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Einleitung: Um die empfindlichen Nervenzellen des Gehirns vor den Einflüssen schädigender Substanzen im systemisch zirkulierenden Blut zu schützen, besitzen höhere Lebewesen einen Barrieremechanismus, der das zentrale Nervensystem (ZNS) nach außen hin abriegelt. Diese Blut-Hirn-Schranke (BHS) wird durch die Gefäßendothelzellen im Gehirn gebildet, die über eine Kombination mehrerer Mechanismen Substanzen vom Eindringen in das Gehirngewebe abhalten. Zum einen stellt die Existenz dieser Barriere einen lebensnotwendigen Schutz dar, zum anderen jedoch bedeutet sie eine große Hürde in der Pharmakotherapie von Erkrankungen des zentralen Nervensystems, da nur wenige Arzneimittel in der Lage sind sie zu überwinden. Eine gute Gehirngängigkeit besitzen in der Regel kleine Moleküle mit einer hohen Lipophilie oder solche, die aktiv über Transporter oder Rezeptoren in das ZNS aufgenommen werden. Alle anderen Substanzen, wie effektiv sie auch im restlichen Körper sein mögen, stehen für die Therapie zerebraler Krankheiten wie z.B. Epilepsie, Alzheimer, Gehirntumore oder ZNS-HIV unter normalen Umständen nicht zur Verfügung. Das Gebiet der kolloidalen Trägersysteme bietet eine Lösung für dieses Problem. Durch den Einsatz von Liposomen oder Nanopartikeln als „Carrier“ können verschiedene Arzneistoffe aktiv in das Gehirn transportiert warden, um dort ihre Wirkung zu entfalten. Des Weiteren führt ein solches „Drug targeting“ nicht nur zu einer Überwindung der BHS sondern gleichzeitig zu einer vermehrten Anreicherung des Arzneistoffs im ZNS und dadurch zu geringeren Nebenwirkungen im restlichen Organismus. Durch die erhöhte Selektivität für das ZNS können kleinere und somit für den Körper verträglichere Dosen des Arzneistoffs eingesetzt werden. In der Vergangenheit konnte gezeigt werden, dass unter anderem Nanopartikel aus humanem Serumalbumin, welche mit Polysorbat 80 überzogen waren oder deren Oberfläche mit Apolipoproteinen modifiziert wurde, Arzneistoffe, die üblicherweise nicht in der Lage sind die Blut-Hirn-Schranke zu überwinden, zentral zur Wirkung brachten. Der genaue Mechanismus, durch den diese Arzneistoffe mithilfe der Trägersysteme ins Gehirn gelangen,war bisher weitgehend ungeklärt. Ein Eindringen des arzneistoffbeladenen Nanopartikels als Ganzes in das Gehirn sowie die Einleitung 2 Vermittlung des Arzneistoff-Transportes durch das Partikel am Endothel oder gar eine unselektive Zerstörung der Barrierefunktion wurden diskutiert. Im Rahmen dieser Arbeit wurden mit Apolipoproteinen modifizierte Partikel aus humanem Serumalbumin hergestellt und hinsichtlich ihrer Größe, der Größenverteilung, des Partikelgehaltes, der Oberflächenladung und ihres morphologischen Erscheinungsbildes charakterisiert. Anschließend wurde die Interaktion dieser kolloidalen Trägersysteme mit isolierten Endothelzellen des Nagergehirns mittels verschiedener Analytiken untersucht. Gleichzeitig wurden in umfangreichen Untersuchungen an Mäusen und Ratten die Geschehnisse in vivo beleuchtet und mit Hilfe eines bildgebenden Verfahrens, der Elektronenmikroskopie, dargestellt. Des Weiteren wurde der Effekt einer nanopartikulären Applikation auf die Integrität der Barrierefunktion der BHS untersucht, wodurch eine schädliche Wirkung der Partikel ausgeschlossen und die der Aufnahme in das ZNS zugrunde liegenden Transportmechanismen aufgeklärt werden konnten.
Ziel dieser Arbeit war es, einen genaueren Einblick in die Rolle von PaCLPXP für den Energiemetabolismus von P. anserina zu erhalten und mögliche Komponenten zu identifizieren, welche wichtig für die Langlebigkeit der PaClpP-Deletionsmutante sind. Folgende neue Erkenntnisse konnten hierbei gewonnen werden:
1. Die Substrat-Analyse durch eine Cycloheximid-Behandlung und anschließender Proteom-Analyse legte erfolgreich eine Reihe potentieller bisher nicht bekannter Substrate von PaCLPP offen. Interessanterweise waren unter den identifizierten Proteinen viele ribosomale Untereinheiten und Komponenten verschiedener Stoffwechselwege des Energiemetabolismus zu finden. Am auffälligsten unter diesen Substraten war die extreme Anreicherung eines Retikulon-ähnlichen Proteins, das einen neuen Aspekt der möglichen molekularbiologischen Rolle von PaCLPP in P. anserina andeutet.
2. Durch die Zugabe von Butyrat zum Medium, konnte erfolgreich die Autophagie sowohl im P. anserina Wildtyp als auch in der PaClpP-Deletionsmutante reduziert werden. Diese Verminderung der Autophagie sorgt bei ΔPaClpP für eine Verkürzung der Lebensspanne. Dieser Effekt ist spezifisch für die PaClpP-Deletionsmutante, während die Auswirkung von Butyrat auf den Wildtyp nur marginal ist. Dieses Ergebnis untermauert frühere Analysen dieser Deletionsmutante, welche besagen, dass die Langlebigkeit von ΔPaClpP Autophagie abhängig ist (Knuppertz und Osiewacz, 2017).
3. Die Metabolom-Analyse von ΔPaClpP im Vergleich zum Wildtyp zeigt, dass das Fehlen der PaCLPP zu Veränderungen in der Menge der Metaboliten der Glykolyse und des Citratzyklus kommt. Außerdem sind die Mengen der meisten Aminosäuren und der Nukleotide betroffen. Diese Analyse beweist, dass das Fehlen dieser mitochondrialen Protease weitreichende Folgen für die ganze Zelle hat. Durch die signifikante Verringerung von ATP und die Anreicherung von AMP in jungen ΔPaClpP-Stämmen und durch den Umstand der gesteigerten Autophagie in dieser Mutante, fiel das Augenmerk auf die AMPK. Dieses veränderte AMP/ATP-Verhältnis ist ein Indiz für eine gesteigerte AMPK-Aktivität und könnte auch den Umstand der gesteigerten Autophagie in ΔPaClpP erklären.
