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Dicer and Drosha are the major enzymes involved in microRNA processing. Using siRNA targeting Dicer and Drosha, thereby downregulating a substantial number of microRNAs in EC, we demonstrate a crucial role of both enzymes in angiogenic processes. Interestingly, Dicer inhibition exerts more profound effects on processes like migration and viability of EC in comparison to Drosha inhibition. Moreover, Dicer effects in vivo angiogenesis, a process which is unaffected by Drosha. This discrepancy might be partially due to the involvement of Dicer in other cellular processes like heterochromatin formation and to the fact that Dicer and Drosha target mainly different subsets of microRNAs. In addition, we identified miR-92a as a novel endogenous repressor of the angiogenic program in EC, which impairs their angiogenic functions in vitro and in vivo. Consistent with these data, blocking miR-92a by systemic infusion of antagomirs enhances neovascularization and functional recovery after ischemia in vivo. At first sight, the anti-angiogenic function of miR-92a in EC appears to contradict the previously identified anti-apoptotic and pro-angiogenic activities of the miR-17~92 cluster in tumor cells. However, this apparent discrepancy might be well rationalized by a predominant function of miR-18a and miR-19a in tumor cells, which are responsible for the tumorigenic and non-cell autonomous pro-angiogenic functions of the miR-17~92 cluster. Instead, miR-92a expression is specifically upregulated in ischemic tissues and appears to cell-autonomously repress the angiogenic potential of EC. Among the various targets and verified regulated genes identified by microarray, we confirmed the downregulation of Integrin a5 in vitro and in vivo. The relevance of this miR-92a target is evidenced by severe vascular defects in the absence of Integrin a5. In addition, endothelial miR-92a interferes with the expression pattern of genes controlling key EC functions at various levels, some of which, e.g. eNOS, might be secondarily affected by directly targeted genes. Obviously, our data do not formally exclude effects of antagomir-92a on perivascular and other cell types, but surely include effects on EC. Regardless of this, the capacity of miR-92a to target various downstream effectors might be an advantage of miRNA-based therapeutic strategies and may overcome the limited therapeutic capacity of single growth factor or single gene therapies in ischemic diseases, since the highly organized process of vessel growth, maturation and functional maintenance is well known to require the fine-tuned regulation of a set of genes.
My PhD work employed genetic and pharmacological manipulations, coupled with highresolution live imaging, to understand intercellular communications during zebrafish cardiovascular development. The heart is the first organ to form, and it is composed of several tissues, among which interactions are crucial. I identified two important interactions between muscular and non-muscular tissues in poorly characterized contexts, and the molecules required for the signalling. First, I discovered an important cellular and molecular crosstalk orchestrating the development of the cardiac outflow tract (i.e., the aortic root in mammals).
Endothelial-derived TGF-beta signalling controls the generation of the local extracellular matrix (ECM). The ECM in turn affects endothelial proliferation as well as smooth muscle cell organization (Boezio et al, 2020; Bensimon-Brito*, Boezio* et al, 2020). In my second project, I investigated the crosstalk between the epicardial layer and the myocardial wall. By generating epicardial-impairment models, I identified a novel role for the epicardium in regulating cardiomyocyte volume during heart development (Boezio et al, 2021). Ultimately, this research contributed to our understanding of how paracrine signalling controls the multicellular interactions integral to organogenesis.
Conclusion: Proteins containing a Jumonji C (JmjC) domain appear in almost all living organisms and catalyze a variety of oxidation reactions. Therefore, they are important regulators in many biological processes such as proliferation and differentiation. They act either as protein hydroxylases, histone demethylases or by regulate mRNA splicing. Given the fact that some of the JmjC domain-containing proteins are shown to be upregulated in response to hypoxia as well as the dependency of JmjC domain catalytic activity on oxygen led to the assumption of an involvement in angiogenesis. For Jmjd6, a member of the JmjC domain-containing protein family, a regulatory involvement in mRNA splicing has been shown. The Jmjd6-/- mouse dies perinatally due to several severe organ malformations, especially in the heart. Despite the pale appearance, the growth retardation and the cardiac defects, it is unclear whether these mice exhibit defects of cells comprising the vasculature. Therefore, the involvement of Jmjd6 in angiogenesis was examined in vitro using angiogenesis assays as well as in vivo using the Jmjd6+/- mouse. An siRNA-mediated knockdown of Jmjd6 in ECs significantly impaired the formation of capillary-like networks in the tube formation assay as well as sprouting in the spheroid assay. Moreover, after siRNA-mediated knockdown of Jmjd6 in ECs cell migration was significantly reduced. These findings were confirmed in the matrigel plug assay in vivo. Implanted matrigel plugs of Jmjd6+/- mice exhibited significantly less perfused vessels compared to wildtype littermates. Furthermore, cultured lung ECs from Jmjd6+/- mice exhibited impaired network forming activity ex vivo compared to cells isolated from wildtype littermates. To elucidate the mechanisms underlying the requirement of Jmjd6 in angiogenesis, an Affymetrix exon-array was performed, which allows detection of changes in gene expression as well as splicing. The siRNA-mediated knockdown of Jmjd6 altered the expression of genes known to play a role in vascular biology. The bioinformatic assessment of alternative splice variants revealed that Jmjd6 silencing affects the splicing of the VEGF receptor 1 (Flt1). Differential splicing of Flt1 was shown to generate a short and soluble form of Flt1 (sFlt1), which sequestrates VEGF and PlGF, and thereby inhibits angiogenesis. In particular, a significant increase in sFlt1 expression was observed. Jmjd6 was recently reported to hydroxylate the splicing factor U2AF65. Therefore, we investigated whether U2AF65 might mediate Flt1 splicing and binds to Flt1 mRNA. Indeed, U2AF65 co-immunoprecipitated with Jmjd6 in ECs, while an interaction of U2AF65 with sFlt1 was demonstrated. Moreover, inhibition of Jmjd6 catalytic function by reduced oxygen concentration altered splicing of Flt1 resulted in an increase of the sFlt1 splice variant. Finally, saturating concentrations of VEGF or PlGF or neutralizing antibodies against sFlt1 significantly reduced the inhibition of sprouting caused by Jmjd6 knockdown in vitro.
