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Paracoccus denitrificans besitzt eine verzweigte Elektronentransportkette. Unter aeroben Bedingungen werden die Elektronen ausgehend von Ubichinol bevorzugt über den bc 1 Komplex auf die aa 3 Cytochrom c Oxidase übertragen. Alternativ können die Elektronen jedoch unter Umgehung des bc 1 Komplexes direkt auf die ba 3 Chinoloxidase transferiert werden. Diese gehört wie die Cytochrom c Oxidase zur Gruppe der HämKupfer Oxidasen; sie reduzieren Sauerstoff zu Wasser und koppeln diese Reaktion an eine vektorielle Translokation von Protonen über die Membran. Die vorgelegte Dissertation befaßt sich mit der Charakterisierung der ba 3 Chinoloxidase. Mittels Mutationen sollen ausgesuchte Aminosäuren untersucht werden, die an der Protonen Translokation bzw. der Reduktion von Sauerstoff beteiligt sind. Zudem soll das Phänomen der heterogenen Untereinheit II geklärt sowie die Notwendigkeit für die Anwesenheit von Häm a in der highspin Position untersucht werden. Dazu mußte zunächst das homologe Expressionssystem für die ba 3 Chinoloxidase verbessert werden. Zu diesem Zweck wurde ein aa 3 /ba 3 ParacoccusDeletionsstamm geschaffen, der es ermöglicht, die Expression der auf einem Plasmid in trans angebotenen Gene der Chinoloxidase um den Faktor fünf zu erhöhen. In Anlehnung an ein bereits existierendes Reinigungsprotokoll ist es gelungen, die Chinoloxidase in einem zweistufigen säulenchromatographischen Verfahren zu isolieren. Das gereinigte Enzym oxidiert sein Substrat Ubichinol in einer pHabhängigen, aber Ionenstärke unabhängigen Reaktion. Bis dato sind zwei Kanäle definiert, der D und der KKanal, über die Protonen ausgehend vom Cytoplasma bis zum binukleären Zentrum transportiert werden. Diese werden dann entweder für die Reduktion des Sauerstoffs verwendet oder gekoppelt an diesen Prozeß über die Membran transloziert. Durch gezielte Punktmutationen sowie GanzzellPumpexperimente kann der Beginn eines weiterführenden ProtonenAusgangskanals bestimmt werden, der durch die benachbarten Arginine 490, 491 und das DRingPropionat des highspin Häms gebildet wird. Durch WasserstoffbrückenBindungen und Ladungsinteraktionen stabilisieren diese Arginine die deprotonierte, anionische Form der PropionatGruppe und erlauben somit eine transiente Bindung von Protonen an das Propionat. Für die Stabilisierung dieses Zustands bzw. die spätere Weiterleitung von Protonen scheint unter anderem die Aminosäure Aspartat 416 verantwortlich zu sein, da eine Mutation an dieser Position zu einem entkoppelten Phänotyp führen kann. Für die Reduktion des Sauerstoffs werden vier Elektronen benötigt. Da aber das vollständig reduzierte binukleäre Zentrum nur drei Elektronen liefern kann, wird ein Tyrosinradikal diskutiert, welches das benötigte vierte Elektron zur Verfügung stellen soll. Gezielte Punktmutationen und spektroskopische Analysen der ba 3 Chinoloxidase sollten zeigen, ob es sich dabei um Tyrosin 297 handelt, dessen Radikalform durch eine kovalente Bindung zu Histidin 293 stabilisiert wäre. Die Mutationen Y297H und Y297F führen in beiden Fällen zu einer enzymatisch inaktiven ba 3 Chinoloxidase. Durch FTIRSpektroskopie kann gezeigt werden, daß Mutationen an dieser Position die Stabilität des binukleären Zentrums beeinflussen. Es läßt sich jedoch aufgrund der fehlenden Enzymaktivität sowie der Störung der geometrischen Struktur des binukleären Zentrums keine Aussage über die Bedeutung der Aminosäure Tyrosin 297 als Elektronendonor treffen. Die Verkürzung des CTerminus der Untereinheit II durch das Einbringen von StopCodons zeigt, daß es sich bei der Heterogenität dieser Untereinheit um einen proteolytischen Abbau handeln muß. Dieser geschieht an spezifischen, aber bisher noch nicht näher charakterisierten Positionen, hat aber keinen Einfluß auf den Zusammenbau oder die Aktivität der Oxidase. Durch die heterologe Expression der bo 3 Chinoloxidase aus E. coli in Paracoccus kann gezeigt werden, daß eine Grundvoraussetzung für eine aktive Chinoloxidase ein farnesyliertes Häm b Derivat in der highspin HämPosition ist. Die dadurch gebildete HydroxylGruppe stellt eine Möglichkeit dar, wie die für die Reduktion des Sauerstoffs notwendigen Protonen das binukleäre Zentrum erreichen können. Ob es sich dabei um ein Häm a oder o handelt, ist wirtsspezifisch und eine Frage der HämVerfübarkeit bzw. des HämEinbaus.
In der vorliegenden Arbeit wurden die Porcinen Endogenen Retroviren (PERV) erstmals ausführlich biochemisch und biologisch charakterisiert sowie ihr Wirtsspektrum und ihre Expression in vitro näher analysiert. Es wurden sensitive immunologische Nachweismethoden entwickelt, die in experimentellen, präklinischen und ersten klinischen Studien zur Xenotransplantation angewandt wurden. Die Charakterisierung der Viren ergab, daß es sich um TypCRetroviren handelt, wobei ein Teil der Partikel nicht gereift ist. In hoch gereinigten Viruspräparationen aus Überständen produzierender porciner und PERVinfizierter, humaner Zellen konnten alle Strukturproteine identifiziert werden. Dazu wurden neben Elektrophoresen Western BlotAnalysen eingesetzt, wobei kreuzreaktive Antiseren gegen verwandte Viren und neu entwickelte, erstmals gegen PERVProteine gerichtete Antiseren benutzt wurden. Bei der Untersuchung der biologischen Eigenschaften wurde gezeigt, daß PERV in vitro ein mit anderen Retroviren vergleichbares immunsuppressives Potential besitzt. Mit diesen neuen Antiseren und den hoch gereinigten Viruspräparationen wurden sehr sensitive Western BlotVerfahren sowie ELISAs auf der Basis synthetischer Peptide als Nachweissysteme etabliert und validiert. Zuerst wurden Seren gesunder Blutspender mit diesen Tests untersucht. Dann wurden Seren von Schlachtern und von Patienten nach Xenotransplantationen getestet. Erstmals wurden auch Seren von Pavianen, denen u.a. auch ganze Schweineorganen transplantiert wurden und die eine profunde, für zukünftige Anwendungen typische, pharmakologische Immunsuppression erhielten, auf Antikörper gegen PERV untersucht. Bei Seren einiger Patienten und gesunder Blutspendern wurden zwar Kreuzreaktionen mit viralen Proteinen gefunden, es lagen aber keinerlei Anzeichen für eine PERVInfektion vor. Um das Wirtspektrum von PERV zu analysieren, wurden Zellinien und erstmals auch primäre Zellen verschiedener Spezies einschließlich Ratte und Maus mit PERV inokuliert. Dabei wurden erstmals Hinweise auf die Suszeptibilität von humanen Blutzellen erhalten. Es konnte gezeigt werden, daß mitogenstimulierte porcine PBMC PERV freisetzen können, wobei alle drei Subtypen der Hüllproteine nachgewiesen wurden. Eine nähere Analyse ergab daß verschiedene Schweinerassen aber auch einzelne Individuen der gleichen Rasse unterschiedliche Mengen an Virus freisetzen. Unter bestimmten Stimulationsbedingungen wurde PERV von adhärenten Zellen produziert, die nicht näher charakterisiert werden konnten. Eine endgültige Beurteilung des Infektionsrisikos bei Xenotransplantationen ist nach Abschluß dieser Studie noch nicht möglich. Mit der Charakterisierung von PERV und den immunologischen Nachweismethoden wurden die Voraussetzung für die Analyse weiterer experimenteller und klinischer Xenotransplantationen gelegt.
Für eine zukünftige Gentherapie der Immunschwächekrankheit AIDS ist ein effizienter, spezifischer und sicherer Gentransfer in CD4-positive Zellen des peripheren Blutes erforderlich. Hierzu bieten sich vom murinen Leukämievirus (MLV) abgeleitete retrovirale Pseudotypvektoren an, die das Hüllprotein (Env) des HIV-1 oder des simianen Immundefizienzvirus der Afrikanischen Grünen Meerkatze (SIVagm) tragen und daher einen selektiven Gentransfer in CD4-positive Zielzellen bewirken (Transduktion). [MLV(SIVagm)]-Vektoren haben gegenüber [MLV(HIV-1)]-Vektoren den Vorteil, daß sie von Seren HIV-1-positiver Patienten nicht neutralisiert werden und daher auch in HIV-1-infizierten Patienten angewendet werden könnten. Jedoch kann aufgrund des Tropismus von SIVagm mit [MLV(SIVagm-wt)]-Vektoren nur die kleine Subpopulation der CCR5-positiven Zellen innerhalb der humanen CD4-positiven Lymphozyten (3 bis 15%) transduziert werden. Das Ziel dieser Arbeit war es daher, den Tropismus des SIVagm Env so zu modifizieren, daß auch die Mehrzahl der CD4-positiven Lymphozyten, die den CXCR4-Korezeptor exprimieren (70 bis 95%), transduziert werden kann. Hierzu wurde die putativ für die Korezeptorbindung verantwortliche V3- Loop-Region im Env des SIVagm durch die homologe Region eines CXCR4-tropen HIV-1-Stammes ersetzt. Mit diesem modifizierten Env gelang es, [MLV(SIVagm-X4)]- Pseudotypvektoren herzustellen, die spezifisch CD4/CXCR4-positive Zellen transduzieren können. Neben der Bedeutung für die Generation neuer Vektoren für die Gentherapie beweist dieses Ergebnis die bisher nicht gezeigte Äquivalenz der V3- Loops der Hüllproteine von HIV-1 und SIVagm für die Korezeptornutzung. Um die neuen [MLV(SIVagm)]-Vektoren charakterisieren zu können und für eine spätere Anwendung weiterzuentwickeln, wurden stabile Zellinien etabliert, die große Vektormengen mit Titern zwischen 6x103 und 7,6x105 i.E./ml produzierten. Mittels Ultrazentifugation konnten Vektorpräparationen mit Titern bis zu 108 i.E./ml hergestellt werden. Die neu generierten [MLV(SIVagm-X4)]-Vektoren erwiesen sich wie die [MLV(SIVagm-wt)]-Vektoren als resistent gegenüber der Neutralisierung durch Seren HIV-1-infizierter Spender und könnten damit in vivo angewendet werden. In Experimenten zur Bestimmung der Transduktionseffizienz in primären peripheren Blutlymphozyten humaner Spender konnte der selektive Gentransfer mittels [MLV(SIVagm)]-Vektoren in CD4-positive Zellen gezeigt werden, während herkömmliche, amphotrope Vektoren CD4-positive und -negative Lymphozyten gleichermaßen transduzierten. Beide [MLV(SIVagm)]-Vektoren erlaubten im Vergleich zu den eingesetzten amphotropen MLV-Vektoren eine höhere Transduktionseffizienz in CD4-positiven Zellen. Neben Zielzell-Spezifität und Effizienz ist die Sicherheit neuer Vektorsysteme entscheidend für die Anwendbarkeit in der humanen Gentherapie. Eine Übertragung replikationskompetenter Retroviren (RCR) gilt hierbei als das Hauptrisiko bei der Nutzung retroviraler Vektoren. Auch bei der Herstellung von [MLV(HIV-1)]- oder [MLV(SIVagm)]-Pseudotypvektoren könnten durch Rekombinationsereignisse in den Verpackungszellen replikationsfähige Hybridviren entstehen. Bei der Untersuchung dieser Vektorsysteme wurde allerdings bisher keine spontane Bildung von RCR nachgewiesen. In der vorliegenden Arbeit wurde versucht, durch molekulare Klonierung gezielt derartige Hybridviren zu generieren, um zu klären, ob solche Onko/Lenti-Hybridviren replikationsfähig sein können, zudem sollte gegebenenfalls das pathogene Potential dieser Viren untersucht werden. Dazu wurden die vollständigen Leserahmen des rev- und des env-Gens des HIV-1 bzw. SIVagm anstelle des MLV env-Gens in das Genom eines infektiösen molekularen Klon des MLV inseriert. Die Klonierungsstrategie wurde dabei so gewählt, daß alle notwendigen mRNAs gebildet werden konnten. Die Hybridvirusklone waren nach Transfektion in 293T-Zellen tatsächlich in der Lage, neben den MLV-Genen auch HIV-1 bzw. SIVagm env und rev funktionell zu exprimieren. Es konnten infektiöse Partikel nachgewiesen werden, die das Hybridvirusgenom auf Zielzellen übertragen konnten. In den infizierten Zielzellen wurde jedoch nur die Expression von MLV/SIVagm nachgewiesen werden. Keines der beiden Hybridviren erwies sich als replikationskompetent. Dies deutet darauf hin, daß die Bildung replikationskompetenter Onko/Lenti-Hybridviren unwahrscheinlich ist. Mit den [MLV(SIVagm)]-Vektoren steht somit ein Vektorsystem zur Verfügung, das sich für In-vivo-Anwendungen im HIV-infizierten Patienten eignet. Es konnte gezeigt werden, daß humane CD4-positive Lymphozyten mittels [MLV(SIVagm)]-Vektoren spezifisch, aber auch effizienter und sicherer transduziert werden als unter Verwendung bisher beschriebener amphotroper MLV-Vektoren.
Die Hämatopoese stellt den blutbildenden Prozeß dar, der den Menschen ein Leben lang mit Blutzellen versorgt und deren Ausgangspunkt eine kleine Zahl hämatopoetischer Stammzellen ist. Diese Stammzellen besitzen einerseits die Fähigkeit zur Selbsterneuerung und sind andererseits in der Lage, durch Proliferation und terminale Differenzierung Zellen verschiedener Linien hervorzubringen. Das biologische Hauptmerkmal der Stammzelle ist die Fähigkeit die Hämatopoese zu rekonstituieren, was klinisch bei der Stammzelltransplantation genutzt wird. Überwiegend werden dabei Knochenmark und peripheres Blut als Quelle für Stammzellen genutzt, die abhängig von der Zahl der transplantierten Zellen zur völligen Rekonstitution der Blutbildung führen. Für Patienten ohne passende Spender wurde das Nabelschnurblut als Alternative in Betracht gezogen. Trotz verschiedener Vorteile der Stammzellen aus Nabelschnurblut besteht der Hauptnachteil in der sehr limitierten Zahl der Zellen mit dem erhöhten Risiko eines Transplantatversagens. Aus diesem Grund wird die ex vivo Vermehrung dieser Stammzellen derzeit zunehmend untersucht. Erforderlich sind Bedingungen zur ausreichenden Vermehrung der Zellen unter Erhalt der Stammzelleigen schaften, die die klinische Anwendung möglich machen. Diese Bedingungen waren bisher nicht erfüllt. Hauptziel dieser Arbeit war es demnach Kulturbedingungen für die Expansion von Stammzellen aus Nabelschnurblut zu etablieren, die den klinischen Anforderungen einer Transplantation genügen. Dafür wurden sowohl die determinierten Vorläuferzellen untersucht, als auch die Fähigkeit der Stammzelle in vitro Langzeithämatopoese aufrecht zu erhalten und zur Repopulierung der NOD/SCIDMaus. Die Repopulierung ist ein spezifischer Prozeß (Homing), bei dem die Migration der Zellen aus der Blutbahn durch die Endothelzellschicht der Gefäße in die spezialisierten Nischen des Knochenmarks erfolgt. Da für die Amplifikation äußere Stimuli erforderlich sind, welche die biologischen Eigenschaften der Zellen modulieren, wurden die Eigenschaften der expandierten Zellen in verschiedenen in vitro Assays wie CFU und LTCIC untersucht, die derzeit als die besten Verfahren gelten, die hämatopoetische Stammzelle zu detektieren. Zur Untersuchung der Repopulierungsfähigkeit wurde das NOD/SCIDMausmodell etabliert, in dem der Aufbau einer humanen Hämatopoese im murinen Knochenmark gemessen wird, sowie ein neues in vitro Modell entwickelt, das Stromazellsphäroid, mit dessen Hilfe die Migrationsfähigkeit untersucht wurde. Mit der Kombination der auf primitive Stammzellen wirkenden Zytokine SCF, FL, TPO und IL3 gelang eine gute und ausreichende Vermehrung der ontogenetisch unreifen und der determinierten Progenitorzellen nach Kultivierung der Zellen über 7 Tage. Das beim Einsatz in der ex vivo Expansion umstrittene Zytokin IL3 führte hierbei nicht zum befürchteten Verlust der Repopulierungsfähigkeit der expandierten Zellen. Es sorgte vielmehr durch eine starke Vermehrung der Zellen für ein Engraftment der NOD/SCIDMaus, das dem durch frische unmanipulierte Nabelschnurblutzellen vergleichbar war. Von den getesteten Kultursystemen erwies sich die statische Kultivierung im Teflonbeutel als geeignet zur Vermehrung der primitiven Progenitoren, ohne die Repopulierungsfähigkeit der expandierten Zellen zu vermindern. Durch die Wahl eines serumfreien, klinisch anwendbaren Mediums gelang somit die Etablierung eines Kultursystems zur optimierten ex vivo Expansion früher Progenitor und Stammzellen aus Nabelschnurblut ohne Verlust der Repopulierungsfähigkeit für die klinische Anwendung. Das Homing in das Knochenmark ist ein selektiver aus mehreren Einzelschritten bestehender Prozeß unter Interaktion der Zellen mit Endothelzellen und dem Knochenmarkstroma, der durch eine Vielzahl verschiedener zusammenwirkender Adhäsionsmoleküle reguliert wird. Weitere Faktoren, die das Homing beeinflussen sind Zytokine oder Chemokine. Diese Stimuli wirken über verschiedene intrazelluläre Signalwege, von denen die RhoProteinfamilie der kleinen GTPasen eine bestimmende Rolle in der Migration zugedacht wird, sowie andere Bestandteile der intrazellulären Signaltransduktion, wie Kinasen und GProteine. Die Migration in das Sphäroidmodell ist ebenso ein selektiver und gerichteter Prozeß, bei dem neben den primären CD34 Zellen aus Nabelschnurblut auch andere humane hämatopoetische Zelllinien eine gerichtete Einwanderung zeigen. Durch Zugabe eines Inhibitors von G Proteinen, Pertussis Toxin (PT), und Hemmung der kleinen GTPasen durch spezifische Toxine aus Clostridien konnte eine reproduzierbare und deutliche Verringerung der Migration in das Sphäroid erreicht werden. Die Migration hämatopoetischer Zellen in das Sphäroid erfolgt also unter Beteiligung der kleinen GTPasen, sowie PT sensitiver GProteine. Blockierungsversuche zeigten unerwarteterweise keine funktionelle Beteiligung des ChemokinRezeptorpaares SDF1/CXCR4 und des Adhäsionsmoleküls VLA4 bei der Migra- tion in das Sphäroid. Welche weiteren Mechanismen für diese Migration bedingend sind erfordert weitergehende Untersuchungen. Durch die Kultivierung von hämatopoetischen Stammzellen aus Nabelschnurblut mit den Zytokinen SCF, FL, TPO und IL3 gelang eine ausreichende Vermehrung von frühen und determinierten Progenitorzellen unter Erhalt ihrer Stammzellfähigkeiten, so daß ein klinischer Einsatz möglich wird. Dabei ergab sich durch Untersuchung der Migrationsfähigkeit im Sphäroidmodell, daß beim Homing der Zellen die Aktivierung der kleinen GTPasen und eines Pertussis Toxinsensitiven GProteins beteiligt sind.
Der Cytochrom-bc1-Komplex katalysiert die Elektronenübertragung von Ubihydrochinon auf Cytochrom c in der Atmungskette und in der bakteriellen Photosynthese. Das Enzym stellt somit das Bindeglied zwischen den Ubihydrochinon bildenden Dehydrogenasen und der Cytochrom c oxidierenden Cytochrom-c-Oxidase dar. Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurden die Wechselwirkungen des Cytochrom-bc1-Komplexes aus Saccharomyces cerevisiae mit seinen Substraten Ubichinon und Cytochrom c sowie mit Phospholipiden der inneren Mitochondrienmembran untersucht. Durch Analyse von Gesamtlipidextrakten aus Proben des Cytochrom-bc1-Komplexes konnte gezeigt werden, daß das Enzym in Anwesenheit von vier verschiedenen Phospholipiden gereinigt und kristallisiert werden kann. In der Kristallstruktur des Enzyms bei 2,3 Å Auflösung wurden fünf Bindungsstellen für Phospholipide und eine Bindungsstelle für ein Detergensmolekül identifiziert. Die Bindungsstelle für eines der Phospholipide, ein Cardiolipin-Molekül, liegt am Eingang eines von zwei Protonierungspfaden für die Ubichinon-Reduktionsstelle (Qi-Bindungsstelle). Ein Phosphatidylinosit-Molekül befindet sich in einer außergewöhnlichen Position unweit der flexiblen "Linker"-Region des Rieske Eisen-Schwefel-Proteins und trägt vermutlich zur Stabilisierung dieser katalytischen Untereinheit bei. Durch Röntgenbeugung an Kokristallen bestehend aus Cytochrom-bc1-Komplex und gebundenem Cytochrom c konnte die dreidimensionale Struktur dieses transienten Enzym-Substrat-Komplexes bei 2,97 Å ermittelt werden. Die Kristallstruktur ist die erste Struktur des Cytochrom c im Komplex mit einem seiner beiden Redoxpartner aus der Atmungskette. Sie zeigt, daß das Cytochrom c hauptsächlich durch hydrophobe Wechselwirkungen an das Cytochrom c1 bindet und daß die Nähe der beiden c-Typ Hämgruppen eine schnelle Reduktion des Cytochrom c erlaubt. Im homodimeren Cytochrom-bc1-Komplex ist nur eine der beiden Bindungsstellen für Cytochrom c besetzt. Diese hälftige Substratbindung zeigte sich auch für das Ubichinon in der Qi- Bindungsstelle und weist darauf hin, daß die beiden Monomere des Enzyms unabhängig voneinander oder sequentiell arbeiten können. Möglicherweise dient dies der Regulation der Enzymaktivität des Cytochrom-bc1-Komplexes. Durch partielle Reduktion des Cytochrom-bc1-Komplexes in Anwesenheit von Ubichinon konnte ein proteingebundenes Ubisemichinonradikal erzeugt und durch Schockgefrieren stabilisiert werden. Die spektralen Eigenschaften dieses Radikals sind typisch für ein Ubisemichinon an der Qi-Bindungsstelle. Durch Spektroskopie an einer Probe, die einem Wasserstoff/Deuterium-Austausch unterzogen wurde, konnte gezeigt werden, daß dieses Radikal von Protonen koordiniert wird, die mit dem Solvens im Austausch stehen. Dies steht in Übereinstimmung mit der Theorie des Q-Zyklus und wurde durch die hochauflösenden Kristallstruktur des Enzyms bei 2,3 Å vorhergesagt. Die erzielten Ergebnisse zeigen neue Informationen zum Wechselspiel des Cytochrom- bc1-Komplexes mit Phospholipiden aus der inneren Mitochondrienmembran. Die Bestimmung der Struktur des transienten Komplexes bestehend aus Enzym und Cytochrom c erweitert das Bild über den Elektronentransfer durch Cytochrom c zwischen dem Cytochrom-bc1-Komplex und der Cytochrom-c-Oxidase. Das mögliche Zusammenwirken der Bindungstellen für Cytochrom c und Ubichinon ist ein neuer mechanistischer Aspekt, der auf eine Regulation der Enzymaktivität schließen läßt.
Sauerstoff wird in vielen prokaryotischen und eukaryotischen Atmungsketten von der Cytochrom c Oxidase zu Wasser reduziert. Dieses Enzym besteht in Paracoccus denitrificans aus vier Untereinheiten, von denen aber nur die ersten zwei für die Funktion essentiell sind. Elektronen werden von einem membrangebundenen Cytochrom c552 zunächst auf das CuA-Zentrum der Untereinheit II der Oxidase übertragen und gelangen von dort zum low-spin Häm a der Untereinheit I. Am binukleären Zentrum, das aus dem high-spin Häm a3 und dem CuB-Atom besteht, erfolgt schließlich die Reduktion von molekularem Sauerstoff zu Wasser. Hauptziel dieser Arbeit war es, die Bindungsstelle für Cytochrom c durch das gezielte Einführen oder Entfernen negativer Ladungen auf der Oxidase-Oberfläche zu bestimmen. Die Charakterisierung dieser Mutanten erfolgte hauptsächlich durch spektroskopische Analyse der kinetischen Parameter unter Umsatzbedingungen. Zusätzlich wurde der Teilschritt der Susbtratbindung durch die Aufnahme von Assoziationskinetiken untersucht. Als Substrat diente das reduzierte mitochondriale Cytochrom c oder ein lösliches Fragment des Paracoccus-Cytochrom c552. Die eingeführten Mutationen beeinflußten in unterschiedlicher Weise die Bindung der beiden verwendeten Substrate. Hierbei ist der negativ geladene Bereich der Oberfläche von Untereinheit II der Oxidase, der zur Bindung des Paracoccus-eigenen Substrats beiträgt, größer als der für die Wechselwirkung mit dem mitochondrialen Cytochrom c. Erstmals kann somit ein Modell für die Bindung des nativen Substrats an die Paracoccus-Oxidase aufgestellt werden. Die aa3-Oxidase aus Paracoccus zeigte keine Elektronentransfereaktion mit dem Cytochrom c552 aus Thermus thermophilus, da dessen Oberfläche nicht die hierfür erforderlichen Ladungen trägt. Durch Erhöhung der Hydrophobizität auf der Untereinheit II der Paracoccus-Oxidase wurde deren Oberfläche so verändert, dass sie nunmehr auch durch dieses „hydrophobe“ Cytochrom c reduziert werden konnte. Der Aminosäurerest W121 auf der Oberfläche der Untereinheit II wurde in der Vergangenheit als ein möglicher Elektroneneintrittsort in die Cytochrom c Oxidase beschrieben. Die in der vorliegenden Arbeit an dieser Position hergestellten Mutanten zeigten zwar drastische Einbußen in den maximalen Wechselzahlen, aber eine weitgehend unveränderte Affinität zum Cytochrom c. Die exakte Positionierung der Seitengruppe des Tryptophans spielt hierbei gegenüber der Aromatizität die entscheidende Rolle. An benachbarten Positionen eingeführte Mutationen ergaben keine Hinweise auf alternative Elektroneneintrittsorte. Durch ortsspezifische Mutagenese auf dem löslichen Cytochrom c552-Fragment wurden die Lysine auf der Oberfläche entfernt, um zu klären, ob die Wechselwirkung zwischen Cytochrom c und Oxidase auf Ladungspaaren beruht oder über das Gesamtpotential der Bindungsstellen bestimmt wird. Die Lysin-Mutanten zeigten alle im gleichen Maße eine reduzierte Affinität zur Oxidase. Die vorliegenden Ergebnisse lassen den Schluß zu, dass die Wechselwirkung zwischen Oxidase und Cytochrom c552 über das Gesamt-Oberflächenpotential vermittelt wird. Steady-state-Kinetiken unter Verwendung von Pferdeherz-Cytochrom c oder Paracoccus Cytochrom c552 weichen von den klassichen Michaelis-Menten-Verhalten ab, da zwei separate Phasen für die Kinetik beobachtet werden. Dieses Phänomen bisher wurde mit der Anwesenheit einer zweiten Bindungsstelle oder einer redoxgekoppelten Konformationsänderung der Oxidase erklärt. Durch Untersuchungen von Oxidase-Präparationen mit unterschiedlicher Untereinheiten-Zusammensetzung oder gebundenem Antikörper konnte gezeigt werden, dass die Biphasizität der Oxidase-Kinetik ! nicht auf der Anwesenheit der Untereinheiten III und IV beruht, ! durch die spezifische Bindung von Antikörpern zu niedrigeren Ionenstärken verschoben wird bei gleichzeitiger Verringerung der Affinität zum Substrat, ! eine intrinsische Eigenschaft aller untersuchten Mutanten ist. Im Rahmen dieser Untersuchungen konnten keine Hinweise auf eine zweite Cytochrom c Bindungsstelle gefunden werden. Ein weiteres Ziel dieser Arbeit war die Expression, Reinigung und Charakterisierung des homologe, membrangebundenen Cytochrom c552 aus P. denitrificans. Das Protein wurde mit einem Histidin-Tag versehen und heterolog in E. coli in guter Ausbeute exprimiert und gereinigt. Seine Charakterisierung über steady-state-Messungen ergab ein deutlich verschobenes pH-Optimum mit höherer Affinität zur Oxidase im Vergleich zu seinen verkürzten löslichen Fragmenten.
Als Ergebnisse der vorliegenden Arbeit kann man folgendes festhalten: • Die zuverlässige Bestimmung der leichten Elemente Phosphor und Schwefel mit TXRF ist im Konzentrationsbereich 30 mg/l bis 0,1 mg/l (600 ng bis 2 ng) grundsätzlich möglich. • Die Bestimmung von Schwefel in Proben, die dazu tendieren dicke, dichte Probenrückstände zu bilden (z.B. Alkalimetallsulfate) erfordert eine spezielle Probenpräparation. Hier können durch den Einsatz von geeigneten Glättungsmitteln gute Ergebnisse erzielt werden. • Für die Detektion von Phosphor ist die Verwendung von Saphirprobenträgern notwendig, da die Lage der Absorptionskante von Silizium, als Hauptbestandteil der üblicherweise verwendeten Quarzglasprobenträger, diese negativ beeinflußt. • Für Schwefelkonzentrationen ≤ 0,5 mg/l (≤ 10 ng) sollte mit dem dünnen Filter (Filter 1) gemessen werden. • Die berechneten Erfassungsgrenzen liegen für Schwefel, je nach Zusammensetzung der Probe, bei 0,29 bis 0,76 ng. Für Phosphor erhält man in anorganischen Proben auf Saphirträgern 0,34 ng und bei biologischen Proben 0,70 ng. Die erhaltenen Ergebnisse zeigen klar, daß die zuverlässige Bestimmung der Elemente Phosphor und Schwefel mit TXRF möglich ist. Die Möglichkeit diese leichten Elemente zu bestimmen, eröffnet der TXRF verschiedene neue Forschungsgebiete, wie beispielsweise Biologie und Biochemie. Durch den großen Vorteil der TXRF, der geringen Probenverbrauch kombiniert mit niedrigen Nachweisgrenzen, sind Screening von Proteinen, Enzymen oder auch von anderen Makromolekülen die Phosphor und Schwefel enthalten, möglich. Hier können Strukturfragen oder Mutagenese Schritte in Proteinen, Enzymen und Nucleinsäuren geklärt werden. Eine weitere Anwendung der TXRF ist die quantitative Proteinbestimmung. Die genaue Schwefelbestimmung macht es möglich ältere Methoden wie beispielsweise die Bestimmung nach Lowry zu ersetzen. Durch Kombination der TXRF mit weiteren analytischen Methoden (z.B. AAS) und oberflächenabbildenden Methoden (z.B. REM oder AFM) kann die Probenvorbereitung verbessert werden und somit die TXRF für weitere Gebiete der Elementanalytik in Zukunft als zuverlässige Standardmethode etabliert werden.
Während der letzten Jahrzehnte hat sich die Totalreflexions-Röntgenfluoreszenzanalyse (TXRF) als eine tragende Methode in der Elementanalytik etabliert. Sie ist eine universelle, auf vielen Gebieten einsetzbare, ökonomische Multielementmethode zur Mikro- und Spurenanalyse. Die Vorteile der TXRF mit ihrer hohenEmpfindlichkeit kombiniert mit einer einfachen Quantifizierung und einem geringen Probenverbrauch prädestinieren sie für Elementbestimmungen in verschiedenen biologischen Matrices - besonders auf dem Gebiet der Protein- und Enzymanalytik. Das Potential der TXRF für die Bestimmung von Übergangsmetallen in diesenMatrices wurde schon in der Literatur beschrieben. Eine bedeutende Rolle kommt hier auch der Analyse leichter Elemente zu, insbesondere der des Schwefels. Als Bestandteil der beiden Aminosäuren Cystein und Methionin erlaubt die quantitative Bestimmung des Schwefelgehaltes eine zur Metall-Cofaktoren-Bestimmung einfache und simultane Bestimmung der Enzym- oder Proteinkonzentration. Die Evaluation dieses Verfahrens mit seinen Möglichkeiten und Grenzen für die TXRF, sowie die Weiterentwicklung von Anwendungsgebieten auf diesem Gebiet waren die vorrangigen Ziele dieser Arbeit. Zuvor erfolgte eine Überprüfung der für die quantitative Auswertung notwendigen und wichtigen relativen Empfindlichkeitsfaktoren (Kalibrierfaktoren). Für die beiden untersuchten leichteren Elemente Schwefel und Phosphor ließen sich im Gegensatz zu den höheren Elementen Abweichungen von > ± 10 % zu den in der Spektrometer-Software bereits vorinstallierten Faktoren feststellen. Die Betrachtung der Matrix- und Konzentrationsabhängigkeit des relativen Empfindlichkeitsfaktors von Schwefel zeigte eine starke Matrixabhängigkeit des Faktors bei höheren Konzentrationen. Hier spielen vorrangig Absorptionseffekte der induzierten Fluoreszenzstrahlung des Schwefels in den unterschiedlich massiven Rückständen der untersuchten Verbindungen Al2(SO4)3, MgSO4 und Na2SO4 eine entscheidende Rolle. Im Zuge der Probenvorbereitung für die Analyse der Protein- und Enzymproben erwies sich die Trocknung an Luft bei Raumtemperatur als eine gut geeignete Methode im Vergleich zu herkömmlichen Verfahren (Trocknung unter Wärmezufuhr). Bei letzterem Verfahren besteht die Gefahr möglicher Elementverluste von flüchtigen Verbindungen z. B. beim Vorhandensein sulfidischer Bestandteile. Der Einfluss der Matrixbestandteile (Puffer/bio-organische Matrix der Enzyme selbst) und ihre systematischen Zusammenhänge auf die ausgebildeten Trocknungsrückstände zeigten sich deutlich in den zur Evaluation der Schwefelbestimmung durchgeführten Konzentrationsreihen mit schwefelhaltigen anorganischen Standardlösungen. Bei den beiden untersuchten Enzymen Diisopropylfluorophosphatase (DFPase) undCytochrom c Oxidase wurden über die durchgeführten Konzentrationsbereiche sehr gute Wiederfindungen dokumentiert. Bei der Cytochrom c Oxidase trägt vor allem der im Vergleich zur DFPase deutlich höhere Anteil an Pufferkomponenten zur Ausbildung massiverer Trocknungsrückstände (max. 5 μm Dicke) bei. Dennoch traten erst bei der NADH:Q Oxidoreduktase (Komplex I) deutliche, reproduzierbare Minderbefunde bei der Schwefelbestimmung im Verlauf der Konzentrationsreihe auf. Anhand der topologischen Untersuchungen ließen sich hier für die Minderbefunde Schichtdickeneinflüsse und eine damit verbundene Absorption der emittierten Fluoreszenzstrahlung verantwortlich machen. Der Einsatz von sogenannten Filmbildnern zur Minimierung der Schichtdicken von Trocknungsrückständen und der damit verbundenen besseren Elementwiederfindungen brachte dagegen keine deutlichen und reproduzierbaren Verbesserungen, insbesondere nicht für den Schwefel. Eine Erhöhung der Anregungseffizienz durch die Verwendung einer Cr-Kα-Strahlung zeigte in den untersuchten Proben (wässrige Matrix/Enzymmatrix: DFPase) keine deutlichen Vorteile in der Bestimmung des leichten Elementes. Die beiden, in herkömmlichen Spektrometern zur Verfügung stehenden, AnregungsmodenW-Lα und Mo-Kα, sind für die Anlayse von Enzymproben und einer vergleichenden Bestimmung der Enzymkonzentration gut geeignet. Dies zeigten auch Vergleiche mit den biochemisch bestimmten Protein- bzw. Enzymkonzentrationen. Kritische Schichtdicken im Rahmen von Schwefel-Bestimmungen wurden für die verwendeten Anregungsmoden auf etwa 20 μm (Mo-Kα), 3 μm (W-Lα) und rund 2 μm (Cr-Kα) kalkuliert. Eine Beeinträchtigung der Zuverlässigkeit der TXRF-Messungen für die höheren Elemente durch die Matrixbestandteile konnte nicht festgestellt werden. Somit wird in den meisten Fällen die einfache Probenpräparation auf hydrophoben oder hydrophilen (siliconisierten/unsiliconisierten) Probenträgern, ohne die Notwendigkeit eines Verfahrens zur vorherigen Matrixabtrennung, möglich sein. Jedoch muss bei allen künftig zu untersuchenden Protein- oder Enzymproben mit hohen Matrixanteilen mit dem Auftreten von Schichtdickeneffekten und damit verbundenen Absorptionseffekten von leichten Elementen (Schwefel, Phosphor) gerechnet werden. Die in der Arbeit vorgestellten, unterschiedlichen Projekte zeigen deutlich das Potential der TXRF als eine Standardmethode auf diesem Anwendungsgebiet.
Mit Hilfe des Modellorganismus S. cerevisiae konnten alle bisher unbekannten Gene der Gluconeogenese und des Glyoxylat-Zyklus des opportunistisch humanpathogenen Pilzes C. albicans isoliert werden. Erste Hinweise führten zu der Annahme, dass diese Stoffwechselwege möglicherweise essentiell für das vegetative Wachstum sind, so dass sie gute Wirkorte für neu zu entwickelnde Antimycotica darstellen könnten. In dieser Arbeit wurde gezeigt, dass diese Stoffwechselwege ungeeignete Wirkorte für Antimycotica sind, da sie weder essentiell für das vegetative Wachstum sind noch von ihnen Virulenzfaktoren von C. albicans beeinflusst werden (z.B. Hyphenentwicklung). Die Regulation der Gluconeogenese und des Glyoxylat-Zyklus in S. cerevisiae ist gut untersucht und alle Ergebnisse mit C. albicans zeigen, dass die Regulation dieser Stoffwechselwege zwischen diesen beiden Hefen sehr konserviert ist. Es wurde eine Methode für die Identifizierung von essentiellen Genen durch funktionelle Komplementation in S. cerevisiae entwickelt. Diese sogenannte Split-Marker-Selektion basiert auf einer Cre/loxP-vermittelten induzierten Deletion eines essentiellen Gens von S. cerevisiae und der Komplementation des resultierenden letalen Phänotyps durch ein heterolog exprimiertes Gen in einer DNS Genbank. Die Methode ist auch für die Funktionsanalyse von essentiellen Genen in S. cerevisiae geeignet (z.B. Identifizierung von Suppressoren, Analyse finaler Phänotypen). Mit Hilfe der Split-Marker-Selektion wurde das putativ essentielle Gen NEP1 ("nuclear essential protein") von C. albicans identifiziert. Die Funktionsanalyse des homologen Gens in S. cerevisiae ergab, dass das Gen für ein Mikrotubuli-assoziiertes Protein kodiert, das in allen Eukaryonten existiert. Es erwies sich, dass das menschliche Homolog in S. cerevisiae funktionell ist und den letalen Phänotyp einer NEP1 Deletion in S. cerevisiae überwindet. Es zeigte sich weiterhin, dass das menschliche Homolog in S. cerevisiae nicht an Mikrotubuli assoziiert ist. Dies deutet darauf hin, dass die Mikrotubuli-Assoziation nicht für die essentielle Funktion von Nep1p nötig ist. Das bisher uncharakterisierte Protein Ydl148p wurde als Interaktionspartner von Nep1p gefunden. Desweitern konnte SAM2 als Multicopy-Suppressor des konditional letalen Phänotyps (Temperatursensitivität) eines NEP1 Mutantenallels (nep1-ts1) identifiziert werden. Die Suppression wurde hierbei über die erhöhte Konzentration an S-Adenosylmethionin vermittelt. Dieser Cofaktor ist an Methylierungsreaktionen beteiligt, so besteht die Möglichkeit, dass Nep1p eine Methyltransferase ist oder an Methylierungsreaktionen beteiligt ist.
In bestimmten methanogenen Archaea wurde vor einigen Jahren eine metallfreie Hydrogenase gefunden, die den reversiblen und stereoselektiven Transfer eines Hydridions von Wasserstoff auf die an den C1-Carrier Tetrahydroniethanopterin (H4MPT) gebundene Methenyl-Gruppe katalysiert. Damit stellt dieses Enzym den ersten und einzigen rein organischen Hydrogenierungskatalysator dar, den man in der Natur kennt. Ziel der vorgelegten Arbeit war die kristallographische Bestimmung der Enzymstruktur. Versuche zur Strukturlösung des in aktiver Form aus M. marburgensis isolierten Enzyms durch mehrfachen isomorphen Ersatz, über die anomale Dispersion an nicht-isomorphen Quecksilberderivaten und die des Selens an mit Selenomethionin markiertem Enzym verliefen nicht erfolgreich. Ursächlich hierfür war die perfekte meroedrische Zwillingsbildung der Kristalle. Für die beiden heterolog produzierten, inaktiven Apoenzyme aus den Hyperthermophilen M. jannaschii und M. kandleri wurden in dieser Arbeit effektive Expressions- und Reinigungsprotokolle entwickelt. Für das Enzym aus M. jannaschii wurden Mikrokristalle erhalten, die lediglich ein Proteolysefragment von etwa der halben Masse des Vollängenproteins enthalten. Kristalle des Enzyms aus M. kandleri konnten durch serielles Microseeding so weit verbessert werden, daß die Durchführung eines MAD-Experiment möglich wurde. Erst unter Verwendung vor kurzem entwickelter direkter Methoden (Shake-and-Bake) gelang die Strukturlösung bei einer Auflösung von 2.8 Å. Die Monomere bilden ein sehr eng assoziiertes Homodimer; zwei dieser Dimere sind zu einem locker assoziierten Tetramer verbunden. Jedes Monomer besitzt zwei Domänen. Die N-terminale Domäne von etwa 255 Resten besitzt eine Faltung, wie sie für Dinukleotid-bindende Enzyme typisch ist, mit einem zentralen, verdrehten achtsträngigen beta-Faltblatt. Die C-terminale Domäne von etwa 100 Resten besitzt dagegen weitgehend alpha-helikale Struktur und ist für die außerordentlich enge Assoziation des Homodimers verantwortlich. Beide Domänen sind durch eine gestreckte, flexible Verbindung verknüpft. Im Dimer entstehen dadurch zwei tiefe Spalten, die von Anteilen der N-terminalen Domäne eines und der C-terminalen Domäne des jeweils anderen Monomers begrenzt werden. Das aktive Zentrum liegt wahrscheinlich in dieser Spalte, wobei postuliert wird, daß der fest gebundene Cofaktor eher mit der größeren N-terminalen Domäne assoziiert ist und das Substrat zwischen den Domänen bindet. An der Bindung dürfte die C-terminale Domäne und möglicherweise auch direkt der Cofaktor beteiligt sein. Die Struktur zeichnet sich durch außergewöhnlich hohe Tenmperaturfaktoren ans. Für das Enzym aus M. marburgensis konnte eine Lösung durch molekularen Ersatz erhalten werden. Da der für die Katalyse benötigte, noch unbekannte Cofaktor nicht in der Struktur enthalten ist, ist eine weitergehende Diskussion des enzymatischen Mechanismus noch nicht möglich. Die Verfügbarkeit eines ersten Strukturmodells der metallfreien Hydrogenase stallt aber bereits einen entscheidenden Schritt auf dem Weg zum Verständnis dieses ungewöhnlichen Hydrogenierungskatalysators dar.
Die primäre Funktion der Haut ist die Abgrenzung des Körpers gegenüber der Umwelt, wodurch der Organismus vor destruktiven Einwirkungen (Xenobiotika, Mikroorganismen, UV-Licht) geschützt wird. Neben wichtigen sensorischen Funktionen ist die Haut außerdem beteiligt an der Regulation von Körpertemperatur sowie Wasserhaushalt und dient als wichtiges Sozialorgan. Da die Verletzung der Haut demnach schwerste Folgen für den Organismus hat, ist die Wundheilung ein essentieller Prozeß zur Aufrechterhaltung der Unversehrtheit der Haut. Der Prozeß der Wund heilung läßt sich in vier Phasen unterteilen (Koagulation, Entzündungsphase, Proliferationsphase, Remodellierungsphase), die zeitlich und räumlich überlappen (Moulin, 1995; Singer and Clark, 1999). ...
Das Photosystem II (PSII) und die F1Fo-ATP-Synthase, zwei Membranproteinkomplexen der Energieumwandlung, wurden im Rahmen dieser Dissertation bearbeitet. Mittels zweidimensionaler (2D) Kristallisation und elektronenkristallographischen Methoden sollte die dreidimensionale (3D) Struktur aufgeklärt werden. PSII katalysiert den ersten Schritt der Lichtreaktion der Photosynthese. Es ist für das Einfangen von Lichtquanten, die Anregung von Elektronen, die Freisetzung von Sauerstoff aus Wasser verantwortlich. Über 25 Untereinheiten sind an diesem Prozess in den Thylakoidmembranen der Chloroplasten beteiligt. Ziel des ersten Projekts war die Verbesserung der 8 Å-Struktur des CP47-RC-Subkomplexes durch neue oder bessere 2D-Kristalle. Die Aufreinigung aus Spinat lieferte reproduzierbar eine gute Ausbeute an aktivem PSII. Das solubilisierte PSII enthielt genug endogenes Lipid, um es ohne den Zusatz von weiterem Lipid direkt durch Mikrodialyse zu rekonstituieren. Während der Rekonstitution verlor der PSII-Komplex CP43 und andere Untereinheiten, wahrscheinlich durch das Detergenz begünstigt, und ergab hoch geordnete Membranen aus CP47-RC. Die besten vesikulären 2D-Kristalle hatten eine tubuläre Morphologie und waren bis zu 1 µm breit und 3 µm lang. Elektronenmikroskopische Bilder unter Cryo-Bedingungen von ihnen aufgenommen zeigten nach der Bildverarbeitung Daten bis 6 Å. Durch Erhöhung der Zinkazetatkonzentration im Dialysepuffer konnten dünne 3D-Kristalle gezüchtet werden, die aus 2D-Kristallstapeln bestanden. Obwohl Elektronenbeugungsmuster Reflexe bis 4,5 Å aufwiesen, konnte auf Grund der unbekannten und veränderlichen Anzahl von Schichten keine 3D-Struktur erstellt werden. Weitere Versuche die Qualität der 2D-Kristalle von CP47-RC zu verbessern waren nicht erfolgreich. Durch die kürzliche Veröffentlichung der Röntgenkristallstruktur des dimeren PSII-Komplexes aus Synechococcus elongatus wurden weitere Untersuchungen eingestellt. Im letzten Schritt der Energieumwandlungskette bildet die F1Fo-ATP-Synthase unter Ausnutzung eines elektrochemischen Gradienten schließlich ATP, die universelle Energieeinheit der Zelle. Die Struktur und Funktion des löslichen, katalytischen F1-Teils sind seit einigen Jahren im Detail bekannt. Im Gegensatz zeichnet sich die Struktur des membranintegrierten, Ionen-translozierenden Fo-Teiles aus den Untereinheiten ab2cx erst langsam ab. Der c-Ring besteht in Hefe aus 10 und in Spinatchloroplasten aus 14 Untereinheiten. Ziel des zweiten Projekts war die Aufklärung der 3D-Struktur des sehr stabilen, undecameren c-Rings aus dem Bakterium Ilyobacter tartaricus, welches Na als Kopplungsion nutzt. Große, tubuläre 2D-Kristalle mit einer Einheitszelle von 89,7 x 91,7 Å und p1-Symmetrie bildeten sich nach der Rekonstitution von gereinigten c-Ringen mit dem Lipid Palmitoyl-Oleoyl-Phosphatidylcholin, nachdem das Detergenz durch Mikrodialyse entzogen wurde. Bilder von in Trehalose eingebetteten 2D-Kristallen wurden im Elektronenmikroskop JEOL 3000 SFF bei 4 K aufgenommen. Ein 3D-Datensatz, bestehend aus 58 Bilder bis zu einem Kippwinkel von 45°, ermöglichte die Berechnung einer 3D-Dichtekarte mit einer Auflösung von 4 Å in der Membranebene und 15 Å senkrecht dazu. Die elffach symmetrisierte Karte eines c-Rings zeigt einen taillierten Zylinder mit einer Höhe von 70 Å und einem äußeren Durchmesser von 50 Å, der aus zwei konzentrischen Ringen von transmembranen (-Helices besteht. Ein C-(-Modell der c-Untereinheit, die eine helikale "hair pin" bildet, konnte in die Dichte eingepaßt werden. Die inneren Helices sind nur 6,5 Å (Zentrum-zu-Zentrum-Abstand) von einander entfernt um eine zentrale Öffnung von 17 Å Durchmesser angeordnet. Die dichte Helixpackung wird durch ein konserviertes Motiv aus vier Glycinresten ermöglicht. Jede innere Helix ist mit einer äußeren, C-terminalen Helix über einen kurzen, wohl geordneten Loop auf der cytoplasmatischen Seite verbunden. Die äußere Helix weist in der Nähe der Ionenbindungsstelle einen Knick auf, der gleichzeitig in der Mitte der Membran liegt, wo sich die äußeren und inneren Helices am nächsten kommen. Dadurch wird es möglich, dass die Ionenbindungsstelle aus den Resten von zwei äußeren (Glu65, Ser66) und einer inneren Helix (Pro28) geformt wird. Zur Unterstützung der Ein-Kanal-Modell der Ionentranslokation konnte ein Zugang von der Ionenbindungsstelle zum Cytoplasma durch polare Reste in der c-Untereinheit vorgeschlagen werden. Des Weiteren kann spekuliert werden, dass drei Ionenbrücken zwischen den c-Untereinheiten für die hohe Temperaturstabilität des Oligomers von I. tartaricus verantwortlich sind. Die Vorstellung dieses 3D-Modells des c-Rings ist ein erster Schritt hin zum Verständnis der Kopplung der Ionentranslokation an die Rotation der F1Fo-ATP-Synthase. Wenn die Struktur der a-Untereinheit gelöst worden ist, wird hoffentlich auch der Mechanismus des kleinsten, biologischen Rotationsmotors entschlüsselt werden.
Wolinella succinogenes reduziert Fumarat mit H2 oder Formiat als Elektronendonor. Der Elektronentransport wird von der membranständigen Hydrogenase oder Formiat-Dehydrogenase und der Fumarat-Reduktase katalysiert. Redoxmediator zwischen beiden Enzymen ist Menachinon. Der Elektronentransport ist mit der Erzeugung eines elektro-chemischen Protonenpotentials (Dp) gekoppelt. Ziel dieser Arbeit war, den Mechanismus der Dp-Entstehung durch Rekonstitution der gekoppelten Fumarat-Atmung in Liposomen aufzuklären. Aus Wolinella succinogenes isolierte Hydrogenase und Fumarat-Reduktase wurden in Liposomen eingebaut, die Menachinon enthielten. Die resultierenden Proteoliposomen kataly-sierten die Reduktion von Fumarat mit H2. Die Wechselzahl der Enzyme im Elektronentrans-port von H2 zu Fumarat war etwa 10 % von der in Bakterien. In den Proteoliposomen waren sowohl Hydrogenase als auch Fumarat-Reduktase ausschließlich nach außen orientiert. Elektronenmikroskopische Aufnahmen zeigten, dass die Proteoliposomen sphärische Vesikel mit einem mittleren Außendurchmesser von 88 nm waren. Die Proteoliposomen enthielten statistisch 8,4 Hydrogenasemoleküle und 72 Fumarat-Reduktasemoleküle. Alle aktiven Enzymmoleküle waren in der Proteoliposomenmembran zufällig verteilt eingebaut und nahmen am Elektronentransport von H2 zu Fumarat teil. Der aus dem Protonenpermeabilitätskoeffizienten (PH = 8,1·10-3 cm·s-1) berechnete unspezifische Protonenfluß über die Proteoliposomenmembran war etwa 20mal langsamer als der durch den Elektronentransport von H2 zu Fumarat katalysierte Protonenfluß. Während der Fumarat-Reduktion mit H2 entstand ein elektrisches Protonenpotential über der Proteoliposomenmembran (Dø = -0,19 V; innen negativ), das die gleiche Richtung und Größe hatte wie das Dø während der Fumarat-Atmung in Zellen von W. succinogenes. Der H /e--Quotient für die Fumarat-Reduktion mit H2 war in Proteoliposomen in Gegenwart von Valinomycin und externem K etwa 1. Das gleiche Dø und der gleiche H /e--Quotient waren mit der Reduktion von 2,3-Dimethyl-1,4-naphthochinon (DMN) durch H2 verbunden, wenn die Proteoliposomen Menachinon und Hydrogenase mit oder ohne Fumarat-Reduktase enthielten. Proteoliposomen, die Menachinon und Fumarat-Reduktase mit oder ohne Hydrogenase enthielten, katalysierten die Reduktion von Fumarat durch DMNH2, die aber nicht mit der Entstehung von Dp gekoppelt war. Proteoliposomen, die Formiat-Dehydrogenase, Menachinon und Fumarat-Reduktase enthielten, katalysierten die Reduktion von Fumarat oder DMN durch Formiat. Beide Reaktionen erzeugten über der Proteoliposomenmembran ein Dø von -0,13 V (innen negativ). Der H /e--Quotient der Formiat-Oxidation durch Menachinon oder DMN war nahezu 1. Die Entstehung von Dø war von der Art des in die Proteoliposomen eingebauten Chinons abhängig. Während der Reduktion von DMN durch H2 entstand ein Dø, wenn die Proteoliposomenmembran Menachinon, Vitamin K2 oder das aus W. succinogenes isolierte Methylmenachinon enthielt. Proteoliposomen ohne Chinon oder mit Vitamin K1 erzeugten kein Dø während der DMN-Reduktion mit H2. Die Fumarat-Atmung mit H2 war nur in Gegenwart von Menachinon oder Vitamin K2 mit der Entstehung von Dø gekoppelt. In dieser Arbeit wurde erstmals die gekoppelte Fumarat-Atmung mit aus W. succinongenes isolierten Elektronentransportenzymen in Lipsomen rekonstituiert. Die Ergebnisse bestätigen die Hypothese, dass das durch die Fumarat-Atmung erzeugt Dp ausschließlich durch die Menachinon-Reduktion mit H2 oder Formiat entsteht, während die Menachinol-Oxidation mit Fumarat ein elektroneutraler Prozeß ist.