4. Das Gen codierend für die katalytische α-Untereinheit der AMPK (PaSnf1) konnte erfolgreich in P. anserina deletiert werden. Das Fehlen von PaSNF1 führt zu einer reduzierten Wuchsrate, eine beeinträchtige weibliche Fertilität und eine verzögerte Sporenreifung. Es konnte gezeigt werden, dass die Autophagie infolge einer PaSnf1-Deletion nicht gänzlich unterdrückt wird, PaSNF1 allerdings für die Stress-induzierte Autophagie notwendig ist. Überraschenderweise führt die Abwesenheit von PaSNF1 zu einer verlängerten Lebensspanne im Vergleich zum Wildtyp. Die meisten Effekte infolge einer PaSnf1-Deletion konnten durch die Einbringung eines FLAG::PaSNF1-Konstrukts komplementiert werden.
5. Eine gleichzeitige PaSnf1 und PaClpP-Deletion führt zu eine unerwarteten, extremen Lebenspannenverlängerung, die die Verlängerung der Lebensspanne bei der PaClpP-Deletionsmutante noch übertrifft. Interessanterweise geht dieser Phänotyp nicht mit einer erhöhten Autophagie einher. Des Weiteren konnte beobachtet werden, dass das Fehlen von PaSNF1 sowohl in ΔPaSnf1 als auch in ΔPaSnf1/ΔPaClpP zu einer veränderten Mitochondrien-Morphologie im Alter führt. Die Abwesenheit von PaSNF1 verursacht, dass die Stämme auch im Alter (20d) noch überwiegend filamentöse Mitochondrien aufweisen. Zudem zeigen die drei analysierten Deletionsstämme (ΔPaSnf1, ΔPaClpP und ΔPaSnf1/ΔPaClpP) massive Einschränkungen wenn sie auf die mitochondriale Funktion angewiesen sind.
6. Auffallend war, dass bei ΔPaSnf1, ΔPaClpP und bei ΔPaSnf1/ΔPaClpP die Stämme mit dem Paarungstyp „mat-“ langlebiger sind als die Stämme mit dem Paarungstyp „mat+“. Dieser Effekt ist bei der ΔPaSnf1/ΔPaClpP-Doppelmutante am stärksten ausgeprägt. Weitere Untersuchungen dazu ergaben, dass die Paarungstypen immer dann eine Rolle spielen, wenn die Stämme mitochondrialem Stress ausgesetzt, oder aber auf die mitochondriale Funktion angewiesen sind. Verantwortlich für diese Unterschiede sind zwei rmp1-Allele, die mit den unterschiedlichen Paarungstyp-Loci gekoppelt sind und mit dem jeweiligen Paarungstyp-Locus vererbt werden (rmp1-1 mit „mat-“; rmp1-2 mit „mat+“).
Aufgrund des großen Potenzials der Nanotechnologie ist in Zukunft eine Zunahme der Produktion und Verwendung von Nanomaterialien zu erwarten, wodurch mit einer steigenden Freisetzung in der Umwelt zu rechnen ist. In der vorliegenden Dissertation werden daher Methoden zur Untersuchung von Nanomaterialien betrachtet und Effekte von NP auf Algen untersucht.
In Teil I wurden Silber-, Titandioxid- und Polystyrol-Nanopartikel sowie Kohlenstoffnano-röhrchen untersucht. Von jedem Nanomaterial standen eine unmodifizierte Form sowie zwei modifizierte Partikeltypen mit geladener Oberfläche und zusätzlich Polystyrol-Mikropartikel zur Verfügung. Zunächst erfolgte eine Charakterisierung der Materialien mittels Transmissions-elektronenmikroskopie, wobei die Größe der Objekte gemessen und das Verhalten beschrieben wurde. Zudem wurde im Fall der Polystyrol-Nanopartikel der Einfluss mehrerer Chemikalien getestet, welche im Zusammenhang mit der Probenvorbereitung für das Elektronen¬mikroskop zum Einsatz kamen. In einem nächsten Schritt erfolgte die Untersuchung von Nanomaterialien in umweltrelevanten Matrices. Hierbei wurden Boden- und Wasserproben sowie humane Körperflüssigkeiten und Fischgewebe elektronenmikroskopisch auf die Anwesenheit von synthetischen Nanomaterialien untersucht und Proben mit Nanomaterialien versetzte, um die Nachweisbarkeit mit dem Elektronenmikroskop bewerten zu können. Zusätzlich wurden verschiedene Zellkulturen und Gewebe auf morphologische Auffälligkeiten im Zusammenhang mit einer Exposition gegenüber Nanomaterialien untersucht.
Die durchgeführten Versuche zeigen, dass die Transmissionselektronenmikroskopie für viele Nanomaterialien ein sinnvolles Charakterisierungswerkzeug darstellt. Die Untersuchung besonders kleiner Partikel mit einem Durchmesser im einstelligen Nanobereich gestaltet sich jedoch schwierig bis unmöglich. Für den Nachweis von Nanomaterialien in Umweltmatrices und Zellen ist die Methode nur bedingt geeignet, wobei insbesondere niedrige Partikelkonzentrationen problematisch sind. Die Methode ist somit lediglich als Ergänzung zu anderen Nachweismethoden zu betrachten, kann jedoch hilfreiche Informationen zur Lokalisation von Nanoobjekten in Zellen und zu ihrem Verhalten in Umweltproben liefern.
In Teil II wurden die beiden Grünalgen Raphidocelis subcapitata und Chlamydomonas reinhardtii sowie die Diatomee Cyclotella meneghiniana gegenüber unterschiedlich modifizierten Silber-, Titandioxid- und Polystyrol-Nanopartikeln exponiert. Die Beurteilung der Toxizität wurde anhand der über die Absorption gemessenen Zellzahl, des Chlorophyll a Gehalts, der über die Chlorophyllfluoreszenz gemessenen Parameter Fv/Fm und NPQ sowie der transmissions¬elektronenmikroskopischen Untersuchung der Algenzellen vorgenommen. Zudem wurde der Einfluss der Beschattung von Algenzellen durch die Nanopartikel experimentell untersucht.
