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Im Kindes- und Jugendalter gehoert das Rhabdomyosarkom zu den haeufigsten Weichteilsarkomen. Bisher belaeuft sich das Therapieverfahren auf chirurgische Entfernung, gefolgt von Chemotherapie, bzw. bei nicht-operablen Faellen auf Radiotherapie und Chemotherapie, jedoch haben sich die Ueberlebenschancen fuer Patienten mit einer Erkrankung in metastasiertem oder rezidiviertem Stadium trotz intensiver Forschung ueber mehrere Jahrzehnte hinweg kaum gebessert und bleiben bei unter 30%. Neue therapeutische Strategien versuchen das Immunsystem des Patienten zu modulieren und dieses gezielter oder aggressiver gegen Tumorzellen zu machen. Nebst direkter Injektion von Zytokinen oder Antikoerpern bietet die adoptive Immunzelltherapie einen vielversprechenden Ansatz. In der vorliegenden Arbeit lag der Fokus auf Natuerlichen Killer- (NK) Zellen, da diese ein hohes zytotoxisches Potential gegenueber Tumorzellen aufweisen. Eine der groessten Herausforderungen der NK-Zellforschung ist die Breitstellung ausreichender Mengen an NK-Zellen mit optimaler antitumoraler Funktion fuer den klinischen Einsatz. Viele aktuell erprobte NK-Zellexpansionsstrategien basieren auf der Verwendung von Hilfs- oder Feeder-Zellen (Versorgerzellen), die jedoch vor der Applikation in Patienten aus dem finalen Produkt entfernt werden muessen. In der vorliegenden Arbeit sollten Feeder-zellfreie NK-Zellexpansionsprotokolle unter Verwendung von Gammakettenzytokinen getestet werden.
Interleukin (IL-) 15 erwies sich dabei vor allem fuer die Vermehrung der NK-Zellen als besonders foerderlich. Im Vergleich dazu fielen die Expansionsraten mit IL-2 oder IL-21 geringer aus. Interessanterweise wurde der expansionsfoerdernde Effekt von IL-15 durch dauerhafte Anwesenheit von IL-21 im Kulturmedium gehemmt. Ein kurzer, dreitaegiger IL-21-Boost am Ende der Expansionsphase wirkte sich wiederum positiv auf die NK-Zellexpansionsraten aus. Zudem zeigte sich durch IL-21 ein vermehrtes Auftreten von NK-Zellen des reiferen CD16posCD56dim Phaenotyps, der die zytotoxische Funktion vermittelt. Bei Degranulationsuntersuchungen wurden eine IL-21-induzierte Exozytoseaktivitaet und die vermehrte Ausschuettung von Perforin und Granzym B, welche Apoptose in den Zielzellen ausloesen, beobachtet. Vor allem der dreitaegige Boost mit IL-21 bewirkte eine gesteigerte Zytotoxizitaet gegenueber Tumorzellen, insbesondere gegenueber Rhabdomyosarkomzellen.
Auf dieser Grundlage bot es sich an fuer die NK-Zellexpansion ein Zwei-Phasen-Protokoll anzuwenden, bestehend aus einer initialen Proliferationsphase mit IL-15 und einem anschliessendem IL-21-Boost, durch den die antitumorale Funktionalitaet der NK-Zellen gesteigert wurde. Dieses IL-15+21boost-Protokoll wurde mit anderen Kombinationen aus den Gammakettenzytokinen IL-2, IL-15 und IL-21 verglichen und stellte sich hinsichtlich der NK-Zellexpansionsraten, der Degranulationskapazitaet und der damit verbundenen Zytotoxizitaet als den anderen Protokollen ueberlegen heraus.
