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Photolabile Schutzgruppen haben sich im Laufe der letzten Jahre als wertvolle Werkzeuge für die Untersuchung und Regulation biologischer Prozesse etabliert. Dabei wird die photolabile Schutzgruppe auf geeignete Weise mit Biomolekülen verknüpft, sodass deren Funktion temporär deaktiviert wird. Durch Bestrahlen mit Licht geeigneter Wellenlängen wird die photolabile Schutzgruppe entfernt und die Aktivität des Biomoleküls bzw. des zu beobachtenden Prozesses wiederhergestellt. Die Grundlagen der Verwendung photolabiler Schutzgruppen im biologischen Kontext wurden in zwei Pionierarbeiten 1977 von J.W. ENGELS und 1978 von J.F. HOFFMAN gelegt. Davon ausgehend haben sich zahlreiche Anwendungen photolabiler Schutzgruppen für biologisch interessante Molekülklassen entwickelt. Auf dem speziellen Gebiet der Nukleinsäuren wurden in den letzten Jahren einige fundamentale Mechanismen entdeckt und aufgeklärt, die nicht zuletzt auch therapeutisch interessante Anwendungsmöglichkeiten für photolabile Schutzgruppen bieten. Hierbei stellt das An-/Aus-Schaltverhalten von Nukleinsäuren jedoch ein nicht-triviales Problem dar. Selbst der gezielte Einbau einer einzelnen photolabilen Schutzgruppe in ein multifunktionales Oligonukleotid führt in der Regel nämlich nicht zu einer vollständigen Deaktivierung dessen. Ein multipler Einbau photolabiler Schutzgruppen entlang der Sequenz eines funktionellen Oligonukleotids schaltet die Hintergrundaktivität im deaktivierten Zustand zwar vollständig aus, allerdings müssen in diesem Fall hohe Bestrahlungsintensitäten bzw. –dauern für das Entfernen aller photolabilen Modifikationen angewendet werden. Dadurch geht zum einen die Zeitauflösung der lichtgeschalteten Prozesse verloren, nicht zuletzt erhöht sich dabei aber auch das Risiko von lichtinduzierten Schäden am biologischen System. Das Kernthema der vorliegenden Dissertation war es daher, neue Architekturen für den Aufbau photoaktivierbarer Oligonukleotide zu entwickeln.
Das erste große Projekt basierte auf der Annahme, dass sich Duplexstrukturen, die für die Funktion vieler Nukleinsäuremechanismen fundamental sind, durch Zyklisierung von Oligonukleotiden global destabilisieren und damit effizienter photoaktivieren lassen, als durch lokalen Einbau einzelner photolabiler Schutzgruppen in Oligonukleotide. Hierzu wurden geeignete Alkin-Modifikationen an photolabile Nitrobenzyl- und Cumarin-Schutzgruppen angebracht und diese an die Nukleobasen verschiedener DNA-Bausteine geknüpft. Es ist daraufhin gelungen, Oligonukleotide mit je zwei photolabilen Alkin-Modifikationen herzustellen und diese intrasequentiell über eine Cu(I)-katalysierte Click-Reaktion mit einem Bisazid-Linker zu zyklisieren. Die so erhaltenen Oligonukleotide wiesen dramatisch erniedrigte Schmelzpunkte gegenüber den nativen Duplexen, sowie gegenüber den zweifach photolabil geschützten Oligonukleotiden auf. Dabei wurde außerdem festgestellt, dass Zyklisierungsparameter wie die Linkerlänge, -polarität und –flexibilität und die Wahl der photolabilen Schutzgruppe keinen signifikanten Einfluss auf die Duplexstabilität hat. Über einen Bereich von Ringgrößen zwischen ca. 11-21 Nukleotiden wurden die niedrigsten Duplexstabilitäten beobachtet. Sehr kleine, sowie große Ringe ab 30 Nukleotiden wiesen dagegen höhere Stabilität auf.
