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Charakterisierung der alternativen NADH-Ubichinon-Oxidoreduktase (NDH2) aus Yarrowia lipolytica
(2004)
Neben dem protonenpumpenden Komplex I (NDH-1) der Atmungskette besitzt die obligat aerobe Hefe Yarrowia lipolytica eine alternative NADH:Ubichinon Oxidoreduktase (NDH-2). Diese Enzyme, die in den Atmungsketten von Pflanzen, Pilzen und Bakterien vorkommen, bestehen aus nur einer Untereinheit, führen jedoch dieselbe Reaktion aus wie Komplex I, nämlich die Elektronenübertragung von NADH auf Ubichinon, wobei allerdings keine Protonen über die Membran transloziert werden. Nur peripher mit der Membran assoziiert, können alternative Dehydrogenasen entweder zur cytosolischen Seite (extern) oder zur Matrixseite (intern) orientiert sein. Y. lipolytica besitzt im Gegensatz zu anderen Ascomyceten nur eine einzige extern orientierte alternative Dehydrogenase mit einer vorhergesagten Masse von ca. 60 kD und einem nicht kovalent gebundenem Molekül FAD als Cofaktor. Durch Fusion des Leserasters mit der Präsequenz der 75 kD Untereinheit von Komplex I war die interne Expression des Enzyms (NDH2i) gelungen, die das Überleben von Komplex I Deletionsmutanten ermöglichte. Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurde die alternative Dehydrogenase von Y. lipolytica innerhalb ihrer natürlichen Membranumgebung charakterisiert. Das Enzym reagierte mit verschiedenen Chinonanaloga, wobei mit dem hydrophilen Q1 eine höhere katalytische Rate erzielt wurde als mit DBQ, das dem natürlich vorkommenden Q9 am ähnlichsten ist. Da hydrophobe Substrate fast ausschließlich in der Lipidphase der Membranen gelöst vorliegen, musste bei der Bestimmung von kinetischen Parametern (ebenso wie bei Komplex I) auf eine gleichbleibend große Membranphase im Messvolumen geachtet werden. Mit dem standardmäßig benutzten Substrat DBQ reagierte YLNDH2 nach einem Ping-Pong Reaktionsmechanismus. Dieser beschreibt eine abwechselnde Bindung der beiden Substrate, wobei das Enzym die Elektronen von NADH aufnimmt (E-FADH2) und an Ubichinon weitergibt (E-FAD); es existiert kein ternärer Enzym-Substrat Komplex. Gestützt durch Kristallstrukturen des analogen Enzyms QR1 mit NADPH bzw. mit Durochinon, liegt die Vermutung nahe, dass beide Substrate in ähnlicher Weise und sehr wahrscheinlich in der gleichen Bindungstasche binden. Ein Ping-Pong Reaktionsmechanismus wurde bereits für die NADH:DCPIP Oxidoreduktase Aktivität von zwei weiteren alternativen Enzymen postuliert, jedoch noch nie für ein physiologisches Substrat. Als bislang wirksamster Inhibitor für alternative Dehydrogenasen wurde 1-hydroxy-2-dodecyl-4(1H)chinolon (HDQ) entdeckt. HDQ hemmte NDH2 in Membranen aus Y. lipolytica mit einer I50 von 200 nM, was der 500fachen Hemmwirkung des gängig verwendeten Flavon auf das isolierte Enzym NDI1 von S. cerevisiae entspricht. Allerdings hemmte HDQ auch Komplex I mit einer I50 von 2 µM, ähnlich wie es bei Platanetin in Pflanzenmitochondrien der Fall war [Roberts et al., 1996]. Mit dem Ziel, ein polyklonales Antiserum gegen die native YLNDH2 zu generieren, wurde das Enzym in E. coli heterolog exprimiert. Die Expression führte zur Bildung von Einschlusskörpern, aus denen das rekombinante Enzym unter denaturierenden Bedingungen gereinigt und zur Immunisierung eines Kaninchens verwendet werden konnte. Das Antiserum kreuzreagierte mit der nativen und der internen Version von YLNDH2 und zeigte nur wenige unspezifische Bindungen. Es wurde gezeigt, dass Y. lipolytica Stämme ohne NDH2 und Komplex I mit NDH2i als einziger Dehydrogenase erzeugt werden konnten. In N. crassa war der Versuch, NDE2 und Komplex I gleichzeitig zu deletieren, gescheitert, was zu der Schlussfolgerung führte, dass sich die beiden Enzyme in diesem Organismus möglicherweise kompensieren könnten. Dies war in Y. lipolytica ausgeschlossen worden, da wahrscheinlich kein (oder nur unzureichender) Austausch zwischen matrixständigem und cytosolischem NADH stattfindet. Die zielgerichtete Mutagenese hochkonservierter Bereiche im offenen Leserahmen von YLNDH2 lieferte das eindeutige Ergebnis, dass die zweite der beiden beta-alpha-beta-Bindungsdomänen NADH binden muß, da sich der KM Wert für NADH bei Mutation des essentiellen sauren Restes E320 dratisch erhöhte. Alle Mutationen, die die Dinukleotid Bindungsdomäne I betrafen, die danach folgerichtig den Cofaktor FAD binden muß, führten zu einem vollständigen Verlust von NDH2. Dieselbe Zuordnung der Bindungsstellen war bereits von Björklöf et al. [2000] vorgeschlagen worden. Eine Chinonbindungstelle konnte durch Mutagenese der beiden apolar/aromatischen Bereiche der Sequenz nicht identifiziert werden. Die Modifikation des C-Terminus von NDH2i führte zu nicht mehr messbarer Aktivität und stark verringerter Expression des Enzyms in mitochondrialen Membranen (siehe Anhang 7.5.1.1). Es kann daher vermutet werden, dass der C-Terminus für die korrekte Faltung eine wichtige Rolle spielt, möglicherweise sogar bei der Membranassoziation, wie bei Rasmusson [1999] vorgeschlagen wurde. Interessant war in diesem Zusammenhang, dass die C-terminal modifizierte NDH2i trotzdem das Überleben von Komplex I Deletionsmutanten bzw. das Wachstum auf DQA ermöglichte. In Membranen, die einen unterschiedlichen Gehalt an NDH2, jedoch die gleiche Gesamtmenge an Protein enthielten, wurde eine unerwartete lineare Abhängigkeit zwischen KM und Vmax Werten beobachtet. Dieses Phänomen wurde mit dem Modell der externen Diffusionslimitierung beschrieben, die in ähnlicher Weise auch bei immobilisierten Enzymen auftritt. Danach wird die Geschwindigkeit der enzymatischen Reaktion von YLNDH2 sowohl durch die kinetisch kontrollierte Rate, als auch durch die Transportrate des Ubichinons bestimmt, das aus der Membran heraus in die wässrige Umgebung des katalytischen Zentrums gelangen muss. Aus diesem Grund ist nicht nur die Maximalgeschwindigkeit, sondern auch die Michaelis Menten Konstante KM abhängig vom Gehalt des Enzyms in Membranen. Dies führte bei niedrig exprimierten mutanten Enzymen zur gleichzeitigen Abnahme von KM und Vmax. Eine externe Diffusionskontrolle der enzymatischen Reaktion wurde auch für Komplex I, dessen Reaktionszentrum im peripheren Arm vermutet werden kann, aber nicht für Komplex III aus S. cerevisiae, dessen Chinonbindungsstellen sich definitiv in hydrophober Umgebung befinden, beobachtet.
The cytochrome bc1 complex is a cornerstone in bioenergetic electron transfer chains, where it carries out tasks as diverse as respiration, photosynthesis, and nitrogen fixation. This homodimeric multisubunit membrane protein has been studied extensively for several decades and the enzyme mechanism is described with the modified protonmotive Q cycle. Still, the molecular and kinetic description of the catalytic cycle is not complete and questions remain regarding the bifurcation of electron transfer at the quinol oxidation (Qo) site, substrate occupancy, pathways of proton conduction, and the nature of the Rieske protein domain movement. We used competitive inhibitors to study the molecular architecture at the Qo site with X-ray crystallography. The structure of the enzyme with the substrate analog 5-n-heptyl-6-hydroxy-4,7-dioxobenzothiazole (HHDBT) bound at the Qo site was determined at 2.5 Å resolution. Spectroscopic studies showed that HHDBT is negatively charged when bound at the active site. Mechanistic interpretations from inhibitor binding are in line with single occupancy model for quinol oxidation and structural analysis supports the proposed proton transfer pathway. For functional insight into the enzyme mechanism, redox-sensitive protonation changes were studied by Fourier transform infrared spectroscopy. The protein purification procedure was optimized for less delipidation and the isolated enzyme was more active. Furthermore, two new phospholipids were identified in the X-ray structures, including a cardiolipin. Strikingly, conserved lipid binding cavities were observed in structural comparison with homologous enzymes. The functional role of tightly bound phospholipids will be discussed. Finally, the Qo site is a target for various compounds of agricultural and pharmaceutical importance. Importantly, the X-ray structures permit detailed analysis of the molecular reasons for acquired resistance to and treatment failure of Qo site inhibitors, such as atovaquone, that is used to treat malaria and pneumonia, as discussed herein.
RcsB is a central transcriptional regulator in enteric bacteria involved in exopolysaccharide (EPS) biosynthesis, in cell division, in the expression of osmoregulated genes, and regulates at least 20 other genes and operons. It is a member of a phosphorelay system and signal transfer is mediated by phosphorylation through the RcsC/YojN phosphorelay. RcsB proteins modified with the phosphorylation mimic BeF3- as shown by its conformational changes and DNA binding properties and resulted phosphorylated RcsB derivatives with sufficient stability. Both, the wild type RcsB protein and the mutant RcsBD11A could be modified with BeF3-. Non-phosphorylated RcsB has been shown to bind as a heterodimer with the coinducer RcsA at the conserved RcsAB box in Rcs regulated promoters. In this study, it has been shown that the modification of RcsB by BeF3 - (I) has a negative effect on its homodimerization, (II) abolishes the complex formation of RcsAB with the RcsAB box as shown by the EMSA and SPR technique. All the effects were found to be reversible by increasing the NaF concentration in the assays presumably leading to the formation of the inactive BeF4 2- salt. This hypothesis of RcsB being modified by BeF3- was also supported by other phosphodonors like ATP and acetyl phosphate, both of them showed the same negative effect on DNA binding by RcsAB heterodimer giving evidence that BeF3- could be used as a phosphorylation mimic. In addition, the phosphorylation mimic BeF3- was found to be a better phosphorylating agent than ATP and acetyl phosphate. This is the first evidence that phosphorylation of RcsB might have a negative effect on the activation of RcsAB regulated operons. Autophosphorylation of RcsB proves that it has the ability to take up phosphoryl groups and the mutant protein also become autophosphorylated with less efficiency or stability than the wild type protein. RcsB probably takes up phosphoryl groups through RcsC -> YojN -> RcsB phosphorelay pathway. To study the interaction among the proteins in this pathway, fluorescence spectroscopy, NMR spectroscopy, and an in vivo ß galactosidase assay were performed by using two domains of RcsC (T-RcsC and R-RcsC), HPt domain of the protein YojN, and RcsB. The interactions between R-RcsC/YojN-HPt and YojN-HPt/RcsB supports the proposed pathway of phosphorylating RcsB. RcsB might also be phosphorylated by YojN-HPt that is phosphorylated by other sensor kinase other than RcsC in a cross-talk mechanism. The phosphorylation of RcsB by YojN-HPt probably has the same negative effect on cps induction as obtained with BeF3 - effect on DNA binding by RcsAB heterodimer.
