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Helicobacter pylori (H. pylori) ist ein spiralförmiges, gram-negatives und mikroaerophiles humanpathogen. Seit seiner ersten Isolierung 1983 gilt H. pylori als eine der häufigsten Ursachen für entzündliche Prozesse des gastrointestinalen Traktes (u.a. chronische, sowie atrophische Gastritis und Ulzera). Darüber hinaus kann es gastrale Adenokarzinome und Lymphome des MALT (mucosa-associated lymphoid tissue)-Systems induzieren. Einige H. pylori-Stämme besitzen eine Gruppe von ungefähr 30 Genen, die als cag-Pathogenitätsinsel (cagPAI) bekannt ist. Diese Stämme sind häufig mit Magenschleimhautentzündungen, Geschwürbildung und einem erhöhtem Risiko von Magenkrebs verbunden. Die Gene der cagPAI kodieren für ein Typ IV-Sekretionssystem (T4SS), das Protein- Effektor-Moleküle in die Wirtszelle transloziert. In dieser cagPAI befindet sich ebenfalls das Gen für den Pathogenitätsfaktor CagA (cytotoxin associated gene A). Dieses Protein ist, neben Peptidoglykan, eines der beiden bisher bekannten Moleküle, die vom T4SS transportiert werden. In der Zielzelle wird CagA von Kinasen der Src-Familie an den Tyrosinen in den EPIYA-Sequenz-Wiederholungen phosphoryliert und induziert über einen wenig verstandenen Signalweg eine starke Elongierung und Migration der infizierten Epithelzellen. In diesem Zusammenhang wurde der Einfluss von c-Abl auf die zellulären Prozesse während einer Infektion mit H. pylori untersucht. Die erarbeiteten Daten zeigen deutlich, dass c-Abl ein wichtiges Zielmolekül in der H. pylori-induzierten Zellmigration ist. Durch den Einsatz von spezifischen Inhibitoren der c-Abl-Kinase konnte die Zellelongierung signifikant reduziert werden. Nach Transfektion eines shRNA-Vektors in eine humane Adenokarzinom- Zelllinie wurde eine stabile c-Abl-„Knockdown“-Zelllinie hergestellt. Infektion dieser Abl- AGS-Zellen mit H. pylori induzierte ebenfalls nicht mehr die Zellelongierung. Da wie erwartet die Blockierung der Src-Kinasen ebenfalls den H. pylori-vermittelten Phänotyp inhibierte, sollte in weiteren Experimenten geklärt werden, ob c-Abl- und Src- Kinasen ähnliche Mechanismen aktivieren, die zur Zellmotilität beitragen. Es konnte gezeigt werden, dass Src-Kinasen bereits nach 10-30 min nach der Infektion aktiviert und sehr früh nach 45-60 Minuten wieder inaktiviert wurden. In in-vitro Kinase-Experimenten konnte darüber hinaus beobachtet werden, dass c-Abl dagegen erst nach 60-90 min aktiviert wurde und anschließend über einen längeren Zeitraum aktiviert blieb. Diese unterschiedlichen Kinetiken deuten darauf hin, dass beide Kinasen in der H. pylori-Infektion differentiell reguliert werden und unterschiedliche Funktionen übernehmen. Es wurde bereits publiziert, dass Src-Kinasen CagA direkt in den EPIYA-Motiven phosphorylieren. In dieser Arbeit konnte mittels Ko-Immunpräzipitationen gezeigt werden, dass zwischen c-Abl und CagA eine stabile physikalische Interaktion induziert wird. Des Weiteren konnte gezeigt werden, dass c- Abl CagA direkt phosphoryliert und diese c-Abl-vermittelte Phosphorylierung ein wichtiger Schritt in der H. pylori-induzierten Zellmotilität spielt. Zusammengefasst kann ein Model aufgestellt werden, dass c-Abl die CagA Phosphorylierung über einen langen Zeitraum aufrechterhält und somit die frühe Inaktivierung von Src ersetzt. Die Aktivität von Proteinkinasen wird häufig über Tyrosinphosphorylierungen reguliert. Im Gegensatz zu Src wurden die in der Literatur schon für c-Abl beschriebenen Phosphorylierungsstellen Tyrosin 245 und 412 während einer H. pylori-Infektion nicht phosphoryliert. Eine Phosphorylierung von Tyrosin 245 ließ sich nur durch Stimulation der Zellen mit Natrium-Vanadat und H2O2 erzielen. Interessanterweise korrelierte die c-Abl Aktivität aber mit einer H. pylori-induzierten Zunahme der c-Abl-Proteinmenge. Da die mRNA-Menge nicht variierte, handelte es sich vermutlich um eine Stabilisierung von c-Abl im Komplex mit CagA. Anstelle der Tyrosin-Phosphorylierung konnte die Phosphorylierung von Threonin 735 während einer H. pylori-Infektion nachgewiesen werden. Die bisher nur in geringer Anzahl vorliegenden Veröffentlichungen beschreiben, dass die Phosphorylierung von Threonin 735 eine Rolle in der zellulären Lokalisierung der Kinase spielen könnte. Mit Hilfe von konfokaler Mikroskopie und subzellulärer Fraktionierung, konnte nach H. pylori- Infektion eine Translokation von c-Abl von der typischen zytosolischen Verteilung in die Fokalkomplexe nachgewiesen werden. Ein weiterer Aspekt dieser Arbeit war erste Anhaltspunkte zur Identifizierung der bis heute völlig unbekannten Kinase zu finden, die für die Phosphorylierung von c-Abl an diesem Lokus verantwortlich ist. Bemerkenswert dabei ist, dass diese Phosphorylierung unabhängig von CagA ist, aber trotzdem ein funktionierendes T4SS voraussetzt. Dies konnte durch den Einsatz von Mutationen im T4SS von H. pylori nachgewiesen werden. Dieser Befund deutet darauf hin, dass weitere Faktoren von H. pylori existieren, die über das T4SS in die Zielzellen injiziert werden und an der Regulierung von c-Abl beteiligt sind.