Collectively, our results indicate that Jmjd6 has an essential role in the oxygen-dependent regulation of angiogenesis by controlling the splicing of Flt1 mRNA, thereby adjusting the generation of the anti-angiogenic short splice variant sFlt1. Several publications demonstrated a major importance for sFlt1 as a biomarker for many severe human diseases such as preeclampsia, sepsis, cancer, myocardial infarction as well as chronic heart failure. Therefore, the identification of the molecular mechanism behind the generation of sFlt1 might enable the development of new or more precise clinical markers for the diagnosis of the corresponding diseases. Furthermore, the discovery of the enzymes involved in the generation of sFlt1 provides further possibilities to modulate sFlt1 levels and thereby may potentially gives rise to the development of new therapies.
Get3 in Arabidopsis
(2021)
Der guided entry of tail-anchored proteins (GET) Biogenese-Weg vermittelt den Transport und die Insertion von tail-anchor (TA) Proteinen in die Doppellipidschicht des Endoplasmatischen Retikulums (ER). TA Proteine sind dadurch gekennzeichnet, dass sie eine Transmembran Domäne (TMD) in den letzten 50 Aminosäuren ihrer Sequenz beherbergen. Diese TMD enthält die notwendigen Informationen, mit denen die Proteine an ihren jeweiligen subzellulären Zielort transportiert werden können. TA Proteine erfüllen eine Vielzahl von essentiellen biologischen Prozessen, sie fungieren zum Beispiel als Rezeptoren, sind maßgeblich an der Fusion von Vesikeln beteiligt sowie an der Initiation von Apoptose. Durch ihren modularen Aufbau können TA Proteine nicht mit dem Signalerkennungspartikel interagieren und müssen deshalb posttranslational zum ER geleitet werden. Im Modellorganismus Bäckerhefe (Saccharomyces cerevisiae) ist der GET Biogenese-Weg am besten beschrieben und läuft wie folgt ab: Nach der Termination der Translation bindet das Protein SgtA das TA Protein und händigt es über den Adapter-Komplex, bestehend aus Get4 und Get5, an die zytosolische ATPase Get3 aus. Get3 ist der zentrale Zielsteuerungsfaktor des GET Biogenese-Weges. Sobald sich ein Komplex aus Zeilsteuerungsfaktor und TA Protein gebildet hat, wird dieses zur Membran des ERs überführt. Dort wird das TA Protein an den Rezeptorkomplex bestehend aus Get1 und Get2 übergeben, welcher anschließend die Insertion des TA Proteins in die Doppellipidschicht des ERs initiiert.
Get3 hat im zellulären Kontext noch eine weitere Funktion. Unter oxidativem Stress oder Energie depletierenden Bedingungen wird Get3 zu spezifischen Foci rekrutiert, an denen sich noch weitere durch Stress -induzierbare Proteine, wie z.B. die der Familie der Hitze Stress Proteine (HSPs) versammeln. Analysen haben gezeigt, dass Get3 unter den oben genannten Bedingungen, Konformationsänderungen durchläuft und dann als ATP unabhängige Holdase fungiert. Diese kann die exponierten, hydrophoben Anteile von Proteinen binden, um dadurch die Proteostasis aufrechtzuhalten.
Durch die Bedeutsamkeit der TA Proteinen ist die zentrale ATPase Get3 in allen Domänen des Lebens hochgradig konserviert. Phylogenetische Analysen ergaben, dass sich Get3 im Allgemeinen in eine „A“ Gruppe sowie eine „BC“ Gruppe aufspaltet. Im Modellorganismus Arabidopsis thaliana (Ackerschmalwand) wurden drei Orthologe zu Get3 identifiziert. Eins davon gehört zu der „A“ Gruppe und befindet sich im Zytoplasma. Die anderen zwei Orthologe befinden sich in den Organellen endo-symbiotischen Ursprungs und gehören der „BC“ Gruppe an. Untersuchungen an verschiedenen Deletionsmutanten in A. thaliana haben gezeigt, dass die Mutationen einzelner GET Komponenten zu einer signifikanten Verkürzung der Haarwurzeln führen, obwohl der restliche Habitus der Pflanze unverändert bleibt. Diesbezüglich wurde SYP123 als einziges TA Proteine identifiziert, dessen Abundanz durch die Deletion von GET Komponenten beeinflusst werden kann. Von den anderen beiden Orthologen organellären Ursprungs ist, abgesehen von ihrer Lokalisation nichts weiter bekannt
Vier Orthologe Gruppen in Pflanzen
Da bislang nicht mehr als zehn Pflanzenarten für phylogenetische Analysen herangezogen wurden, wurden in dieser Arbeit die taxonomischen Beziehungen von Get3 zu einander in 50 Spezies der Viridiplantae auf Basis der Orthologie sowie Homologie untersucht. Dies führte zur Identifizierung einer zytolischen (AtGet3a), einer plastidären (AtGet3b), einer mitochondriellen (AtGet3c) sowie einer Monokotyledone spezifischen Gruppe (SBGet3). Die Lokalisation der ersten drei Gruppen wurde in selektierten Pflanzen, sowohl homolog als auch heterolog, der unterschiedlichen Spezies mittels saGFP untersucht, und es konnte gezeigt werden, dass mehrere Get3 Orthologe mit unterschiedlichen subzellulären Lokalisationen eine unter Pflanze häufig auftretende Eigenschaft ist. Das Weitern konnte gezeigt werden, dass manche Komponenten des Präzielsteuerungskomplexes (SgtA und Get4) sowie des Rezeptorkomplexes (Get1) in fast allen der 50 untersuchten Pflanzenarten vorhanden sind. Dies weist auf eine Konservierung des gesamten GET Biogenese-Weges in Pflanzen hin.
