Refine
Document Type
- Article (2)
- Doctoral Thesis (1)
Has Fulltext
- yes (3)
Is part of the Bibliography
- no (3)
Keywords
- acetylcholine binding protein (1)
- acetylcholine receptors (1)
- conotoxin (1)
- cys-loop receptor (1)
- gland extracts (1)
- ion channel (1)
- nicotinic acetylcholine receptors (1)
- potassium channels (1)
- sodium channels (1)
- terebridae venom (1)
Neuronal nAChRs are a diverse family of pentameric ion channels with wide distribution throughout cells of the nervous and immune systems. However, the role of specific subtypes in normal and pathological states remains poorly understood due to the lack of selective probes. Here, we used a binding assay based on acetylcholine-binding protein (AChBP), a homolog of the nicotinic acetylcholine ligand-binding domain, to discover a novel alpha-conotoxin (alpha-TxIA) in the venom of Conus textile. alpha-TxIA bound with high affinity to AChBPs from different species and selectively targeted the alpha3beta2 nAChR subtype. A co-crystal structure of Ac-AChBP with the enhanced potency analog TxIA(A10L), revealed a 20° backbone tilt compared to other AChBP–conotoxin complexes. This reorientation was coordinated by a key salt bridge formed between Arg5 (TxIA) and Asp195 (Ac-AChBP). Mutagenesis studies, biochemical assays and electrophysiological recordings directly correlated the interactions observed in the co-crystal structure to binding affinity at AChBP and different nAChR subtypes. Together, these results establish a new pharmacophore for the design of novel subtype-selective ligands with therapeutic potential in nAChR-related diseases.
Sowohl die Gifte der Kegel- (Conidae) als auch die der Schraubenschnecken (Terebridae) enthalten eine Vielzahl pharmakologisch aktiver Peptide. Vor allem die Conopeptide bzw. Conotoxine aus den Giften der Kegelschnecken werden aufgrund ihrer Selektivität für Ionenkanäle und Rezeptoren seit langem als Werkzeuge in der neuropharmakologischen Forschung eingesetzt. Hier rücken gerade neuronale nikotinische Acetylcholinrezeptoren immer mehr in den Fokus der medizinischen Forschung, da sie vermutlich an der Entwicklung neurodegenerativer Erkrankungen wie Alzheimer, Parkinson, Demenz, Schizophrenie und Epilepsie beteiligt sind. Ziel dieser Dissertation war es daher, neue Inhibitoren in den Giften Kegelschnecken (Conidae) und der Schraubenschnecken (Terebridae) für nikotinische Acetylcholinrezeptoren, vor allem der neuronalen Subtypen, zu identifizieren. Es erfolgte die:
1. Identifizierung neuer αD-Conotoxine
Aus den Giften von Conus capitaneus und C. mustelinus konnten zwei native αDConotoxine (αD-CAP und αD-MUS) isoliert und charakterisiert werden. Beide Toxine sind Homodimere mit Molekulargewichten von 11 kDa und inhibieren nikotinische ACh-Rezeptoren. Sie blockieren die Subtypen α7>α3β2>α4β2, wobei sich αD-MUS als potenter als αD-CAP erweist (IC50-Werte von αD-MUS: α7 0,12 nM, α3β2 1,08 nM, α4β2 4,5 nM; IC50-Werte von αD-CAP α7 0,25 nM, α3β2 2,8 nM, α4β2 28,6 nM). Hingegen haben die αD-Conotoxine auf die Rezeptorsubtypen α3β4, α4β4 und α1β1γδ keinen hemmenden Einfluss. Zusätzlich konnten drei weitere αD-Conotoxine mit Hilfe der cDNA von C. vexillum und C. betulinus identifiziert werden. Eine Besonderheit hierbei war, dass innerhalb der Familie der αD-Conotoxine zwei unterschiedliche Signalsequenzen vorkommen und somit diese Sequenzen nicht stark konserviert sind.