Helicobacter pylori (H. pylori) ist ein gram-negatives Bakterium, das die menschliche Magenmukosa kolonisieren kann. Ca. 50 % der Weltbevölkerung sind mit diesem Erreger infiziert, wobei er ohne medizinische Behandlung über Jahrzehnte in seinem Wirt persistieren kann. Das Bakterium gilt als eine der häufigsten Ursachen bei der Entwicklung von schweren gastrointestinalen Erkrankungen wie chronischer Gastritis und Gastral- oder Duodenalulkus. Darüber hinaus kann eine Infektion aber auch zu einem gastralen Adenokarzinom oder dem MALT- („mucosa-associated lymphoid tissue“) Lymphom führen. Bestimmte H. pylori-Stämme können über ein Typ IV Sekretionssystem (T4SS) das bakterielle Protein CagA („cytotoxin-assoziiertes Gen A“) in die Wirtszelle injizieren und dadurch Signaltransduktionswege stören, die die Morphologie und Mobilität der infizierten Wirtszelle drastisch verändern. In diesem Zusammenhang wurde die putative Phosphorylierung der Proteine VASP („Vasodilator-stimuliertes Phosphoprotein“) und α-Actinin-4 untersucht, welche beide regulatorische Funktionen im Zytoskelett der Wirtszelle ausüben. Im Rahmen dieser Doktorarbeit sollte der Einfluss von H. pylori auf diese Proteine analysiert werden, sowie die daraus resultierenden zellulären Auswirkungen. Es konnte verifiziert werden, dass H. pylori die Phosphorylierung der drei bekannten Phosphorylierungsstellen von VASP, bzw. eine Tyrosin-Phosphorylierung von α-Actinin-4 (ACTN4) induziert. Weiterhin zeigte sich, dass beide Proteine nach einer Infektion mit dem Bakterium in fokalen Kontaktstellen der Zellen lokalisieren. Zusätzlich lies sich zeigen, dass VASP und α-Actinin-4 eine entscheidende Rolle bei der durch H. pylori-induzierten Zellelongation spielen, da eine Herunterregulation der Genexpression von beiden Proteinen über siRNA zu einer Inhibition der morphologischen Veränderungen führte. Die genaueren Studien über VASP zeigten, dass hauptsächlich die Phosphorylierungsstelle VASPSer239 für die H. pylori-induzierte Zellelongation verantwortlich ist und die Phosphorylierung durch die Proteinkinase G (PKG) vermittelt wird. Für α-Actinin-4 konnte in dieser Arbeit des Weiteren gezeigt werden, dass die Kinase c-Abl eine Tyrosin-Phosphorylierung vermitteln kann, wobei die genaue Phosphorylierungsstelle im Protein noch ermittelt werden muss. Durch den Einsatz von H. pylori-Mutanten lies sich darüber hinaus noch zeigen, dass die Phosphorylierung von VASPSer239 und VASPThr278 durch das bakterielle Protein CagA deutlich verstärkt wird. Für die Tyrosin-Phosphorylierung von α-Actinin-4 war CagA sogar ausschlaggebend. Diese neu entdeckten zellulären Zielproteine bei einer H. pylori-Infektion ermöglichen weitere Einblicke in die Deregulation des eukaryotischen Zytoskeletts und möglichen Mechanismen bei der Krebsentstehung.
Die vaskuläre NADPH-Oxidase ist eine wichtige Quelle für reaktive Sauerstoff-Spezies (ROS). Viele dieser Daten wurden unter Verwendung des Inhibitors Apocynin (4'-Hydroxy-3' methoxyacetophenon) erhoben, dessen Wirkungsweise jedoch nicht bekannt war. In dieser Arbeit wurde der Mechanismus der Hemmung der vaskulären NADPH-Oxidase näher untersucht, sowie nach weiteren Inhibitoren gesucht. In HEK293-Zellen wurden die NADPH-Oxidase-Isoformen Nox1, Nox2, Nox4, Duox1 oder Duox2 überexprimiert und die von den Zellen produzierten Radikale durch verstärkte Chemilumineszenz gemessen. Hierbei wurde festgestellt, dass Apocynin die Produktion von Superoxidanionen nicht hemmt, aber die Detektion von Wasserstoffperoxid- oder Hydroxylradikalen beeinflusst. Wenn die Radikale durch Xanthin/Xanthin-Oxidase oder nicht-enzymatische Systeme generiert wurden, beeinflusste Apocynin direkt die Peroxid-, aber nicht die Superoxid-Detektion. In Leukozyten ist Apocynin ein Pro-Pharmakon, das durch Myeloperoxidase (MPO) aktiviert werden kann. Dieser Prozess führt zur Bildung eines Apocyninradikals, das zu einem Dimer umgewandelt wird. Allerdings kann man aufgrund der hohen Reaktivität des Radikals nur das Dimer nachweisen. Endothelzellen und glatte Muskelzellen sind nicht in der Lage dieses Dimer zu bilden und können daher Apocynin nicht aktivieren. In Nox-überexprimierenden HEK293-Zellen konnte die Dimer-Bildung gezeigt werden, wenn MPO zugegeben wurde. Apocynin kann ohne MPO-Zugabe nur die NADPH-Oxidase in Leukozyten hemmen und wirkt in vaskulären Zellen als Antioxidans. Tatsächlich wurde in vaskulären glatten Muskelzellen die Aktivierung der redoxsensitiven Kinasen p38-MAP-Kinase, Akt und Erk1/2 durch Wasserstoffperoxid und durch den intrazellulären Radikal-Generator Menadion in Anwesenheit von Apocynin