Nitric oxide (NO) is a potent mediator with pleiotropic functions such as inhibition of platelet aggregation, smooth muscle relaxation and regulation of neuronal transmission. These effects are mostly mediated by intracellular NO-sensitive guanylyl cyclases (GCs) which convert GTP into the second messenger, cGMP. This messenger in turn activates multiple downstream effectors such as cGMP-dependent protein kinases, cGMP-regulated ion channels and cGMPdependent phosphodiesterases. Mammalian NO-sensitive GCs are obligate heterodimers of an α and β subunit each. Given that these enzymes play a key role in cGMP-mediated pathways, one may anticipate that mechanisms other than allosteric activation via NO may exist to regulate the production and turnover of cGMP. In this thesis, novel aspects of the regulation of the most abundantly expressed GC heterodimer α1β1 are presented.
A possible mechanism of regulation that was tested here, is tyrosine phosphorylation. Using anti-phosphotyrosine antibodies, the phosphorylation of the β1 subunit was detected after incubation of β1-overexpressing COS-1 cells with protein tyrosine phosphatase (PTP) inhibitors such as pervanadate and bpV(phen). β1 phosphorylation on tyrosines was also observed in PC-12 cells which endogenously express GC and in rat aorta after inhibition of PTPs. Furthermore, hydrogen peroxide was found to be a physiological stimulus for the induction of reversible β1 tyrosine phosphorylation in intact cells. Using phenylalanine mutants of different tyrosines, residue 192 (Y192) of β1 was identified as the major phosphorylation site. Consistent with this finding, sequence analyses showed that Y192 forms part of a motif that resembles a preferential target site for Src-like kinases. When tyrosine-phosphorylated, this motif exposes a typical SH2 docking site for members of the Src kinase family.
Experiments with inhibitors of Src kinases, PP1 and PP2, clearly showed that phosphorylation of Y192 is Src-dependent. Preincubation of β1-expressing cells with these inhibitors significantly reduced the level of phosphorylated β1 after bpV(phen) treatment. Furthermore, co-expression of β1 with Src led to a strong phosphorylation of this subunit. Co-precipitation experiments showed that Src interacts with GC. Interestingly, kinases of the Src family are recruited to β1 via the SH2 domain upon phosphorylation of Y192. Together, these results indicate that Src kinases phosphorylate tyrosine 192 thereby creating a docking site for their own SH2 domains. Kinase bound to GC may then catalyze phosphorylation of GC or other downstream effectors. Inhibition of PTPs altered GC activity in two ways: it increased both the basal activity and the YC-1- and BAY 41-2272-stimulated activity two-fold, and it reduced the sensitivity of the enzyme towards NO. The detailed mechanism of action is still unknown, but experiments using the mutant β1[Y192F] demonstrated that residue 192 is not responsible for these effects.
Another major focus of this thesis was the identification of novel GC binding proteins. Using the yeast two-hybrid approach, the carboxy-terminal portion of a protein named AGAP1 (amino acid (aa) 399-804) was found to interact with the catalytic domain of α1 (aa 466-690) and with the regulatory domain of β1 (aa 1-348). Human AGAP1 is a multidomain protein of 804 amino acids with a calculated molecular mass of 89,1 kDa comprising an Arf-GAP (GAP:GTPase activating protein), a putative GTPase domain, two Ankyrin repeats and a PHdomain. Co-precipitation experiments using lysates from mammalian cells overexpressing both binding partners confirmed the interaction of AGAP1 with the GC subunits. Immunofluorescence analyses demonstrated that AGAP1 co-localizes with GC in the cytoplasm of COS-1 cells.
In Northern blots, AGAP1 mRNA was detected in various human and murine tissues showing a comparable expression pattern described for the mRNA of α1 and β1. Using an AGAP1-specific antibody, endogenous protein was precipitated from lysates of HEK-293 cells derived from human embryonic kidney. The same antibody efficiently cross-reacted with the rat homologue (rAGAP1) and immunoprecipitated endogenous rAGAP1 from lysates of PC-12 cells, aorta and heart. The molecular mass of rAGAP1 is larger than that of the human protein, possibly due to an additional exon present in the rat genome. Like β1, AGAP1 is a substrate for tyrosine kinases. Phosphorylation of AGAP1 was detected after inhibition of PTPs or by coexpression of Src. Furthermore, the kinase inhibitor PP2 strongly impaired phosphorylation of AGAP1 after pervanadate treatment suggesting that tyrosine kinases of the Src family are involved. Measurements of cGMP production showed that AGAP1 has no influence on the activity of NO-sensitive GC. Interestingly, inhibition of PTPs potently increased the complex formation between AGAP1 and GC indicating that the interaction between these two proteins is modulated by reversible tyrosine phosphorylation. Whether this effect is due to the phosphorylation of AGAP1 or GC is still unknown. AGAP1 associates with endosomes and exposes Arf-GAP activity towards Arf1 and Arf5 which are involved in vesicular transport. Thus, one may hypothesize that binding of α1β1 to AGAP1 targets GC to distinct subcellular compartments in close proximity to cGMP-dependent effectors, thereby optimizing cGMP generation and fostering cGMP-driven actions.
Taken together, these results demonstrate that beside the modulation of GC by NO the enzyme is regulated by tyrosine phosphorylation and interaction with AGAP1.
The transcriptional regulator RcsB controls the expression of a minimum of 20 different genes having diverse functionalities and biosynthetic operons in the family of Enterobacteriaceae. While in the heterodimeric complex with the co activator RcsA, the RcsAB box consensus is recognized, DNA binding sites for RcsB without RcsA have also been identified. The conformation of RcsB might therefore be modulated upon interaction with various co activators, resulting in recognition of different DNA targets. In this study the interaction of RcsB with some of these DNA targets have been analysed by a diverse array of techniques including gel shift assay and SPR. The solution structure of the C-terminal DNA-binding domain of RcsB from Erwinia amylovora spanning amino acid residues 129-215 has been solved in this study by heteronuclear NMR spectroscopy. The C-terminal domain is composed of four α-helices where the two central helices of the H-T-H motif are similar to the structures of the regulatory proteins GerE, NarL and TraR. The DNA-binding activity of the C-terminal domain alone is established for the first time in this study and was specified by fluorescence spectroscopy, SPR and NMR titration experiments. The molecular interaction between the individual RcsB domains was analysed by cross-linking experiments and heteronuclear NMR spectroscopy and the amino acid residues of the C-terminal domain involved in this interaction were identified precisely. Another important part of this project was the cell-free production of different Trp analogue labelled RcsB protein. RcsB protein was produced in quite a good yield with different Trp analogue having spectrally enhanced properties. The isolated RcsB alloproteins proved to be ideal for protein interaction studies by fluorescence spectroscopy and the very first evidence of an oligomerization of RcsB due to molecular association has been put forth from these studies. The phosphorylated state of the RcsB protein was mimicked by a beryllofluoride complex in order to study its role in transcriptional regulation. It was found that RcsB alone could bind to DNA targets upon this modification by the beryllofluoride complex. Thus the phosphorylation of the protein that involves the Asp 56 residue induces a structural change of the protein followed probably by a domain movement also, so that the C-terminal domain having the H-T-H DNA binding motif that was previously eclipsed by the N-terminal domain is relieved of this constraint.
CFTR ist ein Chloridkanal, der bei der rezessiven Erbkrankheit Mukoviszidose defekt ist. Es ist bekannt, dass CFTR durch Proteinkinasen aktiviert und seine Aktivität durch Nukleotide reguliert wird. Die Regulation von CFTR wurde unter zwei verschiedenen Gesichtspunkten untersucht. Zum einen wurden Experimente durchgeführt, die Aufschluss über die Beteiligung der Nukleotidbindedomänen beim Öffnen und Schließen des Kanals und über die Notwendigkeit einer ATP-Hydrolyse geben sollten. Zum anderen wurde untersucht, ob neben der durch Proteinkinasen vermittelten Aktivierung von CFTR ein alternativer Prozess existiert. Hierbei wurde ein Regulationsmechanismus entdeckt, der eine Proteinkinase-unabhängige Aktivierung von CFTR durch Phosphatidylinositolphosphate ermöglicht.
Humaner CFTR wurde in Oozyten des Krallenfrosches Xenopus laevis heterolog exprimiert und mit der Patch-Clamp-Methode untersucht. Stationäre und zeitaufgelöste Ströme des CFTR-Wildtyps wurden mit mutierten CFTR-Kanälen verglichen. Das Lysin im Walker AMotiv ist an der Koordinierung des γ-Phosphats von MgATP bei der Hydrolyse beteiligt, so dass Walker A-Mutationen die ATP-Bindung und –Hydrolyse von ATPasen beeinflussen. In dieser Arbeit wurden Walker A-Mutanten untersucht, die eine Substitution des konservierten Lysins innerhalb der Walker A-Sequenz der NBD1 (K464A) oder beider Nukleotidbindedomänen (K464A/K1250A) aufwiesen. Da die Öffnungsgeschwindigkeit der Mutante K464A kaum einen Unterschied zu der des Wildtyps aufzeigte, die Mutante K1250A jedoch das Öffnen stark verlangsamte, wurde gefolgert, dass keine Hydrolyse von ATP an der NBD1 für die Öffnung nötig ist. Während Wildtyp-Kanäle auf eine gleichzeitige Applikation von ATP und AMP-PNP, einem nichthydrolysierbaren ATP-Analogon, mit einem verlängerten Offenhalten der Kanäle („locked open“–Effekt) reagierten, das sich in einem langsamen Schließen der Kanäle äußerte, konnte bei K464A-Mutanten dieser Effekt nicht beobachtet werden. Außerdem erfolgte das Schließen der Doppelmutante K464A/K1250A im Vergleich zur Einzelmutante K1250A nach MgATP-Entzug schneller. Daraus wurde geschlossen, dass die NBD1 auf das durch die NBD2 vermittelte Offenhalten des Kanals, möglicherweise durch eine direkte Interaktion, regulierend einwirkt, bevor letztere den Kanal wieder schließt. Da auch ein Öffnen und Schließen des CFTR-Kanals unter Mg2+-freien Bedingungen zu beobachten war, unter denen keine ATP-Hydrolyse erfolgen kann, konnte die Notwendigkeit einer ATP-Hydrolyse bezüglich des Kanalgatings ausgeschlossen werden. Ein Einwirken der NBD1 auf das Offenhalten der Kanäle durch die NBD2 war unter nicht-hydrolytischen Bedingungen anhand des Vergleichs der Schließkinetiken von WT und Mutante K464A nicht feststellbar, so dass eine direkte Interaktion beider Nukleotidbindedomänen wahrscheinlich ausgeschlossen werden kann.
