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In the title compound, C19H24N2O2, a di-Mannich base derived from 2-methylphenol and 1,3,6,8-tetraazatricyclo[4.4.1.13,8]dodecane, the imidazolidine ring adopts a twist conformation, with a twist about the ring N—C bond [C—N—C—C torsion angle = −44.34 (14)°]. The two 2-hydroxy-3-methylbenzyl groups are located in trans positions with respect to the imidazolidine fragment. The structure displays two intramolecular O—H⋯N hydrogen bonds, which each form an S(6) ring motif. In the crystal, the molecules are linked by weak C—H⋯O interactions with a bifurcated acceptor, forming a three-dimensional network.
The title compound, C12H20N4O, undergoes a phase transition on cooling. The room-temperature structure is tetragonal (P43212, Z′ = 1), with the methoxybornyl group being extremely disordered. Below 213 K the structure is orthorhombic (P212121, Z′ = 2), with ordered molecules. The two independent molecules (A and B) have very similar conformations; significant differences only occur for the torsion angles about the Cbornyl—Ctetrazole bonds. The independent molecules are approximately related by the pseudo-symmetry relation: xB = −1/4 + yA, yB = 3/4 - xA and zB = 1/4 + zA. In the crystal, molecules are connected by N—H⋯N hydrogen bonds between the tetrazole groups, forming a pseudo-43 helix parallel to the c-axis direction. The crystal studied was a merohedral twin with a refined twin fraction value of 0.231 (2).
The title molecule, C34H28I4·4C6H6, has crystallographic 4 symmetry and crystallizes with four symmetry-related benzene solvent molecules. The phenyl group is eclipsed with one of the adamantane C—C bonds. The tetraphenyladamantane units and the benzene solvent molecules are connected by weak intermolecular phenyl–benzene C—H⋯π and benzene–benzene C—H⋯π interactions. In the crystal, molecules are linked along the c-axis direction via the iodophenyl groups by a combination of weak intermolecular I⋯I [3.944 (1) Å] and I⋯π(phenyl) [3.608 (6) and 3.692 (5) Å] interactions.
Zur Untersuchung der Eigenschaften organischer Halbleiter sollte die Ultrareinigung organischer Materialien durch Zonenschmelzen ermöglicht werden und anschließend dieses Verfahren auf einen neuen molekularen n-Halbleiter, Perfluoranthracen, angewendet werden. Ein Großteil der vorliegenden Arbeit beschäftigte sich daher mit der Konstruktion einer Zonenschmelze. Diese sollte in der Lage sein, laborübliche Mengen organischer Materialien zu reinigen (ca. 0,5-5 g). Ein Eigenbau wurde in Angriff genommen, um eine optimale Anpassung an die zu erwartenden Aufgabenstellungen zu erreichen. Daher wurde das System in einer modularen Bauweise konzipiert, sodass einzelne oder mehrere Heizzonen verwendet werden können und die Apparatur auch später beliebig erweitert werden kann. Zunächst mussten Erfahrungen mit der Wärmezufuhr und Kühlung gesammelt werden und ein verlässlicher Zugmechanismus entwickelt werden, der die Probe in kontrollierter, langsamer Weise durch die Apparatur bewegt. Ein grosses Problem stellte das Bersten der gläsernen Probenbehältnisse beim Zonenschmelzen einiger Substanzen dar. Nach dem erfolgreichen Einsatz verschiedener Puffermaterialien wurde schliesslich ein apparativer Aufbau entwickelt, der auf eine aktive Kühlung verzichtete. Hierdurch konnte die unkontrollierte Sublimation unterbunden werden und das Bersten der Probenbehältnisse wurde unterdrückt. Gleichzeitig musste jedoch sichergestellt werden, dass die Effektivität des Zonenschmelzen auch ohne den Einsatz grosser Temperaturgradienten gegeben war. Die Reinigung verschiedener kommerziell verfügbarer Substanzen wurde getestet und gleichzeitig die Analytik der organischen Verunreinigungen mittels Gaschromatographie im Arbeitskreis etabliert. Das Zonenschmelzen ermöglichte schließlich die Reinigung von Anthracen bis auf 99,97%. In Dibenzothiophen konnten der Anteil der Nebenkomponenten unter die Nachweisgrenze verringert werden. Nach der Herstellung von Perfluoranthracen wurden unterschiedliche Methoden zur Reinigung getestet und schließlich das Zonenschmelzen angewendet. Es war möglich, kleinere Mengen an Perfluoranthracen in einer Reinheit von bis zu 99,11% zu isolieren, was durch reguläre Reinigungsverfahren wie Umkristallisation oder Sublimation nicht erreicht werden konnte. Dennoch limitierte die thermische Instabilität des Materials die Effektivität des Zonenschmelzens.
Weiterhin wurden die optische und elektrochemische Bandlücke von Perfluoranthracen untersucht, um Aussagen über die mögliche Anwendung als n-Halbleiter treffen zu können. Es wurde eine optische Bandlücke von 3,08 eV und eine elektrochemische Bandlücke von 2,82 eV ermittelt. Im Vergleich zu Anthracen wurden niedriger liegende Grenzorbitale bestimmt, was ein Einbringen von Elektronen in das energetisch niedrigste unbesetzte Molekülorbital (LUMO) und somit n-Halbleitung vereinfachen könnte. Schließlich wurde untersucht, ob sich durch die äquimolare Mischung von Anthracen und Perfluoranthracen Mischkristalle herstellen lassen, die Charge-Transfer-Eigenschaften (CT) und eine hohe elektrische Leitfähigkeit aufweisen würden. Hierzu mussten zunächst ausreichend grosse Einkristalle gezüchtet werden, von denen anschliessend die Röntgenkristallstruktur bestimmt wurde. Das einkristalline Material zeigte eine gemischt gestapelte Anordnung (siehe Abbildung 0.2), wie sie für andere Systeme, beispielsweise Benzol/Hexafluorbenzol, bekannt ist. In feldstärkenabhängigen und temperaturabhängigen Messungen wurden danach die elektrischen Eigenschaften des Materials charakterisiert. Es konnten keine Hinweise für CT-Eigenschaften gefunden werden. Dennoch besitzt der Mischkristall im Vergleich zu Anthracen eine etwa 10 12 -fach höhere Leitfähigkeit und erreicht Werte guter anorganischer Halbleiter. Das temperaturabhängige Verhalten selbst zeigt aber keine typisch halbleitenden Charakteristiken, da für die thermisch angeregte Zunahme der Ladungsträgerkonzentration im untersuchten Mischkristall kein lineares Verhalten im Arrhenius-Plot gefunden wurde. Die genauen Leitungsmechanismen bedürfen weiterer Untersuchungen. In nachfolgenden Experimenten könnte die mögliche Anwendbarkeit in elektronischen Anwendungen geklärt werden.
The title compound, C37H67NO13·2C2H6OS·1.43H2O, is a macrolide antibiotic with better solubility and better dermal penetration abilities than erythromycin A itself. The asymmetric unit of this form contains one erythromycin A molecule, two dimethyl sulfoxide (DMSO) solvent molecules, a fully occupied water molecule and a partially occupied water molecule with an occupancy factor of 0.432 (11). The 14-membered ring of the erythronolide fragment has a conformation which differs considerably from that in erythromycin A dihydrate [Stephenson, Stowell, Toma, Pfeiffer & Byrn (1997[Stephenson, G. A., Stowell, J. G., Toma, P. H., Pfeiffer, R. R. & Byrn, S. R. (1997). J. Pharm. Sci. 86, 1239-1244.]). J. Pharm. Sci. 86, 1239–1244]. One of the two DMSO molecules is disordered over two orientations; the orientation depends on the presence or absence of the second, partially occupied, water molecule. In the crystal, erythromycin molecules are connected by O—H⋯O hydrogen bonds involving the hydroxy groups and the fully occupied water molecule to form layers parallel to (010). These layers are connected along the b-axis direction only by a possible hydrogen-bonding contact involving the partially occupied water molecule.
The crystal structure of the title compound, C25H24N2O2, at 173 K has monoclinic (C2/c) symmetry. The molecule is located on a crystallographic twofold rotation axis with only half a molecule in the asymmetric unit. The imidazolidine ring adopts a twist conformation, with a twist about the ring C—C bond. The crystal structure shows the anticlinal disposition of the two (2-hydroxynaphthalen-1-yl)methyl substituents of the imidazolidine ring. The structure displays two intramolecular O—H⋯N hydrogen bonds, each forming an S(6) ring motif.
In the title salt, [Ag(C27H36N2)2]Cl·C4H8O, the AgI atom is coordinated by two 1,3-bis(2,6-dimethylphenyl)imidazol-2-ylidene ligands. The imidazole rings are inclined to one another by 46.69 (13)° and the benzene rings in each ligand are almost normal to the imdazole ring to which they are attached, with dihedral angles varying from 82.39 (13) to 88.27 (12)°. There are C—H⋯π interactions present in the cation, involving the two ligands, and the solvent molecule is linked to the cation via a C—H⋯O hydrogen bond. In the crystal, molecules are linked by trifurcated C—H⋯(Cl,Cl,Cl) hydrogen bonds, forming slabs parallel to (101). One isopropyl group is disordered over two sets of sites with an occupancy ratio of 0.447 (17):0.553 (17) and the THF molecule is disordered over two positions with an occupancy ratio of 0.589 (6):0.411 (6).
In the title ternary co-crystalline adduct, C7H14N4·2C6H5NO3, molecules are linked by two intermolecular O—H⋯N hydrogen bonds, forming a tricomponent aggregates in the asymmetric unit. The hydrogen-bond formation to one of the N atoms is enough to induce structural stereoelectronic effects in the normal donor→acceptor direction. In the title adduct, the two independent nitrophenol molecules are essentially planar, with maximum deviations of 0.0157 (13) and 0.0039 (13) Å. The dihedral angles between the planes of the nitro group and the attached benzene rings are 4.04 (17) and 5.79 (17)°. In the crystal, aggregates are connected by C—H⋯O hydrogen bonds, forming a supramolecular dimer enclosing an R66(32) ring motif. Additional C—H⋯O intermolecular hydrogen-bonding interactions form a second supramolecular inversion dimer with an R22(10) motif. These units are linked via C—H⋯O and C—H⋯N hydrogen bonds, forming a three-dimensional network.
In der vorliegenden Arbeit wurde ein Flugzeitmassenspektrometer (TOF-MS) für die Messung von halogenierten Spurengasen charakterisiert und das verwendete analytische System optimiert. Ein TOF-MS hat den Vorteil, dass es die volle Masseninformation aufzeichnet. Dadurch ist es möglich, auch im Nachhinein Substanzen zu identifizieren und retrospektiv auszuwerten. Eine retrospektive Auswertung kann helfen, Auswirkungen auf die Atmosphäre besser abschätzen zu können. Aus diesem Grund wurde mit Hilfe des TOF-MS ein digitales Datenarchiv durch regelmäßige Messungen von Luftproben, die am Taunus Observatorium auf dem Kleinen Feldberg genommen wurden, initialisiert. Durch die Wahl des Taunus Observatoriums werden in unmittelbarer Nähe des industriellen Ballungsraums Rhein-Main auf der Nordhemisphäre Luftproben genommen, wodurch die Wahrscheinlichkeit erhöht wird, unbekannte Substanzen in erhöhter Konzentration zu messen.
Bevor das TOF-MS jedoch für die Initialisierung des Datenarchivs verwendet werden konnte, wurde es charakterisiert und mit einem, für die Analyse von halogenierten Kohlenwasserstoffen etablierten QP-MS verglichen. Um beide Detektoren vergleichen zu können, erfolgte die Probenaufgabe, Probenaufkonzentrierung und die Separation der Probe im Gaschromatographen innerhalb eines gemeinsamen Systems. Nach der Separation im GC teilt sich der Trägergasfluss auf. Die Charakterisierung des TOF-MS und der Vergleich mit dem QP-MS umfasst die Auswertung der Daten, die Messpräzision, die Linearität, die Sensitivität der Detektoren, die Massenauflösung und die Massenachsenbestimmungsgenauigkeit.
Hinsichtlich der Messpräzision liegen beide Massenspektrometer, wie ermittelt auf dem selben Niveau, wodurch sie auch sehr geringe Variabilitäten in den Mischungsverhältnissen von halogenierten Kohlenwasserstoffen aufzeichnen können.
Die Linearität der Detektoren ist substanzspezifisch. Während das QP-MS in Übereinstimmung mit bereits literaturbekannter Eigenschaft, einen sehr großen linearen Bereich aufweist, zeigt das hier verwendete TOF-MS für 2/3 aller ausgewerteter Substanzen starke substanz- und fragmentabhängig Nichtlinearitäten. Das nichtlineare Verhalten des Detektors des TOF-MS zeigt sich auch bei den Messvergleichen, wobei jedoch nur signifikante Abweichungen bei sehr hohen und sehr niedrig gemessenen Mischungsverhältnissen beobachtet wurden. Diese starke Nichtlinearität stellt eine große Einschränkung für eine retrospektive Auswertung unbekannter Substanzen dar, da deren Verlauf nur qualitativ nicht aber quantitativ dargestellt werden kann.
Die Massenauflösung liegt beim TOF-MS bei 1000 mit einer Massenachsenbestimmungsgenauigkeit zwischen 50-170~ppm, wodurch es dem QP-MS, welches nur Einheitsauflösung vorweist, weit überlegen ist. Mit dieser Auflösung und Massenachsenbestimmungsgenauigkeit ist das TOF-MS in der Lage einen halogenierten von einem nichthalogenierten Kohlenwasserstoff quantitativ zu trennen.
Zum Vergleich der Sensitivität der beiden Massenspektrometer wurde das QP-MS in drei verschiedenen Modi betrieben: Zum einen dem SCAN-Modus, dem operationalen SIM-Modus, welcher im regulärem Messbetrieb verwendet wird und mehrere Ionen pro Zeitfenster misst, und dem optimierten SIM-Modus, welcher nur ein Ion der jeweiligen Substanz misst. Das TOF-MS hat die gleiche Sensitivität wie das QP-MS im optimierten SIM-Modus. Das TOF-MS hat eine um den Faktor 3 höhere Sensitivität als das QP-MS im operationalen SIM-Modus und eine um den Faktor 12 höhere Sensitivität als das QP-MS im SCAN-Modus bei den betrachteten Substanzen.
Die Initialisierung des digitalen Datenarchivs wurde im Oktober 2013 mit der Probennahme am Taunus Observatorium begonnen, wobei in der vorliegenden Arbeit der Zeitraum von einem Jahr betrachtet wurde. Es wurden Identifizierungen aus regulären Proben der Taunus Observatoriums-Zeitreihe durchgeführt und so die Substanzen HFC-32, HFC-245fa,HCFC-133a und HFO-1234yf gefunden. Zusätzlich stellte Martin Vollmer (Eidgenössische Material und Prüfgesellschaft) zwei Gasmischungen zu Verfügung für die Identifikation von noch nicht am System vermessenen Substanzen. Somit konnte die Vielfalt an diesem System vermessener Substanzen von 40 auf insgesamt 64 Substanzen erweitert werden.
Von den neu identifizierten Substanzen wurden HFC-227ea, HFC-236fa, HFC-32, HCFO-1233zd, HFO-1234zd, HFO-1234yf, HFC-245fa, HCFC-31, HFC-133a, Isofluran und HFC-112 in der Taunus Observatoriums-Zeitreihe gefunden und rückwirkend aufgearbeitet.
Durch die retrospektive Auswertung ist das TOF-MS für seine charakterisierte Anwendung zum Einsatz gekommen.
The structure of the 1:2 co-crystalline adduct C8H16N4·2C6H5BrO, (I), from the solid-state reaction of 1,3,6,8-tetraazatricyclo[4.4.1.13,8]dodecane (TATD) and 4-bromophenol, has been determined. The asymmetric unit of the title co-crystalline adduct comprises a half molecule of aminal cage polyamine plus a 4-bromophenol molecule. A twofold rotation axis generates the other half of the adduct. The primary inter-species association in the title compound is through two intermolecular O—H⋯N hydrogen bonds. In the crystal, the adducts are linked by weak non-conventional C—H⋯O and C—H⋯Br hydrogen bonds, giving a two-dimensional supramolecular structure parallel to the bc plane.
In the title solvate, C14H12N2O·0.5C6H6, the complete benzene molecule is generated by a crystallographic inversion centre. The dihedral angle between the planes of the benzimidazole moiety and the phenol substituent is 75.28 (3)°. In the crystal, O—H⋯N hydrogen bonds link the molecules into parallel chains propagating along [100]. The molecules are further connected by C—H⋯π interactions.
In the title compound, C23H19NO2, an oxazine Mannich base derivative, the oxazine ring has a half-chair conformation. The 2-hydroxynaphthalen-1-yl substituent is placed in an axial position. There is an intramolecular O-H...N hydrogen bond, forming an S(6) graph-set motif. In the crystal, molecules are connected by a pair of C-H...[pi] interactions into an inversion dimer, which is reinforced by another pair of weak C-H...[pi] interactions. The dimers are linked by a [pi]-[pi] interaction [centroid-centroid distance = 3.6268 (17) Å], consolidating a column along the a axis. Furthermore, the columns interact with each other by a weak C-H...[pi] interaction, generating a three-dimensional network.
In the crystal of the title co-crystalline adduct, C8H16N4·C8H9ClO, (I), prepared by solid-state reaction, the molecules are linked by intermolecular O—H⋯N hydrogen bonds, forming a D motif. The azaadamantane structure in (I) is slightly distorted, with N—CH2—CH2—N torsion angles of 10.4 (3) and −9.0 (3)°. These values differ slightly from the corresponding torsion angles in the free aminal cage (0.0°) and in related co-crystalline adducts, which are not far from a planar geometry and consistent with a D2d molecular symmetry in the tetraazatricyclo structure. The structures also differ in that there is a slight elongation of the N—C bond lengths about the N atom that accepts the hydrogen bond in (I) compared with the other N—C bond lengths. In the crystal, the two molecules are not only linked by a classical O—H⋯N hydrogen bond but are further connected by weak C—H⋯π interactions, forming a two-dimensional supramolecular network parallel to the bc plane.
Starkes Übergewicht und eine damit einhergehende Hypertrophie von Geweben aber auch des Herz-Kreislauf-Systems führen zu einer Reihe von Folgeerkrankungen wie z. B. Diabetes mellitus Typ 2 oder auch Arteriosklerose. Während im Fettgewebe freie Fettsäuren, die von Makrophagen aufgenommen werden, eine entscheidende Rolle spielen, scheint in der Pathogenese von Arteriosklerose die Aufnahme von Fettsäuren aus Lipoproteinpartikeln durch Makrophagen von großer Wichtigkeit zu sein. Ein weiterer Faktor, der durch freie Fettsäuren ausgelöst wird ist ER-Stress. Makrophagen, die zu Triglycerid (TG) reichen Schaumzellen geworden sind, akkumulieren in arteriosklerotischen Läsionen. Der Lipidmetabolismus von Makrophagen wird transkriptionell u.a. durch den Transkriptionsfaktor PPARγ (Peroxisomproliferator aktivierter Rezeptor γ) reguliert. Sein Zielgen FABP4 (Fettsäuren bindendes Protein 4) beschleunigt die Entwicklung von Arteriosklerose in Mausmodellen. Da die Expression von PPARγ und FABP4 in IL 4- (Interleukin-4) polarisierten Makrophagen induziert wird, sollte die Rolle von FABP4 in humanen, mit IL 4 polarisierten Makrophagen untersucht werden. Hierfür wurden primäre humane Monozyten in Anwesenheit von LPS/IFNγ (Lipopolysaccharid/Interferon γ) bzw. IL 4 zu Makrophagen differenziert. Es zeigte sich, dass in LPS/IFNγ stimulierten Makrophagen PPARγ und dessen Zielgene nicht exprimiert wurden. Dagegen waren sie bei unstimulierten Makrophagen bei IL 4 stimulierten Makrophagen deutlich erhöht. Dies spiegelte sich auch in einer erhöhten Aufnahme von Triglyceriden aus VLDL-Partikeln (Lipoproteinpartikel sehr niedriger Dichte) wider. IL 4 induzierte also einen Fettsäuren akkumulierenden Phänotyp. Durch einen PPAR-Luciferase-Reporter-Test wurde untersucht, ob FABP4 für die Aktivierung von PPARγ nötig war. Dies konnte bestätigt werden, da PPARγ durch seinen Liganden Linolsäure nur in Anwesenheit von FABP4 aktiviert werden konnte. Diese Aktivierung konnte zusätzlich durch den FABP4-Inhibitor HTS01037 verhindert werden. Nun sollte der Einfluss von FABP4 auf die PPARγ-abhängige Genexpression untersucht werden. Hierfür wurde FABP4 während der Differenzierung mit den beiden Inhibitoren HTS01037 oder BMS309403 in IL 4 stimulierten Makrophagen inhibiert. Durch die Inhibition von FABP4 sank die Expression von FABP4 und LPL (Lipoproteinlipase), während die von PPARγ unverändert blieb. Die LPL spielt eine entscheidende Rolle in der Aufnahme von Lipiden aus VLDL-Partikeln und trägt somit zur TG-reichen Schaumzellbildung bei. Die verminderte Expression von LPL spiegelte sich in einer verminderten Lipidaufnahme aus VLDL-Partikeln wider. Gleichzeitig wurde durch die FABP4-Inhibition die Entzündungsantwort der Makrophagen auf VLDL-Partikel abgeschwächt. IL 4 induziert also LPL, indem es PPARγ aktiviert. FABP4 unterstützt hierbei die Aktivierung von PPARγ. Durch die Inhibition kann die LPL-Expression vermindert werden, was die TG-reiche Schaumzellbildung und die Entzündungsreaktion in einem VLDL-reichen Umfeld vermindert und eine neue Therapiemöglichkeit von Arteriosklerose eröffnet. Im Fettgewebe kommt bei starkem Übergewicht, bedingt durch die erhöhte Konzentration an freien Fettsäuren und Hypoxie, zu einer leichten Entzündungsreaktion. Diese Entzündungsreaktion wurde durch eine Stimulation mit Palmitat unter Hypoxie (1 % O2) nachgebildet. Überstände von Makrophagen nach dieser Stimulation (MCM) wurden auf primäre humane Adipozyten übertragen. Diese Überstände konnten zwar keine Insulinresistenz in Adipozyten auslösen, induzierten jedoch eine Entzündungsreaktion. Diese zeigte sich in einer erhöhten Expression der proentzündlichen Zytokine CCL2 (CC-Chemokin-Ligand-2) und IL 6. Gleichzeitig wurde die Expression des antientzündlichen Zytokins Adiponectin vermindert. Der Transfer von MCM ist also ein Modell für die Entstehung der Insulinresistenz in einem frühen Stadium. Beim Versuch, die entzündungsfördernde Fähigkeit des MCMs zu verhindern, wurde AMPK mit verschiedenen Aktivatoren stimuliert. Es zeigte sich, dass der AMPK-Aktivator AICAR (5-Aminoimidazol-4-carboxamidribonukleotid) die Entzündungsantwort und den ER-Stress von mit Hypoxie und Palmitat stimulierten Makrophagen deutlich reduzierte. Der starke Effekt auf den ER-Stress konnte auch mit anderen ER-Stress-Auslösern wie Thapsigargin oder Tunicamycin nachvollzogen werden. Da AICAR ein AMPK-Aktivator ist, wurden typische Effekte der AMPK-Aktvierung wie reduzierte Proteinexpression, verstärkte Sirtuin-1-Aktivierung und Steigerung der Fettsäurenoxidation mittels Inhibitoren verhindert. Dies hatte keinen Einfluss auf die Wirkung von AICAR. Ebenso wurde untersucht, ob AICAR in die Zelle aufgenommen werden musste und ob es zu seiner phosphorylierten Form ZMP umgewandelt werden musste. Durch den Inhibitor ABT 702 kann die Adenosinkinase inhibiert werden, welche die Phosphorylierung katalysiert. Es zeigte sich, dass die Phosphorylierung von AICAR zu ZMP nicht erforderlich war, damit AICAR die ER-Stress-Antwort hemmen konnte. AICAR und nicht ZMP wirkte gegen den ER-Stress. Da durch das fehlende ZMP die AMPK nicht aktiviert wurde, war das ein weiteres Zeichen, dass AICAR AMPK-unabhängig wirkte. Dies konnte durch einen AMPK-Knockdown bestätigt werden. Durch einen Knockdown verschiedener Adenosintransporter konnte gezeigt werden, dass SLC28A3 (Soluttransporterfamlie 28 Typ A3) verantwortlich für die Aufnahme von AICAR in primäre humane Makrophagen war. Es konnte demnach gezeigt werden, dass AICAR den ER-Stress in primären humanen Makrophagen in einem von AMPK unabhängigen Mechanismus vermindert. Dafür wird es mittels SLC28A3 in die Zelle aufgenommen und wirkt als AICAR und nicht als ZMP. Diese Erkenntnisse stellen eine interessante, neue therapeutische Möglichkeit im Feld von Arteriosklerose und Diabetes dar.
Disturbances in lipid metabolism are responsible for many chronic disorders, such as type 2 diabetes and atherosclerosis. Regulation of lipid metabolism occurs by activated transcription factors peroxisome proliferator-activated receptor δ (PPARδ) and liver X receptor α (LXRα) mediating transcription of different target genes involved in regulation of fatty acid uptake and oxidation or cellular cholesterol homeostasis. This is especially relevant for the macrophages, since pathways regulated by PPARδ and LXRα affect foam cell formation, a process driving the progression of atherosclerotic lesion. AMP-activated protein kinase (AMPK) plays a central role in energy homeostasis in every type of eukaryotic cell, but its role in human macrophages, particularly with regard to lipid metabolism, is not precisely defined yet. Thus, I investigated the impact of AMPK activity on PPARδ and LXRα and the expression of their target genes involved in fatty acid oxidation (FAO) and cholesterol metabolism.
As PPARδ has been described as a potential target for prevention and treatment of several disorders and AMPK as interesting drug target for diabetes and metabolic syndrome, the aim of the first part of my studies was to investigate their interaction in primary human macrophages. Completing the first challenge successfully, I was able to establish a lentiviral transduction system for constitutively active AMPK (consisting of a truncated catalytic AMPKα1 subunit bearing an activating T198D mutation) in primary human macrophages.
Using genome-wide microarray analysis of gene expression, I demonstrate FAO as the strongest affected pathway during combined AMPKα1 overexpression and PPARδ activation.
The most influenced genes were validated by quantitative PCR as well as by Western analysis. I found that AMPK increases the expression of FAO-associated genes targeted by PPARδ. Corroborating the results obtained using AMPKα1 overexpression, PPARδ target gene expression was increased not only by PPARδ agonist GW501516, but also by pharmacological allosteric AMPK activator A-769662. Additional enhancement of target gene mRNA expression was achieved upon co-activation of PPARδ and AMPK. Silencing PPARδ expression increased basal expression of target genes, confirming the repressive nature of ligand-free PPARδ, abolishing the increased target gene expression upon AMPK or PPARδ activation. Measurements of triglyceride contents of human macrophages incubated with VLDL following PPARδ activation demonstrated a reduction of intracellular triglyceride accumulation in cells, which may reflect the enhancement of fat catabolism.