verhindert. Des Weiteren wurde untersucht, ob Cyclooxygenase 2 (COX-2), die eine ähnliche Peroxidase-Domäne wie MPO besitzt, mit Apocynin interagiert. Die COX-2-Aktivität wurde durch Apocynin gehemmt. In COX-2 überexprimierenden HEK293- Zellen wurden die Superoxidanion- sowie die Wasserstoffperoxid-Bildung durch Apocynin völlig gehemmt. Allerdings konnte durch die Peroxidaseaktivität von COX-2 Apocynin nicht aktiviert und somit kein Dimer nachgewiesen werden. Diese Beobachtung unterstützt ferner die unspezifische Natur der Nox-Hemmung durch Apocynin.Intravenös appliziertes Apocynin in Mäusen und Schweinen führte zu einer Aktivierung von Apocynin. In vivo wirkt Apocynin somit als möglicher Nox2-Inhibitor und als Antioxidans. Flavonoide, insbesondere die des Katechol-Typs, in dem der B-Ring monomethyliert ist, haben eine ähnliche Struktur wie Apocynin. Daher wurde in dieser Arbeit auch das Potenzial der Flavonoide Epicatechin, 3'-O-Methyl-Epicatechin, Procyanidin B2 und Isorhamnetin als Inhibitoren der NADPH-Oxidase analysiert. Nox-überexprimierende HEK293-Zellen (Nox1, Nox2 sowie Nox4) wurden mit verschiedenen Flavonoiden inkubiert und die ROS-Bildung mittels verstärkter Chemilumineszenz gemessen. Epicatechin und Procyanidin B2 hemmten die Radikal-Detektion der verschiedenen Nox-Isoformen in allen Detektionssystemen. Isorhamnetin hemmte die Radikal-Detektion durch Nox1 nur leicht, allerdings wurde die Bildung der Radikale durch Nox4 und Nox2 fast komplett blockiert. 3'-O-Methyl-Epicatechin wies die schwächste antioxidative Wirkung auf. Es hemmte zwar die Wasserstoffperoxidbildung, jedoch kaum die Nox1- und Nox2-abhängige Superoxidanion-Bildung. Keine der getesteten Substanzen konnte den „respiratorischen Burst“ in mit Phorbolmyristatacetat stimulierten Leukozyten blockieren. Diese Daten deuten darauf hin, dass Apocynin und Katechine potente Antioxidantien für Wasserstoffperoxid, aber keine spezifischen NADPH-Oxidase- Hemmer in vaskulären Systemen sind.
Durch die Behandlung HIV-positiver Patienten mit einer Kombinationstherapie verschiedener antiviraler Substanzen (HAART = hochaktive antiretrovirale Therapie) kann die Virusreplikation über einen längeren Zeitraum unterdrückt werden. Allerdings hat diese Therapie Limitationen. Die Medikamente verursachen hohe Therapiekosten, haben zum Teil starke Nebenwirkungen und es entstehen mit der Zeit resistente Viren. Eine Alternative besteht in der somatischen Gentherapie der HIV-Infektion. Bei diesen Ansätzen werden Zellen der Patienten genetisch modifiziert, so dass sie ein antivirales Genprodukt exprimieren. In der vorliegenden Arbeit wurde ein membrangebundenes, antivirales C46 Peptid (maC46) sowohl in vitro in Zelllinien und primären humanen T-Zellen als auch in vivo in zwei humanisierten Mausmodellen getestet. Das C46 Peptid entstammt der C-terminalen "heptad repeat" Sequenz des HIV Hüllproteins gp41. C-Peptide wie C46 oder auch T20, welches bereits für die HAART Therapie zugelassen ist, binden während der Fusion des Virus mit der Zielzelle an gp41 und inhibieren so die Fusion. Werden T-Zelllinien oder primäre humane T-Zellen mit einem gammaretroviralen Vektor, der maC46 codiert, transduziert, können sie sehr effizient vor einer Infektion mit HIV geschützt werden [30]. Dieser Vektor wurde bereits in einer klinischen Studie mit T-Zellen von 10 HIV-positiven Patienten getestet [142]. Dabei konnte allerdings kein antiviraler Effekt der Gentherapie beobachtet werden. Hier wurde nun ein lentiviraler Vektor für maC46 (LV-maC46-GFP) verwendet. Lentivirale Vektoren transduzieren im Gegensatz zu gammaretroviralen auch ruhende Zellen, was ein kürzeres ex vivo Aktivierungs- und Transduktionsprotokoll ermöglicht. Außerdem ist für lentivirale Vektoren das Risiko der Transformation der Zelle niedriger als für gammaretrovirale. Für eine mögliche klinische Anwendung sollte es daher tolerierbar sein, für lentivirale Vektoren eine höhere MOI zu verwenden als für gammaretrovirale. Eine höhere Transduktionseffizienz sollte auf der anderen Seite auch eine effektive und langanhaltende Transgenexpression ermöglichen. Zunächst wurde gezeigt, dass sowohl die T-Zelllinie PM-1 als auch primäre humane T-Zellen nach Transduktion mit LV-maC46-GFP vor einer Infektion mit HIV geschützt waren und während der Infektion einer gemischten Kultur einen Selektionsvorteil gegenüber nicht-transduzierten Zellen hatten. Dabei konnte auch durch konfokale Mikroskopie gezeigt werden, dass das Virus die maC46-exprimierenden Zellen nicht injizieren konnte, sondern lediglich auf der Zelloberfläche gebunden wurde. Im Weiteren wurden zwei