Im zweiten Teil dieser Arbeit wurde der Effekt des Phospholipids Phosphatidylinositol-4,5-bisphosphat (PIP2) auf CFTR-Kanäle untersucht. Die Applikation von PIP2 und MgATP zu unphosphorylierten CFTR-Kanälen zeigte einen deutlichen Stromanstieg, der einem Chloridstrom entsprach. Einzelkanaluntersuchungen ergaben, dass durch PKA induzierte Kanäle und Einzelkanäle, die durch PIP2 aktiviert wurden, dieselbe Leitfähigkeit von ~5 pS besaßen. Somit konnte eine PIP2-induzierte Aktivität endogener Chloridkanäle ausgeschlossen und ein Einfluss des Phospholipids auf CFTR-Chloridkanäle bewiesen werden, der zudem ATP-abhängig war.
Neben PIP2, welches den stärksten Effekt auf die CFTR-Aktivität zeigte, konnten auch Phosphatidylinositol (PI) und Phosphatidylinositol-4-monophosphat (PIP), sowie Arachidonsäure unphosphorylierte CFTR-Kanäle aktivieren. Damit wurde gezeigt, dass der Effekt des Signalanstiegs durch Phosphatidylinositole abhängig von der Struktur des Moleküls war, also von der Anzahl der Phosphatgruppen am Inositolring und der Fettsäurezusammensetzung des Phospholipids.
Experimente, die unter Mg 2+-freien Bedingungen durchgeführt wurden, so dass eine Phosphorylierungsreaktion durch Kinasen ausgeschlossen werden konnte, zeigten dennoch eine PIP2-vermittelte Aktivierung von unphosphorylierten CFTR-Kanälen. Auch eine Substitution des nicht-hydrolysierbaren ATP-Analogons AMP-PNP anstelle von ATP erlaubte die Öffnung unphosphorylierter CFTR-Kanäle. Mit diesen beiden Ergebnissen wurde gezeigt, dass eine PIP2-vermittelte Aktivierung von unphosphorylierten CFTR-Kanälen unabhängig von einer Proteinphosphorylierung ist.
Physiologisch betrachtet könnte man sich vorstellen, dass über die Aktivierung von Lipidkinasen die Synthese von PIP2 über PI und PIP stimuliert wird, so dass das Phospholipid, wie für viele Ionenkanäle und Transporter gezeigt, eine direkte Interaktion mit dem Protein eingeht. Eine ATP-abhängige Synthese von PIP2 in Makropatches an Xenopus-Oozyten durch endogene Lipidkinasen könnte eine mögliche Erklärung für den gezeigten ATP-abhängigen Anstieg des CFTR-Signals sein.
In dieser Arbeit wurde bei CFTR-Kanälen zum ersten Mal ein alternativer Regulationsmechanismus über Phosphatidylinositolphosphate identifiziert, der Proteinkinaseunabhängig ist und der möglicherweise über eine direkte Interaktion zwischen dem Phospholipid und dem Protein vermittelt wird.
The quinol:fumarate reductase (QFR) is the terminal reductase of anaerobic fumarate respiration, the most commonly occurring type of anaerobic respiration. This membrane protein complex couples the oxidation of menaquinol to menaquinone to the reduction of fumarate to succinate. The three-dimensional crystal structure of the QFR from Wolinella succinogenes has previoulsy been solved at 2.2 Å resolution. Although the diheme-containing QFR from W. succinogenes is known to catalyze an electroneutral process, structural and functional characterization of parental and variant enzymes has revealed active site locations which indicate electrogenic catalysis across the membrane. A solution to this apparent controversy was proposed with the so-called “Epathway hypothesis”. According to this, transmembrane electron transfer via the heme groups is strictly coupled to a parallel, compensatory transfer of protons via a transiently established pathway, which is inactive in the oxidized state of the enzyme. Proposed constituents of the E-pathway are the side chain of Glu C180, and the ring C propionate of the distal heme. Previous experimental evidence strongly supports such a role for the former constituent. One aim of this thesis is to investigate by a combination of specific 13C-heme propionate labeling and FTIR difference spectroscopy whether the ring C propionate of the distal heme is involved in redox-coupled proton transfer in the QFR from W. succinogenes. In addition to W. succinogenes, the primary structures of the QFR enzymes of two other e- proteobacteria are known. These are Campylobacter jejuni and Helicobacter pylori, which unlike W. succinogenes are human pathogens. The QFR from H. pylori has previously been established to be a potential drug target, and the same is likely for the QFR from C. jejuni. The two pathogenic species colonize mucosal surfaces causing several diseases. The possibility of studying these QFRs from these bacteria and creating more efficient drugs specifically active for this enzyme depends substantially on the availability of large amounts of high-quality protein. Further, biochemical and structural studies on QFR enzymes from e- proteobacteria species other than W. succinogenes can be valuable to enlighten new aspects or corroborate the current understanding of this class of membrane proteins.
Die Entwicklung neuer Formen der Tumortherapie bleibt notwendig, solange die Heilung verschiedener solider metastasierender Tumore nicht möglich ist. Solch ein neuer Ansatz besteht in der Infektion des Tumors mit replikationskompetenten (retroviralen) Vektoren oder Viren. Um die Spezifität dieser Viren für die Tumorzellen zu erhöhen, wird in dieser Arbeit ein Konzept vorgestellt, dass die Tumor-spezifische Expression von Proteasen, im Besonderen von Matrix-Metalloproteasen (MMPs), zur Aktivierung des Maus Leukämievirus (MLV) ausnutzt (Protease-Targeting). Dazu wurde durch eine Blockierungsdomäne (CD40L) Nterminal vom infektionsvermittelnden MLV-Hüllprotein Env die Bindung an die Zelleintrittsrezeptoren verhindert. Eine Spaltstelle zwischen CD40L und Env ermöglicht die Entfernung der Blockierungsdomäne und damit die Aktivierung des Virus. Um eine Spaltstelle zu finden, die optimal auf das Proteasespektrum eines Tumors passt, wurde das zwischen CD40L und Env befindliche Linkerpeptid kombinatorisch diversifiziert und so eine Bibliothek von Retroviren erzeugt. Die Selektion dieser Bibliothek auf zwei unterschiedlichen Tumorlinien (HT1080, Fibrosarkom und U-87 MG, malignes Gliom) führte zur Anreicherung MMP-aktivierbarer Viren. Drei der mehr als 10 identifizierten Linkerpeptide (AKGLYK, PSGLYQ und PAGLHV) wurden im viralen Kontext näher charakterisiert. Für das Spaltmotiv PSGLYQ konnte MMP-2 als aktivierende Protease nachgewiesen werden. Für die Motive AKGLYK und PAGLHV erwies sich eine kummulative Spaltung durch eine Reihe von MMPs als wahrscheinlich. Um die Ausbreitung der Viren in Abhängigkeit der MMP-Expression zu zeigen, wurden verschiedene Zelllinien hinsichtlich ihrer Expression von MMP-2 und MMP-9 charakterisiert und in MMP-positive und MMP-negative Zelllinien eingeteilt. Durch Infektion dieser Zelllinien und anschließende Verfolgung der Virus-Ausbreitung konnte die konditionale Replikation der aktivierbaren Viren ausschließlich auf MMP-positiven Zellen nachgewiesen werden. Daher erreichten die Viren mit selektionierten Spaltmotiven im Gegensatz zum Parental- Virus, welches ein in der Literatur beschriebenes MMP-2-Spaltmotiv aus Kollagen (PLGLWA) präsentierte, die vollständige Infektion der Kulturen. Auch die Titer lagen etwa um das 1000fache höher. Die Replikationsgeschwindigkeit der aktivierbaren Viren mit AKGLYK und PSGLYQ Motiv erreichte annähernd die des unveränderten MLV, das Virus mit PAGLHV Motiv zeigte sogar eine identische Replikationskurve. In einem Tumor-Maus-Modell konnte die Ausbreitung der proteolytisch aktivierbaren Viren auch in der Umgebung eines soliden Tumors gezeigt werden. Sowohl nach Etablierung des Tumors aus zum Teil vorinfizierten Zellen, als auch nach Injektion von Viren in zuvor etablierte Tumore erfolgte sie für die selektionierten Viren genetisch stabil. Um die Verteilung der Viren im Organismus zu bestimmen, wurde ein Modell entwickelt, in dem ein vollständig infizierter Tumor als Virusquelle diente, und nach bestimmten Zeiträumen verschiedene Organe der Maus und ein zweiter aus uninfizierten Zellen etablierter Tumor per PCR auf Infektionen untersucht wurde. Hier zeigte sich, dass WT-MLV bis zu 20.000fach mehr Zellen in den Organen infizierte als die aktivierbaren Viren. Dagegen wurden Zellen in einem sekundären uninfiziert etablierten Tumor vom WT-MLV nur etwa 5fach besser infiziert als durch die aktivierbaren Viren. Das heißt, die selektionierten Viren erreichten ein hohes Maß an Tumortargeting. In der vorliegenden Arbeit wurden durch molekulare Evolution zum ersten Mal replizierende Retroviren hergestellt, die einen eingeschränkten und für Protease-positive Zellen spezifischen Tropismus aufwiesen. Die selektionierten Substrate glichen anderen, mit Hilfe von Peptid-Bibliotheken für MMPs identifizierten Motiven, jedoch konnten durch die Berücksichtigung des gesamten Proteasespektrums einer Zelllinie weitere Motive selektioniert werden, die durch bisherige Systeme nicht ermittelt werden konnten. Damit ergibt sich für die selektionierten MMP-aktivierbaren Viren durch die Kombination aus Targeting beim Zelleintritt und Replikation in der Targetzellpopulation, die für andere beschriebene Targetingsysteme nicht gegeben ist, eine echte Option für neue Wege in der Tumortherapie.
