es wurden Precursoren synthetisiert, die durch Thermolyse infolge intramolekularer Umlagerungen und Abspaltungen definierter Abgangsgruppen Si=X-Doppelbindungen (X= O, S) ausbilden. Diese Precursoren und ihre Pyrolyseprodukte wurden sowohl in der neuen Anlage als auch mittels eines vorhandenen PE-Spektrometers charakterisiert. Parallel zu den Synthesen wurden quantenmechanische Berechnungen an den Produkten der Pyrolysereaktionen durchgeführt, um ihre Eigenschaften, wie z.B. die Orbitalenergien und ihre Strukturparameter, zu bestimmen. Die Ergebnisse sollten die Interpretation der spektroskopischen Untersuchungen (PE und MS) unterstützen. Im zweiten Teil der Arbeit wurden Fragestellungen bearbeitet, die in anderen Teilprojekten der Arbeitsgruppe von essentiellem Interesse sind. Dabei wurden Lösungen zu Fragestellungen der direkten Si-C-Knüpfung und von Silylen-Reaktionen erarbeitet. Eine Versuchsreihe, die durchgeführt wurde, beschäftigte sich mit den Hochtemperaturreaktionen von SiCl4 und SiF4. Die flüchtigen Ausgangssubstanzen wurden im Pyrolyseofen bei ansteigenden Temperaturen mit pulverförmigem elementarem Silicium oder SiO umgesetzt. Hierbei wurden die Bildungsbedingungen von Dihalogensilylenen in der Gasphase optimiert. In einer weiteren Fragestellung wurden die Thermolyseeigenschaften von Si und SiO untersucht. Beide Feststoffe können ab einer Temperatur von ca. 1000°C und einem Druck von 2x10 hoch -6 mbar atomar bzw. molekular in die Gasphase überführt werden. Dort reagieren sie mit Halogensilanen unter Bildung von Silylenen und Chlorsilanen. Weiterhin wurde eine Disproportionierung von SiO zu Silicium und SiO2 unter hohen Temperaturen beobachtet; konsequenterweise wird dabei Sauerstoff freigesetzt. Weiterhin wurde versucht, die Produkte der Halogensilan-Pyrolyse mit Oxidationsmitteln wie Ethylenoxid zur Reaktion zu bringen. Zuletzt wurden Hydrolyse-Versuche mit SiCl4/SiF4 bzw. :SiCl2/:SiF2 und Wasser untersucht.
Mit der nichtenzymatischen templatgesteuerten Oligomerisierung von RNA zu Selektionsexperimenten
(2004)
Die vorliegende Dissertation beruht auf der Nichtenzymatischen Templatgesteuerten Oligomerisierung von RNA. Dazu inkubiert man einen farbstoffmarkierten Primer mit komplementären Templaten und aktivierten Monomeren, den 2-Methyl-Phosphorimidazoliden. Die Verlängerung des Primers wurde durch Gelelektrophorese mit anschließender Detektion des Fluoreszenzfarbstoffs nachgewiesen. Eine erfolgreiche Primerverlängerung ist an viele Vorraussetzungen gebunden. Wichtig ist, dass der Duplex in der A-Konformation vorliegt. Deshalb ist es nötig, dass wenigstens der Primer oder das Templat aus RNA besteht. Von großem Vorteil ist, wenn die Basenpaare drei Wasserstoffbrücken ausbilden können. Auch die Stapelwechselwirkung ist ebenso wichtig für eine effiziente Kettenverlängerung, der Einbau von Purinen verläuft besser als der Einbau von Pyrimidinen. In der Arbeit konnte gezeigt werden, dass die Durchführung eines nichtenzymatischen PCR-artigen Experiments möglich ist. Das Verlängerungsprodukt der Hin-Reaktion wurde durch eine präparative Polyacrylamid Gelelektrophorese isoliert. Dieses diente dann als Templat für die Rückreaktion. Das Experiment aus Hin- und Rückreaktion bildete die Grundlage für ein Selektionsexperiment. Die Template wurden dafür um Zufallspositionen erweitert, die zwischen die Primerbindestellen