Die Untersuchungen zeigen, dass Nanomaterialien bei Absorptionsmessungen in Abhängigkeit von ihrem Grundmaterial, ihrer Oberflächenmodifikation und dem umgebenden Medium ein mehr oder weniger starkes Streuungsverhalten zeigen. Auch die Anwesenheit von Algen kann einen deutlichen Einfluss haben. Trotz der Beeinflussung der Lichtstreuung hat die Beschattung von Algen durch die Trübung des Mediums durch Nanomaterialien keinen Einfluss auf das Wachstum der Testorganismen. Die direkte Exposition der Algen gegenüber den Nanomaterialien zeigt, dass Silber-Nanopartikel die toxischste Wirkung haben. Die Abgabe von Silberionen durch die Partikel kann hierbei die auftretenden Effekte erklären. Auch Titandioxid-Nanopartikel führen zu negativen Effekten, wobei mögliche Gründe die Toxizität des Materials und die physikalische Isolierung der Zellen sind. Die Polystyrol-Nanopartikel haben eine stimulierende Wirkung auf die Algenzellen, welche auf einer Präferenz von adhäsivem Wachsen und dem Hormesis-Effekt beruhen kann. Die Oberflächenmodifikation der Nanomaterialien hat zwar einen Effekt auf die Toxizität, ihr Einfluss wird jedoch durch andere Faktoren überlagert. In Bezug auf die unterschiedlichen Methoden zum Nachweis der Toxizität, ist die Bestimmung des Chlorophyll a-Gehalts als besonders sensitiv zu bewerten und kann zudem auf alle Partikel angewandt werden. Hinsichtlich der Absorptionsmessung besteht teilweise ein Einfluss durch die Partikelstreuung. Die Messung der Chlorophyllfluoreszenz scheint einer starken Beeinflussung durch externe Faktoren und ggf. die Nanomaterialien selbst zu unterliegen. Die elektronenmikroskopische Untersuchung ist vergleichsweise wenig sensitiv, kann jedoch ergänzende Informationen bezüglich der Wirkweise von Nanomaterialien liefern. Der Vergleich der Testorganismen zeigt, dass Raphidocelis subcapitata empfindlicher reagiert als Chlamydomonas reinhardtii. Eine allgemeingültige Sensitivitätsabstufung zwischen den Grünalgen und der Diatomee ist nicht möglich, da die Reaktionen in Abhängigkeit von Medium bzw. Partikelgrundmaterial unterschiedlich ausfallen.
Ziel dieser Dissertation war es, die biologische Rolle der Autophagie für die Entwicklung, Alterung und mitochondriale Qualitätskontrolle in dem Ascomyceten Podospora anserina zu untersuchen. Folgende Ergebnisse wurden dabei erzielt:
1. Der Verlust einer funktionalen Autophagie-Maschinerie ist in P. anserina mit einem Defekt der Sporen-Entwicklung bzw. -Keimung charakterisiert.
2. Es konnten drei Methoden zur Untersuchung der Autophagie in P. anserina etabliert werden: 1) Die Verwendung eines Gfp::PaAtg8-Stamms ermöglicht die Fluoreszenzmikroskopische Bestimmung der Autophagosomen-Anzahl; 2) Die phänotypische Charakterisierung des PaAtg1-Deletionsstamms unter verschiedenen Stressbedingungen (z. B. Stickstoffmangel, Rapamycin) liefert Hinweise auf eine mögliche Autophagie-abhängige Stressadaption; 3) Die Verwendung des „GFPcleavage assays“ ermöglicht einen quantitativen Nachweis genereller und selektiver Autophagie (hier: Mitophagie).
3. In zwei voneinander unabhängigen Experimenten wurde ein altersabhängiger Anstieg der Autophagie für P. anserina demonstriert: Das Autophagie-Niveau nimmt in gealterten P. anserina-Kulturen zu. Gleichzeitig resultiert der Verlust der Autophagie in ∆PaAtg1 in eine reduzierte Lebensspanne. Unter Stressbedingungen (hier: Stickstoffmangel) wird dieser positive Einfluss der Autophagie auf die Lebensspanne im Wildtyp sogar noch verstärkt.
4. Der unerwartet „gesunde“ Phänotyp der PaSod3-Deletionsmutante ist abhängig von einer funktionalen Autophagie-Maschinerie. Der Mitophagie wurde eine besondere Rolle als Kompensationsmechanismus für den Verlust von PaSOD3 zugeteilt, da das Mitophagie-Niveau in dieser Mutante erhöht ist. Am Beispiel dieser Mutante, für die ein erhöhter Superoxid-Ausstoß nachgewiesen wurde, konnte eine Dosis-abhängige Wirkung von ROS in P. anserina identifiziert werden. Eine geringe zelluläre ROSMenge verursacht eine mitohormetische Reaktion, die eine Induktion der Mitophagie zur Folge hat und sich positiv auf den Organismus auswirkt. Übersteigt die zelluläre ROS-Dosis einen kritischen Punkt, kommt es zur Induktion des autophagischen Zelltods und damit zum vorzeitigen Tod des Individuums.
5. Der Verlust der PaCLPXP-Protease führt zu Beeinträchtigungen in der Funktion und Zusammensetzung der mitochondrialen Atmungskette. Dieses Defizit im Energiemetabolismus wird über eine Induktion der AOX, vor allem aber über eine ZUSAMMENFASSUNG 127 gesteigerte Autophagie kompensiert. Die deutlich verlängerte Lebensspanne der verschiedenen PaClpXP-Deletionsmutanten (∆PaClpX, ∆PaClpP und ∆PaClpXP) ist abhängig von einer funktionalen Autophagie-Maschinerie. Interessanterweise konnte keine kompensatorische Funktion der Autophagie oder Mitophagie für den Verlust der mitochondrialen i-AAA-Protease PaIAP in P. anserina nachgewiesen werden.
Autophagie/Mitophagie stellt einen übergeordneten Qualitätskontrollmechanismus in P. anserina dar, der den Organismus sehr effektiv vor zellulären Schäden und Dysfunktionen bewahrt und einen positiven Einfluss auf die Alterung, Entwicklung und Energieversorgung einnimmt.