humanisierte Mausmodelle etabliert, um LV-maC46-GFP in vivo zu testen. Im humanen Immunsystem Mausmodell (HIS-Mausmodell) wurden immundefiziente Mäuse mit humanen Blutstammzellen repopuliert. In den Tieren kam es zu einer de novo Bildung von humanen, reifen T-Lymphozyten durch Thymopoese. Dabei wurden im Blut der Tiere humane, maC46- exprimierende CD4+ T-Zellen detektiert. Nach Infektion der Tiere mit HIV wurden diese T-Zellen depletiert. Es kam allerdings nicht zu einer Anreicherung oder einem selektiven Überleben der genmodifizierten T-Zellen. Eine Erklärung dafür könnte eine gestörte T-Zellhomeostase in den Tieren sein. Das zweite humanisierte Mausmodell (T-Zellmausmodell) verwendete immundefiziente Mäuse, die mit transduzierten humanen T-Zellen repopuliert wurden. Die Infektion mit HIV erfolgte entweder in vitro vor Transplantation der Zellen oder in vivo nach Repopulierung der Tiere. In beiden Fällen konnte ein selektives Überleben maC46-exprimierender CD4+ T-Zellen nach HIV-Infektion beobachtet werden. Im letzten Teil der vorliegenden Arbeit wurde die Weiterentwicklung von maC46, eine sekretierte Variante des C46-Peptids (iSAVE), im T-Zellmausmodell getestet. Ein sekretierter Fusionsinhibitor stellt insofern eine Weiterentwicklung des membrangebundenen dar, als nicht nur die genmodifizierten Zellen, sondern zusätzlich auch nicht-modifizierte Nachbarzellen vor einer Infektion mit HIV geschützt werden könnten. Dadurch erhöht sich auch das Spektrum an möglichen Produzentenzellen für den Fusionsinhibitor. In den hier beschriebenen Experimenten wurden humane T-Zellen entweder mit einem gammaretroviralen (RV-iSAVE) oder einem lentiviralen Vektor (LV-iSAVE) transduziert und die Experssion das iSAVE-Peptids wurde im Serum der Tiere gemessen. In beiden Ansätzen konnte iSAVE Peptid im Serum der Tiere detektiert werden. In weiteren Experimenten sollte nun untersucht werden, ob dieses in vivo sekretierte iSAVE Peptid antiviral aktiv ist und die humanisierten Mäuse vor einer Infektion mit HIV schützen kann.
Innerhalb des adaptiven Immunsystems spielt der Major Histocompatibility Complex (MHC)-Klasse I-Weg der Antigenpräsentation eine essenzielle Rolle bei der Erkennung und Zerstörung Virus-infizierter Zellen. Ein grundlegender Schritt innerhalb dieses Prozesses ist die Translokation endogener Peptide durch den transporter associated with antigen processing (TAP) in das ER-Lumen. Der TAP-Transporter ist zusammen mit verschiedenen Chaperonen und weiteren Faktoren in einem Peptidbeladungskomplex (PLC) assoziiert. Insbesondere Herpesviren, die durch eine lebenslange Persistenz im Wirt und wiederkehrende Reaktivierung unter Stresssituationen gekennzeichnet sind, interferieren direkt mit dem PLC und dem TAP-Transporter. Das varicellovirale Typ-I-Membranprotein UL49.5 inhibiert den TAP-Komplex, wobei das Protein des Rinderherpesvirus (Bovines Herpesvirus 1, BHV-1) zusätzlich die proteasomale Degradation verschiedener Komponenten des PLCs einleitet. Dieser Mechanismus wird durch die C-terminale Domäne des UL49.5-Proteins vermittelt und ist von keinem anderen Virusprotein bekannt. Welche Aminosäuren des Virusproteins jedoch für diese Inhibition und Degradation essenziell sind, wurde bisher nicht aufgeklärt. Ziel der vorliegenden Doktorarbeit war es, die Funktionsweise des BHV-1 UL49.5-Proteins zu verstehen und insbesondere zu analysieren, welche Bereiche des Proteins für die proteasomale Degradation des TAP-Komplexes verantwortlich sind. Das UL49.5-Protein wurde im Rahmen der vorliegenden Arbeit erfolgreich in Insektenzellen und in HeLa-Zellen exprimiert. Mittels Coimmunpräzipitation (Co-IP) wurde daraufhin die Bindung verschiedener UL49.5-Varianten an den TAP-Komplex analysiert. Unterstützt wurden diese Daten durch einen in vivo Interaktionsscreen (BiFC) und in vitro translatiertes UL49.5. Hierbei stellte sich heraus, dass das UL49.5-Protein in Abwesenheit sämtlicher Komponenten des Immunsystems an beide Untereinheiten des TAP-Transporters bindet. Die Bindung erfolgt sowohl an vollständige TAP-Untereinheiten als auch an den sogenannten coreTAP-Komplex, der nur die inneren sechs Transmembranhelices besitzt. Weiterhin wurden systematisch verkürzte UL49.5-Varianten generiert, um wichtige Reste für TAP-Inhibition und proteasomale Degradation zu identifizieren. Interessanterweise sind weder die N-terminale noch die C-terminale Domäne von UL49.5 für die Bindung an den TAP-Komplex zwingend notwendig. Die Bindung an den TAP-Transporter wird demnach über die Transmembrandomäne von UL49.5 vermittelt. Mit Hilfe von Peptidtransport-Analysen wurde die inhibitorische