Get3a in Arabidopsis thaliana
Da die molekulare Zusammensetzung des Präzielsteuerungskomplexes für AtGet3a in A. thaliana nicht bekannt ist, habe ich Co-Immunpräzipitationen mit Zellextrakten aus weißer Zellkultur und einen von mir selbst aufgereinigten Antikörper gegen AtGet3a durchgeführt. Nach anschließender Gelelektrophorese und einer Anfärbung mit Coomassie Brilliant Blue ließ sich ein reproduzierbares Muster aus Proteinbanden erkennen, welche ausgeschnitten und mittels LC-MS/MS analysiert wurden. Dadurch wurde ein putativer Kandidat für Get5 identifiziert sowie eine Assoziation mit Chaperonen und proteasomalen Untereinheiten.
Um die Zielsteuerungseffizienz und Topologie von ER-Membranproteinen zu analysieren habe ich (i) die rekombinante Synthese eines Modell-TA Proteins mit glykosylierbarem opsin bovine glycosylation Tag (OPG) etabliert sowie (ii) eine Methode etabliert um in isolierten Protoplasten die Richtigkeit der Insertion zu überprüfen. Mit Hilfe dieser Methoden können nun verschiedene Mutanten auf ihre Insertions-Wirksamkeit untersucht werden. Desweitern können durch Mutationsanalysen die notwendigen physikochemischen Eigenschaften für die Erkennung des Substrates ermittelt werden.
Eine weit verbreitete Methode im GET Feld ist die tail-anchor translocation (TAT). Bei dieser Methode werden isolierte mikrosomale Fraktionen des rauen ERs mit rekombinanten Komplexen bestehend aus Zielsteuerungsfaktor und TA Protein inkubiert. Durch einen rekombinanten OPG, der im Lumen des ERs post-translational modifiziert werden kann, ist die Beobachtung einer zeitabhängigen Kinetik der Glykosylierung möglich. Dieses System wurde bislang nur für Komponenten aus Säugern oder Hefen benutzt, aber noch nie mit einem System auf pflanzlicher Basis. Um dies zu verwirklichen, habe ich die rekombinante Proteinexpression soweit optimiert, dass der Großteil des synthetisierten Proteins sich im löslichen Anteil des Lysats statt in den Inclusion Bodies befand. Mittels dieser Optimierung konnte ich die Ko-Expression von Zielsteuerungsfaktor mit TA Protein als löslichen Komplex etablieren. Ergänzend zu den löslichen Komplexen habe ich eine geeignete Methode etabliert um mittels Saccharosegradienten mikrosomale Fraktionen aufzutrennen in denen AtGet3a angereichert ist. Leider müssen noch die Parameter der Reaktion optimiert werden, aber die Akquirierung alle nötigen Bestandteile ist etabliert.
Carotinoide sind Pigmente, die in Pflanzen, Algen, einigen Pilzen und Bakterien vorkommen. Sie spielen eine wichtige Rolle bei der Photosynthese durch Absorption von Licht und beim Lichtschutz. Sie sind verantwortlich für die braunen, roten, orangen und gelben Farben von Obst, Gemüse, Herbstblättern und die Farbe einiger Blumen und Algen. Tiere können keine Carotinoide synthetisieren, daher ist ihre Anwesenheit auf die Nahrungsaufnahme zurückzuführen. Carotinoide sind Tetraterpenoide (40C), die aus Isoprenoidmolekülen (5C) synthetisiert werden. Der Methylerythritol-phosphatweg ist der Carotinoid-Vorläuferweg, der die Isoprenoideinheiten bildet. Carotinoide haben aufgrund ihrer gesundheitlichen Vorteile das Interesse der Nutrazeutika-Industrie geweckt.
Fucoxanthin ist ein Carotinoid, das nur in Kieselalgen, Braunalgen, Haptophyten und einigen Dinoflagellaten vorkommt. Aufgrund seiner Vorteile zur Vorbeugung von Krebs, kognitiven Erkrankungen und Fettleibigkeit sowie seiner antioxidativen Eigenschaften ist Fucoxanthin ein sehr interessantes Molekül fur die Nutrazeutikabranche.