Zytokinexpandierte NK-Zellen zeigten eine hoehere Rezeptorexpression an ihren Oberflaechen als unstimulierte Zellen. Die Expansion mit dem IL-15+21boost-Protokoll bewirkte die hoechste Dichte des Todesrezeptors TRAIL, jedoch auch der inhibitorischen KIR2D-Rezeptorfamilie. Fuer andere Oberflaechenmarker ergab sich jeweils eine mittlere Expressionsdichte verglichen mit dem IL-15- bzw. dem IL-15+21-Expansionsprotokoll. Die Sekretion von proinflammatorischen Zytokinen wie Interferon-gamma (IFN-g) und Tumor-Nekrose-Faktor-alpha (TNF-a) wurde zudem verstaerkt durch IL-21 angeregt, aber ebenso die Sekretion des immunsupprimierenden IL-10.
Weiter wurden die zytoinexpandierten NK-Zellen zur UEberpruefung ihrer in vivo Funktionalitaet anhand eines praeklinischen Xenograftmodells unter Verwendung von NOD SCID IL-2-Rgamma-/- (NSG) Maeusen und der Technologie der in-vivo-Biolumineszenzbildgebung getestet. Dabei konnte beobachtet werden, dass die NK-Zellen das Wachstum luciferaseexprimierender humaner Rhabdomyosarkome verlangsamten. Die Wirksamkeit der IL-15+21boost-expandierten NK-Zellen zeigte sich vor allem in einem kombinierten Ansatz, bei dem die Tumore zunaechst mit ionisierender Strahlung behandelt wurden und residuale Rhabdomyosarkomzellen anschliessend durch den adoptiven Transfer von humanen NK-Zellen in ihrem Wachstum gehemmt waren, solange die NK-Zelltherapie andauerte. Somit stellte sich die Kombination aus Bestrahlung und NK-Zelltransfer als wirksamer im Einsatz gegen Rhabdomyosarkome heraus als die alleinige Behandlung der Tumore durch Radiotherapie.
Zusammengefasst konnte in dieser Arbeit ein NK-Zellexpansionsprotokoll entwickelt werden, dass durch den ausschliesslichen Einsatz von Gammakettenzytokinen zu einem funktionalen NK-Zellprodukt fuehrte, welches auch in vivo lytische Aktivitaet gegenueber Rhabdomyosarkomzellen aufwies.
High-risk rhabdomyosarcoma (RMS) occurring in childhood to young adulthood is associated with a poor prognosis; especially children above the age of 10 with advanced stage alveolar RMS still succumb to the disease within a median of 2 years. The advent of chimeric antigen receptor (CAR)-engineered T cells marked significant progress in the treatment of refractory B cell malignancies, but experience for solid tumors has proven challenging. We speculate that this is at least in part due to the poor quality of the patient's own T cells and therefore propose using CAR-modified cytokine-induced killer (CIK) cells as effector cells. CIK cells are a heterogeneous population of polyclonal T cells that acquire phenotypic and cytotoxic properties of natural killer (NK) cells through the cultivation process, becoming so-called T-NK cells. CIK cells can be genetically modified to express CARs. They are minimally alloreactive and can therefore be acquired from haploidentical first-degree relatives. Here, we explored the potential of ERBB2-CAR-modified random-donor CIK cells as a treatment for RMS in xenotolerant mice bearing disseminated high-risk RMS tumors. In otherwise untreated mice, RMS tumors engrafted 13–35 days after intravenous tumor cell injection, as shown by in vivo bioluminescence imaging, immunohistochemistry, and polymerase chain reaction for human gDNA, and mice died shortly thereafter (median/range: 62/56–66 days, n = 5). Wild-type (WT) CIK cells given at an early stage delayed and eliminated RMS engraftment in 4 of 6 (67%) mice, while ERBB2-CAR CIK cells inhibited initial tumor load in 8 of 8 (100%) mice. WT CIK cells were detectable but not as active as CAR CIK cells at distant tumor sites. CIK cell therapies during advanced RMS delayed but did not inhibit tumor progression compared to untreated controls. ERBB2-CAR CIK cell therapy also supported innate immunity as evidenced by selective accumulation of NK and T-NK cell subpopulations in disseminated RMS tumors, which was not observed for WT CIK cells. Our data underscore the power of heterogenous immune cell populations (T, NK, and T-NK cells) to control solid tumors, which can be further enhanced with CARs, suggesting ERBB2-CAR CIK cells as a potential treatment for high-risk RMS.