Aktivität verschiedener UL49.5-Mutanten eingehend untersucht. Zusätzlich wurde eine Untersuchung der MHC I-Oberflächenexpression in transient transfizierten HeLa-Zellen etabliert. In diesen Zellen wurde nach Sortierung eine drastisch reduzierte TAP-Konzentration nachgewiesen, die auf proteasomale Degradation des TAP-Komplexes zurückzuführen war. Die Untersuchung von C-terminal verkürzten UL49.5-Mutanten zeigte, dass die letzten zwei C-terminalen Aminosäuren essenziell für die Induktion der TAP-Degradation sind. Die C-terminale Domäne von UL49.5 konnte jedoch, nach Übertragung auf andere Proteine, keine proteasomale Degradation des TAP-Komplexes einleiten. Demnach ist ein weiterer Bereich des Proteins für diesen Prozess zwingend notwendig. Erstaunlicherweise waren auch N-terminal verkürzte UL49.5-Proteine deutlich in ihrer inhibitorischen Funktion beeinträchtigt. Bereits nach der Deletion von 10 N-terminalen Aminosäuren war das Protein nicht mehr in der Lage, eine proteasomale Degradation des TAP-Komplexes einzuleiten. Demnach spielt auch die ER-luminale Domäne von UL49.5 eine wichtige Rolle bei der UL49.5-induzierten TAP-Degradation. Somit wurde ein bisher noch nicht beschriebener neuartiger Inhibitionsmechanismus für das BHV-1 UL49.5-Protein entdeckt. Nach Bindung von UL49.5 über die Transmembrandomäne an beide Untereinheiten des TAP-Transporters scheint die ER-luminale Domäne von UL49.5 ein Signal über die ER-Membran an die zytoplasmatische Domäne zu übertragen, die dann die proteasomale Degradation des TAP-Komplexes einleitet. Es konnte im Rahmen dieser Doktorarbeit erstmals gezeigt werden, dass additive Effekte eines sehr kleinen Virusproteins auf zwei unterschiedlichen Seiten der ER-Membran zu einer proteasomalen Degradation eines sehr großen Membran-Komplexes führen.
Ziel dieser Dissertation war es, die biologische Rolle der Autophagie für die Entwicklung, Alterung und mitochondriale Qualitätskontrolle in dem Ascomyceten Podospora anserina zu untersuchen. Folgende Ergebnisse wurden dabei erzielt:
1. Der Verlust einer funktionalen Autophagie-Maschinerie ist in P. anserina mit einem Defekt der Sporen-Entwicklung bzw. -Keimung charakterisiert.
2. Es konnten drei Methoden zur Untersuchung der Autophagie in P. anserina etabliert werden: 1) Die Verwendung eines Gfp::PaAtg8-Stamms ermöglicht die Fluoreszenzmikroskopische Bestimmung der Autophagosomen-Anzahl; 2) Die phänotypische Charakterisierung des PaAtg1-Deletionsstamms unter verschiedenen Stressbedingungen (z. B. Stickstoffmangel, Rapamycin) liefert Hinweise auf eine mögliche Autophagie-abhängige Stressadaption; 3) Die Verwendung des „GFPcleavage assays“ ermöglicht einen quantitativen Nachweis genereller und selektiver Autophagie (hier: Mitophagie).
3. In zwei voneinander unabhängigen Experimenten wurde ein altersabhängiger Anstieg der Autophagie für P. anserina demonstriert: Das Autophagie-Niveau nimmt in gealterten P. anserina-Kulturen zu. Gleichzeitig resultiert der Verlust der Autophagie in ∆PaAtg1 in eine reduzierte Lebensspanne. Unter Stressbedingungen (hier: Stickstoffmangel) wird dieser positive Einfluss der Autophagie auf die Lebensspanne im Wildtyp sogar noch verstärkt.
4. Der unerwartet „gesunde“ Phänotyp der PaSod3-Deletionsmutante ist abhängig von einer funktionalen Autophagie-Maschinerie. Der Mitophagie wurde eine besondere Rolle als Kompensationsmechanismus für den Verlust von PaSOD3 zugeteilt, da das Mitophagie-Niveau in dieser Mutante erhöht ist. Am Beispiel dieser Mutante, für die ein erhöhter Superoxid-Ausstoß nachgewiesen wurde, konnte eine Dosis-abhängige Wirkung von ROS in P. anserina identifiziert werden. Eine geringe zelluläre ROSMenge verursacht eine mitohormetische Reaktion, die eine Induktion der Mitophagie zur Folge hat und sich positiv auf den Organismus auswirkt. Übersteigt die zelluläre ROS-Dosis einen kritischen Punkt, kommt es zur Induktion des autophagischen Zelltods und damit zum vorzeitigen Tod des Individuums.
5. Der Verlust der PaCLPXP-Protease führt zu Beeinträchtigungen in der Funktion und Zusammensetzung der mitochondrialen Atmungskette. Dieses Defizit im Energiemetabolismus wird über eine Induktion der AOX, vor allem aber über eine ZUSAMMENFASSUNG 127 gesteigerte Autophagie kompensiert. Die deutlich verlängerte Lebensspanne der verschiedenen PaClpXP-Deletionsmutanten (∆PaClpX, ∆PaClpP und ∆PaClpXP) ist abhängig von einer funktionalen Autophagie-Maschinerie. Interessanterweise konnte keine kompensatorische Funktion der Autophagie oder Mitophagie für den Verlust der mitochondrialen i-AAA-Protease PaIAP in P. anserina nachgewiesen werden.