Endogene Retroviren des Schweines (PERV), die vertikal auf die Nachkommen vererbt werden, stellen ein potentielles Infektionsrisiko bei der Transplantation porziner Zellen, Gewebe oder solider Organe auf den Menschen (Xenotransplantation) dar. Bislang sind zwei PERV- Klassen des C-Typs bekannt, die in-vitro humane Zellen produktiv infizieren können. Voraussetzung einer produktiven Infektion ist neben dem Rezeptor-vermittelten Eindringen des Virus in die Wirtszellen die transkriptionelle Aktivität des retroviralen Promotors (LTR), welcher die zweite Determinante des Wirtstropismus darstellt. Mittels eines Luciferase Reportergen Assays wurde die Aktivität verschiedener PERV LTRs in humanen und anderen Säugerzellen im Vergleich zu bekanntermaßen starken Promotoren untersucht. Dabei zeigten LTRs, welche in der die Transkription regulierenden Region U3 eine aus 39-bp Repeats bestehende Repeatbox trugen, in nahezu allen getesteten Zellinien eine außerordentlich starke Promotoraktiviät. Diese wurde insbesondere durch die Repeatbox vermittelt und korrelierte direkt mit der Anzahl der 39-bp Repeats. Wie weiterführende Untersuchungen zeigten, konnte die Aktivität heterologer und Repeat-loser homologer Promotoren durch eine 4-fach 39-bp Repeatbox unabhängig von deren Lage und Orientierung über weite Distanzen hinweg signifikant erhöht werden. Die Repeatbox stellt damit einen klassischen Enhancer dar. Als die Transkription regulierende zelluläre Komponente konnte der ubiquitäre, in der Evolution konservierte Transkriptionsfaktors NF-Y identifiziert werden, dessen Bindung an Sequenzabschnitte des 39-bp Repeats nachgewiesen wurde. Weitere cis-aktive Elemente konnten in der U3 Region stromaufwärts der Repeatbox sowie in der R Region lokalisiert werden. Im Verlauf einer seriellen Passagierung in infizierten humanen Zellen erfolgte eine rasche Adaptation der Repeatzahl und damit der transkriptionellen Aktivität an den neuen Wirt. Wie die Ergebnisse einer neu etablierten quantitativen Real- Time PCR zeigten, korrelierte die Anzahl der von einer infizierten Zelle freigesetzten Viruspartikel direkt mit der Aktivität der LTR. Durch Adaptation der LTR Aktivität kann somit eine maximale, für die Wirtszelle verträgliche Virusproduktion erfolgen. Ausgehend von den beschriebenen Eigenschaften der PERV LTR ergeben sich für die Xenotransplantation spezifische Risiken, die Infektion des möglichen Transplantatempfängers vorausgesetzt. Diese betreffen durch mögliche Aktivierung von Protoonkogen oder Disruption zellulärer Gene den Empfänger selbst, durch die mögliche Rekombination von PERV mit humanen endogenen Sequenzen oder anderen exogenen Erregern und der Ausbildung potentiell hochpathogener Formen aber auch sein soziales Umfeld. Wie in-vitro Studien mit zwei routinemäßig in der Transplantationsmedizin eingesetzten Immunsuppressiva belegen, werden diese Risiken durch deren unvermeidlichen Einsatz im Falle einer Xenotransplantation nicht potenziert. Ausgehend von der starken transkriptionellen Aktivität Repeat-tragenden LTRs könnten diese geeignete Werkzeuge für molekularbiologische Anwendungen darstellen, bei denen, wie im Falle des Gentransfers oder der Gentherapie, starke Promotoren benötigt werden. In einem zweiten Projekt der vorliegenden Arbeit sollte untersucht werden, ob die Expression des humanen endogenen Retrovirus HERV-K in einem transgenen Mausmodell Auswirkungen auf den Phänotyp der Tiere hat. HERV-K kodiert im Gegensatz zu den meisten anderen HERV-Familien für komplette virale Proteine, deren Bedeutung für den menschlichen Organismus jedoch weitgehend unbekannt sind. Zur Etablierung transgener Tiere waren zwei verschiedene Transgen-Konstrukte verwendet worden, von denen eines die komplette provirale Sequenz exklusive der LTRs beinhaltete, das andere lediglich das env-Gen. Für beide Konstrukte war die Etablierung homozygot transgener Tiere gelungen, der Nachweis der RNA Expression konnte jedoch nur bei jenen Linien erfolgen, die das komplette virale Genom trugen. Immuno Blot-Analysen und indirekte Immunfluoreszenz belegten die Expression viraler Proteine in verschiedenen Organen juveniler und adulter Tiere dieser Linien. Die transgenen Mäuse zeigten einen normalen Phänotyp und einen normalen Lebenszyklus mit einer unveränderten Reproduktionsrate. Eine auftretende Tumorgenese konnte stets auf das hohe Alter der betroffenen Tiere zurückgeführt werden, histologische oder anatomische Auffälligkeiten traten nicht auf. Ausgehend von diesen Beobachtungen in einem Tiermodell kann der Schluß gezogen werden, daß die HERV-K Expression im humanen Organismus keine große Bedeutung hat.
In der vorliegenden Dissertation wurden Antikörperfragmente, um sie zu oligomerisieren, an alpha-Helixbündel rekombinant fusioniert und die Fusionsproteine sowie deren Produktion untersucht. Dabei wurde durch Fusion eines Fv-Antikörperfragmentes an das trimere alpha-Helixbündel "Coil-Ser" das Fusionsprotein "Fv7E2-CS" entwickelt. Wegen der Fusion an Coil-Ser liegt das Ev-Fragment selbst in trimerem Zustand vor und kann auch sein Antigen, eine Cytochrom-c-Oxidase aus Paracoccus denitri/icans, binden und dadurch trimersieren. Antikörper gehören zur Immunabwehr der Wirbeltiere und sind Proteine, die in den Organismus eingedrungene, fremde Moleküle als "Antigene" spezifisch binden. Im momentan stark expandierenden Forschungsgebiet des "Antikörper-Designs" werden Antikörper und ihre Fragmente modifiziert, was besonders für die Entwicklung medizinischer Diagnostiken und Therapien vielversprechend ist. Eines der vielen Ziele ist die Steigerung der Bindungsaffinitäten, was unter anderem über die Vervielfältigung der natürlichen Bindestellen innerhalb eines künstlichen Antikörpermoleküls erreicht werden kann. Weiterhin möchte man Bindestellen gegen unterschiedliche Antigene in einem einzigen Antikörpermolekül vereinen, um dem Antikörper komplexere Funktionsfähigkeiten zu verleihen. Beide Ziele können durch Oligomerisierung der bindenden Antikörperfragmente verwirklicht werden. Zur künstlichen Oligomerisierung von Antikörperfragmenten wurde, neben anderen Strategien, die rekombinante Fusion an alpha-Helixbündel bereits einige Male erfolgreich angewandt. alpha-Helixbündel bestehen aus zwei bis etwa acht alpha-helikalen, längsseitig miteinander oligomerisierenden Peptidketten und können auch in natürlichen Proteinen als Oligomerisierungseinheiten fungieren. In der vorliegenden Dissertation wurden drei Fv-Antikörperfragmente und ein SchwerkettenAntikörperfragment mit drei verschiedenen alpha-Helixbündeln in unterschiedlichen Kombinationen rekombinant fusioniert und anschließend ihre Produktion und Funktion untersucht. Als Helixbündel zum Einsatz kamen das heterotetramere alpha-Helixbündel des neuronalen "SNARE"-Komplexes, die homo- als auch mit "Fos" heterodimerisierende Helix des AP-1-Transkriptionsfaktors ".Jun" und das synthetische, antiparallel homotrimerisierende Peptid "Coil-Ser". Die Expressionsprodukte vieler Fusionen konnten in Zellaufschlüssen mit Western Blots gefunden werden, nur einige aber ließen sich mit Affinitäts-Chromatographie in geringen Mengen (<0,1 mg/L Kultur) anreichern. Andere Produkte, bzw. bei einigen Fv-Fragmenten die Untereinheiten mit Peptid, waren durch die Fusion in ihrer Produktion deutlich gestört bis gar nicht vorhanden. Alle drei an Coil-Ser fusionierten Ev-Fragmente ließen sich in Mengen bis 0,5 mg/L Kultur anreichern. In der Gelfiltration zeigten sie sich mit vollständig assoziierten Untereinheiten, als auch mit vergrößerter, apparenter Molmasse im Vergleich zu den Fv-Fragmenten ohne fusioniertes Peptid. Von zweien der Coil-Ser-Fv-Fragmente konnte Antigenbindung beobachtet werden und davon bei Fv7E2-CS die Entstehung eines Fv-Antigen-Komplexes mit einer gegenüber dem ursprünglichen Antigen-Komplex sehr stark vergrößerten apparenten Molmasse. Mit analytischer Ultrazentrifugation wurde die Oligomerisierungsfähigkeit von Fv7E2-CS näher untersucht und für das ungebundene Fv-Fragment sowie für seinen Antigen-Komplex eine Massenkomponente mit im Vergleich zum jeweiligen Monomer dreifacher Molmasse gefunden. Für die Probe des Fv7E2-CS alleine wurde dabei ein Anteil an Komponenten trimerer Größenordnung von gut 95% ermittelt, also nahezu Homogenität, und in der Probe des Antigen-Komplexes zu 35 - 50 % Komponenten trimerer, sonst monomerer Größenordnung. Die Ursache für den niedrigeren Anteil an trimeren Komponenten in der Probe des Komplexes könnte hauptsächlich das hier vorhandene Detergenz sein, welches für das als Antigen fungierende Membranprotein Cytochrom-c-Oxidase nötig ist. Denn schon für das Fv7E2-CS alleine wurde in Kontrollen mit Detergenz eine Verringerung des Anteils an trimerer Komponente bzw. seiner mittleren Molmasse festgestellt. Das Fv-Fragment Fv7E2 ohne Peptid als auch dessen Antigen-Komplex zeigten in der Ultrazentrifuge keine bzw. nur unbedeutende Anteile an trimeren Massenkomponenten. Die Experimente deuten somit daraufhin, daß durch die Fusion des trimerisierenden Peptides Coil-Ser an Fv7E2 sowohl die Trimerisierung des Fv-Fragmentes, als auch bei Bindung des Antigens dessen Trimerisierung bewirkt wird. Das alpha-Helixbündel Coil-Ser ist folglich potentiell in der Lage, als Oligomerisierungseinheit für Fv-Antikörperfragmente eingesetzt zu werden. Wegen der aus Röntgenstrukturanalysen bekannten und für in Lösung prognostizierten Antiparallelität der Peptide im Coil-Ser-Bündel werden für die drei Fv-Fragmente bzw. die drei Bindestellen im Coil-Ser-Fusionsprotein einander entgegen-gesetzte Orientierungen vermutet, was für spätere Anwendungen von Bedeutung ist.
An der chemischen Synapse des Nervensystems führt ein präsynaptisches Aktionspotential zur Freisetzung eines Neurotransmitters, der über den synaptischen Spalt diffundiert und an die Rezeptoren der postsynaptischen Membran bindet. Die ionotropen Rezeptoren sind an dieser Membran zu Clustern aggregiert. Entstehung und Dynamik dieser Rezeptoraggregate sind für Funktion und Plastizität der Synapse essentiell. Für die Aggregation der inhibitorischen Glyzin- und der meisten Subtypen der GABAA-Rezeptoren ist das periphere Membranprotein Gephyrin notwendig. Es ist ein Schlüsselfaktor für die Genese und Aufrechterhaltung der glyzinergen postsynaptischen Membran. Dabei bindet es direkt an den GlyR und verbindet diesen über die Bindung von Mikrotubulie an das Zytoskelett. Auch andere Bindungspartner wurden nachgewiesen. Gephyrin ist in einer zweiten Funktion in die Synthese des Molybdän-Cofaktors involviert und weist Sequnezhomologien zu Proteinen anderer Spezies auf, die in diesen Syntheseweg eingebunden sind. Gephyrin ist ubiquitär exprimiert und wird alternativ gespleißt. Möglicherweise existieren verschiedene Varianten mit unterschiedlichen Funktionen. Die Untersuchung der Domänen und Bindungseigenschaften Gephyrins ist daher für das weitere Verständnis über Aufbau und Funktion der Synapse unerlässlich. In dieser Arbeit wurde ein Testsystem etabliert, mit dem sowohl heterolog exprimiertes als auch natives Gephyrin über die hoch-affine Bindung an den GlyR aufgereinigt werden konnte. Mit diesem System konnten erstmals unterschiedliche Varianten Gephyrins nachgewiesen werden. In verschiedenen Organen der adulten Ratte wurden dabei Gephyrinmoleküle mit Molekulargewichten zwischen 52 und den bekannten 93 kDA identifiziert. Auch Bestandteile des GlyR-Komplexes lassen sich mit dieser Methode anreichern. So wurde gezeigt, daß Gephyrin und Collybistin in einem trimeren Komplex mit dem GlyR vorliegen können. Hiermit ist es künftig möglich, in einem proteomischen Ansatz weitere aus dem GlyR-Konmplex anzureichern und zu identifizieren. Mit dem gleichen System wurde auch die Bindungsregion Gephyrins für den GlyR gefunden. Diese diskontinuierliche Bindungsstelle wird aus einer a-Helix der Aminosäuren 164 bis 184, sowie aus hydrophoben Resten gebildet, die von Aminosäure 15 bis 163 unregelmäßig über den gesamten N-Terminus Gephyrins verteilt sind. Zur Bindung an den GlyR werden beide Elemente benötigt. Das kleinste GlyR-bindende Gephyrinfragment erstreckt sich somit über die Aminosäuren 1-184. Mit einem Kosedimentationsassay wurde die Bindung Gephyrins an Mikrotubuli untersucht. Es stellte sich heraus, daß die vermutete Bindungsstelle nicht zur Bindung an Mikrotubuli benötigt wird. Vielmehr ist der C-terminale Abschnitt Gephyrins hierzu ausreichend. Um Regionen Gephyrins zu finden, die die Autoaggregation vermitteln, wurden Bindungsstudien mit dem Zwei-Hybrid-System und ein heterologes Expressionssystem in Zellkulturen durchgeführt. Es wurde gezeigt, daß sowohl die N- als auch der C-terminal gelegene Bereich in der Lage sind, mit Gephyrin zu aggregieren. Im C-Terminus wurde die Domäne auf 62 Aminosäuren eingegrenzt. Zur Erfüllung der verschiedenen Funktionen Gephyrins sind die hierfür notwendigen Domänen offensichtlich in modularer Art organisiert. So lässt sich durch alternatives Spleißen eine Variante exprimieren, die den speziellen Erfordernissen der Zelle gerecht wird. In dieser Arbeit wurden mehrere Domänen und Regionen Gephyrins eingegrenzt, deren Aufgaben von der GlyR-Bindung über die Autoaggregation zur Bildung glyzinerger Proteinkomplexe und der Verknüpfung mit dem Zytoskelett reichen. Somit konnte ein Beitrag zum weiteren Verständnis über die glyzinerge Synapse geleistet werden.
The light-harvesting chlorophyll a/b protein complex (LHC-II) is the major collector of solar energy in all plants and it binds about half of the chlorophyll in green plants. LHCII is a trimer in the photosynthetic membrane; each monomer consists of 232 amino acids, binds and orients a minimum of 12 chlorophyll molecules and three caroteinoids (two luteins and one neoxanthin) for light-harvesting and energy transfer. Although, the structure of LHC-II has been determined at 3.4 Å resolution by electron microscopy of two-dimensional crystals (Kühlbrandt et al., 1994), this is not sufficient to allow a complete understanding of the mechanism of energy transfer from LHC-II to the reaction centre, since the effective resolution in the z dimension is 4.9 Å. In fact, the chemical difference between Chl a and Chl b, which has a formyl group instead of the methyl group at the 7-position in the chlorin ring, is too small to be detected at this level of resolution. In addition, the orientation of the chlorophyll tetrapyrroles have not been determined unambiguously. This information is essential for a detailed understanding of the energy transfer within the complex and to the reaction centres of photosystem II and I (PSII and PSI). X-ray crystallography of three dimensional (3D) crystals may yield a more complete structure at high resolution. 3D crystals have been grown from LHC-II isolated from pea leaves using a standard purification procedure (Burke et al., 1978). The thylakoid membranes are solubilised in Triton X-100 and further purified by sucrose gradient ultra centrifugation. The LHC-II fraction is salt precipitated and pellets resuspended at the chlorophyll a/b ratio 2.8 mg/ml in 0.9 % Nonyl-glucoside. Crystals are currently obtained by vapour diffusion in hanging drops. These crystals are thin hexagonal plates, have a fairly large unit cell and diffract quite weakly. The high level of the background is due both to the detergent, necessary for protein solubilisation, and lipids, required for the trimer and crystals formation. However, three data sets, each from one single crystal have been collected up to 3.2 Å resolution over a rotation range of 135°. The crystals were exposed to a very highly collimated and brilliant beam (ID-14 EH1 at ESRF, Grenoble, France) and were kept under a stream of cold nitrogen to prevent radiation damage. Data were successfully integrated using the program XDS by Kabsch (1993). The crystals were found to belong to the space group P6 22 3 and have unit cell dimensions of a=128.45, b=128.45, c=135.32, a= ß=90º, ?=120. The solution of the phase problem was tackled by molecular replacement using, as a search model, the LHC-II structure solved by electron cryo-microscopy studies of twodimensional crystals (Kühlbrandt et al. 1994). Three different programs were tested: the most used AMoRe (Navaza et al., 1994) and the brute force based program Brute (Fujinaga
Bei einer HIV-1-Infektion ist die Krankheitsprogression zum Vollbild AIDS mit dem Auftreten von Virusvarianten assoziiert, die den Chemokinrezeptor CXCR4 zum Zelleintritt verwenden. Dagegen nutzen SIV ein breites Korezeptorspektrum, vor allem CCR5. Im Verlauf einer SIV-Infektion findet kein Korezeptorwechsel von CCR5 zu CXCR4 statt. In dieser Arbeit wurde der Einfluß einer solchen Änderung der Korezeptornutzung auf die SIVagm-Infektion in-vitro und auf den Verlauf der apathogenen SIV-Infektion in-vivo nach Infektion von Schweinsaffen untersucht. Um die Korezeptorspezifität eines SIV zu CXCR4 zu verändern, wurde das in AGM und Schweinsaffen apathogene SIVagm3mc verwendet, das als Korezeptoren zum Zelleintritt CCR5, BOB und BONZO nutzt. Die potentielle Korezeptorbindungsstelle, der zu HIV-1 homologe V3-Loop des Oberflächen-Hüllproteins gp130-SU des SIVagm3mc wurde durch den V3-Loop des CD4 / CXCR4-tropen HIV-1-Klons BH10 ersetzt. Das resultierende SIVagm3-X4mc erwies sich als replikationskompetent und verwendete zum Zelleintritt ausschließlich CD4 / CXCR4. Die Replikation wurde durch den natürlichen Liganden des CXCR4, SDF-1a, dosisabhängig gehemmt. Überraschenderweise besaß SIVagm3-X4mc die Eigenschaft, in-vitro nicht nur in IL2 / PHA-stimulierten sondern auch in unstimulierten PBMC von Schweinsaffen und AGM replizieren. Nach Infektion von je zwei Schweinsaffen (Macaca nemestrina) mit SIVagm3mc bzw. SIVagm3-X4mc konnte bis zu 14 Monate nach Inokulation keine Krankheitsentwicklung und kein Abfall der absoluten Anzahl der CD4 -T-Lymphozyten beobachtet werden. Die Virusbelastung der Tiere war vergleichbar und die Korezeptornutzung blieb auch nach in-vivo Replikation erhalten. Interessanterweise konnte SIVagm3-X4mc, nicht aber das Wildtypvirus SIVagm3mc, durch Sera von SIVagm3mc und SIVagm3-X4mc infizierten Schweinsaffen neutralisiert werden. HIV-1-spezifische Antikörper konnten in Sera eines mit SIVagm3-X4mc infizierten Tieren nachgewiesen werden. Diese Studie beschreibt zum ersten Mal den erfolgreichen Austausch eines V3-Loops bei SIV. Das resultierende SIVagm3-X4mc, das wie beabsichtigt CD4 / CXCR4-positive Zellen infizierte, war im Gegensatz zum Ausgangsvirus in der Lage, in nicht-stimulierten PBMC zu replizieren und zeigte Sensitivität gegenüber neutralisierenden Antikörpern, die in SIVagm3mc- und SIVagm3-X4mc-infizierten Schweinsaffen induziert wurden.
Fourier-Transform Infrarot Differenz Spektroskopie ist eine Methode. die es erlaubt, selbst kleinste konformelle Änderungen in der Umgebung der katalytischen Zentren in Enzymen selektiv und mit hoher Zeitauflösung zu messen. Diese Technik wurde an Oxidasen von Paracoccus denitrificans, Thermus thermophilus und Escherichia coli angewandt, um einen Einblick in strukturelle und molekulare Prozesse der Bindung und Dynamik von Liganden am binuklearen Zentrum zu erhalten. Die pH- und Temperatur-Abhängigkeit von CO Schwingungsmoden sowie deren Verhalten nach der Photolyse konnten zeitaufgelöst untersucht und miteinander verglichen werden. Bei Temperaturen >180K war die Bestimmung von thermodynamischen Parametern wie Enthalpie-Barrieren und Arrhenius-Vorfaktoren möglich. Aus dem Verlauf der Rückbindungskinetiken ließen sich ferner Rückschlüsse über die konformelle Heterogenität der Bindung ziehen. Für Temperaturen um 140K konnte das Protein im "quasistationären" Zustand vermessen werden, da Rückreaktionen des Liganden an die Bindungsstelle des Häm a3 unterbunden waren. Trotz der strukturellen Ähnlichkeit und analoger Funktion zeigten diese typischen Oxidasen große Unterschiede sowohl im Reaktionszentrum als auch im kinetischen Verhalten des Liganden. Die kinetischen Parameter für alle untersuchten Oxidasen weichen deutlich voneinander ab und spiegeln unter anderem die Stärke der Bindung am CUB wider. Die Temperaturabhängigkeit der Populationen der CO-Konformere und die äquivalente Rückbindungs-Kinetik der unterschiedlichen Konformere in den Oxidasen aus dem thermophilen System weisen auf ein strukturelles Merkmal in der Nähe des binuklearen Zentrums hin, das den Populations-Austausch in anderen Oxidasen unterbindet. Aufgrund der pH-Abhängigkeit der entsprechenden Oxidasen kann man schließen, daß diese Eigenschaft durch eine oder mehrere protonierbare Gruppen bewirkt wird, die die unterschiedlichen Konformere in bestimmten Positionen fixiert hält. Die Rückbindungsraten des Liganden zeigen für die T. thermophilus Oxidasen eine Rückbindung erster Ordnung. was auf eine homogene Verteilung der zwei Konformer-Populationen im Enzym deutet. Hingegen zeigte die Oxidase aus P. denitrificans für die Rückbindung eine Verteilung der Reaktionsraten. Ursache dafür ist ein sehr heterogenes Ensemble an Proteinen, das minimale strukturelle Unterschiede im Konformationsraum des Reaktionszentrums aufweist. Ein weiterer Aspekt der Arbeit war die Beobachtung von Absorptionsbanden der Hämpropionate an Cytochrome c Oxidase von Paracoccus denitrificans nach CO Rückbindung. Sowohl über 13C-isotopenmarkierte Hämpropionate als auch über ortsgerichtete Mutagenese in deren unmittelbarer Umgebung konnten definierte Banden-Zuordnungen im IR-Differenzspektrum erhalten werden. Experimente am Enzym mit Mutationen an der Stelle Asp 399 zeigten, daß die strukturellen Eigenschaften des Häm a3-CuB Zentrums im wesentlichen von dieser Veränderung nicht beeinflußt werden. Jedoch war die pH-Abhängigkeit der CO Konformere hier unterbunden, was auf deren Einfluß auf eine Protonierbarkeit im Wildtyp-Enzym hinweist. Rückschlüsse anhand der Mutante Asp399Asn zeigten (über den Verlust der pH-Abhängigkeit) ganz klar, daß alle unterschiedlichen CO-Konformere funktionell intakt sind. FT-IR Messungen an einem weiteren Enzym, der isolierten Cytochrom bd Oxidase aus E. coli, zeigten bei einer Untersuchung der CO Rückbindungs-Eigenschaften bei 84K die ausschließliche Rückbindung an das Häm d. der möglichen Sauerstoff-Bindungsstelle. Die Bindungsstelle an Häm b, die zu ca. 5% ebenfalls CO bindet, kann bei diesen Temperaturen nicht wiederbesetzt werden. Im typischen Spektralbereich von 1680 bis 1760 cm hoch minus 1 konnten eindeutig die Absorptionsbanden von Asparagin- oder Glutaminsäure-Seitenketten identifiziert werden. Über einen direkten Vergleich der Spektren, die über Redox-Reaktion und CO Rückbindung erhalten wurden, konnten diese Signale als klar in der direkten Umgebung des binuklearen Zentrums lokalisiert zugeordnet werden. Eine Rolle als vorübergehender Protonen-Akzeptor/Donor auf dem Weg zur Sauerstoff-Bindungsstelle ist naheliegend.
Identifizierung neuer Bindungspartner von Gephyrin, einem Strukturprotein inhibitorischer Synapsen
(2002)
Synapsen sind spezialisierte Zellkontakte, die der Kommunikation von Nervenzellen dienen. Für eine effiziente Signalübertragung ist es erforderlich, daß an diesem Prozeß beteiligte Proteine präzise und in hoher Dichte an der Synapse angereichert vorliegen. Die selektive Akkumulation von Glyzinrezeptoren sowie der verbreitetesten GABAARezeptoren an inhibitorischen Synapsen wird durch das periphere Membranprotein Gephyrin vermittelt. Gephyrin bindet direkt an die β-Untereinheit des Glyzinrezeptors und kann diesen vermittels seiner Affinität zu polymerisiertem Tubulin am Zytoskelett verankern. Um mehr über die Rolle dieses Proteins in der Entwicklung und Funktion von inhibitorischen Synapsen zu erfahren, sollten in der vorliegenden Arbeit neue Interaktionspartner von Gephyrin identifiziert werden. Hierzu wurde das Zwei-Hybrid-System in Saccharomyces cerevisiae zur Analyse einer cDNA-Bank aus dem Gehirn von Ratten verwendet. Dies resultierte in der Sequenzaufklärung von 24 potentiellen Gephyrin-bindenden Proteinen. Von diesen erwiesen sich vier in einem weiteren Bindungsexperiment als positiv und kommen daher als hochaffine Interaktionspartner in Frage. Es handelte sich um die eng verwandten Dynein light chains-1 und -2 (Dlc-1/-2), den Natrium-Kalzium-Austauscher NCX2 und ein Fragment eines bisher unbekannten Proteins, das nicht weiter untersucht wurde. Im Einklang mit einer möglichen Interaktion zwischen NCX2 und Gephyrin gelang es zu zeigen, daß NCX2 sowie das verwandte Protein NCX3 in neuronalen Primärkulturen an inhibitorischen Synapsen mit Gephyrin-Immunreaktivität kolokalisierten. Der Schwerpunkt der vorliegenden Arbeit lag in der Untersuchung der Interaktion zwischen Gephyrin und Dlc-1/-2. Die Bindedomäne von Gephyrin für Dlc-1/-2 konnte auf den Bereich von Aminosäuren 181-243 eingegrenzt werden, und eine Gephyrinmutante ohne dieses Bindemotiv wies keine Affinität zu Dlc-1/-2 auf. Sowohl endogenes als auch rekombinant exprimiertes Dlc-Protein kolokalisierte mit aus der Überexpression in HEK-Zellen resultierenden zytosolischen Gephyrinaggregaten. Weiter gelang die Coimmunpräzipitation von Komplexen aus Gephyrin und Dlc-1/-2 aus transfizierten HEK-Zellen, und bakteriell exprimierte GST-Fusionsproteine von Dlc-1 bzw. Gephyrin reicherten den jeweils anderen Bindungspartner aus Hirnextrakt an. In neuronalen Primärkulturen waren Dlc-Proteine zu großen Anteilen zytoplasmatisch lokalisiert, darüberhinaus jedoch in Abhängigkeit von der Zelldichte an inhibitorischen Synapsen angereichert. Dlc-1/-2 sind Komponenten der Motorproteinkomplexe Dynein und Myosin-Va, in welchen sie möglicherweise als Adapter für zu transportierende Lasten dienen. Es ist daher denkbar, daß Gephyrin über Dlc-1/-2 mit einem aktiven Transportprozess verbunden wird. Zur Untersuchung dieser Frage wurden EGFP-epitopmarkierte Gephyrinproteine in hippokampalen Neuronen exprimiert und auf ihre subzelluläre Lokalisation untersucht. Sowohl EGFP-Gephyrin als auch die Deletionsmutante ohne Dlc-Bindemotiv waren zuverlässig an inhibitorischen Synapsen angereichert, ein Lokalisationsdefekt aufgrund fehlender Dlc-Bindung wurde nicht beobachtet. Dieses Ergebnis spricht gegen eine essentielle Rolle von Dlc-1/-2 und möglicherweise assoziierten Motorproteinen im Transport von Gephyrin zur Synapse. Aktiver Transport kann jedoch andere Funktionen im Zusammenhang mit der subzellulären Lokalisation von Gephyrin haben, wie etwa im retrograden Transport zum Zellkörper des Neurons. Diese Frage wird in weiteren Experimenten zu untersuchen sein.
Im Rahmen dieser Arbeit sollte ein Anti-PGE2-Antikörperfragment exprimiert werden, mit dem über NMR-Spektroskopie genauere Strukturdaten der Antikörperbindungsdomäne zu erhalten wären. Da Fab-, Fv- und scFv-Fragmente die Antigenbindungsstelle besitzen und sich gegenüber einem vollständigem IgG zusätzlich durch ihre geringere Größe auszeichnen, wurden die korrespondierenden Antikörperfragmente für diese Arbeiten gewählt. Ausgehend von einer etablierten Hybridom-Zelllinie konnten über cDNA-Synthese und Assembly-PCR die Gene für die Antikörperfragmente bereitgestellt werden. Zum Verifizieren von DNA-Sequenz und Bindungseigenschaften stand ein Anti-PGE2-Fab-Fragment früherer Arbeiten von Frau Dr. Ilse Zündorf zur Verfügung. Für Strukturuntersuchungen müssen relativ große Proteinmengen bereit gestellt werden, daher ist es notwendig, hohe Ausbeuteverluste durch Präzipitation, Degradierung, Aufreinigungsverluste u.a. zu vermeiden. Um zunächst eine möglichst gute Proteinexpression zu erhalten, wurde der Bakterienstamm Escherichia coli BL21DE3 und das pET-Expressionssystem gewählt. In diesem System war zu erwarten, dass die überexprimierten Antikörperfragmente unter den gewählten Bedingungen in Form unlöslicher Aggregate, sogenannter inclusion bodies, in den Zellen vorliegen werden. Die der Klonierung der VH-, Vk- und scFv-Gene folgende Expression der Proteine zeigte, dass es tatsächlich zur Bildung von inclusion bodies kommt. Die Vorteile dieser Aggregatbildung, wie hohe Proteinmenge, Proteaseunempfindlichkeit aufgrund der hohen Dichte sowie die hohe Homogenität, sollten für die Gewinnung nativer Antikörperfragmente genutzt werden. Hierfür konnte ein System etabliert werden, das im wesentlichen auf der Solubilisierung der Aggregate und der Reduktion falscher Disulfidbrücken mit anschließender Rückfaltung und Rekonstituierung der Disulfidbrücken beruht. Kritische Parameter, die den Rückfaltungsprozess beeinflussen, wurden untersucht. Hierunter fallen insbesondere die Zusammensetzung des Renaturierungssystems wie Pufferbedingungen, das Verhältnis von oxidierten zu reduzierten Glutathion und der Zusatz von sogenannten Faltungsenhancern, die Additiva. Für fast alle wesentlichen Punkte konnten Systemkomponenten etabliert werden, die für das scFv-Fragment eine nahezu vollständige Überführung der inclusion bodies in die lösliche Form erlauben. Auch eine Bindung an das Antigen Prostaglandin E2 konnte unter Anwendung von Radioimmunoassays gezeigt werden. Problematisch ist die Aufkonzentrierung der in niedriger Konzentration vorliegenden renaturierten scFv-Fragmente. Je stärker aufkonzentriert wird, desto stärker präzipitieren die scFv-Moleküle in der Ultrafiltrations- bzw. Zentrifugationsfiltereinheit. Antikörper und Antikörperframente sind ohne Frage eine sehr wichtige Molekülgruppe von molekularbiologischen und biochemischen Interesse, nicht nur in dieser Arbeitsgruppe. Im Rahmen einer möglichen Weiterführung dieser Arbeit müsste geklärt werden, ob das Präzipitationsverhalten der scFv-Fragmente eine inhärente Eigenschaft des Anti-PGE2 scFv ist, oder ob hier doch eine zumindest teilweise inkorrekte Faltung der Proteinkette vorliegt. Mögliche weitere Experimente könnten in der Variation des Linkers liegen oder das etablierte Verfahren an einem weiteren scFv-Fragment zu testen. Da die genannten Probleme bei der Aufkonzentrierung der Proteinlösung auftreten, sollten statt der angewandten Techniken alternative Methoden geprüft werden. Auch wäre es interessant zu sehen, ob sich ein z.B. kommerziell verfügbares scFv-Fragment, dessen Bindungseigenschaften bekannt sind, nach Denaturierung wieder in die native Form überführen lässt. Abschließend lässt sich sagen, dass die Herstellung von nativen Protein aus inclusion bodies viele Vorteile bietet, die für die Präparation größerer Proteinmengen nicht ungenutzt bleiben sollten.
Zwei der wichtigsten Leistungen eines sich entwickelnden Embryos sind der Aufbau des Blutkreislauf- und des Nervensystems. Beide Systeme sind hierarchisch organisierte Strukturen, deren Verzweigungen nahezu alle Teile des Körpers erreichen. Es gibt eine zunehmende Zahl von Hinweisen darauf, dass ihre Entwicklung eng miteinander verknüpft ist, nach ähnlichen Prinzipien verläuft und verwandte molekulare Mechanismen verwendet. Die Entstehung eines funktionellen vaskulären Netzwerks erfordert Signale, die Prozesse wie die Lenkung und die Verzweigung von Gefäßen in den Zielgeweben kontrollieren. Ähnliche Anforderungen werden an wachsende Axone bei der Knüpfung der Verbindungen des Nervensystems während der Embryonalentwicklung gestellt. Einige der Faktoren, die die Lenkung der Axone kontrollieren, spielen auch eine ähnliche Rolle in der vaskulären Entwicklung. Lenkungsmoleküle, die eine Richtungsinformation vermitteln, sind für die Wegfindung der Axone besonders wichtig. Die größte Familie solcher Lenkungsmoleküle wird durch die Semaphorine gebildet. Semaphorine können in acht Klassen unterteilt werden, deren gemeinsames Merkmal eine konservierte Semaphorin-Domäne ist und die unterschieden werden anhand ihrer Klassen-spezifischen carboxyterminalen Domänen. Die Semaphorin-Familie umfasst sowohl sekretierte als auch membrangebundene Proteine. Die am besten charakterisierten hiervon sind die sekretierten Klasse 3 Semaphorine. Eine Kombination von in vitro und in vivo Ansätzen zeigte, dass die Klasse 3 Semaphorine an der Steuerung der Axon- und Dendritenlenkung, der Bildung von Axonbündeln und der neuronalen Migration während der Entwicklung des Nervensystems beteiligt sind. Sie agieren hauptsächlich als repulsiv wirkende Signale, die Axone aus Regionen ausschließen, von den Geweben weg, in denen sie exprimiert sind. Diese Wirkung wird über die Semaphorin-Domäne vermittelt. Verschiedene Hinweise deuten auf eine Beteiligung von Semaphorinen an der Entwicklung des vaskulären Systems. Sowohl homozygote Sema3a- als auch Sema3c-Mausnullmutanten sterben nach der Geburt aufgrund kardiovaskulärer Defekte. Darüber hinaus binden die Rezeptoren für die Klasse 3 Semaphorine, Neuropilin-1 (Nrp-1) und –2 (Nrp-2), einige Isoformen des vaskulären endothelialen Wachstumsfaktors (Vascular Endothelial Growth Factor, VEGF). Neuropilin-1 und Neuropilin-2-defiziente Mäuse und Neuropilin-1/-2-Doppelmutanten weisen Defekte des Gefäßsystems auf, wie z.B. eine Rückbildung der neuralen Vaskularisierung und Abweichungen in der Entwicklung des Herzens und der großen Gefäße. Die membrangebundenen Semaphorine sind bisher nur wenig untersucht, da zuverlässige in vitro Assays fehlen. Somit ist ein genetischer Ansatz der beste Weg, die physiologische Funktion dieser Proteine zu untersuchen. Aus diesen Gründen war die Zielsetzung dieser Arbeit, durch homologe Rekombination in embryonalen Stammzellen eine Mauslinie herzustellen, die ein Nullallel des membrangebundenen Sema5a-Gens trägt. Für diesen Ansatz wurde ein Mitglied der Klasse 5 Semaphorine gewählt, da es nur zwei Mitglieder dieser Klasse im Mausgenom gibt, die weitgehend komplementäre Expressionsmuster aufweisen. Damit unterscheiden sie sich von den anderen Klassen der Semaphorine, deren Mitglieder stark überlappende Expressionsmuster zeigen. Dies verringert die Wahrscheinlichkeit einer gegenseitigen funktionellen Kompensation nach Mutation eines Gens. Die Klasse 5 Semaphorine sind auch deshalb besonders interessant, da sie die einzigen sind, die sowohl in Vertebraten als auch in Invertebraten vertreten sind. Sie sind gekennzeichnet durch sieben carboxyterminale Typ 1-Thrombospondinmodule (TSP) in ihrer extrazellulären Domäne. TSPs wurden ursprünglich in den Proteinen Thrombospondin 1 und 2 gefunden, in denen sie das Auswachsen von Neuriten verschiedener Nervenzelltypen fördern. Dies lässt vermuten, dass Klasse 5 Semaphorine sowohl inhibierende als auch stimulierende Effekte haben könnten, in dem sie unterschiedliche Rezeptoren mit der Semaphorin-Domäne oder der TSPs aktivieren. Das Expressionsmuster von Sema5A und die bekannte Funktion von Semaphorinen in der Ausbildung neuronaler Verbindungen lassen es sinnvoll erscheinen, bei der Untersuchung der mutanten Tiere den Schwerpunkt auf die Entwicklung des Nerven- und des Gefäßsystems zu legen. Aufgrund technischer Schwierigkeiten konnte innerhalb der Bearbeitungszeit dieser Doktorarbeit nur der Phänotyp des vaskulären Systems untersucht werden. Die Inaktivierung des Sema5a-Gens wurde durch die Verwendung eines ‚Targeting’-Vektors erreicht, welcher die Exone 4 und 5 des Sema5a-Gens durch eine Neomycin-Selektionskassette ersetzte. Aus 144 untersuchten ES-Zellklonen wurden drei ES-Zellinien mit einem rekombinierten Sema5a-Locus identifiziert. Zwei der positiven Klone wurden zur Herstellung einer chimären Maus durch die Morula-Aggregationsmethode verwendet. Mit einem der Klone konnte eine männliche Chimäre erzeugt werden, die nach Kreuzung mit NMRI-Wildtyptieren die Mutation an die Nachkommen weitergab. Der Verlust der Proteinexpression in homozygoten Sema5a-Mutanten wurde durch Westernblot-Analyse von Zellmembranpräparationen homozygoter Embryonen unter Verwendung eines Antikörpers gegen das zytoplasmatische Ende von Sema5A bestätigt. Dieses Ergebnis bestätigte, dass die Deletion des vierten und fünften Exons des Sema5a-Gens ein Nullallel hervorbringt. Nach Verpaarungen heterozygoter Mutanten konnten keine Neugeborenen identifiziert werden, die homozygot für das mutierte Allel waren. Homozygte Mutanten starben zwischen E11,5 und E12,5 der Embryonalentwicklung, der Verlust von Sema5A ist also embryonal letal. Die Morphologie der homozygoten Tiere zeigte keinen offensichtlichen Unterschied zu den heterozygoten Embryonen oder zu Wildtyp-Geschwistern auf. Frühe embryonale Musterbildungsprozesse in Sema5a-Nullmutanten sind also nicht gestört. Ein Tod bei dieser Entwicklungsstufe deutet auf einen Defekt in der Entwicklung des Blutgefäßsystems hin, da die Embryonalstadien zwischen E9 und E13 besonders wichtig für die Ausbildung dieser Gefäße sind und viele Mutationen, die Herz und Blutgefäßen beeinträchtigen, den Tod der Embryonen in diesem Stadium bewirken. Das embryonale Blutgefäßsystem in E10,5 und E11,5 Embryonen wurde durch immunhistochemische Färbungen ganzer Embryonen unter Verwendung eines spezifischen gegen das Platelet Endothelial Cell Adhesion Molecule (PECAM) gerichteten Antikörpers dargestellt, welches in vaskulären Endothelzellen exprimiert ist. Die allgemeine Architektur des Gefäßsystems war in homo- und heterozygoten Mutanten ähnlich und wies weder an E10,5 noch an E11,5 besondere Abweichungen auf. Es wurden bei der Lage und der Anzahl intersomitischer Gefäße, der Entwicklung der dorsalen Aorta oder der Vaskularisierung der Extremitätenanlagen keine Abweichungen festgestellt. Morphologische Defekte konnten jedoch bei E10,5 in den Verästelungen der Blutgefäße detektiert werden, die von den Hauptvenen der Cranialregion abzweigen. Die Verzweigungen waren geringer ausgeprägt als in heterozygoten oder Wildtyp-Vergleichstieren. Insbesondere zeigte sich eine Verringerung der Anzahl sekundärer und tertiärer Verzweigungen. In dem sich entwickelnden Embryo führt die wiederholte Verzweigung von Ästen der Hauptvenen zu einem hierarchisch gegliederten Netzwerk großer Gefäße in der Region des medialen Kopfes. Während die Ausbildung dieses Netzwerkes in den Sema5a-/--Tieren beeinträchtigt ist, erscheint die Organisation der kleinen Gefäße in den mehr dorsal und peripher gelegenen Regionen des Kopfes normal. In heterozygoten und homozygoten Mutanten bilden die kleineren Gefäße ein dicht verzweigtes Netzwerk. Die Verminderung der Komplexität der größeren Gefäße konnte in allen untersuchten Nullmutanten beobachtet werden. Es variierte jedoch die Penetranz des Phänotyps. In allen Fällen war die Anzahl primärer Verzweigungen unverändert, während die Anzahl der sekundären und der tertiären Verzweigungen zu unterschiedlichen Graden reduziert war. Im Gegensatz dazu zeigte sich im Verzweigungsmuster von heterozygoten Mutanten und beim Wildtyp nur eine geringe Variabilität zwischen individuellen Embryonen. Dies belegt, dass die Verminderung des Verzweigungsgrades größerer Gefäße nicht innerhalb der normalen Variabilität liegt, sondern durch die Inaktivierung des Sema5a-Gens verursacht wird. Dieser Phänotyp ist in späteren Stadien sogar deutlicher ausgeprägt. In E11,5 Embryonen waren die Stämme der großen Blutgefäße in den Nullmutanten weniger komplex und in einigen Fällen trat sogar eine Reduzierung der Anzahl primärer Verzweigungen auf. Diese spätere Verminderung der Anzahl bereits ausgebildeter primärer Verzweigungen legt nahe, dass der Phänotyp durch eine Rückbildung von Verzweigungen aufgrund möglicher Defizite in deren Reifung und/oder Stabilisierung erfolgt. Die interessanteste Besonderheit der vaskulären Defekte in den Nullmutanten liegt in ihrer regionalen Spezifität. Bis hier ist das Netzwerk großer Gefäße, welches der anterioren Hauptvene entspringt, das einzige Gefäßsystem, in dem Abweichungen entdeckt wurden. Dieses Netzwerk wird durch die strukturelle Umbildung des primären kapillaren Plexuses gebildet. Zwischen E9,5 und E12 sprießen Zweige rostral aus der Hauptvene, um ein hierarchisch organisiertes Netzwerk von Gefäßen zu bilden. Die Umbildung des primären kapillaren Plexus in den mehr rostral und ventral gelegenen Kopfregionen führt zu der Bildung eines hochverzweigten vaskulären Netzwerkes, welches jedoch bei E10,5 noch nicht hierarchisch organisiert erscheint. Die Signale, die für diesen unterschiedlichen Ablauf der Musterbildung während der Entwicklung des Gefäßsystems des Kopfes verantwortlich sind, sind noch unbekannt. Die besonderen Defekte in der stereotypischen Organisation der cranialen Gefäße in Sema5a-Mutanten legt nahe, dass Sema5A eines dieser Signale sein könnte. Es könnte Teil eines Rezeptor/Ligandenkomplexes sein, welcher positionelle Signale für das Verzweigen und das Wachstum großer Gefäße in rostraler Richtung liefert. Sema5A könnte die Bildung von Verzweigungen durch die Regulierung der Wanderung endothelialer Zellen, ihrer Proliferation oder ihrer Interaktion mit unterstützenden Zellen oder der extrazellulären Matrix kontrollieren. Sema5A könnte Teil eines neuen Signalweges sein oder als Teil eines der bekannten Signalwegs wirken, welcher die Entwicklung des Gefäßsystems reguliert. Einer der Signalwege, die essentiell für die Gefäßbildung sind, wird durch VEGF und Angiopoietin (Ang-1) reguliert. Sowohl in VEGF-, als auch in Ang-1-Mutanten ist die Gefäßumbildung im Kopf beeinträchtigt. Insbesondere erscheint das Netzwerk kleiner Gefäße in den Ang-1 Nullmutanten als nur nur teilweise restrukturiert und die großen Gefäße als weniger komplex. Das Verzweigungsmuster der großen Gefäße in den Ang-1- Nullmutanten ähnelt auffallend dem der Sema5a-Nullmutanten. Eine zweite Ähnlichkeit in den Phänotypen von Ang-1- und Sema5a-Mutanten zeigt sich in der Reduzierung der primären Verzweigungen, welche in den Sema5a-Nullmutanten bei E11,5 beobachtet wird. Hier könnte die Verminderung aus einer Rückbildung von Gefäßen resultieren, wie sie auch typischerweise in Mutanten für Ang-1 oder dessen Rezeptor auftritt. Diese Beobachtung legt nahe, dass Sema5A ein neuer Teilnehmer innerhalb des Ang-1-Signalweges ist, welcher die Auswirkung von Ang-1 auf die endothelialen Zellen der großen Gefäße entweder vermittelt oder moduliert und dadurch das spezifische Muster der Blutgefäße des Kopfes beeinflußt. Mit dieser Doktorarbeit wird zum ersten Mal eine funktionelle Untersuchung des Klasse 5 Semaphorins Sema5A vorgestellt. Die phänotypische Untersuchung von Mäusen, die Nullallele für Sema5a-Gens tragen ergab, dass dieses membrangebundene Protein essentiell für die embryonale Entwicklung ist. Es ist an der Musterbildung des Gefäßsystems beteiligt. Seine Aufgabe besteht möglicherweise darin, die Bereitstellung positioneller Signale für die Ausbildung von Gefäßverzweigungen zu gewährleisten. Einige grundlegende Fragen werden durch diesen Phänotyp aufgeworfen. Sowohl die Ursache für die embryonale Sterblichkeit als auch die zellulären Prozesse, welche in den Sema5a-Nullmutanten beeinträchtigt sind, müssen noch beschrieben werden. Unbekannt ist ebenfalls, ob zusätzlich zu der hier beschriebenen Rolle von Sema5A in der Gefäßbildung dieses an der Entwicklung des Nervensystems beteiligt ist. Die ersten Daten über die physiologische Rolle von Sema5A, welche mit dieser Arbeit vorgelegt werden, öffnen den Weg für weitergehende Untersuchungen über die Funktion des Proteins während der Embrionalentwicklung. Das hier erstmals vorgestellte Modellsystem ermöglicht es, Sema5A regulierte zelluläre Mechanismen zu untersuchen. Zusätzlich stellt es ein Werkzeug zur Verfügung, um die funktionelle Beziehung zwischen der Entwicklung des kardiovaskulären Systems und des Nervensystems zu untersuchen. Damit können die Aufgaben der Semaphorin-Proteinfamilie, die an diesen beiden wichtigen Prozessen beteiligt sind, näher charakterisiert werden.
Gehirne von an Scrapie erkrankten Tieren sind histopathologisch durch Vakuolisierung, Astrogliose, Neurodegeneration und charakteristische PrPSc-Ablagerungen gekennzeichnet. Die pathologischen Mechanismen, die zu diesen Veränderungen führen, sind noch weitgehend unverstanden. Die Untersuchung der differentiellen Genexpression in Scrapie-infizierten Mausgeweben kann zu einem besseren Verständnis der pathogenen Mechanismen dieser Erkrankung auf molekularer Ebene beitragen. Auch könnten einige der differentiell exprimierten Gene zur Entwicklung eines auf Surrogatmarkern basierenden Testsystems beitragen oder für die Entwicklung von Strategien zur therapeutischen Intervention nützlich sein. Um im Verlauf der Scrapieerkrankung in Mäusen hoch- oder herunterregulierte Gene zu identifizieren, wurden RNA arbitrarily primed PCR (RAP-PCR) und suppression subtractive hybridisation (SSH) an Hirn- und Milzproben Scrapie-infizierter Mäuse und gesunder Kontrolltiere durchgeführt. Die Ergebnisse wurden anhand eines differentiellen Screening-Schrittes, Sequenzanalysen und Northernblots bestätigt. Durch einen Datenbankabgleich der erhaltenen Sequenzen wurden mehrere Kandidaten identifiziert. Einige davon, wie GFAP, Apolipoprotein D, Vimentin, Mx-Protein, MHC I und II wurden bereits als in Scrapie-infizierten Gehirnen hochreguliert von anderen Arbeitsgruppen publiziert. Eine differentielle Regulation weniger weiterer Kandidaten, wie Cytochromoxidase, Ubiqitinierungsfaktor E4a und das herunterregulierte Stathmin wurden bisher noch nicht beschrieben. Auch eine bisher unbekannte differentiell exprimierte Sequenz wurde gefunden. Ergänzend zu den Untersuchungen auf Nukleinsäureebene wurde die 2DElektrophorese für Gehirngewebe zur Untersuchung der differentiellen Expresssion auf Proteinebene unter Berücksichtigung posttranslationaler Modifikationen etabliert. Protokolle für die Vorbereitung von Mäusegehirnproben, die Durchführung der isoelektrischen Fokussierung und der 2. Dimension, sowie Färbeprotokolle für qualitative und quantitative Analysen der Gele unter Berücksichtigung der Erfordernisse nachfolgender MALDI-Analysen wurden erarbeitet.
Septine bilden eine neue Klasse filamentbildender kleiner GTPasen, die ursprünglich in der Hefe Saccharomyces cerevisiae aufgrund ihrer Funktion in der Cytokinese entdeckt wurden. Mittlerweile wurde gezeigt, dass Septine nicht nur in Pilzen, sondern auch im gesamten Tierreich vorkommen. In Säugern sind bisher zehn Isoformen, die z. T. in mehreren Spleißvarianten auftreten, beschrieben worden. Die Tatsache, dass Septine auch in postmitotischen Geweben wie dem Hirn exprimiert werden, weist darauf hin, dass Septine zumindest in Säugetieren nicht nur in der Zellteilung eine Rolle spielen. Die nachgewiesene Interaktion eines Säugerseseptins mit dem für die Fusion sekretorischer Vesikel essentiellen Membranprotein Syntaxin-1 (Beites et al., 1999) und die Koimmunopräzipitation eines Septinkomplexes mit Antikörpern gegen den Sec6/8-Komplex (Hsu et al., 1998), der beim zielgerichteten Transport sekretorischer Vesikel eine Rolle spielt, deuten darauf hin, dass Säugerseptine ein Funktion bei Transportprozessen spielen könnten. Um weitere Hinweise über die Wirkungsweisen von Septinen zu erhalten, wurden in dieser Arbeit zwei Screening-Systeme angewendet, um Interaktionspartner von Septinen zu identifizieren. Bei einem Suppressor-Screen mit einer Hefe-Septinmutante (cdc1-11) wurden zwei andere Hefeseptine als Suppressoren identifiziert (Cdc3p und Cdc12p), was auf eine Redundanz in der Funktion dieser Septine hinweist. Außerdem wurden Hefe-Zwei-Hybrid-Screens durchgeführt, bei denen eine cDNA-Bank aus adultem Rattenhirn nach potentiellen Interaktionspartnern des N-Terminus und des C-Terminus des Säuger-Septins rSLPa durchsucht wurde, das wegen der oben genannten Koimmunpräzipitation mit Komponenten des Sec6/8-Komplexes möglicherweise eine Rolle in Transportprozessen spielt. Als möglicher Interaktionspartner des N-Terminus von rSLPa wurde die lange Isoform der Kalzium-unabhängigen Phospholipase A2 identifiziert. Die Interaktion konnte in vitro mittels GST-Fusionsproteinen in Kopräzipitations-Experimenten zwar nicht eindeutig verifiziert werden. Jedoch wurde in Koexpressionsexperimenten eine Kolokalisation von rSLPa mit iPLA2 beobachtet, was zumindest auf eine mögliche Interaktion beider Proteine in vitro hindeutet. Weitere Untersuchungen sind notwendig, um die gefundene Interaktion eindeutig zu verifizieren. Als Interaktionspartner des C-Terminus von rSLPa wurden drei verschiedene Septine identifiziert: KIAA0202, Pntl2 und ein Klon mit hoher Homologie zu Septinen (DKFZp566C224). Die Interaktion von rSLPa und KIAA0202 wurde durch Kolokalisationsstudien in COS-7 Zellen bestätigt. Bei der weiteren Untersuchung verschiedener Säugerseptine und deren Interaktionen wurde die filamentbildende Eigenschaft der Septine näher charakterisiert. Mithilfe von Mutanten, die die Fähigkeit, GTP zu binden, verloren hatten, konnte nachgewiesen werden, dass die GTP-Bindung eine wichtige Funktion in der Filamentbildung hat. Des Weiteren wurde gezeigt, dass der N-Terminus von rSLPa dessen Lokalisation an Aktinstressfasern vermittelt. Mit spezifischen Antiseren, die gegen rSLPa und Septin6 hergestellt wurden, wurde die Expression dieser Septine in verschiedenen Rattengeweben untersucht. Außerdem wurde gezeigt, dass beide Septine während der Entwicklung in etwa gleich bleibenden Mengen in verschiedenen Regionen des Gehirns exprimiert werden, was die Annahme unterstützt, dass diese Septine nicht ausschließlich eine Rolle in der Zellteilung spielen. Die Lokalisation von endogenem sowie überexprimiertem rSLPa wurde in hippocampalen Neuronen untersucht. rSLPa ist nicht synaptisch, sondern in Anreicherungen direkt neben synaptischen Kontakten, bzw. unterhalb von dendritischen Dornfortsätzen lokalisiert. Diese Lokalisation von rSLPa weist neben einer Funktion des Septins in Transportprozessen auch auf eine Rolle in der Kompartimentalisierung der Plasmamembran von Neuronen hin.
