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Im Rahmen dieser Arbeit wurde die humane Leukotrien A4-Hydrolase untersucht.
Die hLTA4H ist ein bifunktionelles Enzym, welches neben der Hydrolaseaktivität, welche für die Umwandlung des instabilen LTA4 zu LTB4 verantwortlich ist, auch eine Peptidaseaktivität aufweist. Beide Enzymaktivitäten spielen bei Entzündungsprozessen eine wichtige Rolle, weshalb die LTA4H ein interessantes pharmakologisches Target darstellt. Aufgrund der gegensätzlichen Eigenschaften der beiden Aktivitäten der LTA4H (Produktion des proinflammatorischen LTB4 durch die Hydrolase-Aktivität, sowie der Abbau des PGP-Tripeptids durch die Peptidase-Aktivität) wird deutlich, dass die Entwicklung selektiver Hydrolase-Inhibitoren von Vorteil ist.
Das Protein der humanen LTA4H konnte erfolgreich kloniert werden und in E. coli-Zellen exprimiert werden. Zur Gewinnung des reinen rekombinanten Proteins konnte ein Aufreinigungsprotokoll mittels Nickel-Affinitätschromatographie sowie anschließender Größenausschlusschromatographie etabliert werden. Durch die Testung unterschiedlicher Lysemethoden konnte die Ausbeute deutlich erhöht werden.
Um herauszufinden, ob es durch den potentiellen Inhibitor zu einer Hemmung der Enzymaktivität kommt, muss diese detektiert werden können. Hierfür wurde ein geeignetes fluoreszenzbasiertes Testsystem zur Detektion der Enzymaktivität der hLTA4H entwickelt. Dies lässt auch die Quantifizierung der Wirksamkeit der möglichen Inhibitoren zu. Mit Hilfe eines pharmakophorbasierten Ansatzes wurden 22 Testsubstanzen für die in vitro Testung ausgewählt. Nach der Evaluierung dieser Substanzen wurden weitere 14 Derivate der besten Verbindung ausgewählt und ihre inhibitorischen Eigenschaften an rekombinanter LTA4H getestet. Die Ergebnisse wurden mittels Differential Scanning Fluorimetrie validiert, wofür ein einfaches Protokoll etabliert werden konnte.
Im Rahmen dieser Arbeit wurden weiterhin 5 bereits bekannte Inhibitoren der LTA4H ausgewählt, um sie hinsichtlich ihres thermodynamischen Profils zu untersuchen. Hierzu wurden die ausgewählten Inhibitoren mittels Isothermer Titrationskalorimetrie vermessen. Die Dissoziationskonstanten der untersuchten Inhibitoren wurden ebenfalls mittels Differential Scanning Fluorimetrie bestimmt, wobei sich zeigte, dass diese Methode nicht zur präzisen Messung von Protein/Ligand Interaktionen herangezogen werden kann. Mittels eines in silico Ansatzes zur Vorhersage von stabilisierten und destabilisierten Wassermolekülen in der Bindetasche konnten die thermodynamischen Daten im strukturellen Kontext interpretiert werden. Durch diese Kombination konnten neue Erkenntnisse zum Design neuer Inhibitoren der LTA4H gewonnen werden.
Die Arachidonsäurekaskade spielt bei Entzündungsprozessen und der Schmerzentstehung eine wichtige Rolle. Deren primäre Produkte, die Leukotriene und die Prostaglandine, sind entzündungsfördernde Mediatoren und nehmen Einfluss auf den Entzündungs-auflösendenprozess und sind bei einer Dysregulation für diverse Erkrankungen wie z.B. Asthma bronchiale und allergische Rhinitis mitverantwortlich. Die Kaskade gliedert sich mit ihren beiden Hauptenzymen, Cyclooxygenase und 5-Lipoxygenase (5-LO), in zwei Wege auf. Beide Enzyme sind außerdem in der Lage entzündungsauflösenden Mediatoren zu bilden. Die Mediatoren wie z.B. Lipoxin können im Zellstoffwechsel einerseits über die Lipoxygenase-Route, oder andererseits wie „aspirin-triggered“-Lipoxin von der durch geeignete Wirkstoffe acetylierten Cyclooxygenase-2 (COX-2) katalysiert werden. Diese Mediatoren werden benötigt, um (chronische) Entzündungen und beschädigtes Gewebe zurück zur Homöostase zu führen.