Autophagie/Mitophagie stellt einen übergeordneten Qualitätskontrollmechanismus in P. anserina dar, der den Organismus sehr effektiv vor zellulären Schäden und Dysfunktionen bewahrt und einen positiven Einfluss auf die Alterung, Entwicklung und Energieversorgung einnimmt.
Der Typ 1 Diabetes mellitus (IDDM) ist eine multifaktorielle Erkrankung deren Risiko zu 50-60% von genetischen Faktoren vermittelt werden, wobei dem HLA-System auf Chromosom 6 (IDDM1) eine Schlüsselrolle zugesprochen wird. Innerhalb dieser Genregion befinden sich die beiden solitären retroviralen "long terminal repeats" (LTRs) DQ-LTR3 und DQ-LTR13. Sie können theoretisch mit Hilfe ihrer regulatorischen Elemente die Expression benachbarter funktioneller Gene beeinflussen. Im Rahmen der Fragestellung nach einer möglichen Funktion retroviraler LTRs im Kontext des Typ 1 Diabetes mellitus ist das unmittelbar benachbarte DQB1 Gen ein Kandidatengen von besonderer Bedeutung. Im Rahmen einer Familienassoziationsstudie wurde DQ-LTR13 als potentieller genetischer Risikomarker charakterisiert und es konnte gezeigt werden, daß die Haplotypen DQ8/LTR13+ und DQ2/LTR13- signifikant häufiger transmittiert werden als bei einer zufälligen Vererbung erwartet. Gleichzeitig unterscheidet sich ihr Segregationsmuster signifikant von dem der Haplotypen DQ8/LTR13- und DQ2/LTR13+. Das Kopplungsungleichgewicht zwischen DQ-LTR3 und DQ-LTR13 ist so ausgeprägt, daß sie zwar präferentiell aber nicht ausschließlich zusammen auf einem Haplotypen vorkommen. Die Wahrscheinlichkeit einer Erkrankung an IDDM in Zusammenhang mit einem der beiden Risikohaplotypen DQ8/LTR13+ bzw DQ2/LTR13- liegt bei 76% bzw. 68%. Aufgrund dieser Ergebnisse ist DQ-LTR13 insgesamt als unabhängiger genetischer Risikomarker für Typ 1 Diabetes mellitus zu bewerten, zusätzlich zu den bekannten Risikohaplotypen DQ8 und DQ2 und unabhängig von DQ-LTR3. Im Rahmen funktioneller Analysen unter Verwendung eines Reportergen-Assays konnte nach Transfektion diverser EBV-transformierter lymphoblastoider B-Zellen für keine der beiden LTRs die Fähigkeit nachgewiesen werden, als eigenständiger Promotor auf die Expression des Reportergens Luciferase zu wirken. Diese Fähigkeit konnte auch nicht durch die Gabe von Hydrocortison bzw. ß-Estradiol induziert werden. DQ-LTR13 ist jedoch in vitro in der Lage, abhängig von transkriptioneller Orientierung und Position, über den Promotor des DQB1 Gens verstärkend auf die Expression des Luciferase-Gens zu wirken. Dieser Effekt ist darüber hinaus, bezüglich der beiden Risikoallele DQB1*0302 und DQB1*0201, differentiell ausgeprägt. Eine Verifizierung des beobachteten Effekts in vivo war im Rahmen der vorliegenden Doktorarbeit leider nicht möglich.
In der vorliegenden Arbeit sollte das basolaterale Targeting des Transmembranproteins shrew-1 in polarisierten Epithelzellen analysiert werden. Es konnte gezeigt werden, dass die cytoplasmatische Domäne von shrew-1 mehrere spezifische basolaterale Sortingmotive enthält. Die Funktionalität dieser Motive wurde anhand Mutationsanalysen von Schlüsselaminosäuren untersucht. Substitution dieser Aminosäuren führt zu einer apikalen Lokalisation von shrew-1 in polarisierten MDCK Zellen. Durch Analyse der Proteinverteilung von shrew-1 Varianten in polarisierten LLC-PK1 Zellen wurde deutlich, dass das Sorting von shrew-1 in die basolaterale Plasmamembran ein AP-1B-abhängiger Prozess ist. Außerdem konnte mittels Coimmunopräzipitation eine Interaktion zwischen shrew-1 und der Untereinheit my1B aus dem Adapterproteinkomplex AP-1B nachgewiesen werden. Untersuchungen des Targetings von shrew-1 Varianten in polarisierten MDCK und LLCPK1 Zellen mit Hilfe der Transzytoseexperimente zeigten, dass die apikal lokalisierte Mutante shrew-1-NTD5 auf dem Weg zur apikalen Membranregion, trotz fehlender Sortinginformation, die basolaterale Plasmamembran durchquert. Durch Inhibition der Membranfusion mittels Tanninsäure konnte zusätzlich gezeigt werden, dass die Passage der basolateralen Plasmamembran für das Targeting von sowohl shrew-1 als auch von shrew-1-NTD5 essentiell ist. Die Beobachtungen des Turnovers von shrew-1 in der Plasmamembran von lebenden Zellen zeigten, dass shrew-1 aktiv endozytiert wird und dass nachfolgend ein Recycling des Proteins zur Plasmamembran stattfindet. Anhand der durchgeführten Untersuchungen lässt sich zusammenfassend ein Targetingmodell für shrew-1 in polarisierten Epithelzellen aufstellen, das ein postendozytotisches Sorting beschreibt: Dabei wird shrew-1 zunächst in Post-Golgi-Carriern auf unbekanntem Weg zur basolateralen Plasmamembran gebracht, wo seine unmittelbare Internalisierung und ein Weitertransport zum Recyclingendosom stattfinden. Der im Recyclingendosom lokalisierte und am Sorting beteiligte Adapterproteinkomplex AP-1B vermittelt dann den Rücktransport von shrew-1 zur basolateralen Plasmamembran.
