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Im Rahmen dieser Arbeit wurde die humane Leukotrien A4-Hydrolase untersucht.
Die hLTA4H ist ein bifunktionelles Enzym, welches neben der Hydrolaseaktivität, welche für die Umwandlung des instabilen LTA4 zu LTB4 verantwortlich ist, auch eine Peptidaseaktivität aufweist. Beide Enzymaktivitäten spielen bei Entzündungsprozessen eine wichtige Rolle, weshalb die LTA4H ein interessantes pharmakologisches Target darstellt. Aufgrund der gegensätzlichen Eigenschaften der beiden Aktivitäten der LTA4H (Produktion des proinflammatorischen LTB4 durch die Hydrolase-Aktivität, sowie der Abbau des PGP-Tripeptids durch die Peptidase-Aktivität) wird deutlich, dass die Entwicklung selektiver Hydrolase-Inhibitoren von Vorteil ist.
Das Protein der humanen LTA4H konnte erfolgreich kloniert werden und in E. coli-Zellen exprimiert werden. Zur Gewinnung des reinen rekombinanten Proteins konnte ein Aufreinigungsprotokoll mittels Nickel-Affinitätschromatographie sowie anschließender Größenausschlusschromatographie etabliert werden. Durch die Testung unterschiedlicher Lysemethoden konnte die Ausbeute deutlich erhöht werden.
Um herauszufinden, ob es durch den potentiellen Inhibitor zu einer Hemmung der Enzymaktivität kommt, muss diese detektiert werden können. Hierfür wurde ein geeignetes fluoreszenzbasiertes Testsystem zur Detektion der Enzymaktivität der hLTA4H entwickelt. Dies lässt auch die Quantifizierung der Wirksamkeit der möglichen Inhibitoren zu. Mit Hilfe eines pharmakophorbasierten Ansatzes wurden 22 Testsubstanzen für die in vitro Testung ausgewählt. Nach der Evaluierung dieser Substanzen wurden weitere 14 Derivate der besten Verbindung ausgewählt und ihre inhibitorischen Eigenschaften an rekombinanter LTA4H getestet. Die Ergebnisse wurden mittels Differential Scanning Fluorimetrie validiert, wofür ein einfaches Protokoll etabliert werden konnte.
Im Rahmen dieser Arbeit wurden weiterhin 5 bereits bekannte Inhibitoren der LTA4H ausgewählt, um sie hinsichtlich ihres thermodynamischen Profils zu untersuchen. Hierzu wurden die ausgewählten Inhibitoren mittels Isothermer Titrationskalorimetrie vermessen. Die Dissoziationskonstanten der untersuchten Inhibitoren wurden ebenfalls mittels Differential Scanning Fluorimetrie bestimmt, wobei sich zeigte, dass diese Methode nicht zur präzisen Messung von Protein/Ligand Interaktionen herangezogen werden kann. Mittels eines in silico Ansatzes zur Vorhersage von stabilisierten und destabilisierten Wassermolekülen in der Bindetasche konnten die thermodynamischen Daten im strukturellen Kontext interpretiert werden. Durch diese Kombination konnten neue Erkenntnisse zum Design neuer Inhibitoren der LTA4H gewonnen werden.
Die Arachidonsäurekaskade spielt bei Entzündungsprozessen und der Schmerzentstehung eine wichtige Rolle. Deren primäre Produkte, die Leukotriene und die Prostaglandine, sind entzündungsfördernde Mediatoren und nehmen Einfluss auf den Entzündungs-auflösendenprozess und sind bei einer Dysregulation für diverse Erkrankungen wie z.B. Asthma bronchiale und allergische Rhinitis mitverantwortlich. Die Kaskade gliedert sich mit ihren beiden Hauptenzymen, Cyclooxygenase und 5-Lipoxygenase (5-LO), in zwei Wege auf. Beide Enzyme sind außerdem in der Lage entzündungsauflösenden Mediatoren zu bilden. Die Mediatoren wie z.B. Lipoxin können im Zellstoffwechsel einerseits über die Lipoxygenase-Route, oder andererseits wie „aspirin-triggered“-Lipoxin von der durch geeignete Wirkstoffe acetylierten Cyclooxygenase-2 (COX-2) katalysiert werden. Diese Mediatoren werden benötigt, um (chronische) Entzündungen und beschädigtes Gewebe zurück zur Homöostase zu führen.
Die Pharmakotherapie chronisch entzündlicher Erkrankungen mit guter Wirksamkeit und verträglichem Profil bei Langzeiteinnahme stellt jedoch eine Herausforderung dar. Die Therapie verzögern oft, z. B bei Einnahme von nicht-steroidalen Antirheumatika (NSAR), die Entzündungsauflösung, da die Bildung von entzündungshemmenden und entzündungs-auflösenden Lipidmediatoren gehemmt werden. Die gezielte Modulation und Einflussnahme auf die Arachidonsäurekaskade an einem der beiden Enzyme, stellt daher einen guten Ansatz für eine verbesserte Therapiemöglichkeit von (chronischen) entzündlichen Krankheiten dar. Diese Arbeit beschäftigt sich mit der Synthese von Modulatoren und Inhibitoren der Arachidonsäurekaskade. Zum einen befasst sie sich mit der Entwicklung von irreversiblen COX-2-acetylierenden Substanzen als neues anti-entzündliches und entzündungsauflösendes Prinzip. Zum anderen mit der Untersuchung der Struktur-Wirkungsbeziehung (SAR) von 2-Aminothiazolen als direkte 5-LO-Inhibitoren ausgehend von SKI-II, welches zuvor als Leitstruktur zur Entwicklung von 5-LO-Inhibitoren entdeckt wurde.
Als Leitstrukturen für die irreversiblen COX-2-acetylierenden Substanzen wurden bekannte COX-2 selektive Substanzen ausgewählt sowie vereinzelte nicht-selektive NSAR. Es wurden an der COX-2 Kristallstruktur Docking-Studien durchgeführt, um die geeignetsten Positionen für die Einführung einer (labilen) Acetylgruppe zu identifizieren. Aufgrund dieser Studien wurden drei Positionen ausgewählt zur Derivatisierung. Es wurden daraufhin zahlreiche Derivate synthetisiert von Celecoxib, Valdecoxib, Rofecoxib, Etericoxib, als Vertreter der (COX-2) selektive Inhibitoren, sowie von Acetylsalicylsäure, Diclofenac und Nimesulid-Analoga als Vertreter der nicht-selektiven NSARs. Zusätzlich wurden Derivate synthetisiert mit Michael-Akzeptoren als kovalente bindende Komponente. Alle synthetisierten Substanzen wurden sukzessiv auf ihre COX inhibitorischen Eigenschaften hin untersucht und auf COX-2 Selektivitäten überprüft. Weiterhin wurden von allen Derivaten Auswaschungs-Studien durchgeführt als Vorversuche welche Derivate eine irreversible COX-2-Inhibition hervorrufen. In den Vorversuchen zeigte die Verbindung ST-1650 am deutlichsten eine COX-2-Selektivität sowie eine starke irreversible Inhibition der COX-2. Die Verbindung ST-1650 wurde weiterhin auf indirekte Hinweise zur Entstehung von heilungsfördernden Mediatoren untersucht anhand von: M1-Macrophagen Polarisation und einem Schmerzmodell, dem Zymosan-Überempfindlichkeit Pfotenmodell. Im Makrophagen-Modell konnte ST-1650 keine Phänotypverschiebung hinzu entzündungsauflösenden M2-Makrophagen bewirken, sowie in den Schmerzmodellen leider keine schnellere Schmerzauflösung als die Kontrollgruppe. Ob diese Effekte durch mangelnde oder zu geringer Entstehung von entzündungshemmenden Mediatoren zurückzuführen ist, ist noch unklar.
Für die SAR der 2-Aminothiazole als direkte 5-LO-Inhibitoren wurden über 60 Verbindungen synthetisiert und untersucht. Zu Beginn erfolgte eine Optimierung der Grundstruktur als 5-LO-Inhibitor. Es wurden die Einflüsse der Substituenten des Thiazolsrings und des Aminolinkers auf die 5-LO-Aktivität ermittelt, um die SAR initialer Arbeiten zu vertiefen. Nach der SAR-Untersuchung im intakten Zellsystem konnten durch Kombination bevorzugter Strukturelemente die zwei Verbindungen ST-1853 und ST-1906, als neue potente 5-LO-Inhibitoren entwickelt werden, die sich als nicht-toxisch herausstellten. Diese beiden 5-LO-Inhibitoren wirken um einen Faktor 10 potenter und sind weniger toxisch verglichen mit der Leitstruktur SKI-II. ST-1853 wurde innerhalb der Arachidonsäurekaskade auch auf Off-targets getestet, deren Aktivitäten sie erst bei 100-fach höherer Konzentration beeinflusst, sowie in humanem Vollblut, wo sie sich ihre 10-fach bessere Wirksamkeit im Vergleich zu SKI-II bestätigte. Darüber hinaus erwies sich ST-1853 bei den ersten Überprüfungen seiner Stabilität unter physiologischen Bedingungen wie bei der in vitro Metabolisierung durch Rattenlebermikrosomen als ausreichend stabil und daher zur weiteren Charakterisierung gut geeignet.
Diese Zusammenfassung ist in zwei Abschnitte gegliedert. Im Abschnitt 6.1. wird die physiologische Bedeutung der Glutamatrezeptoren (GluR) und ihr biologischer Hintergrund kurz erklärt. Am Ende dieses Abschnitts wird der Stand der Strukturanalyse des GluR-B Ionenkanals zu Beginn des Projektes zusammengefasst. Im nachfolgenden Abschnitt 6.2. sind die wesentlichen Ergebnisse der hier vorgelegten Arbeit zusammengefasst. 6.1. Die Bedeutung von Glutamatrezeptoren - Stand der Strukturanalyse zum Beginn dieser Arbeit Die Kommunikation zwischen Nervenzellen erfolgt vorwiegend an hochspezialisierten Kontaktstellen den chemischen Synapsen. Der enge Raum zwischen sendender und empfangender Nervenzelle wird auch als synaptischer Spalt bezeichnet. Der Prozess der synaptischen Übertragung beruht auf der präsynaptischen Freisetzung von chemischen Botenstoffen, sogenannten Neurotransmittern in den synaptischen Spalt. Die Aminosäure L- Glutamat (Glu) ist der wichtigste erregende Neurotransmitter im menschlichen Gehirn und Rückenmark. Dementsprechend bedeutend ist die Rolle der ionotropen Glutamatrezeptoren (iGluRs), die sie bei der elektrochemischen Erregungsübertragung am synaptischen Spalt spielen (Seeburg, 1993), (Hollmann and Heinemann, 1994), (Dingledine et al., 1999). Die Freisetzung von Neurotransmittern wird durch ein elektrisches Signal (Aktionspotential) ausgelöst, das sich entlang der Nervenfaser, dem Axon, bis zur Nervenendigung, der Synapse, fortpflanzt. Nach der Freisetzung diffundieren die Neurotransmitter durch den synaptischen Spalt und binden an sogenannte Rezeptoren. Ionotrope Glutamatrezeptoren sind Ionenkanäle, die in die Membran der nachgeschalteten (postsynaptischen) Nervenzelle eingebaut sind. Sie zählen deshalb zu den Membranproteinen. Als ligandgesteuerte kationenselektive Ionenkanäle machen Glutamatrezeptoren (GluRs) die postsynaptische Membran nach Aktivierung durch Ligandbindung für bestimmte Kationen durchlässig. Der Einstrom von Ionen bewirkt eine Änderung des Membranpotentials. Die Stärke der synaptischen Übertragung ist lebenslang modulierbar; die sogennante synaptische Plastizität wird als eine entscheidende Grundlage für die Erklärung von Lernen und Gedächtnis angesehen. Drei synthetische Agonisten aktivieren die GluRs selektiv und wurden deshalb für die Klassifizierung der ionotropen Glutamatrezeptoren herangezogen. Bei den Agonisten handelt es sich um -Amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazol-4-propionat (AMPA), Kainat and N- Methyl-D-Aspartat (NMDA). Die ersten beiden Subtypen werden auch als non-NMDA- Rezeptoren zusammengefasst. Die Aktivierung und Desensitivierung der non-NMDA Rezeptoren ist schneller als die der NMDA-Rezeptoren. Aus molekularbiologischer Sicht (siehe Kapitel 1.3.2.) zeigen die drei Klassen der ionotropen Glutamatrezeptoren eine beträchliche Diversität. So gibt es vier verschiedene Unterheiten vom AMPA-Subtyp, nämlich GluR-A, GluR-B, GluR-C und GluR-B. In dieser Arbeit steht die Strukturanalyse eines aus GluR-B Untereinheiten bestehenden AMPA-Rezeptors im Vordergrund. (Die weitere Unterteilung der NMDA- und Kainatrezeptoren kann dem Kapitel 1.3.2. auf Seite 6 entnommen werden.) Bestimmte Abschnitte der Aminosäurensequenz von Glutamatrezeptoren sind durch hydrophobe Bereiche gekennzeichnet ((M1-M4) in Abbildung 6.1.A (A.)). Das durch verschiedene Untersuchungen etablierte Modell der Glutamatrezeptor-Topologie zeigt 3 Transmembrandomänen (M1, M3 und M4) und eine Membranschleife (M2) (Hollmann et al., 1994), (Kuner et al., 1996). Der Aminoterminus ist extrazellulär, der Carboxyterminus hingegen intrazellulär. Daraus ergibt sich die in Abbildung 6.1.A (B.) abgebildete Topologie (Paas, 1998). S1 und S2 kennzeichnen die Ligandbindungsdomäne. Glutamatrezeptoren (GluR) sind Oligomere, die sich mit grosser Wahrscheinlichkeit aus vier Untereinheiten (Rosenmund et al., 1998), (Ayalon and Stern-Bach, 2001) zusammensetzen (siehe Kapitel 1.3.3.). Die Zusammenlagerung verschiedener Untereinheiten zu einem funktionellen Kanal setzt voraus, dass die Untereinheiten zum gleichen Subtyp gehören, d.h. AMPA Untereinheiten können nur mit anderen AMPA Untereinheiten einen Ionenkanal bilden. Das gleiche gilt für die Zusammensetzung von NMDA und Kainat-Rezeptoren. Das Modell eines tetrameren Glutamatrezeptors ist im Bild C. der Abbildung 6.1.A zu sehen. Die Bestimmung der Quartärstruktur eines vollständigen Glutamatrezeptors ist bislang nicht veröffentlicht. Die strukturelle Analyse von Proteinen erfordert die Isolierung von reinem und funktionellem Protein. Im Vergleich zu den meisten löslichen Proteinen erfordert die Isolierung von Membranproteinen oft besonderer Optimierung. Falls das Vorkommen des Proteins in natürlichem Gewebe gering ist, so kann die strukturelle Analyse durch rekombinante Expression in einem geeigneten Wirtsorganismus zugänglich gemacht werden. Die Isolierung von Milligramm-Mengen eines rekombinanten homomeren GluR-B Rezeptors aus dem entsprechenden Baculovirusexpressionssystem (Keinänen et al., 1994) wurde in unserem Labor etabliert (Safferling et al., 2001) und wurde im ersten Jahr dieses Projektes fortgeführt. Durch zonale Ultrazentrifugation konnte gezeigt werden, dass die molekulare Masse des GluR-B Proteinkomplexes ca. 495 kD beträgt. Dieser Wert liegt in der Nähe des theoretischen Molekulargewichts eines tetrameren Ionenkanals, dessen Molmasse sich aus vier GluR-B Untereinheiten (104 kD) und einer Detergenzmizelle von ca. 63-97 kD zusammensetzt (Safferling et al., 2001). Die elektronenmikroskopische Analyse des Proteinkomplexes von W. Tichelaar aus unserer Gruppe erfolgte 1999 durch Negativfärbung. Für die Strukturanalyse mit Hilfe der Software IMAGIC wurden 10 000 Proteinteilchen selektiert. Das Ergebnis der Bildrekonstruktion ist in der folgenden Abbildung 6.1.B gezeigt. Die projezierten Dimensionen des Models entsprechen einem Molekül mit den Dimensionen 17 nm × 11 nm × 14 nm. Das Model zeigt keine ausgezeichnete Symmetrie, die auf die Stöchiometrie des GluR hinweisen könnte. Das Molekül zeigt mit Färbemittel gefüllte Vertiefungen und innere Strukturen, die vielleicht an der Ionenleitung beteiligt sind. 6.2. Funktionelle und strukturelle Charakterisierung des GluR-B Ionenkanals In der Fortsetzung des oben beschriebenen Projektes wurden für die rekombinante Expression desselben Rezeptors (GluR-B homomer) stabil transformierte Insektenzellen eingesetzt. Dazu wurde die für die GluR-B Untereinheit kodierende und in Plasmiden enthaltene DNA in Insektenzellen transformiert (siehe APPENDIX A.2.2.). Im Vergleich zu dieser auf Dauerhaftigkeit angelegten Integration der Rezeptor DNA wird die Proteinexpression beim Baculovirusexpressionssystem durch Infektion mit rekombinanten Baculoviren initiiert. Der Vergleich zeigte, dass die mit Baculoviren erzielten Ausbeuten bei GluR-B etwa doppelt so hoch waren als bei stabil transformierten Zellen. Allerdings fallen bei stabil transformierten Zellen die eventuellen Nachteile der viralen Belastung auf die zellulären Sekretionsprozesse weg. Im Verlauf der elektronenmikroskopischen Analyse von baculoviral erzeugtem GluR-B Protein hat sich gezeigt, dass Proteine viralen Ursprungs unter Umständen selbst doppelt aufgereinigte GluR-B Proben verunreinigen können (siehe APPENDIX A.2.1.). Dieser Punkt ist bei einer Einzelbildverarbeitung von grosser Relevanz, falls die virusspezifischen Proteinverunreinigungen eine ähnliche Grösse haben wie das eigentliche Zielprotein. Das Hauptziel dieser Arbeit war es, das Potenzial stabil transformierter Insektenzellen für die Expression von homomeren GluR-B Ionenkanälen zu bewerten und dabei die Stöchiometrie der Untereinheiten in diesem Ionenkanal aufzuklären. Zu diesem Zweck wurden biochemische und elektronenmikrosopische Techniken eingesetzt. Zur Isolierung des GluR-B Ionenkanals aus stabil transformierten Insektenzellen wurde das bestehende Aufreinigungsprotokoll für die Affinitätchromatographie an immobilisierten Metallionen (IMAC) (Safferling et al., 2001) optimiert, indem das Chargenverfahren durch das Durchflussverfahren ersetzt wurde (zur genaueren Erklärung der Optimierung siehe RESULTS 4.1.2.). Abbildung 6.C zeigt ein silbergefärbtes Gel mit den Eluaten der IMAC und Eluaten der abschliessenden Affinitätschromatographie mit immobilisiertem M1-Antikörper. Die auf den Bahnen 5-8 aufgetragen GluR-B Proben wurden auch für die Einzelteilchenanalyse mittels Elektronenmikroskopie verwendet. Die Ligandbindungsaktivität von GluR-B wurde durch Filterbindungsexperimente mit dem Radioliganden [3H]-AMPA vor und nach der Isolierung aus den Membranfragmenten bestimmt. Die KD-Werte sind für beide Proben ähnlich gross. Der Bmax-Werte ist für die aufgereinigte Probe wie erwartet sehr viel (mehr als 200×) höher. Die Ergebnisse der Ligandbindungsexperimente sind im Kapitel 4.2.1 tabellarisch zusammengefasst. Die oligomere Struktur des isolierten Ionenkanals wurde durch Quervernetzungsexperimente (Cross-linking) und Einzelteilchenanalyse von negativ gefärbten Proteinmolekülen bewertet. Die Quervernetzungsexerimente selbst erbrachten kein eindeutiges Ergebnis im Hinblick auf oligomere Struktur des komplett zusammengesetzten Rezeptors. Kontrollexperimente mit dem Lysat vom Rattenhippocampus zeigten, dass mit DTSSP ein geeigneter Cross-Linker verwendet wurde (siehe RESULTS 4.3.2.). Neben einem aus 4 Banden bestehenden Muster (siehe RESULTS 4.3.1.) lieferten die Quervernetzungsexperimente mit isoliertem GluR-B aber einen deutlichen Hinweis auf die Stabilität von dimeren GluR-B Strukturen, die im Einklang mit einer jüngst veröffentlichten Arbeit stehen (Ayalon and Stern-Bach, 2001). Diese Veröffentlichung liefert zusätzliche (Armstrong et al., 1998) Hinweise auf die Bedeutung von Dimeren in der Glutamatrezeptorstruktur und postuliert, dass sich ein kompletter Glutamaterezeptor aus einem Dimer-Paar zusmmensetzt, wobei die Dimere zuerst gebildet werden. Die nachfolgende Abbildung 6.2.B zeigt negativ gefärbte GluR-B Ionenkanäle bei einer 46000× Vergrösserung. Die Aufnahme stammt von einem Philips EM 400 Elektronenmikroskop. Für die 3D Rekonstruktion wurden 500 der in Abbildung 6.2.B gezeigten Rezeptormoleküle ausgewählt. Dieser relativ kleine Datensatz besteht aus GluR-B Ionenkanälen deren Präservierung in Uranylacetat als besonderes vielversprechend eingeschätzt wurde. Dieser positive Effekt wurde auf die Verwendung frisch von einer Wasseroberfläche aufgefischter Kohlefilme zurückgeführt (siehe RESULTS 4.4.3.3.). Während der Klassifizierung dieses Datensatzes fiel auf, dass die beim Band-Pass-Filtern für die niedrigen Frequenzen gesetzten Cut-offs einen deutlichen Einfluss auf die erste Klassifizierung der unterschiedlichen zweidimensionalen Ansichten des Proteinkomplexes haben (siehe RESULTS 4.4.3.4.). Aus diesem Grund wurde der gleiche Datensatz mit 5 verschiedenen low-frequency cut-offs (LFCO) gefiltert (siehe Table 4.4.3.4.) und getrennt klassifiziert. Von den 5 resultierenden Klassifikationen wurden 3 (LFCO 0,005, 0,03 und 0,05) für die weiterführende 3D Rekonstruktion ausgewählt. Die Evaluierung der resultiernden 3D Modelle ergab, dass der mit einem LFCO von 0,03 gefilterte Datensatz eine Klassifikationen erlaubte, die zu einem 3D Modell (Modell GluR-BII/a siehe RESULTS Figure 4.4.3.4.H) führte, das im Vergleich zu den beiden anderen Rekonstruktionen konsistenter war. Am stärksten spricht für dieses Modell die Übereinstimmung der Input-Projektionen mit den Reprojektionen der 3D Rekonstruktion (siehe siehe RESULTS Figure 4.4.3.4.H). Zur Verfeinerung des Modells GluR-BII/a wurden die beiden Projektionen mit der höchsten Standardabweichung vom Klassendurchschnitt (class average) eliminiert. Die verbleibenden 11 Projektionen bildeten die Input-Projektionen für die Berechung eines verfeinerten Modells, GluR-BII/b, das auf einer neuen Zuordnung der Euler-Winkel beruht. Das Ergebnis dieser Berechung ist in der nachfolgenden Abbildung gezeigt. Das Modell in Abbildung 6.2.C zeigt einen zentralen Kanal und hat die Dimensionen 18 nm × 14 nm × 11 nm. Die Stöchiometrie der Untereinheiten ist aus dem Modell, das mit grosser Wahrscheinlichkeit einen komplett zusammengesetzten GluR darstellt, nicht ablesbar. Ebensowenig zeigt das Modell eine eindeutig vierzählige oder fünfzählige Symmetrie. Allerdings ist die erkennbare zweizählige Symmetrie im Einklang mit dem vorgeschlagenen Pair-of-Dimer Modell (Ayalon and Stern-Bach, 2001), das auf eine teramere Struktur des oligomeren Ionenkanals schliessen lässt. Die Ergebnisse dieser Arbeit zeigen, dass stabil transifzierte Insektenzellen eine durchaus geeignete Quelle für GluR-B Ionenkanäle sind. Nachteilig sind die geringen Ausbeuten. Allerdings kann durch weitere Selektion der Zellen die GluR Expression noch gesteigert werden (siehe APPENDIX A.2.2.). Bei höheren GluR-B Ausbeuten könnte zukünftig auch die Detektion des Rezeptors in vitrifizierten Proben in Verbindung mit Kryo-Elektronen- mikroskopie und auch die 2D-Kristallisation gelingen. Die während dieses Projekts gemachten Kristallisationsexperimente (siehe APPENDIX A.3.) und Kryo-Experimente mit GluR-B Protein aus dem Baculovirusexpressionssystem (siehe RESULTS 4.4.1. und 4.4.2.) ergaben negative Ergebnisse. Das Potential der Kryo-Methode konnte allerdings in Kontrollexperimenten mit Tabak-Mosaik-Virus (TMV) gezeigt werden. Kryo-Daten von GluR-B würden die Berechnung eines genaueren Strukurmodells erlauben. Die Reprojektionen des hier besprochenen Strukturmodells GluR-BII/b aus der Abbildung 6.2.C könnten als Referenzen für das Alignment der vitrifizierten GluR Ionenkanäle dienen. Für das langfristige Ziel der Rekonstituition des Rezeptors in Liposomen sollte die Delipidierung des Membranproteins während der Aufreinigung möglichst reduziert werden. Hier erscheinen zwei Ansätze sinnvoll. Die Aufreinigung des Proteins in einem Schritt durch die Erweiterung des tags am Carboxyterminus von nur 6 auf 10 Histidin-Reste. Ausserdem gibt es Hinweise, dass die Anwesenheit von Lipiden während der Aufreinigung für seine Rekonstituierbarkeit förderlich ist (Huganir and Racker, 1982).
Die NO/cGMP-Kaskade spielt bei der nozizeptiven Transmission im Hinterhorn des Rückenmarks eine wichtige Rolle. In der vorliegenden Arbeit wurden bekannte cGMP-Targets (PKG-1, CNG-Kanäle, PDE-2 und -3) sowie synaptische Vesikelproteine (Synapsin 2, Rabphilin) als potentielle Targets der NO/cGMP-Kaskade mit Hilfe von molekularbiologischen Methoden und nozizeptiven Verhaltensstudien hinsichtlich einer Beteiligung an der nozizeptiven Transmission im Rückenmark untersucht. Im Formalintest reduzierte der PKG-1-Inhibitor Rp-8-Br-cGMPS (0,1 - 0,5 µmol i.t.) die nozizeptive Antwort, während der PKG-1-Aktivator 8-Br-cGMP in hoher Dosis (2,5 µmol i.t.) einen gegenteiligen Effekt zeigte. Überraschenderweise wirkte 8-Br-cGMP in niedriger Dosis (0,1 - 0,25 µmol i.t.) antinozizeptiv, was durch die gleichzeitige Applikation des PKG-Inhibitors weiter verstärkt wurde. Im Gegensatz zu Rp-8-Br-cGMPS oder 8-Br-cGMP beeinflussten weder der CNG-Kanal-Inhibitor L-cis-Diltiazem (0,5 mg i.t.), noch die PDE-Inhibitoren EHNA (0,25 µmol i.t.) oder Milrinon (5 - 10 mg/kg i.p.) die nozizeptive Antwort im Formalintest. Mit Western Blot-Analysen konnte gezeigt werden, dass die Formalininjektion in eine Hinterpfote im Lumbalmark nach 48 - 96 h eine Steigerung der PKG-1-Proteinkonzentration zur Folge hat. Dies wurde durch Vorbehandlung der Versuchstiere mit Rp-8-Br-cGMPS (0,1 - 0,5 µmol i.t.) oder Morphin (2,5 - 5 mg/kg i.p.) verhindert, während 8-Br-cGMP (2,5 µmol i.t.) die Formalin-induzierte Steigerung der PKG-1-Konzentration im Lumbalmark verstärkte. Die Formalininjektion in eine Hinterpfote veränderte auch die Synapsin 2b-Konzentration im Lumbalmark: 10 min bis 8 h nach der Injektion wurde die Synapsin 2b-Proteinkonzentration gesenkt, nach 48 h war jedoch eine Zunahme zu beobachten. Diese späte Zunahme der Synapsin 2b-Proteinkonzentration wurde durch eine Steigerung der Genexpression hervorgerufen, denn mit quantitativer Realtime RT-PCR wurden erhöhte mRNA-Konzentrationen 24 - 48 h nach der Formalininjektion gemessen. Die rasche Formalin-induzierte Abnahme der Synapsin 2b-Proteinkonzentration ging jedoch weder mit Änderungen der mRNA-Konzentration, noch mit veränderten Solubilisierungseigenschaften bei der Proteinaufbereitung einher, und wurde durch Vorbehandlung der Versuchstiere mit Morphin (10 mg/kg i.p.), Diclofenac (10 mg/kg i.p.), Metamizol (1 g/kg i.p.) oder dem NOS-Inhibitor L-NAME (10 - 100 mg/kg i.p.) verhindert. Demgegenüber führte die Vorbehandlung mit dem NO-Donor NOC-5 (4 - 20 µg i.t.), 8-Br-cGMP (0,1 - 2,5 µmol i.t.), Rp-8-Br-cGMPS (0,1 - 0,25 µmol i.t.) oder der Kombination von 8-Br-cGMP und Rp-8-Br-cGMPS (0,1 + 0,1 und 0,5 + 0,5 µmol i.t.) zu einer Verstärkung der Formalin-induzierten raschen Senkung der Synapsin 2b-Konzentration. Die funktionelle Relevanz dieser Befunde wurde in mehreren nozizeptiven Tiermodellen überprüft. Durch eine kontinuierliche i.t. Infusion von Antisense-Oligonukleotiden wurde die Synapsin 2-Konzentration im Lumbalmark der Ratte gesenkt, was eine Reduktion der nozizeptiven Antwort im Formalintest zur Folge hatte. Bei Synapsin 2-Knockout-Mäusen war im Vergleich zu Wildtyp-Mäusen eine verminderte nozizeptive Antwort im Formalintest und eine Reduktion der mechanischen Hyperalgesie bei Zymosan-induzierter Pfotenentzündung zu beobachten. Im Hot-Plate-Test zeigten die Knockout-Mäuse im Vergleich zu Wildtyp-Mäusen kürzere Latenzzeiten. Im Gegensatz zu Synapsin 2b wurde die Rabphilin-Konzentration im Lumbalmark durch Formalininjektion in eine Hinterpfote nicht beeinflusst. Allerdings führte die Verabreichung von Metamizol (500 mg/kg i.p.) oder Diclofenac (5 mg/kg i.p.) nach 1 h zu einer Steigerung der Rabphilin-Proteinkonzentration, welche nicht von Änderungen der mRNA-Expression begleitet war. Eine Senkung der Rabphilin-Proteinkonzentration wurde durch Applikation von NOC-5 (4 - 20 µg i.t.), 8-Br-cGMP (0,5 - 2,5 µmol i.t.), oder Rp-8-Br-cGMPS (0,1 - 0,25 µmol i.t.) hervorgerufen. Zusammenfassend bestätigen diese Ergebnisse die Hypothese, dass im Rückenmark PKG-1 einen Effektor der NO-induzierten Hyperalgesie darstellt. Darüber hinaus konnte gezeigt werden, dass NO/cGMP über noch unbekannte Mechanismen die Verfügbarkeit bestimmter synaptischer Vesikelproteine moduliert, die vor allem bei starker oder anhaltender nozizeptiver Erregung für die Transmitterausschüttung und damit für die nozizeptive Transmission notwendig sind. Interessanterweise führt NO/cGMP über diese Mechanismen eher zur Hemmung der Nozizeption, was die bei niedrigen intrathekalen Dosen beobachteten antinozizeptiven Effekte von 8-Br-cGMP erklären kann. Die These der NO-induzierten Hyperalgesie kann aufgrund der Untersuchungen in dieser Arbeit und früherer Studien um eine insbesondere in niedriger Dosis auftretende NO/cGMP-vermittelte Antinozizeption erweitert werden.
Charakterisierung der Amyloidplaque-assoziierten Entzündungsreaktion in APP23 transgenen Mäusen
(2009)
Ein charakteristisches Merkmal der Alzheimer-Krankheit ist die Ablagerung von Amyloid-beta (A beta) Protein im Gehirn. Die Proteinaggregate bilden Plaques, in deren Umgebung eine chronische Entzündungsreaktion nachgewiesen werden kann. Welche Rolle diese plaqueassoziierte Inflammation für die Pathogenese der Alzheimerschen Krankheit spielt, ist unklar. Es wird diskutiert, dass es sich um einen Versuch des Immunsystems handelt, A beta durch Prozessierung und Phagozytose aus dem Gehirn zu entfernen. Durch die dadurch entstehende chronische Entzündung könnten Nervenzellen in der Umgebung von Plaques geschädigt werden ("bystander attack"). Ein Schritt zu einem besseren Verständnis der plaqueassoziierten Entzündungsprozesse und ihrer pathogenetischen Bedeutung ist die Aufklärung der zugrunde liegenden molekularen Mechanismen. Daher beschäftigt sich die vorliegende Arbeit mit drei zentralen Fragen: (1) Welche Moleküle sind an der plaqueassoziierten Entzündungsreaktion beteiligt? (2) Sind ausgewählte Kandidatenmoleküle (Toll-like Rezeptoren, SOCS) in der Umgebung von Plaques reguliert? (3) Welche Rolle spielen Entzündungsmediatoren aus Endothelzellen in der Nähe von Plaques? Die plaqueassoziierten Entzündungsprozesse wurden im Gehirn von alten APP23 transgenen Mäusen, einem Modell der Alzheimer-Erkrankung, untersucht. Plaques, plaquenahes Gewebe und plaquefreies Gewebe wurden mittels Laser Mikrodissektion ausgeschnitten und anschließend mit Hilfe von Mikroarrays und quantitativer RT-PCR analysiert. Dazu wurden zwei methodische Ansätze gewählt: Im ersten Teil der Arbeit wurden in einem hypothesenfreien Ansatz neue regulatorische Kandidatenmoleküle identifiziert, unter ihnen der Rezeptor Trem2. Dabei konnten sowohl eine erhöhte plaqueassoziierte mRNA als auch eine erhöhte Protein Expression von Trem2 sowie dessen Lokalisation auf Mikrogliazellen nachgewiesen werden. Trem2 spielt anscheinend eine Rolle bei der Herbeiführung eines mikroglialen Aktivierungsstatus, der die Phagozytose unterstützt, während die Entstehung von proinflammatorischen Zytokinen unterdrückt wird. Im zweiten Teil der vorliegenden Arbeit wurde mit einem hypothesenbasierten Ansatz die plaqueassoziierte mRNA Expression von Molekülen untersucht, die bereits in anderen Untersuchungen mit der Alzheimer-Erkrankung in Zusammenhang gebracht wurden. Dabei konnte eine erhöhte plaqueassoziierte mRNA Expression der Toll-like Rezeptoren Tlr2, 4 und 9 sowie einzelner SOCS in APP23 transgenen Mäusen nachgewiesen werden. Tlr2 und 4 sind in der Lage, Mikrogliazellen und andere phagozytierende Zellen zu aktivieren und werden mit der Aufnahme und Beseitigung von Amyloid-beta in Verbindung gebracht. Im dritten Teil der Arbeit wurde ebenfalls mit einem hypothesenbasierten Ansatz die mRNA Expression von plaqueassoziiertem Endothelgewebe überprüft. Dabei konnte eine erhöhte mRNA Expression von MIP-1 alpha und CXCL10, zwei Entzündungsmediatoren aus der Familie der Chemokine, in plaqueassoziiertem Endothelgewebe gezeigt werden. Es kann daher davon ausgegangen werden, dass auch das Endothelgewebe an der Entzündungsreaktion beteiligt ist. Die Ergebnisse dieser Arbeit tragen zu einem besseren Verständnis der plaqueassoziierten Entzündungsreaktion im Rahmen der Alzheimer-Erkrankung bei. Die Aufklärung der Pathogenese der Alzheimer-Erkrankung ist entscheidend, um in den nächsten Jahren und Jahrzehnten neue und effektive Medikamente zur Behandlung dieser schweren Demenzerkrankung zu entwickeln.
Antikarzinogene Effekte konnten mehrfach für sowohl klassische NSAIDs als auch für selektive COX-2-Inhibitoren belegt werden, wobei Celecoxib eine herausragende Stellung einnimmt und als einziges NSAID zur Behandlung der familiären adenomatösen Polyposis den Zulassungsstatus erreicht hat. Dimethylcelecoxib (DMC), ein Strukturanalogon des Celecoxibs, zeigte aufgrund einer strukturellen Molekülaufweitung in vitro in Konzentrationen kleiner 100 µM keine Hemmung der COX-2. Dennoch weist dieses Molekül ähnliche antikarzinogene Eigenschaften auf und wird daher häufig als Vergleichssubstanz zu Celecoxib verwendet, um COX-abhängige Mechanismen von COX-unabhängigen zu trennen. In der vorliegenden Arbeit konnte für DMC eindeutig gezeigt werden, dass es in vitro die PGE2-Synthese in den drei humanen Krebszellen HeLa, A-549 und HCA-7 im niedrigen mikromolaren Bereich hemmt. Da DMC weder die COX-Aktivität noch die Proteinexpression der COX-Isoenzyme in HeLa-Zellen beeinflusst, muss diese Substanz mit anderen Enzymen des PGE2-Syntheseweges interagieren. Die mPGES-1 zeigte wie die COX-2 eine gesteigerte Expression in einer Vielzahl von Tumorgeweben. Eine daraus resultierende gesteigerte PGE2-Produktion erwies sich durch die Wirkung auf spezifische Rezeptoren als prokarzinogen. DMC zeigte in einem zellfreien Assay eine Hemmung der mPGES-1-Aktivität bis zu einem maximalen Effekt von 65 % und einer daraus resultierenden IC50 von ca. 16 µM. Daneben konnte DMC in HeLa-Zellen auch die Protein- und mRNA-Expression der mPGES-1 in Konzentrationen größer 15 µM hemmen. Die Analyse der Gesamtprostanoide in Krebszellen nach DMC-Behandlung zeigte eine Hemmung der Synthese aller vorhandenen Prostanoide. Da extern zugesetzte Arachidonsäure diesen Effekt von DMC sowohl in HeLa- als auch in HCA-7-Zellen unterbinden konnte, war eine Hemmung der Arachidonsäurefreisetzung durch Beeinflussung der Phospholipasen A2 nahe liegend. Es konnte für DMC eine Hemmung der cPLA2a-Aktivität in einem in vitro Assay mit einer IC50 von 58 µM gezeigt werden. Die zur Steigerung der Aktivität notwendige Translokation der cPLA2a vom Cytosol zu intrazellulären Membranen sowie die Phosphorylierung am Serin505 blieben wie auch die Gesamtproteinexpression der cPLA2a von DMC unbeeinflusst. Somit konnte für DMC in vitro eine Hemmung von mPGES-1 und cPLA2a nachgewiesen werden. Jedoch wurden in vitro weitaus höhere Konzentrationen an DMC eingesetzt, um diese Enzyme zu hemmen, als für die Hemmung der PGE2-Produktion in intakten Zellen benötigt wurde. Für die bereits wiederholt gezeigte antiproliferative Wirkung von DMC in vitro konnte die PGE2-Unabhängigkeit bestätigt werden. Aufgrund der hier dargestellten Ergebnisse kann DMC jedoch nicht mehr als COX- und Prostaglandin-unabhängige Kontrollsubstanz im Vergleich zu anderen Coxiben eingesetzt werden. Für die mehrfach beschriebenen antiproliferativen Wirkungen von Celecoxib und DMC sowie die Hemmung der identifizierten Zielmoleküle wurden in vitro meist sehr hohe Konzentrationen benötigt. Die Relevanz dieser Ergebnisse wird daher stark diskutiert, da die in vivo erreichten Plasmakonzentrationen von Celecoxib nicht mit den hohen Konzentrationen in vitro korrelieren. Im zweiten Teil dieser Arbeit wurde zunächst gezeigt, dass DMC und Celecoxib eine intrazelluläre Anreicherung in verschiedenen humanen Krebszelllinien und in vaskulären Endothelzellen aufweisen. In den untersuchten Zellsystemen wurden im Vergleich zu den restlichen Coxiben für Celecoxib und DMC ca. 5 - 10-fach höhere intrazelluläre Konzentrationen erreicht, die linear von den eingesetzten Konzentrationen abhängig waren. DMC und Celecoxib zeigten dabei eine Akkumulation in zelluläre Membranstrukturen und hier insbesondere eine Interaktion mit den lipophilen Bestandteilen des Phospholipidbilayers, was mittels subzellulärer Fraktionierung und zweidimensionaler 1H MAS NOESEY NMR-Spektroskopie nachgewiesen werden konnte. Die intrazelluläre Anreicherung für DMC und Celecoxib ist vermutlich vom Zelltyp und der Lipidzusammensetzung der vorliegenden Membran abhängig, da dieser Effekt in Fibroblasten nicht bestätigt werden konnte. Des Weiteren konnte gezeigt werden, dass die Beeinflussung der Membranintegrität neben der Anreicherung in Phospholipidmembranen zu einer effizienteren COX-2-Hemmung durch Celecoxib im Vergleich zu Rofecoxib und Etoricoxib in HCA-7 Zellen führte. Im humanen COX-2-Vollblutassay wurden hingegen ähnliche Effektivitäten der Coxibe auf die COX-2 nachgewiesen. Eine Steigerung der Wirksamkeit von Celecoxib oder DMC auf Membran-gebundene oder Membran-assoziierte Enzyme, die eine Affinität gegenüber diesen Substanzen aufweisen, wäre somit denkbar und würde speziell in solchen Krebszellen eine Rolle spielen, wo durch eine erhöhte Aktivität dieser Enzyme eine verstärkte Proliferation und Überlebensrate nachgewiesen werden konnte. Pharmakokinetische Studien zeigten für Celecoxib im Vergleich zu anderen Coxiben ein vielfach höheres Verteilungsvolumen. Somit besteht die Möglichkeit, dass sich Celecoxib in solche tieferen Kompartimente einlagert, die vermehrt durch hydrophobe Membranstrukturen gekennzeichnet sind. Aufgrund der hier beschriebenen Ergebnisse ist anzunehmen, dass in intakten Zellen die Wirkung von Celecoxib und DMC auf Zielmoleküle mit einer gewissen Affinität zu diesen Substanzen stärker ist als in vitro und so die Diskrepanz zwischen den Wirkkonzentrationen in vitro und in vivo erklärt werden kann.
Proliferation and apoptosis are fundamental cellular processes that are important for the development and homeostasis of multi-cellular organisms. Deregulation of these processes plays an important role in tumor formation. Often, genes that control homeostasis by regulating proliferation and apoptosis are mutated or improperly expressed in tumors. In this project, the physiological and pathological functions of FUSE Binding Protein 1 (FBP1) were studied to elucidate the involvement of this gene in the context of embryonic development and tumorigenesis. Two reasons led to the hypothesis that FBP1 might be relevant in this context. FBP1 was isolated in the group of PD Dr. Martin Zörnig using a functional yeast survival screen for the identification of anti-apoptotic genes involved in tumorigenesis, and the anti-apoptotic function of FBP1 was confirmed in the human colon carcinoma cell line RKO. In addition, FBP1 had been published to function as a transcriptional regulator that activates expression of the proto-oncogene c-myc. This gene stimulates cell proliferation and is overexpressed in many tumors. Analysis of FBP1 expression by immunhistochemistry in normal and tumor tissue samples revealed frequent and significant overexpression of FBP1 in Hepatocellular Carcinoma (HCC). To study the functional relevance of FBP1 activity for this tumor type, apoptosis and proliferation of the HCC cell line Hep3B were studied in dependence of FBP1 expression. Downregulation of FBP1 by lentiviral expression of FBP1-specific short hairpin RNA (shRNA) reduced proliferation and increased sensitivity to apoptosis. Subcutaneous injection of FBP1-deficient Hep3B cells into immunodeficient NOD/SCID mice demonstrated that tumor growth was strongly decreased in comparison to control cells. mRNA expression studies by quantitative real time PCR showed reduced mRNA levels of the pro-apoptotic genes Bik, Noxa, TRAIL and TNF-􀀁 in the absence of FBP1. In addition, the cell cycle inhibitors p21 and p15 were repressed by FBP1 while Cyclin D2 expression was decreased in the absence of FBP1. Surprisingly, expression of c-myc was not altered by FBP1 downregulation, indicating a different mechanism of c-myc regulation in HCC cells. These results demonstrate that overexpression of FBP1 inhibits apoptosis and stimulates proliferation in HCC cells by regulating the transcription of relevant target genes. Therefore, FBP1 might represent a promising therapeutic target for the treatment of HCC. For analysis of the physiological function of FBP1, a gene trap mouse model was established. In these mice, the gene trap vector pT1􀀂geo is inserted in intron 19 of the FBP1 locus, leading to the expression of a fusion protein consisting of a truncated FBP1 (lacking the last 62 amino acids), 􀀁-Galactosidase and Neomycin Phosphotransferase. Luciferase reporter assays demonstrated that the fusion protein was not capable of activating the c-myc promoter and even showed a dominant negative effect. Thus, this gene trap mouse serves as a functional FBP1 knockout model. Phenotyping of the FBP1 gene trap mice showed that homozygous mutation of FBP1 resulted in embryonic lethality at late stages of embryonic development (E15.5-E16.5). Heterozygous mice were viable, but born at lower frequencies, indicating a gene dosage- or a dominant negative effect of the FBP1 fusion protein. The cellular effects of FBP1 inactivation were tested in mouse embryonic fibroblasts isolated from FBP1 gene trap mice. While proliferation was reduced in the absence of wildtype FBP1, apoptosis was not affected. Expression analysis showed that in homozygous MEFs p15 and p21 transcripts were upregulated, while decreased cmyc mRNA levels were measured. Closer inspection of homozygous gene trap embryos revealed an anemic phenotype that appeared most pronounced around embryonic day 15.5. Analysis of fetal livers, the main site of hematopoiesis at this stage of development, showed a strongly reduced total cell number in homozygous embryos. Evaluation of the different hematopoietic cell lineages did not reveal significant changes in particular differentiated cell types. Instead, all cell lineages seemed to be affected equally by FBP1 inactivation. In contrast, analysis of hematopoietic progenitor cell populations showed an increased percentage of multipotent progenitor cells (MPPs) and a strongly reduced number of long-term hematopoietic stem cells (LT-HSCs). Functional analysis of MPPs by in vitro colony formation assays demonstrated that the FBP1-mutant cells possess a normal colony formation potential while their expansion capacity was reduced. Competitive transplantation of lineage negative fetal liver cells into irradiated recipient mice resulted in reduced engraftment of liverderived progenitor cells from homozygous FBP1 gene trap mice. However, stable engraftment was observed over a period of 12 weeks, demonstrating that the FBP1-deficient LT-HSCs are in principle capable of long-term repopulation. These results demonstrate that FBP1 exerts an essential function during definitive hematopoiesis. It can be speculated that FBP1 influences proliferation, apoptosis and possibly also stem cell self-renewal through the regulation of specific target genes within the hematopoietic progenitor cells. Alternatively, extrinsic effects caused by the absence of FBP1 activity could impair the function of the progenitor cells.
Der Produktion von Interleukin-8 (IL-8), Hämoxygenase-1 (HO-1), und dem vaskulären endothelialen Wachstumsfaktor (VEGF) wird zunehmend größere Bedeutung im Rahmen der Regulation der Immunantwort bei Entzündung, Infektion und Tumorwachstum zugemessen. Ziel dieser Arbeit war die Untersuchung der Regulation dieser Botenstoffe in vitro durch Verwendung der humanen Dickdarmkarzinomzellinie DLD-1. Die Substanz Pyrrolidinedithiocarbamate (PDTC) verstärkt nicht nur die durch Tumornekrosefaktor-a (TNF-a) vermittelte Ausschüttung von IL-8, sondern induziert auch als alleiniger Stimulus die IL-8-Sekretion. Mutationsanalysen des IL-8-Promotors und "Electrophoretic Mobility Shift" Untersuchungen (EMSA) zeigten, daß die Aktivierung des Transkriptionsfaktors AP-1 (Aktivator Protein-1) und die Bindungsaktivität von konstitutiv aktiviertem NF-KB in DLD-1 Zellen für die PDTC induzierte IL-8 Expression zwingend erforderlich waren. Weiterhin war PDTC in der Lage in DLD-1 Zellen neben IL-8 auch die Expression von HO-1 und VEGF zu verstärken. Die Induktion von IL-8 durch PDTC war nicht nur auf DLD-1 Zellen beschränkt, sondern wurde auch in Caco-2 Zellen (ebenfalls Dickdarmkrebszellen) und in humanen mononukleären Blutzellen beobachtet. Die Verwendung von PDTC wird seit kurzem als Kombinationspräparat für Zytostatia zur Behandlung von verschiedenen bösartigen Tumoren, unter ihnen auch Darmkrebs, vorgeschlagen. Aus unseren Versuchen läßt sich ableiten, daß die Induktion von IL-8, HO-1 und VEGF die therapeutische Anwendung dieser Substanz nachteilig beeinflussen könnte. Dies ergibt sich daraus, daß alle drei genannten Faktoren durch proangiogene Wirkungen das Tumorwachstum fördern. Die Expression der induzierbaren Stickoxidsynthase und die Produktion von Stickoxid (NO) korreliert mit der Angiogenese bei verschiedenen Krebserkrankungen darunter Melanome, Tumore im Hals- und Kopfbereich und Darmkrebs. Da tumorbegünstigende Funktionen von NO mit vermehrter Angiogenese in Verbindung gebracht werden, wurden die Effekte von NO hinsichtlich der Produktion von ausgesuchten Chemokinen, die an der Steuerung des Tumorwachstums beteiligt sind, untersucht. Zu diesen Chemokinen gehören das proangiogene IL-8 sowie das tumorsuppressiv durch Interferon induzierbare Protein-10 (IP-10) und das Monokin induziert durch Interferon-y (MIG). Diese Chemokine werden, nach Stimulation mit IL- 1ß und lnterferon-? (IFN-?) von DLD-1 Zellen, ausgeschüttet. Unter diesen Bedingungen wird die IL-8 Freisetzung alleine durch IL-1ß vermittelt, aber nicht durch INFy. Im Gegensatz zu IL-8 hängt die Sekretion von IP-10 und MIG von der Aktivierung durch IFNy ab. Die Effekte von NO wurden analysiert indem DLD-1 Zellen mit dem NO-Donor DETA-NO inkubiert wurden. DETA-NO besitzt eine Halbwertzeit von 16,5h und simuliert damit die Effekte der endogenen NO-Synthase. Synthese und Freisetzung von IL-8 wurden durch die Behandlung mit NO stark gesteigert. Außerdem wurde in Zellen die dem NO-Donor ausgesetzt wurden die basale Sekretion des VEGF signifikant verstärkt. Dies steht im Gegensatz zur IL-Iß/IFNy-induzierten Produktion von IP-10 und MIG, beide wurden durch Koinkubation mit NO unterdrückt. Ebenso wurde die Regulation der IFNy abhängigen induzierbaren Stickoxidsynthase in DLD-1 Zellen von NO unterdrückt. Die vorliegenden Daten ergänzen vorherige Studien, in denen NO mit Tumorangiogenese und verstärkten Tumorwachstum in Verbindung gebracht wird. Die NO vermittelte Induktion von IL-8 und VEGF, ebenso wie die Verminderung der IP-10 and MIG Expression, könnte zu diesem Phänomen beitragen. Unsere Studien stützen die Hypothese, daß spezifische lnhibitoren der iNOS therapeutischen Nutzen bei humanen Neoplasien haben könnten.
Antigen-präsentierende Zellen spielen eine wichtige Rolle bei der Entstehung einer Kontaktallergie. Ziel dieser Arbeit war es, frühe Mechanismen der Signaltransduktion zu identifizieren, die an der Aktivierung von Antigen-präsentierenden Zellen durch Kontaktallergene beteiligt sind. · Monocyten und dendritische Zellen wurden auf ihre Eignung als Modell für epidermale Langerhanszellen hin untersucht. Die Aktivierbarkeit von Monocyten und dendritischen Zellen konnte durch den Anstieg der Tyrosinphosphorylierung nach Stimulation mit verschiedenen Kontaktallergenen gezeigt werden. Die durch Kontaktallergene induzierte TNF-alpha-Produktion von dendritischen Zellen belegt die funktionelle Relevanz des Modellsystems. · Ausgehend von der Bedeutung von Cytokinen für die Differenzierung von myeloiden Zellen wurde untersucht, ob Kontaktallergene die mit Cytokin-Rezeptoren assozierten Signalwege des Jak/STAT-Systems aktivieren. Es konnte keine Aktivierung von STAT-Moldekülen (STAT1, 3, 4, 5, 6) durch Kontaktallergene nachgewiesen werden. Daher ist davon auszugehen, daß Kontaktallergene die üblichen Jak/STAT-Signalwege nicht direkt aktivieren, weder durch Bindung an Jak-assoziierte Cytokin-Rezeptoren noch über deren downstream-Elemente. · Die Aktivierung der MAP Kinasen ERK und p38 durch verschiedene Kontaktallergene wurde charakterisiert. MCI/MI und TNCB aktivieren ERK und p38. Nicht alle Kontaktallergene bewirken die gleichen Aktivierungsmuster. Die Phosphorylierung von ERK durch MCI/MI wurde im Vergleich zur Aktivierung von p38 als früher Mechanismus der Signaltransduktion charakterisiert. Die Beteiligung von ERK und p38 an der TNF-alpha-Induktion durch MCI/MI belegt die Relevanz dieser MAP Kinasen für die Aktivierung von dendritischen Zellen. · Weiterhin wurden eine Reihe von upstream-Elementen von ERK untersucht. Die Aktivierung von ERK durch MCI/MI und TNCB verläuft nicht über den klassischen Ras-c-Raf-MEK-ERK Signalweg. Während MEK1/2 an der Aktivierung von ERK durch MCI/MI und TNCB beteiligt ist, werden c-Raf und Ras nicht aktiviert. · Die intrazelluläre Calcium-Konzentration ist wichtig für die ERK-Aktivierung durch MCI/MI und TNCB, extrazelluläres Calcium dagegen ist nicht erforderlich. Das Modellallergen MCI/MI bewirkt die Mobilisierung von intrazellulärem Calcium. Der Anstieg von [Ca2+]i allein jedoch löst keine Aktivierung von ERK aus. Das durch MCI/MI induzierte Calcium-Signal wird nicht durch Calmodulin vermittelt. · Durch Inhibition von Proteinkinase C konnte nachgewiesen werden, daß vorwiegend klassische Calcium-abhängige Isoformen der PKC an der Aktivierung von ERK durch MCI/MI beteiligt sind. Die Translokation von cPKC-Isoformen weist auf deren Aktivierung durch MCI/MI und TNCB hin. Die Inhibition von PI3-Kinase hingegen lieferte keinen Hinweis auf Beteiligung an der Aktivierung von ERK durch MCI/MI. Mit den Ergebnissen dieser Arbeit konnte auf der Grundlage der aktuellen Literatur ein möglicher Signalweg der Aktivierung von ERK durch Kontaktallergene entwickelt werden. Auslöser der Signalmechanismen wäre die Kopplung von Haptenen an ein heterodimeres (an die tTG siehe Zahn 2002) oder heterotrimeres G-Protein. Eine wichtige Rolle bei der Signalweiterleitung spielen die Freisetzung von Calcium aus intrazellulären Speichern, klassische Isoformen der Proteinkinase C und die MAPK Kinase MEK1/2. Sowohl ERK als auch p38 sind an der Induktion der TNF-alpha-Produktion durch Kontaktallergene in dendritischen Zellen beteiligt. Damit liefert diese Arbeit einen wesentlichen Beitrag zum Verständnis der molekularen Mechanismen bei der Aktivierung von dendritischen Zellen durch Kontaktallergene.
Die LC/MS/MS Methoden zur Quantifizierung des selektiven COX-2-Hemmers Celecoxib und des selektiven COX-1-Hemmers SC-560 wurden auf einem Sciex API 3000 Tandem Massenspektrometer mit einer TurboIon Spray Quelle entwickelt und validiert. Für Celecoxib wurden zwei Assays mit internem Standard für die Quantifizierung aus Plasmaproben und ein Assay ohne internen Standard für die Quantifizierung aus Microdialysaten entwickelt. Die Plasmaproben wurden mittels Festphasenextraktion über C18 Material extrahiert. Für die Methode CLX-1 wurde über eine RP-C18 Säule (30 x 2 mm) isokratisch mit Methanol/Wasser/NH4OH 20% 80:20:0,1 v/v mit einer Flussrate von 0,2 ml/min eluiert. Die Methode wurde über den Konzentrationsbereich von 10-1000 ng/ml für Humanplasma und 10-500 ng/ml für Rattenplasma validiert. Für die Methode CLX-2 wurde die Chromatographie mit einer RP-C18 Säule (30 x 2 mm) isokratisch mit Acetonitril/Wasser/NH4OH 20% 85:15:0,1 v/v mit einer Flussrate von 0,2 ml/min eluiert. Die Methode wurde über den Konzentrationsbereich von 0,25-250 ng/ml für Humanplasma validiert. Für die Methode CLX-Microdialysate wurde die Elution über eine RP-C18 Säule (70 x 2 mm) isokratisch mit Acetonitril/Wasser/NH4OH 20% 65:25:0,1 v/v mit einer Flussrate von 0,2 ml/min durchgeführt. Das Assay wurde über den Konzentrationsbereich von 0,25-250 ng/ml validiert. Die Analytik von SC-560 mittels LC/MS/MS wurde für den Nachweis in Microdialysaten entwickelt. Die Microdialysate wurden mit dem Äquivalenten Volumen Acetonitril verdünnt, um den Analyten vollständig in Lösung bringen zu können. Eine RP-C18 Säule (60 x 1 mm) wurde verwendet und die chromatographische Trennung mit einem Gradientenprogramm durchgeführt. Die Methode wurde über den Konzentrationsbereich von 0,5-20 ng/ml für Microdialysate validiert. Die Assays wurden für pharmakologische Untersuchungen zur Wirkung und zum molekularen Wirkmechanismus von selektiven Cyclooxygenasehemmern eingesetzt. Die Rolle der Cyclooxygenase-Isoformen bei der nozizeptiven Transmission im Rückenmark wurde in der ersten Studie untersucht. SC-560 reduzierte das Schmerzverhalten der Tiere und hemmte die spinale Prostaglandinproduktion. Celecoxib hatte auf die Effekte keinen Einfluss. Die Ergebnisse legten den Schluss nahe, dass die Wirksamkeit von Celecoxib bei Trauma-bedingten Akutschmerzen der Wirksamkeit unselektiv wirkender NSAIDs unterlegen ist. In der zweiten Studie wurden Die Effekte hoher Dosen von Celecoxib untersucht. In Tierversuchen mit Zymosan-induzierten Entzündungen der Hinterpfoten konnte Celecoxib bei 50 mg/kg das Ödem in der Hinterpfote reduzieren, aber nicht bei Dosierungen größer gleich 100 mg/kg. In Zellkultur konnte an Mesangiumzellen der Ratte gezeigt werden, dass eine Dosis von 50 µM Celecoxib den Transskriptionsfaktor NF-_B aktiveren kann. In einer dritten Studie wurde der Einfluss COX-abhängiger und -unabhängiger Mechanismen auf die antiproliferative Wirkung von Celecoxib untersucht. SC-560 und Celecoxib verursachten einen Zellzyklus-Block. Celecoxib beeinflusste die Expression Zellzyklus-regulierender. Celecoxib induzierte Apoptose unabhängig vom COX-2 Status der Zellen. In vivo wurde das Wachstum von COX-2 defizienten Tumoren durch Celecoxib und SC-560 reduziert. Die in vitro und in vivo Daten deuten auf COX-2 unabhängige Mechanismen der antiproliferativen Wirkung von Celecoxib hin.
IL-22 ist ein TH17-Signaturzytokin und wird primär von aktivierten T- und NK-Zellen produziert. Die Literatur beschreibt IL-22 als immunregulatorisches Signalmolekül, welches vor allem bei Infektionen und Entzündungsprozessen eine wichtige Rolle spielt. Typische IL-22-induzierte Gene sind beispielsweise Akut-Phase-Proteine, β-Defensine sowie Matrixmetalloproteasen. In dieser Arbeit wurde erstmals gezeigt, dass IL-22 die IFNγ-induzierte iNOS-Expression in humanen DLD-1 Kolonkarzinomzellen massiv verstärkt. Eine gestörte iNOS-Induktion mit folglich extensiver NO-Produktion trägt zu entzündlichen Veränderungen und zur Tumorentstehung bei. Insbesondere gibt es stichhaltige Belege, welche iNOS und NO in Verbindung mit Krebs als potentes Mutagen, als Angiogenesefaktor, als Verstärker der Protoonkogenexpression und als Inhibitor der Apoptose charakterisieren. Demzufolge ist gerade die Identifikation von Signaltransduk-tionswegen von Interesse, welche das Potential zur Regulation der iNOS-Expression in epithelialen Kolonkarzinomzellen besitzen. Der Nachweis des IL-22-Rezeptorkomplexes sowie einer STAT3-Phosphorylierung belegte die IL-22-Responsivität der hier verwen-deten DLD-1 Kolonkarzinomzellen. Der Transkriptionsfaktor STAT3 gilt als prominentes Signalmolekül in der Signaltransduktionskette von IL-22. In der aktuellen Literatur wird STAT3 aufgrund seiner antiapoptotischen und proliferativen Eigenschaften als Onkogen definiert. Sowohl in Patienten mit Morbus Crohn als auch im humanen Kolorektalkarzinom ist eine Überexpression von STAT3 und iNOS beschrieben. Unter Verwendung einer STAT3-spezifischen siRNA konnte der Nachweis erbracht werden, dass STAT3 ein essen-tieller Faktor in der IL-22-vermittelten Induktion der iNOS-Expression ist. Luciferase-Reporterstudien zeigten, dass IL-22 die humane iNOS-Promotoraktivität in DLD-1 Zellen, welche die Photinus pyralis (Firefly)-Luciferase unter Kontrolle eines 16kb-iNOS-Promotor-konstrukts überexprimieren (DLD-1/pXP2-16kb), erhöht. Somit kann eine Regulation der Transkription durch IL-22 angenommen werden. Dennoch vermag diese Arbeit die Frage nach den transkriptionellen Regulationsmechanismen der IL-22-vermittelten iNOS-Expres-sion in DLD-1 Zellen nicht abschließend zu beantworten. Eine Beteiligung ausgewählter Parameter der Zellaktivierung wie beispielsweise NFκB, STAT1α oder IRF-1 an der IL-22-vermittelten iNOS-Induktion konnte durch die vorliegende Arbeit ausgeschlossen werden. Neben transkriptionellen Regulationsmechanismen übernimmt auch die Regulation der iNOS mRNA-Stabilität eine wichtige Funktion bei der Induktion der iNOS-Expression. Allerdings zeigten auch hier die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit, dass IL-22 die iNOS-mRNA nicht stabilisieren kann. Dies bekräftigt wiederum die Annahme, dass IL-22 auf transkriptioneller Ebene den iNOS-Promotor reguliert. Weitere Versuche zeigten auch, dass IL-22 spezifisch an der iNOS-Expression in Kolonkarzinomzellen beteiligt ist und keinen generellen Verstärker der IFNγ-induzierten Genexpression darstellt. Beachtet man hierbei die bedeutende Rolle von STAT3 und iNOS bei Entzündung und Karzinogenese, so repräsentiert IL-22 möglicherweise eine neue Zielstruktur für immuntherapeutische Interventionen im Rahmen dieser Erkrankungen. Der zweite Abschnitt der vorgelegten Arbeit beschäftigte sich mit der Regulation der IL-22-Sekretion im Kontext von Sepsis und systemischer Entzündung. Es stellte sich die Frage, inwiefern IL-22 in diesem komplexen klinischen Syndrom der Sepsis nachzuweisen ist. In diesem Zusammenhang zeigte sich, dass sowohl eine generelle T-Zellaktivierung sowie verschiedene Stimuli der angeborenen Immunität, hier im Besonderen ein hitze-inaktiviertes Lysat von Staphylococcus epidermidis, eine vermehrte IL-22-Produktion anre-gen. Eine wichtige Frage ist hier die pharmakologische Beeinflussung der IL-22-Sekretion. Da bei der Therapie einer Sepsis die Behandlung mit niedrig dosierten Glukokortikoiden Erfolg versprechend ist, wurde im Folgenden der Einfluss des klassischen antientzünd-lichen Pharmakons Dexamethason auf die IL-22-Sekretion in PBMC untersucht. Es konnte eindrucksvoll gezeigt werden, dass Dexamethason sowohl auf mRNA- als auch auf Proteinebene einen sehr potenten Inhibitor der S. epidermidis-induzierten IL-22-Sekretion darstellt. Um die in vitro-Daten der IL-22-Sekretion nach Immunaktivierung humaner PBMC durch in vivo-Experimente zu ergänzen, wurde ein kürzlich etabliertes Nagermodell der schweren Sepsis mit akutem Verlauf verwendet (CLI; caecum ligation and incision). In diesem Modell ist IL-22 im Vergleich zu unbehandelten Tieren signifikant erhöht. In Über-einstimmung mit den in vitro-Experimenten in humanen PBMC hat die Applikation von Dexamethason im CLI-Modell die Hemmung der IL-22-Produktion zur Folge. Zur Abrun-dung dieser Ergebnisse wurde das Serum von Patienten mit einer Peritonitis-bedingten Sepsis untersucht und es konnte erstmals eindrucksvoll gezeigt werden, dass IL-22 in dieser Patientengruppe signifikant erhöht ist. Zum aktuellen Zeitpunkt ist die Rolle von IL-22 in der Sepsis noch nahezu unbekannt. Daher ist zu klären, wie die eingehend beschriebene IL-22-vermittelte Aktivierung der epithelialen Immunabwehr, die systemische Immunsuppression über die Induktion von IL-10 sowie das proinflammatorische und destruktive Potential von IL-22 in Einklang zu bringen sind.
In the first part of this study, we have identified the two steroid hormones progesterone and norgestimate as novel TRPC channel blockers. Both substances blocked TRPC-mediated Ca2+ influx with micromolar activities in fluorometric measurements. TRPC channel inhibition did not seem to be a general steroid effect since another progestin, the norgestimate metabolite levonorgestrel, was not effective. Norgestimate was 4- to 5-fold more active on the TRPC3/6/7 subfamily compared to TRPC4/5, whereas progesterone was similarly potent. This selectivity of norgestimate was confirmed by patch clamp recordings. As norgestimate blocked channels directly gated by DAG with a fast kinetic, we assume the compound acts on the channel protein itself. This view was further substantiated by the lack of effects on IP3R-mediated Ca2+ release from the endoplasmic reticulum, which is activated in parallel with TRPCs by Gq/11-coupled receptor stimulation. Norgestimate did not only block ectopically expressed TRPC channels but also native, TRPC-mediated currents in rat aortic smooth muscle cells with similar activity. The usefulness of norgestimate as a tool compound for the investigation of physiological TRPC functions was tested in isolated vessel rings. Consistent with TRPC6 being an essential component of the alpha-1-adrenoceptor-activated cation channel, we demonstrated a direct vasorelaxant, endothelium-independent effect of norgestimate on rat aortic rings precontracted with phenylephrine. Thus, our results provide further experimental support for a role of TRPC6 in alpha-1-adrenergic vessel constriction. In the second part of this study, we screened a human aorta cDNA-library for novel TRPC4-interacting proteins with a modified yeast two-hybrid (Y2H) system in which the TRPC4-C-terminus was expressed as tetrameric bait protein, thereby mimicking the native channel conformation. Of the eleven interacting proteins found SESTD1 was chosen for further analyses since it contains a phospholipid-binding Sec14p-like domain and thus could be involved in regulation of TRPC channels by phospholipids. After the biochemical validation of the found interaction, the first spectrin domain of SESTD1 was then identified to interact with the CIRB domain of TRPC4 in directed Y2H tests. SESTD1 also co-immunoprecipitated with the closely related TRPC5 protein in which the SESTD1-binding domain is highly conserved. Independent of the CIRB site, co-immunoprecipitation with TRPC6 and the distantly related TRPM8 channel was observed indicating the existence of other sites in these channel proteins that mediate interaction with SESTD1. Analysis of SESTD1 gene expression in human tissues showed that its transcripts are ubiquitously expressed and tissues with significant coexpression with TRPC4 and -5 were identified. We have generated two polyclonal antisera directed against SESTD1 that consistently detected SESTD1 protein in brain, aorta, heart, and in smooth muscle and endothelial cells. The functional consequences of the found interaction were investigated by examination of the TRPC5-mediated Ca2+ influx in a clonal HM1 cell line stably expressing the channel. Since SESTD1 overexpression had no detectable effects on TRPC5-mediated Ca2+ influx, most likely due to expression of endogenous SESTD1, we knocked-down the native protein with specific siRNA. This procedure reduced TRPC5-mediated Ca2+ influx following receptor stimulation by 50%. Parallel biotinylation experiments did not reveal any differences in cell surface expressed TRPC5-protein, suggesting that reduction of TRPC5 activity resulted from a loss of a direct SESTD1 effect on the channel. In addition, in immunofluorescence experiments we observed that reduced SESTD1 protein levels resulted in a redistribution of the multifunctional protein ß-catenin from the plasma membrane to the cytosol. This result may point to an involvement of SESTD1 in formation and maintenance of adherens junctions. SESTD1 contains a phospholipid-binding Sec14p-like domain and we were the first to demonstrate its Ca2+-dependent binding to phosphatidic acid and all physiological phosphatidylinositol mono- and bisphosphates in vitro. The physiological function of this binding activity is not known at present, but it could play a role in regulation of associated TRPC channels. TRPC4 and -5 channels are activated by phospholipid hydrolysis and also bind phospholipids directly. The identification of SESTD1 as novel TRPC-interacting protein could thus be an important step forward in the investigation and better comprehension of the complex molecular mechanisms of TRP channel regulation by lipids.