Der humane ABC-Transporter TAP (transporter associated with antigen processing) spielt in der Antigenprozessierung und in der MHC Klasse I-vermittelten Antigenpräsentation eine zentrale Rolle. Unter ATP-Hydrolyse katalysiert der heterodimere TAP-Komplex den Transport von proteosomal degradierten Peptiden aus dem Cytosol in das ER-Lumen. Diese werden im Peptidbeladungskomplex (PLC) auf MHC Klasse I-Moleküle geladen und zur Zelloberfläche transportiert, wo sie zytotoxischen T-Zellen präsentiert werden. Die Assemblierung eines funktionalen Komplexes hängt dabei von der korrekten intra- und intermolekularen Anordnung seiner Transmembransegmente (TMS) ab. Die strukturelle Organisation des TAP-Komplexes ist schon seit vielen Jahren Gegenstand intensiver Forschung und wird in der Literatur kontrovers diskutiert. Cystein-freie Proteinvarianten dienen bei der Untersuchung der Topologie als sehr gute Hilfsmittel und wurden bereits erfolgreich zur Aufklärung der Membrantopologie von komplexen Membranproteinen, wie P-glycoprotein oder der Lactose-Permease LacY, eingesetzt (Kaback et al., 2001; Loo und Clarke, 1995). Im ersten Teil der vorliegenden Arbeit wurden humane TAP1- und TAP2-defiziente Fibroblasten, die ansonsten alle anderen Komponenten der Antigenpräsentationsmaschinerie besitzen, stabil mit der jeweiligen humanen Cystein-freien TAP1- oder TAP2-Untereinheiten transfiziert. Alle 19 natürlichen Cysteine von TAP1 und TAP2 konnten vorher durch de novo Gensynthese ausgetauscht werden. Nach erfolgreicher Expression konnte ein ATP-abhängiger Peptidtransport, der spezifisch durch den viralen Inhibitor ICP47 inhibiert wurde, nachgewiesen werden. Außerdem konnte die MHC Klasse I-Oberflächenexpression der Zellen, ein Indikator einer funktionsfähigen Antigenpräsentierung, nach Transfektion mit den Cystein-freien TAP-Untereinheiten wiederhergestellt werden. Im zweiten Abschnitt wurde die Membrantopologie des humane TAP-Transporters in einem funktionalen Peptidbeladungskomplex durch ortsspezifische Mutagenese in Kombination mit der Markierung mittels thiolspezifischer Fluorophore untersucht. Durch Co-Immunpräzipitationen und Transportstudien mit radioaktiv-markierten Peptiden konnte die Funktionalität des, in Sf9 Zellen exprimierten, Cystein-freien TAP-Komplexes gezeigt werden. Einzelne Cysteine wurden aufgrund von Hydrophobizitätsanalysen in Kombination mit Sequenzvergleichen von anderen ABC-Transportern in vorhergesagte cytosolische oder ER-luminale Schleifen der TAP1-Untereinheit eingeführt und deren Zugänglichkeit mit dem thiolspezifischen, membran-impermeablen Fluorophor Fluoreszein-5-Maleimid in semi-permeabilisierten Zellen untersucht. Es konnte zum ersten Mal experimentell gezeigt werden, dass die Transmembrandomäne (TMD) der TAP1-Untereinheit in einem funktionalen Komplex aus zehn Transmembranhelices aufgebaut ist. Die TMD lässt sich in eine für die Heterodimerisierung, die Peptidbindung und den Transport essentielle und für viele ABC-Transporter charakteristische Core-Domäne, und zusätzliche N-terminale Domänen, die für die Bindung von Tapasin und die Assemblierung des PLCs verantwortlich sind, unterteilen. Somit konnte experimentell die Membrantopologie des ABC-Transporters TAP in einem funktionalen Peptidbeladungskomplex aufgeklärt werden. Der dritte Teil der Arbeit befasste sich mit der Untersuchung der veränderten Peptidbeladungskapazität, die in Kombinationen aus wildtyp TAP1 und Cystein-freiem TAP2 beobachtet wurde. Durch ortsspezifische Mutagenese wurden einzelne Cysteine in TAP2 wiedereingeführt und deren Funktionalität in Transportstudien analysiert. Es konnte ein einzelnes Cystein in TAP2 identifiziert werden, welches die Peptidbeladungskapazität beeinflusst und durch Modifikation mit thiolspezifischen Reagenzien zum Schalter für die Peptidbindung wird. Durch Quervernetzungsstudien mit radioaktiv-markierten Peptiden konnte weiterhin ein direkter Kontakt zwischen dem Cystein und dem gebundenen und somit transportierten Peptid des TAP-Transporters nachgewiesen werden.
Der Glycinrezeptor (GlyR) ist ein inhibitorischer Chloridkanal, der u.a. im Rückenmark, im Hirnstamm und in der Retina exprimiert wird und dort maßgeblich an der Prozessierung von motorischen und/oder sensorischen Signalen beteiligt ist. Als Mitglied der Superfamilie der nikotinischen Acetylcholinrezeptoren ist der GlyR ein Pentamer, dessen Untereinheiten jeweils aus einer extrazellulären N-terminalen Domäne, vier Transmembranregionen und einer großen intrazellulären Schleife bestehen. Bislang wurden vier ligandenbindende alpha-Untereinheiten (alpha 1-4) und eine für die synaptische Verankerung verantwortliche beta-Untereinheit identifiziert. Die beta-Untereinheit bildet im Gegensatz zu den alpha-Untereinheiten keine Homooligomere; sie ist nur in heterooligomeren GlyRs mit einer bisher angenommenen Stöchiometrie von 3alpha:2beta zu finden. Wie bei allen Mitgliedern der Superfamilie erfolgt die Ligandenbindung innerhalb der extrazellulären Domänen an der Kontaktstelle zwischen zwei benachbarten Untereinheiten. Um den Mechanismus der Ligandenbindung am homo- und heterooligomeren GlyR in dieser Arbeit aufzuklären, wurden Modelle der N-terminalen Domänen der alpha1- und beta-Untereinheiten basierend auf der Kristallstruktur des Acetylcholin-Bindeproteins generiert. Zur Verifizierung der Rolle aller im Modell in der Bindungstasche lokalisierten Aminosäureseitenketten wurden diese durch zielgerichtete PCR-Mutagenese substituiert, anschließend die mutierten Untereinheiten in Xenopus laevis Oozyten exprimiert und elektrophysiologisch charakterisiert. So konnten die wichtigsten Seitenketten der alpha1-Ligandenbindungstasche identifiziert werden, die an der Bindung der Agonisten Glycin und Taurin, des Antagonisten Strychnin und des Modulators 3alpha-(3’-Methoxybenzoyloxy)nortropan beteiligt sind. Die anschließende Untersuchung des heterooligomeren alpha1beta-GlyRs konnte zum ersten Mal eine direkte Beteiligung der beta-Untereinheit an der Ligandenbindung aufzeigen, wobei die Stabilisierung der Liganden in der Bindungstasche mit den zur alpha1-Untereinheit homologen Resten erfolgt. Zusätzlich ergab ein Vergleich der Affinitätsveränderungen nach Substitution homologer Reste in der alpha1- und der beta-Untereinheit Hinweise auf eine neue Stöchiometrie heterooligomerer GlyRs. Nur die Koexpression einer alpah1beta-Tandemuntereinheit mit der beta-Untereinheit resultierte in einem Rezeptor mit den gleichen pharmakologischen Eigenschaften wie der heterooligomere Wildtyp-GlyR. Dieses Ergebnis bestätigte die neue 2alpha:3beta Stöchiometrie heterooligomerer GlyRs. Damit wurde in dieser Arbeit eine dominante Rolle der beta-Untereinheit in heterooligomeren GlyRs aufgezeigt, welche für das Verständnis der synaptischen Verankerung und insbesondere der Pharmakologie des Rezeptors wichtig ist. Mit der neuen Stöchiometrie wurde gleichzeitig eine neue betabeta-Kontaktstelle in heterooligomeren GlyRs identifiziert, die als Wirkungsort neuer Therapeutika genutzt werden könnte.
