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Background: Cancer gene therapy will benefit from vectors that are able to replicate in tumor tissue and cause a bystander effect. Replication-competent murine leukemia virus (MLV) has been described to have potential as cancer therapeutics, however, MLV infection does not cause a cytopathic effect in the infected cell and viral replication can only be studied by immunostaining or measurement of reverse transcriptase activity. Results: We inserted the coding sequences for green fluorescent protein (GFP) into the proline-rich region (PRR) of the ecotropic envelope protein (Env) and were able to fluorescently label MLV. This allowed us to directly monitor viral replication and attachment to target cells by flow cytometry. We used this method to study viral replication of recombinant MLVs and split viral genomes, which were generated by replacement of the MLV env gene with the red fluorescent protein (RFP) and separately cloning GFP-Env into a retroviral vector. Co-transfection of both plasmids into target cells resulted in the generation of semi-replicative vectors, and the two color labeling allowed to determine the distribution of the individual genomes in the target cells and was indicative for the occurrence of recombination events. Conclusions: Fluorescently labeled MLVs are excellent tools for the study of factors that influence viral replication and can be used to optimize MLV-based replication-competent viruses or vectors for gene therapy.
Replizierende Murine Leukämieviren (MLV) können wertvolle Werkzeuge für die humane Krebsgentherapie werden, da sie das Transgen innerhalb des gewünschten Gewebes verteilen, ihr Genom stabil integrieren und einen natürlichen Tumortropismus aufweisen. In vorliegender Arbeit wurde ein System zur visuellen Analyse der MLV‐Replikation sowie der Virusbindung an Zielzellen mittels Einfügung fluoreszierender Proteine etabliert und als Werkzeug für dasDesign und die Optimierung dieser Viren als Gentherapievektoren benutzt. Zuerst wurde die Kodierungskapazität dieser Retroviren durch Aufteilen der viralen Gene auf zwei semireplikative Vektoren vergößert. Die Kopplung der Genome mit fluoreszierenden Proteinen ermöglichte ebenfalls in diesem Zusammenhang die Beobachtung der Repliktion aber auch die einfache Aufdeckung von Rekombinationsereignissen. Die Ergebnisse zeigten den Bedarf weiterer Optimierungen, stellten allerdings einen Vorreiter auf diesem Forschungsgebiet dar und zeigten das Potential dieses Systems auf (Sliva et al., 2004a). Zusätzlich zum natürlichen Tumortropismus sollte die Sicherheit von replizierenden Retroviren für die Tumortherapie erhöht werdn. Gezielte Veränderungen des ecotropen Hüllproteins zu EGFR‐exprimierenden Zellen mittels gerichteter Evolution sowie der Versuch, den Wirtstropismus des Env mit der Insertion des Liganden SDF‐1α auf humane CXCR4‐exprimierende Zellen auszuweiten, sind jedoch gescheitert. Diese Daten müssen sich in die Reihe der erfolglos gebliebenen Versuche, den Wirtstropismus des ecotropen Env auf humane Zellen auszuweiten, einreihen (Sliva et al., 2004b). Abschließend wurde shRNA als therapeutisches Effektormolekül erfolgreich mittels replikationskompetenter MLV in Zielzellen überragen, was zur deutlichen Herabsetzung des Proteinlevels des Zielproteins der siRNA führte (Sliva et al., 2006). Diese modifizierten Viren sind ein gutes Werkzeug zur einfachen in vitro Untersuchung von Genfunktionen, und könnten auch eine Erleichterung für die Untersuchung von Genfunktionen innerhalb von proliferierendem Tumorgewebe darstelln. Des Weiteren präsentieren die Ergebnisse und Beobachtungen dieser Arbeit einen großen Schritt in Richtung Anwendung dieser Virn für die humane Gentherapie. Denn gekoppelt mit z.B. einer tumorspezifischen Expression der shRNA‐Expressionskassette und der intelligenten Wahl der siRNA‐(Ziel)Sequenz, die nach Applikation zum Tod von malignen Tumorzellen führt, wären sie die perfekte Waffe gegen solide Tumoren.