Die Pharmakotherapie chronisch entzündlicher Erkrankungen mit guter Wirksamkeit und verträglichem Profil bei Langzeiteinnahme stellt jedoch eine Herausforderung dar. Die Therapie verzögern oft, z. B bei Einnahme von nicht-steroidalen Antirheumatika (NSAR), die Entzündungsauflösung, da die Bildung von entzündungshemmenden und entzündungs-auflösenden Lipidmediatoren gehemmt werden. Die gezielte Modulation und Einflussnahme auf die Arachidonsäurekaskade an einem der beiden Enzyme, stellt daher einen guten Ansatz für eine verbesserte Therapiemöglichkeit von (chronischen) entzündlichen Krankheiten dar. Diese Arbeit beschäftigt sich mit der Synthese von Modulatoren und Inhibitoren der Arachidonsäurekaskade. Zum einen befasst sie sich mit der Entwicklung von irreversiblen COX-2-acetylierenden Substanzen als neues anti-entzündliches und entzündungsauflösendes Prinzip. Zum anderen mit der Untersuchung der Struktur-Wirkungsbeziehung (SAR) von 2-Aminothiazolen als direkte 5-LO-Inhibitoren ausgehend von SKI-II, welches zuvor als Leitstruktur zur Entwicklung von 5-LO-Inhibitoren entdeckt wurde.
Als Leitstrukturen für die irreversiblen COX-2-acetylierenden Substanzen wurden bekannte COX-2 selektive Substanzen ausgewählt sowie vereinzelte nicht-selektive NSAR. Es wurden an der COX-2 Kristallstruktur Docking-Studien durchgeführt, um die geeignetsten Positionen für die Einführung einer (labilen) Acetylgruppe zu identifizieren. Aufgrund dieser Studien wurden drei Positionen ausgewählt zur Derivatisierung. Es wurden daraufhin zahlreiche Derivate synthetisiert von Celecoxib, Valdecoxib, Rofecoxib, Etericoxib, als Vertreter der (COX-2) selektive Inhibitoren, sowie von Acetylsalicylsäure, Diclofenac und Nimesulid-Analoga als Vertreter der nicht-selektiven NSARs. Zusätzlich wurden Derivate synthetisiert mit Michael-Akzeptoren als kovalente bindende Komponente. Alle synthetisierten Substanzen wurden sukzessiv auf ihre COX inhibitorischen Eigenschaften hin untersucht und auf COX-2 Selektivitäten überprüft. Weiterhin wurden von allen Derivaten Auswaschungs-Studien durchgeführt als Vorversuche welche Derivate eine irreversible COX-2-Inhibition hervorrufen. In den Vorversuchen zeigte die Verbindung ST-1650 am deutlichsten eine COX-2-Selektivität sowie eine starke irreversible Inhibition der COX-2. Die Verbindung ST-1650 wurde weiterhin auf indirekte Hinweise zur Entstehung von heilungsfördernden Mediatoren untersucht anhand von: M1-Macrophagen Polarisation und einem Schmerzmodell, dem Zymosan-Überempfindlichkeit Pfotenmodell. Im Makrophagen-Modell konnte ST-1650 keine Phänotypverschiebung hinzu entzündungsauflösenden M2-Makrophagen bewirken, sowie in den Schmerzmodellen leider keine schnellere Schmerzauflösung als die Kontrollgruppe. Ob diese Effekte durch mangelnde oder zu geringer Entstehung von entzündungshemmenden Mediatoren zurückzuführen ist, ist noch unklar.
Für die SAR der 2-Aminothiazole als direkte 5-LO-Inhibitoren wurden über 60 Verbindungen synthetisiert und untersucht. Zu Beginn erfolgte eine Optimierung der Grundstruktur als 5-LO-Inhibitor. Es wurden die Einflüsse der Substituenten des Thiazolsrings und des Aminolinkers auf die 5-LO-Aktivität ermittelt, um die SAR initialer Arbeiten zu vertiefen. Nach der SAR-Untersuchung im intakten Zellsystem konnten durch Kombination bevorzugter Strukturelemente die zwei Verbindungen ST-1853 und ST-1906, als neue potente 5-LO-Inhibitoren entwickelt werden, die sich als nicht-toxisch herausstellten. Diese beiden 5-LO-Inhibitoren wirken um einen Faktor 10 potenter und sind weniger toxisch verglichen mit der Leitstruktur SKI-II. ST-1853 wurde innerhalb der Arachidonsäurekaskade auch auf Off-targets getestet, deren Aktivitäten sie erst bei 100-fach höherer Konzentration beeinflusst, sowie in humanem Vollblut, wo sie sich ihre 10-fach bessere Wirksamkeit im Vergleich zu SKI-II bestätigte. Darüber hinaus erwies sich ST-1853 bei den ersten Überprüfungen seiner Stabilität unter physiologischen Bedingungen wie bei der in vitro Metabolisierung durch Rattenlebermikrosomen als ausreichend stabil und daher zur weiteren Charakterisierung gut geeignet.