Ziel dieser Arbeit war es erstmals durch eine Kombination aus chemischer Mutagenese und gezielter genetischer Modifikation (hier: „metabolic engineering“) einen Phaffia-Stamm herzustellen, welcher über die Mutagenese hinaus über eine weiter verstärkte Astaxanthin-Synthese verfügt.
Die von „DSM Nutritional Products“ bereitgestellten chemischen Mutanten wurden analysiert und über einen Selektionsprozess auf Pigmentstabilität und Wachstum hin optimiert, da die Stämme aus cryogenisierter Dauerkultur starke Pigmentinstabilitäten und ein verzögertes Wachstum aufwiesen.
Über eine exploratorische Phase wurde die Carotinoidsynthese analysiert und festgestellt, dass in den Mutanten keine Einzelreaktionen betroffen sind, welche für die Heraufregulierung der Carotinoidsynthese in den Mutanten verantwortlich sind. Hierbei wurden Limitierungen identifiziert und diese durch Transformation von Expressionsplasmiden mit geeigneten Genen aufgehoben, um damit eine noch effizientere Metabolisierung von Astaxanthin-Vorstufen hin zu Astaxanthin zu erreichen. Eine Überexpression der Phytoensynthase/Lycopinzyklase crtYB resultierte in einem gesteigerten Carotinoidgehalt bei gleichbleibendem Astaxanthin- Anteil. Durch eine zweite Transformation mit einer Expressionskassette für die Astaxanthin-Synthase asy konnte der Carotinoidgehalt weiter gesteigert und zusätzlich eine Limitierung der Metabolisierung von Astaxanthin-Vorstufen behoben werden, sodass die Transformante nahezu alle Intermediate der Astaxanthinsynthese zu Astaxanthin metabolisieren konnte (Gassel et al. 2013). Es konnte gezeigt werden, dass auch in den Mutanten, aus Experimenten mit dem Wildtyp bekannte, Limitierungen identifiziert und ausgeglichen werden konnten.
Es ist wohl unumstritten, dass das Leben, wie wir es kennen, ohne die sauerstoffproduzierenden Organismen unserer Erde nicht möglich wäre. Zu ihnen gehören nicht nur die Landpflanzen, deren mannigfaltige Nutzung wichtiger Bestandteil unseres Alltags ist. Auch mikroskopisch kleine Algenarten leisten einen entscheidenden Beitrag zu den Stoffwechselkreisläufen dieser Welt. Unter ihnen befinden sich die Kieselalgen (Diatomeen), die mit einer Varietät von bis zu 10000 Spezies etwa 40 % der marinen Primärproduktion verantworten. Der Ursprung der heutigen zur oxygenen Photosynthese befähigten Eukaryoten geht auf Endosymbioseereignisse zurück, von denen aus sich diese Organismen ausgesprochen vielfältig entwickelt haben. Diese Vielfalt wird dabei nicht nur anhand ihrer äußeren Morphologie, sondern auch auf subzellulärer Ebene, deutlich. So zum Beispiel durch die unterschiedlichen Strukturen der Thyakoidmembranen, die sich in Kieselalgen wie Cyclotella meneghiniana in dreilagigen Bändern arrangieren. In Pflanzen wie Nicotiana tabacum (Tabak) hingegen bilden sie große, stapelartige Bereich aus, die zur räumlichen Separation der in den Thylakoiden eingebetteten Photosystemen beitragen. Auch die an die Photosysteme (PS) gebundenen Lichtsammelproteine (Lhcs) haben sich in Tabak und Cyclotella unterschiedlich entwickelt. Gemäß ihrem Namen zeichnen sie sich zwar allesamt durch die Sammlung und Weiterleitung der Lichtenergie an die Photosysteme aus, grenzen sich aber in Hinblick auf Proteingröße und Pigmentierung voneinander ab.
Die Lhcs der höheren Pflanzen werden entsprechend ihrer Zuordnung zu den Photosystemen in den aus zwei Heterodimeren bestehenden LHCI des PSI und die Lhcb-Antennenproteine des PSII unterschieden. Zu letzteren gehören der trimere Hauptantennenkomplex LHCII und die monomeren, minoren Antennenproteine. Die Lhcs binden die zur Lichtsammlung benötigten Pigmente, vor allem Chlorophyll a und Chlorophyll b, aber auch primäre Carotinoide wie Violaxanthin, Lutein und Neoxanthin, in unterschiedlichen Stöchiometrien. Es ist bereits bekannt, dass die Pigmentierung entscheidend zur Stabilität der Lichtsammelproteine beiträgt, wenngleich zum Teil auch eine gewisse Flexibilität in Bezug auf die Art der gebundenen Pigmente an den entsprechenden Bindestellen der Proteine besteht.
Im Rahmen dieser Arbeit liegt der Fokus auf der Fragestellung inwieweit die in der Regel nicht in Pflanzen vorkommenden Ketocarotinoide die Struktur und Funktion des LHCII aus einer Ketocarotinoide produzierenden N. tabacum - Transformante (bkt-Linie) beeinflussen und welche Auswirkungen sie auf dessen Photosyntheseapparat im Allgemeinen haben. Die bkt-Linie bildet dabei zum Teil auf Kosten ihrer primären Carotinoide sowohl das als antioxidativ und als anti-kanzerogen beschriebene Astaxanthin, als auch dessen Vorstufe Canthaxanthin und einige Derivate dieser Pigmente, die, nach vergleichenden HPLC-Analysen von Blättern und Thylakoidfraktionen, zu einem großen Teil mit der Thylakoidmembran assoziiert sind. Durch spektroskopische Untersuchungen konnte gezeigt werden, dass diese Ketocarotinoide in Hinblick auf die Energieweiterleitung zum Chlorophyll a nicht funktionell an den LHCII binden, ihre Produktion aber die Trimerisierung dieses Lichtsammelkomplexes in N. tabacum nachhaltig beeinträchtigt. Auch die Assemblierung der PSII-LHCII-Superkomplexe wird dadurch maßgeblich gestört. Elektronenmikroskopische Aufnahmen von Chloroplasten der bkt-Linie verdeutlichten zudem die Beeinträchtigung der Granathylakoid-Stapelung: Sie fällt ungeordneter aus als im Wildtyp, was durch den Mangel an intakten LHCII-Trimeren begründet sein kann.