A central motivation for the development of x-ray free-electron lasers has been the prospect of time-resolved single-molecule imaging with atomic resolution. Here, we show that x-ray photoelectron diffraction—where a photoelectron emitted after x-ray absorption illuminates the molecular structure from within—can be used to image the increase of the internuclear distance during the x-ray-induced fragmentation of an O2 molecule. By measuring the molecular-frame photoelectron emission patterns for a two-photon sequential K-shell ionization in coincidence with the fragment ions, and by sorting the data as a function of the measured kinetic energy release, we can resolve the elongation of the molecular bond by approximately 1.2 a.u. within the duration of the x-ray pulse. The experiment paves the road toward time-resolved pump-probe photoelectron diffraction imaging at high-repetition-rate x-ray free-electron lasers.
The consequences of the current COVID-19 pandemic for mental health remain unclear, especially regarding the effects on suicidal behaviors. To assess changes in the pattern of suicide attempt (SA) admissions and completed suicides (CS) in association with the COVID-19 pandemic. As part of a longitudinal study, SA admissions and CS are systematically documented and analyzed in all psychiatric hospitals in Frankfurt/Main (765.000 inhabitants). Number, sociodemographic factors, diagnoses and methods of SA and CS were compared between the periods of March–December 2019 and March–December 2020. The number of CS did not change, while the number of SA significantly decreased. Age, sex, occupational status, and psychiatric diagnoses did not change in SA, whereas the percentage of patients living alone while attempting suicide increased. The rate and number of intoxications as a SA method increased and more people attempted suicide in their own home, which was not observed in CS. Such a shift from public places to home is supported by the weekday of SA, as the rate of SA on weekends was significantly lower during the pandemic, likely because of lockdown measures. Only admissions to psychiatric hospitals were recorded, but not to other institutions. As it seems unlikely that the number of SA decreased while the number of CS remained unchanged, it is conceivable that the number of unreported SA cases increased during the pandemic. Our data suggest that a higher number of SA remained unnoticed during the pandemic because of their location and the use of methods associated with lower lethality.
Natural killer (NK) cells are a promising tool for the use in adoptive immunotherapy, since they efficiently recognize and kill tumor cells. In this context, ex vivo cultivation is an attractive option to increase NK cells in numbers and to improve their antitumor potential prior to clinical applications. Consequently, various strategies to generate NK cells for adoptive immunotherapy have been developed. Here, we give an overview of different NK cell cultivation approaches and their impact on shaping the NK cell antitumor activity. So far, the cytokines interleukin (IL)-2, IL-12, IL-15, IL-18, and IL-21 are used to culture and expand NK cells. The selection of the respective cytokine combination is an important factor that directly affects NK cell maturation, proliferation, survival, distribution of NK cell subpopulations, activation, and function in terms of cytokine production and cytotoxic potential. Importantly, cytokines can upregulate the expression of certain activating receptors on NK cells, thereby increasing their responsiveness against tumor cells that express the corresponding ligands. Apart from using cytokines, cocultivation with autologous accessory non-NK cells or addition of growth-inactivated feeder cells are approaches for NK cell cultivation with pronounced effects on NK cell activation and expansion. Furthermore, ex vivo cultivation was reported to prime NK cells for the killing of tumor cells that were previously resistant to NK cell attack. In general, NK cells become frequently dysfunctional in cancer patients, for instance, by downregulation of NK cell activating receptors, disabling them in their antitumor response. In such scenario, ex vivo cultivation can be helpful to arm NK cells with enhanced antitumor properties to overcome immunosuppression. In this review, we summarize the current knowledge on NK cell modulation by different ex vivo cultivation strategies focused on increasing NK cytotoxicity for clinical application in malignant diseases. Moreover, we critically discuss the technical and regulatory aspects and challenges underlying NK cell based therapeutic approaches in the clinics.