In the second part of my studies, I concentrated on the regulation of cholesterol transporter ATP-binding cassette transporter A1 (ABCA1) expression by AMPK. ABCA1 facilitates
cholesterol efflux from macrophages thus, preventing atherosclerosis progression. For the first time, AMPK implication in the regulation of the ABCA1 pathway could be presented. Both AMPK overexpression and activation lead to significantly increased ABCA1 expression, whereas AMPKα1 knock-down strongly reduced this effect. Besides, I was able to prove an enhanced activity of ABCA1 during AMPK activation in human THP-1 macrophages by measuring cholesterol efflux into apolipoprotein AI-containing medium.
Previous findings showed regulation of ABCA1 by LXRα. I confirmed these results by silencing experiments indicating an essential role of LXRα in ABCA1 regulation pathway.
Here, ABCA1 mRNA as well as protein expression were positively mediated by LXRα. LXRα activation elevated ABCA1 levels, whereas its silencing down-regulated this effect.
Interestingly, ABCA1 was found to be regulated only by LXRα and not through LXRα. At the same time, knock-down of PPARδ, -γ or -δ, which may be also involved in the regulation of LXR/ABCA1 axis, did not influence the activation of ABCA1 expression by an AMPK activator. To confirm that LXRE on Abca1 promoter is essential for ABCA1 regulation, I performed luciferase reporter assay using constructs based on Abca1 promoter with or without LXRE mutation. Mutation of LXRE abolished reporter activity, whereas AMPK activation increased luciferase activity of wild-type LXRE construct. Furthermore, I demonstrate AMPK-dependent LXRα binding to the LXRE site of Abca1 promoter using the method of chromatin immunoprecipitation. AMPK activation significantly increased, whereas silencing of AMPK significantly attenuated LXRα binding, indicating AMPK as one of the most important regulators of ABCA1 expression.
In summary, I provided an evidence for AMPK involvement into lipid and cholesterol metabolism in human macrophages showing the regulation of PPARδ and LXRα target genes. The understanding of AMPK and PPARδ interaction allows the development of new approaches for treatment of metabolic syndrome and related diseases. Increased FAO during the activation of both proteins may exhibit better therapeutic benefit. On the other hand, I have shown the impact of AMPK activation on ABCA1 via LXRα up-regulation leading to increased cholesterol efflux in human macrophages for the first time. These findings thus may impact future improving of anti-atherosclerosis therapies.
In dieser Arbeit werden Projekte beschrieben, in denen das Adsorptionsverhalten von Proteinen und Bakterien an verschiedene Materialoberflächen manipuliert wird.
Durch die Reaktion verschiedener oxidischer Oberflächen mit Glycidol konnten biorepulsive Polyglycerolschichten erzeugt werden. Für die Herstellung dieser Polyglycerolschichten wurden zwei unterschiedliche Verfahren entwickelt und untersucht. Die erste Methode beruht auf der Bildung einer aminoterminierten Monolage auf Silicium-Oberflächen, an der in einem zweiten Schritt die Polymerisation von Glycidol durchgeführt wird. Die Dicke der angebundenen Polyglycerolschicht ist abhängig von der Beschichtungsdauer, wobei die dicksten Schichten bis zu 98% der Bakterienadhäsion unterdrücken können. Das zweite Verfahren ist die direkte Anbindung von stabilen Polyglycerol-Beschichtungen an Silicium-, Aluminium- oder Stahl-Oberflächen. Je größer die abgeschiedene Polyglycerolmenge ist, desto höher ist die Biorepulsivität der Schicht, was durch Adsorptionstests mit Proteinen und ermittelt wurde.
Polyglycerolschichten eignen sich besonders gut für die nachträgliche Modifizierung. So konnten beispielsweise mittels Elektronenstrahlen laterale Strukturierungen der Polyglycerol-beschichteten Oberflächen erfolgreich durchgeführt werden. Sensorisch aktive Moleküle wie Ethylendiamintetraessigsäure oder Biotin konnten im Rahmen dieser Arbeit nachträglich an Polyglycerolschichten angebunden werden. Die Aktivität der Bindungsstellen nach der Anbindung an die Oberfläche konnte dabei durch spezifische Erkennungsereignisse nachgewiesen werden.
Im zweiten Teil dieser Arbeit wurden selbstanordnende Monoschichten mit Oligoethylenglycol (OEG)-Kopfgruppen und Thiolat-Ankergruppen verwendet, um lateral strukturierbare, biorepulsive Schichten auf Gold zu erzeugen. Es wurde untersucht, ob derartige OEG-Monolagen kontrolliert durch langwelliges UV-Licht (390 nm) abgebaut werden können, um proteinbindende und proteinrepulsive Bereiche auf einer Substrat-Oberfläche zu generieren. Die Bestrahlung mit UV-Licht bewirkte die Oxidation und Abspaltung der Ethylenglycol-Einheiten, wodurch die unspezifische Adsorption von Proteinen erfolgen kann. Zusätzlich konnten Photooxidations-Reaktionen an der Thiolat-Ankergruppe nachgewiesen werden, welche die Ablösung des SAM-Bausteins zur Folge haben.
Für den Einsatz von Lithographie-Techniken in mikrofluidischen Anlagen wurde das Abbauverhalten der biorepulsiven Monolage bei der Bestrahlung unter Wasser untersucht. In Abwesenheit von molekularem Sauerstoff kommt es hier lediglich zur Spaltung der Etherbindung zwischen den Ethylenglycol-Einheiten. Die Beobachtung, dass die An- bzw. Abwesenheit von molekularem Sauerstoff zu zwei unterschiedlichen Abbaumechanismen führt, kann für die Feinabstimmung der Oberflächenbeschaffenheit und somit der Proteinanlagerung genutzt werden.
Biorepulsive OEG-Monolagen können auch dazu verwendet werden, um gezielt bestimmte Biomoleküle anzulagern. Dazu können die Monolagen mit Erkennungsstellen ausgestattet werden, welche die spezifische Anbindung einer Biomolekül-Spezies ermöglichen. Gerade bei der Detektion von großen Biomolekülen oder Mikroorganismen spielt jedoch nicht nur die chemische Zusammensetzung, sondern auch die Ausrichtung der Bindungsstelle eine entscheidende Rolle. Für die Untersuchung des Orientierungseinflusses wurden Moleküle verwendet, die neben einer Mannose-Einheit als Bindungsstelle für Bakterien auch eine Azobenzol-Gruppe, welche die strahlungsinduzierte reversible Schaltung der Konformation ermöglicht, tragen. Bakterien-Adhäsionstests zeigten, dass sich die Orientierung der Mannose-Einheit auf die Anbindung der Bakterien auswirkt.
Im Rahmen dieser Arbeit wurden neuartige Methoden zur Herstellung, Charakterisierung und Strukturierung biorepulsiver und biosensorischer Schichten entwickelt. Die dadurch gewonnenen Erkenntnisse sind von bedeutender wissenschaftlicher Relevanz und ermöglichen die potentielle industrielle Anwendung der entwickelten Methoden im Kontext der Material- und Biotechnologie sowie der Nanofabrikation.
Since Inhibitor of Apoptosis (IAP) proteins are frequently dysregulated in different cancer entities and contribute to apoptosis resistance, pharmacological IAP antagonists are considered to be promising agents for the future development of cancer treatment strategies. IAP antagonists are small-molecule drugs that have been designed to mimic the interaction site of IAP proteins with their endogenous inhibitor Second mitochondrial activator of caspases (SMAC). Thus, they are frequently referred to as SMAC mimetics. Treatment with SMAC mimetics engages an apoptotic program in cancers by affecting different components of the apoptotic machinery. Besides disinhibition of caspases, SMAC mimetics trigger non-canonical nuclear factor-κB (NF-κB) signaling, which induces upregulation of tumor necrosis factor (TNF) α and other NF-κB target genes. In particular, TNFα production has been closely linked to the induction of SMAC mimetic-mediated cell death. The TNFα-dependent para/autocrine loop facilitates the formation of a cytosolic complex consisting of caspase-8, Fas-associated death domain (FADD) and Receptor-interacting protein (RIP) 1, which serves as caspase-8 activation platform and ultimately triggers induction of apoptosis. In the present study, we use the small-molecule bivalent SMAC mimetic BV6 to analyze SMAC-stimulated NF-κB signaling in cancer cell lines of different entities. Interestingly, we identify two novel NF-κB-regulated factors that are both required for SMAC mimetic-induced apoptosis in a context-dependent manner. First, we show that NF-κB-dependent upregulation of death receptor 5 (DR5) can serve as an alternative mechanism of BV6-mediated cell death. We demonstrate that BV6 treatment induces NF-κB-dependent but largely TNFα -independent apoptosis in A172 glioblastoma cells. By using an unbiased whole genome expression analysis approach, we identify DR5 as a critical NF-κB target gene, which substitutes TNFα and is indispensable for BV6-initated cell death in A172 cells. Second, we demonstrate that Interferon regulatory factor (IRF) 1 is required for BV6-induced TNFα production and apoptosis. Our study provides evidence that IRF1 closely cooperates with the NF-κB network in BV6-mediated cell death and additionally alters expression of selective SMAC mimetic-induced target genes. Furthermore, we show that BV6 treatment triggers secretion of a set of proinflammatory cytokines and increases attraction of monocytes to BV6-treated tumor cells in an IRF1-dependent manner. In summary, our work supports the notion that NF-κB-regulated factors are critically required for SMAC mimetic-initiated apoptosis. We show that IRF1 is indispensable for TNFα production and cell death in BV6-sensitive cell lines and that also DR5 can serve as a proapoptotic NF-κB-controlled factor in BV6-induced apoptosis besides TNFα. Furthermore, this study contributes to an improved understanding on non-apoptotic functions of SMAC mimetics, as IRF1 additionally influences expression levels of proinflammatory cytokines and attraction of immune cells. Thus, our work provides novel insights into the regulation of SMAC mimetic-induced signaling events, which is crucial for the translation of SMAC mimetics for use in clinical application.
In mitochondria, biogenesis of oxidase is a crucial process involving the participation of an array of assembly factors. Studying the process of biogenesis in eukaryotes is highly complicated due to the presence and partaking of two genetic systems. Employing a bacterial model such as Paracoccus denitrificans that utilizes only one genetic system enables easy studying of the assembly process. The aa3 cytochrome c oxidase of P. denitrificans shows high structural and functional homology to its mitochondrial counterpart despite its simple subunit composition. The assembly of the core subunits I and II that house the active redox centers (heme a, and heme a3.CuB centre in subunit I; and the binuclear CuA centre in subunit II) along with the chaperons responsibly for their incorporation form the crux of this work. This work concentrates particularly on CtaG, a chaperone previously speculated to be involved in the delivery of copper to the CuB center in subunit I. As the full length structure of CtaG or its structural homologues have not been solved, attempts were made to obtain high-diffracting crystals of CtaG by heterologously expressing it in E. coli. Growth media, expression strains and induction parameters were some of the conditions screened in order to obtain optimal yield. Additives, pH and detergent were screened to yield a homogeneous preparation of CtaG. Crystallization trials were conducted by employing the sitting drop, vapour diffusion, method and later the bicelles were employed. Preliminary crystals obtained were further optimized employing seeding, detergent and additives, to improve diffraction. The diffraction improved from 30 Å to 15 Å. BN PAGE (Blue Native Polyacrylamide Gel Electrophoresis) analysis and cross-linking studies were undertaken to decipher the oligomeric condition of CtaG. Both the methods indicate that the protein is a dimer under native conditions. To study the importance of CtaG in the process of oxidase assembly, two deletion mutants were obtained from the lab; one with only ctaG deleted and the other with ctaG and most of the upstream ORF. The effect of the deletion was assayed on the assembly and activity of oxidase. The deletion mutants showed residual activity of approx. 20 %, while displaying a very low heme signal (both in membranes and in purified COX). In order to exclude polar effects arising due to gene manipulation, complementation strains were prepared, reintroducing ctaG alone into both the deletion strains. Complementation strains, where only ctaG was deleted and re-introduced assayed for COX activity showed a restoration in activity to approx. 70 %. Further, calculating the heme:protein ratio, the deletion strains displayed a value of 7 nmol/mg of oxidase which was increased to wild type levels of 16 nmol/mg in the complementation strains. To further confirm the absence of the copper in subunit I, total reflection X-ray fluorescence spectroscopy analysis was carried out, which showed a decrease in the copper content in the deletion strain, restored on complementation. The strain lacking in the ORF and ctaG when complemented with ctaG alone illustrated no increase in activity or heme signal in comparison to that of the deletion strain. These point at a possible role for ORF in the assembly of COX, which is still absent in the complementation strains. To further characterize the ORF, a series of bioinformatical analysis was carried out, the results from which were insufficient to characterize the ORF conclusively. In order to enlist the proteins involved in the biosynthesis of COX, two independent approaches were employed. Two-dimensional gel examinations of solubilised membranes from untreated and cross-linked cells were analyzed by Western blotting. The CtaG-COX interaction was observed in untreated membranes, which was additionally strengthened by cross-linking. To further confirm this association, pull-down assays were done employing protein A coated magnetic beads coated with different antibodies and incubated with solubilised membranes derived from untreated or cross-linked cells. The elutions were assayed by Western blotting and confirmed for the CtaG-COX interaction. These fractions were further analysed by mass spectrometry to identify other chaperons involved in biogenesis of oxidase. Along with CtaG, I also noticed Sco, Surf1c and other factors involved in the recruitment and transport of heme (CtaB, CtaA, and Ccm proteins). Interestingly, protein components of both ribosomal subunits and protein translocation factors were observed, which indicated a co-translational approach for co-factor insertion into COX.
Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurde einerseits der Einsatz lichtaktivierbarer Oligonukleotide zur Kontrolle der Leitfähigkeit entlang von DNA untersucht sowie neue photoaktivierbare Verbindungen für die Peptidchemie und für eine neu entwickelte Variante des SELEX (Systematic Evolution of Ligands by EXponetial enrichment) Verfahrens synthetisiert.
DNA vermittelte Ladungsübertragung verläuft entlang des gestapelten π-Systems der heteroaromatischen Nukleobasen. Die Leitfähigkeit von Oligonukleotiden reagiert daher empfindlich auf Störungen in der Watson-Crick-Basenpaarung. Die in der Arbeitsgruppe Heckel etablierte Technik, Nukleobasen an für die Basenpaarung relevanten Positionen mit photolabilen Schutzgruppen zu modifizieren, sollte daher mit Systemen der Ladungsübertragung in DNA kombiniert werden. Im Verlauf dieses Projekts wurden zwei literaturbekannte Varianten, in denen Ladungstransport über einen lichtinduzierten Redoxprozess zwischen Metallkomplexen ablaufen und über eine dabei unterdrückte Fluoreszenz optisch verfolgt werden sollte, als ungeeignete Systeme identifiziert. Durch den Wechsel zu elektrodengestützter Leitfähigkeitsmessung konnte der prinzipielle Effekt von Leitfähigkeit in perfekt gepaarter DNA und deutlich reduziertem Stromfluss in Oligonukleotiden mit Fehlpaarungen gezeigt werden. Beim Einsatz photolabil geschützter Oligonukleotide konnte jedoch auch in diesem System noch nicht der gewünschte Effekt gefunden werden.
Im zweiten Projekt dieser Arbeit wurden neue photolabile Verbindungen hergestellt, die Peptide nach ihrem Einbau in das Peptidrückgrat durch Zwei-Photonen-Anregung mit IR-Licht spalten sollen. Drei entsprechende Nitrodibenzofuran-Verbindungen und ein Cumarin-Baustein konnten erfolgreich synthetisiert werden. Die neuen Moleküle zeigten im Rahmen der Peptid-Festphasensynthese Stabilitätsprobleme. Diese Schwierigkeiten konnten durch Peptid-Kopplungen in Lösung umgangen werden. Mit Hilfe eines der hergestellten Bausteine wurden zwei Tripeptide hergestellt, die jeweils mit dem Farbstoff ATTO565 markiert und hinsichtlich ihrer photochemischen Eigenschaften charakterisiert wurden. Der neue Baustein zeigte neben den Eigenschaften als photospaltbare Gruppe, dass er gleichzeitig ein Quencher für den Farbstoff ATTO565 darstellt. Nach Belichtung stieg die Fluoreszenz um den Faktor 81 an. Die Aktivierung gelang wie erwartet mit Ein- und Zwei-Photonen-Anregung. In Kollaboration mit der Arbeitsgruppe von Prof. Heilemann konnten Antiköper mit einem der Tripeptide modifiziert werden und die Kompatibilität der Verbindung mit hochaufgelöster Einzelmolekül-Fluoreszenzmikroskopie demonstriert werden.
Im letzten in dieser Arbeit thematisierten Projekt wurden neue lichtspaltbare Verbindungen für eine Variante des SELEX-Prozesses hergestellt. Diese Verbindungen erlauben die temporäre Einführung einer Indol Modifikation an Alkin-modifizierte Oligonukleotide über die sogenannte Click-Chemie. Neue chemische Modifikationen wie die hier verwendeten Indole erhöhen die chemische Vielfalt der Oligonukleotide. Eine größere Vielfalt führt zu neuen potentiellen Wechselwirkungen gegenüber Verbindungen, gegen die mit Hilfe herkömmlicher SELEX-Verfahren keine Aptamere erzeugt werden konnten. Da die chemische Modifikation über eine photolabile Gruppe an die Oligonukleotide gebunden wird, kann sie photochemisch von der DNA gespalten werden, wodurch eine Interferenz der Modifikation mit den enzymatisch katalysierten Schritten innerhalb der SELEX ausgeschlossen werden kann.
Necroptosis is a programmed cell death pathway that is implicated in a variety of human diseases. In recent years, increasing knowledge has been gained on the necroptotic signaling cascade. Nevertheless, the role of reactive oxygen species (ROS) in necroptosis is still ambiguous. In this study, we reveal that ROS critically regulate BV6/TNFα-induced necroptotic signaling in FADD-deficient Jurkat cells and in zVAD-treated MV4-11 cells. We show that several ROS scavengers such as butylated hydroxyanisole (BHA), N-acetylcysteine (NAC), α-tocopherol (αToc) and ethyl pyruvate (EP) significantly reduce ROS production and BV6/TNFα–induced cell death. Importantly, ROS are produced prior to cell death induction and promote the assembly of the Receptor-interacting protein kinase (RIP)1/RIP3 necrosome complex via a potential positive feedback loop since on the one hand radical scavengers diminish RIP1/RIP3 necrosome formation and since on the other hand RIP1 or RIP3 silencing attenuates ROS production. Furthermore, the deubiquitinase CYLD contributes to BV6/TNFα-induced ROS generation, necrosome assembly and cell death since CYLD knockdown attenuates all these events. Of note, knockdown of the downstream effector protein mixed lineage kinase domain like (MLKL) only partly reduces BV6/TNFα-triggered ROS production and cell death and does not affect necrosome formation. Contrary to expectations, the MLKL inhibitor Necrosulfonamide (NSA) not only decreases BV6/TNFα-stimulated ROS production and cell death but also attenuates RIP1/RIP3 necrosome assembly pointing to additional and MLKL-independent anti-necroptotic effects of NSA. Interestingly, silencing of the potential necroptotic excecutors mitochondrial proteins phosphoglycerate mutase family member 5 (PGAM5) or Dynamin-related protein 1 (Drp1) does not affect BV6/TNFα-induced cell death. Consistently, mitochondrial perturbations are not implicated in BV6/TNFα-induced cell death since mitochondrial membrane potential and respiration remain stable along with to BV6/TNFα-triggered necroptosis induction. Interference with the mitochondrial potential by depolarizing agents such as FCCP reduces BV6/TNFα-induced necroptosis indicating that proper mitochondrial function or a well-defined redox status is required for necroptotic cell death execution. This study demonstrates that ROS are critically involved in BV6/TNFα-induced necroptosis and thus provides novel insights into the redox regulation of necroptotic signaling.
To overcome poor treatment response of pediatric high-risk acute lymphoblastic leukemia (ALL), novel treatment strategies are required to reactivate programmed cell death in this malignancy. Therefore, we take advantage of using small-molecule antagonists of Inhibitor of apoptosis (IAP) proteins, so called Smac mimetics such as BV6, which are described to overcome apoptosis resistance and thereby sensitize tumor cells for several apoptotic stimuli. To address the question whether redox alterations can sensitize leukemic cells for Smac mimetic-mediated cell death, we interfered with the cellular redox status in different ALL cell lines. Here, we show for the first time that redox alterations, mediated by the glutathione depleting agent Buthioninesulfoximine (BSO), prime ALL cells for BV6-induced apoptosis. Besides ALL cell lines, BV6/BSO cotreatment similarly synergizes in cell death induction in patient-derived primary leukemic samples. In contrast, the combination treatment does not exert any cytotoxicity against peripheral blood lymphocytes (PBLs) or mesenchymal stroma cells (MSCs) from healthy donors, suggesting some tumor selectivity of this treatment. We also identify the underlying molecular mechanism of the novel synergistic drug interaction of BSO and BV6. We demonstrate that both agents act in concert to increase reactive oxygen species (ROS) production, lipid peroxidation and finally apoptotic cell death. Enhanced ROS levels in the combination treatment account for cell death induction, since several ROS scavengers, like NAC, MnTBAP and Trolox attenuate BSO/BV6-induced apoptosis. BSO/BV6-induced ROS can be mainly classified as lipid peroxides, since the vitamin E derivate α-Tocopherol as well as Glutathione peroxidase 4 (GPX4), which both specifically reduce lipid-membrane peroxides, prevent lipid peroxidation, caspase activation and cell death induction. Vice versa, GPX4 knockdown and pharmacological inhibition of GPX4 by RSL3 or Erastin enhance BV6-induced cell death. Importantly, cell death induction critically depends on the formation of a complex consisting of RIP1/FADD/Caspase-8, since all complex components are required for ROS production, lipid peroxidation and cell death induction. Taken together, we demonstrate that BSO and BV6 cooperate to induce ROS production and lipid peroxidation which are eventually required for caspase activation and cell death execution. Collectively, findings of this study indicate that BV6-induced apoptosis is mediated via redox alterations offering promising new treatment strategy to overcome apoptosis resistance in ALL.
Hepatocellular carcinoma (HCC) is the fifth most common malignant tumor and third leading cause of cancer-related death worldwide. Most cases arise as a consequence of underlying liver disease, e.g. developed from chronic hepatitis B or C infectionsalcohol abuse or obesity, and are most often associated with liver cirrhosis. Hypoxiand the hypoxia inducible factors (HIF)-1α and -2α promote tumor progression of HCC, not only affecting tumor cell proliferation and invasion, but also angiogenesis and lymphangiogenesis and thus, increasing the risk of metastasis.
HCC is characterized as one of the most vascularized solid tumors. While HIF-1α and HIF-2α are frequently up-regulated in HCC only HIF-2α is correlated with high patientlethality. HIF-dependent regulation of HCC angiogenesis is controversially discussed.VEGFA, for example, as the most prominent factor inducing tumor angiogenesis represents not only a HIF-1 target, but also a HIF-2 target gene in HCC. This questions whether both isoforms have overlapping functions in regulating the angiogenic switch in HCC.
Besides angiogenesis also tumor-associated lymphangiogenesis significantly influences patient survival in HCC. Lymphatic spread is an important clinical determinant for the prognosis of HCC, but little is known how lymphangiogenesis is controlled in this context. To date, mainly HIF-1α was positively correlated with olymphatic invasion and metastasis in HCC, while a defined role of HIF-2α is missing. Thus, although HIF-1α and HIF-2α are structurally alike and regulate overlapping but not identical sets of target genes, they promote highly divergent outcomes in cancer progression and may even have counteracting roles. The aim of my work was to characterize the specific role of HIF-1α and HIF-2α in the angiogenic switch and lymphangiogenesis induction during HCC development.
Therefore, I created a stable knockdown of HIF-1α and HIF-2α in HepG2 cells and generated cocultures of HepG2 spheroids and embryonic bodies derived from embryonic mouse stem cells as an in vitro tumor model mimicking the cancer microenvironment to analyze which HIF isoform has key regulatory functions in HCC (lymph)angiogenesis. In cocultures with a HIF-2α knockdown angiogenesis was attenuated but lymphangiogenesis increased, while the knockdown of HIF-1α was without effect. Microarray analysis identified plasminogen activator inhibitor 1 (PAI-1)and insulin-like growth factor binding protein 1 (IGFBP1) as HIF-2 target genes.However, prominent angiogenic and lymphangiogenic factors such as VEGFs, PDGFB, ANG and their receptors were not regulated in a HIF-dependent manner. As PAI-1 was linked to angiogenesis in literature and IGF-signaling, which is negatively regulated by IGFBP-1, was correlated with lymphangiogenesis, I decided to investigate their HIF-2α-dependent influence on HCC (lymph)angiogenesis. The knockdown of PAI-1 in HepG2 cells also lowered angiogenesis in PAI-1k/d cocultures similar to the HIF-2α k/d phenotype. PAI-1 as the potent inhibitor of tPA and uPA, both inducing the conversion of plasminogen to plasmin, also inhibits plasmin directly. Therefore, I assumed an increase of plasmin in HIF-2α k/d and PAI-1 k/d cocultures as a result of the reduced PAI-1 levels. Blocking plasmin with aprotinin in HIF-2α k/d cocultures restored angioge nesis, suggesting that HIF-2α increases PAI-1 to lower concentrations of active plasmin, thereby supporting angiogenesis. In further experiments I could exclude PAI-1 to reduce angiogenesis by inducing plasmin-mediated apoptosis of differentiating stem cells in PAI-1 k/d and HIF-2α k/d cocultures, but demonstrated an increase of VEGFA165 degradation in these cocultures, suggesting plasmin-catalyzed proteolysis of VEGF as an additional layer of regulation required to explain the angiogenic phenotype. Besides the pivotal role of PAI-1 in angiogenesis I also investigated its potentialinfluence in lymphangiogenesis. Indeed, the knockdown of PAI-1 reduced lymphaticstructures and implied an important but opposing role in lymphangiogenesis comparedto induced lymphangiogenesis in HIF-2α k/d cocultures. However, blocking plasmin again with aprotinin in HIF-2α k/d cocultures restored lymphangiogenesis to the level of control virus, which indicates a divergent lymphangiogenic role of plasmin in PAI-1 k/d and HIF-2α k/d cocultures, possibly because of other essential pathways masking the lymphangiogenic effects of PAI-1 in HIF-2α k/d cocultures.