Diese Zusammenfassung ist in zwei Abschnitte gegliedert. Im Abschnitt 6.1. wird die physiologische Bedeutung der Glutamatrezeptoren (GluR) und ihr biologischer Hintergrund kurz erklärt. Am Ende dieses Abschnitts wird der Stand der Strukturanalyse des GluR-B Ionenkanals zu Beginn des Projektes zusammengefasst. Im nachfolgenden Abschnitt 6.2. sind die wesentlichen Ergebnisse der hier vorgelegten Arbeit zusammengefasst. 6.1. Die Bedeutung von Glutamatrezeptoren - Stand der Strukturanalyse zum Beginn dieser Arbeit Die Kommunikation zwischen Nervenzellen erfolgt vorwiegend an hochspezialisierten Kontaktstellen den chemischen Synapsen. Der enge Raum zwischen sendender und empfangender Nervenzelle wird auch als synaptischer Spalt bezeichnet. Der Prozess der synaptischen Übertragung beruht auf der präsynaptischen Freisetzung von chemischen Botenstoffen, sogenannten Neurotransmittern in den synaptischen Spalt. Die Aminosäure L- Glutamat (Glu) ist der wichtigste erregende Neurotransmitter im menschlichen Gehirn und Rückenmark. Dementsprechend bedeutend ist die Rolle der ionotropen Glutamatrezeptoren (iGluRs), die sie bei der elektrochemischen Erregungsübertragung am synaptischen Spalt spielen (Seeburg, 1993), (Hollmann and Heinemann, 1994), (Dingledine et al., 1999). Die Freisetzung von Neurotransmittern wird durch ein elektrisches Signal (Aktionspotential) ausgelöst, das sich entlang der Nervenfaser, dem Axon, bis zur Nervenendigung, der Synapse, fortpflanzt. Nach der Freisetzung diffundieren die Neurotransmitter durch den synaptischen Spalt und binden an sogenannte Rezeptoren. Ionotrope Glutamatrezeptoren sind Ionenkanäle, die in die Membran der nachgeschalteten (postsynaptischen) Nervenzelle eingebaut sind. Sie zählen deshalb zu den Membranproteinen. Als ligandgesteuerte kationenselektive Ionenkanäle machen Glutamatrezeptoren (GluRs) die postsynaptische Membran nach Aktivierung durch Ligandbindung für bestimmte Kationen durchlässig. Der Einstrom von Ionen bewirkt eine Änderung des Membranpotentials. Die Stärke der synaptischen Übertragung ist lebenslang modulierbar; die sogennante synaptische Plastizität wird als eine entscheidende Grundlage für die Erklärung von Lernen und Gedächtnis angesehen. Drei synthetische Agonisten aktivieren die GluRs selektiv und wurden deshalb für die Klassifizierung der ionotropen Glutamatrezeptoren herangezogen. Bei den Agonisten handelt es sich um -Amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazol-4-propionat (AMPA), Kainat and N- Methyl-D-Aspartat (NMDA). Die ersten beiden Subtypen werden auch als non-NMDA- Rezeptoren zusammengefasst. Die Aktivierung und Desensitivierung der non-NMDA Rezeptoren ist schneller als die der NMDA-Rezeptoren. Aus molekularbiologischer Sicht (siehe Kapitel 1.3.2.) zeigen die drei Klassen der ionotropen Glutamatrezeptoren eine beträchliche Diversität. So gibt es vier verschiedene Unterheiten vom AMPA-Subtyp, nämlich GluR-A, GluR-B, GluR-C und GluR-B. In dieser Arbeit steht die Strukturanalyse eines aus GluR-B Untereinheiten bestehenden AMPA-Rezeptors im Vordergrund. (Die weitere Unterteilung der NMDA- und Kainatrezeptoren kann dem Kapitel 1.3.2. auf Seite 6 entnommen werden.) Bestimmte Abschnitte der Aminosäurensequenz von Glutamatrezeptoren sind durch hydrophobe Bereiche gekennzeichnet ((M1-M4) in Abbildung 6.1.A (A.)). Das durch verschiedene Untersuchungen etablierte Modell der Glutamatrezeptor-Topologie zeigt 3 Transmembrandomänen (M1, M3 und M4) und eine Membranschleife (M2) (Hollmann et al., 1994), (Kuner et al., 1996). Der Aminoterminus ist extrazellulär, der Carboxyterminus hingegen intrazellulär. Daraus ergibt sich die in Abbildung 6.1.A (B.) abgebildete Topologie (Paas, 1998). S1 und S2 kennzeichnen die Ligandbindungsdomäne. Glutamatrezeptoren (GluR) sind Oligomere, die sich mit grosser Wahrscheinlichkeit aus vier Untereinheiten (Rosenmund et al., 1998), (Ayalon and Stern-Bach, 2001) zusammensetzen (siehe Kapitel 1.3.3.). Die Zusammenlagerung verschiedener Untereinheiten zu einem funktionellen Kanal setzt voraus, dass die Untereinheiten zum