Strukturelle und funktionelle Untersuchungen am Cytochrom-bc1-Komplex aus Paracoccus denitrificans
(2005)
Cytochrom bc-Komplexe sind zentrale Enzyme energietransduzierender Elektronen-transportketten. Anerkanntes Funktionsprinzip ist der Q-Zyklus; mechanistische Details insbesondere der Chinoloxidation am Qo-Zentrum sind noch unklar. Ein Verständnis des Qo-Zentrums ist auch von Interesse, da hier Inhibitoren in Form von Fungiziden und Malariatherapeutika wichtige Anwendung finden. In den vergangenen Jahren wurde eine Reihe mitochondrialer Komplexe kristallographisch charakterisiert, die Struktur eines bakteriellen Enzyms steht jedoch aus. Hauptziel dieser Arbeit war es, Ansätze zur Strukturaufklärung des bc1-Komplexes aus Paracoccus denitrificans (P.d.) zu finden, der als homologes Enzym mitochondrialer Komplexe bei einfacher genetischer Zugänglichkeit ein wichtiges Modellsystem darstellt. In der vorliegenden Arbeit wurde auf die Kristallisation des bc1-Komplexes aus S. cerevisiae aufgebaut, die mit Hilfe monoklonaler Antikörperfragmente (Fv) gegen die Rieske-Untereinheit (ISP) erreicht wurde; die Fv-Fragmente erleichtern die Ausbildung von Kristallkontakten. Die Epitopregion des Hefeenzyms wurde genetisch auf den bakteriellen Komplex übertragen, um dessen Ko-Kristallisation mit dem bereits verfügbaren Fv zu ermöglichen. Punktuelle Anpassungen führten zu keiner signifikanten Bindung, ein weitergehender Austausch des entsprechenden ISP-Bereichs verbesserte die Bindung hingegen deutlich. Die besten Ergebnisse konnten mit chimären Enzymen erzielt werden, bei denen die gesamte ISP-Ektodomäne durch das Hefe-Homologe ersetzt wurde. Aufbauend auf dieser Arbeit scheint die Fv-vermittelte Kristallisation des Enzyms ein greifbares Ziel. Eine komplementäre Strategie zielte auf die strukturelle Charakterisierung der Rieske-Ektodomäne (ISF). Das klonierte ISF wurde in E. coli überexprimiert, lag jedoch fast vollständig in inclusion bodies vor. Das ISF konnte in eine lösliche Form rückgefaltet werden, die anschließende chemische Rekonstitution zum Holo-Protein gelang jedoch nur mit einer Ausbeute von ~ 1 %. Die geringe Menge an löslichem ISF, die sich nach Expression in E. coli isolieren lässt, trägt kein [2Fe-2S]-Zentrum. Durch Koexpression der für die Biogenese von Eisen-Schwefel-Zentren relevanten Gencluster konnte die lösliche ISF-Fraktion in vivo in die Holo-Form konvertiert werden. Auch hier war aber die Gesamtausbeute für strukturelle Untersuchungen zu gering. Eine homologe Expression in P.d. war nur für das komplette ISP nachweisbar, nicht für das verkürzte ISF. Durch gerichtete Mutagenese konnte hier erstmals gezeigt werden, dass das bakterielle Rieske-Protein über den Tat-Translokationsweg in die Membran inseriert. Die Kristallstrukturen mitochondrialer bc1-Komplexe zeigen ein dimeres Enzym. Die Assoziation des bakteriellen Komplexes wurde in dieser Arbeit mit der analytischen Ultrazentrifugation untersucht, und auch hier wurde eindeutig ein Dimer nachgewiesen. Dynamische Messverfahren deuteten jedoch auf einen höheren Assoziationszustand hin. Es bleibt unklar, ob diese Diskrepanz durch Formparameter oder die Detergenzbindung begründet ist oder ob unter bestimmten Versuchsbedingungen möglicherweise Tetramere vorliegen. In situ ist der bc1-Komplex strukturell mit den Komplexen I und IV sowie dem Elektronenüberträger Cyt c552 assoziiert. Die Analyse verschiedener Deletionsstämme zeigte, dass Komplex I der Atmungskette durch diesen Superkomplex stabilisiert wird. Dieser Befund konnte kürzlich in anderen Arbeiten auch an menschlichen Mitochondrien bestätigt werden. Neben strukturellen Aspekten wurden am bc1-Komplex auch die H+-Translokation und die Chinonbindung untersucht. Da chemische Modifikationsexperimente zeigen, dass ein saurer Rest im ISP eine kritische Rolle für die Kopplung von H+-Translokation und Elektronentransport spielt, wurden durch gerichtete Mutagenese kombinatorisch saure Reste gegen entsprechende Säureamide ersetzt. Die biochemische Charakterisierung wurde nur für eine Fünffach-Mutante durchgeführt; diese erwies sich jedoch als zu instabil, um verlässliche Daten aus H+-Pumpexperimenten zu gewinnen. Die Charakterisierung der übrigen Mutanten scheint lohnenswert, da der relevante Aminosäurerest auch in anderen Arbeiten noch nicht identifiziert werden konnte. Der Gehalt des aufgereinigten Enzyms an spezifisch gebundenem Chinon wurde FTIR-spektroskopisch quantifiziert. Eine Stöchiometrie von ~ 3 Chinonmolekülen/Monomer stützt das double occupancy-Modell, demzufolge zwei Substratmoleküle am Qo-Zentrum binden; das dritte Chinon bindet am Qi-Zentrum. Partielle Extraktion des Chinons und Messungen bei verschiedenen pH-Werten zeigten, dass die Substratbindung mit Protonierung eines sauren Rests einhergeht. Möglicherweise handelt es sich dabei um Glu295 des Cytochrom b, das auf Basis der Kristallstrukturen als primärer H+-Akzeptor am Qo-Zentrum diskutiert wird. Aufbauend auf dieser Arbeit können die an der Chinonbindung beteiligten Reste durch Mutagenese identifiziert werden.
Mitochondial NADH:ubiquinone oxidoreductase (complex I) the largest multiprotein enzyme of the respiratory chain, catalyses the transfer of two electrons from NADH to ubiquinone, coupled to the translocation of four protons across the membrane. In addition to the 14 strictly conserved central subunits it contains a variable number of accessory subunits. At present, the best characterized enzyme is complex I from bovine heart with a molecular mass of about 980 kDa and 32 accessory proteins. In this study, the subunit composition of mitochondrial complex I from the aerobic yeast Y. lipolytica has been analysed by a combination of proteomic and genomic approaches. The sequences of 37 complex I subunits were identified. The sum of their individual molecular masses (about 930 kDa) was consistent with the native molecular weight of approximately 900 kDa for Y. lipolytica complex I obtained by BN-PAGE. A genomic analysis with Y. lipolytica and other eukaryotic databases to search for homologues of complex I subunits revealed 31 conserved proteins among the examined species. A novel protein named “X” was found in purified Y. lipolytica complex I by MALDI-MS. This protein exhibits homology to the thiosulfate sulfurtransferase enzyme referred to as rhodanese. The finding of a rhodanese-like protein in isolated complex I of Y. lipolytica allows to assume a special regulatory mechanism of complex I activity through control of the status of its iron-sulfur clusters. The second part of this study was aimed at investigating the possible role of one of these extra subunits, 39 kDa (NUEM) subunit which is related to the SDRs-enzyme family. The members of this family function in different redox and isomerization reactions and contain a conserved NAD(P)H-binding site. It was proposed that the 39 kDa subunit may be involved in a biosynthetic pathway, but the role of this subunit in complex I is unknown. In contrast to the situation in N. crassa, deletion of the 39 kDa encoding gene in Y. lipolytica led to the absence of fully assembled complex I. This result might indicate a different pathway of complex I assembly in both organisms. Several site-directed mutations were generated in the nucleotide binding motif. These had either no effect on enzyme activity and NADPH binding, or prevented complex I assembly. Mutations of arginine-65 that is located at the end of the second b-strand and responsible for selective interaction with the 2’-phosphate group of NADPH retained complex I activity in mitochondrial membranes but the affinity for the cofactor was markedly decreased. Purification of complex I from mutants resulted in decrease or loss of ubiquinone reductase activity. It is very likely that replacement of R65 not only led to a decrease in affinity for NADPH but also caused instability of the enzyme due to steric changes in the 39 kDa subunit. These data indicate that NADPH bound to the 39 kDa subunit (NUEM) is not essential for complex I activity, but probably involved in complex I assembly in Y. lipolytica.
My graduate thesis is on the "Structural studies of membrane transport proteins". Transporters are membrane proteins that have multiple membrane-spanning a-helices. They are dynamic and diverse proteins, undergoing a large conformational change and transporting wide range of susbtrates. Based on their energy source they can be classified into primary and secondary transport systems. Primary transport systems are driven by the use of chemical (ATP) or light energy, while secondary transporters utilize ion gradients to transport substrates. I began my PhD dissertation on secondary transporters by two-dimensional crystallization and electron crystallographic analysis and recently my focus also has shifted towards 3D crystallization. The following projects constitute my PhD thesis: 1) 2D crystallization of MjNhaP1 and pH induced structural change: MjNhaP1, a Na+/H+ antiporter that is regulated by pH has been implicated in homeostasis of H+ and Na+ in Methanococcus jannaschii, a hyperthermophilic archaeon that grows optimally at 85°C. MjNhaP1 was cloned and expressed in E. coli. Two-dimensional crystals were obtained from purified protein at pH4. Electron cryo-microscopy yielded an 8Å projection map. The map of MjNhaP1 shows elongated densities in the centre of the dimer and a cluster of density peaks on either side of the dimer core, indicative of a bundle of 4-6 membrane-spanning helices. The effect of pH on the structure of MjNhaP1was studied in situ in 2D crystals revealing a major change in density within the helix bundle relative to the dimer interface. This change occurred at pH6 and above. The two conformations at low and high pH most likely represent the closed and open states of the antiporter, respectively. This is the first instance where a conformational change associated with the regulation of a secondary transporter appears to map structurally. Reconstruction of 3D map and high-resolution structure by x-ray crystallography would be necessary to understand the mechanism of ion transport and regulation by pH. 2) 2D crystallization of Proline transporter: Proline transporter (PutP) from E.coli belongs the sodium-solute symporter family that includes disease related sodium dependent glucose and iodide transporter in humans. Sodium and proline are co-transported with a stoichiometry of 1:1. Purified PutP was reconstituted to yield 2D crystals that were hexagonal in nature. The 2D crystals had tendency to stack indicating their willingness to form 3D crystals. A projection map of PutP from negatively stained crystals showed trimeric arrangement of protein. Other members of the SSF family have been shown to be monomers. My analysis of oligomeric state of PutP in detergent by blue native gel indicates a monomer in detergent solution. It is likely that PutP can function as a monomer but at higher concentration and in lipid bilayer it tends to form trimer. 3) Oligomeric state and crystallization of carnitine transporter from E.coli: E.coli carnitine transporter (CaiT) belongs to the BCCT (Betaine, Carnitine and Choline) superfamily that transports molecules with quaternary amine groups. CaiT is predicted to span the membrane 12 times and acts as a L-carnitine/g-butyrobetaine exchanger. Unlike other members in this transporter family, it does not require an ion gradient and does not respond to osmotic stress. Over-expression of the protein yielded ~2mg of protein/L of culture. The structure and oligomeric state of the protein were analyzed in detergent and lipid bilayers. Blue native gel electrophoresis indicated that CaiT was a trimer in detergent solution. Gel filtration and cross-linking studies further support this. Reconstitution of CaiT into lipid bilayers resulted in 2D crystals. Analysis of negatively stained 2D crystals confirmed that CaiT is a trimer in the membrane. Initial 3D crystallization trials have been successful and currently, the crystals diffract to 6Å and are being improved. 4) Monomeric porin OmpG: OmpG is a bacterial outer membrane b-barrel protein. It is monomeric and its size (33kDa) places it as a prime candidate for a structural solution, using the recently developed method of solid state NMR (work in collaboration with Prof.Hartmut Oskinat, FMP, Berlin). A long-term aim would be to study porins as templates for designing nanopores, for DNA sequencing and identification. I have expressed OmpG in inclusion bodies and refolded at an efficiency of >90% into a functional form using detergent. OmpG was then crystallized by 2D crystallization yielding an 8Å projection map whose structure was similar to native protein. In addition, these crystals were used for structure determination by solid state NMR. An initial spectrum of heavy isotopically labeled OmpG has allowed identification of specific amino acid residues including threonine and proline. Additionally, I obtained 3D crystals in detergent that diffract to 5.5Å and are being improved.