HIF-2α resulting in reduced IGFBP1 expression induced the differentiation of stem cells toward a lymphatic cell type and significantly enhanced the assembly of human dermal lymphatic endothelial cells into tubes. These data point the first time to an important impact of HIF-2 in the regulatin of lymphangiogenesis in vitro by inducing IGFBP1 and thus, scavenging IGF-1. Furthermore, matrigel plug assays to investigate the in vivorelevance of these observations confirmed HIF-2α as a crucial factor in the regulation of lymphangiogenesis in vivo
In conclusion, this work provides evidence that HIF-2α is a key regulator of angiogenesis and lymphangiogenesis in HCC by regulating PAI-1 and IGFBP1. HIF-2α positively influences the angiogenic switch via PAI-1 and negatively affects lymphangiogenesis via IGFBP1 expression. Targeting HIF-2α in HCC to reduce tumor angiogenesis should be approached carefully, as it might be overcome by induced lymphangiogenesis and metastasis.
The RAF family of kinases constitutes the members A, B and CRAF. They mediate RAS signaling by linking it to the MEK/ERK transduction module, which regulates cellular processes such as cell proliferation, migration, survival and cell death. As the RAS/RAF/MEK/ERK (MAPK) pathway is found to be activated in human cancers, the RAF kinases have been exploited as valuable therapeutic targets and RAF inhibitors show promising results in the clinic, esp. with tumors harboring an activating BRAFV600E mutation. However, RAF inhibitors paradoxically accelerate metastasis in RAS mutant and BRAF wildtype tumors. They also become ineffective over time in BRAFV600E tumors because of reactivation of downstream mitogen-activated protein kinase (MAPK) signaling by promoting RAF dimerization. Aims of the present work were 1) to investigate the role of ARAF kinase in the paradoxical activation of the enzymatic cascade by RAF inhibitors downstream of mutated RAS and 2) to study the consequences of the loss of ARAF function on signal transduction in vitro and in vivo (nude mice). We have engineered several cell lines that would allow the study of basal and RAF inhibitor induced effects on MAPK activation, tumor cell migration and invasion.
In summary, we were able to show that the RAF isoform ARAF has an obligatory role in promoting MAPK activity and tumor cell invasion in a cell type dependent manner. In these cell types, ARAF depletion prevented the activation of MAPK kinase 1 (MEK1) and extracellular signal-regulated kinase 1 and 2 (ERK1/2) and led to a significant decrease of protrusions growing out of tumor cell spheroids in a three-dimensional (3D) culture that were otherwise induced by BRAFV600E-specific or BRAF/CRAF inhibitors (GDC-0879 and sorafenib, respectively). RAF inhibitors stimulated homodimerization of ARAF and heteromerization of BRAF with CRAF and the scaffolding protein KSR1. However, induced oligomerization was not sufficient to activate MAPK signaling if ARAF was depleted. By employing full length recombinant kinases, we were able to show for the first time that the three RAF isoforms competed for the binding to MEK1. In cell culture models, the overexpression of dimer-deficient ARAF mutants impaired the interaction between ARAF and endogenous MEK1 and thus prevented the subsequent phosphorylation of MEK1 and ERK1/2. Our findings reveal a new role for ARAF in directly activating the MAPK cascade through homodimerization and thereby promoting tumor cell invasion, suggesting the conserved RAF-dimer interface as a target for RAS- and RAF mediated cancer therapy.
Collectively, we provide evidence for the dual role ARAF plays in controlling MAPK signaling and cancer as loss of ARAF promoted strong lung metastasis formation in nude mice. Preliminary data describing the underlying mechanisms behind ARAF-regulated metastases have been presented and discussed.
Evaluierung der zellfreien Produktion sekundär aktiver Transporter für die Proteinkristallisation
(2013)
The four subunit (SU) aa3 cytochrome c oxidase (CcO) from Paracoccus denitrificans is one of the terminal enzymes of the respiratory chain. It uses electrons from cytochrome c to reduce molecular oxygen to water. Its binuclear active center, residing in SU I, contains hemeÊa3 and CuB, the latter being liganded by three histidine residues. Apart from its oxygen reductase activity, the protein possesses a peroxidase and a catalase activity.
To compare variants and the wild type (WT) protein in a more stringent way, a recombinant (rec.) WT CcO was constructed, carrying the gene for SUÊI on a low copy number plasmid. This rec. WT showed, as expected, no difference in oxygen reductase activity compared to the American Type Culture Collection (ATCC) WT CcO but surprisingly its catalase activity was increased by a factor of 20. The potential overproduction of SUÊI due to plasmid coding and the resulting deficiency in metal inserting chaperones might impair the correct insertion of hemeÊa3 and CuB because of a deficiency in metal inserting chaperones. This in turn might lead to differences in side chain orientation and to changes in the water network. However, slight changes might cause an increased accessibility of the active center for hydrogen peroxide, resulting in an increased catalase activity. The availability of chaperones and therefore the proposed structural reasons for the difference was improved by cloning the genes for the two metal inserting chaperones CtaG and Surf1c on the same plasmid together with SUÊI. This new rec. WT CcO showed in fact a reduced catalase activity. Another WT with a deletion in the chromosomal second, non expressing gene of SU I was analysed to prove plasmid coding as the reason for the difference of the ATCC WT and the rec. WT. This strain showed an increased kcat of the catalase activity as well, additionally pointing to a regulatory effect of the non expressed gene for SU I in the chromosome. To fathom the structural difference of the increased catalase activity, differential scanning calorimetry was used, but no significant difference in thermal stability between the ATCC WT CcO and the rec. WT CcO was detected. However, upon aging, the thermal stability of the rec. WT CcO declined faster than that of the ATCC WT CcO pointing to a decreased structural stability of the rec. WT CcO.
To characterize the catalase reaction, several known inhibitors were used to probe the contribution of the different metal cofactors in the catalase reaction. In addition variants in aromatic amino acids near the active center were constructed to conclude on a possible reaction mechanism of the catalase activity of CcO. These variants in combination with the wild type forms were analysed for radical signals by EPR-spectroscopy. A radical relevant for the catalase reaction of CcO was found in the F-intermediate of all variants and all wild type forms. This narrow 12 G radical signal was assigned to a porphyrine radical probably involved in the catalase reaction of CcO. Moreover, gas chromatography-mass spectrometry measurements were used to analyse isotopically labelled oxygen produced in the catalase reaction.
As a result of these experiments, a reaction cycle of the catalase activity of CcO is postulated and the structural difference between the ATCC and rec. WT CcO is outlined. The catalase activity appears to be a true catalase activity and not a "pseudocatalase" activity.
With only a 2.6 Å resolution laboratory powder diffraction pattern of the θ phase of Pigment Yellow 181 (P.Y. 181) available, crystal-structure solution and Rietveld refinement proved challenging; especially when the crystal structure was shown to be a triclinic dimethylsulfoxide N-methyl-2-pyrrolidone (1:1:1) solvate. The crystal structure, which in principle has 28 possible degrees of freedom, was determined in three stages by a combination of simulated annealing, partial Rietveld refinement with dummy atoms replacing the solvent molecules and further simulated annealing. The θ phase not being of commercial interest, additional experiments were not economically feasible and additional dispersion-corrected density functional theory (DFT-D) calculations were employed to confirm the correctness of the crystal structure. After the correctness of the structure had been ascertained, the bond lengths and valence angles from the DFT-D minimized crystal structure were fed back into the Rietveld refinement as geometrical restraints (‘polymorph-dependent restraints’) to further improve the details of the crystal structure; the positions of the H atoms were also taken from the DFT-D calculations. The final crystal structure is a layered structure with an elaborate network of hydrogen bonds.
The knowledge of three-dimensional structures of biomolecules is fundamental for the understanding of their function. Nuclear magnetic resonance (NMR) spectroscopy represents besides X-ray crystallography one of the two most widely used techniques to study macromolecules at atomic resolution. Its application has long been a laborious task that could take months and required the expertise of an experienced scientist, however, owing to the tremendous effort that has been put into the development of respective computer algorithms, structure determination by NMR spectroscopy of small- to medium sized proteins is nowadays routinely performed. CYANA is one widely used software package, which combines the majority of individual steps towards a three-dimensional structure. The most common application of the program, however, restricts to the combined automated NOE assignment and structure calculation based on NOESY peak lists and an existing chemical shift assignment. Completely automated structure determination starting from NMR spectra is to date technically possible with CYANA, however, not yet routinely applied. In order to achieve this long-term goal, the individual steps need to become more robust with regard to data imperfections such as peak overlap, spectral artifacts or a limited amount of NMR data. The work presented in this thesis should be placed within the context of increasing the reliability and improving the accuracy of structures determined by CYANA on the basis of solution- as well as solid-state NMR data.
The chapter “Systematic evaluation of combined automated NOE assignment and structure calculation with CYANA” comprises an extensive study on the robustness of the combined automated NOE assignment and structure calculation algorithm based on experimental solution NMR data sets that were modified in multiple ways to mimic different kinds of data imperfections. The results show that the algorithm is remarkably robust with regard to imperfections of the NOESY peak lists and the chemical shift tolerances but susceptible to lacking or erroneous resonance assignments, in particular for nuclei that are involved in many NOESY cross peaks.
In the chapter “Peakmatch – A simple and robust tool for peaklist matching” a method to achieve self-consistency of the chemical shift referencing among a set of peak lists is presented. The Peakmatch algorithm matches a set of peak lists to a specified reference peak list, neither of which have to be assigned, by optimizing an assignment-free match-score function. The algorithm has been extensively tested on the basis of experimental NMR data sets of five different proteins. The results show that peak lists from many different types of spectra can be matched reliably as long as they contain at least two corresponding dimensions.
NMR structures are represented by bundles of conformers whose spread indicates the precision of the atomic coordinates. However, there is as yet no reliable measure of structural accuracy, i.e. how close NMR conformers are to the “true” structure. Instead, the precision of structure bundles is widely (mis)interpreted as a measure of structural quality. Attempts to increase the precision thus often yield tight structure bundles where the precision overestimates the accuracy. To overcome this problem, the chapter “Increased reliability of NMR protein structures by consensus structure bundles” introduces a new protocol for NMR structure determination with the software package CYANA that produces bundles of conformers with a realistic precision that is throughout a large number of test data sets a much better estimate of the structural accuracy than the precision of conventional structure bundles.
Solid-state NMR is a powerful technique to study molecules which are not amenable to either solution NMR or X-ray crystallography. Despite the reporting of individual atomic resolution structures of membrane proteins and amyloid fibrils based on solid-state NMR data, the application is far from routine. One major obstacle that hinders structure determination by solid-state NMR is the overall lower quality of the solid-state NMR spectra. It is therefore necessary to increase the robustness of the computer algorithms in order to improve the results when using lower quality solid-state NMR spectra. The chapter “Structure calculations of the model protein GB1 from solid-state NMR data” presents structure calculations on the basis of a set of two-dimensional solid-state NMR experiments of the model protein GB1. The most important result obtained from these test calculations is that the limitation of structural accuracy can be attributed to inaccurate distance information resulting from the limited correlation between peak intensities and distance, which is especially severe in spin diffusion-based solid-state NMR experiments.
The chapter “Full relaxation matrix-based correction of relayed polarization transfer for solid-state NMR structure calculation” therefore introduces a method which corrects experimental peak intensities for spin diffusion in order to improve the distance information from solid-state NMR spectra. The results show that the structural accuracy can be significantly improved when using the corrected distance information, however, strongly dependent on the preliminary structural model that is required as input for the method.
Die Sulfonyl-Gruppe (-SO2-) ist ein weit verbreitetes Strukturmotiv in der organischen Chemie und Bestandteil vieler biologisch aktiver Moleküle, insbesondere Arzneistoffen. Zwei der am häufigsten auftretenden Gruppen sind Sulfone und Sulfonamide, die in über 100 zugelassenen Medikamenten und 10% der meistverkauften Medikamente sind. Insofern kommt der Entwicklung neuer Synthesemethoden eine große Bedeutung zu. Dabei stehen besonders einfache, wirtschaftliche und zeitsparende Vorgehensweisen im Vordergrund, die eine große Bandbreite an neuen Substanzen generieren können. Ein Ansatz hierfür sind Multikomponenten- oder Eintopfreaktionen.
Aufgrund der Wichtigkeit dieser zwei Strukturklassen, sollen im Rahmen der hier vorliegenden Doktorarbeit neue Syntheserouten für Sulfone und Sulfonamide entwickelt werden. Besonderes Augenmerk wird auf die die Einführung der SO2-Einheit während der Reaktionsführung gelegt. Im Vergleich zu bereits existierenden Verfahren ist dies ein enormer Fortschritt, da die Mehrheit der bekannten Routen auf Schwefel- oder Schwefeldioxid-haltige Startmaterialien zurückgreift.
In der vorliegenden Arbeit gelang es, einen synthetischen Zugang zu Arylsulfonen basierend auf von Natrium-, Lithium-, Magnesium- und Zinksulfinaten zu finden. Diese Reaktion besitzt eine sehr große Anwendungsbandbreite und setzt sowohl Aryl- als auch Alkylsulfinate effizient um. Außerdem weisen Reaktionen mit unsymmetrischen Diaryliodoniumsalzen hohe Chemoselektivitäten auf.
Auf der Grundlage auf der Reaktion zwischen Natriumsulfinaten und Iodoniumsalzen wurde eine simple Route zur Synthese von Diarylsulfonen abgeleitet, jedoch war hierbei die Sulfonylgruppe noch Bestandteil eines der Edukte. Um die SO2-Einheit während der Reaktion einführen zu können, wurde ein praktisches Eintopf-Protokoll entwickelt, welches die direkte Umsetzung von (hetero)aromatischen und alkylischen Halogeniden zu Arylsulfonen gestattet. Diese innovative Methode besteht aus folgenden vier Schritten: (1) Generierung des Organometallreagenzes via Halogen-Metall-Austausch, direkte Metallinsertion oder Deprotonierung; (2) Reaktion des Organometallreagenzes mit SO2 zum Sulfinat; (3) Entfernen des SO2-Überschusses und flüchtiger Komponenten und (4) Umsetzung des nicht aufgereinigten Sulfinates mit einem Iodoniumsalz.
Desweiteren wird in dieser Arbeit ein neuartiger Übergangsmetall-katalysierter Ansatz zur Darstellung von Diarylsulfonen ausgehend von Arylhalogeniden und Sulfinaten diskutiert. Erste Experimente deuten auf Nickel-Katalysatoren als gute Wahl für die Reaktion. Optimierungsreaktionen zeigten eine starke Abhängigkeit der Ausbeute in Hinsicht auf die Bisswinkel der an das zentrale Nickelatom koordinierten Liganden. Da die bis dato besten Ergebnisse mit dem Komplex [o-tol-Ni(PPh2Me)2Cl] erzielt wurden, wird der [o-tol-Ni(PMe3)2Cl]-Komplex momentan in unserem Labor weiteren Studien unterzogen. Bislang ist davon auszugehen, dass dieser Katalysator hervorragende Ergebnisse liefert und zu einer allgemein gültigen Methode führt.
In weiteren Kapiteln wird die Anwendbarkeit von SO2-Surrogaten, Metabisulfiten „S2O52-„ oder DABSO; untersucht; mit dem Ziel eine Eintopf- oder Multikomponentenreaktion zu entwickeln.
Zum einen wird die Entwicklung einer Ein-Topf-Reaktion von Alkylhalogeniden mit Metabisulfiten und Organozinkreagenzien zur Darstellung von Alkylarylsulfonen vorgestellt. Darüber hinaus wird eine Übergangsmetall-katalysierte Multikomponenten Reaktion zur Synthese von Sulfonsäureamiden vorgestellt. Eine Reaktion zwischen Aminen, Arylhalogeniden und DABSO als SO2-Quelle wurde in Form einer Palladium-katalysierten Aminosulfonylierung entwickelt.
Azulen: Für die Orientierungsfehlordnung im Azulen werden mit Kraftfeld-Methoden sowie mit quantenmechanischen Methoden an einem Satz geordneter Kristallstrukturmodelle Gitterenergieminimierung durchgeführt. Die Modelle zeigen sehr ähnliche Gitterenergien. Keine signifikante Nahordnung ist zu erkennen. Es liegt eine statistische Orientierungsfehlordnung vor. Die Auslenkungsparameter in der experimentellen Kristallstruktur werden durch die Überlagerung der berechneten Atompositionen gut reproduziert.
Perinon-Pigmente P.R. 194, P.O. 43 und V.R. 14: Für das cis-Isomer (P.R. 194), das trans-Isomer (P.O. 43) und den Mischkristall (V.R. 14) der Perinone werden geordnete Kristallstrukturmodelle aufgestellt und Gitterenergieminimierung mit Kraftfeld-Methoden sowie quantenmechanischen Methoden durchgeführt.
In der Orientierungsfehlordnung von P.R. 194 zeigen sich kurze Korrelationsreichweiten für alle Richtungen. Die Lokalstruktur wird über Variationen der exakten Positionen und Orientierungen der Moleküle beschrieben. Die experimentellen Auslenkungsparameter werden durch Überlagerung berechneter Atompositionen reproduziert.
Für trans-Perinon sind keine Hinweise auf eine Fehlordnung zu erkennen.
Im Mischkristall der beiden Isomere (Küpenfarbstoff V.R. 14) liegen eine Positions- und eine Orientierungsfehlordnung vor. Quantenmechanische Gitterenergieoptimierungen zeigen zwei Bandbreiten der Gitterenergie für geordnete Kristallstrukturmodelle, getrennt anhand der Orientierung der Moleküle des trans-Isomers. Die ungewöhnlichen experimentellen Auslenkungsparameter und Positionen der Atome werden ebenfalls durch die Überlagerung berechneter Atompositionen gut reproduziert.
Die Nachbarschaftswahrscheinlichkeiten werden über eine statistische Auswertung der Häufigkeiten einzelner Nachbarschaften genähert beschrieben und zeigen stark anisotrope Präferenzen. Die intermolekularen Wechselwirkungen werden mit Kraftfeldmethoden qualitativ charakterisiert und zeigen eine zu den Nachbarschaftswahrscheinlichkeiten sehr ähnliche Anisotropie.
PTCBI: Im cis-Isomer von PTCBI beobachtet man eine dem P.R. 194 ähnliche Orientierungsfehlordnung. Anhand der Ergebnisse der Gitterenergieminimierungen wird eine statistische Fehlordnung angenommen.
Für das trans-Isomer von PTCBI findet man durch Gitterenergieminimierungen ein theoretisches energetisch ungünstiges Polymorph in der Raumgruppe P 21/c.
Für den PTCBI-Mischkristall wird aus der Auswertung von Röntgenpulverdiagrammen eine zum cis-Isomer isotype Struktur abgeleitet. Für diese Struktur wird eine dem V.R. 14 ähnliche Positions- und Orientierungsfehlordnung untersucht. In der statistischen Auswertung der Gitterenergien zeigen alle Modelle vergleichbare und gleichzeitig sehr niedrige relative Wahrscheinlichkeiten. Für die Lokalstruktur sind keine klaren Präferenzen für bestimmte Motive erkennbar. Im PTCBI-Mischkristall wird eine nahezu statistische Fehlordnung erwartet. Die Wechselwirkungen der geordneten zentralen Kohlenstoffgerüste der Perylen-Tetracarbonsäure bestimmen die Packung in cis-PTCBI und im PTCBI-Mischkristall.
P.R. 170: Die Struktur der β-Phase von Pigment Rot 170 besteht aus geordneten Schichten. Die Komponente des Translationsvektors zwischen den Schichten in b-Richtung beträgt entweder ty = +0,421 oder ty = -0,421. Die Abfolge der Translationsvektoren ist weder periodisch noch völlig zufällig.
Gitterenergieminimierungen an kombinatorisch vollständigen Sätzen geordneter Modelle mit einem maßgeschneiderten Kraftfeld werden durchgeführt. Erhaltene Gitterenergien erlauben die Beschreibung der Lokalstruktur durch bevorzugte Stapelsequenzen. Darin beeinflussen die nächsten und übernächsten Nachbarn die Energie und die Geometrie einer einzelnen Schicht.
Relative Wahrscheinlichkeiten (respektive der Entartungen) für endliche lokale Motive werden mit der Boltzmann-Statistik berechnet. So tritt das Motiv + + − mit einer Wahrscheinlichkeit von ca. 61,4% auf, während das Motiv − + − mit einer Wahrscheinlichkeit von ca. 23,3% wesentlich seltener erscheint. Das Motiv + + + ist mit der Wahrscheinlichkeit von ca. 15,3% am seltensten. Mit diesen relativen Wahrscheinlichkeiten werden Strukturmodelle in Superzellen mit bis zu 100 aufeinanderfolgenden Schichten aufgebaut und zur Simulation der Röntgenbeugungsdaten verwendet. Damit werden Pulver- wie Einkristalldaten gut reproduziert, inklusive der diffusen Streuung.
Septulen: Für Septulen werden Unterschiede in der Konformation der Moleküle zwischen der Gasphase und dem Festkörper beobachtet. Berechnungen der Einzelmolekülenergien sowie Gitterenergieminimierungen werden mit rigiden sowie flexiblen Molekülen für beide Konformationen durchgeführt. Die Konformationsänderung zwischen Gasphase und Festkörper bedeutet einen Verlust an Energie, welcher durch die günstigere Packung und durch den Gewinn an Gitterenergie wettgemacht wird. Ähnlich günstige Gitterenergien wurden für die Gasphasen-Konformation nicht gefunden.
In Reaktion auf zellulären Stress wie etwa Schädigungen der DNA oder die vermehrte Aktivität von Onkogenen aktivieren vorgeschaltete Signalkaskaden den Transkriptionsfaktor (TF) p53. Dieser kann über die Aktivierung der Expression von Zielgenen wiederum die Zellteilung stoppen, die Reparatur von DNA Schäden initiieren oder in schweren Fällen die Eliminierung der Zelle durch Apoptose einleiten. Ist p53 durch Mutationen deaktiviert, können sich entartete somatische Zellen vermehren und in der Folge Krebs entstehen.
In Wirbeltieren finden sich neben p53 mit p63 und p73 zwei weitere TFs, welche während der Evolution aus dem gleichen gemeinsamen Vorläufer durch Genduplikationen hervorgegangen sind. Die drei TFs sind modular aufgebaut und alle Isoformen verfügen jeweils minimal über eine DNA Bindungsdomäne (DBD) und eine Tetramerisierungsdomäne (TD). Werden die p53 ähnlichen TFs aktiviert, lagern sie sich über die TD vermittelt zu Tetrameren zusammen, wodurch ihre DBDs kooperativ an DNA Sequenzmotive binden können. Die DBD ist auch über große phylogenetische Abstände hinweg hoch konserviert, wodurch bereits gezeigt werden konnte, dass auch primitive vielzellige Tiere bereits Homologe dieser TF Familie besitzen. Im Vergleich zur DBD variiert die Proteinsequenz der TD deutlich stärker, was andeutet, dass deren Struktur im Laufe der Evolution erhebliche Veränderungen durchlaufen hat. Diese Veränderungen aufzuklären ist das übergeordnete Forschungsvorhaben zu dem diese Dissertationsschrift beiträgt.
Ciona intestinalis (C.int.) ist eine Spezies aus dem Unterstamm der Manteltiere. Diese sind die engsten lebenden Verwandten der Wirbeltiere und C.int. ist ein populärer Modelorganismus für die Erforschung der Embryonalentwicklung. Sein Genom kodiert für zwei p53 ähnliche TFs, welche mit p53/p73-a und p53/p73-b bezeichnet werden. Die Struktur ihrer TDs wurde im Rahmen der vorliegenden Arbeit mittels Kernspinresonanz (NMR) Spektroskopie untersucht.
Die TD von menschlichem p53 (hp53) ist ein Dimer aus Dimeren. Jedes Monomer formt einen beta-Strang und eine alpha-Helix. Im primären Dimer lagern diese sich so zusammen, dass ein beta-Faltblatt entsteht und die alpha-Helices mit entgegen gesetzter Orientierung der Länge nach aneinander packen. Zwei dieser Dimer lagern sich dann so zum Tetramer zusammen, dass zwischen pol-ständigen beta-Faltblättern ein Bündel aus vier Helices entsteht. Dieses Motiv ist auch in den TDs der Ciona Proteine hochkonserviert und wird im Folgenden als Kern?TD bezeichnet. In den TDs von menschlichem p63 und p73 (hp63 und hp73) verfügt jedes Monomer an seinem C-terminus noch über eine zweite Helix. Die zweiten Helices eines jeden Dimers greifen wie Klammern um das jeweils andere primäre Dimer und stabilisieren so das Tetramer. Entscheidend für die stabile Anbindung an die Kern?TD ist dabei ein charakteristisches Tyrosin-Arginin (YR) Motiv in der zweiten Helix, welches sich auch in der Sequenz der TD von C.int. p53/p73-a wiederfindet. Analysen der Sekundärstruktur auf Basis von NMR Experimenten ergaben jedoch, dass die TD von C.int. p53/p73-a bei 25°C keine zweite Helix ausbildet. Mit Hilfe von chimären TD Peptiden, in denen Teile der Ciona Sequenz gegen die entsprechenden Abschnitte von hp73 ausgetauscht wurden, konnte gezeigt werden, dass die Kern TD von C.int. p53/p73-a fähig ist eine zweite Helix zu stabilisieren und hierfür neben dem YR Motiv auch der Sequenzabschnitt zwischen erster und zweiter Helix entscheidend ist. Stabilisierende Substitutionen in diesem Bereich bewirkten ebenso wie ein Absenken der Temperatur die Ausbildung einer zweiten Helix, welche jedoch im Gegensatz zu jener in hp73 nur transient faltet und auch nicht essentiell für die Bildung des Tetramers ist, wohl aber dessen Stabilität erhöht.
Spezifisch in der Entwicklungslinie von Ciona kam es dazu, dass eine, für eine entsprechende Vorläuferversion von C.int. p53/p73-a kodierende, mRNA spontan zurück in DNA übersetzt und ins Genom eingefügt wurde. Die durch diese Retrotransposition erzeugte neue Genkopie C.int. p53/p73-b muss demnach ursprünglich einmal für die gleiche Proteinsequenz kodiert haben, innerhalb der TD finden sich konservierte Reste jedoch nur im Bereich der Kern TD.
Von der TD von C.int. p53/p73-b wurde die molekulare Struktur in freier Lösung mittels NMR ermittelt. Diese zeigte, dass interessanterweise in der TD von C.int. p53/p73-b jedes Monomer am C-terminus eine stabil gefaltete, zweite Helix besitzt. Obwohl diese zweite Helix sich aus einer Sequenz faltet, die keinerlei Sequenzhomologie zu homologen Proteinen aus Wirbeltieren aufweist, lagert sie sich in einer Position auf die Kern TD, welche der in hp73 sehr nahe kommt. Da die primären Dimere der Kern TD aber anders als in hp63 und hp73 durch Salzbrücken miteinander verbunden sind, ist die zweite Helix jedoch nicht essentiell, um das Tetramer zu stabilisieren. Vermutlich kommt der zweiten Helix von C.int. p53/p73-b vielmehr u.a. die Aufgabe zu die Bildung von Heterotetrameren aus C.int. p53/p73-a und –b zu unterbinden.