gleichen Subtyp gehören, d.h. AMPA Untereinheiten können nur mit anderen AMPA Untereinheiten einen Ionenkanal bilden. Das gleiche gilt für die Zusammensetzung von NMDA und Kainat-Rezeptoren. Das Modell eines tetrameren Glutamatrezeptors ist im Bild C. der Abbildung 6.1.A zu sehen. Die Bestimmung der Quartärstruktur eines vollständigen Glutamatrezeptors ist bislang nicht veröffentlicht. Die strukturelle Analyse von Proteinen erfordert die Isolierung von reinem und funktionellem Protein. Im Vergleich zu den meisten löslichen Proteinen erfordert die Isolierung von Membranproteinen oft besonderer Optimierung. Falls das Vorkommen des Proteins in natürlichem Gewebe gering ist, so kann die strukturelle Analyse durch rekombinante Expression in einem geeigneten Wirtsorganismus zugänglich gemacht werden. Die Isolierung von Milligramm-Mengen eines rekombinanten homomeren GluR-B Rezeptors aus dem entsprechenden Baculovirusexpressionssystem (Keinänen et al., 1994) wurde in unserem Labor etabliert (Safferling et al., 2001) und wurde im ersten Jahr dieses Projektes fortgeführt. Durch zonale Ultrazentrifugation konnte gezeigt werden, dass die molekulare Masse des GluR-B Proteinkomplexes ca. 495 kD beträgt. Dieser Wert liegt in der Nähe des theoretischen Molekulargewichts eines tetrameren Ionenkanals, dessen Molmasse sich aus vier GluR-B Untereinheiten (104 kD) und einer Detergenzmizelle von ca. 63-97 kD zusammensetzt (Safferling et al., 2001). Die elektronenmikroskopische Analyse des Proteinkomplexes von W. Tichelaar aus unserer Gruppe erfolgte 1999 durch Negativfärbung. Für die Strukturanalyse mit Hilfe der Software IMAGIC wurden 10 000 Proteinteilchen selektiert. Das Ergebnis der Bildrekonstruktion ist in der folgenden Abbildung 6.1.B gezeigt. Die projezierten Dimensionen des Models entsprechen einem Molekül mit den Dimensionen 17 nm × 11 nm × 14 nm. Das Model zeigt keine ausgezeichnete Symmetrie, die auf die Stöchiometrie des GluR hinweisen könnte. Das Molekül zeigt mit Färbemittel gefüllte Vertiefungen und innere Strukturen, die vielleicht an der Ionenleitung beteiligt sind. 6.2. Funktionelle und strukturelle Charakterisierung des GluR-B Ionenkanals In der Fortsetzung des oben beschriebenen Projektes wurden für die rekombinante Expression desselben Rezeptors (GluR-B homomer) stabil transformierte Insektenzellen eingesetzt. Dazu wurde die für die GluR-B Untereinheit kodierende und in Plasmiden enthaltene DNA in Insektenzellen transformiert (siehe APPENDIX A.2.2.). Im Vergleich zu dieser auf Dauerhaftigkeit angelegten Integration der Rezeptor DNA wird die Proteinexpression beim Baculovirusexpressionssystem durch Infektion mit rekombinanten Baculoviren initiiert. Der Vergleich zeigte, dass die mit Baculoviren erzielten Ausbeuten bei GluR-B etwa doppelt so hoch waren als bei stabil transformierten Zellen. Allerdings fallen bei stabil transformierten Zellen die eventuellen Nachteile der viralen Belastung auf die zellulären Sekretionsprozesse weg. Im Verlauf der elektronenmikroskopischen Analyse von baculoviral erzeugtem GluR-B Protein hat sich gezeigt, dass Proteine viralen Ursprungs unter Umständen selbst doppelt aufgereinigte GluR-B Proben verunreinigen können (siehe APPENDIX A.2.1.). Dieser Punkt ist bei einer Einzelbildverarbeitung von grosser Relevanz, falls die virusspezifischen Proteinverunreinigungen eine ähnliche Grösse haben wie das eigentliche Zielprotein. Das Hauptziel dieser Arbeit war es, das Potenzial stabil transformierter Insektenzellen für die Expression von homomeren GluR-B Ionenkanälen zu bewerten und dabei die Stöchiometrie der Untereinheiten in diesem Ionenkanal aufzuklären. Zu diesem Zweck wurden biochemische und elektronenmikrosopische Techniken eingesetzt. Zur Isolierung des GluR-B Ionenkanals aus stabil transformierten Insektenzellen wurde das bestehende Aufreinigungsprotokoll für die Affinitätchromatographie an immobilisierten Metallionen (IMAC) (Safferling et al., 2001) optimiert, indem das Chargenverfahren durch das Durchflussverfahren ersetzt wurde (zur genaueren Erklärung der Optimierung siehe