eingefügt wurden. Nach mehrmaligem Durchlaufen des Zyklus aus Hin- und Rückreaktion sollte es sich zeigen, ob sich bestimmte Nucleotide in den Sequenzen angereichert haben. Zur Analyse wurde eine Methode basierend auf einer RP-HPLC entwickelt. Die vollverlängerten Produkte wurden mittels Gelelektrophorese isoliert und durch basische Hydrolyse in Monomere gespalten. Nach anschließender enzymatischer Dephosphorylierung konnte der Anteil der Nucleoside durch RP-HPLC bestimmt werden. Die erste erfolgreiche Anwendung fand diese Methode in der Analyse des Einbaus gegenüber T (U). Hier konkurrieren nämlich D (A) durch Watson/Crick-Paarung und G durch Wobble-Paarung um die Bindestelle. Aus diesem Grund bildeten sich bei Templaten aus C und T und der Inkubation nur mit G-Imidazolid allein die vollverlängerten Produkte zu einem hohen Anteil. Bei Reaktionen mit den Imidazoliden G und D konnte gezeigt werden, dass gegenüber T der Watson/Crick Partner D etwa dreimal häufiger eingebaut wurde als G. Eine weitere wichtige Grundlage für ein Selektionsexperiment bildete die Untersuchung, ob sich gegenüber Zufallspositionen überhaupt eine Kettenverlängerung feststellen lässt. Dazu wurde die Verlängerung unterschiedlicher Primer mit Templaten untersucht, die an einer oder mehreren Stellen Positionen aus [C/T] oder [A/C/G/T] enthielten. Es war deutlich zu sehen, dass die Verlängerung an solchen random-Sequenzen möglich ist. Die besten Ergebnisse wurden erzielt, wenn man entweder nur mit 2-MeImpG allein oder mit 2-MeImpG und 2-MeImpD inkubierte. Die Verwendung aller vier Imidazolide aus C, D, G und U führte zwar auch zu vollverlängerten Produkten, ihr Anteil war aber deutlich geringer. Eine andere wichtige Aufgabe dieser Dissertation war die Aufklärung der Ursache für die kritische Länge der Template. Es konnte gezeigt werden, dass die Bildung von G-Quadrupelsträngen nicht der Grund ist, der den reibungslosen Einbau an längeren "homoC" Templaten verhindert. Zusätze von NaCl oder LiCl beeinflussten die Effizienz dieser Reaktionen kaum. Gute Resultate wurden bei der Verlängerung an Homopyrimidin-Templaten, die aus C und T bestanden, erzielt. Das vollverlängerte Produkt bildete sich bei der Verwendung von 2-MeImpG und 2-MeImpD in hohen Ausbeuten. Interessante Resultate ergaben sich im Fall des Einbaus von C an "homoG" Templaten. Die besten Ergebnisse wurden erzielt, wenn völlig auf Na+-Ionen verzichtet wurde. Die Verwendung von Li-Imidazoliden, die auch in höherer Konzentration eingesetzt werden konnten, steigerte die Effizienz dieser Reaktionen deutlich. Durch das reduzierte stacking liefen alle Reaktionen allerdings langsamer und unvollständiger ab als beim Einbau von G an "homoC" Templaten. Die Stabilisierung des Duplexes durch stacking ist also entscheidend für erfolgreiche Primerverlängerungen. Überraschend schlechte Ergebnisse waren zu beobachten, wenn die Template gleichzeitig aus G und C aufgebaut waren. Die vollständig verlängerten Produkte wurden zu einem sehr geringen Anteil gebildet. Zusätzlich zum geringeren stacking der Pyrimidine, wurden Unregelmäßigkeiten in der Doppelhelixstruktur, die durch das abwechselnde Auftreten von Purinen und Pyrimidinen verursacht worden sind, als Ursache ausgemacht. Als neue Vorrausetzung für eine effiziente Kettenverlängerung hat sich also das Vorliegen einer regelmäßigen Doppelhelixstruktur herausgestellt.