In funktioneller Hinsicht stören die Ketocarotinoide die Energieweiterleitung innerhalb des PSII und bewirken die Reduktion der photoprotektorischen, nicht-photochemischen Fluoreszenzlöschung des Wirtsorganismus nachhaltig. Zeitgleich reduzieren sie durch einen abschirmenden Effekt auf Grund ihrer Assoziation mit der Thylakoidmembran und/oder durch einen eventuellen S1-S1-Energietransfer von Chl a auf die Ketocarotinoide aber auch die Menge der Lichtenergie, die über die Lhcs an die Photosysteme weitergeleitet wird. Dadurch kommt ihnen neben dem nachhaltig störenden Einfluss auf die Intaktheit des Photosyntheseapparats zugleich auch eine schützende Wirkung vor einem Übermaß an Lichtenergie zu.
Aus Cyclotella meneghiniana sind zwei Hauptantennenkomplexe bekannt: FCPa und FCPb. Im Gegensatz zu den Lhcs der Chl a/b-haltigen Organismen binden die Lichtsammelproteine der Diatomeen das Xanthophyll Fucoxanthin anstelle des Luteins, und Chlorophyll c anstelle des Chlorophyll b. Im Gegensatz zu der bereits sehr detailliert aufgeklärten Struktur des trimeren LHCII in höheren Pflanzen, existieren für den Aufbau des FCPb in C. meneghiniana bisher nur fundierte Modellvorschläge. Diese postulieren eine homotrimere Grundstruktur für den FCPb, die zu höheren Oligomeren assembliert.
In der vorliegenden Arbeit konnte anhand elektronenmikroskopischer Aufnahmen und der anschließenden Einzelpartikelanalyse nun erstmalig die Struktur des etwa 6-7 nm großen, trimeren FCPb gezeigt und die Richtigkeit der bisher postulierten Modellvorschläge in Hinblick auf die Struktur des Trimers bewiesen werden. Nach den hier dargelegten Erkenntnissen gleicht die Anordnung der Untereinheiten des FCPb-Trimers der des LHCII. Zudem ergibt sich aus dem Zusammenhang der hier erhobenen Daten und den in der Fachliteratur veröffentlichten Ergebnissen zum Thema FCPb ein klares Bild über die Anordnung der höheren Oligomere in Form von Nonameren. Auch diese Erkenntnisse unterstützen das ursprünglich von C. Büchel vorgeschlagene Modell für die oligomere Struktur des FCPb in C. meneghiniana.
Mikroalgen wird aufgrund ihrer photoautotrophen Lebensweise, ihrer meist einfachen Anzucht und ihres schnellen Wachstums ein großes Potential als Produzenten verschiedener Stoffe, wie beispielsweise den Sekundärmetaboliten der Carotinoidbiosynthese, zugesprochen. Zur Produktion solcher Stoffe bedarf es der Aufklärung der in einem Biosyntheseweg operierenden Enzyme und ihrer zugehörigen Gene.
In dieser Arbeit sollte einerseits durch genetische Modifikation der Carotinoidbiosynthese der Fucoxanthingehalt erhöht und andererseits die Produktion von Astaxanthin in P. tricornutum erreicht werden. Bisher fehlen experimentelle Nachweise über die Funktion, Regulation und die limitierenden Eigenschaften daran beteiligter Gene und deren Enzyme. Um dem Ziel der Arbeit näher zu kommen, wurden zuerst potentiell an der Regulation der Carotinoidbiosynthese beteiligte Gene ausgewählt und deren Enzyme funktionell charakterisiert. Eines dieser Enzyme ist das Eingangsenzym der Carotinoidbiosynthese, die Phytoen-Synthase. Die entsprechend annotierte putative Sequenz (psy #Pt56881) wurde zur Analyse herangezogen. Nachdem im Rahmen dieser Arbeit über die Komplementation in einem dafür ausgerichteten E. coli Stamm der funktionelle Nachweis der Phytoen-Synthase erbracht werden konnte, wurde untersucht, ob die Phytoen-Synthase einer lichtabhängigen Expression unterliegt und somit die Carotinoidsynthese im WT von P. tricornutum limitiert. Durch die Inhibierung der Phytoen-Desaturase mittels Norflurazon konnte die verstärkte Akkumulation des Produktes der Phytoen-Synthase, Phytoen, bei einem Transfer der P. tricornutum-Kulturen von Schwach- in Starklicht gezeigt werden. Die Expression der Phytoen-Synthase von P. tricornutum wird demnach durch die Lichtbedingungen reguliert und limitiert auch die Carotinoidsynthese. Ein weiteres an der Carotinoidsynthese beteiligtes Enzym ist die Zeaxanthin-Epoxidase. Sie bietet zugleich eine Möglichkeit, an dieser Stelle die Carotinoidsynthese in Richtung Astaxanthinproduktion umzulenken. Für P. tricornutum sind drei potentielle Genkandidaten (zep1: #Pt45845; zep2: #Pt56488; zep3: #Pt56792) annotiert, welche ebenfalls im Rahmen dieser Arbeit funktionell charakterisiert wurden. Der funktionelle Nachweis erfolgte dabei ebenfalls mittels eines Komplementationsansatzes in einem damit neu etablierten Expressionssystem mit npq2-Mutanten aus der Modellpflanze A. thaliana. Die Analyse der Transformanden zeigte eine Epoxidase-Aktivität des Produktes aus zep2 und zep3. Das Enzym Zeaxanthin-Epoxidase 2 weist dabei eine andere Spezifität auf als die Zeaxanthin-Epoxidase 3, welche funktionell betrachtet der Zeaxanthin-Epoxidase aus A. thaliana am nächsten kommt. Die Zeaxanthin-Epoxidase 2 akzeptiert im Unterschied zu Zeaxanthin-Epoxidase 3 neben Zeaxanthin auch andere Substrate wie Lutein mit nur einem 3 Hydroxy-β-Iononring und stellt damit einen validen Kandidaten für die Umwandlung von Diatoxanthin in Diadinoxanthin in P. tricornutum dar. Obwohl die Transkriptanalysen ausreichende Mengen an RNA von zep1 in A. thaliana zeigen und anhand eines zusätzlichen mit der Sequenz für GFP markierten zep1-Konstruktes in WT-Protoplasten von A. thaliana der Import in den Chloroplasten und die Expression nachgewiesen werden konnte, weist die Zeaxanthin-Epoxidase 1 zumindest in den A. thaliana-Transformanden keine Epoxidase-Aktivität auf. Des Weiteren zeigt die diurnale Expression in P. tricornutum, dass die Regulation der Zeaxanthin-Epoxidasen an den Bedarf photoprotektiver Pigmente angepasst wird. Während die Regulation des Transkript-Levels von zep2 und zep3 nahezu parallel laufen und ein gemeinsames Maximum aufweisen, zeigt das Transkript-Level von zep1 ein anderes Maximum.