Mechanismus der funktionell relevanten Kopplung von Kontaktallergenen in dendritischen Zellen
(2002)
Über die Signaltransduktion in Langerhanszellen, den antigenpräsentierenden Zellen der Epidermis, ist bisher nur wenig bekannt. Mit ein Grund dafür ist die schlechte Verfügbarkeit reiner Langerhanszellen aufgrund ihrer geringen Zahl und der schwierigen Präparation, die häufig schon zur Voraktivierung dieser Zellen führt. Humane unreife und reife dendritische Zellen erwiesen sich als geeignete Modellzellpopulation für kutane antigenpräsentierende Zellen. Mit Hilfe dieser Modellzellen wurde die Beteiligung von zentralen Signaltransduktionswegen nach Interaktion mit dem Kontaktallergen TNCB untersucht. 1. Zum ersten Mal wird gezeigt, dass TNCB in den ersten 10 Minuten nach der Haptenisierung bei dendritischen Zellen intrazellulär lokalisiert ist. Die Stimulation von DC mit dem starken Kontaktallergen TNCB führte zu einer Aktivierung der ERK1/2 MAP Kinase. Dieses Ergebnis entspricht der Vorstellung, dass starke Kontaktallergene in subtoxischen Konzentrationen zellulären Streß bei MAP Kinasen auslösen und somit zu einer für die Kontaktallergie typischen Antigenpräsentation führen. 2. Die Tyrosinphosphorylierung wurde bereits in vorausgegangenen Arbeiten (Kuhn, 1998; Brand, 2002) als Charakteristikum für haptenbehandelte Monozyten und humane dendritische Zellen herausgestellt. Diese Ergebnisse konnten mit humanen unreifen und reifen DC weitergeführt werden. Proteinbiochemisch ergab das Kontaktallergen TNCB ein spezifisches und reproduzierbares Muster hyperphosphorylierter Proteinbanden. Der gemessene Anstieg an Phosphotyrosin beruhte auf der gesteigerten Aktivität von Protein Tyrosin-Kinasen. 3. In weiteren Untersuchungen wurden Proteine massenspektrometrisch analysiert, die tyrosinphosphoryliert waren und gleichzeitig TNCB gebunden hatten. Es wurden drei Proteine identifiziert: Gewebstransglutaminase bei 74-80kD, Thyroidhormon Bindeprotein bei 58kD und Aktin bei 38kD. Nach Literaturrecherchen war die Transglutaminase am vielversprechendsten und wurde auf ihre Aktivität innerhalb der Kontaktallergen-induzierten Signaltransduktionskaskade hin untersucht. Drei strukturell verschiedene Stoffe, das Kontaktallergen TNCB, die Retinsäure (RA) und ein Phorbolester (PMA) induzierten eine starke, proteinbiochemisch meßbare Tyrosinphosphorylierung der ERK1/2 MAP Kinase. Aus der Literatur war die RA für eine Aktivierung der tTG bekannt (Antonyak et al., 2002) und PMA als Stimulator der ERK1/2 MAP Kinase (Chen et al., 2002; Lee et al., 2002) - aus diesem Grund wurden sie als Positivkontrolle mitgeführt. 4. Mittels Immunpräzipitation wurde der Nachweis, dass TNCB an die tTG bindet, erbracht. Dies war der erste Indikator für eine Bedeutung der tTG als Zielstruktur für ein Kontaktallergen. 5. TNCB, RA und PMA lösen eine gesteigerte Transamidierungsaktivität der tTG aus, die essentiell zur Induktion der ERK-Phosphorylierung ist. Dies wurde durch einen Transamidierungs Aktivitäts Assay bestimmt (Zhang et al., 1998), einem Nachweis der tTG Aktivität mittels Inkorporation von biotinylierten Polyaminen in lokale Proteine. 6. Sowohl die tTG Aktivität als auch die ERK-Phosphorylierung nach TNCB Stimulation konnten durch den spezifischen Inhibitor der Transamidierungsaktivität der tTG MDC gehemmt werden. Dies war ein zweiter Hinweis, dass die enzymatische Aktivität der tTG eine große Rolle spielt. Das gleichzeitige Ausbleiben der Transamidierung und der ERK-Phosphorylierung deutet auf den deutlichen Einfluß der tTG auf den Signaltransduktionsweg der ERK1/2 MAP Kinase hin. Analysen mit anderen starken Kontaktallergenen, wie z.B. Thiomersal und Chlormethylisothiazolon/ Methylisothiazolon bieten zukünftige Forschungsansätze zur weiteren Charakterisierung der funktionellen Bedeutung der tTG und des ERKWeges. Interessant wären auch Untersuchungen zur Hochregulation der tTGExpression in DC von 24-72 Stunden nach einer Inkubation mit TNCB, RA und PMA. Auch sind weitere Untersuchungen zur Signaltransduktionskaskade im Hinblick auf die erforderlichen, nachgeschalteten Elemente interessant, wie z.B. der von der tTG aktivierten Protein B Kinase AKT (Antonyak et al., 2002) sowie beteiligter Kinasen des ERK-Weges.
Die 5-Lipoxygenase (5-LO) ist das Schlüsselenzym bei der zellulären Leukotriensynthese. Sie katalysiert zunächst die Umwandlung von AA zu 5-Hydroperoxyeicosatetraensäure (5-HPETE) und als zweiten Schritt die Dehydratisierung der 5-HPETE zum instabilen Epoxid Leukotrien A4 (LTA4). Leukotriene sind wichtige Mediatoren bei Entzündungsprozessen und allergischen Reaktionen. Die 5-LO besteht aus zwei Domänen, einer N-terminalen regulatorischen Domäne (AS 1-121) und einer C-terminalen katalytischen Domäne (AS 120-673). Die katalytische Domäne besteht hauptsächlich aus a-Helices, die regulatorische hingegen hat fast ausschließlich b-Faltblätter als Sekundärstrukturelemente. Mit ihrem aus acht Faltblättern bestehenden antiparallelen b-Sandwich hat sie Ähnlichkeit mit einer C2- Domäne. Sie besitzt eine Ca2+-Bindungsstelle und ist maßgeblich bei der Bindung des Enzyms an Membranen beteiligt. Für einige Inhibitoren und zelluläre Faktoren existieren Hinweise, dass sie an die C2-ähnliche Domäne der 5-LO binden, die direkten Beweise fehlen jedoch. Die katalytische Domäne enthält das aktive Zentrum mit einem prosthetischen Eisen und drei Phosphorylierungsstellen. In der vorliegenden Arbeit wurde zum ersten Mal erfolgreich eine Methode zur Überexpression und Aufreinigung der regulatorischen Domäne in E. coli entwickelt, die eine große Ausbeute des Zielproteins erbringt. In einer einfachen one-step Aufreinigung können bis zu 80 mg Fusionsprotein aus MBP und der regulatorischen Domäne der 5-LO (MBP-5LO1-128) pro Liter Expressionskultur gewonnen werden. Ein Verdau mit TEV-Protease führt zur effizienten Abspaltung des MBP. Die weitere Aufreinigung mit hydrophober Interaktionschromatogragphie ergibt eine Ausbeute von 3,4 mg reiner regulatorischer Domäne. Dabei weisen sowohl das Fusionsprotein, als auch die abgespaltene regulatorische Domäne eine Reinheit von über 95% auf. Leider ist die momentan erreichbare Konzentration der reinen regulatorischen Domäne noch nicht ausreichend, um damit NMR-Messungen zur Strukturaufklärung durchführen zu können. Es konnte bestätigt werden, dass die katalytische Domäne der 5-LO alleine nicht zu einer Umsetzung von Arachidonsäure in der Lage ist. Der Verlust der enzymatischen Aktivität ist vermutlich nicht auf eine Fehlfaltung der Proteindomäne zurückzuführen. Die korrekte Faltung der katalytischen Domäne konnte durch eine - wenn auch schwache - Bindung der Domäne an ATP gezeigt werden konnte. Die Zugabe von regulatorischer Domäne zu rekombinanter, aufgereinigter WT 5-LO hat unter gewissen Bedingungen (Abwesenheit von PC) einen stimulierenden Effekt auf die Aktivität des Gesamtenzyms. Dieser Effekt könnte durch eine „Dimerisierung“ der regulatorischen Domäne mit WT 5-LO hervorgerufen werden. In Gegenwart von PC ruft die regulatorische Domäne eine Hemmung der 5-LO-Aktivität hervor. Außerdem ist MBP-5LO1-128 (im Gegensatz zu MBP alleine) in der Lage, das Zwischenprodukt der 5-LO, 5-HPETE, in einer 1:1 Reaktion zu reduzieren. Diese Fähigkeit könnte zur Unterdrückung einer Selbstaktivierung der 5-LO physiologisch bedeutend sein. Interessant ist, dass die Reduktion in Anwesenheit von Ca2+, PC oder PC und Ca2+ deutlich verringert war. Ca2+ führte vor allem in Abwesenheit von PC zu einer deutlichen Verminderung der 5-HPETE-Reduktion. In Gegenwart von PC zeigt Ca2+ nur einen minimalen Einfluss auf die 5-HPETE-Reduktion. Es existieren deutliche Hinweise für eine Konformationsänderung von C2-Domänen durch Ca2+-Bindung [105; 106]. Geht man davon aus, dass dies auch für die C2-ähnliche Domäne der 5-LO zutrifft, erklärt sich damit die Verminderung der 5-HPETE-Menge in Gegenwart von Ca2+. Es ist gut vorstellbar, dass eine Ca2+-induzierte Konformationsänderung zu einer schlechteren Zugänglichkeit der für die Reduktion wichtigen Aminosäureseitenketten führt. Die Anwesenheit von PC führte zu einer noch stärkeren Hemmung der 5-HPETEReduktion, als die Zugabe von Ca2+. Die Beobachtung, dass 5-HPETE in Anwesenheit von PC teilweise vor einer Reduktion geschützt wird, ist in Übereinstimmung mit Ergebnissen von Rakonjac [62]. Vermutlich werden die, für die Reduktion wichtigen Aminosäureseitenketten bei Bindung der Domäne an die PC-Micellen teilweise verdeckt. Cystein 99 könnte eine Rolle bei dieser Reaktion spielen. Es konnte jedoch gezeigt werden, dass es bei der Reduktion von 5-HPETE nicht zu einer maßgeblichen Ausbildung von Disulfidbrücken kommt. Vorstellbar wäre die Ausbildung einer Hydroxysulfonylgruppe am Cystein. Eine Beteiligung von Cystein 99 wird durch die Ergebnisse des Dockings von 5-HPETE an das Homologiemodell der 5-LO und experimentelle Daten aus anderen Arbeiten (M. Hörnig, O. Rådmark) unterstützt. Um den genauen Mechanismus aufzuklären und die physiologische Relevanz zu zeigen sind weitere umfassende Untersuchungen nötig. Um eine Bindung von Hyperforin, LP 121, C06 und B02 an die regulatorische Domäne zu untersuchen wurde ein Kompetitionsassay entwickelt. Dabei wurde rekombinante, aufgereinigte 5-LO mit dem entsprechenden Inhibitor versetzt und dann versucht, die Hemmung mit Hilfe der regulatorischen Domäne aufzuheben. Greift der Inhibitor an der regulatorischen Domäne an, so sollte die Zugabe von MBP-5LO1-128 bewirken, dass ein Teil des Inhibitors an die regulatorische Domäne bindet, er sich somit nicht mehr an der 5-LO befindet und seine Wirkung vermindert wird. Um sicher zu gehen, dass die beobachteten Effekte nicht artifiziell sind, wurde ein Inhibitor, der an der katalytischen Domäne der 5-LO angreift als Negativkontrolle für den Assay benutzt. Für diesen Zweck wurde der Eisenligandinhibitor Zileuton ausgewählt. Es ist bekannt, dass Zileuton das Eisen im aktiven Zentrum der 5-LO chelatiert und nicht an die regulatorische Domäne bindet. Die Hemmung von Zileuton konnte erwartungsgemäß durch Zugabe der regulatorischen Domäne nicht aufgehoben werden. Hyperforin und B02 zeigten eine deutlich verminderte 5-LOHemmung bei steigender Menge an MBP-5LO1-128. Die Hemmung durch LP 121 und C06 wurde nicht von der regulatorischen Domäne beeinflusst. Es konnte also ein effektives und einfaches Screeningverfahren zur Untersuchung der Bindung von 5-LO-Inhibitoren an die regulatorische Domäne entwickelt werden, mit der Einschränkung, dass der Assay nur für den Nachweis einer reversiblen Bindung von Inhibitoren an die regulatorische Domäne tauglich ist. Dieser Assay wird sich in Zukunft als wichtiges Tool bei der Suche nach neuen 5-LO-Inhibitoren erweisen, da die Substanzen mit einem direkten Angriff des aktiven Zentrums bisher nicht zu effektiven und nebenwirkungsarmen Arzneimitteln geführt haben.
5-LO is the key enzyme in the biosynthesis of proinflammatory leukotrienes. It catalyses the conversion of arachidonic acid to the hydroperoxy intermediate 5(S)-hydroperoxy-6- trans-8,11,14-cis-eicosatetraenoic acid (5-HpETE). In a second step 5-LO catalyses a dehydration reaction forming the unstable epoxide intermediate 5(S)-trans-5,6-oxido-7,9- trans-11,14-cis-eicosatetraenoic acid (leukotriene A4 , LTA4). The 5-LO gene is subjected to versatile regulation mechanisms. Apart from regulation by DNA-methylation and histone acetylation / deacetylation 5-LO gene expression can be regulated by the differentiation inducers calcitriol (1,25-dihydroxyvitamin D3) and transforming growth factor beta (TGFβ) 5-LO gene expression. In the myeloid cell lines Mono Mac 6 (MM6) and HL-60, differentiation with both agents caused a prominent upregulation of 5-LO mRNA level, of 5-LO protein expression and of 5-LO activity. Treatment with calcitriol alone already has an impact on 5-LO gene expression which is additionally potentiated by TGFβ treatment. Previous nuclear run-off analysis and reporter gene analysis could not associate the 5-LO promoter with the induction of 5-LO mRNA expression mediated by calcitriol and TGFβ. Inclusion of the 5-LO coding sequence (cds) and inclusion of the 5-LO cds plus the last four introns of the gene (J to M) in the 5-LO promoter construct pN10 led to an enhanced reporter gene activity. The inductions were dependent on vitamin D receptor (VDR) and retinoid x receptor (RXR) cotransfection. Therefore the work was concentrated on identifying elements outside the 5-LO promoter region which contribute to the calcitriol / TGFβ effect on 5-LO mRNA expression. Insertion of the LTA4 hydrolase coding sequence – a coding sequence of similar size - instead of the 5-LO cds led to a loss of the calcitriol / TGFβ effect (pN10LTA4Hcds 1-fold induction). Therewith, it was proven that the presence of the 5-LO cds is crucial for the upregulating effect of calcitriol / TGFβ on 5-LO mRNA level. Cloning of the SV40 promoter instead of pN10 upstream of the 5-LO cds still showed inducibility by treatment with the inducers which argues for a promoter unspecific effect. Insertion of the 5-LO cds in a promoterless basic vector (pGL3cds) displayed same inductions by calcitriol / TGFβ treatment as the 5-LO promoter 5-LO cds construct (pN10cds). Thus, the effect of the inducers is not dependent on the 5-LO promoter under the in vitro conditions of the reporter gene assay. Hence, further cloning was done with promoterless constructs. Through 5-LO cds deletion constructs a positive regulating region in exon 10 to 14 was discovered. To adapt the natural gene context the last four introns (J-M) of the 5-LO gene were inserted in a promoterless construct containing exon 10 to 14 (pGL3cdsΔABInJM). 5end deletion constructs of it revealed putative vitamin D responsive elements (VDREs) in exon 12 and intron M. Mutation of the putative VDREs led to a reduced calcitriol effect –more prominent when the putative VDRE in intron M was mutated (reduction of 40%). Moreover another putative VDRE in exon 10 with an adjacent SMAD binding element (SBE) was detected. SMAD proteins are effector proteins of TGFβ signalling. Gelshift experiments demonstrated in vitro binding of the VDR-RXR heterodimer to those three putative VDREs. By chromatin immunoprecipitation (ChIP) assay in vivo binding of VDR and RXR was shown to the VDRE in the region of exon 10, exon 12 and intron M. 8h and 24h incubation with calcitriol / TGFβ resulted in enhanced expression of VDR in each of the examined regions. The VDR is able to bind to the VDRE without its ligand, whereas this goes along with corepressor recruitment and thus the VDR has a repressive effect on transcription. Histone H4 acetylation was increased when MM6 cells were treated for 8h or 24h with calcitriol or the combination of calcitriol / TGFβ. This finding implies that at that point of time corepressors associated with the VDR are replaced by coactivators. It seems convincing that 5-LO transcription is mainly promoted by calcitriol alone which leads to a more accessible chromatin structure. Previous data indicated that calcitriol and TGFβ upregulate 5-LO RNA maturation and 5- LO transcript elongation. Thus several elongation markers were investigated by ChIP analysis: Histone H3 lysine 36 (H3K36) trimethylation and H4K20 monomethylation were detected in the analysed regions in exon 10, exon 12 and intron M. In region exon 10 the H3K36 trimethylation status was enhanced after 24h calcitriol or calcitriol / TGFβ treatment. An increased H4K20 monomethylation status in all regions was observed when MM6 cells were treated for 24h with calcitriol / TGFβ. 24h treatment with both agents also enhanced the recruitment of the elongation form of RNA polymerase II, which is phosphorylated at serine 2 of the carboxyterminal domain, to the investigated regions. These findings prove the positive regulating role for calcitriol and TGFβ on 5-LO transcript elongation. A putative mechanism of the effect of calcitriol and TGFβ on 5-LO RNA maturation might be the elevated phosphorylation of serine 2 of the RNA Polymerase II which is known to be followed by recruiting polyadenylating factors.
Beteiligung der Sphingosinkinasen 1 und 2 bei Zellwachstum und Apoptose in Nierenmesangiumzellen
(2009)
Seit einigen Jahren ist bekannt, dass Sphingolipide neben ihrer Funktion als Plasmamembranbestandteile auch als intra- und extrazelluläre Botenstoffe in zelluläre Signalwege eingreifen können. So haben das Lysosphingolipid S1P und sein Vorläufermolekül Ceramid wichtige regulatorische Funktionen in der Regulation von Zelltod- und wachstum. Dabei agiert Ceramid als proapoptotisches und wachstumshemmendes Lipid, während S1P zellprotektive und wachstumfördernde Funktionen in der Zelle hat und dadurch als „Gegenspieler“ von Ceramid wirkt. Durch die zwei Enzymklassen der Ceramidasen und Sphingosinkinasen wird in der Zelle ein sogenanntes „Sphingolipid-Gleichgewicht“ durch die stete Interkonvertierbarkeit der Lipide aufrechterhalten. Das zu einem bestimmten Zeitpunkt in seiner Konzentration dominierende Sphingolipid entscheidet so über das Schicksal der Zelle, ob es zum Zelltod oder zum Wachstum kommt. In dieser Arbeit wurde die Beteiligung der beiden Sphingosinkinasen 1 und 2 bei Zellwachstum und Apoptose in Nierenmesangiumzellen untersucht. Dafür wurden aus SK1(-/-)- und SK2(-/-)-Mäusen Mesangiumzellen isoliert. Obwohl beide Sphingosinkinasen dasselbe Produkt S1P generieren, zeigen die beiden „knock-out“-Zelllinien unterschiedliches Apoptose- und Wachstumsverhalten. In einem ersten Kapitel wurde gezeigt, dass eine Depletion der SK1 in einer Desensitivierung der Mesangiumzellen gegenüber dem apoptotischen Stimulus Staurosporin und in einer drastischen Wachstumsverlangsamung im Vergleich zu den Wt-Zellen resultierte. Im Gegensatz dazu führte eine Depletion der SK2 zu einem Schutz vor Apoptose und zu einer erhöhten Wachstumsrate. In einem zweiten Kapitel wurden mögliche molekulare Mechanismen untersucht, die für diese gegensätzlichen Zellantworten verantwortlich sind. Nachdem eine vermehrte Prozessierung der Caspase 3 in SK1(-/-)-Zellen und eine verminderte Prozessierung in SK2(-/-)- Zellen festgestellt wurde, ergaben weitere Westernblot-Analysen eine Beteiligung der beiden Signalkaskaden PKB/Bad sowie MEK/ERK1/2 im Apoptosemechanismus der Mausmesangiumzellen. SK1(-/-)-Zellen zeigen eine verminderte Phosphorylierungsrate der involvierten Enzyme PKB, MEK1/2 und ERK1/2, wohingegen die Signalkaskaden von SK2(-/-) durch vermehrte Phosphorylierung dieser Kinasen konstitutiv aktiviert sind. Daneben scheint auch der antiapoptotische Faktor Bcl-xL am Vorgang der mesangialen Apoptose beteiligt. Eine Depletion der SK1 führt zu einer reduzierten Bcl-xL-Proteinexpression, wohingegen SK2(-/-)- Zellen eine drastisch erhöhte Expressionsrate dieses antiapoptotischen Faktors aufweisen. Als zentraler Regulator des Zellwachstums zeigt sich das Retinoblastoma-Protein (Rb) in den SK1(-/-)- und SK2(-/-)-Zellen antagonistisch reguliert. Während keine basale Phosphorylierung des Proteins in SK1(-/-)-Zellen gefunden werden konnte, ist Rb in SK2(-/-)-Zellen hyperphosphoryliert. Anschliessend konnte in SK1(-/-)- und SK2(-/-)-Zelle eine Beteiligung von weiteren zellzyklus-regulierenden Enzymen, die Rb-Protein vorgeschaltet sind, gefunden werden. So ist die cyklinabhängige Kinase CDK6 in hyperproliferierenden SK2(-/-)-Zellen auf Proteinebene vermehrt exprimiert. SK1(-/-)-Zellen zeigen eine erhöhte Proteinexpression des Zellzyklushemmers p27. In einem dritten Kapitel konnte gezeigt werden, dass eine Depletion der SK2 auch in Mausfibroblasten, die aus der Lunge von SK2(-/-)-Mäusen isoliert worden waren, zu einer vermehrten DNA-Synthese führt; die Funktion des Enzyms scheint also nicht zellspezifisch zu sein. Ein viertes Kapitel machte deutlich, dass Mausmesangiumzellen, die eine humane Variante der SK1 überexprimieren, vor stimulusinduzierter Apoptose geschützt sind. Darüberhinaus ist die DNA-Synthese der hSK1-transgenen Mausmesangiumzellen im Vergleich zu Wt- Zellen erhöht. Zusammenfassend kann man sagen, dass die Sphingosinkinasen 1 und 2 in den primären Mausmesangiumzellen zelluläres Wachstum und Apoptose in entgegengesetzterweise regulieren: die SK1 wirkt mitogen und zellprotektiv, die SK2 hingegen wachstumshemmend und proapoptotisch
Neuropathische Schmerzen werden durch Läsionen im zentralen oder peripheren Nervensystem ausgelöst. Sie treten z.B. bei der diabetischen Polyneuropathie oder nach einem Bandscheibenvorfall auf und sind durch die Symptome Allodynie und Hyperalgesie gekennzeichnet. Bislang lassen sich neuropathische Schmerzen nur unzureichend behandeln, weshalb ein großer Bedarf an neuen, besser wirksamen und verträglicheren Arzneimitteln besteht. Die Voraussetzung für die Entwicklung neuer Arzneimittel ist die Erforschung der molekularen Mechanismen von Neuropathien. Im ersten Projekt dieser Dissertation sollten deshalb mit Hilfe der differenziellen Gelelektrophorese Proteine identifiziert werden, die nach Induktion neuropathischer Schmerzen im Lumbalmark von Ratten reguliert sind. Durch vergleichende Proteomanalyse konnte gezeigt werden, dass 55 Proteine 7 Tage nach Induktion neuropathischer Schmerzen im Lumbalmark der Ratte differenziell exprimiert werden. 54 Proteine zeigten ein verminderte, und ein Protein eine gesteigerte Expression im Modell der „spared nerve injury“ (SNI). Durch massenspektrometrische Analyse der Proteinspots konnten 38 Proteine eindeutig identifiziert werden. Einige dieser Proteine sind möglicherweise an zentralen Sensibilisierungsvorgängen beteiligt und könnten somit als neue Zielmoleküle für die Schmerztherapie fungieren. Die meisten der deregulierten Proteine stehen im Zusammenhang mit dem Energiestoffwechsel und dem zellulären Metabolismus. Aufgrund der verminderten Expression dieser Proteine deutet vieles darauf hin, dass es 7 Tage nach SNI auf spinaler Ebene zu degenerativen Prozessen wie z.B. dem Abbau der Myelinscheide kommt. Mit einer Reihe ausgewählter Proteine wurden zusätzlich Genexpressionsanalysen mittels RT-PCR durchgeführt. Die Ergebnisse zeigten, dass zahlreiche Proteine, die im DIGE Experiment auf Proteinebene eine reduzierte Expression aufwiesen, schon auf Transkriptionsebene reguliert sind. Einige Gene waren in ihrer mRNA-Expression jedoch nicht verändert, was ein Hinweis darauf ist, dass die beobachteten Regulationen auf translationale bzw. posttranslationale Modifikationen zurückzuführen sind. Eines der Proteine, welches aufgrund der peripheren Nervenläsion eine deutlich geringere spinale Expression zeigte, wurde anhand des Massenspektrums als Latexin identifiziert. Latexin ist ein Inhibitor der Carboxypeptidase A Aktivität und spielt bei der Schmerzweiterleitung und Schmerzverarbeitung eine Rolle. Darüber hinaus wurde der Abbau von Latexin in der Literatur mit der neurodegenerativen Erkrankung Morbus Alzheimer in Verbindung gebracht. In der vorliegenden Arbeit wurde die periphere und zentrale Expression von Latexin mit Hilfe verschiedener molekularbiologischer Methoden untersucht. Dabei zeigte sich, dass Latexin unter neuropathischen Bedingungen im Lumbalmark sowohl auf Transkriptionsebene, als auch auf Translationsebene signifikant reduziert vorliegt. Zusätzlich wurde mit Hilfe eines Aktivitätsassays nachgewiesen, dass eine verminderte Latexinexpression zu einer signifikanten Erhöhung der Carboxypeptidase-Aktivität führt. Im peripheren Nervensystem konnte im Gegensatz zum zentralen Nervensystem keine Modulation von Latexin beobachtet werden. Um die funktionelle Relevanz von Latexin bei neuropathischen Schmerzen zu charakterisieren, wurden am Ende der Dissertation rekombinante Adenoviren hergestellt, mit deren Hilfe eine spinale Latexinüberexpression erreicht werden sollte. Die dazugehörigen Tierversuche wurden erst nach Abschluss dieser Arbeit durchgeführt. Im Vorfeld dieser Arbeit wurden mit NF-kappaB p50 Knockout-Mäusen mehrere Schmerztests durchgeführt, die gezeigt haben, dass p50 Knockout-Mäuse im Vergleich zu Wildtyp-Tieren signifikant weniger akute und chronische Entzündungsschmerzen hatten. In einem zweiten Projekt sollte deshalb untersucht werden, welche molekularen Mechanismen dem verminderten Schmerzverhalten der Knockout Tiere zugrunde liegen. Anhand von RT-PCR Experimenten konnte gezeigt werden, dass das NF-kappaB abhängige, proinflammatorische Gen COX-2 8 Stunden nach Zymosaninjektion in eine Hinterpfote bei den Wildtyp-Tieren im Lumbalmark signifikant erhöht war, während bei den Knockout-Mäusen keine signifikante Veränderung zu beobachten war. Weiterhin wurden Änderungen der Proteinexpression und der Genexpression im Lumbalmark von NF-kappaB Knockout- und Wildtyp-Tieren mittels 2D-Gelelektrophorese bzw. RNA-Microarray untersucht. Beim Vergleich der Proteinexpressionsmuster zeigten sich bei 5 Proteinen Regulationen infolge der p50 Deletion, während mit Hilfe des RNA-Microarrays 7 differenziell exprimierte Gene identifiziert werden konnten, die auf das Fehlen der p50 Untereinheit zurückzuführen sind. Zusammenfassend lässt sich aus diesen Befunden schlussfolgern, dass die p50 Untereinheit des Transkriptionsfaktors NF-kappaB als Zielmolekül für die Therapie akuter und chronischer Entzündungsschmerzen geeignet sein könnte. Es wird vermutet, dass die p50 Untereinheit von NF-kappaB bei chronischen Entzündungsschmerzen auf zentraler Ebene an einer Aktivierung proinflammatorischer Stimuli beteiligt ist, während p50 bei akuten Schmerzen wahrscheinlich eine konstitutive Rolle spielt.
5-lipoxygenase (5-LO) is the key enzyme in the formation of inflammatory leukotrienes, which are mediators of inflammation and allergy. The 5-LO catalyses the oxidation of arachidonic acid to 5-HPETE and subsequently to LTA4. The leukotrienes are involved in the development and maintenance of inflammatory diseases, like asthma and allergic rhinitis. Additionally, 5-LO is overexpressed in some cancer types, although its relevance is still not fully understood. 5-LO expressing cells are B- lymphocytes and cells of myeloid origin like monocytes, macrophages and granulocytes. The 5-LO promoter lacks a TATA or CCAT box and covers two CpG islands. These are characteristics of a housekeeping gene, but as the 5-LO is not expressed ubiquitiously, the expression of the 5-LO is tightly regulated. Epigenetic mechanisms were known to be involved in the control of the 5-LO expression. The HDAC inhibitor TsA significantly induced the transcriptional activity of the 5-LO promoter in reporter gene assays as well as on 5-LO mRNA transcript level in MM6 cells. The GC-boxes GC4 and GC5 in the proximal 5-LO promoter were identified to be essential for the TsA effect, as deletion of these element led to an attenuated TsA effect in reporter gene assay. Recruitment of the transcription factors Sp1 and Sp3 and the RNA polymerase II to the 5-LO promoter was detectable after TsA treatment in MM6 cells by chromatin immunoprecipitation assays (ChIP), while the acetylation status of histone H4 remained unchanged. Likewise it is known that DNA methylation leads to silencing of 5-LO expression in-vitro and in-vivo. The 5-LO promoter is densely methylated in the cell line U937, but unmethylated in HL-60 cells and - elucidated in this study - also in MM6 cells. Reporter gene assays with in-vitro methylated 5-LO promoter containing plasmids revealed that the frequency of methylated CpGs is directly proportional to reduction of 5-LO promoter activity. Incubation of U937 cells with 5-AdC, an inhibitor of DNA methyltransferases, was able to reactivate 5-LO transcription and to demethylate CpG dinucleotides. In the first part of this study the mechanism of TsA induced promoter activation was further investigated. I elucidated the mechanism of Sp1 and Sp3 recruitment to the 5-LO promoter after TsA treatment. Immnoprecipitation assay was used to detect a transcription factor complex containing Sp1 or Sp3 interacting with HDAC proteins, which might change its composition after TsA treatment. Besides the posttranslational modifications of the transcription factors Sp1 and Sp3 after TsA treatment were investigated, potentially causing an increased interaction of the proteins with the 5-LO promoter. Both aspects and their response in HDAC inhibition have been described. TsA did not affect the composition of the Sp1/HDAC1/HDAC2 complex. Sp3 was not located in a complex with the HDAC enzymes. Acetylation of Sp1 and Sp3 was detectable, but no change occurred after TsA treatment. Since neither release of the transcription factors off a complex, nor alterations in posttranslational modifications of Sp1 and Sp3 are the reason for the increased Sp1 and Sp3 binding to the 5-LO promoter, I elucidated alterations in the chromatin structure. The acetylation status of the histone proteins H3 and H4, as well as the chromatin marks H3K4me3, representing active chromatin, and H3K9me, representative for repressive state, were investigated. Additionally, the time course of the TsA effect was determined on 5-LO mRNA level using real-time PCR. The acetylation status of the histone proteins on the 5-LO core promoter correlated with the basal 5-LO mRNA transcript expression in MM6, HL-60 and U937 cells. The highest 5-LO mRNA level was detectable in MM6 cells, followed by HL-60 cells. The lowest 5-LO mRNA level was detected in 5-LO promoter methylated U937 cells. The order of the basal 5-LO mRNA expression of the three cell lines correlates with the basal acetylation status of histone proteins H3 and H4. In MM6 cells the highest basal levels in acH3 and acH4 were detected, followed by HL-60 and U937 cells. Moreover, the data obtained in U937 cells revealed that the correlation between DNA methylation and histone hypoacetylation is alike on the 5-LO promoter. TsA treatment induced the 5-LO mRNA level in the three cell lines with different intensity: 5-LO mRNA level in MM6 cells was induced 11-fold, in HL-60 cells 6- fold and in U937 cells 4- fold. The histone acetylation and methylation levels on the 5-LO promoter after TsA incubation were investigated. No increase in acH3 and acH4, but in H3K4me3 was detectable in MM6 cells by ChIP assay. HL-60 cells showed an increase in acH3 and acH4 as well as in H3K4me3. H3K9me was only detectable in untreated U937 cells, but disappeared after TsA treatment, while acH3, acH4 and H3K4me3 increased constantly after TsA treatme nt. A strong correlation between the histone modifications and the time course of the mRNA expression was detectable in all three cell lines. The combination of the posttranslational modifications acH3, acH4 and H3K4me3 led to a fast effect in transcriptional activation and the maxima of acH3 and acH4 were usually associated with the maximum in 5-LO mRNA transcript level. An increase in H3K4me3 alone, as detected in MM6 cells, led to continuous increase in the 5-LO mRNA expression with a late maximum. Additionally, we detected a slight overall decrease in 5-LO promoter methylation in U937 cells after TsA treatment. This fact taken together with the observed histone modifications could explain the 4- fold response in 5-LO mRNA level to TsA treatment of the methylated cell line U937. Another aim of the present study was to identify the specific HDAC enzymes involved in the 5-LO promoter regulation. Reporter gene assays and real-time PCR with selective HDAC inhibitors revealed that HDACs of class I are involved in 5-LO promoter regulation, namely HDAC 1, 2 and 3. The influence of each of the enzymes seemed to depend on the cell type, as inhibition of HDACs 2, 3 strongly induced 5-LO promoter activity in reporter gene assay in HeLa cells, whereas in MM6 cells HDACs 1 and 2, 3 seemed to be responsible for the 5-LO promoter regulation, measured as 5-LO mRNA level. The HDACs of class IIa and class III are not involved in the regulation of 5-LO mRNA expression. The second part of this study investigated the influence of MBD proteins on the methylated 5-LO promoter and the 5-LO mRNA expression. ChIP assays revealed MBD1, 2 and MeCP2 protein binding to the proximal 5-LO promoter in U937 cells. MBD1 was detectable on the 5-LO promoter in unmethylated HL-60 cells, while no MBD protein was located on the 5-LO promoter in MM6 cells. To elucidate the functional role of the MBD proteins, stable knocked down of MBD proteins was established in U937 cells. 5-LO mRNA transcript level was determined in the knock down clones by real-time PCR. The 5-LO transcript level was increased in all knock down samples. MBD2 knock down clones showed the highest effect in activating 5-LO with a 3- and 4.4-fold increase in the 5-LO mRNA level, followed by MBD1 (3.5- fold) and MeCP2 (2.5-fold) knock down clones. A combined participation of these three enzymes in the corepression of the methylated 5-LO promoter is indicated. Taken together, the data reveal that epigenetic mechanisms are strongly involved in the regulation of 5-LO transcription and might function as a crucial control mechanism of 5-LO expression.
Nukleäre Rezeptoren regulieren eine Vielzahl von Genen durch Bindung an bestimmte DNA-Sequenzen im Promotor dieser Gene. Sie fungieren als Transkriptionsfaktoren, die nach Bindung ihres Ligandendie Transkription aktivieren oder supprimieren. In ihrer Funktion werden sie weiterhin durch verschiedene Signale moduliert, beispielsweise durch posttranslationale Veränderungen. Aufgrund der Möglichkeit, durch Liganden, in der Regel kleine lipophile Moleküle, die Aktivität nukleärer Rezeptoren und in der Folge die Transkription definierter Gene zu beeinflussen, sind nukleäre Rezeptoren gute Zielstrukturen für Arzneistoffe und stehen im Zentrum intensiver Forschungsbemühungen. ROR alpha und RevErb alpha sind nukleäre Rezeptoren aus der Gruppe der sogenannten Orphan-Rezeptoren. Die Angehörigen dieser Gruppe wurden als Waisen bezeichnet, da ihr Ligand zum Zeitpunkt ihrer Charakterisierung unbekannt war. 2007 gelang es zwei Gruppen unabhängig voneinander Häm als den Liganden des RevErb alpha zu identifizieren, für ROR alpha werden verschiedene potentielle Liganden diskutiert, wobei bisher keiner allgemein anerkannt wurde. ROR alpha und RevErb alpha steuern die Expression ihrer Zielgene über ein gemeinsames Response-Element, wobei ROR alpha die Expression dieser Gene aktiviert und RevErb alpha sie inhibiert. Gemeinsam nehmen sie eine zentrale Rolle in der Aufrechterhaltung zirkadianer Rhythmen und an der Integration dieser in metabolische Prozesse ein. ROR alpha ist weiterhin beteiligt an der Reifung der Cerebellums sowie an der Steuerung der Immunabwehr. Ziel der vorliegenden Arbeit war es, die Regulation der beiden Rezeptoren auf molekularer Ebene aufzuklären. Hierfür wurden Untersuchungen auf Ebene der Transkription ebenso wie auf posttranslationaler Ebene durchgeführt. Es zeigte sich, dass ROR alpha - hnRNA in vitro extrem stabile Sekundärstrukturen ausbildet und somit bei der reversen Transkription den Transkriptionsstart selbst initiieren kann. Im Zuge der durchgeführten Untersuchungen konnte nicht nachgewiesen werden, welche Auswirkung diese Sekundärstrukturen in vivo zeigen. Studien anderer Gruppen hatten aber gezeigt, dass die Ausbildung von RNA-Doppelsträngen an vielen Stellen in die Regulationen von Genen eingreift, sei es durch Veränderungen des Spleißmusters, RNA-Editierung oder durch Herabregulierung der Transkriptmenge. Des Weiteren konnte gezeigt werden, dass sowohl RevErb alpha als auch ROR alpha einer intensiven Regulation durch posttranslationale Veränderungen unterliegen, im Speziellen durch Phosphorylierung. Vorangegangene Studien hatten Hinweisegeliefert, dass ROR alpha durch ERK-2 phosphoryliert werden kann. In meinen Studien war ich in der Lage nachzuweisen, dass auch RevErb alpha Ziel dieser Kinase ist. Im Gegensatz zu ROR alpha wird RevErb alpha jedoch gleichzeitig an mehreren Stellen phosphoryliert, wobei die physiologische Funktion dieser Phosphorylierungen Gegenstand weiterer Untersuchungen ist. Die Aktivität von ROR alpha am Response-Element wird durch eine Erhöhung des intrazellulären cAMP-Spiegels stark stimuliert. Im Zuge meiner Untersuchungen konnte eine Beteiligung sowohl des cAMP-Response-Elementbindenden Proteins CREBals auch des PPAR gamma - Coaktivators 1a an der Vermittlung dieser Aktivitätssteigerung ausgeschlossen werden. Es zeigte sich jedoch, dass der Effekt durch eine Hemmung der Proteinkinase A dosisabhängig aufgehoben werden konnte. In weiteren Untersuchen konnte ich eine direkte Phosphorylierung von ROR alpha, nicht aber von RevErb alpha durch PKA nachweisen und die Phosphorylierungsstelle als Serin 99 des ROR alpha 4 identifizieren. Da eine Mutation der in der C-terminalen Verlängerung der DNA-bindenden Domäne des Rezeptors gelegenen Aminosäure jedoch nicht in der Lage war, die Aktivitätssteigerung zu verhindern, sind auch noch weitere Faktoren, vermutlich zelluläre Coaktivatoren an deren Vermittlung beteiligt. Bereits in früheren Untersuchungen war beschrieben worden, dass die Aktivität von ROR alpha durch eine Erhöhung des intrazellulären Calciumspiegels stark stimuliert wird. Weiterhin fanden sich Hinweise, dass die Calcium/-Calmodulin-abhängige Kinase IV an der Vermittlung dieser Stimulation beteiligt ist, jedoch ohne direkte Phosphorylierung von ROR alpha durch CaMKIV. Es konnte allerdings nicht aufgeklärt werden, über welchen Mechanismus die Signaltransduktion stattdessen erfolgt. In meinen Untersuchungen konnte ich zeigen, dass eine Inhibition durch Proteinkinase A aktivierter Signalwege auch die Aktivierung von ROR alpha durch CaMKIV dosisabhängig hemmte. Zusammengenommen lieferten meine Untersuchungen weitere Hinweise auf eine wichtige Rolle von ROR alpha in der Regulation metabolischer Prozesse wie des Glycogen- und Lipidstoffwechsels. Außerdem deuten meine Ergebnisse auf eine Verknüpfung der Signalwege von CaMKIV und Proteinkinase A hin und etablieren ROR alpha als gemeinsame Zielstruktur
Der L-Carnitin/gamma-Butyrobetain Antiporter CaiT ist ein Mitglied der Betain/Carnitin/Cholin Transporter (BCCT) Familie. Sekundärtransporter der BCCT Familie transportieren Substrate, die eine positiv-geladene quartäre Ammoniumgruppe besitzen. CaiT besteht aus 504 Amiosäuren und besitzt ein moleculares Gewicht von etwa 56 kDa. In Enterobakterien wie Escherichia coli, Proteus mirabilis und Salmonella typhimurium wird die Expression des caiTABCDE Operons unter anaeroben Bedingungen induziert. Unter diesen Bedinungen ist CaiT der Haupttransporter des Betain-Derivates L-Carnitin. In Enterobakterien wird L-Carnitin unter anaeroben Bedingungen aufgenommen und dehydratisiert wobei Crotonobetain ensteht. Crotonobetain wird anschließend zum Endprodukt gamma-Butyrobetain reduziert. Gamma-Butyrobetain ist das Gegensubstrat, das aus der Zelle hinaustransportiert wird, wenn L-Carnitin in die Zelle aufgenommen wird. Der Austauschmechanismus von LCarnitin gegen gamma-Butyrobetain geschieht ohne das Vorhandensein eines elektrochemischen Gradients, d.h. CaiT ist sowohl H+- als auch Na+-unabhängig. Ein Ziel dieser Arbeit war es die drei-dimensionale (3D) Struktur von CaiT mittels Röntgenstrukturanalyse zu lösen. Weiterhin sollten mit Hilfe der 3D-Struktur und funktionellen Studien detailiertere Erkenntnisse über den kationenunabhängigen Antiportmechanismus von CaiT ermittelt werden. Im Rahmen dieser Arbeit wurden die 3D-Röntgenkristallstrukturen von drei CaiT-Homologen der Enterobakterien P. mirabilis (PmCaiT), E. coli (EcCaiT) und S. typhimurium (StCaiT) mittels molekularem Ersatz (engl.: molecular replacement, MR) mit einem Alanin-Model des CaiT verwandten Na+/Glycinbetain Symporters BetP gelöst. PmCaiT konnte mit einer Auflösung von 2.3 Å gelöst werden. Das Protein kristallisierte in der Kristallraumgruppe H3, mit drei Molekülen in der asymmetrischen Einheit (engl.: asymmetric unit, AU). Die drei PmCaiT-Moleküle ordneten sich innerhalb der AU um eine kristallographische dreifach Symmetrieachse an. EcCaiT wurde mittels MR mit einem Alanin-Model von PmCaiT bei einer Auflösung von 3.5 Å gelöst. EcCaiT kristallisierte in der Kristallraumgruppe P32, ebenfalls mit drei Molekülen in der AU, jedoch ohne kristallographische Symmetry. Während der Verfeinerung des EcCaiT-Models wurde eine strenge dreifache nichtkristallographische Symmetry (engl.: non-crystallographic symmetry, NCS) angewandt. StCaiT, das ebenfalls mittels MR mit einem Alanin-Model von PmCaiT, aber bei einer Auflösung von 4.0 Å gelöst wurde, kristallisierte in der Kristallraumgruppe P65, ebenfalls mit drei StCaiT-Molekülen in der AU, ohne kristallographische Symmetry. Bei der Verfeinerung des StCaiT-Modells wurde wie bei EcCaiT eine strenge NCS angewandt. Da die Auflösung von 4.0 Å bei StCaiT zu niedrig ist um detailierte moleculare Erkenntnisse zu gewinnen, wurden Protein- sowie Substratinteraktionen nur an den Strukturen von PmCaiT und EcCaiT analysiert. Alle drei CaiT-Homologe weisen jedoch einen ähnlichen strukturellen Aufbau auf. In der Röntgenkristallstruktur bildet CaiT ein symmetrisches Trimer, das über ionische und polare Wechselwirkungen zwischen den Protomeren stabilisiert wird. Der trimere Oligomerisierungszustand von CaiT in Detergenzlösung sowie in zweidimensionalen Lipidmembrankristallen wurde bereits in früheren Arbeiten gezeigt. Jedes der drei CaiT-Protomere besteht aus zwölf Transmembranhelices (TMH), die N- und C-terminalen Domänen des Proteins befinden sich auf der cytoplasmatischen Seite. Zehn der TMH bilden zwei invertierte Wiederholungseinheiten aus jeweils fünf TMH. Die erste Einheit besteht aus den TMH 3 – 7, die invertierte zweite Einheit besteht aus den TMH 8 – 12. Beide Wiederholungseinheiten sind strukturell nahezu identisch und lassen sich fast vollständig übereinanderlegen, jedoch weisen die Aminosäuren der beiden Einheiten keine signifikante Sequenzidentität auf. Die ersten beiden Helices der Wiederholungseinheiten, die TMH 3 – 4 und die TMH 8 – 9, bilden ein antiparalleles vier-Helix-Bündel, in dem in CaiT zwei Substratbindestellen lokalisiert sind. Eine derartige Transporterarchitektur wurde erstmals in der Struktur des Na+/Alanin Symporters LeuTAa des thermophilen Bakteriums Aquifex aeolicus gezeigt. Bislang wurden, inklusive CaiT, sieben Sekundärtransporterstrukturen gelöst, die diese LeuT-Transporterarchitektur aufweisen. Ungewöhnlich dabei ist, dass diese sieben Sekundärtransporter fünf verschiedenen Transporterfamilien angehören und eine Verwandschaft auf Basis der Aminosäuren nicht zu finden ist. Da jedoch die tertiäre Struktur dieser Tansporter konserviert ist, kann davon ausgegangen werden, dass sie alle von einem Urprotein entstanden sind, welches zunächst aus fünf TMH bestanden haben muss. Im Laufe der Evolution hat sich das Urgen des Urproteins zunächst dupliziert und die weitere Evolution hat zwar die Aminosäuresequenz verändert und den Umweltbedingungen angepasst, jedoch ist die tertiäre Struktur erhalten geblieben. Da sich die tertiäre Struktur der sieben Sekundärtransporter so stark ähnelt, ist zu vermuten, dass auch der Transportmechanismus ähnlich, jedoch nicht identisch ist. Nach dem strukturellen Aufbau der Transporter, der Lage der Substratbindestellen in den jeweiligen Transportern und der Tatsache, dass es sich bei diesen Proteinen um Membranproteine handelt, wurde ein Transportmechanismus aufgestellt, in dem die Bindestelle des zu transportierende Substrats alternierend zu beiden Seiten der Membran zugänglich ist, ohne jedoch jemals den Substratweg innerhalb des Proteins vollständig zu öffnen. Dieser Mechanismus wurde als “alternating access mechanism” beschrieben. Anhand der unterschiedlichen Zustände, in denen einige der Transporter kristallisierten, kann abgeleitet werden, welche Konformationsänderungen erforderlich sind um das Substrat von einer Seiter der Membran auf die andere zu transportieren. Bisher kristallisierten einzelne der sechs Transporter in der nach außen gerichteten offenen Form, der nach außen gerichteten Form, in der die Substratbindestelle jedoch nicht mehr zugänglich ist, in einer Form, die keine Öffnungspräferenz der Substratbindestelle zu einer Seite der Membran hat und in der nach innen gerichteten Form, in der die Substratbindestelle jedoch nicht geöffnet ist. CaiT kristallisierte in der noch fehlenden Konformation, der nach innen gerichteten Form, in der die Substratbindestelle zugänglich ist. Mit dieser noch fehlenend Konformation kann der Transportzyklus des “alternating access mechanism” vollständig beschrieben werden. Alle drei CaiT-Homologe kristallisierten in der nach innen gerichteten, offenen Konformation. Im Gegensatz zur EcCaiT-Struktur kristallisierte PmCaiT in der substratungebundenen Form. In der StCaiT-Struktur konnte aufgrund der niedrigen Auflösung kein Substrat nachgewiesen werden. In der EcCaiT-Struktur sind zwei gamma-Butyrobetain-Moleküle gebunden. Das erste Molekül wurde in der zentralen Substratbindestelle, der sogenannten Tryptophan-Box bestehend aus vier Tryptophanen, im Zentrum des Protein lokalisiert. Das zweite gamma-Butyrobetain-Molekül wurde in einer Vertiefung an der extrazellulären Proteinoberfläche gefunden. Beide Substrate werden hauptsächlich über Kation-Pi-Interaktionen zwischen der positiv geladenen quatären Ammoniumgruppe des Substrats und des Pi-Elektronensystems der Tryptophane in den jeweiligen Bindestellen gebunden. Eine besondere Eigenschaft von CaiT ist der H+- bzw. Na+-unabhängige Substrattransport. Die CaiT-Struktur erklärt warum kein zusätzliches Kation benötigt wird um Substrat zu binden oder zu transportieren. In der EcCaiT-Struktur ist eine wichtige polare nicht-bindende Interaktion zwischen der Carboxylgruppe des gamma-Butyrobetains und dem Schwefelatom eines Methionins in der zentrale Bindestelle zu erkennen. Dieses Methionin ist konserviert in den prokaryotischen CaiTs und in den Na+-unabhängigen eukaryotischen L-Carnitin Transportern (OCTN), jedoch ist es nicht konserviert im Na+-abhängigen verwandten Glycinbetain Transporter BetP. In BetP ist diese Position des Methionins durch ein Valin ersetzt. Die Mutation des Methionins in CaiT zu Valin ermöglicht zwar immernoch die H+- bzw. Na+-unabhängige Bindung des Substrates durch die Tryptophan-Box, jedoch ist der Substrattransport nahezu vollständig zerstört. Eine derart wichtige Substratkoordinierende Funktion des Schwefelatoms eines Methionins wurde bisher nicht beschrieben. Eine weitere Stelle, die in H+- bzw. Na+-abhängigen Transporter mit H+ bzw. Na+ besetzt ist, ist in CaiT von einem positiv geladenen Arginin eingenommen. Eine positive Ladung an dieser Stelle stabilisiert den Bereich im Protein in der Nähe der zentralen Substratbindestelle. Die Mutation des Arginins zu Glutamat in CaiT erzielt eine vollständige Inaktivierung des Substrattansports. Durch Zugabe von Na+ im Transportansatz kann die Substrattransportaktivität der Glutamat-Mutante jedoch teilweise zurückerlangt werden. Diese eben beschriebenen Aminosäurereste in den beiden Stellen des Proteins erklären die Kationenunabhängigkeit von CaiT. Die Aktivierung des Antiportmechanismus in CaiT wurde mit Hilfe von Bindungsstudien an rekonstituiertem Protein ermittelt. Diese Messungen ergaben für das Wildtypprotein ein sigmoidales Substratbindungsverhalten, was auf ein positiv-kooperatives Bindungsverhalten hindeutet. Die beiden Substratbindestellen im Protein sowie die beiden unterschiedlichen Substrate, L-Carnitin und gamma-Butyrobetain, lassen auf einen heterotropen positiv-kooperativen Bindungs- und einen allosterisch regulierten Transportmechanismus schließen. Bei diesem Mechanismus erhöht die Bindung eines Substrats in der regulatorischen Bindestelle durch induzierte Konformationsänderungen die Affinität eines anderen Substrats in einer weiteren Substratbindestelle. Die regulatorische Bindestelle in CaiT befindet sich an der extrazellulären Proteinoberfläche. Eine Schwächung der Substrataffinität in dieser Bindestelle durch Einführung einer Mutation, verstärkt das sigmoidale Substratbindungsverhalten und hat einen negativen Einfluss auf den Substrattransport. Durch die in dieser Arbeit gelösten 3D-Röntgenkristallstrukturen der zwei CaiT-Homologen, PmCaiT und EcCaiT, sowie den durchgeführten funktionellen Studien sowohl an Wildtypprotein wie auch an Mutanten konnte ein L-Carnitin/gamma-Butyrobetain Antiport-Mechanismus für CaiT vorzuschlagen werden.
Leukotrienes (LTs) are pro-inflammatory lipid mediators that belong to the group of eicosanoids, which are oxygenated metabolites of one common precursor, the aracidonic acid (AA). This polyunsaturated fatty acid is esterified at the sn-2 position of cellular membrane phospholipids and can be released by cytosolic phospholipase A2 alpha (cPLA2alpha) enzymatic deacylation. AA can be converted into LTs by the catalytic reaction of 5-lipoxygenase (5-LO). Enzymatic activation of cPLA2alpha as well as of 5-LO is regulated by similar determinants. In response to cellular stimuli that elevate the intracellular Ca2+ level and/or activate MAP kinase pathways, cPLA2alpha and 5-LO comigrate from a soluble cell compartment (mainly the cytosol) to the nuclear membrane, where AA is released und converted into LTs. LTs play a significant role in promoting inflammatory reactions and immune processes. They have been shown to be released from leukocytes in response to bacterial and viral infections and substantially contribute to an effective immune reaction for host defense. Innate immune pathogen recognition is mediated to a substantial part by the Toll-like receptor (TLR) family. So far, 10 human TLR subtypes have been identified, all of which detect distinct highly conserved microbial structures and trigger the induction of signaling pathways that lead to the expression of numerous immune and inflammatory genes. TLR signaling culminates in the activation NF-kappaB and/or MAP kinases, which as well are known to be involved in the regulation of cellular LT biosynthesis. In this regard, it seemed conceivable that the release of LTs might be regulated by TLR activation. Present studies were undertaken in order to verify and characterize a possible influence of TLR activation on the LT biosynthesis, and furthermore to identify the involved signaling pathways and underlying mechanisms. First experiments revealed that pre-incubation of differentiated Mono Mac 6 (MM6) cells with a TLR4 ligand, a TLR5 ligand, as well as with different TLR2 ligands led to an about 2-fold enhancement of Ca2+ ionophore induced LT biosynthesis. Ligands of other TLR subtypes did not show any influence. These observations could also be confirmed in primary human monocytes stimulated with ionophore or fMLP. With focus on TLR2 ligands, further studies were carried out to characterize the observed enhancement of LT biosynthesis in MM6 cells. It was demonstrated that the extent of LT formation was dependent on the ligand concentration used, but was also dependent on the duration of pre-incubation. Ligand pre-incubation of 15 minutes was optimal to maximally enhance LT formation and further prolongation of pre-incubation decreased LT formation again. Moreover, simultaneous addition of TLR2 ligands with ionophore did also not enhance LT formation. These results indicated that TLR2 ligands seemed to prime human monocytes for an enhanced response upon ionophore stimulation, but did not act as costimuli, which per se were not capable of directly stimulating the biosynthesis of LTs. To analyze the underlying mechanism, the impact of TLR2 ligands on the two key enzymes of the LT biosynthesis pathway, cPLA2alpha and 5-LO, was investigated. In this regard, 5-LO could not been shown to be positively regulated by TLR ligand priming. Neither a direct stimulation, nor an enhancement of 5-LO activity by TLR ligands was detectable in MM6 cells. Similarly, TLR2 ligands did also not enhance ionophore induced 5-LO translocation to the nuclear membrane. However, it was shown that TLR2 ligands enhanced ionophore induced release of AA in MM6 cells, which occurred with a similar time course as LT formation, displaying a maximum at 10 minutes of pre-incubation. A direct stimulation of AA release, however, could not been detected. Inhibitor studies revealed cPLA2alpha to be essential for AA release in TLR2 ligand primed, ionophore stimulated MM6 cells, but also sPLA2 was found to be involved. However, the priming effect of TLR2 ligands was mediated exclusively by cPLA2alpha. Western Blot analyses revealed that p38 MAP kinase, as well as ERK1/2, are activated in MM6 cells in response to TLR2 ligands, and also Ser-505 phosphorylation of cPLA2alpha was detected, which is known to be mediated by MAP kinases and to increase cPLA2alpha activity in vitro. Maximal cPLA2alpha phosphorylation occurred after 5-10 minutes of TLR2 ligand incubation, slightly preceding maximal AA release at 10 minutes and maximal LT formation at 15 minutes of priming. The combined use of a specific p38 MAPK inhibitor with an inhibitor of the ERK1/2 signaling pathway resulted in a complete prevention of cPLA2alpha phosphorylation and TLR2 ligand mediated enhancement of AA release. Thus, both MAPK pathways seem to play a role for TLR2 ligand mediated priming effects on the release of AA. An impact of other kinases such as Mnk-1 and CamKII, which can also regulate cPLA2alpha by phosphorylation, was excluded. Finally, an anti-hTLR2 antibody significantly reduced enhanced AA release, confirming the priming effects to be dependent on TLR2 activation. In summary, it was concluded that the increase of LT biosynthesis by TLR2 ligand priming is considerably due to an enhanced cellular AA supply, which arises from a MAPK mediated phosphorylation and up-regulation of cPLA2alpha. TLR dependent enhancement of LT biosynthesis represents an interesting link between activation of innate immune receptors and the rapid formation of pro-inflammatory lipid mediators. On the one hand, this support the role of LTs in host defence and infectious diseases, but may also be relevant in pathophysiological processes, which involve TLRs as well as LTs, as it has been shown for the pathogenesis of atherosclerosis or allergic diseases.
Durch anhaltende Entzündungsvorgänge oder Nervenläsionen kommt es zu einem vermehrten nozizeptiven Einstrom ins Rückenmark, was lang anhaltende Sensibilisierungsvorgänge an den zentralen Synapsen zur Folge hat. Auf molekularer Ebene kommt es dabei zur Regulation verschiedenster Proteinsynthesen. Diese plastischen Veränderungen im Zellstoffwechsel der Hinterhornneurone können eine Chronifizierung der zentralen Vorgänge bewirken. In der vorliegenden Arbeit wurden mittels vergleichender Proteomanalyse Proteine identifiziert, die aufgrund chronischer Entzündungsschmerzen und neuropathischer Schmerzen im Lumbalmark reguliert werden. In Folge einer durch Zymosan induzierten Pfotenentzündung konnten mittels 2D-Gelelektrophorese des Lumbalmarks der Ratte bei neun Proteinspots eine Regulation festgestellt werden. Diese Proteine sind möglicherweise an Mechanismen der zentralen Sensibilisierung in Hinterhornneuronen beteiligt und könnten als innovative Therapieansatzpunkte von Bedeutung sein. Ein Zusammenhang zwischen den identifizierten Proteinen und Mechanismen der Schmerzentstehung und -verarbeitung wurde bislang nicht beschrieben. Eines der Proteine, bei dem es zu einem deutlichen zeitabhängigen Abbau nach Zymosaninjektion kam, wurde massenspektrometrisch als Neurofilament light (NF-L) identifiziert. NF-L spielt insbesondere für die strukturelle Stabilität der Neurone und den axoplasmatischen Transport eine wichtige Rolle. Ein Abbau von Neurofilamenten im Rahmen von neurodegenerativen Erkrankungen wurde bereits mehrfach beschrieben. Für die Degradierung von NF-L wird hierbei hauptsächlich die Protease Calpain verantwortlich gemacht. In der vorliegenden Arbeit wurde eine Aktivierung von Calpain nach Zymosaninjektion sowohl im Lumbalmark als auch im entzündeten Pfotengewebe nachgewiesen. Der entzündungsassoziierte Abbau von NF-L im Rückenmark und den Hinterwurzelganglien konnte durch die einmalige Verabreichung eines spezifischen Inhibitors von Calpain verhindert werden. Eine Vorbehandlung der Tiere mit dem Calpain Inhibitor zeigte darüber hinaus antiinflammatorische und antihyperalgetische Effekte im Entzündungsmodell. Die antinozizeptive Wirkung des Inhibitors war dabei unabhängig davon, ob die Substanz systemisch (i.p.) oder am Rückenmark (peridural) appliziert wurde. Zusammenfassend zeigen die bisher genannten Ergebnisse, dass die Hemmung einer pathophysiologischen Aktivierung von Calpain ein neues, bislang nicht beschriebenes Wirkprinzip zur Behandlung von Schmerzen und Entzündungen darstellen könnte. In einem weiteren Teil der Arbeit wurde das Protein Aldose Reduktase (AR), das ebenfalls nach Induktion einer peripheren Entzündung reguliert wurde, näher beleuchtet. Bislang wurde die AR vorwiegend mit der Entstehung diabetischer Spätschäden in Verbindung gebracht. Im Proteinmuster des Lumbalmarks zeigte sich dieses Protein durch zwei verschiedene Spots, wobei nach der Zymosaninjektion eine Verschiebung in der Intensität zwischen diesen beiden Varianten der AR beobachtet wurde. Da die AR nach der Entzündungsinduktion weder auf Transkriptions- noch auf Translationsebene reguliert wurde, ist von einer posttranslationalen Modifikation des Proteins auszugehen, wobei eine Phosphorylierung naheliegend erscheint. In Zellkulturexperimenten wurde gezeigt, dass die AR nach einer Stimulation der transfizierten Zellen mit proinflammatorischen Zytokinen abgebaut wird, wobei hierfür eine Aktivierung des Proteasoms verantwortlich zu sein scheint. Eine Hemmung des Abbaus konnte dabei nicht nur durch einen Proteasominhibitor sondern zum Teil auch durch Dexamethason erzielt werden. Die AR scheint daher bei Entzündungsprozessen auf verschiedene Arten reguliert zu werden. Weiterhin wurden Änderungen im Lumbalmark nach Induktion von neuropathischen Schmerzen proteomanalytisch untersucht. Beim Vergleich der Proteinexpressionsmuster zeigten sich bei vier Proteinen Regulationen infolge der Nervenläsion. Keines dieser Proteine wurde bislang mit neuropathischen Schmerzen in Verbindung gebracht. Eines der identifizierten Proteine, alpha-Crystallin, wurde sowohl bei neuropathischem Schmerz als auch bei chronischem Entzündungsschmerz herunterreguliert. Dieses Protein scheint daher mit beiden dieser chronischen Schmerzzustände korreliert zu sein. Die ansonsten beobachteten Änderungen waren jedoch spezifisch für das jeweilige Schmerzmodell, so dass davon ausgegangen werden kann, dass deutliche Unterschiede in den spinalen Sensibilisierungsvorgängen infolge einer Entzündung oder einer Nervenläsion bestehen. Mit der Identifizierung und Charakterisierung von schmerz- und entzündungsassoziierten Proteinen im Rahmen dieser Arbeit wurde ein Beitrag zur Aufklärung bislang unbekannter Mechanismen der zentralen Sensibilisierung geleistet. Diese Erkenntnisse könnten in der Zukunft als Grundlage zur Entwicklung innovativer Therapieansätze für die Schmerztherapie genutzt werden.
The retinoic acid related orphan receptor alpha (RORalpha) regulates the expression of various target genes by binding to specific response elements in their promoter region. RORalpha is an interesting pharmaceutical target since it positively affects several pathophysiological processes of clinical relevance. RORalpha enhances the expression of Apo-AI protein, the major constituent of HDL, which is responsible for the cholesterol transportation. RORalpha notably contributes to the bone mineralization and generation of the extracellular bone matrix, demonstrating its involvement in osteoporosis, and by up-regulating the gene for IKBalpha, RORalpha has anti-inflammatory effects. Moreover, RORalpha is necessary for cerebellar development and the maintenance of the mammalian day-night periodicity governed by the core-clock within the suprachiasmatic nuclei. RORalpha receptors have been reported to bind cholesterol, melatonin, or to function ligand-independent. By monomeric binding to the recognition motif AGGTCA preceded by an A/T-rich sequence (ROR response element, RORE), RORalpha constitutively activates gene transcription. However, RORalpha activity is passively suppressed by its opponents RevErbalpha and RevErbbeta, which both bind to the same target sequence. ...
Die Rho-Kinase gehört zur Familie der Serin/Threonin Kinasen und wird durch verschiedene vasoaktive Mediatoren, wie Katecholamine, UII, Thromboxan und Serotonin aktiviert. Sie spielt eine Schlüsselrolle in der Gefäßkontraktion des glatten Muskels. Die Rho-Kinase induzierte Kontraktion ist in allen Gefäßbetten der verschiedenen untersuchten Tierspezies (Ratte, Maus, Kaninchen, Schwein) induzierbar und durch selektive Rho-Kinase Inhibitoren konzentrationsabhängig hemmbar. Die Rho-Kinase Inhibitoren induzieren in vitro eine Gefäßrelaxation und führen in vivo zu einer Blutdrucksenkung. In akuten invasiven Blutdruckmessungen und chronischen telemetrischen Untersuchungen wurde für Rho-Kinase Inhibitoren eine Senkung des peripheren arteriellen Blutdrucks nachgewiesen. Der vasorelaxierende Effekt von Rho-Kinase Inhibitoren in vitro und in vivo ist gleichermaßen in normotensiven und hypertensiven Tiermodellen messbar und hängt nicht von der Endothelfunktion ab. Es wurden keine Unterschiede in der Sensitivität gegenüber Rho-Kinase Inhibitoren zwischen hypertensiven Tieren und normotensiven Tieren gemessen. In der Proteinexpressionsanalyse zeigte sich eine tendenziell, aber nicht signifikante Erhöhung der Rho-Kinase II-Expression im arteriellen glatten Gefäßmuskel der hypertensiven Tiere. Im Tiermodell der pulmonalen arteriellen Hypertonie wurde durch chronische Behandlung mit Rho-Kinase Inhibitoren die Progredienz der PAH verbessert. Rho-Kinase Inhibitoren normalisierten die Endothelfunktion und die Hyperkontraktilität der pulmonalen Gefäße. Zusätzlich konnten die Rechtsherzhypertrophie und rechtsventrikuläre Druck verbessert werden. In Untersuchungen am isoliert perfundierten Herzen nach Langendorff führte die Perfusion mit Rho-Kinase Inhibitoren zu einer verbesserten Durchblutung der Herzkranzgefäße. Die kardiale Kontraktilität und die Herzfrequenz wurden durch die akute Rho-Kinase Hemmung nicht beeinflusst. Zusätzlich zur Gefäßfunktion reguliert Rho-Kinase auch die Aktivierung und Aggregation von Thrombozyten. Vasoaktive Mediatoren können eine Rho-Kinase induzierte Aktivierung von Thrombozyten bewirken und so die Atherogenese begünstigen. Die Hemmung von Rho- Kinase bewirkt die Hemmung der Thrombozytenaggregation. Die Aktivierung von Rho- Kinase ist essentiell für zelluläre Transportvorgänge und die Zellmotilität. Dies wird durch Umstrukturierung des Zytoskeletts und mit Hilfe von Stressfaserformierungen realisiert. Rho- Kinase Hemmung verringert die Formierung von Stressfasern und kann somit Transporte von cholesterolsensitiven Transkriptionsfaktoren, z.B. SREBPs, zu ihren Bindungselementen reduzieren. Dadurch wird eine verstärkte Expression SRE-regulierter Gene, wie z.B. Cholesterolsyntheseenzymen, verhindert. Gleichzeitig führt eine Hemmung der Rho-Kinase Aktivität zu einer Senkung der Proliferationsrate von glatten Muskelzellen und Monozyten. Im LDLR defizienten Tiermodell der Atherosklerose wurde durch eine chronische Behandlung mit Rho-Kinase Inhibitoren eine signifikante Verbesserung der Endothelfunktion erreicht. Die Behandlung mit Rho-Kinase Inhibitoren zeigt allen untersuchten Modellen der Hypertonie blutdrucksenkende Effekte. In Modellen der Atherosklerose wurden durch Langzeitbehandlung mit Rho-Kinase Inhibitoren therapeutische Effekte auf die Endothelfunktion erzielt. Durch Reduktion der Risikofaktoren Bluthochdruck, Atherosklerose und endotheliale Dysfunktion senken Rho-Kinase Inhibitioren das kardiovaskuläre Risiko und bieten eine neue Therapiemöglichkeit zur Behandlung und Prophylaxe von Herz- Kreislauferkrankungen.
Die Inhibition des Natrium-Protonen-Austauschproteins, Subtyp-1 (NHE-1), stellt möglicherweise ein wichtiges Prinzip zur Behandlung der Herzhypertrophie und damit der frühen Herzinsuffizienz dar. Als Ausgangspunkt dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass der oral bioverfügbare und selektive NHE-1-Inhibitor Cariporide dabei u.a. in einem transgenen Tiermodell wirkt, bei dem die Hypertrophie nicht durch Myokardinfarkt, sondern mittels transgener Überexpression des beta-1-adrenergen Rezeptors erzeugt wurde, die Hypertrophie-Entwicklung verhinderte. Um die Wirkung und vor allem den Wirkmechanismus von NHE-1-Inhibitoren näher zu untersuchen, wurde in der vorliegenden Arbeit ein zelluläres Modell der alpha-1-adrenergen Hypertrophie-Induktion in adulten Kardiomyozyten aus Rattenherzen aufgebaut und mittels gängiger Parameter wie Zellvolumen, Protein und RNA-Neusynthese validiert. Dabei konnte ein klassenspezifischer Hemmeffekt aller eingesetzten NHE-1-Inhibitoren auf die untersuchten Hypertrophie-Parameter gezeigt werden. Interessante molekulare Mechanismen der Hypertrophie-Inhibition durch spezifische NHE-1- Inhibitoren konnten in der vorliegenden Arbeit aufgedeckt werden. Nach alpha-1-adrenerger Stimulation und gleichzeitiger NHE-1-Inhibition waren nur wenige Gene in ihrer Expression deutlich differentiell reguliert, darunter der Angiotensin-II AT-1 Rezeptor und die sogenannte Rho-kinase (ROCK). Aus dieser Erkenntnis heraus ergeben sich neue mögliche Ansatzpunkte zum Wirkmechanismus von NHE-1-Inhibitoren. Im Gegensatz zu Befunden bei Herzischämie scheint es bei der Herzhypertrophie im vorliegenden Modell keine Kopplung zwischen dem NHE-1 und einem weiteren Austauschprotein, dem Natrium-Calcium-Austauscher, zu geben. Die Hypertrophie der adulten Kardiomyozyten ließ sich nicht durch einen selektiven Hemmstoff dieses Austauschers, SEA0400, hemmen. Bei näherer Untersuchung auf Translationsebene zeigten sich überraschende Ergebnisse, die für eine Hemmung der Hypertrophie-Entwicklung in Anwesenheit eines NHE-1-Inhibitors verantwortlich gemacht werden könnten. So war auf der einen Seite die Translokation von in adulten Kardiomyozyten exprimierten PKC-Subtypen (delta und eta) vom Zytosol an die Plasmamembran durch die NHE-1-Inhibition signifikant beeinflusst. Auf der anderen Seite war die Phosphorylierung bestimmter NHE-1-aktivierender Kinasen über den gesamten betrachteten Zeitraum verstärkt vorhanden. Diese Ergebnisse legen nahe, dass neben möglichen Autoregulationseffekten in der Zelle, ausgelöst durch eine NHE-1-Inhibition, eine weitere Wirkkomponente eine Rolle bei der Beeinflussung intrazelluläre membranabhängiger Translokation spielen könnten.