RESULTS 4.1.2.). Abbildung 6.C zeigt ein silbergefärbtes Gel mit den Eluaten der IMAC und Eluaten der abschliessenden Affinitätschromatographie mit immobilisiertem M1-Antikörper. Die auf den Bahnen 5-8 aufgetragen GluR-B Proben wurden auch für die Einzelteilchenanalyse mittels Elektronenmikroskopie verwendet. Die Ligandbindungsaktivität von GluR-B wurde durch Filterbindungsexperimente mit dem Radioliganden [3H]-AMPA vor und nach der Isolierung aus den Membranfragmenten bestimmt. Die KD-Werte sind für beide Proben ähnlich gross. Der Bmax-Werte ist für die aufgereinigte Probe wie erwartet sehr viel (mehr als 200×) höher. Die Ergebnisse der Ligandbindungsexperimente sind im Kapitel 4.2.1 tabellarisch zusammengefasst. Die oligomere Struktur des isolierten Ionenkanals wurde durch Quervernetzungsexperimente (Cross-linking) und Einzelteilchenanalyse von negativ gefärbten Proteinmolekülen bewertet. Die Quervernetzungsexerimente selbst erbrachten kein eindeutiges Ergebnis im Hinblick auf oligomere Struktur des komplett zusammengesetzten Rezeptors. Kontrollexperimente mit dem Lysat vom Rattenhippocampus zeigten, dass mit DTSSP ein geeigneter Cross-Linker verwendet wurde (siehe RESULTS 4.3.2.). Neben einem aus 4 Banden bestehenden Muster (siehe RESULTS 4.3.1.) lieferten die Quervernetzungsexperimente mit isoliertem GluR-B aber einen deutlichen Hinweis auf die Stabilität von dimeren GluR-B Strukturen, die im Einklang mit einer jüngst veröffentlichten Arbeit stehen (Ayalon and Stern-Bach, 2001). Diese Veröffentlichung liefert zusätzliche (Armstrong et al., 1998) Hinweise auf die Bedeutung von Dimeren in der Glutamatrezeptorstruktur und postuliert, dass sich ein kompletter Glutamaterezeptor aus einem Dimer-Paar zusmmensetzt, wobei die Dimere zuerst gebildet werden. Die nachfolgende Abbildung 6.2.B zeigt negativ gefärbte GluR-B Ionenkanäle bei einer 46000× Vergrösserung. Die Aufnahme stammt von einem Philips EM 400 Elektronenmikroskop. Für die 3D Rekonstruktion wurden 500 der in Abbildung 6.2.B gezeigten Rezeptormoleküle ausgewählt. Dieser relativ kleine Datensatz besteht aus GluR-B Ionenkanälen deren Präservierung in Uranylacetat als besonderes vielversprechend eingeschätzt wurde. Dieser positive Effekt wurde auf die Verwendung frisch von einer Wasseroberfläche aufgefischter Kohlefilme zurückgeführt (siehe RESULTS 4.4.3.3.). Während der Klassifizierung dieses Datensatzes fiel auf, dass die beim Band-Pass-Filtern für die niedrigen Frequenzen gesetzten Cut-offs einen deutlichen Einfluss auf die erste Klassifizierung der unterschiedlichen zweidimensionalen Ansichten des Proteinkomplexes haben (siehe RESULTS 4.4.3.4.). Aus diesem Grund wurde der gleiche Datensatz mit 5 verschiedenen low-frequency cut-offs (LFCO) gefiltert (siehe Table 4.4.3.4.) und getrennt klassifiziert. Von den 5 resultierenden Klassifikationen wurden 3 (LFCO 0,005, 0,03 und 0,05) für die weiterführende 3D Rekonstruktion ausgewählt. Die Evaluierung der resultiernden 3D Modelle ergab, dass der mit einem LFCO von 0,03 gefilterte Datensatz eine Klassifikationen erlaubte, die zu einem 3D Modell (Modell GluR-BII/a siehe RESULTS Figure 4.4.3.4.H) führte, das im Vergleich zu den beiden anderen Rekonstruktionen konsistenter war. Am stärksten spricht für dieses Modell die Übereinstimmung der Input-Projektionen mit den Reprojektionen der 3D Rekonstruktion (siehe siehe RESULTS Figure 4.4.3.4.H). Zur Verfeinerung des Modells GluR-BII/a wurden die beiden Projektionen mit der höchsten Standardabweichung vom Klassendurchschnitt (class average) eliminiert. Die verbleibenden 11 Projektionen bildeten die Input-Projektionen für die Berechung eines verfeinerten Modells, GluR-BII/b, das auf einer neuen Zuordnung der Euler-Winkel beruht. Das Ergebnis dieser Berechung ist in der nachfolgenden Abbildung gezeigt. Das Modell in Abbildung 6.2.C zeigt einen zentralen Kanal und hat die Dimensionen 18 nm × 14 nm × 11 nm. Die Stöchiometrie der Untereinheiten ist aus dem Modell, das mit grosser Wahrscheinlichkeit einen komplett zusammengesetzten GluR darstellt, nicht ablesbar. Ebensowenig