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NP25 wurde im Jahre 1994 als ein in allen Bereichen des zentralen Nervensystems Neuron-spezifisch exprimiertes Gen in der adulten Ratte identifiziert (Ren et al., 1994). Durch eigene Vorarbeiten konnte diese selektive neuronale Expression im Huhnembryo bestätigt werden, wobei die Expression von NP25 im Neuralrohr, den sympathischen paravertebralen Ganglien und sensorischen Hinterwurzelganglien vor der terminalen Differenzierung und Scg10-Expresison beginnt (M.Pape, Diplomarbeit, 2003). In dieser Arbeit konnte nun gezeigt werden, dass NP25 in diesen Geweben nach den proneuralen Faktoren Ascl1 und Ngn2 exprimiert wird, zu einem Zeitpunkt an dem die Vorläuferzellen mit der Differenzierung beginnen. Im Neuralrohr beginnt die Expression von NP25 zeitgleich mit der Expression von NeuroM, einem der frühesten Marker für junge, postmitotische differenzierende Neurone (Roztocil et al., 1997). NP25 stellt somit einen der frühesten panneuronalen Marker für differenzierende Neurone dar. Das NP25-Protein ist in den Zellkörpern und Fortsätzen der Neurone im Neuralrohr und den untersuchten peripheren Ganglien lokalisiert, wobei die Fasern der Motoneurone, im Gegensatz zu deren Zellkörpern, NP25-negativ sind. Mit voranschreitender Differenzierung nimmt die NP25- Proteinkonzentration ähnlich wie die Expression auf mRNA-Ebene ab, wobei in den peripheren Ganglien NP25 über einen längeren Zeitraum hinweg auf hohem Niveau exprimiert wird. Kultivierte Neurone aus sensorischen Hinterwurzelganglien und sympathische Neurone der paravertebralen Ganglien zeigen eine Lokalisation des NP25-Proteins im Zytoplasma der Zellkörper und Fortsätze, wobei NP25 in den sympathischen Neuronen wesentlich stärker exprimiert wird. Dieser Befund konnte durch die Analyse der Proteinkonzentration mit Hilfe der Western Blot Methode bestätigt werden. Die Überexpression von NP25 in verschiedenen Zelltypen führte zu verstärktem oder reduzierten Neuritenauswachsen, wobei die Effekte mit dem NP25-Niveau korrelieren. Zellen mit einem geringen endogenen NP25-Expressionsniveau, wie sensorische Neurone aus fünf Tage alten Huhnembryonen und PC12-Zellen, reagieren auf die Erhöhung des NP25-Gehalts mit verstärktem Längenwachstum der Neuriten, während sympathische Neurone aus sieben Tage alten Huhnembryonen, die ein hohes endogenes Expressionsniveau aufweisen, reduziertes Längenwachstum und reduzierte Verzweigungskapazität zeigen. Diese Ergebnisse sprechen dafür, dass maximales Neuritenwachstum eine optimale NP25-Konzentration erfordert, wobei im Falle der Überexpression von NP25 in den sympathischen Neuronen das Optimum überschritten wird und dadurch Neuritenauswachsen und Verzweigung inhibiert werden. Die Effekte auf das Längenwachstum der Neuriten in den primären Neuronen konnten durch RNAi Experimente bestätigt werden. Neben dem Längenwachstum war auch das initiale Auswachsen von Fortsätzen durch die Veränderung des NP25-Expressionsniveaus betroffen. Im Falle der PC12-Zellen induzierte die NP25-Überexpression nicht nur Längenwachstum der Neuriten, sondern auch die Zahl der Fortsätze pro Zelle wurde erhöht. In den sympathischen Neuronen, in denen durch NP25- Überexpression das Längenwachstum und die Verzweigungskapazität negativ reguliert werden, nimmt die Anzahl der Neuriten pro Zellen nach Erniedrigung des NP25-Expressionsniveaus ebenfalls ab. Dies kann dadurch erklärt werden, dass Längenwachstum und initiales Auswachsen von Neuriten durch unterschiedliche Mechanismen reguliert werden (Glebova and Ginty, 2005; Luo, 2002), was hier möglicherweise dazu führt, dass Längenwachstum negativ und initiales Auswachsen positiv durch NP25 beeinflusst wird. In den sensorischen Neurone führte weder die Erhöhung noch die Erniedrigung des NP25-Expressionsniveaus zu einer Veränderung des initialen Auswachsens, was eine differentielle Regulation der Prozesse bestätigt. Da viele Mitglieder der CaP-Proteinfamilie mit F-Aktin interagieren (Gimona et al., 2002) wurde untersucht, ob NP25 und F-Aktin in kultivierten sympathischen und sensorischen Neuronen und in PC12-Zellen kolokalisieren. In den primären Neuronen wurde im Gegensatz zu der Situation in den PC12-Zellen keine Kolokalisation beobachtet, wobei NP25 und F-Aktin in den PC12-Zellen nur in kleinen Bereichen an den