Fucoxanthin hat eine komplexe chemische Struktur mit einer Allenbindung und einer Epoxyketogruppe. Daher wäre seine chemische Synthese kompliziert, da es auch eine stereokontrollierte Synthese erfordert86. Aus diesem Grund ist die Extraktion aus Makroalgen oder Mikroalgen die Methode der Wahl für die kommerzielle Herstellung von Fucoxanthin.
In dieser Arbeit bestand das Ziel darin, die Fucoxanthin-Produktivität in Kieselalgen mit gentechnischen Methoden zu steigern, damit die Zellen mehr Fucoxanthin produzieren. Zu diesem Zweck wurde der Effekt der Insertion zusätzlicher Kopien von Genen in das Genom untersucht, die für geschwindigkeitsbestimmende oder Schlüsselenzyme im Carotinoid- und MEP-Weg kodieren.
Zu Beginn wurden diese Effekte bei einzelnen Mutanten beobachtet. Letztendlich ist es jedoch das Ziel, eine Mutante zu erzeugen, die mehrere geschwindigkeitsbestimmende Enzyme überexprimiert, um auf diese Weise Engpässe zu vermeiden. In früheren Studien erreichten Eilers et al.54 durch die einmalige Überexpression der psy- und dxs-Gene in der Kieselalge P. tricornutum einen 2.4- und 1.8-fachen Anstieg der Fucoxanthin-Spiegel.
In dieser Arbeit führte die Insertion zusätzlicher Kopien der Gene idi und pds2 nicht dazu, dass die Zellen mehr Fucoxanthin produzieren. Im Gegensatz dazu erreichten die Mutanten mit zusätzlichen Kopien der Gen ggpps und mit zusätzlichen Kopien sowohl von psy als auch von dxs seine um 28% bzw. 10% höhere Fucoxanthin-Produktivität pro Million Zellen. Bei diesen Mutanten ist die Gesamtproduktivität jedoch geringer als beim Wildtyp, da ihr Wachstum langsamer als beim Wildtyp ist.
Unter Berücksichtigung der besten Zielgene wurden Mutanten erzeugt, die gleichzeitig zusätzliche Kopien von psy, dxs und ggpps enthielten. Die Mutanten hatten unter sehr niedriegen Lichtbedingungen eine um bis zu 61% höhere Produktivität pro Million Zellen als der Wildtyp. Ausnahmsweise wurden diese Mutanten bei sehr schwachem Licht (10 µE m-2 s-1) gezüchtet, da sie sehr gestresst waren und als Zellklumpen wuchsen. Obwohl die Gesamt-Fucoxanthin-Spiegel in diesen Mutanten unter diesen Bedingungen höher sind als im Wildtyp, sind sie daher niedriger als die Fucoxanthin-Spiegel bei den in anderen Experimenten verwendeten Lichtbedingungen (50 µE m-2 s-1). Als Ergebnis dieser Experimente kann gesagt werden, dass die Belastung der Zellen nach den genetischen Veränderungen untersucht werden muss, da dies zu einer Abnahme der Biomasse und folglich zu einer Abnahme der Fucoxanthinproduktion führt. Alternativ könnte auch eine 2-Stufen-Kultur etabliert werden, in der in einem ersten Schritt eine hohe Biomasse erreicht wird und im zweiten Schritt die Expression der interessierenden Gene induziert wird.
Aufgrund der antioxidativen Eigenschaften von Carotinoiden besteht eine übliche Strategie zur Akkumulation von Carotinoiden darin, die Zellen unter oxidative Stressbedingungen zu setzen. Diese Strategie ist jedoch nicht wirksam für die Anreicherung von Fucoxanthin unter hohen Salzkonzentrationen oder hohen Lichtbedingungen. Bessere Versuchspläne könnten jedoch eine 2-Stufen-Kultur oder adaptive Laborbedingungen gewesen sein.
Eine andere mögliche Strategie zur Erhöhung des Fucoxanthinspiegels wäre die Durchführung einer zufälligen Mutagenese der Zellen. Auf diese Weise sind keine Vorkenntnisse über den Carotinoidsyntheseweg und seine Regulation erforderlich und es kann zu Veränderungen in Genen führen, die keine offensichtlichen Ziele sind.
Experimente mit zufälliger Mutagenese erfordern ein Hochdurchsatz-Screeningsystem, da Hunderte oder sogar Tausende von Mutanten erhalten werden. Eine mögliche Strategie, um die Kultivierung der hohen Anzahl von Mutanten zu vereinfachen, ist die Einkapselung dieser Mutanten in Alginatkügelchen. Auf diese Weise können alle Mutanten in demselben Gefäß kultiviert werden. Die eingekapselten Zellen können dann beispielsweise mit einem Durchflusszytometer auf große Partikel durch Fluoreszenz- oder Absorptionsmessungen gescreent werden.
...