Tumorerkrankungen, insbesondere solche im metastasierenden Stadium, erfordern effiziente Therapien. Krebstherapien wie Bestrahlung oder Chemotherapie wirken über die Induktion von Apoptose. Resistenz gegen diese Behandlungsansätze geht einher mit der Blockierung relevanter apoptotischer Signalwege. Dennoch haben Tumorzellen nicht grundsätzlich die Fähigkeit verloren, apoptotischen Zelltod zu sterben, d. h. mit einem geeigneten Stimulus kann in jeder Tumorzelle Apoptose induziert werden. In dieser Arbeit wurden Proteine entwickelt, die Enzyme apoptotischer Signalkaskaden selektiv in Tumorzellen einschleusen. Um Spezifität für transformierte Zellen zu erlangen, wurden diese Proteine mit Zellbindungsdomänen gekoppelt, die an tumorassoziierte Antigene binden. Als Zielstrukturen auf der Oberfläche von Krebszellen dienten die Rezeptoren der ErbB Familie „epidermal growth factor receptor“ (EGFR) und ErbB2. Überexpression dieser Rezeptoren wird auf einer Vielzahl von Tumoren epithelialen Ursprungs beobachtet und ist ursächlich beteiligt an der malignen Transformation. Als Apoptoseinduktoren wurden die Serinprotease Granzym B (GrB) sowie das Protein „apoptosis inducing factor“ (AIF) eingesetzt. GrB induziert Apoptose durch direkte Aktivierung von Caspasen und Spaltung zentraler Caspasen-Substrate. Damit greift die Protease am unteren Effektorende apoptotischer Signalwege ein und umgeht so die meisten Resistenzmechanismen transformierter Zellen. Um GrB in Tumorzellen einzuschleusen, wurde die Protease mit dem ErbB2 spezifischen Antikörperfragment scFv(FRP5) gekoppelt. Zunächst wurde eine biotinylierte Variante der Protease (bGrB) über die hochaffine Streptavidin/ Biotin Interaktion mit einem Fusionsprotein komplexiert, das aus dem scFv(FRP5) und Streptavidin besteht (SA-5). Komplexe aus enzymatisch aktivem bGrB und SA-5 wiesen selektive cytotoxische Aktivität gegenüber ErbB2 exprimierenden Zellen auf, die allerdings von der Präsenz des endosomolytischen Reagenz Chloroquin abhing. Dies zeigt die Notwendigkeit einer Translokation vom endosomalen Kompartiment, um internalisiertem GrB Zugang zu seinen cytosolischen Substraten zu ermöglichen. Aufbauend auf diesen Ergebnissen, die grundsätzlich nachweisen, daß das Einbringen von GrB in Tumorzellen ausreichend ist, um in diesen Zellen Apoptose zu induzieren, wurden Fusionsproteine abgeleitet, in denen GrB direkt mit Zellbindungsdomänen fusioniert ist. Neben dem scFv(FRP5) wurde auch der EGFR-Ligand TGFalpha eingesetzt. Fusionsproteine bestehend aus reifem GrB und scFv(FRP5) (GrB-5) bzw. TGFalpha (GrB-T) wurden in der Hefe Pichia pastoris exprimiert und mit hohen Ausbeuten gereinigt. GrB-5 und GrB-T zeigten enzymatische Aktivität und wiesen Affinität zu ErbB2 bzw. EGFR auf. In Gegenwart von Chloroquin zeigten GrB-5 und GrB-T selektive cytotoxische Aktivität gegenüber Zellen, die den jeweiligen Zielrezeptor exprimieren. Die IC50 Werte der Proteine lagen im pico- bis nanomolaren Bereich und sind damit vergleichbar mit denen rekombinanter Immun- bzw. Wachstumsfaktortoxine, die Exotoxin A (ETA) aus Pseudomonas aeruginosa als Effektor nutzen. Induktion von Apoptose erfolgte durch GrB-5 und GrB-T allerdings deutlich schneller (3 h) als durch ETA Fusionsproteine (72 h), da GrB im Gegensatz zu ETA direkt in apoptotische Signalkaskaden eingreift. Um die weitere Charakterisierung von GrB-5 und GrB-T zu erleichtern, wurden in der vorliegenden Arbeit Möglichkeiten für eine Optimierung der Expression dieser Fusionsproteine in Hefe untersucht. Dazu wurde eine Strategie entwickelt, die auf der Beobachtung beruht, daß die Löslichkeit und Stabilität von Proteinen durch Fusion mit solchen Domänen erhöht werden kann, die selbst eine hohe Löslichkeit und Stabilität besitzen. Ein Protein mit diesen Eigenschaften ist das Maltose Bindungsprotein (MBP) aus E. coli. In dieser Arbeit wurde MBP bei der Expression rekombinanter Proteine in P. pastoris eingesetzt, um die Ausbeute löslicher Proteine zu steigern. Es wurde eine Strategie entwickelt, die es erlaubt, MBP posttranslational in vivo vom Fusionspartner zu trennen. Hierzu wurde eine Erkennungssequenz der Protease Furin (furS) zwischen MBP und Fusionspartner eingefügt. Zunächst wurde untersucht, ob GrB als MBP Fusionsprotein in enzymatisch aktiver Form exprimiert werden kann, was eine Grundvoraussetzung für die Expression tumorspezifischer GrB Fusionsproteine in diesem System darstellt. Die Ausbeute von GrB konnte durch diese Strategie erheblich gesteigert werden. Daneben war eine vollständige Prozessierung der Fusionsproteine innerhalb der Furin-Erkennungssequenz nachweisbar. Als MBP Fusionsprotein exprimiertes GrB wies allerdings keine enzymatische Aktivität auf. Weitere Untersuchungen zeigten, daß das terminale Serin der furS-Sequenz, das nach Spaltung durch Furin am N-Terminus von GrB zurückbleibt, die enzymatische Aktivität der Serinprotease inhibiert. Im Rahmen dieser Arbeit wurde daher nicht weiter versucht, die Ausbeute an tumorspezifischen GrB Fusionsproteinen durch Fusion mit löslichen Proteindomänen zu erhöhen. Für Proteine, die ein N-terminales Serin tolerieren, stellt das hier entwickelte System allerdings eine neuartige Strategie dar, um die Ausbeute in P. pastoris um ein Vielfaches zu steigern. Dies wurde anhand von rekombinantem ErbB2 als Modellprotein bestätigt. Als alternativer Effektor in tumorspezifischen Fusionsproteinen wurde AIF als caspasenunabhängig agierendes proapoptotisches Signalmolekül eingesetzt. In apoptotischen Zellen bewirkt die Freisetzung von AIF aus dem mitochondrialen Intermembranraum die nachfolgende Translokation des Proteins in den Zellkern, woraufhin DNA-Fragmentierung induziert wird. Zum Einschleusen von AIF in Tumorzellen wurde das Flavoprotein mit dem scFv(FRP5) fusioniert (5-AIF). Um eine cytosolische Translokation von AIF zu erreichen, wurde ein Konstrukt abgeleitet, das zusätzlich die Translokationsdomäne von Exotoxin A enthält (5-E-AIF). Diese Domäne ist beim Wildtyp-Toxin notwendig für dessen retrograden Transport vom Endosom über den Golgi Apparat und das ER in das Cytosol. Innerhalb der Translokationsdomäne findet zudem eine Prozessierung durch die endosomale Protease Furin statt. AIF Fusionsproteine wurden in E. coli exprimiert, gereinigt und renaturiert. Die Proteine wiesen Affinität für ErbB2 auf und interagierten mit DNA, eine Eigenschaft, die essentiell für die proapoptotische Aktivität von AIF ist. 5-E-AIF zeigte gegenüber ErbB2 exprimierenden Zellen cytotoxische Aktivität, die vergleichbar mit der des Immuntoxins scFv(FRP5)-ETA war. Diese Aktivität war allerdings nur in Gegenwart von Chloroquin gegeben. Das Protein 5-AIF, in dem die Translokationsdomäne fehlt, zeigte auch in Kombination mit Chloroquin keine Cytotoxizität. Eine mögliche Folgerung hieraus ist, daß die N-terminale Antikörperdomäne der Fusionsproteine die proapoptotische Aktivität der AIF Domäne blockiert. 5-E-A wird sehr wahrscheinlich durch die endosomale Protease Furin „aktiviert“, die den scFv(FRP5) durch proteolytische Spaltung innerhalb der ETA-Domäne entfernt haben könnte. Für die eigentliche Translokation reicht der ETA-Anteil allerdings nicht aus, wahrscheinlich, weil in dem hier abgeleiteten Konstrukt ein für die Funktionsweise des Wildtyp-Toxins essentielles ER Retentionssignal fehlte. Die Ergebnisse dieser Arbeit zeigen, daß durch Einsatz apoptotischer Signalmoleküle in tumorzellspezifischen Fusionsproteinen hohe und selektive cytotoxische Aktivitäten erzielt werden können. Eine weitere Entwicklung dieser Proteine als mögliche Tumortherapeutika erscheint daher sinnvoll.