distalen Enden filopodienartiger Fortsätze kolokalisieren. Auch eine Interaktion von NP25 und G-Aktin konnte in den PC-Zellen ausgeschlossen werden. Durch die Identifikation zweier RhoGAP-Proteine (NIRGAP1 und 2) als potentielle Interaktionpartner (M.Geissen, nicht publiziert) könnte NP25 Neuritenauswachsen durch indirekte Beeinflussung des Aktinzytoskeletts über Rho-Signalwege regulieren. Die identifizierten RhoGAPs konnten durch in situ Hybridisierung im Rückenmark, in den Hinterwurzelganglien und den sympathischen paravertebralen Ganglien im Rattenembryo nachgewiesen werden. Sie gehören zu keiner bekannten Familie und unterscheiden sich auch strukturell von den meisten bisher beschriebenen RhoGAPs, da sie mehr als eine (drei) GAP-Domänen enthalten. Durch diesen Befund ergeben sich neue Ansätze für die weiteren Untersuchungen zur Regulation des Neuritenwachstums durch NP25. Da im adulten Nervensystem für NP25 eine Funktion in der Dynamik der Dendriten angenommen wird, sind Untersuchungen der Dendritenausbildung in vitro ebenfalls nahe liegend.
Purpose: The prospective, randomized ERGO2 trial investigated the effect of calorie-restricted ketogenic diet and intermittent fasting (KD-IF) on re-irradiation for recurrent brain tumors. The study did not meet its primary endpoint of improved progression-free survival in comparison to standard diet (SD). We here report the results of the quality of life/neurocognition and a detailed analysis of the diet diaries. Methods: 50 patients were randomized 1:1 to re-irradiation combined with either SD or KD-IF. The KD-IF schedule included 3 days of ketogenic diet (KD: 21–23 kcal/kg/d, carbohydrate intake limited to 50 g/d), followed by 3 days of fasting and again 3 days of KD. Follow-up included examination of cognition, quality of life and serum samples. Results: The 20 patients who completed KD-IF met the prespecified goals for calorie and carbohydrate restriction. Substantial decreases in leptin and insulin and an increase in uric acid were observed. The SD group, of note, had a lower calorie intake than expected (21 kcal/kg/d instead of 30 kcal/kg/d). Neither quality of life nor cognition were affected by the diet. Low glucose emerged as a significant prognostic parameter in a best responder analysis. Conclusion: The strict caloric goals of the ERGO2 trial were tolerated well by patients with recurrent brain cancer. The short diet schedule led to significant metabolic changes with low glucose emerging as a candidate marker of better prognosis. The unexpected lower calorie intake of the control group complicates the interpretation of the results. Clinicaltrials.gov number: NCT01754350; Registration: 21.12.2012.
Purpose: The prospective, randomized ERGO2 trial investigated the effect of calorie-restricted ketogenic diet and intermittent fasting (KD-IF) on re-irradiation for recurrent brain tumors. The study did not meet its primary endpoint of improved progression-free survival in comparison to standard diet (SD). We here report the results of the quality of life/neurocognition and a detailed analysis of the diet diaries. Methods: 50 patients were randomized 1:1 to re-irradiation combined with either SD or KD-IF. The KD-IF schedule included 3 days of ketogenic diet (KD: 21–23 kcal/kg/d, carbohydrate intake limited to 50 g/d), followed by 3 days of fasting and again 3 days of KD. Follow-up included examination of cognition, quality of life and serum samples. Results: The 20 patients who completed KD-IF met the prespecified goals for calorie and carbohydrate restriction. Substantial decreases in leptin and insulin and an increase in uric acid were observed. The SD group, of note, had a lower calorie intake than expected (21 kcal/kg/d instead of 30 kcal/kg/d). Neither quality of life nor cognition were affected by the diet. Low glucose emerged as a significant prognostic parameter in a best responder analysis. Conclusion: The strict caloric goals of the ERGO2 trial were tolerated well by patients with recurrent brain cancer. The short diet schedule led to significant metabolic changes with low glucose emerging as a candidate marker of better prognosis. The unexpected lower calorie intake of the control group complicates the interpretation of the results. Clinicaltrials.gov number: NCT01754350; Registration: 21.12.2012.