G-Protein-gekoppelte Rezeptoren (GPCRs) bilden eine Superfamilie von plasmamembranständigen Proteinen. Die chemische Vielfalt ihrer Aktivatoren macht sie zu der größten und variantenreichsten Proteinfamilie mehrzelliger Organismen. Moderne Klonierungstechniken sowie der Abschluß der Humangenom-Sequenzierung im Jahr 2001 haben die Existenz von ca. 140 unbekannten GPCR-Sequenzen offengelegt, denen bislang weder ein natürlicher Ligand noch eine physiologische Funktion zugeordnet werden konnte. Sie werden daher als orphan Rezeptoren (engl.: Waisenkind) bezeichnet. Mehr als 30% der auf dem internationalen Pharma-Markt zugelassenen Substanzen sind GPCRWirkstoffe mit einem Jahresumsatz (2000) von 23,5 Mrd. US-$ (Wise et al., 2002). Aufgrund der großen wirtschaftlichen Bedeutung dieser Rezeptorfamilie ist es verständlich, daß die pharmazeutische Forschung mit hohem Aufwand an der Ligandenidentifizierung von orphan GPCRs arbeitet und die Ergebnisse patentrechtlich absichert. Die unter den Begriffen Reverse Pharmakologie und Orphan Rezeptor Strategie zusammengefaßte, praktische Wirkstoffentwicklung an orphan GPCRs vereinigt Techniken aus Bioinformatik, Zell- und Molekularbiologie, Biochemie und Pharmakologie. Im Zentrum dieser Arbeit stehen die humanen orphan Rezeptoren gpr3 (Iismaa et al., 1994), gpr6 (Heiber et al., 1995) und gpr12 (Song et al., 1995). Die Sequenz-Identität beträgt 57-61% auf der Proteinebene, und das deutet auf eine neue GPCR-Subfamilie hin. Aufgrund dominanter Präsenz von gpr3-, 6- und 12-mRNA-Transkripten im ZNS ist bislang ein Ligand mit neuromodulatorischen Eigenschaften vermutet worden. Eggerickx et al., 1995 zeigen, daß gpr3-transfizierte COS-7-Zellen konstitutiv, d.h. Agonist-unabhängig, die Adenylat-Zyklase aktivieren und so zu basal erhöhten cAMP-Spiegeln führen. Die Autoren vermuten die Ursache der Agonist-Unabhängigkeit entweder in einer basalen Aktivierung durch einen ubiquitären Serumfaktor im Kulturmedium oder in einer starken Überexpression im COS-7-Zellmodell. Bioinformatische Analysen im Vorfeld dieser Arbeit (Dr. Gassenhuber, Aventis Pharma, 2000) zeigen große Ähnlichkeiten von gpr3, 6 und 12 zu der Cannabinoid (cb)- und zu der endothelial differentiation gene (edg)-Lipidrezeptorfamilie von 42-44% auf der Proteinebene, und das deutet auf ein Lipid als potentiellen Liganden hin. Die edg-Rezeptoren regulieren über die bioaktiven Lipid-Mediatoren Sphingosin-1-Phosphat (S1P) und Lysophosphatidsäure (LPA) zentrale physiologische Funktionen im Rahmen von Proliferation und Zelldifferenzierung sowie eine Vielzahl kardiovaskulärer Effekte (z.B. Plättchenaktivierung, Schutz des Endothels vor Apoptose, Angiogenese, negative Chronotropie, Entwicklung des Herzens etc.). Aventis Pharma Deutschland GmbH beschäftigt sich u.a. mit der molekularbiologischen und pharmakologischen Charakterisierung dieser kardiovaskulären Effekte. Die zentrale Fragestellung dieser Arbeit besteht darin, zu klären, ob auch die orphan Rezeptoren gpr3, 6 und 12 über bioaktive Lipide und eine zusätzliche Expression in peripheren, Herz-Kreislauf-relevanten Organen eine Rolle spielen. Die Ergebnisse dieser Arbeit identifizieren gpr3, 6 und 12 als eine Familie von konstitutiv aktiven Rezeptoren, wobei die konstitutive Aktivierung unabhängig vom Rezeptor-Subtyp, der Spezies oder dem Zelltyp ist. Die Beobachtung, daß HEK293-Zellen, die mit den potentiellen Lipidrezeptoren gpr3, 6 und 12 transfiziert wurden, in lipidfreiem Medium (Aktivkohle-resorbiertes Serum) reduzierte, basale cAMP-Spiegel zeigen, führt zu der Schlußfolgerung, daß zumindest ein Teil der konstitutiven Aktivität auf ein Lipid des Serums zurückzuführen sein muß. In second messenger-Assays sind die bioaktiven Lipide S1P und Dihydro-S1P (DHS1P) als Modulatoren der konstitutiven gpr3-, 6- und 12-Aktivität identifiziert und funktionell charakterisiert worden. S1P- und DHS1P-Wirkungen an diesen Rezeptoren induzieren in HEK293-Zellen sowohl eine Ca2 -Mobilisierung (EC50 = 50-100nM), eine Stimulation der Adenylat-Zyklase als auch eine funktionelle Internalisierung eines Fusionskonstruktes aus gpr6 mit einem grün fluoreszierenden Protein (GFP). Das im Rahmen dieser Arbeit klonierte gpr3-Homologe der Ratte (Acc.Nr.: AJ427482) läßt sich ebenfalls durch S1P und DHS1P in funktionellen Ca2 - und cAMP-Assays anschalten. Eine Substanz-Bibliothek mit 200 bioaktiven Lipiden bestätigt die Wirksamkeit von S1P und DHS1P und liefert darüber hinaus keinen weiteren Liganden mit agonistischen Eigenschaften an den humanen Rezeptoren gpr3, 6 und 12. Expressionsprofile von gpr3, 6 und 12 sind mittels Nachweismethoden auf mRNA- (RT-PCR, Echtzeit- Taqman-PCR, Northern Blot, RNA-Chip) und Proteinebene (Western Blot) erstellt worden. Sie konnten mit Informationen aus der LifeSpan Bioscience-Datenbank (www.isbio.com) ergänzt werden, die ein immunhistologisches Profil des humanen Rezeptors gpr12 im gesunden und kranken Gewebe zur Verfügung stellt. Der Nachweis von gpr3-, 6- und 12-mRNA-Transkripten und Proteinen in einer Vielzahl humaner peripherer Organe und in isolierten Zellsystemen des Herz-Kreislauf- (Herz, Niere, Endothel- und glatte Gefäßmuskelzellen, Blutplättchen) und Immunsystems (Milz, Thymus, Leukozyten) weist eindeutig auf zusätzliche, periphere Funktionen dieser Rezeptorfamilie hin. Dies untermauert die kardiovaskuläre Relevanz, die bereits aufgrund des Liganden S1P zu vermuten war. In einem endothelialen Funktionsmodell, bei dem der pulsierende Blutstrom im Gefäßlumen simuliert wird (Scherstress), wird der Rezeptor gpr3 um den Faktor 2 auf Proteinebene hochreguliert. Es ist jedoch offen, ob diese Regulation auf eine Schutzfunktion im Endothel oder auf eine funktionelle Gegenregulation zurückzuführen ist. Zur Klärung dieser Frage sind Antisense-Oligonukleotide gegen den Rezeptor gpr3 getestet worden; eine Reduktion des gpr3-Proteinniveaus konnte jedoch nicht nachgewiesen werden. Die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit identifizieren die humanen orphan Rezeptoren gpr3, 6 und 12 als weitere Mitglieder einer kontinuierlich wachsenden Lipidrezeptorfamilie. Es ist ein wesentlicher Schwerpunkt zukünftiger Studien, diesen für die Herz-Kreislauf-Forschung interessanten Rezeptoren eine physiologische bzw. pathophysiologische Funktion zuzuordnen.
In dieser Arbeit wurde das Potential von CD34-positiven hämatopoetischen Stammzellen (HSC) und Endothelprogenitorzellen (EPC) aus peripherem Blut bzw. Nabelschnurblut sowie von aus diesen Vorläuferzellen differenzierten Zellen als Zielzellen für die Gentherapie der Hämophilie A untersucht. Der Gentransfer erfolgte mit einem lentiviralen Vektorsystem der zweiten Generation, das einen bicistronischen Transfervektor mit internem CMV-Promotor, einer FVIII-cDNA mit Deletion der B-Domäne, einem IRES-Element und dem EGFP-Gen als Markergen enthielt. Das Vektorsystem wurde zunächst für die Transduktion humaner hämatopoetischer Zellinien verwendet, die verschiedene Leukozytentypen repräsentierten, um es in bezug auf Gentransfereffizienz und FVIII-Expressionsstärke zu evaluieren. Im Rahmen dieser Versuchsreihe konnte zum ersten Mal gezeigt werden, daß hämatopoetische Zellen grundsätzlich in der Lage sind, FVIII zu sezernieren. Zugleich verwiesen die Befunde auf mögliche Expressionsprobleme, da trotz durchweg erfolgreichen Gentransfers und FVIII-Transkription nur in den Überständen von vier der sechs charakterisierten Zellinien FVIII-Protein meßbar war. In anschließenden Experimenten mit humanen und murinen HSC sowie humanen Granulozyten und Makrophagen konnte nach lentiviralem Gentransfer keine Sezernierung von FVIII-Protein detektiert werden. In expandierten humanen HSC wurden jedoch FVIII-mRNA und intrazelluläres FVIII-Protein detektiert, so daß in diesen Zellen ein Exportdefekt für das FVIII-Protein vorzuliegen schien. Da hämatopoetische Zellen und Endothelzellen mit dem Hämangioblasten eine gemeinsame Vorläuferzelle besitzen, wurde zudem geprüft, ob aus CD34-positiven Stammzellen generierte Endothelprogenitorzellen (EPC) in der Lage sind, therapeutisch relevante FVIII-Mengen zu sezernieren. In Anwesenheit von VEGF, FGF-2, SCF und SCGF-beta wurden adhärente Zellen gewonnen, die aufgrund des Musters der Expression von Oberflächenmarkern und durch ihr Verhalten im Matrigel-Assay einen eindeutig endothelialen Phänotyp besaßen. Diese Zellen wurden (bezogen auf die Zahl der eingesetzten CD34-positiven Zellen) um bis zu neun Größenordnungen expandiert. Nach lentiviraler Transduktion der Zellen, die weder das Proliferationspotential der Zellen noch ihren Phänotyp veränderte, wurde eine hocheffiziente FVIII:C-Sezernierung (7,0-7,8 IU/10 hoch 6 Zellen/48 Std.) gemessen. Im ELISA fielen leicht erhöhte FVIII:Ag-Werte auf, und eine nachfolgende Western Blot- Analyse legte nahe, daß dies auf unvollständige intrazelluläre Spaltung des FVIII-Polypeptids in schwere und leichte Kette zurückführbar sein könnte, die sich wegen der weiteren proteolytischen Aktivierung im Plasma jedoch nicht negativ auf die Gerinnungsaktivität in vivo auswirken sollte. Die Befunde dieser Arbeit identifizieren EPC aus CD34-positiven Nabelschnurblutzellen als potentielle Zielzellen für eine FVIII-Substitution nach ex vivo-Gentransfer, da sie sich nicht nur durch ihr hohes Expansionsvermögen auszeichnen, sondern auch durch die Fähigkeit zur rekombinanten FVIIISezernierung auf sehr hohem Niveau, das nur wenig unter dem FVIII-Sekretionspotential humaner Hepatozyten liegt. Primäre hämatopoetische Zellen sind aufgrund eines Exportdefektes zwar nicht direkt für eine FVIII-Substitution, möglicherweise aber für eine Toleranzinduktion geeignet.
The endothelin B receptor belongs to the rhodopsin-like G-protein coupled receptors family. It plays an important role in vasodilatation and is found in the membranes of the endothelial cells enveloping blood vessels. During the course of this work, the production of recombinant human ETB receptor in yeast, insect and mammalian cells was evaluated. A number of different receptor constructs for production in the yeast P. pastoris was prepared. Various affinity tags were appended to the receptor N-and C-termini to enable receptor detection and purification. The clone pPIC9KFlagHisETBBio, with an expression level of 60 pmol/mg, yielded the highest amount of active receptor (1.2 mg of receptor per liter of shaking culture). The expression level of the same clone in fermentor culture was 17 pmol/mg, and from a 10L fermentor it was possible to obtain 3 kg of cells that contained 20-39 mg of the receptor. For receptor production in insect cells, Sf9 (S. frugiperda) suspension cells were infected with the recombinant baculovirus pVlMelFlagHisETBBio. The peak of receptor production was reached at 66 h post infection, and radioligand binding assays on insect cell membranes showed 30 pmoL of active receptor /mg of membrane protein. Subsequently, the efficiency of different detergents in solubilizing the active receptor was evaluated. N-dodecyl-beta-D-maltoside (LM), lauryl-sucrose and digitonine/cholate performed best, and LM was chosen for further work. The ETB receptor was produced in mammalian cells using the Semliki Forest Virus expression system. Radioligand binding assays on membranes from CHO cells infected with the recombinant virus pSFV3CAPETBHis showed 7 pmol of active receptor /mg of membrane protein. Since the receptor yield from mammalian cells was much lower than in yeast and insect cells, this system was not used for further large-scale receptor production. After production in yeast and insect cells, the ETB receptor was saturated with its ligand, endothelin-1, in order to stabilize its native form. The receptor was subsequently solubilized with n-dodecyl-beta-D-maltoside and subjected to purification on various affinity matrices. Two-step affinity purification via Ni2+-NTA and monomeric avidin proved the most efficient way to purify milligram amounts of the receptor. The purity of the receptor preparation after this procedure was over 95%, as judged from silver stained gels. However, the tendency of the ETB receptor produced in yeast to form aggregates was a constant problem. Attempts were made to stabilize the active, monomeric form of the receptor by testing a variety of different buffer conditions, but further efforts in this direction will be necessary in order to solve the aggregation problem. In contrast to preparations from yeast, the purification of the ETB receptor produced in insect cells yielded homogeneous receptor preparations, as shown by gel filtration analysis. This work has demonstrated that the amounts of receptor expressed in yeast and insect cells and the final yield of receptor, isolated by purification, represent a good basis for beginning 3D and continuing 2D crystallization trials.
In this study we investigated the regulation of IL-18BPa by IFN-y in the context of colon cancer and human autoimmune diseases. IL-18BPa is a naturally occuring inhibitor that counteracts IL-18 bioactivity. By enhancing IFN-y production IL-18 has been introduced as pivotal mediator of TH1 immune responses. Indeed, many IL-18 effects are mediated by IFN-y. IL-18 bioactivity is connected with the pathogenesis of different inflammatory diseases, for instance, septic shock, colitis, Crohn's disease, myasthenia gravis, multiple sclerosis, rheumatoid arthritis, atherosclerosis, and organ transplant rejection. In addition, IL-18 has tumor-suppressive properties. IFN-y induced IL-18BPa expression was shown on protein and mRNA level in different colon carcinoma cell lines, organ cultures of colonic intestinal biopsy specimens, HaCaT keratinocytes as well as rheumatoid arthritis fibroblastlike synoviocytes (RA-FLS). The IFN-y-mediated induction of IL-18BPa appears to be a more general phenomenom. The capability of IFN-y to induce IL-18BPa also has been confirmed on the promoter level by performing luciferase reporter gene studies with two IL- 18BP promoter fragments. A GAS-site proximal to the transcription start site has been identified to be relevant for IFN-y-mediated induction of these two IL18BP promoter fragments. The induction of IL-18BPa is most likely mediated by STAT-1 in DLD-1 colon carcinoma cells. Sodium butyrate inhibited IFN-y-induced IL-18BPa expression in these cells. On the basis of our observations, we postulate a negative feedback mechanism, by which IFN-y-dependent and -independent IL-18 action might be counterregulated. In this model sodium butyrate is an additional player, that may interrupt the postulated negative feedback loop. A coculture system was performed to simulate an inflammatory TH1 response. This model which is more close to the in vivo situation, confirmed upregulation of IL-18BPa by endogenously produced IFN-y. The role of IL-18BPa is manifold and depends on IL-18 function in each particular case. In autoimmune diseases, for instance, which are often characterized by a TH1 polarized immune response, IL-18BPa might counterregulate IL-18 and/or IL-18-induced IFN-y bioactivity. Important examples are Crohn's disease and rheumatoid arthritis. In CD therapeutic use of IL-18BPa may therefore restore a hypothetically disturbed IL-18/IL-18BP balance. Concerning RA, IL-18BPa expression might contribute to protective functions of IFN-y, observed in different murine models for arthritis and in rheumatoid arthritis patients. Moreover, IL-18BPa might inhibit IL-18-mediated induction of subsequent cardinal inflammatory cytokines responsible for the pathogenesis of these diseases. Indeed, the pharmaceutical industry successfully used IL-18BP as therapeutic agent in a murine model of RA and in phase I clinical trials. On the contrary, in the context of carcinogenesis IFN-y- mediated IL-18BPa expression might be disadvantageous. By counterregulating the IL-18 arm of immune defenses against tumors, IL-18BP may have the potential to promote carcinogenesis. Our hypothesis is underlined by the observation that sodium butyrate, known to be protective in colon cancer, inhibited IFN-y-induced IL-18BPa expression. In parallel, IL-18-induced IFN-y is also responsible for iNOS induction. iNOS-derived NO provides a second possible way for inhibition of IFN-y-dependent and -independent tumor suppressive effects of IL-18. Finally, IFN-y-induced IL-18BPa expression was confirmed on the promoter level. This induction on the promoter level was associated with STAT-1 binding to the GAS element proximal to the start of transcription. It is tempting to speculate that blockage of the cytokine cascade upstream of IL-1 and TNF- a on the level of IL-18 may be of therapeutic benefit. Our data reflect the relationship between inflammation and cancer, in that inflammatory cells and cytokines found in tumors are likely to contribute to tumor growth, progression, and immunosuppression than they are to mount an effective host antitumour response.
AML1/ETO liegt bei 12% aller Patienten mit einer AML vor. Bei der Translokation t(8;21) kommt es zur Fusion der DNA-Bindungsdomäne des Transkriptionsfaktors AML1 mit dem starken transkriptionellen Repressor ETO. Über den ETO-Anteil wird einen aktiver Korepressorkomplex rekrutiert, der zur transkriptionellen Repression AML1 relevanter Zielgene führt. Die dysregulierte Genexpression führt in AML1/ETO-transformierten Zellen möglicherweise zusätzlich zur Aktivierung anderer Signaltransduktionswege. Untersuchungen in der hämatopoetischen Zellinie TF-1 hatten diesbezüglich gezeigt, daß die Expression von AML1/ETO zu einer verlängerten STAT5-Aktivität führte. Durch ein synthetisches Phosphopeptid konnte die Proliferation AML1/ETO-transformierter Zellen, nicht aber normaler CD34+-Zellen gehemmt werden. Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurde PLCgamma als ein Zielmolekül des Phosphopeptids identifiziert. Weiterführende Untersuchungen hatten gezeigt, daß PLCgamma nicht zur Transformation AML1/ETOexprimierender Zellen beiträgt. Die Synthese des Phosphopeptids bereitete aufgrund der Phosphorylierung Schwierigkeiten, so daß die Untersuchungen dadurch eingeschränkt waren. Ziel war es dennoch, Peptide identifizieren zu können, die in der Lage sind die transformierenden Eigenschaften in AML1/ETO-exprimierenden Zellen spezifisch zu blockieren. Hierfür wurden zwei Selektionssysteme in einer humanen Zellinie aufgebaut, die es ermöglichen sollen ETO-inhibierende Peptide aus einer Peptid-Bibliothek identifizieren zu können. Das erste Selektionssystem basierte auf der Produktion viraler Partikel, die von einer Gal4-ETO-regulierten VSV-G-Expression abhängig ist. Unter anderem bestätigte die Kompetition von Gal4-ETO durch die Koexpression der Gal4-DNA-bindenden- Domäne, daß die drastisch verminderte Virusproduktion allein auf eine ETO-vermittelte transkriptionelle Repression des VSV-G-Hüllproteins zurückzuführen war. Für die Durchmusterung einer Peptid-Bibliothek war der Hintergrund an viralen Partikeln (1.5x10 hoch 4 TU/ml), die trotz der Gal4-ETO-Expression produziert wurden, allerdings zu hoch. Im Gegensatz dazu verfügt das zweite Selektionssystem über ein tkneo- Reporterkonstrukt, dessen Expression ebenfalls durch Gal4-ETO reguliert wird. Es wurden zwei Zellklone etabliert (#61, #157), bei welchen die ETO-vermittelte Repression des tkneo-Fusionsproteins durch Butyrat und durch die Koexpression der Gal4-DNA-bindenden- Domäne spezifisch aufgehoben werden konnte. Neben dem gewünschten Wachstumverhalten der Klone unter den verschiedenen Selektionsbedingungen (ETO "on": G418-sensitiv; GCV-resistent; ETO "off": G418-resistent; GCV-sensitiv) wurde die stabile Integration des tkneo-Reporterkonstrukts und des Gal4-ETO-Plasmids in einer semiquantitaiven PCR nachgewiesen. Es wurde zum ersten Mal ein Selektionssystem etabliert, welches den Mechanismus der AML1/ETO-vermittelten Repression eines Gens genau wider spiegelt und die Selektion ETO-inhibierender Peptide aus einer Peptid- Bibliothek unter physiologischen Bedingungen ermöglicht.
Der Elektronentransfer von NADH zu Sauerstoff ist ein essentieller Bestandteil im Energiehaushalt der Zelle und wird durch transmembrane Enzymkomplexe vermittelt. Hohe Geschwindigkeit und Spezifität dieser Reaktionen sind dabei von großer Bedeutung. In der Atmungskette von Paracoccus denitrificans und Thermus thermophilus wird Sauerstoff durch Cytochrom c Oxidasen umgesetzt. Beide Enzymkomplexe erhalten die für diese Reaktion notwendigen Elektronen von einem Cytochrom c552 in einer sehr schnellen bimolekularen Reaktion bei hoher Selektivität für das Partnerprotein. Hauptziel dieser Arbeit war es, lösliche Module der elektronenakzeptierenden CuA-Domäne der Cytochrom c Oxidasen zu generieren, das Kupferzentrum zu rekonstituieren und die Proteine für Wechselwirkungsstudien mit den Cytochrom c-Partnern zugänglich zu machen. Die Charakterisierung der Elektronentransferreaktionen erfolgte durch stopped-flow Spektroskopie und ermöglichte die Bestimmung der bimolekularen Reaktionsgeschwindigkeitskonstanten unter verschiedenen Ionenstärkebedingungen. Ein Vergleich zwischen dem mesophilen Reaktionspaar aus P. denitrificans mit dem thermophilen aus T. thermophilus zeigte die unterschiedlichen Interaktionsmechanismen auf. Während die Reaktion in T. thermophilus weitgehend auf Ladungsinteraktionen verzichtet, wurde für die Reaktanden aus P. denitrificans eine Beteiligung von 2 - 3 Ladungen mit entgegengesetztem Vorzeichen auf jedem Protein festgestellt. Die Interaktionen wurden weiterhin durch chemical-shift-perturbation Experimente mittels NMR-Spektroskopie charakterisiert. Durch Isotopenanreicherung des Cytochroms c552 aus P. denitrificans konnten für dieses Protein Aminosäurereste identifiziert werden, die an einer direkten Bindung mit dem CuA-Partnerprotein beteiligt sind. In einem ähnlichen Ansatz wurde auch die Interaktionsfläche der löslichen CuA-Domäne aus T. thermophilus charakterisiert. Für das Cytochrom c552 aus P. denitrificans konnte gezeigt werden, daß bei direkten Kontakten zwischen den Proteinen fast keine Ladungen beteiligt sind und primär ungeladene Reste die Wechselwirkung dominieren. Ein ähnliches Bild wurde auch für die Interaktion der löslichen CuA-Domäne aus T. thermophilus mit ihrem Substrat ermittelt. Für die lösliche CuA-Domäne aus P. denitrificans konnte aufgrund der geringen Stabilität keine Zuordnung durchgeführt werden, so daß eine Charakterisierung der Interaktionsfläche nicht möglich war. Weiterhin wurde ein für T. thermophilus bisher nicht beschriebener Komplex III aufgrund von Sequenzdaten identifiziert. Eine lösliche Domäne des membranständigen Cytochrom c1 wurde in E. coIi heterolog exprimiert, aufgereinigt und charakterisiert. Die Elektronentransferkinetiken zum Cytochrom c552 wurden durch stopped-flow Spektroskopie aufgenommen, und das Cytochrom c1 wurde als effizienter Elektronendonor für das Protein identifiziert. Für spätere Mutageneseansätze wurde ein Plasmid-basiertes Expressionssystem für das extrem thermophile Eubakterium T. thermophilus etabliert, um Schwierigkeiten, die bei der Expression von Cofaktor-tragenden Membranproteinen auftreten können, zu umgehen. Durch Expression eines löslichen c-Typ Cytochroms und der ba3-Cytochrom c Oxidase in T. thermophilus konnte gezeigt werden, daß dieses homologe Expressionssystem funktional ist und damit rekombinante Proteine exprimiert werden können. Durch die Konstruktion von Histidin-Tags konnte die Aufreinigung der Proteine erleichtert werden und eine notwendige Abgrenzung von chromosomal kodierten Wildtyp-Formen erfolgen.
Der bc1-Komplex ist eine Komponente der Atmungskette und damit essentiell für den Energiestoffwechsel vieler Organismen, die zum aeroben Wachstum befähigt sind. Im Vergleich zu mitochondrialen bc1-Komplexen, die bis zu elf unterschiedliche Untereinheiten besitzen, ist das Enzym aus Paracoccus denitrificans mit nur drei Untereinheiten einfach aufgebaut. Vergleicht man die Sequenz des P. denitrificans Cytochrom c1 Genproduktes mit denen anderer prokaryotischer und mitochondrialer Cytochrom c1 Untereinheiten, so fällt auf, dass dieses prokaryotische Protein eine für Paracoccus charakteristische zusätzliche N-terminale Domäne von ca. 150 Aminosäuren trägt, die zudem eine sehr auffällige Zusammensetzung besitzt (40% saure Reste, 40% Alanine, keine einzige positiv geladene Aminosäure). Diese saure Domäne wird in anderen Organismen durch zusätzliche Untereinheiten innerhalb des bc1-Komplexes dargestellt, die in direkter Assoziation mit dem Cytochrom c1 vorliegen. Bis dato konnte für Paracoccus jedoch noch kein eindeutiger Beweis für eine Beteiligung dieser sauren Domäne an der Wechselwirkung zwischen bc1 und den Substraten des Komplexes geführt werden. Ziel dieser Arbeit war es zunächst, zwei lösliche Fragmente des Cytochrom c1 aus P. denitrificans zu konstruieren und in E. coli heterolog zu exprimieren. Durch zielgerichtete Mutagenese am Cytochrom c1 und anschließende kinetische Charakterisierung der Produkte sollte die funktionelle Bedeutung einzelner Aminosäurereste dargestellt werden. Es ist im Rahmen dieser Arbeit gelungen, zwei lösliche Fragmente des Cytochrom c1 aus P. denitrificans zu exprimieren. Für das saure Fragment (SF) wurde lediglich der Membrananker deletiert, während das Kernfragment (KF) durch die zusätzliche Deletion der sauren Domäne als eine Art minimalisiertes Cytochrom c1 anzusehen ist. Beide Fragmente konnten nach erfolgreicher Aufreinigung durch pre-steady-state-Kinetiken in ihrer Wechselwirkung mit dem homologen Reaktionspartner Cytochrom c552 sowie mit drei weiteren c-Typ Cytochromen funktionell charakterisiert werden. Des weiteren wurden zahlreiche Mutanten von KF hergestellt und ebenfalls hinsichtlich ihrer Wechselwirkung mit Cytochrom c552 getestet. Die Untersuchungen zur Ionenstärkeabhängigkeit des Cytochrom c1 zeigten, dass das saure Fragment unter den gewählten Versuchsbedingungen im Vergleich zu KF keine erhöhte Spezifität gegenüber Cytochrom c552 besitzt. Es konnte jedoch eindeutig gezeigt werden, dass die Interaktion der beiden untersuchten Elektronentransportpartner von der Wechselwirkung geladener Aminosäureseitenketten auf beiden Proteinen abhängt und somit elektrostatischer Natur ist. Dieser Sachverhalt wird zusätzlich durch die Ergebnisse bestätigt, die mit der Negativkontrolle (Cytochrom c551 aus Ps. aeruginosa) erzielt wurden. Dieses negativ geladene Protein zeigte nur eine schwach affine Wechselwirkung mit dem ebenfalls stark negativ geladenen Cytochrom c1 aus P. denitrificans. Zusätzliche kinetische Untersuchungen mit weiteren Cytochromen im Bereich mittlerer Ionenstärke zeigten, dass die beiden löslichen Fragmente SF und KF keine erhöhte Spezifität gegenüber homologen Elektronenakzeptoren (Cyt c552 und Cyt c550 aus P. denitrificans) im Vergleich zu dem nicht-homologen Reaktionspartner (Pferdeherz Cyt c) besitzen. Bei diesen drei Cytochromen handelt es sich um Proteine, die eine basische Interaktionsfläche aufweisen. In Hinblick auf die Ergebnisse zur Wechselwirkung von KF und SF mit dem löslichen Cytochrom c551 aus Ps. aeruginosa wird jedoch deutlich, dass die Spezifität des Cytochrom c1 gegenüber möglicher Substrate alleinig durch das Kriterium des Oberflächenpotentials bedingt ist. Keine der eingeführten Punktmutationen führte zu einem vollständigen Aktivitätsverlust des Proteins. Vielmehr zeigten die meisten Mutanten eine im Vergleich zum Wildtyp leicht herabgesetzte Geschwindigkeitskonstante der Elektronentransport-Reaktion. Der deutlichste Effekt wurde für die Mutanten E243K (36 % der WT-Aktivität) und E243Q (78 % der WT-Aktivität) bestimmt. Dieser Rest ist am oberen, dem Periplasma zugewandten Rand der Hämspalte positioniert, wodurch eine direkte Interaktion mit dem Cytochrom c552 während der Elektronentransport-Reaktion sehr gut möglich ist. Die im Rahmen dieser Arbeit bestimmten Geschwindigkeitskonstanten der Reaktion zwischen Cytochrom c1 und Cytochrom c552 lassen eindeutig auf einen diffusionskontrollierten Prozess schließen. Ein solches Verhalten schließt eine spezifische Oberflächen-Wechselwirkung der beiden Proteine nicht aus Die Ergebnisse der Mutagenesestudie verdeutlichen jedoch, dass die Substratspezifität nicht primär durch definierte gegensätzliche Ladungspaare auf der Oberfläche von Cytochrom c1 und Cytochrom c552 definiert wird.
Sequenz-spezifische DNA-Rekombination (SSR) bewirkende Systeme aus niederen Organismen, wie z.B. das Cre/loxP-System aus dem P1-Phagen oder das Flp/FRT-System aus Hefe, sind in den letzten Jahren als wichtige und weitverbreitete Werkzeuge zur Modifikation des Säugergenoms etabliert worden. Dies hängt unter anderem mit der Vielfalt an Reaktionen zusammen, welche diese Systeme in der Lage sind durchzuführen. Dazu zählen Exzisions/Deletions-, Integrations-, Inversions- und Translokationsreaktionen. Die hier vorgestellte Arbeit fokussiert auf die Integrationsreaktion, welche aus thermodynamischen Gründen bisher keine breite Anwendung finden konnte, und ihren Einsatz bei der Etablierung allelischer Serien in embryonalen Stammzellen (ES Zellen) oder frühen Embryonen der Maus. Eine solche Methodik wäre ideal für Fragestellungen zu Funktionen von Genen in vivo (Functional Genomics) geeignet. Zur Anwendung kam ein als „Rekombinase vermittelter Kassettenaustausch“ (recombinase-mediated cassette exchange, RMCE) bezeichnetes Verfahren. RMCE ist ein Zwei-Schritt-Verfahren: Zuerst wird der interessierende Genort durch homologe Rekombination derart verändert, daß 5’ und 3’ des Genlocus SSR-Erkennungsstellen eingeführt werden. Durch das Einbringen eines die gleichen Erkennungsstellen tragenden Austauschplasmides und die Bereitstellung der entsprechenden Rekombinase kann die im Genom residierende gegen die eingebrachte Kassette (von Erkennungsstellen flankiertes DNA-Segment) ausgetauscht werden. In dieser Arbeit werden zwei verschiedene Ansätze für RMCE vorgestellt: Der erste Ansatz basiert auf der Verwendung heterospezifischer lox-Sequenzen, welche sich in einer Base unterscheiden (lox511/loxP). Diese Mutation sollte eine effektive Integration durch Verhinderung der Exzision gewährleisten. Es konnte hier gezeigt werden, daß RMCE unter Verwendung einer solchen Methodologie in ES Zellen und frühen Mausembryonen effizient möglich ist, daß das Produkt der Integration jedoch instabil ist und nachfolgender Exzision unterliegt. Diese Deletionsreaktionen sind durch promiskuitive Rekombination der verwendeten lox511 und loxP bedingt. Aus diesen Erkenntnissen wurde ein zweiter Ansatz entwickelt, welcher auf dem simultanen Einsatz des Cre/lox- und des Flp/FRT-Systems basiert. Diese Methodik umgeht die Nachteile promiskuitiver Erkennungssequenzen und ihre Anwendbarkeit, Funktionsfähigkeit und Effizienz in ES Zellen konnten demonstriert werden. Ein solches Verfahren, welches sowohl in Zellkultur als auch in frühen Mausembryonen zum Einsatz kommen könnte, bietet insbesondere im Hinblick auf zukünftige Bedürfnisse in der Functional Genomics viele Optionen.
Der T-Zell-Wachstumsfaktor Interleukin-2 (IL-2) wird von Antigen-stimulierten T-Zellen sezerniert und spielt eine wichtige Rolle bei der zellulären Immunantwort. Dabei tragen in aktivierten T-Zellen die MAPK-Signalwege, der Calcineurin/NF-AT-Signalweg und der NF-KB-Signalweg kooperativ zur IL-2-lnduktion bei. In den letzten Jahren wurden mehrere Hinweise gefunden, dass IL-2 möglicherweise bei der HIV- und SIV-Pathogenese eine Rolle spielt. Zwei Publikationen konnten bereits eine verstärkte IL-2-Sekretion HIV-1-infizierter T-Zellen nachweisen, die molekularen Mechanismen dieser IL-2-Induktion sind bisher allerdings kaum untersucht. In der vorliegenden Arbeit konnte gezeigt werden, dass das apathogene simiane Immundefizienzvirus der Afrikanischen Grünen Meerkatze (SIVagm3) in suboptimal stimulierten PBMC ebenfalls die Interleukin-2-Sekretion verstärken kann. In der humanen T-Zelllinie A3.01 wurde nach Transfektion des Volllängenplasmids des SIVagm3 eine bis zu 38-fach verstärkte transkriptionelle Aktivierung des IL-2-Promotors beobachtet. Die Untersuchung der beteiligten Signalwege zeigte, dass die MAP-Kinasen ERK, JNK/SAPK und p38 für die IL-2-Induktion durch SIVagm3 notwendig sind, während die Inhibition der Calcineurin-Aktivität durch das Immunsuppressivum Cyclosporin A keinen Einfluss hatte. In Übereinstimmung mit diesem Ergebnis zeigte die Analyse der Transkriptionsfaktorbindungsstellen des IL-2-Promotors keine Aktivierung der NF-AT-kontrollierten Genexpression durch SIVagm3, womit zum ersten Mal ein Calcineurin/NF-AT-unabhängiger Weg der IL-2-Induktion beschrieben wurde. Dagegen erhöhte SIVagm3 die transkriptionelle Aktivität des NF-KB-responsiven Elements und die Aktivität des CD28/AP-1-responsiven Elements, die auch bei der klassischen T-Zellaktivierung eine Rolle spielen. Eine Aktivierung der CD28/AP-1-kontrollierten Genexpression konnte auch durch Expression des viralen Transaktivator-Proteins Tat induziert werden, das in stimulierten Zellen in der Lage war, die IL-2-Expression zu verstärken. Die Beschränkung dieser Tat-Funktion auf stimulierte Zellen konnte aber nicht auf eine Phosphorylierung von SIVagm3-Tat durch die MAP-Kinasen ERK, JNK/SAPK oder p38 zurückgeführt werden. Weitere Analysen zeigten dagegen, dass SIVagm3-Tat durch die Cyclin-abhängige Proteinkinase 9 (CDK9) phosphoryliert wird, die mit Tat koimmunpräzipitiert. Darüberhinaus konnte eine weitere nicht-identifizierte Tat-assoziierte Kinase nachgewiesen werden, die SIVagm3-Tat ebenfalls phosphorylieren kann. Aktuelle Publikationen zeigen, dass das lentivirale Vif-Protein die Degradation von Apobec3G im Proteasom induziert, da dieser zelluläre Faktor die Infektiosität der entstehenden Viruspartikel stark reduziert. Die antivirale Funktion von Apobec3G, die in der Deaminierung der Minusstrang-DNA während der reversen Transkription besteht, ist bereits weitgehend aufgeklärt, aber über die Regulation von Apobec3G ist noch wenig bekannt. In dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass die Aktivierung der mitogenen Raf/MEK/ERK-Signalkaskade durch den Phorbolester TPA zu einer verstärkten Apobec3G-Expression führt. Dieser Effekt konnte durch den Proteinkinase C (PKC)-Inhibitor Staurosporin und den MEK-Inhibitor U0126 inhibiert werden, wodurch gezeigt wurde, dass die Aktivität der MAP-Kinase ERK für die Verstärkung der Apobec3G-Expression notwendig ist. Eine Phosphorylierung von Apobec3G durch ERK wurde im Kinase-Assay jedoch nicht beobachtet. Dagegen konnte durch radioaktive in-vivo-Markierung nachgewiesen werden, dass es sich bei Apobec3G nicht um ein Phosphoprotein handelt. Neben den Untersuchungen zur Regulation von Apobec3G, konnten neue Erkenntnisse zu den Apobec3G/Vif-Interaktionen gewonnen werden. Durch Koimmunpräzipitationsstudien wurde die physikalische Interaktion von Vif und Apobec3G nachgewiesen. Zudem konnte gezeigt werden, dass in Gegenwart von Vif der Einbau von Apobec3G in die Viruspartikel gehemmt wird. Damit wurden erste Hinweise gefunden, dass Vif neben der Induktion des proteolytischen Abbaus von Apobec3G weitere Strategien anwendet, um die Inkorporation des antiviralen Faktors zu verhindern.
Für bestimmte Gentherapiestrategien bieten sich retrovirale Vektoren auf Grund der stabilen Integration der von ihnen übertragenen genetische Information an. Mit bisher vorhandenen retro- und lentiviralen Vektorsystemen kann jedoch kein effizienter Gentransfer in ruhende primäre Zellen wie unstimulierte PBMC oder undifferenzierte Monozyten erreicht werden. Ziel dieser Arbeit war es daher, retrovirale Vektorsysteme zu etablieren, die naive primäre Zellen effizient transduzieren können. Zunächst wurden HIV-1-Vektoren mit den Hüllproteinen (Env) des amphotropen MLV, des MLV-Klons 10A1, des felinen endogenen Retrovirus RD114 und des VSV sowie einem modifizierten GaLV-Env pseudotypisiert, um ihre Eignung für die Transduktion von primären T-Lymphozyten zu untersuchen. Mit diesen Vektoren konnten primäre stimulierte humane T-Lymphozyten mit ähnlichen Transduktionsraten von ca. 20% transduziert werden. Im Gegensatz dazu wurden mit MLV-Vektoren, die mit den gleichen Hüllproteinen pseudotypisiert waren, bei gleichem Transduktionsprotokoll untereinander deutlich unterschiedliche Transduktionsraten zwischen 1 - 45% erreicht. Dieser unerwartete Unterschied ist möglicherweise auf eine längere, dabei untereinander ähnliche Halbwertszeit der HIV- 1-abgeleiteten Vektoren zurückzuführen. Unstimulierte PBMC konnten allerdings unabhängig vom verwendeten Hüllprotein weder von den MLV- noch von den HIV-1-abgeleiteten Vektoren transduziert werden. Demgegenüber hatte sich in meiner vorangegangenen Diplomarbeit die Transduzierbarkeit ruhender humaner Zellen durch Vektoren angedeutet, die von dem akut pathogenen simianen Immundefizienzvirus SIVsmmPBj1.9 abgeleitet waren. In der hier vorgestellten Arbeit zeigten die PBj-Vektoren, die nur im env-Gen eine Deletion aufwiesen, dass sie auch in der G0-Phase des Zellzyklus arretierte GHOST-Indikatorzellen oder diploide Fibroblasten effizient und unabhängig von dem zur Pseudotypisierung verwendeten Hüllprotein transduzieren können. Die korrespondierenden HIV-1-Vektoren waren dazu nicht in der Lage. Auch PBj- und HIV-1-Vektoren, die egfp als Markergen transferieren, zeigten das gleiche Transduktionsverhalten. Die egfp-transferierenden SIVsmmPBj-Vektoren konnten schließlich im Unterschied zu den entsprechenden HIV-1-Vektoren auch frisch isolierte primäre humane Monozyten sehr effizient transduzieren. Mit Nef-deletierten Mutanten wurde schließlich gezeigt, dass die beschriebenen Fähigkeiten PBj-abgeleiteter Vektoren nicht vom viralen Nef-Protein abhängen, obwohl dieses regulatorische Gen die pathogenen Eigenschaften und die Replikationsfähigkeit von SIVsmmPBj-Viren bestimmt. Für alle mit SIVsmmPBj-abgeleiteten Vektoren transduzierten Zellen konnte in der vorliegenden Arbeit ferner die chromosomale Integration des Transfervektors gezeigt werden. Schließlich gelang die Konstruktion eines ersten 3-Plasmid-Vektorsystems, mit dem transduktionsfähige Vektorpartikel generiert werden können. Mit SIVsmmPBj-abgeleiteten Vektoren steht somit ein neues retrovirales Vektorsystem zur Verfügung, mit dem auch ruhende primäre Zellen stabil genetisch modifiziert werden können. Durch die Erschließung dieser wichtigen Zielzellen werden die Perspektiven einer dauerhaften Gentherapie in vitro und in vivo beträchtlich erweitert.
Das humane Zytomegalievirus (HCMV) gehört zur Familie der beta-Herpesviridae. Bis zu 80% menschlichen Bevölkerung sind weltweit mit dem Virus infiziert. Nach einer meist asymptotischen Erstinfektion persistiert HCMV lebenslang in seinem Wirtsorganismus. Im Laufe der Evolution wurden von einigen Herpesviren verschiedene Strategien entwickelt, um der Antigenprozessierung und damit der zellulären Immunantwort zu entgehen. Das HCMV-Protein US6 blockiert die Antigenpräsentation via MHC I. US6 ist ein ER-ständiges Typ I Transmembranglykoprotein bestehend aus einer Signalsequenz, einer ER-luminalen Domäne, einer Transmembranhelix und einem kurzen zytoplasmatischen C-Terminus. US6 inhibiert den TAP-abhängigen Peptidtransport aus dem Zytoplasma in das ER-Lumen. Im Rahmen dieser Arbeit wurde die ER-luminale Domäne von US6 bestehend aus der Primärsequenz 20-146 heterolog in E. coli exprimiert und aus inclusion bodies rückgefaltet. Das rückgefaltete Protein erwies sich als Monomer (15,6 kDa). Die in der ER-luminalen Domäne befindlichen acht Cysteine bilden ein intramolekulares Netzwerk aus vier Disulfidbrücken. Zur Aufklärung des molekularen Inhibitionsmechanismus von US6(20-146) wurden verschiedene in vitro TAP-Funktions-Assays angewendet. Die Bindung von US6 an die ER-luminalen Bereiche von TAP blockiert die ATP-Bindung in den zytoplasmatischen NBD des Transporters. Die Peptid- und ADP-Bindung von TAP ist nicht beeinflusst, durch die Inhibition der ATP-Bindung wird jedoch die Peptid-induzierte ATP-Hydrolyse unterbunden. Für die Inhibitionsreaktion konnte ein halbmaximaler Inhibitionskoeffizient (IC50) von 1 µM ermittelt werden. Für die inhibitorische Aktivität von US6 sind die C-terminalen Aminosäuren 126-139 der ER-luminalen Domäne von US6 verantwortlich. Die innerhalb dieser Region befindlichen Aminosäuren Cys127, Cys129, D130, W134 und R138 wurden gegen Serin bzw. Alanin ersetzt. Dies hatte keine Auswirkung auf die Aktivität von US6(20-146). Auch ist der N-Terminus von US6 nicht essentiell für die Aktivität.
Nitric oxide (NO) represents a short-lived mediator that pivotally drives keratinocyte movements during cutaneous wound healing. In this study, we have identified p68 DEAD box RNA helicase (p68) from a NO-induced differential keratinocyte cDNA library. Subsequently, we have analyzed regulation of p68 by wound-associated mediators in the human keratinocyte cell line HaCaT. NO, serum, growth factors and pro-inflammatory cytokines were potent inducers of p68 expression in the cells. p68 was constitutively expressed in murine skin, but rapidly down-regulated upon injury. The down-regulation appeared to be transient, as p68 protein expression increased again after the inflammatory phase of repair. However, p68 protein expression did not completely disappear during wound inflammation, as immunohistochemistry and cell fractiona tion analysis revealed a restricted localization of p68 in keratinocyte nuclei of the developing epithelium. In line, cultured human (HaCaT) and murine (PAM 212) keratinocyte cell lines showed a nuclear localization of the helicase. Moreover, confocal microscopy revealed a strong localization of p68 protein within the nucleoli of the keratinocytes. Functional analyses demonstrated that p68 strongly participates in keratinocyte proliferation and gene expression. Keratinocytes that constitutively overexpressed p68 protein were characterized by a marked increase in serum-induced proliferation and vascular endothelial growth factor (VEGF) expression, whereas down-regulation of endogenous p68 using small interfering RNA (siRNA) markedly attenuated serum-induced proliferation and VEGF expression. Altogether, our results suggest a tightly controlled expression and nucleolar localization of p68 in keratinocytes in vitro and during skin repair in vivo that functionally contributes to keratinocyte proliferation and gene expression.
Isolierung und Charakterisierung der Atmungsketten-Superkomplexe aus Paracoccus denitrificans
(2004)
Isolierung von Atmungsketten-Superkomplexen aus Paracoccus denitrificans: Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurde ein Reinigungsprotokoll zur Präparation der Atmungskettenkomplexe I, III und IV des Gram-negativen, fakultativ anaeroben Bodenbakteriums Paracoccus denitrificans in Form eines NADH Oxidase Komplexes erstellt. Bisher konnten stabile Superkomplexe bakterielle Atmungskettenkomplexe nur in Gestalt einer Chinol Oxidase, bestehend aus den Komplexen III (Ubichinol:Cytochrom c Oxidoreduktase) und IV (Cytochrom c Oxidase), isoliert werden (Berry, et al., 1985). Jedoch enthielten diese Assemblierungen keinen Komplex I (NADH: Ubichinon Oxidoreduktase). Dies ist die erste chromatographische Isolierung eines kompletten "Respirasoms" aus Paracoccus denitrificans. Unter der Verwendung des milden Detergenz Digitonin zur Solubilisierung von Paracoccus denitrificans Membranen gefolgt von zwei chromatographischen Reinigungsschritten, der Hydroxylapatit-Chromatographie und der Gelfiltration, konnte eine NADH Oxidase, bestehend aus den Komplexen I, III und IV in einer 1:4:4 Stöchiometrie isoliert werden. Neben der Isolierung der NADH Oxidase konnten weitere kleine Superkomplexe identifiziert werden, die aus vier Komplex III und vier Komplex IV (III4IV4) sowie vier Komplex III und zwei Komplex IV (III4IV2) assoziiert waren. Charakterisierung der Superkomplexe aus Paracoccus denitrificans: Die isolierten Atmungskettenkomplexe wurden zur Charakterisierung bezüglich ihrer Funktion, enzymatischen Aktivität, Stöchiometrie und Untereinheiten-Zusammensetzung aus Paracoccus denitrificans Wildtyp-Membranen analysiert. Proben aller Präparationsstufen wurden parallel zur BN-Gelelektrophorese und für enzymatische Einzel- und kombinierte Aktivitäten der Komplexe I-IV eingesetzt. Mittels BN-Gelelektrophorese konnten die apparenten Massen der Komplexe bestimmt werden. Im folgenden denaturierenden SDS-Gel wurde die Untereinheiten-Zusammensetzung der Superkomplexe durch Immunodetektion mit Antikörpern gegen die Komplexe I, III, IV und Cytochrom c552 analysiert. Abschließend konnte nach der Gelfiltration festgestellt werden, das Komplex II eindeutig nicht Teil des Superkomplexes (I1III4IV4) war. Die Stöchiometrie des Superkomplexes a wurde mit Hilfe der fluorimetrischen Bestimmung von FMN (Flavin) als Marker für Komplex I und mittels Pyridin Hämochromogen Spektren für Häm a, b und c bestimmt. Da Komplex III physiologisch als Dimer vorliegt (Mayer et al. 2002), müsste die Stöchiometrie der funktionellen Einheit des Superkomplex a folgendermaßen lauten: I1 (III2)2 IV4. In diesem Fall diente der Vergleich der Wechselzahl einzelner Präparationsstufen als Maß der Verunreinigung der ergab, dass Fremdkomplexe mit Flavin und Cytochrom b im Ausgangsmaterial der Präparation vorhanden waren. Nur die Wechselzahl des Komplexes IV blieb während der Präparation konstant. Um den Gehalt an Komplex I und die Qualität der Präparation abzuschätzen, wurde das Verhältnis der HAR zu dNADH:DBQ Oxidoreduktase Aktivität in Membranen und isoliertem Superkomplex a bestimmt. Es war während der Präparation konstant. Die Bestimmung des Phospholipidgehalts aus isoliertem Superkomplex a im Vergleich zu P. denitrificans Membranen ergab eine Abnahme von 980 ± 80 nmol PL / mg Protein in Membranen auf 290 ± 10 nmol / mg Protein in isoliertem Superkomplex a, wohingegen der Ubichinongehalt von 2,7 ± 0,3 nmol / mg auf 6,7 ± 0,8 nmol / mg in isolierter Oxidase anstieg. Katalytische Aktivitäten von P. denitrificans Membranen des Parentalstamms und verschiedener Mutantenstämme zeigten, dass die Inaktivierung des Gens für fest gebundenes Cytochrom c552 die Bildung eines Superkomplexes nicht verhindern konnte, was ein Hinweis dafür ist, dass dieses Elektronen Carrier Protein nicht essentiell für die strukturelle Verbindung zwischen den Komplexen III und KIV ist. Komplex I Aktivität wurde ebenfalls in Membranen von Mutanten-Stämmen, denen Komplex III oder Komplex IV fehlte, gefunden. Jedoch enthielten diese Stämme keinen assemblierten Komplex I, sondern nur dissoziierte Untereinheiten des Komplexes. Trotz der Verwendung der selben Protokolle für die elektrophoretische Trennung und chromatographische Isolierung wie für Superkomplexe aus dem Wildtyp-Stamm, führte die Isolierung aus Mutantenstämmen, denen Komplex III oder IV fehlte, zum vollständigen Verlust der NADH:DBQ Oxidoreduktaseaktivität. Dies weist darauf hin, dass Paracoccus denitrificans Komplex I durch die Assemblierung in Form eines NADH Oxidase Superkomplex stabilisiert wird. Zusätzlich zum Substrat Channeling scheint die strukturelle Stabilisierung von Membran Protein Komplexen die Hauptaufgabe von respiratorischen Superkomplexen zu sein.