Zusammengenommen zeigen die Ergebnisse, dass die Architektur der TD mit zweiter Helix bereits der Prototyp für die TDs aller p53 ähnlichen Proteine der Wirbel- und Manteltiere war und die als eine Art Klammer das Tetramer stabilisierende zweite Helix sich nicht erst während der Evolution der Wirbeltiere entwickelt hat.
Funktionalisierung mikro- und nanostrukturierter Oberflächen zur spezifischen Proteinimmobilisierung
(2014)
Die vollständige Sequenzierung des humanen Genoms zu Beginn dieses Jahrtausends leitete einen Boom der Genomik ein, in deren Anfangszeiten man sich jedoch vor einer großen Herausforderung sah. Aufgrund der selbst bei einfachen Organismen großen Anzahl kodierender Gene und auch vor dem Hintergrund ständig wachsender Datenbanken mit immer neuen vollständig sequenzierten Arten, stellten sich genetische Analysen mit klassischen Methoden als zu zeit- und kostenaufwändig heraus. Die Entwicklung sog. DNA-Chips – feste Substrate, die mehre zehn- bis hunderttausend verschiedene Oligonukleotide tragen und die parallele Durchführung einer großen Anzahl von genetischen Analysen in sehr kurzer Zeit bei vergleichsweise geringen Kosten erlaubten – lösten dieses Problem. Analog hierzu werden Protein-Chips ähnlich gute Erfolgsaussichten in der Proteomik beschieden. Der Aufbau eines Protein-Chips ist dem eines DNA-Chips sehr ähnlich, allerdings sind die Anforderungen, die für eine funktionale Immobilisierung von Proteinen an eine Substratoberfläche gestellt werden, ungleich höher. Es muss gewährleistet sein, dass durch die Verankerung auf dem Substrat die native Struktur der Proteine nicht zerstört wird, dass die immobilisierten Proteine in einer Orientierung vorliegen, in der wichtige Merkmale, wie Bindungsmotive, aktive Zentren usw. weiterhin zugänglich sind und dass unspezifische Proteinadsorptionen auf ein Minimum reduziert werden. Ziel dieser Arbeit war es, ein Konzept für eine Protein-Chip-Plattform zu entwickeln, welches diese Voraussetzungen erfüllt.
Einleitend wird die Erarbeitung eines Assays zur Analyse einer Antikörper-Antigenwechselwirkung mittels Oberflächenplasmonresonanz-(SPR)-spektroskopie dargestellt. Da diese Technik ebenfalls eine native Immobilisierung von Proteinen auf einem festen Substrat erfordert, stellt sie eine Vorform der Protein-Chip-gestützten Analyse dar. Dem entsprechend werden an SPR-Oberflächen ähnliche Anforderungen gestellt wie an Protein-Chips. In der Etablierungsphase des SPR-Assays wurden zunächst grundlegende Parameter wie die Immobilisierungs- und Regenerationsbedingungen optimiert. Anschließend wurde überprüft, ob Antigen und Antikörper unter den gewählten Versuchsbedingungen noch miteinander interagieren konnten und die Wechselwirkung zwischen beiden Proteinen nicht beeinträchtig wurde. Hauptziel des SPR-Assays war die Überprüfung der Bindeaktivität verschiedener Chargen des Antikörpers im Vergleich zu einer Referenz-Charge unter Berücksichtigung eines möglichen Einflusses der Lagerzeit. Als Ergebnis konnte zwar eine geringe Abnahme der Bindungsaktivität beobachtet werden, welche eindeutig mit der Lagerzeit korrelierte, ein signifikanter Unterschied zwischen den zu vergleichenden Chargen war jedoch nicht erkennbar.
Der weitaus größere Teil der in dieser Dissertation beschriebenen Ergebnisse betrifft die Konzeption neuer Protein-Chip-Architekturen. In Zusammenarbeit mit der Arbeitsgruppe um Armin Gölzhäuser von der Universität Bielefeld wurde eine Protein-Chip-Plattform erarbeitet, für deren Herstellung Nitrobiphenyl-(NBPT)-Monolagen auf Gold mit Hilfe chemischer Lithographie im Mikro bzw. Nanomaßstab strukturiert wurden. Die Strukturen wurden anschließend mit multivalenten NTA-Verbindungen funktionalisiert, sodass Proteine mit His-Tag spezifisch darauf verankert werden konnten. Die wichtigsten Vorteile dieses Systems sind eine hohe Bindungsstabilität der immobilisierten Proteine, eine aufgrund der weiten Verbreitung des His-NTA-Systems leichte Verfügbarkeit His-getaggter Proteine sowie die Erhaltung ihres nativen Zustandes bei gleichzeitig uniformer Orientierung auf der Substratoberfläche. Nachdem zunächst die grundsätzliche Machbarkeit der Strukturierung und Funktionalisierung gezeigt wurde, folgte eine eingehende Charakterisierung der einzelnen Fertigungsschritte per Rasterkraftmikroskopie (AFM) und SPR-Spektroskopie, um diese anschließend weiter zu optimieren. So konnte die Proteinresistenz in den Bereichen zwischen den Mikro- bzw. Nanostrukturen, in denen keine Proteine binden sollten, deutlich verbessert werden. Zusätzlich wurde die Effizienz der Oberflächenfunktionalisierung gesteigert, sodass eine höhere Immobilisierungsdichte möglich war. Die Funktionalität des verbesserten Protein-Chips wurde mittels AFM und konfokaler Fluoreszenzmikroskopie (CLSM) überprüft. Es konnte eine hochspezifische und stabile, aber gleichzeitig reversible Bindung His-getaggter Proteine auf dem Protein-Chip gezeigt werden. Die bis dahin nass-chemisch durchgeführten Fertigungsschritte wurden in der Folge ins Hochvakuum übertragen, um die Herstellung dieser Protein-Chips mittels Gasphasenabscheidung zu ermöglichen. Als Ergebnis dieser Arbeiten konnten proteinresistente EG3-Monolagen allein durch Gasphasendeposition generiert werden. Bis auf die Funktionalisierung mit trisNTAs konnten im Rahmen dieser Arbeit sämtliche Fertigungsschritte in die Gasphase übertragen werden. Protein-Chips, die auf diese Art hergestellt worden waren, hatten in Hinsicht auf Bindungsspezifität und -stabilität ebenso gute Eigenschaften wie Protein-Chips aus der klassischen nass-chemischen Fertigung. Zusätzlich wurde parallel zu diesen Arbeiten ein neuer Ansatz zur Strukturierung und trisNTA-Funktionalisierung von EG3-SAMs erarbeitet.
Ein zweiter Protein-Chip-Prototyp sollte durch orthogonale Funktionalisierung von nano-strukturierten Glasoberflächen mit Polyenthylenglykol (PEG) und multivalenten Chelatoren hergestellt werden. CLSM-Untersuchten ergaben zunächst, dass dieser Ansatz der orthogonalen Funktionalisierung nicht gelang, da auf den Goldstrukturen nur wenig Protein zu binden schien, während in den vermeintlich proteinresistenten PEG-Bereichen eine vergleichsweise große Menge His-getaggter Proteine adsorbierte. Nach einer Reihe von Versuchen stand fest, dass sich die Verfahren zur Funktionalisierung mit PEG und bisNTA-Thiolen gegenseitig störten. Die PEGylierung verhinderte die anschließende Ausbildung einer dicht-gepackten bisNTA-SAM, was zwar durch vorheriges Aufbringen einer Schutz-SAM aus Undecylthiolen gemildert, aber nicht vollständig verhindert werden konnte. Die anschließende Funktionalisierung der Nanostrukturen mit bisNTA-Thiolen führte wiederum zur Dotierung der PEG-Schicht mit bisNTA-Thiolen, sodass diese Schicht ihre Proteinresistenz verlor. Da dieser ungewollte Prozess seine Ursache in der zweistufigen PEGylierungsreaktion hatte und dieser auch durch verschiedenste Block-Verfahren nicht vollständig verhindert werden konnte, wurde ein alternatives, einstufiges PEGylierungsverfahren getestet. Dieses hatte eine deutliche Verbesserung der Oberflächeneigenschaften zur Folge. Einerseits zeigten die Glasbereiche nun eine sehr gute Proteinresistenz, zum Anderen hatte das neue PEGylierungsverfahren keine negativen Auswirkungen auf die Ausbildung von bisNTA-SAMs. Mittels CLSM konnte auf Mikrostrukturen eine hochspezifische Proteinbindung beobachtet werden, während die PEGylierten Glasbereiche frei von Proteinen blieben. Interessanterweise konnte auf entsprechend funktionalisierten Nanostrukturen jedoch keine Proteinbindung nachgewiesen werden. Hierfür sind mehrere Ursachen denkbar, zu deren Klärung es weiterer Untersuchungen bedarf.
ATP synthases are multi-subunit membrane enzymes, which utilize the energy stored in a transmembrane electrochemical ion gradient to produce adenosine-5´-triphosphate (ATP), the universal energy carrier in biological systems. Research on these important enzymes goes back more than 50 years and has produced innumerable studies. The F-type ATP synthase consists of two functionally distinct, but tightly coupled subcomplexes, the water-soluble F1 and the membrane-embedded Fo complex. In its simplest form, F1 consists of five different subunits with a stoichiometry of α 3β3γδε, and harbors three catalytic centers in the α 3β3-headpiece, while Fo consists of three different subunits in a stoichiometry of ab2cn, where n varies between 8 to 15 depending on the species. From a mechanistic standpoint, the complex can also be divided into two different units, namely a stator, α3β3δ-ab2, and a rotor, γε-cn. The enzyme utilizes the energy stored in a transmembrane electrochemical gradient of protons, or in some cases Na+, to drive ATP synthesis. In particular, the downhill translocation of these ions across the Fo complex drives rotation of the γε-cn unit, which is then transduced to the active centers, catalyzing the phosphorylation of adenosine-5`-diphosphate (ADP) with inorganic phosphate (Pi), and the release of ATP....
So far clinical human immunodeficiency virus (HIV) therapy is limited to non-curative treatments. However, as recently shown, alternative approaches such as HIV gene therapy have the potential to functionally cure the disease (e.g. the hematopoietic stem cell (HSC)-transplantation with a CCR5Δ32 homozygous transplant) (1). In contrast to the highly personalized medical treatment applied in the ‘Berlin case’, more broadly applicable approaches are currently under intensive investigation.
One example is the adeno-associated-virus (AAV)-mediated delivery of in vivo secreted antiviral entry inhibitors (iSAVE), the concept of which is based on the direct in vivo administration of a broadly applicable highly potent antiviral gene (here: a C46-derived entry inhibitory peptide interfering with HIV-1 membrane fusion). The AAV-based gene delivery is believed to overcome several limitations of gene therapeutic treatments based on ex vivo lentiviral trials in the past. It is (i) targeting differentiated HIV target cells (i.e. liver and differentiated lymphatic cells) reducing the risk of genotoxicity compared to stem cell-based trials, (ii) overcoming the limitation of a low number of genetically modifiable cells as in lentivirally based ex vivo transduction strategies (i.e. limited modifiable cell number due to culture conditions and lower vector titers) and (iii) using the safe AAV vector system, which has not been associated with major genotoxicity in men. (iv) Most importantly, the concept of secretable entry inhibitors does not require transduction of large amounts of cells due to the protective bystander effect. Thus, iSAVE might be a treatment principle for HIV infection that might be able to cure patients irrespective of their viral isolates or adherence.
Accordingly, the iSAVE concept could aim at two different sites in the patient for the production of antiviral transgenes, either the systemic production via suitable producer cells (e.g. hepatocytes) or the local production in the lymphatic system.
In a first approach, we are able to efficiently target hepatocytes using the natural AAV serotype 8 to express high plasma levels of secretable antiviral entry inhibitors in order to systemically suppress viral replication. In this setting we could show that iSAVE peptides are highly expressed in hepatocytes. However, plasma levels of iSAVE were insufficient when using a secretable peptide as sole antiviral transgene.
As a second treatment strategy, the iSAVE project aimed to deliver antiviral genes directly to the site of viral replication, the lymphatic system. Here, (i) a panel of naturally occurring AAV serotypes as well as (ii) AAV retargeting approaches were employed to design a highly efficient and selective AAV vector variant for gene delivery into the lymphatic system after intravenous vector administration.
In detail, (i) screening of the natural occurring serotypes revealed that the AAV serotype 1 (AAV-1) was best in targeting splenic tissue in two humanized mouse models, however at a very low level. After systemic AAV-1 vector administration neither transduction of human lymphocytes did occur nor was iSAVE expressed in the lymphatic system in a humanized mouse model.
(ii) In a second approach, we modified the well-characterized AAV-2 serotype in a tropism-defining region of its capsid gene by insertion of human peripheral blood lymphocytes (hPBL)-tropic peptide ligands. These in turn were selected by M13 in vivo phage display and by in vivo AAV peptide display. Selected variants were cloned and tested for hPBL transduction in vitro. Although the selected variants did not show increased expression efficacies compared to AAV-2 WT, it still might be possible that the selected variant are more specific for hPBLs as these conditions have not been tested.
As these selection processes required a humanized mouse model that comprises a functional lymphatic system, we established the previously described Trimera mouse model in our lab (2). We found that this mouse model could be further improved to allow engraftment of a lower number of gene-modified (gm) human T cells as in the classical Trimera model. These modified Trimera mice (mT3 mice) were conditioned by inclusion of cyclophosphamide (CTX) to the irradiation-conditioning scheme of the classical Trimera model.
Comparison of mT3 mice with established NSG and DKO mice in an adoptive gm T cell transplantation setting revealed that NSG mice were the most robust model providing high reproducibility in human T cell engraftment. MT3 mice allowed a substantial, yet more variable engraftment of gm T cells. Besides comparing engraftment kinetics, the graft quality (i.e. clonality and cytokine milieu) was analyzed. Again, NSG mice showed the most balanced homeostatic repopulation three weeks after transplantation, while mT3 mice were prone to Th1-type, oligloclonal repopulation, indicating an early onset of xenograft-versus-host disease. Finally, the lymphatic infiltration was analyzed. As expected, mT3 mice provided the most intact lymphatic structures, although the normal lymphatic morphology was not restored.
In conclusion, it was demonstrated in this work that AAV-mediated iSAVE gene therapy faces specific limitations depending on the respective targeting approach
In the systemic approach, iSAVE peptides have to be further optimized in terms of transgene design itself, as high-level accumulation in murine plasma was not feasible for the short iSAVE precursor. In the local, lymphatic targeting approach, AAV-mediated expression faces its limits in targeting specificity but foremost expression efficacy. Thus, the AAV vector itself needs further optimization for sufficient local iSAVE expression levels. Independently from the AAV-related approaches, a novel humanized mouse model was established in this work. Despite drawbacks regarding repopulation variability and set-up complexity, the novel mT3 mouse model comprised improved secondary lymphatic structures for adoptive T cell transfer, which might be an interesting platform for studies in lymphoma or leukemia therapy.
Die vorliegende Dissertation hatte das Ziel molekulare Mechanismen der Präeklampsieerkrankung aufzuklären. Bei PE handelt es sich um eine schwangerschaftsassoziierte Krankheit, die in 3 bis 5 % aller Schwangerschaften auftritt und eine der Hauptursachen für maternale und fetale Mortalität und Morbidität ist. Zudem haben PE-Patientinnen und ihre Kinder im späteren Leben ein erhöhtes Risiko für die Ausbildung kardiovaskulärer und hypertensiver Erkrankungen. Trotz langer und intensiver Forschung konnte die komplexe Pathogenese von PE noch nicht aufgeklärt werden. Im Rahmen der Promotion sollten neue Gene in der präeklamptischen Plazenta identifiziert und ihre Funktionen im Pathogeneseprozess der Krankheit untersucht werden. Dabei war es wichtig die Zusammenhänge der gestörten Prozesse zu verstehen um Mutter und Kind vor schwerwiegenden und langfristigen Folgeerscheinungen von PE zu schützen.
Mit dem durchgeführten Gen-Array konnte gezeigt werden, dass bei PE die Expression einiger Gene der Angiogenese-, der Invasions- sowie der Migrationsregulation verändert waren. Zudem konnten anhand von Deregulationen bei der SURVIVIN und BCL6 Expression zwei weitere Gene identifiziert werden, deren Funktionen in der präeklamptischen Plazenta bislang unbekannt waren.
Bei PE kam es im Vergleich zur gesunden Kontrolle zu einer verringerten Genexpression von SURVIVIN. Eine Veränderung des Proteinlevels konnte jedoch nicht festgestellt werden. Die Analyse der Survivin Funktionen zeigte, dass die Zellen der präeklamptischen Plazenta, die konstantem zellulärem Stress ausgesetzt sind, versuchen durch Aktivierung aller Überlebensmechanismen, wie einer Stabilisierung des anti-apoptotischen Proteins Survivin, ihr Überleben zu sichern und somit die Funktionalität des ganzen Organs zu gewährleisten. Als multifunktionelles Protein ist Survivin bislang vor allem als Apoptose-Inhibitor sowie als Partner des CPC mit Funktionen bei der Zellteilung bekannt. Die Untersuchungen ergaben, dass Survivin auch in Trophoblastenzellen für den einwandfreien Ablauf der Mitose verantwortlich ist, da es bei einer Depletion zu einem G2/M Arrest der Zellen sowie einer erhöhten Rate an Centrosomen Abberationen und congression Fehlern kam. Die vorliegende Arbeit zeigt zum ersten Mal, dass die Stabilisierung von Survivin bei Präeklampsie der Kompensation der gestörten Trophoblastenfunktionen dient indem die vermehrte Apoptose der Zellen verhindert und die Proliferation der Trophoblasten präzise gesteuert wird.
Im Rahmen der Dissertation wurden zudem die Funktionen von BCL6 bei Präeklampsie untersucht. BCL6 ist vorrangig durch seine Rolle bei der B-Zell Reifung und der T-Zell Regulation sowie als Onkogen bei B-Zell Lymphomen und auch bei Mammakarzinomen bekannt. Es konnte gezeigt werden, dass sowohl die Gen-, wie auch Proteinexpression von BCL6 in der präeklamptischen Plazenta erhöht sind. Bei einer Depletion von BCL6 kam es zu verminderter Proliferation der Trophoblasten mit G2/M Arrest und vermehrter Apoptose sowie reduzierter Invasions- und Migrationsfähigkeit. Eine erhöhte BCL6 Expression führte zu einer verminderten Expression der Fusionsregulatoren Syncytin 2, β-hCG und GCM1, woraus eine gestörte, reduzierte Fusionsfähigkeit der Trophoblasten resultierte. Dies bedeutet, dass die Expression von BCL6 präzise reguliert werden muss um die Trophoblasten zu Beginn der Schwangerschaft vor Apoptose und Zellzyklusarrest zu schützen und somit die Invasion und Plazentation zu ermöglichen. Kommt es im weiteren Verlauf zu einer Deregulation mit erhöhter BCL6 Expression, so resultiert daraus eine verminderte Trophoblastenfusion und Präeklampsie.
Zusammenfassend belegt die Arbeit, dass mit Survivin und BCL6 zwei weitere Regulatoren der PE-Pathogenese identifiziert und charakterisiert wurden. Im Rahmen der Promotion konnten die Funktionen bei der Regulation von Zellzyklus, Apoptose sowie Trophoblastenfusion und –invasion dargestellt werden. Weitere Untersuchungen sind jedoch notwendig um die Rolle von Survivin und BCL6 im ersten Schwangerschaftstrimester aufzuklären. Aufgrund ihrer wichtigen Rolle bei PE stellen Survivin und BCL6 neue Möglichkeiten zur Entwicklung von Therapieansätzen sowie zur Identifizierung prognostischer Marker für die Präeklampsieerkrankung dar.
Künstliche Ribonucleasen, die sequenzspezifisch und effizient die Spaltung von RNA-Phosphordiesterbindungen katalysieren, könnten potenziell nicht nur als biochemische Werkzeuge dienen, sondern auch als Wirkstoffe gegen eine Vielzahl von Erkrankungen, bei denen mRNA oder miRNA involviert sind, eine wichtige Rolle spielen. Obwohl in den letzten beiden Jahrzehnten zahlreiche sequenzspezifische RNA-Spalter entwickelt wurden, bleibt die Spaltaktivität dieser Verbindungen nach wie vor deutlich hinter der ihrer natürlichen Äquivalente zurück. Die Optimierung künstlicher Ribonucleasen und grundlegend dafür die Erforschung der Faktoren, die die Spaltaktivität einer Verbindung beeinflussen, sind daher weiterhin von großem Interesse. Zwar enthalten die meisten künstlichen Ribonucleasen Metallionen, doch sind auch metallfreie RNA-Spalter, zum Beispiel auf der Basis heterocyclischer Guanidine, bekannt. Prinzipiell kann die Hydrolyse des RNA-Rückgrates durch Deprotonierung der nucleophil am Phosphoratom angreifenden 2‘-OH-Gruppe, durch Protonierung der als Abgangsgruppe fungierenden 5‘-OH-Gruppe sowie durch Stabilisierung des bei der Spaltung durchlaufenen dianionischen Phosphorans katalysiert werden. Daher sollten potenzielle RNA-Spalter in der Lage sein, sowohl als Base als auch als Säure wirken zu können, was bei einem pKa-Wert im Bereich von 7 am besten gegeben ist. Fungiert ein und dasselbe Molekül als Protonenakzeptor und -donor, so kommt es im Fall von Guanidinanaloga zu einer Tautomerisierung vom Amino- zum Iminoisomer. Eine möglichst kleine Energiedifferenz zwischen beiden Formen sollte sich daher positiv auf die Spaltaktivität auswirken. In der vorliegenden Arbeit wurde eine Reihe heterocyclischer Guanidine synthetisiert, deren pKa-Werte bestimmt und die jeweiligen Energiedifferenzen zwischen Amino- und Iminotautomer grob mittels AM1-Rechnungen abgeschätzt. In Spaltexperimenten wurden Cy5-markierte RNA-Substrate mit den verschiedenen Verbindungen inkubiert (Spalter-Konzentration: 2 bzw. 10 mM). Die Analyse und Quantifizierung der Spaltprodukte erfolgten anschließend mithilfe eines DNA-Sequenziergerätes. Alle untersuchten und ausreichend löslichen Substanzen, die sowohl einen geeigneten pKa-Wert (6 – 8) als auch eine niedrige Energiedifferenz zwischen Amino- und Iminotautomer (≤ 5 kcal/mol) aufwiesen bzw. bei denen nur der pKa-Wert oder nur die Energiedifferenz in geringem Maße vom Idealwert abwich, spalteten RNA, wenn auch teilweise nur mit einer geringen Aktivität. In den Spaltexperimenten erwiesen sich Guanidinanaloga mit einem großen aromatischen System als besonders aktiv, allen voran 2-Aminoperimidin und seine Derivate, die auch bei Konzentrationen unter 50 µM Spaltaktivität zeigten. Gleichzeitig offenbarten diese Verbindungen in Fluoreszenzkorrelationsspektroskopie Experimenten eine große Tendenz zur Aggregation mit RNA, so dass die Spaltung in diesen Fällen möglicherweise nicht durch Einzelmoleküle, sondern durch Aggregate erfolgte. Um RNA-Substrate auch sequenzspezifisch spalten zu können, wurden PNA-Konjugate des bereits bekannten RNA-Spalters Tris(2-aminobenzimidazol) hergestellt, wobei der Spalter über eine neue, quecksilberfreie Route synthetisiert wurde. Es konnte gezeigt werden, dass diese PNA-Konjugate RNA sequenzspezifisch mit einer Halbwertszeit von etwa 11 h spalten, was im Rahmen der Halbwertszeit vergleichbarer DNA-Konjugate liegt. Um zu untersuchen, ob 2-Aminoperimidine auch als Einzelverbindungen aktiv sind, wurden zwei PNA-Konjugate von am Naphthylring substituierten 2-Aminoperimidin-Derivaten synthetisiert. Beide Konjugate zeigten keinerlei Spaltaktivität, was darauf hindeuten könnte, dass die Hydrolyse des RNA-Rückgrates nur durch mehrere Spalter-Einheiten – kovalent verknüpft oder in Form von Aggregaten – effizient katalysiert werden kann.
In the title compound, C20H24N2O4, both peptide bonds adopt a trans configuration with respect to the —N—H and —C=O groups. The dihedral angle between the aromatic rings is 53.58 (4)°. The molecular conformation is stabilized by an intramolecular N—H⋯O hydrogen bond. The crystal packing is characterized by zigzag chains of N—H⋯O hydrogen-bonded molecules running along the b-axis direction.
Nichtribosomale Peptid Synthetasen sind Quelle für eine Vielzahl an Sekundärmetaboliten mit antibiotischer Wirkung. Jede Synthetase besteht aus einer Abfolge von Modulen, wobei jedes Modul die nötigen Domänen für den Einbau eines Bausteins in das gebildeten Peptids enthält. Ein Ansatz zur Gewinnung neuer Peptidantibiotika, die angesichts der steigenden Zahl multiresistenter Keime dringend benötigt werden, ist der Austausch von Domänen oder Modulen. Aufgrund bisher noch nicht verstandener Selektivitäten, entweder zwischen den Domänen oder zwischen einzelnen Domänen und Zwischenstufen des gebildeten Peptids, führt dieser Ansatz jedoch in der Praxis oft zu keiner oder nur geringer Ausbeute.
Ziel der vorgelegten Arbeit war es, einige dieser Selektivitäten zu untersuchen, wobei der Fokus auf Peptidyl Carrier Proteinen Domänen (PCPs) lag. An diese Domänen sind alle Intermediate während der Reifung des Peptids kovalent über einen Phosphopantethein-Kofaktor (Ppan-Arm) gebunden.
Im ersten Teil der Arbeit sollte die Struktur einer mit einem Heptapeptid beladenen PCP mittels Lösungs-Kernspinresonanzspektroskopie (NMR) bestimmt werden. Hierbei konnte die natürliche Verknüpfung zwischen Ppan-Arm und Peptid über einen Thioester nicht verwendet werden, da diese Bindung zu Hydrolyse-anfällig war. Es konnte jedoch gezeigt werden, dass die Substitution des Thioesters durch eine nicht hydrolysierbare Amidbindung keinen Einfluss auf die Struktur hat, wodurch die Strukturbestimmung möglich war. Hierbei zeigte sich, dass die Peptid-beladene PCP in der sogenannten A/H state Konformation vorliegt, wobei das an sie gebundene Peptid frei beweglich ist. Somit scheint es wahrscheinlich, dass die PCP keine Selektivität für das an sie gebundene Peptid aufweist. Dies ist ein Unterschied zu den strukturell ähnlichen Acyl Carrier Proteinen (ACPs) aus der bakteriellen Fettsäurebiosynthese, da diese eine Bindungstasche für die an sie gebundenen Fettsäuren ausbilden.