Die gewonnenen Erkenntnisse wurden dann zur Steigerung der Synthesekapazität mittels genetischer Modifikation des Carotinoidsyntheseweges in P. tricornutum angewendet. Durch das Einbringen zusätzlicher Genkopien der Phytoen-Synthase in P. tricornutum konnte dabei eine deutliche Steigerung des Fucoxanthingehalts unter Schwachlichtbedingungen erreicht werden. Gleichzeitig konnte durch weitere inhibitorische Versuche mittels Norflurazon beim Transfer von Schwach- zu Starklicht demonstriert werden, dass die Carotinoidsynthese durch die Kombination der genetischen Modifikation mit der Phytoen-Synthase und Starklicht per se weiterhin gesteigert werden kann. Zusammen mit den Transkriptanalysen zeigen die Pigmentanalysen, dass es einen nicht-linearen Zusammenhang zwischen RNA-Menge und gebildeter Phytoenmenge gibt, welcher durch eine zusätzliche Substratlimitierung der Phytoen-Synthase erklärt werden kann.
Bevor das Herunterregulieren der Zeaxanthin-Epoxidasen in P. tricornutum durchgeführt und damit ein verstärkter Fluss zur Astaxanthinbildung erreicht werden sollte, wurde das Potential von P. tricornutum zur Astaxanthinproduktion überprüft. Hierfür wurde die β-Carotin-Ketolase (bkt #CrAEA35045.1) aus C. reinhardtii einmal ohne und zusätzlich mit verschiedenen Präsequenzen fusioniert separat in P. tricornutum eingebracht. Astaxanthin konnte trotz Nutzung funktionell bestätigter Präsequenzen aus der Literatur nicht nachgewiesen werden. Die Versuche zeigen damit, dass hier noch weitere Untersuchungen nötig sind, um mittels eines geeigneten Transportsystems Fremd-Proteine in den Chloroplasten von P. tricornutum einzubringen. Das Ausbleiben der Astaxanthinproduktion konnte an dieser Stelle nicht hinreichend geklärt werden.
Insgesamt schaffen die Ergebnisse dieser Arbeit eine weitere Grundlage, um die Carotinoidbiosynthese in P. tricornutum besser zu verstehen und diese mittels genetischer Modifikationen biotechnologisch nutzbar zu machen.
In dieser Arbeit wurde der Hefepilz Xanthophyllomyces dendrorhous als vielseitige biotechnologische Plattform für die Produktion von Carotinoiden verwendet. Durch genetische Modifikationen der Carotinoidbiosynthese wurde ein Astaxanthin-Hochproduzent zur Akkumulation des farblosen Phytoens, das die menschliche Haut vor der schädlichen Wirkung der UV-Strahlung schützt und des gelben Zeaxanthins, das zur Förderung und Erhalt der Sehfähigkeit beiträgt, befähigt. Zur Generierung eines Phytoen-Hochproduzenten wurde das Gen crtI (Phytoen-Desaturase) inaktiviert und der Phytoengehalt durch Überexpression der Gene HMGR, crtE und crtYB gesteigert. Die Generierung eines Zeaxanthin-Hochproduzenten beinhaltete die Inaktivierung des Gens asy (Astaxanthin-Synthase) und die heterologe Expression einer bakteriellen ß-Carotin-Hydroxylase CrtZoXd.
Die Inaktivierung der Gene erfolgte mit spezifischen Knock-Out-Konstrukten, die mittels homologer Rekombination in crtI oder asy integrierten. Nachdem die Transgene auf Vektoren mit verschiedenen Antibiotikaresistenzen kloniert wurden, wurde die Überexpression durch genomische Integration in die ribosomale DNA erreicht. Anschließend wurde die Carotinoidzusammensetzung der Zellextrakte durch Hochleistungsflüssigkeitschromatographie an einer C18-Trennsäule oder durch Dünnschichtchromatographie bestimmt. Der Knock-Out-Nachweis erfolgte mittels Polymerase-Kettenreaktion und Amplifikation der Genloci, während die Anzahl integrierter Carotinoidgene durch quantitative Real-Time-PCR bestimmt wurde. Die Kultivierungen von X. dendrorhous wurden sowohl in Schikanekolben als auch in einem 2L-Bioreaktor durchgeführt.
Im Zuge der genetischen Modifikationen konnte der Ploidiegrad des Wildtyps bestimmt werden, der bis dahin unbekannt war. Durch das Auftreten von instabilen heterozygoten Stämmen und deren Überführung zu stabilen Homozygoten wurde die Existenz eines diploiden Genoms nachgewiesen. Um die für die biotechnologische Anwendung notwendige Stabilität der Carotinoidbiosyntheseleistung zu erreichen, wurden zwei Strategien entwickelt. Hierbei erfolgte die Stabilisierung der Stämme als Folge mitotischer Rekombination nach Subkultivierung und anschließender Farbselektion oder durch Induktion des sexuellen Zyklus und Sporulation.
Der crtI-Knock-Out führte zur Akkumulation von 3,6 mg/g dw Phytoen. Anschließend wurde die Limitierung der Phytoensynthese durch crtYB-Überexpression aufgehoben und die Versorgung der Carotinoidbiosynthese mit Vorläufermolekülen durch HMGR- und crtE-Überexpression erhöht. Im Bioreaktor wurde durch die Anwendung eines dreistufigen Fed-Batch-Prozesses, der eine effiziente Glucoseverwertung sicherstellte, mit 10,4 mg/g dw die höchste bis dato publizierte zelluläre Phytoenkonzentration im stabilisierten Hochproduzenten erreicht.