Zytotoxische T-Lymphozyten und natürliche Killer-Zellen sind hochspezialisierte Zellen des Immunsystems, die durch Sekretion der Serin-Protease Granzym B (GrB) und des membranolytischen Proteins Perforin Virusinfizierte, körperfremde oder auch Tumorzellen durch Induktion von apoptotischem Zelltod eliminieren. Während Perforin für die Aufnahme von Granzym B in Zielzellen verantwortlich ist, wirkt Granzym B im Zytosol als aktive Effektor-Caspase und spaltet Caspase-3 und andere zelluläre Caspasen sowie verschiedene zentrale Caspasen-Substrate. Granzym B aktiviert damit wie Caspase-3 Apoptose-Signalwege am unteren Effektorende und umgeht daher die meisten Kontrollmechanismen, die in Tumorzellen häufig dereguliert sind und zur Resistenz gegenüber klassischer Chemo- und Strahlentherapie führen. Beide Proteasen stellen damit vielversprechende Enzymaktivitäten für die Verwendung als Effektorfunktion in Tumorzell-spezifischen zytotoxischen Fusionsproteinen dar. In der vorliegenden Arbeit wurden rekombinante Formen von Granzym B und Caspase-3 hergestellt und daraufhin untersucht, ob beide Enzyme mit dem ErbB2-spezifischen "single chain" Antikörper scFv (FRP5) als Tumorzell-spezifischer Zellbindungsdomäne fusioniert werden können, ohne dadurch die Faltung der Proteasen zu verhindern, um eine gezielte Applikation in Tumorzellen und Eliminierung der Zellen durch Apoptose zu ermöglichen. Die Herstellung von Granzym B als rekombinantes Protein im präparativen Maßstab war bisher nicht in der Literatur beschrieben worden. In dieser Arbeit konnte humanes aktives Granzym B in der Hefe Pichia pastoris mit Ausbeuten von 1 bis 4 mg/l Kultur exprimiert werden. Zum Nachweis der enzymatischen Aktivität wurde ein in vitro Assays etabliert, bei dem rekombinante Procaspase-3 als Substrat für Granzym B eingesetzt wurde. Nach intrazellulärer Applikation mit einem synthetischen Transduktionsreagens induziert das gereinigte Protein Apoptose in HeLa Zellen. Wie für endogenes Granzym B in der Literatur beschrieben, wird rekombinantes Granzym B aus Pichia pastoris sehr schnell in HeLa Zellen aufgenommen, lokalisiert aber in vesikulären Strukturen, in denen die enzymatische Aktivität eingeschlossen ist. Aus verschiedenen Expressionskulturen wurden jedoch zwei unterschiedliche Proteine isoliert, die bei vergleichbarer molarer Masse und enzymatischer Aktivität in Zellen aufgenommen wurden bzw. nicht internalisierten, was darauf hinweist, daß eine posttranslationale Modifikation der Protease für die Bindung von Granzym B an Zielzellen verantwortlich ist. Während für die Freisetzung von Granzym B aus den Membranvesikeln und Induktion von Apoptose Perforin erforderlich ist, konnte in dieser Arbeit beobachtet werden, daß Kulturen verschiedener etablierter Tumorzellinien nach Behandlung mit Granzym B auch in Abwesenheit von Perforin-Aktivität auffallende morphologische Veränderungen zeigen, die mit dem partiellen Verlust des Kontakts zum Kultursubstrat verbunden sind. Dies deutet darauf hin, daß Granzym B auch extrazellulär auf Zellen einwirkt, indem es Komponenten der extrazellulären Matrix spaltet, und so indirekt Apoptose durch Anoikis induziert. Dieser Effekt ist jedoch für eine mögliche therapeutische Verwendung von Granzym B nicht von Bedeutung, da relativ hohe Proteinkonzentrationen erforderlich sind. Um Granzym B selektiv gegen Tumorzellen zu richten, wurden verschiedene Fusionen mit dem "single chain" Antikörper scFv(FRP5) sowie einer bakteriellen Translokationsdomäne von Exotoxin A oder Diphtherietoxin konstruiert und in E. coli oder Pichia pastoris exprimiert. Während verschiedene in E. coli hergestellte Fusionsproteine nicht enzymatisch aktiv waren, konnte im Überstand einer Pichia Expressionskultur volle-Länge GrB-scFv(FRP5) sowie Granzym B Aktivität nachgewiesen werden. Die Expressionsrate war allerdings so gering, daß