Untersuchungen der Selektivität der Kondensationsdomäne (C Domäne) für das PCP gebundene Peptid mittels NMR-Titrationen und biochemischer Analysen konnten nicht durchgeführt werden, da sich im Laufe des Projekts zeigte, dass die aus der Synthetase herausgetrennte C Domäne katalytisch nicht aktiv war. Stattdessen sollte die Kristallstruktur einer Peptid-beladenen PCP-C Bidomäne, für welche eine katalytische Aktivität bereits gezeigt worden war, gelöst werden. Da aber bereits ein signifikanter Anteil der Bidomäne während der Expression mit dem Ppan-Arm beladen wurde, war die nötige quantitative Beladung mit dem Peptid gekoppelten Ppan-Arm in vitro nicht möglich. Eine quantitative Modifizierung mit dem Ppan-Arm in vitro war hingegen erfolgreich, und die Struktur der Ppan-beladenen Bidomäne konnte gelöst werden. Aufgrund des großen Abstands zwischen den aktiven Zentren der beiden Domänen kann es sich bei der beobachteten Orientierung nicht um jene handeln, die die beiden Domänen zueinander annehmen, wenn die C Domäne das PCP-gebundene Peptid bindet.
Im zweiten Teil der Arbeit wurde die Modifizierung einer PCP durch eine Gruppe II Phosphopantetheintransferase (PPT) untersucht. PPTs katalysieren die Übertragung des Ppan Arms auf die Seitenkette eines in PCPs konservierten Serins. In dieser Magnesium-abhängigen Reaktion dient Coenzym A (CoA) als Quelle für den Ppan-Arm. Durch Mutation des konservierten Serins in der PCP zu Alanin konnte ein stabiler Komplex aus PCP und PPT in Anwesenheit von CoA und Magnesium kristallisiert und seine Struktur bestimmt werden.
In einem Strukturmodell für den PCP/PPT Komplex war eine andere Konformation für die PCP postuliert worden, als sie in der Kristallstruktur des Komplexes zu beobachten ist. Durch Strukturbestimmung der PCP mittels Lösungs-NMR und anschließender Titrationsexperimente konnte jedoch gezeigt werden, dass sowohl die freie als auch die komplexierte PCP in Lösung ebenfalls die in der Kristallstruktur beobachtete Konformation einnehmen.
Aufgrund der gelösten Kristallstruktur konnten zwei Bereiche identifiziert werden, in denen die beiden Proteine im Komplex in direktem Kontakt zueinander stehen. Der eine Bereich ist durch eine intermolekulare Wasserstoffbrücke, der andere durch hydrophobe Wechselwirkungen zwischen den Proteinen gekennzeichnet. Durch ortsspezifische Mutagenese konnten beide Wechselwirkungen gestört werden, was sich in einer Abnahme der Komplexstabilität und einer veränderten Geschwindigkeit der Übertragung des Ppan-Arms äußerte.
Die große strukturelle Ähnlichkeit zwischen dem in dieser Arbeit untersuchten Komplex aus zwei in Bacillus vorkommenden Proteinen und einem humanen ACP/PPT Komplex legt die Vermutung nahe, dass die beobachteten Wechselwirkungen in vielen Organismen konserviert sind.
Observation and tracking of fluorescently labeled molecules and particles in living cells reveals detailed information about intracellular processes on the molecular level. Whereas light microscopic particle observation is usually limited to two-dimensional projections of short trajectory segments, we report here image-based real-time three-dimensional single particle tracking in an active feedback loop with single molecule sensitivity. We tracked particles carrying only 1-3 fluorophores deep inside living tissue with high spatio-temporal resolution. Using this approach, we succeeded to acquire trajectories containing several hundred localizations. We present statistical methods to find significant deviations from random Brownian motion in such trajectories. The analysis allowed us to directly observe transitions in the mobility of ribosomal (r)RNA and Balbiani ring (BR) messenger (m)RNA particles in living Chironomus tentans salivary gland cell nuclei. We found that BR mRNA particles displayed phases of reduced mobility, while rRNA particles showed distinct binding events in and near nucleoli.
A versatile synthetic procedure is described to prepare the benzimidazole-fused 1,2,4-thiadiazoles 2a–c via a methanesulfonyl chloride initiated multistep cyclization involving the intramolecular reaction of an in-situ generated carbodiimide with a thiourea unit. The structure of the intricate heterocycle 2a was confirmed by single-crystal X-ray analysis and its mechanism of formation supported by DFT computations.
Nach der Entdeckung und strukturellen Aufklärung des Ribosoms war bekannt, dass neben den Proteinen auch regulatorische RNA Sequenzen für die Steuerung biologischer Prozesse im Organismus verantwortlich sind. Dazu zählt unter anderem das trans-activation responsive element (TAR) aus HIV-1, welches am terminalen 5' Bereich (1-59) aller HIV-1 mRNAs eine identische bulge-loop Struktur ausbildet. Die basale Trans-kription des integrierten HIV Promotors ist in Abwesenheit des viralen trans-activator of transcription (Tat) sehr gering (und abhängig von zellulären Transkriptionsfaktoren). Sobald Tat exprimiert wird, bindet es zusammen mit dem humanen positive trancription elongation factor b (p-TEFb) spezifisch an TAR und aktiviert die Transkriptionsrate des viralen Genoms und die Bildung von volllängen Transkripten drastisch. Die Notwendigkeit der Tat-vermittelten Aktivierung als Grundlage einer funktionierenden HIV Replikation macht dieses System zu einem hoch interessanten Target für eine antivirale HIV Therapie. Basierend auf der Hemmung des Tat/TAR Komplexes wurde in den vergangen Jahren eine Reihe von Verbindungen identifiziert, die zwar in-vitro eine inhibierende Wirkung zeigten, aber keine von ihnen konnte bis jetzt als Therapeutikum Verwendung finden. So wäre die noch ausstehende Entdeckung eines effizienten Tat Antagonisten, der ohne die zelleigene Transkription zu beeinträchtigen eine Reduzierung der Virusreplikation von 80 - 90 % akut infizierter Zellen bewirkt, ein bedeutender Durchbruch in der HIV Forschung. Durch eine längere Behandlung von chronisch infizierten Zellen könnte so die Transkription des viralen Genoms abgeschaltet und dadurch eine Eliminierung latenter HIV Reservoirs ermöglichen werden.
Das Ziel dieser Arbeit war die Entwicklung neuartiger TAR Liganden, zunächst auf Grundlage eines nicht auf Strukturmodellen beruhenden Ligandenscreenings, gefolgt von einem strukturbasierten Ligandendesign. Bei der Suche nach potentiellen Wirkstoffen, beschränkte man die Auswahl der untersuchten Verbindungen auf Guanidin- und Amidinanaloga. Dazu zählten einfache Guanidinderivate mit unterschiedlichen aromatischen Resten sowie heterocyclische Verbindungen, wie Isochinoline, Chinazoline, Perimidine und Phenanthridine. Die Bindungsaffinitäten dieser Wirkstoffkandidaten in Bezug zu TAR wurden über einen FRET Assay nach Matsumoto[1] bestimmt. Eine Auswahl an Verbindungen wurde zudem über eine NMR Titration charakterisiert (AK Schwalbe). Dadurch konnte beobachtet werden, an welcher Position die Liganden mit der TAR RNA in Wechselwirkung treten. Bei diesen Untersuchungen zählten 1,7-
Diaminochinolin (IC50 = 150 µM), 2,4,6-Triaminochinazolin (IC50 = 40 µM) sowie 6,8-Diaminophenanthridin (IC50 = 15 µM) zu den aktivsten Verbindungen.
Um eine Aussage über die Bindungsposen treffen zu können, wurde mittels HF-docking Methoden die Komplexgeometrie energetisch optimiert. Ausgehend von diesen Bindungsmodellen entwickelte man eine Leitstruktur, die als Grundlage eines strukturbasierten Ligandendesigns diente. Im Fokus stand hierbei die Entwicklung einer GC-Basenpaar erkennenden Untereinheit. Mit 3,5-Diamino-9-methyl-3,4,9,10-tetrahydro-1H-pyrrolo[3,4-b]phenanthridin-8(2H)-on (IC50 = 45 µM) konnte ein Ligand identifiziert werden, der im NMR Titrationsexperiment ausschließlich am Basenpaar G26/C39 von TAR eine Verschiebung der Iminoprotonen induzierte. In einem weiteren Projekt versuchte man eine Selektivitätssteigerung durch simultane Adressierung zweier Bindungsstellen zu erreichen. Nachdem im NMR Experiment gezeigt werden konnte, dass 2,4,6-Triaminochinazolin mit hoher Affinität an zwei verschiedenen Bereichen der RNA bindet, wurden eine Reihe dimerer 2,4,6-Triaminochinazolinderivate mit unterschiedlich langen Linkern hergestellt. Mit diesem Ansatz gelang es den hoch affinen Liganden N6,N6'-(1,4-phenylenbis(methylen))bis(chinazolin-2,4,6-triamin) (IC50 = 150 nM) zu identifizieren.
Single-molecule super-resolution microscopy allows imaging of fluorescently-tagged proteins in live cells with a precision well below that of the diffraction limit. Here, we demonstrate 3D sectioning with single-molecule super-resolution microscopy by making use of the fitting information that is usually discarded to reject fluorophores that emit from above or below a virtual-'light-sheet', a thin volume centred on the focal plane of the microscope. We describe an easy-to-use routine (implemented as an open-source ImageJ plug-in) to quickly analyse a calibration sample to define and use such a virtual light-sheet. In addition, the plug-in is easily usable on almost any existing 2D super-resolution instrumentation. This optical sectioning of super-resolution images is achieved by applying well-characterised width and amplitude thresholds to diffraction-limited spots that can be used to tune the thickness of the virtual light-sheet. This allows qualitative and quantitative imaging improvements: by rejecting out-of-focus fluorophores, the super-resolution image gains contrast and local features may be revealed; by retaining only fluorophores close to the focal plane, virtual-'light-sheet' single-molecule localisation microscopy improves the probability that all emitting fluorophores will be detected, fitted and quantitatively evaluated.
Prostaglandin E2 (PGE2) favors multiple aspects of tumor development and immune evasion. Therefore, microsomal prostaglandin E synthase (mPGES-1/-2), is a potential target for cancer therapy. We explored whether inhibiting mPGES-1 in human and mouse models of breast cancer affects tumor-associated immunity. A new model of breast tumor spheroid killing by human PBMCs was developed. In this model, tumor killing required CD80 expression by tumor-associated phagocytes to trigger cytotoxic T cell activation. Pharmacological mPGES-1 inhibition increased CD80 expression, whereas addition of PGE2, a prostaglandin E2 receptor 2 (EP2) agonist, or activation of signaling downstream of EP2 reduced CD80 expression. Genetic ablation of mPGES-1 resulted in markedly reduced tumor growth in PyMT mice. Macrophages of mPGES-1-/- PyMT mice indeed expressed elevated levels of CD80 compared to their wildtype counterparts. CD80 expression in tumor-spheroid infiltrating mPGES-1-/- macrophages translated into antigen-specific cytotoxic T cell activation. In conclusion, mPGES-1 inhibition elevates CD80 expression by tumor-associated phagocytes to restrict tumor growth. We propose that mPGES-1 inhibition in combination with immune cell activation might be part of a therapeutic strategy to overcome the immunosuppressive tumor microenvironment.
Channelrhodopsin-2 (ChR2) is a cation-selective light-gated channel from Chlamydomonas reinhardtii (Nagel G, Szellas T, Huhn W, Kateriya S, Adeishvili N, Berthold P, et al. Channelrhodopsin-2, a directly light-gated cation-selective membrane channel. Proc Natl Acad Sci USA 2003;100:13940-5), which has become a powerful tool in optogenetics. Two-dimensional crystals of the slow photocycling C128T ChR2 mutant were exposed to 473 nm light and rapidly frozen to trap the open state. Projection difference maps at 6Å resolution show the location, extent and direction of light-induced conformational changes in ChR2 during the transition from the closed state to the ion-conducting open state. Difference peaks indicate that transmembrane helices (TMHs) TMH2, TMH6 and TMH7 reorient or rearrange during the photocycle. No major differences were found near TMH3 and TMH4 at the dimer interface. While conformational changes in TMH6 and TMH7 are known from other microbial-type rhodopsins, our results indicate that TMH2 has a key role in light-induced channel opening and closing in ChR2.
Translation fidelity and efficiency require multiple ribosomal (r)RNA modifications that are mostly mediated by small nucleolar (sno)RNPs during ribosome production. Overlapping basepairing of snoRNAs with pre-rRNAs often necessitates sequential and efficient association and dissociation of the snoRNPs, however, how such hierarchy is established has remained unknown so far. Here, we identify several late-acting snoRNAs that bind pre-40S particles in human cells and show that their association and function in pre-40S complexes is regulated by the RNA helicase DDX21. We map DDX21 crosslinking sites on pre-rRNAs and show their overlap with the basepairing sites of the affected snoRNAs. While DDX21 activity is required for recruitment of the late-acting snoRNAs SNORD56 and SNORD68, earlier snoRNAs are not affected by DDX21 depletion. Together, these observations provide an understanding of the timing and ordered hierarchy of snoRNP action in pre-40S maturation and reveal a novel mode of regulation of snoRNP function by an RNA helicase in human cells.
African trypanosomes cause a parasitic disease known as sleeping sickness. Mitochondrial transcript maturation in these organisms requires a RNA editing reaction that is characterized by the insertion and deletion of U-nucleotides into otherwise non-functional mRNAs. Editing represents an ideal target for a parasite-specific therapeutic intervention since the reaction cycle is absent in the infected host. In addition, editing relies on a macromolecular protein complex, the editosome, that only exists in the parasite. Therefore, all attempts to search for editing interfering compounds have been focused on molecules that bind to proteins of the editing machinery. However, in analogy to other RNA-driven biochemical pathways it should be possible to stall the reaction by targeting its substrate RNAs. Here we demonstrate inhibition of editing by specific aminoglycosides. The molecules bind into the major groove of the gRNA/pre-mRNA editing substrates thereby causing a stabilization of the RNA molecules through charge compensation and an increase in stacking. The data shed light on mechanistic details of the editing process and identify critical parameters for the development of new trypanocidal compounds.
Pulsed Electron Paramagnetic Resonance (EPR) spectroscopy is the most powerful tool to investigate structural properties and dynamics of paramagnetic substances. Up to date the electron spin is almost exclusively manipulated by rectangular shaped microwave pulses generated with switches. These pulses are unselective which means they excite outside their nominal bandwidth which is in most cases shallow compared to the overall spectral width of the spin system. Shaped pulses which are widely applied in NMR promise higher bandwidth and selectivity. The use of amplitude and phase modulated pulses was not possible for EPR due to the three orders of magnitude faster timescale compared to NMR. In this work, for the first time, an AWG (arbitrary waveform generator) operating with a 1 ns time resolution and 14 bit amplitude resolution was implemented into a commercial Bruker pulsed EPR spectrometer.
First results were obtained with broadband excitation pulses derived by optimum control theory (OCT). The OCT-pulse used excites transverse magnetization with 98% efficiency over a more than four times larger bandwidth than common rectangular pulse generating the same 1 B field. The benefit of such a pulse was demonstrated for magnitude FT-EPR spectroscopy on organic radicals in liquid phase.
Due to Spectrometer deadtime an FID cannot be observed for most inhomogeneous spin systems. For that reason prefocused pulses have been evaluated for their applicability to EPR spectroscopy. OCT-derived prefocused pulses can be understood as a compact Hahn Echo sequence in one monolithic pulse. Here, two problems have been encountered. 1) The limited bandwidth of the active and passive microwave components in the excitation path as well as microwave resonator cause linear distortions of the pulse shape which results in inferior pulse performance. This could be circumvented by measuring the impulse response function of the whole spin excitation path and including this information in the pulse optimization procedure. 2) Anisotropic hyperfine interaction which was not taken into account during the pulse optimization also caused efficiency losses.
PELDOR spectroscopy is a valuable tool to measure distance distributions between two or more paramagnetic centers in the range from 2-8 nm. It is demonstrated that the S/N ratio of PELDOR experiments can be substantially increased by substituting the rectangular shaped pump pulse by an adiabatic inversion pulse. The damping of the dipolar oscillations introduced by the prolonged pump pulse towards shorter distances could be circumvented by introducing a second time reversed pump pulse.
By substituting the refocused echo of the well-known 4-pulse PELDOR with a CPMG sequence the dipolar evolution time and thus the validity of PELDOR experiments would be increased. To achieve the maximum dipolar evolution time in a CPMG PELDOR for each refocusing pulse one pump pulse has to be applied. This could only be achieved with the new adiabatic inversion pulses since multiple inversions with efficiency close to one are not possible with rectangular pulses. Even with adiabatic pump pulses a reduced efficiency was observed due to hardware limitations thus limiting the sequence to three refocusing pulses. An iterative method was developed to remove the residual dipolar signals attributed to the reduced inversion efficiency.
The new 7-pulse CPMG PELDOR sequence enabled measuring reliable distance distributions between the protomers of the trimeric betaine transporter BetP. With these it could be shown that the asymmetries found for the 2 and 3-dimensional crystal structures are even larger in frozen detergent.
In dieser Arbeit wurden zwei Themenblöcke bearbeitet. Zum einen der Aufbau und die Charakterisierung des Kerr-Schalters, einer Anlage zur Messung von Fluoreszenz mit einer Zeitauflösung im Femtosekundenbereich. Zum anderen die Charakterisierung von pyrenmodifizierten Nukleobasen, sowie deren Anwendung in einem neomycinbindenden Aptamer.
In eukaryotic cells, mitochondria host ancient essential bioenergetic and biosynthetic pathways. LYR (leucine/tyrosine/arginine) motif proteins (LYRMs) of the Complex1_LYR-like superfamily interact with protein complexes of bacterial origin. Many LYR proteins function as extra subunits (LYRM3 and LYRM6) or novel assembly factors (LYRM7, LYRM8, ACN9 and FMC1) of the oxidative phosphorylation (OXPHOS) core complexes. Structural insights into complex I accessory subunits LYRM6 and LYRM3 have been provided by analyses of EM and X-ray structures of complex I from bovine and the yeast Yarrowia lipolytica, respectively. Combined structural and biochemical studies revealed that LYRM6 resides at the matrix arm close to the ubiquinone reduction site. For LYRM3, a position at the distal proton-pumping membrane arm facing the matrix space is suggested. Both LYRMs are supposed to anchor an acyl-carrier protein (ACPM) independently to complex I. The function of this duplicated protein interaction of ACPM with respiratory complex I is still unknown. Analysis of protein-protein interaction screens, genetic analyses and predicted multi-domain LYRMs offer further clues on an interaction network and adaptor-like function of LYR proteins in mitochondria.
DNA damage in oocytes induces a switch of the quality control factor TAp63α from dimer to tetramer
(2011)
TAp63a, a homolog of the p53 tumor suppressor, is a quality control factor in the female germline. Remarkably, already undamaged oocytes express high levels of the protein, suggesting that TAp63a’s activity is under tight control of an inhibitory mechanism. Biochemical studies have proposed that inhibition requires the C-terminal transactivation inhibitory domain. However, the structural mechanism of TAp63a inhibition remains unknown. Here, we show that TAp63a is kept in an inactive dimeric state. We reveal that relief of inhibition leads to tetramer formation with ~20-fold higher DNA affinity. In vivo, phosphorylation-triggered tetramerization of TAp63a is not reversible by dephosphorylation. Furthermore, we show that a helix in the oligomerization domain of p63 is crucial for tetramer stabilization and competes with the transactivation domain for the same binding site. Our results demonstrate how TAp63a is inhibited by complex domain-domain interactions that provide the basis for regulating quality control in oocytes.
Focus on quantum efficiency
(2014)
Technologies which convert light into energy, and vice versa, rely on complex, microscopic transport processes in the condensed phase, which obey the laws of quantum mechanics, but hitherto lack systematic analysis and modeling. Given our much improved understanding of multicomponent, disordered, highly structured, open quantum systems, this ‘focus on’ collection collects cuttingedge research on theoretical and experimental aspects of quantum transport in truly complex systems as defined, e.g., by the macromolecular functional complexes at the heart of photosynthesis, by organic quantum wires, or even photovoltaic devices. To what extent microscopic quantum coherence effects can (be made to) impact on macroscopic transport behavior is an equally challenging and controversial question, and this "focus on" collection provides a setting for the present state of affairs, as well as for the "quantum opportunities" on the horizon.
Glioblastoma multiforme (GBM) is a deadly primary brain malignancy. Glioblastoma stem cells (GSC), which have the ability to self-renew and differentiate into tumor lineages, are believed to cause tumor recurrence due to their resistance to current therapies. A subset of GSCs is marked by cell surface expression of CD133, a glycosylated pentaspan transmembrane protein. The study of CD133-expressing GSCs has been limited by the relative paucity of genetic tools that specifically target them. Here, we present CD133-LV, a lentiviral vector presenting a single chain antibody against CD133 on its envelope, as a vehicle for the selective transduction of CD133-expressing GSCs. We show that CD133-LV selectively transduces CD133+ human GSCs in dose-dependent manner and that transduced cells maintain their stem-like properties. The transduction efficiency of CD133-LV is reduced by an antibody that recognizes the same epitope on CD133 as the viral envelope and by shRNA-mediated knockdown of CD133. Conversely, the rate of transduction by CD133-LV is augmented by overexpression of CD133 in primary human GBM cultures. CD133-LV selectively transduces CD133-expressing cells in intracranial human GBM xenografts in NOD.SCID mice, but spares normal mouse brain tissue, neurons derived from human embryonic stem cells and primary human astrocytes. Our findings indicate that CD133-LV represents a novel tool for the selective genetic manipulation of CD133-expressing GSCs, and can be used to answer important questions about how these cells contribute to tumor biology and therapy resistance.
Coevolution of viruses and their hosts represents a dynamic molecular battle between the immune system and viral factors that mediate immune evasion. After the abandonment of smallpox vaccination, cowpox virus infections are an emerging zoonotic health threat, especially for immunocompromised patients. Here we delineate the mechanistic basis of how cowpox viral CPXV012 interferes with MHC class I antigen processing. This type II membrane protein inhibits the coreTAP complex at the step after peptide binding and peptide-induced conformational change, in blocking ATP binding and hydrolysis. Distinct from other immune evasion mechanisms, TAP inhibition is mediated by a short ER-lumenal fragment of CPXV012, which results from a frameshift in the cowpox virus genome. Tethered to the ER membrane, this fragment mimics a high ER-lumenal peptide concentration, thus provoking a trans-inhibition of antigen translocation as supply for MHC I loading. These findings illuminate the evolution of viral immune modulators and the basis of a fine-balanced regulation of antigen processing.
Heme-copper oxidases (HCOs) are the terminal enzymes of the aerobic respiratory chain in the inner mitochondrial membrane or the plasma membrane in many prokaryotes. These multi-subunit membrane protein complexes catalyze the reduction of oxygen to water, coupling this exothermic reaction to the establishment of an electrochemical proton gradient across the membrane in which they are embedded. The energy stored in the electrochemical proton gradient is used e.g. by the FOF1-ATP synthase to generate ATP from ADP and inorganic phosphate. The superfamily of HCOs is phylogenetically classified into three major families: A, B and C. The A-family HCOs, represented by the well-studied aa3-type cytochrome c oxidases (aa3-CcOs), are found in mitochondria and many bacteria. The B-family of HCOs contains a number of bacterial and archaeal oxidases. The C-family comprises only the cbb3-type cytochrome c oxidase (cbb3-CcO) and is most distantly related to the mitochondrial respiratory oxidases.
Die Suche nach neuen Zielmolekülen und Wirkstoffen für die Schmerztherapie ist eine unerlässliche Aufgabe, um Nebenwirkungen heutiger auf dem Markt befindlicher Schmerzmedikamente entgegenzuwirken. Ein vielversprechendes Ziel - als Alternative zu cyclooxigenasehemmenden Medikamenten (tNSDAIDs und Coxibe) - ist die mikrosomale Prostaglandin E-Synthase 1 (mPGES-1). In dieser Arbeit wurden zwei Substanzklassen rund um die Benzensulfonamid-Leitstruktur FR4 und die Quinazolinon-Leitstruktur FR20 aufgebaut. Die Benzensulfonamidklasse enthält 32 Derivate, die Klasse der Quinazolinone 24 Derivate. Beide Strukturklassen konnten durch chemische Modulation an verschiedenen Resten erweitert werden. Durch strukturelle Variationen konnte die Aktivität der FR4-Klasse von initial 14 µM auf 0,8 µM (FR4-Dev28) optimiert werden. In der FR20-Klasse konnten zahlreiche equipotente Derivate gefunden werden. Beide Klassen zeigten eine niedrige Toxizität (ab etwa 100 µM) und konnten auch auf zellulärer Ebene den PGE2-Level konzentrationsabhängig reduzieren. In humanen Vollblutversuchen wurde die Kreuzreaktivität dieser Substanzen auf andere Eicosanoide untersucht. Beide Klassen konnten auch hier den PGE2-Level reduzieren. Ein Prostanoidshunting in Folge der mPGES 1-Hemmung konnte dabei nicht festgestellt werden. Darüber hinaus wurde eine dualinhibitorische Funktion der Benzensulfonamide beobachtet. Neben der mPGES-1 wurde auch das 5LOX-vermittelte LTB2-Level reduziert. Dieser Effekt trat bei den Quinazolinonen nicht auf. Neben der humanen mPGES-1 wurde auch der Einfluss auf das murine Enzym untersucht. Dabei wurde festgestellt, dass die Hemmung von der Wahl der Klasse abhängt: Benzensulfonamide hemmen die murine mPGES-1, Quinazolinone nicht. Damit konnte erstmals eine Strukturklasse mit dualinhibitorischer (mPGES-1/5LOX) und speziesübergreifender Hemmung (human/murin) beschrieben werden. Untersuchungen an erstellten Homologie-Modellen der humanen und murinen mPGES-1 zeigten Unterschiede der Bindetaschen der beiden Spezies. PLIF-Analysen der beiden Strukturklassen deckten verschiedene Bindungsmuster auf. In vivo-Pharmakologische Untersuchungen von FR4-Dev6 zeigten eine sehr schnelle Resorption ins Blut (tMax = 10 min) sowohl nach intraperitonealer als auch nach oraler Applikation, gefolgt von einer raschen Verteilung in zahlreiche Organe. Hohe Konzentrationen wurden im Gastrointestinaltrakt und der Niere gemessen, beides Organe, in denen PGE2 eine physiologische Funktion ausübt. Die Konzentration fiel bereits nach 30 min in allen Organen wieder stark ab, ein basaler Level war aber noch nach sechs Stunden mit der eigens entwickelten LC-MS/MS-Methode detektierbar. Eine antiinflammatorische Wirkung in einem Zymosan-induzierten Entzündungsmodell konnte nicht bestätigt werden, da die gewählte Formulierung bereits den PGE2-Level stark reduzierte. Eine starke Akkumulation von FR4-Dev6 konnte aber im Pfotenödem gemessen werden. Die umfassende Charakterisierung der vorgestellten Substanzklassen hat neben grundlegenden Struktur-Aktivitätsbeziehungen neue Einsichten in die Wirkungsweise von mPGES-1-Inhibitoren geliefert. Diese Ergebnisse können in Zukunft für weitere Entwicklungen von neuartigen, verträglicheren Analgetika, Antiphlogistika und Antipyretika mit dem Zielmolekül mPGES-1 genutzt werden.