Anthropogene Landnutzung in ariden Savannen verändert die strukturelle Diversität der Vegetation und bedroht damit die Artenvielfalt der Flora und Fauna von etwa 20% der Landoberfläche der Erde. Ziel meiner Dissertation war es, den Einfluss von Landnutzung auf die Abundanz und Diversität von Kleinkarnivoren und ihrer Beutetiere zu untersuchen. Dabei sollten Bioindikatoren identifiziert werden, die eine Einschätzung der Diversität im Farmmosaik der südlichen Kalahari ermöglichen. Entlang eines Weideintensitätsgradienten analysierte ich mit Hilfe freilandökologischer Methoden die komplexen Zusammenhänge zwischen Beweidungsintensität, struktureller Diversität der Vegetation, Beuteverfügbarkeit und Diversität von Kleinkarnivoren. Nach den Ergebnissen dieser Studie in der südlichen Kalahari kann ich folgende Aussagen über die anthropogene Störung der Integrität von ariden Savannensystemen durch Beweidung treffen: 1. Eine Steigerung der Bestockungsdichten von Weidetieren führte zu drastischen Veränderungen der Zusammensetzung und strukturellen Diversität der Vegetation. Dabei sank mit zunehmendem Beweidungsdruck der Anteil an Gräsern an der Vegetationsbedeckung bei gleichzeitigem Anstieg der Strauchvegetation. Die Heterogenität des Habitats, gemessen in Anzahl von Strauchpatches (ø>4m) pro Hektar, zeigte einen unimodalen Verlauf bei steigender Strauchbedeckung und damit bei steigender Weideintensität. Maximale Habitatheterogenität wurde bei einer Strauchbedeckung von ca. 20% festgestellt. 2. Die beobachteten Veränderungen der Vegetation wirkten sich sowohl auf Tierarten aus, die sich direkt von pflanzlicher Kost ernähren als auch auf solche am Ende einer Nahrungskette: Die Effekte zunehmender Strauchbedeckung (und damit steigender Beweidungsintensität) auf die relative Häufigkeit der wichtigsten Beutetiere von Kleinkarnivoren unterschieden sich zwischen den einzelnen Gruppen. Es bestand eine lineare negative Korrelation für Orthopteren, während unimodale Antwortmuster für Käfer mit maximaler Abundanz bei einer Strauchbedeckung von ca. 15% und für Nagetiere bei ca. 12,5% festgestellt wurden, wohingegen keine Korrelation für Termiten ermittelt werden konnte. 3. Am Beispiel der Nagetiergemeinschaft konnte die wesentliche Bedeutung der räumlichen Skala für das Auflösungsvermögen von Abundanz- und Diversitätsmuster gezeigt werden. Ihre Muster und damit die Auswirkungen von Beweidung wurden ausschließlich auf einer großen räumlichen Skala (250ha) identifiziert, nicht jedoch auf der Skala des mittleren Aktionsraums (1ha). Ein wichtiges Fazit dieser Ergebnisse ist, dass zuerst diejenige räumliche Skala identifiziert werden muss, auf der ein Organismus mit Habitatstrukturen (Z.B. geeigneten Nahrungsplätzen) interagiert, um die Effekte von Veränderungen der strukturellen Zusammensetzung von Habitaten verstehen zu können. Dabei führte steigende Grasbedeckung zu einer exponentiellen Sättigung der Gesamtabundanz sowie der Diversität der Nagetiere. Dagegen wurde bei Zunahme der Strauchbedeckung ein unimodales Muster für Gesamtabundanz und Diversität festgestellt. 4. Obwohl ein hoher Strauchanteil sich durchgehend negativ auf die Beuteverfügbarkeit auswirkte, haben Sträucher eine besondere Bedeutung für die Artenvielfalt in diesem Lebensraum, da sie als Schutz- und Nistplatz wichtige Funktionen erfüllen. Am Beispiel von Fuchsmangusten (Cynictis penicillata) konnte ich exemplarisch die zentralen Funktionen von Sträuchern und ihren Einfluss auf den Reproduktionserfolg dieser Art zeigen. Interessanterweise waren die Auswirkungen von Sträuchern inkonsistent für unterschiedliche räumliche Skalen. Im Mikrohabitat haben Strauchstrukturen positive Eigenschaften (Schutzfunktionen). Fuchsmangusten legten ihre Bauten meistens unter Sträuchern an, um ein Einstürzen durch Huftrampeln zu verhindern und ihr Prädationsrisiko durch Greifvögel zu reduzieren. Für die Anlage ihrer Reproduktionsbauten wählten sie Strauchstrukturen mit einem Durchmesser von mindestens sechs Metern (bevorzugt der Art Acacia hebeclada) und außerdem, wenn sich im Umkreis von 10 Metern kein weiterer Strauchpatch befand. Auf einer größeren räumlichen Skala (im Umfeld von einem Hektar um Reproduktionsbauten) wurden Flächen mit einer Strauchbedeckung präferiert, die geringer war, als zufällige Flächen im Habitat. Dabei wirkte sich zunehmende Strauchbedeckung auch negativ auf die Gruppengröße und den Reproduktionserfolg dieser Art aus. Für eine erfolgreiche Reproduktion bei Fuchsmangusten scheint die Strauchbedeckung im Umfeld von einem Hektar um die Reproduktionsbauten einen Schwellenwert zwischen 10 und 15% nicht überschreiten zu dürfen. Dies ist mit der sinkenden Beuteverfügbarkeit (Nagetiere und Arthropoden) bei zunehmender Strauchbedeckung zu begründen. 5. Aufgrund der dramatischen Auswirkungen von Verbuschung auf die Beuteverfügbarkeit von Kleinkarnivoren unterschieden sich die Abundanzen der einzelnen Kleinkarnivoren deutlich zwischen diesen Farmen. Die Abundanz der jeweiligen Einzelarten konnte über Regressionsmodelle mit Vegetationsparameter oder Beutetierverfügbarkeit erklärt werden. Im Gegensatz dazu war die Strauchbedeckung die beste erklärende Variable für Gesamtabundanz und Diversität der Gilde. Sie integriert habitatspezifische Eigenschaften, wie die Verfügbarkeit von vier Beutetiergruppen, die Konnektivität von Nahrungspatches mit hoher Qualität, das Prädationsrisiko durch Greifvögel sowie das Nistplatzangebot. Dabei sank mit zunehmender Strauchbedeckung die Gesamtabundanz, während für die Diversität ein unimodales Muster mit maximaler Diversität bei einer Strauchbedeckung von ca. 12,5% festgestellt wurde. Für eine Einschätzung der Diversität von Kleinkarnivoren eignet sich die Ginsterkatze (Genetta genetta) als Indikatorart. Interessanterweise war die Strauchbedeckung ein noch besserer Bioindikator für die Einschätzung der Diversität von Kleinkarnivoren. 