Die vorliegende Arbeit befaßte sich mit der Untersuchung der Funktion und der Regulation des neuronalen GABA-Transporter 1 der Maus (mGAT1). Der mGAT1 ist ein elektrogener Neurotransmittertransporter, der in Gegenwart von GABA in Abhängigkeit des Membranpotentials und des Na+-Konzentrationsgradienten über der Membran einen sogenannten mGAT1-vermittelten Strom generiert. Der mGAT1 wurde in Oozyten von Xenopus laevis exprimiert und mit elektro-physiologischen Methoden (Two-Electrode Voltage Clamp), mit radioaktiven Auf-nahmemessungen (3H-GABA, 22Na+, 36Cl-) und mit biochemischen Methoden untersucht. In der vorliegenden Arbeit konnte unter Verwendung des Tiagabin –Analogons SKF-89976-A gezeigt werden, daß der mGAT1-vermittelte Strom aus zwei Komponenten besteht, einem Transportstrom und einem Transporter-assoziierten Strom. Dabei wurde die hier gewonnene neue Erkenntnis genutzt, daß SKF-89976-A die Transporter-assoziierte Stromkomponente selektiv blockieren kann. Als Ursache des Transportstroms konnte die in der Literatur angenommene Transportstöchiometrie von 1GABA : 2Na+ : 1Cl- bewiesen werden. Als Ursache des Transporter-assoziierten Stroms konnte eine vom GABA-Transport entkoppelte Na+-spezifische Leitfähigkeit in Gegenwart von GABA identifiziert werden, die drei bis fünfmal größer ist als die Transport-Leitfähigkeit selbst. Transportstrom und Transporter-assoziierter Strom scheinen von zwei unterschiedlichen Konformeren des mGAT1 vermittelt zu werden, die nicht miteinander im Gleichgewicht stehen. In Abwesenheit von GABA ist in der Stromantwort auf einen Spannungspuls ein mit der Zeit abfallender transienter Strom zu beobachten. Hinsichtlich dieses langsamen transienten Stroms des mGAT1 konnte ein Bindungsmodell für Na+ und Cl- in Abwesenheit von GABA entwickelt werden. Nach diesem Modell kommt es vor der Bindung von GABA am Transporter zu einer sequentiellen Bindung zweier Na+-Ionen und eines Cl--Ion. Regulation des mGAT1 konnte durch Phosphorylierung bzw. Dephosphorylierung des mGAT1 mittels PKC und PP2B gezeigt werden. Dabei scheint der mGAT1-vermittelte Strom durch Serin- / Threonin-Phosphorylierung verstärkt zu werden. Durch Koinjektion von mGAT1-cRNA und humaner Hirn-mRNA konnte der mGAT1 zusammen mit unbekannten zytosolischen bzw. Membranproteinen des humanen Hirns koexprimiert werden. Dabei wird die Transportrate des mGAT1 signifikant gesteigert; der mGAT1-vermittelte Strom wird nicht signifikant beeinflußt. Es scheint, daß eines oder mehrere der koexprimierten humanen Proteine die Bildung des Transport-Modus bzw. die Bildung des Kanal-Modus mit beeinflussen.
PPARs gehören wie die Steroidhormon-Rezeptoren (z. B.Glucocorticoid-, Estrogen- oder Testosteron-Rezeptoren) zur Superfamilie der nukleären Rezeptoren. Es existieren drei PPAR-Subtypen, die als PPARalpha, PPARbeta/delta und PPARgamma bezeichnet werden und von drei verschiedenen Genen kodiert werden. Fibrate sind PPARalpha-Agonisten, welche die Plasma-Triglyceridspiegel reduzieren und gleichzeitig eine moderate Steigerung des HDL-Cholesterols bewirken. Thiazolidindione (Glitazone) sind PPARgamma-Agonisten, die bei Typ-2-Diabetes-mellitus indiziert sind und als Insulinsensitizer wirken. Duale PPARalpha/gamma-Agonisten stellen eine neue Klasse von Arzneistoffen dar, die zukünftig zur Behandlung von Typ-2-Diabetikern mit gestörtem Lipidprofil eingesetzt werden könnten. Im Rahmen der vorliegenden Dissertation wurde eine Leitstrukturoptimierung des selektiven PPARalpha-Agonisten Pirinixinsäure (WY 14643) durchgeführt. Die pharmakologische In-vitro-Charakterisierung der Substanzen erfolgte mit Hilfe subtypspezifischer Reportergen-Assays. Zusätzlich wurde gezeigt130, dass Chinolinderivate der Pirinixinsäure 5-LOX-inhibierende Eigenschaften in polymorphnukleären Leukozyten zeigen. Zunächst wurde eine geeignete Synthesestrategie zur Darstellung von Pirinixinsäurederivaten etabliert, was zur Charakterisierung und Identifizierung einer Serie von potenten dualen PPARalpha/gamma-Agonisten und 5-LOX-Inhibitoren führte. Die Synthesestrategie zur Darstellung von sowohl im Arylamino-Bereich (W) als auch in alpha- Position (R) modifizierten Derivaten der Pirinixinsäure bestand in einer vierstufigen Reaktionsfolge (I–IV; siehe Abb.). ... Die PPAR-Modulatoren (Carbonsäuren) 4, 8, 14, 32–38, 41 und 42 wurden in-vitropharmakologisch unter Anwendung subtypselektiver Reportergen-Assays (hPPARalpha, beta, gamma) charakterisiert. Die 5-LOX-Modulatoren (Carbonsäureester) 3, 7, 8, 13, 14, 24–29, 31–42 und 50 wurden in-vitro-pharmakologisch unter Anwendung des 5-LOX-Standardassays in intakten PMNL (polymorphnukleäre neutrophile Leukozyten) evaluiert. Die vorliegende Untersuchung deckte auf, dass der Ersatz des 2,3-Dimethylanilin-Strukturelements der Pirinixinsäure durch 6-Aminochinolin zu einem Gesamtverlust des PPARalpha/gamma-Agonismus führt. Durch Strukturmodifikationen im Arylamino-Bereich der Leitstruktur WY 14643 mit für 5-LOX-Non-Redoxinhibitoren typischen Pharmakophorresten, Tetrahydropyran-4-yl (Substanzen 13–14) und Methoxychinolin-2-yl (Substanz 43), konnte eine signifikante Steigerung des 5-LOX-inhibitorischen Potenzials erzielt werden [IC50 7 mikro M (13) bzw. 4 mikro M (43)]. Die alpha-alkylsubstituierten Carbonsäurederivate 33–38 zeigten sowohl am hPPARalpha als auch am hPPARgamma eine mit der aliphatischen Kettenlänge steigende Potenz. Am hPPARalpha erwiesen sich das alpha-Hexyl-Derivat 35 und das alpha-Butyl-Derivat 34 mit EC50-Werten von 1,9 mikro M (35) bzw. 11,5 mikro M (34) entsprechend einer Steigerung der Aktivität gegenüber WY 14643 um den Faktor 20 (35) bzw. den Faktor 4 (34) als besonders potent. Im Falle des hPPARgamma zeigten ebenso das alpha-butylsubstituierte Derivat 34 und der alpha-hexylsubstituierte Ligand 35 die höchste Aktivität mit EC50-Werten von 8,7 mikro M (34) bzw. 5,8 mikro M (35) und einer Steigerung der Aktivität gegenüber WY 14643 von Faktor 6 (35) bzw. Faktor 9 (34). Die Einführung von alpha-Alkylsubstituenten in das Grundgerüst der Pirinixinsäure führt möglicherweise zum Besetzen der linken proximalen Bindungstasche und somit zu einer im Vergleich zur Leitstruktur WY14643 stärkeren Bindung in die Ligandenbindungstasche des Rezeptors. Die Besetzung dieser proximalen Bindungstasche entscheidet jedoch nicht über die PPAR-Selektivität, da diese sowohl von hPPARalpha- als auch von hPPARgamma-Agonisten belegt wird. PPARalpha/gamma-Selektivität kann zum einen durch das Besetzen der linken bzw. rechten distalen Bindungstasche erzielt werden, zum anderen durch die Auswahl verschiedener acider Kopfgruppen. Aufgrund unterschiedlicher Aminosäuresequenzen der Bindungstaschen der einzelnen PPAR-Subtypen ergibt sich für die Kopfgruppen der PPAR-Modulatoren im hPPARalpha und hPPARgamma eine durch den sterischen Einfluss von Carboxyl- bzw. TZD-Kopfgruppen verursachtes unterschiedliches Wasserstoffbrückennetzwerk. Im Vergleich mit Pirinixinsäure konnte nur durch die Einführung der größeren Alkylketten (n-Butyloder n-Hexyl) ein stark erhöhter dualer PPARalpha/gamma-Agonismus erreicht werden. Die Substitution des sekundären Amins der Chinolin-6-ylverbindungen durch einen Ether-Sauerstoff in den Substanzen 41 und 42 sowie die Einführung eines Linkers, genauer einer Methylengruppe, zwischen dem Chinolin-6-ylrest und dem Scaffold (Derivate 29 und 36), führt zu einer verminderten Aktivität sowohl an hPPARalpha als auch an hPPARgamma. Eine mögliche Erklärung hierfür könnte sein, dass an entsprechender Position der Liganden-Bindungstasche eine Wasserstoffbrücken-Akzeptor-Position vorhanden ist, welche zur Erhöhung der Affinität beiträgt. Offensichtlich wird, durch die Ausbildung einer Wasserstoffbrücke zwischen der NH-Funktion und einem Wasserstoffbrücken-Akzeptor innerhalb der LBP im Falle von WY 14643 ein hoher Bindungsbeitrag erreicht. Daten bezüglich der Inhibierung der 5-Lipoxygenase demonstrieren, dass 6-Aminochinolinderivate potente 5-LOX-Inhibitoren sind. Die Einführung eines 3,5-Bis-(2,2,2-trifluor-ethoxy)-phenylrestes in 6-Position des alpha-hexylsubstituierten Scaffolds führt zu Ligand 38. Dieser ist ein potenter dualer PPARalpha/gamma-Agonist mit einem EC50-Wert von 11 mikro M an hPPARalpha bzw. 7,7 mikro M an hPPARgamma und ein stark wirksamer 5-LOX-Inhibitor mit einem IC50-Wert von 1 mikro M im 5-LOX-PMNL-Standardassay. Die Substanz 38 wurde in präklinischen Studien eingesetzt. Vier Stunden nach oraler Administration bei Mäusen (n = 6) wurde einen Plasmaspiegel von 40 mikro M erreicht. Im Hinblick auf eine Steigerung der PPAR-agonistischen Aktivität und der Reduktion der hepatotoxischen Eigenschaften der Leitstruktur Pirinixinsäure wurde eine Leitstrukturoptimierung durch Einführung der größeren Alkylketten in alpha-Position zur pharmakophoren Carboxyl-Funktion durchgeführt. Für die inhibierende Wirkung auf die 5-LOX scheint das Chinolin-Strukturelement verantwortlich zu sein, während die Potenz der Inhibition durch das Substitutionsmuster moduliert wird.
Mechanistische Untersuchungen zur Modulation der zytosolischen Phospholipase A2 durch Hyperforin
(2009)
Aus der Familie der Phospholipasen A2 nimmt die zytosolische Phospholipase A2 (cPLA2) in der Bereitstellung von Arachidonsäure (AA) für die Produktion von entzündungsfördernden Eikosanoiden und Lysophospholipiden eine Schlüsselrolle ein. Inwieweit die Modulation dieses Enzyms zum antientzündlichen Wirkspektrum von Hyperforin beiträgt, war Gegenstand dieser Arbeit. Hyperforin als Bestandteil des Johanniskrauts greift auf vielfältige Art und Weise in Entzündungsprozesse ein und hemmt unter anderem die Aktivität der 5-Lipoxygenase und Cyclooxygenase-1 in mikromolaren Konzentrationen. Zur Erforschung der cPLA2 als weitere potentielle Zielstruktur wurden die Effekte Hyperforins auf frisch isolierte humane polymorphkernigen Leukozyten (PMNL) und Thrombozyten untersucht. Dabei ergaben sich erstaunlich widersprüchliche Ergebnisse. Während in PMNL die A23187- und Thapsigargin-induzierte AA-Freisetzung potent unterdrückt wurde (IC50 = 1,5 bis 1,9 µM), konnte Hyperforin die cPLA2-Aktivität in Thrombozyten nach A23187-Stimulation nicht und nach Thrombin-Induktion nur leicht beeinträchtigen. Hingegen resultierte aus der Behandlung von Thrombozyten mit 10 µM Hyperforin eine 2,6- bzw. 8,1-fache Steigerung der AA-Freisetzung und 12-Hydro(pero)xyeikosatetraensäure(H(P)ETE)-Produktion, die von einer Translokation der cPLA2 an die Plasmamembran begleitet war. In PMNL wurde eine Aktivierung der cPLA2 nicht beobachtet. Diese widersprüchlichen Befunde führten zu näheren mechanistischen Untersuchungen. Insbesondere der Einstrom von Ca2+, wie auch die Aktivierung von mitogenaktivierten Proteinkinasen (MAPK) tragen in PMNL und Thrombozyten zur cPLA2-Aktivierung bei. Allerdings konnte eine Beeinträchtigung dieser Signaltransduktionswege durch Hyperforin ausgeschlossen werden. In PMNL wird der durch A23187- oder Thapsigargin-induzierte Ca2+-Einstrom nicht inhibiert und die Aktivierung der entsprechenden MAPK konnte durch Hyperforin (bis zu 10 µM) nicht vermindert werden. In Thrombozyten wurde die Translokation der cPLA2 sowie die AA- und 12-H(P)ETE-Produktion durch die Chelatierung von extra- und intrazellulärem Ca2+ nicht gehemmt. Auch die Unterbindung der Phosphorylierung der cPLA2 durch Hemmung der MAPK-Aktivierung konnte die Aktivierung der cPLA2 nicht verhindern. In zellfreien Untersuchungen an aufgereinigtem Enzym zeigte Hyperforin weder hemmende noch aktivierende Effekte, wenn Liposomen aus 1-Palmitoyl-2-arachidonoyl-sn-glycerol-3-phospatidylcholin (PAPC) eingesetzt wurden. Nach Einbau von Dipalmitoylphosphatidylinositol-4,5-diphosphat, 1-Palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycerol und Cholesterol in PAPC-Liposomen sowie gegenüber Lipid-Raft-Adaptionen (PAPC/Sphingomyelin/Cholesterol 1:1:1) zeigte Hyperforin allerdings inhibitorisches Potential (IC50 = 13,2 µM, 7,6 µM, 5,5 µM und 4,4 µM). Aktivierende Effekte des Hyperforins konnten in Abwesenheit von Ca2+ beobachtet werden, wenn cholesterolhaltige, Lipid-Raft-artige- oder 1-Palmitoyl-2-arachidonoyl-sn-glycerol-3-phospatidylethanolamin(PAPE)-Vesikel eingesetzt wurden. 10 bis 30 µM Hyperforin erhöhten die AA-Freisetzung 3,3- bis 7,3-fach, wobei die Bindung des Enzyms an Liposomen mit Cholesterol und Lipid-Raft-Strukturen, aber nicht gegenüber dem PAPE-Substrat verstärkt war. Alle Effekte konnten durch die Zerstörung der Membranoberfläche und –struktur nach Zugabe von Triton-X-100 aufgehoben werden, wodurch die Bedeutung der Struktur der Lipidaggregate für die Hyperforinwirkung in den Vordergrund tritt. Darüber hinaus konnte die essentielle Rolle der vinylogen Carbonsäurestruktur des Hyperforins gezeigt werden, da ein O-Methylester des Hyperforins weder die Hemmung der cPLA2 in PMNL noch deren Aktivierung in Thrombozyten reproduzieren konnte und im Liposomenassay nur eine unspezifische Aktivierung der cPLA2 unabhängig von der Membranstruktur bewirkte. Neben der cPLA2-Aktivität wurde auch die Dichte der Liposomen abhängig von der Membranstruktur durch Hyperforin moduliert, allerdings konnten Änderungen der Membrandichte nicht mit Einflüssen auf die Enzymaktivität korreliert werden. Weiterhin wurden in Zusammenarbeit mit der Arbeitsgruppe Prof. Glaubitz, Universität Frankfurt, 1H-MAS-NMR-NOESY-Spektren von Liposomen aus 1-Palmitoyl(D31)-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphatidylcholin mit integriertem Hyperforin aufgenommen. Das sich aus der Analyse der Spektren ergebende Modell postuliert die Lokalisation des sauerstoffreichen Bizyklus des Hyperforins im Kopfgruppenbereich der Lipide und eine Penetration der Isoprenylgruppen in die hydrophobe Schicht der Membranen. Die Ergebnisse dieser Arbeit in intakten Zellen und zellfreien Systemen verweisen somit auf komplexe Zusammenhänge, bei denen Interkalationen von Hyperforin mit speziellen Membranstrukturen im Vordergrund stehen. Die unspezifische Einlagerung der lipophilen Substanz Hyperforin in zelluläre Membrankompartimente könnte somit unter Umgehung der regulären Signaltransduktionswege zelltypabhängig die cPLA2-Aktivität modulieren.
Die Transkription ist ein entscheidender Schritt in der Transition der genetischen Information, welche durch die DNA codiert und im Genom hinterlegt ist, zu dreidimensionalen Funktionseinheiten in der Zelle, den Proteinen. Während der Transkription wird die Information von der Ebene der DNA in RNA umgewandelt, welche in der Zelle zusätzlich zu dessen Rolle als Informationsmediator in Form der mRNA eine Vielzahl von Funktionen ausübt. Die Transkription benötigt in Hinblick auf ihre essentielle Rolle in der Errichtung des Proteoms und der notwendigen Adaption von Genexpressionsprogrammen an externe zelluläre Stimuli, den Zellzyklus etc. eine präzise und gleichzeitig flexible Regulation. Besonders für die Transkription von mRNA dient die eukaryotische RNA-Polymerase II (RNAP II) in diesem Prozess als eine zentrale Einheit, die einer Vielzahl regulativer Mechanismen wie post-translationaler Modifikationen und der Assemblierung dynamischer Proteinkomplexe unterliegt. Während Komponenten dieser Regulation wie die Zusammensetzung und Dynamik des Prä-Initiationskomplex bereits seit Jahrzehnten beschrieben sind, ist eine besondere Form der RNAP II-abhängigen Regulation erst in den letzten Jahren Gegenstand genauerer Untersuchungen geworden. So erfährt die RNAP II bei einer Vielzahl von Genen unmittelbar nach der Initiation einen Arrest, der das Enzym nicht weiter über die DNA prozessieren lässt und somit die produktive Elongation des Gens blockiert. Die Aufhebung dieser Blockade wird durch den positiven Transkriptions-elongationsfaktor b (P-TEFb) dominiert, der durch distinkte post-translationale Modifikationen der C-terminalen Domäne der RNAP II und assoziierter Faktoren die produktive Elongation ermöglicht. P-TEFb selbst unterliegt dabei einer strengen Regulation durch eine inaktivierende Assoziation mit Speicherkomplexen. P-TEFb wurde abseits dieser Komplexe in einer Vielzahl von Elongations-assoziierten Proteinkomplexen identifiziert, der Mechanismus der Transition aus dem inaktiven Speicherkomplex zur aktiven Form an der RNAP II war jedoch unbekannt.
Ein zentrales Element aller aktiven Komplexe ist die Anwesenheit von Proteinen der AF4/FMR2-Familie, darunter das AF4 Protein. Bemerkenswerterweise war die genaue Rolle dieses Proteins in den Komplexen bisher unbekannt oder wurde lediglich auf die strukturelle Integrität der Komplexe beschränkt. AF4 und speziell dessen N-Terminus ist über diese Rolle hinaus als Bestandteil des Fusionsproteins AF4-MLL eng mit der onkogenen Zelltransformation im Falle einer durch die t(4;11)(q21;q23) chromosomalen Translokation bedingter, akuter lymphoblastischer Leukämie assoziiert.
In dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass das AF4 Protein und im Speziellen sein N-Terminus in der Lage ist, die zelluläre Transkription durch die Aktivierung und Rekrutierung von P-TEFb zu aktivieren. In Anwesenheit von AF4 wird die Kinase-Untereinheit CDK9 des P-TEFb post-translational an Lysinresten modifiziert und damit aktiviert sowie die C-terminale Domäne der RNAP II im Kontext stärker phosphoryliert. Gleichzeitig wurde das P-TEFb inaktivierende Protein HEXIM1 stärker exprimiert. AF4 und AF4-MLL waren weiterhin in der Lage ein Elongations-kontrolliertes Reportergen zu aktivieren. Gleichzeitig führte die Überexpression des AF4 zu einer Erhöhung der zellulären RNA Menge. Zur genaueren Untersuchung der AF4-abhängigen Mechanismen wurden zwei Zelllinien erstellt, die zum Einen eine induzierbare und reproduzierbare Überexpression und Reinigung des AF4 erlaubten (TCZP-AF4ST) und zum Anderen durch lentiviralen knock-down eine an AF4-Mangelsituation nachstellten (AF4kd V100). Es konnte so gezeigt werden, dass AF4 über P-TEFb hinaus eine regulative Funktion gegenüber Transkription-assoziierten Faktoren wie CDK7, MENIN und NF?B besitzt und dass diese Faktoren vorrangig, analog zu P-TEFb, mit dem N-Terminus des AF4 interagieren. Die Überexpression von AF4 führte über die Bindung an die 7SK snRNA und deren Degradation zur Rekrutierung des P-TEFb aus den Speicherkomplexen in distinkte AF4-assoziierte Komplexe und zu einer Umverteilung des Faktors auf distinkte Loci im Zellkern, wobei der AF4 N-Terminus für sich alleine jedoch nicht in der Lage war, diese Funktion auszuüben. Im Falle eines Mangels an AF4 kam es zur Wachstumsretardierung der Zellen sowie zu einem völligen Aktivitätsverlust in Reportergenversuchen.
Die Tatsache, dass AF4 ein zentrales Element in der Elongationskontrolle darstellt führte zu der weitergehenden Vermutung, dass virale immediate early (IE) Proteine zur Kontrolle viraler Genexpression auf der Ebene der Elongation ebenfalls auf dieses Wirtsprotein zugreifen können. Es konnte vor diesem Hintergrund gezeigt werden, dass AF4 tatsächlich mit den IE-Proteinen IE1 (HCMV) und Zta (EBV) aus der Familie der Herpesviren interagiert und durch die Stabilisierung des AF4 Proteins eine kooperative, transaktivierende Funktion auf ein ALOX5 Reportergen ausgeübt wurde. Es wurde gezeigt, dass die viralen IE-Proteine dabei Komponenten der AF4 Komplexe sind und in der Zelle zur epigenetischen Regulation des ALOX5 Gens führen. Weiterhin konnte in diesen Experimenten dargestellt werden, dass AF4 über seine Rolle in der Elongationskontrolle hinaus auch distinkte Effekte in der Aktivierung von Promotoren und damit in der Initiation der Transkription zeigt. Damit konnte in dieser Arbeit zum ersten Mal die essentielle Rolle des AF4 Proteins in der Elongationskontrolle und der Initiation der Transkription als auch in der Infektion durch Herpesviren gezeigt werden.
Das Hepatozelluläre Karzinom (HCC) ist die sechsthäufigste Krebsart mit der zweithäufigsten krebsbedingten Letalität. Sorafenib ist bereits seit über 10 Jahren die einzige verfügbare und zugelassene systemische Chemotherapie. Allerdings zeigen Patienten oft eine Resistenz gegenüber Sorafenib.
In zahlreichen Krebsarten konnte bereits gezeigt werden, dass Sphingolipide bei der Tumorentwicklung und Chemoresistenz eine wichtige Rolle spielen. Sphingolipide sind bioaktive Lipidmoleküle, welche unteranderem für die Beeinflussung verschiedener Signalwege intra- und extrazellulär verantwortlich sind. So konnte gezeigt werden, dass das Verhältnis zwischen Sphingosin-1-Phosphat (S1P) und Ceramiden eine wichtige Rolle für das Überleben von Zellen spielt, wobei eine Verschiebung des Verhältnisses zugunsten des S1P meist eine proliferative Wirkung auf Zellen hat. Für die Phosphorylierung des Sphingosins zu S1P sind die zwei Enzyme Sphingosinkinase 1 und 2 (SPHK1/2) verantwortlich.
Es gibt bereits Studien, die nachweisen konnten, dass diese Enzyme gerade in Tumorzellen verstärkt exprimiert werden. Auf der anderen Seite kann eine verstärkte Bildung von Ceramiden die Apoptose der Tumorzellen verstärken. Daher ist es nicht verwunderlich, dass der Sphingolipid-Stoffwechsel einen interessanten Angriffspunkt für die Krebstherapie darstellt. Aus diesem Grund sollte in der vorliegenden Arbeit zunächst untersucht werden, ob Sorafenib einen Einfluss auf den Sphingolipid Stoffwechsel hat. Weiter sollte untersucht werden, ob die Beeinflussung des Sphingolipid-Stoffwechsels die Effekte von Sorafenib potenzieren könnte.
Es konnte zunächst gezeigt werden, dass Sorafenib die mRNA-Expression verschiedener Enzyme, die das Verhältnis zwischen Ceramiden und S1P regulieren, beeinflussen kann. Es wurde weiter untersucht, wie sich der Ceramidsynthase Inhibitor FB1 auf die Proliferation und die Induktion der Apoptose auswirkt. Dies wurde ebenfalls mit SLP (SPHK1 Inhibitor), SLM (SPHK2 Inhibitor) und SKI II, einem unspezifischen Inhibitor beider Sphingosinkinasen, untersucht. Es wurden weiter die Einflüsse aller verwendeten Substanzen auf die Bildung verschiedener Sphingolipide untersucht.
Hierbei konnte gezeigt werden, dass Sorafenib in der Lage ist, die Proliferation der Zellen zu hemmen und die Apoptose-Induktion zu fördern. Weiter führte Sorafenib zu einer Akkumulation der Dihydroceramide. Was wiederrum weder mit SKI II, FB1; SLP noch SLM beobachtet werden konnte. Der signifikante Anstieg der Dihydroceramid-Konzentrationen konnte mit dem durch Sorafenib induzierten oxidativen Stress in Verbindung gebracht werden.
SLP und SLM waren nicht in der Lage, die Effekte von Sorafenib auf die Proliferation zu potenzieren. Die Kombination von Sorafenib mit SLP oder SLM führte jedoch in den Huh7.5 Zellen zu einer drastischen Reduktion des S1P-Spiegel.
FB1 und SKI II führten zu einer stärkeren Hemmung der Proliferation als Sorafenib. Wobei gezeigt werden konnte, dass beide Substanzen die Ceramid-Spiegel tendenziell eher vermindern und die S1P-Spiegel erhöhen. Durch die Stimulation mit FB1 kam es sogar zu einer signifikanten Erhöhung der S1P-Spiegel. Es scheint, dass der Einfluss von FB1 und SKI II auf die Proliferation der Zellen unabhängig vom Sphingolipid-Stoffwechsel ist. Diese scheinen eher über andere Mechanismen zu wirken. Es könnte von Interesse sein, gerade diese Signalwege von SKI II im HCC weiter zu untersuchen, da SKI II bereits in Mausmodellen anderer Krebsarten vielversprechende Ergebnisse zeigte.
Das natürlich vorkommende Polyphenol Resveratrol (3,4‘,5-(E)-Trihydroxystilben) ist eine potente chemopräventive Substanz, die in vielen verschiedenen Krebszelllinien wirksam ist. Außerdem verfügt sie über anti-inflammatorische, anti-oxidative und pro-apoptotische Wirkungen. Da Resveratrol auch in Tiermodellen des Typ-2-Diabetes und der nicht-alkoholischen Fettlebererkrankung gute Effekte gezeigt hat, wird in Erwägung gezogen es zur Prävention und Behandlung von metabolischen Erkrankungen einzusetzen. Allerdings liegen, aufgrund von schneller Metabolisierung und geringer Bioverfügbarkeit, die wirksamen Konzentrationen im mikromolaren Bereich. Eine geeignete Strategie, um die anti-tumorale Wirkung und die Bioverfügbarkeit von Resveratrol zu verbessern, scheint die Methylierung der freien Hydroxylgruppen zu sein. Allerdings liefern einige Studien Hinweise darauf, dass diese strukturelle Modifikation der Stilbengrundstruktur zu einer Veränderung des antiproliferativen Wirkmechanismus der methylierten Substanzen führt. Daher führten wir im ersten Teil dieser Arbeit genauere Untersuchungen durch, um die Veränderungen der biologischen Wirkung, die durch die Methylierung der freien Hydroxylgruppen von (E)- und (Z)-Resveratrol verursacht werden, zu charakterisieren. Einen Schwerpunkt bildete die Bestimmung der metabolischen Effekte der methylierten Substanzen. Dabei sollte aufgeklärt werden, ob die Analoga noch immer in der Lage sind bekannte Resveratrol-Targets, wie AMPK, SIRT1 und Phosphodiesterasen, zu modulieren. Zunächst bestätigten wir, dass die methylierten Resveratrolanaloga ST911 (3,4‘,5-Z)-Trimethoxystilben) und ST912 (3,4‘,5-(E)-Trimethoxystilben) einen starken antiproliferativen Effekt auf verschiedene Krebszelllinien ausüben. Wie bereits zuvor beschrieben, konnten wir beobachten, dass ST911 und ST912 das Wachstum von Tumorzellen stärker beeinflussen, als die hydroxylierten Substanzen (E)- und (Z)-Resveratrol. Dies, in Verbindung mit einer vernachlässigbaren zytotoxischen Wirkung und einer deutlich geringeren antiproliferativen Wirkung auf Primärzellen, legt nahe, dass ST911 als potentielles neues Chemotherapeutikum weiter untersucht werden sollte. Zudem zeigten ST911 und ST912 signifikante pro-apoptotische Wirkungen in CaCo-2-Zellen. Auch Resveratrol konnte in diesen Zellen Apoptose auslösen, allerdings erst nach Behandlung mit deutlich höheren Konzentrationen, verglichen mit ST911 und ST912. Eine genauere Charakterisierung der antitumoralen Wirkung von ST911 in HT-29-Zellen zeigte, dass ST911 die Polymerisation von Tubulin zu Mikrotubuli beeinflusst und einen Arrest des Zellzyklus in der Mitose-Phase auslöst. Im Gegensatz dazu führt Resveratrol zu einem Zellzyklus-Arrest in der S-Phase und beeinflusst die Tubulinpolymerisation nicht. Diese Beobachtungen verstärkten die Annahme, dass ST911 ein Mitosehemmer ist und betonten noch einmal die mechanistischen Unterschiede zwischen Resveratrol und den methylierten Analoga. Interessanterweise konnte ST911 die hepatische Fettakkumulation in einem in-vitro-Steatosemodell nicht beeinflussen, während eine Behandlung mit Resveratrol zu einer signifikanten Reduktion der intrahepatischen Triglyzeride führte. Dieses Experiment lässt vermuten, dass die stärkere antiproliferative Wirkung von ST911, keine erhöhte Aktivität in metabolischen Krankheitsmodellen nach sich zieht. Die beobachteten Unterschiede im Steatosemodell führten zu der Frage, ob die methylierten Analoga noch immer in der Lage sind die gleichen metabolischen Targetgene zu modulieren, die in der Literatur für Resveratrol beschrieben sind. Vor kurzem wurden Phosphodiesterasen (PDEs) als direkte Targets von Resveratrol identifiziert. Die Inhibition von PDEs durch Resveratrol führt zu einem Anstieg der intrazellulären cAMP-Konzentration. Diese wiederum aktiviert die bekannten Resveratrol-Targetgene AMPK und SIRT1. Unsere Experimente zeigten, dass ST911 und ST912 keinen Einfluss auf die intrazelluläre cAMP-Konzentration haben. Zusätzlich konnten wir keine AMPK- oder SIRT1-abhängigen Veränderungen der Genexpression beobachten. Dies ist ein Hinweis darauf, dass die Substanzen ihre zellulären Effekte vermutlich nicht über eine Modulation von PDEs, AMPK oder SIRT1 vermitteln. Zusammenfassend liefert der erste Teil der Arbeit Beweise dafür, dass ST911 keine positiven Effekte in metabolischen Krankheitsmodellen ausübt. Dies liegt vermutlich in einem Aktivitätsverlust gegenüber den metabolischen Targetgenen von Resveratrol begründet. Des Weiteren unterstützen unsere Ergebnisse frühere Arbeiten, die zeigen konnten, dass ST911 an Tubulin bindet und die Polymerisation zu Mikrotubuli verhindert. Weiterhin bestätigen unsere Daten, dass die Methylierung von Resveratrol zu einer grundlegenden Veränderung des Wirkmechanismus dieser Substanzen führt, die von einem kompletten Verlust der metabolischen Aktivität begleitet wird. Dies sollte bei zukünftigen Leitstrukturoptimierungen mit Resveratrol berücksichtigt werden. Im ersten Teil dieser Arbeit konnte außerdem gezeigt werden, dass Resveratrol die Gentranskription des nukleären Rezeptors SHP (aus dem Englischen: small heterodimer partner) stark induziert. Der Mechanismus dieser Induktion scheint von der Aktivität von AMPK und SIRT1 abhängig zu sein. Diese Ergebnisse konnten unser Verständnis der vielseitigen biologischen Wirkungen von Resveratrol erweitern. Dennoch sollte die Relevanz der SHP-Induktion für die Effekte von Resveratrol auf metabolische Krankheiten und Tumorwachstum noch weiter untersucht werden. Während der Experimente für den ersten Teil der Arbeit stellten wir fest, dass der AMPK-Inhibitor Compound C (CC) in der Lage war, die wachstumshemmende Wirkung von ST911 signifikant zu reduzieren. Die Untersuchung dieses sogenannten „Rescue-Effektes“ wird durch die Tatsache bestärkt, dass eine steigende Anzahl von Tumoren resistent gegenüber Chemotherapeutika ist. Außerdem fehlen spezifische Antidota für akute Intoxikationen mit Mitosehemmern. Daher zielten die folgenden Experimente darauf ab den Rescue-Effekt näher zu charakterisieren und die zugrundeliegenden Wirkmechanismen aufzuklären. Zunächst zeigten Knockdown-Experimente, dass der Rescue-Effekt unabhängig von der AMPK-inhibierenden Wirkung von CC vermittelt wird. Da CC ein ATP-kompetitiver Inhibitor der AMPK ist und zuvor bereits gezeigt wurde, dass es auch eine große Zahl anderer Kinasen inhibieren kann, vermuteten wir, dass der Rescue-Effekt mit diesen Off-Target-Effekten von CC zusammenhängt. Als nächstes testeten wir, ob die wachstumshemmenden Effekte von anderen Mitosehemmern auch durch CC aufgehoben werden können. Wir wählten verschiedene etablierte Substanzen, die dafür bekannt sind mit Mikrotubuli zu interagieren: Colchicin, das Vinca-Alkaloid Vinblastin, Disorazol A und das aus Taxus-Arten isolierte Paclitaxel. Die ersten drei dieser Substanzen haben eine depolymerisierende Wirkung auf die Mikrotubuli, während Paclitaxel zu einer stärkeren Polymerisierung führt. Zudem binden diese Substanzen an drei verschiedenen Bindestellen am Tubulin. Interessanterweise zeigten unsere Versuche, dass CC die antiproliferative Wirkung aller getesteten Mitosehemmer auf HT-29-Zellen, unabhängig von der Bindestelle, abschwächen kann. Des Weiteren konnte CC die Wirkung der pro-apoptotischen Substanz Staurosporin nicht reduzieren. Diese Ergebnisse weisen darauf hin, dass eher die tubulinbindenden, als die pro-apoptotischen Eigenschaften, von ST911 für den Rescue-Effekt verantwortlich sind. Um zu untersuchen, ob der Rescue-Effekt mit einer kompetitiven Bindung von CC und Mitosehemmern an Mikrotubuli erklärt werden kann, führten wir eine Immunfluoreszenzfärbung von ?-Tubulin durch. Wir konnten beobachten, dass die Tubulinpolymerisation und die Funktion des Spindelapparates in Zellen, die mit Mitosehemmern behandelt wurden, deutlich eingeschränkt waren. Außerdem stellten wir fest, dass CC nicht in der Lage ist die Zerstörung des Tubulingerüstes durch die Mitosehemmer zu verhindern. Eine Einzelbehandlung mit CC hatte keine Wirkung auf die Polymerisation des Tubulin zu Mikrotubuli. Insgesamt legen diese Daten nahe, dass CC nicht direkt an Mikrotubuli binden kann, um mit den Mitosehemmern um eine Bindung zu kompetitieren. Um diese Hypothese zu stärken, führten wir, in Kooperation mit Dr. Jennifer Herrmann (Helmholtz Institut für Pharmazeutische Forschung, Saarbrücken) SPR-Experimente mit Chips durch, auf denen Tubulin immobilisiert wurde. Die Messungen zeigten, das CC nicht in der Lage war gebundenes Disorazol A von der Bindestelle am Tubulin zu verdrängen. Dies zeigte nun deutlich, dass der Rescue-Effekt nicht auf einer Kompetition von CC und Mitosehemmern um Tubulinbindestellen beruht. Zellzyklusanalysen zeigten, dass die kombinierte Behandlung mit ST911 und CC zu einer Abschwächung des durch ST911 verursachten G2/M-Arrestes führt. Da wir zuvor bereits eine Beeinflussung der direkten Targets von CC und Mitosehemmern, AMPK oder Tubulin, ausgeschlossen hatten, schlussfolgerten wir, dass CC vermutlich mit anderen zellulären Signalwegen interagiert, die zu den beschriebenen Veränderungen des Zellwachstums und der Zellzyklusprogression führen. Eine Literaturrecherche ergab, dass ein erhöhter intrazellulärer Polyaminspiegel, die Aktivierung des PI3K/Akt-Signalweges oder eine erhöhte Aktivität des Transkriptionsfaktors c-Myc zu einer Abschwächung eines G2/M-Arrestes führen können. Daher fokussierten wir die weiteren Experimente auf die Untersuchung einer möglichen Beteiligung dieser Targets an der Vermittlung des Rescue-Effektes. Wir zeigten, dass CC die Expression der Spermidin/Spermin-N1-Acetyltransferase (SSAT) erhöhen kann. Die SSAT ist ein Enzym, das an der Biosynthese der Polyamine beteiligt ist. Zusätzlich beobachteten wir, dass die Behandlung mit CC nach 4 h zu einer Erhöhung von phosphoryliertem und damit aktiviertem Akt (pAkt) führt. Die zusätzliche Behandlung mit Wortmannin, einer Substanz, welche die Phosphorylierung von Akt hemmen kann, führte zu einer Abschwächung des Rescue-Effektes. Insgesamt weisen diese Ergebnisse darauf hin, dass eine Aktivierung von Akt-Signalwegen und ein Einfluss auf die Polyaminbiosynthese, zumindest teilweise, mit dem Rescue-Effekt zusammenhängen können. Die Überexpression von c-Myc, einem Transkriptionsfaktor, der eng mit dem Akt-Signalweg und der Biosynthese von Polyaminen zusammenhängt, ist oft mit einer erhöhten Zellproliferation verbunden. Wir untersuchten die zellulären Proteinmengen von c-Myc mittels Western Blot und entdeckten, dass nach der Behandlung mit Mitosehemmern zusätzliche Banden für c-Myc auf den Blots auftauchten. Diese Ergebnisse geben einen Hinweis auf eine posttranslationale Modifikation von c-Myc nach der Behandlung mit Mitosehemmern. Durch Kombination mit CC wurden die zusätzlichen Banden abgeschwächt und die Gesamtmenge an c-Myc-Protein nahm nach längeren Inkubationszeiten rapide ab. Dies legt nahe, dass die posttranslationale Modifikation von c-Myc zum Abbau des Proteins führt und, dass CC dies abschwächen kann. Verschiedene Arbeiten zeigten bereits, dass c-Myc phosphoryliert wird und nach Konjugation mit Ubiquitin vom Proteasom abgebaut wird. Daher überprüften wir, ob eine Inhibition des Proteasoms mit MG-132 zu einem ähnlichen Rescue-Effekt führt wie mit CC. Tatsächlich führte die Behandlung mit ST911 in Kombination mit MG-132 zu einer Zunahme der Zellproliferation, wie sie vorher bereits für CC beobachtet wurde. Dies bestärkte die Theorie, dass der proteasomale Abbau von c-Myc eine Rolle beim Rescue-Effekt spielen kann. Als nächstes untersuchten wir die Phosphorylierungen von c-Myc am Ser62 und Thr58. Diese Phosphorylierungen spielen eine wichtige Rolle beim Abbau von c-Myc, indem Sie das Protein für die Konjugation mit Ubiquitin markieren. Die densitometrische Auswertung der Western Blots ergab, dass die Behandlung mit ST911 initial zu einem Anstieg von phospho-c-Myc führt, dem eine schnelle Abnahme zu späteren Zeitpunkten folgt. Außerdem konnte gezeigt werden, dass dieser Anstieg von phospho-c-Myc durch Kombination mit CC reduziert wurde. Dies unterstützt die Hypothese, dass ST911 den proteasomalen Abbau von c-Myc begünstigt und CC dies verhindern kann. Dies ist eine mögliche Erklärung für die erhöhte Zellproliferation, die für die durch CC „geretteten“ Zellen beobachtet wurde. Allerdings konnte das direkte Target, das für die Vermittlung des Rescue-Effektes durch CC verantwortlich ist, bisher nicht identifiziert werden. DYRKs (aus dem Englischen: Dual-specificity tyrosine-phosphorylation-regulated kinases) sind wichtige Regulatoren von Proteinstabilität und –abbau während der Zellzyklusprogression. Vor kurzem wurde gezeigt, dass DYRK1A und DYRK2 c-Myc am Ser62 phosphorylieren können und es dadurch für den proteasomalen Abbau markieren. Interessanterweise wurde CC bereits in einer früheren Publikation als potenter Inhibitor verschiedener DYRKs beschrieben. Allerdings wurde die Hemmung der DYRKs durch CC in diesem Artikel nur in einer einzelnen Konzentration getestet. Daher bestimmten wir in einem in-vitro-Kinaseassay in Kooperation mit Dr. Matthias Engel (Universität des Saarlandes, Saarbrücken) die IC50-Werte für CC gegenüber DYRK1A, DYRK1B und DYRK2. Unsere Ergebnisse zeigten deutlich, dass CC ein bevorzugter Inhibitor von DYRK1A und DYRK1B (IC50-Wert von etwa 1 µM) ist, aber auch DYRK2 hemmen kann (IC50-Wert von etwa 5 µM). Da sich die vermutete Bindestelle von CC in der stark konservierten Kinasedomäne befindet, ist eine unspezifische Inhibition verschiedener DYRKs nicht überraschend. Genexpressionsanalysen zeigten, dass HT-29 und HepG2 vergleichbare Mengen an DYRK1A exprimieren, während DYRK1B und DYRK2 deutlich weniger in HepG2 vorhanden sind. Vorige Experimente hatten gezeigt, dass HepG2 weniger sensitiv für ST911 und den durch CC vermittelten Rescue-Effekt waren. Wir schlussfolgerten, dass die unterschiedliche Expression der DYRK-Formen eine mögliche Erklärung für diese Unterschiede sein könnte. Daher entschieden wir uns für eine nähere Untersuchung von DRK1B und DYRK2. Experimente mit verschiedenen Inhibitoren der DYRKs zeigten, dass diese Substanzen, ähnlich wie CC, in der Lage waren die antiproliferative Wirkung von ST911 abzuschwächen. Diese Ergebnisse wurden in nachfolgenden Knockdown-Experimenten bestätigt. Dies legt nahe, dass die DYRKs zumindest teilweise für die Vermittlung des Rescue-Effektes verantwortlich sind. Zusammenfassend man kann sagen, dass der Rescue-Effekt vermutlich mit der Biosynthese von Polyaminen, dem Akt-Signalweg und dem proteasomalen Abbau von c-Myc zusammenhängt. Des Weiteren scheint die direkte Inhibition von DYRKs durch CC ein vielversprechender Ansatz für die Erklärung des Effektes zu sein. Allerdings konnte in keinem der Experimente eine kompletten Aufhebung des Rescue-Effektes durch CC gezeigt werden. Daher gehen wir davon aus, dass verschiedene Targets in die Vermittlung des Rescue-Effektes involviert sind. Dies ist höchstwahrscheinlich auf eine unspezifische, ATP-kompetitive Hemmung verschiedener Kinasen durch CC zurückzuführen. Nichtsdestotrotz, sind eine nähere Untersuchung von DYRKs im Rahmen der Therapieresistenz von Tumoren und eine genauere Aufklärung der am Rescue-Effekt beteiligten Signalwege eine interessantes Feld für weitere Untersuchungen.
The tumor suppressor programmed cell death 4 (Pdcd4) exerts its function by inhibiting protein translation initiation. Specifically, it displaces the scaffold protein eukaryotic initiation factor 4G (eIF4G) from its binding to the eukaryotic initiation factor 4A (eIF4A). Thereby, Pdcd4 inhibits the helicase activity of eIF4A, which is necessary for the unwinding of highly structured 5’ untranslated regions (UTRs) of messenger RNAs (mRNAs) often found in oncogenes like c-myc to make them accessible for the translation machinery and subsequent protein production. Overexpression of Pdcd4 inhibits tumorigenesis in vitro and in vivo and inversely, Pdcd4 knockout mice show enhanced tumor formation. In line, Pdcd4 is lost in various tumor types and proposed as prognostic factor in colon carcinomas. Unlike most other tumor suppressors that are rendered nonfunctional by mutations (e.g., p53), Pdcd4 loss is not attributable to mutational inactivation. It is regulated via translational repression by microRNAs and increased degradation of the protein under tumor promoting, inflammatory conditions and mitogens. Specifically, proteasomal degradation of Pdcd4 is controlled by p70 S6 Kinase (p70S6K)-mediated phosphorylation in its degron sequence (serines 67, 71 and 76). Stimulation of the PI3K-AKT-mTOR pathway by growth factors, hormones and cytokines initiates p70S6K activity. Phosphorylated Pdcd4 is subsequently recognized by the E3 ubiquitin ligase beta-transducin repeats-containing protein (β-TrCP) and marked with a polyubiquitin tail to be detected by the 26S proteasome for degradation. β-TrCP represents the substrate specific recognition subunit of the ubiquitin ligase complex responsible for protein-protein interaction with Pdcd4 as substrate for ubiquitin transfer and subsequent proteasomal disassembly.
The first part of the present work aimed at identifying novel stabilizers of the tumor suppressor Pdcd4 in a high throughput screen (HTS). As assay design, a fragment of Pdcd4 from amino acid 39 to 91, containing the phosphorylation sensitive degron sequence, was fused to a luciferase reporter gene construct. Stable expression of this Pdcd4(39-91)luciferase (Pdcd4(39-91)luc) fusion protein in HEK 293 cells served as read-out for the Pdcd4 protein amount to be detected in a high throughput compatible cell-based assay. Loss of Pdcd4(39-91)luc was induced by treatment with 12-O-
tetradecanoylphorbol-13-acetate (TPA), a phorbolester, which activates the PI3K signaling cascade leading to degradation of Pdcd4. The cut-off for hit definition was set at >50% activity in rescuing the Pdcd4(39-91)luc signal from TPA-induced degradation. Activity was calculated relative to the difference of DMSO- and TPA-treated cells (ΔDMSO-TPA = RLUDMSO-RLUTPA). Initial screening of a protein kinase inhibitor library (PKI) revealed hit substances expected to show Pdcd4 stabilizing activity by inhibition of kinases involved in Pdcd4 downregulation, e.g., the mTOR inhibitor rapamycin, the PI3K inhibitors wortmannin and LY294002 and the PKC inhibitors GF 109203X and Ro 31-8220.
The Molecular Targets Laboratory (MTL) of the National Cancer Institute (NCI) in Frederick, USA, hosts one of the largest collections of crude natural product extracts as well as a big substance libraries from pure synthetic sources. Screening of over 15 000 pure compounds and over 135 000 natural product extracts identified 46 pure and 42 extract hits as Pdcd4 stabilizers. For nine synthetic and six natural product derived compounds (after bioassay-guided fractionation), dose-dependent activities for recovering the TPA-induced Pdcd4(39-91)luc loss defined IC50s in the low micromolar range. Most importantly, these compounds were confirmed to stabilize endogenous Pdcd4 protein levels from forced degradation as well. This result proved the assay design to be highly representative for endogenous cellular mechanisms regulating Pdcd4 protein stability. The next step was to stratify the hit substances according to their likely mechanism of action to be located either up- or downstream of the p70S6K-mediated phosphorylation of Pdcd4. Therefore, phosphorylation of S6, as proto-typical p70S6K target, was analyzed and uncovered two natural derived compounds to influence p70S6K activity. Four substances did not affect p70S6K phosphorylation activity and were therefore considered to stabilize Pdcd4 by acting downstream, i.e. on the β-TrCP-mediated proteasomal degradation.
In the second part of this work, one of these compounds, namely the sesquiterpene lactone erioflorin, isolated by bioassay-guided fraction from the active extract of Eriophyllum lanatum, Asteraceae, was further characterized in detail with respect to its molecular mechanism of action. Erioflorin dose-dependently protected both Pdcd4(39-91)luc and endogenous Pdcd4 protein from TPA-induced degradation with IC50s of 1.28 and 2.64 μM, respectively. Pdcd4 stabilizing activity was maximal at 5 μM erioflorin. Up to this concentration, erioflorin was verified not to inhibit p70S6K activity. In addition, it was observed that erioflorin rescued Pdcd4(39-91)luc from both, wild type and constitutively active p70S6K-mediated downregulation. Only wild type p70S6K was inhibitable by the mTOR inhibitor rapamycin which served as an upstream acting control. To study the next section of Pdcd4 regulation, i.e. recognition by the E3 ubiquitin ligase β-TrCP, Pdcd4(39-91)luc and endogenous Pdcd4 were immunoprecipitated from whole cell extracts with the corresponding antibodies. In this key experiment, treatment with TPA increased overexpressed β-TrCP binding to both and this coimmunoprecipitation could be strongly reduced by erioflorin treatment. This result strongly pointed to an inhibitory mechanism of the β-TrCP specific binding to Pdcd4 by erioflorin. In addition, erioflorin disrupted the binding of in vitro transcribed/translated β-TrCP to Pdcd4 in an in vitro interaction assay to exclude nonspecific intracellular signals. Furthermore, polyubiquitination of Pdcd4 was decreased by erioflorin treatment as well. To clarify questions regarding specificity of erioflorin for the E3 ubiquitin ligase β-TrCP, stability of another important β-TrCP target was explored, i.e. the tumor suppressor inhibitor of kappa B alpha (IκBα). Indeed, the tumor necrosis factor alpha (TNFα)-mediated loss of IκBα could be prevented by erioflorin cotreatment. On the other hand, the E3 ubiquitin ligase von Hippel Lindau protein (pVHL) was left unaffected as its target hypoxia inducible factor 1 alpha (HIF-1α) could not be stabilized from oxygen-dependent degradation by erioflorin treatment. These results argued strongly for erioflorin being a specific inhibitor of β-TrCP-mediated protein degradation. Functional consequences of erioflorin treatment were investigated by observing its influence on the transcriptional activities of the transformation marker activator protein 1 (AP-1, an indirect downstream target of Pdcd4) and nuclear factor κB (NF-κB which is directly inhibited by IκBα). Indeed, erioflorin showed significant inhibition of AP-1 and NF-κB reporter constructs at 5 μM, a concentration for which an impact on cell viability was excluded. Finally to characterize the significance of erioflorin in a cell-based tumorigenesis assay, the highly invasive colon carcinoma cell line RKO was tested in a two dimensional migration assay. Erioflorin was discovered to significantly lower cell migration in a wound closure assay.
In conclusion, development of a high throughput compatible cell-based reporter assay successfully identified novel substances from pure synthetic and natural product derived background as potent stabilizers of the tumor suppressor Pdcd4. In addition, this work aimed at elucidating the detailed mechanism of action of the sesquiterpene lactone erioflorin from Eriophyllum lanatum, Asteraceae. Erioflorin was discovered to inhibit the E3 ubiquitin ligase β-TrCP, thereby preventing protein degradation of tumor suppressors like Pdcd4 and IκBα. This may offer the possibility to more specifically target protein degradation and generate less adverse side effects by blocking a particular E3 ubiquitin ligase compared to general proteasome inhibition.
Tumor development usually follows predictable paths where tumor cells acquire common characteristics and features known as the hallmarks of cancer. Recently, additional characteristics have been added to these hallmarks since solid tumors are composed of a very heterogeneous population of transformed, formerly normal tissue cells and stromal cells, e.g. immune cells and fibroblasts. Compelling evidence suggests that stromal cells and tumor cells maintain a symbiotic relationship to build up the tumor microenvironment and to fuel tumor growth. In cancer therapies, common features of tumors such as unrestricted cell growth, suppression of immunological responses, and the ability to form new blood vessels (angiogenesis) have emerged as the main targets of interest. The lipid mediator prostaglandin E2 (PGE2) is known to promote all these features and thus, is connected to cancer progression in general. Its synthesis is triggered in response to stress factors or during inflammation. Inducible PGE2 production relies on the enzymes cyclooxygenase 2 (COX-2) and microsomal prostanglandin E synthase 1 (mPGES-1), which are simultaneously expressed in response to a variety of different stimuli and are functionally coupled. Inhibition of COX-2 with non-steroidal antiinflammatory drugs (NSAIDs) for cancer treatment is, however, limited by cardiovascular risks, since selective COX-2 inhibition disrupts the prostacyclin/thromboxane balance. Therefore targeting mPGES-1 downstream of COX-2 for PGE2 inhibition was evaluated in this work in different steps of carcinogenesis. Knockdown of mPGES-1 in DU145 prostate cancer cells revealed that the mPGES-1 status did not affect growth of monolayer tumor cells, but significantly impaired 3D growth of multi-cellular tumor spheroids (MCTS). Spheroid formation induced COX-2 in DU145 and other prostate cancer spheroids. High levels of PGE2 were detected in supernatants of DU145 MCTS as opposed to monolayer DU145 cells. Pharmacological inhibition of COX-2 and mPGES-1 confirmed the pivotal role of PGE2 for DU145 MCTS growth. Besides promoting spheroid growth, MCTS-derived PGE2 also inhibited cytotoxic T lymphocyte (CTL) activation. When investigating the mechanisms of COX-2 induction during spheroid formation, the typical tumor microenvironmental factors such as glucose deprivation, hypoxia or tumor cell apoptosis failed to enhance COX-2. Interestingly, when interfering with apoptosis in DU145 spheroids, the pan-caspase inhibitor Z-VAD-FMK triggered a Summary 12 shift towards necrosis, thus enhancing COX-2 expression. Coculturing viable DU145 monolayer cells with isolated heat-shocked-treated necrotic DU145 cells, but not with necrotic cell supernatants, induced COX-2 and PGE2, confirming the impact of necrosis for MCTS growth and CTL inhibition. As mentioned, in vivo tumors are very heterogenous mixtures of tumor cells and stromal cells e.g. immune cells. Hence, the interaction of the immune system with tumors was investigated in further experiments. When coculturing MCF-7 breast cancer spheroids with human peripheral blood mononuclear cells (PBMCs), only low levels of PGE2 were detected, since MCF-7 cells did not upregulate COX-2 during spheroid formation and did not induce PGE2 production by PBMCs. Under inflammatory conditions, by adding the toll-like receptor 4 (TLR4) agonist lipopolysaccharide (LPS) to cocultures, PGE2 production was triggered, spheroid sizes were reduced, and numbers of high levels of granzyme B expressing (GrBhi) CTLs were increased, while CD80 expression by tumor-associated phagocytes was also elevated. Inhibition of CD80 but not CD86 diminished numbers of GrBhi CTLs and attenuated spheroid lysis. To determine the role of ctivation-induced PGE2 production, use of the COX-2 inhibitor celecoxib and the experimental mPGES-1 inhibitor C3 further increased CD80 expression. Addition of PGE2, the prostaglandin E2 (EP2) receptor agonist butaprost, and the phosphodiesterase 4 (PDE4) inhibitor rolipram reduced LPS/C3-triggered CD80 expression, confirming the impact of COX- 2/mPGES-1-derived PGE2 on shaping phagocyte phenotypes in an EP2/cAMP-dependent manner. In a spontaneous breast cancer model (MMTV-PyMT), mPGES-1-deficiency significantly delayed tumor growth in mice, confirming an overall protumorigenic role of mPGES-1 in breast cancer development in vivo. However in tumors of mPGES-1-/- mice, tumor-infiltrating phagocytes expressed low levels of CD80 similar to their wildtype counterparts. These data suggest that the immunosuppressive microenvironment does not allow for immunostimulatory effects by mPGES-1 inhibition without an activating stimulus. Evidences in this study recommend the application of mPGES-1 inhibitors for treating cancer diseases, since mPGES-1 promotes tumor growth in multiple steps of carcinogenesis, ranging from well-characterized effects of tumor cell growth to immune suppression of CTL activity and phagocyte polarization. Regarding the latter, blunting PGE2 during immune activation may limit the tumor-favoring features of inflammation and improve the efficiency of TLR4 based immune therapies.
Zur Behandlung von chronisch entzündlichen Erkrankungen besteht nach wie vor ein dringendes medizinisches Bedürfnis, da die bisher eingesetzten Medikamente gerade in der Langzeittherapie zu schwerwiegenden Nebenwirkungen führen können. Um chronisch entzündliche Erkrankungen in Zukunft adäquat therapieren zu können, sind bereits verschiedene neuartige Ansätze in klinischer bzw. präklinischer Entwicklung. Ein möglicher Ansatz besteht in einer dualen Hemmung der mikrosomalen Prostaglandin E2 Synthase-1 (mPGES-1) und der 5-Lipoxygenase (5-LO). Im Rahmen dieser Arbeit wurden die Struktur-Wirkungs-Beziehungen (SAR) von zwei verschiedenen Leitstrukturen an der 5 LO und der mPGES 1 untersucht. Die erste Leitstruktur entstammt aus den Arbeiten von Waltenberger et al. und besitzt im Grundgerüst eine Sulfonamidstruktur. In dieser Arbeit ist es gelungen, durch eine gezielte Untersuchung der Struktur-Wirkungsbeziehungen, die Leitstruktur I an der 5 LO und der mPGES-1 in ihrer Potenz zu optimieren. Die Leitstruktur (IC50: 5-LO (zellfrei) = 5.7 µM, IC50: 5 LO (PMNL) = 3.7 µM, IC50: mPGES-1 = 4.5 µM) konnte durch Variation in allen drei Positionen modifiziert werden, so dass die optimierte Struktur 170 (IC50: 5-LO (zellfrei) = 2.3 µM, IC50: 5-LO (PMNL) = 0.4 µM, IC50: mPGES-1 = 0.7 µM) entstanden ist. Für die Verbindung 170 wurden die pharmakokinetischen Eigenschaften, wie Löslichkeit und metabolische Stabilität, sowie der Wirkmechanismus auf molekularer Ebene bestimmt. Ebenso konnte für Verbindung 170 auch in vivo anti-entzündliche Eigenschaften festgestellt werden.
Die zweite Leitstruktur stammt ebenfalls aus den Arbeiten von Waltenberger et al. und besitzt im Grundgerüst eine Mercaptobenzothiazol-Grundstruktur. Aufgrund der Ähnlichkeit zu den bekannten Pirinixinsäurederivaten wurde auch hier für die Untersuchung der Struktur-Wirkungs-Beziehungen zunächst eine Kettenverlängerung an der Alkylkette vorgenommen. Es ließ sich auch hier durch eine gezielte SAR, die Leitstruktur bis hin zum submikromolaren Bereich in Verbindung 219 optimieren. Gleichzeitig ist es gelungen in Verbindung 219 einer der am potentesten dual ausgeglichensten dualen 5 LO/mPGES-1 Inhibitoren zu identifizieren.
Zusammenfassend lässt sich sagen, dass in dieser Arbeit es gelungen ist durch gezielte Untersuchungen der Struktur-Wirkungs-Beziehungen zwei verschiedene Substanzklassen zu dualen 5-LO/mPGES-1 Inhibitoren zu optimieren. Ebenso konnte für Substanz 170 auch in vivo anti-entzündliche Eigenschaften festgestellt werden. Diese Arbeit soll dazu beitragen, das therapeutische Potential von dualen 5-LO/mPGES-1 Inhibitoren als anti-entzündliche Wirkstoffe in Zukunft besser einschätzen zu können.
Der ligandaktivierte Transkriptionsfaktor Farnesoid X Rezeptor (FXR) ist neben seiner Funktion als Regulator des Gallensäurehaushaltes auch in vielen anderen metabolischen Prozessen wie Glukose- und Lipidhomöostase involviert und besitzt antiinflammatorische Eigenschaften. Gerade bei hepatischen, gastrointestinalen und systemischen Erkrankungen erscheint FXR daher als interessante Zielstruktur zur Behandlung metabolischer Erkrankungen. Basierend auf den natürlichen Liganden von FXR, den Gallensäuren, wurde Obeticholsäure (OCA) als seminsynthetisches Derivat der endogenen Chenodesoxycholsäure zu einem potenten FXR-Agonisten entwickelt. OCA wurde in mehreren Studien auf seine therapeutische Wirkung bei hepatisch-entzündlichen Krankheitsbildern wie der primären biliären Cholangitis (PBC), der nicht-alkoholischen Fettleber (engl: non-alcoholic fatty liver disease, NAFLD) und der daraus folgenden nicht-alkoholischen Steatohepatitis (NASH) getestet. Mittlerweile ist OCA als Zweitlinientherapie der PBC auf dem Arzneimittelmarkt zuge-lassen. Neben OCA gibt es noch eine große Anzahl an weiteren FXR-Liganden, deren strukturelle Diversität von Steroiden bis nicht-steroidalen kleinen Molekülen (engl: small molecules) reicht. Trotz dieser Erfolge muss das Therapiepotential von FXR noch weiter ausgebaut werden. Die meisten verfügbaren Liganden besitzen in vitro zwar eine hohe Potenz, können in ihrem pharmakokinetischen Profil oder ihrer Selektivität gegenüber anderen nukleären Rezeptoren aber nicht überzeugen.
Die hier vorliegende Arbeit hat sich mit der Entwicklung unterschiedlicher Liganden für FXR beschäftigt und diese in vitro und teilweise auch in vivo charakterisiert, um sie entsprechend ihrer Wirkungsweise einzuordnen und ein besseres Verständnis der regulatorischen Funktion von FXR zu erlangen.
Modulation von FXR bezieht sich nicht nur auf die agonistische Aktivierung, sondern setzt sich auch mit Antagonismus auseinander. Neben einigen Krankheitsbildern, die aus einer Überexpression von FXR resultieren, werden Antagonisten als Werkzeug (engl: tool compound) zur Aufklärung von konformellen Veränderungen von FXR und deren Auswirkung auf bestimmte Signalwege benötigt. Für die Erforschung solcher FXR-Antagonisten sollte das Potential nicht-steroidaler Antirheumatika (engl: non-steroidal anti-rheumatic drugs, NSAIDs) als etwaige Leitstrukturen untersucht werden, da in einer Veröffentlichung von Lu et al. ein FXR-Antagonismus durch NSAIDs postuliert wurde. Beim Versuch der Reproduktion der Ergebnisse von Lu et al. mit den drei NSAIDs Ibuprofen, Indometacin und Diclofenac wurde festgestellt, dass die Effekte auf den ersten Blick antagonistisch erscheinen, aber bei genaueren biochemischen Untersuchungen zweifelsfrei als Zytotoxizität identifiziert wurden.
FXR-Antagonisten wie Guggulsteron oder Gly-MCA sind auf ihre therapeutische Wirksamkeit unter-sucht worden, aber die genaue Wirkweise ist noch nicht aufgeklärt. Aufgrund ihrer steroidalen Grundstruktur ist ihre Selektivität gegenüber anderen nukleären Rezeptoren fraglich. Die überschaubare Anzahl an publizierten nicht-steroidalen FXR-Antagonisten besitzt zwar moderate IC50-Werte, ihre strukturelle Diversität und Selektivität ist aber limitiert. Zur Entwicklung neuer potenter FXR-Antagonisten, die aus kleinen Molekülen (engl: small molecules) aufgebaut sind, wurde eine N-Phenylbenzamid-Leitstruktur ausgewählt. Diese Leitstruktur wurde im Rahmen der SAR-Unter-suchungen zur Entwicklung von Anthranilsäurederivaten als FXR-Partialagonisten innerhalb des Arbeitskreises entdeckt. Ausgehend von dieser Leitstruktur wurde eine mehrstufige, systematische SAR-Untersuchung durchgeführt, wodurch ein sehr potenter FXR-Antagonist entwickelt werden konnte, der anschließend umfangreich biochemisch auf FXR-Modulation, Selektivität, Löslichkeit, Toxizität und metabolische Stabilität charakterisiert wurde.
Neben dem Verständnis eines Modulationsmechanismus ist die konkrete Anwendung eines FXR-Liganden zu therapeutischen Zwecken von großem Interesse. Die Beteiligung von FXR in unterschiedlichen metabolischen Prozessen macht den Rezeptor zu einem begehrten Ansatzpunkt für die Wirkstoffentwicklung. Doch die Behandlung eines multifaktoriellen Krankheitsbildes (z.B. metabolisches Syndrom, NASH) sollte sich nicht nur auf einen der gestörten Signalwege beziehen, da diese Erkrankungen durch mehrere Faktoren ausgelöst oder beeinflusst werden. Der semisynthetische FXR-Agonist OCA zeigte innerhalb der FLINT-Studie sowohl antientzündliche und antifibrotische Effekte, als auch eine Verbesserung der metabolischen Parameter mit Blick auf NAFLD und NASH. Die lösliche Epoxidhydrolase (engl: soluble epoxidhydrolase, sEH) besitzt nachweislich anti-inflammatorische und antisteatotische Effekte in der Leber. Aus diesem Grund wurde eine Leitstruktur entwickelt, die eine duale Modulation aus FXR-Aktivierung und sEH-Inhibition erzeugt. Dafür wurden die Pharmakophore eines im Arbeitskreis entwickelten FXR-Partialagonisten sowie eines potenten sEH-Inhibitors miteinander verknüpft. Zur Weiterentwicklung einer ausgewogenen hohen Potenz beider Modulationsfaktoren wurden mehrere unterschiedliche SAR-Untersuchungen als translationales Projekt in mehreren Arbeiten durchgeführt. In der hier vorliegenden Arbeit konnten dieses SAR-Untersuchungen zusammengeführt und weiterentwickelt werden. Dabei wurde ein ausgewogener und hochpotenter dualer Modulator erhalten, der umfassend in vitro und in vivo charakterisiert wurde. Die gezielte duale Aktivität, die mit dieser Substanz erreicht wurde, führt in einem Krankheitsbild zu synergistischer Ergänzung zweier Therapieoptionen. Jedoch kann eine unerwünschte Promiskuität über verwandten nukleären Faktoren zu Nebenwirkungen führen. Die Ursache dafür kann eine saure Funktion darstellen. Ein sehr potenter nicht-azider FXR-Agonist mit einem subnanomolaren EC50-Wert konnte im Arbeitskreis entwickelt werden. Diese Verbindung ist FXR-selektiv, hat keinen toxischen Effekt auf HepG2-Zellen und eine moderate metabolische Halbwertszeit. Die qRT-PCR-Untersuchung direkter und indirekter FXR-Zielgene zeigte eine verstärkte Expression nach der Inkubation mit der nicht-aziden Substanz. Dadurch lässt sich das Prinzip der Nebenwirkungsminderung durch nicht-azide Verbindungen beweisen.
Insgesamt konnte in dieser Arbeit gezeigt werden, wie vielfältig und vielversprechend eine FXR-Modulation aufgebaut sein kann. Zum einen konnte über eine ausgeprägte biochemische Evaluation eine Differenzierung zwischen FXR-Antagonismus und Zelltoxizität bewiesen werden, worauf sich aufbauend eine genaue in vitro-Charakterisierung von neuen N-phenylbenzamidbasierten FXR-Antagonisten durchführen ließ, die ausgehend von einer moderat potenten Leitstruktur zu einer sehr potenten optimierten Substanz entwickelt wurden. FXR-Antagonismus und die dazu passenden tool compounds sind nicht nur von Bedeutung zum besseren Verständnis der unterschiedlichen Bindungsmodi des FXR, sondern auch potentielle Therapieansätze zur Behandlung von Krankheiten, in denen eine FXR-Überexpression stattfindet. Die agonistische Modulation von FXR wurde genauer betrachtet in der in vitro-Untersuchung nicht-azider FXR-Agonisten, die durch das Fehlen einer sauren Funktion ein hohes Maß an Selektivität und dabei eine geringe Toxizität aufwiesen. Synergistische Effekte zur Behandlung eines multifaktoriellen Krankheitsbildes durch die Kombination von FXR-Partialagonismus und sEH-Inhibition konnte durch die Entwicklung der potenten und balancierten Substanz sowohl in vitro als auch in vivo bewiesen werden, wodurch diese Verbindung ein vielversprechender Kandidat für weitere klinische Entwicklung ist.