The cytochrome bc1 complex or ubiquinol:cytochrome c oxidoreductase (QCR) catalyses electron transfer from ubiquinol to cytochrome c in respiration and photosynthesis coupled to a vectorial proton transport across the membrane, in which the enzyme resides. In both bacteria and eukaryotic organisms, QCR participates in supramolecular assembly of membrane proteins that comprise the respiratory or photosynthetic chain. In the present work, proton transfer pathways, substrate binding and the supramolecular assembly of the respiratory chain in yeast were probed by structure-based site-directed mutagenesis and characterization of the variants. Both active sites centre P, the place of quinol oxidation, and centre N, where quinone reduction takes place, lack direct access to the bulk solvent necessary for proton release and uptake. Based on the X-ray structure, proton transfer pathways were postulated. Analysis at centre P showed, that E272 and Y132 of cytochrome b are important for QCR catalysis as indicated by increased superoxide production and lowered Cyc1p reductase activity in these variants. Pre-steady state heme reduction kinetics in combination with stigmatellin resistance indicated that charge and length of the side chain at position 272 are crucial for efficient docking of the ISP to form the enzyme substrate complex and for electron bifurcation at centre P. Variants of Y312 and F129, both residues of cytochrome b, showed an increased Km indicating participation of these residues in coordination of ubiquinol or the possible intermediate semiquinone anion radical. F129 proved to be crucial for a functional Q-cycle as indicated by respiratory negative growth phenotype and a lowered H+/e- stoichiometry of F129 variants. At centre N, the postulated CL/K and E/R proton transfer pathways are located at opposite sites of the bound ubiquinone. Variants in the surface residues R218 (cytochrome b) and E52 (Qcr7) of the E/R pathway and E82 (Qcr7) of the CL/K pathway showed instability upon purification indicating an important role of these residues for QCR integrity. The slowed down centre N reduction kinetics in H85 (CL/K), R218 and N208 (both E/R) variant was attributed to a destabilised semiquinone anion consistent with the observed decreased sensitivity towards the site-specific inhibitor antimycin and an increased Km. Variants of residues of both pathway, E82Q and R218M, exhibited a decreased H+/e- stoichiometry indicating a crucial role of both residue for maintaining a working Q-cycle and supporting the proposed protonation of the substrate via the Cl/K and the E/R pathway. Long-range interaction between centre N and centre P were observed by altered reduction kinetics of the high potential chain and increased superoxide production in the centre N variants. The role of the cation-pi-interaction between F230 of Cyt1p and R19 of cytochrome c in binding of the redox carrier to QCR was analysed. In F230L hydrophobic interaction were partially lost as was deduced from the ionic strength dependence of Cyc1p reductase activity and Cycp1 binding, as detected by ionic strength sensitive Kd and Km for Cyc1p. The decreased enzymatic rate of F230W could be explained by a disturbed binding of Cyc1p to the variant enzyme. F230 may influence the heme mid point potential and thereby the electron transfer rate to Cyc1p. Reduction of Cobp via both centre P and centre N was disturbed suggesting an interaction between high and low potential chain. Supramolecular association between QCR and cytochrome c oxidase (COX) in yeast mitochondria was probed by affinity chromatography of a his-tagged QCR in the presence of the mild detergent digitonin. In comparison to purification with laurylmaltoside, the presence of both QCR and COX subunits was detected in the elution fractions by SDS-PAGE, Cyc1p reductase and TMPD oxidase activity assays and immunoblot analysis. The CL-dependent formation of the supercomplex between QCR and COX was analysed by replacement variants in the CL-binding site of QCR in CL containing and CL free environment. With an increasing number of replacements of the three lysines the CL-binding pocket supercomplex formation was not abolished, when CL is present as shown by BN-PAGE analysis. This was supported by the synergetic decrease in enzyme activity for both enzymes upon increased number of replacements. In the CL-free environment, no supracomplex formation was observed for a wildtype CL binding site. By replacements of two lysines in the CL-binding pocket, supercomplex formation could be recovered as revealed by BN-PAGE. This indicates, that CL may serve as a charge neutralizer for the lysines near the presumed interaction domain between complex III and complex IV. The obtained results for centre P provide new information of residues critical for stabilisation of ubiquinol and controlling electron short circuit reactions. The observations for centre N variants clearly support the proposed two proton transfer pathways and the role of the bound phospholipids in centre N kinetics. Variants in the Cyc1p binding site suggest a role for F230 both in Cyc1p binding and electron transfer. Clear interaction between the high and low potential chain in both Cyt1p and centre N variants strongly support long-range interactions in the complex. Studies on the supramolecular association of complex III and complex IV indicate a new role of Cl in stabilising a supracomplex.
Ligands of Iron-Sulphur Cluster N2: In this work the ubiquinone reducing catalytic core of NADH:ubiquinone oxidoreductase (complex I) from Y. lipolytica was studied by a series of point mutations replacing conserved histidines or arginines in the 49-kDa subunit. Although the missing 4th ligand of cluster N2 could not be found in the 49-kDa subunit of complex I, it was clearly demonstrated that iron-sulphur cluster N2 resides directly on the interface between the PSST and 49-kDa subunits. The results presented in this work show that residues in the 49-kDa subunit have strong influence on this redox centre and also on catalytic activity. The strong influence of Arg-141 and His-226 residues in 49-kDa subunit on this cluster can be deducted from complete loss of N2 signals in EPR spectra such as in case of mutants H226A and R141A. In the case of mutant H226M the EPR signal from cluster N2 was shifted and cluster N2 even lost the pH dependence of its redox midpoint potential and became more similar to the other so called 'isopotential' clusters. Specifically in the case of mutants R141M and R141K the characteristic signature of cluster N2 became undetectable in EPR spectra. However, specific dNADH:DBQ oxidoreductase activity that could be inhibited with the specific complex I inhibitors DQA and rotenone was not absolutely abolished but rather reduced. These reductions in complex I activity did not correspond to similar reductions in the specific EPR signal of cluster N2 as it was observed in the His-226 mutant series. No indications could be found that these mutations had modified the magnetic properties of cluster N2, resulting in different EPR spectra. From these observations it could be concluded that both mutants R141K and R141M virtually or entirely lack iron-sulphur cluster N2. The rates in complex I activity could be reconciled with electron transfer theory: After removal of a single redox centre in a chain, electron transfer rates are predicted to be still much faster than steady-state turnover of complex I. These results from mutants R141K, R141M and also the result from mutant H226M that protons are being pumped even if the redox midpoint potential of cluster N2 is not pH dependent questions the prominent role in the catalytic mechanism of complex I that has been ascribed to cluster N2. Histidine 91 and 95 were found to be absolutely essential for activity of complex I since in both mutants complex I was fully assembled and artificial NADH:HAR activity was parental whereas complex I specific dNADH:DBQ activity was abolished. The signal from cluster N2 in EPR spectra was parental for all His-91 and -95 mutants. Mutations at the C-terminal arginine 466 affected ubiquinone affinity and inhibitor sensitivity but also destabilised complex I. All these results provide further support for a high degree of structural conservation between the 49-kDa subunit of complex I and the large subunit of water soluble [NiFe] hydrogenases. Remodelling of Human Pathogenic 49-kDa Mutations in Y. lipolytica: Y. lipolytica has been proven a good system for studying complex I properties and thus also for studying defects that occur in humans. In this work pathogenic mutations in the 49-kDa subunit of complex I were recreated and studied. The P232Q mutant showed non-assembly of complex I and this is probably the cause why this mutation was lethal in patients. The mutants R231Q and S416P were parental for the content, artificial and also specific complex I activity, Km for DBQ and IC50 for DQA. From these results we can conclude that these two residues Arg-228 and Ser-413 in mammalian cells have specific structural importance for the 49-kDa subunit even if they are not directly involved in catalytic process.
Proton-translocating NADH:ubiquinone oxidoreductase (complex I) transports two electrons from NADH to membranal ubiquinone: in this process protons are translocated across the membrane, producing 40% of the total proton gradient between matrix side and intermembrane space. Mitochondrial complex I contains at least 46 subunits in mammals, and has a molecular weight of around 1000 kDa. Electronic microscopy analysis showed that complex I has an L-form, which consists of two domains: a peripheral “arm” (hydrophilic domain) and a membrane “arm” (hydrophobic domain). The peripheral domain, which protrudes into the matrix, contains one non-covalently bound flavin mononucleotide (FMN) and the iron-sulfur clusters N1a, N1b, N2, N3, N4 and N5 as redox active groups. They transport electrons from NADH to ubiquinone. Cluster N2 is supposed to be the immediate electron donor to ubiquinone by virtue of its highest and pH dependent redox midpoint potential (Em,7 –150 mV). The exact location of the tetra-nuclear cluster N2 is still object of discussion. The TYKY and the PSST subunits contain three binding motifs for tetranuclear clusters which are formed by twelve cysteins. In an effort to investigate the “ubiquinone reduction module” of complex I, in the first part of this work site directed mutagenesis of the TYKY and PSST subunits has been carried out. Mutant strains were characterised in terms of complex I content, catalytic activity and EPR signature of cluster N2. The second part of this work was aimed at developing a substrate inducible version of the internal alternative NADH:ubiquinone oxidoreductase (NDH2i). A substrate inducible NDH2i is expected to offer a “switch” between complex I activity dependent (no NDH2i activity) and independent (NDH2i activity) cell growth, by changing between activating and non-activating substrates. This strategy would allow the screening for two types of complex I mutants, which is a prerequisite for realising a random PCR mutagenesis of single subunits of complex I, that allows the production of a high number of point mutations in relatively short time. Y. lipolytica complex I deficiency mutant strains could be easily identified, by virtue of their inability to survive under complex I dependent growth conditions (no NDH2i activity). By this way, amino acids that have an important role for complex I structure or function could be identified by subsequent sequence analysis. Each of the twelve cysteines that form the above mentioned three binding motifs for iron-sulfur cluster have been mutagenised. In mutant mitochondrial membranes, no assembled complex I could be detected. From these data one may conclude that the mutagenised 6 SUMMARY 92 cysteines play an important role for complex I stability, or that are a prerequisite for complex I assembly in Y. lipolytica, but there is not direct evidence indicating that any of the four mutagenised residues acts as a ligand. Two aspartates in the PSST subunit, Asp-99 and Asp-115, were found to be essential for complex I catalytic activity. EPR spectroscopic analysis indicated that the electron transfer to N2 cluster was not blocked and implied that this was not the reason for the loss of catalytic activity. From these data it can be concluded that D99 and D115 play a vital role for complex I NADH:ubiquinone reductase activity, but are not ligands for cluster N2 and that their position is not close enough to the cluster to influence directly its electromagnetic environment. Three mutations, identified in the PSST and TYKY homologous subunits of patients affected with Leigh syndrome (V119M in PSST, P78L and R101H in TYKY) were reconstructed in the obligate aerobic yeast Y. lipolytica. This approach may help to understand the aetiology of the Leigh syndrome, in terms of the ability of complex I to oxidize NADH and to transport electrons. In fact, all three mutations showed effects on electron transport, reducing the VMax by about 50%. Mutant V119M in the PSST subunit, which had a lethal effect in two patients that were homozygous for this mutation, affects a fully conserved residue. Overall, the results from site directed mutagenesis carried out so far support the theory that the “catalytic core ” (N2 cluster and quinone binding site) of complex I has been evolved from the electron transfer module of the [Ni-Fe] hydrogenases. In fact, mutagenesis of residues that are fully conserved between complex I and [Ni-Fe] hydrogenases, showed dramatic effects on complex I in terms of assembly (cysteine mutants) or catalytic activity (D99-D115). Differently, changing aspartate 174 and glutamic acid 185 (not fully conserved, Fig 4.1A) had little or no effect on the Michaelis-Menten parameters and N2 EPR signal. In recent years Y. lipolytica has been developed as a yeast genetic system to study mitochondrial complex I. The present work introduced the promoter for the isocitrate lyase (pICL1) as a useful tool for the substrate selective expression of the internal version of the alternative NADH:ubiquinone oxidoreductase (pICL1-NDH2i). This allows to rescue complex I deficiencies “in vivo” selectively by growth on acetate (or ethanol) medium. The integration of the pICL1-NDH2i construct into the genome of Y. lipolytica and subsequent deletion of nuclear-coded subunits like PSST, TYKY and 49 kDa, would contribute to further develop this organism as a useful genetic model for studying subunits of mitochondrial complex I by site directed mutagenesis.
Charakterisierung der alternativen NADH-Ubichinon-Oxidoreduktase (NDH2) aus Yarrowia lipolytica
(2004)
Neben dem protonenpumpenden Komplex I (NDH-1) der Atmungskette besitzt die obligat aerobe Hefe Yarrowia lipolytica eine alternative NADH:Ubichinon Oxidoreduktase (NDH-2). Diese Enzyme, die in den Atmungsketten von Pflanzen, Pilzen und Bakterien vorkommen, bestehen aus nur einer Untereinheit, führen jedoch dieselbe Reaktion aus wie Komplex I, nämlich die Elektronenübertragung von NADH auf Ubichinon, wobei allerdings keine Protonen über die Membran transloziert werden. Nur peripher mit der Membran assoziiert, können alternative Dehydrogenasen entweder zur cytosolischen Seite (extern) oder zur Matrixseite (intern) orientiert sein. Y. lipolytica besitzt im Gegensatz zu anderen Ascomyceten nur eine einzige extern orientierte alternative Dehydrogenase mit einer vorhergesagten Masse von ca. 60 kD und einem nicht kovalent gebundenem Molekül FAD als Cofaktor. Durch Fusion des Leserasters mit der Präsequenz der 75 kD Untereinheit von Komplex I war die interne Expression des Enzyms (NDH2i) gelungen, die das Überleben von Komplex I Deletionsmutanten ermöglichte. Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurde die alternative Dehydrogenase von Y. lipolytica innerhalb ihrer natürlichen Membranumgebung charakterisiert. Das Enzym reagierte mit verschiedenen Chinonanaloga, wobei mit dem hydrophilen Q1 eine höhere katalytische Rate erzielt wurde als mit DBQ, das dem natürlich vorkommenden Q9 am ähnlichsten ist. Da hydrophobe Substrate fast ausschließlich in der Lipidphase der Membranen gelöst vorliegen, musste bei der Bestimmung von kinetischen Parametern (ebenso wie bei Komplex I) auf eine gleichbleibend große Membranphase im Messvolumen geachtet werden. Mit dem standardmäßig benutzten Substrat DBQ reagierte YLNDH2 nach einem Ping-Pong Reaktionsmechanismus. Dieser beschreibt eine abwechselnde Bindung der beiden Substrate, wobei das Enzym die Elektronen von NADH aufnimmt (E-FADH2) und an Ubichinon weitergibt (E-FAD); es existiert kein ternärer Enzym-Substrat Komplex. Gestützt durch Kristallstrukturen des analogen Enzyms QR1 mit NADPH bzw. mit Durochinon, liegt die Vermutung nahe, dass beide Substrate in ähnlicher Weise und sehr wahrscheinlich in der gleichen Bindungstasche binden. Ein Ping-Pong Reaktionsmechanismus wurde bereits für die NADH:DCPIP Oxidoreduktase Aktivität von zwei weiteren alternativen Enzymen postuliert, jedoch noch nie für ein physiologisches Substrat. Als bislang wirksamster Inhibitor für alternative Dehydrogenasen wurde 1-hydroxy-2-dodecyl-4(1H)chinolon (HDQ) entdeckt. HDQ hemmte NDH2 in Membranen aus Y. lipolytica mit einer I50 von 200 nM, was der 500fachen Hemmwirkung des gängig verwendeten Flavon auf das isolierte Enzym NDI1 von S. cerevisiae entspricht. Allerdings hemmte HDQ auch Komplex I mit einer I50 von 2 µM, ähnlich wie es bei Platanetin in Pflanzenmitochondrien der Fall war [Roberts et al., 1996]. Mit dem Ziel, ein polyklonales Antiserum gegen die native YLNDH2 zu generieren, wurde das Enzym in E. coli heterolog exprimiert. Die Expression führte zur Bildung von Einschlusskörpern, aus denen das rekombinante Enzym unter denaturierenden Bedingungen gereinigt und zur Immunisierung eines Kaninchens verwendet werden konnte. Das Antiserum kreuzreagierte mit der nativen und der internen Version von YLNDH2 und zeigte nur wenige unspezifische Bindungen. Es wurde gezeigt, dass Y. lipolytica Stämme ohne NDH2 und Komplex I mit NDH2i als einziger Dehydrogenase erzeugt werden konnten. In N. crassa war der Versuch, NDE2 und Komplex I gleichzeitig zu deletieren, gescheitert, was zu der Schlussfolgerung führte, dass sich die beiden Enzyme in diesem Organismus möglicherweise kompensieren könnten. Dies war in Y. lipolytica ausgeschlossen worden, da wahrscheinlich kein (oder nur unzureichender) Austausch zwischen matrixständigem und cytosolischem NADH stattfindet. Die zielgerichtete Mutagenese hochkonservierter Bereiche im offenen Leserahmen von YLNDH2 lieferte das eindeutige Ergebnis, dass die zweite der beiden beta-alpha-beta-Bindungsdomänen NADH binden muß, da sich der KM Wert für NADH bei Mutation des essentiellen sauren Restes E320 dratisch erhöhte. Alle Mutationen, die die Dinukleotid Bindungsdomäne I betrafen, die danach folgerichtig den Cofaktor FAD binden muß, führten zu einem vollständigen Verlust von NDH2. Dieselbe Zuordnung der Bindungsstellen war bereits von Björklöf et al. [2000] vorgeschlagen worden. Eine Chinonbindungstelle konnte durch Mutagenese der beiden apolar/aromatischen Bereiche der Sequenz nicht identifiziert werden. Die Modifikation des C-Terminus von NDH2i führte zu nicht mehr messbarer Aktivität und stark verringerter Expression des Enzyms in mitochondrialen Membranen (siehe Anhang 7.5.1.1). Es kann daher vermutet werden, dass der C-Terminus für die korrekte Faltung eine wichtige Rolle spielt, möglicherweise sogar bei der Membranassoziation, wie bei Rasmusson [1999] vorgeschlagen wurde. Interessant war in diesem Zusammenhang, dass die C-terminal modifizierte NDH2i trotzdem das Überleben von Komplex I Deletionsmutanten bzw. das Wachstum auf DQA ermöglichte. In Membranen, die einen unterschiedlichen Gehalt an NDH2, jedoch die gleiche Gesamtmenge an Protein enthielten, wurde eine unerwartete lineare Abhängigkeit zwischen KM und Vmax Werten beobachtet. Dieses Phänomen wurde mit dem Modell der externen Diffusionslimitierung beschrieben, die in ähnlicher Weise auch bei immobilisierten Enzymen auftritt. Danach wird die Geschwindigkeit der enzymatischen Reaktion von YLNDH2 sowohl durch die kinetisch kontrollierte Rate, als auch durch die Transportrate des Ubichinons bestimmt, das aus der Membran heraus in die wässrige Umgebung des katalytischen Zentrums gelangen muss. Aus diesem Grund ist nicht nur die Maximalgeschwindigkeit, sondern auch die Michaelis Menten Konstante KM abhängig vom Gehalt des Enzyms in Membranen. Dies führte bei niedrig exprimierten mutanten Enzymen zur gleichzeitigen Abnahme von KM und Vmax. Eine externe Diffusionskontrolle der enzymatischen Reaktion wurde auch für Komplex I, dessen Reaktionszentrum im peripheren Arm vermutet werden kann, aber nicht für Komplex III aus S. cerevisiae, dessen Chinonbindungsstellen sich definitiv in hydrophober Umgebung befinden, beobachtet.
The cytochrome bc1 complex is a cornerstone in bioenergetic electron transfer chains, where it carries out tasks as diverse as respiration, photosynthesis, and nitrogen fixation. This homodimeric multisubunit membrane protein has been studied extensively for several decades and the enzyme mechanism is described with the modified protonmotive Q cycle. Still, the molecular and kinetic description of the catalytic cycle is not complete and questions remain regarding the bifurcation of electron transfer at the quinol oxidation (Qo) site, substrate occupancy, pathways of proton conduction, and the nature of the Rieske protein domain movement. We used competitive inhibitors to study the molecular architecture at the Qo site with X-ray crystallography. The structure of the enzyme with the substrate analog 5-n-heptyl-6-hydroxy-4,7-dioxobenzothiazole (HHDBT) bound at the Qo site was determined at 2.5 Å resolution. Spectroscopic studies showed that HHDBT is negatively charged when bound at the active site. Mechanistic interpretations from inhibitor binding are in line with single occupancy model for quinol oxidation and structural analysis supports the proposed proton transfer pathway. For functional insight into the enzyme mechanism, redox-sensitive protonation changes were studied by Fourier transform infrared spectroscopy. The protein purification procedure was optimized for less delipidation and the isolated enzyme was more active. Furthermore, two new phospholipids were identified in the X-ray structures, including a cardiolipin. Strikingly, conserved lipid binding cavities were observed in structural comparison with homologous enzymes. The functional role of tightly bound phospholipids will be discussed. Finally, the Qo site is a target for various compounds of agricultural and pharmaceutical importance. Importantly, the X-ray structures permit detailed analysis of the molecular reasons for acquired resistance to and treatment failure of Qo site inhibitors, such as atovaquone, that is used to treat malaria and pneumonia, as discussed herein.
RcsB is a central transcriptional regulator in enteric bacteria involved in exopolysaccharide (EPS) biosynthesis, in cell division, in the expression of osmoregulated genes, and regulates at least 20 other genes and operons. It is a member of a phosphorelay system and signal transfer is mediated by phosphorylation through the RcsC/YojN phosphorelay. RcsB proteins modified with the phosphorylation mimic BeF3- as shown by its conformational changes and DNA binding properties and resulted phosphorylated RcsB derivatives with sufficient stability. Both, the wild type RcsB protein and the mutant RcsBD11A could be modified with BeF3-. Non-phosphorylated RcsB has been shown to bind as a heterodimer with the coinducer RcsA at the conserved RcsAB box in Rcs regulated promoters. In this study, it has been shown that the modification of RcsB by BeF3 - (I) has a negative effect on its homodimerization, (II) abolishes the complex formation of RcsAB with the RcsAB box as shown by the EMSA and SPR technique. All the effects were found to be reversible by increasing the NaF concentration in the assays presumably leading to the formation of the inactive BeF4 2- salt. This hypothesis of RcsB being modified by BeF3- was also supported by other phosphodonors like ATP and acetyl phosphate, both of them showed the same negative effect on DNA binding by RcsAB heterodimer giving evidence that BeF3- could be used as a phosphorylation mimic. In addition, the phosphorylation mimic BeF3- was found to be a better phosphorylating agent than ATP and acetyl phosphate. This is the first evidence that phosphorylation of RcsB might have a negative effect on the activation of RcsAB regulated operons. Autophosphorylation of RcsB proves that it has the ability to take up phosphoryl groups and the mutant protein also become autophosphorylated with less efficiency or stability than the wild type protein. RcsB probably takes up phosphoryl groups through RcsC -> YojN -> RcsB phosphorelay pathway. To study the interaction among the proteins in this pathway, fluorescence spectroscopy, NMR spectroscopy, and an in vivo ß galactosidase assay were performed by using two domains of RcsC (T-RcsC and R-RcsC), HPt domain of the protein YojN, and RcsB. The interactions between R-RcsC/YojN-HPt and YojN-HPt/RcsB supports the proposed pathway of phosphorylating RcsB. RcsB might also be phosphorylated by YojN-HPt that is phosphorylated by other sensor kinase other than RcsC in a cross-talk mechanism. The phosphorylation of RcsB by YojN-HPt probably has the same negative effect on cps induction as obtained with BeF3 - effect on DNA binding by RcsAB heterodimer.
The transcriptional regulator RcsB controls the expression of a minimum of 20 different genes having diverse functionalities and biosynthetic operons in the family of Enterobacteriaceae. While in the heterodimeric complex with the co activator RcsA, the RcsAB box consensus is recognized, DNA binding sites for RcsB without RcsA have also been identified. The conformation of RcsB might therefore be modulated upon interaction with various co activators, resulting in recognition of different DNA targets. In this study the interaction of RcsB with some of these DNA targets have been analysed by a diverse array of techniques including gel shift assay and SPR. The solution structure of the C-terminal DNA-binding domain of RcsB from Erwinia amylovora spanning amino acid residues 129-215 has been solved in this study by heteronuclear NMR spectroscopy. The C-terminal domain is composed of four α-helices where the two central helices of the H-T-H motif are similar to the structures of the regulatory proteins GerE, NarL and TraR. The DNA-binding activity of the C-terminal domain alone is established for the first time in this study and was specified by fluorescence spectroscopy, SPR and NMR titration experiments. The molecular interaction between the individual RcsB domains was analysed by cross-linking experiments and heteronuclear NMR spectroscopy and the amino acid residues of the C-terminal domain involved in this interaction were identified precisely. Another important part of this project was the cell-free production of different Trp analogue labelled RcsB protein. RcsB protein was produced in quite a good yield with different Trp analogue having spectrally enhanced properties. The isolated RcsB alloproteins proved to be ideal for protein interaction studies by fluorescence spectroscopy and the very first evidence of an oligomerization of RcsB due to molecular association has been put forth from these studies. The phosphorylated state of the RcsB protein was mimicked by a beryllofluoride complex in order to study its role in transcriptional regulation. It was found that RcsB alone could bind to DNA targets upon this modification by the beryllofluoride complex. Thus the phosphorylation of the protein that involves the Asp 56 residue induces a structural change of the protein followed probably by a domain movement also, so that the C-terminal domain having the H-T-H DNA binding motif that was previously eclipsed by the N-terminal domain is relieved of this constraint.
CFTR ist ein Chloridkanal, der bei der rezessiven Erbkrankheit Mukoviszidose defekt ist. Es ist bekannt, dass CFTR durch Proteinkinasen aktiviert und seine Aktivität durch Nukleotide reguliert wird. Die Regulation von CFTR wurde unter zwei verschiedenen Gesichtspunkten untersucht. Zum einen wurden Experimente durchgeführt, die Aufschluss über die Beteiligung der Nukleotidbindedomänen beim Öffnen und Schließen des Kanals und über die Notwendigkeit einer ATP-Hydrolyse geben sollten. Zum anderen wurde untersucht, ob neben der durch Proteinkinasen vermittelten Aktivierung von CFTR ein alternativer Prozess existiert. Hierbei wurde ein Regulationsmechanismus entdeckt, der eine Proteinkinase-unabhängige Aktivierung von CFTR durch Phosphatidylinositolphosphate ermöglicht.
Humaner CFTR wurde in Oozyten des Krallenfrosches Xenopus laevis heterolog exprimiert und mit der Patch-Clamp-Methode untersucht. Stationäre und zeitaufgelöste Ströme des CFTR-Wildtyps wurden mit mutierten CFTR-Kanälen verglichen. Das Lysin im Walker AMotiv ist an der Koordinierung des γ-Phosphats von MgATP bei der Hydrolyse beteiligt, so dass Walker A-Mutationen die ATP-Bindung und –Hydrolyse von ATPasen beeinflussen. In dieser Arbeit wurden Walker A-Mutanten untersucht, die eine Substitution des konservierten Lysins innerhalb der Walker A-Sequenz der NBD1 (K464A) oder beider Nukleotidbindedomänen (K464A/K1250A) aufwiesen. Da die Öffnungsgeschwindigkeit der Mutante K464A kaum einen Unterschied zu der des Wildtyps aufzeigte, die Mutante K1250A jedoch das Öffnen stark verlangsamte, wurde gefolgert, dass keine Hydrolyse von ATP an der NBD1 für die Öffnung nötig ist. Während Wildtyp-Kanäle auf eine gleichzeitige Applikation von ATP und AMP-PNP, einem nichthydrolysierbaren ATP-Analogon, mit einem verlängerten Offenhalten der Kanäle („locked open“–Effekt) reagierten, das sich in einem langsamen Schließen der Kanäle äußerte, konnte bei K464A-Mutanten dieser Effekt nicht beobachtet werden. Außerdem erfolgte das Schließen der Doppelmutante K464A/K1250A im Vergleich zur Einzelmutante K1250A nach MgATP-Entzug schneller. Daraus wurde geschlossen, dass die NBD1 auf das durch die NBD2 vermittelte Offenhalten des Kanals, möglicherweise durch eine direkte Interaktion, regulierend einwirkt, bevor letztere den Kanal wieder schließt. Da auch ein Öffnen und Schließen des CFTR-Kanals unter Mg2+-freien Bedingungen zu beobachten war, unter denen keine ATP-Hydrolyse erfolgen kann, konnte die Notwendigkeit einer ATP-Hydrolyse bezüglich des Kanalgatings ausgeschlossen werden. Ein Einwirken der NBD1 auf das Offenhalten der Kanäle durch die NBD2 war unter nicht-hydrolytischen Bedingungen anhand des Vergleichs der Schließkinetiken von WT und Mutante K464A nicht feststellbar, so dass eine direkte Interaktion beider Nukleotidbindedomänen wahrscheinlich ausgeschlossen werden kann.
Im zweiten Teil dieser Arbeit wurde der Effekt des Phospholipids Phosphatidylinositol-4,5-bisphosphat (PIP2) auf CFTR-Kanäle untersucht. Die Applikation von PIP2 und MgATP zu unphosphorylierten CFTR-Kanälen zeigte einen deutlichen Stromanstieg, der einem Chloridstrom entsprach. Einzelkanaluntersuchungen ergaben, dass durch PKA induzierte Kanäle und Einzelkanäle, die durch PIP2 aktiviert wurden, dieselbe Leitfähigkeit von ~5 pS besaßen. Somit konnte eine PIP2-induzierte Aktivität endogener Chloridkanäle ausgeschlossen und ein Einfluss des Phospholipids auf CFTR-Chloridkanäle bewiesen werden, der zudem ATP-abhängig war.
Neben PIP2, welches den stärksten Effekt auf die CFTR-Aktivität zeigte, konnten auch Phosphatidylinositol (PI) und Phosphatidylinositol-4-monophosphat (PIP), sowie Arachidonsäure unphosphorylierte CFTR-Kanäle aktivieren. Damit wurde gezeigt, dass der Effekt des Signalanstiegs durch Phosphatidylinositole abhängig von der Struktur des Moleküls war, also von der Anzahl der Phosphatgruppen am Inositolring und der Fettsäurezusammensetzung des Phospholipids.
Experimente, die unter Mg 2+-freien Bedingungen durchgeführt wurden, so dass eine Phosphorylierungsreaktion durch Kinasen ausgeschlossen werden konnte, zeigten dennoch eine PIP2-vermittelte Aktivierung von unphosphorylierten CFTR-Kanälen. Auch eine Substitution des nicht-hydrolysierbaren ATP-Analogons AMP-PNP anstelle von ATP erlaubte die Öffnung unphosphorylierter CFTR-Kanäle. Mit diesen beiden Ergebnissen wurde gezeigt, dass eine PIP2-vermittelte Aktivierung von unphosphorylierten CFTR-Kanälen unabhängig von einer Proteinphosphorylierung ist.
Physiologisch betrachtet könnte man sich vorstellen, dass über die Aktivierung von Lipidkinasen die Synthese von PIP2 über PI und PIP stimuliert wird, so dass das Phospholipid, wie für viele Ionenkanäle und Transporter gezeigt, eine direkte Interaktion mit dem Protein eingeht. Eine ATP-abhängige Synthese von PIP2 in Makropatches an Xenopus-Oozyten durch endogene Lipidkinasen könnte eine mögliche Erklärung für den gezeigten ATP-abhängigen Anstieg des CFTR-Signals sein.
In dieser Arbeit wurde bei CFTR-Kanälen zum ersten Mal ein alternativer Regulationsmechanismus über Phosphatidylinositolphosphate identifiziert, der Proteinkinaseunabhängig ist und der möglicherweise über eine direkte Interaktion zwischen dem Phospholipid und dem Protein vermittelt wird.
Nitric oxide (NO) is a potent mediator with pleiotropic functions such as inhibition of platelet aggregation, smooth muscle relaxation and regulation of neuronal transmission. These effects are mostly mediated by intracellular NO-sensitive guanylyl cyclases (GCs) which convert GTP into the second messenger, cGMP. This messenger in turn activates multiple downstream effectors such as cGMP-dependent protein kinases, cGMP-regulated ion channels and cGMPdependent phosphodiesterases. Mammalian NO-sensitive GCs are obligate heterodimers of an α and β subunit each. Given that these enzymes play a key role in cGMP-mediated pathways, one may anticipate that mechanisms other than allosteric activation via NO may exist to regulate the production and turnover of cGMP. In this thesis, novel aspects of the regulation of the most abundantly expressed GC heterodimer α1β1 are presented.
A possible mechanism of regulation that was tested here, is tyrosine phosphorylation. Using anti-phosphotyrosine antibodies, the phosphorylation of the β1 subunit was detected after incubation of β1-overexpressing COS-1 cells with protein tyrosine phosphatase (PTP) inhibitors such as pervanadate and bpV(phen). β1 phosphorylation on tyrosines was also observed in PC-12 cells which endogenously express GC and in rat aorta after inhibition of PTPs. Furthermore, hydrogen peroxide was found to be a physiological stimulus for the induction of reversible β1 tyrosine phosphorylation in intact cells. Using phenylalanine mutants of different tyrosines, residue 192 (Y192) of β1 was identified as the major phosphorylation site. Consistent with this finding, sequence analyses showed that Y192 forms part of a motif that resembles a preferential target site for Src-like kinases. When tyrosine-phosphorylated, this motif exposes a typical SH2 docking site for members of the Src kinase family.
Experiments with inhibitors of Src kinases, PP1 and PP2, clearly showed that phosphorylation of Y192 is Src-dependent. Preincubation of β1-expressing cells with these inhibitors significantly reduced the level of phosphorylated β1 after bpV(phen) treatment. Furthermore, co-expression of β1 with Src led to a strong phosphorylation of this subunit. Co-precipitation experiments showed that Src interacts with GC. Interestingly, kinases of the Src family are recruited to β1 via the SH2 domain upon phosphorylation of Y192. Together, these results indicate that Src kinases phosphorylate tyrosine 192 thereby creating a docking site for their own SH2 domains. Kinase bound to GC may then catalyze phosphorylation of GC or other downstream effectors. Inhibition of PTPs altered GC activity in two ways: it increased both the basal activity and the YC-1- and BAY 41-2272-stimulated activity two-fold, and it reduced the sensitivity of the enzyme towards NO. The detailed mechanism of action is still unknown, but experiments using the mutant β1[Y192F] demonstrated that residue 192 is not responsible for these effects.
Another major focus of this thesis was the identification of novel GC binding proteins. Using the yeast two-hybrid approach, the carboxy-terminal portion of a protein named AGAP1 (amino acid (aa) 399-804) was found to interact with the catalytic domain of α1 (aa 466-690) and with the regulatory domain of β1 (aa 1-348). Human AGAP1 is a multidomain protein of 804 amino acids with a calculated molecular mass of 89,1 kDa comprising an Arf-GAP (GAP:GTPase activating protein), a putative GTPase domain, two Ankyrin repeats and a PHdomain. Co-precipitation experiments using lysates from mammalian cells overexpressing both binding partners confirmed the interaction of AGAP1 with the GC subunits. Immunofluorescence analyses demonstrated that AGAP1 co-localizes with GC in the cytoplasm of COS-1 cells.
In Northern blots, AGAP1 mRNA was detected in various human and murine tissues showing a comparable expression pattern described for the mRNA of α1 and β1. Using an AGAP1-specific antibody, endogenous protein was precipitated from lysates of HEK-293 cells derived from human embryonic kidney. The same antibody efficiently cross-reacted with the rat homologue (rAGAP1) and immunoprecipitated endogenous rAGAP1 from lysates of PC-12 cells, aorta and heart. The molecular mass of rAGAP1 is larger than that of the human protein, possibly due to an additional exon present in the rat genome. Like β1, AGAP1 is a substrate for tyrosine kinases. Phosphorylation of AGAP1 was detected after inhibition of PTPs or by coexpression of Src. Furthermore, the kinase inhibitor PP2 strongly impaired phosphorylation of AGAP1 after pervanadate treatment suggesting that tyrosine kinases of the Src family are involved. Measurements of cGMP production showed that AGAP1 has no influence on the activity of NO-sensitive GC. Interestingly, inhibition of PTPs potently increased the complex formation between AGAP1 and GC indicating that the interaction between these two proteins is modulated by reversible tyrosine phosphorylation. Whether this effect is due to the phosphorylation of AGAP1 or GC is still unknown. AGAP1 associates with endosomes and exposes Arf-GAP activity towards Arf1 and Arf5 which are involved in vesicular transport. Thus, one may hypothesize that binding of α1β1 to AGAP1 targets GC to distinct subcellular compartments in close proximity to cGMP-dependent effectors, thereby optimizing cGMP generation and fostering cGMP-driven actions.
Taken together, these results demonstrate that beside the modulation of GC by NO the enzyme is regulated by tyrosine phosphorylation and interaction with AGAP1.
The quinol:fumarate reductase (QFR) is the terminal reductase of anaerobic fumarate respiration, the most commonly occurring type of anaerobic respiration. This membrane protein complex couples the oxidation of menaquinol to menaquinone to the reduction of fumarate to succinate. The three-dimensional crystal structure of the QFR from Wolinella succinogenes has previoulsy been solved at 2.2 Å resolution. Although the diheme-containing QFR from W. succinogenes is known to catalyze an electroneutral process, structural and functional characterization of parental and variant enzymes has revealed active site locations which indicate electrogenic catalysis across the membrane. A solution to this apparent controversy was proposed with the so-called “Epathway hypothesis”. According to this, transmembrane electron transfer via the heme groups is strictly coupled to a parallel, compensatory transfer of protons via a transiently established pathway, which is inactive in the oxidized state of the enzyme. Proposed constituents of the E-pathway are the side chain of Glu C180, and the ring C propionate of the distal heme. Previous experimental evidence strongly supports such a role for the former constituent. One aim of this thesis is to investigate by a combination of specific 13C-heme propionate labeling and FTIR difference spectroscopy whether the ring C propionate of the distal heme is involved in redox-coupled proton transfer in the QFR from W. succinogenes. In addition to W. succinogenes, the primary structures of the QFR enzymes of two other e- proteobacteria are known. These are Campylobacter jejuni and Helicobacter pylori, which unlike W. succinogenes are human pathogens. The QFR from H. pylori has previously been established to be a potential drug target, and the same is likely for the QFR from C. jejuni. The two pathogenic species colonize mucosal surfaces causing several diseases. The possibility of studying these QFRs from these bacteria and creating more efficient drugs specifically active for this enzyme depends substantially on the availability of large amounts of high-quality protein. Further, biochemical and structural studies on QFR enzymes from e- proteobacteria species other than W. succinogenes can be valuable to enlighten new aspects or corroborate the current understanding of this class of membrane proteins.
Die Entwicklung neuer Formen der Tumortherapie bleibt notwendig, solange die Heilung verschiedener solider metastasierender Tumore nicht möglich ist. Solch ein neuer Ansatz besteht in der Infektion des Tumors mit replikationskompetenten (retroviralen) Vektoren oder Viren. Um die Spezifität dieser Viren für die Tumorzellen zu erhöhen, wird in dieser Arbeit ein Konzept vorgestellt, dass die Tumor-spezifische Expression von Proteasen, im Besonderen von Matrix-Metalloproteasen (MMPs), zur Aktivierung des Maus Leukämievirus (MLV) ausnutzt (Protease-Targeting). Dazu wurde durch eine Blockierungsdomäne (CD40L) Nterminal vom infektionsvermittelnden MLV-Hüllprotein Env die Bindung an die Zelleintrittsrezeptoren verhindert. Eine Spaltstelle zwischen CD40L und Env ermöglicht die Entfernung der Blockierungsdomäne und damit die Aktivierung des Virus. Um eine Spaltstelle zu finden, die optimal auf das Proteasespektrum eines Tumors passt, wurde das zwischen CD40L und Env befindliche Linkerpeptid kombinatorisch diversifiziert und so eine Bibliothek von Retroviren erzeugt. Die Selektion dieser Bibliothek auf zwei unterschiedlichen Tumorlinien (HT1080, Fibrosarkom und U-87 MG, malignes Gliom) führte zur Anreicherung MMP-aktivierbarer Viren. Drei der mehr als 10 identifizierten Linkerpeptide (AKGLYK, PSGLYQ und PAGLHV) wurden im viralen Kontext näher charakterisiert. Für das Spaltmotiv PSGLYQ konnte MMP-2 als aktivierende Protease nachgewiesen werden. Für die Motive AKGLYK und PAGLHV erwies sich eine kummulative Spaltung durch eine Reihe von MMPs als wahrscheinlich. Um die Ausbreitung der Viren in Abhängigkeit der MMP-Expression zu zeigen, wurden verschiedene Zelllinien hinsichtlich ihrer Expression von MMP-2 und MMP-9 charakterisiert und in MMP-positive und MMP-negative Zelllinien eingeteilt. Durch Infektion dieser Zelllinien und anschließende Verfolgung der Virus-Ausbreitung konnte die konditionale Replikation der aktivierbaren Viren ausschließlich auf MMP-positiven Zellen nachgewiesen werden. Daher erreichten die Viren mit selektionierten Spaltmotiven im Gegensatz zum Parental- Virus, welches ein in der Literatur beschriebenes MMP-2-Spaltmotiv aus Kollagen (PLGLWA) präsentierte, die vollständige Infektion der Kulturen. Auch die Titer lagen etwa um das 1000fache höher. Die Replikationsgeschwindigkeit der aktivierbaren Viren mit AKGLYK und PSGLYQ Motiv erreichte annähernd die des unveränderten MLV, das Virus mit PAGLHV Motiv zeigte sogar eine identische Replikationskurve. In einem Tumor-Maus-Modell konnte die Ausbreitung der proteolytisch aktivierbaren Viren auch in der Umgebung eines soliden Tumors gezeigt werden. Sowohl nach Etablierung des Tumors aus zum Teil vorinfizierten Zellen, als auch nach Injektion von Viren in zuvor etablierte Tumore erfolgte sie für die selektionierten Viren genetisch stabil. Um die Verteilung der Viren im Organismus zu bestimmen, wurde ein Modell entwickelt, in dem ein vollständig infizierter Tumor als Virusquelle diente, und nach bestimmten Zeiträumen verschiedene Organe der Maus und ein zweiter aus uninfizierten Zellen etablierter Tumor per PCR auf Infektionen untersucht wurde. Hier zeigte sich, dass WT-MLV bis zu 20.000fach mehr Zellen in den Organen infizierte als die aktivierbaren Viren. Dagegen wurden Zellen in einem sekundären uninfiziert etablierten Tumor vom WT-MLV nur etwa 5fach besser infiziert als durch die aktivierbaren Viren. Das heißt, die selektionierten Viren erreichten ein hohes Maß an Tumortargeting. In der vorliegenden Arbeit wurden durch molekulare Evolution zum ersten Mal replizierende Retroviren hergestellt, die einen eingeschränkten und für Protease-positive Zellen spezifischen Tropismus aufwiesen. Die selektionierten Substrate glichen anderen, mit Hilfe von Peptid-Bibliotheken für MMPs identifizierten Motiven, jedoch konnten durch die Berücksichtigung des gesamten Proteasespektrums einer Zelllinie weitere Motive selektioniert werden, die durch bisherige Systeme nicht ermittelt werden konnten. Damit ergibt sich für die selektionierten MMP-aktivierbaren Viren durch die Kombination aus Targeting beim Zelleintritt und Replikation in der Targetzellpopulation, die für andere beschriebene Targetingsysteme nicht gegeben ist, eine echte Option für neue Wege in der Tumortherapie.
Der humane ABC-Transporter TAP (transporter associated with antigen processing) spielt in der Antigenprozessierung und in der MHC Klasse I-vermittelten Antigenpräsentation eine zentrale Rolle. Unter ATP-Hydrolyse katalysiert der heterodimere TAP-Komplex den Transport von proteosomal degradierten Peptiden aus dem Cytosol in das ER-Lumen. Diese werden im Peptidbeladungskomplex (PLC) auf MHC Klasse I-Moleküle geladen und zur Zelloberfläche transportiert, wo sie zytotoxischen T-Zellen präsentiert werden. Die Assemblierung eines funktionalen Komplexes hängt dabei von der korrekten intra- und intermolekularen Anordnung seiner Transmembransegmente (TMS) ab. Die strukturelle Organisation des TAP-Komplexes ist schon seit vielen Jahren Gegenstand intensiver Forschung und wird in der Literatur kontrovers diskutiert. Cystein-freie Proteinvarianten dienen bei der Untersuchung der Topologie als sehr gute Hilfsmittel und wurden bereits erfolgreich zur Aufklärung der Membrantopologie von komplexen Membranproteinen, wie P-glycoprotein oder der Lactose-Permease LacY, eingesetzt (Kaback et al., 2001; Loo und Clarke, 1995). Im ersten Teil der vorliegenden Arbeit wurden humane TAP1- und TAP2-defiziente Fibroblasten, die ansonsten alle anderen Komponenten der Antigenpräsentationsmaschinerie besitzen, stabil mit der jeweiligen humanen Cystein-freien TAP1- oder TAP2-Untereinheiten transfiziert. Alle 19 natürlichen Cysteine von TAP1 und TAP2 konnten vorher durch de novo Gensynthese ausgetauscht werden. Nach erfolgreicher Expression konnte ein ATP-abhängiger Peptidtransport, der spezifisch durch den viralen Inhibitor ICP47 inhibiert wurde, nachgewiesen werden. Außerdem konnte die MHC Klasse I-Oberflächenexpression der Zellen, ein Indikator einer funktionsfähigen Antigenpräsentierung, nach Transfektion mit den Cystein-freien TAP-Untereinheiten wiederhergestellt werden. Im zweiten Abschnitt wurde die Membrantopologie des humane TAP-Transporters in einem funktionalen Peptidbeladungskomplex durch ortsspezifische Mutagenese in Kombination mit der Markierung mittels thiolspezifischer Fluorophore untersucht. Durch Co-Immunpräzipitationen und Transportstudien mit radioaktiv-markierten Peptiden konnte die Funktionalität des, in Sf9 Zellen exprimierten, Cystein-freien TAP-Komplexes gezeigt werden. Einzelne Cysteine wurden aufgrund von Hydrophobizitätsanalysen in Kombination mit Sequenzvergleichen von anderen ABC-Transportern in vorhergesagte cytosolische oder ER-luminale Schleifen der TAP1-Untereinheit eingeführt und deren Zugänglichkeit mit dem thiolspezifischen, membran-impermeablen Fluorophor Fluoreszein-5-Maleimid in semi-permeabilisierten Zellen untersucht. Es konnte zum ersten Mal experimentell gezeigt werden, dass die Transmembrandomäne (TMD) der TAP1-Untereinheit in einem funktionalen Komplex aus zehn Transmembranhelices aufgebaut ist. Die TMD lässt sich in eine für die Heterodimerisierung, die Peptidbindung und den Transport essentielle und für viele ABC-Transporter charakteristische Core-Domäne, und zusätzliche N-terminale Domänen, die für die Bindung von Tapasin und die Assemblierung des PLCs verantwortlich sind, unterteilen. Somit konnte experimentell die Membrantopologie des ABC-Transporters TAP in einem funktionalen Peptidbeladungskomplex aufgeklärt werden. Der dritte Teil der Arbeit befasste sich mit der Untersuchung der veränderten Peptidbeladungskapazität, die in Kombinationen aus wildtyp TAP1 und Cystein-freiem TAP2 beobachtet wurde. Durch ortsspezifische Mutagenese wurden einzelne Cysteine in TAP2 wiedereingeführt und deren Funktionalität in Transportstudien analysiert. Es konnte ein einzelnes Cystein in TAP2 identifiziert werden, welches die Peptidbeladungskapazität beeinflusst und durch Modifikation mit thiolspezifischen Reagenzien zum Schalter für die Peptidbindung wird. Durch Quervernetzungsstudien mit radioaktiv-markierten Peptiden konnte weiterhin ein direkter Kontakt zwischen dem Cystein und dem gebundenen und somit transportierten Peptid des TAP-Transporters nachgewiesen werden.
Der Glycinrezeptor (GlyR) ist ein inhibitorischer Chloridkanal, der u.a. im Rückenmark, im Hirnstamm und in der Retina exprimiert wird und dort maßgeblich an der Prozessierung von motorischen und/oder sensorischen Signalen beteiligt ist. Als Mitglied der Superfamilie der nikotinischen Acetylcholinrezeptoren ist der GlyR ein Pentamer, dessen Untereinheiten jeweils aus einer extrazellulären N-terminalen Domäne, vier Transmembranregionen und einer großen intrazellulären Schleife bestehen. Bislang wurden vier ligandenbindende alpha-Untereinheiten (alpha 1-4) und eine für die synaptische Verankerung verantwortliche beta-Untereinheit identifiziert. Die beta-Untereinheit bildet im Gegensatz zu den alpha-Untereinheiten keine Homooligomere; sie ist nur in heterooligomeren GlyRs mit einer bisher angenommenen Stöchiometrie von 3alpha:2beta zu finden. Wie bei allen Mitgliedern der Superfamilie erfolgt die Ligandenbindung innerhalb der extrazellulären Domänen an der Kontaktstelle zwischen zwei benachbarten Untereinheiten. Um den Mechanismus der Ligandenbindung am homo- und heterooligomeren GlyR in dieser Arbeit aufzuklären, wurden Modelle der N-terminalen Domänen der alpha1- und beta-Untereinheiten basierend auf der Kristallstruktur des Acetylcholin-Bindeproteins generiert. Zur Verifizierung der Rolle aller im Modell in der Bindungstasche lokalisierten Aminosäureseitenketten wurden diese durch zielgerichtete PCR-Mutagenese substituiert, anschließend die mutierten Untereinheiten in Xenopus laevis Oozyten exprimiert und elektrophysiologisch charakterisiert. So konnten die wichtigsten Seitenketten der alpha1-Ligandenbindungstasche identifiziert werden, die an der Bindung der Agonisten Glycin und Taurin, des Antagonisten Strychnin und des Modulators 3alpha-(3’-Methoxybenzoyloxy)nortropan beteiligt sind. Die anschließende Untersuchung des heterooligomeren alpha1beta-GlyRs konnte zum ersten Mal eine direkte Beteiligung der beta-Untereinheit an der Ligandenbindung aufzeigen, wobei die Stabilisierung der Liganden in der Bindungstasche mit den zur alpha1-Untereinheit homologen Resten erfolgt. Zusätzlich ergab ein Vergleich der Affinitätsveränderungen nach Substitution homologer Reste in der alpha1- und der beta-Untereinheit Hinweise auf eine neue Stöchiometrie heterooligomerer GlyRs. Nur die Koexpression einer alpah1beta-Tandemuntereinheit mit der beta-Untereinheit resultierte in einem Rezeptor mit den gleichen pharmakologischen Eigenschaften wie der heterooligomere Wildtyp-GlyR. Dieses Ergebnis bestätigte die neue 2alpha:3beta Stöchiometrie heterooligomerer GlyRs. Damit wurde in dieser Arbeit eine dominante Rolle der beta-Untereinheit in heterooligomeren GlyRs aufgezeigt, welche für das Verständnis der synaptischen Verankerung und insbesondere der Pharmakologie des Rezeptors wichtig ist. Mit der neuen Stöchiometrie wurde gleichzeitig eine neue betabeta-Kontaktstelle in heterooligomeren GlyRs identifiziert, die als Wirkungsort neuer Therapeutika genutzt werden könnte.
Strukturelle und funktionelle Untersuchungen am Cytochrom-bc1-Komplex aus Paracoccus denitrificans
(2005)
Cytochrom bc-Komplexe sind zentrale Enzyme energietransduzierender Elektronen-transportketten. Anerkanntes Funktionsprinzip ist der Q-Zyklus; mechanistische Details insbesondere der Chinoloxidation am Qo-Zentrum sind noch unklar. Ein Verständnis des Qo-Zentrums ist auch von Interesse, da hier Inhibitoren in Form von Fungiziden und Malariatherapeutika wichtige Anwendung finden. In den vergangenen Jahren wurde eine Reihe mitochondrialer Komplexe kristallographisch charakterisiert, die Struktur eines bakteriellen Enzyms steht jedoch aus. Hauptziel dieser Arbeit war es, Ansätze zur Strukturaufklärung des bc1-Komplexes aus Paracoccus denitrificans (P.d.) zu finden, der als homologes Enzym mitochondrialer Komplexe bei einfacher genetischer Zugänglichkeit ein wichtiges Modellsystem darstellt. In der vorliegenden Arbeit wurde auf die Kristallisation des bc1-Komplexes aus S. cerevisiae aufgebaut, die mit Hilfe monoklonaler Antikörperfragmente (Fv) gegen die Rieske-Untereinheit (ISP) erreicht wurde; die Fv-Fragmente erleichtern die Ausbildung von Kristallkontakten. Die Epitopregion des Hefeenzyms wurde genetisch auf den bakteriellen Komplex übertragen, um dessen Ko-Kristallisation mit dem bereits verfügbaren Fv zu ermöglichen. Punktuelle Anpassungen führten zu keiner signifikanten Bindung, ein weitergehender Austausch des entsprechenden ISP-Bereichs verbesserte die Bindung hingegen deutlich. Die besten Ergebnisse konnten mit chimären Enzymen erzielt werden, bei denen die gesamte ISP-Ektodomäne durch das Hefe-Homologe ersetzt wurde. Aufbauend auf dieser Arbeit scheint die Fv-vermittelte Kristallisation des Enzyms ein greifbares Ziel. Eine komplementäre Strategie zielte auf die strukturelle Charakterisierung der Rieske-Ektodomäne (ISF). Das klonierte ISF wurde in E. coli überexprimiert, lag jedoch fast vollständig in inclusion bodies vor. Das ISF konnte in eine lösliche Form rückgefaltet werden, die anschließende chemische Rekonstitution zum Holo-Protein gelang jedoch nur mit einer Ausbeute von ~ 1 %. Die geringe Menge an löslichem ISF, die sich nach Expression in E. coli isolieren lässt, trägt kein [2Fe-2S]-Zentrum. Durch Koexpression der für die Biogenese von Eisen-Schwefel-Zentren relevanten Gencluster konnte die lösliche ISF-Fraktion in vivo in die Holo-Form konvertiert werden. Auch hier war aber die Gesamtausbeute für strukturelle Untersuchungen zu gering. Eine homologe Expression in P.d. war nur für das komplette ISP nachweisbar, nicht für das verkürzte ISF. Durch gerichtete Mutagenese konnte hier erstmals gezeigt werden, dass das bakterielle Rieske-Protein über den Tat-Translokationsweg in die Membran inseriert. Die Kristallstrukturen mitochondrialer bc1-Komplexe zeigen ein dimeres Enzym. Die Assoziation des bakteriellen Komplexes wurde in dieser Arbeit mit der analytischen Ultrazentrifugation untersucht, und auch hier wurde eindeutig ein Dimer nachgewiesen. Dynamische Messverfahren deuteten jedoch auf einen höheren Assoziationszustand hin. Es bleibt unklar, ob diese Diskrepanz durch Formparameter oder die Detergenzbindung begründet ist oder ob unter bestimmten Versuchsbedingungen möglicherweise Tetramere vorliegen. In situ ist der bc1-Komplex strukturell mit den Komplexen I und IV sowie dem Elektronenüberträger Cyt c552 assoziiert. Die Analyse verschiedener Deletionsstämme zeigte, dass Komplex I der Atmungskette durch diesen Superkomplex stabilisiert wird. Dieser Befund konnte kürzlich in anderen Arbeiten auch an menschlichen Mitochondrien bestätigt werden. Neben strukturellen Aspekten wurden am bc1-Komplex auch die H+-Translokation und die Chinonbindung untersucht. Da chemische Modifikationsexperimente zeigen, dass ein saurer Rest im ISP eine kritische Rolle für die Kopplung von H+-Translokation und Elektronentransport spielt, wurden durch gerichtete Mutagenese kombinatorisch saure Reste gegen entsprechende Säureamide ersetzt. Die biochemische Charakterisierung wurde nur für eine Fünffach-Mutante durchgeführt; diese erwies sich jedoch als zu instabil, um verlässliche Daten aus H+-Pumpexperimenten zu gewinnen. Die Charakterisierung der übrigen Mutanten scheint lohnenswert, da der relevante Aminosäurerest auch in anderen Arbeiten noch nicht identifiziert werden konnte. Der Gehalt des aufgereinigten Enzyms an spezifisch gebundenem Chinon wurde FTIR-spektroskopisch quantifiziert. Eine Stöchiometrie von ~ 3 Chinonmolekülen/Monomer stützt das double occupancy-Modell, demzufolge zwei Substratmoleküle am Qo-Zentrum binden; das dritte Chinon bindet am Qi-Zentrum. Partielle Extraktion des Chinons und Messungen bei verschiedenen pH-Werten zeigten, dass die Substratbindung mit Protonierung eines sauren Rests einhergeht. Möglicherweise handelt es sich dabei um Glu295 des Cytochrom b, das auf Basis der Kristallstrukturen als primärer H+-Akzeptor am Qo-Zentrum diskutiert wird. Aufbauend auf dieser Arbeit können die an der Chinonbindung beteiligten Reste durch Mutagenese identifiziert werden.