zeigt das Modell eine eindeutig vierzählige oder fünfzählige Symmetrie. Allerdings ist die erkennbare zweizählige Symmetrie im Einklang mit dem vorgeschlagenen Pair-of-Dimer Modell (Ayalon and Stern-Bach, 2001), das auf eine teramere Struktur des oligomeren Ionenkanals schliessen lässt. Die Ergebnisse dieser Arbeit zeigen, dass stabil transifzierte Insektenzellen eine durchaus geeignete Quelle für GluR-B Ionenkanäle sind. Nachteilig sind die geringen Ausbeuten. Allerdings kann durch weitere Selektion der Zellen die GluR Expression noch gesteigert werden (siehe APPENDIX A.2.2.). Bei höheren GluR-B Ausbeuten könnte zukünftig auch die Detektion des Rezeptors in vitrifizierten Proben in Verbindung mit Kryo-Elektronen- mikroskopie und auch die 2D-Kristallisation gelingen. Die während dieses Projekts gemachten Kristallisationsexperimente (siehe APPENDIX A.3.) und Kryo-Experimente mit GluR-B Protein aus dem Baculovirusexpressionssystem (siehe RESULTS 4.4.1. und 4.4.2.) ergaben negative Ergebnisse. Das Potential der Kryo-Methode konnte allerdings in Kontrollexperimenten mit Tabak-Mosaik-Virus (TMV) gezeigt werden. Kryo-Daten von GluR-B würden die Berechnung eines genaueren Strukurmodells erlauben. Die Reprojektionen des hier besprochenen Strukturmodells GluR-BII/b aus der Abbildung 6.2.C könnten als Referenzen für das Alignment der vitrifizierten GluR Ionenkanäle dienen. Für das langfristige Ziel der Rekonstituition des Rezeptors in Liposomen sollte die Delipidierung des Membranproteins während der Aufreinigung möglichst reduziert werden. Hier erscheinen zwei Ansätze sinnvoll. Die Aufreinigung des Proteins in einem Schritt durch die Erweiterung des tags am Carboxyterminus von nur 6 auf 10 Histidin-Reste. Ausserdem gibt es Hinweise, dass die Anwesenheit von Lipiden während der Aufreinigung für seine Rekonstituierbarkeit förderlich ist (Huganir and Racker, 1982).
Die NO/cGMP-Kaskade spielt bei der nozizeptiven Transmission im Hinterhorn des Rückenmarks eine wichtige Rolle. In der vorliegenden Arbeit wurden bekannte cGMP-Targets (PKG-1, CNG-Kanäle, PDE-2 und -3) sowie synaptische Vesikelproteine (Synapsin 2, Rabphilin) als potentielle Targets der NO/cGMP-Kaskade mit Hilfe von molekularbiologischen Methoden und nozizeptiven Verhaltensstudien hinsichtlich einer Beteiligung an der nozizeptiven Transmission im Rückenmark untersucht. Im Formalintest reduzierte der PKG-1-Inhibitor Rp-8-Br-cGMPS (0,1 - 0,5 µmol i.t.) die nozizeptive Antwort, während der PKG-1-Aktivator 8-Br-cGMP in hoher Dosis (2,5 µmol i.t.) einen gegenteiligen Effekt zeigte. Überraschenderweise wirkte 8-Br-cGMP in niedriger Dosis (0,1 - 0,25 µmol i.t.) antinozizeptiv, was durch die gleichzeitige Applikation des PKG-Inhibitors weiter verstärkt wurde. Im Gegensatz zu Rp-8-Br-cGMPS oder 8-Br-cGMP beeinflussten weder der CNG-Kanal-Inhibitor L-cis-Diltiazem (0,5 mg i.t.), noch die PDE-Inhibitoren EHNA (0,25 µmol i.t.) oder Milrinon (5 - 10 mg/kg i.p.) die nozizeptive Antwort im Formalintest. Mit Western Blot-Analysen konnte gezeigt werden, dass die Formalininjektion in eine Hinterpfote im Lumbalmark nach 48 - 96 h eine Steigerung der PKG-1-Proteinkonzentration zur Folge hat. Dies wurde durch Vorbehandlung der Versuchstiere mit Rp-8-Br-cGMPS (0,1 - 0,5 µmol i.t.) oder Morphin (2,5 - 5 mg/kg i.p.) verhindert, während 8-Br-cGMP (2,5 µmol i.t.) die Formalin-induzierte Steigerung der PKG-1-Konzentration im Lumbalmark verstärkte. Die Formalininjektion in eine Hinterpfote veränderte auch die Synapsin 2b-Konzentration im Lumbalmark: 10 min bis 8 h nach der Injektion wurde die Synapsin 2b-Proteinkonzentration gesenkt, nach 48 h war jedoch eine Zunahme zu beobachten. Diese späte Zunahme der Synapsin 2b-Proteinkonzentration wurde durch eine Steigerung der Genexpression hervorgerufen, denn mit quantitativer Realtime RT-PCR wurden erhöhte mRNA-Konzentrationen 24 - 48 h nach der Formalininjektion gemessen. Die rasche Formalin-induzierte Abnahme der Synapsin 2b-Proteinkonzentration ging jedoch weder mit Änderungen der mRNA-Konzentration, noch mit veränderten Solubilisierungseigenschaften