The NO/cGMP pathway inhibits Rap1 activation in human platelets via cGMP-dependent protein kinase I
(2005)
The NO/cGMP signalling pathway strongly inhibits agonist-induced platelet aggregation. However, the molecular mechanisms involved are not completely defined.We have studied NO/cGMP effects on the activity of Rap1, an abundant guanine-nucleotidebinding protein in platelets. Rap1-GTP levels were reduced by NO-donors and activators of NO-sensitive soluble guanylyl cyclase. Four lines of evidence suggest that NO/cGMP effects are mediated by cGMP-dependent protein kinase (cGKI): (i) Rap1 inhibition correlated with cGKI activity as measured by the phosphorylation state ofVASP, an established substrate of cGKI, (ii) 8-pCPT-cGMP, a membrane permeable cGMP-analog and activator of cGKI, completely blocked Rap1 activation, (iii) Rp- 8pCPT-cGMPS, a cGKI inhibitor, reversed NO effects and (iv) expression of cGKI in cGKI-deficient megakaryocytes inhibited Rap1 activation. NO/cGMP/cGKI effects were independent of the type of stimulus used for Rap1 activation.Thrombin-,ADPand collagen-induced formation of Rap1-GTP in platelets as well as turbulence-induced Rap1 activation in megakaryocytes were inhibited. Furthermore, cGKI inhibited ADP-induced Rap1 activation induced by the G a i -coupled P2Y12 receptor alone, i.e. independently of effects on Ca2+-signalling. From these studies we conclude that NO/cGMP inhibit Rap1 activation in human platelets and that this effect is mediated by cGKI. Since Rap1 controls the function of integrin a IIbß 3 , we propose that Rap1 inhibition might play a central role in the anti-aggregatory actions of NO/cGMP.
In this study, we describe the synthesis of 1,4-disustituted-1,2,3-triazolo-quinazoline ribonucleosides or acyclonucleosides by means of 1,3-dipolar cycloaddition between various O or N-alkylated propargyl-quinazoline and 1'-azido-2',3',5'-tri-O-benzoylribose or activated alkylating agents under microwave conditions. None of the compounds selected showed significant anti-HCV activity in vitro.
Die vorliegende Arbeit ist das Extrakt umfangreicher Untersuchungen an ausgewählten organischen und metallorganischen Verbindungen im Hinblick auf ihre Polymorphie. Nicht nur die praktischen Arbeiten, wie Synthesen, Polymorphie-Screenings (nach eigens entwickeltem Vorgehen), die chemisch-physikalischen Charakterisierungen neuer polymorpher Formen, sondern auch die Kristallstrukturbestimmungen aus Röntgenbeugungsdaten wurden durchgeführt. Im Fokus der Untersuchungen standen Pigmentvorprodukte, Pigmente, pharmazeutische Wirkstoffe und weitere organische und metallorganische Verbindungen.
Ein Auszug zu Pigmentvorprodukten bilden 2-Ammoniobenzolsulfonate, welche klassische Vorprodukte verlackter Hydrazonpigmente sind. Die bislang unbekannte tautomere Form und Kristallstruktur der CLT-Säure als Zwitterion konnte erfolgreich aus dem Zusammenspiel von IR-, Festkörper-NMR-Spektroskopie und Röntgen-Pulverdiffraktometrie ermittelt werden [1]. Mit Hilfe eines Polymorphie-Screenings konnten nicht nur zwei neue Pseudopolymorphe, sondern auch das Ansolvat der CLT-Säure selbst kristallisiert und ihre Strukturen aus Röntgen-Einkristalldaten bestimmt werden. Hierbei konnte das, aufgrund der Strukturbestimmung aus Röntgen-Pulverdaten proklamierten Tautomer der CLT-Säure verifiziert werden [2]. Mit Hilfe thermischer und röntgenographischer Untersuchungen an drei Derivaten der CLT-Säure, konnte der Einfluss des Substitutionsmusters (Chlor- und Methylsubstituenten) auf die Kristallpackung aufgezeigt werden [3]. Mit Hilfe eines Polymorphie-Screenings an der Iso-CLT-Säure konnten Reaktionen der zum Polymorphie-Screening eingesetzten Lösungsmittel und der Iso-CLT-Säure beobachtet und mittels thermischer und röntgenographischer Ergebnisse aufgeklärt werden. In zwei Fällen konnte eine Deprotonierung und im dritten Fall eine Desulfonierung beobachtet werden. Durch Erwärmen der deprotonierten und desulfonierten Verbindung(en) ist die Rückgewinnung der Iso-CLT-Säure möglich [4]. Ein Polymorphie-Screening an Pigment Red 53 lieferte vierundzwanzig neue Phasen, welche identifiziert und charakterisiert werden konnten. Ferner konnten von neun Phasen die Kristallstrukturen bestimmt werden (acht aus Röntgen-Einkristall- und eine aus Röntgen-Pulverdaten). Mit Hilfe dieser konnte ein Teil der Funktionalisierung von Lösungsmittelmolekülen in Pigment Red 53 aufgedeckt werden. Diverse Beziehungen pseudopolymorpher Formen zueinander konnten auf Basis der gewonnenen Erkenntnisse bestimmt werden [5]. Mit Hilfe der Ergebnisse aus den Untersuchungen zu Pigment Red 53 konnte mittels Modifizierung der bekannten Syntheseroute zu Pigment Red 53:2 die bekannte α-Phase erhalten werden. Weiterhin konnten neben zehn bekannten weitere fünfzehn neue Polymorphe identifiziert und weitestgehend charakterisiert werden. Die Kristallstrukturen von fünf bekannten und zwei neuen Phasen (sechs aus Röntgen-Einkristall- und eine aus Röntgen-Pulverdaten [6]) konnten bestimmt werden. Anhand der Ergebnisse aus den chemisch-physikalischen Charakterisierungen konnten Einzelbeziehungen zwischen den Phasen beobachtet werden. Die eigene Synthese von Pigment Red 57:1 resultierte in der bereits bekannten α-Phase. Ein Polymorphie-Screening an der α-Phase lieferte neben der bereits bekannten β-Phase elf neue Modifikationen. Schließlich konnte mit Hilfe der gesammelten Daten zur α-, β- und γ-Phase ein Zusammenhang zwischen De-/Rehydratation und dem damit einhergehenden Farbwechsel hergestellt und nachgewiesen werden [7]. Die bislang unbekannte Protonierung und Kristallstruktur von Nimustin-Hydrochlorid konnten erfolg-reich aus der Symbiose von Festkörper-NMR und Röntgen-Pulverdiffraktometrie des Handelsproduktes ermittelt werden [8]. Ebenso konnte die bislang unbekannte Kristallstruktur von 5′-Deoxy-5-fluorouridin konnte erfolgreich aus Röntgen-Pulverdaten des Handelsproduktes bestimmt werden [9]. Nach einem umfangreichen Polymorphie-Screening gelang es, Einkristalle von Tizanidin-Hydrochlorid zu erhalten und dessen Struktur aus Röntgen-Einkristalldaten zu bestimmen. Die bislang angenommene Tautomerie von Tizanidin im Festkörper und flüssiger Phase konnte mittels Röntgen-Einkristalldiffraktometrie und 1H-NMR korrigiert werden [10]. Während thermischer Untersuchungen wurden zwei bisher nicht beschriebene Polymorphe (ein Hochtemperatur- und ein Raumtemperaturpolymorph) gefunden. Schließlich konnte die Kristall-struktur des zweiten bei Raumtemperatur stabilen Polymorphs aus Röntgen-Pulverdaten bestimmt werden.
Es konnte die Kristallstruktur von 4,5,9,10-Tetramethoxypyren [11], eines neuen 2:1 Co-Kristalls aus Chinolin und Fumarsäure [12] und einer biradikalen Azoverbindung [13] aus Röntgen-Pulverdaten bestimmt werden. Neben diesen Verbindungen konnten aus analytischen und röntgenographischen Untersuchungen an ausgewählten Stereoisomeren von Inositol dreizehn neue Phasen erhalten werden. Zudem konnten mehrere Schmelzpunkte mittels DSC-Messungen korrigiert oder als Phasenübergänge oder Zersetzungs-punkte identifiziert werden. Acht Strukturen geordneter Phasen konnten aus Röntgen-Pulverdaten bestimmt werden. Zusätzlich konnten fünf der dreizehn Phasen als Rotatorphasen identifiziert und deren Elementarzelle ermittelt werden [14]. Auf Basis einer neuen Syntheseroute konnten ein Cobalt(II)- und ein Zink(II)-fumarat-Anhydrat, welche im Vergleich zu den bisher bekannten Hydraten besser wasser-löslich sind, erhalten werden. Diese Anhydrate konnten zur Kristallisation eingesetzt werden und lieferten alle bisher bekannten und zusätzlich drei neue Kristallphasen (zwei neue Cobalt(II)-fumarat-Hydrate und ein neues Zink(II)-fumarat-Hydrat). Die Kristallstrukturen der drei neuen Kristallphasen konnten aus Röntgen-Einkristalldaten bestimmt werden [15 und 16].
[1] S. L. Bekö, S. D. Thoms, J. Brüning, E. Alig, J. van de Streek, A. Lakatos, C. Glaubitz & M. U. Schmidt (2010), Z. Kristallogr. 225, 382–387; [2] S. L. Bekö, J. W. Bats & M. U. Schmidt (2012), Acta Cryst. C 68, o45–o50; [3] S. L. Bekö, C. Czech, M. A. Neumann & M. U. Schmidt. "Doubly substituted 2-ammonio-benzenesulfonates: Substituent influence on the packing pattern", eingereicht; [4] S. L. Bekö, J. W. Bats, E. Alig & M. U. Schmidt (2013), J. Chem. Cryst. 43, 655–663; [5] S. L. Bekö, E. Alig, J. W. Bats, M. Bolte & M. U. Schmidt. "Polymorphism of C.I. Pigment Red 53", eingereicht; [6] T. Gorelik, M. U. Schmidt, J. Brüning, S. Bekö & U. Kolb (2009), Cryst. Growth Des. 9, 3898–3903; [7] S. L. Bekö, S. M. Hammer & M. U. Schmidt (2012), Angew. Chem. Int. Ed. 51, 4735–4738 und Angew. Chem. 124, 4814–4818; [8] S. L. Bekö, D. Urmann, A. Lakatos, C. Glaubitz & M. U. Schmidt (2012), Acta Cryst. C 68, o144–o148; [9] S. L. Bekö, D. Urmann & M. U. Schmidt (2012), J. Chem. Cryst. 42, 933–940; [10] S. L. Bekö, S. D. Thoms, M. U. Schmidt & M. Bolte (2012), Acta Cryst. C 68, o28–o32; [11] M. Rudloff, S. L. Bekö, D. Chercka, R. Sachser, M. U. Schmidt, K. Müllen & M. Huth. "Structural and electronic properties oft he organic charge transfer system 4,5,9,10-tetramethoxypyrene - 7,7,8,8-tetracyanoquinodimethane", eingereicht; [12] S. L. Bekö, M. U. Schmidt & A. D. Bond (2012), CrystEngComm 14, 1967–1971; [13] S. L. Bekö, S. D. Thoms & M. U. Schmidt (2013), Acta Cryst. C 43, 1513–1515; [14] S. L. Bekö, E. Alig, M. U. Schmidt & J. van de Streek (2014), IUCrJ 1, 61–73; [15] S. L. Bekö, J. W. Bats & M. U. Schmidt (2009), Acta Cryst. C 65, m347–m351; [16] S. L. Bekö, J. W. Bats & M. U. Schmidt. "One-dimensional zinc(II) fumarate coordination polymers", akzeptiert.
Background: Advanced non-small cell lung cancer (NSCLC) represents a significant unmet medical need. Despite advances with targeted therapies in a small subset of patients, fewer than 20% of patients survive for more than two years after diagnosis. Cancer vaccines are a promising therapeutic approach that offers the potential for durable responses through the engagement of the patient's own immune system. CV9202 is a self-adjuvanting mRNA vaccine that targets six antigens commonly expressed in NSCLC (NY ESO-1, MAGEC1, MAGEC2, 5 T4, survivin, and MUC1).
Methods/Design: The trial will assess the safety and tolerability of CV9202 vaccination combined with local radiation designed to enhance immune responses and will include patients with stage IV NSCLC and a response or stable disease after first-line chemotherapy or therapy with an EGFR tyrosine kinase inhibitor. Three histological and molecular subtypes of NSCLC will be investigated (squamous and non-squamous cell with/without EGFR mutations). All patients will receive two initial vaccinations with CV9202 prior to local radiotherapy (5 GY per day for four successive days) followed by further vaccinations until disease progression. The primary endpoint of the study is the number of patients experiencing Grade >3 treatment-related adverse events. Pharmacodynamic analyses include the assessment of immune responses to the antigens encoded by CV9202 and others not included in the panel (antigen spreading) and standard efficacy assessments.
Discussion: RNActive self-adjuvanted mRNA vaccines offer the potential for simultaneously inducing immune responses to a wide panel of antigens commonly expressed in tumors. This trial will assess the feasibility of this approach in combination with local radiotherapy in NSCLC patients.
Antigenic and 3D structural characterization of soluble X4 and hybrid X4-R5 HIV-1 Env trimers
(2014)
Background: HIV-1 is decorated with trimeric glycoprotein spikes that enable infection by engaging CD4 and a chemokine coreceptor, either CCR5 or CXCR4. The variable loop 3 (V3) of the HIV-1 envelope protein (Env) is the main determinant for coreceptor usage. The predominant CCR5 using (R5) HIV-1 Env has been intensively studied in function and structure, whereas the trimeric architecture of the less frequent, but more cytopathic CXCR4 using (X4) HIV-1 Env is largely unknown, as are the consequences of sequence changes in and near V3 on antigenicity and trimeric Env structure.
Results: Soluble trimeric gp140 Env constructs were used as immunogenic mimics of the native spikes to analyze their antigenic properties in the context of their overall 3D structure. We generated soluble, uncleaved, gp140 trimers from a prototypic T-cell line-adapted (TCLA) X4 HIV-1 strain (NL4-3) and a hybrid (NL4-3/ADA), in which the V3 spanning region was substituted with that from the primary R5 isolate ADA. Compared to an ADA (R5) gp140, the NL4-3 (X4) construct revealed an overall higher antibody accessibility, which was most pronounced for the CD4 binding site (CD4bs), but also observed for mAbs against CD4 induced (CD4i) epitopes and gp41 mAbs. V3 mAbs showed significant binding differences to the three constructs, which were refined by SPR analysis. Of interest, the NL4-3/ADA construct with the hybrid NL4-3/ADA CD4bs showed impaired CD4 and CD4bs mAb reactivity despite the presence of the essential elements of the CD4bs epitope. We obtained 3D reconstructions of the NL4-3 and the NL4-3/ADA gp140 trimers via electron microscopy and single particle analysis, which indicates that both constructs inherit a propeller-like architecture. The first 3D reconstruction of an Env construct from an X4 TCLA HIV-1 strain reveals an open conformation, in contrast to recently published more closed structures from R5 Env. Exchanging the X4 V3 spanning region for that of R5 ADA did not alter the open Env architecture as deduced from its very similar 3D reconstruction.
Conclusions: 3D EM analysis showed an apparent open trimer configuration of X4 NL4-3 gp140 that is not modified by exchanging the V3 spanning region for R5 ADA.
Correlative microscopy incorporates the specificity of fluorescent protein labeling into high-resolution electron micrographs. Several approaches exist for correlative microscopy, most of which have used the green fluorescent protein (GFP) as the label for light microscopy. Here we use chemical tagging and synthetic fluorophores instead, in order to achieve protein-specific labeling, and to perform multicolor imaging. We show that synthetic fluorophores preserve their post-embedding fluorescence in the presence of uranyl acetate. Post-embedding fluorescence is of such quality that the specimen can be prepared with identical protocols for scanning electron microscopy (SEM) and transmission electron microscopy (TEM); this is particularly valuable when singular or otherwise difficult samples are examined. We show that synthetic fluorophores give bright, well-resolved signals in super-resolution light microscopy, enabling us to superimpose light microscopic images with a precision of up to 25 nm in the x-y plane on electron micrographs. To exemplify the preservation quality of our new method we visualize the molecular arrangement of cadherins in adherens junctions of mouse epithelial cells.
We review fluorescent probes that can be photoswitched or photoactivated and are suited for single-molecule localization based super-resolution microscopy. We exploit the underlying photochemical mechanisms that allow photoswitching of many synthetic organic fluorophores in the presence of reducing agents, and study the impact of these on the photoswitching properties of various photoactivatable or photoconvertible fluorescent proteins. We have identified mEos2 as a fluorescent protein that exhibits reversible photoswitching under various imaging buffer conditions and present strategies to characterize reversible photoswitching. Finally, we discuss opportunities to combine fluorescent proteins with organic fluorophores for dual-color photoswitching microscopy.
Physical Biology is a field of life sciences dealing with the extraction of quantitative data from biophysical or molecular biological experiments with different levels of complexity. Such data are further used as parameters for mathematical models of the biological system. These models allow to predict reactions on external stimuli by describing the relevant molecular interactions and are therefore used for example to generate a deeper comprehension of complex human diseases. An essential technique in biophysical research on human diseases is fluorescence microscopy. This is a constantly developed toolbox comprising a large number of specific labeling strategies, as well as a broad spectrum of fluorescent probes. It is further minimal invasive and therefore suitable for measurements in living cells or organisms. The sensitivity of modern photo-detectors even allows for the detection of a single fluorescent probe with an accuracy of approximately 10 nm.
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The model-prediction was further verified by two color SMLM experiments. In this work the development and application of imaging-systems are described which provide quantitative data with single-molecule resolution for systems biological model approaches with a low degree of abstractness. In the near future, the impact of mathematical models in the research field of complex human diseases will increase. The predictions of these models will be more exact, the more detailed and accurate the input parameters will become. This work gives an impression of how quantitative data obtained by SMLM may serve as input parameters for mathematical models at the single-cell level.
Bacteria have adapted their NhaA Na(+)/H(+) exchangers responsible for salt homeostasis to their different habitats. We present an electrophysiological and kinetic analysis of NhaA from Helicobacter pylori and compare it to the previously investigated exchangers from Escherichia coli and Salmonella typhimurium. Properties of all three transporters are described by a simple model using a single binding site for H(+) and Na(+). We show that H.pylori NhaA only has a small acidic shift of its pH-dependent activity profile compared to the other transporters and discuss why a more drastic change in its pH activity profile is not physiologically required.
5-Lipoxygenase (5LO) is a key enzyme in biosynthesis of leukotrienes (LTs), lipid mediators of inflammation. To study the roles of the 5LO accessory proteins coactosin-like protein (CLP) and 5LO-activating protein (FLAP), we knocked down these proteins in human monocytic cells. Our results show that expression of CLP was required for full cellular 5LO activity when cells were activated with Ca2+ ionophore, as well as with a physiological stimulus (lipopolysaccharide followed by N-formylmethionyl-leucyl-phenylalanine). During LT biosynthesis in stimulated cells, 5LO typically translocates to the nuclear membrane. This redistribution, from cytosolic to perinuclear, was clearly compromised in both CLP- and FLAP-deficient cells. Our results suggest that the CLP–5LO interaction may be a target for reduced LT production.
Channelrhodopsin-1 from Chlamydomonas augustae (CaChR1) is a light-activated cation channel, which is a promising optogenetic tool. We show by resonance Raman spectroscopy and retinal extraction followed by high pressure liquid chromatography (HPLC) that the isomeric ratio of all-trans to 13-cis of solubilized channelrhodopsin-1 is with 70:30 identical to channelrhodopsin-2 from Chlamydomonas reinhardtii (CrChR2). Critical frequency shifts in the retinal vibrations are identified in the Raman spectrum upon transition to the open (conductive P2(380)) state. Fourier transform infrared spectroscopy (FTIR) spectra indicate different structures of the open states in the two channelrhodopsins as reflected by the amide I bands and the protonation pattern of acidic amino acids.
Na+/H+ antiporters are integral membrane proteins that are present in almost every cell and in every kingdom of life. They are essential for the regulation of intracellular pH-value, Na+-concentration and cell volume. These secondary active transporters exchange sodium ions against protons via an alternating access mechanism, which is not understood in full detail. Na+/H+ antiporters show distinct species-specific transport characteristics and regulatory properties that correlate with respective physiological functions. Here we present the characterization of the Na+/H+ antiporter NhaA from Salmonella enterica serovar Thyphimurium LT2, the causing agent of food-born human gastroenteritis and typhoid like infections. The recombinant antiporter was functional in vivo and in vitro. Expression of its gene complemented the Na+-sensitive phenotype of an E. coli strain that lacks the main Na+/H+ antiporters. Purified to homogeneity, the antiporter was a dimer in solution as accurately determined by size-exclusion chromatography combined with multi-angle laser-light scattering and refractive index monitoring. The purified antiporter was fully capable of electrogenic Na+(Li+)/H+-antiport when reconstituted in proteoliposomes and assayed by solid-supported membrane-based electrophysiological measurements. Transport activity was inhibited by 2-aminoperimidine. The recorded negative currents were in agreement with a 1Na+(Li+)/2H+ stoichiometry. Transport activity was low at pH 7 and up-regulation above this pH value was accompanied by a nearly 10-fold decrease of KmNa (16 mM at pH 8.5) supporting a competitive substrate binding mechanism. K+ does not affect Na+ affinity or transport of substrate cations, indicating that selectivity of the antiport arises from the substrate binding step. In contrast to homologous E. coli NhaA, transport activity remains high at pH values above 8.5. The antiporter from S. Typhimurium is a promising candidate for combined structural and functional studies to contribute to the elucidation of the mechanism of pH-dependent Na+/H+ antiporters and to provide insights in the molecular basis of species-specific growth and survival strategies.
Characterization of mouse NOA1 : subcellular localizaion, G-Quadruplex binding and proteolysis
(2013)
Mitochondria contain their own protein synthesis machinery with mitoribosomes that are similar to prokaryotic ribosomes. The thirteen proteins encoded in the mitochondrial genome are members of the respiratory chain complexes that generate a proton gradient, which is the electromotoric force for ATP synthesis.
NOA1 (Nitric Oxide Associated Protein-1) is a nuclear encoded GTPase that positively influences mitochondrial respiration and ATP production. Although a role in mitoribosome assembly was assigned to NOA1 the underlying molecular mechanism is poorly understood. This work shows that the multi-domain protein NOA1 serves multiple purposes for the function of mitochondria. NOA1 is a dual localized protein that makes a detour through the nucleus before mitochondrial import. The nuclear shuttling is mediated by a nuclear localization signal and the now identified nuclear export signal. SELEX (Systemic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment) analysis revealed a G-quadruplex binding motif that characterizes NOA1 as ribonucleoprotein (RNP). G-quadruplex binding was coupled to the GTPase activity and increased the GTP hydrolysis rate. The sequence of localization events and the identification of NOA1 being a RNP lead to the discussion of an alternative import pathway for RNPs into mitochondria. The short-lived NOA1 contains ClpX recognition motifs and is specifically degraded by the mitochondrial matrix protease ClpXP. NOA1 is the first reported substrate of ClpXP in higher eukaryotes and augments the contribution of the ClpXP protease for mitochondrial metabolism. To assess the direct action of NOA1 on the mitoribosome co-sedimentation assays were performed. They showed that the interaction of NOA1 and the mitoribosome is dependent on the GTPase function and the nascent peptide chain. In vitro, NOA1 facilitated the membrane insertion of newly translated and isotope labeled mitochondrial translation products into inverted mitochondrial inner membrane vesicles. In conclusion, NOA1 is a G-quadruplex-RNP that acts as mitochondrial membrane insertion factor for mtDNA-encoded proteins.
This thesis provides a comprehensive model of the molecular function of NOA1 and is the basis for future research. The identification of NOA1 as ClpXP substrate is a major contribution to the field of mitochondrial research.
The human endothelin receptors, ETA and ETB, are two members of the G-protein coupled receptors family (GPCRs) and they are key players in cardiovascular regulation. The characterization of their functionality in vitro has been limited by the possibility to obtain high quality samples using conventional expression systems. The Cell-Free expression system is an alternative technique for the production of membrane protein as well as GPCRs and can overcome some of the limitations that are commonly encountered using an in vivo approach. Cell-Free expression protocols for the two receptors ETA and ETB have been optimized by implementing post- and co-translational association to lipid bilayers. The efficiency of the reconstitution or association to liposomes and nanodiscs has systematically been studied and the ligand binding properties of the two receptors have been analyzed using a set of different complementary techniques. In several different conditions a high affinity binding of the peptide ligand ET-1 to both endothelin receptors could be obtained and the highest activity values were detected in sample prepared using a co-translational approach in presence of nanodiscs. Furthermore, the characteristic differential binding pattern of selected agonists and antagonists to the two receptors was confirmed. In samples obtained from several Cell-Free expression conditions, two intrinsic properties of the functionally folded ETB receptor, such as the proteolytic processing based on conformational recognition as well as the formation of SDS-resistant complexes with the peptide ligand ET-1, were detected. ETA and ETB are able to induce in vivo the activation of hetrotrimeric G proteins upon stimulation with an agonist, leading to the dissociation of the heterotrimeric complex and the exchange of GDP to GTP in the Galpha subunit. The Cell-Free expression system was chosen for the production of two G alpha subunit, Galpha s and Galpha q. Soluble expression of the two proteins was achieved and the production of active Galpha s was confirmed using fluorescent as well as radioactive assays. In conclusion, the obtained results document a new process for the production of ligand binding competent endothelin receptors, as well as Galpha proteins, using a Cell-Free expression system. The combination of this expression system and the nanodiscs technology appears to be a promising tool for the further characterization of membrane proteins as well as GPCRs.
5-lipoxygenase (5-LO) is an enzyme with a substantial role in inflammatory processes. In vitro kinase assays using [32P]-ATP in combination with mutagenesis have revealed that serine residues 271, 523 and 663 can be phosphorylated by MK2, PKA and ERK2 kinases, respectively. A few available reports regarding 5-LO protein sequence have covered up to 30% of the sequence after amino acid sequencing including Ser663. In LCMS/MS analyses of 5-LO tryptic digests from different cellular sources different peptides have been detected; however, none of the three phosphorylations has been detected and only Ser663 was included in the covered sequence.