Mitochondial NADH:ubiquinone oxidoreductase (complex I) the largest multiprotein enzyme of the respiratory chain, catalyses the transfer of two electrons from NADH to ubiquinone, coupled to the translocation of four protons across the membrane. In addition to the 14 strictly conserved central subunits it contains a variable number of accessory subunits. At present, the best characterized enzyme is complex I from bovine heart with a molecular mass of about 980 kDa and 32 accessory proteins. In this study, the subunit composition of mitochondrial complex I from the aerobic yeast Y. lipolytica has been analysed by a combination of proteomic and genomic approaches. The sequences of 37 complex I subunits were identified. The sum of their individual molecular masses (about 930 kDa) was consistent with the native molecular weight of approximately 900 kDa for Y. lipolytica complex I obtained by BN-PAGE. A genomic analysis with Y. lipolytica and other eukaryotic databases to search for homologues of complex I subunits revealed 31 conserved proteins among the examined species. A novel protein named “X” was found in purified Y. lipolytica complex I by MALDI-MS. This protein exhibits homology to the thiosulfate sulfurtransferase enzyme referred to as rhodanese. The finding of a rhodanese-like protein in isolated complex I of Y. lipolytica allows to assume a special regulatory mechanism of complex I activity through control of the status of its iron-sulfur clusters. The second part of this study was aimed at investigating the possible role of one of these extra subunits, 39 kDa (NUEM) subunit which is related to the SDRs-enzyme family. The members of this family function in different redox and isomerization reactions and contain a conserved NAD(P)H-binding site. It was proposed that the 39 kDa subunit may be involved in a biosynthetic pathway, but the role of this subunit in complex I is unknown. In contrast to the situation in N. crassa, deletion of the 39 kDa encoding gene in Y. lipolytica led to the absence of fully assembled complex I. This result might indicate a different pathway of complex I assembly in both organisms. Several site-directed mutations were generated in the nucleotide binding motif. These had either no effect on enzyme activity and NADPH binding, or prevented complex I assembly. Mutations of arginine-65 that is located at the end of the second b-strand and responsible for selective interaction with the 2’-phosphate group of NADPH retained complex I activity in mitochondrial membranes but the affinity for the cofactor was markedly decreased. Purification of complex I from mutants resulted in decrease or loss of ubiquinone reductase activity. It is very likely that replacement of R65 not only led to a decrease in affinity for NADPH but also caused instability of the enzyme due to steric changes in the 39 kDa subunit. These data indicate that NADPH bound to the 39 kDa subunit (NUEM) is not essential for complex I activity, but probably involved in complex I assembly in Y. lipolytica.
My graduate thesis is on the "Structural studies of membrane transport proteins". Transporters are membrane proteins that have multiple membrane-spanning a-helices. They are dynamic and diverse proteins, undergoing a large conformational change and transporting wide range of susbtrates. Based on their energy source they can be classified into primary and secondary transport systems. Primary transport systems are driven by the use of chemical (ATP) or light energy, while secondary transporters utilize ion gradients to transport substrates. I began my PhD dissertation on secondary transporters by two-dimensional crystallization and electron crystallographic analysis and recently my focus also has shifted towards 3D crystallization. The following projects constitute my PhD thesis: 1) 2D crystallization of MjNhaP1 and pH induced structural change: MjNhaP1, a Na+/H+ antiporter that is regulated by pH has been implicated in homeostasis of H+ and Na+ in Methanococcus jannaschii, a hyperthermophilic archaeon that grows optimally at 85°C. MjNhaP1 was cloned and expressed in E. coli. Two-dimensional crystals were obtained from purified protein at pH4. Electron cryo-microscopy yielded an 8Å projection map. The map of MjNhaP1 shows elongated densities in the centre of the dimer and a cluster of density peaks on either side of the dimer core, indicative of a bundle of 4-6 membrane-spanning helices. The effect of pH on the structure of MjNhaP1was studied in situ in 2D crystals revealing a major change in density within the helix bundle relative to the dimer interface. This change occurred at pH6 and above. The two conformations at low and high pH most likely represent the closed and open states of the antiporter, respectively. This is the first instance where a conformational change associated with the regulation of a secondary transporter appears to map structurally. Reconstruction of 3D map and high-resolution structure by x-ray crystallography would be necessary to understand the mechanism of ion transport and regulation by pH. 2) 2D crystallization of Proline transporter: Proline transporter (PutP) from E.coli belongs the sodium-solute symporter family that includes disease related sodium dependent glucose and iodide transporter in humans. Sodium and proline are co-transported with a stoichiometry of 1:1. Purified PutP was reconstituted to yield 2D crystals that were hexagonal in nature. The 2D crystals had tendency to stack indicating their willingness to form 3D crystals. A projection map of PutP from negatively stained crystals showed trimeric arrangement of protein. Other members of the SSF family have been shown to be monomers. My analysis of oligomeric state of PutP in detergent by blue native gel indicates a monomer in detergent solution. It is likely that PutP can function as a monomer but at higher concentration and in lipid bilayer it tends to form trimer. 3) Oligomeric state and crystallization of carnitine transporter from E.coli: E.coli carnitine transporter (CaiT) belongs to the BCCT (Betaine, Carnitine and Choline) superfamily that transports molecules with quaternary amine groups. CaiT is predicted to span the membrane 12 times and acts as a L-carnitine/g-butyrobetaine exchanger. Unlike other members in this transporter family, it does not require an ion gradient and does not respond to osmotic stress. Over-expression of the protein yielded ~2mg of protein/L of culture. The structure and oligomeric state of the protein were analyzed in detergent and lipid bilayers. Blue native gel electrophoresis indicated that CaiT was a trimer in detergent solution. Gel filtration and cross-linking studies further support this. Reconstitution of CaiT into lipid bilayers resulted in 2D crystals. Analysis of negatively stained 2D crystals confirmed that CaiT is a trimer in the membrane. Initial 3D crystallization trials have been successful and currently, the crystals diffract to 6Å and are being improved. 4) Monomeric porin OmpG: OmpG is a bacterial outer membrane b-barrel protein. It is monomeric and its size (33kDa) places it as a prime candidate for a structural solution, using the recently developed method of solid state NMR (work in collaboration with Prof.Hartmut Oskinat, FMP, Berlin). A long-term aim would be to study porins as templates for designing nanopores, for DNA sequencing and identification. I have expressed OmpG in inclusion bodies and refolded at an efficiency of >90% into a functional form using detergent. OmpG was then crystallized by 2D crystallization yielding an 8Å projection map whose structure was similar to native protein. In addition, these crystals were used for structure determination by solid state NMR. An initial spectrum of heavy isotopically labeled OmpG has allowed identification of specific amino acid residues including threonine and proline. Additionally, I obtained 3D crystals in detergent that diffract to 5.5Å and are being improved.
Tumorerkrankungen, insbesondere solche im metastasierenden Stadium, erfordern effiziente Therapien. Krebstherapien wie Bestrahlung oder Chemotherapie wirken über die Induktion von Apoptose. Resistenz gegen diese Behandlungsansätze geht einher mit der Blockierung relevanter apoptotischer Signalwege. Dennoch haben Tumorzellen nicht grundsätzlich die Fähigkeit verloren, apoptotischen Zelltod zu sterben, d. h. mit einem geeigneten Stimulus kann in jeder Tumorzelle Apoptose induziert werden. In dieser Arbeit wurden Proteine entwickelt, die Enzyme apoptotischer Signalkaskaden selektiv in Tumorzellen einschleusen. Um Spezifität für transformierte Zellen zu erlangen, wurden diese Proteine mit Zellbindungsdomänen gekoppelt, die an tumorassoziierte Antigene binden. Als Zielstrukturen auf der Oberfläche von Krebszellen dienten die Rezeptoren der ErbB Familie „epidermal growth factor receptor“ (EGFR) und ErbB2. Überexpression dieser Rezeptoren wird auf einer Vielzahl von Tumoren epithelialen Ursprungs beobachtet und ist ursächlich beteiligt an der malignen Transformation. Als Apoptoseinduktoren wurden die Serinprotease Granzym B (GrB) sowie das Protein „apoptosis inducing factor“ (AIF) eingesetzt. GrB induziert Apoptose durch direkte Aktivierung von Caspasen und Spaltung zentraler Caspasen-Substrate. Damit greift die Protease am unteren Effektorende apoptotischer Signalwege ein und umgeht so die meisten Resistenzmechanismen transformierter Zellen. Um GrB in Tumorzellen einzuschleusen, wurde die Protease mit dem ErbB2 spezifischen Antikörperfragment scFv(FRP5) gekoppelt. Zunächst wurde eine biotinylierte Variante der Protease (bGrB) über die hochaffine Streptavidin/ Biotin Interaktion mit einem Fusionsprotein komplexiert, das aus dem scFv(FRP5) und Streptavidin besteht (SA-5). Komplexe aus enzymatisch aktivem bGrB und SA-5 wiesen selektive cytotoxische Aktivität gegenüber ErbB2 exprimierenden Zellen auf, die allerdings von der Präsenz des endosomolytischen Reagenz Chloroquin abhing. Dies zeigt die Notwendigkeit einer Translokation vom endosomalen Kompartiment, um internalisiertem GrB Zugang zu seinen cytosolischen Substraten zu ermöglichen. Aufbauend auf diesen Ergebnissen, die grundsätzlich nachweisen, daß das Einbringen von GrB in Tumorzellen ausreichend ist, um in diesen Zellen Apoptose zu induzieren, wurden Fusionsproteine abgeleitet, in denen GrB direkt mit Zellbindungsdomänen fusioniert ist. Neben dem scFv(FRP5) wurde auch der EGFR-Ligand TGFalpha eingesetzt. Fusionsproteine bestehend aus reifem GrB und scFv(FRP5) (GrB-5) bzw. TGFalpha (GrB-T) wurden in der Hefe Pichia pastoris exprimiert und mit hohen Ausbeuten gereinigt. GrB-5 und GrB-T zeigten enzymatische Aktivität und wiesen Affinität zu ErbB2 bzw. EGFR auf. In Gegenwart von Chloroquin zeigten GrB-5 und GrB-T selektive cytotoxische Aktivität gegenüber Zellen, die den jeweiligen Zielrezeptor exprimieren. Die IC50 Werte der Proteine lagen im pico- bis nanomolaren Bereich und sind damit vergleichbar mit denen rekombinanter Immun- bzw. Wachstumsfaktortoxine, die Exotoxin A (ETA) aus Pseudomonas aeruginosa als Effektor nutzen. Induktion von Apoptose erfolgte durch GrB-5 und GrB-T allerdings deutlich schneller (3 h) als durch ETA Fusionsproteine (72 h), da GrB im Gegensatz zu ETA direkt in apoptotische Signalkaskaden eingreift. Um die weitere Charakterisierung von GrB-5 und GrB-T zu erleichtern, wurden in der vorliegenden Arbeit Möglichkeiten für eine Optimierung der Expression dieser Fusionsproteine in Hefe untersucht. Dazu wurde eine Strategie entwickelt, die auf der Beobachtung beruht, daß die Löslichkeit und Stabilität von Proteinen durch Fusion mit solchen Domänen erhöht werden kann, die selbst eine hohe Löslichkeit und Stabilität besitzen. Ein Protein mit diesen Eigenschaften ist das Maltose Bindungsprotein (MBP) aus E. coli. In dieser Arbeit wurde MBP bei der Expression rekombinanter Proteine in P. pastoris eingesetzt, um die Ausbeute löslicher Proteine zu steigern. Es wurde eine Strategie entwickelt, die es erlaubt, MBP posttranslational in vivo vom Fusionspartner zu trennen. Hierzu wurde eine Erkennungssequenz der Protease Furin (furS) zwischen MBP und Fusionspartner eingefügt. Zunächst wurde untersucht, ob GrB als MBP Fusionsprotein in enzymatisch aktiver Form exprimiert werden kann, was eine Grundvoraussetzung für die Expression tumorspezifischer GrB Fusionsproteine in diesem System darstellt. Die Ausbeute von GrB konnte durch diese Strategie erheblich gesteigert werden. Daneben war eine vollständige Prozessierung der Fusionsproteine innerhalb der Furin-Erkennungssequenz nachweisbar. Als MBP Fusionsprotein exprimiertes GrB wies allerdings keine enzymatische Aktivität auf. Weitere Untersuchungen zeigten, daß das terminale Serin der furS-Sequenz, das nach Spaltung durch Furin am N-Terminus von GrB zurückbleibt, die enzymatische Aktivität der Serinprotease inhibiert. Im Rahmen dieser Arbeit wurde daher nicht weiter versucht, die Ausbeute an tumorspezifischen GrB Fusionsproteinen durch Fusion mit löslichen Proteindomänen zu erhöhen. Für Proteine, die ein N-terminales Serin tolerieren, stellt das hier entwickelte System allerdings eine neuartige Strategie dar, um die Ausbeute in P. pastoris um ein Vielfaches zu steigern. Dies wurde anhand von rekombinantem ErbB2 als Modellprotein bestätigt. Als alternativer Effektor in tumorspezifischen Fusionsproteinen wurde AIF als caspasenunabhängig agierendes proapoptotisches Signalmolekül eingesetzt. In apoptotischen Zellen bewirkt die Freisetzung von AIF aus dem mitochondrialen Intermembranraum die nachfolgende Translokation des Proteins in den Zellkern, woraufhin DNA-Fragmentierung induziert wird. Zum Einschleusen von AIF in Tumorzellen wurde das Flavoprotein mit dem scFv(FRP5) fusioniert (5-AIF). Um eine cytosolische Translokation von AIF zu erreichen, wurde ein Konstrukt abgeleitet, das zusätzlich die Translokationsdomäne von Exotoxin A enthält (5-E-AIF). Diese Domäne ist beim Wildtyp-Toxin notwendig für dessen retrograden Transport vom Endosom über den Golgi Apparat und das ER in das Cytosol. Innerhalb der Translokationsdomäne findet zudem eine Prozessierung durch die endosomale Protease Furin statt. AIF Fusionsproteine wurden in E. coli exprimiert, gereinigt und renaturiert. Die Proteine wiesen Affinität für ErbB2 auf und interagierten mit DNA, eine Eigenschaft, die essentiell für die proapoptotische Aktivität von AIF ist. 5-E-AIF zeigte gegenüber ErbB2 exprimierenden Zellen cytotoxische Aktivität, die vergleichbar mit der des Immuntoxins scFv(FRP5)-ETA war. Diese Aktivität war allerdings nur in Gegenwart von Chloroquin gegeben. Das Protein 5-AIF, in dem die Translokationsdomäne fehlt, zeigte auch in Kombination mit Chloroquin keine Cytotoxizität. Eine mögliche Folgerung hieraus ist, daß die N-terminale Antikörperdomäne der Fusionsproteine die proapoptotische Aktivität der AIF Domäne blockiert. 5-E-A wird sehr wahrscheinlich durch die endosomale Protease Furin „aktiviert“, die den scFv(FRP5) durch proteolytische Spaltung innerhalb der ETA-Domäne entfernt haben könnte. Für die eigentliche Translokation reicht der ETA-Anteil allerdings nicht aus, wahrscheinlich, weil in dem hier abgeleiteten Konstrukt ein für die Funktionsweise des Wildtyp-Toxins essentielles ER Retentionssignal fehlte. Die Ergebnisse dieser Arbeit zeigen, daß durch Einsatz apoptotischer Signalmoleküle in tumorzellspezifischen Fusionsproteinen hohe und selektive cytotoxische Aktivitäten erzielt werden können. Eine weitere Entwicklung dieser Proteine als mögliche Tumortherapeutika erscheint daher sinnvoll.
In der vorliegenden Arbeit wurden die Strukturen der Excisionase (Xis) aus dem Bakteriophagen HK022 sowie des Proteinkomplexes zwischen Cytochrom c552 und der CuA-Domäne aus T. thermophilus mittels NMR in wässriger Lösung bestimmt. Im Falle der Excisionase wurde mit Hilfe isotopenmarkierter Proteinproben die vollständige Zuordnung der 1H-, 15N- und 13C-Resonanzen durchgeführt. Hierauf basierend wurden anhand verschiedener zwei- und dreidimensionaler NOESY Spektren insgesamt 902 Abstandsbeschränkungen identifiziert, mit deren Hilfe die räumliche Struktur des Proteins bestimmt werden konnte. Die Strukturrechnungen ergaben letztendlich ein Strukturensemble von 20 Konformeren, die aus 2 alpha-Helices und 5 beta-Faltblattsträngen aufgebaut sind. Die beta-Faltblattstränge bilden 2 antiparalelle beta-Faltblätter, während die beiden alpha-Helices eine L-Formation darstellen. Die letzten 12 Aminosäurereste am C-Terminus zeigten keine NOEs und besaßen folglich auch keine geordnete Struktur. Dennoch ist dieser C-terminale Teil der Sequenz möglicherweise von physiologischem Interesse, da für den Rest 66 eine Asn/IsoAsp- Isomerisierung beobachtet wurde, welche eine Rolle bei der Autoregulation dieses Proteins in vivo spielen könnte. Ein weiteres markantes Strukturelement der Excisionase ist das Triprolinsegment Pro32-Pro33-Pro34, das die beiden beta-Faltblätter miteinander verbindet. Diese drei Prolinreste liegen in einer cis-trans-trans Konformation vor; aufgrund von Ligandenwechselwirkungen verschiedener anderer Proteine, die ein solches Motiv besitzen, liegt die Vermutung nahe, daß diese Region in der spezifischen Protein-Protein-Interaktion, die während der exzisiven Rekombination stattfindet, eine Schlüsselrolle spielen könnte. Zur Untersuchung der Wechselwirkung von Cytochrom c552 mit der CuA-Domäne wurden beide löslichen Fragmente mit dem 15N-Isotop angereichert. Daraufhin konnten für jedes Protein heteronukleare NMR-Experimente durchgeführt werden, die eine vollständige Zuordnung der Amidresonanzen sowohl im reduzierten als auch im paramagnetischen oxidierten Zustand ermöglichte. Basierend auf diesen Resonanzzuordnungen konnten Veränderungen der chemischen Verschiebungswerte aufgrund von Oberflächenkontakten mit dem jeweiligen Redoxpartner mittels 2D [15N, 1H]-TROSY Experimenten in beiden Redoxzuständen ermittelt werden. Die betroffenen Aminosäurereste, welche an der Moleküloberfläche die Kontaktzone definieren, wurden für eine Docking-Rechnung herausgezogen, um letztendlich die räumliche Struktur des Elektronentransferkomplexes zwischen Cytochrom c552 und der ba3-Oxidase zu bestimmen. Interessanterweise traten beim Cytochrom c552 zusätzlich zu den Verschiebungseffekten auf der Moleküloberfläche im reduzierten Zustand auch noch sehr dominante Sekundäreffekte im hinteren Teil der Hämspalte an der Stelle auf, wo das Propionat A über Wasserstoffbrückenbindungen mit dem Protein verbunden ist. Analog zu dem System aus P. denitrificans befindet sich auch im Cytochrom c552 aus T. thermophilus in dieser Position ein aromatischer Ring, der vermutlich von elektronischen Veränderungen im Hämring beeinflußt wird und diese Effekte durch seinen somit veränderten Ringstrom an die unmittelbare Umgebung weitergibt. Diese experimentellen Daten unterstützen die Elektronendelokalisierungstheorie von Wikström und Mitarbeitern (Johansson et al., 2002a und b), wonach im reduzierten Häm ein Teil der Elektronenladung bis in die Peripherie des Hämrings delokalisiert ist, einschließlich der nichtkonjugierten Propionatreste. Aus vorangegangenen Studien ergab sich bereits, daß der Elektronentransferkomplex in T. thermophilus auf hydrophoben Wechselwirkungen beruht, im Gegensatz zum P. denitrificans System, in dem die Interaktion elektrostatischer Natur ist (Maneg et al., 2003). Tatsächlich weist die in dieser Arbeit bestimmte Struktur des Elektronentranferkomplexes einen hohen Anteil (ca. 40%) an unpolaren Kontaktoberflächen auf. Das Cytochrom c552 bindet dabei an die CuA-Domäne nahe dem CuA-Zentrum, so daß der Abstand zwischen den Metallzentren von Donor und Akzeptor 15,6 Å beträgt. Der Hämring des Cytochrom c552 berührt die CuA-Domäne im Bereich von Phe86 und Phe88, wie bereits von Soulimane et al. (2000) aufgrund der Sequenzhomologie mit dem P. denitrificans System postuliert worden war. Wie jedoch aus dem berechneten Elektronentransferweg hervorgeht, ist die aromatische Seitenkette des Phe88 nicht unbedingt in die Elektronenübertragung einbezogen. Der ca. 19-20 Å lange Weg des Elektrons führt wahrscheinlich vom Häm über das Proteinrückgrat der CuAReste Ala87 und Phe88 zum CuA-Zentralliganden His114 und schließlich zum binuklearen Kupferzentrum. Dies erklärt auch, wieso eine F88L Mutation der CuA-Domäne (Maneg et al., 2003) nur zu einer 50%igen Abnahme der Aktivität geführt hat. Hiermit ist nun für das T. thermophilus System der gesamte Weg der Elektronenübertragung vom Cytochrom c552 über die CuA-Domäne zur Untereinheit I der ba3-Oxidase in den Grundzügen aufgeklärt, da der Elektronentransfer vom CuA- zum CuB-Zentrum bereits zuvor beschrieben worden war (Soulimane et al., 2000).
The N-terminal domain (matrix protein or MA) of a retroviral Gag polyprotein precursor plays a critical role in several stages of the retrovirus life cycle. MA is involved in the effective membrane targeting, assembly and release of the immature viral particles from the infected cell. In order to understand the structural basis of these functions, the full length MA from Moloney Murine Leukemia Virus (MoMuLV) was purified and the solution structure of the MA MoMuLV was determined by means of heteronuclear high-resolution NMR spectroscopy and compared with that of the X-ray diffraction analysis as well as with the structures of several MA proteins from geterologous viruses. Structural features were also obtained from CD spectroscopy, dynamic light scattering, sedimentation velocity, differential scanning calorimetry and other methods. It was found that the MA MoMuLV globular core (residues 8-98) is comprised of 7 well-defined helices (five alpha-helices and two 310 helices), with the general fold typical for MA proteins from other retroviral species. The N-terminus (residues Met1-Leu7) and the C-terminal proline-rich part (residues Pro103-Tyr131) are not structured in solution. Although MA MoMuLV has a low sequence identity compared with other matrix proteins for which the three-dimensional structure is known, it was shown that its overall topology and pattern of secondary structural units is similar to other retroviral matrix proteins. The monomeric state is observed for the correctly folded MA MoMuLV in a variety of external conditions and protein concentrations, indicating that virion assembly starts with the plasma membrane targeting of the nascent Gag precursor. The denaturation of MA MoMuLV is irreversible and is connected with protein aggregation. For Moloney Murine Leukemia Virus (MoMuLV) a proteolytic processing of the R-peptide (last 16 amino acids from the C-terminus of the Envelope protein (Env)) has been described as a second mode of fusion and activation preceding the receptor contact between the viral particle and the cellular membrane. An interaction between the R-peptide and MA MoMuLV has been proposed, since the R-peptide and MA are localized at the inner part of the membrane. Therefore the interaction between 15N labelled purified MA MoMuLV and synthesized R-peptide has been investigated using high-resolution NMR. It was found that in water solution MA MoMuLV and R-peptide do not form a tight complex, but in a mature virion in the presence of membranes or other protein factors it might be possible. In the case of HIV-1 the cytoplasmic part (EnvC) of the Env protein is much longer than in other retroviruses and again as for MoMuLV little is known about the interaction between EnvC and HIV MA. Hence, the full length HIV MA, and the last 150 amino acids from HIV Env have been subcloned with suitable expression vectors, purified and analysed by native gel electrophoresis, a pull down assay and by high resolution NMR for the purpose to detect the complex formation of EnvC and HIV MA. Finally, after all those experiments, it was found that a stable complex is not formed, but a weak interaction between the two proteins can not be excluded.
In dieser Arbeit wurde der Gentransfer von Todesliganden als Ansatz zur Tumor-Gentherapie untersucht. Dazu wurde ein lentiviraler Vektor der zweiten Generationverwendet, der die Todesliganden CD95L oder TRAIL sowie das Markergen EGFP exprimiert. Dies ist die erste Beschreibung von CD95L- oder TRAILexprimierenden lentiviralen Vektoren. Der TRAIL-exprimierende Vektor erwies sich als geeignet für die therapeutische Induktion von Apoptose in humanen Tumorzelllinien auch bei geringen Vektordosen. Die Transduktion mit diesem Vektor bei niedriger MOI führte zu Todesrezeptor-spezifischer Induktion von Apoptose. Diese wurde ausschließlich durch membranständiges TRAIL bei Zell-Zell-Kontakt vermittelt. Die transduzierten Zellen waren zudem in der Lage, bei Kontakt mit nichttransduzierten Zellen in diesen Apoptose auszulösen. Durch den TRAIL-Gentransfer wurde jedoch spezifisch in den transduzierten Zellen Resistenz gegen TRAIL-induzierte Apoptose ausgelöst, während die CD95- oder Cisplatin-induzierte Apoptose nicht beeinflusst war. Dies führte zum Auswachsen einer vollständig TRAIL-resistenten Population. Bereits 72 Stunden nach Transduktion konnten Anzeichen der Resistenz detektiert werden. Der Grund für diese Resistenzinduktion lag in einer spezifischen Blockade der DISC-Bildung und Caspase-8-Aktivierung durch die TRAIL-Todesrezeptoren. Die Signaltransduktion durch den sehr ähnlichen CD95-Signalweg war gänzlich unbeeinflusst. Durchflusszytometrische und proteinbiochemische Untersuchungen der Expression von TRAIL-R1 und TRAIL-R2, sowie die Untersuchung der mRNA-Expression dieser Rezeptoren ergaben, dass beide TRAIL-Todesrezeptoren noch synthetisiert, jedoch intrazellulär zurückgehalten wurden. In fluoreszenzmikroskopischen Versuchen konnte gezeigt werden, dass TRAIL-R2 intrazellulär in einem Komplex mit TRAIL vorlag, der sich im Bereich des ER/Golgi-Apparates befand. Diese Ergebnisse belegen, dass intrazelluläre Interaktion von TRAIL mit seinen Rezeptoren zur Retention dieser Proteine in der Zelle und damit zur Resistenzentwicklung führte. Bei Versuchen zur in vivo-Gentherapie durch lentivirale TRAIL-Expression in humanen Tumortransplantaten auf Nacktmäusen wurde nur ein transienter Effekt erzielt. Es konnte gezeigt werden, dass mit Vektorpartikeln assoziiertes TRAIL-Protein in den Tumoren Apoptose auslöste. Diese Induktion von Apoptose führte zu einer Wachstumsverzögerung. Dadurch wurde jedoch gleichzeitig eine effiziente Transduktion der Tumorzellen mit dem TRAIL-exprimierenden Vektor und ein langfristiger Effekt der TRAIL-Expression verhindert. Diese Ergebnisse zeigen, dass lentiviraler Gentransfer mit konstitutiv TRAIL-exprimierenden Vektoren ungeeignet zur in vivo-Transduktion von Tumoren ist. Gleichzeitig belegen die Ergebnisse der Transduktion mit einem Kontrollkonstrukt einen effizienten Gentransfer. Der hier charakterisierte Resistenzmechanismus ist zuvor nicht beschrieben worden und stellt eine neuartige Form der Therapie-induzierten Resistenz dar. Die proapoptotische Gentherapie durch konstitutive TRAIL-Expression in Tumoren muss nach diesen Ergebnissen neu bewertet werden. Der lentivirale Gentransfer in Tumore in vivo läuft prinzipiell effizient ab. Bei Verwendung eines regulierbaren Expressionssystems und in Kombination mit Suizidgenen könnte eine therapeutische Nutzung des lentiviralen TRAIL-Gentransfers möglich sein.
Heterologe Expression des humanen ß-2-adrenergen Rezeptors in Semliki-Forest-Virus-Expressionssystem
(2005)
Der humane ß2-adrenerge Rezeptor besitzt sieben Transmembrandomänen und gehört zur Superfamilie der G-Protein gekoppelten Rezeptoren (GPCRs). Der Rezeptor ist an der Zelloberfläche lokalisiert und kann nach Bindung extrazellulärer Signalstoffe intrazelluläre Antworten auslösen. Als physiologische Liganden des ß2-adrenergen Rezeptors dienen hauptsächlich die Katecholamine wie Noradrenalin. Nach der Bindung des Liganden kann der Rezeptor an ein stimulatorisches G-Protein (Gs) koppeln und durch Aktivierung der Adenylatzyklase die intrazelluläre cAMP-Konzentration regulieren. Aufgrund der großen pharmakologischen Bedeutung von GPCRs ist es wichtig, die dreidimensionale Struktur dieser Rezeptoren aufzuklären. Da die GPCRs im nativen Gewebe nur in geringen Mengen vorkommen, müssen sie heterolog überproduziert und zur Strukturaufklärung gereinigt werden. In dieser Arbeit wurde das Semliki Forest Virus (SFV)-Expressionssystem zur Produktion des ß2-adrenergen Rezeptors etabliert und optimiert. Die Optimierung des SFV-Expressionssystems erfolgte zunächst bei der Produktion von rekombinanten Viren. Die in vitro Transkriptionsreaktion wurde zur Verbesserung der RNA-Ausbeute untersucht. Anschließend wurde eine optimale Bedingung für die Elektroporation gefunden. Dabei konnte einen Virustiter von 7,5 × 108 infektiöse Partikel pro ml erreicht werden. Zur Produktion des Rezeptors in Säugerzellen wurden sieben rekombinante Viren hergestellt. Verschiedene N- und C-terminale Fusionen wurden im Hinblick auf einen möglichen Einfluss auf die Rezeptorproduktion untersucht. Für das Gen des Kapsid-Proteins (CAP) des Semliki-Forest-Virusgenoms konnte eine deutliche Steigerung der Rezeptorproduktion gefunden werden. Auch die Kozak-Sequenz und das Hämagglutinin (HA)-Signal-Peptid zeigten einen positiven Einfluss auf die Rezeptorproduktion. Die heterologe Proteinexpression wurde in verschiedenen Zelllinien durchgeführt. Es zeigte sich, daß die BHK-21-Zellen für die Produktion in großen Mengen am besten geeignet sind. Die Expressionsrate des Rezeptors in BHK-21-Zellen stieg mit zunehmender Infektionsmultiplizität (MOI). Durch Zugabe von Liganden Alprenolol ins Kulturmedium konnte eine weitere signifikante Steigerung von Rezeptorproduktion erzielt werden. So konnte in adhärenten BHK-21-Zellen 20 Stunden nach der Infektion bei einer MOI von 150 und 2 µM Alprenolol im Medium eine Produktionsrate von 49,6 pmol Rezeptor pro mg Membranprotein erreicht werden. In Suspensionskultur konnte eine Produktionsrate von 36,0 pmol Rezeptor pro mg Membranprotein erreicht werden. Damit konnten 0,2 mg Rezeptoren aus 1 Liter Suspensionskultur produziert werden. Die Rezeptorproduktion in Suspensionskultur könnte jedoch weiter verbessert werden. Mit Immunogoldmarkierung konnte eine überwiegende Lokalisation des Rezeptors im endoplasmatischen Retikulum festgestellt werden. Ein N-Glykosylierung des Rezeptors konnte nachgewiesen werden. Die Glykosylierung gehört zum mannosereichen Typ. Für den Rezeptor wurde eine Dissoziationskonstante von 2,7 nM konnte für Liganden [3H]-CGP-12177 bestimmt. Durch Messung der intrazellulären cAMP-Konzentration wurde die vollständige Funktionalität des rekombinanten Rezeptors nachgewiesen. Für die Membranpräparation wurde ein Protokoll erarbeitet, womit ca. 120 mg Membranprotein aus 1 Liter Zellkultur gewonnen werden konnten. Bei der anschließenden Solubilisierung des Rezeptors mit 1,5 % n-Dodecyl-ß-D-maltosid bei pH 7,4 und 100 mM NaCl konnte eine Ausbeute von ca. 100% erreicht werden. In dieser Arbeit konnte nach verschiedenen Versuchen gezeigt werden, daß eine Reinigung über Immobilisierte Metallchelat-Affinitätschromatographie (IMAC) in einem einzigen Schritt nicht möglich war.
Sodium proton antiporters are ubiquitous membrane proteins found in the cytoplasmic and organelle membranes of cells of many different origins, including plants, animals and microorganisms. They are involved in cell energetics, and play primary roles in the homeostasis of intracellular pH, cellular Na+ content and cell volume. Adaptation to high salinity and/or extreme pH in plants and bacteria or in human heart muscles requires the action of such Na+/H+ antiporters. NhaA is the essential Na+/H+ antiporter for pH and Na+ homeostasis (at alkaline pH) in Escherichia coli and many other enterobacteria. NhaA is an electrogenic Na+/H+ antiporter that exchanges 2H+ for 1Na+ (or Li+). NhaA shares with many other prokaryotic and eukaryotic antiporters a very strong dependence on pH. In order to achieve three-dimensional structure of NhaA, the previously described NhaA protein preparation was modified: (i) the wild type bacterial strain (TA16) used for homologous over-expression of NhaA was replaced with a delta nhaA strain (RK20). As a result, the purity and homogeneity of the sample was significantly improved; (ii) the previously two-step purification procedure was shortened to a single step affinity chromatography purification; (iii) a wide-range screening of crystallisation conditions, more than 20,000, was performed; (iv) a Seleno-L-methionine (SeMet) NhaA derivative was produced in order to solve the phases during structure determination. In parallel, attempts of production and crystallisation of co-complexes composed of NhaA and antibody fragments have been made. Four different monoclonal antibodies were available against NhaA. Selected antibody fragments were produced and the stability of the complex analysed. Here, the crystal structure of the pH down-regulated secondary transporter NhaA of Escherichia coli is presented at 3.45 Å resolution. A negatively charged ion funnel opens to the cytoplasm and ends in the middle of the membrane at the putative ion-binding site. There, a unique assembly of two pairs of short helices connected by crossed, extended chains creates a balanced electrostatic environment. A possible mechanism is proposed: the binding of charged substrates causes electric imbalance inducing movements, which allow for a rapid alternating access mechanism. This ion exchange machinery is regulated by a conformational change elicited by a pH signal perceived at the cytoplasmic funnel entry. The structure represents a novel fold that provides two major insights: it reveals the structural basis for the mechanism of Na+/H+ exchange and its unique regulation by pH in NhaA and in many other similar antiporters. Furthermore, it is also important for the understanding of the architecture of membrane proteins in general. However, although many aspects of the ion-translocation mechanism and pH regulation are clarified by the NhaA structure, higher resolution structures with Li+ or Na+ bound are required for understanding the ligand binding and the translocation mechanism at the atomic level. The alkaline pH-induced conformation is essential to further understand the pH-control and proton access to the binding site.
The Na+/proline transporter of E. Coli (PutP) is responsible for the uptake of proline which is subsequently used not only as a carbon and nitrogen source and a constituent of proteins but also as a particularly effective osmoprotectant. However, for a long time there was little known about the single steps in the reaction cycle of this transporter and only few details about its structure-function relationship are available. Aim of the present work was to achieve a deeper understanding about the kinetic properties of the Na+/proline transporter and to get insights into the structure-function relationship of the substrate binding. To answer these questions different techniques were used. By using the novel SSM technique combining the preparation of PutP proteoliposomes it was possible to demonstrate for the first time the electrogenic substrate binding to PutP transporter. Due to rapid solution exchange measurements on the SSM it was additionally possible to obtain time resolved information about the kinetic details of the cytoplasmic substrate binding sites which were not available by previous steady state and equilibrium binding measurements. Pre-steady-state charge translocation was observed after rapid addition of one or both of the cosubstrates Na+ and/or proline to the PutP-WT proteoliposomes adsorbed on the SSM. Thereby it was possible to link the observed electrical signals with the binding activity of PutP. The observed Na+ and/or proline induced charge displacement were assigned to an electrogenic Na+ and/or proline binding process at the cytoplasmic face of the enzyme with a rate constant of k > 50 s-1 proceeding the rate limiting step of the reaction cycle. Furthermore, based on the kinetic analysis of the electrical signals obtained from the measurements of PutP on SSM, the following characteristics of the substrates binding in PutP were deduced: (1) both Na+ and proline can bind individually to the transporter. Under physiological conditions, an ordered binding mechanism prevails; while at sufficiently high concentrations, each substrate can bind in the absence of the other; (2) substrate binding is electrogenic not only for Na+, but also for the uncharged cosubstrate proline. The charge displacement associated with Na+ binding and proline binding is of comparable size and independent of the presence of the respective cosubstrate. In addition, it was concluded that Na+ accesses its binding site through a high-field access channel resulting in a charge translocation, whereas the binding of the electroneutral proline induces a conformation alteration involving the displacement of charged amino acid residue(s) of the protein; (3) Na+ and proline binding sites interact cooperatively with each other by increasing the affinity and/or the speed of binding of the respective cosubstrate; (4) proline binding proceeds in a two step process: low affinity (~ 0.9 mM) electroneutral substrate binding followed by a nearly irreversible electrogenic conformational transition; (5) membrane impermeable PCMBS inhibits both Na+ and proline binding to the inside-out orientated PutP transporter, indicating that rather than selectively blocking a specific binding site, PCMBS probably locks the enzyme in an inactive state. The possible targets for this SH-reagent are cysteines 281 and 344 located close to the cytoplasmic surface of the protein. Beyond it, transient electrical currents of PutP were also observed on the BLM after rapid addition of proline in the presence of Na+. This was possible by combining the conventional BLM technique with high-speed flash-photolysis of caged-proline. Indeed the signals on the BLM indicate the detection of a different underlying reaction process in comparison to the data achieved by the SSM technique. This has paved the way for supplemental information about the reaction cycle since it was possible to assign the flash-photolysis BLM signals to the proline binding step followed by the internalization of Na+ and proline into the liposome. Thereby it was found, that the presence of Na+ is indispensable and the time constant for the process is ~ 63 ms. Moreover, structure-function information about the Na+ and proline binding sites of PutP was obtained by investigating the functionally important amino acid residues Asp55, Gly63 and Asp187 with site-directed mutagenesis and the combined SSM technique. One finding is that the mutated proteins PutP-D55C and PutP-G63C showed no activity on the SSM. Therefore, it can be assumed that either both Asp55 and Gly63 are crucial for the structure of PutP protein, or they are located at or close to the Na+ and proline binding sites. Furthermore, the results obtained from PutP-D187N and PutP-D187C mutants on SSM suggest that Asp187 of PutP is likely to be involved in the Na+ binding at the cytoplasmic side of the backward running carrier. Taken together the results of the present work have substantially broadened the known picture of the Na+/proline transporter PutP thereby several steps of the reaction cycle were elucidated, and moreover, valuable insights into the structure-function relationship of the transporter have become available.
The technique of site-specific fluorescence labelling with Tetramethylrhodaminemaleimide (TMRM) in combination with two electrode voltage-clamp technique (TEVC), an approach that has been named voltage clamp fluorometry (VCF), has been used in this work to study the Na,K-ATPase. The TMRM dye has the ability to attach covalently to cysteine residues and it responds to changes in the hydrophobicity of its local environment. We exploited this property using a construct of the Na-pump in which the native, extracellularly accessible cysteines were removed and cysteine residues were introduced by site-directed mutagenesis in specific positions of the Na-pump. In this way it was possible to detect site-specific conformational rearrangements of the Na-pump in a time-resolved fashion within a native membrane environment. In particular this technique allows to resolve reactions with low electrogenicity that cannot be satisfactorily analyzed with purely electrophysiological techniques and to identify the conformations of the enzyme under specific ionic composition of the measuring buffers. We used VCF to study the influence that several cations like Na+, K+, NMG+, TEA+ and BTEA+ exert on the distribution of the Na,K-ATPase between several enzymatic intermediates and on some of the reactions related to cation transport. To this end we utilized the mutants N790C in the loop M5-M6 and the mutant E307C, T309C, L311C and E312C in the loop M3-M4. From the correspondence of the fluorescence changes with the activation and inhibition of pumping current, by K+ and ouabain respectively, and from the fact that in Na+/Na+ exchange conditions the voltage distribution of charge movement and fluorescence changes evoked by voltage jumps are in reasonable agreement we conclude that through the fluorescence signals measured from these mutants, we can indeed monitor conformational changes linked to transport activity of the enzyme. For the mutants N790 and L311, it was found that the Na+ dependence of the amplitude and kinetics of the fluorescence signal associated with the E1P-E2P transition is in agreement with the prediction of an access channel model describing the regulation of the access of extracellular Na+ to its binding site. In particular for the mutants E307 and T309 it was found that in Na+/Na+ exchange conditions, the conformational change tracked by the fluorescence was much slower than the charge relaxation at hyperpolarized potentials while the kinetics was very similar at depolarized potentials. This implies that at hyperpolarized potentials the conformational change connected to the E1P-E2P transition does not give a large contribution to the electrogenicity of the process which is also consistent with the access channel model. On the mutant N790C it was found that the external pH does not seem to have any effect on the E1P-E2P equilibrium even if it seems to modulate the fluorescence quantum yield of the dye. Fluorescence quenching experiments with iodide and D2O indicate that at hyperpolarized potentials the local environment of the mutant N790C, experiences a small change in the accessibility to water without major changes in the local electrostatic field ...
The mitochondrial respiratory chain consists of NADH:ubiquinone oxidoreductase (Complex-I), succinate:ubiquinone reductase (Complex-II), ubiquinol:cytochrome c reductase (Complex-III), cytochrome c oxidase (Complex-IV) and cytochrome c as an electron mediator between Complex-III and Complex-IV. Paracoccus denitrificans membranes were used as a model system for the association of the mitochondrial respiratory chain. More than 50 years ago, a model was given for a supercomplex assembly formed by stable associations between these complexes. This model gradually shifted by the model of random diffusion given by Hackenbrock et al. 1986 Different independent approaches were used to further analyze this situation in a native membrane environment, thus avoiding any perturbation caused by detergent solubilization: (a) measuring the distance and orientation of the different complexes by multi-frequency EPR Spectroscopy we started to analyze simple system, the interaction between CuA fragment derived from P. denitrificans and various c type cytochrome by Pulsed X band and G band (180 GHz) EPR. Partner proteins for the CuA (excess negative surface charge) were (i) horse heart cytochrome c which contain a large number of positive charges in heme crevice,(ii) the cytochrome c552 soluble fragment (physiological electron donor and have positive charges), and as a control (iii) the cytochrome c1 soluble fragment (negative surface potential, derived from bc1 complex) The measurements were performed at several magnetic field positions varying temperature between 5 to 30 K. Both the X band and the high-field measurements show the existence of a strong relaxation enhancement of the CuA by the specific binding of the P. denitrificans cytochrome c552 and horse heart cytochrome c. This relaxation enhancement is dependent on temperature and provides information about the distance and relative orientation of the two interacting spins within this protein-protein complex. (b) For quantitative information about lateral diffusion of cytochrome c oxidase in the native membrane Fluorescence Correlation Spectroscopy (FCS) was used. In this experiment, diffusion coefficients for oxidase differ in the case of supercomplex for wild type membrane and for two deletion mutants lacking either Complex-I or Complex-III. (c) The optical absorption spectroscopy at microsecond level resolution was tried for the translational mobility of oxidase in membrane vesicles. Due to the presence of different hemes in the native membrane, carbon monoxide (CO) used as a probe for the experiment. The optimization of the experimental conditions were carried out to get the optimal signal.
In dieser Arbeit wurde das Proteom synaptischer Vesikel mit Hilfe vier verschiedener elektrophoretischer Techniken in Kombination mit Massenspektrometrie eingehend charakterisiert. Die bisherigen Proteomansätze resultierten in der Identifizierung einer deutlich geringeren Anzahl von Proteinen. Bis auf wenige Ausnahmen wurden alle in der Literatur beschriebenen Proteine detektiert. Dies zeigt, daß die Verwendung der eingesetzten Techniken die umfassende Charakterisierung der Proteinbestandteile der Vesikel zuläßt. Ferner kann aus den Analysen geschlossen werden, daß zum jetzigen Zeitpunkt die technischen Grenzen für die Charakterisierung nicht weiter subfraktionierter synaptischer Vesikel erreicht sind. Die Anwendung der drei Techniken legt nahe, daß jede Technik ihre Vor- und Nachteile für die Identifizierung bestimmer Proteinklassen besitzt. Dies wurde bisher noch nicht in dieser Form gezeigt und liefert wertvolle Informationen für weitere Proteomanalysen. Zu den in der Summe 238 identifizierten Proteinen gehören neun Proteine, für die weder Lokalisations- noch Funktionsdaten vorliegen. Die zwei ausgewählten Proteine Svap30 und SV35 zeigen eine gliale bzw. neuronale Verteilung. SV35 befindet sich in Subpopulationen von Neuronen, die nach immunhistochemischer Untersuchung als GABAerg und glutamaterg zu werten sind. Welche Funktion dieses Protein in diesen Neuronen ausübt, bleibt zu klären. Analysen mittels RNA-Intereferenz in PC12-Zellen und Untersuchungen zur Änderung der catecholaminergen Transmitterausschüttung könnten erste Indizien liefern. Zudem könnte über Transfektion des Proteins in Oozyten die Identität des putativ transportierten Substrates bestimmt werden. All diese Arbeiten werden in Zukunft zu einer eingehenden Charakterisierung des Proteins beitragen.
Natrium/Protonen-Austauscher sind integrale Proteine biologischer Membranen und aufgrund ihrer funktionalen Abhängigkeit von einem elektrochemischen Gradienten der Klasse der Sekundärtransporter zugeordnet. Sie spielen eine essentielle Rolle sowohl in der Adaption von Bakterien an eine saline, alkalische Umgebung, als auch in der Regulation des intrazellulären pH- und Natriumhaushalts in Eukaryonten. Aufgrund der medizinischen Relevanz, unter anderem im Rahmen in der Behandlung des Herzinfarkts, besteht großes Interesse an der Struktur und den biochemischen Charakteristika des im Menschen ubiquitär vorkommenden Natrium/Protonen-Austauschers NHE1. Die heterologe und funktional aktive Produktion eukaryontischer Membranproteine stellt jedoch immer noch eine enorme Herausforderung dar, bei der sich das auf dem Semliki Forest Virus basierende Expressionssystem als gut geeignet erwiesen hat. Da die Überexpression von NHE1 mittels verschiedener eukaryontischer Expressionssysteme bisher kein kristallisationsfähiges Material liefern konnte, sollte in dieser Arbeit die heterologe Gewinnung von NHE1 mit dem Semliki Forest Virus Expressionssystem ermöglicht werden. Das Semliki Forest Virus Expressionssystem wurde auf Basis eines Vektorkonstrukts mit GFP zur späteren Übertragung der Parameter auf die Produktion von NHE1 etabliert. Konstrukte von NHE1 mit N- und C-terminalem Affinitäts-Tag wurden erfolgreich kloniert und zur Infektion von BHK-21 Zellkulturen eingesetzt. Dabei konnte beobachtet werden, dass der N-Terminus abgespalten wird und wahrscheinlich als Signalpeptid zum Einbau in die Membran dient. Das Protein wurde im Endoplasmatischen Retikulum lokalisiert, wo die Glykosylierung zum Transport in die Plasmamembran unterbleibt, was auf eine Interferenz mit der Virusinfektion zurückgeführt wurde. Eine Infektion der Zellen mit dem Semliki Forest Virus hat neben einem bereits bekannten massiven Anstieg des intrazellulären Natriumgehalts eine starke Alkalinisierung des Zytoplasma zur Folge. Ähnliches ist bisher über die Infektion von Zellen mit dem Poliovirus bekannt und stellt dort ein Schlüsselelement in der Sicherstellung der viralen Replikation dar, was auch für das Semliki Forest Virus zu gelten scheint. Die Expression von NHE1 konnte im 8 Liter-Maßstab optimiert und sowohl die Präparation als auch die Solubilisierung mit verschiedenen Detergenzien erfolgreich eingeführt werden. NHE1 erfährt jedoch bereits in vivo einen erheblichen proteolytischen Abbau, der sich während der Membranpräparation und Aufreinigung fortsetzt und zu einer Fragmentierung führt, die trotz des Einsatzes unterschiedlicher Kultivierungszeiten, Detergenzien, Additive oder Proteaseinhibitoren in vivo als auch in vitro nicht in einem Maße reduziert werden konnte, welches zur Gewinnung von kristallisationsfähigem Material erforderlich gewesen wäre. Es muss empfohlen werden einen in vivo Ansatz zu etablieren, um die proteolytische Degradation zu unterdrücken. Da die Virusreplikation nicht erforderlich ist, wäre Bafilomycin als Inhibitor der V-Typ ATPase geeignet, um die intrazelluläre Alkalinisierung und somit wahrscheinlich den Abbau von NHE1 zu verhindern. Ebenso erscheint der Einsatz von MG-132 zur spezifischen Inhibierung des Proteasoms Erfolg versprechend, was aber wegen hoher Kosten praktisch kaum in Frage kommt. Da man trotz individuell gelagerter Unterschiede zwischen den einzelnen Natrium/Protonen-Austauschern von einem ähnlichen Prinzip in Regulation und Transport ausgeht, wurden Strukturuntersuchungen mit Hilfe der Kryo-Elektronenmikroskopie am bakteriellen Natrium/Protonen-Antiporter NhaA aus Escherichia coli durchgeführt, um die strukturelle Basis der pH-Wahrnehmung und die Translokation von Natrium in das Periplasma besser zu verstehen. Die vorliegende Röntgen- und EM-Struktur repräsentieren den inaktiven Zustand, weshalb der eigentliche Ablauf des Transportvorgangs bisher biochemisch herzuleiten war, da bislang keine Kristalle im aktiven Zustand gezüchtet werden konnten. Durch die in situ Inkubation von 2D-Kristallen konnten aktive Zustände des Proteins direkt auf dem EM-Netz induziert und kryo-elektronenmikroskopisch festgehalten werden. Einzelne Datensätzen wiesen Reflexe bis zu 5 Å auf. Aus den angefertigten Projektionsdichte- und Differenzkarten ergaben sich pH- und Natrium-abhängige Konformationsänderungen. Die Röntgenstruktur wurde mit Hilfe des Molekularen Ersatzes in die EM-Struktur eingepasst und diente der Zuordnung und Interpretation der beobachteten Zustände als Basis. Die pH-abhängige Konformationsänderung wurde einem mit der funktional wichtigen Helix 9 assoziierten Bereich zugeordnet, welcher durch die Röntgenstruktur nicht definiert ist und wahrscheinlich die fehlenden Aminosäuren des regulatorisch relevanten N-Terminus enthält. Die beobachtete Konformationsänderung stellt das Entstehen einer besser geordneten Struktur dar und geht mit der pH-regulierten Aktivierung von NhaA zwischen pH 6 und 7 einher, weshalb dieser Bereich des Proteins zumindest als Bestandteil des sogenannten pH-Sensors betrachtet werden kann. Nach der vollständigen Aktivierung durch den pH-Wert, welche der folgenden Natrium-abhängigen Konformationsänderung vorauslaufen muss, konnte beobachtet werden, dass die Präsenz von Natrium im Rahmen der Ionentranslokation eine Bewegung des periplasmatischen Teils von Helix 4 induziert. Es wäre interessant, eine tiefergehende und genauere Charakterisierung der beobachteten Konformationsänderungen durch die Erstellung einer dreidimensionalen EM-Dichtekarte zu ermöglichen. Des Weiteren hat die eingehendere Untersuchung des röntgenkristallographischen Monomers nach der Einpassung in das physiologisch vorliegende Dimer der EM-Struktur sowohl eine für Membranproteine neuartige „Joint β-Sheet“ Dimerisierungsdomäne im Periplasma, als auch eine Verzahnung von Helix 7 und 9 an der Monomer-Monomer-Grenze aufgezeigt. Diesen Charakteristika kommt wahrscheinlich eine tragende Rolle in der Dimerisierung von NhaA zu, was durch weitere Untersuchungen im Rahmen einer Mutagenesestudie unter Einbeziehung der periplasmatischen β-Haarnadelstrukturen überprüft werden sollte.