Die humane 5-LO ist das Schlüsselenzym in der LT-Biosynthese. LTs sind wichtige Entzündungsmediatoren und sind in einer Vielzahl von Krankheiten involviert, u. a. Asthma, Atherosklerose, rheumatische Arthritis, Sepsis, allergischen Reaktionen und in vielen Krebsarten. Die Struktur der 5-LO besteht aus 673 Aminosäuren und besitzt ein Molekulargewicht von 78 kDa. Sie ist in zwei Domänen unterteilt: die kleinere C2-ähnliche regulatorische Domäne (C2ld) und der größeren katalytischen Domäne. Die 5-LO besitzt NIS und NES, die für die zelluläre Lokalisation der 5-LO verantwortlich sind. Außerdem wird die Lokalisation noch von Phosphorylierungsstellen reguliert, die auf der katalytischen Domäne identifiziert werden konnten. 2011 konnten Häfner et al. zeigen, dass die 5-LO in der Lage ist Homodimere zu bilden.
Wie für die meisten anderen humanen Gene konnten auch bei der 5-LO alternative Spleißvarianten identifiziert werden. Schon 1992 konnten die ersten unterschiedlich gesüleißten Transkripte in Hirntumoren und differenzierten HL-60-Zellen gefunden werden. Später konnten weitere Isoformen in verschiedenen Zelllinien entdeckt werden.
In der vorliegenden Arbeit wurden die alternativen Spleißvarianten 5-LO∆13, 5-LO∆4 und 5-LOp12 untersucht und charakterisiert. Auf mRNA-Ebene wurde die Expression des 5-LO-WT und deren Isoformen sowohl in B- und T-Zelllinien als auch primären B- und T-Zellen, monozytären Zelllinien und primäre Monozyten aus Patientenproben (RA und Sepsis) untersucht. Es wurde festgestellt, dass das Expressionsprofil der 5-LO-Varianten zellspezifisch ist. Im Vergleich zu den T-Zellen konnte in B-Zelllinien ein höheres Expressionslevel detektiert werden. Des Weiteren zeigte sich interessanterweise ein stark erhöhtes Expressionslevel in primären Monozyten von RA- und Sepsis-Patienten.
Untersuchungen der 5-LO-Aktivität ergaben unterschiedliche Ergebnisse, abhängig von der Transfektionsmethode. Als transiente Transfektion diente die Calciumphosphat-Methode. Für die stabile Integration der HEK293T-Zellen wurde die Sleeping Beauty-Methode gewählt. Hierfür wurden Proteine mit einem GFP bzw. mCherry-Tag (GFP-5-LO-WT, mCherry∆13, mCherry∆4, mCherryp12) verwendet, um diese mittels Konfokalmikroskop visualisieren zu können. Nach transienter Transfektion konnte eine Inhibition der 5-LO-Aktivität nach Kotransfektion mit jeweils einer Isoform gemessen werden. Nach stabiler Integration jedoch zeigte sich eine Steigerung der 5-LO-Produktbildung. Mit Hilfe von Western Blots wurden Expressionskontrollen angefertigt und die Menge des 5-LO-WT quantifiziert. In transient transfizierten Zellen wurde eine Erniedrigung der Expression des 5-LO-WT bestimmt, wohingegen in stabil integrierten Zellen ein Anstieg des 5-LO-WT als auch der Isoformen beobachtet werden konnte. Einerseits könnte dies einem Artefakt der Transfektionmethode zugrunde liegen, andererseits könnte es ein Hinweis darauf sein, dass sich die Proteine gegenseitig in ihrer Expression beeinflussen.
Ebenso wurde die Lokalisation der 5-LO und deren Isoformen untersucht. Es konnte gezeigt werden, dass die 5-LO überwiegend im Zellkern lokalisiert ist, während alle alternativen Protein-Isoformen im Zytosol zu finden waren. Durch Ionophor-Behandlung wurde eine Translokation des 5-LO-WT an die Kernmembran detektiert, die Isoformen verblieben im Zytosol. Überraschenderweise konnte beobachtet werden, dass die Spleißvariante 5-LO∆13 mit höherer Ionophor-Konzentration ebenso in der Lage ist an die Kernmembran zu translozieren. Um eine mögliche Interaktion der 5-LO mit den Isoformen zu untersuchen, sollten alle Proteine im selben Zellkompartiment lokalisiert sein. Dafür wurden verschiedene Stimuli und Mutationen getestet. Mit der Mutante GFP-5-LO-S271A und dem Stressstimulus Sorbitol und den CaMKII/p38-Inhibotoren KN-93/SB203580 konnte eine Translokation in das Zytosol erreicht werden. Die Ergebnisse der anschließenden Aktivitätsassays zeigten, dass die Isoformen keinen Einfluss auf die Aktivität der 5-LO ausüben.
Des Weiteren wurden die Phosphorylierungen an S523 und S271 von 5-LO-WT, 5-LO∆13, 5-LO∆4 und 5-LOp12 untersucht. Es wurde herausgefunden, dass die 5-LO-Proteine unterschiedliche Phosphorylierungsmuster aufweisen. Während 5-LO-WT und 5-LO∆4 eine schwache Phosphorylierung an S271 aufzeigen, konnte eine starke Phosphorylierung der 5-LO∆13 und 5-LOp12 detektiert werden. Im Vergleich dazu zeigte lediglich die Isoform 5-LOp12 eine sehr starke Bande an der Phosphorylierungsstelle S523. Bei beiden Phosphorylierungen konnten deutlich stärkere Signale nach Kotransfektion gemessen werden. Durch Klonierung eines P2A-Linkers zwischen 5-LO und des GFP-Tags, konnten die Isoformen vom 5-LO-WT in Western Blots voneinander getrennt werden. Dies zeigte, dass es zu einer Hochregulation der Expression der alternativen 5-LO-Varianten nach Kotransfektion mit dem WT führte, aber auch, dass die stärkere Phosphorylierung nach Kotransfektion unabhängig von der Proteinmenge ist.
The importance of RNA in molecular and cell biology has long been underestimated. Besides transmitting genetic information, studies of recent years have revealed crucial tasks of RNA especially in gene regulation. Riboswitches are natural RNA-based genetic switches and known only for ten years. They directly sense small-molecule metabolites and regulate in response the expression of the corresponding metabolic genes. Within recent years, artificial riboswitches have been developed that operate according to user-defined demands. Hence, they represent powerful tools for synthetic biology.
This study focused on the development of engineered catalytic riboswitches for conditional gene expression in eukaryotes. A self-cleaving hammerhead ribozyme was linked to a tetracycline binding aptamer in order to regulate ribozyme cleavage allosterically with tetracycline. By integrating such a hybrid molecule into a gene of interest, mRNA cleavage and thereby gene expression is controllable in a ligand dependent manner. The linking domain between ribozyme and aptamer was randomised. Tetracycline inducible ribozymes were isolated after eleven cycles of in vitro selection (SELEX). 80% of the analysed ribozymes show cleavage that strongly depends on tetracycline. In the presence of 1 μM tetracycline, their cleavage rates are comparable to that of the parental hammerhead ribozyme. In the absence of tetracycline, cleavage rates are inhibited up to 333-fold. The allosteric ribozymes bind tetracycline with similar affinity and specificity as the parental aptamer. Ribozyme cleavage is fully induced within minutes after addition of tetracycline. Interestingly, the isolated linker domains exhibit structural consensus motives rather than consensus sequences.
When transferred to yeast, three switches reduced reporter gene expression by 30 - 60% in the presence of tetracycline; none of them controlled gene expression in mammalian cells. In vitro selected molecules do not necessarily retain their characteristics when applied in a cellular context. Therefore, high throughput screening and selection systems have been developed in mammalian cells. The screening system is based on two fluorescent reporter proteins (GFP and mCherry). 1152 individual constructs of the selected ribozyme pool were tested, but none of them reduced reporter gene expression significantly in the presence of tetracycline. The selection system employs a fusion peptide encoding two selection markers (Hygromycin B phosphotransferase and HSV thymidine kinase) facilitating both negative and positive selection. 6.5 x 104 individual constructs of the selected ribozyme pool are currently under investigation.
5-Lipoxygenase (5-LO) catalyzes the two initial steps in the biosynthesis of leukotrienes, a group of inflammatory lipid mediators derived from arachidonic acid. Here, the regulation of 5-LO mRNA expression by alternative splicing and nonsense-mediated mRNA decay (NMD) was investigated. In the present study, the identification of two truncated transcripts and four novel 5-LO splice variants containing premature termination codons (PTC) was reported. The characterization of one of the splice variants, 5-LOΔ3, revealed that it is a target for NMD since knockdown of the NMD factors UPF1, UPF2 and UPF3b in the human monocytic cell line Mono Mac 6 (MM6) altered the expression of 5-LOΔ3 mRNA up to 2-fold in a cell differentiation-dependent manner suggesting that cell differentiation alters the composition or function of the NMD complex. In contrast, the mature 5-LO mRNA transcript was not affected by UPF knockdown. Thus, the data suggest that the coupling of alternative splicing and NMD is involved in the regulation of 5-LO gene expression.
RT-PCR analysis of different cell types revealed the existence of a large number of 5-LO splice variants. The most interesting splice variants were observed in BL41-E95A cells, which give a raise to novel 5-LO protein isoforms. This leads to the hypothesis of a novel regulatory mechanism in which the dimerization of 5-LO with 5-LO isoforms might regulate the 5-LO activity.
The 5-LO protein expression was reduced on translational level in UPF1 knock down cells, suggesting that UPF1 has a positive influence on 5-LO translation. Therefore, a mass spectrometry based proteomics study was started to identify compartment specific protein expression changes upon UPF1 knockdown in differentiated and undifferentiated MM6 cells. The proteomics analysis demonstrated that the knockdown of UPF1 results in numerous protein changes in the microsomal fraction (~ 21%) but not in the soluble fraction (< 1%). Western blot data confirmed the trend of the proteomics analysis. This data suggest that UPF1 is a critical gene expression regulator in a compartment specific way. During differentiation by TGFβ and calcitriol the majority of UPF1 regulated proteins was adjusted to normal level. It appears that that not only the NMD mechanism alters its composition during differentiation. Also the gene expression regulation on translational level by UPF1 seems to be also cell differentiation dependent. An interesting group of UPF1 target genes represent the downregulated proteins. qRT-PCR analysis of randomly chosen genes revealed no effect on mRNA expression upon UPF1 knockdown, suggesting that UPF1 positively influences the translation of these genes. Computational sequence analysis identified a conserved C-rich sequence which might be a hnRNP E2-binding site. hnRNP E2 has been characterized as a translational repressor in myeloid cells. Western blot analysis revealed a differentiation independent up regulation of hnRNP E2 by UPF1 knockdown. Additionally, microRNA-328 (miR-328) has been described as an RNA decoy modulating hnRNP E2 regulation. Due to this, stem loop qRT-PCR showed an up regulation of miR-328 in TGFβ and calcitriol differentiated MM6 cells. Based on this data we suggest a model in which downregulation of UPF1 increases hnRNP E2 expression, leading to translation inhibition. During differentiation, miRNA-328 is upregulated thereby competing with hnRNP E2 leading to an efficient translation
5-lipoxygenase (5-LO) catalyzes the first two steps in leukotriene (LT) biosynthesis. In a two step reaction the enzyme oxygenates arachidonic acid (AA) to form the highly unstable epoxide leukotriene A4 (LTA4) in dehydrating a hydroperoxide intermediate (20). LTA4 can then be further metabolized by two terminal synthases yielding either the potent chemoattractant leukotriene B4 (LTB4) or the cysteinyl leukotrienes (CysLTs). 5-LO enzyme expression is primarily found in mature leukocytes (22) where it can either reside in the cytoplasm or in the nucleus associated with euchromatin (29). Its enzymatic activity is embedded in a complicated network in intact cells regulating LT synthesis by various factors dependent on the cell type and nature of stimulus. Factors such as the amount of free AA released by phospholipase A2 enzymes, levels of enzymes involved, catalytic activity per enzyme molecule and availability of different small molecules influence 5-LO activity (36).
The 5-LO derived LTs are lipid mediators which were shown to primarily mediate inflammatory and allergic reactions and their role in the pathogenesis of asthma is well defined. CysLTs are among the most potent bronchoconstrictors yet studied in man and play an important role in airway remodeling. LTB4 has no bronchoconstrictory effects in healthy and asthmatic humans but displays potent chemoattractant properties on neutrophils and increases leukocyte adhesion to the vessel wall endothelium (22). Therefore, LTB4 enhances the capacity of macrophages and neutrophils to ingest and kill microbes. In concert with LTB4, histamine and prostaglandin E2 (PGE2) CysLTs are thought to maintain the tone of the human airways (82).
Besides their well studied role in asthma, 5-LO derived LTs have also been implicated to play a role in cardiovascular diseases and cancer. In contrast to healthy tissues, LT pathway enzymes and receptors were found to be abundantly expressed in cancer tissues, atherosclerotic lesions in the aorta, heart and carotid artery (86). Pharmacological inhibition of 5-LO potently suppressed tumour cell growth by inducing cell cycle arrest and triggering cell death via the intrinsic apoptotic pathway (92, 93). In several studies LTs were found to exhibit cardiovascular actions by promotion of plasma leakage in postcapillary venules, coronary artery vasoconstriction and impaired ventricular contraction leading to reduced coronary blood flow and cardiac output (24). Unfortunately, the precise molecular mechanisms through which LTs influence carcinogenesis and cardiovascular diseases are still incompletely understood.
In contrast, an increasing number of studies questions the correlation between 5-LO and cancer (95-97) since extreme LT concentrations were applied to induce proliferative effects in the majority of the publications. A few studies exist which show susceptibility towards 5-LO products in physiological concentrations or achieve anti-proliferation by applying low concentrations of 5-LO inhibitors (98) ...
The enzyme 5-lipoxygenase (5-LO) occupies a central role in the biosynthesis of inflammatory leukotrienes and thus takes part in the pathogenesis of related diseases. Its occurrence is mainly restricted to cells of the immune system including granulocytes, monocytes/macrophages or B-lymphocytes and can be induced by cell differentiation of myeloid cells after treatment with differentiating agents, such as DMSO, retinoic acid or the combination of TGFβ/1,25(OH)2D3. The latter contribute to the highest level of induction of mRNA and protein expression. Its cell specific occurrence is at least partly due to DNA methylation in cells that do not exhibit 5-LO activity and genetic regulation is further dependent on histone acetylation. 5-LO expression is controlled by transcription factors binding to the promoter sequence of the ALOX5 gene that induce basal promoter activity, as well as promoter independent effects including transcript initiation and elongation, which are mostly attributed to TGFβ/1,25(OH)2D3 signaling. The ALOX5 gene resembles a typical housekeeping gene, hence lacks TATA- or CAAT-boxes for transcriptional regulation, but displays a high GC-content with eight GC-boxes, five of which are arranged in tandem, that provide binding sites for transcription factors Sp1, Sp3 and Egr-1.
The proximal ALOX5 promoter is furthermore a target for additional factors, such as TGFβ effector proteins SMADs or the vitamin D receptor and possesses additional consensus sequences for transcriptional regulators, including NF-κB or PU.1. However, as yet no actual binding of these proteins to the promoter sequence was demonstrated and an unbiased screening for identifying further ALOX5 promoter interacting proteins, which might have impact on 5-LO expression, is still lacking. For this purpose, the present study focused on the identification of significantly interacting proteins, employing DNA-affinity enrichment coupled to label-free quantitative proteomics, spanning a sequence of about 270 base pairs of the proximal ALOX5 promoter. For the elucidation of potential cell specific differences in protein patterns and compositions, DNA pulldowns were performed by using oligonucleotide stretches comprising the core promoter sequence including the 5-fold GC-box, which were incubated with different cell lines and differentiation states of myeloid, as well as B-lymphocytic lineages. In order to compare different mass spectrometric quantification strategies that would allow for identification of interactors, dimethyl labeling and label-free techniques were used. Since the label-free approach outperformed the label-based one in initial experiments, it was established as standard quantification strategy in all DNA pulldowns performed. The pulldowns of myeloid cell lines in both undifferentiated and differentiated state and B-lymphocytes resulted in a cell-unspecific protein pattern whose composition was similar, regardless of cell lineage. Additionally, further DNA sequences comprising either a vitamin D response element or a SMAD binding element were investigated in the promyelocytic model cell line HL-60 in both undifferentiated and differentiated state. The identified proteins confirmed known interaction partners and furthermore revealed novel potential regulators of the 5-LO promoter. Out of these, the most prominently identified and promising proteins included transcription factors of the KLF- and CCAAT/enhancer binding protein-family. In this context, KLF5 and KLF13 are both involved in the regulation of inflammatory processes, the former additionally being an effector protein of TGFβ-signaling, whose functional characterization is of utmost interest in terms of regulation of 5-LO expression. Further protein characterization will be inevitable for the CCAAT/enhancer binding proteins C/EBPα, C/EBPβ and C/EBPε. These transcription factors are involved in the regulation of inflammatory processes and heterodimers thereof (C/EBPα/β) are known to control TGFβ/1,25(OH)2D3-mediated effects of the CD14 gene.
Several of the identified proteins of the pulldowns containing the tandem GC-box represented interactors of G-quadruplex DNA, including the helicases BLM and DHX36, the ribonucleoproteins hnRNP D and hnRNP K and transcription factor MAZ. Since G-quadruplexes form in G-rich DNA sequences as secondary DNA structures and exhibit substantial regulatory effects on the transcription of their target genes, the potential formation thereof in the ALOX5 core promoter sequence was investigated in a second project. Out of the proteins mentioned above, MAZ is shown to exert resolving effects on G4-DNA and synergistically induce Sp1-dependent gene activation of oncogene h-RAS, which displays analogous promoter characteristics to the ALOX5 gene. A DNA stretch comprising the tandem GC-box was used for elucidating the potential of secondary DNA structure formation. Intriguingly, both immune-based and spectroscopic methods provided clear evidence for the in vitro G-quadruplex formation of the proximal promoter sequence for the first time. In order to provide additional information on a possible regulatory effect of existing G-quadruplex structures on 5-LO transcription, differentiated HL-60 cells were subsequently treated with two distinct G4-DNA stabilizing agents. A porphyrin analogon (TMPyP4) did not exhibit any effects on 5-LO mRNA and protein expression after cell treatment. A second G4-DNA stabilizing agent (pyridostatin) on the other hand revealed significant reduction on 5-LO protein expression after cellular treatment. These mixed results render further experiments inevitable, in order to provide a clear assertion as to whether 5-LO expression is regulated by G-quadruplex structures or not.
Altogether, this study enlarges the knowledge of ALOX5 proximal promoter interacting proteins by corroborating the binding of already known transcription factors and identifying novel interactors. It yields essential groundwork for subsequent functional studies of proteins involved in 5-LO transcription and introduces G-quadruplexes as a new potential mechanism in ALOX5 gene regulation.
Die 5-Lipoxygenase (5-LOX) stellt den Startpunkt des Leukotrienstoffwechsels dar, da sie Arachidonsäure (AA) über die 5(S)-Hydroperoxy-6-trans-8,11,14-cis-eicosatetraensäure (5-HpETE) in Leukotrien A4 (LTA4) umwandelt. 5-HpETE kann zum korrespondierenden Alkohol 5(S)-Hydroxy-6-trans-8,11,14-cis-eicosatetraensäure (5-HETE) reduziert werden. LTA4 dient als Zwischenprodukt für die Synthese von LTB4 und den Cysteinyl-gebundenden LTs LTC4, LTD4 und LTE4. LTs nehmen eine wichtige Funktion in der Immunabwehr ein, sind jedoch auch an einer Vielzahl von Krankheitsgeschehen wie z. B. Asthma bronchiale, Atherosklerose und einiger Tumorarten beteiligt. Die 5-LOX teilt sich in zwei Domänen auf: der reglatorischen, N-terminalen Domäne und der katalytischen, C-terminalen Domäne. Ihre Aktivität unterliegt einer komplexen allosterischen Regulation und kinetischen Besonderheiten wie einer Substratinhibition. In vielen Fällen ist die regulatorische PLAT-(Polycystin-1, Lipoxygenase, alpha-Toxin)-Domäne involviert. Sie ist essentiell an der Bindung von Calcium, Membranen und weiterer Faktoren wie dem Coactosin-like protein (CLP) und Dicer beteiligt. Auch eine zweite Bindungsstelle für das Substrat oder einen seiner Metaboliten wird dort vermutet. Letztlich bleibt jedoch die Regulation der 5-LOX-Aktivität durch die PLAT-Domäne unzureichend geklärt. Diese Tatsache und die fortwährende Suche nach neuen Ansatzpunkten für die 5-LOX-Inhibition bilden den Hintergrund, vor dem diese Arbeit angefertigt wurde.
Das Ziel lag in der Entwicklung einer stabilen, isolierten PLAT-Domäne und deren Charakterisierung. Es stellte sich jedoch heraus, dass sich die isolierte Domäne durch eine hohe thermische Instabilität und starke Aggregationsneigung auszeichnet. Mittels Mutationsstudien auf Basis der 5-LOX AS 1-115, verbunden mit Gelfiltrationsläufen zur Analyse der Proteinaggregation, wurde schließlich ein Konstrukt entwickelt, das in Konzentrationen < 0,5 mg/ml als Monomer vorlag: die sogenannte PLAT1-115 W75G. Ein Austausch des W75 in Glycin erhöhte ebenfalls die thermische Stabilität, so dass Versuche bei 20°C durchgeführt werden konnten. Zunächst wurden jedoch die grundlegenden Eigenschaften der Mutante untersucht. Dies umfasste die Beantwortung der Frage, ob auch die PLAT1-115 W75G Calcium bindet, sowie die Aufnahme eines Circulardichroismus-(CD)-Spektrums. Der erste Aspekt konnte mit mehreren Methoden bestätigt werden. Eine Calciumzugabe zum Laufpuffer 20 mM MOPS, 50 mM KCl pH 7,4 erhöhte konzentrationsabhängig das Elutionsvolumen der PLAT1-115 W75G auf der analytischen Gelfiltrationssäule – vermutlich durch den bekannten Einfluss von Calcium auf die Hydrophobizität der PLAT-Domäne. Zusätzlich wurde die Interaktion durch differential scanning fluorimetry (DSF) und Oberflächen-Plasmonen-Resonanz-Spektroskopie (SPR) nachgewiesen. Allerdings gelang aus verschiedenen Gründen keine Quantifizierung der Bindungsaffinität. Das CD-Spektrum bestätigte die Struktur der PLAT-Domäne als sogenanntes all-beta_protein und ermöglichte die Einordnung der PLAT1-115 W75G in die Gruppe der betaII-Proteine.
Ein weiterer Fokus dieser Arbeit lag auf der vermuteten allosterischen Fettsäurebindungsstelle in der PLAT-Domäne. Es wurde versucht, die Interaktion mittels SPR nachzuweisen. Zur Vorbereitung wurde im 5-LOX-Aktivitätstest und im DSF an der isolierten Domäne ein Detergens bestimmt, das einen möglichst geringen Einfluss auf das Protein ausübt. Dabei zeigte Octyl-beta-D-glucopyranosid (beta-OG) das vorteilhafteste Profil. Auf dieser Basis wurde die kritische Mizellbildungs-Konzentration (CMC) der AA und einiger HETEs in beta-OG-haltigen Puffern bestimmt. Die SPR-Studien ergaben jedoch keine reproduzierbaren Ergebnisse. In einem weiteren Schritt wurden die Substrathemmung des Gesamtproteins 5-LOX und der Einfluss von Calcium charakterisiert. Sowohl in Gegenwart von ~ 1 mM freiem Calcium als auch von 1 mM EDTA lag mit 20 µM AA die höchste Produktbildung nach 10-minütiger Reaktion vor. Das Detergens Tween20 (T20) hob in einer Konzentration unter seiner CMC (0,001 % m/V) in Anwesenheit von Calcium die Inhibition auf. Ohne Calcium zeigte sich auch in Gegenwart von T20 die bekannte Substratinhibition der 5-LOX einschließlich ihrer Maximalaktivität bei 20 µM AA. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass Calcium eine Bindung der 5-LOX an eventuell vorhandene, negativ geladene Vesikel aus AA und Detergens vermitteln und dadurch die Substratinhibition aufheben kann. In Fällen, in denen die Substratinhibition vor dem Erreichen der AA-CMC auftritt, hat Calcium folglich keinen Einfluss.
Zuletzt wurde die Interaktion der PLAT1–115 W75G mit CLP und einem C-terminalen Fragment von Dicer untersucht. Im Crosslinking ließ sich nicht auf eine Interaktion der isolierten PLAT-Domäne mit CLP schließen. Dagegen ergaben Diamid-Crosslinking-Studien, dass die isolierte PLAT-Domäne in der Lage ist, das Dicer-Fragment zu binden. Dieses Ergebnis wurde im SPR bestätigt.
Sphingolipide sind an zahlreichen physiologischen und pathophysiologischen Prozessen im Körper beteiligt. Vor Allem das sowohl auto- als auch paracrinwirkende Sphingosin-1-Phosphat (S1P) spielt dabei eine essentielle Rolle. Ein Großteil der S1P-vermittelten / regulatorischen Effekte beruht auf dessen Wechselwirkung mit den fünf G Protein-gekoppelten S1P-Rezeptoren (S1P1-5). S1P nimmt hierüber Einfluss auf das Schicksal der Zellen (Proliferation, Überleben, Migration), die Zellmobilität, die Angiogenese und das Immunsystem. Viele der über die S1P-Rezeptor-vermittelten Effekte sowie deren Rolle und Funktion in einzelnen Geweben oder Organen sind bis heute noch nicht komplett verstanden bzw. erklärbar. Pharmakologische Tools können einen wichtigen Beitrag zur weiteren Erforschung und zum Verständnis des komplexen Sphingolipidnetzwerks leisten. Ausgehend von einer substituierten Diaryl-1,2,4-oxadiazol-Leitstruktur, die in der Literatur als privilegierte Struktur für S1P1-Rezeptoragonisten gilt, und dem selektiven S1P1-Agonisten SEW2871 wurden verschiedene Liganden mit unterschiedlichen chemischen Gruppen synthetisiert. Nach der Etablierung eines Synthesewegs zu etherverknüpften Aminoethan-diphenyl-1,2,4-oxadiazolen wurden diese in die fluoreszierenden Dansyl-, Isoindolin-, Pyridinium-Dye- und Coumarin-gelabelten Derivate überführt. Außerdem wurde eine einfache und optimierte Syntheseroute zu dem kleinen, umgebungsempfindlichen Fluorophor 4-(Dimethyl-amino)phthalimid (4-DMAP) entwickelt, dass entlang eines linearen Synthesewegs in guten Aus-beuten auch mit den Trifluormethyl- und Methyl-substituierten Diphenyloxadiazol-Grundstrukturen zu fluoreszenzmarkierten Derivaten umgesetzt wurde. Neben den fluoreszenzmarkierten Liganden für den S1P1-Rezeptor wurden zudem drei substituierte Phenyloxadiazolaniline zu den entspre-chenden Acrylamiden umgesetzt, die als kovalente Labeling Tools eingesetzt werden können. Durch die Synthese von Trifluormethyl- und Cyano-substituierten 4-DMAP-markierten Diaryloxa-diazolen sowie von Arylpropansäurederivaten wurde die gewählte Leitstruktur auf Grundlage einer ersten Affinitätstestungen verfeinert. Dabei wurde die zuvor entwickelte Synthese-strategie optimiert. Der Aufbau der Arylpropansäuren erfolgte durch eine Heck-Reaktion mit Acroleindiethylacetal. Durch den Wechsel der Synthesestrategie von 1. Heck-Reaktion und 2. Oxadiazolringschluss zur umgekehrten Vorgehensweise konnte eine Reihe von synthetischen Problemen umgangen werden und die Gesamtausbeute gesteigert werden.
Zwei der fluoreszenzmarkierten S1P1-Liganden mit verfeinerter Grundstruktur zeigten eine durch die Bindung an den S1P1-Rezeptor verursachte Internalisierung des Rezeptors, die durch die GFP-Markierung unter dem Fluoreszenzmikroskop sichtbar gemacht wurde. Diese Internalisierung lieferte weitere Hinweise, dass die beiden Substanzen eine durch Bindung am S1P1-Rezeptor verursachte, agonistische Wirkung haben. Die weitere pharmakologische Charakterisierung aller synthetisierten, funktionellen Liganden im Bereich der Sphingolipide steht noch aus. Leukotriene (LT) sind wichtige Lipidmediatoren, die durch Oxygenierung von Arachidonsäure entstehen. Sie nehmen eine zentrale Rolle ein in der Entstehung und dem Voranschreiten von Entzündungen, allergischen Reaktionen, Asthma, kardiovaskulären Erkrankungen und auch bei Krebserkrankungen. Das Schlüsselenzym der LT-Biosynthese ist das Enzym 5-Lipoxygenase (5-LO). Zur Behandlung von LT-assoziierten Krankheiten sind bis heute nur zwei Wirkstoffe zugelassen, die in den LT-Stoffwechsel eingreifen: der Cys-LT-Rezeptorantagonist Montelukast (Singulair®) und der eisenchelatisierende 5-LO-Inhibitor Zileuton (Zyflo®, nur in den USA zugelassen). Es besteht daher ein großer Bedarf an neuen, selektiven Liganden. C06 ist einer der am besten charakterisierten Vertreter einer neue Klasse an potenten, direkten und selektiven 5-LO-Inhibitoren: den Aryliden-Aryl-Thiazolonen, die ein großes Potential für die Entwicklung neuer anti-Leukotrien Arzneistoffe aufweisen. In-vivo-Experimente haben jedoch gezeigt, dass C06 und seine Derivaten nicht optimale pharmakologische Profile besitzen und zudem nur in geringem Maße im Wässrigen löslich sind. Durch die Optimierung und Etablierung einer mikrowellenassistierte Drei-Komponenten-one-pot-Synthese sowie einer verwandten zweistufigen Synthese zum Aufbau der Aryliden-Aryl-Thiazolone, konnte die Reaktionszeit verringert werden und daher die Isolierung und Aufreinigung vereinfacht werden. Zur Steigerung der Löslichkeit der Aryliden-Aryl-Thiazolone in wässrigen Systemen und zur weiteren Erforschung der SAR wurde einige Derivate mit polaren Substituenten, unterschiedlichen Wasserstoffbrückenbindungs-Eigenschaften, Morpholinderivate und verschiedene heteroaromatische Aryliden-Aryl-Thiazolone hergestellt, wobei die Heteroarylderivate aufgrund ihrer niedrigeren, berechneten Lipophilie (clogP) und höheren berechneter Löslichkeit (clogS) ausgewählt wurden. Für alle synthetisierten Derivate wurde die Inhibition der 5-LO-Produktbildung unter zellfreien (S100) und unter zellulären Bedingungen (PMNL) bestimmt. Zudem wurden für einige Derivate die experimentellen Löslichkeiten in DMSO und in Puffer grob ermittelt. Die Ergebnisse zeigen, dass alle besser löslichen Derivate einen höheren IC50-Wert im zellbasierten Assay aufweisen bzw. die potentesten Substanzen nicht gut im Wässrigen löslich sind. Zur Charakterisierung der unbekannten, allosterischen Bindestelle der Aryliden-Aryl-Thiazolone wurde eine Reihe von zum kovalenten bzw. zum Photoaffinity-Labeling fähigen Aryliden-Aryl-Thiazolonderivaten synthetisiert. Alle Derivate wiesen gute bis sehr gute 5-LO Affinitäten auf und durch Vorversuche konnte die prinzipielle Eignung zum Photoaffinity-Labeling gezeigt werden. Da sowohl die polaren als auch die heteroarylbasierten Aryliden-Aryl-Thiazolone die bekannte kontinuierliche SAR wiederspiegelten und keine hohe Wasserlöslichkeit bei gleichzeitiger hoher 5-LO-Inhibition erreicht werden konnte, wurden die einzelnen Element des Aryliden-Aryl-Thiazolon-grundgerüstes durch individuelle Synthesen variiert. Diese Kernvariations- und die an der Aryliden-einheit variierten Derivate haben die SAR der Aryliden-Aryl-Thiazolone deutlich erweitert und konnten die für die 5-LO-Aktivität wichtigen Elemente identifizieren. Dadurch ist es gelungen, die 2-Aryl-5-aryl(methyl)thiazol-4-ole als 5-LO-Leitstruktur zu erschließen, die sowohl unter zellfreien Bedingungen (S100) als auch im zellbasierten Assay (PMNL) Aktivitäten im nanomolaren Bereich erreichen. Mit den 2-Aryl-5-arylmethylthiazol-4-olen konnte außerdem die Löslichkeit in DMSO und vor allem im Wässrigen, verglichen zu C06, deutlich erhöht werden. ST-1829 ist ein C06-Analogon, dass die Nachteile im pharmakologischen Profil von C06 eliminiert und zu einem neuen, effektiven Wirkstoff in der anti-Leukotrien Therapie weiter entwickelt werden kann.
Abdominale Aortenaneurysmen sind in Industrienationen eine häufige Erkrankung der Personengruppe über 65 Jahre. Diese Dilatationen der abdominalen Aorta zeichnen sich durch eine lokale Inflammation aus, die mit der Infiltration von Immunzellen, dem Verlust von glatten vaskulären Muskelzellen und der Degeneration der extrazellulären Matrix einhergeht. Ursprünglich als Symptom einer Atherosklerose angesehen, sind die Ursachen dieser progressiv verlaufenden Erkrankung nach wie vor nicht vollständig verstanden; obwohl steigendes Alter, männliches Geschlecht, genetische Prädisposition, Rauchen und ein zuvor erlittener Myocardinfarkt als Risikofaktoren identifiziert werden konnten. Der lange Zeit asymptomatische Krankheitsverlauf, die Gefahr einer Ruptur mit häufig letalen Folgen und der Mangel einer effizienten pharmakologischen Therapie machen eine weitere Untersuchung dieser Erkrankung unabdingbar.
Diltiazem ist ein Inhibitor spannungssensitiver L Typ-Calciumkanäle, der seit über 25 Jahren zur Behandlung von arterieller Hypertonie, verschiedener Arrhythmien und Angina pectoris verwendet wird. Im Rahmen der vorliegenden Arbeit sollte untersucht werden, ob Diltiazem auch einen antianeurysmatischen Effekt besitzt. Eine vierwöchige subcutane Infusion des blutdrucksteigernden Hormons Angiotensin II führte nach vier Wochen zur Bildung abdominaler Aortenaneurysmen, sowie zu atherosklerotischen Gefäßveränderungen der thorakalen Aorta Apolipoprotein E (ApoE)-defizienter Mäuse. Eine parallele Therapie mit Diltiazem über das Trinkwasser konnte diese Entwicklung unabhängig vom arteriellen Blutdruck und damit unabhängig von der antihypertensiven Wirkung verhindern. Im Aortenbogen Diltiazem-behandelter Tiere konnte im Rahmen dieses in vivo-Modells nach sechs Tagen eine deutlich geringere lokale Expression proinflammatorischer Cytokine, wie Tumornekrosefaktor-a, Interleukin-1ß (IL1B) und Interleukin-6 (IL6), Chemokine, wie CCL2, und degenerativer Proteasen, wie der Matrix-Metalloprotease 9 (MMP9), festgestellt werden. Dies war die Folge einer reduzierten Anzahl von Macrophagen in der Gefäßwand. Zirkulierende proinflammatorische Cytokine, wie CCL12, konnten im Serum teilweise ebenfalls vermindert nachgewiesen werden.
Obwohl die antihypertensive Wirkung von Diltiazem in glatten vaskulären Muskelzellen vermittelt wird, war es nicht möglich, die Angiotensin II-induzierte Produktion von promigratorischem CCL2 und proinflammatorischem IL6 in isolierten Aortenringen ApoE-defizienter Mäuse oder in glatten vaskulären Muskelzellen der Ratte zu reduzieren. Diltiazem war zudem nicht in der Lage, die CCL2-induzierte Migration proinflammatorischer Ly6C+-Monocyten in vivo zu unterbinden. In isolierten peritonealen Macrophagen ApoE-defizienter Mäuse dagegen, konnte die IL6 induzierte Expression von IL1B- und CCL12-mRNA durch eine Inkubation mit Diltiazem verhindert werden. In der RAW264.7-Zelllinie, die morphologische und funktionelle Merkmale von Monocyten und Macrophagen aufweist, konnte die Dilitiazem-sensitive IL6-induzierte Expression von IL1B-mRNA in vitro ebenfalls nachgewiesen werden. Eine Stimulation mit IL6 war in diesen Zellen jedoch nicht ausreichend, um die Sekretion von IL1B-Protein auszulösen.
Thorakales Aortengewebe wies im Vergleich mit RAW264.7-Zellen eine veränderte Ausstattung spannungssensitiver Calciumkanäle auf. In letzteren fanden sich keine muskelzellspezifischen L-Typ-Calciumkanäle (CACNA1C), aber eine relevante Expression neuronaler P/Q-Typ-Calciumkanäle (CACNA1A). Mittels fluorimetrischer Bestimmung mit Fura-2AM konnte jedoch festgestellt werden, dass die intrazelluläre Calciumkonzentration Diltiazem-behandelter RAW264.7-Zellen unverändert war und der antiinflammatorische Effekt somit calciumunabhängig vermittelt wurde.
Diltiazem war nicht in der Lage, eine Lipopolysaccharid (LPS)-bedingte Inflammation in RAW264.7-Zellen zu unterbinden. Weder die LPS-induzierte Sekretion von IL1B Protein, noch die nucleäre Translokation des Transkriptionsfaktors NF-?B oder die Aktivierung des NF-?B-Promotors konnten durch eine Inkubation der Zellen mit Diltiazem verhindert werden. Diltiazem reduzierte jedoch, die IL6-induzierte Aktivierung des AP 1-Promotors unabhängig von der MAPK1-Phosphorylierung oder der Phosphorylierung und nucleären Translokation des Transkriptionsfaktors STAT3 zu unterbinden. Eine Unterdrückung von c-Jun N-terminale Kinase JNK- oder p38 Proteinkinase-vermittelten Signalwegen ist damit wahrscheinlich.
Das Pirinixinsäurederivat LP105 ist ein neuer Inhibitor der Arachidonat-5-Lipoxygenase (LOX5), der im Rahmen dieser Arbeit erstmals in vivo auf seine antianeurysmatischen Eigenschaften hin untersucht wurde. LOX5 katalysiert die Reaktion von Arachidonsäure zu Leukotrien A4 und kontrolliert damit einen wichtigen Schritt in der Synthese proinflammatorischer Leukotriene. LP105 war im Tiermodell nicht in der Lage die Angiotensin II-induzierte Bildung abdominaler Aortenaneurysmen in ApoE-defizienten Mäusen komplett zu unterbinden, führte aber über die Reduktion der vaskulären Inflammation zu einer deutlich verringerten Krankheitslast. LP105 selbst beeinflusste die mRNA-Expression verschiedener Enzyme des Arachidonsäuremetabolismus nicht, verstärkte jedoch durch die Blockade von LOX5 die Metabolisierung von Arachidonsäure über Arachidonat-15-Lipoxygenase und Cytochrom P450-Enzyme.
Lipid mediators have been referred as bioactive lipids, whose change in lipid levels resulted in functional or pathophysiological consequences. They are in the focus of biological research, nevertheless this is a late recognition due to the many difficulties of working with bioactive lipids due to their properties: hydrophobic, unstable and they occur in only in small quantities. Liquid chromatography and mass spectrometry have facilitated the work with them. Especially in this field, cardiovascular diseases and inflammatory mediated diseases and cancer are pathophysiological events where LMs are deregulated. Additionally, if the modulation of one LM pathway is not sufficient to overcome a disease, the combination of targeting two or more pathways could be effective. Needless to say, lipid signaling cascades are complicated pathways and possible shunting into other pathways when inhibiting or genetically deleting enzymes should be taken into consideration.
The first part of this work has focused on enzymes that metabolize eicosanoids, like mPGES-1 and 5-LO. mPGES-1 is an important enzyme metabolizing PGH2 and one of the key players of the AA cascade. Its product, PGE2 plays an important role in different inflammatory processes. Inhibition of the mPGES-1 might be a promising step to circumvent COX dependent side effects of NSAIDs. The class of quinazoline compounds around the lead structure FR20 has been investigated on isolated human and murine enzyme, in HeLa cells and in different human whole blood (HWB) settings to establish the possible effects of these compounds on eicosanoid profiling. Novel compounds with inhibitory activities in the submicromolar range (IC50: 0.13 µM - 0.37 µM on isolated enzyme) were obtained which were also effective in cells and HWB. Furthermore, pharmacological profiling of toxicity and lipid screening with LC/MS-MS revealed that compounds also reduce PGE2 levels in intact cells and whole blood; they do not impair cell viability but lack the ability to inhibit the murine mPGES-1 enzyme. This problem could be overcome by means of chemical synthesis varying the scaffold (quinoline, quinazoline) or introducing biosteric replacement in the phenyl moieties.
5-LO is a relevant enzyme that plays an important role in eicosanoid signaling in particular in leukotriene biosynthesis. Leukotrienes are involved in asthma, allergic rhinitis, glomerulonephritis, rheumatoid arthritis, sepsis, cancer and atherosclerosis. Moreover, genetic variants in the genes of the 5-LO pathway have been associated with the risk of development of acute myocardial infarction and stroke. Eicosanoids are increased in infectious exacerbations of chronic obstructive pulmonary disease (COPD). They are also elevated in the airways of stable COPD patients compared to healthy subjects. Therefore, 5-LO has attired the scientific community as a possible therapeutic target to treat the several disease conditions listed before. In this study an extensive evaluation of imidazo[1,2-a]pyridines as a suitable lead structure for novel 5-LO targeting compounds was presented Within the three publications, 5-LO inhibitory activity of synthesized compounds was investigated in intact PMNL, a cell-free assay, in human whole blood and rodent cells to both elucidate structure-activity relationships and compounds were in vitro pharmacological evaluated. Chemical modifications for lead optimization via straight forward synthesis were used to combine small polar groups (hydroxy, and methoxy groups) which led to a suitable candidate with desired in vitro pharmacokinetic profile in terms of solubility and intrinsic clearance without showing any cytotoxicity. More than 70 imidazo[1,2-a]pyridine derivatives have been synthesized, resulting in more than 50 active compounds. Although it was not possible to introduce a solubility group without impairing the 5-LO inhibitory activity, combination of small polar groups lead to a more favorable solubility and in vitro metabolic stability. Overall, the development of 5-LO inhibitors with high efficacy and selectivity in vivo will provide a possible treatment for patients having one of the diseases where leukotriene biosynthesis plays an important role.
Other types of 5-LO inhibitors have been synthesized during this work, NO-NSAIDs can be postulated as novel 5-LO inhibitors that could circumvent the undesired side-effects of inhibiting COX isoforms (ulcer perforation, gastrointestinal bleeding and in some cases death). It is suggested that NO group is released in situ or after compounds are metabolized. NO-NSAIDs maintain the same anti-inflammatory properties by inhibiting 5-LO in clinical relevant concentrations. NO-NSAIDs are currently under clinical trial for the treatment of diseases where inflammation plays an important role. Synthesis of NO-NSAIDs is straightforward and can be applied for most NSAIDs recently published. Among them, the most promising candidate is NO-sulindac that was able to inhibit 5-LO product formation in intact PMNL, purified 5-LO and HWB in micromolar concentration. Additional experiments regarding their mechanism are currently being performed.
The present study could show that dual inhibitors are an interesting approach that is practicable. It has been used in the recent years to overcome side-effects and diseases concerning more pathophysiological conditions. MetS is an example of a conjunction of symptoms: hyperglycemia, hypertriglyceridemia, hypertension and obesity. Due to its complex nature, the current treatment strategies of MetS require multiple pharmacological compounds regulating lipid and glucose homeostasis as well as blood pressure and coagulation. This study describes the first synthesis of dual sEH/PPAR modulators as potential agents for treatment of MetS. Following a combinatorial approach, an acidic head group known as a pharmacophore important for PPARα/γ dual agonistic activity was combined with different hydrophobic urea derivatives in order to introduce an epoxide mimetic (sEH pharmacophore). The resulting compounds yielded high inhibition of sEH and different patterns of PPAR agonistic activity. This study demonstrates that the pharmacophores of PPAR agonists and sEH inhibitors can be easily combined, resulting in a simplified blueprint of a dual sEH/PPAR modulator. Further in vivo pharmacological evaluation studies are needed in order to evaluate, which pattern of PPAR activation shows the most promising profile for treatment of metabolic syndrome.
Another example of dual pharmacology has been presented in this work. Natural products derived compounds were able to target sEH and exhibit promising antiproliferative properties. The principle of addressing multiple targets by natural products can be transferred to synthetic multi-target ligands. In conclusion, several (E)-styryl-1H-benzo[d]imidazoles were synthesized and evaluated on recombinant sEH after an initial hit (IPS) that lead to potent sEH inhibitors exhibiting antiproliferative activities. Following the natural product-inspired design, the desired biological activity from a bacterial secondary metabolite has been enhanced and transferred to a synthetic compound series. The resulting compounds were accessible via an easy synthetic route and offered a possibility to investigate the structure-activity relationships. The natural product inspired drug design extends the valuable role of natural products as drugs and drug precursors to templates for fully synthetic bioactive molecules. Simplification of natural products by means of chemical synthesis could lead to an interesting field in the treatment of cancer.
Affinity chromatography has been used to unravel unknown- and off-target effects which either contribute to the biological effect of the inhibitor or that counteract or lead to undesired side-effects. During this PhD work, two main projects related to this technique have been established. In the first one, related to an imidazo[1,2-a]pyridine inhibitor (EP6), it has been shown that epoxide-sepharose is a reliable material in order to couple compounds bearing an alcohol. Coupling of an analogue of EP6 to the sepharose has been accomplished and affinity towards 5-LO was demonstrated. The challenging step is to discern from unspecific protein binders and analysis via SDS-PAGE separation and mass spectrometry. Further experiments using other cell types or improving SDS-PAGE analysis (e.g. 2D gel analysis) should be useful to unravel EP6 off-target effect. During the second project related to off-target effects of celecoxib and DMC, the main problem was the coupling of the functional group to the sepharose. Affinity towards COX-2 could not be demonstrated pointing out the inefficient coupling method. Higher pH values during coupling reaction should be tested in further experiments. Nevertheless, affinity chromatography is a useful technique to unravel cellular mechanisms.
Sphingolipid metabolism is also a recent area that attired the attention of cancer researchers, due to their important roles in cell proliferation and apoptosis. Ceramide metabolism inhibitors were synthesized and evaluated on different assay systems in order to assess their efficacy on several cancer lines. Remarkably, 2,2-dimethyl-1,3-dioxolan-4-yl)methanamine (32) was a useful scaffold to mimic the sphingoid base. This key intermediate was used to produce ceramide analogues that could enter the cell and target apoptosis machinery. EB143 (38) increased ceramide levels in an in vitro ceramide synthase assay in a dose-response manner meaning that ceramide synthase was not inhibited but the ceramide de novo synthesis was activated. This effect was due to the fact that EB143 is a cytotoxic compound with an interesting antiproliferative profile. Further chemical modifications should be carried out to modulate this effect.
COX and LO inhibitors are cancer-preventive not only by inhibiting specific antiapoptotic AA metabolites but also by facilitating accumulation of AA which promotes neutral SMase activity and increases the proapoptotic ceramide. Several 5-LO inhibitors have been evaluated on several cancer lines and sphingolipid levels were measured in order to obtain a relationship. A549, Capan-2 and MCF-7 cells line were incubated with synthetic 5-LO inhibitors and zileuton. Compounds were cytotoxic to all cancer cell lines except from A549. Needless to say, zileuton did not exhibit a cytotoxic profile. Synthetic 5-LO inhibitors were able to modify ceramide levels but were useless when coincubating with sphingolipid metabolism inhibitors (myoricin, amitryptiline etc.) and inconsistent results were obtained. On the contrary, zileuton selectively increased Cer-C16 levels and in less extend Cer-C24:1. When using a SPT inhibitor (myoricin) alone was able to reduce C24:1 and Cer-C16:0 levels below the control, a similar effect occurred when incubation the cells with zileuton and myriocin. Interestingly, treatment of zileuton together with either amitryptiline or desipramine led to a decrease in Cer-C24:1 and levels Cer-C16:0 but the inhibition was not complete indicating that probably the de novo pathway has an important role. Further investigations on mRNA level should be carried out in order to discern which CerS is activated.
The main objective of the present thesis was the synthesis of lipid signaling modulators and their evaluation in vitro as therapeutic strategy to overcome pathophysiological conditions (cancer, metabolic syndrome, etc). It has been accomplished on many relevant targets like 5-LO, mPGES-1, sEH and PPAR and these lipid signaling modulators could be used in the treatment of diseases conditions where lipid mediators play an important role.
Polypharmakologie hat in den letzten Jahren mehr und mehr an Bedeutung in der pharmazeutischen Forschung gewonnen und könnte in Zukunft zu einem Umdenken in der Entwicklung neuer Wirkstoffe führen. Das wachsende Verständnis für biologische Zusammenhänge, im speziellen für die starke Vernetzung zwischen verschiedenen Signalwegen oder Gewebearten, und die daran beteiligten Proteine, könnten zu gänzlich neuen Strategien führen. Beispiele aus dem Bereich der Onkologie und der Entwicklung von Neuroleptika haben bereits gezeigt, dass eine Intervention an mehreren Stellen eines solchen komplexen Netzwerkes zu wirksameren und gleichzeitig sichereren Wirkstoffen führen kann. Erkenntnisse aus der Systembiologie und die retrospektive Analyse bereits zugelassener Wirkstoffe machen deutlich, dass viele erfolgreiche Wirkstoffe nur aufgrund ihres polypharmakologischen Wirkprofils so effektiv sind – wenngleich dies bei Ihrer Entwicklung oftmals nicht beabsichtigt war.
Das rationale Design sogenannter „multitarget Wirkstoffe“ stellt bis heute eine große Herausforderung dar. Aus Sicht eines medizinischen Chemikers bedeutet es die Verknüpfung zweier, auf unterschiedliche Targets aktiver, Liganden zu einem neuen Wirkstoff, ohne einen signifikanten Aktivitätsverlust auf die einzelnen Targets herbeizuführen. Ein naheliegender Ansatz zur Verbindung zweier Liganden ist die Verknüpfung der Moleküle über einen flexiblen Linker. Dieser Ansatz kann zwar in vitro zu sehr potenten Wirkstoffen führen, birgt jedoch pharmakokinetische Nachteile, bedingt durch das hohe Molekulargewicht, die sich oft erst in vivo zeigen. Die Schwierigkeit besteht also zum einen in der Aufrechterhaltung der individuellen Aktivität auf das jeweilige Target und zum anderen im Erreichen einer guten Balance zwischen Aktivität und Komplexität des Liganden. Damit soll ausreichend Raum für spätere Optimierung von pharmakokinetischen und pharmakodynamischen Eigenschaften gewährleistet werden. Bisher wurden nur wenige Computer-gestützte Ansätze entwickelt um diese und ähnliche Fragestellungen zu bearbeiten. Aus diesem Grund ist die Entwicklung neuer in silico Verfahren zur Identifzierung von multitarget Liganden ein Kernthema dieser Arbeit. Die Implementierung eines Fragment-basierten Ansatzes hält die Komplexität der Liganden möglichst gering und bietet genügend Raum für eine anschließende, multi-dimensionale Optimierung an zwei oder mehreren Targets.
In der ersten Studie wurde eine Pharmakophor-basierte Strategie verfolgt. Die Repräsentation eines Liganden durch ein Pharmakophormodell stellt eine abstrakte dreidimensionale Darstellung der für die biologische Aktivität relevanten Strukturmerkmale dar. Diese Abstraktion vereinfacht den Vergleich zweier Verbindungen und erlaubt gleichzeitig Spielraum für chemische Variabilität. Bei diesem Ansatz wurden Pharmakophormodelle, jeweils für eine Vielzahl aktiver Liganden zweier Targets, erzeugt und paarweise miteinander verglichen. Sobald zwei Pharmakophormodelle eine genügend große Anzahl an Pharmakophorpunkten in räumlich ähnlicher Orientierung teilen, stellt dieses gemeinsame Pharmakophor die Basis eines potentiellen multitarget Liganden dar. In der beschriebenen Studie wurde dieses Verfahren anhand von aktiven Liganden der löslichen Epoxid Hydrolase (sEH) und 5-Lipoxygenase (5-LO) evaluiert. Die auf dieser Grundlage identifizierten multitarget Pharmakophormodelle wurden zum anschließenden Screening einer Fragement-Datenbank verwendet und führten zu 9 aktiven Liganden für sEH und 5-LO. Diese Liganden besitzen chemische Grundgerüste (Scaffolds), die in der Literatur bisher noch nicht als aktive sEH- oder 5-LO-Liganden beschrieben wurden und somit eine ideale Grundlage für die Entwicklung neuer Wirkstoffe darstellen. Für eine der gefundenen Verbindungen, basierend auf einem Benzimidazol-Gerüst, wurden Aktivitäten im niedrig mikromolaren Bereich für beide Targets bestimmt. Diese Verbindung und weitere Derivate werden zu diesem Zeitpunkt weiter charakterisiert um eine erste Struktur-Aktivitäts-Beziehung aufzustellen und die Eignung dieser Substanzklasse als potentielle Leitstruktur für neue, duale sEH/5-LO Liganden zu überprüfen.
Parallel dazu wurde eine Substruktur-basierte Strategie verfolgt um Rückschlüsse auf jene Strukturmerkmale zu ziehen, die für die Aktivität auf dem jeweiligen Target verantwortlich sein könnten. Dazu wurden in einem ersten Schritt alle aktiven Liganden zweier Targets auf ihre möglichst maximalen gemeinsamen Substrukturen reduziert. Für jedes Target wird damit ein Set von Substrukturen generiert, welches die für die Bindung an das jeweilige Target charakteristische Strukturmerkmale enthält. Diese Substrukturen, repräsentieren den chemischen Raum des jeweiligen Targets und stellten die Trainingsdaten für den entwickelten multiSOM Ansatz dar. Dieser Ansatz basiert auf dem automatisierten Vergleich von selbst-organisierenden Karten und hebt Gemeinsamkeiten zwischen diesen Substruktursets in einer leicht zu interpretierenden, visuellen Form hervor. Dies erlaubt die Identifizierung von gemeinsamen Substrukturen aus beiden verwendeten Substruktursets, welche potentielle duale Strukturelemente darstellen.
Die Validierung dieses Ansatzes erfolgte erneut auf Basis bekannter 5-LO- und sEH-Liganden. Unter 24 ausgewählten Verbindungen konnten neun Fragmente identifiziert werden, die auf einem der beiden Targets und 5 Fragmente, die auf beiden Targets im niedrig mikromolaren Bereich inhibierend wirken. Einer dieser dualen Fragmente wurden anschließend als Basis für eine Substruktursuche in einer Inhouse Datenbank verwendet. Die daraus resultierende Verbindung, die einen Teil des ursprünglichen Fragments beinhaltet, wirkt sowohl auf sEH als auch 5-LO in nanomolaren Konzentrationen inhibierend. Auch diese Verbindung wird zu diesem Zeitpunkt weiter charakterisiert und stellt eine vielversprechende Basis als Leitstruktur neuer dualer sEH/5-LO-Liganden dar.
Zusammenfassend lässt sich sagen, dass die vorgestellten Methoden neue Möglichkeiten bieten, das rationale Design von multitarget Liganden zu unterstützen. Die Pharmakophor-basierte Methode kann besonders dann von Vorteil sein, wenn bereits Strukturinformationen für beide Targets bzw. die bioaktiven Konformationen der Liganden vorliegen. Für einen ausschließlichen Liganden-basierten Ansatz stellt die Verwendung der MultiSOM, und damit die Identifizierung gemeinsamer Strukturelemente der Liganden, die bessere Methode dar.
Im zweiten Teil dieser Arbeit werden Studien zur Identifizierung neuer Farnesoid-X-Rezeptor (FXR) Partialagonisten beschrieben. Auch in diesem Fall wurden zwei unterschiedliche Strategien verfolgt. Da FXR eine starke strukturelle Anpassung abhängig vom gebundenen Liganden aufweist („induced fit“), sind rein strukturbasierte virtuelle Screening-Methoden nur eingeschränkt einsetzbar. Aus diesem Grund sollte zunächst ein Liganden-basierter Drug Repurposing Ansatz verfolgt werden, bei dem bereits zugelassene Wirkstoffe mit potentiell FXR-modulierenden Eigenschaften identifiziert werden sollten. Der Vorteil des Drug Repurposing besteht darin, dass die betrachteten Wirkstoffe bereits intensiv hinsichtlich Sicherheit und Bioverfügbarkeit untersucht wurden. Somit kann man sich bei der Entwicklung verstärkt auf die biologische Aktivität auf das neue Target konzentrieren.
Erneut wurden selbstorganiserende Karten (SOMs) verwendet, um zugelassene Wirkstoffe mit FXR-Aktivität zu identifizieren. Trainiert wurde die SOM auf einem Datensatz bestehend aus bekannten FXR-Agonisten zum einen und der DrugBank Datenbank mit zugelassen Wirkstoffen zum anderen. Die Eigenschaft der SOM Verbindungen mit ähnlicher biologischer Aktivität in räumlicher Nähe auf der Karte zu clustern führte zu einer Anhäufung an bekannten FXR-Agonisten auf einigen wenigen Neuronen. Auf solchen sogenannten Aktivitätsinseln wurden zusätzlich auch zugelassene Wirkstoffe platziert, wenn ihre Ähnlichkeit zu den FXR-Agonisten ausreichend hoch war. Die auf den Aktivitätsinseln angesiedelten Wirkstoffe wurden anschließend bestellt und hinsichtlich ihrer FXR-Aktivität in einem Transaktivierungs-Assay untersucht. Unter den bestellten Verbindungen konnten sechs Liganden mit einer signifikanten relativen FXR-Aktivierung identifiziert werden. Weitere Hinweise auf eine mögliche FXR-Aktivierung der Verbindungen gaben in der Literatur beschriebene Nebeneffekte, die mit einer FXR-Aktivierung in Zusammenhang stehen könnten. Die potentenste Verbindung, der zugelassenen Tyrosinkinase-Inhibitor Imatinib, wurde zusätzlich in Bezug auf FXR-basierte SHP mRNS Induktion untersucht. In qPCR-Experimenten konnte dabei eine mit GW4064 vergleichbare Induktion in HepG2 Zellen gezeigt werden. Diese Ergebnisse untermauern die aus der Literatur gewonnen Vermutung, dass Imatinib FXR-modulierende Eigenschaften besitzt und somit eine interessante Grundlage für die Entwicklung neuer FXR-Partialagonisten darstellt. Zu diesem Zeitpunkt werden weitere Imatinib-Derivate synthetisiert und diese Struktur als mögliche Leitstruktur charakterisiert.
In einer zweiten Studie wurde eine Kombination aus Liganden- und Struktur-basierten Ansatz verfolgt. Dabei wurden sämtliche Struktur-Informationen aus publizierten FXR-Kristallstrukturen und den darin kokristallisierten Liganden gebündelt, um die Auswirkungen des zu Beginn erwähnten induced-fit Effekts zu minimieren. Auf Basis der ko-kristallisierten Liganden wurden zunächst zwei Konsensus-Pharmakophormodelle erstellt. Diese Modelle wurden in einem anschließenden Schritt jeweils mit einem Konsensus-Pharmakophormodell, das mit Hilfe von Protein-Ligand-Interaktions-Fingerprints (PLIF) aus den korrespondieren Kristallstrukturen abgeleitet wurde, überlagert und kombiniert. Diese kombinierten Modelle vereinten sowohl Informationen der strukturellen Gemeinsamkeiten der Liganden als auch gemeinsame, relevante Interaktionspunkte zwischen Ligand und Rezeptor aus den Kristallstrukturen. Das Pharmakophor-Screening mit anschließender Docking Analyse führte zu 42 getesteten Verbindungen, von denen 12 Strukturen eine signifikante relative FXR-Aktivierung zeigten. Darunter konnte ein Partial-Agonist mit einem EC50 von 480 nM bei einer maximalen Aktivierung von ca. 14% im Vergleich zur Referenz GW4064 identifiziert werden. Auch diese Verbindung wird zum aktuellen Zeitpunkt weiter charakterisiert und könnte in Zukunft als Leitstruktur für neue FXR-Partialagonisten dienen.
In beiden Studien konnten neue FXR-Agonisten mit bisher noch nicht beschriebenen Scaffolds identifiziert werden. Es konnte gezeigt werden, dass die Verwendung bereits zugelassener Wirkstoffe für neue Indikationen eine attraktive Quelle für neue Leitstrukturen darstellen kann und im Zuge dessen bisher ungeklärte Nebeneffekte bekannter Wirkstoffe aufgeklärt werden können.
Abschließend lässt sich festhalten, dass selbstorganisierende Karten eine universelle Methode zur Erkennung und Analyse von polypharmakologischen Zusammenhängen darstellen. Des Weiteren lassen sich mit ihrer Hilfe chemische Räume repräsentieren und durch den in dieser Arbeit entwickelten MultiSOM-Ansatz direkt vergleichen. Dies ermöglicht auf intuitive und effiziente Weise die Identifizierung von überlappenden chemischen Räumen und somit möglicher polypharmakologischer Zusammenhänge.
Die Funktion nukleärer Rezeptoren (NR) beruht auf einem empfindlichen Zusammenspiel zwischen ihren Domänen, Coregulatoren und Liganden. Die meisten Rezeptoren binden die DNA als Homo- oder Heterodimere und transregulieren die Gentranskription in Folge von Ligandenbindung. Klassische Assay-Systeme, die sich auf die Untersuchung der NR-Funktion oder auf die Charakterisierung von Substanzen richten, bilden nur die Coregulator-Rekrutierung zu isolierten NR-Ligandenbindungsdomänen (LBDs) ab und vernachlässigen dabei die NR:NR-Interaktion. Damit klammern sie die NR:NR-Wechselwirkung aus, obwohl die Rekrutierung von Cofaktoren durch allosterischen Crosstalk mit der Oligomerisierung verbunden ist. Dies war die Motivation dafür, Assay-Systeme zu entwickeln, welche die Untersuchung von NR-Interaktionen,
insbesondere der NR-Dimerisierung, und deren Modulation durch verschiedene Arten von Liganden ermöglichen. Im Rahmen dieser Doktorarbeit wird ein vielfältiges modulares Set von Assays für die Untersuchung der NR-Dimerisierung und NR-Coregulator-Rekrutierung vorgestellt und deren Anwendbarkeit auf eine Vielzahl von NRs demonstriert. Die Verwendung einer
rekrutierungsunfähigen RXRα-Variante mit einer mutierten AF-2-Domäne ermöglichte den spezifischen Nachweis der Coaktivatorrekrutierung durch PPARγ im Kontext des Heterodimers mit seinem obligatorischen Dimerpartner RXRα. Außerdem konnte gezeigt werden, dass die Aktivierung der RXRα LBD mit ihrem Agonisten SR11237 zu einer Destabilisierung des RXRα-Homodimers, aber zu einer Förderung der Bildung des Heterodimers mit der PPARγ LBD führte.
Ein zentrales Ergebnis war das Phänomen, dass der Einbau von PPARγ in das Heterodimer zu einem erheblichen Anstieg an Affinität gegenüber Coaktivatoren führt, auch in Abwesenheit von Liganden. Somit fördert die RXRα-Aktivierung die Coaktivator-Rekrutierung von PPARγ indirekt durch eine Verschiebung der Oligomerisierungspräferenz von RXRα in Richtung des Heterodimers. Zusätzlich wurde die Wirkung von Tetrac, einem nicht-klassischen Schilddrüsenhormon, auf PPARγ und RXRα untersucht und dessen Aktivierungsvermögen gegenüber beiden Rezeptoren mit einer deutlich vervielfachten Wirkung auf das Heterodimer demonstriert. Mit Hilfe des neu etablierten Cofaktor-Rekrutierungsscreens konnte die Dynamik
zwischen dem Nurr1 NR und 29 kanonischen Coregulatoren, von denen einige ligandenabhängig hohe Affinitäten zum Rezeptor aufwiesen, beleuchtet werden. Diese Interaktionen wurden
bidirektional durch eine Reihe von strukturell unterschiedlichen nicht-steroidalen Antirheumatika moduliert, die auch die Affinitäten sowohl des Nurr1-Homodimers als auch des Heterodimers mit der RXRα LBD beeinflussen konnten. Die Nurr1-Dimere zeigten zudem auch eine hohe Empfindlichkeit gegenüber dem Endocannabinoid Anandamid. Zusätzlich zu PPARγ, RXRα und Nurr1 wurden erste Schritte zur Untersuchung der TLX NR-Funktion unternommen. Unter Anwendung der entwickelten Assays konnte die Heterodimerbildung der TLX und der RXRα LBD
beschrieben und die ligandenabhängige Rekrutierung des Corepressors SMRT beobachtet werden.
Zusammenfassend beschreibt diese Arbeit einen Satz von Werkzeugen für die Untersuchung von ligandenabhängiger NR-Coregulator-Interaktion und Oligomerisierung. Auf diese Weise trug sie zu einer umfassenderen Identifizierung und Charakterisierung von NR-Liganden bei und stellt eine valide Basis für die weitere Assayentwicklung und Ligandendesign dar.
Die Identifikation neuer Hits und Leitstrukturen sind die ersten Schritte bei der Entwicklung neuer Arzneistoffe. Dieser Herausforderung wird derzeit primär mittels High-Throughput-Screening oder der gezielten Modifikationen bekannter Liganden begegnet. Eine weitere Option ist das computerbasierte virtuelle Screening, das es kostengünstig ermöglicht, in kurzer Zeit sehr viele Moleküle auf ihre potentielle biologische Aktivität hin zu untersuchen. Der in dieser Arbeit verwendete Ansatz zur Identifikation neuer Inhibitoren der 5-Lipoxygenase und der Cyclooxygenase-2 beruht auf dem Verfahren des ligandenbasierten virtuellen Screenings. Unter der Voraussetzung der Kenntnis mindestens eines Referenzliganden können so mittels einer Ähnlichkeitsanalyse potentielle neue strukturelle Grundgerüste identifiziert werden. Zu diesem Zweck wurde ein auf atomaren Partialladungen und der dreidimensionalen Struktur der Moleküle basierender Deskriptor (Charge3D/TripleCharge3D) entwickelt. In retrospektiven Studien mit Cyclooxygenase-2 Inhibitoren wurde die Effektivität der neuen Deskriptoren überprüft und mittel eines evolutionären Algorithmus optimiert. Der Charge3D Deskriptor erreicht Anreicherungsfaktoren bis zu 16,1 im ersten Perzentil der durchsuchten Datenbank, wohingegen der TripleCharge3D Deskriptor mit seiner detailierteren Ladungsauftrennung Werte von bis zu 24,8 erreichte. Ein ebensolches retrospektives Screening wurde für 5-Lipoxygenase Inhibitoren durchgeführt. Den maximalen Anreicherungsfaktor von 6,1 im ersten Prozent der Datenbank erreichte hier der Charge3D Deskriptor, der TripleCharge3D Deskriptor erreichte 5,3. Diese wesentlich geringeren Werte sind auf die Diversität der 5-LO Inhibitoren (54 Inhibitoren mit 39 verschiedenen Grundgerüsten) und deren unterschiedliche Inhibitortypen (Redox, nicht Redox und Eisen-bindende Inhibitoren) mit ihren jeweiligen Bindemodi zurückzuführen. In Screenings nach 5-LO Inhibitoren in der Naturstoffdatenbank der Firma AnalytiCon Discovery und COX-25-LO Dualinhibitoren in Datenbanken der Firma Asinex konnten unter Verwendung der beiden Deskriptoren Inhibitoren, mit für diese Targets bislang unbekannten Scaffolds identifiziert werden. Unter Verwendung des 2D Pharmakophor Deskriptors CATS wurden zuerst zwei neue Scaffolds für Inhibitoren der 5-LO identifiziert. Struktur 1 ist den in vitro Assaydaten zufolge ein direkter Inhibitor der 5-LO. Struktur 2 hingegen erreicht seine Wirkung nicht nur über die direkte Interaktion mit der 5-LO. Eine Erklärung dafür wäre die Wechselwirkung mit dem 5-LO aktivierenden Protein FLAP, der Hemmung der Translokation der 5-LO zur Kernmembran, oder die Inhibition 5-LO aktivierender bzw. inaktivierender Kinasen. In nachfolgenden Screenings mit den Strukturen 1 und 2 als Referenzstrukturen konnten mittels der Charge Deskriptoren Substanzderivate (17 Moleküle) mit 5-LO inhibitorischer Wirkung (5 Moleküle mit IC50 Werte ≤ 1 μM an partiell aufgereinigter 5-LO), identifiziert werden. Für das Screening nach COX-2/5-LO Dualinhibitoren wurden 11 Strukturen mit 7 unterschiedlichen Scaffolds unter Verwendung der Charge Deskriptoren aus gewählt. Drei Moleküle zeigten keine 5-LO Aktivität, und jeweils eines nur in intakten PMNLs bzw. im S100 Zellüberstand. Die restlichen 6 Moleküle waren in beiden 5-LO Assays aktiv (intakte PMNLs IC50 zwischen 2 und 15 μM, S100 Zellüberstand 5-LO zwischen 0.5 μM und 25 μM). Somit zeigten 7 Moleküle im S100 Assay Aktivität und konnten als direkte Inhibitoren der 5-LO identifiziert werden. Im Cyclooxygenase-2 Aktivitätsassay mit intakten MonoMac6 Zellen zeigte eine der 11 Strukturen zudem eine geringe (IC50 = 70 μM) inhibierende Aktivität. Modifikationen zur Verbesserung der COX-2 Hemmung könnten in einem potenten COX-2/5-LO Dualinhibitor resultieren, der beispielsweise in der Schmerzbehandlung eingesetzt werden könnte. Ein weiteres Projekt war die Erstellung eines Homologiemodells der 5-LO basierend auf der 15-Lipoxygenase Struktur des Kaninchens (PDB-Struktur: 1LOX). Die Sequenzidentität der beiden Strukturen (1LOX / humane 5-LO) lag bei 37 %. Das Modell wurde zum einen zur Vorhersage von zugänglichen Caspase-6 Schnittstellen an der 5-LO angewandt, und zum anderen wurden Dockingexperimente in Aktiven Zentrum und in Bereichen der C2-like Domäne der 5-LO durchgeführt. Hyperforin, ein bekannter Inhibitor d er 5-Lipoxygenase, wurde an verschiedenen Stellen des Modells für Dockingexperiment eingebracht. Die im Aktiven Zentrum erreichten Scorewerte (Chemscore = -9±1) deuteten hier auf eine unfavorisierte Bindungsstelle hin. BWA4C (ein bekannter Eisenbinder) und ZM230487 (ein nicht-redox Inhibitor) erhielten im Aktiven Zentrum Scorewerte von 27±0,1 und 22±2,5, wodurch eine Bindung als wahrscheinlich angenommen werden kann. Weitere Dockingexperimente an der C2-like Domäne, und speziell am Interface zwischen der C2-like und der katalytischen Domäne, ergaben ähnlich hohe Chemscorewerte für Hyperforin, BWA4C und ZM230487. Aus diesen Resultaten ließ sich kein eindeutiger Bindemodus für Hyperforin ableiten. Eine Positionierung im Aktiven Zentrum ist nach diesen Experimenten unwahrscheinlich, so dass die Existenz einer weiteren, experimentell noch nicht identifizierten Bindestelle vermutet werden kann. Eine solche Interaktionsfläche könnte als Ansatzpunkt für die Entwicklung weiterer 5-Lipoxygenaseinhibitoren eine zentrale Rolle einnehmen.