6. Die Schlussfolgerung meiner Ergebnisse ist, dass die Diversität der Kleinkarnivoren einen Großteil der Biodiversität der Untersuchungsflächen in der südlichen Kalahari widerspiegelt. Dabei integriert die Kleinkarnivorengilde als Indikatorvariable neben der zoologischen Diversität (i) auch die strukturelle Diversität der Vegetation (ii) sowie die strukturelle Organisation im Nahrungsnetz (iii). Kleinkarnivoren erhalten dadurch einen Status einer Indikatorgilde und eignen sich damit sehr gut zur Beurteilung der südlichen Kalahari oder einer anderen Weidelandschaft arider Savannen. 7. Das für den Naturschutz wichtigste Ergebnis meiner Arbeit ist, dass höchste Diversität aller Untersuchungsorganismen bei einer Strauchbedeckung zwischen 10 und 15%, also einer mittleren Beweidungsintensität von ca. 3,5 LSU/ l00ha, festgestellt wurde. Daher wirken sich mäßige Bestockungsdichten durchaus positiv auf die Diversität aus, während eine Überbeweidung einen dramatischen Rückgang der Artenvielfalt in diesem Lebensraum verursacht.
Das Volumen von tierischen Zellen ist durch äußere und innere Einflüsse Veränderungen unterworfen. Um die zelluläre Homöostase zu gewährleisten und bedrohliche Volumenänderungen zu verhindern, verfügen die meisten Zellen daher über regulatorische Mechanismen zur Verringerung (regulatory volume decrease, RVD) oder Erhöhung (regulatory volume increase, RVI) des Zellvolumens. Darüber hinaus finden diese Mechanismen auch im Rahmen physiologischer Prozesse, wie z. B. der Zellbewegung oder der Proliferation Verwendung. Der RVD erfordert einen Sensor-Mechanismus, der die Veränderung des Zellvolumens registriert. Die nachfolgende Signaltransduktion führt zur Aktivierung von Transportmechanismen, die v. a. dem Export von K+- und Cl--Ionen, aber auch organischen Osmolyten, dienen und zum Ausstrom von Wasser aus der Zelle führen, bis das Sollvolumen erreicht ist. Bisher ist noch nicht sicher, welcher Mechanismus den RVD einleitet; in verschiedenen Geweben wurden Hinweise auf mehrere mögliche Kandidaten gefunden. In dieser Arbeit wurde der RVD von HaCaT-Zellen, einer humanen Keratinozyten-Zelllinie hinsichtlich der Beteiligung des Aktin-Zytoskeletts mit mikroskopischen, pharmakologischen und molekularbiologischen Methoden untersucht. HaCaT-Zellen schwellen in hypotonem Medium schnell an (30 s) und führen einen RVD durch, der nach ca. 5 min das Ausgangsvolumen wieder herstellt. Der RVD von HaCaT-Zellen ist vom Einstrom extrazellulärer Ca2+-Ionen abhängig. Dieser Einstrom erfolgt durch einen Kanal, der durch die Inhibitoren von stretch activated channels (SAC) Gd3+ und GsMTx-4, sowie den spezifischen Inhibitor des transient receptor potential vaniloid 4 (TRPV4), Rutheniumrot, gehemmt werden kann. TRPV4 wird in HaCaT-Zellen exprimiert. Der RVD und der damit verbundene Einstrom von Ca2+-Ionen, nicht aber das Anschwellen der Zellen werden durch den Abbau des Aktin-Zytoskeletts durch 2 μM Cytochalasin D (CD) gehemmt. Die Hemmung durch CD ist reversibel; nach dem Entfernen von CD bildet sich innerhalb von 30 min erneut ein Netzwerk von Aktinfilamenten aus. Ein zwei-stufiges Absenken der Osmolarität (jeweils ca. 20%), zunächst in Anwesenheit von CD führt zu einer Volumenzunahme, löst aber keinen RVD aus. Auch nach dem Entzug von CD bleibt das Volumen konstant erhöht. Erst das zweite Absenken löst eine Volumenregulation aus, allerdings nur bis zu dem Volumen, das nach dem Entfernen von CD etabliert war. Die mikroskopische Struktur des Aktin-Zytoskeletts von HaCaT-Zellen ändert sich während des RVD kaum. Durch die Messung der Fluoreszenz von gebundenem Rhodamin-Phalloidin konnte ein vorübergehender Anstieg der Menge von Aktinfilamenten (F-Aktin) während des RVD gezeigt werden. Ein quantitativer biochemischer Ansatz zeigt, dass die relative Menge des Triton- X-100-löslichen Anteils des Aktin-Zytoskeletts im gleichen Zeitraum zunimmt. Der RVD von HaCaT-Zellen hängt ebenfalls von der Geschwindigkeit der Osmolaritätsänderung ab; die langsame Verringerung der Osmolarität (≤ 5 mosM/min) führte zum Anschwellen, nicht aber zum RVD. Auf Basis der erzielten Ergebnisse wird ein Modell für den RVD von HaCaTZellen vorgeschlagen, bei dem der Anstieg des Zellvolumens zu einer Zunahme der mechanischen Spannung im kortikalen Zytoskelett führt. Dadurch wird – indirekt, etwa durch Phospholipase A2, oder direkt - TRPV4 aktiviert. Dies führt zu einem Einstrom von extrazellulären Ca2+-Ionen und über Ca2+-abhängige Aktin-bindende Proteine (z. B. Gelsolin) zu einer Reorganisation des Aktin-Zytoskeletts (Gel-Sol-Übergang) und verbunden damit zu einer Abnahme der mechanischen Spannung. Ca2+-Ionen und kurze Aktinfilamente aktivieren Transportmechanismen, die zum Ausstrom von K+- und Cl-- Ionen und einer Abnahme des Zellvolumens führen.