2. Charakterisierung des α-Conotoxins SI aus dem Gift von C. striatus
Im Gift der Kegelschnecke Conus striatus wurde ein Peptid mit inhibierender Wirkung an α7-Rezeptoren nachgewiesen. Molekulare Masse (1.352,5 Da) und Aminosäuresequenz entsprachen dem α-Conotoxin SI, das als Antagonist muskulärer nACh-Rezeptoren bekannt ist. Da die Ergebnisse mehrere Jahre zurück lagen und bisher keine Analysen im Oozytenexpressions-System durchgeführt wurden, wurdeeine mögliche Aktivität sowohl an neuronalen als auch an muskulären nACh-Rezeptoren vermutet. Voltage Clamp-Messungen bestätigten die spezifische Wirkung am Muskeltyp, wodurch die Aktivität am α7-Rezeptorsubtyp einem anderen Conopeptid, zugewiesen werden muss, das als Beiprodukt isoliert wurde.
3. Identifizierung neuer Conotoxine der A-Superfamilie Mit molekularbiologischen Methoden unter Nutzung von cDNA-Bibliotheken gelang es, 27 Conotoxine (17 neue und 10 bekannte) aus der A-Superfamilie zu identifizieren: drei α- und zwei κA-Conotoxine aus Conus striatus, zwei α-Conotoxine aus C. betulinus, zwei α- und zwei κA-Conotoxine aus C. carinatus, drei α-Conotoxine aus C. catus, drei α- und zwei κA-Conotoxine aus C. circumcisus, ein α-Conotoxin aus. C. geographus, zwei aus C. imperialis, jeweils eines aus C. lividus, C. quercinus, C. sponsalis sowie zwei aus C. terebra Die Vielzahl der identifizierten α-Conotoxine belegt die hohe Diversität dieser Toxine in den Giften der Kegelschecken. Anhand von Vergleichen mit bereits bekannten Toxinen werden die möglichen Wirkungsweisen einiger neuer α-Conotoxine diskutiert. Für einen Teil der α-Conotoxine wurden 3D-Strukturmodelle erstellt, die Einblicke in die Bindung der Toxine an den Rezeptor geben können.
4. Untersuchung der Gifte der Terebridae
Die inhibierende Aktivität einiger Gifte (Terebra consobrina, T. argus, Myurella affinis, Acus felina, A. chlorata, A. maculata und Hastulopsis pertusa) an nACh-Rezeptoren (α7, α3β2, α4β2, α3β4, α4β4 und α1β1γδ) wurde erstmals nachgewiesen. An Kalium- und Natriumkanälen zeigten die Giftextrakte keine Wirkung. Die Giftextrakte von Myurella affinis und Acus maculata waren am potentesten und blockierten alle untersuchten nACh-Rezeptoren. Dies ist besonders ungewöhnlich, da diese Terebriden-Arten nach der Literatur (Puillandre & Holford, 2010) keinen Giftapparat besitzen sollen. Eine weitere Auffälligkeit aller Terebriden-Giftextrakte war neben der Selektivität für a7-Rezeptorsubtypen, eine hohe Aktivität gegenüber α4-enthaltenden Rezeptoren. In den Giften und mit Hilfe von cDNA-Bibliotheken von Kegelschnecken konnte eine Vielzahl neuer Inhibitoren für neuronale nikotinische Acetylcholinrezeptoren identifiziert werden. Sie zeigen ein breites Wirkungsspektrum, das die unterschiedlichsten nAChRSubtypen einschließt, was ihre Verwendung als pharmaklogische Werkzeuge begrenzt. Hingegen zeigen die Gifte der Schraubenschnecken ein Selektivitätsspektrum, das die Analyse ihrer Peptide als vielversprechend erscheinen lässt.
Venomous secretions from marine snails of the Terebridae family target acetylcholine receptors
(2013)
Venoms from cone snails (Conidae) have been extensively studied during the last decades, but those from other members of the suborder Toxoglossa, such as of Terebridae and Turridae superfamilies attracted less interest so far. Here, we report the effects of venom and gland extracts from three species of the superfamily Terebridae. By 2-electrode voltage-clamp technique the gland extracts were tested on Xenopus oocytes expressing nicotinic acetylcholine receptors (nAChRs) of rat neuronal (α3β2, α3β4, α4β2, α4β4, α7) and muscle subtypes (α1β1γδ), and expressing potassium (Kv1.2 and Kv1.3) and sodium channels (Nav1.2, 1.3, 1.4, 1.6). The extracts were shown to exhibit remarkably high inhibitory activities on almost all nAChRs tested, in particular on the α7 subtype suggesting the presence of peptides of the A-superfamily from the venom of Conus species. In contrast, no effects on the potassium and sodium channels tested were observed. The venoms of terebrid snails may offer an additional source of novel biologically active peptides.