eine präparative Isolierung nicht möglich war. Es konnte damit aber gezeigt werden, daß die Fusion heterologer Proteindomänen an den C-Terminus von Granzym B unter Erhalt der enzymatischen Aktivität prinzipiell möglich ist, während zusätzliche Peptidsequenzen am N-Terminus der Protease zumindest partiell zum Verlust der enzymatischen Aktivität führen. Aktive Caspase-3 besteht aus zwei Peptiden p12 und p17, die im aktiven Enzym ein Tetramer (p12 p17)2 bilden. Um Caspase-3 selektiv in Tumorzellen zu applizieren, wurden ebenfalls Möglichkeiten untersucht, eine der beiden Untereinheiten mit dem scFv(FRP5) als Tumorzell-spezifische Zellbindungsdomäne zu fusionieren. Während aus den beiden separat in E. coli exprimierten p12 und p17 Untereinheiten durch gemeinsame Rückfaltung enzymatisch aktive Caspase-3 rekonstituiert werden konnte, führte die Fusion heterologer Proteindomänen an den N- und C-Terminus der p12 Untereinheit sowie an den C-Terminus der p17 Untereinheit zum Verlust der enzymatischen Aktivität, wahrscheinlich aufgrund der Verhinderung der korrekten Faltung des Protease-Tetramers. Dagegen konnte an den N-Terminus der p17 Untereinheit eine bakterielle Translokationsdomäne unter Erhalt der enzymatischen Aktivität fusioniert werden; ein entsprechendes Konstrukt, das zusätzlich den "single chain" Antikörper scFv(FRP5) enthielt, wurde aber in E. coli vollständig degradiert. Nachdem die Idee, Granzym B oder aktive Caspase-3 zur selektiven Induktion von Apoptose in Tumorzellen für therapeutische Zwecke einzusetzen, bereits seit längerem diskutiert wird, es jedoch bisher praktisch nicht möglich war, entsprechende rekombinante Fusionsproteine in funktionaler Form herzustellen, liefern die Ergebnisse dieser Arbeit wichtige grundlegende Informationen, wie die weitere Entwicklung solcher Moleküle erfolgreich durchgeführt werden könnte.
The transporter associated with antigen processing (TAP) plays a pivotal role in the adaptive immune response against virus-infected or malignantly transformed cells. As member of the ABC transporter family, TAP hydrolyzes ATP to energize the transport of antigenic peptides from the cytosol into the lumen of the endoplasmic reticulum. TAP forms a heterodimeric complex composed of TAP1 and TAP2 (ABCB2/3). Both subunits contain a hydrophobic transmembrane domain and a hydrophilic nucleotide-binding domain. The aim of this work was to study the ATP hydrolysis event of the TAP complex and gain further insights into the mechanism of peptide transport process. To analyze ATP hydrolysis of each subunit I developed a method of trapping 8- azido-nucleotides to TAP in the presence of phosphate transition state analogs followed by photocross-linking, immunoprecipitation, and high-resolution SDS-PAGE. Strikingly, trapping of both TAP subunits by beryllium fluoride is peptide-specific. The peptide concentration required for half-maximal trapping is identical for TAP1 and TAP2 and directly correlates with the peptide-binding affinity. Only background levels of trapping were observed for low affinity peptides or in the presence of the herpes simplex viral protein ICP47, which specifically blocks peptide binding to TAP. Importantly, the peptideinduced trapped state is reached after ATP hydrolysis and not in a backward reaction of ADP binding and trapping. In the trapped state, TAP can neither bind nor exchange nucleotides, whereas peptide binding is not affected. In summary, these data support the model that peptide binding induces a conformation that triggers ATP hydrolysis in both subunits of the TAP complex within the catalytic cycle. The role of the ABC signature motif (C-loop) on the functional non-equivalence of the NBDs was investigated. The C-loops of TAP transporter contain a canonical C-loop (LSGGQ) for TAP1 and a degenerated ABC signature motif (LAAGQ) for TAP2. Mutation