Die aktuellen HIV Medikamente basieren sich zum größten Teil auf Substanzen, die gegen virale Proteine gerichtet sind. Ein großer Nachteil dieser Medikamente besteht darin, dass das HI-Virus durch Mutationen Resistenzen gegen diese Substanzen entwickeln kann. Zelluläre Co-Faktoren als antivirales Ziel in der HIV-Therapie zu nutzen, könnte ein neuer Lösungsansatz sein, da das menschliche Genom stabiler ist als das virale. Der Schwerpunkt dieser Arbeit konzentriert sich auf die RNA Helikase DDX3, welche als zellulärer Co-Faktor für die HIV-1 Replikation identifiziert wurde.
Im Rahmen der Dissertation wurde die RNA-Helikase DDX3 durch biochemische Untersuchungen von DDX3Wt und DDX3-Mutanten näher charakterisiert. Die Versuche zeigten, dass die konservierten Motive V und VI bei DDX3Wt für die Bindung und Hydrolyse von ATP essentiell sind. Die spezifische DDX3 Insertion wies ebenfalls eine mutmaßliche Rolle bei der ATP-Bindung und bei Ausbildung der ATP-Bindestelle auf. Ferner konnte für die spezifische Insertion von DDX3 eine Funktion bei der Bindung von viraler RNA Bindungsnachweise nachgewiesen werden. Daher bietet diese Insertion von DDX3 ein mögliches Ziel für die spezifische Modulation bzw. Manipulation der Interaktion von DDX3Wt und viralen Interaktionspartnern sein, ohne weitere RNA Helikasen zu beeinflussen.
Zusätzlich wurden weitere Eigenschaften von DDX3Wt entdeckt. Die ATPase-Aktivität von DDX3Wt konnte durch die Zugabe von ssDNA deutlicher stimuliert werden, als durch die Zugabe ssRNA. Das DDX3Wt eine höhere katalytische Effizienz durch DNA aufweist ist neu, da die meisten DEAD-box Helikasen eine Präferenz für RNA als Co-Faktor für die ATPase-Aktivität besitzen. Des Weiteren konnte erstmalig nachgewiesen werden, dass DDX3 neben der ATPase-Aktivität auch eine Exonuklease-Aktivität besitzt. Die Versuche zeigten, dass DDX3Wt in der Lage war, ssDNA und dsDNA effizient zu spalten. In der DDX3Wt AS-Sequenz wurden fünf Aminosäuresequenz-Motive, sogenannte Exonuklease-Boxen identifiziert, die mit der Exonukleaseaktivität in Verbindung gebracht werden. Die Untersuchung der Bindungseigenschaften von DDX3Wt zeigte auf, dass DDX3Wt auch ohne den zellulären Co-Faktor XPO1 in der Lage ist, virale HIV-1 RNA und DNA direkt zu binden. Diese Erkenntnisse tragen dazu bei, die Funktionen von DDX3Wt im zellulären System besser zu verstehen. Eine genaue Analyse ist Voraussetzung für die Entwicklung von spezifischen Inhibitoren, die die Interaktion von HIV-1 und DDX3Wt hemmen sollen ohne dabei zelluläre Prozesse negativ zu beeinflussen.
Durch Lokalisationsstudien konnte ein neuer relevanter Angriffspunkt für die Inhibition der HIV-1 Replikation identifiziert werden. Denn entgegen den Literaturangaben spielt das putative Leucin-reiche Exportsignal im N-Terminus von DDX3Wt eine wichtige Rolle beim Export aus dem Zellkern und somit auch für die Interaktion mit XPO1.
Mithilfe der Phagen-Display-Technologie konnte im Rahmen dieser Arbeit ein Sequenz-spezifischer Peptid-Ligand für die Insertion von DDX3 identifiziert werden, der eine Aminosäurehomologie zu dem zellulären Co-Faktor XPO1 zeigt. Das identifizierte Peptid DDX3-INS1 wurde für weitere Untersuchungen in Verbindung mit einer Proteintransduktionsdomäne synthetisiert. Das Peptid DDX3-INS1 ist in HIV-1 infizierten Zellen funktionell aktiv und inhibiert die Produktion von HI-Viren ab einer Konzentration von 20 µM ohne dabei toxische oder virolytische Effekte auszuüben. Weitere funktionelle Untersuchungen werden zeigen, ob das selektionierte Peptid DDX3-INS1 als therapeutisches Medikament für die Inhibition von HIV-1 geeignet ist.