Als zellulärer Sensor für Gallensäuren und als Regulator zahlreicher metabolischer und inflamma-torischer Gene stellt der nukleäre Farnesoid X Rezeptor (FXR) ein vielversprechendes neues Wirkstofftarget dar. Die Aktivierung von FXR mit natürlichen oder synthetischen Liganden führte in vitro und in vivo zu zahlreichen wünschenswerten Effekten wie gesteigerter Insulinfreisetzung, verringerter Insulinresistenz oder verbessertem Lipidprofil. Daneben stellt die Aktivierung von FXR ein Prinzip zur Behandlung von Lebererkrankungen wie nicht-alkoholischer Fettleber und primärer billiärer Zirrhose dar, das mit dem FXR-Agonisten Obeticholsäure bereits in klinischen Studien überprüft wird. Existierende synthetische FXR-Liganden sind Fettsäure- bzw. Gallensäuremimetika und imitieren die physiologischen FXR-Agonisten. Die meisten synthetischen FXR-Liganden sind jedoch aufgrund von Toxizität, geringer Selektivität oder schlechter Bioverfügbarkeit nicht zur wie-teren klinischen Entwicklung geeignet. Sie stellen außerdem vornehmlich vollagonistische FXR-Ligan-den dar, doch die klinischen Erfahrungen mit Liganden anderer nukleärer Rezeptoren wie den Peroxi-somen Proliferator-aktivierten Rezeptoren (PPAR) oder den Estrogenrezeptoren (ER) haben gezeigt, dass eine zu starke Aktivierung eines Ligand-aktivierten Transkriptionsfaktors Risiken erheblicher Nebenwirkungen bergen kann. Eine Möglichkeit, dieser Gefahr vorzubeugen, bietet die Entwicklung partialagonistischer FXR-Liganden, die den Rezeptor nur mit moderater Amplitude aktivieren.
In dieser Arbeit wurde ausgehend von der in einem virtuellen Screening identifizierten Leitstruktur 1, durch medizinisch chemische Optimierung und Studien zu den Struktur-Wirkungs-Beziehungen (SAR) ein potenter und selektiver FXR-Partialagonist entwickelt. Die drei Molekülteile der Leitstruktur 1 (azide Kopfgruppe, zentraler Anthranilamidkörper und Acylsubstituent) wurden einzeln hinsichtlich ihrer Potenz an FXR untersucht und optimiert. In der Untersuchung der SAR des Acylsubstituenten zeigten sich ein 2-Naphthoyl- und ein 4-tert-Butylbenzoylsubstituent der in 1 enthaltenen 4-Methylbenzoylgruppe überlegen. Unter Beibehaltung des 2-Naphthoylsubstituenten wurde hierauf durch selektive Methylierung bzw. Reduktion die Notwendigkeit beider Amidbindungen der Subs-tanzklasse für Aktivität an FXR nachgewiesen. Durch Erweiterung der aziden Kopfgruppe um einen zusätzlichen aromatischen Ring gelang eine weitere Potenzsteigerung, die sich durch eine Methyl-gruppe an 6-Position dieses neu eingeführten Ringes noch erhöhen ließe. Andere Substituenten am aromatischen Ring der Kopfgruppe führten dagegen an keiner Position zu einer Aktivitätsverbes-serung. Der Austausch der freien Carbonsäure durch metabolisch stabilere Bioisostere wie ein Methylketon oder ein Nitril stellte sich als ohne Aktivitätsverlust möglich heraus, wobei das Tetrazol als klassisches Carbonsäurebioisoster eine Ausnahme mit geringerer Potenz bildete. Die entscheiden-de Steigerung der Aktivität der Acylanthranilamide an FXR resultierte aus der Einführung eines zusätzlichen Substituenten in 4-Position des zentralen aromatischen Ringes, wobei eine Methoxy-gruppe zur größten Potenz führte. Das resultierende Anthranilamid 2 stellt einen hochpotenten FXR-Partialagonisten mit einem EC50-Wert von 8±3 nM in einem flFXR-Reportergenassay bei 18±1% Maximalaktivierung dar und ist der Leitstruktur somit um mehr als einen Faktor 1000 überlegen.
Die optimierte Verbindung 2 wurde aufgrund ihrer großen Potenz ausführlich in vitro pharma-kologisch charakterisiert. Dabei stellte sich die Substanz als metabolisch sehr stabil, moderat löslich in Wasser und gemessen an ihrer hohen Aktivität an FXR als wenig toxisch heraus. Darüber hinaus er-wies sich 2 als selektiv für FXR über den membranständigen G-Protein-gekoppelten Gallen-säurerezeptor TGR5 (Faktor >1000) sowie über die nukleären Rezeptoren PPARα (>1000), PPARγ (~375) und PPARδ (>1000). Bei der Quantifizierung seiner Effekte auf die FXR-Targetgene SHP, CYP7A1, BSEP, OSTα und IBABP durch qRT-PCR übte 2 im Bereich 0,1 µM bis 10 µM einen konzen-trationsunabhängigen partialagonistischen Effekt von etwa 40% des Effektes des physiologischen FXR-Agonisten Chenodeoxycholsäure (CDCA) aus. Mit der Verbindung 2 wurde somit ein hochpotenter, selektiver und metabolisch stabiler FXR-Partialagonist entwickelt und charakterisiert, der sich für künftige in vitro und in vivo Studien zu partieller FXR-Aktivierung empfehlen kann.
Metabolites such as lactate and free fatty acids (FFAs) abundantly occur in high concentrations in tumor and stromal cells of solid malignancies. Their known functions comprise the allocation of nutrients and intermediates for the generation of cell components, the evasion of immune destruction, the induction of vessel formation and the stimulation of cell migration in order to promote tumor growth, progression and metastasis. However, the role of metabolites as signaling molecules and the downstream mechanisms of metabolite receptor mediated signaling in tumor and stromal cells is poorly understood. Our study confirms the expression of Hydroxycarboxylic acid receptor 1 (HCA1) in solid human breast tumors and the expression of Free fatty acid receptor 4 (FFA4) in solid human colorectal tumors. In addition, the expression of HCA1 in human breast cancer cell lines as well as the expression of FFA4 in human colorectal cancer cell lines was proved. Moreover, our research reveals the expression HCA2, FFA2 and FFA4 in tumor associated macrophages (TAMs).
To test whether the loss of any of the metabolite receptors affects tumor growth and progression we utilized a syngeneic Lewis lung cancer (LLC1) tumor model, an azoxymethane (AOM) – dextran sulfate (DSS) colorectal cancer model and a Mouse mammary tumor virus Polyoma Virus middle T antigen (MMTV-PyMT) breast cancer model. The loss of HCA2 did not lead to a changed outcome compared to wild type littermates in any of the models. Likewise, the deletion of FFA4 had no influence on the LLC1 model and, surprisingly, tumor number and area in the AOM-DSS model also remained unaltered. The impact of HCA1 deficiency was investigated utilizing the MMTV-PyMT model and revealed a moderately improved tumor growth. The absence of FFA2 did not affect tumor growth in the LLC1 model but led to an increased number of colorectal tumors in the AOM-DSS model while the tumor area remained unchanged. The most compelling results were obtained upon the deletion of FFA2 in the MMTV-PyMT model. Here, we demonstrate that the loss of FFA2 significantly reduces tumor latency and also significantly improves tumor growth. Nevertheless, the formation of metastases in the LLC1 model and the MMTV-PyMT model did not show any changes upon the loss of any of the metabolite receptors.
Together, our results describe a tumor-protective effect of FFA2 with an unclear impact on metastatic processes. Considerations about putative mechanisms of short chain fatty acid (SCFA) mediated FFA2 signaling suggest potential targets for pharmacological interventions to treat mammary tumors.
Entzündungen sind eine Gegenreaktion des Körpers auf einen schädlichen Stimulus. Eine akute Entzündung zeichnet sich durch typische Zeichen wie Schwellung, Rötung, Überwärmung, Schmerz und eingeschränkter Funktionsfähigkeit aus.Findet die Auflösung der Entzündung nur sehr langsam oder nicht statt, entsteht eine chronische Entzündung. Eine chronische Entzündung kann Auslöser vieler schwerwiegender Krankheiten, wie Diabetes mellitus, Krebs oder kardiovaskulärer Erkrankungen sein. Die symptomatische Behandlung einer chronischen Entzündung erfolgt unter anderem durch NSAIDs. Diese haben bei einer Langzeiteinnahme schwere Nebenwirkungen wie gastrointestinale Blutungen oder nephrotoxische Eigenschaften.NSAIDs greifen in den Metabolismus der Arachidonsäure-Kaskade ein. Die Arachidonsäure wird über mehrere Enzyme metabolisiert, die drei Hauptmetabolismuswege erfolgen über die Cyclooxygenase- (COX), 5-Lipoxygenase- (5-LOX) und Cytochrom P450-Enzyme (CYP450). Studien ergaben, dass die Inhibition eines Metabolismusweges eine Verschiebung der Lipidwerte innerhalb des Arachidonsäurestoffwechsels verursacht. Viele dieser Nebenwirkungen bei einer Langzeitmedikation kommen vermutlich durch die Verschiebung der Metabolite zustande.8 Diese Problematik könnte möglicherweise durch eine Inhibition mehrerer Metabolismuswege umgangen werden. Tierstudien belegen eine bessere Wirksamkeit dualer Inhibitoren gegenüber der Einzelverabreichung von „selektiven“ Inhibitoren und zudem wird ein erhöhtes Sicherheitsprofil für duale Inhibitoren postuliert.9,10 Im Rahmen dieser Arbeit wurden einerseits duale Inhibitoren der löslichen Epoxidhydrolase (sEH) und Leukotrien-A4-Hydrolase (LTA4H) und anderseits der sEH und der 5-Lipoxygenase entworfen, synthetisiert und in vitro gegenüber den betreffenden Enzymen in einem Aktivitätsassay evaluiert.
Es ist gelungen, duale Inhibitoren der sEH und LTA4H mit IC50-Wert im submikromolaren Bereich zu synthetisieren. Dies wurde durch die Erweiterung des Fragments 3-(4-(Benzyloxy)phenyl)propan-1-ol, welches Amano et al. publizierten, bewerkstelligt.11 Die synthetisierten Inhibitoren wurden analytisch charakterisiert und in vitro auf ihr inhibitorisches Potential untersucht. Des Weiteren konnte die Kristallstruktur eines dualen Inhibitors in der Bindetasche der sEH gelöst werden und damit weitere Erkenntnisse über den Bindungsmodus des Inhibitors gewonnen werden. Es konnten auch duale Inhibitoren der sEH und 5-LOX synthetisiert werden und jene auf ihr inhibitorisches Potential untersucht werden. Es wurden einige Inhibitoren mit submikromolaren bis nanomolaren IC50-Werten gegenüber beiden Zielproteinen entworfen, synthetisiert und analytisch charakterisiert. Da mehrere Inhibitoren zwei stereogene Zentren aufweisen, wurde ein Inhibitor mit definierten Stereozentren durch eine asymmetrische Synthese generiert. Ein stereogenes Zentrum wurde über drei Schritte synthetisiert und zum Nachweis der Reinheit des Enantiomeres zum Diastereomer gekuppelt. Per NMR-Spektroskopie wurde das Verhältnis (dr 9:1) der Diastereomere zueinander bestimmt. Das andere stereogene Zentrum wurde mit Hilfe eines Evans-Auxiliar über eine achtstufige Synthese dargestellt und mit dem Enantiomer aus der dreistufigen Synthese verknüpft. Per HPLC konnte ein dr-Verhältnis von 99:1 für den Inhibitor HK330 bestimmt werden. Das andere Diastereomer wurde mittels HPLC aus dem Recemat isoliert. Eine in vitro Evaluation zeigte, dass der Einfluss des stereogenen Zentrums auf das Inhibitionsvermögen marginal ist.
Nach einer Evaluation des Inhibitionsvermögens, der Löslichkeit, der Zelltoxizität, der metabolischen Stabilität und der synthetischen Zugänglichkeit, wurde der Inhibitor HK330 weiter untersucht. In einem Zellassay konnte jener die 5-LOX-Aktivität senken, die 12- und 15-LOX wurde jedoch nicht inhibiert. Des Weiteren wurde der Inhibitor in einer pharmakokinetischen Studie untersucht und erreichte Plasmawerte, die bis zu 4 h in der aktiven Konzentration des Inhibitors lagen. LC-MS/MS Untersuchungen der Plasmaproben ergaben ein erhöhtes EETs/DHETs-Verhältnis, welches die in vivo Inhibition der sEH bestätigt. Die Verbindung HK330 besitzt vielversprechende Eigenschaften und deshalb soll die Wirksamkeit des Inhibitors in einem Tiermodell getestet werden. Geeignete Tiermodelle wie die unilaterale Harnleiterobstruktion (unilateral ureteral obstruction, UUO) in Mäusen könnten Aufschlüsse über die Wirksamkeit von HK330 geben. Denn sowohl die Inhibition der 5-LOX als auch der sEH sind renoprotektiv.12,13 Die profibrinolytischen und anti-inflammatorischen Eigenschaften eines sEH-Inhibitors könnten auch in einem Tiermodell zur gestörten Wundheilung untersucht werden. In einem murinen Ohrwundmodell wurde gezeigt, dass eine Behandlung mit Epoxyeicosatriensäuren (EETs) die Wundheilung signifikant beschleunigte.15 Ramalho et al. zeigten, dass die Leukotriene des 5-LOX-Metabolisimusweges eine verminderte Wundheilung in diabetischen Mäusen (Typ 1) bewirkten.
Die 5-Lipoxygenase ist das Schlüsselenzym der Bildung proentzündlicher Leukotriene. Diese Mediatoren sind assoziiert mit Erkrankungen des entzündlichen Formenkreises wie beispielsweise Arteriosklerose [6]. Durch die Veröffentlichungen von Qiu et. al. [248] und Gredmark-Russ et. al. [650] konnte gezeigt werden, dass die Infektion mit humanen Cytomegalovirus in vitro und in vivo zur Induktion der 5-LO in HPASMCs und SMCs (smooth muscle cells) führt. HCMV ist ein ß-Herpesvirus, welches nach einer zumeist asymptomatischen Primärinfektion, dauerhaft im Wirt persisiert und bei Schwächung des Immunsystems oder entzündliche Prozessen reaktiviert werden kann [256]. Geht das Virus in die lytische Replikationsphase über, werden Entzündungsprozesse gefördert, die zur Ausprägung von Krankheitsbildern wie Retinitis, rheumatoider Arthritis oder auch Psoriasis führen. Es besteht demnach ein Zusammenhang zwischen der aktiven HCMV-Infektion und Erkrankungen des entzündlichen Formenkreises, welche unter anderem durch die Induktion der 5-LO vermittelt wurden.
Ziel der Arbeit war es, den molekularen Mechanismus der viral induzierten 5-LO-Promotoraktivierung aufzuklären. Dazu wurde zunächst überprüft, ob die Infektion mit HCMV in HFF, einer Zelllinie die äußerst permissiv für die Infektion ist und daher zumeist als Testsystem für HCMV herangezogen wird, eine verstärkte 5-LO-Expression hervorruft, oder ob es sich um einen zelltypspezifischen Effekt der smooth muscle cells handelt. Es konnte gezeigt werden, dass es nach Infektion zu einer verstärkten Promotoraktivierung, mRNS- sowie Proteinexpression der 5-LO kam (Abb. 19, 23, 24). Weitere Untersuchungen charakterisierten, welches virale Protein die Effektvermittlung bedingte. Aufgrund der sequentiellen Genexpression des Virus unterscheidet man nach Zeitpunkt der Expression in Immediate Early, Early und Late Proteine, wobei letztere erst nach Replikation des viralen Genoms exprimiert werden. Der Zusatz von Foscavir als Replikationsinhibitor verdeutlichte, dass ein Immediate Early oder Early Protein die Induktion hervorruft (Abb. 16). Reportergenassay-Experimente unter Überexpression einzelner viraler Proteine zeigten, dass Immediate Early 1 essentiell an der Erhöhung der 5-LO-Promotoraktivität beteiligt ist (Abb. 18). Weitergehende Versuche unter Verwendung des IE1-Deletionsvirus CR208 bestätigten, dass die Induktion der 5-LO-Promotoraktivität sowie der mRNS-Expression durch dieses virale Protein vermittelt wird (Abb. 18, 20-22). Auf Proteinebene konnte ebenfalls nach IE1-Überexpression beziehungsweise nach Infektion mit HCMV eine erhöhte 5-LO-Expression detektiert werden (Abb. 23 und 24). Aktivitätsuntersuchungen, bei denen die Konzentration der 5-LO-Produkte LTB4 und 5-HETE gemessen wurden, bestätigten, dass das Enzym funktionsfähig ist (Abb. 25). Nach Infektion mit HCMV kommt es demnach zur IE1-vermittelten Induktion der 5-LO auf mRNS- und Proteinebene sowie nachgeordnet zur verstärkten Produktion von inflammatorischen Leukotrienen, die an der Ausbildung der entzündlichen Symptomatik einer lytischen Infektion beteiligt sind.
Immediate Early 1 ist ein potenter Transaktivator, der sowohl virale als auch zelluläre Promotorstrukturen aktivieren kann [387]. Funktionell wird dies reguliert über die Förderung der Transkriptionsfaktor-Expression, aber auch durch Beeinflussung histonmodifizierender Enzyme wie Histondeacetylasen [464]. Für den 5-LO-Promotor ist bekannt, dass dessen Aktivität über Bindung von Sp1, sowie durch HDAC-Inhibition beeinflusst werden kann [9, 171]. Diese beiden Regulationsmechanismen stellen demnach mögliche Verknüpfungspunkte in der viral induzierten Induktion des 5-LO-Promotors dar. Zunächst wurde die Expression von Transkriptionsfaktoren, welche charakterisierte Bindungsstellen im 5-LO-Promotor besitzen, nach IE1-Überexpression untersucht. Es zeigte sich, dass der zelluläre Sp1-mRNS-Spiegel durch IE1 80fach induziert werden kann (Abb. 27). Im Reportergenassay mit 5-LO-Promotordeletionskonstrukten, bei denen gezielt einzelne Sp1-Bindungsstellen, sogenannte GC-Boxen, mutiert wurden, konnte bestätigt werden, dass die IE1-vermittelte Induktion essentiell von Sp1-abhängt, da die Mutation der GC4-Box die Aktivierung nahezu komplett inhibiert (Abb. 30, 31). Auch der Zusatz von Mithramycin, einem DNS-Interkalator, welcher die Bindung von Sp1 an die DNS unterdrückt, ist in der Lage die Induktion abzuschwächen (Abb. 33) [651]. Um die direkte Sp1-Bindung an den 5-LO-Promotor nachzuweisen wurden sowohl EMSA- als auch ChIP-Experimente durchgeführt. Es zeigte sich, dass in vitro und in vivo die Sp1-Bindung an den proximalen 5-LO-Promotor nach IE1-Überexpression beziehungsweise nach Infektion zunimmt (Abb. 49, 50). Interessanterweise wird dieser Effekt nicht durch Immediate Early 2, einer Spleißvariante von IE1, welche eine große strukturelle Ähnlichkeit aufweist, hervorgerufen. Da Veröffentlichungen gezeigt haben, dass beide Immediate Early Proteine in der Lage sind, Sp1 auf mRNS-Level zu induzieren, muss ein weiterer regulatorischer Mechanismus in die Sp1-Promotorbindung involviert sein [410]. In Co-Immunopräzipitations Versuchen zeigten beide IEPs eine Interaktion mit Sp1 (Abb. 38), wonach der Unterschied in der transaktivierenden Fähigkeit des 5-LO-Promotors nicht durch Protein-Protein-Bindung mit Sp1 bedingt wird. Strukturell unterscheiden sich die beiden Proteine in ihrer carboxyterminalen Sequenz. Für IE1 ist hier eine intrinsische Kinaseaktivität beschrieben, die zur Autophosphorylierung, aber auch zur Phosphorylierung von Bindungsproteinen führen kann. Western Blot Analysen auf den zellulären phospho-Sp1-Gehalt nach viraler Überexpression konnten zeigen, dass IE1, nicht aber IE2 die posttranslationale Modifikation des Transkriptionsfaktors fördert (Abb. 39). Auch die Testung viraler Deletionsmutanten, denen einzelne Exons beziehungsweise die ATP-Bindungsstelle der Kinasedomäne fehlen, bestätigten die Schlüsselfunktion dieses Strukturelements (Abb. 37). Ob es sich um eine direkte oder indirekte Phosphorylierung von Sp1 durch IE1 handelt wurde durch in vitro Kinase-Assays und die Testung unterschiedlicher Proteinkinase-Inhibitoren bestimmt (Abb. 40, 42, 45). Obwohl die beiden Proteine miteinander interagieren können, kam es nicht zu einer direkten Phosphorylierung, sondern zelluläre Kinasen wie Tyrosinkinasen und nachgeordnet die Mitglieder des MAPK-Signalweges sind in die Phosphorylierung von Sp1 involviert. Die finale Bestätigung der essentiellen Funktion von Sp1 in der IE1-vermittelten Aktivierung des 5-LO-Promotors lieferte ein Reportergenassay-Experiment mit Sp1-Knock-down Zellen, welche nach viraler Überexpression keine 5-LO-Promotoraktivität und mRNS-Expression mehr zeigten (Abb. 47, 48). Für die Vermittlung der IE1-induzierten 5-LO-Promotoraktivierung sind dessen transaktivatorische Fähigkeiten demnach essentiell, durch Erhöhung der Sp1-mRNS-Expression und nachfolgender Phosphorylierung wird die DNS-Bindung des Transkriptionsfaktors an die GC4-Box des 5-LO-Promotors erhöht und dieser damit transkriptionell aktiviert.
Neben der Regulation über verstärkte phospho-Sp1-Bindung an die GC4-Box Region muss die Induktion von 5-LO durch IE1 noch über weitere Interaktionen vermittelt werden, da die reine Sp1-Überexpression ohne IE1 keine Promotoraktivierung hervorrufen konnte (Abb. 34). Überprüft wurde daher die HDAC-inhibitorische Fähigkeit von IE1, da der 5-LO-Promotor über diese epigenetischen Mechanismen reguliert werden kann. Pull-down-Experimente zeigten zunächst eine Protein-Protein-Interaktion zwischen IE1 und HDAC1/2/3 (Abb. 51). Nachfolgend konnte in einem HDAC-Aktivitätsassay gezeigt werden, dass diese Interaktion die Enzymaktivität der HDACs drastisch reduziert (Abb. 52). Durch HDAC-Inhibition liegen Promotorstrukturen zunehmend acetyliert vor und sind damit transkriptionell aktiv. Für den funktionellen Nachweis auf den 5-LO-Promotor diente ein Reportergenassay-Experiment in dem IE1 und in steigenden Mengen HDAC überexprimiert wurde (Abb. 53). Die Überexpression von HDAC1 und HDAC3 konnten den aktivierenden Einfluss von IE1 auf den 5-LO-Promotor teilweise konzentrationsabhängig revertieren und scheinen damit an der Effektvermittlung beteiligt zu sein. Die Charakterisierung der HDAC-vermittelten 5-LO-Promotorregulation von Pufahl et. al. bestätigte durch Knock-down Experimente, dass HDAC3 entscheidenden Einfluss auf den 5-LO-Promotor hat [172]. HDAC1 dagegen reguliert über die verstärkte Deacetylierung von Sp1 dessen DNS-Bindungsaffinität. Eine Hemmung dieser beiden Histondeacetylasen durch das virale Protein erhöht damit die Aktivität des 5-LO-Promotors.
Zusammenfassend lässt sich sagen, dass das Ziel der Arbeit erreicht wurde und ein detaillierter Mechanismus der 5-LO-Promotoraktivierung durch HCMV aufgeklärt wurde. Immediate Early 1 induziert dabei zunächst die Expression und Phosphorylierung von Sp1. Ebenso interagiert das virale Protein mit HDAC1/2/3 und hemmt deren Aktivität, wodurch es zur Öffnung der 5-LO-Promotorstruktur kommt. Entscheiden ist hierbei vor allem die Hemmung von HDAC3. HDAC1 Inhibition sorgt im getesteten Zellsystem zusätzlich für verstärkte Acetylierung des Transkripti-onsfaktors Sp1, welcher aufgrund der dadurch erhöhten DNS-Bindungsaffinität an die GC4-Box-Region binden und so die Transkription fördern kann. Interessanterweise ist die Bindung an andere beschriebene GC-Boxen des 5-LO-Promotors nicht induktiv, was die Annahme nahelegt, dass nicht Sp1 alleine, sondern ein transaktivatorischer Komplex an diese Region bindet. Die Aktivierung des Promotors führt nachfolgend zur mRNS- und Proteinexpression, welche eine verstärkte Leukotrienbildung zur Folge hat. Diese Mediatoren sind in die Entstehung der entzündlichen Charakteristik einer aktiven HCMV involviert. Das Virus macht sich demnach generelle Prinzipien der Transaktivierung zu Nutze und fördert so zum einen seine Reaktivierung aus der Latenz, zum anderen die produktive Verbreitung der Infektion.
G protein-coupled receptors (GPCRs) constitute an important class of integral membrane proteins that are involved in several signaling pathways. About 50% of the currently available drugs are targeted against these receptors and high-resolution structures of these receptors will be of immense importance from the perspective of designing specific and potent drugs. However, structure determination of these receptors and of membrane proteins in general, has been a very challenging task till date. A major limitation in the structure determination of these proteins is that they are present in minute amounts in the native tissues and therefore, they must be produced heterologously. Additionally, crystallization of GPCRs is difficult owing to their flexible nature and limited hydrophilic surface area available for crystal contacts. The aim of my Ph.D. thesis work is two fold, first, to address the problem of GPCR crystallization by using a fusion protein complex approach and second, to tailor Rhodobacter sphaeroides as an expression system for the heterologous production of GPCRs. In the first approach, R. sphaeroides was used as an expression system to generate a fusion protein complex of the photosynthetic reaction center (RC) with a GPCR, expecting that such a complex would be easier to crystallize than the receptor alone. The notion behind this approach is that the RC will act as a scaffold in providing surface area to create crystal contacts and at the same time, it will also reduce the flexibility of the receptor, hopefully without perturbing the functionality of the receptor. Based on the computational modelling experiments, two ways to generate a fusion complex were assigned. Long linkers were inserted between the subunits of the RC and the GPCR. The linkers were designed with a possibility of straightforward alteration of their length as they contained a number of restriction enzyme sites. A series of these constructs were designed and expressed in R. sphaeroides deletion strain, which did not possess the chromosomal RC genes. Though most of these fusion constructs could be successfully expressed, as analyzed by western blot, majority of them were not functional in terms of ligand binding of the GPCR component of the fusion complex. Interestingly, one of these constructs, where the M subunit of RC was directly fused to the human angiotensin II type 1a receptor (AT1aR), exhibited significant functional expression. Based on saturation binding analysis using [125I] iodotyrosyl4Sar1Ile8-angiotensin II (an AT1aR subtype specific antagonist), an expression level of 40+5 pmol/mg of total membrane protein was calculated. This expression level corresponds to approximately 0.3 mg of functional receptor per liter culture and it is significantly higher than the AT1aR expression in native tissues. Additionally, the binding affinity of the recombinant receptor for its endogenous ligand angiotensin II was found to be 1±0.1 nM, which is similar to that observed for the AT1aR in native tissues. More interestingly, the RC part of the fusion complex was structurally assembled in other words, properly folded as judged by the presence of the characteristic peaks at 760 nm, 800 nm and 850 nm by absorption spectroscopy. However, a slight change in the intensity of the peak at 800 nm was observed while comparing the spectra of native RC with that in the fusion protein complex. This slight variation might be due to the change in the protein environment. The fusion protein complex RC-AT1aR was functionally solubilized and purified using a decahistidine tag fused at the c-terminus of the AT1aR. Subsequently, the monodispersity and integrity of the complex was confirmed by size exclusion chromatography, which revealed a homogeneous peak. Additionally, it was also possible to solubilize and purify this complex in the presence of a fluorescein tagged angiotensin II ligand which provides a nice tool to judge the functionality of the AT1aR and integrity of the complex at the same time. The purified RC-AT1aR fusion complex was then subjected to three-dimensional (3-D) crystallization trials and it was possible to obtain reproducible crystals of this complex. The crystals were fluorescent (as the complex was purified in presence of fluorescently labelled angiotensin II) and needle or tetragonal in shape, but produced a powdery diffraction pattern. Further attempts to improve the crystallization condition and to optimize the cryo-conditions are underway. In addition, attempts are also being made to obtain the crystals of this complex with the antagonist (e.g. losartan) bound to the receptor. In view of several limitations in the heterologous expression of GPCRs, as the second part of my Ph.D. thesis, I decided to explore the possibilities of developing a novel expression system based on R. sphaeroides for production of recombinant GPCRs. The notion behind using this host is that lack of inclusion bodies and high concentration of membranes in R. sphaeroides would result in efficient functional overexpression of recombinant membrane proteins. For this purpose, a R. sphaeroides strain, modified by the deletion of the genes encoding the RC and the light harvesting proteins LH1 and LH2, was used. The genes for RC and LHs constitute about 85-90% of total membrane proteins in a R. sphaeroides cell. These membranes are normally housed in special membrane vesicles called intracytoplasmic membranes (ICMs) that can fill almost the entire cell volume under certain growth conditions. Synthesis of a heterologous protein under the control of the moderately strong photosynthetic superoperonic promoter should be coordinated with the synthesis of new membranes to harbour these proteins, thus acting as a natural induction system. Moreover, as most of the native membrane proteins are absent in this deletion strain, heterologously produced protein should not experience a shortage of molecular chaperones for proper folding and insertion. Additionally, the absence of inclusion bodies in this host should enhance the functional and homogenous population of the recombinant proteins. Three human GPCRs, namely the adenosine A2a receptor (A2a), the angiotensin II type 1a receptor (AT1aR) and the bradykinin subtype 2 receptor (B2R) were tested for expression and functionality in this system. Two different constructs were used to determine the optimal position and ribosome-binding site (RBS) in the superoperon for the highest expression level. Of these three receptors, the AT1aR and B2R were successfully produced, while the A2aR failed to express, producing green carotenoid free R. sphaeroides mutants, for unknown reasons. For the recombinant B2R, [3H] bradykinin binding analysis revealed a low functional expression level of 0.7-0.8 pmol/mg of total membrane protein. This expression level corresponds to 0.01 mg functional receptor per liter of culture and is not sufficient for large-scale expression of this receptor. However, for the recombinant AT1aR, [125I] iodotyrosyl4Sar1Ile8- angiotensin II binding analysis revealed an expression level of 12±1 pmol/mg of total membrane protein. This expression level corresponds to approximately 0.1 mg functional receptor per liter culture and this is significantly higher than the AT1aR expression in native tissues. This expression system is still in the nascent stages of development and there are several parameters, which are still to be assessed for the optimal use of this system for the production of GPCRs and other membrane proteins. In conclusion, my Ph.D. work presents a novel fusion protein complex based approach for obtaining crystallizable GPCRs and a novel expression system for producing heterologous GPCRs. It was possible, for the first time, to produce a functional RC-GPCR complex that could easily be crystallized, though further finetuning of the system is required. R. sphaeroides based novel expression system was successfully used to produce functional human GPCRs under the control of a moderately strong photosynthetic superoperonic promoter. This expression system represents a naturally induced system where the expression of a heterologous protein is coordinated with the synthesis of new membranes to harbour the recombinant protein. The fusion protein complex approach and the expression system presented here can hopefully be used as a general method to facilitate the expression and crystallization of other membrane proteins.
Die Suche nach neuen Zielmolekülen und Wirkstoffen für die Schmerztherapie ist eine unerlässliche Aufgabe, um Nebenwirkungen heutiger auf dem Markt befindlicher Schmerzmedikamente entgegenzuwirken. Ein vielversprechendes Ziel - als Alternative zu cyclooxigenasehemmenden Medikamenten (tNSDAIDs und Coxibe) - ist die mikrosomale Prostaglandin E-Synthase 1 (mPGES-1). In dieser Arbeit wurden zwei Substanzklassen rund um die Benzensulfonamid-Leitstruktur FR4 und die Quinazolinon-Leitstruktur FR20 aufgebaut. Die Benzensulfonamidklasse enthält 32 Derivate, die Klasse der Quinazolinone 24 Derivate. Beide Strukturklassen konnten durch chemische Modulation an verschiedenen Resten erweitert werden. Durch strukturelle Variationen konnte die Aktivität der FR4-Klasse von initial 14 µM auf 0,8 µM (FR4-Dev28) optimiert werden. In der FR20-Klasse konnten zahlreiche equipotente Derivate gefunden werden. Beide Klassen zeigten eine niedrige Toxizität (ab etwa 100 µM) und konnten auch auf zellulärer Ebene den PGE2-Level konzentrationsabhängig reduzieren. In humanen Vollblutversuchen wurde die Kreuzreaktivität dieser Substanzen auf andere Eicosanoide untersucht. Beide Klassen konnten auch hier den PGE2-Level reduzieren. Ein Prostanoidshunting in Folge der mPGES 1-Hemmung konnte dabei nicht festgestellt werden. Darüber hinaus wurde eine dualinhibitorische Funktion der Benzensulfonamide beobachtet. Neben der mPGES-1 wurde auch das 5LOX-vermittelte LTB2-Level reduziert. Dieser Effekt trat bei den Quinazolinonen nicht auf. Neben der humanen mPGES-1 wurde auch der Einfluss auf das murine Enzym untersucht. Dabei wurde festgestellt, dass die Hemmung von der Wahl der Klasse abhängt: Benzensulfonamide hemmen die murine mPGES-1, Quinazolinone nicht. Damit konnte erstmals eine Strukturklasse mit dualinhibitorischer (mPGES-1/5LOX) und speziesübergreifender Hemmung (human/murin) beschrieben werden. Untersuchungen an erstellten Homologie-Modellen der humanen und murinen mPGES-1 zeigten Unterschiede der Bindetaschen der beiden Spezies. PLIF-Analysen der beiden Strukturklassen deckten verschiedene Bindungsmuster auf. In vivo-Pharmakologische Untersuchungen von FR4-Dev6 zeigten eine sehr schnelle Resorption ins Blut (tMax = 10 min) sowohl nach intraperitonealer als auch nach oraler Applikation, gefolgt von einer raschen Verteilung in zahlreiche Organe. Hohe Konzentrationen wurden im Gastrointestinaltrakt und der Niere gemessen, beides Organe, in denen PGE2 eine physiologische Funktion ausübt. Die Konzentration fiel bereits nach 30 min in allen Organen wieder stark ab, ein basaler Level war aber noch nach sechs Stunden mit der eigens entwickelten LC-MS/MS-Methode detektierbar. Eine antiinflammatorische Wirkung in einem Zymosan-induzierten Entzündungsmodell konnte nicht bestätigt werden, da die gewählte Formulierung bereits den PGE2-Level stark reduzierte. Eine starke Akkumulation von FR4-Dev6 konnte aber im Pfotenödem gemessen werden. Die umfassende Charakterisierung der vorgestellten Substanzklassen hat neben grundlegenden Struktur-Aktivitätsbeziehungen neue Einsichten in die Wirkungsweise von mPGES-1-Inhibitoren geliefert. Diese Ergebnisse können in Zukunft für weitere Entwicklungen von neuartigen, verträglicheren Analgetika, Antiphlogistika und Antipyretika mit dem Zielmolekül mPGES-1 genutzt werden.
In dieser Studie haben wir die Modulation von Arachidonsäure (AA)-Stoffwechselwegen während einer Wurminfektionen mit dem Fadenwurm Heligmosomoides polygyrus bakeri (Hpb) als angeborene regulatorische Strategie zur Modulation der Typ-2-Entzündung untersucht. Wir zeigten, dass Hpb in frühen Stadien der Infektion (Tag 7) die Produktion von regulatorischen Prostaglandinen (PGE2 und 6-keto PGF1-α, ein Abbauprodukt von PGI2) und COX-Metaboliten (12-HHT und TXB2) fördert, jedoch die Sekretion von entzündungsfördernden Mediatoren PGD2 und LTs (LTB4, cysLTs) unterdrückt. Die Hpb-gesteuerte Regulierung des AA-Stoffwechsels könnte eine Strategie zur Immunsuppression/ Immunevasion dieses Parasiten darstellen, die darauf abzielt, die vom Wirt ausgelösten Immunantworten des Typs-2 zu unterbinden und sowohl die Infiltration und Rekrutierung von Granulozyten als auch die Schleimproduktion zu begrenzen und auf diese Weise das Abtöten bzw. Ausscheiden der Larven zu verhindern.
Als Schwerpunkt der Arbeit, konnten wir ebenso zeigen, dass ein Larvenextrakt aus Heligmosomoides polygyrus bakeri (HpbE) den AA Stoffwechsel in myeloiden Zellen wie Makrophagen und Granulozyten moduliert, indem die Synthese von 5-LOX in Richtung COX-Metaboliten verschoben wird. Die Behandlung von murinen und humanen Makrophagen mit HpbE induzierte die Synthese von regulatorischen Prostaglandinen (PGE2) und Prostaglandinen, die an der Wundheilung und Blutgerinnung beteiligt sind (12-HHT, TXB2), wohingegen die Produktion von entzündungsfördernden Lipidmediatoren (LTs, PGD2) unterdrückt wurde. Weiter induzierte HpbE in humanen und murinen Makrophagen die Synthese der Typ-2 hemmenden Mediatoren IL-10 und IL-1β und modulierte die Produktion von Zytokinen, die an der Regulierung von M2-Polarisierung und der Typ-2-Entzündung (IL-12, IL-28, IL-27 und TNF-α) in humanen Makrophagen beteiligt sind. Ähnlich zu der HpbE-vermittelten Eicosanoid-Umprogrammierung in Makrophagen, veränderte HpbE den AA-Stoffwechsel humaner Granulozyten und zeigt eine Verschiebung von LOX- in Richtung COX-Metabolismus. Außerdem kann HpbE direkt auf humane Granulozyten wirken und die Chemotaxis von Granulozyten effizienter hemmen als zur Asthmabehandlung verwendete Standardarzneimittel, indem es die Expression von LT synthetisierenden Enzymen (LTA4H und LTC4S) verringert und die Expression von chemotaktischen Rezeptoren (CCR3 und CRTH2) herunterreguliert.
Darüber hinaus, konnten wir die Mechanismen identifizieren, die der HpbE-gesteuerten Eicosanoid-Umprogrammierung in Makrophagen zugrunde liegen. Hpb Produkte induzierten die Aktivierung von p38 MAPK, welche COX und die Transkriptionsfaktoren HIF-1α und NFκβ aktiviert und die Produktion von Prostaglandinen (PGE2 and TXB2) sowie der Typ-2 unterdrückenden Zytokine IL-10 and IL-1β fördert. Der der Induktion des COX-Signalwegs zugrunde liegende Upstream-Mechanismus umfasste mehrere PPRs (TLR2, Dectin-1/2). Diese Rezeptoren waren allerdings nicht an der HpbE-gesteuerten Induktion von IL-10 beteiligt. Die Mechanismen der Modulation des 5-LOX-Signalweges muss noch in zukünftigen Studien weiter erforscht werden.
Das therapeutische Potential von HpbE oder HpbE-behandelten Makrophagen wurde in einem Maus Model mit HDM-induzierter allergischer Atemwegsentzündung in vivo gezeigt. Eine intranasale Behandlung mit HpbE vor HDM-Sensibilisierung und -Provokation führte zu einer Umprogrammierung des AA-Stoffwechsels und verhinderte die Allergie-induzierte Eosinophilie, Zellinfiltration, Atemwegsentzündung und Schleimproduktion. Die Modulation der Typ-2-Entzündung durch HpbE wurde vor allem durch COX-2-Metabolite vermittelt, die von HpbE-stimulierten Makrophagen freigesetzt wurden. Dies zeigte sich insbesondere darin, dass der Transfer von HpbE-stimulierten Wildtyp- aber nicht COX-2-defizienten Makrophagen vor Provokation die Granulozyten Rekrutierung und Typ-2-Entzündung während der HDM-induzierten Allergie in vivo abschwächte.
Mittels eines Maus Models für die allergische Atemwegsentzündung in unterschiedlichen Altersstufen (Neugeboren, Jungtier und Erwachsen) zeigte dieses Forschungsprojekt, dass das Alter der Sensibilisierung eine Schlüsselrolle bei der Produktion von LTs, der Expression von LT-Synthese Enzymen sowie von Faktoren, die zu strukturellen Veränderungen in den Atemwegen führen, spielt. Hier haben wir auch festgestellt, dass der Mechanismus hinter der LT-Produktion und dem Atemwegs-Remodeling im Epithel von ausgewachsenen sensibilisierten Mäusen die Aktivierung der Faktoren sPLA2X, TGM2 und Wnt5a beinhaltet.
Des Weiteren zeigte unsere Studie, dass eine Wechselwirkung zwischen entzündetem Atemwegsepithel und Alveolar-ähnlichen Makrophagen die Synthese von LTs fördern kann. Der vorgeschlagene Mechanismus startet mit der Sekretion von Wnt5a durch das entzündete Atemwegsepithel, welches die Expression von TGM2 in Makrophagen aktiviert und die Produktion von entzündungsfördernden LTs induziert, wodurch die Rolle der Makrophagen in entzündeten Atemwegen bei Erwachsenen weiter unterstützt wird. Die Relevanz der entdeckten Kaskade konnte auch in Geweben von Patienten mit chronischer Rhinosinusitis und Nasenpolypen (CRSwNP) bestätigt werden. Hohe Konzentrationen von LT Enzymen (5-LO, LTC4S LTA4H), sPLA2-X, TGM2 und Wnt5a wurden in humanen Nasenpolyp Geweben beobachtet, und hohe Konzentrationen von CysLTs wurden in Nasenpolyp Sekreten dieser Patienten gemessen. Dies lässt vermuten, dass die Expression von Atemwegs Remodeling-Faktoren, LT-Synthese Enzymen und die LT Synthese steroidresistent sind. Daher könnte diese entzündliche Kaskade ein alternatives therapeutisches Ziel für die Behandlung von Asthma darstellen, speziell bei Patienten mit steroidresistenten Formen von Atemwegsentzündungen.
Basierend auf den möglichen therapeutischen Anwendungen von HpbE haben wir begonnen, an der Charakterisierung der im HpbE vorhandenen immunmodulatorischen Wirkstoffe zu arbeiten. Glutamatdehydrogenase (GDH) und Ferritin wurden als potenzielle immunmodulatorische Komponenten von HpbE identifiziert. Es ist jedoch weitere Arbeit erforderlich, um diese in HpbE vorhandenen Proteine rekombinant herzustellen und den Wirkungsmechanismus im Bezug auf die Typ-2-Entzündung weiter aufzuklären.
Bioaktive Sphingolipide spielen eine wichtige Rolle bei der Regulation vieler entscheidender Prozesse in Endothelzellen. Speziell dem S1P wird eine Schlüsselfunktion in der Regulation der Proliferation und Migration von Endothelzellen beigemessen. Diese Prozesse sind notwendige Teilschritte in der Angiogenese, welche eine wichtige biologische und medizinische Bedeutung hat. So ist die umorangiogenese eine Voraussetzung für die adäquate Versorgung des Tumors mit Sauerstoff und Nährstoffen und trägt des Weiteren zu dessen Aggressivität bei. Ein weiteres Merkmal vieler solider Tumoren ist das Vorkommen hypoxischer Bereiche und erhöhter NO-Spiegel, die zudem, je nach Konzentration, als proangiogene Faktoren wirken können. Das Hauptziel dieser Arbeit lag in der Untersuchung des Einflusses hypoxischer Bedingungen und des Signalmoleküls NO auf das Sphingolipidgleichgewicht in der humanen Endothelzelllinie EA.hy 926. Ein spezieller Fokus wurde dabei auf die Regulation der S1P synthetisierenden Sphingosinkinasen (SK) und der daraus resultierenden Beeinflussung angiogener Zellantworten gelegt. In dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass sowohl Hypoxie als auch NO die Aktivität der SK-1, jedoch nicht der SK-2, langanhaltend erhöhten. Dieser Aktivitätsanstieg wurde durch eine Aktivierung des SK-1-Promotors mit einer nachfolgenden verstärkten mRNA- und Proteinexpression vermittelt. Dabei war unter Hypoxie der Transkriptionsfaktor HIF-1α der entscheidende SK-1 regulierende Faktor. Zusätzlich führte die durch Hypoxie ausgelöste Hochregulation der SK-1 zu einem Anstieg der zellulären S1P-Spiegel und zu einer Reduktion der Sphingosinkonzentration. Mechanistische Untersuchungen des Effekts von NO auf die SK-1 zeigten, dass dieser unabhängig von erhöhten cGMP-Konzentrationen aufgrund einer Aktivierung der löslichen Guanylatzyklase (sGC) durch NO war. Zum einen hatte die Verwendung des cGMP-Analogons 8-Bromo-cGMP und des Aktivators der sGC YC-1 keinen Einfluss auf die SK-1-Proteinexpression, und zum anderen hatte die Kostimulation mit dem sGC-Inhibitor ODQ keinen hemmenden Effekt auf die durch NO ausgelöste Hochregulation der SK-1. Demgegenüber ist die klassische MAPK-Kaskade essenziell für die Wirkung von NO auf die SK-1, da der MEK-Inhibitor U0126 die erhöhte Proteinexpression der SK-1 verhindern konnte. Die Aktivierung des vorgeschalteten kleinen GTP-bindenden Proteins p21ras ist ein möglicher Mechanismus, über den NO die Aktivierung der MAPKKaskade verursachen könnte (Lander et al, 1995). In einem weiteren Teil der Arbeit wurde die funktionelle Konsequenz einer Regulation der SK-1 durch Hypoxie und NO in EA.hy 926 Zellen untersucht. Sowohl Hypoxie als auch NO wurden als pro-angiogene Faktoren beschrieben. Daher wurde anhand von Migrationsassays und in-vitro-Angiogeneseassays untersucht, ob die SK-1 bei diesen Zellantworten eine Rolle spielt. Die Depletion der SK-1 durch die Verwendung einer spezifischen siRNA oder mit Hilfe von lentiviralen shRNA-Konstrukten zeigte, dass die Hochregulation der SK-1 unter Hypoxie und NO essenziell für die erhöhte Migration der Endothelzellen ist. Zusammenfassend zeigen die Daten, dass hypoxische Bedingungen und NO zu einer Hochregulation der SK-1 in EA.hy 926 Zellen führten und eine erhöhte Migrationsrate dieser Zellen zur Folge hatten. Somit ist die SK-1 ein interessanter therapeutischer Ansatzpunkt zur Behandlung von Krankheiten, die mit einer pathologischen Angiogenese einhergehen, wie es im Tumorgeschehen der Fall ist.
Das Gleichgewicht zwischen den Sphingolipiden Ceramid und Sphingosin-1-Phosphat (S1P) spielt eine entscheidende Rolle für das Schicksal einer Zelle. Es ist bekannt, dass Ceramid proapoptotisch wirkt, wohingegen S1P antiapoptotische und entzündungshemmende Signalwege induziert [6]. Eine Beeinflussung der Sphingolipid-metabolisierenden Enzyme sowie eine daraus resultierende gestörte Balance zwischen Ceramid und S1P ist somit ein Merkmal diverser entzündlicher Krankheiten wie der Asthma bronchiale, der Colitis ulcerosa [148] oder auch verschiedenen Arten von Tumoren [199]. Das Hauptziel dieser Arbeit lag in der Untersuchung der Ceramid-abbauenden neutralen Ceramidase (NCDase) und der S1P-synthetisierenden Sphingosinkinase 1 (SK1) in verschiedenen Nierenzellen. Ein Fokus wurde dabei auf die Regulierung dieser Enzyme durch entzündungshemmende Corticosteroide in Ratten Mesangiumzellen gelegt, wobei diese Zellen entscheidend in der Entstehung entzündlicher Nierenerkrankungen wie einer Glomerulonephritis sind. Weiterhin wurde der Einfluss der Mutation putativer Phosphorylierungsstellen der NCDase auf die Regulierung dieses Enzyms in HEK293 Zellen untersucht und in einem dritten Teil der Arbeit schließlich die Expression und die Funktion der SK1 in der humanen Niere im Vergleich zum Nierenzellkarzinom analysiert.
Es konnte gezeigt werden, dass Glucocorticoide (GCs) Mesangiumzellen durch eine Steigerung der intrazellulären S1P-Konzentrationen vor durch Stress induzierter Apoptose schützen. Diese Beeinflussung des Sphingolipid-Rheostats beruhte auf einer gesteigerten mRNA- und Proteinexpression der Sphingosinkinase 1 (SK1) und der neutralen Ceramidase (NCDase). Außerdem wurde nachgewiesen, dass der Promotor der NCDase durch GCs aktivierbar ist und dass zwei Glucocorticoid-responsive-Elemente (GREs) innerhalb der Promotorsequenz durch die Bindung von Glucocorticoidrezeptoren (GRs) diese Aktivierung bewirken. In vivo Experimente mit isolierten Glomeruli, die aus mit Dexamethason behandelten Mäusen gewonnen wurden, zeigten ebenfalls eine Erhöhung der mRNA-Expression und Aktivität der SK1 sowie eine gesteigerte Proteinexpression der NCDase. Somit wurde erstmals ein direkter Einfluss von GCs auf den Sphingolipidmetabolismus in Mesangiumzellen beschrieben.
In einem zweiten Teil dieser Arbeit wurde gezeigt, dass eine Mutation zweier putativer Proteinkinase C (PKC)-Phosphorylierungsstellen (T253A und T420/23A) in der Sequenz der murinen NCDase zu einem verlangsamten Reifungsprozess dieses Enzyms führt. Western Blot-Analysen ergaben, dass der überexprimierte NCDase-WT zwei unterschiedlich glykosylierte Isoformen mit einem Molekulargewicht von 120 und 130 kDa exprimiert, welche stetig durch einen aktiven Prozess sezerniert werden. Im Gegensatz dazu war in den Mutanten ausschließlich die 130 kDa-Form im Zellkulturüberstand und die 120 kDa-Form im Lysat zu finden. Im Gegensatz zum WT lokalisierten die Mutanten lediglich an intrazellulären Membranen und nicht zusätzlich an der Plasmamembran. In Lysaten von Zellen die die Mutanten exprimierten, konnte eine verringerte relative Aktivität gemessen werden, die der sezernierten mutierten Formen hingegen war erhöht. Daher wurde vermutet, dass die 130 kDa-Form die reife Plasmamembran-gebundene und anschließend sezernierte, aktivere Isoform der NCDase darstellt. Die Inkubation von Mesangiumzellen mit Zellkulturüberständen, die den sezernierten NCDase-WT enthielten, führte zum Schutz vor durch Stress induzierter Apoptose. Somit kann eine auto- bzw. parakrine Funktion der sezernierten NCDase angenommen werden.
Dem dritten Teil der Arbeit lag die erstmalige Beschreibung der SK1-Expression in der gesunden humanen Niere zugrunde. Es konnte gezeigt werden, dass diese im Zytoplasma sowie an Membranen von Zellen des proximalen Tubulus sowie in geringerem Maße in Podozyten und Mesangiumzellen des Glomerulus exprimiert wird. Im Gegensatz dazu wurde die SK1 in Biopsien von Patienten mit Nierentumor im Nukleus gefunden. Die Untersuchung der SK1-Expression in 5 verschiedenen Nierentumorzelllinien im Vergleich zu Epithelzellen des proximalen Tubulus (Human Kidney 2 - HK2-Zellen) ergaben, dass sowohl die Protein- als auch die mRNA-Expression der SK1 in Föhn-Zellen stark erhöht, in ACHN3-Zellen hingegen signifikant niedriger war. Zudem konnte auch in den Föhn-Zellen eine nukleäre Expression der SK1 nachgewiesen werden. Die Behandlung von HK2-, ACHN3- und Föhn-Zellen mit dem Transforming Growth Factor-ß2 (TGF-ß2) resultierte in einer transkriptionellen Steigerung der SK1-Expression. Die Herunterregulierung der SK1 in diesen Zellen führte zu einem Arrest der Zellen in der S Phase, wohingegen die Überexpression der SK1 in den ACHN3-Zellen zu einem signifikanten Schutz vor Apoptose führte.
Zusammenfassend sind die Sphingolipid-metabolisierenden Enzyme NCDase und SK-1 ein interessanter therapeutischer Ansatzpunkt zur Behandlung von Krankheiten, die mit pathologischen Prozessen wie Entzündung, Apoptose und Proliferation einhergehen, wie es bei Glomerulonephritiden und bei Nierentumoren der Fall ist.
Identifizierung und Charakterisierung neuer Inhibitoren der C2-ähnlichen Domäne der 5-Lipoxygenase
(2011)
Die 5-Lipoxygenase (5-LO) katalysiert die ersten beiden Schritte der Leukotrien (LT)-Biosynthese (Samuelsson et al., 1987). Das Substrat Arachidonsäure (AA) wird im ersten Schritt zu einem Fettsäurehydroperoxid, der 5(S)-Hydroperoxy-6-trans-8,11,14-cis-Eikosatetraensäure (5-HpETE) oxidiert. Durch Dehydrierung entsteht im zweiten Reaktionsschritt das instabile Epoxid LTA4. Weiter wandeln zwei Synthasen das LTA4 zum einen in LTB4 oder zum anderen in die Cysteinyl-LTs C4, D4 und E4 um (Samuelsson et al., 1987). Die 5-LO wird in Zellen myeloiden Ursprungs exprimiert und kommt vor allem in reifen Leukozyten vor.
LTs spielen eine wichtige Rolle bei der angeborenen Immunantwort und vermitteln vor allem entzündliche und allergische Reaktionen (Funk 2001; Peters-Golden & Henderson, 2007). Asthma bronchiale, kardiovaskuläre Erkrankungen wie Atherosklerose, Osteoporose oder verschiedene Krebsarten werden im Zusammenhang mit der 5-LO untersucht (Werz & Steinhilber, 2006). Die Inhibition der LT-Biosynthese oder die Senkung der LT-Spiegel stellt eine Möglichkeit dar, den entzündungsfördernden Eigenschaften entgegenzuwirken. Inhibitoren der LT-Biosynthese lassen sich in indirekte und direkte 5-LO-Inhibitoren gliedern. Zu den indirekten 5-LO-Inhibitoren zählen FLAP-Antagonisten (Young, 1991; Evans et al., 2008) sowie CysLT1-Rezeptorantagonisten (Darzen, 1998). Von den vier Gruppen der direkten 5-LO-Inhibitoren (redoxaktive, Eisenligand-, nichtredox- sowie diverse Inhibitoren (Pergola & Werz, 2010)) ist bisher nur Zileuton (Carter et al., 1991), ein Eisenligand-Inhibitor, als Wirkstoff zur Behandlung von Asthma bronchiale in den USA zugelassen.
Das Ziel der vorliegenden Arbeit war es, die neuartige Klasse der Imidazo[1,2-a]pyridine hinsichtlich ihrer 5-LO-Inhibition, ihrer Löslichkeit sowie ihrer Effekte auf die Zellviabilität zu evaluieren und zu optimieren. Dabei stand das Verständnis der Rezeptor-Ligand-Wechselwirkung im Fokus. Ausgehend von Substanz A14, der potentesten Substanz eines virtuellen Screenings nach dualen COX/5-LO-Inhibitoren (Hofmann et al., 2008), wurden 78 Substanzen in ionophor-stimulierten intakten polymorphkernigen Leukozyten (PMNL) sowie im zellfreien System, dem Überstand nach 100.000 × g Zentrifugation (S100) von homogenisierten PMNL, bezüglich ihrer inhibitorischen Aktivität untersucht. Die Effekte auf die Zellviabilität nach Inkubation mit den Substanzen für 48 h auf die humane leukämische Monozytenvorläufer Zelllinie U937 wurden mit Hilfe eines WST-Assays, der die mitochondriale Aktivität misst, sowie eines LDH-Assays, zur Bestimmung der Freisetzung von LDH als Folge von Nekrose, evaluiert.
Innerhalb der Struktur-Aktivitäts-Beziehung (SAR) der 78 Derivate konnte kein eindeutiges Substitutionsmuster, das sowohl in intakten PMNL als auch in zellfreiem S100 zu den gleichen Schlüssen führt, festgestellt werden. Ausgehend von Substanz A14 konnte die inhibitorische Aktivität verbessert werden, wobei Substanzen mit nanomolaren IC50-Werten in beiden Assaysystemen resultierten. Die Substanzen lassen sich in drei strukturelle Teile gliedern: Einen oberen Teil am sekundären Amin, ein bizyklisches N-fusioniertes Imidazopyridin (Teil A) sowie einen Teil B am aromatischen Kern. Nur für den oberen Teil ließ sich ein allgemein-gültiges Substitutionsmuster feststellen. Am sekundären Amin führen in intakten PMNL größere Substituenten zu einer Verbesserung der inhibitorischen Aktivität, wobei dies bis zu einer Cyclohexylgruppe gilt und eine Adamantyl-Substitution eine Ausnahme bildet. Allgemein lässt sich feststellen, dass bei einer Cyclohexylgruppe am sekundären Amin und einer Methylgruppe an Position 6 in Teil A, die Substituenten in Teil B stark variieren können, ohne an inhibitorischer Aktivität zu verlieren. Werden innerhalb des oberen Teils oder in Teil A die Substituenten polarer, sind in Teil B weniger Variationen möglich. Es werden insbesondere lipophile Reste toleriert. Beim Versuch, die Löslichkeit zu verbessern, zeigte sich, dass ein Gleichgewicht zwischen polaren und unpolaren Substituenten vorliegen muss. Auch die Einflüsse der Substituenten auf die Zellviabilität konnten nicht einem allgemein-gültigen Muster unterworfen werden. Mit Substanz 15 konnte ein Derivat identifiziert werden, das verglichen mit der Ausgangssubstanz A14 eine verbesserte inhibitorische Aktivität aufweist (IC50-Werte von 0,16 µM (PMNL) und 0,1 µM (S100)), löslicher ist (clogP-Wert von 4,6) und keine Nekrose auslöst. Weiter zeigten auch die Substanzen 31 und 50 eine Verbesserung der inhibitorischen Aktivität (IC50-Werte von 0,26 µM bzw. 0,58 µM (PMNL) und 0,8 µM bzw. 0,16 µM (S100)) ohne Nekrose auszulösen, wobei Substanz 50 zusätzlich eine verringerte Lipophilie (clogP-Wert von 4,2) aufweist. Substanz 76 ist mit einem IC50-Wert von 6 nM die im zellfreien System aktivste Substanz unter den 78 getesteten Derivaten.
Ein vielversprechender Vertreter dieser neuartigen Klasse der Imidazo[1,2-a]pyridine, Substanz 15 (EP6), wurde in verschiedenen Assaysystemen charakterisiert. EP6 ist ein hochwirksamer Inhibitor der 5-LO mit einem IC50-Wert von 0,16 µM in intakten PMNL und weist im zellfreien S100 von PMNL einen IC50-Wert von 0,1 µM, am partiell gereinigten Enzym einen IC50-Wert von 0,05 µM auf. Die vergleichbare inhibitorische Aktivität in intakten Zellen sowie im zellfreien System lässt auf eine direkte Inhibition der 5-LO schließen. Die Zugabe der allosterischen Faktoren ATP oder Calcium hat keinen Einfluss auf die Potenz von EP6. Auch ist die Inhibition nicht vom Redoxzustand der Zelle abhängig, wie im Falle bekannter nichtredox-Inhibitoren (Werz et al., 1998). Die Zugabe von steigenden Mengen an exogenem Substrat AA zu S100 von PMNL führt zu keiner Beeinträchtigung der Potenz von EP6, was im Vergleich zu den nichtredox-Inhibitoren einen Vorteil bei entzündlichen Prozessen mit erhöhten Lipidhydroperoxid-Spiegeln darstellt. Bei ionophor-stimulierten PMNL ohne die Zugabe von exogenem Substrat resultiert ein sechsfach höherer IC50-Wert von 1,2 µM, der auf eine allosterische Inhibition durch EP6 hinweist, bei der Substrat in ausreichenden Mengen vorliegen muss, damit EP6 mit dem 5-LO-AA-Komplex interagieren kann. Darüber hinaus inhibiert EP6 die LT-Bildung unabhängig von der Art der 5-LO-Stimulation bei einer Zugabe von 20 µM exogener AA. Der physiologische Stimulus in PMNL über N-Formylmethionyl-Leucyl-Phenylalanin (fMLP) führt zu einem höheren IC50-Wert von 0,76 µM mit Zugabe von 20 µM AA und bestätigt die Ergebnisse von ionophor-stimulierten PMNL ohne Zugabe von exogenem Substrat. Für EP6 konnte weiterhin eine allosterische Bindestelle an der C2-ähnlichen Domäne der 5-LO postuliert werden. Die Zugabe von Phosphatidylcholin führte zu einer verminderten inhibitorischen Aktivität. Durch Experimente mit einer Mutante der 5-LO, bei der die Tryptophane, welche die Membranbindung vermitteln, ausgetauscht sind (3W-Mutante), konnte die Interaktion dieser Aminosäuren mit EP6 gezeigt werden. Über einen Kompetitionsassay mit der C2-ähnlichen Domäne, Mutations- und Docking-Studien, wurden die Aminosäuren Y81, Y100 und Y383 des Interfaces der beiden Domänen der 5-LO als essentiell für die Bindung identifiziert. Somit zählt EP6 als Vertreter der Klasse der Imidazo[1,2-a]pyridine neben Hyperforin und AKBA zu den einzigen mit der C2-ähnlichen Domäne interagierenden 5-LO-Inhibitoren.
EP6 ist ein selektiver Inhibitor der 5-LO, der die 15-LO1, 15-LO2 und 12-LO nicht inhibiert. Weiterhin werden drei weitere Enzyme der AA-Kaskade, die Cyclooxygenase-1 und -2 sowie die mikrosomale Prostaglandin E2 Synthase-1 nicht durch EP6 beeinflusst. Neben der humanen 5-LO wird auch die murine 5-LO, in intakten RAW 264.7 Zellen und deren S100 getestet, mit niedrig mikromolarem bzw. nanomolarem IC50-Wert inhibiert, was die erste Voraussetzung für potentielle in vivo Studien darstellt.
Die Inhibition der 5-LO-Produktbildung in humanem Vollblut konnte jedoch bis zu einer Konzentration von 30 µM EP6 nicht gehemmt werden. EP6 ist lipophil (clogP-Wert von 4,6) und weist eine hohe Plasmaproteinbindung (Bindung an humanes Serumalbumin von 97,5 ± 0,7% bei 10 µg/ml EP6) auf, was die Unwirksamkeit in humanem Vollblut erklären könnte.
Abschließend wurden die Effekte von EP6 auf die Zellviabilität untersucht. Die Experimente wurden zunächst in U937 bei einer Inkubationszeit von 48 h mit einer maximalen Konzentration von 30 µM EP6 durchgeführt. EP6 führt zu keinen unmittelbaren zytotoxischen Effekten innerhalb der Inkubationszeit der in dieser Arbeit durchgeführten Aktivitätsassays (gezeigt in PMNL). Weiter wurde jedoch gezeigt, dass die mitochondriale Aktivität nach Inkubation für 48 h mit einem EC50-Wert von 14 µM beeinträchtigt wird (WST-Assay). Dieser Effekt ist jedoch nicht auf Nekrose zurückzuführen, da die gemessene Konzentration an freigesetztem LDH gering bleibt. Über ein Langzeitexperiment wurde die Abnahme der Lebendzellzahl nach Inkubation mit 30 µM EP6 nach 24 h festgestellt. Über Detektion von PARP-Spaltung, einem Marker für späte Apoptose, stellte sich heraus, dass EP6 in U937 Apoptose induziert. Zusätzlich zu den Untersuchungen der leukämischen Zelllinie wurden humane nicht-tumor Zellen (RPE) im Langzeitexperiment sowie im BrdU-Assay untersucht. EP6 beeinträchtigt die Lebendzellzahl der nicht-tumor Zelllinie RPE nicht und führt nur zu geringen antiproliferativen Effekten.
Eine weltweite Veränderung der Lebensweise hat eine Zunahme der Anzahl adipöser Menschen und damit ein verstärktes Auftreten von Typ 2 Diabetes mellitus zur Folge. Eine häufig auftretende Komplikation dieser Erkrankung ist das diabetische Fußulkus, dessen molekularen und zellbiologischen Grundlagen weitestgehend unbekannt sind. Für einen normalen Wundheilungsverlauf ist ein Zusammenspiel vieler Wachstumsfaktoren und Zytokine essentiell. Auch die Insulinsensitivität der Haut scheint von großer Bedeutung zu sein. Die Funktionen von Insulin im Wundheilungsprozess und in der Haut sind weitestgehend unerforscht. Um ein besseres Verständnis für die Bedeutung von Insulin in der Wundheilung zu erhalten, bestand das Ziel dieser Arbeit in der Analyse eines Insulin-regulierten Enzyms in der Haut, der HMG-CoA-Reduktase, während des Heilungsprozesses normaler sowie diabetisch chronischer Wunden. Die HMG-CoA-Reduktase katalysiert den geschwindigkeitsbestimmenden Schritt im Mevalonat-Stoffwechselweg und ist somit indirekt an vielen zellulären Ereignissen beteiligt. Die Verletzung von murinem Hautgewebe führte zu einem Anstieg der HMG-CoA-Reduktase-mRNA-Expression an Tag 3 und an Tag 13 nach Verletzung. Die Lokalisation der HMG-CoA-Reduktase im Wundgewebe zeigte, dass insbesondere die am Wundrand gelegenen Keratinozyten durch eine besonders starke mRNA-Expression des Enzyms charakterisiert waren. Im Gegensatz dazu konnte im diabetischen, chronischen Wundgewebe keine Regulation der mRNA-Expression der HMG-CoA-Reduktase detektiert werden. Wundheilungsrelevante Faktoren, wie Insulin und EGF, induzierten die mRNA-Expression der HMG-CoA-Reduktase in HaCaT-Keratinozyten (in vitro). Für die Insulin-vermittelte mRNA-Induktion konnte gezeigt werden, dass der Transkriptionsfaktor SREBP2 für die Transkription des Gens essentiell war. Neben einer erhöhten Transkription der HMG-CoA-Reduktase wurde ebenfalls eine gesteigerte Enzymaktivität nach Insulin- oder EGF-Stimulation detektiert. Die Induktion der Insulin-vermittelten HMG-CoA-Reduktase-Aktivität stand in einem funktionellen Zusammenhang zur Biosynthese des angiogenen Faktors VEGF. Der Einfluss der HMG-CoA-Reduktase auf die VEGF-Biosynthese war posttranskriptionell über die Phosphorylierung des eIF4E-BP1 vermittelt. Auch im tierexperimentellen Modell (in vivo) konnte durch eine Statin-Behandlung bei Mäusen gezeigt werden, dass die Enzymaktivität der HMG-CoA-Reduktase in Keratinozyten für eine normale VEGF-Expression essentiell war. Die VEGF-Synthese wurde von der Aktivität der HMG-CoA-Reduktase in vivo, wie in vitro nach Insulin-Stimulation, posttranskriptionell beeinflusst. Die Analyse weiterer wundheilungsrelevanter Vorgänge ergab, dass eine Inhibierung der HMG-CoA-Reduktase in vivo wie in vitro eine Verringerung der Keratinozytenproliferation zur Folge hatte. Die Keratinozytenproliferation ist ein wichtiger Vorgang bei der Reepithelisierung einer Wunde. Ist das Wundareal durch Keratinozyten geschlossen, beginnt die Differenzierung der Zellen. Die Ergebnisse dieser Arbeit konnten zeigen, dass der Differenzierungsprozess von Keratinozyten in vitro mit einer Induktion der HMG-CoA Redukase Aktivität assoziiert war. Eine Hemmung der Enzymaktivität hatte eine Inhibierung der mRNA-Expression von Keratinozyten-Differenzierungsmarkern, wie Involucrin, Filaggrin und Keratin 1 zur Folge. Zusammenfassend weisen die Ergebnisse dieser Arbeit darauf hin, dass die HMG-CoA-Reduktase wichtige Prozesse, wie Wundangiogenese und Keratinozytenproliferation, im kutanen Wundheilungsverlauf beeinflusst.