The multidrug resistance like protein 1 (Mdl1p) belongs to the class of ATP binding cassette (ABC) transporters which comprise a large family of membrane proteins utilising ATP hydrolysis to drive up-hill transport of a wide variety of solutes across membranes. Mdl1p is a mitochondrial ABC transporter involved in the export of protein fragments derived from the proteolysis of non-assembled inner membrane proteins out of the mitochondrial matrix. Mdl1p forms a homodimeric complex consisting of two polytrophic transmembrane domains (TMDs) and two nucleotide binding domains (NBDs). The transport function and structural organisation of Mdl1p have not been elucidated yet. To characterise the ATP hydrolysis cycle of Mdl1p, the His-tagged NBD (amino acids D423-R695) was over-expressed in Escherichia coli and purified to homogeneity. The isolated NBD was active in ATP binding and hydrolysis. The ATPase activity was non-linear regarding to the protein concentration, indicating that the functional state is a dimer. Dimeric catalytic transition states could be trapped and three different intermediate states were isolated, containing two ATPs, one ATP and one ADP, or two DPs, which are trapped by orthovanadate or beryllium fluoride. These experiments showed that (i) ATP binding to the NBDs induces dimerisation, (ii) in all isolated dimeric states, two nucleotides are present, (iii) phosphate can dissociate from the dimer, (iv) both nucleotides are hydrolysed, and (v) hydrolysis occurs in a sequential mode. Studies in the workgroup systematically screened for over-expression of the full-length Mdl1p and expression conditions were optimised. These studies showed that highest expression was obtained in S. cerevisiae, where the protein was over-expressed 100-fold. In this work over-expressed His-tagged protein was purified via immobilised metal-ion affinity chromatography that was active in ATP binding and hydrolysis with a turn-over of 2.5 ATP per second. N-terminal amino acid sequencing of purified Mdl1p by Edman degradation confirmed experimentally a N-terminal targeting sequence of a mitochondrial ABC transporter of S. cerevisiae for the first time. This sequence was determined to be 59 amino acids in length. Mdl1p was reconstituted into liposomes, which was confirmed by freeze fracture electron microscopy. The reconstituted protein showed ATP hydrolysis similar to the solubilised Mdl1p. However peptide translocation with radiolabelled X(8) or X(23) libraries as done for the transporter associated with antigen processing TAP could not be shown with this setup. Furthermore, structural insights of the mitochondrial transport complex and its oligomeric state were obtained via single particle electron microscopy. It was shown that Mdl1p forms a homodimer in detergent. These in vitro studies provide the basis for further detailed investigation of the mitochondrial ABC transporter Mdl1p.
P2X receptors are ligand (ATP)-gated ion channels that open an intrinsic cation permeable pathway in response to extracellular ATP released from both neuronal and non-neuronal cells. P2X receptors are abundantly distributed and mediate a wide variety of physiological functions, ranging from fast synaptic transmission in the central, peripheral, and enteric nervous system, to proinflammatory cytokine release from immune cells. The primary aim of this work was to elucidate the pathway that leads to the finally assembled trimeric P2X receptors, including the assessment of a possible role of ER chaperones and folding factors in this process. Additionally, the study was conducted to investigate the various ER quality control processes involved in the selection of “properly folded and assembled” P2X receptors that are suitable for the surface expression.
Das Genom des anaeroben ε-Proteobakteriums Wolinella succinogenes codiert überraschenderweise für Enzymkomplexe, die typisch für die aerobe Atmung sind. Die entsprechenden Gene werd en unter bekannten Wachstumsbedingungen nicht
exprimiert. Darunter findet sich ein Operon ( sdhABE) für eine putative „Succinat-Dehydrogenase“, die hohe Sequenzhomol ogien zu sog. „nicht-klassischen“ archaealen Succinat-Dehydrogenasen zeigt. In der vorliegenden Arbeit sollte die „Succinat-Dehydro genase“ mit Hilfe des etablierten genetischen Systems zur Modifikation und Produktion der Chinol:Fumarat-Reduktase(QFR) homolog in W. succinogenes produziert und charakterisiert werden. Das genetische System besteht aus der QFR- Deletions-mutante ΔfrdCAB und dem Vektor pFrdcat2, der aufgrund seiner zentralen Bedeutung im Rahmen dieser Arbeit sequenziert wurde.
In der vorliegenden Arbeit wurden festkörperunterstützte Membranen in Verbindung mit schnellen Lösungswechseln als Methode zur Messung von elektrogenen Transportvorgängen in biologischen Membranen untersucht und charakterisiert. Parallel zu einem manuellen Messsystem wurde eine Technologie auf der Basis eines Pipettierroboters mitentwickelt und charakterisiert, die es erlaubt, automatisierte Messungen mit erhöhtem Durchsatz durchzuführen. Die Sensoren wurden als Sensorarray auf der Basis einer standardisierten 96er Mikrotiterplatte realisiert. Zur Lösungshantierung kam ein Pipettierroboter zum Einsatz, der mit einer selbstentwickelten Injektionseinheit bestückt wurde. In dieser Injektionseinheit ließen sich die verwendeten Lösungen überschichten, wodurch ein Lösungswechsel von einer substratfreien zu einer substrathaltigen Lösung durchgeführt werden konnte. Mit dem beschriebenen System konnten die in dieser Arbeit behandeleten Proteine EAAC1 und NhaA erfolgreich aktiviert und charakterisiert werden. Hinsichtlich der Transportaktivität wurden mit beiden Proteinen vergleichbare Ergebnisse erzielt wie mit dem manuellen Messsystem. Aus kultivierten CHO-Zellen, die den neuronalen Glutamattransporter EAAC1 rekombinant und fuktional exprimierten, wurden EAAC1-haltigen Cytoplasmamembranen in einem Aufreinigungsschritt (Membranpräparation) gewonnen. Die derart vorliegenden Membranfragmente konnten erfolgreich auf der festkörperunterstützten Membran angelagert werden. In der Abwesenheit von Natriumionen war der EAAC1 nicht aktiv, und er konnte durch den spezifischen kompetitiven Inhibitor TBOA inhibiert werden (Inhibitionskonstante Ki = 1µM). Es wurde beobachtet, dass die Transportströme des EAAC1 in der Abwesenheit von Kaliumionen eine andere Kinetik aufwiesen als in der Anwesenheit von Kaliumionen, und die Affinität für L-Glutamat war in der Abwesenheit von Kaliumionen verringert (K0,5 = 144 µM). Analysen der Signalformen ergaben eine reduzierte Relokationsrate, wobei es wahrscheinlich ist, dass der EAAC1 ohne Kaliumionen einen Single-Turnover durchführt. Eine weitere Eigenschaft des EAAC1 ist die Fähigkeit, bestimmte Anionen zu leiten. Diese Anionenleitfähigkeit ist strikt Natriumabhängig und wird durch die Bindung von L-Glutamat getriggert. Wenn bei einem Experiment zusätzlich bestimmte Anionen (z.B. Chlorid oder Thiocyanat) anwesend waren, wies der Transportstrom des EAAC1 in der Abwesenheit von Kaliumionen eine negative Komponente auf. Diese Komponente konnte auf den Einstrom der Anionen entlang des durch den Glutamattransport aufgebauten elektrischen Gradienten zurückgeführt werden. Des Weiteren konnte die Anionenleitfähigkeit mit Anionensprüngen in der Anwesenheit von L-Glutamat und Natriumionen direkt induziert werden. Damit wurden erstmals kanalartige Ionenströme an der festkörperunterstützten Membran nachgewiesen. Der Anionenstrom wies dabei die gleiche Abhängigkeit von der Glutamatkonzentration auf (K0,5 = 31 µM) wie der Transportstrom. Der Übergang in den leitfähigen Zustand und der Transport hängt demnach von dem gleichen L-glutamatgebundenen Zustand des EAAC1 ab. Dies konnte auch unter Verwendung des Inhibitors HIP-B gezeigt werden. HIP-B wurde erstmals an EAAC1 getestet und wies eine Inhibitionswirkung auf den Transportstrom auf, die nicht auf eine kompetitive Bindung zurückzuführen war. Die Anionenleitfähigkeit ließ sich mit HIP-B hingegen nicht inhibieren. Der bakterielle Natrium-Protonen-Austauscher NhaA lag rekonstituiert in Liposomen vor, die auf der festkörperunterstützten Membran angelagert wurden. Bedingt durch die RSO-Orientierung des NhaA, konnte der Natriumtransport entgegen der natürlichen Transportrichtung (extrazelluläre Natriumbindung) untersucht werden. Der Transportstrom wies eine ausgeprägte Abhängigkeit vom pH-Wert auf. Bei neutralen bzw. sauren pH-Werten (pH <= 7) war die Aktivität des NhaA gegenüber dem alkalischen Bereich (7 < pH < 9) erheblich reduziert. Dieses Verhalten entspricht Literaturangaben für die Intrazellulärseite des NhaA. Dennoch war der NhaA bei einem neutralen pH-Wert nicht vollständig inaktiv. Die Affinität für Natriumionen konnte bei einem pH-Wert von 8,5 zu K0,5 = 11 mM und bei pH 7,0 zu K0,5 = 180 mM bestimmt werden. Neben einer Verringerung der Wechselzahl sinkt im neutralen/sauren Bereich also auch die Affinität für Natriumionen. Durch die Verwendung von Liposomen, in denen der NhaA mit verschiedenen Lipid- zu Protein-Verhältnissen rekonstituiert wurde, konnte gezeigt werden, dass die Messströme auf die Aufladung der Liposomen zurückführbar sind. Der Transportstrom konnte mit der amiloridähnlichen Substanz 2-Aminoperimidin inhibiert werden (Ki = 3 µM). Eine Inhibitionswirkung war nur zu beobachten, wenn der pH-Wert kleiner als pH 8 war. Zusammmen mit der ausgeprägten pH-Wertabhängigkeit kann dieses Phänomen auf eine pH-induzierte Konformationsänderung des NhaA zurückgeführt werden.
Adenosintriphosphat (ATP) als universelles Energieäquivalent der Zelle wird durch die oxidative Phosphorylierung synthetisiert, bei der Elektronen entlang des elektrochemischen Gefälles der Atmungskette über verschiedene Redoxkomplexe transferiert und durch die chemiosmotische Kopplung Protonen über die Membran gepumpt werden. Der Protonengradient wird dann von der ATP-Synthase genutzt, um ADP zu ATP zu phosphorylieren. Zentraler Redoxkomplex der Atmungskette vieler Pro- und Eukaryonten ist der bc1-Komplex, der Elektronen von Ubichinol auf Cytochrom c überträgt, von wo sie nachfolgend auf die Cytochrom c-Oxidase transferiert werden. Das mesophile Bodenbakterium Paracoccus denitrificans wird als Modellsystem für den mitochondrialen Elektronentransfer (ET) verwendet, da es eine aerobe Atmungskette exprimiert, die der mitochondrialen homolog ist, allerdings einen wesentlich einfacheren Aufbau der einzelnen Redoxkomplexe aufweist. Auch Thermus thermophilus als extrem thermophiles Bakterium bildet eine vergleichbare aerobe Atmungskette aus, wobei deren Proteine allerdings eine hohe Thermostabilität aufweisen, wodurch sie in das Interesse der Forschung gerückt sind. Ziel dieser Arbeit war die funktionelle Charakterisierung des ET zwischen Komplex III und IV der Atmungsketten von P. denitrificans und T. thermophilus, die aufgrund ihrer mesophilen und thermophilen Eigenschaften unterschiedliche Mechanismen in der Wechselwirkung ihrer Redoxproteine aufweisen. Es wurden lösliche Redoxfragmente verwendet, um anhand von Mutagenesestudien, Stopped-Flow (SF)- und Laserflash-Kinetiken (LF) unter pre-steady state-Bedingungen sowie FRET-Experimenten den ET zu untersuchen. Für die LF-Experimente wurde eine photoaktive Rutheniumverbindung kovalent an Cyt c552 gekoppelt, durch die bei Laseranregung das Häm photooxidiert und dadurch der ET von einem reduzierten Redoxpartner induziert werden kann. Die Strukturdaten des bc1/Cyt c-Cokomplexes aus Hefe zeigen, dass direkte Kontakte zwischen Cyt c1 und Cyt c durch unpolare Wechselwirkungen und eine zentrale Kation-p-Interaktion vermittelt werden. Daher wurden anhand von Sequenz- und Struktur-alignments äquivalente Aminosäurepositionen im Paracoccus Cyt c1 identifiziert, die an der Wechselwirkung zu Cyt c552 beteiligt sein könnten. Diese wurden durch gerichtete Mutagenese in ihrem Raumvolumen, ihrer Polarität oder Ladung variiert und in kinetischen Studien untersucht. Für die LF-Kinetiken sowie für die FRET-Experimente wurden Oberflächen-Cysteinmutanten des Cyt c1 bzw. c552 generiert, über deren SH-Gruppen kovalent der Rutheniumkomplex bzw. Fluorophore gekoppelt werden konnten. Die ET-Reaktion zeigt zwei Phasen in Abhängigkeit von der Ionenstärke. Bei niedrigen Ionenstärken ergeben sich Geschwindigkeitskonstanten von 109 M -1s-1 und eine geringe Ionenstärkeabhängigkeit (etwa eine effektive Ladung), wohingegen bei Ionenstärken ab 35 mM 2-3 effektive Ladungen pro Redoxpartner beteiligt sind und bimolekulare Geschwindigkeitskonstanten von 107 bis 109 M-1s-1 erhalten werden. Diese Ergebnisse deuten auf die Bildung eines Encounter-Komplexes bei niedrigen Ionenstärken hin, der ein Ensemble verschiedener Distanzen und relativer Orientierungen der Redoxpartner zueinander darstellt. Diese Annahme wurde ebenfalls durch FRET-Experimente bestätigt, durch die selbst bei niedrigen Ionenstärken keine definierten Abstände erhalten werden konnten. Die Geschwindigkeitskonstanten der bimolekularen Reaktion weisen auf einen diffusionskontrollierten Prozess hin, an dem 2 bis 3 effektive Ladungen an der elektrostatischen Annäherung der beiden Redoxpartner beteiligt sind. Diese Ergebnisse werden durch vorherige kinetische Untersuchungen und EPR-Studien des ET von Cyt c552 zum CuA-Fragment der aa3-Oxidase bekräftigt, für den die gleiche Anzahl effektiver Ladungen und die Bildung eines Encounter-Komplex gefunden wurden. Lediglich c1-Mutanten, deren variierte Aminosäuren sich direkt oberhalb der Hämspalte und in der Sequenz um bzw. innerhalb des Hämbindemotivs befinden, bewirken eine Verlangsamung der Gesamtreaktion und ein leicht verändertes Ionenstärkeverhalten, das auf eine leicht verschobene Interaktionsfläche hindeutet. Es wurde durch Sequenz- und Strukturalignments kein aromatischer Rest in direkter Nähe der entsprechenden Position im Paracoccus Cyt c1 gefunden, der wie im Hefekomplex eine stabilisierende Kation-p-Interaktion zwischen den Redoxpartnern vermittelt. Zur Untersuchung des ET zwischen Komplex III und Komplex IV aus T. thermophilus wurde die hydrophile Cytochrom c-Domäne der caa3-Oxidase in Analogie zum Paracoccus-System als lösliches Redoxfragment kloniert, heterolog exprimiert und charakterisiert. Dieses Fragment wurde in SF-Studien eingesetzt, um den ET zu seinen potentiellen Redoxpartnern Cyt cbc des bc-Komplexes und Cyt c552 zu charakterisieren. Es konnte gezeigt werden, dass das ccaa3-Fragment Elektronen von beiden Redoxpartnern empfängt, wobei die ET-Reaktion mit Cyt c552 so schnell verläuft, dass sie durch SF-Techniken nur schlecht aufgelöst und lediglich eine Größenordnung der Geschwindigkeitskonstanten abgeschätzt werden kann (kon ~ 1010 M-1s-1). Die Reaktion mit Cyt cbc verläuft auch noch schnell (kon = 108-109 M-1s-1) und ist nahezu unabhängig von der Ionenstärke, was eine hydrophobe Wechselwirkung zwischen beiden Redoxpartnern bestätigt. Die Ergebnisse deuten erstmals darauf hin, dass ein ET direkt zwischen zwei Redoxproteinkomplexen (bc-Komplex und caa3-Oxidase) stattfindet, ohne dass ein Elektronenüberträger (wie z. B. Cyt c552) zwischengeschaltet ist. Um die Übertragbarkeit der Erkenntnisse, die hier über den ET an löslichen Redoxfragmenten gewonnen wurden, in einem Proteinkomplex zu verifizieren, wurde ein bc1-Komplex verwendet, in dem die für P. denitrificans einzigartige saure Cyt c1-Domäne deletiert ist. Der Komplex wurde für eine erleichterte Aufreinigung mit einem His-tag versehen, homolog exprimiert und erste Aufreinigungs- und Charakterisierungsschritte unternommen. Er soll zukünftig eingesetzt werden, um die Mutationen des löslichen c1-Fragmentes in den Komplex zu überführen und die Mutanten kinetisch mittels pre-steady state- und steady state-Techniken im Vergleich zum bc1WT-Komplex zu untersuchen, ohne dass die Effekte der Punktmutationen durch die hohe negative Ladungsdichte der sauren Domäne überlagert werden.
Die vorliegende Arbeit befaßte sich mit der Untersuchung der Protonenbewegung während des O-E Schrittes im katalytischen Zyklus der Cytochrom-c-Oxidase von P. denitrificans. Die Zuordnung der Protonenbewegung zu den einzelnen Schritten des katalytischen Zyklus der Cytochrom-c-Oxidase ist immer noch ein Gegenstand zahlreicher Kontroversen. Obwohl von Ruitenberg et al. (2000) durch Spannungsmessungen gezeigt wurde, daß die Reduktion von Häm a während des ersten Elektrontransfers in das oxidierte Enzyme eine schnelle Protonenaufnahme von der gegenüberliegenden Seite der Membran bewirkt, wurden diese Ergebnisse angezweifelt. Daher sollte mit einer unabhängigen und direkten Methode herausgefunden werden, ob Protonen bereits während des ersten Schrittes des katalytischen Zyklus aufgenommen werden. Dazu wurde ns-zeitaufgelöste Blitzlicht-Absorptionsspektroskopie in Kombination mit pH-sensitiven Farbstoffen genutzt, und zwar sowohl mit Fluorescein kovalent an der Proteinoberfläche gebunden als auch mit Phenolrot löslich im Medium vorliegend. Zur kovalenten Kopplung von thiolreaktiven Farbstoffen mußten zuerst die nötigen Voraussetzungen geschaffen werden. Dazu wurde in dieser Arbeit ein Mutagenesesystems für sowohl Untereinheit I als auch Untereinheit II etabliert und eine oberflächencysteinfreie Variante und elf Einzelcystein-Varianten hergestellt, exprimiert und aufgereinigt sowie die Enzymaktivitäten überprüft. Danach wurde ein Protokoll zur Kopplung der Einzelcysteinvarianten mit Iodoacetamidfluoresein ausgearbeitet und die Varianten Fluorescein-markiert. Dabei zeigte es sich, daß nur sieben Varianten erfolgreich mit IAF reagierten. Mittels dieser AF-markierten Varianten konnte die Pufferkapazität an der Oberfläche der Cytochrom-c-Oxidase bestimmt werden. Es zeigte sich, daß die Pufferkapazität des Enzyms in Lösung im Vergleich zu Bakteriorhodopsin dreimal so groß ist, an der Oberfläche sogar 10-15mal so groß. Dies deutet auf eine hohe Anzahl protonierbarer Gruppen um die für die Markierung ausgewählten Aminosäuren im Bereich der Eintrittsstellen der Protonen hin. Die gezielte Übertragung eines Elektrons auf die Cytochrom-c-Oxidase erfolgte durch Licht anregbare Rutheniumkomplexe. In unserem Meßsystem war die Elektronentransfereffizienz von [Ruthenium(2,2‘-bipyridin)2]2quarterpyridin am höchsten. Nach einer sorgfältigen Optimierung der Meßbedingungen wie pH-Wert, Ionenstärke und Energie des Lasers konnte eine 10-15 %ige Reduktion von Häm a mit einer Zeitkonstanten von t = 13,7 ± 2,4 µs nachgewiesen werden. Die Protonenkonzentrationsänderungen im Medium konnten durch Phenolrot verfolgt werden. Durch den Vergleich von Funktionsvarianten, bei denen jeweils einer oder beide Protoneneingangswege blockiert sind, konnte ein Modell für die Protonenaufnahme und -abgabe während der Einelektronen-Reduktion der Cytochrom-c-Oxidase entwickelt werden. Dies konnte durch Messungen an in Liposomen inkorporierter wt Cytochrom-c-Oxidase verifiziert werden. Die Nettoprotonenaufnahme von der N-Seite der Cytochrom-c-Oxidase beträgt somit 0,3 H+ für das im O-E Schritt aufgenommene Elektron. Die Variante CS-I302C-AF wurde dazu genutzt, die Oberflächenladungsdichte an der N-Seite der Cytochrom-c-Oxidase zu bestimmen. Die Oberflächenladungsdichte auf der N-Seite des Enzyms in der Nähe zum Eingang des K-Wegs ist negativ und beträgt 0,5 e-/1000 Å2.
Untersuchung der Wirkung von Cyclooxygenase-Inhibitoren auf die Entstehung der Arteriosklerose
(2006)
In der vorliegenden Arbeit wurde der Einfluss der COX-2-selektiven NSAIDs Celecoxib und Rofecoxib sowie des traditionellen nichtselektiven NSAIDs Naproxen auf die Entstehung und Entwicklung von Arteriosklerose in ApoE-defizienten Mäusen untersucht. Befunde über kardiovaskuläre Risiken dieser Medikamentengruppe sowie die Beobachtung, dass COX-2 in arteriosklerotischen Plaques exprimiert wird, ließen sowohl die Hypothese von pro- als auch von antiatherogenen Wirkungen zu. Zunächst wurde die Funktionsfähigkeit des Versuchsdesigns nachgewiesen. In den Aorten von Diätgefütterten ApoE-defizienten Mäusen entwickelten sich im Alter von 22 Wochen Plaques, in denen typische atherogene sowie proinflammatorische Proteine exprimiert wurden. Die Effektivität und Selektivität der jeweiligen NSAIDs wurde durch Messung der Urinkonzentration relevanter Metabolite nachgewiesen, die aus der COX-2-vermittelten PGI2- und der COX-1-vermittelten TXA2-Synthese stammten. Erwartungsgemäß hemmten sowohl die Coxibe als auch Naproxen die Synthese von PGI2, während die TXA2-Produktion nur unter Naproxen reduziert wurde. Im Vergleich zu Kontrolltieren führte die chronische Behandlung mit Celecoxib und Rofecoxib tendenziell zu kleineren Plaques in der Aorta von diätgefütterten ApoE-defizienten Mäusen. In den Plaques wurde die Proteinexpression von COX-2 durch die Behandlung mit den NSAIDs nicht beeinflusst. Dies deutet darauf hin, dass die Reduktion der Plaques in den Aorten eher durch eine Hemmung der COX-2-Aktivität oder durch COX-unabhängige Effekte als über eine Inhibition der COX-2-Proteinexpression zustande kommt. Die Blutfettwerte wurden durch die eingesetzten NSAIDs nicht verändert, was den Daten aus der Literatur entspricht. ApoE-defiziente Mäuse, die normales Futter erhalten hatten und mit Celecoxib oder Rofecoxib behandelt wurden, entwickelten vereinzelt intimale Läsionen, während Kontrolltiere oder Naproxen-behandelte Mäuse in keinem Fall Plaques zeigten. Diese Ergebnisse könnten einen Hinweis dafür liefern, dass durch Coxibe COX-unabhängige Effekte ausgelöst werden, welche die Arteriogenese einleiten. Die umfangreichen Untersuchungen lassen auf eine unterschiedliche Beteiligung von NSAIDs bei der Arteriogenese schließen. Dabei scheinen die selektiven COX-2-Inhibitoren Celecoxib und Rofecoxib eine andere Rolle als Naproxen, dem nichtselektiven COX-2-Inhibitor, zu spielen. In ApoEdefizienten Diät-Mäusen wurde die Arteriosklerose durch Celecoxib und Rofecoxib über COX-2-abhängige Mechanismen inhibiert, wobei der Effekt vermutlich durch den stärker ausgeprägten Effekt der Hypercholesterinämie überlagert war. In den Kontroll-Mäusen (mit Normalfutter) dagegen könnte die Arteriogenese unter Celecoxib und Rofecoxib durch COX-unabhängige Mechanismen eingeleitet worden sein. Dabei scheint das Stadium der Arteriosklerose eine wichtige Rolle zu spielen. Zusammenfassend deuten die Ergebnisse daraufhin, dass Coxibe die Initiation der Arteriosklerose eher begünstigen, während bei weiter fortgeschrittenen Plaques tendenziell antiatherogene Effekte zu beobachten waren, die möglicherweise auf die entzündungshemmenden Eigenschaften der Substanzen zurückzuführen sind. Nachdem jedoch diese Effekte bisher nur in Maus-Modellen beobachtet und untersucht wurden, bleibt die Frage, wie NSAIDs thrombotische Ereignisse im Patienten auslösen, weiterhin offen. Erst kürzlich wurde beschrieben, dass unter Rofecoxib schon nach kurzer Behandlungsdauer Herzinfarkte ausgelöst werden können (Levesque et al. 2006). Weitere Daten deuten daraufhin, dass NSAIDs über COX-unabhängige Mechanismen dazu führen, dass sogar nach dem Absetzen des Medikament auf lange Sicht ein erhöhtes Risiko für die Entwicklung kardiovaskuläre Erkrankungen bestehen bleibt (Merck, APPROVe Report 2006; unter www.merck.com). Die genauen Mechanismen dieser Langzeiteffekte von NSAIDs auf das vaskuläre System sind zurzeit nach wie vor unklar. Abschließend kann jedoch aufgrund der aktuellen Datenlage vermutet werden, dass Coxibe eine Schädigung von vaskulären Zellen verursachen können und das Risiko für kardiovaskuläre Effekte eher erhöhen als antiatherogene Effekte zu erzeugen und die Arteriosklerose zu verbessern.
G protein-coupled receptors (GPCRs) comprise the largest membrane protein family and play an essential role in signal transduction through the cell membrane. They are currently the targets of approximately 50 % of the pharmaceuticals on the market (Klabunde and Hessler, 2002). However, only one high-resolution GPCR structure has been determined up to now, that of bovine rhodopsin (Palczewski et al., 2000). The GPCR activation and regulation mechanisms are still unknown and other GPCR structures are thus required. MePNet (Membrane Protein Network) was a European consortium dedicated to structural studies of GPCRs. The approach was to produce 100 GPCRs in three expression systems (Escherichia coli, Pichia pastoris and Semliki Forest Virus infected mammalian cells) in order to select at each step of the process (production, solubilization, purification) the constructs that fulfilled quantity and quality (functionality) requirements for crystallization trials. In our team, we screened 38 of the 100 targets in P. pastoris. For each receptor, the clone with the highest production level was identified by dot-blot. The size and homogeneity of each receptor were then analyzed by Western-blot. The human adenosine A2A receptor showed a well-defined and pronounced single band and was thus selected for further characterization. The adenosine A2A receptor is a GPCR mainly localized in the central nervous system and, as it antagonizes dopaminergic activity, it has great potential as a drug target for the treatment of Parkinson’s disease. Functional characterization by binding assays with the specific antagonist [3H]-ZM241385 demonstrated a Bmax of 56 +/- 3 pmol/mg i.e. pmol of binder per milligram of total membrane protein, and a KD of 0.40 +/- 0.02 nM. Receptor production was then improved by lowering the induction temperature, decreasing the induction time and adding DMSO to the medium. For large-scale production, fermention reached around 300 g cells (wet weight)/L culture, which provided 43 mg of functional receptor in membranes per liter of culture. Functional solubilization was achieved with dodecyl-β-D-maltoside and the soluble yield was increased to 70-80 % of the membrane content by addition of cholesteryl hemisuccinate and increasing the ionic strength. The receptor was successfully purified via Ni-NTA and monomeric avidin chromatography in the presence of the antagonist ZM241385. This strategy produced a pure, homogeneous and stable receptor preparation with functionality demonstrated by radioligand binding assays. The total receptor yield after purification was routinely around 20 % of the membrane functional receptor content and 2 g of membranes provided 4 mg of pure receptor for crystallization trials. GPCRs are very difficult targets for crystallization, and co-crystallization with antibody fragments has been shown to be a successful method for crystallization of membrane proteins. In order to develop such a tool for the adenosine A2A receptor, a single-chain Fv (scFv) fragment specific to the purified receptor was selected by phage display. The receptor was functionally immobilized on the surface of streptavidin beads and after two rounds of selection, 6 different phages were identified several times. After production in E. coli and purification via Ni-NTA affinity chromatography, 4 out of the 6 scFv fragments were sufficiently enriched to be tested by ELISA. For the ELISA, the receptor was functionally immobilized via the biotinylation domain of the construct in a 96-well streptavidin-coated plate. The antibody fragments binding to the receptor were identified based on interaction with HRP-conjugated protein L. One scFv fragment gave a positive ELISA signal 10 fold above background and titration of the scFv fragment binding to the receptor was specific and saturable. However no complex of scFv fragment and receptor was observed on gel filtration. In order to have a more sensitive detection method, the scFv fragment was labeled with fluorescein: a complex was then observed up on gel filtration but the binding appeared to be non-specific. A pull-down assay with immobilized non-labeled scFv fragment finally confirmed the specificity of the binding, but also the low affinity of the interaction. Affinity maturation of this specific scFv fragment by a random mutagenesis and selection process should improve this parameter in order to obtain an adapted tool for co-crystallization.
Zur erfolgreichen Behandlung von Tumorerkrankungen sind effiziente Therapien notwendig. Oftmals kommt es nach einer klassischen Tumortherapie zum Auftreten von Rezidiven, die aus residuellen Tumorzellen hervorgehen. Grund hierfür können eine bereits erfolgte Metastasierung oder Resistenzmechanismen der Tumorzellen sein. Auf Grund ihrer Fähigkeit Gewebe aktiv zu infiltrieren bietet der Einsatz zytotoxischer Lymphozyten im Rahmen einer zellulären Immuntherapie den Vorteil, auch bereits metastasierte Tumorzellen zu erreichen. Dadurch können auch Tumorzellen eliminiert werden, die Resistenzmechanismen meist im oberen Teil apoptotischer Signalkaskaden aufweisen. Eine spezifische Ausrichtung zytotoxischer Lymphozyten auf Tumorantigene ist grundsätzlich über chimäre Antigenrezeptoren möglich. Dabei bietet die Generierung von Tumor-spezifischen zytotoxischen Effektorzelllinien den Vorteil, Zellklone mit definierter Aktivität und Spezifität bereitstellen zu können. Im Hinblick auf einen klinischen Einsatz scheint hierfür die Natürliche Killerzelllinie NK-92 besonders geeignet. Die Ergebnisse einer klinischen Studie mit parentalen NK-92 Zellen zeigten eine gute Verträglichkeit ohne Nebenwirkungen. Im Rahmen dieser Arbeit wurden NK-92 Zellen genetisch so modifiziert, dass sie chimäre Antigenrezeptoren mit Spezifität für die Tumorantigene CD20, EpCAM, GD2 und CD138 exprimieren. In der Tumortherapie stellen das mit Tumoren der B-Zell-Reihe assoziierte CD20-Molekül und das auf den meisten Tumorzellen epithelialen Ursprungs exprimierte EpCAM-Protein wichtige Zielantigene monoklonaler Antikörper dar. Studien zeigten, dass auch die auf Tumorzellen des Neuroblastoms bzw. Multiplen Myeloms exprimierten Moleküle GD2 bzw. CD138 geeignete Angriffspunkte für immuntherapeutische Ansätze sein könnten. Die chimären Antigenrezeptoren sind aus einem Antigenspezifischen scFv-Antikörperfragment aufgebaut, das über ein Fragment der CD8alpha-Kette mit der CD3zeta-Kette als Signaltransduktionsdomäne verbunden ist. Nach retroviraler Transduktion zeigte sich eine hohe und homogene Oberflächenexpression dieser Rezeptoren auf modifizierten NK-92 Zellen. Auf das Oberflächenprotein CD20 ausgerichtete NK-92-scFv(Leu-16)-Zeta Zellen wiesen gegen CD20- positive Tumorzelllinien und primäre Tumorzellen eine hohe zytotoxische Aktivität auf. Im Vergleich waren parentale NK-92 Zellen gegen diese Tumorzellen nicht oder deutlich weniger aktiv. Dabei war die zytotoxische Aktivität der NK-92-scFv(Leu-16)-Zeta Zellen mit dem monoklonalen anti-CD20 Antikörper Rituximab kompetitierbar. Mit Hilfe der gegen parentale und modifizierte NK-92 Zellen resistenten Zelllinie NIH3T3 wurde gezeigt, dass allein über die stabile Expression des CD20-Proteins in NIH3T3 Zellen die Resistenz gegen modifizierte NK-92 Zellen überwunden werden kann. NK-92-scFv(Leu-16)-Zeta Zellen waren in der Lage, CD20-positive NIH3T3-CD20 Zellen auch bei niedrigen E/T-Verhältnissen effizient abzutöten. In Mischkulturen aus NIH3T3 und NIH3T3-CD20 Zellen war zudem eine selektive zytotoxische Aktivität der NK-92-scFv(Leu-16)-Zeta Zellen ausschließlich gegen Antigen-positive Zellen nachweisbar. Über die Analyse von Zellkonjugaten zwischen zytotoxischen Effektorzellen und ihren Zielzellen, deren Bildung grundsätzliche Voraussetzung für eine Eliminierung ist, wurden Hinweise erhalten, dass der chimäre Antigenrezeptor hierzu keinen Beitrag zu leisten scheint, sondern vor allem die anschließende Aktivierung der modifizierten NK-92 Zellen bewirkt. Mit EpCAM-spezifischen NK-92-scFv(MOC31)-Zeta Zellen war auch bei niedrigen E/T-Verhältnissen eine effiziente Abtötung von unterschiedlichen Tumorzelllinien epithelialen Ursprungs möglich. Eine erfolgreiche Blockierung dieser zytotoxischen Aktivität mit dem monoklonalen Antikörper MOC31 bestätigte, dass diese spezifisch über den chimären Antigenrezeptor vermittelt wurde. Die untersuchten epithelialen Zelllinien erwiesen sich dagegen als vollkommen resistent gegen parentale bzw. mit demleeren Expressionsvektor modifizierte NK-92-Mock Zellen. Weitere Ergebnisse zeigten, dass die zytotoxische Aktivität von NK-92-scFv(MOC31)-Zeta Zellen tatsächlich über Granzym B vermittelt wird. Eine erhöhte FasL-Oberflächenexpression infolge der Cokultur mit Antigen-positiven Zielzellen war dagegen nicht nachweisbar. Anhand dieser Ergebnisse kann eine signifikante Beteiligung von FasL an der zytotoxischen Aktivität der modifizierten NK-92 Zellen ausgeschlossen werden. Weiterhin wurden therapeutische Effekte von NK-92-scFv(MOC31)-Zeta Zellen in einem Xenograftmodell in NOD-scid/scid Mäusen mit einer humanen EpCAM-positiven Tumorzelllinie untersucht. Hier wurde im Vergleich zur Kontrollgruppe durch Behandlung mit EpCAM-spezifischen NK-92 Zellen, unerwarteterweise aber auch mit NK-92-Mock Zellen, ein signifikant längeres Überleben der Tiere beobachtet. Nach der Ableitung CD138-spezifischer NK-92-scFv(B-B4)-Zeta Zellen wurde zwar eine hohe zytotoxische Aktivität gegen CD138-positive Zelllinien erhalten. Es war jedoch keine im Vergleich zu parentalen NK-92 Zellen weiter verstärkte Zytotoxizität nachweisbar. Als Ursache hierfür ist eine mangelnde Funktionalität des scFv-Antikörperfragments im Kontext des chimären Antigenrezeptors denkbar. Da die Bindungseigenschaften von scFv-Fragmenten entscheidend durch die Anordnung ihrer schweren und leichten Antikörperketten zueinander beeinflusst werden können, wurden NK-92 Zellen etabliert, die ein scFv-Fragment mit umgekehrter Orientierung der Antikörperketten in ihrem chimären Antigenrezeptor tragen. Diese werden derzeit im Rahmen einer externen Zusammenarbeit auf ihre Funktionalität hin überprüft. Zur Konstruktion gegen das Disialogangliosid GD2 gerichteter chimärer Antigenrezeptoren wurden parallel zwei scFv-Fragmente des Antikörpers ch14.18 eingesetzt, die sich in der Orientierung der schweren und leichten Antikörperketten zueinander unterscheiden. Mit den Antigenrezeptorkonstrukten modifizierte NK-92 Zellen zeigten eine im Vergleich zu parentalen NK-92 und NK-92-Mock Zellen stark erhöhte Zytotoxizität gegen GD2 exprimierende humane Tumorzelllinien. Dabei wurde weder bei der Expressionsdichte der chimären Antigenrezeptoren noch in der zytotoxischen Aktivität modifizierter NK-92 Zellen mit unterschiedlicher Anordnung der variablen Antikörperdomänen im scFv Antikörperfragment ein signifikanter Unterschied beobachtet. Mit der extrazellulären Domäne von CTLA-4 als Modellprotein wurde der mögliche Einsatz einer zu scFv-Antikörperfragmenten alternativen Antigenbindungsdomäne geprüft. CTLA-4 wird normalerweise auf T-Zellen exprimiert und bindet an CD80 bzw. CD86 auf APCs. CD80- und/oder CD86-positive Zielzellen wurden von NK-92-sCTLA-4-Zeta Zellen im Vergleich zu parentalen NK-92 Zellen spezifisch und mit hoher Effizienz lysiert. In Zytotoxizitätsassays wurde mit Hilfe einer sowohl gegen parentale als auch modifizierte NK-92 Zellen resistenten Tumorzelllinie gezeigt, dass allein die stabile Expression des CD86 Proteins in dieser Zelllinie ausreicht, um die Resistenz gegen NK-92-sCTLA-4-Zeta Zellen aufzuheben. Daraus kann geschlossen werden, dass grundsätzlich auch der Einsatz von zu scFv- Antikörperfragmenten alternativen Antigenbindungsdomänen eine spezifische Ausrichtung und effiziente Aktivierung von NK-92 Zellen gewährleistet. Die Ergebnisse dieser Arbeit zeigen, dass die genetische Modifikation der Natürlichen Killerzelllinie NK-92 zur Ausrichtung auf Tumor-spezifische Zielstrukturen einen grundsätzlich geeigneten Ansatz zur Behandlung maligner Erkrankungen darstellt. Eine Weiterentwicklung Antigen-spezifischer NK-92 Derivate als mögliche Zelltherpeutika erscheint daher sinnvoll und vielversprechend.
Although in general cells are genetically identical in multicellular organisms, the differential expression of genomic information enables cell type definition and specific organ function. In eukaryotic cells, the DNA is associated with histone and non-histones proteins into a restrictive structure called chromatin. Assembly into chromatin does not only protect and package the linear double stranded DNA into the nucleus but is fundamental for the execution of diverse genetic programs. Posttranslational modifications of histones regulate the accessibility of the DNA to transcription factors and serve as scaffold for binding of regulatory proteins. Nuclear receptors are transcription factors that bind specific target sequences on the DNA and recruit transcriptional coregulators at the promoter. These are able to modify the chromatin structure in an activating or repressing manner. The contribution of corepressors to the biological actions of nuclear receptors has turned out to be essential. Impaired corepressor function can be the cause of endocrine malfunctions, neoplastic diseases or severe developmental abnormalities. To better understand the role of the nuclear receptor corepressor N-CoR the unknown function of the extreme C-terminus was investigated. In this thesis the interaction of N-CoR with the non-POU-domain containing octamer-binding protein Non0/p54nrb, that was found tobe a potential interaction partner in a yeast-two-hybrid screen, was confirmed. This protein contains two RNA recognition motifs (RRM) and is described as a multifunctional protein since it is involved in transcription Initiation as well as in pre-mRNA processing. The RRM1 motif was determined to be essential and sufficient for the interaction with N-CoR. Obtaining dominant negative effect with the Non0/p54nrb RRM1 deletion mutant in functional reporter assays, data support that NonO modulates the capacity of N-CoR to repress and alters the recruitment of N-CoR by nuclear receptors to targeted Promoters. Additional analyses suggest that the N- and C- terminus of N-CoR are involved in intramolecular interactions and that they regulate each other. Taken results together a functional model is proposed that supports the biological relevance of the interaction of N-CoR with NonO and the function of N-CoR C-terminus acting as asensor that evaluates the ratio of corepressors and coactivators in the nuclear receptor environment. N-CoR repressive capacity would be altered by modulating factors like NonO that interacts with N-CoR C-terminus. The mechanism support that splicing and transcription regulation are physically and functionallylinked to ensure the appropriate amount of messager RNA to be transcript and process in response to stimulation intensity and cell context.
Die Cytochrom c Oxidase von Paracoccus denitrificans katalysiert die Reduktion von Sauerstoff zu Wasser und „pumpt“ zusätzlich vier Protonen von der cytoplasmatischen Seite auf die periplasmatische Seite der Cytoplasmamembran. Die Spaltung des molekularen Sauerstoffes im binuklearen Zentrum erfolgt im katalytischen Zyklus des Enzyms bei der Umwandlung des Intermediates A, in welchem molekularer Sauerstoff an das Häm a3 Eisen gebunden ist, in das Intermediat PM durch spontane elektronische Umorganisation. Drei der dazu benötigten vier Elektronen werden von den Metallzentren geliefert. Das vierte Elektron wird sehr wahrscheinlich von einer Aminosäure in der Nähe des binuklearen Zentrums durch Bildung eines Aminosäureradikals beigesteuert. Dieses Radikal sollte in den Intermediaten PM und F• des katalytischen Zyklus der Cytochrom c Oxidase vorhanden sein. Durch Reaktion von stöchiometrischen Mengen an Wasserstoffperoxid mit dem vollständig oxidierten Enzym lassen sich PM; F• und F-Intermediate künstlich erzeugen und durch ihre Maxima in Absorptionsdifferenzspektren charakterisieren. Mit paramagnetischer Elektronenresonanzspektroskopie (EPR-Spektroskopie) können Struktur und Dynamik paramagnetischer Zentren in Proteinmolekülen untersucht werden. Mit dieser Methode konnte in mit Wasserstoffperoxid generierten PM und F•-Intermediaten ein Tyrosinradikal nachgewiesen werden. Der Schwerpunkt der vorliegenden Arbeit war die Identifikation dieses Tyrosins mittels einer Mutagenesestudie. Dazu wurden Tyrosinvarianten (Y35F, Y167F, Y267F, Y280H, Y328F und Y414F) aus Untereinheit I, die einen maximalen Abstand von 25 Angström vom binuklearen Zentrum aufweisen, mit Hilfe von Absorptions- und EPR-Spektroskopie charakterisiert. Auf diese Weise konnte nachgewiesen werden, dass Tyrosin 167 eindeutig der Ursprungsort des Tyrosinradikals ist, das bei der Generierung von PM- und F•-Intermediaten der Cytochrom c Oxidase mit Wasserstoffperoxid entsteht. Da die Variante Y167F jedoch eine hohe katalytische Aktivität aufwies und in der Lage war, die Oxoferrylintermediate PM; F• und F zu bilden, konnte gleichzeitig gezeigt werden, dass dieses Tyrosin nicht der primäre Donor des vierten Elektrons sein kann, das im katalytischen Zyklus des Enzyms für die Spaltung der Sauerstoffbindung benötigt wird. Diese Ergebnisse wurden dahingehend interpretiert, dass Tyrosin 167 eine thermodynamische Senke darstellt, in die das von einem unbekannten kurzlebigen Elektronendonor bei der Wasserstoffperoxidreaktion gebildete Radikal verschoben wird. Als Donor des vierten Elektrons für die Sauerstoffspaltung kommt auch Tryptophan 272 infrage. Daher wurde auch die Variante W272M spektroskopisch charakterisiert. Diese Variante war katalytisch inaktiv und nicht in der Lage in Reaktion mit Wasserstoffperoxid die Intermediate PM, F• und F zu bilden. Es ließen sich weder das Tyrosin-167-Radikal noch ein anderes Radikal nachweisen. Diese Ergebnisse sprechen dafür, dass Tryptophan 272 möglicherweise der ursprüngliche Donor des vierten Elektrons für die Sauerstoffspaltung im katalytischen Zyklus der Cytochrom c Oxidase sein könnte. Während des PM zu F-Übergangs im katalytischen Zyklus der Cytochrom c Oxidase werden zwei Protonen gepumpt. Diese können vom Enzym entweder über den D-Weg oder den K-Weg aufgenommen werden. Eine Untersuchung des PM zu F-Übergangs von D-Weg- und K-Weg-Varianten der Cytochrom c Oxidase kann Aufschluss über die Beteiligung der beiden Protonenaufnahmewege des Enzyms an diesem Schritt des katalytischen Zyklus geben. Daher wurde die Reaktion der D-Weg Varianten D124N, N131D, Y35F und E278Q und der K-Weg Variante K354M mit Wasserstoffperoxid absorptionsspektroskopisch untersucht. Durch diese Experimente konnte die zentrale Bedeutung des D-Weges für die Protonentranslokation im PM zu F-Übergangs bestätigt, aber auch ein gewisser Einfluss des K-Weges nicht ausgeschlossen werden. Außerdem wurde der PM zu F-Übergang der Variante R437N, die eventuell Teil des noch nicht konkret identifizierten Protonenaustrittsweg der Cytochrom c Oxidase ist, untersucht.
Apoptose ist für grundlegende Prozesse des Lebens wie die Embryonalentwicklung und die Infektabwehr unentbehrlich. Defekte im Apoptoseprozess haben ernste Erkrankungen wie z.B. Krebs zur Folge. Ein charakteristisches Kennzeichen von Krebszellen ist deren Apoptoseresistenz, die verhindert, dass Krebszellen auf natürlichem Wege vernichtet werden. Die Tumorzellen reagieren im allgemeine nicht mehr auf Zelltod-Signale, die z. B. bei Nähr- und Sauerstoffmangel oder einem Angriff durch Effektorzellen des Immnunsystems empfangen werden. Ein wesentlicher Grund dafür sind Mutationen im Signalweg der Apoptose. Häufig wird in Tumoren die Überaktivierung von antiapoptotischen Proteinen beobachtet. Die Aufklärung der Apoptose-Signalwege und die Charakterisierung der ihnen zu Grunde liegenden molekularen Interaktionsmechanismen sind wichtig für die Erklärung der Pathogenesse vieler Erkrankungen. Daher ist es von großem Interesse, neue anti-apoptotische Proteine zu identifizieren, die als Targets zur Entwicklung alternativer therapeutischer Strategien benutzt werden können. Ein wichtiger Bestandteil des Apoptoseweges ist das Mitochondrium. Ausgangspunkt für den mitochondrialen oder intrinsischen Apoptose-Signalübertragungsweg ist die Freisetzung von Cytochrom c (Cyt c) und anderen apoptogenen Faktoren aus dem Mitochondrien. Zytoplasmatisches Cytochrom c bindet zusammen mit ATP oder dATP an das Adaptorprotein Apaf-1 und induziert daraufhin eine Konformationsänderung sowie die Oligomerisation von Apaf-1. Die Selbstassoziation von Apaf-1 führt zur zusätzlichen Rekrutierung von Caspase-9, die in diesem des sogenannten Apoptosomskomplexes durch die Erhöhung ihrer lokalen Konzentration autokatalytisch aktiviert wird. Aktive Caspase-9 wiederum spaltet und aktiviert Effektorcaspasen wie Caspase-3, die zelluläre Targetproteine spalten und damit den Zelltod verursachen. Viele apoptotische Stimuli aktivieren den mitochondrialen Apoptoseweg. Defekte im intrinsischen Signalweg finden sich häufig im Tumoren und sind oft mit Resistenzen gegen apoptoseauslösende Krebstherapien assoziert. Anti-apoptotische Proteine, die mit dem apoptotischen Programm an dieser Stelle interferieren und in Tumoren überexprimiert werden, stellen attraktive Targets für Tumortherapien dar. In der Arbeitsgruppe von Dr. Martin Zörnig am Georg-Speyer-Haus wurde ein S. pombe Hefesystem etabliert, um in einem funktionellen „Survival-Screen“ neue anti-apoptotische Säugergene aus Tumor-cDNA-Banken zu identifizieren. Hefen können durch die Expression bestimmter pro-apoptotischer Säugerproteine abgetötet werden. Dieser Hefezelltod weist äusserliche Gemeinsamkeiten mit apoptotischen Zellen multizelluläre Organismen auf. Frühere Studien haben gezeigt, dass es möglich ist, mit Hilfe dieses Screens tatsächlich anti-apoptosische Säugerproteine zu identifizieren, die den induzierten Hefezelltod inhibieren können. In einem Screen, bei dem das Apaf-1 Homolog in C.elegans, CED-4, als Killerprotein verwendet wurde, konnte unter anderem das Gen Aven isoliert werden, das nicht nur CED-4-induzierten Zelltod in Hefe, sondern auch Apaf-1/Casp-9-vermittelte Apoptose in Säugerzellen inhibiert. Dabei wurde ein unvollständiges ΔAven-cDNA-Plasmid isoliert, dem das 5´-Ende fehlte. Diese Verkürzung ist vermutlich auf ein vorzeitiges Abbrechen der cDNA-Synthese durch die Reverse Transkriptase zurückzuführen. Die vollständige humane Aven cDNA wurde im Rahmen einer Kooperation von Prof. J. M. Hardwick (J. Hopkins University, Baltimore USA) bereitgestellt, zusammen mit zwei polyklonalen anti-Aven Antiseren. Die Antisera erkennen die N-terminalen Aminosäuren 98-112 (anti-Aven A) sowie am C-terminus aa 256-268 (anti-Aven B). In der AG Zörnig wurde ein zusätzliches Antiserum (anti-Aven C) gegen ein Peptid generiert, das die letzten 17 Aminosäuren des humanen und des Maus-Aven-Proteins erkennt. Aven wurde in der Gruppe von M. Hardwick als anti-apoptotisches Protein beschrieben, das an das anti-apoptotische Bcl-2 Familienmitglied Bcl-xL und Apaf-1 bindet (Chau et al., 2000). Aven wurde mit Hilfe eines „Hefe-2-Hybrid Screens“ mit Bcl-xL als Köder („bait“) isoliert. Es wurde publiziert, dass Aven die Apaf-1 Selbstassoziation (und damit Caspase-9-Aktivierung) verhindert. Das humane Aven Gen kodiert für insgesamt 362 Aminosäuren. Die Sequenz ist in zahlreichen Spezies hoch konserviert. Aven mRNA Expression wurde in vielen Geweben (Herz, Nieren, Pankreas, Testis und Skelet-Muskulatur) und in mehreren Zelllinien gefunden. Dies deutet auf eine ubiquitäre Expression hin. In der Zelle ist Aven hauptsächlich im Zytoplasma lokalisiert. Immunfluoreszenzanalysen der Arbeitsgruppe Hardwick zeigten zusätzlich eine schwache Expression des Proteins im Nukleus. In der Arbeitsgruppe Zörnig konnte gezeigt werden, dass die isolierte Deletionsmutante ΔAven (aa 180-362) CED-4-induzierten Zelltod in Hefen inhibiert (Doktorarbeit M.L. Brezniceanu, unpublizierte Daten). Eine anti-apoptotische Wirkung konnte für ΔAven zusätzlich im Säugersystem verifiziert werden. Durch Überexpressionsstudien eines ΔAven- GFP-Fusionskonstruktes wurde Apaf-1/Caspase-9-induzierte Apoptose in der humanen Kolonkarzinomzelllinie RKO inhibiert. Weitere Experimente zeigten, dass sich in Tumoren des Kolons, der Niere und der Schilddrüse erhöhte Aven mRNA-Mengen nachweisen lassen und dass Aven auf mRNA-Ebene während der Entwicklung der Brustdrüse reguliert wird (unpublizierte Daten). Im Rahmen dieser Arbeit wurde Aven biochemisch und genetisch näher charakterisiert. Dabei wurden sowohl das volle-Länge-Aven sowie die artifizielle ΔAven Deletionsmutante untersucht. Zunächst wurde ein Teil der publizierten Daten verifiziert. Beschrieben ist eine Bindung zwischen Aven und Bcl-xL, die durch die N-terminale Domäne von Aven (Aminosäure 74-108) vermittelt wird. ΔAven, das den N-Terminus nicht enthält, sollte daher nicht an Bcl-xL binden können. In einem Immunpräzipitations-Experiment mit dem anti-Aven B Antiserum wurde entsprechend einer Interaktion mit Bcl-xL nur für das volle-Länge-Aven-Protein, nicht aber für ΔAven nachgewiesen. Den Publizierten Daten zufolge bindet Aven mit den Aminosäuren 180 bis 300 an Apaf-1, und diese Interaktion konnte in einem weiteren Ko-Immunpräzipitations-Experiment bestätigt werden. Ein Ziel dieser Arbeit bestand darin, den Einfluß von Aven auf die Bildung des Apoptosoms zu untersuchen. Dafür wurden Apoptosom-Immunpräzipitations-Experimente mit 293T Zelllysaten etabliert, in denen man endogene Apaf-1/Caspase-9-Komplexe nachweisen konnte. Durch Zugabe von Cytochrom c und dATP direkt zu den Zelllysaten wurde die Bildung des Apoptosoms induziert, das anschließend mit einem monoklonalen anti-Caspase-9 Antiköper immunpräzipitiert werden konnte. Bei gleichzeitiger Überexpression von ΔAven wurde weniger Apaf-1 mit Caspase-9 ko-immunpräzipitiert, ein Hinweis darauf, dass die Apoptosombildung unterdrückt wurde. Das Ergebnis wurde durch die Beobachtung bestätigt, dass Caspase-9-Spaltung und -Aktivierung durch ΔAven vermindert wurde. Interessanterweise konnte eine Überexpression des volle-Längen Aven-Proteins die Bildung des Apoptosoms nicht verhindert. Apaf-1 wurde wie bei den Lysaten nichttransfizierter Zellen mit Caspase-9 Ko-immunopräzipitiert, und die Caspase-9 Spaltprodukte p35 und p37, die bei Aktivierung des Apoptosoms entstehen, wurden unverändert detektiert. Bei den beschriebenen Ko-Immunpräzipitationsexperimenten konnte auch eine Bindung von Aven und ΔAven an Caspase-9 (und nicht nur an Apaf-1) nachgewiesen werden. Diese Ergebnisse zeigen, dass der C-Terminus von Aven für die Bindung an Caspase-9 wichtig ist. Interessanterweise nahm die Bindung von ΔAven an Caspase-9 nach Apoptosominduktion ab, während kein Unterschied in der Bindung des vollständigen Aven-Proteins an Caspase-9 vor oder nach Apoptosominduktion beobachtet werden konnte. Wegen der Bindung von Aven und ΔAven an Caspase-9 konnte mit diesen Experimenten nicht festgestellt werden, ob Aven bzw. ΔAven Teil des gebildeten Apoptosomkomplexes sind, d. h. ob sie auch nach Apoptosombildung an Apaf-1 binden. Eine Hemmung der Apoptosomsbildung führt zur Inhibierung der Caspase-Aktivierungskaskade und damit zu verringerter Caspase-3 Aktivität. Entsprechend wurde die Caspase-3-Aktivität nach in vitro Apoptosominduktion bei Überexpression von ΔAven inhibiert, während das volle-Länge Aven keinen Einfluß auf die Caspase-3-Aktivität hatte. In weiteren Verlauf des Projektes wurden funktionelle Apoptoseexperimente mit transfizierten RKO-Zellen durchgeführt. Die Ergebnisse zeigten eine Protektion durch Aven und ΔAven nach Staurosporin- und UV- Behandlungen. Dabei zeigte ΔAven einen stärkeren anti-apoptotischen Effekt als das volle-Länge-Aven in vivo. Die Tatsache, dass ΔAven ein höheres anti-apoptotisches Potential als das volle-Länge-Aven-Protein aufweist, deutet auf eine mögliche Spaltung oder Konformationsänderung von Aven in vivo hin, die zur Entstehung eines aktiven anti-apoptotischen C-terminalen Proteins führt. Um dies nachzuweisen, wurden einzel- und doppel-getaggte Fusionskonstrukte kloniert. Western Blot Analysen mit dem anti-Aven B Antiserum zeigten zusätzlich zu der volle-Längen-Aven- Bande (50 kDa) eine kleinere immunreaktive Bande mit einer Größe von ca. 35 kDa. Nach Apoptoseinduktion nahm die relative Menge dieser kleineren Bande zu. Das 35 kDa Aven-Spaltprodukt wurde nicht nur nach Überexpression, sondern auch auf endogener Proteinebene detektiert. Es konnte gezeigt werden, dass diese Spaltung Caspasen-abhängig ist. Eine Behandlung der Aven-überexprimierenden Zellen vor Apoptoseinduktion mit dem Caspase-Inhibitor z-VAD-fmk blockierte die Spaltung von Aven vollständig. Gleiche Ergebnisse konnten mit dem endogenen Protein gezeigt werden. Obwohl die Aven-Sequenz keine in silico vorausgesagten Spaltstellen für Caspasen enthält, zeigten in vitro Experimente mit rekombinanter Caspase-3, dass Aven von Caspase-3 direkt prozessiert wird. In vivo Experimente mit Wildtyp-MCF-7-Zellen, die keine endogene Caspase-3 exprimieren, sowie mit transfizierten MCF-7-Zellen, die Caspase-3 stabil exprimieren, bestätigten dies. Aven wurde nur in den mit Caspase-3 transfizierten MCF-7-Zellen nach Staurosporin-Behandlung in das 35 kDa Fragment gespalten. Western Blot Analysen mit Antikörpern, die das N-terminale Ende von Aven erkennen (anti-Flag oder anti-Aven A) zeigten eine zusätzliche kleinere Bande. Dieses Spaltprodukt ist ungefähr 30 kDa groß, und im Vergleich mit dem 35 kDa Aven-Peptid veränderte sich seine Expression kaum unter apoptotischen Bedingungen. Dieses Aven-Fragment ist jedoch nicht das Ergebnis einer Caspase-Spaltung, weil seine Entstehung nicht durch z-VAD-fmk inhibiert wurde. Zusätzlich konnte gezeigt werden, dass auch Serin-Proteasen nicht für diese Spaltung verantwortlich sind. Western Blot Analysen mit Antikörpern, die gegen den C-Terminus von Aven gerichtet sind, zeigten erstaunlicherweise kein zusätzlichen Aven-Spaltprodukte, sondern nur das volle Länge-Aven-Protein. Offensichtlich ist das entstehende C-terminale Fragment nach Spaltung durch Caspase-3 instabil und kann nicht nachgewiesen werden. Zusätzliche, nicht näher identifizierte 40 und 45 kDa große Aven Spaltprodukte wurden in MCF7-Zellen detektiert, die jedoch nicht in RKO-, HeLa-, oder 293T-Zellen beobachtet wurden. Mit Hilfe einer frei verfügbaren Software (GrabCas; ein Programm, das auch Granzyme Bund Caspase-Spaltstellen voraussagt, die sich von den Konsensusspaltsequenzen unterscheiden) sowie mit Western Blot Analysen von verschiedenen Aven-Deletionsmutante sollten potenzielle Schnittstellen näher charakterisiert werden. Dabei wurde die Spaltung durch Caspase-3 bei D293 (oder D287) bestätigt. Außerdem wurden zusätzliche mögliche Spaltstellen bei aa 240 oder zwischen aa 142-175 in Aven gefunden. Eine Spaltung zwischen den Aminosäuren 142 und 175 würde zu einem ähnlichen C-terminalen Aven-Peptid führen wie das artifizielle ΔAven und sollte von daher potente anti-apoptotische Eigenschaften aufweisen. Eine weitere Spaltstelle wurde ungefähr bei aa 100 kartiert. Die Isolierung von Aven Spaltprodukten aus eindimensionalen SDS-PA Gelen für eine nachfolgende massenspektrometische Analyse war aus technischen Gründe leider nicht erfolgreich. Die vorausgesagte Aven-Prozessierungsstellen sowie die in Western Blot Analysen beobachteten Aven-Fragmente lassen die Schlussfolgerung zu, dass Aven nach proteolytischer Aktivierung (d. h. nach Abspaltung inhibierender N-terminaler Sequenzen) anti-apoptotische Eigenschaften annimmt. Das generierte C-terminale Peptid wird dann möglicherweise durch Caspase-3-Spaltung bei D293 inaktiviert, wenn ein starker apoptotischer Stimulus auftritt. Zu Aufklärung der physiologischen Funktion von Aven in Normalgewebe und um zu untersuchen, ob Aven bei der Tumorentstehung eine Rolle spielt, wurden verschiedene Mausmodelle etabliert. Dazu wurde die humane Aven-cDNA zum einen unter der Kontrolle eines Hühner-ß-Aktin-Promotors und eines CMV-Enhancers kloniert. Diese Kombination regulatorischer Elemente sollte zu einer hohen und ubiquitären Expression des Transgens führen. Zusätzlich wurde die humane Aven-cDNA in den Vektor p1017 unter die Kontrolle des proximalen lck-Promotors kloniert, der eine Expression in unreifen T Zellen erlaubt. Die Etablierung der Mauslinien wurde in Kollaboration mit dem GSF-Institut für Experimentelle Genetik (AG Prof. M. Hrabé de Angelis) in München durchgeführt. Bei einer Untersuchung der Organe zeigte sich, dass in der ß-Aktin Aven-transgenen Maus eine starke Überexpression von Aven nur im Herz nachgewiesen wurde. Diese transgenen Mäuse werden zurzeit in Kollaboration mit Dr. S. Barrère-Lemaire (Institut of Functional Genomics, Montpellier, Frankreich) analysiert. Des Weiteren wurde im Rahmen dieser Arbeit auch eine lck Aven-Maus Linie untersucht. Western Blot Analyse zeigten eine starke Proteinexpression des Transgens im Thymus und auch in reifen T-Zellen (Milz). Mit Hilfe des anti-Aven C Antiserums konnte im Western Blot ein weiteres, vorher nicht beobachtetes Aven-Spaltprodukt in Thymozyten und aufgereinigten periphären T-Zellen nachgewiesen werden. Diese Überexpression von Aven in Thymozyten und gereinigten T-Zellen hatte jedoch keine messbare Inhibition von Apoptose zur Folge. Dagegen wurde eine Inhibition der aktivierungsinduzierten Proliferation von T-Zellen in transgenen Aven-Mäuse beobachtet. Bemerkenswerterweise zeigten die transgenen Aven-Mäuse keine spontane Tumorentwicklung obwohl eine Korrelation zwischen Aven-Expression und einer schlechten Prognose in Kinderleukämien publiziert worden ist. Um zu untersuchen, ob Aven in Kombination mit anderen Onkogenen in Tumorentstehung oder Progression kooperieren kann, sollen transgene Aven-Mäuse mit anderen transonkogenen Mausstämmen (z.B. p53-/- Mäusen) gekreuzt werden.