of the leucine or glycine (LSGGQ) in TAP1 fully abolished peptide transport. TAP complexes with equivalent mutations in TAP2 showed however still residual peptide transport activity. To elucidate the origin of the asymmetry of the NBDs of TAP, we further examined TAP complexes with exchanged C-loops. Strikingly, the chimera with two canonical C-loops showed the highest transport rate whereas the chimera with two degenerated C-loops had the lowest transport rate, demonstrating that the ABC signature motifs control the peptide transport efficiency. All single-site mutants and chimeras showed similar activities in peptide or ATP binding, implying that these mutations affect the ATPase activity of TAP. In addition, these results prove that the serine of the C-loop is not essential for TAP function, but rather coordinates, together with other residues of the C-loop, the ATP hydrolysis in both nucleotide-binding sites. To study the coupling between the ATP binding/hydrolysis and the peptide binding, the putative catalytic bases of the TAP complex were mutated to generate the so-called EQ mutants. The mutations did not influence the peptide-binding ability. Dimerization of the NBDs of EQ mutants upon ATP binding does not alter the peptide binding property. At 27°C, both ATP and ADP could induce the loss of peptide-binding ability (Bmax) only in the variants bearing a mutated TAP2. Further studies are required to deduce at which stage in the catalytic cycle the peptide-binding site is affected. In addition, mutation of the putative catalytic base of both subunits showed a magnesium-dependent peptide transport activity, demonstrating these mutants did not abolish the ATP hydrolysis. Thus, the function of this acidic residue as the catalytic base is not likely to be universe for all ABC transporters.
Das humane Zytomegalievirus (HCMV) gehört zur Familie der beta-Herpesviridae. Bis zu 80% menschlichen Bevölkerung sind weltweit mit dem Virus infiziert. Nach einer meist asymptotischen Erstinfektion persistiert HCMV lebenslang in seinem Wirtsorganismus. Im Laufe der Evolution wurden von einigen Herpesviren verschiedene Strategien entwickelt, um der Antigenprozessierung und damit der zellulären Immunantwort zu entgehen. Das HCMV-Protein US6 blockiert die Antigenpräsentation via MHC I. US6 ist ein ER-ständiges Typ I Transmembranglykoprotein bestehend aus einer Signalsequenz, einer ER-luminalen Domäne, einer Transmembranhelix und einem kurzen zytoplasmatischen C-Terminus. US6 inhibiert den TAP-abhängigen Peptidtransport aus dem Zytoplasma in das ER-Lumen. Im Rahmen dieser Arbeit wurde die ER-luminale Domäne von US6 bestehend aus der Primärsequenz 20-146 heterolog in E. coli exprimiert und aus inclusion bodies rückgefaltet. Das rückgefaltete Protein erwies sich als Monomer (15,6 kDa). Die in der ER-luminalen Domäne befindlichen acht Cysteine bilden ein intramolekulares Netzwerk aus vier Disulfidbrücken. Zur Aufklärung des molekularen Inhibitionsmechanismus von US6(20-146) wurden verschiedene in vitro TAP-Funktions-Assays angewendet. Die Bindung von US6 an die ER-luminalen Bereiche von TAP blockiert die ATP-Bindung in den zytoplasmatischen NBD des Transporters. Die Peptid- und ADP-Bindung von TAP ist nicht beeinflusst, durch die Inhibition der ATP-Bindung wird jedoch die Peptid-induzierte ATP-Hydrolyse unterbunden. Für die Inhibitionsreaktion konnte ein halbmaximaler Inhibitionskoeffizient (IC50) von 1 µM ermittelt werden. Für die inhibitorische Aktivität von US6 sind die C-terminalen Aminosäuren 126-139 der ER-luminalen Domäne von US6 verantwortlich. Die innerhalb dieser Region befindlichen Aminosäuren Cys127, Cys129, D130, W134 und R138 wurden gegen Serin bzw. Alanin ersetzt. Dies hatte keine Auswirkung auf die Aktivität von US6(20-146). Auch ist der N-Terminus von US6 nicht essentiell für die Aktivität.