In der vorliegenden Arbeit wurden die Strukturen der Excisionase (Xis) aus dem Bakteriophagen HK022 sowie des Proteinkomplexes zwischen Cytochrom c552 und der CuA-Domäne aus T. thermophilus mittels NMR in wässriger Lösung bestimmt. Im Falle der Excisionase wurde mit Hilfe isotopenmarkierter Proteinproben die vollständige Zuordnung der 1H-, 15N- und 13C-Resonanzen durchgeführt. Hierauf basierend wurden anhand verschiedener zwei- und dreidimensionaler NOESY Spektren insgesamt 902 Abstandsbeschränkungen identifiziert, mit deren Hilfe die räumliche Struktur des Proteins bestimmt werden konnte. Die Strukturrechnungen ergaben letztendlich ein Strukturensemble von 20 Konformeren, die aus 2 alpha-Helices und 5 beta-Faltblattsträngen aufgebaut sind. Die beta-Faltblattstränge bilden 2 antiparalelle beta-Faltblätter, während die beiden alpha-Helices eine L-Formation darstellen. Die letzten 12 Aminosäurereste am C-Terminus zeigten keine NOEs und besaßen folglich auch keine geordnete Struktur. Dennoch ist dieser C-terminale Teil der Sequenz möglicherweise von physiologischem Interesse, da für den Rest 66 eine Asn/IsoAsp- Isomerisierung beobachtet wurde, welche eine Rolle bei der Autoregulation dieses Proteins in vivo spielen könnte. Ein weiteres markantes Strukturelement der Excisionase ist das Triprolinsegment Pro32-Pro33-Pro34, das die beiden beta-Faltblätter miteinander verbindet. Diese drei Prolinreste liegen in einer cis-trans-trans Konformation vor; aufgrund von Ligandenwechselwirkungen verschiedener anderer Proteine, die ein solches Motiv besitzen, liegt die Vermutung nahe, daß diese Region in der spezifischen Protein-Protein-Interaktion, die während der exzisiven Rekombination stattfindet, eine Schlüsselrolle spielen könnte. Zur Untersuchung der Wechselwirkung von Cytochrom c552 mit der CuA-Domäne wurden beide löslichen Fragmente mit dem 15N-Isotop angereichert. Daraufhin konnten für jedes Protein heteronukleare NMR-Experimente durchgeführt werden, die eine vollständige Zuordnung der Amidresonanzen sowohl im reduzierten als auch im paramagnetischen oxidierten Zustand ermöglichte. Basierend auf diesen Resonanzzuordnungen konnten Veränderungen der chemischen Verschiebungswerte aufgrund von Oberflächenkontakten mit dem jeweiligen Redoxpartner mittels 2D [15N, 1H]-TROSY Experimenten in beiden Redoxzuständen ermittelt werden. Die betroffenen Aminosäurereste, welche an der Moleküloberfläche die Kontaktzone definieren, wurden für eine Docking-Rechnung herausgezogen, um letztendlich die räumliche Struktur des Elektronentransferkomplexes zwischen Cytochrom c552 und der ba3-Oxidase zu bestimmen. Interessanterweise traten beim Cytochrom c552 zusätzlich zu den Verschiebungseffekten auf der Moleküloberfläche im reduzierten Zustand auch noch sehr dominante Sekundäreffekte im hinteren Teil der Hämspalte an der Stelle auf, wo das Propionat A über Wasserstoffbrückenbindungen mit dem Protein verbunden ist. Analog zu dem System aus P. denitrificans befindet sich auch im Cytochrom c552 aus T. thermophilus in dieser Position ein aromatischer Ring, der vermutlich von elektronischen Veränderungen im Hämring beeinflußt wird und diese Effekte durch seinen somit veränderten Ringstrom an die unmittelbare Umgebung weitergibt. Diese experimentellen Daten unterstützen die Elektronendelokalisierungstheorie von Wikström und Mitarbeitern (Johansson et al., 2002a und b), wonach im reduzierten Häm ein Teil der Elektronenladung bis in die Peripherie des Hämrings delokalisiert ist, einschließlich der nichtkonjugierten Propionatreste. Aus vorangegangenen Studien ergab sich bereits, daß der Elektronentransferkomplex in T. thermophilus auf hydrophoben Wechselwirkungen beruht, im Gegensatz zum P. denitrificans System, in dem die Interaktion elektrostatischer Natur ist (Maneg et al., 2003). Tatsächlich weist die in dieser Arbeit bestimmte Struktur des Elektronentranferkomplexes einen hohen Anteil (ca. 40%) an unpolaren Kontaktoberflächen auf. Das Cytochrom c552 bindet dabei an die CuA-Domäne nahe dem CuA-Zentrum, so daß der Abstand zwischen den Metallzentren von Donor und Akzeptor 15,6 Å beträgt. Der Hämring des Cytochrom c552 berührt die CuA-Domäne im Bereich von Phe86 und Phe88, wie bereits von Soulimane et al. (2000) aufgrund der Sequenzhomologie mit dem P. denitrificans System postuliert worden war. Wie jedoch aus dem berechneten Elektronentransferweg hervorgeht, ist die aromatische Seitenkette des Phe88 nicht unbedingt in die Elektronenübertragung einbezogen. Der ca. 19-20 Å lange Weg des Elektrons führt wahrscheinlich vom Häm über das Proteinrückgrat der CuAReste Ala87 und Phe88 zum CuA-Zentralliganden His114 und schließlich zum binuklearen Kupferzentrum. Dies erklärt auch, wieso eine F88L Mutation der CuA-Domäne (Maneg et al., 2003) nur zu einer 50%igen Abnahme der Aktivität geführt hat. Hiermit ist nun für das T. thermophilus System der gesamte Weg der Elektronenübertragung vom Cytochrom c552 über die CuA-Domäne zur Untereinheit I der ba3-Oxidase in den Grundzügen aufgeklärt, da der Elektronentransfer vom CuA- zum CuB-Zentrum bereits zuvor beschrieben worden war (Soulimane et al., 2000).
The N-terminal domain (matrix protein or MA) of a retroviral Gag polyprotein precursor plays a critical role in several stages of the retrovirus life cycle. MA is involved in the effective membrane targeting, assembly and release of the immature viral particles from the infected cell. In order to understand the structural basis of these functions, the full length MA from Moloney Murine Leukemia Virus (MoMuLV) was purified and the solution structure of the MA MoMuLV was determined by means of heteronuclear high-resolution NMR spectroscopy and compared with that of the X-ray diffraction analysis as well as with the structures of several MA proteins from geterologous viruses. Structural features were also obtained from CD spectroscopy, dynamic light scattering, sedimentation velocity, differential scanning calorimetry and other methods. It was found that the MA MoMuLV globular core (residues 8-98) is comprised of 7 well-defined helices (five alpha-helices and two 310 helices), with the general fold typical for MA proteins from other retroviral species. The N-terminus (residues Met1-Leu7) and the C-terminal proline-rich part (residues Pro103-Tyr131) are not structured in solution. Although MA MoMuLV has a low sequence identity compared with other matrix proteins for which the three-dimensional structure is known, it was shown that its overall topology and pattern of secondary structural units is similar to other retroviral matrix proteins. The monomeric state is observed for the correctly folded MA MoMuLV in a variety of external conditions and protein concentrations, indicating that virion assembly starts with the plasma membrane targeting of the nascent Gag precursor. The denaturation of MA MoMuLV is irreversible and is connected with protein aggregation. For Moloney Murine Leukemia Virus (MoMuLV) a proteolytic processing of the R-peptide (last 16 amino acids from the C-terminus of the Envelope protein (Env)) has been described as a second mode of fusion and activation preceding the receptor contact between the viral particle and the cellular membrane. An interaction between the R-peptide and MA MoMuLV has been proposed, since the R-peptide and MA are localized at the inner part of the membrane. Therefore the interaction between 15N labelled purified MA MoMuLV and synthesized R-peptide has been investigated using high-resolution NMR. It was found that in water solution MA MoMuLV and R-peptide do not form a tight complex, but in a mature virion in the presence of membranes or other protein factors it might be possible. In the case of HIV-1 the cytoplasmic part (EnvC) of the Env protein is much longer than in other retroviruses and again as for MoMuLV little is known about the interaction between EnvC and HIV MA. Hence, the full length HIV MA, and the last 150 amino acids from HIV Env have been subcloned with suitable expression vectors, purified and analysed by native gel electrophoresis, a pull down assay and by high resolution NMR for the purpose to detect the complex formation of EnvC and HIV MA. Finally, after all those experiments, it was found that a stable complex is not formed, but a weak interaction between the two proteins can not be excluded.
In dieser Arbeit wurde der Gentransfer von Todesliganden als Ansatz zur Tumor-Gentherapie untersucht. Dazu wurde ein lentiviraler Vektor der zweiten Generationverwendet, der die Todesliganden CD95L oder TRAIL sowie das Markergen EGFP exprimiert. Dies ist die erste Beschreibung von CD95L- oder TRAILexprimierenden lentiviralen Vektoren. Der TRAIL-exprimierende Vektor erwies sich als geeignet für die therapeutische Induktion von Apoptose in humanen Tumorzelllinien auch bei geringen Vektordosen. Die Transduktion mit diesem Vektor bei niedriger MOI führte zu Todesrezeptor-spezifischer Induktion von Apoptose. Diese wurde ausschließlich durch membranständiges TRAIL bei Zell-Zell-Kontakt vermittelt. Die transduzierten Zellen waren zudem in der Lage, bei Kontakt mit nichttransduzierten Zellen in diesen Apoptose auszulösen. Durch den TRAIL-Gentransfer wurde jedoch spezifisch in den transduzierten Zellen Resistenz gegen TRAIL-induzierte Apoptose ausgelöst, während die CD95- oder Cisplatin-induzierte Apoptose nicht beeinflusst war. Dies führte zum Auswachsen einer vollständig TRAIL-resistenten Population. Bereits 72 Stunden nach Transduktion konnten Anzeichen der Resistenz detektiert werden. Der Grund für diese Resistenzinduktion lag in einer spezifischen Blockade der DISC-Bildung und Caspase-8-Aktivierung durch die TRAIL-Todesrezeptoren. Die Signaltransduktion durch den sehr ähnlichen CD95-Signalweg war gänzlich unbeeinflusst. Durchflusszytometrische und proteinbiochemische Untersuchungen der Expression von TRAIL-R1 und TRAIL-R2, sowie die Untersuchung der mRNA-Expression dieser Rezeptoren ergaben, dass beide TRAIL-Todesrezeptoren noch synthetisiert, jedoch intrazellulär zurückgehalten wurden. In fluoreszenzmikroskopischen Versuchen konnte gezeigt werden, dass TRAIL-R2 intrazellulär in einem Komplex mit TRAIL vorlag, der sich im Bereich des ER/Golgi-Apparates befand. Diese Ergebnisse belegen, dass intrazelluläre Interaktion von TRAIL mit seinen Rezeptoren zur Retention dieser Proteine in der Zelle und damit zur Resistenzentwicklung führte. Bei Versuchen zur in vivo-Gentherapie durch lentivirale TRAIL-Expression in humanen Tumortransplantaten auf Nacktmäusen wurde nur ein transienter Effekt erzielt. Es konnte gezeigt werden, dass mit Vektorpartikeln assoziiertes TRAIL-Protein in den Tumoren Apoptose auslöste. Diese Induktion von Apoptose führte zu einer Wachstumsverzögerung. Dadurch wurde jedoch gleichzeitig eine effiziente Transduktion der Tumorzellen mit dem TRAIL-exprimierenden Vektor und ein langfristiger Effekt der TRAIL-Expression verhindert. Diese Ergebnisse zeigen, dass lentiviraler Gentransfer mit konstitutiv TRAIL-exprimierenden Vektoren ungeeignet zur in vivo-Transduktion von Tumoren ist. Gleichzeitig belegen die Ergebnisse der Transduktion mit einem Kontrollkonstrukt einen effizienten Gentransfer. Der hier charakterisierte Resistenzmechanismus ist zuvor nicht beschrieben worden und stellt eine neuartige Form der Therapie-induzierten Resistenz dar. Die proapoptotische Gentherapie durch konstitutive TRAIL-Expression in Tumoren muss nach diesen Ergebnissen neu bewertet werden. Der lentivirale Gentransfer in Tumore in vivo läuft prinzipiell effizient ab. Bei Verwendung eines regulierbaren Expressionssystems und in Kombination mit Suizidgenen könnte eine therapeutische Nutzung des lentiviralen TRAIL-Gentransfers möglich sein.