Ausgangspunkt dieser Doktorarbeit ist die dominant erbliche hypertrophische Kardiomyopathie, eine Herzkrankheit, die mit Funktionseinschränkungen des Myokards und einem relativ hohen Risiko für einen plötzliche Herztod assoziiert ist. Als Ursachen wurden ca. 160 Mutationen in bisher zehn verschiedenen Genen nachgewiesen, die - mit einer möglichen Ausnahme - für Proteine des kardialen Sarkomers kodieren. Am häufigsten betroffen sind das ventrikelspezifische -Myosin (schwere Kette) sowie das kardiale Myosin-Bindungsprotein C. Ein in Bad Nauheim initiiertes Projekt hat zum Ziel, die Wirkungen einer Mikrodeletion im - Myosingen (Deletion des Codons 927, E927) auf die Struktur und Arbeitsweise des Herzens in transgenen Mäusen zu untersuchen. Es ist bei diesem Projekt beabsichtigt, die Expression des mutierten Myosin-Transgens so zu steuern, dass es nicht unkontrolliert dauernd (konstitutiv), sondern zeitlich kontrolliert (induzierbar) im Herzen exprimiert wird. Als Induktionssystem der Wahl ist dabei das bakterielle Tetrazyklinrepressor-System vorgesehen. Dieses besteht aus dem Repressor tetR, einer DNA- Repressor-Bindungssequenz tetO und einem von außen zugeführten Induktor (Tetrazyklin, tet, oder Doxyzyklin, DOX, einem tet-Derivat). Da dieses Regulationssystem vor dem aufwändigen Einsatz an transgenen Mäusen zunächst in vitro an Zellkulturen zu testen war, wurden für die transiente Transfektion von Zellen in Kultur zwei Plasmide (mit jeweils zwei verschiedenen Promotoren, also insgesamt vier Plasmide) hergestellt. Ein Plasmid enthielt den Repressor und das zweite die tetO-Sequenz mit einem nachgeschalteten Reportergen (lacZ für -Galactosidase). Die beiden Promotoren waren der ubiquitäre virale CMV-Promotor (hCMV-Promotor) einerseits und der herz- und mäusespezifische -Myosin-Promotor (-MHC Promotor) andererseits. Getestet wurde die Regulierbarkeit des Reportergens in transient transfizierten COS1-Zellen, L6 Myoblasten sowie an neonatalen Kardiozyten von Ratten. Für die Kotransfektion von jeweils einem Paar der Plasmide (mit dem tetR-Gen, bzw. dem tetO/lacZ-Gen) wurde ein modifiziertes und in dieser Arbeit optimiertes ballistisches System (Gene Gun von BioRad) benutzt. Die Versuchsanordnung bestand aus Anzüchtung der Zellen, Transfektion, Induktion und Nachweis des Reporterenzyms. Mit dem hCMV-Promotor wurde in allen drei getesteten Zelltypen eine von DOX abhängige Expression der -Galaktosidase nachgewiesen. Mit dem -MHC Promotor, der wegen seiner Herzspezifität nur an kardialen Rattenmyozyten getestet werden konnte, waren in der Standardversuchsanordnung (nach DOX Induktion) nur sehr geringe Mengen an - Galaktosidase nachweisbar. Um die Regulierbarkeit des lacZ-Gens eindeutig zu demonstrieren, wurden als Stimulatoren des -MHC Promotors die Hormone Trijodthyronin, Insulin und Dexamethason einzeln und in Kombination verwendet. Die höchste Stimulierung (ca. 5-fach) wurde mit einer Kombination aller drei Hormone erreicht. In dieser Anordnung wurde damit gezeigt, dass das binäre tetR/tetO-System in vitro nach Induktion auch mit dem -MHC Promotor funktioniert. Mit diesem Resultat war - im Prinzip - der Weg für Experimente mit transgenen Mäusen vorgegeben. In Transgen-Linien mit Einzeltransgenen (entweder mit dem tetR-Gen oder dem lacZ-Gen, beide unter Kontrolle des -MHC Promotors, letzteres zusätzlich mit der tetO- Sequenz für den Repressor) wurde die herzspezifische Expression der -Galaktosidase eindeutig nachgewiesen, nicht jedoch die des tet-Repressors. Die Gründe dafür können gegenwärtig nur vermutet werden. Die Zahl der Genkopien könnte unzureichend gewesen sein. Da es sich um ein bakterielles Gen handelt, könnte auch eine ungünstige Codon-Verwendung einer effizienten Expression entgegenstehen. Zur Klärung dieser Umstände sind weitere Versuche (die nicht mehr Gegenstand dieser Doktorarbeit sind) inzwischen initiiert worden. Das hier in Zellkultur getestete Regelsystem wird als tetON-System charakterisiert, bei dem das Transgen, dessen Expression kontrolliert werden soll (jetzt das Gen für -Galktosidase, später ein mutiertes ventrikelspezifisches Myosingen), erst nach Zugabe des Induktors (Doxyzyklin, bei Mäusen im Trinkwasser) aktiviert wird. Damit unterscheidet sich dieses System von vielfach benutzten tetOFF-Systemen. Diese bestehen aus einem hybriden Protein, das aus zwei verschiedenen Struktur/Funktionsdomänen besteht: der tet-Bindungsdomäne des bakteriellen tet-Repressors und einem viralen ubiquitären Transkriptionsaktivator (das Hybridprotein hat die Bezeichnung tTA). Die zu regulierenden Zielgene enthalten die tetO- Sequenz. Bindung von tet an tTA führt zur Dissoziation des tTA/tetO-Komplexes und damit zur Deaktivierung des Zielgens. Entzug von tet erlaubt die Bindung von tTA an den Promotor des Zielgens und ermöglicht damit dessen Transkription. Dieses System, dessen Funktionalität an Modellversuchen nachgewiesen wurde, hat gleichwohl Nachteile. Diese sind erstens auf eine gewisse Toxizität des Transkriptionsaktivators tTA und zweitens auf negative Wirkungen in Verbindung mit der Dauerzufuhr von Tetrazyklin (zur Unterdrückung der Expression des Zielgens) zurückzuführen. Da ein in der Literatur auch beschriebenes tTA-basiertes tetON- System als nicht ausreichend berichtet wird, erscheint der Aufwand für die Herstellung eines einfachen (nicht-viralen) und ggf. genetisch modifizierten tetON-Systems für die Anwendung an Mäusen sinnvoll und notwendig.