Die 5-Lipoxygenase (5-LO) ist das Schlüsselenzym in der Biosynthese proinflammatorischer Leukotriene, die maßgeblich an der Entstehung allergischer und entzündlicher Erkrankungen wie Arthritis, Asthma und kardiovaskulären Erkrankungen beteiligt sind (23). Humane 5-LO besteht aus 673 Aminosäuren und besitzt ein Molekulargewicht von 77,8 kDa (25). Das Protein besteht aus einer größeren katalytischen Domäne, die ein zentrales Eisen(II)-Atom enthält, dass für die zweistufige LTA4-Bildung aus Arachidonsäure benötigt wird, und einer kleineren C2-ähnlichen Domäne, die Bereiche für die Membran- sowie Ca2+-Bindung enthält. Durch Stimulation von intakten Zellen kommt es zu einer Translokation der 5-LO an die Kernmembran. Die Wechselwirkung mit dem membranständigen FLAP fördert die 5-LO-Leukotrienbildung. Die vorliegende Arbeit beschäftigte sich mit niedermolekularen Modifikationen der 5-LO durch U-73122 und Glutathion sowie mit der Charakterisierung von 5-LO-Inhibitoren. U-73122 ist ein Inhibitor, der in vitro und in vivo mit einem IC50-Wert von 30 nM bzw. 2,4 µM die 5-LO-Aktivität hemmt (2). U-73122 verfügt über eine thiol-reaktive Maleinimid-Gruppe, wodurch die Substanz kovalent an einige 5-LO-Cysteine (Cys-99, -159 und weitere) binden kann. Entsprechende U-73122-5-LO-Peptide konnten nach Trypsin-Verdau der 5-LO mit MALDI-MS-Messungen nachgewiesen werden. Für diesen Zweck musste eine effiziente Aufreinigung für native 5-LO (Reinheit > 95%) entwickelt werden. Um die Veränderung der 5-LO-Aktivität nach U-73122-Zugabe zu untersuchen, wurden Cystein/Serin-5-LO-Mutanten hergestellt. Es konnte festgestellt werden, dass die Mutante C416S-5-LO nicht mehr effektiv durch U-73122 gehemmt werden konnte. Daher ist anzunehmen, dass U-73122 an Cystein-416 der 5-LO bindet und die 5-LO-Produktbildung hemmt. Auf der 5-LO-Oberfläche kann ein Bereich lokalisiert werden, der einen Zugang für das Substrat zum aktiven Zentrum der 5-LO bilden könnte (238,239). Dieser Bereich liegt in unmittelbarer Nähe zu Cystein-416. Daher besteht die Möglichkeit, dass U-73122, nachdem es an Cystein-416 gebunden hat, diesen Bereich hemmend beeinflussen kann. Es konnte nachgewiesen werden, dass Glutathion an mehrere Cysteine der 5-LO (Cystein-99, -264 und -449) kovalent binden kann. Um Veränderungen der 5-LO-Aktivität durch in vivo Glutathionylierungen zu zeigen, wurden HeLa-Zellen mit 5-LO, Cystein-/Serin-5-LO-Mutanten sowie FLAP transfiziert und mit Diamid inkubiert. Es konnte festgestellt werden, dass die native sowie FLAP-gesteigerte 5-LO-Produktbildung durch Diamid gehemmt wird. Dies konnte ebenfalls für die Mutante 3W-5-LO beobachtet werden. Zusätzlich wurden verschiedene Cystein-/Serin-5-LO-Punktmutanten sowie eine 4fach Mutante (C159S/C300S/C416S/C418S-5-LO = 2D-5-LO) untersucht. Das Verhalten dieser Mutanten konnte in drei Gruppen eingeteilt werden. Gruppe A (C159S-, C300S- und C418S-5-LO) wurde durch Diamid nicht beeinflusst. Gruppe B (C416S- und 2D-5-LO) zeigte eine sehr starke Stimulation der 5-LO±FLAP-Leukotrienbildung nach Zugabe von Diamid. Bei Gruppe C (C99S-, C264S- und C449S-5-LO) konnte eine FLAP-gesteigerte 5-HETE-Bildung beobachtet werden. Durch Diamid kommt es zu Glutathionylierungen von zellulären Proteinen, da reduziertes Glutathion (GSH) zu reaktiveren oxidierten Glutathion (GSSG) umgesetzt wird. An der 5-LO-Oberfläche können in Folge an verschiedenen Cysteinen Glutathione binden. Durch die Glutathion-Bindung wird eine stark polare Struktur auf der 5-LO-Oberfläche eingebracht. Dadurch kommt es zu einer verminderten Membranbindung und Produktbildung der nativen 5-LO. Die 5-LO-Oberfläche der 2D-5-LO-Mutante kann an verschiedenen Positionen keine Glutathione mehr binden, es kommt es zu einer stärkeren Wechselwirkung mit Membranbestandteilen und zu einer erhöhten 5-LO-Leukotrienbildung. Für Celecoxib konnte gezeigt werden, dass neben der COX2-Hemmung auch die 5-LO-Aktivität mit einem IC50-Wert von 3-10 µM gehemmt werden kann (268). Im Rahmen dieser Arbeit wurden HeLa-Zellen mit 5-LO±FLAP transfiziert, um den Einfluss von Celecoxib auf FLAP zu untersuchen. Celecoxib führt zu einer direkten Hemmung der 5-LO. ML3000 (Licofelon) wurde als dualer COX/5-LO-Inhibitor entwickelt und hemmt die 5-LO-Aktivität in intakten Zellen, aber nicht im Homogenat. Daher wurden Versuche mit 5-LO±FLAP-tranfizierten HeLa-Zellen durchgeführt, um den Einfluss von ML3000 auf die FLAP-gesteigerte 5-LO-Leukotrienbildung zu zeigen. Aus diesen und weiteren Ergebnissen unserer Arbeitsgruppe konnte gefolgert werden, dass ML3000 ein FLAP-Inhibitor ist (277). Garsubellin A ist strukturverwandt zu Hyperforin, einem dualen COX/5-LO-Inhibitor (204). Garsubellin A hemmt die 5-LO-Aktivität im Homogenat von PMNL und am gereinigten Enzym mit einer IC50 von 10-30 µM. Verbindungen, die den Bicyclo[3.3.1]nonan-Grundkörper des Garsubellin A und Hyperforin enthalten, wurden auf ihr inhibitorisches Potential getestet. Es konnte gezeigt werden, dass der Bicyclo[3.3.1]nonan-Grundkörper alleine nicht für eine 5-LO-Hemmung ausreicht, sondern eine freie Carbonsäure sowie eine bis zwei Prenylierungen vorliegen müssen, um eine 5-LO-Hemmung zu erzielen. Sind diese Voraussetzungen vorhanden, wird die 5-LO-Aktivität in intakten PMNL mit einer IC50 von 10 µM und an gereinigter 5-LO mit 0,3-1 µM gehemmt.
5-Lipoxygenase (5-LO) katalysiert die ersten beiden Schritte in der Biosynthese der Leukotriene, die an Reaktionen des Immunsystems beteiligt sind. Die 5-LO-Aktivität wird durch verschiedene Faktoren wie Ca2+, Phospholipide und den zellulären Redoxstatus beeinflusst. Die 5-LO besteht aus einer katalytischen und einer N-terminalen, C2-ähnlichen Domäne. Durch Oxidation des Eisens im aktiven Zentrum zur Fe3+-Form wird das Enzym aktiv. Die C2-ähnliche Domäne bindet Ca2+ und PC und ist für die Membranbindung der 5-LO verantwortlich. In der vorliegenden Arbeit wurde die Aktivierung der 5-LO durch das Diacylglycerid OAG untersucht. Bekannt war die Stimulation der Agonist-induzierten 5-LO-Aktivität in intakten Zellen durch OAG, die nicht auf den bekannten Aktivierungswegen wie Translokation, Phosphorylierung oder Ca2+-Mobilisierung beruht. Hier kann nun die direkte Aktivierung des 5-LO-Enzyms durch OAG in vitro gezeigt werden. Untersucht man den Einfluss von OAG auf die 5-LO-Aktivität in Anwesenheit von 1 mM Ca2+, lässt sich weder an Homogenat, S100 noch am partiell aufgereinigten Enzym aus PMNL ein Effekt beobachten. Entfernt man dagegen Ca2+ aus den Versuchsansätzen, induziert OAG (30 µM) bei Substratkonzentrationen unter 20 µM AA die 5-LO-Aktivität im S100 und am partiell aufgereinigten Enzym. Auch andere Glyceride wie DOG, OG und EAG aktivieren die 5-LO, nicht jedoch SAG. OAG stabilisiert die 5-LO-Aktivität vor der Hemmung durch die Glutathionperoxidase (GPx), dies vermögen ebenfalls andere Glyceride. Damit ähnelt der Einfluss von OAG auf die 5-LO dem bereits bekannten Effekt von Ca2+: es ist in der Lage, vor allem bei niedrigen Substratkonzentrationen die 5-LO-Produktmenge direkt zu erhöhen und kann die 5-LO-Aktivität gegen den inhibitorischen Effekt der Glutathionperoxidase (GPx) stabilisieren. Ähnlich wie Ca2+ scheint OAG die Affinität der 5-LO für das Substrat AA zu erhöhen und das Bedürfnis für aktivierende Hydroperoxide zu erniedrigen. Durch Untersuchungen im Rahmen dieser Arbeit kann eine Beteiligung der Ca2+-Bindungsstelle an der Interaktion zwischen 5-LO und OAG ausgeschlossen werden, da OAG auch an der loop2 mut-5LO die Aktivität zu steigern vermag. Der Anstieg der 5-LO-Produktbildung durch OAG in S100 und am partiell aufgereinigten 5-LO-Enzym lässt sich durch die Zugabe von PC und anderen Phospholipiden unterbinden. Damit erklärt sich gleichzeitig, weshalb OAG am Homogenat aus PMNL keine Effekte zeigt, da hier noch Zellmembran-Bestandteile enthalten sind. Der OAG-Effekt wird wohl über die drei Tryptophan-Reste Trp-13,-75 und -102 der Phospholipid-Bindungsstelle auf der C2-ähnlichen Domäne der 5-LO vermittelt. Dies zeigen auch Untersuchungen an der 3W mut-5LO, bei der die drei Tryptophan-Reste zu Alanin-Resten mutiert sind. Die Aktivität dieser Mutante lässt sich durch OAG unter den bereits beschriebenen Versuchsbedingungen nicht steigern. Ein weiterer Hinweis auf die Phospholipid-Bindungsstelle ist die Interaktion zwischen OAG und dem 5-LO-Inhibitor Hyperforin. Hyperforin selbst hemmt die 5-LO über diese Bindungsstelle, durch OAG wird der IC50-Wert von Hyperforin deutlich erhöht. Im Rahmen dieser Arbeit wurde ein Lipid Protein Overlay Assay für 5-LO ausgearbeitet, ein direkter Nachweis der Bindung zwischen OAG und 5-LO ist aber bisher nicht gelungen. OAG steigert nicht die Aktivität des 5-LO-Enzyms aus serumfrei kultivierten MM6-Zellen, BL41-E95-A Zellen und transfizierten HeLa-Zellen, auch die Produktmenge der Sojabohnen-LO kann nicht durch OAG beeinflusst werden. Untersucht man die Interaktion von OAG mit aufgereinigter regulatorischer Domäne (MBP-Fusionsprotein, MBP-5LO1-128), so zeigt sich eine weitere Steigerung der durch OAG-induzierten 5-LO-Aktivität, obwohl MBP-5LO1-128 bei höheren Konzentrationen eine Hemmung der 5-LO-Aktivität durch Reduktion der gebildeten 5-HPETE verursacht. Diese Ergebnisse lassen sich damit erklären, dass OAG das Bedürfnis der 5-LO für Hydroperoxide senkt und damit geringere Mengen an 5-HPETE zur Aktivierung der 5-LO ausreichen. Betrachtet man das 5-HETE/5-HPETE-Verhältnis, führt die Zugabe OAG in Abwesenheit von Ca2+ und bei 10 µg MBP-5LO1-128 zu einer geringen Abnahme des 5-HETE-Anteils. Im zweiten Teil der Arbeit wurden neue 5-LO-Inhibitoren identifiziert. Aus der Reihe der Pirinixinsäure-Derivate konnte durch entsprechende Modifikationen der potente 5-LO-Inhibitor LP 119 mit einem IC50-Wert von 0,6 µM in intakten PMNL-Zellen identifiziert werden. Durch systematisches Durchsuchen virtueller Datenbanken konnten mindestens zwei Substanzen gefunden werden, die sowohl an intakten Zellen wie auch am partiell aufgereinigten Enzym die 5-LO-Aktivität hemmen, weitere Untersuchungen ergaben, dass es sich wohl zumindest bei einer Strukturklasse um einen direkten 5-LO-Inhibitor handelt.
Myxobacteria are on order of Gram-negative, soil dwelling bacteria that feature an impressive number of properties: they can glide on solid surfaces by using two different motility motors, subsist by preying on other microorganisms, are often producers of multiple natural products, and upon adverse environmental conditions, they are able to form multicellular structures called “fruiting bodies”. The process, in which these macroscopically visible structures arise from independent single cells, has been the predominant subject of myxobacterial research for many decades. More precisely, researchers have strived for the discovery of genes, proteins and small molecules that act as signals, receivers or modulators of this complex process. In this regard, the species Myxococcus xanthus has evolved into the model organism due to its relatively simple and reliable handling in a laboratory environment. The research underlying this thesis focused on the identification and biosynthesis of lipids that may act as intercellular signaling molecules during the course of fruiting body formation of the myxobacterium Myxococcus xanthus as part of the “E-signal” system. In general, lipids containing branched-chain fatty acids with an uneven number of carbon atoms were found to be important players in this particular process. Nevertheless, their exact roles remain largely unknown as of this day. The first publication that is part of this thesis deals with an aspect that even strengthened the importance of role of iso-branched compounds in myxobacteria: myxobacterial metabolism is able to transform precursors of iso-lipids to isoprenoids. It addresses the question whether isoprenoids in general are important for fruiting body formation. Phenotypic analysis of mutants impaired in the biosynthesis of the central isoprenoid precursor 3-hydroxymethylglutaryl-Coenzyme A (3-HMG-CoA) from acetate and/or branched chain keto acids and their genetic and metabolic complementation clearly showed that isoprenoids are essential for fruiting body formation and confirmed that leucine derived isovalerate is an important source for isoprenoid precursors in myxobacteria. The second, and by far and away most tedious and sophisticated study, addressed the question as to how myxobacteria form fatty acid derived iso-branched ether lipids and to what extent they are important for fruiting body formation and sporulation. In a previous study, those unusual lipids were identified as specific biomarkers for myxobacterial development. No biochemical pathways to ether lipids specific for prokaryotes were known by then. In this study, a putative candidate gene that may be in involved in ether lipid biosynthesis was investigated. A combination of gene disruption and complementation experiments, phenotypic analysis and monitoring of ether lipid formation by means of GC-MS demonstrated its involvement in myxobacterial ether lipid biosynthesis and the importance of these lipids for the developmental process. Heterologous expression and biochemical testing of this gene together with in-silico sequence analysis and docking experiments confirmed the functions of its predicted domains. The discussion section provides an additional suggestion on how the ether bond formation is performed. Furthermore and most importantly, iso-branched ether lipids were found to be essential for sporulation but not for fruiting body formation. In summary, one or several molecules derived from an iso-branched alkylglycerol seem to play a role during sporulation in M. xanthus and a multidomain enzyme unique for myxobacteria is involved in their biosynthesis. The last manuscript addresses the complexity of lipid metabolism in myxobacteria. Prior to this work, there was limited knowledge about the exact composition of the myxobacterial lipidome and no method was available to monitor putative changes in the myxobacterial lipidome down to the single molecular species for studying lipid biosynthesis or regulation. An ultra-performance liquid chromatography coupled with mass spectrometry based method with electrospray ionization (UPLC-ESI-MS) utilizing standard equipment and a water/acetonitrile/isopropanol based eluent system proved to be geared for the construction of lipid profiles for wild type and mutant cells of M. xanthus and to show their differences. Fragmentation spectra based structure elucidation of lipid molecular species resulted in the identification of 99 molecular species comprising glycerophosphoethanolamines, glycerophosphoglycerols, glycerolipids, ceramides and ceramide phosphoinositols. The latter have never been described for any prokaryotes before. Three dimensional plots were created from the relative intensity differences of the single molecular ion species between the different samples to provide an efficient and versatile visualization of the data and enable the researcher to quickly detect differences.
In this thesis I have investigated the regulation of eicosanoid synthesizing-enzymes by cannabinoid receptor agonists. Rat renal mesangial cells were used as a model system. I could show that all three (CB1, CB2, and GPR55) cannabinoid receptors are expressed on the mRNA level in rat renal mesangial cells – but with differing expression profiles. The CB1 and GPR55 receptors are expressed in comparable amounts, whereas the CB2 receptor is considerably less expressed than the CB1 and the GPR55 receptors. Furthermore I could show that stimulation of renal mesangial cells with CB1 receptor agonists, such as R(+)MA or ACEA, increased IL-1β-induced cPLA2, sPLA2-IIa, and COX2 protein and mRNA expression which subsequently led to an enhanced IL-1β-induced PGE2 formation. Additionally, the IL-1β- induced sPLA2-IIa promoter activity was also increased by CB1 receptor stimulation. Besides the modulated expression of the eicosanoid synthesizing enzymes, I could show that CB1 agonists also led to an increase of IL-1β-induced iNOS expression and subsequent NO formation. In contrast, stimulation with CB2 selective agonists led to a decrease in IL-1β- induced sPLA2-IIa protein expression and PGE2 formation. Accordingly, the IL-1β-induced sPLA2-IIa promoter activity was also reduced by CB2 receptor agonists. IL-1β-induced iNOS expression and subsequent NO formation were not influenced by CB2 recptor activation. Matching the results I obtained with CB1 receptor agonists on IL-1β-induced PGE2 formation, I could observe an increased cPLA2 protein and mRNA expression with a subsequent increase in IL-1β-induced PGE2 formation by GPR55 stimulation. Stimulation with THC, an unselective CB agonist, increased the IL-1β-induced sPLA2-IIa protein expression and subsequently led to an enhanced IL-1β-induced PGE2 formation. Subjecting the cells to higher THC concentrations surprisingly led to a reduction of the IL-1b-induced sPLA2-IIa protein expression and PGE2 formation. A possible explanation may be the differential expression of the three CB receptors. At low concentrations THC may predominantly activate CB1 and GPR55 and with increasing concentration CB2 receptors may also be activated, slightly reversing the enhancing effect. Moreover, I could show that the CB1 receptor stimulation mediated phosphorylation and hence the activation of ERK1/2 MAPK. Additionally to ERK1/2, there was also a phosphorylation and activation of NFkB observed by CB1 receptor stimulation. In my thesis I could show for the first time that PPARα was activated by IL-1β in rMC. The IL-1β-induced PPARα promoter activity was completely inhibited by addition of the CB2 receptor agonist, JWH015. These findings were confirmed by inhibition of the IL-1β-induced PGE2 formation by a PPARα antagonist (MK-886). In summary, I could show that activation of CB1 receptors in our system led to a worsening of an inflammatory condition, whereas activation of the CB2 receptors led to the complete opposite; namely a reduction of the inflammatory response by reducing the sPLA2-IIa expression and PGE2 formation. GPR55 activation did not display any alteration of inflammatory conditions, since the classical inflammatory pathway was not influenced.
During the last years, chemopreventive activity of NSAIDs against a great variety of tumors was highly investigated. COX-2 seemingly plays a major part in tumorigensis and tumor development, underlined by several studies in animals and humans. At first, NSAIDs were thought to accomplish chemoprevention by inhibition of COX-2 as their so far known mode of action comprises unselective inhbition of COX-enzymes. However, further studies revealed COX-independent mechanisms. Sulindac is known as a well established drug used to treat inflammation and pain exerting the most prominent chemopreventive action, mainly in colorectal cancer or FAP and can be classified into the group of NSAIDs inhibting both COX-isoformes. As interference with the AA metabolism is evident, it was speculated whether Ssi has targets other than COX-enzymes providing evidence and explanation of its beneficial side effect profile and its ability to reduce tumor growth. 5-LO is another master enzyme in the AA cascade which produces inflammatory lipid mediators (LTs) upon stimulation in inflamed tissues. The present work should answer the question if Ssi targets the 5-LO pathway and should examine the molecular mechanisms behind Ssi-mediated 5-LO inhibiton. As COX-2 is upregulated during carcinogenesis and is inhibited by Ssi, further investigations should show regulatory effects of Ssi on 5-LO gene expression in MM6-cells and whether Sp1 as a common transcriptional factor is involved in such a regulation. As the use of NO-NSAIDs seem to be a promising strategy concerning their chemopreventive and gastroprotective effects compared to the parent NSAIDs, a possible interaction with the 5-LO pathway as a second, potent target should additionally be elucidated. In the first section it was demonstrated that the pharmacologically active metabolite of sulindac, Ssi, targets 5-LO. Ssi inhibited 5-LO in ionophore A23187- and LPS/fMLP-stimulated human PMNL (IC50 ≈ 8 -10 μM). Importantly, Ssi efficiently suppressed 5-LO in human whole blood at clinically relevant plasma levels (IC50 = 18.7 μM). Ssi was 5-LO-selective as no inhibition of related lipoxygenases (12-LO, 15-LO) was observed. The sulindac prodrug and the other metabolite, sulindac sulfone, failed to inhibit 5-LO. Mechanistic analysis demonstrated that Ssi directly suppresses 5-LO with an IC50 of 20 μM. Together, these findings may provide a novel molecular basis to explain the COX-independent pharmacological effects of sulindac under therapy. In the second part of the work dealing with the analysis of Ssi’s inhibitory mechanism on 5-LO it was presented that Ssi shows a lack of potency in cellular systems where membrane constituents are existent. The addition of microsomal fractions of PMNLto crude 5-LO enzyme were able to recover enzyme activity to ~ 100 %. Selectively 5-LO activity stimulating lipids like PC, participating in 5-LO membrane interactions within the regulatory C2-like domain of 5-LO, counteracted the Ssimediated inhibition on 5-LO-wt in a concentration-dependent manner. Lastly, a protein mutant lacking three trp resudies essential for linking the enzyme to nuclear membranes and deploying catalytic activity was not influenced by Ssi and shows enzyme activity in a cell-free assay. Ssi displays the first 5-LO inhibitor on the market interacting with the C2-like domain of the enzyme and therfore can stand for a novel lead structure of 5-LO inhibitors. An influence on 5-LO gene expression by Ssi could be detected in differentiated MM6-cells, described in the results chapter 3 (4.3). Ssi downregulated the 5-LO mRNA level after 72 hrs of incubation in differentiated MM6-cells to ~ 20 % of output control at concentrations of 10 μM. Concomitantly, mRNA levels of Sp1 were suppressed. Reporter gene studies revealed Sp1 most probably as a regulating agent involved in the Ssi-mediated 5-LO mRNA downregulation as co-transfection of increasing amounts of Sp1 could abrogate the effect. A ChIP assay could identify Sp1 as a critical transcriptional factor as Sp1 binding to the 5-LO promoter decreased in presence of Ssi. Lastly, three NO-NSADIs (NO-sulindac, NOnaproxen, NO-aspirin) were tested for the ability of 5-LO product inhibition. In intact PMNL, all compounds showed effective inhibition of 5-LO activity and NO-sulindac was most potent with an IC50 value of ~ 3 μM. NO-ASA inhibited 5-LO with IC50 values of ~ 30 μM and showed a non-competitive mode of action in cell-based assays. On human recombinant 5-LO all compounds again showed inhibitory potency whereas NO-sulindac again suppressed LT biosynthesis with an IC50 vaue comparable to intact cellular systems. Unfortunately, all inhibitors showed a loss of potency when tested for inhibition of 5-LO product synthesis in human whole blood as higher concentrations up to 100 μM were needed to reach at least 55 % enzyme inhibition. However, this strategy of 5-LO inhibition seems promising and needs further experimental approaches to gain more insight into the mechanism of 5-LO inhibition by NONSAIDs.
Nukleäre Rezeptoren sind ligandenaktivierte Transkriptionsfaktoren, die das pharmazeutische Interesse als Zielstrukturen für antientzündliche Wirkstoffe und andere Indikationen erwecken. Entzündungen werden durch Noxen physikalischer, chemischer oder mikrobiologischer Art hervorgerufen. Dabei reagiert das geschädigte Gewebe mit zahlreichen Vorgängen, die vaskuläre und zelluläre Reaktionen mit Immunantworten verknüpfen und nach der Wiederherstellung des ursprünglichen Zustands streben. Bei andauernder Wirkung können Entzündungen jedoch in einen schädlichen Prozess umschlagen, sodass in solchen Fällen eine therapeutische Intervention Notwendigkeit erlangt. Ziel dieser Arbeit war es deshalb, neue Liganden nukleärer Rezeptoren als Kandidaten für antientzündliche Wirkstoffe zu identifizieren.
Leber X Rezeptoren (LXRs) sind Zielstrukturen für entzündliche und neurodegenerative Erkrankungen mit antiphlogistischem Potenzial. Zur Identifikation neuer LXR-Liganden wurde eine Datenbank mit zugelassenen Wirkstoffen mithilfe einer selbstorganisierenden Karte (SOM) auf Interaktion mit LXR gescreent. Die Retinoid X Rezeptor (RXR)-Agonisten Alitretinoin (37) und Bexaroten (38) konnten in der anschließenden in vitro Charakterisierung als potente duale LXRalpha/LXRbeta-Partialagonisten mit moderater Aktivierungseffizienz bestätigt werden. Während 37 und 38 synthetische LXR-Vollagonisten partiell antagonisierten, führten sie mit dem endogenen Partialagonisten 22(R)-Hydroxycholesterol (4) zur additiven Aktivierung von LXR. Die Charakterisierung von Alitretinoin (37) und Bexaroten (38) als duale LXR/RXR-Agonisten liefert nicht nur eine weitere Erklärung für in klinischen Studien beobachtete Nebenwirkungen, sondern könnte auch den Startpunkt zur Entwicklung neuer antientzündlicher LXR- und dualer LXR/RXR-Liganden bieten.
Der Peroxisomen Proliferator-aktivierte Rezeptor (PPAR) gamma ist ein nukleärer Rezeptor, der neben der Steigerung der Insulinsensitivität auch antientzündliche Effekte aufweist. Auf Grundlage seiner Y-förmigen und fettsäuremimetischen Struktur konnte das Urikosurikum Lesinurad (47) als PPARgamma-Partialagonist in vitro charakterisiert werden. Im Gegensatz zu PPARgamma-Vollagonisten wie Pioglitazon (31) oder Rosiglitazon (32) induzierte 47 nicht die Differenzierung muriner 3T3-L1 Zellen in reife Adipozyten, aber erhöhte in der humanen Leberzellkarzinomzelllinie HepG2 die Expression von Genen, welche die Insulinsensitivität und den Fettsäureabbau steigern könnten. Folglich erwies sich Lesinurad (47), das bei der Pharmakotherapie von Gicht Anwendung findet, als selektiver PPARgamma-Modulator (sPPARgammaM) ohne adipogene Nebenwirkungen. Insbesondere Patienten mit Komorbiditäten wie Diabetes mellitus Typ 2 oder anderen Erkrankungen des metabolischen Syndroms könnten von einer Behandlung mit 47 profitieren. Inwiefern PPARgamma an der Auflösung von Entzündungen bei Gicht beteiligt ist, bleibt in zukünftigen Studien zu klären.
Synthetische RXR-Agonisten haben ein vielversprechendes Potenzial zur Behandlung entzündlicher neurodegenerativer Erkrankungen, das jedoch von nachteiligen Eigenschaften dieser Rexinoide beeinträchtigt wird. Durch ein pharmakophorbasiertes Screening einer fokussierten Substanzbibliothek aus Fettsäuremimetika konnte ein fortschrittliches RXR-Ligandgerüst identifiziert werden. Eine geeignete Synthesestrategie wurde etabliert und die Leitstrukturen durch systematisches Studium der Struktur-Wirkungsbeziehung (SAR) optimiert. In vitro Experimente wie Reportergenassays und die Quantifizierung der Zielgenexpression bestätigten die RXR-partialagonistische Aktivität der dabei entwickelten nanomolaren Verbindung 89. Mit seiner hohen Selektivität, gesteigerten wässrigen Löslichkeit sowie reduzierter Lipophilie und Toxizität könnte 89 die Probleme bisheriger synthetischer RXR-Agonisten überwinden. Seine Präferenz von RXRgamma hinsichtlich der Aktivierungseffizienz könnte richtungsweisend für die Entwicklung subtypselektiver Liganden sein.
Die nichtalkoholische Steatohepatitis (NASH) ist eine Leberentzündung, die aus einer Steatose hervorgehen kann und deren multifaktorielle Natur eine hohe therapeutische Effizienz erfordert. Diese könnte durch duale Modulation der nukleären Rezeptoren Farnesoid X Rezeptor (FXR) und PPARdelta mit antientzündlichen Eigenschaften und unterschiedlichem Wirkprinzip erreicht werden. Zur Validierung dieses Ansatzes mit synergistischem Potenzial sollten duale PPARdelta/FXR-Agonisten ausgehend von einer in früheren Studien des Arbeitskreises identifizierten Leitstruktur mit moderater Potenz entwickelt werden. Dazu wurde ein fünfstufiges Verfahren zur Synthese von Derivaten der Leitstruktur erarbeitet und die Derivate hinsichtlich ihrer Aktivität auf den Zielstrukturen in vitro evaluiert. In systematischen SAR-Studien wurden dabei Strukturmotive charakterisiert, welche die Wirksamkeit und Maximalaktivierung auf PPARdelta und FXR steigerten. Darüber hinaus konnten Modifikationen identifiziert werden, welche eine Selektivität über PPARalpha und PPARgamma gewährten. Die Kombination dieser vorteilhaften Gruppen und Substituenten könnte neue Wirkstoffkandidaten zur Behandlung von NASH hervorbringen.
Insgesamt wurden in dieser Arbeit zahlreiche Wirkstoffe und Wirkstoffkandidaten erfolgreich als Liganden nukleärer Rezeptoren mit antientzündlichem Potenzial identifiziert. Alitretinoin (37) und Bexaroten (38) können als Leitstruktur zur Entwicklung neuer selektiver LXR- oder dualer LXR/RXR-Agonisten dienen. Die PPARgamma-partialagonistische Aktivität von Lesinurad (47) könnte einen Fortschritt in der Therapie von Gicht mit metabolischen Begleiterkrankungen bewirken. Zudem könnten im Zuge dieser Arbeit synthetisierte Serien von RXR- und dualen PPARdelta/FXR-Partialagonisten neue Therapieoptionen bei neurodegenerativen Erkrankungen oder NASH ermöglichen.
Extracts of Boswellia serrata, also known as Indian frankincense, have been used to treat inflammatory diseases in the Indian ayurvedic medicine or Chinese traditional medicine (TCM) for over 3000 years, but the molecular mechanisms of the anti-inflammatory effects are still not well understood. It is obvious that the boswellic acids, the major compounds in the extracts, are responsible for the efficacy. This work employed a protein fishing technique to identify putative targets of boswellic acids at different stages within the inflammatory cascade. For fishing experiments, boswellic acids were immobilized to sepharose and incubated with cell lysates. After washing and boiling, fished proteins were separated by SDS-PAGE and analysed by MALDI-TOF-MS. CatG, DNA-PK and the protein kinase Akt were identified by protein pulldowns with immobilised BAs and characterised as selective and important targets for BAs with an IC50 in the range of physiologically achievable plasma levels up to 5 microM. In addition, the influence on several signal transductions by BAs was tested. Calcium influx, arachidonic acid release, platelet aggregation and TNFalpha-release were assayed to reveal further pharmacological effects of BAs. Celecoxib is a well-known selective COX-2 inhibitor that is in clinical use. In this work, it is demonstrated that celecoxib is also a highly potent direct 5-LO inhibitor. Celecoxib is used in arthritis and its gastro-intestinal side effects are reduced compared to non-selective NSAIDs. In patients with a familiar disposition to polyp forming, celecoxib reduced polyps and the incidence of colon cancer. Because of lowered leukotriene levels in patients under celecoxib therapy it was plausible to test whether celecoxib interferes with 5-LO. Here it is shown that the activity of 5-LO is inhibited in PMNL and cell-free assays with IC50 of 8 microM in intact cells, 20 microM with supplemented arachidonic acid and 30 microM in cell-free systems. Thus, celecoxib is a dual inhibitor of COX-2 and 5-LO. Since 2006, celecoxib has been approved as an orphan drug for the treatment of familial adenomatous polyposis. Aside from this indication, it could be useful for treatment of asthma and other diseases where 5-LO is implicated.
Für die geplanten Untersuchungen wurde eine eigene Methode für die Kultur primärer humaner Bronchialepithelzellen etabliert. Die Bronchialepithelzellen wurden aus Lungenteilresektaten durch eine cytologische Bürstung gewonnen. Die verwendeten Kulturschalen wurden mit Kollagen beschichtet. Als serumfreie Kulturmedien wurden ein Expansionsmedium und ein Differenzierungsmedium verwendet. Dabei enthielt das Expansionsmedium proliferationsfördernde Supplemente, was zu einer deutlich gesteigerten Zellausbeute gegenüber der Verwendung handelsüblicher Medien führte. Im Differenzierungsmedium wurden Supplemente verwendet, die für die Differenzierung und Ziliogenese bronchialer Epithelzellen erforderlich sind. Die Kultur erfolgte an einer Luft-Medium-Grenzfläche, die für Bronchialepithelzellen eine physiologische Umgebung darstellt. Die Charakterisierung der Kulturen zeigte keine Verunreinigungen mit Fibroblasten, Muskelzellen oder Zellen mesenchymalen Ursprungs. Das charakteristische kopfsteinplasterartige Erscheinungsbild, sowie der immunhistochemische Nachweis von Cytokeratin 18 belegten den bronchoepithelialen Charakter der Kulturen. In der vorliegenden Arbeit wurde mit der RT-kompetitive Multiplex-PCR (RCMP) eine Technik entwickelt, mit deren Hilfe die Expression von Genen in niedriger Kopienzahl oder aber in Proben mit geringer RNA-Menge nachgewiesen werden kann. Geringe Ausgangsmengen an RNA wiesen vor allem die Primärkulturen von humanem Bronchialepithel, als auch frische Gewebebürstungen des Bronchial- und Nasenepithels auf. Die RCMP basiert auf einer kompetitiven PCR und kombiniert eine exogen interne und endogen interne Standardisierung. Damit wurde die mRNA-Expression von bis zu vier Genen in einem Ansatz analysiert. Die RCMP löst dabei mehrere Probleme herkömmlicher PCR-Verfahren: 1. mRNAs mit hoher oder niedriger Kopienzahl können in einem Ansatz koamplifiziert werden. 2. Die semiquantitative Quantifizierung ist unabhängig von den Syntheseeffizienzen von Target und Referenzgenen. 3. Die RCMP kontrolliert Schwankungen der initialen RNA-Menge. 4. Die Unabhängigkeit der RCMP von der Kenntnis der initialen RNA Menge erlaubt auch die Bestimmung von Probenmaterial in dem nur geringe mRNA-Mengen vorhanden sind. Damit eignet sich die RCMP besonders für Expressionsstudien Materialien wie Bioptaten, Nasal- oder Bronchialbürstungen, sowie den Kulturen primärer Bronchialepithelzellen. Mit Hilfe der RCMP wurden erstmals die mRNA der Osmolyttransporter BGT-1, SMIT und TAUT in Bronchialepithelzellen nachgewiesen. Nach Behandlung mit hyperosmotischen Medien wurde die mRNA-Expression dieser Transporter stark induziert. Bronchialepithelzellen perzeptieren osmotische Belastungen und versuchen, ihnen entgegenzuwirken. Hyperosmotische Belastungen können in Bronchialepithelien zu einer Inflammation ohne zugrunde liegende Infektion führen. Dabei wird zeit- und dosisabhängig sowohl die Sekretion als auch die Expression von IL-8 induziert. An dieser Induktion ist die p38 MAP-Kinase beteiligt. Reaktive Sauerstoffspezies (ROS) sind sowohl an der Induktion der IL-8 Sekretion und Expression beteiligt, als auch an der Aktivierung der p38 MAPKinase. Weiterhin zeigte sich, dass die Induktion der Sekretion von IL-6 und IL-8 abhängig von osmotisch bedingten Änderungen des Zellvolumens ist. Auch hier wird bereits die p38 MAP-Kinase durch das Zellvolumen reguliert. Die Ergebnisse legen ein mögliches Modell für die initialen Vorgänge in der CF-Lunge nahe. Die Veränderungen des Ionenhaushalts bei der cystischen Fibrose, sowie die eingeschränkte Zellvolumenkontrolle bei CF-Zelllinien, weisen darauf hin, dass ein defektes CFTR-Protein zu einer von neutrophilen Granulozyten dominierten Inflammation führen kann, ohne das die Lunge bereits mit Erregern besiedelt wurde.
Type 1 Diabetes (T1D) is an autoimmune disorder in which the own immune system attacks the insulin producing _-cells in the pancreas. Therapy of T1D with anti-CD3 antibodies (aCD3) leads to a blockade of the autoimmune process in animal models and patients resulting in reduced insulin need. Unfortunately, this effect is only temporal and the insulin need increases after a few years. In the first approach, I aimed at a blockade of the cellular re-entry into the islets of Langerhans after aCD3 treatment by neutralising the key chemokine CXCL10, which is important for the T cell migration. In the second approach I tried to block the transmigration of leukocytes trough the endothelial layer into inflamed tissue with an anti-JAM-C antibody (aJAM-C) after aCD3 treatment.
I used the well-established RIP-LCMV-GP mouse model of T1D. As target autoantigen in the _-cells, such mice express the glycoprotein (GP) of the lymphocytic choriomeningitis virus (LCMV) under control of the rat insulin promoter (RIP). These mice develop T1D within 10 to 14 days only after LCMV-infection. In the combination therapy (CT) I treated diabetic RIP-LCMV-GP mice with 3 5g aCD3 per mouse (3 injections in 3 days) followed by administration of a neutralising anti-CXCL10 (CT) or aJAM-C (CT-J) monoclonal antibody (8 injections of 100 5g per mouse over 2.5 weeks).
CT reverted T1D in RIP-LCMV-GP mice significantly (CT: 67 % reversion; control: 16 % reversion) and with superior efficacy to monotherapies with aCD3 (38 % reversion) and aCXCL10 (36 % reversion).
The CD8 T cells in the spleen have fully regenerated at day 31 after infection. However, the frequency of islet antigen (GP)-specific CD8 T-cells was significantly reduced by 73 % in the spleen after CT compared to isotype control treated mice. In contrast, in aCD3 treated mice the T cells were only reduced by 56 % of the frequency of isotype control treated mice. Flow cytometry and immunohistological examinations demonstrated a marked reduction of CD8 T cells in the pancreas of CT treated mice. Importantly, the number of GP-specific CD8 T cells was reduced dramatically by 78 % in the pancreas of CT treated mice, whereas aCD3 treatment led to a less pronounced reduction of the GP-specific CD8 T cell number (23 %). This reduction of infiltration was long lasting since in the pancreas of CT treated mice the _-cells produce insulin and there were almost no infiltrating T cells present at day 182 post-infection. aCD3 treated mice also showed many insulin producing cells after 182 days post-infection. Nevertheless, their pancreas displayed also some infiltrates around the islets.
In order to confirm my data I treated non-obese diabetic (NOD) mice with CT. In contrast to RIP-LCMV-GP mice, NOD mice develop spontaneous T1D within 15 to 30 weeks after birth, due to a mutation in the CTLA-4 gene. Strikingly CT cured 55 % of diabetic NOD mice, whereas only 30 % showed T1D reversion with aCD3 alone and none reverted after isotype control administration.
The impact of CT on GP-specific T cells (Teff) was stronger in the RIP LCMV-GP than in the NOD model. In contrast, regulatory T cells (Tregs) were induced predominantly in NOD mice rather than in RIP-LCMV-GP mice. However, looking at the Treg/Teff ratio and compared to isotype control antibody treated mice, I found a significant 4-fold increase in the pancreas of CT treated RIP LCMV-GP mice and a 17-fold increase in the PDLN of CT treated NOD mice. In addition, a tendency for an increase in Treg/Teff ratio was obtained in the spleen of CT-treated RIP LCMV-GP as well as NOD mice compared to aCD3 and isotype control antibody treated mice.
In the second combination therapy with neutralising aJAM-C, CT-J (51 % reversion) slightly improved the aCD3 therapy (41 % reversion). However, there was no significant difference between CT-J and aCD3 administration in terms of total CD8 and GP-specific CD8 T cells.
JAM-C also interacts with the integrin receptor macrophage-1 antigen (MAC-1), which is among others expressed by neutrophils. Accordingly, JAM-C could be involved in neutrophil transmigration to the pancreas. Indeed, I found a significant reduction for the infiltrating neutrophils into the pancreas of mice after CT-J compared to aCD3 monotherapy.
In summary the addition of aJAM-C to aCD3 monotherapy showed a small improvement, which was associated with a reduced neutrophil migration into the pancreas. However, JAM C seemed to play only a minor role in T1D development and some other adhesion molecules might be more important. Nevertheless, the combination of aCD3 and aCXCL10 resulted in a significant and long lasting reduction of aggressive T cells in the pancreas in two independent mouse models. Furthermore a protective immune balance was obtained. Since both antibodies are available for as well as tested in humans and the therapy is only for a short period of time after disease onset, this combination therapy might kick-start a novel therapy for T1D.
Pharmakophore sind ein zentrales Konzept der medizinischen Chemie. Im Liganden-basierten Design abstrahieren sie physikochemische Eigenschaften einer Menge aktiver Liganden und lassen dadurch Rückschlüsse auf die möglichen Interaktionen mit einem Target zu. Umgekehrt werden im Struktur-basierten Design Kristallstrukturen von Proteinen genutzt um zu modellieren, welche Eigenschaften die Bindetasche besitzt und welche Eigenschaften das entsprechende Gegenstück möglicher Liganden habe sollte. Diese Informationen können genutzt werden, um neue Substanzen zu identifizieren, welche die im Pharmakophore-Modell modellierten Interaktionen mit dem Target eingehen können. Durch die Abstraktion können hierbei sowohl Verbindungen mit neuen Grundgerüsten (scaffold) als auch mit veränderten funktionellen Gruppen gefunden werden. Im ersten Fall spricht man dabei von „scaffold hopping“, der letzte Fall ist eng verbunden mit dem Konzept des bioisosteren Ersatzes.
Im Rahmen dieser Arbeit wurden Pharmakophore genutzt, um in drei Studien neue Inhibitoren der Arachidonsäurekaskade zu finden. Die Arachidonsäurekaskade ist ein Stoffwechselweg in der aus Arachidonsäure eine Reihe von Lipidmediatoren synthetisiert wird. Viele dieser Mediatoren spielen eine entscheidende Rolle in Entzündungsprozessen und damit einhergehenden Krankheitsbildern. Es wurde außerdem eine neue Methode zur automatischen Generierung von Pharmakophor-Modellen aus einer Menge bekannter Liganden entwickelt.
In der ersten Studie wurde ein Struktur-basiertes Pharmakophor-Modell der Bindetasche der löslichen Epoxidhydrolase (sEH) erstellt, welches die möglichen, relevanten Interaktionsmöglichkeiten abbilden sollte. Dieses Pharmakophor-Modell wurde zum Screening einer Datenbank kommerziell erhältlicher Verbindungen genutzt und führte zu zwei Verbindungen mit IC50-Werten im niedrigen mikromolaren Bereich sowie einer dritten Verbindung mit einem bisher nicht für Inhibitoren der sEH beschriebenem Chemotyp. Zwar war diese Verbindung in höheren Konzentration unlöslich war, jedoch erreichten Derivate ebenfalls IC50-Werte im niedrigen mikromolaren Bereich und könnten als mögliche Startpunkte für eine neue Substanzklasse von sEH-Inhibitoren dienen.
In einer zweiten Studie wurde ein Liganden-basierter Ansatz gewählt um neue Inhibitoren der Leukotrien-A4 Hydrolase (LTA4H) zu suchen. Im Rahmen dieser Studie wurde außerdem eine neue Methode zur automatischen Generierung von Pharmakophor-Modellen entwickelt, welche auf einem wachsenden neuronalen Gas basiert, einer Methode aus dem Bereich des maschinellen Lernens. Die Methode wurde retrospektiv anhand mehrerer Benchmark-Datensätze validiert. Unter anderem wurde überprüft, inwiefern die Methode in der Lage ist die bioaktive Konformation eines Liganden vorherzusagen. Hierzu wurden, ausgehend von co-kristallisierten Liganden, automatisch Modelle generiert, welche im Anschluss genutzt wurden um Konformations-Datenbanken der Liganden zu durchsuchen. Je näher die beste gefundene Konformation an der co-kristallisierten Konformation lag, desto besser war das erzeugte Modell. Die entwickelte Methode war in nahezu allen Fällen in der Lage ein Modell zu erzeugen, mit welchem die durchschnittliche Abweichung zwischen co-kristallisierter und gefundener Konformation unter 2 Å lag. Im Rahmen der Studie wurde die neu entwickelte Methode auch in einem prospektiven Virtual Screening nach neuen Liganden der LTA4H genutzt. Hierzu wurden basierend auf 24 Kristallstrukturen mehrere Pharmakophor-Modelle für LTA4H-Liganden erstellt. Durch zusätzliche Nutzung des ESshape3D Fingerprints konnte außerdem die Form der Bindetasche der LTA4H erfasst werden. Diese Modelle wurden anschließend eingesetzt um eine Datenbank kommerziell erhältlicher Verbindungen zu durchsuchen und führten zur Identifizierung von zwei Substanzen mit IC50-Werten im unteren mikromolaren Bereich. Des Weiteren war die neue Methode in der Lage, den Bindemodus des genutzten Referenzinhibitors vorherzusagen, welcher durch Röntgenstrukturanalyse bestätigt wurde.
In zwei weiteren Studien wurde versucht, duale Inhibitoren der sEH und der 5-Lipoxygenase (5-LO) zu finden. Die erste dieser beiden Studien nutzte hierfür „duale“ Pharmakophor-Modelle: für beide Targets wurde basierend auf einer Vielzahl publizierter, aktiver Liganden eine Reihe von Pharmakophor-Modellen erstellt. Diese Modelle wurden paarweise miteinander verglichen; Modelle, welche eine ausreichend hohe Überlappung an Features besaßen, dienten als Ausgangspunkt für die Suche nach potentiell dualen Liganden. Durch die Suche in einer Fragment-Datenbank konnten neun Verbindungen identifiziert werden, welche eine Aktivität gegenüber einem der beiden Targets zeigten. Diese Verbindungen besaßen zum Teil noch nicht in der Literatur für sEH- oder 5 LO Inhibitoren beschriebene Strukturmerkmale. Eine der Verbindungen war außerdem in der Lage beide Targets im niedrigen mikromolaren Bereich zu inhibieren und könnte als Ausgangspunkt zur Entwicklung weiterer dualer 5-LO/sEH-Inhibitoren dienen. In der zweiten Studie wurde eine auf selbst-organisierenden Karten (SOM) basierende Methode genutzt um potentiell duale Liganden zu suchen. Hierzu wird je eine SOM mit repräsentativen (Sub-) Strukturen von Liganden beider Targets trainiert. Die DrugBank, eine Datenbank zugelassener Wirkstoffe, dient hierbei als Hintergrundverteilung und stellt den Raum wirkstoffartiger chemischer Strukturen dar. Durch einen automatischen Vergleich der trainierten SOMs können mögliche gemeinsame Substrukturen identifiziert werden. Die Anwendung dieser Methode auf bekannte Inhibitoren der sEH und der 5-LO identifizierte neun Fragmente, die auf einem der beiden Targets, sowie fünf Fragmente welche auf beiden Targets im niedrigen mikromolaren Bereich inhibierend wirken. Eine Substruktursuche nach einem dieser Fragmente in einer internen Datenbank lieferte eine Verbindung, welche beide Targets im nanomolaren Bereich inhibiert und eine vielversprechender Basis als Leitstruktur für die Entwicklung dualer 5-LO/sEH-Inhibitoren darstellt.
Zusammenfassend wurden in dieser Arbeit mehrere Ansätze vorgestellt wie Pharmakophore in der Wirkstoffsuche eingesetzt werden können. Im Rahmen mehrerer Virtual Screenings konnten eine Reihe neuer Inhibitoren gefunden werden, einige mit nicht zuvor beschriebenen Strukturmerkmalen für das jeweilige Target. Es wurde außerdem eine neue Methode zur automatischen Generierung von Pharmakophor-Modellen entwickelt, welche sowohl retrospektiv als auch prospektiv validiert wurde.
The ability of endothelial cells to properly adapt to changes in a dynamic blood perfused environment is essential to maintain the physiological function of the vascular system and of the organs. Epigenetic control of gene expression is believed to be the mechanism controlling cell-fate determination and cell-phenotype maintenance. In the thesis, two JmjC demethylases were screened for their function in endothelial biology. Both of them were proved to play a central role in angiogenesis.
The histone 3 lysine 4 demethylase JARID1B was identified as the most highly expressed demethylase in endothelial cell. Knockdown of JARID1B in human umbilical vein endothelial cells (HUVEC) attenuated cell migration, angiogenic sprouting and tube formation. Jarid1b null mice exhibited attenuated retinal angiogenesis and reduced endothelial sprout outgrowth from aortic segments. Microarray data identified that the antiangiogenic transcription factor HOXA5 was suppressed by JARID1B. Consistently, chromatin immunoprecipitation experiment revealed that JARID1B occupies and reduces the histone 3 lysine 4 methylation levels at the HOXA5 promoter, demonstrating a direct function of JARID1B in endothelial HOXA5 gene regulation. Hence, as a highly expressed JmjC protein in endothelial cells, JARID1B fundamentally maintains endothelial angiogenic phenotypes perhaps through suppression of HOXA5.
As second enzyme it was identified that the histone plant homeodomain finger protein 8 (PHF8) plays a role in endothelial angiogenic sprouting as well as tube formation and cell migration. Overexpression of PHF8 catalyzed the removal of methyl-groups from histone 3 lysine 9 (H3K9) and H4K20, whereas knockdown of the enzyme increased H3K9 methylation. Knockdown of PHF8 by RNAi also attenuated endothelial proliferation and survival. To characterize the underlying mechanism, E2F transcription factors were screened, which led to the identification of the gene repressor E2F4 to be controlled by PHF8. Importantly, PHF8 maintains E2F4, but not E2F1, expression in endothelial cells. Likewise, chromatin immunoprecipitation revealed that PHF8 reduces the H3K9me2 level at the E2F4 transcriptional start site, demonstrating a direct function of PHF8 in endothelial E2F4 gene regulation. Thus, it is proposed that PHF8 maintains endothelial function by controlling E2F4 expression. On the other hand, microarray and subsequent qPCR validation revealed that the expressions of small nuclear RNAs (snRNAs) were regulated by PHF8. Co-immunoprecipitation experiment demonstrated that PHF8 interacts with spliceosome related proteins SNRP70 and SRPK1 as well as snRNA. Indeed, PHF8 contributed to splicing: GLS and VEGF-A displayed alternative splicing in PHF8 depleted cells. In addition, c-FOS introns were showed to be retained after knockdown of PHF8 in endothelial cells. These results demonstrated that, by controlling angiogenic mRNA splicing, PHF8 could affect endothelial properties.
Collectively, the results uncover the important roles of JARID1B and PHF8 in endothelial cells in the control of angiogenesis. Changing histone modifiers appears as an attractive concept for pro- and antiangiogenic therapy. The present work adds JARID1B and PHF8 as novel potential targets to this emerging field.
Functional expression of recombinant N-methyl-D-aspartate (NMDA) receptors in eukaryotic cell lines
(2000)
5-lipoxygenase (5-LO) is an enzyme with a substantial role in inflammatory processes. In vitro kinase assays using [32P]-ATP in combination with mutagenesis have revealed that serine residues 271, 523 and 663 can be phosphorylated by MK2, PKA and ERK2 kinases, respectively. A few available reports regarding 5-LO protein sequence have covered up to 30% of the sequence after amino acid sequencing including Ser663. In LCMS/MS analyses of 5-LO tryptic digests from different cellular sources different peptides have been detected; however, none of the three phosphorylations has been detected and only Ser663 was included in the covered sequence.
As there was no comprehensive mass spectrometric analysis of 5-LO, the purpose of this study was to optimize the experimental conditions under which detection of the aforementioned phosphorylation events, as well as other possible post-translational modifications (PTMs), would be feasible. Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization Mass Spectrometry (MALDI-MS) was used for peptide analysis of 5-LO cleaved either by chemical reagents or by proteases. Sequence coverage of 5-LO could be enhanced to be close to completion by combination of results from digestions by trypsin, AspN and chymotrypsin. In-gel trypsin digestion followed by in-solution AspN digestion proved to be a useful sample treatment for reproducible detection of the Ser271-containing peptide.
Nevertheless, in none of the examined cleavage protocols the sequence around Ser523 was detected reproducibly or with acceptable signal intensity for subsequent peptide fragmentation. Propionic anhydride and sulfo-NHS-SS-biotin cross-linker (EZ-linkTM), were used for derivatization of lysine side chains and hindrance of lysine residue recognition by trypsin. Phosphopeptide enrichment became possible after tryptic digestion of these samples, not only due to formation of an individual Ser523-containing peptide, but also because TiO2-mediated enrichment, which is performed in acidic pH, was not impaired by positively charged free lysine side chains. Additionally, biotinylation of lysine residues was exploited for an intermediate enrichment step of the lysine containing peptides, prior to TiO2 phosphopeptide enrichment.
MALDI-MS analysis after in-vitro phosphorylation of 5-LO by the three kinases showed that Ser271 was phosphorylated in the MK2 and PKA kinase assays, while Ser523 was phosphorylated only in the PKA kinase assay. Surpisingly, no phosphopeptides were detected in the in-vitro kinase assays with ERK2, even though the unmodified counterpart of the Ser663-containing peptide was easily detected. The detection limit for each of the three phosphorylation sites was determined by the use of custom made phosphopeptides and an amount of 0.06 pmol of phosphopeptide in 1 μg 5-LO (representing 0.5% phosphorylation rate) was sufficient in all cases for successful enrichment and detection by MS.
In-vitro kinase assays with [32P]-ATP were performed for some kinases that were expected to phosphorylate 5-LO according to in-silico data. Three members of the Src tyrosine kinase family (Fgr, Hck and Yes) and the Ser/Thr specific kinase DNA-PK used 5-LO as their substrate and mainly residues at the N-terminal part of 5-LO were detected phosphorylated by MS (e.g. Y42, Y53). Additional in-vitro assays for recombinant 5-LO modification included incubation with glutathione or compound U73122, previously described as inhibitor of 5-LO.
Since in-vitro assays might have generated artifacts, a method for 5-LO purification from human cells was sought, in order to examine the modification state of the protein in the cellular context. ATP-agarose affinity purification and anti-5-LO immunoprecipitation proved inappropriate for sample purification for MALDI-MS analysis. Consequently, two human cell lines that are able to express 5-LO (Rec-1 Blymphocytes and MM6 monocytes) were transduced with a DNA cassette that contained recombinant human 5-LO sequence with an attached N-terminal FLAG-tag. Anti-FLAG immunoprecipitation was then performed effectively in cell lysates and the precipitated FLAG-5-LO was separated by SDS-PAGE before MALDI-MS analysis.
The examined cell stimuli were expected to result to phosphorylation of 5-LO at Ser523 by PKA in Rec-1 cells and to phosphorylation of Ser271 and/or Ser663 in MM6 cells by activated MK2 and ERK2, respectively. Additionally, under the conditions of MM6 cell stimulation, Fgr, Hck and Yes kinases, which phosphorylated 5-LO in vitro, were expected to be activated and the possibility of 5-LO phosphorylation on tyrosine was investigated. Although immunoblotting results indicated that all the aforementioned phosphorylation events existed in the examined samples, MALDI-MS analysis verified only phosphorylation on Ser271 in differentiated MM6 cells, interestingly regardless of cell stimulation.
Finally, the primary amine derivatization procedure by EZ-linkTM was utilized for MS analysis of lysine rich proteins. In the past, chemical propionylation of histones had been employed prior to trypsin digestion; however it was easily confused in MS with combinations of other PTMs (e.g. acetylation, methylation). Moreover, propionylation is a PTM for histone H3 and this information was lost. Consequently, the EZ-link reagent was more useful for analysis of histones, as unambiguous assignment of PTMs and detection of native propionylation on bovine H3 became possible.
Krebs ist und wird voraussichtlich auch in näherer Zukunft eine der häufigsten Todesursachen weltweit bleiben. Trotz vielversprechenden Fortschritten in Therapeutik und Diagnostik bedarf es noch weiterer Forschung, um die vielfältigen molekularen Mechanismen zu entschlüsseln, welche dem Verlauf von malignen Tumorerkrankungen bestimmen und zu beeinflussen vermögen. Das RNA-Bindeprotein Hu antigen R (HuR) reguliert Genexpression auf posttranskriptioneller Ebene, indem es durch Bindung an Ziel mRNAs Einfluss auf deren Abbau, Lokalisation oder Translationseffizienz nimmt. Darüber hinaus zeigte sich in den letzten Jahren, dass HuR diese Prozesse auch indirekt durch Interaktion mit regulatorischen RNAs beeinflusst. In Krebszellen lässt sich häufig eine erhöhte Aktivität von HuR beobachten, welche in Verbindung mit verschiedenen tumorigenen Prozessen gebracht wird. Unter anderem trägt HuR zur Deregulation des Zellzyklus bei, indem es die Expression der Cycline A2, B1, D1 und E1 erhöht. Weiterhin unterstützt HuR das Tumorwachstum durch Regulation von proangiogenen Faktoren wie VEGF, IL8 und COX2. Da HuR generell eine prominente Rolle bei der Regulation von Immunantworten, sowohl in Immunzellen selbst als auch in solidem Gewebe einnimmt, wurde HuR in der Vergangenheit häufig auch mit der Ausbildung des inflammatorischen Tumormikromilieus in Verbindung gebracht, jedoch ist die Datenlage in dieser Hinsicht bis heute uneindeutig. Obwohl eine Großzahl an Zytokinen und inflammatorischen Faktoren prinzipiell als HuR Zielgene beschrieben sind, gibt es nur für die wenigsten dieser Proteine entsprechende Untersuchungen in Tumorzellen.
Ziel dieser Arbeit war es, den Einfluss von HuR in Tumoren auf die Rekrutierung von Makrophagen zu evaluieren. Hierfür bot sich als in vitro Modell die Brustkrebszelllinie MCF-7 an, da diese unter entsprechenden Kultivierungsbedingungen dreidimensionale Sphäroide bildet. Solch ein Sphäroidmodell bietet sich als Kompromiss zwischen der klassischen zweidimensionalen Zellkultur an, welche zwar höchst artifiziell, jedoch leicht zu handhaben und zu kontrollieren ist, und den physiologischeren, aber gleichzeitig experimentell unzugänglicheren und speziesfremden Tiermodellen. Mittels lentiviraler Transduktion wurde ein small hairpin RNA (shRNA) vermittelter stabiler Knockdown von HuR in MCF-7 erzielt, welcher zu vermindertem Zellwachstum führte, jedoch keinen weiteren Einfluss auf die Bildung von Sphäroiden hatte. Um die initiale Suche nach HuR-regulierten, potenziell relevanten Faktoren möglichst breit und unvoreingenommen zu halten, wurde die Expression von 174 Zytokinen in Wildtyp- und HuR-knockdown Sphäroiden mittels eines Protein Arrays untersucht. Überraschenderweise zeigte der Großteil der veränderten Proteins einen negativen Zusammenhang mit HuR, welches eigentlich eher als positiv regulierendes Protein beschrieben ist. Bemerkenswerterweise befand sich unter den mit am stärksten regulierten Faktoren das Chemokin CCL5 (auch RANTES genannt), welches einerseits als einer der beiden zentralen Faktoren für die Makrophageninfiltration in Brustkrebs gilt, andererseits bisher noch nicht in Verbindung mit HuR gebracht wurde.
Im Folgenden untersuchte ich zuerst den mechanistischen Hintergrund dieser Regulation. Da diese sich auch in adhärenten Zellrasen zeigte, wechselte ich für die entsprechenden Experimente zu zweidimensionaler Zellkultur. Eine negative regulatorische Funktion von HuR wird meist in Verbindung mit verminderter Translation von Zielfaktoren gebracht. Da die mRNA Level von CCL5 dem Effekt auf Proteinebene entsprachen, konnten entsprechende Mechanismen als Grund für die veränderten CCL5 Level ausgeschlossen werden. Desweiteren blieb die mRNA Stabilität ungeachtet der HuR Level konstant; dabei zeigte sich zudem, dass mRNA Abbau generell keinen relevanten Einfluss auf die Expression von CCL5 in MCF-7 hatte. Da diese Ergebnisse auf eine transkriptionelle Regulation hindeuteten, untersuchte ich im Folgenden den Einfluss von HuR auf die Promoteraktivität von CCL5. Hierfür isolierte ich zunächst die CCL5-Promoterregion aus genomischer DNA von MCF-7 Zellen und inserierte diese dann in einen zuvor promoterlosen Luciferase-Expressionsvektor. In den folgenden Reporteranalysen zeigte sich, dass HuR tatsächlich einen negativen Einfluss auf die Promoteraktivität von CCL5 ausübt. Durch sukzessive Verkürzung ließ sich der entscheidende DNA-Bereich auf die letzten 140 Nukleotide vor dem Transkriptionsstartpunkt eingrenzen. Dieser Bereich enthält vier prominente und sehr gut charakterisierte regulatorische Abschnitte: zwei benachbarte NF-κB Bindestellen sowie je ein Interferon-stimulated Response Element (ISRE) und ein C/EBPβ Erkennungsmotiv. Während das C/EBP Element keine funktionelle Relevanz in den Reporteranalysen hatte, reduzierte sich durch Deletion sowohl der ISRE als auch der NF-κB Elemente die Promoteraktivität um mehr als 50%, allerdings nur im ISRE-Deletionskonstrukt unter Nivellierung des HuR-abhängigen Unterschiedes. Somit ließ sich der Einfluss von HuR auf die CCL5 Promoteraktivität vollständig und ausschließlich auf das ISRE zurückführen. Im Gegensatz zu dem in Tumorzellen häufig basal überaktiven NF-κB Signalweg sind die kanonischen, ISRE-assoziierten Typ I Interferon Signalkaskaden und ihre vermittelnden Transkriptionsfaktoren, die sogenannten Interferon Regulatory Factors (IRFs) nicht konstitutiv überaktiviert. Eine Sonderstellung nehmen dabei die Faktoren IRF1 und IRF2 ein, da sie, für Proteine abseits der Stimulus-getriebenen ISRE-Interferon Achse, auch als konstitutive Transkriptionsfaktoren beschrieben sind, wobei IRF2 in diesem Kontext als IRF1-Antagonist und somit Transkriptionsrepressor fungiert. Überraschenderweise ließ sich mittels Chromatin Immunopräzipitation eine Assoziation von IRF1 mit dem CCL5 Promoter nur in Wildtyp-, jedoch nicht in HuR-knockdown Zellen nachweisen. Im Gegensatz dazu ergaben mRNA Expressionsanalysen der Tumor-relevanten IRFs, dass die CCL5 Induktion in HuR-depletierten Zellen mit einer allgemeinen, jedoch niedrigschwelligen Erhöhung von Typ I Interferon-assoziierten Signalen einhergeht. Interessanterweise korrelierte Interferon β zwar mit CCL5 auf mRNA Ebene, jedoch hatte eine Blockade des Interferon-α/β Rezeptors in HuR-depletierten Zellen keinen akuten Effekt auf CCL5. Umgekehrt zeigte sich auch keine erhöhten CCL5 Level in Wildtypzellen unter Kokultur mit HuR-knockdown Zellen, wie es bei parakriner Induktion durch Interferon β zu erwarten wäre. Ebenso konnte alternatives ISRE Signaling durch einen Komplex aus unphosphoryliertem Stat1 und IRF9, wie es in vitro unter länger anhaltender Niedriglevel Exposition mit Interferon β beobachtet wurde, ausgeschlossen werden. Um sicher zu stellen, dass diese Erhöhung kein sequenzabhängiges off-target Artefakt ist, wie es in der Vergangenheit für einzelne small hairpin RNAs (shRNAs) beobachtet wurde, wurde eine entsprechende Aktivierung von IRF3 und damit des IRF3/IRF7 Aktivierungsweges untersucht und ausgeschlossen. Zusätzlich konnte durch Tests unterschiedlicher shRNA Sequenzen sowie Zellsysteme demonstriert werden, dass die CCL5 Aktivierung tatsächlich ein spezifischer und in einer größeren Bandbreite an Krebszelllinien unterschiedlicher Herkunft, darunter Brust- und Lungenkarzinom, Glioblastom- sowie Melanom- Zelllinien, reproduzierbarer Effekt von HuR-Defizienz ist.
Da CCL5 als eines der zentralen Chemokine bei der Rekrutierung von Monozyten/Makrophagen in Tumore beschrieben ist, stellte sich die Frage, ob HuR mit diesem Vorgang in Verbindung zu bringen ist. Brusttumore weisen oft eine hohe Zahl von Tumor-assoziierten Makrophagen auf, welche von eingewanderten Blutmonozyten abstammen. Ein Einfluss von HuR auf diesen Vorgang in vitro konnte mittels einer Kokultur von Sphäroiden mit zuvor frisch aus Humanblut isolierten Primärmonozyten nachgewiesen werden. Hierbei wiesen HuR-knockdown Sphäroide trotz ihres geringeren Durchmessers eine erhöhte Anzahl von Monozyten/Makrophagen auf. Da sich in diesen Zellen weder Proliferation noch relevante Apoptose zeigte, ließ sich die erhöhte Anzahl auf verstärkte Einwanderung in das Sphäroid zurückführen. Hierbei erwies sich der direkte Zellkontakt zwischen Monozyten und Tumorzellen als erforderlich, da Monozyten keine unterschiedliche Chemotaxis gegenüber entsprechenden Sphäroidüberständen zeigten. Dass die erhöhte Infiltration in HuR-defizienten Sphäroiden tatsächlich auf CCL5 zurückzuführen ist, konnte in Kokulturexperimenten durch Inhibierung von CCL5 gezeigt werden. Unterstütztend wurde ein Zusammenhang zwischen HuR, CCL5 und Tumor assoziierten Makrophagen in silico unter Zuhilfenahme des TCGA Datensets für Estrogenrezeptor-positive Brusttumore untersucht. Im Einklang mit meinen Ergebnissen zeigte sich eine negative Korrelation zwischen HuR und CCL5. Außerdem ließ sich ein negativer Zusammenhang zwischen HuR und einer Makrophagensignatur feststellen, während CCL5 wie erwartet mit dieser Signatur positiv korrelierte.
Zusammenfassend zeigte sich in dieser Arbeit, dass HuR eine Rolle bei der zellulären Zusammensetzung des inflammatorischen Tumor-Mikromilieus spielt. Der Verlust von HuR in Tumorzellen führte zu einer erhöhten Expression des Chemokins CCL5. Dies ließ sich in Brust- und Lungenkarzinom-, Glioblastom- sowie Melanom- Zelllinien beobachten. In Brustkrebszellen zeigte sich, dass diese Regulation auf verstärkte Transkription, vermittelt durch ein ISRE innerhalb des CCL5 Promoters, zurückzuführen ist. Funktionell konnte die erhöhte CCL5 Produktion in HuR-defizienten Tumorsphäroiden in Verbindung mit verstärkter Infiltration von Monozyten/Makrophagen gebracht werden. Unterstützend zeigte sich auch bei einer in silico Analyse von Estrogenrezeptor-positiven Brusttumoren eine negative Korrelation zwischen HuR und CCL5, was mit einer entsprechend veränderten Makrophagensignatur einherging. Im Hinblick auf derzeit diskutierte Ansätze, das Wachstum von Tumoren mittels HuR Blockade zu inhibieren, sind meine Ergebnisse potenziell von therapeutischer Relevanz. Basierend auf meiner Arbeit sollte dabei in zukünftigen Studien näher untersucht werden, wie sich Inhibierung von HuR in Tumoren auf die Zusammensetzung und Funktion des Tumormikromilieus auswirkt und daraus resultierende Effekte auf das Tumorwachstum in Relation zu der allgemein wachstumsfördernden Rolle von HuR in Tumorzellen gesetzt werden.
Sphingosin 1 Phosphat (S1P) ist ein wichtiger Lipidmediator, der über G Protein gekoppelte Rezeptoren und intrazelluläre Wirkungen vielfältige Wirkungen auslöst und eine Rolle bei der Lymphozytenzirkulation, der Erhaltung der endothelialen Barriere, bei Entzündungsprozessen und Tumorwachstum spielt. Die S1P Lyase (Sgpl1) katalysiert den irreversiblen Abbau von S1P und damit den letzten Schritt des Sphingolipidkatabolismus‘. Ein Fehlen der Sgpl1 bewirkt eine Akkumulation von S1P und anderen Sphingolipiden im Blut und Gewebe, was multiple Organschäden zur Folge hat. Menschen mit S1P Lyase Insuffizienz Syndrom (SPLIS) leiden insbesondere unter steroidresistentem nephrotischem Syndrom, Nebennierenrinden-insuffizienz und neurologischen Störungen. Weitere mögliche Symptome sind Lymphopenie, Hautveränderungen und Dyslipidämien. S1P Lyase defiziente Mäuse weisen sehr ähnliche Organschädigungen auf.