Der CD95 Ligand (CD95L, FasL) ist ein Mitglied der Tumor-Nekrose-Faktor(TNF)- Superfamilie und ist in der Lage, Apoptose oder -unter bestimmten Bedingungen- Proliferation in CD95 Rezeptor-positiven Zellen auszulösen. Zusätzlich überträgt der CD95 Ligand aber auch als Rezeptor Signale in die ligandentragende Zelle, ein Phänomen, das auch bei anderen TNF-Familienmitgliedern beobachtet und als "reverse signalling" bezeichnet wird. Diese reverse Signalübertragung bewirkt in T-Zellen ein costimulatorisches Signal, welches zur vollständigen Aktivierung nach Antigen-Erkennung durch den T-Zellrezeptor (TZR) benötigt wird und über bisher unbekannte Adaptorproteine stattfindet, die vermutlich an den intrazellulären Anteil des CD95L binden. Die zytoplasmatische CD95L-Domäne ist auf Primärsequenzebene stark konserviert und besitzt eine prolinreiche Proteininteraktionsdomäne sowie eine Casein Kinase I Phosphorylierungsstelle, welche sich auch im intrazellulären Bereich des membrangebundenen TNFalpha findet und bei diesem Protein für die reverse Signalübertragung essentiell ist. Eine weitere Funktion des CD95L ist der Transport des Liganden zu einem speziellen Typ von Lysosomen in NK- und zytotoxischen T-Zellen. Hierfür ist die prolinreiche Region in der CD95L-intrazellulären Domäne wichtig. In diesen sekretorischen Lysosomen wird der CD95L gespeichert, bis er nach einem TZR-vermittelten Signal an die Zelloberfläche transportiert wird und dort mit dem CD95 Rezeptor der Ziel- Zellen interagieren kann. In der vorliegenden Arbeit wurde zur Aufklärung der oben beschriebenen Funktionen des CD95 Liganden ein Hefe-2-Hybrid Screen mit der intrazellulären CD95L-Domäne als Köder durchgeführt. Mit dieser Methode war es möglich, mehrere potentielle Interaktionspartner zu identifizieren. Eines dieser Proteine, FBP11, wurde schon zuvor als "human fas ligand associated factor" in der Datenbank veröffentlicht. Der HMG-Box-Transkriptionsfaktor Lef- 1, das Formin-bindende Protein FBP11, das thymozytenspezifische Protein TARPP und das Adaptorprotein PSTPIP ("proline serine threonin phosphatase interacting protein")/ CD2BP1 ("CD2 binding protein") interagierten in vitro in einem GST-Pulldown-Experiment mit der intrazellulären Domäne des CD95 Liganden. Mit Hilfe von Co- Immunpräzipitationsstudien und Co-Lokalisierungsexperimenten konnte die Interaktion von überexprimiertem CD95L und PSTPIP auch in vivo bestätigt werden. Des Weiteren wurde in dieser Arbeit gezeigt, dass diese Interaktion über eine nicht näher eingegrenzte Aminosäuresequenz in der prolinreichen Region des CD95L mit der SH3-Domäne des PSTPIP-Proteins realisiert wird. Die Phosphatase PTP-PEST bindet an einen Bereich der PSTPIP-Coiled-coil-Domäne, und es besteht die Möglichkeit, dass CD95L, PSTPIP und PTPPEST in der Zelle als ternärer Komplex vorliegen, in welchem der Phosphorylierungsstatus von PSTPIP und CD95L durch PTP-PEST reguliert wird. Wie die gleichzeitige Expression von PSTPIP die Oberflächenexpression von CD95L beeinflusst, war ein weiterer Untersuchungsgegenstand dieser Arbeit. Es konnte festgestellt werden, dass bei Überexpression von PSTPIP weniger CD95L auf der Oberfläche nachgewiesen wird. Interessanterweise wurde auch weniger Apoptose durch den CD95L ausgelöst, sobald PSTPIP überexprimiert wurde. Neben den Untersuchungen zur Interaktion von CD95L und PSTPIP (sowie PTP-PEST) wurden auch funktionelle Studien zur reversen Signalübertragung des CD95L durchgeführt. Sowohl in CD4- als auch in CD8-einzelpositiven frisch isolierten Maus-T-Zellen wurde ein co-stimulatorisches Signal nach suboptimaler TZR-Stimulation über CD95L beobachtet, was sich in verstärkter Proliferation und erhöhter Expression von Aktivierungsmarkern wie CD25 äußerte. Außerdem führt die Stimulation des CD95 Liganden zu einer transienten p42/p44-MAPK-Phosphorylierung, die durch Co-Expression von PSTPIP jedoch nicht beeinflusst wird. Die MAPK-Signalkaskade führt zur Zellproliferation und könnte daher eine wichtige Rolle in der CD95L-vermittelten Co- Stimulation spielen. Im Rahmen dieser Arbeit konnte auch zum ersten Mal gezeigt werden, dass die Lokalisation des CD95L in Lipid Rafts (Mikrodomänen der Zellmembran) wichtig für dessen apoptoseauslösendes Potential ist, da die Behandlung CD95L-positiver Zellen mit Substanzen, die Cholesterol entfernen und so Rafts zerstören, zur Inhibition der Apoptoseinduktion führt. Die Lokalisation sowohl des CD95 Rezeptors als auch des CD95 Liganden in unterschiedlichen Kompartimenten der Zellmembran könnte beide Moleküle voneinander abschirmen und so autokrine Apoptosemechanismen verhindern. Dadurch wird eine weitere Möglichkeit der Regulation der durch CD95L induzierten Apoptose realisiert.