bei der Proteinaufbereitung einher, und wurde durch Vorbehandlung der Versuchstiere mit Morphin (10 mg/kg i.p.), Diclofenac (10 mg/kg i.p.), Metamizol (1 g/kg i.p.) oder dem NOS-Inhibitor L-NAME (10 - 100 mg/kg i.p.) verhindert. Demgegenüber führte die Vorbehandlung mit dem NO-Donor NOC-5 (4 - 20 µg i.t.), 8-Br-cGMP (0,1 - 2,5 µmol i.t.), Rp-8-Br-cGMPS (0,1 - 0,25 µmol i.t.) oder der Kombination von 8-Br-cGMP und Rp-8-Br-cGMPS (0,1 + 0,1 und 0,5 + 0,5 µmol i.t.) zu einer Verstärkung der Formalin-induzierten raschen Senkung der Synapsin 2b-Konzentration. Die funktionelle Relevanz dieser Befunde wurde in mehreren nozizeptiven Tiermodellen überprüft. Durch eine kontinuierliche i.t. Infusion von Antisense-Oligonukleotiden wurde die Synapsin 2-Konzentration im Lumbalmark der Ratte gesenkt, was eine Reduktion der nozizeptiven Antwort im Formalintest zur Folge hatte. Bei Synapsin 2-Knockout-Mäusen war im Vergleich zu Wildtyp-Mäusen eine verminderte nozizeptive Antwort im Formalintest und eine Reduktion der mechanischen Hyperalgesie bei Zymosan-induzierter Pfotenentzündung zu beobachten. Im Hot-Plate-Test zeigten die Knockout-Mäuse im Vergleich zu Wildtyp-Mäusen kürzere Latenzzeiten. Im Gegensatz zu Synapsin 2b wurde die Rabphilin-Konzentration im Lumbalmark durch Formalininjektion in eine Hinterpfote nicht beeinflusst. Allerdings führte die Verabreichung von Metamizol (500 mg/kg i.p.) oder Diclofenac (5 mg/kg i.p.) nach 1 h zu einer Steigerung der Rabphilin-Proteinkonzentration, welche nicht von Änderungen der mRNA-Expression begleitet war. Eine Senkung der Rabphilin-Proteinkonzentration wurde durch Applikation von NOC-5 (4 - 20 µg i.t.), 8-Br-cGMP (0,5 - 2,5 µmol i.t.), oder Rp-8-Br-cGMPS (0,1 - 0,25 µmol i.t.) hervorgerufen. Zusammenfassend bestätigen diese Ergebnisse die Hypothese, dass im Rückenmark PKG-1 einen Effektor der NO-induzierten Hyperalgesie darstellt. Darüber hinaus konnte gezeigt werden, dass NO/cGMP über noch unbekannte Mechanismen die Verfügbarkeit bestimmter synaptischer Vesikelproteine moduliert, die vor allem bei starker oder anhaltender nozizeptiver Erregung für die Transmitterausschüttung und damit für die nozizeptive Transmission notwendig sind. Interessanterweise führt NO/cGMP über diese Mechanismen eher zur Hemmung der Nozizeption, was die bei niedrigen intrathekalen Dosen beobachteten antinozizeptiven Effekte von 8-Br-cGMP erklären kann. Die These der NO-induzierten Hyperalgesie kann aufgrund der Untersuchungen in dieser Arbeit und früherer Studien um eine insbesondere in niedriger Dosis auftretende NO/cGMP-vermittelte Antinozizeption erweitert werden.
Charakterisierung der Amyloidplaque-assoziierten Entzündungsreaktion in APP23 transgenen Mäusen
(2009)
Ein charakteristisches Merkmal der Alzheimer-Krankheit ist die Ablagerung von Amyloid-beta (A beta) Protein im Gehirn. Die Proteinaggregate bilden Plaques, in deren Umgebung eine chronische Entzündungsreaktion nachgewiesen werden kann. Welche Rolle diese plaqueassoziierte Inflammation für die Pathogenese der Alzheimerschen Krankheit spielt, ist unklar. Es wird diskutiert, dass es sich um einen Versuch des Immunsystems handelt, A beta durch Prozessierung und Phagozytose aus dem Gehirn zu entfernen. Durch die dadurch entstehende chronische Entzündung könnten Nervenzellen in der Umgebung von Plaques geschädigt werden ("bystander attack"). Ein Schritt zu einem besseren Verständnis der plaqueassoziierten Entzündungsprozesse und ihrer pathogenetischen Bedeutung ist die Aufklärung der zugrunde liegenden molekularen Mechanismen. Daher beschäftigt sich die vorliegende Arbeit mit drei zentralen Fragen: (1) Welche Moleküle sind an der plaqueassoziierten Entzündungsreaktion beteiligt? (2) Sind ausgewählte Kandidatenmoleküle (Toll-like Rezeptoren, SOCS) in der Umgebung von Plaques reguliert? (3) Welche Rolle spielen Entzündungsmediatoren aus Endothelzellen in der Nähe von Plaques? Die plaqueassoziierten Entzündungsprozesse wurden im Gehirn von alten APP23 transgenen Mäusen, einem Modell der Alzheimer-Erkrankung, untersucht. Plaques, plaquenahes