Protonen gekoppelter Elektronentransfer ist ein zentraler Bestandteil der chemiosmotischen Theorie. Die Beschreibung seiner Natur ist aufgrund seines transienten Charakters eine komplexe Aufgabe. Elektrometrische Messungen stellen hier eine große Hilfe in der Erfassung von Ladungsverschiebungen dar. Sie erlauben die zeitliche Beschreibung des Elektronen- und Protonentransportes, der mit kaum einer geeigneten Methode beobachtet werden kann, und geben Einblick in deren molekularen Mechanismus. Diese Technik wurde hier an drei verschiedenen Membrankomplexen der Atmungskette angewandt: der Cytochrom c Oxidase (COX) aus Paracoccus denitrificans, der Quinol-Fumarat-Reduktase (QFR) aus Wolinella succinogenes und dem bc(1)-Komplex aus Saccharomyces cerevisiae. Hinsichtlich der experimentellen Vorgehensweise für kinetische Untersuchungen stellte sich ein übergreifendes Problem. Neben einer schnellen Aktivierung der Enzymsysteme bedurfte es eines definierten Ausgangszustands. Ziel dieser Arbeit war das Etablieren von Bedingungen, die elektrometrische Messungen am bc(1) und der QFR erlauben, sowie die Fortführung dieser Methodik am bereits vorhandenen System der COX. Cytochrom c Oxidase Elektrometrische Untersuchungen an der COX wurden basierend auf Vorarbeiten weitergeführt. Insbesondere die Ladungsverschiebungen nach Photoreduktion ausgehend vom völlig oxidierten Zustand rückten in den Fokus. In diesem Schritt wird ein Proton aufgenommen, während Häm a vom angeregten Zustand eines Rutheniumkomplexes reduziert wird. Dieses Verhalten ist unabhängig vom heterogenen Ausgangszustand der COX, er wird jedoch durch eine Änderung des pH-Wertes beeinflußt. Der heterogene Ausgangszustand im O-E-Übergang wurde in einem sequentiellen Modell diskutiert. Dabei wurde auf die Diskrepanz zwischen den elektrometrischen und den publizierten spektroskopischen Messungen hingewiesen. Während spektroskopisch die Cu(A)-Oxidation und Häm a-Reduktion in einer Phase verliefen, wurde in den elektrometrischen Messungen eine zweite deutlich langsamere Phase für den Protonentransfer beobachtet. Ein sequentielles Reaktionsmodell führte hier zu einem Widerspruch. Die Auswirkungen auf die Natur der Kopplung von Häm a und dem aufgenommenen Proton wurden diskutiert. Die Kinetik der Ladungsverschiebung wurde detailliert anhand der Temperaturabhängigkeit und des Isotopeneffektes untersucht und mit den Ergebnissen aus den Messungen an einem thermophilen Enzym, der ba(3)-Oxidase aus Thermus thermophilus, verglichen. Quinol-Fumarat-Reduktase Für eine schnelle Aktivierung der QFR wurde ein caged Fumarat synthetisiert, das nach Photolyse zu einer schnellen Erhöhung der Fumaratkonzentration führte. Die neue Substanz wurde bezüglich einer möglichen Verwendung für die QFR charakterisiert. Die Freisetzung erfolgte mit einer Zeitkonstante von 0,1 ms und aktivierte die QFR nur im photolysierten Zustand. Aufgrund der Photochemie der metallischen Kofaktoren in der QFR konnten jedoch keine kinetischen Messungen durchgeführt werden. Da die photochemisch induzierten Elektronenbewegungen in der QFR mit zunehmender Wellenlänge abnahmen, wurde eine neue Substanz vorgeschlagen, die im sichtbaren Spektralbereich gespalten werden kann. bc(1)-Komplex Der bc(1)-Komplex kann wie die COX durch einen Rutheniumkomplex aktiviert werden. Ein dimerer sowie ein an Cytochrom c gekoppelter Rutheniumkomplex wurde hierfür anhand von Literaturdaten synthetisiert, und die Verbindungen wurden hinsichtlich ihrer Eigenschaften nach Lichtanregung charakterisiert. Für die elektrometrischen Messungen wurde der bc(1)-Komplex in Proteoliposomen rekonstituiert, und der Ausgangszustand des bc(1)-Komplexes unter reduktiven und oxidativen Bedingungen eingestellt. Mit dem dimeren Rutheniumkomplex wurden elektrometrische Experimente durchgeführt, die zu zwei Phasen in der Spannungsantwort führten. Die Daten wurden zusammen mit den publizierten spektroskopischen diskutiert. Dabei wurde eine schnelle elektrogene Phase einem Elektronentransfers zwischen Häm c(1) und dem Eisen-Schwefel-Cluster des Rieske-Proteins zugeordnet. Eine langsamere Phase erwies sich sensitiv gegenüber Antimycin und spiegelt Vorgänge unter der Kontrolle der Q(i)-Bindungsstelle wider.
Glycin ist ein wichtiger inhibitorischer Neurotransmitter im zentralen Nervensystem. Um die glycinerge Erregungsübertragung zu sichern, muss die Glycinkonzentration an Synapsen präzise reguliert werden. Hierfür sind die Glycintransporter, GlyT1 und GlyT2, verantwortlich. Der GlyT2 ist ein präsynaptisches Protein, das in glycinergen Nervenendigungen nahe der aktiven Zone lokalisiert ist. Das über den Transporter aus dem extrazellulären Raum aufgenommene Glycin steht anschließend für die Befüllung der synaptischen Vesikel durch den vesikulären inhibitorischen Aminosäuretransporter (VIAAT) zur Verfügung. Die GlyT2-Defizienz führt in Mäusen zu einem letalen Phänotyp und verdeutlicht die Notwendigkeit eines hochaffinen Glycinaufnahmesystems in glycinergen Neuronen. Um mögliche Mechanismen zu untersuchen, die zur präzisen Lokalisation des GlyT2 in der Präsynapse führen, wurde das PDZ-Domänenbindungsmotiv (PDZ-DBM) am extremen C-Terminus bzw. die lange N-terminale Domäne dieses Transporters deletiert. Durch biochemische und pharmakologische Analysen von transfizierten HEKT-Zellen konnte gezeigt werden, dass der Verlust des PDZ-DBM oder der N-terminalen Domäne die Proteinexpression, die Glykosylierung und die Transportaktivität des GlyT2 nicht beeinflussten. Längere Deletionen des N-Terminus (ΔAA1-184) setzten jedoch die Effizienz der Glycinaufnahme herab und ergaben im Vergleich zum wt-Protein einen um 60% reduzierten vmax-Wert, während die apparente Glycinaffinität (KM-Wert) unverändert blieb. Lokalisationsstudien und Oberflächenbiotinylierungen zeigten GlyT2 wt-Immunreaktivität an der Plasmamembran, die sich qualitativ und quantitativ nicht von denen der N- und C-terminalen Mutanten unterschied. Das PDZDBM und die N-terminale Domäne spielen folglich in der Prozessierung und der Transportfunktion des GlyT2 eine untergeordnete Rolle. Möglicherweise reduziert die fast vollständige Deletion der N-terminalen Domäne jedoch die Stabilität des GlyT2. In transfizierten hippocampalen Neuronen wurde der Einfluss des PDZ-DBM und der N-terminalen Domäne hinsichtlich der GlyT2 Lokalisation analysiert. Die transfizierten Mutantenproteine zeigten eine diffuse Verteilung mit partiellen Anreicherungen von GlyT2-Immunreaktiviät. Das wt-Protein kolokalisierte mit Synaptophysin, exzitatorischen synaptischen Markern wie PSD95 und mit den inhibitorischen Markern Gephyrin und VIAAT. Nach Deletion des PDZ-DBM hingegen zeigte der GlyT2 eine um ca. 50% verminderte Kolokalisation mit allen untersuchten synaptischen Markern. Damit konnte hier erstmals eine Funktion des PDZ-DBM für die Anreicherung von GlyT2 an Synapsen gezeigt werden. Mit N-terminalen Deletionsmutanten transfizierte hippocampale Neurone wiesen kolokalisierende GlyT2ΔN-PSD95-Puncta zumeist in MAP2-positiven Neuriten auf, während das wt-Protein zumeist in MAP2-negativen Neuriten kolokalisierte. MAP2 ist ein mikrotubuli-assoziertes Protein, das in Dendriten, aber nicht in Axonen, auftritt und somit eine Unterscheidung derselben ermöglicht. Aufgrund der Überexpression in transfizierten Neuronen war die GlyT2-Immunreaktivität aber sowohl in axonalen als auch dendritischen Neuriten zu beobachten. Zusätzlich zu der in größeren Clustern gefundenen synaptischen GlyT2ΔN-Immunreaktivität war eine Färbung hauptsächlich in sehr kleinen Strukturen (<= 1 μm) nachzuweisen, die Transportvesikeln entsprechen könnten. Dies ist mit einem längeren Verbleib der Deletionsmutanten in intrazellulären Strukturen erklärbar. Im Hippocampus wird GlyT2 endogen nur sehr schwach in einer Subpopulation von putativ glycinergen Neuronen exprimiert. Um die Lokalisation der N-terminalen GlyT2-Proteine in Zellen zu untersuchen, die eine hohe endogene GlyT2-Expression aufweisen, wie spinalen Neuronen, die sich aber nur schlecht transfizieren lassen und in Kultur keine adulte GlyT2-Lokalisation aufweisen, wurden BAC-transgene Mäuse generiert, die myc-markierte GlyT2ΔN-Proteine unter Kontrolle des GlyT2-Promotors exprimieren. Der Vorteil von BAC-transgenen Mauslinien ist, dass sie aufgrund der Verwendung des endogenen Promotors das Transgen nur schwach überexprimieren. Founder-Mäuse, in denen der jeweilige modifizierte BAC-Klon (mGlyT2 wt, ΔAA14-174 oder ΔAA14-184) integriert wurde, wurden identifiziert und mit C57BL/6J-Mäusen verpaart, um so transgene Mauslinien zu etablieren und die Lokalisation der mutierten GlyT2-Proteine zu analysieren. Zusätzlich wurde eine BAC-transgene Cre-Mauslinie generiert, die die Cre-Rekombinase in GlyT2-positiven Zellen exprimiert. Durch die Verpaarung mit konditionalen oder transgenen Mauslinien soll mit diesen GlyT2/Cre-Mäusen die Funktion einzelner Genprodukte in glycinergen Zellen untersucht werden. In dieser Arbeit wurden außerdem die Glycinrezeptor (GlyR) α-Untereinheiten (UE) in GlyT2-defizienten Mäusen untersucht. GlyT2 -/- Tiere sterben in der zweiten postnatalen Woche nach der Geburt und zeigen einen starken neuromotorischen Phänotyp. Da in demselben Zeitraum ein Austausch der embryonalen α2- durch die adulte α1-UE erfolgt, wurde die Entwicklung der α1- und der Gesamt-α- Immunreaktivität in Rückenmarksschnitten von wt und GlyT2 -/- Tieren analysiert und miteinander verglichen. Die Daten zeigen, dass der α-UE-Austausch in den GlyT2-defizienten Tieren ähnlich wie in wt Tieren erfolgt. In α1-GlyRs ist die Öffnungszeit des aktivierten Kanals kürzer als bei α2-GlyRs. Zusammen mit der geringeren Ausschüttung an Glycin aufgrund der GlyT2-Defizienz lässt sich so das Auftreten des Krampf-Phänotyps der GlyT2 -/- Mäuse nach erfolgtem UE-Austausch erklären.
Der mitochondriale Apoptose-Signalübertragungsweg spielt nicht nur bei der Death Rezeptor-induzierten Apoptose in Typ II-Zellen eine Rolle, sondern z.B. auch bei Bestrahlung und Behandlung mit Chemotherapeutika. Über Cytochrom-c Freisetzung, Apoptosombildung und Caspase-9 Aktivierung kommt es zur Spaltung und Aktivierung der Effektorcaspase-3. Die durch Bindung von dATP und zytosolischem Cyt-c induzierte Konformationsänderung von APAF-1 führt nach anschließender ATP-Hydrolyse zur Oligomerisierung von insgesamt sieben APAF-1-Molekülen unter gleichzeitiger Rekrutierung von Caspase-9 über die in beiden Molekülen vorhandene N-terminale Caspase-Rekrutierungsdomänen (CARD). Es entsteht der so genannte Apoptosomkomplex. Die autoproteolytische Prozessierung und Aktivierung von Caspase-9 mit anschließender Spaltung von Caspase-3 im Apoptosomkomplex führt zum Auslösen der apoptotischen Caspasekaskade und zur Spaltung wichtige zellulärer Substrate. Eine wichtige Rolle bei der Regulation der Apoptosom-vermittelten Caspase-9-Aktivierung spielen u.a. die Mitglieder der Bcl-2 Proteinfamilie, die IAPs und Hitzeschockproteine. Die Blockade des intrinsischen Apoptose-Signalübertragungsweges führt in Tumoren zur Resistenzentwicklung gegenüber Chemo- und Strahlentherapie. Deshalb wurde mit Hilfe des Hefe-Two-Hybrid Systems ein Screen nach neuen regulatorischen Proteinen, die an der Apoptosomkomplex-Bildung beteiligt sind, durchgeführt und dabei ein neuer APAF-1 Interaktionspartner entdeckt, den wir CABY („CED-4 and APAF-1 binding protein found in yeast“) genannt haben. CABY ist ein 160 Aminosäuren großes, pro-apoptotisches Protein, das eine so genannte DUF59 Domäne enthält, für die bisher noch keine Funktion beschrieben wurde. Es konnte nachgewiesen werden, daß CABY ein evolutionär hoch konserviertes Protein darstellt und daß die humane CABY cDNA zwei alternative Translations-Initiationsregionen enthält, die zu der Expression der CABYL bzw. der um 32 Aminosäuren verkürzten CABYS Isoformen führen. Im Rahmen dieser Arbeit sollte darüber hinaus eine detaillierte molekulare und funktionelle Analyse von CABY durchgeführt werden. Als Hilfsmittel für die molekularbiologische Analyse wurden sowohl CABY-spezifische polyklonale Antiseren als auch Hybridoma-Zelllinien hergestellt, die monoklonale anti-CABY Antikörper produzieren. Mit biochemischen Untersuchungen wie in vitro GST Pulldown und in vivo Ko-Immunpräzipitationsexperimenten, sowie durch Ko-Lokalisationsstudien mit überexprimierten und endogenen Proteinmengen konnte die Bindung von CABY an APAF-1 verifiziert werden. Mit Hilfe von APAF-1-Deletionsmutanten wurden die Aminosäuren 412-420 der zentralen Linkerdomäne als verantwortlicher Bereich für die Interaktion mit CABY identifiziert. Interessanterweise bindet CABY in vitro zusätzlich sowohl an die N-terminale CARD Domäne von APAF-1 als auch an Pro-Caspase-9. Ko-Immunpräzipitationsexperimente mit endogenen Proteinen konnten zeigen, daß CABY in gesunden Zellen nicht nur mit dem vollständigen APAF-1 Protein, sondern auch mit der verkürzten 84 kDa großen APAF-1-Isoform in einem Komplex assoziiert vorliegt. Zudem konnte nachgewiesen werden, daß CABY-Proteine homophile Interaktionen eingehen und Dimere ausbilden können. Neben den Untersuchungen zur Interaktion von CABY mit APAF-1 wurden auch funktionelle Analysen mit Hilfe dominant negativer CABY Deletionsmutanten sowie mit siRNA Zellkulturexperimenten durchgeführt, um die Bedeutung von CABY für den intrinsischen mitochondrialen Apoptose Signalübertragungsweg untersuchen zu können. Es wurde festgestellt, daß bei Überexpression von CABY die Zellen für Mitomycin C-induzierte Apoptose sensitisiert werden. Die Überexpression einer C-terminal um 20 Aminosäuren deletierten CABY Mutante wie auch der N-terminal verkürzten CABYS Isoform inhibieren jedoch Mitomycin C-induzierte Apoptose. Die Ergebnisse aus CABY siRNA-Knockdown-Experimenten lassen vermuten, daß CABY-ähnliche funktionell redundante Proteine existieren. In den mit CABY siRNA stabil transfizierten K562- und RKO-Zelllinien konnte festgestellt werden, daß der Verlust endogener CABY-Expression in diesen Zelllinien nur einen geringen Einfluss auf das Apoptoseverhalten ausübt, und zwar unabhängig von der Art des eingesetzten apoptotischen Stimulus. Einen Hinweis auf einen möglichen kompensatorischen Mechanismus liefert die Existenz des ribosomalen Proteins S28e, dessen DUF59-Domäne zu über 90% identisch ist mit der CABY-DUF59-Domäne. S28e könnte potentiell CABY-Funktionen ausüben. Ausgehend von mit der pro-apoptotischen Funktion von CABY wurde nach Tumortypen gesucht, in denen die CABY-Expression im Vergleich zum Normalgewebe signifikant herunterreguliert wird. Die Analyse endogener CABY Expressionsmengen in humanen Tumoren konnte dabei einen Verlust an CABY Expression in GIST-Tumoren nachweisen. Dieses Ergebnis weist auf eine mögliche Rolle von CABY als Tumorsuppressorprotein hin.
One of the central research topics in the field of biophysical chemistry is the structure and function of membrane proteins involved in energy transduction. Both, the aerobic and the anaerobic respiration include electron transfer and proton translocation across the mitochondrial and bacterial membranes. These electron transfer processes lead to changes in oxidation states of cofactors some of which are paramagnetic. Therefore, EPR spectroscopy is the method of choice to obtain electronic and structural information directly related to the function of the respiratory chain proteins. In this work, multifrequency continuous wave (CW) and pulsed EPR spectroscopy has been used to characterize the molybdenum active site of polysulfide reductase (Psr) from the anaerobic bacterium Wolinella succinogenes and the protein-protein complex between cytochrome c oxidase (CcO) and cytochrome c from the aerobic bacterium Paracoccus denitrificans. Molybdenum in Psr-Psr is an enzyme essential for the sulfur respiration of Wolinella succinogenes. Biochemical studies suggested that the active site of this enzyme contains a mononuclear Mo center, which catalyzes the reduction of the substrate polysulfide to sulfide. Until now there is no crystal structure available for Psr. Consequently, current characterizations of this enzyme have to rely on biochemical and spectroscopic investigations. Within the present work, CW and modern pulsed EPR techniques were applied to investigate its catalytically active site. In the first part of this thesis, different redox agents have been used to generate paramagnetic states of Psr. Multifrequency CW-EPR spectroscopy was applied to identify the Mo(V) states. Using simulations of the experimental spectra, three spectroscopically distinct states have been identified based on the Mo hyperfine- and g-tensor values. Comparison of their EPR parameters with those of related enzymes indicated five or six sulfur ligands at the Mo center depending on the state. The state generated by addition of polysulfide is suggested to be the catalytically active form, in which the Mo is coordinated by a sulfur of the polysulfide chain as the sixth ligand. 33S (I = 3/2) labeled polysulfide was prepared to probe the proximity of the polysulfide to the molybdenum center via its hyperfine coupling. 1D-ESEEM and 2D122 HYSCORE spectroscopy was used to detect these hyperfine and quadrupole interactions, which are too small to be observed in conventional CW EPR spectra. To date there has been only one pulsed-EPR study involving a 33S nucleus [Finazzo et.al. 2003]. The reasons are that this nucleus has a high nuclear spin of I = 3/2 and a large nuclear quadrupole moment in addition to the low Larmor frequency. All these make the detection of sulfur and the extraction of structural information demanding. However, analysis of the 2D-data led to a Mo(V) 33S distance in a range of about 2 to 2.5 Å. Mo-S distances found in molybdenum enzymes of the same family are in a range of 1.8 to 2.8 Å suggesting that the 33S is indeed the sixth ligand of the Mo(V) center and demonstrating that polysulfide is the actual substrate for this enzyme. Thus HYSCORE experiments have been proved to be a powerful technique to gain further insight into the active site structures of molybdenum enzymes and the trafficking of substrate atoms during catalysis. Density functional theory (DFT) calculations together with quantitative numerical simulations of the 2D-data will help to obtain more structural details about the molybdenum binding site in Psr. CcO:cytochrome c complex Protein-protein complex formation is an important step in energy conversion biological processes such as respiration and photosynthesis. These protein-protein complexes are involved in long range electron transfer reactions and are known to be of transient nature. Within the bacterial and mitochondrial respiratory electron transport chains such a complex is formed between CcO and cytochrome c. Upon complex formation cytochrome c donates the electrons required for the CcO catalyzed reduction of dioxygen to water. Here, the protein-protein complex formation between CcO and cytochrome c from Paracoccus denitrificans was investigated by pulsed EPR spectroscopy. The idea was to use the relaxation enhancement due to the distance and orientation dependent magnetic dipole-dipole interaction between the paramagnetic centers in the different CcO constructs and cytochromes. Two-pulse electron spin echo experiments were carried out on mixtures of the CuA containing soluble subunit II or the full size CcO with the physiological partner cytochrome c552 or horse heart cytochrome c. Significantly enhanced relaxation of CuA due to specific protein-protein complex formation has been observed in all four cases. In contrast the non-binding cytochrome c1 showed only a very weak relaxation enhancement due to unspecific protein-protein interactions. The echo decays of the slowly relaxing observer spin (CuA of CcO) measured in the absence and presence of the fast relaxing spin (Fe(III) of cytochrome c) permitted the extraction of the pure dipolar relaxation contributions for the different complexes. Measurements at different temperatures proved the dipolar nature of the relaxation enhancement. Furthermore, it was demonstrated experimentally that this approach also works for the full-size CcO, which contains four paramagnetic metal centers, in complex with cytochrome c. Quantitative simulations of the data suggest a broad distribution in distances (2 - 4 nm) and orientations between the CuA and Fe(III) in the complex between CcO and cytochrome c. High-field EPR spectroscopy will be useful to further analyze and prove these complex structures. Within the present work, it has been shown that pulsed relaxation enhancement experiments can be used to investigate the distance and relative orientation between paramagnetic metal centers. Furthermore, it has been demonstrated on a qualitative level, that this method can be used complimentary to other biophysical approaches to study transient electron transfer protein-protein complexes. Finally, within this work it has been proven that this method can be applied also to biological systems where more than two paramagnetic centers are present. This is particularly interesting for supercomplexes between membrane proteins.
In der vorgelegten Arbeit wurden 50 Mutationen von Aminosäuren im Bereich der Chinoloxidationsbindungsstelle (Qo-Site) des bc1-Komplexes aus Paracoccus denitrificans untersucht. Hierzu wurden die Mutanten erstellt, Kinetiken der Substratbindung bestimmt und EPR Spektren aufgenommen. Mit den gleichen Methoden wurden auch verschiedene Klasse I und Klasse II Inhibitoren der Qo-Site untersucht. Wenngleich der Reaktionsmechanismus auch mit Hilfe dieser Mutationen nicht vollständig aufgeklärt werden konnte, so konnten doch neue Einsichten in die Funktionsweise des bc1-Komplexes gewonnen werden. Verschiedene Modelle wurden vorgeschlagen, um die energetisch günstige aber thermodynamisch unwahrscheinliche Verzweigung der beiden Elektronen des Ubichinols auf die beiden Redoxketten des bc1-Komplexes der Atmungskette zu beschreiben. Da die Redoxpotentiale der beiden primären Elektronenakzeptoren extrem unterschiedlich sind, scheint es zwingend zu sein, dass beide Elektronen den Hochpotentialzweig (Rieske, Cytochrom c1, Cytochrom c) durchlaufen. Energetisch bietet jedoch die Wiederverwendung eines der beiden Elektronen den immensen Vorteil der realen Verdopplung der Protonenpumpleistung. Die wichtigsten Mutationen der vorliegenden Arbeit betreffen die vermuteten direkten Bindungspartner des Ubichinols, bE295 und fH155. Das Histidin ist Teil der beweglichen Rieske Untereinheit des bc1-Komplexes, das Glutamat ist Teil eines hoch konservierten Abschnitts des Cytochrom b. Aufgrund der gemessenen Wirkungen der untersuchten Mutationen auf die kinetischen Kennzahlen und EPR Parameter der eingesetzten Substrate und Inhibitoren lassen sich folgende Schlüsse ziehen. Die Bindung des Chinol-Substrats in der Qo-Site benötigt die korrekte Ausrichtung und den unveränderten Bindungspartner fH155 der Rieske [2Fe-2S]-Gruppe. Das Fehlen des zweiten vermuteten Bindungspartners bE295, der ein Teil des hochkonservierten PEWY-Loops ist, wird hingegen toleriert. Die Aktivitäten bei Mutationen dieser Aminosäure liegen mit bis zu 56% im Vergleich zum Wildtyp (bE295A) relativ hoch. Auch unter Berücksichtigung von möglichen bypass Reaktionen ist es fraglich, ob das Glutamat des PEWY-Loops ein direkter Bindungspartner des Substrats ist. Der Inhibitor Stigmatellin bindet im bc1-Komplex von Paracoccus denitrificans irreversibel in der Qo-Site, auch wenn einer der beiden vermuteten Bindungspartner (bE295 bzw. fH155) nicht verfügbar oder verändert ist. Daraus kann man schließen, dass die Bindung des Stigmatellins im Wesentlichen von seiner Seitenkette im Bereich des Chinol-Eintrittskanals des bc1-Komplexes stabilisiert wird. Wechselwirkungen der bizyklischen Kopfgruppe mit Aminosäuren der Chinoloxidationsbindungstasche sind hierfür nicht zwingend notwendig. Weitere durchgeführte Mutationen lassen folgende weitere Rückschlüsse zu: Der korrekte Bindungsraum der Qo-Site ist für eine maximale Umsatzgeschwindigkeit des bc1-Komplexes erforderlich. Dies zeigen Mutationen von bG158 und bV161. Die Struktur des hochkonservierten PEWY-Loops ist mitentscheidend für die Aktivität des bc1-Komplexes. Störungen der Konfiguration in diesem Bereich führen zu einer deutlichen Abnahme der Aktivität. Dies lassen Mutationen von bY297, bP294 und bW296 erkennen. Der ef-Loop hat einen Einfluss auf die Bewegungsvorgänge der Rieske-Kopfgruppe. Er ist jedoch nicht sehr flexibel (bL286H). Veränderungen im Wasserstoffbrückennetzwerk der Rieske-Kopfgruppe führen zu einer deutlichen Verminderung der Elektronentransferraten (bY159F, bS157A und bF151H). Die Bindungsregionen von Klasse I Inhibitoren in der Qo-Site überlappen mit denen des natürlichen Substrats. Sie sind jedoch nicht identisch, was sich im unterschiedlichen Verhalten einiger Mutationen auf die Aktivität von Substrat und die Inhibitionswirkung von Klasse I Hemmstoffen ausdrückt. Die Untersuchungen der Auswirkungen von Mutationen auf einen vermuteten Wasserkanal im Bereich des Häm bL und auf eine angenommene Zinkbindungsstelle im gleichen Bereich zeigen keine eindeutig interpretierbaren Ergebnisse. Die Mutationsstudien im Bereich des Cytochrom c1 wurden begonnen. Zusätzliche Mutanten in diesem Bereich könnten weiterführende Aufschlüsse über die Wechselwirkung der Rieske-Kopfgruppe mit Cytochrom c1 bringen. Die vorgelegte Studie lässt erkennen, dass die Vorgänge in der Qo-Site des bc1-Komplexes aus Paracoccus denitrificans höchst komplex sind. Zusätzliche Untersuchungen der erzeugten Mutanten mit Hilfe weiterer Detektionsmethoden, insbesondere CD- und FTIR-Messungen, könnten in Zukunft eine noch bessere Einsicht in die Vorgänge dieses wichtigen Komplexes der Atmungskette geben.
Humane hämatopoetische Stammzellen (HSCs) besitzen die Fähigkeit zur Selbsterneuerung und übernehmen die kontinuierliche Neubildung aller zellulären Bestandteile des Blutes. Aufgrund der zunehmenden klinischen Bedeutung der HSCs ist es essentiell die molekularen Mechanismen, die den Prozess der Vermehrung und Differenzierung von humanen hämatopoetischen Stammzellen steuern, aufzuklären und deren funktionelle Bedeutung zu verstehen. Das Ziel der Arbeit war die Identifizierung, Charakterisierung und gerichtete Modulation funktionell relevanter Signalwege, die am Differenzierungsprozess von HSCs zu myeloiden Effektorzellen beteiligt sind. Für diese Untersuchung wurde ein Expansionsprotokoll für humane HSCs, sowie ein Differenzierungsprotokoll für das humane myeloide DC Differenzierungsmodell entwickelt. In der Arbeit wurden drei wichtige Signalwege der Zelle, die Mitogenen Signalkaskade (MAPK), Protein Kinase C (PKC) gekoppelten Prozessen und dem JAK/STAT Signalweg untersucht. Die vorliegende Arbeit zeigt, daß die Stimulation der HSCs mit GM-CSF und IL-4 zu einer zeitlich begrenzten Aktivierung von MAPK/ERK1/2, PKC delta, JAK2, sowie STAT5 und STAT6 führte. Kommerzielle Inhibitoren von MEK, PKC und Januskinase hemmten selektiv diese Aktivierung und führten zu einer veränderten Hämatopoese. Die Aktivierung dieser Signalwege ist daher für die myeloide Differenzierung von HSCs zu Dendritischen Zellen von entscheidender Bedeutung. Einer der entscheidenden nuklearen Faktoren für die myeloide Differenzierung ist der Ets-Transkriptionsfaktor PU.1, dessen Aktivität durch Phosphorylierung reguliert sein könnte. Obwohl die funktionelle Rolle von PU.1 in der Differenzierung von HSC in der vorliegenden Arbeit nicht vollständig geklärt werden konnte, wurde jedoch erstmals im in vitro Kinase-Assay gezeigt, daß PU.1 durch PKC delta, aber nicht durch MAPK/ERK2 spezifisch phosphoryliert wird. In einem PU.1-spezifischen Luciferasereporter-Assay wurde die transkriptionelle Aktivität von PU.1 durch die Inhibition von PKC delta und MAPK/ERK1/2 deutlich reduziert. Weiterführende Experimente in einem komplexen Differenzierungsmodell von humanen HSCs wiesen darauf hin, daß durch den gezielten Einsatz von Signalweginhibitoren eine Verschiebung der Verhältnisse der gebildeten Blutzellkolonieformen erreicht werden kann. So war die Differenzierung zu Erythrozyten von der Mitogenen Signalkaskade unabhängig, wohingegen die Differenzierung zu Makrophagen eine deutliche Abhängigkeit von der Aktivität der Mitogenen Signalkaskade sowie von der Aktivierung des Protein Kinase C Signalwegs zeigte. Im Gegensatz dazu führte die Inhibition der Januskinasen (JAKs) zu einer Hemmung der Differenzierung in allen Kolonieformen. Insgesamt zeigten die Ergebnisse, daß der MAPK/ERK und PKC delta Signalweg bei der Differenzierung von humanen hämatopoetischen Stammzellen eine wichtige Rolle spielen und eine gerichtete Steuerung der Differenzierung durch den Einsatz spezifischer Signalweginhibitoren möglich erscheint.
Das Bakterium Thermus thermophilus hat sich in den letzten Jahren zu einem Modell für thermophile Organismen entwickelt. Die maximale Wachstumstemperatur liegt bei bis zu 85°C, so dass auch Proteine und die gesamte Zellstruktur an diese hohen Temperaturen adaptiert sein müssen. Aufgrund der allgemein erhöhten Stabilität werden diese Proteine zunehmend für biotechnologische Prozesse und zur Strukturbestimmung verwendet. Im Energiehaushalt der Zelle ist der Elektronentransfer von NADH zu molekularem Sauerstoff ein wesentlicher Bestandteil und wird durch transmembrane Enzymkomplexe vermittelt. In dieser Arbeit konnten vier direkt aufeinanderfolgende Gene (fbcC, fbcX, fbcF, fbcB) identifiziert werden, die in einem 3,1 kb großen Operon mit einem GC-Gehalt von 69% organisiert sind und für die Untereinheiten eines putativen Thermus bc-Komplexes kodieren. Die in silico translatierte DNA-Information konnte für ausführliche Sequenzvergleiche und eine erste Charakterisierung der bc-Untereinheiten genutzt werden. Während Cytochrom b und das Rieske-Protein typische Eigenschaften zu anderen prokaryotischen Untereinheiten aufweisen, unterscheidet sich die Cytochrom c-Untereinheit hinsichtlich Topologie und Verwandtschaft von klassischen c1-Komponenten. Darüber hinaus wurde eine zusätzliche Untereinheit FbcX identifiziert, die keine Entsprechung in bisher bekannten bc-Komplexen hat. Das gesamte Operon mit vorangestellter d70 Promotorregion wurde amplifiziert, in einen Thermus/E.coli-Shuttlevektor mit hitzeoptimierter Kanamycinresistenz eingefügt und so plasmidkodiert für die Überexpression in T. thermophilus HB27 genutzt. Der membranständige Gesamtkomplex wurde nach Solubilisierung mit ß-D-Decyl-Maltosid stabil in Lösung gebracht und anschließend über eine Metallaffinitätssäule stöchiometrisch als vier-Untereinheiten Komplex aufgereinigt. Der Gesamtkomplex sowie seine Einzelkomponenten und deren Cofaktoren waren somit für eine nähere Charakterisierung verfügbar. Alle vier Genprodukte konnten als Untereinheiten des bc-Komplexes in T. thermophilus über N-terminale Sequenzierung und MALDI-MS/MS eindeutig identifiziert werden. Der in vitro Aktivitätstest zeigte keine Hemmbarkeit des aufgereinigten Thermus Komplexes durch klassische bc-Inhibitoren, was auf eine deutlich abweichende Substratbindung dieses Menachinol-oxidierenden Komplexes hinweist. Durch Optimierung des Thermus/E.coli-Shuttlevektors wurde auch die homologe Überexpression weiterer Thermus-Membranproteine ermöglicht. Dazu gehört neben der ba3-Oxidase auch ein MDL-ähnlicher ABC-Transporter. Weiterhin wurde gezeigt, dass die thermostabilen Eigenschaften sowohl des bc-Komplexes als auch des ABC-Transporters in Detergenzumgebung erhalten bleiben. Dieser Nachweis konnte darüber hinaus auch für den heterolog exprimierten und aus E. coli aufgereinigten ABC-Transporter erbracht werden, der im isolierten Zustand die gleiche Aktivität wie das aus Thermus aufgereinigte Äquivalent aufweist. Neben dem bc-Gesamtkomplex, der ba3-Oxidase und Cytochrom c552 wurden in dieser Arbeit weitere Komponenten der thermophilen Atmungskette in löslicher Form oder mit Membrananker, zum Teil auch heterolog in E. coli exprimiert und unter Erhalt der Redox-Cofaktoren aufgereinigt. Mit der Identifizierung und Charakterisierung eines intakten Cytochrom bc-Komplexes konnte die Lücke im Verständnis der thermophilen Atmungskette von T. thermophilus geschlossen und die Grundlage für weitere Struktur- und Funktionsanalysen dieses membranintegralen Enzymkomplexes geschaffen werden.
Riboswitche sind hoch strukturierte RNA‐Elemente, die durch direkte Bindung von kleinen Metaboliten die Expression vieler bakterieller Gene kontrollieren. Sie bestehen aus einer Ligand‐bindenden Aptamerdomäne und einer so genannten Expressionsplattform. Im Zuge der Metabolitbindung an die Aptamerdomäne ändert sich die Konformation der Expressionsplattform. Diese Konformationsänderung führt zu einem vorzeitigen Abbruch der mRNA‐Transkription oder zu einer Inhibierung der Translationsinitiation. In Bacillus subtilis wurden zwei Klassen von Riboswitchen gefunden, die trotz einer sehr hohen Homologie in ihrer Primär‐ und Sekundärstruktur spezifisch zwischen den Purinen Guanin und Adenin unterscheiden.
Durch den direkten NMR‐spektroskopischen Nachweis von Wasserstoffbrückenbindungen konnte der Bindungsmodus von Adenin, Guanin und von weiteren Purinliganden an diese beiden Klassen von Riboswitch‐RNAs beschrieben werden. Für beide Purin‐Riboswitche wurde ein gemeinsamer Bindungsmechanismus des Purinliganden an die RNA beobachtet. Hierbei bildet der Purinligand ein intermolekulares Basentripel mit der Riboswitch‐RNA aus. Die Spezifität der Metabolitbindung ist das Resultat eines intermolekularen Watson‐Crick Basenpaars zwischen dem gebundenen Liganden Guanin und einem Cytidin bzw. zwischen dem Liganden Adenin und einem Uridin der jeweiligen Riboswitch‐RNA. Zusätzlich wurde eine zweite Basenpaarung zwischen der Riboswitch‐RNA und dem gebundenen Liganden entdeckt, die in beiden Riboswitch‐Klassen identisch ist und ein weiteres Uridin der RNA und die N3/N9 Seite des Purinliganden einschließt. Diese Basenpaarung entsteht durch ein bislang unbeschriebenes Wasserstoffbrückenbindungsmuster, das zur Affinität der RNA‐Ligand‐ Wechselwirkung beiträgt. Die beobachteten intermolekularen Wasserstoffbrückenbindungen zwischen der RNA und dem gebundenen Purinliganden erklären die beobachtete Spezifitätsumkehrung einer C zu U Mutation in der Ligandbindungstasche der Riboswitch‐ RNA und die Unterschiede der Bindungsaffinitäten von verschiedenen Purinanaloga.
Weiterhin wurden die Ligand‐ und Kation‐induzierten konformationellen Änderungen der isolierten Aptamerdomänen beider Purin‐bindenden Riboswitche und des gesamten Guanin‐ Riboswitches mittels NMR‐Spektroskopie untersucht. Demnach ist die Ligandbindungstasche in der Ligand‐ungebundenen Form unstrukturiert und Ligandbindung verläuft nach einem induced fit‐Mechanismus. Die Untersuchung der freien und Mg2+‐gebundenen Form der Ligand‐ungebundenen Aptamerdomäne zeigte Unterschiede zwischen den beiden eng verwandten Purin‐bindenden Riboswitchen. Während die Wechselwirkung zwischen den hoch konservierten Sequenzen der apikalen Schlaufen der Helix II und III in der Mg2+‐freien Form des Guanin‐Riboswitches vorgeformt ist, ist sie in der Mg2+‐freien Form des Adenin‐ Riboswitches nicht ausgebildet, wird jedoch in Gegenwart von Mg2+ ausgebildet. Es konnte gezeigt werden, dass dieser konformationelle Unterschied zwischen den Ligand‐ ungebundenen Purin‐Riboswitchen durch die Stabilität der apikalen Basenpaare in Helix II festgelegt wird. Die im Guanin‐Riboswitch gefundene stabile Schlaufen‐Schlaufen‐ Wechselwirkung kann auch außerhalb der Riboswitchsequenz existieren. Durch Mg2+, Mn2+ und Co(NH3)63+ Titrationen der Ligand‐gebundenen Purin‐Riboswitch Aptamerdomänen konnten spezifische Kationbindungsstellen lokalisiert werden, die in beiden Komplexen übereinstimmen und eine Rolle in der Stabilisierung der RNA‐Struktur spielen.
Um die Sekundärstruktur des gesamten Guanin‐Riboswitches in seiner freien und Ligand‐ gebundenen Form zu untersuchen, wurden die NMR‐Spektren dieser RNA mit denen der freien und Ligand‐gebundenen isolierten Aptamerdomäne und der isolierten Terminator‐ und Antiterminatorelemente verglichen. Überaschenderweise bildet bereits die freie Form des gesamten Guanin‐Riboswitches das Terminatorelement und die Aptamerdomäne aus. Somit finden konformationelle Änderungen im Zuge der Ligandbindung einzig in der Aptamerdomäne statt. Weiterhin wurde die Struktur der freien und Ligand‐gebundenen Form einer verkürzten Guanin‐Riboswitch‐RNA untersucht. Diese RNA ist ein Modell für ein Transkriptionsintermediat, das durch eine der drei RNA‐Polymerase‐Ruhestellen induziert wird, die in der Riboswitch‐Sequenz aufzufinden sind. Interessanterweis schließen sich die Ligandbindung an die Aptamerdomäne und die Ausbildung des Antiterminators nicht gegenseitig aus, wie bisher angenommen. Die verkürzte RNA kann in Abhaengigkeit von verschiedenen experimentellen Bedingungen unterschiedliche Sekundärstrukturen annehmen. Das hat interessante Auswirkungen auf die Rolle der im Terminatorelement lokalisierten Transkriptionsruhestelle für den genregulatorischen Prozess und führt zu einem neuen Modell der Funktionsweise des Guanin‐Riboswitches.
The ABC protein ABCE1, also called HP68 or RNase L inhibitor (RLI), is one of the most conserved proteins in evolution. It is universally expressed in eukaryotes and archaea, where ABCE1 is essential for life. ABCE1 plays a crucial role in translation initiation and ribosome biogenesis, however, the molecular mechanism of ABCE1 remains unclear. In addition to two ABC ATPase domains, ABCE1 contains a unique N-terminal region with eight conserved cysteines predicted to coordinate iron-sulfur (Fe-S) clusters. To analyze the function of ABCE1, the hyperthermophilic crenarchaeote Sulfolobus solfataricus was chosen as a model system. S. solfataricus ABCE1 was overexpressed homologously in S. solfataricus and heterologously in E. coli. Noteworthy, for tagged-protein production in S. solfataricus a novel expression system based on a virus shuttle vector was established. This is the first example for a successful overexpression and purification of isolated full-length ABCE1. For the first time it was shown that ABCE1 indeed bears biochemical properties of an ABC protein even though it has unique features. Remarkably, the nucleotide binding domains (NBDs) of ABCE1 bound ATP and AMP, but were functionally non-equivalent in ATP hydrolysis. Mutations of conserved residues in the second NBD led to a hyperactive ATPase, which implies an intramolecular mechanism of dimer formation. Truncation of the Fe-S cluster domains did not influence ATPase activity. The Fe-S clusters of ABCE1 were analyzed by biophysical and biochemical methods. As presented in this study, ABCE1 harbors two essential diamagnetic [4Fe-4S]2+ clusters, one ferredoxin-like cluster formed by cysteines at position 4/5/6/7 and one unique ABCE1 cluster formed by cysteines at position 1/2/3/8. ABCE1 was found to be associated with RNA after purification from S. solfataricus and bound ribosomal RNA in vitro. In addition, ABCE1 showed homo-oligomerization and appeared to form a hexameric complex of ~440 kDa, which was RNase sensitive. Archaeal ABCE1 associated with ribosomes, however, the unique Fe-S clusters of ABCE1 were not required for this interaction. Although archaeal ABCE1 assembled with ribosomes and ribosomal RNA, ABCE1 proved not to be essential for translation in S. solfataricus and did not interact with archaeal initiation factors. Nevertheless, the ABCE1 gene is one of the few genes conserved between archaea and eukaryotes and fulfills a universal task, which needs further characterization.
Membrane proteins play vital role in a variety of cellular processes, such as signal transduction, transport and recognition. In turn they are involved in numerous human diseases and currently represent one of the most prevalent drug targets. A comprehensive understanding of the mechanisms mediated by membrane proteins requires information about their structures at near-atomic resolution, although structural studies of membrane proteins remain behind those of soluble proteins. A bottleneck in the study of membrane proteins resides in the difficulties that are encountered during their high-level production in cell based systems. However, many toxic effects attributed to the over production of membrane proteins are eliminated by cell-free expression, as viable host cells are no longer required. Therefore, the objective of this study was to obtain adequate amounts of selected membrane transport proteins for their structural studies using a cell-free expression system. For the establishment of the cell-free system for membrane proteins, the transporters YbgR and YiiP from Salmonella typhimurium LT2, PF0558 and PF1373 from Pyrococcus furiosus, from the cation diffusion family (CDF), BetP from Corynebacterium glutamicum from the betaine/carnitine/choline transporter (BCCT) family and Aq-2030 from Aquifex aeolicus VF5 from the monovalent cation/proton antiporter-2 (CPA2) family were selected. An Escherichia coli S-30 extract based cellfree system was established by generating the best expression constructs of the target proteins, preparing T7 RNA polymerase and an S-30 extract with high translation efficiency. The functionality of the S-30 extract was shown by the cell-free expression of correctly folded Green Fluorescent Protein (GFP). Essential factors of the cell-free system such as the Mg2+ concentration, the bacterial S-30 extract proportion in the reaction mixture and the time-course of cell-free reactions have been optimized. For the cell-free production of membrane proteins in soluble form, the possibility to supplement cell-free reactions with detergents was explored. A wide range of non-ionic or zwitterionic detergents, were found to be compatible with cell-free synthesis, while ionic detergents and non-ionic detergents at high concentrations had an inhibitory effect. Moreover, high concentrations of polyoxyethylene-alkyl-ethers (Brij) detergents were found to have enhancing effect on the production levels as well as on the solubility of cell-free produced proteins. As membrane proteins tend to misfold and aggregate in a membrane-free translation system, the possibility to supplement the cell-free reactions with inner membrane vesicles (IMVs) to obtain correctly folded target transport proteins was explored. All the target proteins were successfully produced in the batch cell-free reactions and were found to be incorporated in the IMVs. A continuous exchange cell-free (CECF) system was established, where consumable substrates (amino acids, nucleotides and energy regenerating compounds) were supplied to the cell-free reaction mixture through a dialysis membrane, which in consequence resulted in high-level production of target proteins compared to the batch system. The osmosensing and osmoregulated sodium-coupled symporter BetP from C. glutamicum was chosen for the large scale production in CECF set-up. The protein is easily produced in E. coli and is functional as assayed by its transport activity, after purification and reconstitution in liposomes. It is therefore possible to compare in-vivo and cell-free production. High-level cell-free production of BetP was achieved in CECF mode in different forms: (i) as precipitate, (ii) as soluble form in detergent, and (iii) incorporated in IMVs. Cell-free production of BetP resulted in the yield of about 0.5 mg of purified BetP from 1 ml of CECF reaction. The yield of purified BetP was increased to 1.6 fold by addition of 1% polyoxyethylene-(20)-cetyl-ether (Brij58) detergent in the reaction mixture. Moreover, the high level cell-free production of BetP (0.5 mg purified BetP/ml reaction mixture) incorporated in IMVs was shown for the first time in this work.However, it was observed that oligomerization of BetP was not efficient in the cell-free system. Factors that can promote the folding of membrane proteins such as lipids and chaperones were investigated. Addition of lipids and molecular chaperone GroE facilitated correct folding of BetP resulting in increased yield and stability of cell-free produced BetP. The results obtained indicate that most of the cell-free produced BetP exists in functional oligomeric form. The possibility of obtaining milligram amounts of BetP, a 12 trans-membrane protein from the cell-free reactions holds promise for structural and functional studies of other membrane proteins. In any case, the strategies adapted in this study should prove extremely valuable for the production of membrane proteins in the E. coli cell-free expression system.