As there was no comprehensive mass spectrometric analysis of 5-LO, the purpose of this study was to optimize the experimental conditions under which detection of the aforementioned phosphorylation events, as well as other possible post-translational modifications (PTMs), would be feasible. Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization Mass Spectrometry (MALDI-MS) was used for peptide analysis of 5-LO cleaved either by chemical reagents or by proteases. Sequence coverage of 5-LO could be enhanced to be close to completion by combination of results from digestions by trypsin, AspN and chymotrypsin. In-gel trypsin digestion followed by in-solution AspN digestion proved to be a useful sample treatment for reproducible detection of the Ser271-containing peptide.
Nevertheless, in none of the examined cleavage protocols the sequence around Ser523 was detected reproducibly or with acceptable signal intensity for subsequent peptide fragmentation. Propionic anhydride and sulfo-NHS-SS-biotin cross-linker (EZ-linkTM), were used for derivatization of lysine side chains and hindrance of lysine residue recognition by trypsin. Phosphopeptide enrichment became possible after tryptic digestion of these samples, not only due to formation of an individual Ser523-containing peptide, but also because TiO2-mediated enrichment, which is performed in acidic pH, was not impaired by positively charged free lysine side chains. Additionally, biotinylation of lysine residues was exploited for an intermediate enrichment step of the lysine containing peptides, prior to TiO2 phosphopeptide enrichment.
MALDI-MS analysis after in-vitro phosphorylation of 5-LO by the three kinases showed that Ser271 was phosphorylated in the MK2 and PKA kinase assays, while Ser523 was phosphorylated only in the PKA kinase assay. Surpisingly, no phosphopeptides were detected in the in-vitro kinase assays with ERK2, even though the unmodified counterpart of the Ser663-containing peptide was easily detected. The detection limit for each of the three phosphorylation sites was determined by the use of custom made phosphopeptides and an amount of 0.06 pmol of phosphopeptide in 1 μg 5-LO (representing 0.5% phosphorylation rate) was sufficient in all cases for successful enrichment and detection by MS.
In-vitro kinase assays with [32P]-ATP were performed for some kinases that were expected to phosphorylate 5-LO according to in-silico data. Three members of the Src tyrosine kinase family (Fgr, Hck and Yes) and the Ser/Thr specific kinase DNA-PK used 5-LO as their substrate and mainly residues at the N-terminal part of 5-LO were detected phosphorylated by MS (e.g. Y42, Y53). Additional in-vitro assays for recombinant 5-LO modification included incubation with glutathione or compound U73122, previously described as inhibitor of 5-LO.
Since in-vitro assays might have generated artifacts, a method for 5-LO purification from human cells was sought, in order to examine the modification state of the protein in the cellular context. ATP-agarose affinity purification and anti-5-LO immunoprecipitation proved inappropriate for sample purification for MALDI-MS analysis. Consequently, two human cell lines that are able to express 5-LO (Rec-1 Blymphocytes and MM6 monocytes) were transduced with a DNA cassette that contained recombinant human 5-LO sequence with an attached N-terminal FLAG-tag. Anti-FLAG immunoprecipitation was then performed effectively in cell lysates and the precipitated FLAG-5-LO was separated by SDS-PAGE before MALDI-MS analysis.
The examined cell stimuli were expected to result to phosphorylation of 5-LO at Ser523 by PKA in Rec-1 cells and to phosphorylation of Ser271 and/or Ser663 in MM6 cells by activated MK2 and ERK2, respectively. Additionally, under the conditions of MM6 cell stimulation, Fgr, Hck and Yes kinases, which phosphorylated 5-LO in vitro, were expected to be activated and the possibility of 5-LO phosphorylation on tyrosine was investigated. Although immunoblotting results indicated that all the aforementioned phosphorylation events existed in the examined samples, MALDI-MS analysis verified only phosphorylation on Ser271 in differentiated MM6 cells, interestingly regardless of cell stimulation.
Finally, the primary amine derivatization procedure by EZ-linkTM was utilized for MS analysis of lysine rich proteins. In the past, chemical propionylation of histones had been employed prior to trypsin digestion; however it was easily confused in MS with combinations of other PTMs (e.g. acetylation, methylation). Moreover, propionylation is a PTM for histone H3 and this information was lost. Consequently, the EZ-link reagent was more useful for analysis of histones, as unambiguous assignment of PTMs and detection of native propionylation on bovine H3 became possible.
Transcription factor IIS (TFIIS) is a protein known for catalyzing the cleavage reaction of the 3′-end of backtracked RNA transcript, allowing RNA polymerase II (Pol II) to reactivate the transcription process from the arrested state. Recent structural studies have provided a molecular basis of protein-protein interaction between TFIIS and Pol II. However, the detailed dynamic conformational changes of TFIIS upon binding to Pol II and the related thermodynamic information are largely unknown. Here we use computational approaches to investigate the conformational space of TFIIS in the Pol II-bound and Pol II-free (unbound) states. Our results reveal two distinct conformations of TFIIS: the closed and the open forms. The closed form is dominant in the Pol II-free (unbound) state of TFIIS, whereas the open form is favorable in the Pol II-bound state. Furthermore, we discuss the free energy difference involved in the conformational changes between the two forms in the presence or absence of Pol II. Additionally, our analysis indicates that hydrophobic interactions and the protein-protein interactions between TFIIS and Pol II are crucial for inducing the conformational changes of TFIIS. Our results provide novel insights into the functional interplay between Pol II and TFIIS as well as mechanism of reactivation of Pol II transcription by TFIIS.
The YaeJ protein is a codon-independent release factor with peptidyl-tRNA hydrolysis (PTH) activity, and functions as a stalled-ribosome rescue factor in Escherichia coli. To identify residues required for YaeJ function, we performed mutational analysis for in vitro PTH activity towards rescue of ribosomes stalled on a non-stop mRNA, and for ribosome-binding efficiency. We focused on residues conserved among bacterial YaeJ proteins. Additionally, we determined the solution structure of the GGQ domain of YaeJ from E. coli using nuclear magnetic resonance spectroscopy. YaeJ and a human homolog, ICT1, had similar levels of PTH activity, despite various differences in sequence and structure. While no YaeJ-specific residues important for PTH activity occur in the structured GGQ domain, Arg118, Leu119, Lys122, Lys129 and Arg132 in the following C-terminal extension were required for PTH activity. All of these residues are completely conserved among bacteria. The equivalent residues were also found in the C-terminal extension of ICT1, allowing an appropriate sequence alignment between YaeJ and ICT1 proteins from various species. Single amino acid substitutions for each of these residues significantly decreased ribosome-binding efficiency. These biochemical findings provide clues to understanding how YaeJ enters the A-site of stalled ribosomes.
Tumor development usually follows predictable paths where tumor cells acquire common characteristics and features known as the hallmarks of cancer. Recently, additional characteristics have been added to these hallmarks since solid tumors are composed of a very heterogeneous population of transformed, formerly normal tissue cells and stromal cells, e.g. immune cells and fibroblasts. Compelling evidence suggests that stromal cells and tumor cells maintain a symbiotic relationship to build up the tumor microenvironment and to fuel tumor growth. In cancer therapies, common features of tumors such as unrestricted cell growth, suppression of immunological responses, and the ability to form new blood vessels (angiogenesis) have emerged as the main targets of interest. The lipid mediator prostaglandin E2 (PGE2) is known to promote all these features and thus, is connected to cancer progression in general. Its synthesis is triggered in response to stress factors or during inflammation. Inducible PGE2 production relies on the enzymes cyclooxygenase 2 (COX-2) and microsomal prostanglandin E synthase 1 (mPGES-1), which are simultaneously expressed in response to a variety of different stimuli and are functionally coupled. Inhibition of COX-2 with non-steroidal antiinflammatory drugs (NSAIDs) for cancer treatment is, however, limited by cardiovascular risks, since selective COX-2 inhibition disrupts the prostacyclin/thromboxane balance. Therefore targeting mPGES-1 downstream of COX-2 for PGE2 inhibition was evaluated in this work in different steps of carcinogenesis. Knockdown of mPGES-1 in DU145 prostate cancer cells revealed that the mPGES-1 status did not affect growth of monolayer tumor cells, but significantly impaired 3D growth of multi-cellular tumor spheroids (MCTS). Spheroid formation induced COX-2 in DU145 and other prostate cancer spheroids. High levels of PGE2 were detected in supernatants of DU145 MCTS as opposed to monolayer DU145 cells. Pharmacological inhibition of COX-2 and mPGES-1 confirmed the pivotal role of PGE2 for DU145 MCTS growth. Besides promoting spheroid growth, MCTS-derived PGE2 also inhibited cytotoxic T lymphocyte (CTL) activation. When investigating the mechanisms of COX-2 induction during spheroid formation, the typical tumor microenvironmental factors such as glucose deprivation, hypoxia or tumor cell apoptosis failed to enhance COX-2. Interestingly, when interfering with apoptosis in DU145 spheroids, the pan-caspase inhibitor Z-VAD-FMK triggered a Summary 12 shift towards necrosis, thus enhancing COX-2 expression. Coculturing viable DU145 monolayer cells with isolated heat-shocked-treated necrotic DU145 cells, but not with necrotic cell supernatants, induced COX-2 and PGE2, confirming the impact of necrosis for MCTS growth and CTL inhibition. As mentioned, in vivo tumors are very heterogenous mixtures of tumor cells and stromal cells e.g. immune cells. Hence, the interaction of the immune system with tumors was investigated in further experiments. When coculturing MCF-7 breast cancer spheroids with human peripheral blood mononuclear cells (PBMCs), only low levels of PGE2 were detected, since MCF-7 cells did not upregulate COX-2 during spheroid formation and did not induce PGE2 production by PBMCs. Under inflammatory conditions, by adding the toll-like receptor 4 (TLR4) agonist lipopolysaccharide (LPS) to cocultures, PGE2 production was triggered, spheroid sizes were reduced, and numbers of high levels of granzyme B expressing (GrBhi) CTLs were increased, while CD80 expression by tumor-associated phagocytes was also elevated. Inhibition of CD80 but not CD86 diminished numbers of GrBhi CTLs and attenuated spheroid lysis. To determine the role of ctivation-induced PGE2 production, use of the COX-2 inhibitor celecoxib and the experimental mPGES-1 inhibitor C3 further increased CD80 expression. Addition of PGE2, the prostaglandin E2 (EP2) receptor agonist butaprost, and the phosphodiesterase 4 (PDE4) inhibitor rolipram reduced LPS/C3-triggered CD80 expression, confirming the impact of COX- 2/mPGES-1-derived PGE2 on shaping phagocyte phenotypes in an EP2/cAMP-dependent manner. In a spontaneous breast cancer model (MMTV-PyMT), mPGES-1-deficiency significantly delayed tumor growth in mice, confirming an overall protumorigenic role of mPGES-1 in breast cancer development in vivo. However in tumors of mPGES-1-/- mice, tumor-infiltrating phagocytes expressed low levels of CD80 similar to their wildtype counterparts. These data suggest that the immunosuppressive microenvironment does not allow for immunostimulatory effects by mPGES-1 inhibition without an activating stimulus. Evidences in this study recommend the application of mPGES-1 inhibitors for treating cancer diseases, since mPGES-1 promotes tumor growth in multiple steps of carcinogenesis, ranging from well-characterized effects of tumor cell growth to immune suppression of CTL activity and phagocyte polarization. Regarding the latter, blunting PGE2 during immune activation may limit the tumor-favoring features of inflammation and improve the efficiency of TLR4 based immune therapies.
Im Mittelpunkt dieser Arbeit stand die Untersuchung der Reaktivität von Chlorsilanen gegenüber Elektronenpaardonoren. Als Basis hierfür diente die Alkylamin-katalysierte (NMe3, NMe2Et, NEt3) quantitative Disproportionierung von Si2Cl6 bzw. Si3Cl8 zum Neopentasilan 3 und SiCl4 (T ≤ RT, Schema 40). Obwohl diese Reaktion bereits seit über 60 Jahren bekannt ist, sind für ihren Mechanismus nur Vermutungen aufgestellt worden. In Kooperation mit der Gruppe um M. Holthausen ist es hier gelungen, das SiCl2-Amin-Addukt 57 als entscheidende Zwischenstufe zu identifizieren (1H29Si-HMBC-NMR-Experiment sowie DFT-Rechnungen). Si(SiCl3)4, die thermodynamische Senke des Systems, entsteht durch anschließende Insertion des Dichlorsilylens in Si−Cl-Bindungen – bevorzugt am höchst substituierten Si-Zentrum (es bilden sich keine linearen bzw. weniger verzweigten Oligosilane). Zudem lässt sich das koordinierte Amin vom SiCl2-Addukt wieder abspalten, was die Si(SiCl3)4-Synthese überhaupt erst ermöglicht. Dieses Verhalten unterscheidet sich grundlegend vom jenen literaturbekannter stabilisierter Chlorsilylene: hier bindet der Donor so stark an das Si-Atom, dass er den ambiphilen Charakter des Silylens zugunsten der Lewis-basischen Funktion einschränkt. Daher kann man mit diesen Addukten auch keine Oligosilane aufbauen, die mittlerweile auch das Interesse der chemischen Industrie erweckt haben...
In Nervensystemen werden zahlreiche Informationen wahrgenommen und verarbeitet um ein adäquates Verhalten hervorzurufen. Für die Untersuchung der funktionellen Zusammenhänge hierbei wurden verschiedene Methoden entwickelt, die eine gezielte Manipulation neuronaler Prozesse ermöglichen. Durch Analyse der resultierenden Effekte können dabei synaptische Proteine, einzelne Neuronen oder neuronale Netzwerke funktionell charakterisiert werden. Bisherige Ansätze verfügen jedoch nur über eine geringe zeitliche und räumliche Auflösung oder erlauben lediglich eine eingeschränkte Anwendung im frei beweglichen Tier.
Diese Nachteile können durch die heterologe Expression von lichtgesteuerten, mikrobiellen Rhodopsinen zur gezielten Manipulation des Membranpotentials umgangen werden. So induziert die Photoaktivierung des Kationenkanals Channelrhodopsin 2 (ChR2; (Nagel et al., Curr Biol 2005)) eine Depolarisation, während die Chloridpumpe Halorhodopsin (NpHR; (Zhang et al., Nature 2007)) für die Hyperpolarisation verwendet werden kann. Dabei ermöglichen die schnellen Kinetiken der Rhodopsine eine zeitlich präzise Steuerung des Membranpotentials. Durch Auswahl geeigneter Promotoren ist zudem oftmals eine zell spezifische Expression möglich. Dieser Ansatz wird daher allgemein als Optogenetik bezeichnet.
In der vorliegenden Arbeit wurden zunächst konventionelle Techniken genutzt, um die Funktion von zwei assoziierten Proteinen eines Acetylcholin Rezeptors in C. elegans zu untersuchen. Des Weiteren wurden verschiedene Methoden für den Fadenwurm entwickelt und angewendet, die die Vorteile optogenetischer Techniken für die funktionelle Charakterisierung synaptischer Proteine und neuronaler Netzwerke nutzbar machen. Hierbei erlaubt die Transparenz von C. elegans die optogenetische Stimulation im lebenden Organismus unter nicht invasiven Bedingungen. Weitere Vorteile von C. elegans als neurobiologischem Modellorganismus liegen in seiner einfachen Handhabung (Hope, 1999) und der stereotypen Entwicklung seines Nervensystems mit bekannten anatomischen Ausprägungen (Sulston and Horvitz, Dev Biol 1977; Varshney et al., PLoS Comput Biol 2011; White et al., Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci 1986). Durch ihre Häufigkeit und die experimentelle Zugänglichkeit wird hierbei die neuromuskuläre Synapse oftmals zur Erforschung der synaptischen Reizweiterleitung genutzt (Von Stetina et al., Int Rev Neurobiol 2006). Durch pharmakologische (Lewis et al., Neuroscience 1980; McIntire et al., Nature 1993; Miller et al., Proc Natl Acad Sci U S A 1996; Richmond and Jorgensen, Nat Neurosci 1999) und elektrische Stimulation (Richmond and Jorgensen, Nat Neurosci 1999) können dabei Defekte der Transmission hervorgehoben werden, während Verhaltensexperimente oder elektrophysiologische Messungen der post synaptischen Ströme in Muskelzellen eine quantitative Analyse ermöglichen (Richmond and Jorgensen, Nat Neurosci 1999).
Diese Methoden wurden für die funktionelle Charakterisierung von NRA 2 und NRA 4 verwendet, die beide als akzessorische Proteine zusammen mit dem Levamisol sensitiven Acetylcholin Rezeptor der Körperwandmuskelzellen aufgereinigt wurden (Gottschalk et al., EMBO J 2005). Dabei konnte gezeigt werden, dass NRA 2 und NRA 4 im Endoplasmatischen Retikulum (ER) der Muskelzellen einen Komplex bilden, der die Sensitivität von beiden nikotinischen Acetylcholin Rezeptoren gegenüber verschiedenen cholinergen Agonisten verändert. In diesem Zusammenhang wurde auch nachgewiesen, dass die Oberflächenexpression einzelner Untereinheiten der beiden Rezeptoren durch NRA 2/4 beeinflusst wird. Diese Resultate legen die Vermutung nahe, dass beide Proteine die Zusammensetzung der Rezeptoren und somit ihre pharmakologischen Eigenschaften modulieren. Denkbar ist dabei eine regulatorische Funktion bei der Assemblierung verschiedener Untereinheiten zu einem funktionellen Rezeptor oder bei der Kontrolle des ER Austritts von Rezeptoren mit bestimmter Zusammensetzung. In dieser Hinsicht konnte jedoch keine Interaktion von NRA 2/4 mit der Notch Signalkaskade nachgewiesen werden, wie sie für die homologen Proteine nicalin und NOMO in Vertebraten gezeigt wurde (Haffner et al., J Biol Chem 2007; Haffner et al., EMBO J 2004).
Für die Untersuchung synaptischer Proteine durch optogenetische Techniken wurde ChR2(H134R) selektiv in cholinergen oder GABAergen Motorneuronen exprimiert, um die akute und lichtgesteuerte Freisetzung des jeweiligen Neurotransmitters zu ermöglichen. Die resultierende Stimulation bzw. Inhibition von Muskelzellen wurde hierbei durch elektrophysiologische Messungen der post synaptischen Ströme und durch Analyse von Kontraktionen respektive Relaxationen untersucht. Dabei wurde gezeigt, dass Störungen der synaptischen Reizweiterleitung die Ausprägung und Dynamik dieser lichtinduzierten Effekte beeinflussen und dadurch charakterisiert werden können. So zeigten beispielsweise Mutanten von Synaptojanin und Endophilin nachlassende Effekte bei anhaltender oder wiederholter Stimulation, was durch die gestörte Regeneration synaptischer Vesikel erklärt werden kann (Harris et al., J Cell Biol 2000; Schuske et al., Neuron 2003; Verstreken et al., Neuron 2003).
Die hohe Sensitivität dieser Methode wurde im Nachfolgenden dazu verwendet, die Inhibition cholinerger Motorneuronen durch den metabotropen GABAB Rezeptor zu untersuchen, der in C. elegans aus den beiden Untereinheiten GBB 1 und GBB 2 gebildet wird (Dittman and Kaplan, J Neurosci 2008; Vashlishan et al., Neuron 2008). Dabei konnte zunächst gezeigt werden, dass diese heterosynaptische Inhibition verschiedene lokomotorische Verhaltensweisen der Tiere beeinflusst. Für die mechanistische Untersuchung wurden anschließend cholinerge Motorneuronen durch ChR2(H134R) photoaktiviert, während resultierende Kontraktionseffekte in Abhängigkeit von GBB 1/2 analysiert wurden. Um hierbei die Funktion von GBB 1/2 durch erhöhte GABA Konzentrationen hervorzuheben, wurden zusätzlich GABAerge Motorneuronen optogenetisch stimuliert oder die Wiederaufnahme von GABA aus dem synaptischen Spalt durch Mutation des Membran ständigen GABA Transporters blockiert. So konnte gezeigt werden, dass GBB 1/2 eine akute Inhibition der cholinergen Motorneuronen bewirken, was vermutlich für die Regulation von Bewegungsabläufen eine wichtige Rolle spielt. Die geringe Dynamik der GBB 1/2 induzierten Effekte deutet allerdings darauf hin, dass die synaptische Aktivität durch den metabotropen Rezeptor kaum nachhaltig moduliert wird.
In nachfolgenden Versuchen wurde die optogenetische Stimulation von Motorneuronen außerdem mit der elektronenmikroskopischen Analyse der präsynaptischen Feinstruktur kombiniert. Dadurch konnte die Dynamik der Exozytose und Endozytose synaptischer Vesikel (SV) in Abhängigkeit von neuronaler Aktivität untersucht werden. So wurde gezeigt, dass synaptische Vesikel nahe der aktiven Zone während einer 30 sekündigen Hyperstimulation nahezu komplett aufgebraucht waren. Die vollständige Regeneration der SV Pools benötigte anschließend etwa 12 Sekunden und erfolgte zunächst in der Peripherie der aktiven Zone, was auf eine laterale Heranführung der Vesikel schließen lässt. Nach etwa 20 Sekunden erholte sich ebenfalls die Wirksamkeit der Stimulation von Muskelzellen durch die Motorneuronen, was durch elektrophysiologische Messungen der photo induzierten post synaptischen Ströme gezeigt wurde. Während der Hyperstimulation bildeten sich außerdem große vesikuläre Strukturen, die sich anschließend nach etwa acht Sekunden wieder aufgelöst hatten. In Analogie zu vergleichbaren Experimenten in anderen Organismen liegt die Vermutung nahe, dass es sich dabei um Zwischenprodukte der so genannten Bulk Phase Endozytose handelt, die das Clathrin abhängige Recycling von synaptischen Vesikeln bei starker neuronaler Aktivität ergänzt (Heuser and Reese, J Cell Biol 1973; Miller and Heuser, J Cell Biol 1984; Richards et al., Neuron 2000). Bemerkenswerterweise war der Abbau der vesikulären Strukturen in Synaptojanin und Endophilin defizienten Tieren stark verzögert. Denkbar ist, dass beide Proteine für die Synthese von synaptischen Vesikeln aus den vesikulären Zwischenprodukten der Bulk Phase Endozytose wichtig sind, analog zur ihrer Funktion bei der Clathrin abhängigen Endozytose an der Plasmamembran.
Durch die zielgerichtete Manipulation der Zellaktivität ermöglichen optogenetische Techniken außerdem die funktionelle Charakterisierung von Neuronen und neuronalen Netzwerken. Um die zelluläre Spezifität dieses Ansatzes zu erhöhen, wurde ein Tracking System entwickelt das die Position frei beweglicher Tiere in Echtzeit bestimmt und nachverfolgt. Dadurch konnte die Photoaktivierung optogenetischer Proteine auf definierte Bereiche der Fadenwürmer und somit auf ausgewählte Neuronen innerhalb der Expressionsmuster von verwendeten Promotoren eingeschränkt werden. Des Weiteren ermöglichte hierbei die Auswertung translatorischer Parameter die Analyse verschiedener lokomotorischer Merkmale wie Geschwindigkeit, Bewegungsbahn oder Ausprägung der Körperbiegungen. Dieses System wurde beispielhaft für die konzertierte Photoaktivierung durch ChR2(H134R) bzw. Photoinhibition durch MAC von zwei verschiedenen Gruppen von Neuronen angewendet, um die Integration mechanosensorischer Informationen durch Command Interneuronen zu untersuchen. In diesem Zusammenhang wurde zudem eine Rekombinase basierte Methode für optogenetische Proteine adaptiert, die die Transkription auf die zelluläre Schnittmenge von zwei verschiedenen Promotoren einschränkt und somit die Spezifität der Expression erhöht. Idealerweise kann dieser Ansatz außerdem mit der gezielten Photoaktivierung kombiniert werden, um die zelluläre Selektivität optogenetischer Anwendungen weiter zu verbessern.
Weiterhin ist die Anwendung optogenetischer Techniken bisher durch intrinsische Eigenschaften der verwendeten Rhodopsine auf die relativ kurzzeitige Manipulation des Membranpotentials von Zellen beschränkt. So benötigt ChR2 durch die schnelle Schließung seines offenen Kanals eine kontinuierliche Photoaktivierung, um eine andauernde Depolarisation hervorzurufen. Dies ist jedoch potentiell mit phototoxischen und – besonders bei C. elegans – phototaktischen Nebeneffekten verbunden. Deswegen wurden diverse Mutanten von ChR2 mit stark verlangsamter Inaktivierung (Berndt et al., Nat Neurosci 2009) für ihren Nutzen zur Langzeit Stimulation von erregbaren Zellen im Nematode getestet. Dabei wurde gezeigt, dass ChR2(C128S) durch einen kurzen Photostimulus mit vergleichsweise niedriger Intensität eine anhaltende Depolarisation über mehrere Minuten auslösen kann. Die wiederholte Stimulation in ASJ Neuronen ermöglichte zudem eine langzeitige Depolarisation über mehrere Tage, wodurch die genetisch veranlagte Entwicklung von Tieren manipuliert werden konnte. Durch gezielte Punktmutation konnten außerdem relevante Eigenschaften von ChR2(C128S) für die Langzeit Stimulation weiter verbessert werden.
Als weiteres optogenetisches Werkzeug wurde zudem die Photoaktivierbare Adenylatzyklase alpha (PACa) aus Euglena gracilis (Iseki et al., Nature 2002; Ntefidou et al., Plant Physiol 2003; Schroder-Lang et al., Nat Methods 2007) für die akute und lichtgetriebene Synthese des sekundären Botenstoffs cAMP in C. elegans etabliert. Die Photoaktivierung von PACa in cholinergen Motorneuronen verstärkte dabei die Neurotransmitterfreisetzung und induzierte hyperlokomotorische Phänotypen, vergleichbar zu Mutanten mit erhöhten cAMP Konzentrationen.
Zusammengefasst wurden diverse optogenetische Techniken für C. elegans entwickelt und optimiert, die die zellspezifische und nicht invasive Manipulation des Membranpotentials beziehungsweise die Synthese des sekundären Botenstoffs cAMP durch Licht im frei beweglichen Tier ermöglichen. Diese Methoden können zur gezielten Störung neuronaler Aktivität angewendet werden, um dadurch neurobiologische Fragestellungen im Fadenwurm zu untersuchen. Dies wurde beispielhaft für die Erforschung der synaptischen Reizweiterleitung und die funktionelle Analyse neuronaler Netzwerke demonstriert. Denkbar ist außerdem, diese für C. elegans etablierten Methoden vergleichbar in anderen Modellorganismen anzuwenden. So sind die Fruchtfliege ebenso wie der Zebrafisch Embryo bereits für optogenetische Techniken erprobt (Arrenberg et al., Proc Natl Acad Sci U S A 2009; Schroll et al., Curr Biol 2006). Für Säugetiere wie die Maus, die Ratte und den Makaken wurden zudem bereits Ansätze entwickelt, die die gezielte Photostimulation in lebenden und frei beweglichen Tieren ermöglichen (Han et al., Neuron 2009; Wentz et al., J Neural Eng 2011; Yizhar et al., Nature 2011; Zhang et al., Nat Rev Neurosci 2007).