An Sgpl1 Knockoutmäusen war zuerst die massive Akkumulation nicht nur von Sphingolipiden, sondern auch von Cholesterin und Triglyceriden in Blut und Leber aufgefallen. Auch bei SPLIS Patienten wurde eine Hypercholesterinämie beobachtet. Um die Kreuzregulation des Sphingolipid- und Cholesterinmetabolismus besser zu verstehen, sollte die Rolle der Sgpl1 in der Leber, dem Hauptort des Lipidmetabolismus, untersucht werden. Hierzu sollte ein Mausmodell mit einem hepatozytenspezifischen Sgpl1 Knockout (Sgpl1HepKO) etabliert und charakterisiert werden. Dies wurde durch Kreuzen von Sgpl1fl/fl-Mäusen mit Mäusen, welche die Cre-Rekombinase unter dem Albuminpromoter exprimierten, erreicht. Die basale Charakterisierung zeigte, dass diese Mäuse im Gegensatz zu globalen Sgpl1 Knockoutmäusen sowohl im Alter von acht Wochen, als auch im Alter von acht Monaten einen unauffälligen Phänotyp aufwiesen. Das äußere Erscheinungsbild inklusive Leber und Körpergewicht, das Blutbild, die Leberenzyme sowie die Histologie der Leber waren unverändert. Die Analyse der Leberlipide mit Hilfe von Hochleistungsflüssigkeits-chromatographie gekoppelt mit einer Tandem Massenspektrometrie zeigte eine signifikante Akkumulation (≈1,5 2 fach) von S1P, Sphingosin und Ceramiden, aber nicht von Glucosylceramiden und Sphingomyelin in der Leber. Messungen im Plasma zeigten eine Erhöhung mehrerer Ceramide, während der S1P Spiegel normal war. Ferner zeigten Untersuchungen der Galle signifikant erhöhte Konzentrationen an S1P, Dihydro S1P und Glucosylceramiden, jedoch unveränderte Ceramide. Die Ergebnisse legen folgende Schlussfolgerungen nahe: 1. In der Leber kann mit Hilfe von Ceramidsynthasen akkumulierendes Sphingosin in Ceramide umgewandelt werden, welche anschließend ins Blut sezerniert und letztendlich vermutlich von anderen Zellen verstoffwechselt werden. Außerdem ist nicht ausgeschlossen, dass S1P ebenfalls ins Blut sezerniert und dort effektiv abgebaut wird, so dass die S1P Konzentration im Plasma unverändert bleibt. 2. S1P sowie Glucosylceramide werden an die Galle abgegeben und ausgeschieden. 3. Die Sgpl1 in der Leber ist nicht essentiell für die Regulation des Plasma S1Ps, was zuvor vermutet worden war
Eine Analyse der Sterole zeigte in Sgpl1HepKO Mäusen erhöhte Spiegel an Cholesterin und Desmosterol in der Leber. In Übereinstimmung mit der erhöhten Proteinexpression des low density lipoprotein (LDL ) Rezeptors und erniedrigten Konzentrationen des LDL Cholesterins im Plasma, deuten diese Daten auf eine erhöhte Aufnahme von LDL Cholesterin durch die Leber hin. Untersuchungen in der Leber sowie mit primären Hepatozyten zeigten im Gegensatz zu globalen Sgpl1 Knockoutmäusen keine Veränderungen der Peroxisomen-Proliferator-aktiviertem Rezeptor γ Expression. Weitere Gene mit zentraler Rolle wie der Liver X receptor oder die Fettsäuresynthase, waren ebenfalls nicht reguliert. Dieser im Vergleich zu globalen Sgpl1-Knockoutmäusen milde Phänotyp lässt sich durch die deutlich geringere Akkumulation von Sphingolipiden aufgrund der oben beschriebenen Kompensations-mechanismen in Sgpl1HepKO Mäusen erklären.
In weiteren Untersuchungen sollten die Auswirkungen einer Sgpl1-Defizienz an Fibroblasten untersucht werden. Hierzu standen embryonale Fibroblasten aus Sgpl1 Knockoutmäusen zur Verfügung (Sgpl1-/- MEFs). In einer Kooperation mit Dr. Janecke von der Universität Innsbruck standen außerdem humane Fibroblasten eines SPLIS Patienten zur Verfügung.
An Sgpl1-/- MEFs war zuvor eine gestörte Calciumhomöostase festgestellt worden, welche sich durch eine erhöhte zytosolische Calciumkonzentration und vermehrte Calciumspeicherung im Endoplasmatischen Retikulum und in Lysosomen auszeichnete. Die Plasmamembran-Calcium ATPase (PMCA) trägt an Fibroblasten entscheidend zur Regulation der zytosolischen Calciumkonzentration bei. Ihre Expression auf Proteinebene war jedoch in Sgpl1-/- MEFs nicht verändert. Im Rahmen dieser Arbeit wurde durch eine Immunfärbung erstmals festgestellt, dass die PMCA in Sgpl1-/- MEFs nicht vollständig an der Plasmamembran lokalisiert war. Dies könnte der Grund für die erhöhte zytosolische Calciumkonzentration in den Zellen sein. ...
Disruption of the complex gastrointestinal ecosystem between the resident microflora and the colonic epithelial cells has been associated with increased inflammation and altered cell growth. Possible endpoints of this disturbance are IBD and CRC. The data presented in this thesis, entitled "PPARgamma as molecular target of epithelial functions in the gastrointestinal tract", shed further light on the underlying molecular mechanisms contributing to the well ordered homeostasis of this gastrointestinal ecosystem. Except for elucidating important roles for mesalazine and the dietary HDAC inhibitors butyrate and SFN in a) the modulation of cellular growth, b) the induction of APs, and c) the control of NFkappaB signalling in CRC cells, the involvement of the nuclear hormone receptors PPARgamma und VDR as "gatekeepers" in these intricate regulatory mechanisms were established. Future work will be engaged in analysing whether these in vitro findings are also physiologically relevant in regard to prevention and therapy of gastrointestinal diseases. Within the scope of this work, in Paper I and II it could be demonstrated that butyrate and mesalazine act via PPARgamma to induce their anti-proliferative and pro-apoptotic actions along the caspase signalling pathway. Activation of the intrinsic and extrinsic signalling trail and the down-regulation of anti-apoptotic proteins are responsible for increased caspase-3 activity caused by butyrate. In contrast, mesalazine merely activates this cascade via the extrinsic trail and the IAPs. Moreover, a signal transduction pathway leading to increased cell death via p38 MAPK - PPARgamma - caspase-3 in response to butyrate was unveiled. In addition, there is strong evidence that mesalazine-mediated pro-apoptotic and growth-inhibitory abilities are controlled by PPARgamma-dependent and -independent mechanisms which appear to be triggered at least in part by the modulation of the tumor suppressor gene PTEN and the oncoprotein c-myc, respectively. In Paper III and IV the induction of the APs HBD-2 and LL-37 in response to the dietary HDAC inhibitors butyrate and SFN was pinpointed. Regarding the molecular events of this regulation, the data presented in this thesis provide strong evidence for the involvement of VDR in HBD-2- and LL-37-induced gene expression, while the participation of PPARgamma was excluded. Moreover, the role for p38 MAPK and TGF-beta1 in the up-regulation of LL-37 caused by butyrate was established. In contrast, SFN-mediated induction of HBD-2 is modulated via ERK1/2 signalling. The findings in Paper V clearly refer to the involvement of the nuclear hormone receptors PPARgamma and VDR in butyrate-mediated suppression of inducible NFkappaB activation dependent on the stimulated signalling pathway caused by LPS or TNFalpha. Moreover, an inhibitory role for VDR in the regulation of basal NFkappaB activation was revealed. On the contrary, a modulating role for PPARgamma on basal NFkappaB could be debarred. Altogether the data presented in this thesis not only provide new insights in the understanding of the fundamental gastrointestinal physiology regulated by nuclear hormone receptors, but also may offer opportunities for the development of potential drug targets and therapeutic strategies in the treatment of IBD and CRC.
Crohn´s disease (CD) and Ulcerative colitis (UC) are idiopathic inflammatory disorders. Environmental factors, infectious microbes, ethnic origin, genetic susceptibility, and a dysregulated immune system can result in mucosal inflammation. However, the etiology of both CD and UC still remains largely unclear. Inflammatory bowel diseaserelated animal models suggest that a combination of genetic susceptibility factors and altered immune response driven by microbial factors in the enteric environment may contribute to the initiation and chronification of the disease. The intestinal immune system represents a complex network of different lymphoid and non-lymphoid cell populations as well as humoral factors. In inflammatory bowel disease, the controlled balance of the intestinal immune system is disturbed at all levels. In CD, naïve T cells preferably differentiate into Th1 or Th17 producing cells, while in UC, these cells differentiate into aberrant Th2 cells. Overall, in active inflammatory bowel disease effector T cell activity (Th1, Th17, Th2) predominates over regulatory T cells. Animal models of intestinal inflammation are indispensable for our understanding of the pathogenesis of CD and UC. When chosen appropriately, these models proved to be a helpful tool to investigate pathophysiological mechanisms, as well as to test emerging therapeutic options in the preclinical phase. 2,4,6-Trinitrobenzene sulfonic acid (TNBS) and oxazolone are the two major chemicals applied to induce Th1- and Th2-skewed intestinal inflammation, respectively. Colitis can be induced in susceptible strains of mice by intrarectal instillation of the haptenating substances TNBS or oxazolone in ethanol, which is necessary for an initial desintegration of the epithelial barrier. TNBS or oxazolone are believed to haptenize colonic autologous or microbiotic proteins rendering them immunogenic to the host immune system. While TNBS administration in the presence of ethanol results in a transmural infiltrative disease in the entire colon based on an IL-12/IL-23 driven, Th1-or Th17 mediated response, oxazolone instillation finally leads to a colitis caused by a polarized Th2 IL-13-dominated lymphocyte response. Rectal oxazolone instillation in ethanol produces a more superficial inflammation that affects the distal half of the colon rather than the whole colon. Therapeutic modulation of the disturbed immune response in patients with inflammatory bowel disease still represents a complex challenge in the clinic. Currently, none of the therapeutic measure are disease specific and they generally target the pathophysiology downstream of the driving immunpathology. So, there is still the need to develop a tailored approach to prevention of the initiation and perpetuation of the inflammatory cascade before tissue injury occurs. One important aspect of this approach might involve the induction or re-establishment of immunological tolerance. FTY720 following rapid phosphorylation to FTY-P by endogenous sphingosine kinases acts as a sphingosine-1-phosphate (S1P) receptor agonist and represents the prototype of a new generation of S1P receptor modulators. While changing currently its proposed mode of action still focus on the fact, that FTY720 effectively inhibits the egress of T-cells from lymph nodes, thereby reducing the number of antigen-primed/restimulated cells that re-circulate to peripheral inflammatory tissues. However, recent studies indicate, that its immunomodulatory properties might be more complex and exerted not only via interactions with other S1P receptor subtypes but also via a direct modulation of the inflammatory capacity of dendritic cells (DC) resulting in a modified regulation of T cell effector functions as well as in an induction of regulatory T cells and function. 1,25(OH)2D3, the active form of vitamin D, is a secosteroid hormone that has in addition to its central function in calcium and bone metabolism pronounced immune regulatory properties. The biological effects of calcitriol are mediated by the vitamin D receptor (VDR), a member of the superfamily of nuclear hormone receptors. A number of studies identified calcitriol/VDR as prominent negative regulators of Th1-type immune responses, whereas Th2 responses are not affected or even augmented. These effects have been mainly explained by direct activities on lymphocytes, subsequent studies clearly supported a role of calcitriol in modulating monocyte differentiation or DC maturation. However, to translate the immunosuppressive capacities of calcitriol into an effective immunointervention, a great challenge was the design of structural analogs of calcitriol that are devoid of adverse effects related to hypercalcemic activity. The intense study of the 25-oxa series generated a large number of calcitriol analogs exhibiting substantial dissociation between possible immunomodulatory capacities and undesired hypercalcemia. Especially, the combination of the 22-ene modification with the 25-oxa element as realized in ZK156979 yielded a very promising set of new analogs for further characterization in animal models resembling human autoimmune diseases. So, the overall aim of the studies presented here was to evaluate strategies of enhancing regulatory immunity in mouse models of Th1- and Th2-mediated colitis as a new therapeutic approach. To this end we used FTY720, 22-ene-25-oxa vitamin D (ZK156979), as well as the combination of calcitriol and dexamethasone to evaluate the respective pro-tolerogenic potential in intestinal inflammation models in mice. First, to induce Th1-mediated colitis a rectal enema of TNBS was given to Balb/c mice. FTY720 was administered i.p. from day 0-3 or 3-5. FTY720 substantially reduced all clinical, histopathologic, macroscopic, and microscopic parameters of colitis analyzed. The therapeutic effects of FTY720 were associated with a down-regulation of IL-12p70 and subsequent Th1 cytokines. Importantly, FTY720 treatment resulted in a prominent up-regulation of FoxP3, IL-10, TGFβ and CTLA4. Moreover, we observed a significant increase of CD25 and FoxP3 expression in isolated lamina propria CD4+ T cells of FTY720-treated mice. The impact of FTY720 on regulatory T cell induction was further confirmed by concomitant in vivo blockade of CTLA4 or IL-10R which significantly abrogated its therapeutic activity. Thus, our data provide new and strong evidence that besides its well-established migratory properties FTY720 down-regulates proinflammatory signals while simultaneously inducing the functional activity of CD4+CD25+ regulatory T cells. In a second approach, the rectal instillation of oxazolone yielded a Th2-mediated colitis. Treatment with FTY720 prominently reduced the clinical and histopathologic severity of oxazolone-induced colitis, abrogating body weight loss, diarrhea, and macroscopic and microscopic intestinal inflammation. The therapeutic effects of FTY720 were associated with a prominent reduction of the key Th2 effector cytokines IL-13, IL-4 and IL-5. Moreover, FTY720 inhibited GATA3 and T1/ST2 expression, which represent distinct markers for Th2 differentiation and Th2 effector function. Thus, our data are supportive for the view that FTY720 exhibits beneficial prophylactic as well as therapeutic effects in Th2-mediated experimental colitis by directly affecting Th2 cytokine profiles, probably by reducing GATA3 and T1/ST2. Recently, we described 22-ene-25-oxa-vitamin D (ZK156979) as a representative of a novel class of low calcemic vitamin D analogs showing prominent immunomodulative capacities. Here, we used the Th1-mediated TNBS colitis to test its anti-inflammatory properties in vivo. We found that treatment with ZK156979 clearly inhibited the severity of TNBS-induced colitis without exhibiting calcemic effects. Both early and late treatment abrogated all the clinical macroscopic and microscopic parameters of colitis severity; in addition we observed a clear down-regulation of the relevant Th1 cytokine pattern including the T-box transcription factor, T-bet. On the other hand, application of ZK156979 increased local tissue IL-10 and IL-4. Finally, as a new approach we evaluated the pro-tolerogenic potential of calcitriol and dexamethasone in acute Th1-mediated colitis. Calcitriol and/or dexamethasone were administered i.p. from day 0-3 or from day 3-5 following the instillation of the haptenating agent. The combination of these steroids most effectively reduced the clinical and histopathologic severity of TNBS colitis. Th1-related parameters were down- while Th2 markers like IL-4 and GATA3 were up-regulated. Clearly distinguishable from known steroid effects calcitriol in particular promoted regulatory T cell profiles as indicated by a marked increase of IL-10, TGFß, FoxP3 and CTLA4. Furthermore, analysis of DC mediators responsible for a pro-inflammatory differentiation of T cells revealed a clear reduction of IL-12p70, and IL23p19 as well as IL-6 and IL-17. Thus, our data suggest the concept of a steroid-sparing application of calcitriol derivatives in inflammatory bowel disease. Furthermore, the data presented suggest that early markers of inflammatory DC and Th17 differentiation might qualify as new target molecules for both calcitriol as well as for selective immune modulating vitamin D analogs. In conclusion the data of these published investigations added to the substantial progress in understanding the biology of tolerogenic DC and regulatory T cells with respect to their roles in health and disease achieved in the past years. This has led to an increasing interest in the possibility of using DC and regulatory T cells as biological therapeutics to preserve and restore tolerance to self antigens and alloantigens. Especially DC may be helpful to exert their important roles in directing tolerance and immunity by modulation of subpopulations of effector T cells and regulatory T cells. The data demonstrated in the present studies may assist to define the divergent implications of new therapeutic concepts for the treatment of inflammatory bowel disease, especially with regard to a possible auspicious impact on pro-tolerogenic DC and regulatory T cell functions. However, further studies are needed to fulfil our understanding of the complex immunomodulatory profiles of FTY720 as well as of calcitriol and its low calcemic analog ZK156979, thus accelerating their entry into the clinic as new therapeutic options for the cure of inflammatory bowel disease.
Der Name Histamin hat seinen Ursprung aus dem griechischen Wort "histos" (Gewebe) und spielt auf sein breites Spektrum an Aktivitäten, sowohl unter physiologischen als auch unter pathophysiologischen Bedingungen an. Histamin ist eines der Moleküle mit welchem man sich im letzten Jahrhundert am intensivsten beschäftigt hat.
Im Jahr 1907 wurde das Histamin erstmals synthetisiert. Drei Jahre später gelang es, dieses Monoamin erstmals aus dem Mutterkornpilz Claviceps purpurea zu isolieren. Weitere 17 Jahre vergingen, ehe Best et al. Histamin aus der humanen Leber und der humanen Lunge isolieren konnten. Best konnte somit beweisen, dass dieses biogene Amin einen natürlichen Bestandteil des menschlichen Körpers darstellt. Nach der Entdeckung wurden dem Histamin mehrere Effekte zugeschrieben. Dale et al. beobachteten, dass Histamin einen stimulierenden Effekt auf die glatte Muskulatur des Darms und des Respirationstraktes hat, stimulierend auf die Herzkontraktion wirkt, Vasodepression und ein schockähnliches Syndrom verursacht.
Popielski demonstrierte, dass Histamin dosisabhängig einen stimulierenden Effekt auf die Magensäuresekretion von Hunden hat. Lewis wiederum beschrieb erstmals, dass Histamin einen Effekt auf der Haut hervorruft. Dies zeigte sich durch verschiedene Merkmale, wie geröteter Bereich aufgrund der Vasodilatation und Quaddeln aufgrund der erhöhten Gefäßpermeabilität. Des Weiteren wurde Histamin eine mediatorische Eigenschaft bei anaphylaktischen und allergischen Reaktionen zugeschrieben. Zusätzlich spielt das biogene Amin eine entscheidende Rolle im zentralen Nervensystem (ZNS), unter anderem beim Lernen, bei der Erinnerung, beim Appetit und beim Schlaf-Wach-Rhythmus. Von den zahlreichen physiologischen Effekten des Histamins ist seine Rolle bei Entzündungsprozessen, der Magensäuresekretion und als Neurotransmitter am besten verstanden.
Es ist bekannt, dass die Aktivierung von S1P-Rezeptoren die Expression von profibrotischen Mediatoren, wie dem Bindegewebswachstumsfaktor CTGF, induzieren und deshalb auch eine Rolle bei der Entstehung der Nierenfibrose spielen kann. In diesem Kontext konnte unsere Arbeitsgruppe zeigen, dass die Aktivierung von S1P5 zur TGF-β2-induzierten CTGF-Expression in humanen glomerulären Mesangiumzellen beiträgt (Wünsche et al. 2015). Im Rahmen dieser Doktorarbeit wurde deshalb die Rolle von S1P5 in einem in vivo-Modell zur Nierenfibrose untersucht. Männliche S1P5-/--Mäuse und Wildtypmäuse mit C57BL/6J-Hintergrund wurden mit einer adeninreichen Diät für jeweils 7 und 14 Tage gefüttert, um eine tubulointerstitielle Fibrose hervorzurufen. Die Nieren von unbehandelten Mäusen des jeweiligen Genotyps dienten als Kontrolle. Die Ergebnisse zeigen, dass S1P5-/--Mäuse geringere Kreatininplasmaspiegel und weniger Schäden im Nierengewebe gegenüber Wildtypen zeigten. Darüber hinaus wurde festgestellt, dass die mRNA-Expression von mehreren Fibrosemarkern und proinflammatorischen Zytokinen in den S1P5-/--Mäusen schwächer war als in den Wildtypen. Die Auswertung von histochemischen Färbungen und Western Blots bestätigte diese Beobachtung. Zusammengefasst kann festgehalten werden, dass S1P5 eine wichtige Rolle bei der Entstehung von Adenin-induzierter Entzündung in der Niere und nachfolgender Pathogenese wie Gewebeschäden und Fibrose spielt.
Ceramide sind ein Bestandteil der Lipiddoppelschicht, in allen eukaryotischen Zellen vorhanden und zentrale Moleküle des Sphingolipidstoffwechsels. Die Synthese und der Abbau der Ceramide werden von vielen verschiedenen Enzymen reguliert. Neben ihrer Aufgabe als strukturelle Elemente der Zellmembranen wurde herausgefunden, dass Ceramide auch in verschiedenen Signalwegen involviert sind, die auch bei Nierenerkrankungen eine Rolle spielen. In Bezug auf die Kettenlänge der angehängten Fettsäure können so genannte kurz- und langkettige Ceramide Apoptose induzieren, wohingegen sehr langkettige Ceramide Zellproliferation fördern. In mehreren Studien wurden bereits Konzentrationsänderungen von kettenlängenspezifischen Ceramiden im Plasma und Serum von Patienten gemessen, die zu diesem Zeitpunkt an einer Nierenerkrankung litten. In dieser Arbeit wurde daher untersucht, ob solche Konzentrationsänderungen auch im Nierengewebe von Patienten und Mäusen mit einer Nierenfibrose, dem Kennzeichen nahezu aller chronischen Nierenerkrankungen, zu sehen sind. Zu diesem Zwecke wurden Biopsien der Nierenrinde und des Nierenmarks von fibrotischen Nieren aus Patienten, die an Hydronephrose und/oder Pyelonephritis litten, und von gesunden Gewebeproben untersucht. Letztere wurden durch Nephrektomien zur Behandlung von Nierenkarzinomen gewonnen und dienten als nichtfibrotische Kontrolle. Zum Vergleich mit fibrotischen Nieren aus Mäusen wurden männliche Mäuse der Linie C57BL/6J mit einer adeninreichen Diät für 14 Tage gefüttert. Die Konzentrationen der Sphingolipide wurden mittels Massenspektrometrie gemessen und die Level der fibrotischen Marker wurden mit Hilfe von RT-qPCR und histologischen Färbungen analysiert. Die Ergebnisse zeigen, dass die sehr langkettigen Ceramide Cer d18:1/24:0 und Cer d18:1/24:1 sowohl in fibrotischen Nierenrindenproben der Patienten als auch in fibrotischen Nieren der Mäuse im Vergleich zu den jeweiligen Kontrollproben signifikant geringer konzentriert waren. Diese Effekte korrelieren mit der Hochregulation der Fibrosemarker COL1α1, COL3α1 und αSMA in den fibrotischen Nieren. Es konnte gezeigt werden, dass nur bestimmte Ceramide in fibrotischem Nierengewebe in ihrer Konzentration verändert sind, was interessante Fragen hinsichtlich der Ursache dieser Veränderungen, ihrer funktionellen Aufgabe und zu möglichen Effekten einer Manipulation des Ceramidstoffwechsels mit dem Ziel der Behandlung der Nierenfibrose oder der Entdeckung neuer Biomarker aufwirft. Die hier präsentierten Ergebnisse zeigen zudem die Eignung von in vivo-Mausmodellen als translationalen Ansatz für das Verständnis der Beteiligung von Ceramiden in menschlichen Nierenerkrankungen.
Die in vitro-Untersuchungen zu der Rolle des S1P-Transporters Spns2 haben gezeigt, dass Spns2 die Expression von CTGF nach Stimulation von Mausmesangiumzellen mit TFG-β2 verstärkt. 24 Stunden nach Stimulation war im Zellkulturüberstand von Spns2-/--mMC im Gegensatz zu Spns2+/+-mMC keine Akkumulation des pro-fibrotischen Zytokins CTGF gegenüber der unstimulierten Kontrolle detektierbar. Nach 48 Stunden Stimulation mit TFG-β2 war die Menge an CTGF im Zelllysat als auch im Zellkulturüberstand von Spns2-/--mMC genauso hoch wie in der unstimulierten Kontrolle. Im Zelllysat und im Überstand der Spns2-/--mMC war die Expression von CTGF weiterhin deutlich höher im Vergleich zu den Proben der unstimulierten Zellen. Die basale und TFG-β2-induzierte Genexpression von S1P-synthetisierenden und S1P-degradierenden Enzymen, sowie die Konzentrationen an S1P und Sphingosin in den Zellen unterschieden sich zwischen Spns2-/--mMC und Spns2+/+-mMC nicht.
Die 5-LO ist ein Schlüsselenzym der LT-Biosynthese. Sie katalysiert in einem ersten Schritt zunächst die Umsetzung freigesetzter AA zu 5-HPETE und wandelt diese anschließend in LTA4 um. LT sind starke Entzündungsmediatoren, die an entzündlichen und allergischen Reaktionen des Körpers beteiligt sind. Sie lösen eine Immunantwort aus und können zur Entstehung von Asthma bronchiale, allergischer Rhinitis, Herz-Kreislauf-Erkrankungen und verschiedenen Krebserkrankungen beitragen [28]. NFS gehören zur Klasse der michaelreaktiven Verbindungen und inhibieren die 5-LO durch Interaktion mit katalytisch aktiven Cysteinresten in der Nähe der Substrateintrittspforte. Diese Tatsache macht michaelreaktive Verbindungen innerhalb der Entzündungsforschung zu einer interessanten Substanzklasse. Michaelreaktive Verbindungen besitzen eine durch Elektronenzug aktivierte Doppelbindung. Hierdurch verfügen diese Wirkstoffe über elekrophile Eigenschaften, wodurch sie leicht mit Nukleophilen reagieren können. Cysteine bestehen aus nukleophilen Thiolgruppen, die mit einer positiv polarisierten Doppelbindung, wie sie in michaelreaktiven Verbindungen vorliegt, reagieren können. Diese Tatsache kann sie zu effektiven und nachhaltigen Enzymaktivitätsmodulatoren machen. In dieser Arbeit wurde eine große Bandbreite verschiedenster michaelreaktiver Verbindungen auf ihre Fähigkeit untersucht, die 5-LO über Michael-Addition an ihren Cysteinen zu inhibieren. Zum einen wurden Pflanzeninhaltsstoffe mit antiinflammatorischen Eigenschaften, zugelassenene Wirkstoffe mit Michael-Akzeptorfunktion und zum anderen Verbindungen, die durch gezielte Struktursuche ausgewählt wurden, untersucht. Die Testung verschiedenster Strukturen sollte Aufschluss über strukturelle Voraussetzungen für die 5-LO-Inhibition durch Interaktion mit Cysteinen liefern. Hierfür wurden die Substanzen zunächst im intakten Zellsystem und schließlich am aufgereinigten Enzym (r5LO-wt) auf ihre 5-LO-inhibierenden Eigenschaften untersucht. Nachfolgende Messungen an r5LO-4C, deren vier prominente Cysteine durch Serin mutiert wurden, zeigten an, ob die Inhibition der 5-LO-Produktbildung cysteinabhängig war. Die hierbei erhaltenen Ergebnisse deuten darauf hin, dass ganz bestimmte strukturelle Eigenschaften des Michael-Akzeptors, Voraussetzung für eine Interaktion mit den Cysteinen der 5-LO sind. Vor allem Verbindungen mit chinoidem Grundgerüst stellten sich als thiolreaktive Verbindungen heraus, die die 5-LO hauptsächlich über Interaktion mit ihren Cysteinen inhibierten. Weiterhin zeigten die erhaltenen Ergebnisse, dass die strukturelle Umgebung um die aktivierte Doppelbindung des Michael-Akzeptors enorme Auswirkungen auf die Thiolreaktivität hatte. TQ hemmte die 5-LO hauptsächlich über Interaktion mit Cysteinen, wohingegen die 5-LO-Inhibition durch Embelin unabhängig von Cysteinen zu sein schien. Eine daraufhin durchgeführte MALDI-MS-Analyse bestätigte die Bindung von NAPQI und TQ an die Cysteine 416 und 418. Durch diese Arbeit konnte erstmals gezeigt werden, dass eine Reihe antiinflammatorisch wirksamer, natürlich vorkommender Verbindungen wie TQ, Plumbagin, Primin und auch synthetisch generierte Verbindungen wie AA861, CDDO, Methyl-BQ, Methoxy-BQ, Methoxy-Nitrostyren, NAPQI und OH-BQ die 5-LO über Interaktion mit ihren Cysteinen inhibieren.
The µ-opioid receptor is the primary target structure of most opioid analgesics and thus responsible for the predominant part of their wanted and unwanted effects. Carriers of the frequent genetic µ-opioid receptor variant N40D (allelic frequency 8.2 - 17 %), coded by the single nucleotide polymorphism A>G at position 118 of the µ-opioid receptor coding gene OPRM1 (OPRM1 118A>G SNP), suffer from a decreased opioid potency and from a higher need of opioid analgesics to reach adequate analgesia. The aim of the present work was to identify the mechanism by which the OPRM1 118A>G SNP decreases the opioid potency and to quantify its effects on the analgesic potency and therapeutic range of opioid analgesics.
To elucidate the consequences of the OPRM1 118A>G SNP for the effects of opioid analgesics, brain regions of healthy homozygous carriers of the OPRM1 118A>G SNP were identified by means of functional magnetic resonace imaging (fMRI), where the variant alters the response to opioid analgesics after painful stimulation. Afterwards, the µ-opioid receptor function was analyzed on a molecular level in post mortem samples of these brain regions. Finally, the consequences of the OPRM1 118A>G SNP for the analgesic and respiratory depressive effects of opioids were quantified in healthy carriers and non-carriers of OPRM1 118A>G SNP by means of experimental pain- and respiratory depression-models.
To identify pain processing brain regions, where the variant alters the response to opioid analgesics after painful stimulation, we investigated the effects of different alfentanil concentration levels (0, 25, 50 and 75 ng/ml) on pain-related brain activation achieved by short pulses (300 msec) of gaseous CO2 (66% v/v) delivered to the nasal mucosa using a 3.0 T magnetic head scanner in 16 non-carriers and nine homozygous carriers of the µ-opioid receptor gene variant OPRM1 118A>G. In brain regions associated with the processing of the sensory dimension of pain (pain intensity), such as the primary and secondary somatosensory cortices and the posterior insular cortex, the activation decreased linearly in relation to alfentanil concentrations, which was significantly less pronounced in OPRM1 118G carriers. In contrast, in brain regions known to process the affective dimension of pain (emotional dimension), such as the parahippocampal gyrus, amygdala and anterior insula, the pain-related activation disappeared already at the lowest alfentanil dose, without genotype differences.
Subsequently, we investigated the µ-opioid receptor-expression ([3H]-DAMGO saturation experiments, OPRM1 mRNA analysis by means of RT-PCR), the µ-opioid receptor affinity ([3H]-DAMGO saturation and competition experiments) and µ-opioid receptor signaling ([35S]- GTPγS binding experiments) in post mortem samples of the human SII-region, as a cortical projection region coding for pain intensity, and lateral thalamus, as an important region for nociceptive transmission. Samples of 22 non-carriers, 21 heterozygous and three homozygous carriers of OPRM1 118A>G SNP were included into the analysis. The receptor expression and receptor affinity of both brain regions did not differ between non-carriers and carriers of the variant N40D. In non-carriers, the µ-opioid receptors of the SII-region activated the receptor bound G-protein more efficiently than those of the thalamus (factor 1.55-2.27). This regional difference was missing in heterozygous (factor 0.78-1.66) and homozygous (factor 0.66-1.15) carriers of the N40D variant indicating a reduced receptor-G-protein-coupling in the SII-region.
Finally, the consequences of the alteration of µ-opioid receptor function in carriers and noncarriers of the genetic variant was investigated using pain- and respiratory depression-models. Therefore, 10 healthy non-carriers, four heterozygous and six homozygous carriers of the µ- opioid receptor variant N40D received an infusion of four different concentrations of alfentanil (0, 33.33, 66.66 and 100 ng/ml). At each concentration level, analgesia was assessed by means of electrically (5 Hz sinus 0 to 20 mA) and chemically (200 ms gaseous CO2 pulses applied to the nasal mucosa) induced pain, and respiratory depression was quantified by means of hypercapnic challenge according to Read and recording of the breathing frequency. The results showed that depending on the used pain model, both heterozygous and homozygous carriers of the variant N40D needed 2 – 4 times higher alfentanil concentrations to achieve the same analgesia as non-carriers. This increase seems to be at least for homozygous carriers unproblematic, because to reach a comparable respiratory depression as non-carriers, they needed 10-12 times higher alfentanil concentrations.
The results of this work demonstrate that the µ-opioid receptor variant N40D causes a regionally limited reduction of the signal transduction efficiency of µ-opioid receptors in brain regions involved in pain processing. Thus, the painful activation of sensory brain regions coding for pain intensity is not sufficiently suppressed by opioid analgesics in carriers of the variant N40D. Due to the insufficient suppression in hetero- and homozygous carriers of the variant N40D, the concentration of opioids has to be increased by a factor 2 - 4, in order to achieve the same analgesia as in non-carriers. At the same time, the respiratory depressive effects are decreased to a greater extent in homozygous carriers of the N40D variant as they need a 10 - 12 times higher opioid concentration to suffer from the same degree of respiratory depression as non-carriers. Due to the increased therapeutic range of opioid analgesics, an increase of the opioid dose seems to be harmless, at least for homozygous carriers of the N40D variant.
Ubiquitylation is a three-step process, which results in the attachment of the small protein ubiquitin (Ub) to lysine residues on a substrate protein. SUMO proteins are ubiquitin (Ub)-related modifiers implicated in the regulation of gene transcription, cell cycle, DNA repair and protein localization. The molecular mechanisms by which the sumoylation of target proteins regulates diverse cellular functions remain poorly understood. During my PhD I isolated and characterized SUMO1 and SUMO2 binding motifs. Using Yeast Two Hybrid system, bioinformatics and NMR spectroscopy we defined a common SUMO-interacting motif (SIM) and map its binding surfaces on SUMO1 and SUMO2. This motif forms a β-strand that could bind in parallel or anti-parallel orientation to the β2-strand of SUMO due to the environment of the hydrophobic core. A negative charge imposed by a stretch of neighboring acidic amino acids and/or phosphorylated serine residues determines its specificity in binding to distinct SUMO paralogues and can modulate the spatial orientation of SUMO-SIM interactions. Mutation of the SUMO interacting motif of TTRAP (TRAFS and TNF receptor associated protein) influences both its localization and dynamic behaviour in living cells. Ubiquitin (Ub)-binding domains (UBDs) are key elements in conveying Ub-based cellular signals. UBD-containing proteins interact with ubiquitylated targets and control numerous biological processes including receptor trafficking, DNA repair, virus budding and gene transcription. They themselves undergo UBD-dependent monoubiquitylation, which promotes intramolecular binding of the UBD to the attached Ub and consequently leads to their functional inhibition. During the second part of my PhD I could show that, in contrast to the established ubiquitylation pathway, the presence of UBDs allows the monoubiquitylation of host protein independently of classical E3 ligases. UBDs of different types including UBA, UIM, UBM, NFZ and UBZ, can directly cooperate with E2 Ub-conjugating enzymes to promote monoubiquitylation of their host proteins. Using FRET technology I verified that the E2 enzyme and the substrate directly interact in cells. Moreover, UBD-containing proteins Stam2 and Sts2 promote self-ubiquitylation and not ubiquitylation of other targets or form polyUb chains from free Ub. Our study revealed a yet unappreciated role of E2 enzymes in ubiquitylation reactions of UBD containing proteins.
I-kappaB-Kinase epsilon - ein neues Zielprotein für die Pharmakotherapie bei Schmerz und Entzündung?
(2010)
Der Transkriptionsfaktor NF-kappaB spielt eine wichtige Rolle bei der Regulation von Immunantworten, Apoptose und Entzündungen sowie bei der Entstehung und Verarbeitung von Schmerzen. Ein pharmakologischer Eingriff in die NF-kappaB-Aktivierungskaskade könnte daher eine Schmerzhemmung bewirken und so Ansätze für die Entwicklung neuer Therapien für pathophysiologische Schmerzen liefern. Die NF-kappaB-Signalübertragungskaskade bietet verschiedene Angriffspunkte für Pharmaka, wobei zurzeit IkappaB Kinasen (IKK) als hoffnungsvolle Zielmoleküle im Fokus der Untersuchungen stehen. Verschiedene IKKs regulieren die Aktivität von NF-kappaB über die Phosphorylierung des inhibitorischen Proteins IkappaB oder über die direkte Phosphorylierung von NF-kappaB. In der vorliegenden Arbeit wurde die Rolle der neu entdeckten IKK epsilon bei der Schmerzentstehung und -verarbeitung sowie deren Eignung als neues Zielmolekül für die Schmerztherapie näher untersucht. Es konnte gezeigt werden, dass IKK epsilon konstitutiv in Geweben der Maus, welche an der Entstehung und Verarbeitung von Schmerzen beteiligt sind, exprimiert ist. Im Rückenmark konnte die Lokalisation von IKK epsilon in den schmerzrelevanten Laminae I und II des Dorsalhorns nachgewiesen werden und auch in den Hinterwurzelganglien (Dorsal Root Ganglia (DRG’s)) war IKK epsilon in kleinen, nozizeptiven Neuronen exprimiert. Nach peripherer entzündlich-nozizeptiver Stimulation mit Formalin oder Zymosan kam es im Lumbalmark und den DRG’s zu einem signifikanten Anstieg der IKK epsilon-Expression sowohl auf mRNA- als auch auf Proteinebene. Diese Beobachtungen machten eine Beteiligung von IKK epsilon an der Prozessierung von Schmerz sehr wahrscheinlich. Um die Rolle von IKK epsilon während der Schmerzentstehung und -verarbeitung besser beurteilen zu können wurde das Verhalten von IKK epsilon defizienten Mäusen in akuten und inflammatorischen Schmerzmodellen charakterisiert. Es konnte gezeigt werden, dass der Knockout von IKK epsilon zu einem signifikant verringerten nozizeptiven Verhalten im Formalintest und einer Hemmung der mechanischen Hyperalgesie nach Zymosaninjektion im Vergleich zu Wildtyp-Mäusen führte. Gleichzeitig konnte kein Unterschied im akut nozizeptiven Verhalten festgestellt werden. Der Knockout von IKK epsilon hatte demnach keine Auswirkung auf den akuten physiologischen Nozizeptorschmerz, zeigte jedoch eine Verbesserung bei pathophysiologischen Schmerzen. Das verringerte nozizeptive Verhalten der IKK epsilon defizienten Mäuse im Formalintest ging mit einer Hemmung der NF-kappaB-Aktivierung im Rückenmark einher. Auch konnte eine verringerte mRNA-Expression der NF-kappaB-abhängigen Gene Cyclooxygenase-2 (COX-2), Matrixmetalloprotease-9 (MMP-9) und induzierbare Stickstoffmonoxid-Synthase (iNOS), die an der Regulation von Entzündungsschmerzen beteiligt sind, im Rückenmark und den DRG’s nachgewiesen werden. Da IKK epsilon bisher hauptsächlich mit der Aktivierung des TypI Interferon-Signalweges in Zusammenhang gebracht wurde, wurde außerdem geprüft, ob es nach Injektion mit Formalin zu einer Aktivierung des Trankriptionsfaktors Interferon-regulierender Faktor (IRF)-3 in Wildtyp-Mäusen kommt, was nicht beobachtet werden konnte. Der Knockout von IKK epsilon scheint demnach seine antinozizeptive Wirkung direkt über eine fehlende Aktivierung von NF-kappaB zu entfalten, wonach IKK epsilon eine bedeutendere Rolle als bisher angenommen bei der Aktivierung von NF-kappaB spielt. Dies konnte durch in vitro Daten untermauert werden. Der Knockdown von IKK epsilon in Makrophagen-Zellkultur mit spezifischer siRNA verhinderte die Phosphorylierung von NF-kappaBp65 am Serinrest 536 nach Stimulation mit LPS. Anhand der vorliegenden Daten lässt sich also schlussfolgern, dass IKK epsilon an der Schmerzentstehung und verarbeitung bei Entzündungen beteiligt zu sein scheint. Eine Hemmung dieser Kinase könnte demnach ein neues, lohnendes Ziel für die Entwicklung neuer Medikamente für die Schmerztherapie sein.
Ibuprofen gehört zu den am meisten verwendeten nichtsteroidalen Antiphlogistika (NSAIDs) und ist in niedriger Dosierung von 200-400 mg als sogenanntes OTC (over the counter) Analgetikum frei erhältlich. Obwohl es in den meisten Fällen als razemische Mischung aus S- und R-Ibuprofen verabreicht wird, ist mittlerweile auch das reine S-Ibuprofen (Dexibuprofen) als Medikament erhältlich. Während S-Ibuprofen ein potenter COX-Inhibitor ist, zeigt R-Ibuprofen in den klinisch relevanten Konzentrationen keine COX-Hemmung. Seit längerem ist bekannt, dass NSAIDs bei einer kontinuierlichen Einnahme über mehrere Jahre die Initiierung und Proliferation von Tumoren hemmen. Die Hemmung der Cyclooxygenase wird dabei als ein wichtiger Mechanismus für die antikarzinogene Wirkung angesehen, doch für viele NSAIDs sind auch schon COX unabhängige Mechanismen beschrieben worden. In der vorliegenden Arbeit wurde unter Verwendung zweier Tumorzelllinien mit unterschiedlicher COX-2 Expression und dem Einsatz von beiden Ibuprofen Enantiomeren untersucht, inwieweit COX unabhängige Mechanismen für die antikarzinogenen Effekte von S- und R-Ibuprofen verantwortlich sind. Sowohl die COX-2 defizienten HCT-15 als auch die COX-2 exprimierenden HCA-7 Zellen wurden durch Behandlung mit S- oder R-Ibuprofen in ihrer Proliferaton gehemmt. Dabei führte die Behandlung mit S- und R-Ibuprofen für 24 h zu einem G1-Zellzyklusblock und nach 72 h zu einem signifikanten Anstieg von apoptotischen Zellen, was im Western-Blot Assay durch eine verminderte Cyclin A und B Expression, einer erhöhten Expression des Zellzyklusinhibitors p27KIP1 und PARP-Spaltung bestätigt wurde. Dabei zeigten beide Enantiomere in den Tumorzellen eine gleich starke antiproliferative und apoptotische Wirkung. Eine Messung der intrazellulären S- und R-Ibuprofen Konzentrationen ergab außerdem, dass in den verwendeten Tumorzellen keine unidirektionale Konfigurationsinversion von R- zu S-Ibuprofen stattgefunden hat. In den COX-2 exprimierenden HCA-7 Zellen waren die antikarzinogenen Effekte von S- und R-Ibuprofen schwächer ausgeprägt als in den HCT-15 Zellen, was jedoch auf eine niedrigere intrazelluläre S- bzw. R-Ibuprofen Konzentration zurückzuführen war. Diese Ergebnisse zeigen auf jeden Fall, dass COX unabhängige Mechanismen bei der antikarzinogenen Wirkung von S- und R- Ibuprofen eine Rolle spielen. Dass auch COX abhängige Mechanismen an der antikarzinogenen Wirkung von Ibuprofen beteiligt sind, konnte in verschiedenen Studien gezeigt werden. In der vorliegenden Arbeit wurde eine Abnahme an PGE2 nach S-Ibuprofen Behandlung in den COX-2 exprimierenden Tumorzellen beobachtet. In welchem Ausmaß aber die COX Hemmung an der antikarzinogenen Wirkung von S-Ibuprofen in den COX-2 exprimierenden (Hemmung der PGE2 Synthese) und möglicherweise auch in den COX-2 defizienten Zellen (Anstieg an Arachidonsäure und daraus resultierend an Ceramid) beteiligt war, konnte anhand der Ergebnisse nicht geklärt werden. Es kann jedoch angenommen werden, dass S-Ibuprofen zumindest in den COX exprimierenden HCA-7 Zellen sowohl über COX Hemmung als auch über COX unabhängige Mechanismen antiproliferativ und apoptotisch wirkt. Auch im Tumormodell der Maus wurde bei einer täglichen i.p. Applikation von 15 mg/kg S- oder R-Ibuprofen eine Hemmung des Tumorwachstums beobachtet. Dabei betrug die unidirektionale Inversion von R- zu S-Ibuprofen ca. 54 %. Die Inkubation mit S- bzw. R-Ibuprofen führte in beiden Zelllinien außerdem zu einer Akkumulation des Tumorsuppressors p53, der an der Regulierung von Zellzyklus und Apoptose beteiligt ist. Daher wurde im zweiten Teil der Arbeit untersucht, ob S- und R-Ibuprofen die Induktion von Apoptose und Zellzyklusarrest über die Aktivierung des Transkriptionsfaktors p53 und dessen Zielgene vermitteln. Verwendet wurde eine HCT-116 Zelllinien, in der beide p53 Allele durch homologe Rekombination inaktiviert waren (p53-/-). Im Gegensatz zu den HCT-116 p53wt Zellen führte die Behandlung mit S- bzw. R-Ibuprofen in den p53 defizienten Zellen zu keinem signifikanten G1-Zellzyklusblock und auch die Apoptoserate war in diesen Zellen deutlich geringer als in p53wt Zellen. In vivo zeigte eine tägliche i.p. Injektion von 15 mg/kg S- bzw. R-Ibuprofen bei den Mäusen mit p53-/- Tumoren keine signifikante Wachstumshemmung. Im Vergleich dazu wurde die Proliferation der HCT-116 p53wt Tumore durch die R-Ibuprofen Behandlung signifikant gehemmt, und auch die mit S-Ibuprofen behandelten Tieren zeigten deutlich kleinere Tumore als die Gruppe mit den p53 defizienten Tumoren. Nach der Inkubation mit S- bzw. R-Ibuprofen wurde in beiden HCT-116 Zelllinien eine erhöhte Expression des Membranrezeptors p75NTR beobachtet. Außerdem führte die Behandlung mit S- bzw. R-Ibuprofen in den p53wt Zellen, im Gegensatz zu den p53 defizienten Zellen, zu einer vermehrten Bax Expression und einem Anstieg an Bax Protein in der mitochondrialen Fraktion. Schließlich wurde gezeigt, dass die erhöhte p53 Konzentration in den Zellen zumindest teilweise über den p75NTR Rezeptor reguliert wird, da durch die externe Zugabe des Liganden NGF die Ibuprofen induzierte Akkumulation von p53 in den HCT-116 p53wt Zellen wieder aufgehoben wurde. Da in vitro in den HCA-7 Zellen nicht nur die Behandlung mit S-Ibuprofen, sondern auch die mit R-Ibuprofen zu einer Hemmung der PGE2 Synthese führte, wurde im dritten Teil der Arbeit die Wirkung von S- und R-Ibuprofen auf die Expression der PGE-Synthasen und auf die mPGES-1 Aktivität untersucht. Dabei wurden HeLa Zellen verwendet, deren mPGES-1 Expression durch die Zugabe von IL-1ß und TNF-alpha stimmuliert wurde. Nach gleichzeitiger Inkubation mit S- bzw. R-Ibuprofen wurde keine Inhibierung der mPGES-1, mPGES-2 oder cPGES Expression beobachtet. Auch die Enzymaktivität von mPGES-1 wurde weder durch die Inkubation mit S-Ibuprofen noch mit R-Ibuprofen beeinflußt. Die bei der Inkubation mit R-Ibuprofen auftretende Hemmung der PGE2 Synthese konnte in der vorliegenden Arbeit nicht abschließend erklärt werden und bietet somit einen interessanten Ansatzpunkt für weitere Untersuchungen.
Das Ziel der vorliegenden Arbeit bestand darin, die Wechselwirkung des AD-assoziierten Proteins PS1 mit dem Cytoskelett in verschiedenen biochemischen und immuncytochemischen Modellen zu untersuchen. Auf diese Weise sollten Hinweise für das Verständnis der bisher nur in Grundzügen bekannten physiologischen Funktion von PS1 erhalten werden. Ausgehend vom Nachweis der Anreicherung endoproteolytischer PSI-Fragmente in Cytoskelett-Fraktionen aus Hirngewebe wurde die spezifische Assoziation des Proteins mit Mikrofilamenten, Mikrotubuli und Neurofilamenten untersucht. Alle durchgeführten biochemischen und immuncytochemischen Experimente zeigen übereinstimmend die spezifische Assoziation von PS1 mit Mikrofilamenten. So konnten PSI-Fragmente über zwei Depolymerisations/ Polymerisations-Zyklen zusammen mit Actin aus Rattenhirn aufgereinigt werden. Die spezifische Spaltung von Actin-Filamenten durch Gelsolin in cytoskelettreichen Fraktionen aus Hirngewebe führte zur Freisetzung kürzerer Filamente, die nach Zentrifugation zusammen mit PS1- Fragmenten im Überstand erschienen. In immuncytochemischen Färbungen kolokalisierte PS1 mit Actin-Filamenten in primären Gliazellen und der neuronalen Zelinie NT2. Eine vor kurzem veröffentlichte Arbeit zeigte außerdem die Kolokalisation von PS1 und Mikrofdamenten in primären Hippocampus-Neuronen. Die fehlende Kosedimentation von in-vitro translatiertem PS1 und Deletionskonstrukten von PS1 mit aufgereinigten und in-vitro assemblierten Actin-Filamenten, das Fehlen konservierter Actin-Bindungsmotive in der Aminosäuresequenz von PS1 sowie bekannte Interaktionen von PS1 mit Actin-bindenden Vertretern der Filamin- und Armadillo-Proteinfamilien lassen auf eine indirekte Assoziation von PS1 mit Mikrofdamenten schließen. Die vorliegende Arbeit konnte die Frage, welche Rolle Mikrotuli oder Neurofilamente bei der Cytoskelett-Assoziation von PS1 spielen, nicht abschließend Mären. PS1-Fragemente wurden im ersten, nicht jedoch im zweiten Depolymerisations/Polymerisations-Zyklus zusammen mit Tubulin aus Rattenhirn aufgereinigt. In dem gleichen Versuchsansatz kosedimentierte in-vitro translatiertes PS1 nicht mit Mikrotubuli. Immuncytochemische Färbungen zeigten dagegen die Kolokalisation von PS1 mit Mikrotubuli in primären Hippocampus-Neuronen, die auch von zwei aktuellen Arbeiten in primären Hippocampus-Neuronen und murinen Embryonen bestätigt wurde. Die spezifische Depolymerisation von Mikrotubuli in cytoskelettreichen Fraktionen war unter den in der vorliegenden Arbeit verwendeten Bedingungen nicht erfolgreich, so daß aus diesem Experiment keine Aussagen zur Assoziation von PS1 mit Mikrotubuli abgeleitet werden konnten. Es Iäßt sich die Hypothese aufstellen, daß sehr kleine PSI-haltige Vesikel über andere Proteine als PS1 mit Mikrotubuli verbunden sind, so daß PS1 mit Mikrotubuli scheinbar kolokalisiert ist. Hochauflösenden lichtmikroskopische bzw. elektronenmikroskopische Aufnahmen oder biochemische Versuche, die nicht zur Zerstörung der Vesikel durch Detergens führen, könnten für die Überprüfung dieser Hypothese herangezogen werden. In-vitro translatiertes PS1 sowie Deletionskonstrukte von PS1 kosedimentierten nicht mit aufgereinigten und in-vitro assemblierten Neurofilamenten, und in primären Hippocampus-Neuronen kolokalisierte PS1 nicht mit Neurofilamenten. Es wäre jedoch wünschenswert, die Experimente mit geeigneten Positiv-Kontrollen für die Kosedimentation und geeigneteren Antikörpern, die bei einem besseren Signal/Hintergrund-Verhältnis eine stärkere Vergrößerung der Immunfluoreszenzen erlauben, zu wiederholen. Im transgenen Tiermodell beeinträchtigten pathogene Mutationen von PS1 nicht, zumindest nicht quantitativ, die Fähigkeit von PS1, an Cytoskelett-Elemente zu binden. Es wäre jedoch möglich, daß es Unterschiede in der Cytoskelett-Assoziation von wt PS1 und PS1 mit pathogenen Mutationen gibt, die nur im Gewebe von FAD-Patienten zu detektieren sind, nicht aber im transgenen Tiermodell, da die bisher bekannten AD-Tiermodelle nicht alle Aspekte der Erkrankung reproduzieren. Die vorliegenden Ergebnisse können die Basis bilden für weitergehende Untersuchungen zur Funktion von PS1 und der Bedeutung von PS1-Cytoskelettinteraktionen in der Alzheimer Demenz. Aktuelle Arbeiten fokussieren dabei stark auf die Interaktion von PS1 mit Mikrofilament-bindenden Vertretern der Armadillo-Proteinfamilie, die bei Zell-Zell-Adhäsionsprozessen eine wichtige Rolle spielen. Im Diskussionsteil wurde ausgeführt, daß aber, gerade im Hinblick auf die Neurodegeneration bei der Alzheimer Demenz, ein möglicher Einfluß von PS1 auf den schnellen axonalen Transport ein interessanter Ansatz für weitere Versuche sein kann.
LC-MS/MS-Systeme haben sich in den vergangenen Jahren trotz der hohen Anschaffungskosten von mehreren hunderttausend Euro zu einer Standardmethode in analytischen Laboratorien entwickelt und bieten im Vergleich zu herkömmlicher HPLC mit UV- und Fluoreszenz-Detektoren eine höhere Sensitivität und bessere Selektivität. Aufgrund dieser Vorteile war es das Ziel dieser Arbeit, verschiedene LC-MS/MS-Methoden zu entwickeln, mit der Eicosanoide sensitiv und selektiv in verschiedenen biologischen Flüssigkeiten quantifiziert werden können und diese Assays dann in biologischen Fragestellungen einzusetzen. Ein Problem der Eicosanoidanalytik mittels LC-MS/MS besteht in der Strukturähnlichkeit vieler Prostaglandine, die große Schwierigkeiten während einer Methodenentwicklung verursachen. Zwei sehr wichtige Prostaglandine, PGE2 und PGD2, besitzen das gleiche Fragmentspektrum und können nicht über das Selektionsprinzip des Tandem-Massenspektrometers quantifiziert werden, sondern müssen vor der Detektion chromatographisch getrennt werden. Die chromatographischen Bedingungen, die für eine Trennung von PGE2 und PGD2 nötig sind, gehen allerdings mit einem erheblichen Empfindlichkeitsverlust des Massenspektrometers einher. Die beste Empfindlichkeit wurde mit einem neu entwickelten Säulenmaterial, Synergi Hydro-RP, erreicht, was in allen entwickelten Methoden verwendet wurde. Zur Quantifizierung von PGE2 und PGD2 in Mikrodialysaten (max. Volumen 75 µl) musste eine Empfindlichkeit von mindestens 40 pg/ml PGE2 erreicht werden. Nach der Validierung des Systems konnte eine Quantifizierungsgrenze von PGE2 und PGD2 von 25 pg/ml bzw. 50 pg/ml erreicht werden. Bei Formalin-behandelten Ratten stieg PGE2 innerhalb von 15 Minuten auf 380 pg/ml an, womit frühere Ergebnisse, die auf der Verwendung von Immunoassays basieren, bestätigt werden konnten. Für PGD2 konnte kein Unterschied zu Kontroll-Ratten festgestellt werden und ist deswegen im Gegensatz zu PGE2 nicht an der Nozizeption im untersuchten Modell beteiligt. Mit Hilfe des mPGES-1-Enzym-Assays wurde mPGES-1 als ein weiteres Target für die drei COX-Inhibitoren Celecoxib, R- und S-Flurbiprofen identifiziert. Da mit Celecoxib ab einer Konzentration von 100 µM keine weitere Hemmung der mPGES-1 erreicht werden kann, hemmt Celecoxib die mPGES-1 wohl nicht kompetitiv und bindet nicht im katalytischen Zentrum der mPGES-1. Für Rofecoxib und Paracetamol konnte keine Hemmung der mPGES-1 festgestellt werden. Während der Methodenentwicklung wurde ein Störpeak zwischen PGE2 und PGD2 beobachtet, der in den Versuchen immer im gleichen Verhältnis zu PGE2 gebildet wurde. Mit Hilfe eines Fingerprints wurde dieser Störpeak als 5-trans-PGE2 identifiziert, welches ein bisher nicht beschriebenes Nebenprodukt der mPGES-1 zu sein scheint. In der letzten Methode sollte eine Methode entwickelt werden, mit der PGE2, PGD2, PGF2alpha, 6-keto-PGF1alpha und TXB2 in Humanplasma bestimmt werden können. Im direkten Vergleich war die validierte LC-MS/MS-Methode einem handelsüblichen Immunoassay überlegen. Zum einem waren die Standardabweichungen der LC-MS/MS-Methode wesentlich niedriger und zum anderen waren die Basalwerte des Immunoassays unphysiologisch hoch. In einer Studie wurde der Einfluss einer Mutation (-765G -> C) im Promotor der COX-2 auf die COX-2-Aktivität untersucht, für die eine reduzierte COX-2-Expression um den Faktor 2 in Monozyten beschrieben wurde. Zwischen den 2 Gruppen konnten weder in den Prostaglandin-Konzentrationen, der COX-2-mRNA-Expression noch in der COX-2-Protein-Expression statistische Unterschiede festgestellt werden und stehen damit im Widerspruch zu bisherigen Veröffentlichungen. Die entwickelten LC-MS/MS-Methoden ermöglichen eine bessere Sensitivität und schnellere Analysenzeiten im Vergleich zur HPLC und durch ihre gute Sensitivität kann der Einsatz von problematischen Immunoassays vermieden werden. Im Falle der Mikrodialysemethode, wo PGE2 in einer relativ einfachen Matrix bestimmt werden sollte (ACSF), liefert die LC-MS/MS-Methode die gleichen Ergebnisse. Im Falle von Humanplasma ist der Immunoassay allerdings unbrauchbar. Ein weiterer Vorteil der LC-MS/MS-Methoden gegenüber Immunoassays besteht darin, dass mehrere Prostaglandine in einer einzigen Probe bestimmt werden können. Gegenüber GC-MS und GC-MS/MS-Methoden fehlt den LC-MS/MS-Methoden zwar einiges an Empfindlichkeit, allerdings wird hierfür keine Derivatisierung benötigt.
Bei inflammatorischen Schmerzen kann durch Hemmung der COX-2 im Rückenmark die zentrale Sensibilisierung reduziert werden. Da die Hemmung der gesamten COX-2 vermittelten Prostaglandinsynthese jedoch zahlreiche unerwünschte Nebenwirkungen verursacht, wird in jüngster Zeit diskutiert, ob eine selektive Hemmung der PGE2 Synthese auf Ebene der mPGES-1 für die Therapie passagerer Schmerzen sinnvoller ist. Um die funktionellen Rollen von COX-2 und mPGES-1 im Rückenmark zu charakterisieren, wurden in der vorliegenden Arbeit die Folgen einer COX-Inhibierung und mPGES-1-Deletion auf den spinalen Eicosanoidmetabolismus, die neuronale Erregbarkeit, die Synthese proinflammatorischer Zytokine und das nozizeptive Verhalten untersucht. Das proinflammatorische Zytokin TNFa induzierte in primären Rückenmarksneuronen eine COX-2- und mPGES-1-Expression und eine erhöhte PGE2 Synthese. Diese Induktion der PGE2 Synthese konnte durch den selektiven COX-2 Inhibitor Rofecoxib und den „selektiven COX-1 Inhibitor“ SC-560 gleichermaßen potent gehemmt werden. Da der Effekt von SC-560 unerwartet war, wurde sein Wirkmechanismus genauer untersucht. Es konnte gezeigt werden, dass SC-560 in Rückenmarkskulturen weder die COX-2 und mPGES-1 Expression, die PLA2 Aktivität, die mPGES-1 Aktivität noch den PGE2 Transport hemmte. Durch Experimente mit Zellen aus COX-1-/- Mäusen konnte gezeigt werden, dass SC-560 in Rückenmarkskulturen die COX-2 unabhängig von COX-1 in nanomolaren Konzentrationen inhibiert. Da dieses Ergebnis den postulierten COX-1-selektiven Eigenschaften von SC-560 widersprach, wurde nach der Ursache für den Verlust der COX-1-Selektivität gesucht. Es zeigte sich, dass SC-560 in einer zellfreien in vitro Synthese und im Vollbluttest mit klarer Selektivität COX-1 hemmt. In kultivierten Rückenmarkszellen, RAW-Makrophagen und Blutzellen (Monozyten und Thrombozyten) inhibiert SC-560 allerdings d beide COX-Isoformen potent. Es wurde dadurch deutlich, dass die zelluläre Einbindung von COX-2 sowie ein niedriger Proteingehalt im extrazellulären Medium die halbmaximalen Konzentrationen (IC50) für die COX-2-Hemmung durch SC-560 stark reduzieren kann und hierdurch die COX-1-Selektivität der Substanz verloren geht. Neben einer COX-2 Hemmung verursachte auch eine mPGES-1-Deletion in Rückenmarkskulturen sowie im adulten Rückenmark eine Reduktion der PGE2 Synthese. Überrachenderweise bewirkte jedoch die mPGES-1-Defizienz im Gegensatz zur COX-2 Hemmung durch Etoricoxib im Zymosanmodell keine Reduktion der mechanischen Hyperalgesie. Um die Ursache für die unterschiedliche antihyperalgetische Wirkung der COX-2-Hemmung und mPGES-1-Deletion zu finden, wurden zunächst die Konsequenzen für die gesamte Prostaglandinsynthese untersucht. Die Analyse mittels LC-MS/MS zeigte, dass im Rückenmark mPGES-1-defizienter Mäuse verstärkt PGI2, PGF2a und PGD2 synthetisiert wird. Da für alle drei Prostaglandine bereits pronozizeptive Effekte beschrieben wurden, wurde die Expression von den entsprechenden Rezeptoren im Rückenmark und die Konsequenzen der Rezeptoraktivierung auf die neuronale Erregbarkeit untersucht. Mittels „calcium imaging“ wurde demonstriert, dass selektive IP Rezeptoragonisten in Rückenmarksneuronen eine PKA und PKC vermittelte Phosphorylierung der NMDA Rezeptoren verursachen und die Aktivierbarkeit der NMDA Rezeptoren sensibilisieren. Eine Verstärkung des NMDA induzierten Calciumeinstromes konnte nach Applikation der anderen Prostaglandine nicht beobachtet werden. Die Ergebnisse zeigen daher, dass in mPGES-1-defizienten Mäusen durch die Umleitung der Prostaglandinsynthese zu Prostacyclin die exzitatorischen NMDA Rezeptoren sensibilisiert und hierdurch die antihyperalgitische Wirkung von PGE2-Synthesehemmung kompensiert werden kann. Zusammenfassend lässt sich aus den Ergebnissen schlussfolgern, dass mPGES-1 als Zielmolekül für die Schmerztherapie eher nicht eignet ist. mPGES-1-defiziente Tiere zeigten in inflammatorischen Schmerzmodellen ein normales nozizeptives Verhalten. Dies kann dadurch erklärt werden, dass es nach einer mPGES-1 Deletion im Rückenmark zwar zur Reduktion der PGE2 Synthese aber auch gleichzeitig zur verstärkten Synthese anderer pronozizeptiv wirkender Prostaglandine kommt.
Das Enzym 5-Lipoxygenase (5-LO) spielt eine essentielle Rolle in der Biosynthese der Leukotriene, bioaktiver Metabolite der Arachidonsäure (AA), die an einer Vielzahl entzündlicher und allergischer Erkrankungen beteiligt sind. Die 5-LO wird bevorzugt in Zellen myeloiden Ursprungs wie Granulozyten, Monozyten oder B-Lymphozyten exprimiert. In die Regulation der zellulären 5-LO-Aktivität in der Epstein-Barr Virus-transformierten B-lymphozytären Zelllinie BL41-E95-A sind Caspasen, Aspartat-spezifische Cysteinproteasen, involviert. Das Passagieren von BL41-E95-A führt zu einer Erhöhung der Proliferationsrate der B-Lymphozyten sowie zu einem deutlichen Verlust der 5-LO-Aktivität, der mit dem Auftreten eines 62 kDa-Spaltproduktes der 5-LO und einer signifikanten Aktivitätserhöhung der Caspase-8 und -6 korreliert. Isolierte humane 5-LO wird durch rekombinante Caspase-6 zwischen Asp170 und Ser171 zu einem 58 kDa-Fragment in vitro gespalten, wobei das Tetrapeptid VEID170 innerhalb der 5-LO als Erkennungsmotiv für den Angriff der Caspase-6 dient. In einigen weiteren untersuchten Zelllinien wie Mono Mac 6 (MM6), RBL-1, PMNL oder HeLa, die nicht den B-Lymphozyten angehören, konnte die 5-LO-Spaltung weder durch das Passagieren von Zellen noch durch die Behandlung mit diversen proapoptotischen Agentien ausgelöst werden. Laut Ergebnissen aus in vitro-Untersuchungen scheinen 5-LO-positive HeLa- bzw. MM6-Zellen einen Faktor zu exprimieren, der die 5-LO direkt oder indirekt vor dem Angriff der Caspase-6 und anschließender Prozessierung schützt. Die in den BL41-E95-A-Zellen beobachtete Aktivierung der Caspasen mit anschließender Prozessierung der 5-LO lässt sich durch zwei Pflanzeninhaltsstoffe supprimieren, das Hyperforin (HP) aus Johanniskraut-Extrakten und das Myrtucommulon (MC) aus Myrte-Blättern. Beide Verbindungen scheinen in B-Lymphozyten zu einer Hemmung der Caspasen-Aktivierung zu führen. Nichtsdestotrotz führt die Behandlung der B-Lymphozyten mit HP bzw. MC zu einem apoptotischen Tod der Zellen. Offensichtlich wird dabei ein (unbekannter) einzigartiger Mechanismus der Apoptose-Induktion ausgelöst. In der vorliegenden Arbeit konnte zum ersten Mal eine potente Apoptose-induzierende Wirkung des natürlich vorkommenden Myrtucommulons auf Krebszelllinien gezeigt werden. In allen getesteten Krebszelllinien führte Myrtucommulon zum Zelltod, wobei die HL-60-Zellen mit einem IC50-Wert von 3,26 ± 0,51 µM MC am sensitivsten gegenüber MC-Einfluss waren. Zusätzlich konnte in HL-60- und MM6-Zellen nach MC-Behandlung neben einer erhöhten Caspasen-Aktivität und PARP-Spaltung ein signifikanter DNA-Abbau detektiert werden. Von besonderer Bedeutung ist die Tatsache, dass die zytotoxische MC-Wirkung eine bemerkenswerte Selektivität für entartete Zelllinien zu besitzen scheint und gegenüber nicht-transfizierten Zellen minimal ist.