Die endotheliale NO-Synthase (eNOS) ist im kardiovaskulären System der Hauptproduzent von Stickstoffmonoxid (NO). Studien deuten auf eine Beteiligung der eNOS im Krankheits-verlauf einer Leberzirrhose hin; zirrhotische Tiere zeigen eine reduzierte hepatische eNOS-Aktivität bei unveränderten Proteinmengen. Die reduzierte NO-Menge trägt zu einer Erhöh-ung des intrahepatischen Widerstandes und einer portalen Hypertonie bei. Inhibitoren und posttranslationale Modifikationen der eNOS wurden als auslösende Faktoren postuliert, aber auch am intrazellulären Transport der eNOS beteiligte Proteine könnten eine wichtige Rolle spielen. Ein solches ist das neue Protein NOSTRIN (“eNOS traffic inducer”), das über seine C-terminale SH3-Domäne an eNOS bindet und durch seine N-terminale FCH Domäne an Membranen assoziiert. In vorhergegangenen Studien wurde nur ein translatiertes Protein identifiziert, bezeichnet als NOSTRINalpha. In der vorliegenden Arbeit habe ich eine verkürzte Isoform entdeckt (NOSTRINbeta), die aus einem alternativen Spleißvorgang hervorgeht. Ihr fehlt fast die gesamte FCH Domäne, wodurch keine Membranbindung mehr stattfindet. Diese Isoform konnte nur in pathogenem Lebergewebe nachgewiesen werden. Untersuchun-gen mittels Western Blotting und qRT-PCR mit Proben aus Patienten mit Zirrhose, alkoholischer Hepatitis oder von gesunden Personen, zeigten eine deutliche Erhöhung der Expression beider NOSTRIN-Isoformen von gesundem zu zirrhotischem Gewebe. NOSTRINalpha mRNA-Mengen waren in zirrhotischen vs. gesunden Proben verdoppelt, und in Proben aus Patienten mit zusätzlicher Hepatitis verdreifacht. Dies deutet darauf hin, dass erhöhte Mengen von NOSTRINalpha zu einer Internalisierung und Inaktivierung der eNOS führen könnten. NOSTRINalpha und NOSTRINbeta wurden ebenfalls in Hep3B-Zellen auf Protein und mRNA-Ebene nachgewiesen, ihre Expression war durch Retinsäure zeit- und dosisabhängig stimulierbar. NOSTRINalpha lokalisiert an Plasmamembran und vesikulären Strukturen, NOSTRINbeta hingegen hauptsächlich im Zellkern, eine geringe Fraktion im Zytosol. Über Kartier-ungsstudien wurden zwei nuclear leading sequences (NLS) identifiziert, die den Transport in den Zellkern vermitteln, sowie eine Crm-1-abhängige nuclear export sequence (NES). Im EMSA konnte die Bindung von NOSTRINbeta an die Promotorregion des NOSTRIN-Gens gezeigt werden. Diese Ergebnisse legen eine Funktion von NOSTRINbeta als Transkriptionsfaktor nahe, evtl. innerhalb einer negativen Rückkopplung auf die NOSTRINalpha-Expression. Weiter-führende Studien sollen diesen potentiellen molekularen Mechanismus im Detail klären.
Für den mitochondrialen ABC-Transporter MDL1 (multidrug resistance like) aus Saccharomyces cerevisiae wurde eine Funktion als intrazellulärer Peptidexporter vorhergesagt. MDL1 ist wahrscheinlich am Export von Degradationsprodukten der m-AAA (matrixoriented ATPases associated with a variety of cellular activities) Protease in den Intermembranraum beteiligt (Young et al., 2001). Das MDL1-Homodimer besteht aus zwei Transmembrandomänen mit jeweils sechs potentiellen α-Helices und zwei Nukleotidbindedomänen. Eine Überexpression des ABC-Transporters in E. coli und L. lactis ist nicht möglich. Nur im homologen Expressionssystem kann eine bis zu 100-fach gesteigerte MDL1-Konzentration in Anwesenheit des induzierbaren GAL1-Promotors gegenüber dem endogenen Protein erreicht werden. Differentielle Zentrifugation, Immunogold-Markierungen und Proteasezugänglichkeitsexperimente zeigen, dass MDL1 ausschließlich in der mitochondrialen Innenmembran lokalisiert ist und die Nukleotidbindedomänen zur Matrix orientiert vorliegen. Mit Hilfe von Edman Sequenzierung des gereinigten His-getaggten MDL1 wurde eine 59 Aminosäuren lange mitochondriale Leitsequenz identifiziert. Die Deletionsvariante MDL1(60-695) wird ausschließlich in den Membranen des Endoplasmatischen Retikulums exprimiert. Ihre Motordomänen liegen zytosolisch orientiert vor. Beide MDL1-Varianten bilden homooligomere Komplexe vergleichbarer Größe und weisen ähnliche ATPase Aktivitäten auf. Die physiologischen Konsequenzen der Lokalisation in unterschiedlichen Membranen wurden in Zellen näher untersucht, deren mitochondrialer ABC-Transporter ATM1 (ABC transporter of mitochondria) deletiert ist. ATM1 ist von essentieller Bedeutung für die Biogenese zytosolischer Eisen/Schwefel-Proteine (Lill und Kispal, 2000). Der mitochondriale MDL1-Komplex kann zum Teil die ATM1-Funktion übernehmen, wohingegen ER-ständiges MDL1, als auch ATP Binde- und Hydrolyse inaktive Mutanten, den Δatm1 Wachstumsphänotyp nicht komplementieren können. Die physiologische Funktion von MDL1 ist somit eng mit der mitochondrialen Innenmembran und der Funktionalität des Proteins verbunden. Durch in vivo Komplementationsstudien wurden zwei mitochondriale ABC-Transporter ABCB10 und Pa_2_9660 aus H. sapiens bzw. P. anserina als funktionelle MDL1-Homologe identifiziert.
1. Halobacillus halophilus akkumuliert zum Ausgleich geringer, extrazellulärer Wasserpotentiale kompatible Solute. Bei Anzuchten in Gegenwart von 0,4 – 1,5 M NaCl wurden Glutamin und Glutamat als die dominierenden kompatiblen Solute identifiziert, während zwischen 2,0 und 3,0 M NaCl Prolin das dominierende Solut darstellt. Außerdem wurde Ectoin als zweites kompatibles Solut gefunden, das spezifisch bei hohen Salzgehalten akumuliert wird. Die Konzentrationen während der exponentiellen Wachstumsphase war jedoch um den Faktor 6 – 7 geringer im Vergleich zu Prolin. 2. Aus Wachstumsexperimenten in Gegenwart unterschiedlicher Anionen war bekannt, dass Glutamat, im Gegensatz zu Gluconat und Nitrat, in der Lage ist, das Wachstum von H. halophilus auch in Abwesenheit von Chlorid zu ermöglichen. Um der Frage nachzugehen, ob die wachstumsfördernde Wirkung von unphysiologisch hohen Glutamat-Konzentrationen im Medium auf die Verwendung von Glutamat als kompatiblem Solut in den Zellen zurückzuführen ist, wurden Gesamtsolutepools von Chlorid-, Nitrat-, Gluconat- und Glutamat-gezogenen Zellen gemessen. In NaCl-gezogenen Zellen zeigte sich Glutamat als dominantes Solut, während Prolin und Glutamin einen geringeren Teil am Gesamtpool ausmachten. In Nitrat-gezogenen Zellen betrug der Gesamtpool nur noch 83% und in Gluconat-gezogenen Zellen nur noch 27% im Vergleich zu Chlorid-gezogenen Zellen. Zellen, die mit Glutamat gezogen wurden, zeigten jedoch eine Gesamtkonzentration an Soluten, die ca. 100% über dem Vergleichswert aus Chlorid-gezogenen Zellen lag. Die Konzentration an Glutamin in den Zellen stieg dabei um 168%, die Konzentration an Glutamat sogar um 299%. Die Prolinkonzentration verringerte sich um 32%. Diese Daten belegen, dass der wachstumsstimulierende Effekt von Glutamat auf die Verwendung als kompatibles Solut zurückzuführen ist. 3. Zur Untersuchung der molekularen Grundlage der Salzadaptation sowie der Abhängigkeit von Chlorid in H. halophilus wurde in Zusammenarbeit mit der Gruppe von Prof. D. Oesterhelt (MPI für Biochemie, Martinsried) die Sequenzierung des Genoms begonnen. Das Projekt ist zur Zeit noch nicht abgeschlossen und befindet sich in der „Lückenschluß-Phase“. Die bisherigen Sequenzdaten konnten dennoch für die in dieser Arbeit beschriebenen Untersuchungen herangezogen werden. Das Genom besitzt eine Größe von ca. 4,1 Mbp mit einem ungefähren GC-Gehalt von 40%. Außerdem wurden 2 Plasmide identifiziert mit einer Größe von 16047 und 3329 bp. 4. Die Schlüsselgene bekannter Biosynthesewege für Glutamin und Glutamat konnten identifiziert werden. Darunter befinden sich zwei Isogene für eine Glutamatdehydrogenase (gdh1 und gdh2), ein Gen für die große Untereinheit einer Glutamatsynthase (gltA), zwei Gene für die kleine Untereinheit einer Glutamat-Synthase (gltB1 und gltB2) und zwei Isogene für eine Glutaminsynthetase (glnA1 und glnA2). glnA1 befindet sich in einem Cluster zusammen mit einem Gen, das für einen Regulator kodiert (glnR), wie er auch aus B. subtilis bekannt ist. Über reverse Transkription von mRNA und anschließender PCR-Analyse konnte gezeigt werden, dass sowohl gltA/gltB1 als auch glnA1/glnR in einem Operon organisiert sind. 5. Wurde die Transkriptmenge der in Punkt 4 erwähnten Biosynthesegene in Zellen quantifiziert, die in Gegenwart unterschiedlicher Salzkonzentrationen (0,4 – 3,0 M NaCl) gezogen wurden, so zeigte sich keine Abhängigkeit von der Salzkonzentration für die Gene gltA, glnA1 und gdh1. Über die Transkriptmengen von gdh2 ließ sich keine abschließende Aussage treffen, da die gefundenen Transkriptmengen sehr gering waren und daher zu sehr großen Varianzen bei der Quantifizierung führten. Eine klare Abhängigkeit der Transkriptmenge von der im Medium zugesetzten Salzkonzentration konnte für glnA2 gezeigt werden. Die glnA2 mRNA-Menge stieg dabei mit steigender Salzkonzentration an und erreichte bei 1,5 – 2.0 M NaCl ein Maximum. Bei diesen Salzkonzentrationen war die Menge an mRNA ca. 4 mal höher als der Vergleichswert bei 0,4 M NaCl. Bei höhern Salzkonzentrationen sank die Menge an Transkript wieder leicht und war dann ca. nur noch 3 mal so hoch wie bei 0,4 M NaCl. 6. Die zelluläre Konzentration der glnA2-Transkripte in Abhängigkeit unterschiedlicher Anionen im Anzuchtmedium wurde untersucht. Die Quantifizierung der glnA2–mRNA ergab eine 2 mal höhere Transkriptmenge in Gegenwart von Chlorid verglichen mit Nitrat oder Gluconat. 7. Es wurde nach Enzymaktivitäten der bekannten Schlüsselenzyme im Glutamat und Glutamin-Biosyntheseweg gesucht. Eine Glutamatdehydrogenase und eine Glutamatsynthase – Aktivität konnte nicht oder nur in vernachlässigbarem Maße nachgewiesen werden. Im Gegensatz dazu konnt eine Glutaminsynthetase – Aktivität eindeutig belegt werden. Diese Aktivität erwies sich abhängig von der Art und der Konzentration des angebotenen Anions im Medium. Maximale Aktivitäten wurden mit NaCl in einer Konzentration von 2,5 – 3,0 M erreicht. Interessanterweise erwies sich die Glutaminsynthetase – Aktivität auch abhängig von der Art des im Testpuffers verwendeten Anions. Hier zeigte sich eine deutliche Stimulierung der Aktivität durch das Anion Chlorid. [Die für diesen Punkt zugrunde liegenden Daten wurden im Rahmen einer von mir mitbetreuten Diplomarbeit von Jasmin F. Sydow erhoben und sind aus Gründen der vollständigen Darstellung des Projektverlaufes mitaufgeführt!] 8. Wie im Punkt 1 dargelegt, wird Prolin vor allem bei hohen Salzkonzentrationen in H. halophilus - Zellen akkumuliert. Neben der Abhängigkeit von der Salzkonzentration wurde außerdem die Abhängigkeit von der Wachstumsphase untersucht. Die Analyse der Prolinkonzentrationen während verschiedener Wachstumsphasen in Kulturen, die bei 1,0 bzw. 2,5 M NaCl angezogen wurden, zeigte, (i) dass die Prolinkonzentration während der frühen exponentiellen Phase ca. 2,5-fach erhöht war im Vergleich zu Niedrigsalz-Zellen, (ii) dass die Prolinkonzentration beim Übergang von der frühen in die späte exponentielle Phase dramatisch abnahm (um 64% bei 2,5 M NaCl) und dass (iii) in der stationären Phase Prolin praktisch nicht mehr nachzuweisen war. 9. Die Biosynthesegene für die Herstellung von Prolin aus Glutamat konnten im Genom von H. halophilus identifiziert werden. Es handelt sich dabei um ein Cluster von 3 Genen, die für eine putative Pyrrolin-5-carboxylatreductase (proH), eine Glutamat-5-kinase (proJ), und eine Glutamat-5-semialdehyd-dehydrogenase (proA) kodieren. Mittels reverser Transkription von mRNA und anschließenden PCR-Analysen konnte gezeigt werden, dass die drei Gene ein Operon bilden. 10. Eine Quantifizierung der Transkriptmengen der Biosynthesegene proH, proJ und proA mittels quantitativer PCR in Zellen, die bei unterschiedlichen NaCl-Konzentrationen gezogen wurden, zeigte einen deutlichen Zusammenhang zwischen der Salinität des Mediums und der Menge an Transkript. Diese war umso höher, je höher die Salinität des Mediums war. Die maximale Transkriptmenge (6-fach) wurde bei einer Salzkonzentration von 2,5 M NaCl erreicht. Bei noch höherer Salzkonzentration sank die Transkriptmenge auf die ca. 5-fache Menge des Kontrollwertes ab. 11. Um die Regulation und Dynamik der Osmoregulation unabhängig vom Wachstum untersuchen zu können, wurde ein Zellsuspensions-System für H. halophilus etabliert, bei dem eine konzentrierte Zellsuspension direkt von geringen auf hohe Salzkonzentrationen überführt wurde und bei dem die Prozesse der Transkription, Translation und Solut-Biosynthese erhalten blieben. Beispielhaft wurde dieses System an der Produktion von Prolin nach einem Salzschock von 0,8 auf 2,0 M NaCl getestet. Es zeigte sich bei der Analyse, dass sich die Transkriptmengen unmittelbar nach dem Salzschock deutlich erhöhten und bereits nach 1,5 Stunden ein Maximum erreicht wurde. Verglichen mit dem Wert zu Beginn des Versuches waren die Transkriptmengen ca. 13-fach erhöht, sanken im weiteren Verlauf jedoch wieder ab und blieben bei einer 4-fachen Transkriptmenge konstant. Mit der Erhöhung der Transkriptmenge ging auch eine Erhöhung der Prolinkonzentration einher, die ein Maximum von ca. 6 μmol/mg Protein nach 6 Stunden erreichte. Auch diese Konzentration verringerte sich im weiteren Verlauf wieder und erreichte nach 20 Stunden den Ausgangswert. 12. Um den Einfluß diverser Anionen bzw. Osmolyte im Medium auf die Produktion von Prolin zu untersuchen, wurden Zellsuspensionen von H. halophilus einer Erhöhung der Osmolarität von 0,8 M auf 2,0 M unterzogen. Es zeigte sich dabei, dass die maximale Akkumulation von Prolin in Anwesenheit von Chlorid am höchsten war. Nitrat und Glutamat führten zu ähnlichen, aber leicht geringeren maximalen Konzentrationen (92 bzw. 83% des Chloridwertes). Gluconat führte noch zu einer Akkumulation von ca. 51%, während die anderen Osmolyte zu keiner Akkumulation führten. Eine Analyse der Transkriptmengen zeigte jedoch ein völlig anderes Bild. Während Chlorid, Nitrat und Gluconat zu vergleichbaren Anstiegen der Transkripmengen führten, war die maximale Transkriptmenge der Glutamatinkubierten Zellen 3-9 mal höher als in Vergleichszellen mit Chlorid. In anschließenden Titrationsexperimenten mit verschiedenen Glutamatkonzentrationen konnte gezeigt werden, dass eine minimale Konzentration von 0,2 M Glutamat ausreichend ist, um eine 90-fache Steigerung der Transkriptmenge herbeizuführen. 13. Als Antwort auf Hochsalz-Bedingungen akkumuliert H. halophilus neben Prolin auch Ectoin. Die Ectoinkonzentration bei 2,5 M NaCl war ca. 2-3 mal höher als in Zellen, die bei 1,0 M gezogen wurden. Die Bestimmung der intrazellulären Ectoin-Konzentrationen während des Wachstums zeigte außerdem, dass die Produktion von Ectoin wachstumsphasenabhängig ist. Die Konzentration in der stationären Phase war ca. 5-fach höher als in der exponentiellen Phase. Die Entwicklung der Ectoin- Konzentration verhielt sich somit reziprok zur Entwicklung der Prolin-Konzentration während des Wachstums. 14. Es wurde ein Cluster von drei Genen im Genom von H. halophilus identifiziert, deren Genprodukte die Biosynthese von Ectoin aus Aspartatsemialdehyd katalysieren. ectA kodiert dabei für eine putative Diaminobutyrat-Acetyltransferase, ectB für eine putative Diaminobutyrat-2-oxoglutarat-Transaminase und ectC für eine putative Ectoin-Synthase. Mittels reverser Transkription von mRNA und anschließenden PCR-Analysen konnte gezeigt werden, dass die drei Gene ein Operon bilden. 15. Die Transkription der ect-Gene war abhängig von der Salinität des Mediums. Ab 2,0 M stieg die Menge an RNA um das 10-fache an und erreichte bei 3,0 M ein Maximum mit der 23,5-fachen Menge. 16. Nach einem osmotischen Schock stieg die Konzentration an ect-mRNA signifikant und erreichte ein Maximum nach 3 - 4 Stunden. Das Maximum wurde somit 1,5 – 2,5 Stunden später erreicht als bei anderen Genen der Solute-Biosynthese wie etwa gdh1, das für eine Glutamatdehydrogenase, glnA2, das für eine Glutamin-Synthetase oder proH, das für eine Pyrrolin-5-Carboxylase kodiert. Die maximal erreichten Wert lagen 13-fach (ectA), 6,5-fach (ectB) und 3-fach (ectC) über dem Wert vor dem Salzschock. Gegen EctC wurden polyklonale Antikörper generiert. Western-Blot Analysen mit diesem Antikörper zeigten, dass die EctC-Menge nach 4 Stunden um das 2,5-fache stieg, dann aber wieder abfiel auf das 1,6 – 1,7-fache des Ausgangswertes. Der Rückgang an EctC fand keine Entsprechung in der gemessenen Ectoin-Konzentration, welche über einen Zeitraum von 18 Stunden kontinuierlich anstieg. Die maximale Konzentration nach 18 Stunden betrug das ca. 6,3-fache des Ausgangswertes. 17. Wurden H. halophilus Zellen mit anderen Osmolyten außer NaCl geschockt, so ergab sich folgendes Bild der Regulation der Ectoin-Biosynthese: (i) die Transkription der ect-Gene zeigte keine Chlorid-abhängige Regulation. Die maximale Transkriptmenge wurde in Gegenwart von Nitrat erreicht, wohingegen Gluconat zu vergleichbachen mRNA-Mengen führte wie Chlorid. Glutamat führte nur zu schwacher Stimulierung der Transkription. (ii) auf Ebene der Proteinmenge war zu sehen, dass die Menge an EctC nach osmotischem Schock vergleichbar war in Zellen, die mit Chlorid oder Nitrat inkubiert wurden. Gluconat führte nur zu einer 40%-igen Zunahme während andere Osmolyte nahezu wirkungslos auf die Menge an EctC blieben. (iii) die höchste Akkumulation an Ectoin nach einer plötzlichen Erhöhung der Osmolarität wurde erreicht mit Chlorid (6-fache Zunahme) gefolgt von Nitrat (5,6-fache Zunahme). Gluconat führte lediglich zu einer 3,3-fachen und Glutamat nur noch zu einer 2-fachen Steigerung der Ectoinkonzentration. Glutamat hat somit ähnliche Effekte wie Tartrat, Saccharose oder Sulfat. Succinat führte zu keiner Akkumulation und Glycin sogar zu einer deutlichen Abnahme. Die Produktion von Ectoin ist somit hauptsächlich abhängig vom Anion/Osmolyt und nur untergeordnet von der Osmolarität.
Two types of proteins transport ions across the membrane – ion channels and ion pumps. Ion pumps transport ions against their electrochemical gradient by co-transporting another ion or a substrate molecule through a concentration gradient or by coupling this process to an energy source like ATP. Those that couple ATP hydrolysis to ion transport are called ion motive ATPases and can be classified as ‘V’, ‘F’ and ‘P’ types. In this thesis, two sub-classes of P-type ATPases, PIIIA and PIB were studied. Attempts were made to over-express and crystallize the plant proton pump AHA2 (a PIIIA-ATPase). Also, the two putative copper transporting ATPases, CtrA3 (CopB-like) and CtrA2 (CopA-like) from Aquifex aeolicus (both PIB pumps) were over-expressed in E. coli and characterized. PIIIA-type pumps transport protons across the membrane and are found exclusively in plants and fungi, and probably some archaea. One of the most characterized proton pump biochemically is the A. thaliana proton pump AHA2. An 8Å projection map of this enzyme is already available (Jahn 2001). PIBATPases, also called CPX type pumps transport heavy metal ions such as Cu+, Cu2+, Zn2+, Pb2+, Cd2+, Co2+ across biological membranes and play an important role in homeostasis and biotolerance of these metals. CopA and CopB are two such proteins that transport copper across cell membrane found in many prokaryotes. CopB-like proteins are found almost exclusively in bacteria, with CPH sequence motif, while CopA-like proteins have CPC sequence motif, also found in eukaryotic copper transporters including human ATP7A and ATP7B. CopB extrudes Cu2+ across the membrane. CopA is activated by and transports Cu+ but the direction of transport is debated. Attempts were made to over-express the plant proton pump AHA2 in yeast Pichia pastoris. However, the yeast expressed only a truncated protein, which could not be used for further studies. It can be concluded that P. pastoris strain SMD1163 is not a good host for expression of AHA2. Focus was then shifted to AHA2 that has been over-expressed and purified from S. cerevisiae strain RS72. Growth and purification protocols had to be changed from published methods because of laboratory constraints and this probably had an effect on the protein produced. The protein purified from S. cerevisiae could not be crystallized reproducibly for structural studies by electron microscopy. CtrA3 was expressed in E. coli and purified using Ni2+-NTA matrix. Like CopB of A. fulgidus (Mana Capelli 2003), it was active only in the presence of Cu2+ and to some extent in Ag+. The protein was maximally active at 75°C, at pH 7 and in presence of cysteine. Lipids were essential for the activity of CtrA3. However, when the protein was purified in Cymal-6, CtrA3 could not hydrolyze ATP, even when lipids were added to the reaction mixture. For reconstitution of CtrA3 into liposomes for 2D crystallization, several lipids were tested. To screen the lipids compatible for protein incorporation, CtrA3 was dialyzed with different lipids at a high lipid-to-protein ratio of 10:1 and centrifuged by sucrose density gradient. Protein incorporated in lipids localized with liposome fraction in the gradient. Most of the CtrA3 was incorporated into DPPC with no aggregation. This lipid was used for reconstitution of CtrA3 at low LPRs, and at an LPR of 0.3-0.5, the protein formed 2D crystals. A NaCl concentration of 50mM was necessary for the formation of crystals. However, salt removal by dialysis prior to harvesting was essential for obtaining wellordered lattices of CtrA3. Addition of preservatives like trehalose and tannin or direct plunging in liquid ethane for cryo-microscopy destroyed the crystal lattice. Similar to CtrA3, the gene responsible for expression of CtrA2 was amplified from genomic DNA of A. aeolicus and expressed in E. coli and purified by Ni2+-NTA. Functional characterization of CtrA2 was done by analyzing ATP hydrolysis activity of the enzyme. Similar to CopA of A. fulgidus (Mandal 2002), CtrA2 was activated in the presence of Ag+ and to some extent, Cu+. It is possible that both the copper ATPases of A. aeolicus have different ion selectivity- CtrA3, specific for Cu2+ and CtrA2, specific for Cu+. Maximal activity of CtrA2 was also at 75°C. Cysteine was essential for activity of CtrA2, but the protein was not dependent on addition of lipids for activation. Reconstitution of CtrA2 was done similar to CtrA3 for screening of lipids for 2D crystallization. Of the lipids tested, DOPC reconstituted the protein best. However, screening at low LPRs did not yield any crystals. Even though both CtrA3 and CtrA2 are similar heavy metal transporting Ptype ATPases from the same organism and have 36% identity, they behaved completely different in their expression levels in E. coli, purification profiles, activity and reconstitution in lipids.
G-protein coupled receptors (GPCRs) comprise the largest superfamily of cell surface receptors and possess a signature motif of seven transmembrane helices. The endothelin B (ETB) receptor is a member of rhodopsin like GPCR family. It plays an important role in vasodilation and is found in the membranes of the endothelial cells enveloping blood vessels. Knowledge of the three-dimensional structure of G-protein coupled receptors in general would significantly add to our understanding of their molecular mechanisms and would be useful in the search for new specific drugs. However, three-dimensional structural analysis will require milligram quantities of pure and homogeneous protein. This dissertation is a study of the production, biochemical characterization and preliminary structural studies of the human ETB G-protein coupled receptor. The present work aimed at elucidating the structure and mechanistic details of function of the receptor by using a combination of X-ray crystallographic and NMR methods for collecting structural data. To obtain homogenous and monodisperse receptor protein preparation for structural and functional studies, we implemented the baculovirus expression system for the production of ETB receptor for the present work. The two step affinity purification ensured capture of full-length receptor. Silver stained SDS-PAGE of the purified receptor-ligand complex indicated greater than 90% protein purity. Based on previous reports, we used the high affinity ligand (endothelin -1) binding to the receptor for co-crystallization of receptor-ligand complex by locking the receptor in the activated conformation. As a prerequisite for 3D crystallization trials, the stability of the detergent solubilized receptor-ligand complex was assessed with respect to pH, temperature and time. Receptor-ligand complex did not show any degradation and aggregation over 6 days at 4°C and 18°C. Interestingly, change of pH suggested that receptor-ligand complex is unstable at lower pH due to possible charge induced conformational changes. In our work, we introduced the idea of using fluorophore labeled ligand for simple visual recognition of the receptor-ligand complex during purification and crystallization. On the other hand, we alternatively used biotinylated endothelin-1 to produce an adequate amount of ligand bound receptor complex, thus ensuring homogeneity of the purified complex for use in structural studies. Thus far, preliminary crystals have been obtained for both the unlabelled ET-1 and fluorophore labeled ET-1 complexed with ETB receptor. Moreover, we performed the systematic investigation of the protein/peptide binding partner for the receptor-ligand complex with the chief aims of stabilizing structure and increasing the possibilities of 3D-crystal contacts. Thus subsequent to formation of receptor-ligand complex, the additional in vitro formation of a ternary arrestin-receptor-ligand complex was also attempted for use in structural studies. We successfully demonstrated that arrestin mutant (R169E) forms a tight complex with ETB receptor regardless of its phosphorylation state. A second approach to get insight into the ETB receptor ligand binding site relied on the use of spin isotope labeled ET-1 ligand peptide by employing solid state MAS NMR method. Preliminary data provided compelling evidence that the C-terminal region of the peptide is immobilized in an ordered environment and presumably bound to the receptor. This indicates that the approach is feasible, although there are difficulties in sample preparation for further spectral measurements and data collection which are currently being discussed in ongoing investigations. At this point of our research work, we initiated a collaborative effort to obtain high yields of pure, active receptor without post translational modifications, from an E. coli cell lysate based in vitro expression system. We successfully optimized the production of homogenous and monodisperse endothelin B receptor in mg amounts. Thus this could potentially provide an alternative source of high quality receptor production in large quantities for immediate crystallization trials. Thus we hope that the results from these investigations can be applied in a more general sense to the production and crystallization of other G protein-coupled receptors.
Mannheimia haemolytica und Pasteurella multocida gehören zu den Verursachern der unter Rindern weltweit verbreiteten Enzootischen Bronchopneumonie. Derzeitige Impfstoffe und Antibiotika gegen diese Bakterien können die Verbreitung der Krankheit nicht maßgeblich einschränken, weshalb Bedarf an neuen Medikamenten besteht. Bei der Besiedelung der Lunge treffen M. haemolytica und P. multocida auf Eisenmangel. Die Aufnahme von Eisen ist ein wesentlicher Faktor bei der Kolonisierung und Persistenz pathogener Bakterien im Wirt, da Eisen essentiell ist. Medikamente, die an Proteinen der Eisenversorgung angreifen, können deshalb zur Eindämmung der Bronchopneumonie beitragen. Um einen Überblick über die Gene von M. haemolytica und P. multocida zu erhalten, die bei der Adaptation an Eisenmangel beteiligt sind, wurden die Bakterien in der vorliegenden Arbeit in vitro unter Eisenmangel kultiviert, denn die meisten bakteriellen Gene, die an der Eisenaufnahme beteiligt sind, werden erst bei Eisenmangel transkribiert. Mittels Mikroarray-Analyse der Transkriptome wurden erstmals die in vitro eisenregulierten Gene von M. haemolytica und erstmals auch die eisenregulierten Gene eines Rinder-Isolats von P. multocida identifiziert. Der in dieser Arbeit verwendete Mikroarray war ein Multigenom-Mikroarray und stellt die offenen Leserahmen beider Bakterien dar. Mit der Mikroarray-Analyse wurden 129 Gene von M. haemolytica identifiziert, die bei Wachstum unter Eisenmangel eine veränderte Transkription aufwiesen. Die größte Gruppe der Gene mit verstärkter Transkription bildeten die Gene, die für Rezeptoren und Transporter kodieren. Von diesen kodieren etwa drei Viertel für Proteine, die an der Aufnahme von Eisen aus verschiedenen Quellen beteiligt sind. Die größte Gruppe der Gene mit verminderter Transkription wurde von Genen gebildet, die für Proteine des Energie-Stoffwechsels kodieren. Damit wurde auch für M. haemolytica das Prinzip bestätigt, dass Bakterien bei Eisenmangel verstärkt Gene transkribieren, deren Proteine an der Eisenaufnahme beteiligt sind, während Gene für eisenhaltige Proteine des Energie-Stoffwechsels vermindert transkribiert werden. Bei der Analyse des Transkriptoms von P. multocida wurden 173 Gene mit veränderter Transkription identifiziert. Auch bei P. multocida konnte mit der funktionellen Klassifizierung der kodierten Proteine die größte Gruppe an Genen mit verstärkter Transkription den Transport- und Bindungsproteinen zugeordnet werden. Die größte Gruppe an Genen mit verminderter Transkription wurde auch bei P. multocida von Genen gebildet, die für Proteine des Energie-Stoffwechsels kodieren. Beim Vergleich des Transkriptoms von M. haemolytica mit dem von P. multocida wurden mehr Unterschiede als Gemeinsamkeiten festgestellt. Nur 40 der 1424 homologen Gene zeigten die gleiche Richtung in der Änderung in der Transkription. Unter den 15 homologen Genen mit verstärkter Transkription waren die Gene, die für einen Hämoglobin-Rezeptor, die ABC-Transportsysteme FbpABC und YfeABCD sowie das Energie liefernde System TonB-ExbBD kodieren. In den 25 homologen Genen mit verminderter Transkription waren 15 Gene enthalten, deren kodierte Proteine am Energie-Stoffwechsel beteiligt sind. Dies waren die Proteine NapABCDFGH des Nitrat-Reduktase-Komplexes, die Proteine NrfABCD des Nitrit-Reduktase-Komplexes und die Proteine FrdABCD des Komplexes der Fumarat-Reduktase. Ein auffälliger Unterscheid war, dass bei M. haemolytica die gesamten Gene verstärkt transkribiert wurden, deren Proteine an der Aufnahme von Eisen aus Transferrin beteiligt sind. Bei P. multocida dagegen konnte das Gen für den Transferrin-Rezeptor nicht nachgewiesen werden. Somit gehört das in dieser Arbeit verwendete Isolat von P. multocida vermutlich zu den 30% der Rinder-Isolate von P. multocida, die keinen Transferrin-Rezeptor besitzen, aber die Rinderlunge besiedeln können (Ewers et al., 2006). Im Vergleich zu M. haemolytica fielen bei P. multocida die vielen verstärkt transkribierten Gene auf, die an der Aufnahme von Eisen aus dem Blut beteiligt sind. Die Transkription dieser verschiedenen Transporter deutet auf eine gute Adaptation von P. multocida für die Verwendung von Eisen aus dem Blut des Wirts hin, die bei M. haemolytica in diesem Maß nicht gegeben scheint. Für M. haemolytica wurde die in vivo-Relevanz einiger eisenregulierter Gene überprüft, die in der Mikroarray-Analyse eine erhöhte Transkription zeigten. Dazu wurde die RNA untersucht, die aus dem Lungengewebe von infizierten Rindern isoliert worden war. In diesem Gewebe wurde die Transkription von 11 Genen mittels RT-PCR nachgewiesen. Für die Gene, die für die Hämoglobin-Rezeptoren von M. haemolytica kodieren, wurde mittels quantitativer real time PCR auch eine Verstärkung der Transkription im Lungengewebe nachgewiesen. Die Verstärkung der Transkription in vivo war der transkriptionellen Verstärkung in vitro vergleichbar, was auf eine Funktion der Hämoglobin-Rezeptoren bei der Infektion in vivo hindeutet. Zur Untersuchung der Regulation des Eisenhaushalts von M. haemolytica wurde versucht, das Gen fur zu deletieren, das für den Hauptregulator des Eisenhaushalts kodiert, was jedoch nicht gelungen ist. In einem antisense-Ansatz konnte jedoch gezeigt werden, dass der Stamm mit dem fur-antisense-Plasmid ein signifikant verzögertes Wachstum hatte, was auf die essentielle Funktion des Gens fur in M. haemolytica hinweist. Ein antisense-Ansatz ist noch kein Beweis für die essentielle Funktion eines Gens. Doch die mit Gioia et al. (2007) übereinstimmenden Schwierigkeiten bei der Herstellung einer ∆-fur-Mutante von M. haemolytica sowie das verringerte Wachstum in Gegenwart der fur-antisense-mRNA deuten stark auf eine essentielle Funktion dieses Gens hin.
IL-18 ist ein proinflammatorisches Zytokin mit tumorsuppressiven Eigenschaften. Daher befindet es sich derzeit in klinischen Studien der Phase II zur Behandlung immunsensitiver Tumore. Erste Ergebnisse dieser Studien sind vielversprechend, zumal IL-18 im Vergleich zu beispielsweise IL-1Beta und IL-12 eine hohe Verträglichkeit im Menschen aufweist. Die Ergebnisse dieser Arbeit zeigen, dass IL-18 nicht nur in soliden Tumoren, sondern auch in leukämischen Zellen wie AML-Zellen zur Expression eines Genmusters führt, welches hohes antileukämisches Potential aufweist. Diese Erkenntnis wurde mittels einer Microarray-Analyse gewonnen und in unabhängigen Versuchen überprüft. Zu den hochregulierten Genen gehören neben IFNY und Fas-Ligand die in der vorliegenden Arbeit untersuchten angiostatischen Chemokine IP10 und I-TAC sowie EBI3, die Beta-Kette des heterodimeren Zytokins IL-27. Da die Regulation des humanen EBI3-Gens bislang schlecht charakterisiert war, schloss sich eine Promotoranalyse des humanen EBI3-Promotors an. Diese brachte hervor, dass zwei NFKB-Bindungsstellen des Promotors für die Expression von EBI3 unter dem Einfluß von proinflammatorischen Zytokinen unabdingbar sind. Der humane Promotor wurde dabei in dieser Arbeit zum ersten Mal im humanen Kontext betrachtet. Weiterhin konnte zum ersten Mal gezeigt werden, dass IL-27 die Fähigkeit besitzt, humane myeloisch-leukämische Zellen zu aktivieren und Signale in Form von STAT1 und STAT3-Phosphorylierung sowie Hochregulation von SOCS3- Expression zu induzieren. Interessanterweise lassen sich die potentiell tumorsuppressiven Eigenschaften von IL-18 in Bezug auf KG1 Zellen durch eine Zugabe von Zink verstärken. So kommt es unter dem Einfluß von Zink zu einer Verstärkung der Expression von IFNY und EBI3. Dieser synergistische Effekt besitzt allgemeinere Gültigkeit, da die hier durchgeführten Experimente an humanen PBMC zeigten, dass eine Erhöhung des extrazellulären Zinkgehalts um den Faktor 2 im Vergleich zu dem physiologisch zugänglichen Zinkgehalt im Blutplasma zu einer Potenzierung der Freisetzung von IFNY durch die proinflammatorischen Zytokine IL-1Beta, IL-18 und IL-12 führt. Diese Ergebnisse waren besonders in Bezug auf IL-1Beta unerwartet und tragen ihren Anteil zum Verständnis der erhöhten Sensibilität von Leukozyten unter zinksupplementierten Bedingungen bei. Weitere Studien werden zeigen, ob eine Therapie mit IL-18 und möglicherweise auch in Kombination mit Zink eine alternative Option bei AML Patienten bietet, die besonders responsiv auf dieses Zytokin reagieren.
Presentation of intracellular processed antigens by major histocompatibility (MHC) class I molecules to CD8+ cytotoxic T lymphocytes is mediated by the macromolecular peptide loading complex (PLC). In particular accessory proteins, including the transporter associated with antigen processing (TAP) and tapasin, play a pivotal role in the MHC class I mediated antigen presentation pathway. TAP belongs to the ATP-binding cassette (ABC) superfamily and consists of TAP1 (ABCB2) and TAP2 (ABCB3), each of which possesses a transmembrane and a nucleotide-binding domain (NBD). The ER-resident glycoprotein tapasin promotes the optimal folding and assembly of MHC-peptide complexes, and independently stabilizes the steady state expression level of TAP. In the present thesis recombinant Fv, scFv and Fab antibody fragments to human TAP from a hybridoma cell line expressing the TAP1-specific monoclonal antibody mAb148.3, were generated. The epitope of the mAb148.3 was mapped to the very last five C-terminal amino acid residues of TAP1 on solid-supported peptide arrays. The recombinant antibody fragments were heterologously expressed in E. coli and insect cells, and purified to homogeneity by affinity chromatography. The monoclonal and recombinant antibodies display nanomolar affinity to the last five C-terminal amino acid residues of TAP1 as demonstrated by enzyme linked immunosorbent assay (ELISA) and surface plasmon resonance (SPR). Surprisingly, the recombinant antibody fragments confer thermal stability to the heterodimeric TAP complex in insect cells when incubated at elevated temperature. At the same time, TAP is arrested in a peptide transport incompetent conformation, although ATP and peptide binding to TAP are not affected. Furthermore, the recombinant antibodies were successfully used in the purification of the PLC from a human B-lymphoblastoid cell line and a novel factor, protein disulfide isomerase (PDI), was identified by matrix assisted laser desorption/ionisation-mass spectrometry (MALDI-MS). In the second part of this thesis the tapasin-MHC class I interaction was investigated. It is for this reason, that an in vitro assay had been established for direct measuring tapasin-MHC class I interactions. First, soluble single chain MHC class I molecules were engineered, choosing two MHC class I alleles: HLA-B4402 representing a highly tapasin-dependent allele and with HLA-B4405, a tapasin-independent allele was chosen. Tapasin as well as the two single chain MHC class I constructs, scB4402-b2m and scB4405-b2m, were expressed in insect cells and purified from insect cell supernatants by affinity chromatography. In contrast to the HLA-B4405 allele, which was expressed and secreted at moderate yield, the HLA-B4402 allele was expressed and trapped inside the insect cells instead of secreted into the medium. Peptide-binding and anisotropy measurements with fluorescein-labeled peptides verified the functionality of the scB4405-b2m. For further investigation of the tapasin-MHC class I interaction an in vitro assay was established using surface plasmon resonance spectroscopy. Due to the transient nature of the interaction including the decreased affinity of both interaction partners, kinetic data acquisition was difficult to evaluate. Furthermore, interaction of the scB4405-b2m with the sensor surface itself contributed to the measured interaction. Additionally, to investigate tapasin editing function, tapasin as well as the scB4405-b2m-peptide complex were tethered on fluid chelator lipid bilayers and monitored by reflectance interference (RIf) and total internal reflection fluorescence spectroscopy (TIRFS). Stable immobilization of scB4405-b2m-peptide complex as well as of tapasin was observed, unfortunately no changes in peptide dissociation kinetics monitored in the TIRFS channel were detected. Presumably, the tapasin-independent HLA-B4405 already loaded with a high affinity peptide is not influenced by the peptide-editing function of tapasin. Here, for the first time an in vitro assay was established for direct probing interactions within the various proteins of the PLC.
Three-dimensional structure of the glycine-betaine transporter BetP by cryo electron crystallography
(2008)
The soil bacterium Corynebacterium glutamicum has five secondary transporters for compatible solutes allowing it to cope with osmotic stress. The most abundant of them, the transporter BetP, performs a high affinity uptake of glycine-betain when encountering hyperosmotic stress. BetP belongs to the betaine/carnitine/choline/transporter (BCCT) family, and is predicted to have twelve transmembrane helices with both termini facing the cytoplasm. The goal of this thesis is to facilitate understanding of BetP function by determining a three dimensional (3D) model of its structure. Two-dimensional (2D) crystallization of wild-type (WT) BetP has been successfully performed by reconstitution into a mixture of E. coli lipids and bovine cardiolipin, which resulted in vesicular crystals diffracting to 7.5 Å resolution (Ziegler, Morbach et al. 2004). Diffraction patterns of these crystals however showed unfocused spots, generally due to high mosaicity. Better results were obtained by using the constitutively active mutant BetPdeltaC45 in which the first 45 amino acids of the positively charged C-terminus were removed. BetPdeltaC45 crystals obtained under the same conditions for BetP WT were concluded to be pseudo crystals, based on the inconsistence of symmetry. These crystals had BetPdeltaC45 molecules randomly up/downwards inserted into membrane crystals, and cannot be used for structure determination, even though they diffracted up to 7 Å. The problem of pseudo crystal formation could be solved by changing the lipids used for 2D crystallization to a native lipid extract from C. glutamicum cells. This change of lipids improved the crystals to well-ordered packing with exclusive p121_b symmetry. To understand the role of lipids in crystal packing and order, lipids were extracted at different stages during crystallization, and identified by using multiple precursor ion scanning mass spectrometry. The results show that phosphatidyl glycerol (PG) 16:0-18:1 is the most dominant lipid species in C. glutamicum membranes, and that BetP has a preference for the fatty acid moieties 16:0-18:1. Crystallization with synthetic PG 16:0-18:1 proved that an excess of this lipid prevents pseudo crystal formation, but these crystals did not reach the quality as previously achieved by using the C. glutamicum lipids. Apart from the effect of lipids in crystallinity, the concentration and type of salts influenced crystal growth and morphology. High salt conditions (>400 mM LiCl or KCl) yielded tubular crystals, whereas low salt conditions (<300 mM LiCl, NaCl or KCl) led to formation of up to 10 µm large sheet-like crystals. The intermediate concentration gave a mixture of sheet-like and tubular crystals. In terms of resolution, sheets diffracted better than tubes. The sheet-like crystals used for 3D map reconstruction were obtained from a dialysis buffer containing 200 mM NaCl combined with using C. glutamicum lipids. Electron microscopic images were taken from frozen-hydrated crystals using a helium-cooled JEOL 300 SFF microscope or a liquid nitrogen-cooled FEI Tecnai G2 microscope at 300 kV, which allowed optimal data collection and minimized radiation damage to the sample. More than 1000 images of tilt angles up to 50° were taken and evaluated using optical diffraction of a laser beam. The best 200 images were processed with the MRC image processing software package, and 79 images from different tilt angles were merged to the final data set used for calculation of a 3D map at a planar resolution of 8 Å. The structure shows BetPdeltaC45 as a trimer with each monomer consisting of 12 transmembrane alpha-helices. Protein termini and loop regions could not be determined due to the limited resolution of the map. Six of the twelve helices line a central cavity forming a potential substrate-binding chamber. Each monomer shows a central cavity in different sizes and shapes. Thus, the constitutively active BetPdeltaC45 thus forms an unusual asymmetric homotrimer. BetP most likely reflects three different conformational states of secondary transporters: the cytoplasmically open (C), the occluded (O), and the periplasmically open (P) states. The C and O states are similar to BetP WT projection structure, while the P state is discrepant and highly flexible due to the shape and size of the central cavity as well as the lowest intensity of the density. The observation of the P state corresponds well to the constitutively active property of BetPdeltaC45. For the high resolution structure of the C and O states are available, this work presents the first structural information of the P state of a secondary transporter.
Der Cytochrom bc1 Komplex spielt in der mitochondrialen Atmungskette eine zentrale Rolle, er ist am Aufbau des Protonengradienten über die innere Mitochondrien-Membran beteiligt. Die Funktionsweise dieses integralen Membranproteinkomplexes ist trotz mehrerer gelöster Strukturen noch nicht vollständig verstanden. Im Rahmen dieser Arbeit wurde der Komplex aus P. denitrificans untersucht und dabei mehrere Beiträge zu Struktur und Funktion dieses bakteriellen Modellsystems geleistet, wie z.B. seinem Oligomerenzustand in Detergenz-gelöster Form und zur Frage der Monomer:Monomer-Interaktion. Zur Strukturaufklärung des Cytochrom bc1 Komplexes aus P. denitrificans wurde ein chimärer Komplex zur Kristallisation eingesetzt, der in der Lage ist ein, Antikörper-Fragment zu binden, das bereits mit Erfolg zur Strukturbestimmung des Hefe-Komplexes verwendet wurde. Diese Experimente führten vermutlich wegen mangelnder Proteinstabilität nicht zum gewünschten Ergebnis. Eine zweite Mutante, bei der eine stark saure Domäne des Cyt c1 deletiert vorliegt (Δac Cytochrom bc1 Komplex), konnte jedoch erfolgreich kristallisiert und Diffraktionsmuster bis etwa 3,5 Ǻ erhalten werden. Die Kristalle weisen derzeit noch Inhomogenitäten, wahrscheinlich durch den Einfrierprozess, auf und werden gegenwärtig weiter optimiert. Im Rahmen dieser Arbeit konnte der lange diskutierte Oligomerenzustand des Cytochrom bc1 Komplexes aus P. denitrificans in solubilisiertem Zustand als Tetramer, beziehungsweise unter Einbeziehung struktureller und mechanistischer Daten und Überlegungen als Dimer eines Dimers, geklärt werden. Dies erfolgte durch eine für Membranproteine neue Form der Massenspektrometrie, die als LILBID-MS bezeichnet wird. Diese Daten konnten die bisher vorläufigen Beobachtungen aus BN-Gelelektrophorese und Gelfiltrationsversuchen eindeutig und unabhängig bestätigen. Darüber hinaus sollten noch Beiträge zur funktionellen Monomer:Monomer-Wechselwirkung geliefert werden. Hierfür wurde zunächst ein P. denitrificans Stamm erzeugt, der stabil zwei unterschiedliche fbc-Operons trägt und exprimiert: eine Wildtyp-Version mit Strep-tag und eine mit einem His-tag und einer inaktivierenden Mutation im Cyt b. Aus diesem Stamm sollte durch eine Tandem-Aufreinigung ein gemischter Cytochrom bc1 Komplex isoliert werden. Dies gelang nicht, wie in Westernblots, turnover und pre-steady-state Aktivitätsuntersuchungen gezeigt wurde, da sich der Komplex als Tetramer erwies und damit eine eindeutige Aufreinigung nicht möglich war. Die Lösung für dieses Problem liegt im Δac Cytochrom bc1 Komplex, der wie LILBID-MS Ergebnisse zeigten, lediglich als Dimer vorliegt; dazu müssen zukünftig die Affinitäts-tags und die inaktivierende Mutation auf diesen Komplex übertragen werden. Der zweite Beitrag zur Funktionsuntersuchung wurde anhand von Mutanten konservierter saurer Aminosäuren und von Tyrosinen im und um das QP-Zentrum geliefert, mit anschließenden Aktivitätsuntersuchungen, Inhibitor-Bindungstudien mit Stigmatellin und elektrochemisch-induzierten Redox-FTIR-Differenzspektren. Die Mutanten E295Q, E81Q und Y297Q zeigten eine verringerte Sensitivität für Stigmatellin. Die FTIR-Differenzspektren belegen, dass die Mutation der Positionen E295 und D278 die Signale für protonierte Seitengruppen verschieben. Die Mutation der Seitengruppen Y302, Y297, E81 und E295 beeinflussen direkt das oxidierte Chinon und das Proteinrückgrat. Die Bedeutung der lange diskutierten Seitengruppe E295 ließ sich als direkter Interaktionspartner mit dem Hydrochinon bestätigen. Die wichtige Rolle der Seitengruppen in Positionen E295 und Y302 konnte bestätigt werden. Darüber hinaus wurden die Seitengruppen D278 und E81 als wesentliche Wechselwirkungspartner für die Hydrochinon-Oxidation identifiziert. Die Seitengruppen des QP-Zentrums unterliegen durch das Wasserstoffbrückennetzwerk starken Wechselwirkungen, wodurch die Bindungstasche eine gewisse Toleranz gegenüber Veränderungen zeigt.
By translocating proteasomal degradation products into the endoplasmic reticulum (ER) for loading of major histocompatibility complex (MHC) class I molecules, the ATP binding cassette (ABC) transporter associated with antigen processing (TAP) plays a pivotal role in the adaptive immunity against infected or malignantly transformed cells. A key question regarding the transport mechanism is how the inter-domain communication and conformational dynamics of the TAP complex are connected during the peptide transport. To identify residues involved in this processes, we evolved a Trojan horse strategy in which a small artificial protease is inserted into antigenic epitopes. After binding, the TAP backbone in contact is cleaved, allowing the peptide sensor site to be mapped by mass spectrometry. Within this study, the peptide sensor and transmission interface have been identified. This region aligns with the cytosolic loop 1 (CL1) of Sav1866 and MsbA. Based on a number of experimental data and the homology to the bacterial ABC exporter Sav1866, we constructed a 3D structural model of the core TAP complex. According to this model, the CL1 and CL2 of TAP1 are extended cytosolic loops connecting the transmembrane helices (TMH) 2 and 3, and TMH4 and 5 respectively, and contact both nucleotide binding domains (NBDs) of the opposite subunit. In contrast to exporters, the cytosolic loop (named L-loop) of BtuCD importer is much shorter, and contacts only one NBD. The data confirm that the CL1 of TAP1 functions as signal transducer in ABC exporters, because it does not interfere with substrate binding but with substrate transport. The peptide contact site identified herein is restructured during the ATP hydrolysis cycle. Importantly, TAP showed a structural change trapped in the ATP hydrolysis transition state, because direct contact between peptide and CL1 is abolished. By cysteine scanning, the most conserved residues within CL1 were identified, which disrupted the tight coupling between peptide binding and transport. Together with Val-288, these residues are essential in sensing the bound peptide and inter-domain signal transmission. To characterize the molecular architecture of CL1, a convenient and minimally perturbing approach was used, which combined cysteine substitution in the CL1 region and determination of accessibility to thiol specific compounds with different properties. These studies revealed that the N-terminal region of CL1 has a good accessibility for hydrophilic (iodoacetamidofluorescein, IAF) and amphiphilic probes (BODIPY maleimide, BM), whereas the C-terminal region is accessible for hydrophobic probe (coumarin maleimide, CM). Kinetic studies of fluorescence labeling suggest that this region displayed a different accessibility to probes when the protein undergoes distinct conformations (e. g. nucleotide free state), thereby reflecting conformational transitions. Fluorescence labeling with BM induces a lost of peptide transport, whereas the peptide binding remains unaffected. These results indicate that covalent modifications of the CL1 residues influenced the inter-domain communication between transmembrane domain (TMD) and NBD. The X-loop is a recently discovered motif in the NBD of ABC exporters, which stays in close contact to the CLs. Moreover, because the X-loop precedes the ABC signature motif, it probably responds to ATP binding and hydrolysis and may transmit conformational changes to the CLs. By substitution of the highly conserved Glu-602 of TAP2 with residues that have different chemical properties, it was shown for the first time that the X-loop is a functional important element, which plays an key role in coupling substrate binding to downstream events in the transport cycle. We further verified domain swapping in the TAP complex by cysteine cross-linking. The TAP complex can be reversibly arrested either in a binding or translocation incompetent state by cross-linking of the X-loop to CL1 or CL2, respectively. These results resolve the structural arrangement of the transmission interface and point to different functions of the cytosolic loops in substrate recognition, signaling and transport.