In der vorliegenden Arbeit wurde nachgewiesen, dass bei Krebspatienten Tumorspezifische Gedächtnis T-Zellen im Verlauf einer Tumorerkrankung generiert und erhalten werden. Dies konnte sowohl für einen soliden Tumor, das Mammakarzinom, als auch für eine hämatologische Neoplasie, das Multiple Myelom, verifiziert werden. Dabei konnte zum ersten Mal belegt werden, dass im Verlauf einer MM-Erkrankung MUC-1 als autologes Tumor-assoziiertes Antigen immunologisch erkannt wird und zur Generierung von Gedächtnis T-Zellen mit einer Anreicherung im Knochenmark der Patienten führt. Weiterhin konnte eine Anreicherung TAA-spezifischer Gedächtnis T-Zellen innerhalb der EM Zellpopulation bei Mammakarzinom-Patientinnen demonstriert werden. Die Analyse der Funktionalität und Langlebigkeit von EM und CM T-Zellen im Hinblick auf ihre klinische Relevanz zeigte wesentliche Unterschiede zwischen beiden Gedächtniszell- Populationen. So war eine IFN-gamma Induktion und Proliferation in CM T-Zellen in stärkerem Ausmaß von einer zusätzlichen Costimulation abhängig verglichen zu EM T-Zellen. Außerdem fiel eine Apoptose-Induktion in CM stärker aus als in EM T-Zellen. Unterschiede in Funktion und Viabilität von CM und EM T-Zellen korrelierten dabei mit der Expression des Chemokinrezeptors CCR7. ELISpot-Analysen der Polarisierung induzierter TH-Antworten beim Mammakarzinom ergaben eine große Heterogenität zwischen den Patienten. So exhibierte ein Teil der Patienten dominante TH1-Antworten, während bei einem anderen Teil lediglich TH2- oder toleranzinduzierende IL-10-Antworten induziert werden konnten. Darüber hinaus traten auch gemischt-polarisierte TH-Antworten auf. Eine Analyse ausgewählter Zytokine resultierte in der Detektion immunsuppressiver und immunstimulatorischer Zytokine im Tumorgewebe, wobei die Zytokinprofile interindividuell stark schwankten und kein einheitliches Muster erkennen ließen. Interessanterweise bestand jedoch eine inverse Korrelation zwischen der Induktion einer TH1-Antwort im ELISpot und dem erhöhten Vorkommen immunsuppressiver Zytokine im autologen Tumorgewebe von Mammakarzinom-Patienten. Eine derartige Korrelation impliziert, dass das vorherrschende Milieu der Tumorumgebung bei einer tumorspezifischen Aktivierung einen Einfluss auf infiltrierende Dendritische Zellen und ihre nachfolgende Polarisierung von T-Zellantworten hat. Folglich könnte die Untersuchung eines breiten Spektrums an Zytokinen in der Tumor-Mikroumgebung zu relevanten Zeitpunkten einer Tumorentwicklung, einen wichtigen Beitrag zum Verständnis von Tumor-Immun Interaktionen liefern.