Mukoviszidose oder zystische Fibrose (CF) ist die häufigste autosomal-rezessiv Erbkrankheit in der westlichen Welt. Sie wird durch Mutationen in einem Gen verursacht, das den „Cystic Fibrosis Transmembran Conductance Regulator“ (CFTR) kodiert. Das CFTR-Protein ist zum einen ein epithelialer Chloridkanal, zum anderen aber auch ein Regulator zahlreicher anderer epithelialer Ionenkanäle und Transporter. Der Ausfall des CFTR-Proteins verursacht eine Multiorganerkrankung, bei der vorwiegend sekretorische Funktionen beeinträchtigt sind. Besonders betroffen sind Lunge und Pankreas, wobei die Beteiligung der Lunge maßgeblich für die Ausprägung der Erkrankung und deren Letalität ist. Die Mehrzahl der Patienten leidet unter rezidivierenden bronchopulmonalen Infektionen und einer exzessiven pulmonalen Inflammation. Einen wesentlichen Beitrag zur Zerstörung der Lunge liefern dabei jedoch körpereigene neutrophile Granulozyten, die in großer Zahl in die Lunge eindringen, ohne jedoch den Erreger beseitigen zu können. Neuere Studien lassen darauf schließen, dass neben den neutrophilen Granulozyten auch Lymphozyten eine wichtige Rolle in der Pathogenese der Erkrankung spielen. Entzündungsmarker wie Zytokine und Eicosanoide sind nicht nur lokal in den Atemwegen erhöht, sondern auch systemisch, was auf einen generalisierten Entzündungsstatus hinweist. Die Ursache der gestörten Immunantwort bei CF sind immer noch unbekannt und erfordern weitere Untersuchungen. Das Ziel unserer Studien war die vergleichende Untersuchung der Expression und Aktivität der Peroxisom Proliferator-Aktivierten Rezeptoren (PPARs) sowie der 15-Lipoxygenase-1, einem Schlüsselenzym im Eicosanoidstoffwechsel, zwischen Patienten mit CF und gesunden Probanden. Da bekannt ist, dass PPARs sowie die 15-LO-1 in entzündlichen Prozessen regulatorische Funktionen besitzen, und man zudem annimmt, dass CF auf eine übermäßige Immunreaktion zurückzuführen ist, vermuten wir für PPARs bzw. 15-LO-1 ein verändertes Expressionsmuster. Eicosanoide sind wichtige Mediatoren und Modulatoren der inflammatorischen Antwort. Sie sind Derivate mehrfach ungesättigter Fettsäuren. Eine wichtige Rolle spielen sie bei der Thrombozytenaggregation, Kontraktion der glatten Muskulatur, Chemotaxis der Leukozyten, Zytokinproduktion, Schmerzübertragung sowie der Entstehung von Fieber. Einige Eicosanoide verursachen proinflammatorische, andere antiinflammatorische Aktionen, wiederum andere können beides verursachen. Arachidonsäure (AA), eine n-6 mehrfach ungesättigte Fettsäure (PUFA), ist der Vorläufer für potente proinflammatorische Eicosanoide wie Prostaglandin E-2, Thromboxan A2 und Leukotrien B4 und ist in der Phospholipidschicht der Zellmembran gebunden. n-3 PUFA’s wie Docosahexaenoicsäure (DHA) und Eicosapentaensäure werden zu Eicosanoiden wie Prostaglandin E-3, Thromboxan A3 und Leukotrien B5 metabolisiert. DHA besitzt antiinflammatorische Eigenschaften, indem es mit AA um die Aufnahme/Verbindung in die Zellmembran konkurriert, dabei werden die AA Spiegel herunterreguliert. Veränderungen beim Stoffwechsel der Fettsäuren und Eisosanoide wurden bei CF-Patienten von verschiedenen Gruppen beschrieben. Zusätzlich zu dem erhöhten Spiegel proinflammatorischer Leukotriene in Atemwegen, Urin und Serum, wurden erniedrigte Spiegel von DHA im Plasma und übermäßige Freisetzung von AA aus der Zellmembran für CF beschrieben. Desweiteren wurden erhöhte Mengen membrangebundener AA und erniedrigte Mengen membrangebundener DHA in den von CF betroffenen Organen beschrieben. Veränderungen des Fettsäure-Haushalts sind von besonderem Interesse, weil sie die bei CF vorliegender Fehlregulation inflammatorischer Prozesse erklären könnten. Sie sind auch natürliche Liganden von Peroxisom Proliferator-Aktivierten Rezeptoren und darüber hinaus an der Regulation von Entzündungsprozessen beteiligt. Zum gegenwärtigen Zeitpunkt sind drei unterschiedliche PPAR-Isoformen identifiziert, PPAR alpha, beta und gamma. Sie sind Transkriptionsfaktoren, die zu der Superfamilie der nukleäreren Rezeptoren gehören, und werden durch endogene Liganden wie Fettsäuren und Eicosanoide aktiviert. Es wurde gezeigt, dass PPARalpha und –gamma antiinflammatorische Aktivität besitzen, die auf Monozyten, Makrophagen, Lymphozyten, glatte Muskelzellen und Endothellzellen wirkt. Ein Modell dazu ist eine durch PPARalpha und -gamma vermittelte Hemmung der proinflammatorischen Eigenschaften des nuklearen Faktor-kappaB (NF-kappaB) und des aktivierenden Proteins-1 (AP-1). Beides sind Transkriptionsfaktoren, die eine Schlüsselrolle bei der inflammatorischen Antwort spielen, indem sie die Expression von Zytokinen, Chemokinen, Zelladhäsionsmolekülen und Wachstumsfaktoren veranlassen. Die PPARs werden unter anderem in peripheren Blutzellen exprimiert. Da die Spiegel einiger endogener Aktivatoren der PPARs bei CF verändert zu sein scheinen, sollte in der vorliegenden Arbeit ein Einfluss auf Expression und Funktion der PPARs untersucht werden. In der vorliegenden Arbeit wurden Patienten mit CF untersucht, die sich in einem stabilen Zustand befanden und im Rahmen von Routineuntersuchungen in die Klinik kamen. Da die CF-Patienten in unserer Klinik nicht bronchoskopiert werden, konnte kein Versuchsmaterial aus den Atemwegen gewonnen werden. Dennoch gehen wir aufgrund der erhöhten Entzündungsmarker im Blut der CF-Patienten davon aus, dass die Entzündungsreaktionen nicht auf den Respirationstrakt beschränkt sind. Auch in unserer Studie zeigten sich erhöhte IL-8 Spiegel im Plasma von Patienten mit CF. Dies unterstützt die Ergebnisse anderer Arbeitsgruppen und weist auf systemische proinflammatorische Vorgänge hin. Das Blut wurde über Venenpunktion erhalten. Monozyten, Lymphozyten und neutrophile Granulozyten wurden isoliert und untersucht, da sie aufgrund der Freisetzung von Zytokinen, Chemokinen und durch die Produktion von Antikörpern, wichtige Mediatoren in der Immunantwort sind. Die PPAR mRNA Expression wurde in Monozyten und Lymphozyten mittels RT-kompetitiver Multiplex PCR gemessen und mittels RT-Real-time PCR in neutrophilen Granulozyten. Die PPARgamma Spiegel in diesen Zellen lagen unterhalb der Nachweisgrenze. Die statistische Analyse zeigte dass in Lymphozyten von CF-Patienten gegenüber Gesunden PPARalpha mRNA, aber nicht PPARbeta mRNA, signifikant erniedrigt exprimiert wird (-37%). Die gleiche Differenz konnte auf Proteinebene mit Hilfe von Western Blots detektiert werden. Hinsichtlich der Expression von PPARalpha und PPARbeta zeigten sich in Monozyten und Neutrophilen zwischen CF-Patienten und Gesunden keine signifikanten Unterschiede. Unseren Daten werden von verschiedenen Studien unterstützt. Zum ersten gibt es Hinweise, dass PPARalpha mRNA- und Protein-Expression von ihren eigenen Liganden direkt reguliert werden. Bei Patienten mit CF zeigen sich für die natürlichen Liganden, Eicosanoide und Fettsäuren, veränderte Spiegel, was zu einer verringerten Expression von PPARalpha beitragen könnte. Zum zweiten, da bekannt ist, dass die PPARalpha-Expression in proinflammatorisch aktivierten T-Lymphozyten herunterreguliert ist, wurde zusätzlich überprüft, ob die Lymphozyten von CF-Patienten aktiviert sind. Interleukin-2 Rezeptor im Serum (sIL-2 R) ist ein allgemein anerkannter Marker der Aktivierung von Lymphozyten. Tatsächlich zeigte sich, dass die Konzentration von sIL-2 R im Serum der vorliegenden CF Patienten erhöht ist, was mit den Erkenntnissen anderer Arbeitsgruppen übereinstimmt 128-130. Die verstärkte Aktivierung von Lymphozyten in CF-Patienten könnte eine Erklärung für die erniedrigten PPARalpha-Spiegel bieten. Der verantwortliche Mechanismus dafür ist bis jetzt noch nicht bekannt. Drittens wurde für die proinflammatorischen Zytokine IL-6, TNF-alpha und IL-1 gezeigt, dass sie eine Reduktion der PPARalpha Expression verursachen können. CF-Patienten zeigen erhöhte Spiegel von IL-2, TNF-alpha, IL-6 und IL-8 im Sputum und Serum. Konsequenterweise kann die PPARalpha Expression durch die erhöhten Zytokinspiegel im Serum herunter reguliert werden. Eine weitere Unterstützung der vorliegenden Ergebnisse ergibt sich aus einem Kongressbeitrag von Andersson et al., die über eine epitheliale CF-Zelllinie berichten, die weniger PPARalpha-Protein exprimiert als eine normale epitheliale Zelllinie. Dieselbe Forschungsgruppe fand erniedrigte PPARgamma-Spiegel im CF-Maus-Modell in Geweben, die speziell durch CFTR reguliert werden und ihre Daten weisen darauf hin, dass CFTR eine Rolle bei der PPAR Expression spielen kann. Ein funktionales CFTR-Protein wird auch in Lymphozyten von Gesunden exprimiert. Folglich könnte ein defektes CFTR auch in CF-Lymphozyten für die veränderterte PPARalpha-Expression verantwortlich sein. Ob die beschriebene Veränderung der Menge an PPARalpha mRNA und Protein auch auf funktioneller Ebene zum Tragen kommt, wurde durch immunhistometrische Untersuchungen und die Bestimmung der DNA-Bindungsaktivität des Transkriptionsfaktors überprüft. Die immunhistometrischen Untersuchungen zeigten, dass PPARalpha sowohl bei Gesunden als auch bei CF-Patienten hauptsächlich im Cytosol lokalisiert ist und dass sich nur ein kleiner Teil im Nukleus befindet. Eine Quantifizierung war hierbei nicht möglich. Über eine ähnliche zelluläre Verteilung wurde in humanen Makrophagen wie auch in Mäuselymphozyten berichtet. Die DNA-Bindungstudien zeigten, dass die PPARalpha DNA-Bindungsaktivität in Lymphozyten von CF-Patienten gegenüber Kontrollpersonen um 36% signifikant erniedrigt war. Eine erniedrigte DNA-Bindungsaktivität bei CFTR knock-out Mäuse wurde auch für PPARgamma berichtet. Die Bindungsaktivität konnte wiederhergestellt werden, nachdem die Mäuse mit Troglitazon, einem PPARgamma Agonist, behandelt wurden. Darüber hinaus werden mit hoher Wahrscheinlichkeit auch die Veränderungen des Eicosanoidhaushalts bei CF zu der Verminderung sowohl der Expression als auch der Aktivität von PPARalpha beitragen. Hier ist besonders die bei CF verminderter Menge des PPARalpha–Liganden DHA hervorzuheben. Eine ligandeninduzierte Aktivierung von PPARalpha führt zu einer Abnahme verschiedener proinflammatorische Zytokine in Lymphozyten. Dies geschieht vermutlich über eine Antagonisierung der Aktivität von NF-kappaB. PPARalpha hat einen signifikanten Einfluss auf die Immunantwort. Somit könnte die bei CF-Patienten verminderte PPARalpha-Expression und -Funktion ursächlich oder mitverantwortlich für die inflammatorischen Vorgänge bei CF sein. Die vorliegenden Ergebnisse weisen darauf hin, dass die Regulierung der Aktivität von PPARalpha durch die Zugabe von DHA oder andere Liganden eine sinnvolle Therapieoption sein kann. Es sollte in weiterführenden Versuchen geklärt werden, ob eine Therapie mit PPARalpha-Aktivatoren einen Einfluss auf die inflammatorischen Vorgänge bei CF haben kann. Im zweiten Teil der Arbeit wurde untersucht ob CF einen Defekt in der Expression von 15-Lipoxygenase-1 (15-LO-1) verursacht. 15-LO-1 ist ein Schlüsselenzym für die Synthese einiger Eicosanoide wie z.B. 15(S)-HETE und Lipoxin A4. Beide Eicosanoide spielen eine wichtige Rolle in inflammatorischen Vorgängen in der menschlichen Lunge. 15(S)-HETE ist ein von der Arachidonsäure abgeleitetes Eicosanoid, das sich in hoher Konzentration in eosinophilen Granulozyten und Atemwegsepithelien findet. 15(S)-HETE wirkt in den Atemwegen stark mukosekretolytisch und bronchokonstriktorisch. Zum anderen inhibiert 15(S)-HETE die durch die 5-Lipoxygenase katalysierte Konversion von Arachidonsäure zu proinflammatorischen Mediatoren wie LTB4 in neutrophilen Granulozyten. Dies führt zu einer Reduktion der neutrophilen Chemotaxis. Es liegen bisher keine Daten zu 15-HETE-Spiegel in der CF-Lunge vor. Lipoxin A4 verursacht ebenfalls eine Reduktion der Chemotaxis von neutrophilen Granulozyten, supprimiert darüber hinaus aber schon deren Aktivierung. Neben einer direkten Wirkung auf die neutrophilen Granulozyten, sind dabei auch indirekte Effekte beteiligt, wie zum Beispiel die Reduktion der broncho-epithelialen Ausschüttung von IL-8, als einem potenten Chemoattraktor und Aktivator neutrophiler Granulozyten. Tatsächlich ist die Konzentration des anti-inflammatorisch wirksamen LXA4 in der Atemwegsflüssigkeit von CF-Patienten reduziert. Die Expression von15-LO-1 in peripheren Blutzellen ist im Wesentlichen auf die eosinophilen Granulozyten beschränkt. Deren Mukoviszidose oder zystische Fibrose (CF) ist die häufigste autosomal-rezessiv Erbkrankheit in der westlichen Welt. Sie wird durch Mutationen in einem Gen verursacht, das den „Cystic Fibrosis Transmembran Conductance Regulator“ (CFTR) kodiert. Das CFTR-Protein ist zum einen ein epithelialer Chloridkanal, zum anderen aber auch ein Regulator zahlreicher anderer epithelialer Ionenkanäle und Transporter. Der Ausfall des CFTR-Proteins verursacht eine Multiorganerkrankung, bei der vorwiegend sekretorische Funktionen beeinträchtigt sind. Besonders betroffen sind Lunge und Pankreas, wobei die Beteiligung der Lunge maßgeblich für die Ausprägung der Erkrankung und deren Letalität ist. Die Mehrzahl der Patienten leidet unter rezidivierenden bronchopulmonalen Infektionen und einer exzessiven pulmonalen Inflammation. Einen wesentlichen Beitrag zur Zerstörung der Lunge liefern dabei jedoch körpereigene neutrophile Granulozyten, die in großer Zahl in die Lunge eindringen, ohne jedoch den Erreger beseitigen zu können. Neuere Studien lassen darauf schließen, dass neben den neutrophilen Granulozyten auch Lymphozyten eine wichtige Rolle in der Pathogenese der Erkrankung spielen. Entzündungsmarker wie Zytokine und Eicosanoide sind nicht nur lokal in den Atemwegen erhöht, sondern auch systemisch, was auf einen generalisierten Entzündungsstatus hinweist. Die Ursache der gestörten Immunantwort bei CF sind immer noch unbekannt und erfordern weitere Untersuchungen. Das Ziel unserer Studien war die vergleichende Untersuchung der Expression und Aktivität der Peroxisom Proliferator-Aktivierten Rezeptoren (PPARs) sowie der 15-Lipoxygenase-1, einem Schlüsselenzym im Eicosanoidstoffwechsel, zwischen Patienten mit CF und gesunden Probanden. Da bekannt ist, dass PPARs sowie die 15-LO-1 in entzündlichen Prozessen regulatorische Funktionen besitzen, und man zudem annimmt, dass CF auf eine übermäßige Immunreaktion zurückzuführen ist, vermuten wir für PPARs bzw. 15-LO-1 ein verändertes Expressionsmuster. Eicosanoide sind wichtige Mediatoren und Modulatoren der inflammatorischen Antwort. Sie sind Derivate mehrfach ungesättigter Fettsäuren. Eine wichtige Rolle spielen sie bei der Thrombozytenaggregation, Kontraktion der glatten Muskulatur, Chemotaxis der Leukozyten, Zytokinproduktion, Schmerzübertragung sowie der Entstehung von Fieber. Einige Eicosanoide verursachen proinflammatorische, andere antiinflammatorische Aktionen, wiederum andere können beides verursachen. Arachidonsäure (AA), eine n-6 mehrfach ungesättigte Fettsäure (PUFA), ist der Vorläufer für potente proinflammatorische Eicosanoide wie Prostaglandin E-2, Thromboxan A2 und Leukotrien B4 und ist in der Phospholipidschicht der Zellmembran gebunden. n-3 PUFA’s wie Docosahexaenoicsäure (DHA) und Eicosapentaensäure werden zu Eicosanoiden wie Prostaglandin E-3, Thromboxan A3 und Leukotrien B5 metabolisiert. DHA besitzt antiinflammatorische Eigenschaften, indem es mit AA um die Aufnahme/Verbindung in die Zellmembran konkurriert, dabei werden die AA Spiegel herunterreguliert. Veränderungen beim Stoffwechsel der Fettsäuren und Eisosanoide wurden bei CF-Patienten von verschiedenen Gruppen beschrieben. Zusätzlich zu dem erhöhten Spiegel proinflammatorischer Leukotriene in Atemwegen, Urin und Serum, wurden erniedrigte Spiegel von DHA im Plasma und übermäßige Freisetzung von AA aus der Zellmembran für CF beschrieben. Desweiteren wurden erhöhte Mengen membrangebundener AA und erniedrigte Mengen membrangebundener DHA in den von CF betroffenen Organen beschrieben. Veränderungen des Fettsäure-Haushalts sind von besonderem Interesse, weil sie die bei CF vorliegender Fehlregulation inflammatorischer Prozesse erklären könnten. Sie sind auch natürliche Liganden von Peroxisom Proliferator-Aktivierten Rezeptoren und darüber hinaus an der Regulation von Entzündungsprozessen beteiligt. Zum gegenwärtigen Zeitpunkt sind drei unterschiedliche PPAR-Isoformen identifiziert, PPAR alpha, bera und gamma. Sie sind Transkriptionsfaktoren, die zu der Superfamilie der nukleäreren Rezeptoren gehören, und werden durch endogene Liganden wie Fettsäuren und Eicosanoide aktiviert. Es wurde gezeigt, dass PPARalpha und –gamma antiinflammatorische Aktivität besitzen, die auf Monozyten, Makrophagen, Lymphozyten, glatte Muskelzellen und Endothellzellen wirkt. Ein Modell dazu ist eine durch PPARalpha und -gamma vermittelte Hemmung der proinflammatorischen Eigenschaften des nuklearen Faktor-kappaB (NF-kappaB) und des aktivierenden Proteins-1 (AP-1). Beides sind Transkriptionsfaktoren, die eine Schlüsselrolle bei der inflammatorischen Antwort spielen, indem sie die Expression von Zytokinen, Chemokinen, Zelladhäsionsmolekülen und Wachstumsfaktoren veranlassen. Die PPARs werden unter anderem in peripheren Blutzellen exprimiert. Da die Spiegel einiger endogener Aktivatoren der PPARs bei CF verändert zu sein scheinen, sollte in der vorliegenden Arbeit ein Einfluss auf Expression und Funktion der PPARs untersucht werden. In der vorliegenden Arbeit wurden Patienten mit CF untersucht, die sich in einem stabilen Zustand befanden und im Rahmen von Routineuntersuchungen in die Klinik kamen. Da die CF-Patienten in unserer Klinik nicht bronchoskopiert werden, konnte kein Versuchsmaterial aus den Atemwegen gewonnen werden. Dennoch gehen wir aufgrund der erhöhten Entzündungsmarker im Blut der CF-Patienten davon aus, dass die Entzündungsreaktionen nicht auf den Respirationstrakt beschränkt sind. Auch in unserer Studie zeigten sich erhöhte IL-8 Spiegel im Plasma von Patienten mit CF. Dies unterstützt die Ergebnisse anderer Arbeitsgruppen und weist auf systemische proinflammatorische Vorgänge hin. Das Blut wurde über Venenpunktion erhalten. Monozyten, Lymphozyten und neutrophile Granulozyten wurden isoliert und untersucht, da sie aufgrund der Freisetzung von Zytokinen, Chemokinen und durch die Produktion von Antikörpern, wichtige Mediatoren in der Immunantwort sind. Die PPAR mRNA Expression wurde in Monozyten und Lymphozyten mittels RT-kompetitiver Multiplex PCR gemessen und mittels RT-Real-time PCR in neutrophilen Granulozyten. Die PPARgamma Spiegel in diesen Zellen lagen unterhalb der Nachweisgrenze. Die statistische Analyse zeigte dass in Lymphozyten von CF-Patienten gegenüber Gesunden PPARalpha mRNA, aber nicht PPARbeta mRNA, signifikant erniedrigt exprimiert wird (-37%). Die gleiche Differenz konnte auf Proteinebene mit Hilfe von Western Blots detektiert werden. Hinsichtlich der Expression von PPARalpha und PPARbeta zeigten sich in Monozyten und Neutrophilen zwischen CF-Patienten und Gesunden keine signifikanten Unterschiede. Unseren Daten werden von verschiedenen Studien unterstützt. Zum ersten gibt es Hinweise, dass PPARalpha mRNA- und Protein-Expression von ihren eigenen Liganden direkt reguliert werden. Bei Patienten mit CF zeigen sich für die natürlichen Liganden, Eicosanoide und Fettsäuren, veränderte Spiegel, wass zu einer verringerte Expression von PPARalpha beitragen könnte. Zum zweiten, da bekannt ist, dass die PPARalpha-Expression in proinflammatorisch aktivierten T-Lymphozyten herunterreguliert ist, wurde zusätzlich überprüft, ob die Lymphozyten von CF-Patienten aktiviert sind. Interleukin-2 Rezeptor im Serum (sIL-2 R) ist ein allgemein anerkannter Marker der Aktivierung von Lymphozyten. Tatsächlich zeigte sich, dass die Konzentration von sIL-2 R im Serum der vorliegenden CF Patienten erhöht ist, was mit den Erkenntnissen anderer Arbeitsgruppen übereinstimmt 128-130. Die verstärkte Aktivierung von Lymphozyten in CF-Patienten könnte eine Erklärung für die erniedrigten PPARalpha-Spiegel bieten. Der verantwortliche Mechanismus dafür ist bis jetzt noch nicht bekannt. Drittens wurde für die proinflammatorischen Zytokine IL-6, TNF-alpha und IL-1 gezeigt, dass sie eine Reduktion der PPARalpha Expression verursachen können. CF-Patienten zeigen erhöhte Spiegel von IL-2, TNF-alpha, IL-6 und IL-8 im Sputum und Serum. Konsequenterweise kann die PPARalpha Expression durch die erhöhten Zytokinspiegel im Serum herunter reguliert werden. Eine weitere Unterstützung der vorliegenden Ergebnisse ergibt sich aus einem Kongressbeitrag von Andersson et al., die über eine epitheliale CF-Zelllinie berichten, die weniger PPARalpha-Protein exprimiert als eine normale epitheliale Zelllinie. Dieselbe Forschungsgruppe fand erniedrigte PPARgamma-Spiegel im CF-Maus-Modell in Geweben, die speziell durch CFTR reguliert werden und ihre Daten weisen darauf hin, dass CFTR eine Rolle bei der PPAR Expression spielen kann. Ein funktionales CFTR-Protein wird auch in Lymphozyten von Gesunden exprimiert. Folglich könnte ein defektes CFTR auch in CF-Lymphozyten für die veränderterte PPARalpha-Expression verantwortlich sein. Ob die beschriebene Veränderung der Menge an PPARalpha mRNA und Protein auch auf funktioneller Ebene zum Tragen kommt, wurde durch immunhistometrische Untersuchungen und die Bestimmung der DNA-Bindungsaktivität des Transkriptionsfaktors überprüft. Die immunhistometrischen Untersuchungen zeigten, dass PPARalpha sowohl bei Gesunden als auch bei CF-Patienten hauptsächlich im Cytosol lokalisiert ist und dass sich nur ein kleiner Teil im Nukleus befindet. Eine Quantifizierung war hierbei nicht möglich. Über eine ähnliche zelluläre Verteilung wurde in humanen Makrophagen wie auch in Mäuselymphozyten berichtet. Die DNA-Bindungstudien zeigten, dass die PPARalpha DNA-Bindungsaktivität in Lymphozyten von CF-Patienten gegenüber Kontrollpersonen um 36% signifikant erniedrigt war. Eine erniedrigte DNA-Bindungsaktivität bei CFTR knock-out Mäuse wurde auch für PPARgamma berichtet. Die Bindungsaktivität konnte wiederhergestellt werden, nachdem die Mäuse mit Troglitazon, einem PPARgamma Agonist, behandelt wurden. Darüber hinaus werden mit hoher Wahrscheinlichkeit auch die Veränderungen des Eicosanoidhaushalts bei CF zu der Verminderung sowohl der Expression als auch der Aktivität von PPARalpha beitragen. Hier ist besonders die bei CF verminderter Menge des PPARalpha–Liganden DHA hervorzuheben. Eine ligandeninduzierte Aktivierung von PPARalpha führt zu einer Abnahme verschiedener proinflammatorische Zytokine in Lymphozyten. Dies geschieht vermutlich über eine Antagonisierung der Aktivität von NF-kappaB. PPARalpha hat einen signifikanten Einfluss auf die Immunantwort. Somit könnte die bei CF-Patienten verminderte PPARalpha-Expression und -Funktion ursächlich oder mitverantwortlich für die inflammatorischen Vorgänge bei CF sein. Die vorliegenden Ergebnisse weisen darauf hin, dass die Regulierung der Aktivität von PPARalpha durch die Zugabe von DHA oder andere Liganden eine sinnvolle Therapieoption sein kann. Es sollte in weiterführenden Versuchen geklärt werden, ob eine Therapie mit PPARalpha-Aktivatoren einen Einfluss auf die inflammatorischen Vorgänge bei CF haben kann. Im zweiten Teil der Arbeit wurde untersucht ob CF einen Defekt in der Expression von 15-Lipoxygenase-1 (15-LO-1) verursacht. 15-LO-1 ist ein Schlüsselenzym für die Synthese einiger Eicosanoide wie z.B. 15(S)-HETE und Lipoxin A4. Beide Eicosanoide spielen eine wichtige Rolle in inflammatorischen Vorgängen in der menschlichen Lunge. 15(S)-HETE ist ein von der Arachidonsäure abgeleitetes Eicosanoid, das sich in hoher Konzentration in eosinophilen Granulozyten und Atemwegsepithelien findet. 15(S)-HETE wirkt in den Atemwegen stark mukosekretolytisch und bronchokonstriktorisch. Zum anderen inhibiert 15(S)-HETE die durch die 5-Lipoxygenase katalysierte Konversion von Arachidonsäure zu proinflammatorischen Mediatoren wie LTB4 in neutrophilen Granulozyten. Dies führt zu einer Reduktion der neutrophilen Chemotaxis. Es liegen bisher keine Daten zu 15-HETE-Spiegel in der CF-Lunge vor. Lipoxin A4 verursacht ebenfalls eine Reduktion der Chemotaxis von neutrophilen Granulozyten, supprimiert darüber hinaus aber schon deren Aktivierung. Neben einer direkten Wirkung auf die neutrophilen Granulozyten, sind dabei auch indirekte Effekte beteiligt, wie zum Beispiel die Reduktion der broncho-epithelialen Ausschüttung von IL-8, als einem potenten Chemoattraktor und Aktivator neutrophiler Granulozyten. Tatsächlich ist die Konzentration des anti-inflammatorisch wirksamen LXA4 in der Atemwegsflüssigkeit von CF-Patienten reduziert. Die Expression von15-LO-1 in peripheren Blutzellen ist im Wesentlichen auf die eosinophilen Granulozyten beschränkt. Deren Funktion ist bei der zystischen Fibrose ebenfalls verändert: in CF Serum und Sputum misst man erhöhte Spiegel an eosinophilen granulären Proteinen, obwohl die Anzahl der Eosinophilen normal ist. Aus diesem Grund wurde in der vorliegenden Arbeit untersucht, ob im Rahmen der zystischen Fibrose Veränderungen der Expression der 15-LO vorliegen. Durchflusszytometrische Untersuchungen zeigten nach der statistischen Auswertung, dass die intrazelluläre Expression der 15-LO-1 in eosinophilen Granulozyten von CF-Patienten und gesunden Kontrollpersonen keine Unterschiede aufweist. Dies schliesst nicht aus, dass Unterschiede der 15-LO-1 Expression zwischen CF-Patienten und gesunden Kontrollpersonen im Atemwegsepithel zu finden wären, weil, eine erhöhte Expression der 15-LO-1 bei chronischer Bronchitis und Asthma bronchiale wurde beschrieben. Patientenmaterial für das Atemwegsepithel war jedoch nicht zugänglich und wurde von daher nicht untersucht.Funktion ist bei der zystischen Fibrose ebenfalls verändert: in CF Serum und Sputum misst man erhöhte Spiegel an eosinophilen granulären Proteinen, obwohl die Anzahl der Eosinophilen normal ist. Aus diesem Grund wurde in der vorliegenden Arbeit untersucht, ob im Rahmen der zystischen Fibrose Veränderungen der Expression der 15-LO vorliegen. Durchflusszytometrische Untersuchungen zeigten nach der statistischen Auswertung, dass die intrazelluläre Expression der 15-LO-1 in eosinophilen Granulozyten von CF-Patienten und gesunden Kontrollpersonen keine Unterschiede aufweist. Dies schliesst nicht aus, dass Unterschiede der 15-LO-1 Expression zwischen CF-Patienten und gesunden Kontrollpersonen im Atemwegsepithel zu finden wären, weil, eine erhöhte Expression der 15-LO-1 bei chronischer Bronchitis und Asthma bronchiale wurde beschrieben. Patientenmaterial für das Atemwegsepithel war jedoch nicht zugänglich und wurde von daher nicht untersucht.
A necessary requirement for a pharmacological effect is that a drug molecule tightly interacts with its disease relevant target molecule in the patient. Kinases are regulatory, signal transmitting enzymes and are a large protein family that belongs to the most frequent targets of pharmaceutical industry, as deregulation of kinases has been associated with the development of a variety of diseases, including cancer. In drug discovery, equilibrium binding metrics such as the affinity (Ki, KD) or potency (IC50, EC50) are usually applied for the systematic profiling for potent and selective drug candidates. In recent years, dynamic binding parameters, the drugs association (kon) and dissociation (koff) rates for desired primary-targets and undesired off-targets, were discussed to be better predictors than steady-state affinity per se (KD = koff / kon) for the onset and duration of the drug-target complex in the open in vivo environment and thereby for the therapeutic effect and safety of the drug. It is yet unclear whether and when the binding kinetics parameters can influence drug action in the complex context of pharmacokinetics and pharmacodynamics and how the kinetic rate constants can be optimized rationally. One major obstacle for providing proof for the hypothesis that drug binding kinetics is of importance for drug action is the generation of large and comparable binding kinetic datasets.
The aim of this thesis was the comprehensive analysis of the binding kinetic and affinity parameters of a diverse spectrum of 270 small-molecule kinase inhibitors against a panel of pharmacologically relevant kinases to study the role played by binding kinetics for drug discovery: The generated dataset was utilized to assess the effect of chemical properties on drug binding kinetics, and to evaluate the impact of kinetic rate constants on the success of compounds in the drug discovery pipeline.
Large scale profiling was made possible by a recently developed “kinetic Probe Competition Assay” (kPCA), whose evaluation is based on Motulsky’s and Mahan’s “kinetics of competitive binding” theory. Monte Carlo analyses performed in this dissertation widened the theoretical knowledge of this theory, provided new insights into its limitations and allowed to derive recommendations about how to best design assays. It was demonstrated that kPCA is indeed high-throughput compatible and that it is comparable to other biochemical and biophysical assay formats in terms of precision and accuracy.
Multivariable linear regression for the description of the determined kinase inhibitors’ target binding characteristics (kon or koff or KD) using molecular properties and/or particular kinase-inhibitor interactions as descriptors supported the assumption that molecular properties of compounds might affect binding kinetics, generated new hypothesis about molecular determinants influencing binding kinetic parameters and provided a rational basis for following structure-kinetic relationship studies. Remarkably, the binding kinetic rate constants were better described by the established models than binding affinities.
Interestingly, the systematic, quantitative analysis of kinase inhibitors’ target binding kinetics indicated that a slow dissociation rate for the main target is a feature which is more frequently observed in inhibitors that reached approval or late stage clinical testing than in earlier phases of clinical development. In addition, it was demonstrated that binding kinetics of kinase inhibitors is a better predictor for the time course of target engagement in cells as compared to affinity per se. Furthermore, in some study cases simulations using a standard pharmacokinetics model and a modified model considering the inhibitors binding kinetics lead to different in vivo kinase occupancy time profiles. It was illustrated by simulations how the concept of kinetic selectivity can be applied to turn an unselective compound in equilibrium conditions into a more selective compound in the open in vivo situation, where the thermodynamic equilibrium of drug-target binding is not necessarily reached.
Thus the generated data and models provide evidence for the importance of binding kinetics in drug discovery and represent a valuable resource for future studies in this field.
Die 5-Lipoxygenase (5-LO) ist eines der Schlüsselenzyme der Leukotrienbiosynthese. Sie katalysiert zunächst die Umsetzung der freigesetzten Arachidonsäure(AA) zu 5-Hydroperoxyeicosatetraensäure (5-HpETE), in einem zweiten Reaktionsschritt wandelt sie diese in Leukotrien A4 (LTA4) um. Leukotriene sind potente Entzündungsmediatoren und spielen eine wichtige Rolle bei entzündlichen und allergischen Reaktionen. Außerdem wird die Beteiligung an verschiedenen Krebsarten kontrovers diskutiert.
Sie besteht aus 673AS, ist 78 kDa schwer und gliedert sich wie alle bisher bekannten Lipoxygenasen in eine N-terminale C2-ähnliche, regulatorische Domäne(AS 1–114) (C2ld), die für die Membran- und Calciumbindung sowie die Interaktion mit dem Coactosin-like Protein (CLP) verantwortlich ist, und in eine C-terminale, katalytische Domäne (AS 121–673), die das Nicht-Häm-gebundene Eisen im aktiven Zentrum trägt. Ein weiteres Strukturmerkmal sind zwei ATP-Bindungsregionen, eine befindet sich in der C2ld (AS 73–83), die andere auf der katalytischen Domäne (AS 193–209), das molare Verhältnis von 5-LO zu ATP konnte dabei auf 1:1 festgelegt werden [167].
Bereits 1982 wurde in einer Veröffentlichung von Parker et al. beschrieben, dass 5-LO aus Rattenzellen in Gegenwart von Calcium auf einer Gelfiltration dimerisieren kann [204], 2008 schließlich wurde von Aleem et al. publiziert, dass humane 12-LO aus Thrombozyten Dimere bilden kann [219]. Somit konnte es möglich sein, dass auch die humane 5-LO zur Dimerisierung fähig ist.
Zunächst wurde aufgereinigtes Enzym mit nativer Gelelektrophorese und anschließender Coomassiefärbung oder Western Blot untersucht, dabei konnten mehrere Banden pro Bahn detektiert werden. Um dieses Phänomen weiter zu untersuchen, wurde im Anschluss eine Gelfiltration etabliert; da die C2ld der 5-LO recht hydrophob ist, war es nötig, 0,5% T20 zum Elutionspuffer PBS/EDTA zuzusetzen, da das Enzym ansonsten unspezifisch mit dem Säulenmaterial interagiert und für seine Größe zu spät eluiert hätte. In Anwesenheit von T20 eluierte 5-LO in zwei getrennten Peaks, die exakt zu den vorher mit Referenzproteinen bestimmten Elutionsvolumina des Monomers und Dimers passten. Weiter wurde getestet, ob niedermolekulare Substanzen einen Einfluss auf das Dimerisierungsverhalten haben, allerdings konnte weder durch Ca2+noch durch ATP eine Verstärkung der Dimerisierung beobachtet werden. Dahingegen konnte, nach Vorinkubation mit GSH und Diamid, das alleinige Monomer auf der Gelfiltration nachgewiesen werden, nach Vorinkubation nur mit Diamid, lag das gesamte Protein ausschließlich als Dimer vor. Durch Gelelektrophorese mit oder ohne Zusatz von ß-Mercaptoethanol und LILBID-MS konnte die Ausbildung von intermolekularen Disulfidbrücken bestätigt werden. Ein Bindungsassay mit radioaktivem 35S-GSH konnte die kovalente Bindung des GSH an die 5-LO bestätigen. Quantifizierungsstudien mit Ellmans Reagens zeigten, dass mindestens eins der Oberflächencysteine mit GSH modifiziert wurde. Die von der Gelfiltration erhaltenen Fraktionen wurden auf enzymatische Aktivität getestet und in allen 5-LO-haltigen Fraktionen konnte Aktivität gefunden werden. Leider war es nicht möglich, eine Aussage darüber zu treffen, ob das Mono- oder das Dimer aktiver war. Es liegt offenbar in einem Fließgleichgewicht vor, da erneute Injektion des Monomerpeaks im bekannten Elutionsprofil aus zwei Peaks resultierte. Außerdem führt die Anwesenheit von 0,5% T20 während des Aktivitätstests zu einer Hemmung des Enzyms und weniger detektierbaren 5-LO-Produkten; es fiel vor allem auf, dass so gut wie keinerlei trans- und epitrans-LTB4, die nicht-enzymatischen Zerfallprodukte der 5-HpETE, nachzuweisen waren. Betrachtet man die Struktur der 5-LO, so findet man zehn Cysteine an der Oberfläche; die Cysteine 159, 300, 416 und 418 liegen dabei in einem Interface. Mutiert man diese Cysteine zu Serinen, so verschwindet der Dimer-induzierende Effekt des Diamids, wohingegen die Mutante weiterhin glutathionylierbar bleibt. Interessanterweise zeigt diese Mutante auch eine wesentlich weniger ausgeprägte Hemmung durch T20. Um eine Aussage treffen zu können, ob auch 5-LO aus humanen Zellen Dimere bilden kann, wurde 5-LO-haltiger S100 aus polymorphkernigen Leukozyten (PMNL) untersucht. Dabei konnte mit Western Blot und einem Aktivitätsnachweis gezeigt werden, dass die 5-LO in einem breiten Bereich von der Gelfiltration eluiert. Das deutet darauf hin, dass sie in PMNL ebenfalls dimerisiert vorliegen kann. In Gegenwart von Ca2+kam es zu einer Verschiebung der 5-LO zu höhermolekularen Gewichten, wobei dieses Phänomen nicht bei S100 aus transformierten E.coli auftrat, was auf einen gerichteten Komplex nach Calciuminduktion in PMNL hindeutet.
Außerdem wurde im Rahmen dieser Arbeit der Bindemodus von Sulindac an die 5-LO mittels Crosslinking untersucht. Dabei konnte gezeigt werden, dass konzentrationsabhängig der einfache Komplex aus 5-LO und CLP abnimmt, dafür aber ein hochmolekularer Komplex, der beide Enzyme enthält, entsteht. Weder das Prodrug Sulindac noch der weitere Metabolit Sulindacsulfon oder andere Inhibitoren, die ebenfalls an der C2ld angreifen sollen, zeigten diesen Effekt. Leider konnte nicht weiter geklärt werden, was diesen Effekt verursacht, allerdings liegt die Vermutung nahe, dass es zu einer Aggregation kommt. Weitere Untersuchungen könnten wichtige Hinweise auf das Design von neuen Arzneistoffen bringen, um selektivere und damit nebenwirkungsärmere Inhibitoren zu finden.
Macrophages in the tumor microenvironment respond to complex cytokine signals. How these responses shape the phenotype of tumor-associated macrophages (TAMs) is incompletely understood. Here we explored how cytokines of the tumor milieu, interleukin (IL)-6 and IL-4, interact to influence target gene expression in primary human monocyte-derived macrophages (hMDMs). We show that dual stimulation with IL-4 and IL-6 synergistically modified gene expression. Among the synergistically induced genes are several targets with known pro-tumorigenic properties, such as CC-chemokine ligand 18 (CCL18), transforming growth factor alpha (TGFA) or CD274 (programmed cell death 1 ligand 1 (PD-L1)). We found that transcription factors of the signal transducer and activator of transcription (STAT) family, STAT3 and STAT6 bind regulatory regions of synergistically induced genes in close vicinity. STAT3 and STAT6 co-binding further induces the basic leucine zipper ATF-like transcription factor (BATF), which participates in synergistic induction of target gene expression. Functional analyses revealed increased MCF-7 and MDA-MB 231 tumor cell motility in response to conditioned media from co-treated hMDMs compared to cells incubated with media from single cytokine-treated hMDMs. Flow cytometric analysis of T cell populations upon co-culture with hMDMs polarized by different cytokines indicated that dual stimulation promoted immunosuppressive properties of hMDMs in a PD-L1-dependent manner. Analysis of clinical data revealed increased expression of BATF together with TAM markers in tumor stroma of breast cancer patients as compared to normal breast tissue stroma. Collectively, our findings suggest that IL-4 and IL-6 cooperate to alter the human macrophage transcriptome, endowing hMDMs with pro-tumorigenic properties.
Die 5 Lipoxygenase (5 LO) ist das Schlüsselenzym in der Synthese von Leukotrienen. Sie wird auf transkriptioneller und posttranskriptioneller Ebene reguliert. Die Differenzierung myeloider Zelllinien mit 1,25-Dihydroxyvitamin D3 (1,25(OH)2D3) und transformierendem Wachstumsfaktor beta (TGFbeta) führt zu einer Erhöhung der 5 LO mRNA-, Protein-Bildung und der zellulären Enzymaktivität. Hier wurde gezeigt, dass dabei reife, nicht jedoch prä-mRNA der 5 LO im Zytosol und im Zellkern stark angereichert wird und dass beide Agentien in die mRNA-Prozessierung eigreifen. Obwohl die Bindung von VDR-Retinoid-X-Rezeptor (RXR)-Heterodimeren an Bindungsstellen im 5 LO-Promotor mittels DNAseI-Footprinting und EMSAs nachgewiesen wurde, konnten Reportergene unter der Kontrolle des 5 LO-Promotors in transienten und stabilen Transfektionen durch 1,25(OH)2D3/TGFbeta nicht stimuliert werden. Offensichtlich wird die Induktion der Expression der 5 LO durch 1,25(OH)2D3/TGFbeta durch Elemente außerhalb des Promotors vermittelt. In transienten Transfektionen führte der Einbau der kodierenden Sequenz der 5 LO in Luziferase-Plasmide bei Cotransfektion von VDR/RXR zu einer 5 fachen Induktion der Reportergen-Aktivität durch 1,25(OH)2D3/TGFbeta, was durch zusätzlichen Einbau der letzten vier Introns auf eine 13-fache Erhöhung gesteigert wurde. Der VDR zeigte einen Ligand-unabhängigen Effekt. Diese Reportergen-Effekte waren promotorunabhängig und von der kodierenden Sequenz gesteuert. RT-PCR-Analyse wies auf eine Deletion von Teilen der kodierenden Sequenz im Laufe der mRNA-Prozessierung hin, was durch 1,25(OH)2D3/TGFbeta verhindert wird. Auch Cotransfektion der TGFbeta-Effektoren Smads 3/4 führte in Abhängigkeit von der kodierenden Sequenz und in geringerem Maße von der 3'-UTR und den Introns J M, aber unabhängig vom Promotor, zu einer starken Erhöhung der Reportergenaktivität. Die 5 LO-Expression wird in den untersuchten Zellen vermutlich durch posttranskriptionelle Prozesse (Splicing, mRNA-Reifung) herunterreguliert, während 1,25(OH)2D3/TGFbeta die Expression der 5 LO durch eine Gegenregulation zu erhöhen, an der Komplexe beteiligt sind, die vermutlich Smads, VDR-RXR-Dimere, andere Transkriptionsfaktoren, Coaktivatoren, RNA-Polymerase II und Splicing-Faktoren enthalten. Hyperacetylierung des 5 LO-Promoters durch Inkubation mit mit dem Histondeacetylase-Inhibitor TsA führte zu einer transkriptionellen Aktivierung. Die kodierende Sequenz (und die Introns) wirkt diesem Effekt vermutlich durch die Rekrutierung von HDACs an VDR oder Smads, die direkt oder indirekt an die kodierende Region binden, entgegen.
Das Enzym 5-Lipoxygenase (5-LO) spielt eine entscheidende Rolle in der Generierung von Leukotrienen. Diese fungieren als wichtige proinflammatorische Mediatoren. Darüber hinaus ist die 5-LO anhand ihrer N-terminalen Domäne in der Lage mit verschiedenen Proteinen zu interagieren. Unter den Interaktionspartnern befindet sich Dicer, ein Enzym welches für den finalen Schritt der microRNA (miRNA)-Biosynthese verantwortlich ist. MiRNA sind kurze, nicht kodierende RNA Stränge mit einer typischen Länge von etwa 23 Nukleotiden, die an der posttranskriptionalen Regulierung der Proteinbiosynthese beteiligt sind.
Ziel dieser Arbeit war es den Einfluss der 5-LO auf die miRNA-Prozessierung im zellulären Kontext zu untersuchen. Als Modellsystem wurde die MonoMac6 (MM6) Zelllinie ausgewählt. MM6-Zellen exprimieren im undifferenzierten Grundzustand nur geringe Mengen an 5-LO. Erst nach Differenzierung mittels transformierenden Wachstumsfaktors ß (TGFß) und Calcitriol kommt es zur Induktion der 5-LO Proteinbiosynthese. Darüber hinaus war es Basavarajappa et al. möglich die 5-LO-Expression in diesen Zellen mittels RNA-Interferenz stark herunter zu regulieren (Δ5-LO).
Um die Frage der Auswirkungen des 5-LO knockdowns auf die miRNA-Expression analysieren zu können, wurde ein Microarray in differenzierten Kontroll-und Δ5-LO-Zellen durchgeführt.Es wurden 37 miRNAs identifiziert deren Expression 5-LO abhängig ist. Dabei war das Niveau von 30 Vertretern in Abwesenheit der 5-LO erhöht, wohingegen die Expression von sieben miRNAs reduziert war. Unter diesen sieben herunter regulierten miRNAs befanden sich miR-99b-5p und miR-125a-5p, die einem gemeinsamen Cluster entstammen. Als Cluster wird eine Gruppe von miRNAs bezeichnet, die aus einem gemeinsamen primären Transkript (pri-miRNA) hervorgeht. Diese Eigenschaft führte zur Vermutung, dass bereits die Expression dieser pri-miRNA durch die 5-LO reguliert wird. Allerdings zeigte sichim Verlauf dieser Arbeit, dass die Expression der pri-miRNA 5-LO unabhängig verläuft. Im Gegensatz dazu wies die Zwischenstufe zwischen pri-miRNA und reifer miRNA eine reduzierte Expression in Δ5-LO Zellen auf. Für die Prozessierung dieser sogenannten precursor miRNAs (pre-miRNA) ist die Ribonuklease III Drosha verantwortlich, welche die pre-miRNA aus der jeweiligen pri-miRNAs chneidet. Das verringerte pre-miR-99b-und pre-miR-125a-Niveau ist daher ein Hinweis darauf, dass überDicerhinausmöglicherweise ebenfalls die Drosha Aktivität mittels 5-LO reguliert wird.
Des Weiteren wurde untersucht iniefern Leukotriene beziehungsweise 5-LO-Inhibitoren die Expression von miR-99b-5p und miR-125a-5p beeinflussen. Dabei stellte sich heraus, dass das miRNA-Niveau unabhängig von der vorhandenen Leukotrien-Menge ist. Das 5-LO aktivierende Protein (FLAP) besitzt dahingegen einen mit der 5-LO vergleichbaren Einfluss auf die reife miRNA. FLAP ist ein weiterer Interaktionspartner der 5-LO und essentiell für die Leukotrien-Biosynthese in vivo. Anhand von Protein-Lokalisationsstudien mittels Immunofluoreszenz konnte gezeigt werden, dass FLAP außerdem in der Lage zu sein scheint die Relokalisation der 5-LO aus dem Zytoplasma in den Nukleus einzuschränken. Im Zytoplasma ist die 5-LO in der Lage mit Dicer zu interagieren. Daten bezüglich einer Interaktion zwischen Drosha und 5-LO im Zellkern liegen bisher nicht vor. Eine etwaige Interaktion könnte allerdings helfen die reduzierten pre-miRNA Spiegel in Abwesenheit der 5-LO zu erklären.
Im Laufe dieser Arbeit wurden weiterhin die Auswirkungen von proinflammatorischen Lipopolysacchariden (LPS) auf die Prozessierung von miR-99b-5p und miR-125a-5p analysiert. Ausschließlich in Anwesenheit von 5-LO zeigte sich eine differenzierungsunabhängig gesteigerte Biosynthese der pri-und der reifen miRNA. Allerdings konnte kein Einfluss von LPS auf die 5-LO-Lokalisation beziehungsweise Expression festgestellt werden. Aufgrund dessen sind weiterführende Studien, die den Zusammenhang zwischen LPS induzierter miR-99b-5p- beziehungsweise miR-125a-5p-Biosynthese und 5-LO herstellen, nötig.
Abschließend hat sich diese Arbeit mit den Zielgenen der durch 5-LO regulierten miRNAs auseinandergesetzt. Es konnte gezeigt werden, dass in Abwesenheit von miR-99b-5p und miR-125a-5p die Freisetzung der beiden durch LPS stimulierten Zytokine Interleukin 6 (IL-6) und Tumornekrosefaktor α (TNFα) gesteigert ist. Interessanterweise besitzt TNFα einen stimulierenden Effekt auf die Leukotrien-Biosynthese. Allerdings konnte kein direkter Zusammenhang zwischen miR-99b-5p/miR-125a-5p Expression, TNFα und der 5-LO Aktivität hergestellt werden. Der Einsatz von miR-99b-5p-und miR-125a-5p-Inhibitoren zeigte keine Auswirkungen auf die Leukotrien-Biosynthese nach LPS Stimulation. Im Gegensatz dazu konnte in unstimulierten Zellen eine signifikante Aktivitätssteigerung in Abwesenheit von miR-125a-5p festgestellt werden. Diese Beobachtungen legen nahe, dass miR-125a-5p einen TNFα unabhängigen Einfluss auf die 5-LO Aktivität besitzt. In LPS stimulierten Zellen kommt es möglicherweise zu Überlagerungen dieses Effektes.
Zusammenfassend konnte in dieser Arbeit gezeigt werden, dass 5-LO eine regulierende Funktion auf die Reifung der beiden miRNAs miR-99b-5p und miR-125a-5p aufweist. Dieser Effekt könnte einer direkten Interaktion zwischen 5-LO und Dicer zuzuschreiben sein. Des Weiteren konnte gezeigt werden, dass die Regulierung der Expression bestimmter miRNAs mittels 5-LO nicht auf deren kanonischer enzymatischer Aktivität beruht. Diese Ergebnisse schlagen eine neue Richtung der 5-LO-Forschung ein und können in Zukunft dazu beitragen 5-LO vermittelte Effekte besser charakterisieren zu können.
Purification and characterization of heterologously produced cannabinoid receptor 1 and G proteins
(2007)
G protein coupled receptors form the largest group of transmembrane proteins, which are involved in signal transduction and are targeted directly or indirectly by 40-50% of the drugs in the market. Even though a lot of biochemical and pharmacological information was acquired for these receptors in the past decades, structural information is still insufficient. G protein coupled receptors are expressed in a very minute scale in the tissues. Purification of G protein coupled receptors, in amounts needed for structural studies, from native tissue is tedious and almost impossible. To overcome this first hurdle of insufficient protein, several heterologous protein expression systems are being used. Another difficulty in structural determination of a G protein coupled receptor is that it is a membrane protein. Membrane proteins are difficult targets for structural studies. One of the possible reasons is the little hydrophilic surface area on the membrane protein, reducing the chances of crystal contact between the molecules. The present work is an attempt to investigate possible ways to overcome these problems. Aim of the project was to use G proteins to increase the hydrophilic area of the G protein coupled receptor. G protein is a physiological partner to the G protein coupled receptor which makes the complex functionally relevant. In the present work five G alpha proteins were purified to homogeneity by a two step purification using metal affinity and ion-exchange chromatography. The G alpha subunits purified were tested for their detergent susceptibility. It was found that only some G proteins were active in the presence of detergent. Observation from contemporary reports also suggest that the G alpha proteins expressed in Escherichia coli, alone may not be sufficient to bind to the G protein coupled receptors in solution. So the project was extended towards expressing a G protein coupled receptor which was reported to exist in a complex with the G proteins, in the cells. Purifying such a functional complex could be more beneficial to use for crystallization. Cannabinoid receptors were chosen for heterologous expression and purification. Production of recombinant cannabinoid receptor 2 was investigated in Pichia pastoris. The protein obtained was highly heterogenous. There were several oligomeric forms as well as degradation products in the cell membranes. Most of the protein was lost in the purification steps leading to a poor yield. Several oligomeric forms and other impurities were still present in the protein sample after purification. Alternatively, a baculovirus mediated insect cell expression system was investigated, to produce the receptors. Cannabinoid receptor 1 was investigated in insect cell expression system because of its better biochemical understanding and pharmacological importance than cannabinoid receptor 2. Cannabinoid receptor 1 was produced in two forms, a full length and a distal carboxy terminal truncated version. All the several gene constructs made could be expressed in the Spodoptera frugiperda (Sf9) insect cells. Expression levels (Bmax) for the constructs with a decahistidine tag at the amino terminus and Strep-tagII at the carboxy terminus were 40 pmol/mg and 53 pmol/mg respectively, for full length and truncated versions. These expression levels are 2 fold higher than the levels reported till now in the literature. As was quite evident from previous experiences of other research groups, purification of this receptor was a challenge. Protein purified from immobilized metal affinity chromatography (Ni-nitrilo tri acetate)(Ni-NTA) was not even 50% pure. A second purification by immobilized monomeric avidin or Streptactin agarose, making use of Biotag and StreptagII respectively, drastically reduced the protein recovery. Later on, purification of receptor was investigated on different metal chelating resins. His-Select, a Ni-NTA based matrix from Sigma, with much lesser density than Ni-NTA from Qiagen, showed a better purification profile. Purification was optimized to get 80% homogeneity but with low yield (20%). Further efforts are needed to improve the yield and purity of the receptor, to use it for crystallization. Cannabinoid receptors are known to exist in a precoupled form to G proteins in the cells. The existence of such precoupled forms of the receptor was investigated using the fluorescence techniques. Guanosine-5-triphosphate binding assay on the cell membranes, in the absence of agonists confirmed the active precoupled form of the receptor. It was found that it is possible to co-immunoprecipitate the complex. These results show that the truncated cannabinoid receptor can be produced in functional form in insect cells in much higher yields than reported. This receptor exists as a complex with G proteins even in the absence of ligands. It was also shown that the receptor/G protein complex can be coimmunoprecipitated. Further work is required to investigate the possibility of purifying this complex to use it for co-crystallization.
On the molecular basis of novel anti-inflammatory compounds and functional leukocyte responses
(2006)
Inflammation is a complex pathophysiological event that can be triggered by activation of a number of distinct activation pathways eventually leading to the release of pro-inflammatory molecules and enzymes. Among all cells involved in inflammatory processes, neutrophils, monocytes and platelets are of major relevance. Activation of leukocytes occurs via binding of agonists to distinct GPCRs leading to activation of G proteins and proximate signaling cascades. In short, GPCR activation by pro-inflammatory agonists such as fMLP, PAF or LTB4 leads to activation of G proteins that are associated with the receptor at the cytosolic side of the plasma membrane. G proteins consist of a Gα- and a Gβγ-subunit which are associated in the inactive state. In this state, G proteins bind GDP. Upon activation, GDP is replaced by GTP that results in the dissociation of the Gα- from the Gβγ-subunit. Both subunits are capable of activating distinct PLC-β isoenzymes that catalyze the turnover of PtdIns(4,5)P2 into the second messengers Ins(1,4,5)P3 and DAG. Every GPCR holds a distinct pattern of associated G proteins which preferentially activate distinct PLC-β isoenzymes. Ca2+ channels within the SR/ER-membrane function as specific receptors for Ins(1,4,5)P3. Ligation of Ins(1,4,5)P3 to this receptor causes a release of Ca2+ from intracellular stores into the cytosol that is subsequently followed by the influx of Ca2+ e through channels in the plasma membrane. Ca2+ represents an important signaling molecule, involved in the regulation of cellular processes and enzymes that mediate inflammatory events such as ROS formation and the release of degradative enzymes. 5-LO and COXs are involved in the biosynthesis of pro-inflammatory eicosanoids and catalyze the turnover of AA into LTs and PGs, respectively. Both enzymes play pivotal roles in the initiation and maintenance of allergic diseases and inflammatory processes. LTB4 is regarded as a potent chemotactic and chemokinetic substance, whereas the cysteinyl-LTs cause smooth muscle contraction and increased vascular permeability. Therefore, 5-LO inhibitors are assumed to possess therapeutic potential for the treatment of diseases related to inflammation. Besides the intervention with 5-LO activity, inhibition of COX-activity is an effective way to suppress inflammatory reactions. The two COX isoenzymes, namely COX-1 and COX-2 show different patterns in terms of tissue expression and sensitivity towards inhibitors. COX-1 is supposed to be constantly expressed whereas COX-2 expression is upregulated at sites of inflammation. The extract of H. perforatum is commonly used for the treatment of mild to moderate depressive disorders, accompanied by a moderate profile of side effects. The extract´s efficacy as an antidepressant can be traced back to the content of the phloroglucinol hyperforin which represents the most abundant lipophilic constituent. However, in folk medicine hypericum extracts are additionally used for the treatment of inflammatory disorders such as rheumatoid arthritis or inflammatory skin diseases. In fact, it was shown that hypericum extracts and hyperforin possess anti-inflammatory potential. Hyperforin was described as a dual inhibitor of 5-LO and COX-1. The phloroglucinols MC and S-MC from M. communis significantly differ from the molecular structure of hyperforin. Hyperforin represents a monomeric prenylated derivative whereas MS and S-MC are non-prenylated oligomeric compounds. To date, the anti-inflammatory potential of SM and S-MC has not been investigated in detail. So far, solely antioxidant activity was attributed to MC and S-MC that indeed might qualify them as anti-inflammatory drugs. The phloroglucinols MC, S-MC and hyperforin are potent inhibitors of ROS formation and HLE release. However, any inhibitory potential of these compounds was only observed when cells were activated by GPCR agonists such as fMLP or PAF. In contrast, when cells were stimulated under circumvention of G protein-associated signaling cascades, the abovementioned inhibitors were not effective at all. In leukocytes, [Ca2+]i plays a pivotal role in signal transduction and regulation of the indicated pro-inflammatory cellular functions. We were able to show that MC, S-MC and hyperforin inhibited GPCR-mediated Ca2+ mobilization with approximately the same potency as the above-mentioned leukocyte responses. However, all of the indicated phloroglucinols were ineffective when cells were stimulated with ionomycin. Since ionomycin as well as GPCR agonists exert their effects by mobilizing Ca2+ i, it seems conceivable that MC, S-MC and hyperforin somehow interfere with G protein-associated signaling pathways. In order to investigate PLC as a potential target of hyperforin, the effects of hyperforin were compared to those of the broad spectrum PLC inhibitor U-73122. We found that both inhibitors acted in a comparable manner in terms of agonist-induced Ca2+ mobilization and in regard of the manipulation of basal Ca2+ levels in unstimulated cells. In this respect, significant differences between hyperforin and U-73122 were obvious for inhibition of total PLC activity in vitro. Thus, U-73122 blocked PLC activity whereas hyperforin was ineffective in this respect. This might indicate that only certain PLC isoenzymes are affected by hyperforin. Alternatively, other components within G protein-associated signaling pathways such as G proteins itself or the Ins(1,4,5)P3 receptor must be taken into account as putative targets of hyperforin. We were able to introduce MC and S-MC as novel dual inhibitors of 5-LO and COX-1. Interestingly, such a pattern was also described for hyperforin. MC and S-MC turned out to be direct inhibitors of 5-LO, based on the fact that they inhibit 5-LO not only in intact cells but also as purified enzyme in vitro. For MC and S-MC, great discrepancies were observed between the IC50 values concerning 5-LO inhibition and the concentrations that exert the antioxidative effects. It seems probable that 5-LO inhibition is not related to reduction of the active site iron as a result of the antioxidant activity of MC and S-MC but rather to direct interference with the 5-LO enzyme. The capability of MC and S-MC to suppress COX-1 activity seems not to be a unique effect of these phloroglucinols because for COX-1, the IBPC, present in both MC and S-MC, turned out to be the most active compound. ....
Chemokines play a key role in the cellular infiltration of inflamed tissue. They are released by a wide variety of cell types during the initial phase of host response to injury, allergens, antigens, or invading microorganisms, and selectively attract leukocytes to inflammatory foci, inducing both migration and activation. Monocyte chemoattractant protein-1 (MCP-1), a member of the CC chemokine superfamily, functions in attracting monocytes, T lymphocytes, and basophils to sites of inflammation. MCP-1 is produced by monocytes, fibroblasts, vascular endothelial cells and smooth muscle cells in response to various stimuli such as tumour necrosis factor-a (TNF-a), interferon-g (IFN-g), and interleukin-1b (IL-1b). It also plays an important role in the pathogenesis of chronic inflammation, and overexpression of MCP-1 has been implicated in diseases including glomerulonephritis and rheumatoid arthritis. Oligonucleotide-directed triple helix formation offers a means to target specific sequences in DNA and interfere with gene expression at the transcriptional level. Triple helix-forming oligonucleotides (TFOs) bind to homopurine/homopyrimidine sequences, forming a stable, sequence-specific complex with the duplex DNA. Purine-rich sequences are frequent in gene regulatory regions and TFOs directed to promoter sequences have been shown to prevent binding of transcription factors and inhibit transcription initiation and elongation. Exogenous TFOs that bind homopurine/ homopyrimidine DNA sequences and form triple-helices can be rationally designed, while the intracellular delivery of single-stranded RNA TFOs has not been studied in detail before. In this study, expression vectors were constructed which directed transcription of either a 19 nt triplex-forming pyrimidine CU-TFO sequence targeting the human MCP-1 or two different 19 nt GU- or CA-control sequences, respectively, together with the vector encoded hygromycin resistance mRNA as one fusion transcript. HEK 293 cells were stable transfected with these vectors and several TFO and control cell lines were generated. Functional relevant triplex formation of a TFO with a corresponding 19 bp GC-rich AP-1/SP-1 site of the human MCP-1 promoter was shown. Binding of synthetic 19 nt CUTFO to the MCP-1 promoter duplex was verified by triplex blotting at pH 6.7. Underlining binding specificity, control sequences, including the GU- and CA-sequence, a TFO containing one single mismatch and a MCP-1 promoter duplex containing two mismatches, did not participate in triplex formation. Establishing a magnetic capture technique with streptavidin microbeads it was verified that at pH 7.0 the 19 nt TFO embedded in a 1.1 kb fusion transcript binds to a plasmid encoded MCP-1 promoter target duplex three times stronger than the controls. Finally, cell culture experiments revealed 76 ± 10.2% inhibition of MCP-1 protein secretion in TNF-a stimulated CU-TFO harboring cell lines and up to 88% after TNF-a and IFN-g costimulation in comparison to controls. Expression of interleukin-8 (IL-8) as one TNF-a inducible control gene was not affected by CU-TFO, demonstrating both highly specific and effective chemokine gene repression. Furthermore, another chemokine target, regulated upon activation normal T cell expressed and secreted (RANTES), which plays an essential role in inflammation by recruiting T lymphocytes, macrophages and eosinophils to inflammatory sites, was analysed using the triplex approach. A 28 nt TFO was designed targeting the murine RANTES gene promoter, and gel mobility shift assays demonstrated that the phosphodiester TFO formed a sequencespecific triplex with the double-stranded target DNA with a Kd of 2.5 x 10-7 M. It was analysed whether RANTES expression could be inhibited at the transcriptional level testing the TFO in two different cell lines, T helper-1 lymphocytes and brain microvascular endothelial cells (bend3 cells). Although there was a sequence-specific binding of the TFO detectable in the gel shift assays, there was no inhibitory effect of the exogenously added and phosphorothioate stabilised TFO on endogenous RANTES gene expression visible. Additionally, the small interfering RNA (siRNA) approach was tested as another strategy to inhibit expression of the pro-inflammatory chemokines MCP-1 and RANTES. Two different methods were pursuit, describing transient transfection with vector derived and synthetic siRNA. The vector pSUPER containing the siRNA coding sequence was used to suppress endogenous MCP-1 in HEK 293 cells. An empty vector without RNA sequence served as a control. Inhibition due to the siRNA was measured in stimulated and unstimulated cells. In TNF-a stimulated cells MCP-1 protein synthesis was decreased by 35 ± 11% after siRNA transfection. Using a synthetic double-stranded siRNA, the TNF-a induced MCP-1 protein secretion could be successfully inhibited about 62.3 ± 10.3% in HEK 293 cells, indicating that the siRNA is functional in these cells to suppress chemokine expression. The siRNA approach targeting murine RANTES in Th1 cells and b-end3 cells revealed no inhibition of endogenous gene expression. Gene therapy approaches rely on efficient transfer of genes to the desired target cells. A wide variety of viral and nonviral vectors have been developed and evaluated for their efficiency of transduction, sustained expression of the transgene, and safety. Among them, lentiviruses have been widely used for gene therapy applications. In order to improve the delivery of TFOs or siRNAs into the target cells, cloning of the lentiviral transfer vector SEW, the production of lentiviral particles by transient transfection were performed with the aim to generate lentiviral vector-derived TFOs in further experiments. Here, Th1 cells were transduced with infectious lentiviral particles and transduction efficacy was measured. Transduction efficacy higher than 82% could be achieved using the lentiviral vector SEW, opening optimal possibilities for the TFO or siRNA approach.
5-LO is the key enzyme in the biosynthesis of proinflammatory leukotrienes, converting arachidonic acid to 5-HPETE, and in a second step 5-HPETE to leukotriene A4. Although the 5-LO promoter possesses characteristics of so called housekeeping genes, such as lack of TATA/CCAAT boxes and existence of several Sp1 binding sites, the 5 -LO gene is tissue specifically expressed in primarily immune competent cells of myeloid origin including granulocytes, monocytes, macrophages, mast cells and B-lymphocytes. 5-LO gene expression in MM6 and HL-60 cells is strongly induced after differentiation of the cells with TGF-beta and 1,25(OH)2D3. In some monocytic cancer cell lines, such as HL-60 TB and U937, TGF-beta and 1,25(OH)2D3 treatment are not able to activate 5-LO gene transcription. It was demonstrated, that in these cell lines the 5-LO core promoter is heavily methylated and that only demethylation by the DNA methyltransferase inhibitor 5-aza-2 deoxycytidine (Adc) upregulated the 5-LO mRNA levels. It was also shown that the histone deacetylase inhibitor TsA could induce 5-LO mRNA levels, but only in 1,25(OH)2D3/TGF-beta inducible MM6 cells. Interestingly the 1,25(OH)2D3/TGF-beta effect on 5-LO expression is reduced, when combined with TsA. Reporter gene assays revealed that 5-LO promoter activity is strongly induced after 24 h treatment with 330 nM TsA (construct N10 up to 35 fold in HeLa cells). The effect is dependent on the presence of the proximal Sp1 binding site GC4 (-53 bp to –48 bp in relation to the major TIS) in both HeLa and MM6 cells. In vitro binding of the transcription factor Sp1 to this site has been demonstrated in gel shift assays and DNase I footprints. Mutation of the binding site resulted in a loss of basal promoter activity in both 5-LO negative HeLa cells and in 5-LO positive MM6 cells, as well as in the loss of TsA inducibility. The mutational study of different Sp1 binding sites in a larger promoter context revealed the interaction or respectively the additive effect of the multiple Sp1 binding sites of the 5-LO promoter on basal as well as on TsA upregulated promoter activity. However, GC4 seems to be of special relevance for both the basal promoter activity, possibly recruiting the basal transcription machinery, as well as for the TsA induced upregulation of 5-LO promoter activity. TsA does not alter the protein expression levels of Sp1 and Sp3 as investigated in Western blot analysis, neither in HeLa nor in MM6 cells. DNA affinity purification assays revealed that TsA had no effect on the DNA affinity of Sp1 or Sp3. In vitro binding of both Sp1 and Sp3 to the 5-fold GC box, GC4 and GC5 was demonstrated by DAPA analysis, but histone deacetylase inhibition did not change the associated protein amounts. Finally, in vivo binding of Sp1 and Sp3 was investigated in chromatin immunoprecipitation assay (ChIP) in MM6 cells. TsA clearly induced the association of both proteins to the promoter area surrounding the TIS. Upon TsA treatment also RNA polymerase II binding to the area surrounding the TIS (-318 to +52 bp) was increased and even initiated in the more distal promoter parts –1049 to –292 bp, which are negatively regulated in reporter gene assays. Interestingly histone H4 is already highly acetylated without TsA treatment and the acetylation status of H4 remains unchanged after histone deacetylase inhibition, indicating an open chromatin structure of the 5-LO gene in MM6 cells. In a cotransfection study with Sp1 and Sp3, the transactivating potential of factors was investigated and in accordance with the ChIP data, Sp1 and Sp3 increased the promoter activity, but only after TsA treatment. In gel shift assays, the influence of DNA methylation on Sp1 binding was investigated. The results indicate different roles for the three proximal promoter sites. Whereas Sp1 binding to the 5-fold GC box and GC4 is impaired by DNA methylation, binding to GC5 is even increased. A cotransfection study with methylated 5-LO promoter constructs and the murine methyl-CpG binding proteins suggest MBD1 involvement in the regulation of the 5-LO promoter. Since in gel shifts Sp1 binding is inhibited by DNA methylation, at least to the 5-fold GC box and the activating element GC4, and similarly the mutation/deletion of the same sites strongly reduces or inhibits promoter activity, it is likely to assume, that the loss of promoter activity after in vitro methylation is in the first place due to impaired Sp1/Sp3 binding. Together the data underline the importance and complexity of Sp1/Sp3 binding to the GC rich sites in the regulation of 5-LO promoter activity in response to the histone deacetylase inhibitor TsA as well as in respect to DNA methylation.
Haematopoietic stem cells (HSCs) are regarded as the prime target for gene therapy of inherited and acquired disorders of the blood system, e.g. X-linked chronic granulomatous disease (X-CGD). The major reason for this is that HSCs posses the ability to self renew as well as the potential to differentiate into all lineage-specific cell types. However, the need to reach and to maintain sufficient therapeutic levels of genetically modified stem cells and their progeny after gene delivery still presents major challenges for current HSC gene therapy approaches. In particular, one of the main limitations for most genetic defects is the lack of a selective growth advantage of gene-modified cells after engraftment. In vitro and in vivo methods have been developed that focus on either positive or negative selection of HSCs. An artificial selection advantage can be conferred to transduced HSCs by incorporating a selection marker in addition to the therapeutic transgene. In the present study, two novel strategies for positive selection of murine gp91phox gene-modified haematopoietic stem cells were developed and tested, bearing in mind that with selective growth advantage, the possibility of uncontrolled proliferation arises. The first strategy to be investigated was based on the homeobox transcription factor HOXB4, which plays an important role in the control of haematopoietic stem cell proliferation and differentiation. Overexpression of a retroviral bicistronic construct containing the therapeutic gene gp91phox and HOXB4 in murine primary bone marrow cells led to a significant 3–4-fold expansion of transduced cells ex vivo. The numbers of transgene-expressing cells increased 2–3-fold after 2 weeks cultivation under cytokine stimulation. Furthermore, the clonogenic progenitor cell assay (CFU assay) demonstrated that the number of colony-forming cells had increased to levels 2-fold higher than those of mock-transduced cells after 1 week of culture, thereby augmenting the presence of a significant number of stem/progenitor cells in the selected cell population. However, in our experiments, HOXB4-overexpressing murine HSCs did not show any repopulating advantage in transplanted recipient mice over control construct-transduced HSCs. These results indicate that selective expansion of gp91phox gene-modified HSCs can be induced by the HOXB4 transcription factor ex vivo but not in vivo. This is possibly dependent on HOXB4 expression levels, which are too low in vivo to achieve selection. The second strategy made use of a chemically inducible dimerizer system consisting of the therapeutic gene gp91phox and a fusion protein, containing sequences from a growth factor receptor signalling domain (epidermal growth factor receptor, EGFR, or prolactin receptor, PrlR) and the drug binding protein FKBP12, as the selection cassette. This strategy aimed to allow inducible selection that could be easily switched off. The activity of these fusion proteins is controlled through the small molecular dimerizer AP20187. Transduction of BaF/3 cells with lentiviral vectors expressing the EGFR construct induced proliferation and led to complete selection within 18 days (99%). However, removing AP20187 could not turn off proliferation. This construct is, therefore, not suitable as a selection cassette for the expansion of gene-modified HSCs due to its oncogenic potential. Transduction of the construct containing the intracellular domain of PrlR caused significant selective expansion of AP20187-treated BaF/3 cells. Following expression in cells, the fusion protein, which lacks membrane-anchoring sequences, mainly localized to the cytoplasm. Evidence was found to indicate that activated STAT5 might be responsible for this effect. Upon expression of the prolactin construct, phosphorylation of STAT5 and its DNA-binding activity to a ß-casein promoter sequence was strongly increased. Importantly, the induced proliferation was reversible after removal of AP20187. Transduced Sca1+ bone marrow cells obtained from C57BL/6-CD45.1 mice could be expanded about 20–100-fold ex vivo in the presence of AP20187 and mSCF without losing progenitor cell features and the capability to contribute to all lineages of the haematopoietic system. To exclude oncogenic outgrowth of one single clone, the polyclonality of selected cells was proven by ligation-mediated PCR (LM-PCR) analysis. In mouse transplantation experiments, ex vivo-expanded cells repopulated the bone marrow of lethally irradiated mice suggesting that the ex vivo expansion took place at the level of haematopoietic stem and/or progenitor cells. Genomic gp91phox sequences were detected in the bone marrow, spleen and peripheral blood cells of transplanted animals, indicating that gp91phox-containing cells most likely contributed to the reconstitution of haematopoiesis in these mice.