Da mit dem entwickelten Zyklisierungskonzept auch mehrere Ringstrukturen innerhalb einer Oligonukleotidsequenz aufgebaut werden können, wurde im nächsten Schritt eine photoaktivierbare Variante des C10-Aptamers hergestellt, welches selektiv gegen Burkitt’s Lymphomzellen bindet. Dieses 90-mer DNA-Oligonukleotid wurde an drei Stellen photolabil Alkin-modifiziert und infolge mit einem Trisazid-Linker zu einer bizyklisierten Struktur verknotet. Mit Hilfe von Fluoreszenzmikroskopie-Experimenten konnte demonstriert werden, dass das durch eine solche „Photo-Klammer“ deaktivierte C10-Aptamer keine Bindungsaffinität gegenüber Burkitt’s Lymphomzellen aufweist, die Bindungsaktivität jedoch nach Belichten wiederhergestellt werden kann. Mit Atomkraftmikroskopie-Experimenten ist es darüber hinaus gelungen, die Photoaktivierung des verknäuelten C10-Aptamers mit molekularer Auflösung abzubilden. Mit diesem Ergebnis können nun lange funktionelle Oligonukleotide auf definierte Weise photoaktivierbar gestaltet werden, insbesondere auch dann, wenn keine (Informationen über) funktionelle Sekundärstrukturen existieren.
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Background: Perioperative anaemia leads to impaired oxygen supply with a risk of vital organ ischaemia. In healthy and fit individuals, anaemia can be compensated by several mechanisms. Elderly patients, however, have less compensatory mechanisms because of multiple co-morbidities and age-related decline of functional reserves. The purpose of the study is to evaluate whether elderly surgical patients may benefit from a liberal red blood cell (RBC) transfusion strategy compared to a restrictive transfusion strategy.
Methods: The LIBERAL Trial is a prospective, randomized, multicentre, controlled clinical phase IV trial randomising 2470 elderly (≥ 70 years) patients undergoing intermediate- or high-risk non-cardiac surgery. Registered patients will be randomised only if Haemoglobin (Hb) reaches ≤9 g/dl during surgery or within 3 days after surgery either to the LIBERAL group (transfusion of a single RBC unit when Hb ≤ 9 g/dl with a target range for the post-transfusion Hb level of 9–10.5 g/dl) or the RESTRICTIVE group (transfusion of a single RBC unit when Hb ≤ 7.5 g/dl with a target range for the post-transfusion Hb level of 7.5–9 g/dl). The intervention per patient will be followed until hospital discharge or up to 30 days after surgery, whichever occurs first. The primary efficacy outcome is defined as a composite of all-cause mortality, acute myocardial infarction, acute ischaemic stroke, acute kidney injury (stage III), acute mesenteric ischaemia and acute peripheral vascular ischaemia within 90 days after surgery. Infections requiring iv antibiotics with re-hospitalisation are assessed as important secondary endpoint. The primary endpoint will be analysed by logistic regression adjusting for age, cancer surgery (y/n), type of surgery (intermediate- or high-risk), and incorporating centres as random effect.
Discussion: The LIBERAL-Trial will evaluate whether a liberal transfusion strategy reduces the occurrence of major adverse events after non-cardiac surgery in the geriatric population compared to a restrictive strategy within 90 days after surgery.
Trial registration: ClinicalTrials.gov (identifier: NCT03369210).
Photolabile protecting groups are widely used to trigger oligonucleotide activity. The ON/OFF‐amplitude is a critical parameter. An experimental setup has been developed to identify protecting group derivatives with superior caging properties. Bulky rests are attached to the cage moiety via Cu‐catalyzed azide–alkyne cycloaddition post‐synthetically on DNA. Interestingly, the decrease in melting temperature upon introducing o‐nitrobenzyl‐caged (NPBY‐) and diethylaminocoumarin‐cages (DEACM‐) in DNA duplexes reaches a limiting value. NMR spectroscopy was used to characterize individual base‐pair stabilities and determine experimental structures of a selected number of photocaged DNA molecules. The experimental structures agree well with structures predicted by MD simulations. Combined, the structural data indicate that once a sterically demanding group is added to generate a tri‐substituted carbon, the sterically less demanding cage moiety points towards the neighboring nucleoside and the bulkier substituents remain in the major groove.