C-Typ Lektin-ähnliche Rezeptoren (CTLRs) auf Lymphozyten des Immunsystems modulieren deren Effektorfunktionen wie Zytotoxizität oder Zytokinsekretion. Die Gene dieser Immunrezeptoren befinden sich in einer definierten genomischen Region, dem Natürlichen Killer Genkomplex (NKC), welcher im Menschen auf Chromosom 12 und in der Maus auf Chromosom 6 lokalisiert ist. Namensgebend für diesen Gencluster ist die erste Beschreibung von CTLRs auf Natürlichen Killerzellen (NK-Zellen), den Effektorlymphozyten des angeborenen Immunsystems. Einige NKC-kodierte CTLR, insbesondere Vertreter der C-Typ Lektin Familie 2 (CLEC2)-Rezeptorfamilie, werden jedoch auch in nicht-lymphozytären Zellen (z.B. humanes KACL in Keratinozyten, Maus Clr-f in Darmepithelzellen) vorgefunden und in Zusammenhang mit einer gewebsspezifischen Immunüberwachung gebracht. Bemerkenswerterweise sind die Lymphozytenassoziierten Rezeptoren dieser CLEC2-Proteine ebenso CTLRs, welche zudem eng benachbart zu den CLEC2-Proteinen im NKC kodiert sind, sodass es sich um genetisch gekoppelte Rezeptor-Liganden-Paare mit immunologischer Funktion handelt.
Zu Beginn der vorliegenden Arbeit richtete sich das Interesse auf ein bislang uncharakterisiertes Mitglied der CLEC2-Proteinfamilie (CLEC2L), das jedoch außerhalb des NKC und in unmittelbarer Nachbarschaft zu einem weiteren und ebenso uncharakterisierten CTLR (KLRG2) kodiert ist. Im Unterschied zu anderen Mitgliedern der CLEC2-Familie ist CLEC2L (wie auch KLRG2) in Säugetieren hochkonserviert. Im Rahmen dieser Arbeit wurde der Frage nachgegangen, ob CLEC2L wie andere Mitglieder der CLEC2-Proteinfamilie eine gewebsspezifische Expression aufweist, mit einem genetisch gekoppelten CTLR, d. h. mit KLRG2, interagiert und funktionell in Verbindung mit dem Immunsystem gebracht werden kann. Ziel dieser Arbeit war es somit, eine detaillierte Expressions- und Funktionsstudie zu CLEC2L durchzuführen.
Mittels quantitativer Echtzeit-PCR und in situ Hybridisierung konnte CLEC2L-RNA im humanen und Maus-Gehirn nachgewiesen werden. Da die Mengen dort das Expressionsniveau in anderen Organen bei Weitem überstiegen, wurde das CLEC2L-kodierte Protein als BACL (engl. Brain-Associated C-type Lectin) neu benannt. Ektop exprimiertes BACL bildet ähnlich wie viele andere CLEC2-Mitglieder ein disulfid-verknüpftes Homodimer auf der Zellmembran von Säugetierzellen. Um die endogene Proteinexpression dieses gehirnassoziierten „Waisen"-Rezeptors zu charakterisieren, wurde die BACL-Ektodomäne rekombinant produziert und als Immunogen zur Herstellung BACLspezifischer Antikörper eingesetzt. Mit diesen Antikörpern und einer Kombination immunologischer Techniken wie Immunhistochemie, Immunfluoreszenz und Immunpräzipitation konnte die Präsenz von BACL auf humanen und Maus-Neuronen des Gehirns mit einer besonders ausgeprägten Expression in Purkinje-Zellen zum ersten Mal gezeigt werden. Neben dem Gehirn wurden andere Bereiche des Nervensystems, darunter Spinalganglien und Retina, auf die Expression des BACL-Proteins untersucht. Hierbei konnte mittels Immunfluoreszenz und hochauflösender konfokaler Mikroskopie gezeigt werden, dass BACL mit Neuronenmembranen assoziiert ist. Die durchflusszytometrische Analyse von in vitro kultivierten Neurosphären untermauerte die Expression von endogenem BACL als membranständiges Oberflächenprotein.
Diverse Ansätze zur Identifizierung von Interaktionspartnern von BACL erbrachten letztlich keine eindeutigen Ergebnisse. KLRG2 wurde ursprünglich aufgrund seiner benachbarten genomischen Lokalisation als möglicher Rezeptor von BACL favorisiert, jedoch konnten weder Reporterassays noch durchflusszytometriebasierte Bindungsanalysen eine Interaktion dieser beiden Proteine aufzeigen. Auch die aus den massenspektrometrischen Analysen von humanen und Maus BACL-Immunpräzipitaten erhaltenen Kandidatenproteine konnten letztendlich nicht als Interaktionspartner von BACL eindeutig verifiziert werden.
Eine mögliche immunologische Bedeutung von BACL in vivo wurde im Rahmen von Tumorimplantationsexperimenten mit BACL-exprimierenden Tumorzellen untersucht. Hierbei wurde das Tumorwachstum von BACL- mit Kontroll-Transfektanten in C57BL/6 Mäusen verglichen. Der beobachtete Effekt des verlangsamten Tumorwachstums nach BACL-Überexpression war jedoch nicht auf BACL-Erkennung durch Lymphozyten zurückzuführen, wie anhand von immundefizienten Rag1-k.o. und NOD-SCID-gammak.o. Mäusen gezeigt werden konnte.
Insgesamt liefert diese Arbeit die Erstbeschreibung des bislang uncharakterisierten CTLRs BACL. Das Protein teilt strukturelle Merkmale mit Mitgliedern der CLEC2-Familie, unterscheidet sich jedoch deutlich durch (i) seine hohe Konservierung in Säugetieren, (ii) seine Kodierung außerhalb des NKC und (iii) seine pan-neuronale Expression. Die Erkenntnis, dass BACL in Maus- und in humanen Neuronen exprimiert wird, wirft die Frage nach seiner funktionellen Relevanz auf. Als Membranprotein könnte es eine wichtige Rolle in der neuronalen Kommunikation und bei zellulären Kontakten spielen. Die Frage nach der Funktion von BACL wird in zukünftigen Forschungsarbeiten zu klären sein.
Structural determinants for substrate specificity of the promiscuous multidrug efflux pump AcrB
(2013)
Opportunistic Gram-negative pathogens such as Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae, Acinetobacter Baumanii and Pseudomonas aeruginosa are becoming more and more multiresistant against many commonly available antibiotics [39, 40]. An important resistance mechanism of Gram-negative bacteria is the efflux of noxious compounds by tripartite systems [39, 41-44]. The best studied and most clinically relevant tripartite system is the AcrA-AcrB-TolC system of Escherichia coli, where substrate recognition and energy transduction takes place in the inner membrane protein AcrB. AcrB has a remarkably huge substrate spectrum and can recognize structurally diverse molecules, such as hexan in contrast to erythromycin, as its substrates [45]. Therefore, overproduction of the tripartite system can render a Gram-negative pathogen resistant against multiple antibiotics at once. The mechanisms of how AcrB is able to recognize such an enormous spectrum of molecules as substrates, without compromising its specificity (e.g. by neglecting essential compounds like lipids or gluclose as its susbtates), remained puzzling. Structural insight into substrate specificity was so far limited to two co-crystal structures of AcrB, where minocycline and doxorubicin, respectively, were identified bound to an internal binding pocket of AcrB. This binding pocket is particularly deeply buried into internal parts of the T monomer of AcrB and was, therefore, denoted deep binding pocket (DBP). Analysis of several AcrB co-crystal structures with substrate molecules bound to the DBP [4, 23, 25] indicated that the substrate promiscuity involved multisite binding modes within the DBP. Multisite binding modes, where different substrate molecules can bind to slightly different positions and orientations to the same binding pocket, is a common feature of multidrug recognizing proteins such as QacR or BmrR [27-29]. Nevertheless, AcrB's substrate spectrum is much broader than substrate spectra of most other multidrug recognizing proteins. Therefore, it is likely that additional mechanisms are involved in mediating the observed high substrate promiscuity of AcrB. In our recently published high-resolution AcrB/doxorubicin co-crystal structure (pdb entry: 4DX7 [23]) we were able to identify two additional substrate binding pockets in the L monomer of AcrB: i) the access pocket (AP), with an opening towards the periplasm, and ii) a putative binding site in a groove between transmembrane helices 8 and 9 (TM8/TM9 groove), accessible from the lipid layer of the inner membrane. Both binding pockets are likely to be access sites for substrates towards AcrB. Furthermore, each of the binding pockets are possibly specialized to recognize a specific subset of the entire substrate spectrum of AcrB, i.e. highly hydrophobic substrates (e.g. n-dodecyl-ß-d-maltoside or sodium dodecylsulfate) might access AcrB towards the TM8/TM9 groove and water soluble substrates (e.g. berberine) might access AcrB towards the AP. Since substrates will accumulate in the membrane or the periplasm according to their hydrophilic or hydrophobic nature, substrates will be "pre-selected" by the medium, rather than by the protein itself, and guided to their appropriate access site. This process is proposed to be called "medium- mediated pre-selection". The AcrB/doxorubicin co-crystal structure (pdb entry: 4DX7 [23]) furthermore revealed that the AP and DBP are in next neighborhood to each other and are separated by a switch loop. This switch loop adopts distinct conformations in the L, T and O monomers. Specific switch loop conformations are strongly involved in coordinating the selective occupation of both binding pockets, the AP and the DBP. The conformation of the switch loop in the L monomer (L-switch loop) opens the AP and closes the DBP, whereas the conformation of the switch loop in the T monomer (T-switch Loop) opens the DBP and closes the AP. An analysis of all asymmetric AcrB structures indicated that the L-switch loop is able to adopt multiple distinct conformations, whereas the conformation of T-switch loop remained largely congruent in all crystal structures. Moreover, each distinct switch loop conformation, observed in co-crystal structures of AcrB with occupied AP [4, 23], was perfectly adapted to the bound substrate molecule. Therefore, the putatively flexible switch loop is likely to act as an adaptive module and mediates a high binding pocket plasticity without altering the global protein structure. This binding mode is called adaptor-mediated binding mechanism, where an flexible adaptive module (like the switch loop) is able to adapt the surface shape of an binding pocket to different substrate molecules. Furthermore, structural and biochemical analyses of an AcrB G616N variant, revealed the involvement of specific switch loop conformations in the substrate specificity of AcrB. A substitution of G616, located on the switch loop, to N616 was able to alter the conformation of the switch loop exclusively in the L monomers of AcrB, whereas the switch loop conformations in T and O monomers remained congruent to the conformations observed in crystal structures of wildtype AcrB. Moreover, cells producing the AcrB G616N and MexB, both bearing the G616N amino acid substitution, exhibited a reduced resistance against certain substrates, whereas the resistance against most other substrates remained on the level of wildtype AcrB. Correlations of the phenotypes with minimal projection areas, a novel 2-spatiodimensional parameter which approximates the size of a substrate molecule, revealed that AcrB variants with a G616N substitution have a reduced efflux activity for exclusively large substrate molecules. The rejection of large substrates is most likely connected with altered L-switch loop conformations....
Poster presentation at 1st International Workshop on Odor Spaces.
Mice are exceptional in their ability to capture their chemical environment, mapping the olfactory world into a basic sensory representation with over one thousand different types of chemical sensors, that is, olfactory sensory neurons (OSNs). OSNs of each type converge in the olfactory bulb onto exclusive distinct physiological areas called glomeruli. The glomeruli constitute the first relay station of olfactory stimulus representation in the mouse brain. Thus, the stimulus induced glomerular input pattern spatially embodies an important part of the sensory representation in the olfactory bulb. Still, topographic organization principles (chemotopy, tunotopy) are under debate. One reason might be that investigation are, due to experimental limitations, only performed on stimuli sets in the size of one hundred odors. But this represents only a tiny snapshot of the vast amount of molecules in the olfactory world and topographic relationships might be disguised in the incomplete representation of molecular receptive ranges (MRR). Therefore we investigated the problem with the MOR18-2 glomerulus as point of reference: First we determined it's MRR. Then, based on a measurement set covering this MRR, we elucidated the topographic embedding. It shows that MOR18-2 is embedded in a hierarchy of patchy tunotopic domains.
pH and Na+ homeostasis in all cells requires Na+/H+ antiporters. The crystal structure, obtained at pH 4, of NhaA, the main antiporter of Escherichia coli, has provided general insights into an antiporter mechanism and its unique pH regulation. Here, we describe a general method to select various NhaA mutants from a library of randomly mutagenized NhaA. The selected mutants, A167P and F267C are described in detail. Both mutants are expressed in Escherichia coli EP432 cells at 70–95% of the wild type but grow on selective medium only at neutral pH, A167P on Li+ (0.1 M) and F267C on Na+ (0.6 M). Surprising for an electrogenic secondary transporter, and opposed to wild type NhaA, the rates of A167P and F267C are almost indifferent to membrane potential. Detailed kinetic analysis reveals that in both mutants the rate limiting step of the cation exchange cycle is changed from an electrogenic to an electroneutral reaction.
1-(Bromomercurio)ferrocene
(2013)
The asymmetric unit of the title compound, [Fe(C5H5)(C5H4BrHg)], contains two independent molecules, A and B, in which the Hg-C bond lengths are 2.045 (6) and 2.046 (6) Å, the Hg-Br bond lengths are 2.4511 (9) and 2.4562 (7) Å, and the C-Hg-Br angles are 176.42 (17) and 177.32 (17)°. The two cyclopentadienyl rings of mol-ecule A are eclipsed, while those of mol-ecule B are almost staggered. The HgBr groups are connected by intermolecular Hg⋯Br contacts of 3.3142 (9)-3.4895 (11) Å, forming layers parallel to (001). These layers contain both four-membered (HgBr)2 and eight-membered (HgBr)4 rings. Ferrocene-ferrocene C-H⋯π contacts connect the molecular layers along the c-axis direction.
Metallorganische Netzwerke (engl. metal-organic frameworks, MOFs) sind eine neuartige Klasse mikro/mesoporöser Materialien, für die eine Vielzahl von möglichen Anwendungen demonstriert werden konnte. Das Ziel dieser Arbeit besteht in der Synthese von MOF Mikro/Nanopartikeln sowie der Herstellung von sogenannten Oberflächen-deponierten MOFs (engl. surface-attached metal-organic frameworks, SURMOFs). MOF Partikel mit kontrollierbarer Morphologie und Größe wurden unter milden Bedingungen synthetisiert. Um MOFs als Sensoren, intelligente Membrane, oder in nanotechnologischen Bauelementen verwenden zu können, ist die Integration auf der jeweiligen Oberfläche wichtig. Daher beschäftigt sich der Großteil dieser Arbeit mit der kontrollierten Abscheidung von SURMOFs auf verschiedenartigen Trägermaterialien. Etliche interessante Eigenschaften (z.B. die Fluoreszenz in Abhängigkeit von der Gegenwart von Gastmolekülen und die dynamische Gasadsorptionskapazität) der SURMOFs wurden untersucht.
Durch RNAinterferenz (RNAi) läßt sich die Expression eines beliebigen Gens spezifisch unterdrücken. Dafür müssen in das Zytoplasma kurze, doppelsträngige RNA Moleküle (siRNA bzw. shRNA) eingebracht werden, die teilweise komplementäre Sequenzen zu dem Zielgen aufweisen. Um siRNAs mit einer hohen Effizienz und Kopienzahl in die Zielzelle einzubringen, wurden Transfersysteme unterschiedlicher Art entwickelt. Nicht-virale Transfersysteme können nur einen transienten Effekt auslösen - ein Umstand, der für Langzeitstudien eine mehrfache Transfektion bedingt. Zur Lösung dieses Problems wurden retrovirale Vektorsysteme entwickelt, die durch Integration der shRNA-Expressionskassette in das zelluläre Genom eine stabile Unterdrückung eines Zielgens erreichen können. Insbesondere für präklinische Studien in vivo ist jedoch ein System mit erhöhter Transferrate wünschenswert, um in möglichst vielen Zielzellen einen RNAi-Effekt zu bewirken. Sliva et al. konnten zeigen, dass das Murine Leukämie Virus (MLV) theoretisch diese Anforderung erfüllt. Dafür wurde eine shRNA-Expressionskassette in das Virusgenom eingefügt und in vitro ein RNAi-Effekt nachgewiesen. In der vorliegenden Arbeit wurde dieses System nun durch die Verwendung von microRNA-adaptierten shRNAs (shRNAmir) verbessert. In mehreren Publikationen wurde bestätigt, dass shRNAs, die endogenen microRNAs nachempfunden sind, eine höhere Effizienz und niedrigere Toxizität aufweisen. Zunächst wurde die für die genetische Stabilität optimale Orientierung der shRNAmir-Expressionskassette bestimmt. Das Konstrukt in reverser Orientierung wies eine Deletion in der shRNAmir Promotersequenz auf, die wahrscheinlich durch Interferenz mit dem 5’LTR Promoter entstanden ist. Mit dem genetisch stabilen Viruskonstrukt wurden Experimente zur Reduktion der Expression von Markergenen durchgeführt, um die Effizienz der RNAi-Aktivität leicht zu quantifizieren. Dafür wurden humane Fibrosarkom (HT1080) Zellen infiziert, die eGFP oder Luziferase stabil exprimieren.
Mit eGFP- und Luziferase-spezifischen shRNAmir-Expressionskassetten konnte nach Infektion eine Herunterregulation von eGFP auf etwa 20 % und für Luziferase auf unter 10% beobachtet werden. Das Kontrollvirus, das eine unspezifische shRNAmir kodiert, hatte keinen Einfluss auf die Expression beider Markerproteine. Die Kinetik mit der die Markerproteine herrunterreguliert wurden, war abhängig von der Virusdosis. Die Virusdosis hatte aber keinen Einfluß auf die Stärke des RNAi-Effekts, der nach Infektion aller Zellen festgestellt werden konnte. Dieses Ergebnis entspricht der Erwartung an ein replikatives Transfersystems, das je nach applizierter Virusdosis unterschiedlich schnell RNAi in der Zellkultur ausbreitet und induziert. Die Anwendbarkeit dieses RNAi-Transfersystems auch für endogene Gene wurde mit MMP14-spezifischen shRNAmirs gezeigt. Nach Infektion von HT1080 Zellen mit den entsprechenden Viren in HT1080 Zellen konnte eine verringerte Menge an MMP14 mRNA und Protein nachgewiesen werden. Dies konnte funktionell durch eine verringerte Menge an intermediärem MMP2 und durch eine reduzierte Invasivität bestätigt werden. Zudem war die Fähigkeit dieser Zellen subkutane Tumore zu bilden stark eingeschränkt.
Um die Anwendbarkeit dieses Systems für in vivo Applikationen zu zeigen, wurde in Mäuse, die Luziferase-exprimierenden Tumoren trugen, MLV-shLuc oder das Kontrollvirus systemisch appliziert. 21 Tage nach Virusgabe konnte in den Tumoren von MLV-shLuc infizierten Mäusen eine Abnahme der Luziferaseaktivität auf 15 % nachgewiesen werden. Auch in Mäusen, die systemisch applizierte Tumorzellen erhielten, konnte eine Tendenz von RNAi-vermittelter Luziferase-Reduktion beobachtet werden.
Damit wurde in dieser Arbeit ein neuartiges RNAi-Transfersystem geschaffen, das in der Lage ist, auch in vivo einen starken und lang andauernden RNAi-Effekt auszulösen. Die Einzigartigkeit besteht in der Kombination von shRNAmir und Replikations-kompetenten Retroviren. Dadurch konnte eine erweiterte Transferrate von shRNAmir in Tumorzellen erreicht werden, so dass nun Genfunktionsstudien mit sehr hoher Aussagekraft möglich sind.
Organische Verbindungen sind für den Einsatz in der Elektronik und Optoelektronik von großem Interesse, da ihre Eigenschaften durch Derivatisierung gezielt verändert werden können. Eine vielversprechende Strategie ist hierbei der Einbau von Hauptgruppenelementen (z.B. Boratomen) in die Kohlenstoffgerüste.
Bislang fehlte jedoch ein detaillierter Vergleich der optischen und elektronischen Eigenschaften einer umfassend charakterisierten Kohlenwasserstoffspezies mit denen einer isostrukturellen Bor-dotierten Verbindung. In unserer Gruppe wird 9,10-Dihydro-9,10-diboraanthracen (DBA) als Bor-haltiger Baustein zum Aufbau lumineszierender Polymere genutzt. Das isostrukturelle Kohlenstoffanalogon zum DBA-Fragment stellt hierbei das Anthracen-Gerüst dar. Vor diesem Hintergrund wurden in dieser Arbeit die elektronischen, strukturellen und optischen Eigenschaften des DBA-Derivats 30 und des Anthracen-Derivats 31 umfassend untersucht und miteinander verglichen, wobei signifikante Unterschiede zwischen der Kohlenstoffverbindung 31 und dem Bor-dotierten Analogon 30 beobachtet wurden.
Das Ziel meiner Arbeit ist die zuverlässige quantenchemische Beschreibung der Absorptionsspektren von mittelgroßen Molekülen und das Studium von photoaktiven Pigmenten. Nach einer kurzen Einführung in das Thema "elektronisch angeregte Zustände und Photoreaktionen" beschreibe ich die Formalismen, die den verwendeten Rechenmethoden zu Grunde liegen und diskutiere die Anwendbarkeit auf größere Moleküle. Hierbei liegt ein Hauptaugenmerk auf den dichtefunktionaltheoriebasierten Methoden (DFT-Methoden), vor allem auf den Eigenschaften der zeitabhängigen Dichtefunktionaltheorie (engl.: time dependent density functional theory, TDDFT). Anschließend erfolgt eine Zusammenfassung der im Laufe dieser Arbeit erhaltenen Ergebnisse.
Die moderne Quantenchemie befasst sich mit der Anwendung der in den 20er und 30er Jahren des 20. Jahrhunderts entwickelten Quantenmechanik auf chemische Probleme. Zum theoretischen Studium von Molekülen gibt es verschiedene Ansätze. Zum einen gibt es die hochgenauen ab initio Methoden, die Näherungsverfahren zur elektronischen Schrödingergleichung sind. Sie haben den Vorteil systematisch verbesserbar und auf einem sehr soliden theoretischen Gerüst aufgebaut zu sein. Die Genauigkeit der Rechnungen kann die von experimentellen Ergebnissen erreichen, allerdings beschränkt der hohe Rechenaufwand die Anwendung solcher ab initio Methoden auf kleine Moleküle wie Wasser, Methan oder Benzol.
Am anderen Ende des Spektrums der quantenchemischen Methoden sind die "semiempirischen Methoden" angesiedelt. Sie erfordern nur einen sehr geringen Rechenaufwand, wodurch es möglich ist, sehr große Systeme mit mehr als 1000 Atomen zu beschreiben. Allerdings führt der Ansatz, verschiedene Terme der Schrödingergleichung durch an experimentelle Daten gefittete Parameter zu ersetzen, zu einer geringen Genauigkeit und unvorhersehbaren Fehlern. Dies schränkt die standardmäßige Anwendung dieser Methoden stark ein, und eine Verifizierung durch genauere Methoden ist oftmals erforderlich.
Zwischen diesen beiden Polen (hoch genau aber sehr hoher Rechenaufwand und geringer Rechenaufwand, dafür aber ungenau) stehen die auf der Dichtefunktionaltheorie (DFT) basierenden Methoden. Sie zeichnen sich durch eine gute Genauigkeit bei vergleichsweise geringem Rechenaufwand aus. Dadurch hat sich die DFT in den letzten Jahren zur beliebtesten Methode für das Studium mittelgroßer Moleküle mit bis zu 400 Atomen entwickelt. DFT ist eine formal exakte Methode, bei der die berechneten Größen aus der Elektronendichte des Systems abgeleitet werden. Elektronenaustausch- und Korrelationseffekte werden durch Funktionale, den sogenannten Austauschkorrelationsfunktionalen (engl.: exchange correlation functionals, xc-functionals) beschrieben.
Die zeitabhängige Dichtefunktionaltheorie (time dependent DFT, TDDFT) ermöglicht die Beschreibung elektronisch angeregter Zustände mit einer guten Genauigkeit, aber zu einem Bruchteil des Rechenaufwands von ab initio Methoden, was TDDFT zur Methode der Wahl für das Studium der Photochemie mittelgroßer Moleküle macht. Die Fehler in den Anregungsenergien sind in der Regel systematischer Natur und den verwendeten xc-funktionalen geschuldet. Dennoch kann TDDFT nicht als "black box" Methode verwendet werden, da nicht alle elektronischen Zustände gleich gut beschrieben werden. Während energetisch niedrig liegende, lokale π -> π* und n -> π* Zustände oftmals in sehr guter Übereinstimmung mit dem Experiment sind, können Rydberg und Ladungstransferzustände (engl.: charge transfer states, ct-states) Fehler von mehreren Elektronenvolt in der Anregungsenergie haben. Doppelt oder höher angeregte Zustände können mit standard TDDFT Methoden nicht beschrieben werden. Dies kann zu Problemen bei ausgedehnten π-Systemen führen, da z.B. die angeregten Zustände von Polyenen einen hohen Doppelanregungscharakter besitzen. Trotz alledem ist TDDFT eine sinnvolle Methode zum Studium elektronisch angeregter Zustände, da ihre Probleme bekannt sind und vor allem ihr Ursprung in der Theorie gut verstanden ist. Die meisten Probleme können durch die intelligente Wahl der verwendeten xc-Funktionale vermieden werden. Kombiniert man TDDFT mit der Konfigurationswechselwirkungsmethode mit Einfachanregungen (engl.: configuration ineraction singles, CIS) erhält man sehr zuverlässig und mit vergleichbar geringem Rechenaufwand die richtige Energiereihenfolge der angeregten Zustände. Mit dieser Methode war es in dieser Arbeit möglich, die komplexe Photochemie von Bisazomethinpigmenten zu untersuchen und die experimentellen statischen und zeitaufgelösten Spektren auf molekularer Ebene zu interpretieren. Es konnte sowohl der Mechanismus aufgeklärt werden, der für die Fluoreszenzlöschung in den nicht-fluoreszierenden Derivaten verantwortlich ist, als auch die unerwartet komplizierte Photochemie der fluoreszierenden Moleküle schlüssig erklärt werden. Auch die Photoisomerisierung von Z-Hemithioindigo-Hemistilbene (HTI) zu seine E-Form wurde mit dieser Methode untersucht.