Plastids are complex organelles that fulfil numerous essential cellular functions, such as
photosynthesis, amino acid and fatty acid synthesis. he majority of proteins required for
these functions are encoded in the nuclear genome and synthesised on cytosolic ribosomes as
precursors, which are posttranslationally transported to and imported into the organelle by
concerted actions of translocons in the outer and inner chloroplast membrane. For most
preproteins, targeting to the organelle is ensured by a specific import signal, a so called
transit peptide, which is specifically recognised by receptors at the chloroplastês surface. A transit peptide is generally defined as essential and sufficient for precursor targeting to and
translocation into chloroplasts, (however, an analysis of the ability of transit peptides to drive translocation of tightly folded passenger domain revealed that the transit peptide is not
always sufficient for the translocation event. A critical signal length requirement of amino
acids has been determined in vivo and in vitro. In the case of shorter transit peptide, the
succeeding portion of the mature domain provides an extension of an unfolded polypeptide
stretch required for successful translocation. The analysis of the unfolding mode of a folded
model passenger during translocation links the observed transit peptide length requirement
to the action of an energising unit present in the intermembrane space of chloroplasts.
The likely candidate for this energising unit space is putative imsHsp70, previously hypothesised to function in translocation of precursor proteins across the outer membrane. However, as the identity of this protein has up to now remained unknown, its existence has
been a matter of debate. The present study focuses on the isolation and characterisation of
imsHsp70 at the molecular level. Mass spectrometry analyses and in vivo localisation studies
demonstrate that while no specific imsHsp70 exists, multiple cytosolic Hsp70 isoforms are
targeted to the intermembrane space, but not to the stroma of chloroplasts. Thus, a so far unrecognised mode of dual targeting to chloroplasts and cytosol is most likely to ensure the
allocation of (sp s into the intermembrane space.
Neurosphären-bildende Zellen mit dem Potential zur Selbsterneuerung, sowie zur vielseitigen Differenzierung, wurden bereits aus diversen peripheren und zentralen Geweben isoliert. Auch von der Neuralleiste abstammende NCSCs wurden in verschiedenen embryonalen und adulten, peripheren Geweben im Nager-Modell identifiziert und als Neurosphären (NS) kultiviert. In der vorliegenden Arbeit konnten nun erstmals auch aus Zellen des peripheren Nervensystems von Huhn-Embryonen NS gebildet werden. Zudem wurde das Selbsterneuerungspotential der NS-bildenden Zellen analysiert und über 10 Passagen, beziehungsweise mehrere Monate hinweg quantifiziert. Durch eine selektive Isolierung O4-positiver Gliazellen aus Huhn DRGs, konnte der Anteil NS-generierender Zellen gegenüber unsortierten DRG-Zellen signifikant erhöht werden. Aufgrund dieser Beobachtung können im Gewebe verbliebener NCSCs als Ursprung NS-generierender Zellen ausgeschlossen werden. Die von Gliazellen abstammenden NS-Zellen wurden im Weiteren auf ihr Entwicklungspotential hin untersucht. Sowohl über Antikörperfärbungen, als auch auf Nukleinsäurebasis in RT-PCR-Analysen, konnte für die NS-Zellen ein oligopotentes Differenzierungspotential nachgewiesen werden. Auch in klonalen NS-Kulturen wurde die Differenzierung zu Neuronen, Gliazellen und Melanozyte bestätigt. Aufgrund des Selbsterneuerungspotentials, sowie des oligopotenten Entwicklungspotentials O4-sortierter NS-generierender Zellen, wurden die in dieser Arbeit identifizierten und charakterisierten NS-bildende Zellen GDSCs (glial-derived stem cells) benannt. Die im Huhn-Modell beschriebenen NS-bildenden PNS-Zellen wurden anschließend auch im Nager-Modell nachgewiesen. NS-generierende Zellen sind in prä- und postnatalen Maus-DRGs vorhanden und zeigen ein Selbsterneuerungspotential, das für Stammzellen charakteristisch ist. In Zusammenarbeit mit Dr. Verdon Taylor (Freiburg) konnten die aus DRGs von transgenen EGFP-Mäusen gewonnene NS-Zellen in utero in die Hirnventrikel von E10.5 Mausembryonen injiziert werden. Die implantierten, grünfluoreszierenden Zellen wurden noch 5 Monate nach dem Eingriff in großer Zahl im Hirngewebe nachgewiesen und konnten als Neurone, Astrozyten und OLPs/Oligodendrozyten identifiziert werden. Die Entstehung neuraler ZNS-Zelltypen beruht hierbei vermutlich auf einer Änderung der regionalen Identität der Zellen durch die NS-Kultivierung. Obwohl sich einige implantierte Zellen auch 5 Monate nach dem Eingriff noch im Zellzyklus befanden, konnte in keinem der analysierten Gehirne hyperplastisches Gewebe oder tumorassoziiertes Wachstum beobachtet werden. Die in dieser Arbeit nachgewiesene Möglichkeit NS-bildende Zellen aus dem PNS zu gewinnen und durch eine selektive Sortierung für O4-positive Gliazellen zusätzlich anzureichern, stellt einen wichtigen Schritt in Richtung gezielter Generation diverser neuronaler und glialer Subtypen des peripheren Nervensystems dar. Zusammen mit der durch die Neurosphären-Kultivierung erzielten Änderung der regionalen Identität muriner NS-Zellen, könnte diese Arbeit außerdem einen wichtigen Grundstein für weiterführende Arbeiten in Richtung Stammzell-Therapien, z.B. in Multiple-Sklerose-Modellen darstellen.