Heterologe Expression des humanen ß-2-adrenergen Rezeptors in Semliki-Forest-Virus-Expressionssystem
(2005)
Der humane ß2-adrenerge Rezeptor besitzt sieben Transmembrandomänen und gehört zur Superfamilie der G-Protein gekoppelten Rezeptoren (GPCRs). Der Rezeptor ist an der Zelloberfläche lokalisiert und kann nach Bindung extrazellulärer Signalstoffe intrazelluläre Antworten auslösen. Als physiologische Liganden des ß2-adrenergen Rezeptors dienen hauptsächlich die Katecholamine wie Noradrenalin. Nach der Bindung des Liganden kann der Rezeptor an ein stimulatorisches G-Protein (Gs) koppeln und durch Aktivierung der Adenylatzyklase die intrazelluläre cAMP-Konzentration regulieren. Aufgrund der großen pharmakologischen Bedeutung von GPCRs ist es wichtig, die dreidimensionale Struktur dieser Rezeptoren aufzuklären. Da die GPCRs im nativen Gewebe nur in geringen Mengen vorkommen, müssen sie heterolog überproduziert und zur Strukturaufklärung gereinigt werden. In dieser Arbeit wurde das Semliki Forest Virus (SFV)-Expressionssystem zur Produktion des ß2-adrenergen Rezeptors etabliert und optimiert. Die Optimierung des SFV-Expressionssystems erfolgte zunächst bei der Produktion von rekombinanten Viren. Die in vitro Transkriptionsreaktion wurde zur Verbesserung der RNA-Ausbeute untersucht. Anschließend wurde eine optimale Bedingung für die Elektroporation gefunden. Dabei konnte einen Virustiter von 7,5 × 108 infektiöse Partikel pro ml erreicht werden. Zur Produktion des Rezeptors in Säugerzellen wurden sieben rekombinante Viren hergestellt. Verschiedene N- und C-terminale Fusionen wurden im Hinblick auf einen möglichen Einfluss auf die Rezeptorproduktion untersucht. Für das Gen des Kapsid-Proteins (CAP) des Semliki-Forest-Virusgenoms konnte eine deutliche Steigerung der Rezeptorproduktion gefunden werden. Auch die Kozak-Sequenz und das Hämagglutinin (HA)-Signal-Peptid zeigten einen positiven Einfluss auf die Rezeptorproduktion. Die heterologe Proteinexpression wurde in verschiedenen Zelllinien durchgeführt. Es zeigte sich, daß die BHK-21-Zellen für die Produktion in großen Mengen am besten geeignet sind. Die Expressionsrate des Rezeptors in BHK-21-Zellen stieg mit zunehmender Infektionsmultiplizität (MOI). Durch Zugabe von Liganden Alprenolol ins Kulturmedium konnte eine weitere signifikante Steigerung von Rezeptorproduktion erzielt werden. So konnte in adhärenten BHK-21-Zellen 20 Stunden nach der Infektion bei einer MOI von 150 und 2 µM Alprenolol im Medium eine Produktionsrate von 49,6 pmol Rezeptor pro mg Membranprotein erreicht werden. In Suspensionskultur konnte eine Produktionsrate von 36,0 pmol Rezeptor pro mg Membranprotein erreicht werden. Damit konnten 0,2 mg Rezeptoren aus 1 Liter Suspensionskultur produziert werden. Die Rezeptorproduktion in Suspensionskultur könnte jedoch weiter verbessert werden. Mit Immunogoldmarkierung konnte eine überwiegende Lokalisation des Rezeptors im endoplasmatischen Retikulum festgestellt werden. Ein N-Glykosylierung des Rezeptors konnte nachgewiesen werden. Die Glykosylierung gehört zum mannosereichen Typ. Für den Rezeptor wurde eine Dissoziationskonstante von 2,7 nM konnte für Liganden [3H]-CGP-12177 bestimmt. Durch Messung der intrazellulären cAMP-Konzentration wurde die vollständige Funktionalität des rekombinanten Rezeptors nachgewiesen. Für die Membranpräparation wurde ein Protokoll erarbeitet, womit ca. 120 mg Membranprotein aus 1 Liter Zellkultur gewonnen werden konnten. Bei der anschließenden Solubilisierung des Rezeptors mit 1,5 % n-Dodecyl-ß-D-maltosid bei pH 7,4 und 100 mM NaCl konnte eine Ausbeute von ca. 100% erreicht werden. In dieser Arbeit konnte nach verschiedenen Versuchen gezeigt werden, daß eine Reinigung über Immobilisierte Metallchelat-Affinitätschromatographie (IMAC) in einem einzigen Schritt nicht möglich war.
Sodium proton antiporters are ubiquitous membrane proteins found in the cytoplasmic and organelle membranes of cells of many different origins, including plants, animals and microorganisms. They are involved in cell energetics, and play primary roles in the homeostasis of intracellular pH, cellular Na+ content and cell volume. Adaptation to high salinity and/or extreme pH in plants and bacteria or in human heart muscles requires the action of such Na+/H+ antiporters. NhaA is the essential Na+/H+ antiporter for pH and Na+ homeostasis (at alkaline pH) in Escherichia coli and many other enterobacteria. NhaA is an electrogenic Na+/H+ antiporter that exchanges 2H+ for 1Na+ (or Li+). NhaA shares with many other prokaryotic and eukaryotic antiporters a very strong dependence on pH. In order to achieve three-dimensional structure of NhaA, the previously described NhaA protein preparation was modified: (i) the wild type bacterial strain (TA16) used for homologous over-expression of NhaA was replaced with a delta nhaA strain (RK20). As a result, the purity and homogeneity of the sample was significantly improved; (ii) the previously two-step purification procedure was shortened to a single step affinity chromatography purification; (iii) a wide-range screening of crystallisation conditions, more than 20,000, was performed; (iv) a Seleno-L-methionine (SeMet) NhaA derivative was produced in order to solve the phases during structure determination. In parallel, attempts of production and crystallisation of co-complexes composed of NhaA and antibody fragments have been made. Four different monoclonal antibodies were available against NhaA. Selected antibody fragments were produced and the stability of the complex analysed. Here, the crystal structure of the pH down-regulated secondary transporter NhaA of Escherichia coli is presented at 3.45 Å resolution. A negatively charged ion funnel opens to the cytoplasm and ends in the middle of the membrane at the putative ion-binding site. There, a unique assembly of two pairs of short helices connected by crossed, extended chains creates a balanced electrostatic environment. A possible mechanism is proposed: the binding of charged substrates causes electric imbalance inducing movements, which allow for a rapid alternating access mechanism. This ion exchange machinery is regulated by a conformational change elicited by a pH signal perceived at the cytoplasmic funnel entry. The structure represents a novel fold that provides two major insights: it reveals the structural basis for the mechanism of Na+/H+ exchange and its unique regulation by pH in NhaA and in many other similar antiporters. Furthermore, it is also important for the understanding of the architecture of membrane proteins in general. However, although many aspects of the ion-translocation mechanism and pH regulation are clarified by the NhaA structure, higher resolution structures with Li+ or Na+ bound are required for understanding the ligand binding and the translocation mechanism at the atomic level. The alkaline pH-induced conformation is essential to further understand the pH-control and proton access to the binding site.
The Na+/proline transporter of E. Coli (PutP) is responsible for the uptake of proline which is subsequently used not only as a carbon and nitrogen source and a constituent of proteins but also as a particularly effective osmoprotectant. However, for a long time there was little known about the single steps in the reaction cycle of this transporter and only few details about its structure-function relationship are available. Aim of the present work was to achieve a deeper understanding about the kinetic properties of the Na+/proline transporter and to get insights into the structure-function relationship of the substrate binding. To answer these questions different techniques were used. By using the novel SSM technique combining the preparation of PutP proteoliposomes it was possible to demonstrate for the first time the electrogenic substrate binding to PutP transporter. Due to rapid solution exchange measurements on the SSM it was additionally possible to obtain time resolved information about the kinetic details of the cytoplasmic substrate binding sites which were not available by previous steady state and equilibrium binding measurements. Pre-steady-state charge translocation was observed after rapid addition of one or both of the cosubstrates Na+ and/or proline to the PutP-WT proteoliposomes adsorbed on the SSM. Thereby it was possible to link the observed electrical signals with the binding activity of PutP. The observed Na+ and/or proline induced charge displacement were assigned to an electrogenic Na+ and/or proline binding process at the cytoplasmic face of the enzyme with a rate constant of k > 50 s-1 proceeding the rate limiting step of the reaction cycle. Furthermore, based on the kinetic analysis of the electrical signals obtained from the measurements of PutP on SSM, the following characteristics of the substrates binding in PutP were deduced: (1) both Na+ and proline can bind individually to the transporter. Under physiological conditions, an ordered binding mechanism prevails; while at sufficiently high concentrations, each substrate can bind in the absence of the other; (2) substrate binding is electrogenic not only for Na+, but also for the uncharged cosubstrate proline. The charge displacement associated with Na+ binding and proline binding is of comparable size and independent of the presence of the respective cosubstrate. In addition, it was concluded that Na+ accesses its binding site through a high-field access channel resulting in a charge translocation, whereas the binding of the electroneutral proline induces a conformation alteration involving the displacement of charged amino acid residue(s) of the protein; (3) Na+ and proline binding sites interact cooperatively with each other by increasing the affinity and/or the speed of binding of the respective cosubstrate; (4) proline binding proceeds in a two step process: low affinity (~ 0.9 mM) electroneutral substrate binding followed by a nearly irreversible electrogenic conformational transition; (5) membrane impermeable PCMBS inhibits both Na+ and proline binding to the inside-out orientated PutP transporter, indicating that rather than selectively blocking a specific binding site, PCMBS probably locks the enzyme in an inactive state. The possible targets for this SH-reagent are cysteines 281 and 344 located close to the cytoplasmic surface of the protein. Beyond it, transient electrical currents of PutP were also observed on the BLM after rapid addition of proline in the presence of Na+. This was possible by combining the conventional BLM technique with high-speed flash-photolysis of caged-proline. Indeed the signals on the BLM indicate the detection of a different underlying reaction process in comparison to the data achieved by the SSM technique. This has paved the way for supplemental information about the reaction cycle since it was possible to assign the flash-photolysis BLM signals to the proline binding step followed by the internalization of Na+ and proline into the liposome. Thereby it was found, that the presence of Na+ is indispensable and the time constant for the process is ~ 63 ms. Moreover, structure-function information about the Na+ and proline binding sites of PutP was obtained by investigating the functionally important amino acid residues Asp55, Gly63 and Asp187 with site-directed mutagenesis and the combined SSM technique. One finding is that the mutated proteins PutP-D55C and PutP-G63C showed no activity on the SSM. Therefore, it can be assumed that either both Asp55 and Gly63 are crucial for the structure of PutP protein, or they are located at or close to the Na+ and proline binding sites. Furthermore, the results obtained from PutP-D187N and PutP-D187C mutants on SSM suggest that Asp187 of PutP is likely to be involved in the Na+ binding at the cytoplasmic side of the backward running carrier. Taken together the results of the present work have substantially broadened the known picture of the Na+/proline transporter PutP thereby several steps of the reaction cycle were elucidated, and moreover, valuable insights into the structure-function relationship of the transporter have become available.