Der asy-Knock-Out führte zur Akkumulation von 4,5 mg/g dw ß-Carotin, das anschließend durch heterologe Expression der codon-optimierten ß-3,3-ß-Hydroxylase crtZoXd im Hochproduzenten zu 3,5 mg/g dw Zeaxanthin umgesetzt wurde. Zur Optimierung des Vorgehens wurden Knock-In-Konstrukte entwickelt, mit denen beide Schritte (Knock-Out und Integration von Carotinoidgenen) in nur einem molekular-biologischen Schritt durchgeführt und 94 % des in einem Wildtypstamm vorhanden ß-Carotins zu Zeaxanthin umgesetzt wurden. Die Optimierung der Wachstumsbedingungen bei der Bioreaktor-Kultivierung des stabilisierten Zeaxanthinproduzenten führte mit 10,8 mg/L zu einem 5-fach höheren Zeaxanthingehalt im Vergleich zur Schikane-Kultivierung.
Durch den Einsatz der Pentosen Arabinose und Xylose als alternative Kohlenstoffquellen wurde der Carotinoidgehalt der Phytoen- und Zeaxanthin-Hochproduzenten um 70 bzw. 92 % im Vergleich zur Glucose-Kultivierung gesteigert, wobei die Gründe für diesen Effekt in einer stärkeren Kohlenstoffverwertung und der Hemmwirkung von Glucose vermutet wurden. Aus verschiedenen pflanzlichen Abfallstoffen kann Xylose durch Hydrolyse freigesetzt werden, deren Nutzung zum Aufbau einer nachhaltigen und kostengünstigen biotechnologischen Carotinoidproduktion beitragen kann.
Darüber hinaus wurden multioxigenierte Zeaxanthinderivate, von denen eine positive Wirkung auf die menschliche Gesundheit vermutet wird, durch kombinatorische Biosynthese erhalten. Durch die schrittweise Integration der Gene crtZoXd, crtG (ß-2,2-Hydroxylase) und bkt (ß-4,4-Ketolase) in eine ß-Carotinmutante wurde die Biosynthese von Zeaxanthin, Nostoxanthin und schließlich von 4-Keto-Nostoxanthin und 4,4-Diketo-Nostoxanthin erreicht. Anschließend erfolgte die chemische Reduktion zu den neuartigen Carotinoiden 4-Hydroxy-Nostoxanthin und 4,4-Dihydroxy-Nostoxanthin und der zweifelsfreie Nachweis aller vier Carotinoide anhand der mittels Massenspektrometrie bestimmten Molekülmassen und Fragmentierungsmuster.
Reaktive Sauerstoffspezies lösen molekular Schäden aus und werden als möglicher Auslöser des Alterungsprozesses gesehen. Sie sind allerdings auch wichtige Signalgeber, deren Einfluss in den letzten Jahren immer mehr Beachtung findet. Im der vorliegenden Arbeit wurde die Signalwirkung von ROS auf das Alternsmodell P. anserina untersucht. Dabei konnten folgende Erkenntnisse gewonnen werden.
1. Die H2O2–Konzentration im Extrazellularraum und im Cytoplasma steigt bei PQ-Stress und während des Alterns an.
2. Bei PQ-Stress und während des Alterns treten Ähnlichkeiten der globalen Transkriptregulation auf, die vermutlich durch die angestiegene H2O2-Konzentration ausgelöst werden.
3. Die Transkriptmenge von SODs und die Gesamt-SOD-Aktivität sind bei PQ-Stress leicht herunterreguliert. Transkripte für PaCCP1 und PaCATB treten dagegen bei PQ-Stress vermehrt auf und auch die Gesamt-Katalase-Aktivität steigt an. Dies deutet darauf hin, dass der Fokus des enzymatischen Abbaus von ROS bei PQ-Stress nicht im Abbau von Superoxid-, sondern von Wasserstoffperoxid liegt.
4. Bei PQ-Stress steigt die Transkriptmenge von Schlüsselgenen der Carotinoid-Biosynthese.
5. Transkripte von mitochondrial lokalisierten Proteinen werden bei PQ-Stress stark hochreguliert, die Menge an Mitochondrien nimmt allerdings nicht zu. Dies deutet auf einen verstärkten Abbau mitochondrialer Proteine, gefolgt von einer Neusynthese hin.
6. Bei PQ-Stress sinkt die Expression von Genen, die für den Kupferimport benötig werden. Dies wird höchstwahrscheinlich durch die Inaktivierung des Transkriptionsfaktors GRISEA ausgelöst. Es kommt zu einem Kupfermangel, der eine verstärkte alternative PaAOX-abhängige Atmung auslöst und dafür sorgt, dass kupferabhängige Prozesse, wie die Melanin- und Sterigmatocystin-Synthese transkriptionell herunterreguliert werden. Durch die verringerte Transkriptmenge von Kupferimportern bei PQ-Stress kommt es zu starken Gemeinsamkeiten in der globalen Genregulation von PQ-gestressten Kulturen und der Kupfer-depletierten Mutante grisea.
7. Kupfer und PQ haben einen synergistisch negativen Effekt auf Wuchsrate und Lebensspanne von P. anserina. Bei hohen Kupfer und Superoxid-Konzentrationen kommt es vermutlich zur verstärkten Bildung von Hydroxyl-Radikalen, wodurch molekulare Schäden entstehen. Durch eine verringerte Kupferkonzentration wird der Organismus bei PQ-Stress möglicherweise vor der Bildung von Hydroxyl-Radikalen geschützt.
Insgesamt haben die Untersuchungen gezeigt, dass ROS wichtige Signalmoleküle sind, die einen starken Einfluss auf die Regulation von Transkripten haben. Viele dieser transkriptionellen Regulationen führen zu physiologischen Veränderungen. Der Fokus der Regulationen liegt unter den verwendeten Bedingungen im Schutz vor den schädlichen Effekten von ROS.