Brustkrebs repräsentiert die häufigste Krebserkrankung bei Frauen. Der Estrogen Rezeptor α (ERα) ist hier als ein wichtiger prognostischer Marker für Mammakarzinome etabliert, der die Homonsensitivität des Tumors determiniert. Dieser impliziert den Einsatz von Anti-Estrogenen, die die wachstumsfördenden Funktionen von ERα blockieren können. Übergewicht erhöht deutlich das Risiko einer Brustkrebserkrankung bei postmenopausalen Frauen. Übergewicht geht generell mit einem erhöhten Serumleptinspiegel einher. Das Zytokinhormon Leptin ist ein zentraler humoraler Faktor bei der Wahrnehmung und Steuerung der körpereigenen Energiereserven im Gehirn, das darüber hinaus auch pleiotrope Funktionen in der Angiogenese, Hämatopoese, Reproduktion und im Immunsystem ausübt. Leptin bindet an den Transmembranrezeptor Ob-RL (Obese-Rezeptor, lange Isoform) und aktiviert unter anderem den Januskinase (Jak)- „signal transducer and activator of transcription“ (Stat)-Signalweg, der mit neoplastischen Veränderungen assoziiert ist. Weil der kausale Zusammenhang zwischen Übergewicht und Krebserkrankungen gut belegt ist, während die molekularen Mechanismen jedoch noch nicht vollständig aufgeklärt sind, sollte daher in der vorliegenden Arbeit die mögliche Wechselwirkung des leptininduzierten Jak-Stat-Signalwegs und des ERα´s untersucht werden. Ein Zusammenspiel der Ob-RL- und ERα-abhängigen Signalwege wurde einerseits mit Luziferase-Reporter-Konstrukten untersucht, die unter der Kontrolle eines Stat3-responsiven Elements standen. Dabei konnten zelltyp-spezifsche Unterschiede in der leptinabhängigen Stat3-Aktivierung beobachtet werden. Die endogen ERα-exprimierenden Brustkrebszellen MCF-7 wiesen eine wesentlich stärkere Stat3-Aktiverung und Phosphorylierung nach Leptinapplikation auf, als ERα-negative HeLa Zervixkarzinomzellen oder die Brustkrebslinie MDA-MB-231. Dieser Effekt konnte durch die Hemmung der ERα-Expression mittels siRNA in MCF-7 Zellen revertiert werden. Die ERα Überexpression in HeLa Zellen resultierte in einer verstärkten Stat3-Transaktiverung nach Leptinbehandlung. Diese Zunahme in der Stat3-Aktivierung konnte nicht durch eine Kostimulation der Zellen mit einem ERα-Agonisten oder Antagonisten beeinflusstwerden. Weiterhin konnte eine gesteigerte Zellviabilität nach Leptinstimulation in ERα-positiven Zellen detektiert werden. Durch Koimmunpräzipitationsstudien konnte direkte Interaktion von ERα, Jak2 und Stat3 nachgewiesen werden, was auf einen zytoplasmatisch lokalisierten Komplex hindeutet. Eine Mikroarray-Analyse von leptinstimulierten Zellen ergab eine differentielle Regulation von 133 Genen in Abhängigkeit ihres ERα-Expressionstatus. Von den 133 Zielgene sind 42 in der Literatur bereits in Zusammenhang mit malignem Wachstum beschrieben und könnten somit die erhöhte Viabilität der ERα-exprimierenden Zellen in Reaktion auf Leptin erklären. Die in dieser Arbeit gewonnen Erkenntnisse deuten auf eine entscheidende Rolle des ERα´s in der Verstärkung der leptininduzierten Stat3-Aktiverung hin. Diese Daten zur Interaktion von ERα mit einem wachstumsfördernden Signalweg können zur Entwicklung neuartiger Behandlungsmöglichkeiten in der Brustkrebstherapie von übergewichtigen Patientinnen beitragen.