Bei Cryptochromen handelt es sich um Blaulichtrezeptoren der Cryptochrom-Photolyase-Proteinfamilie (CPF). Mitglieder dieser Proteinfamilie sind in allen Domänen des Lebens zu finden und haben eine essentielle Rolle in der Reparatur der DNA sowie der lichtgesteuerten Regulation der Expression. Cryptochrome sind in der Regel keine DNA-reparierenden Proteine. Sie sind regulativ an der Steuerung der inneren Uhr und des Zellzyklus der Organismen beteiligt. In der Kieselalge Phaeodactylum tricornutum konnten bisher sechs phylogenetisch unterschiedliche Mitglieder der CPF identifiziert werden. Bei CryP handelt es sich um das einzige pflanzenähnliche Cryptochrom der photoautotrophen Diatomee. Für das Protein CryP konnte bereits ein blaulichtinduzierter Photozyklus durch die Absorption der Chromophore 5-Methenlytetrahydrofolat (MTHF) und Flavinadenindinukleotid (FAD) gezeigt werden. Außerdem ist eine regulative Wirkung des Proteins auf die Lichtsammelkomplexe (Lhc) der Diatomee bekannt. Für eine weitere Charakterisierung des CryPs wurde in dieser Arbeit zunächst das Absorptionsverhalten unter verschiedenen Wellenlängen beobachtet, um so einen Einblick in eine mögliche Aktivierung und Deaktivierung des Proteins durch Licht unterschiedlicher Wellenlängen zu erlangen. Es zeigte sich hierbei eine mit pflanzlichen Cryptochromen vergleichbare Anreicherung verschiedener Redoxzustände des FADs in Abhängigkeit von der Wellenlänge.
Für eine Aufklärung der Wirkungsweise des CryP-Proteins wurden verschiedene Hypothesen untersucht: Die phylogenetische Nähe und ein ähnliches Absorptionsverhalten des CryPs zu Cryptochromen mit Reparaturfähigkeit für einzelsträngige DNA (Cry-DASH) führte zu einer Untersuchung des Proteins als möglicher Transkriptionsfaktor. Hierfür konnte eine Kernlokalisation des Proteins nachgewiesen werden, was Rückschlüsse auf eine potentielle Regulation der Expression mittels DNA-Bindung zulässt. Außerdem wurde gezeigt, dass CryP DNA-Bindefähigkeit besitzt. Die bisher nachgewiesenen Bindungen waren jedoch unspezifischer Art. Dies konnte auch für die Promotersequenz eines der durch CryP regulierten Gene lhcf1 festgestellt werden. Auf Grund der unspezifischen DNA-Bindung wurde eine zweite Hypothese für CryP untersucht: CryP wirkt regulativ auf die Expression verschiedener Gene durch Protein-Protein-Interaktionen und ist Teil einer Reaktionskaskade zur Signalweiterleitung in P. tricornutum.
Durch die Untersuchung der zweiten Hypothese konnten drei Interaktionspartner für CryP identifiziert und eine Interaktion verifiziert werden. Hierbei handelt es sich um das Protein AAA mit einer bisher unbekannten Funktion und das Protein BolA, welches Teil der zuerst in Escherichia coli identifizierten BolA-like-Proteinfamilie ist. Außerdem konnte eine Interaktion mit dem Cold-Shock-Domänen-Protein CSDP gezeigt werden. Bei den Proteinen BolA und CSDP handelt es sich um potentiell regulierende Faktoren der Transkription und Translation, was Teil einer Reaktionskaskade sein kann. Die aus anderen Organismen bekannten Funktionen des BolA-Proteins überschneiden sich mit den in CryP-Knockdown-Mutanten beobachteten Effekten. Sie zeigen eine erhöhte Sensitivität für Stresssituationen wie abweichende Nährstoffkonzentration, Osmolaritäten und Temperaturen. Diese Beobachtungen stellen einen Zusammenhang der durch einen CryP-Knockdown beobachteten Effekte und der CryP-BolA-Interaktion her. Durch Homologien zu Cold-Shock-Proteinen aus Chlamydomonas reinhardtii gibt die CryP-Interaktion mit dem Protein CSDP Hinweise auf einen potentiellen Mechanismus zur Regulation der Lhc-Proteine, für welche zuvor ein CryP-abhängiger Effekt beschrieben war.
Über die Protein-Protein-Interaktionen hinaus wurde die Phosphorylierung des CryPs als Möglichkeit der Signalweiterleitung untersucht. Es konnte eine reversible Phosphorylierung des heterolog aus E. coli isolierten CryPs gezeigt werden. Diese zeigt Ähnlichkeiten zu bekannten Phosphorylierungen pflanzlicher Cryptochrome und gibt Hinweise auf einen Mechanismus der Signalweiterleitung.
Durch die Untersuchung der CryP-regulierten Transkription mit P. tricornutum CryP-Knockdown-Mutanten durch Next-Generation-Sequencing (NGS) konnte die Hypothese der regulativen Proteinkaskade und der Signalweiterleitung weiter bestätigt werden. Die Auswirkungen des CryPs auf die Transkription erwiesen sich als nicht auf einen Teilbereich des Metabolismus begrenzt, sondern sind in einem großen Teil der funktionellen Gengruppen in P. tricornutum zu sehen. Außerdem konnten drei Klassen CryP-regulierter Gene festgestellt werden. Kategorie 1: die ausschließlich unter Blaulicht regulierten Gene; Kategorie 2: die sowohl unter Blaulicht als auch im Dunkeln regulierten Gene und Kategorie 3: die ausschließlich im Dunkeln regulierten Gene. Ein im Dunkeln und unter Blaulicht jeweils unterschiedlicher regulativer Effekt deutet auf eine Doppelfunktion des CryPs hin. Möglicherweise hat das Cryptochrom unterschiedliche lichtabhängige und lichtunabhängige Funktionen.
Durch die Analyse der CryP-regulierten Genexpression konnte außerdem ein Zusammenhang zwischen CryP und weiteren Photorezeptoren gezeigt werden. Der CryP-Proteingehalt in der Zelle hat einen regulativen Einfluss auf das CPF1-Protein, eine Photolyase mit dualer Funktion aus der gleichen Proteinfamilie. Zusätzlich konnte auch ein Einfluss auf die Lichtsensitivität der Genexpression des Rotlichtrezeptors Phytochrom (DPH) durch CryP gezeigt werden. Vergleichbar mit höheren Pflanzen scheint ein regulatives Netzwerk der Photorezeptoren auch in der Diatomee P. tricornutum vorhanden zu sein.