Gewebe und plaquefreies Gewebe wurden mittels Laser Mikrodissektion ausgeschnitten und anschließend mit Hilfe von Mikroarrays und quantitativer RT-PCR analysiert. Dazu wurden zwei methodische Ansätze gewählt: Im ersten Teil der Arbeit wurden in einem hypothesenfreien Ansatz neue regulatorische Kandidatenmoleküle identifiziert, unter ihnen der Rezeptor Trem2. Dabei konnten sowohl eine erhöhte plaqueassoziierte mRNA als auch eine erhöhte Protein Expression von Trem2 sowie dessen Lokalisation auf Mikrogliazellen nachgewiesen werden. Trem2 spielt anscheinend eine Rolle bei der Herbeiführung eines mikroglialen Aktivierungsstatus, der die Phagozytose unterstützt, während die Entstehung von proinflammatorischen Zytokinen unterdrückt wird. Im zweiten Teil der vorliegenden Arbeit wurde mit einem hypothesenbasierten Ansatz die plaqueassoziierte mRNA Expression von Molekülen untersucht, die bereits in anderen Untersuchungen mit der Alzheimer-Erkrankung in Zusammenhang gebracht wurden. Dabei konnte eine erhöhte plaqueassoziierte mRNA Expression der Toll-like Rezeptoren Tlr2, 4 und 9 sowie einzelner SOCS in APP23 transgenen Mäusen nachgewiesen werden. Tlr2 und 4 sind in der Lage, Mikrogliazellen und andere phagozytierende Zellen zu aktivieren und werden mit der Aufnahme und Beseitigung von Amyloid-beta in Verbindung gebracht. Im dritten Teil der Arbeit wurde ebenfalls mit einem hypothesenbasierten Ansatz die mRNA Expression von plaqueassoziiertem Endothelgewebe überprüft. Dabei konnte eine erhöhte mRNA Expression von MIP-1 alpha und CXCL10, zwei Entzündungsmediatoren aus der Familie der Chemokine, in plaqueassoziiertem Endothelgewebe gezeigt werden. Es kann daher davon ausgegangen werden, dass auch das Endothelgewebe an der Entzündungsreaktion beteiligt ist. Die Ergebnisse dieser Arbeit tragen zu einem besseren Verständnis der plaqueassoziierten Entzündungsreaktion im Rahmen der Alzheimer-Erkrankung bei. Die Aufklärung der Pathogenese der Alzheimer-Erkrankung ist entscheidend, um in den nächsten Jahren und Jahrzehnten neue und effektive Medikamente zur Behandlung dieser schweren Demenzerkrankung zu entwickeln.
Antikarzinogene Effekte konnten mehrfach für sowohl klassische NSAIDs als auch für selektive COX-2-Inhibitoren belegt werden, wobei Celecoxib eine herausragende Stellung einnimmt und als einziges NSAID zur Behandlung der familiären adenomatösen Polyposis den Zulassungsstatus erreicht hat. Dimethylcelecoxib (DMC), ein Strukturanalogon des Celecoxibs, zeigte aufgrund einer strukturellen Molekülaufweitung in vitro in Konzentrationen kleiner 100 µM keine Hemmung der COX-2. Dennoch weist dieses Molekül ähnliche antikarzinogene Eigenschaften auf und wird daher häufig als Vergleichssubstanz zu Celecoxib verwendet, um COX-abhängige Mechanismen von COX-unabhängigen zu trennen. In der vorliegenden Arbeit konnte für DMC eindeutig gezeigt werden, dass es in vitro die PGE2-Synthese in den drei humanen Krebszellen HeLa, A-549 und HCA-7 im niedrigen mikromolaren Bereich hemmt. Da DMC weder die COX-Aktivität noch die Proteinexpression der COX-Isoenzyme in HeLa-Zellen beeinflusst, muss diese Substanz mit anderen Enzymen des PGE2-Syntheseweges interagieren. Die mPGES-1 zeigte wie die COX-2 eine gesteigerte Expression in einer Vielzahl von Tumorgeweben. Eine daraus resultierende gesteigerte PGE2-Produktion erwies sich durch die Wirkung auf spezifische Rezeptoren als prokarzinogen. DMC zeigte in einem zellfreien Assay eine Hemmung der mPGES-1-Aktivität bis zu einem maximalen Effekt von 65 % und einer daraus resultierenden IC50 von ca. 16 µM. Daneben konnte DMC in HeLa-Zellen auch die Protein- und mRNA-Expression der mPGES-1 in Konzentrationen größer 15 µM hemmen. Die Analyse der Gesamtprostanoide in Krebszellen nach DMC-Behandlung zeigte eine Hemmung der Synthese aller vorhandenen Prostanoide. Da extern zugesetzte Arachidonsäure diesen Effekt von DMC sowohl in HeLa- als auch in HCA-7-Zellen unterbinden konnte, war eine Hemmung der Arachidonsäurefreisetzung durch Beeinflussung der Phospholipasen A2 nahe liegend. Es konnte für DMC eine Hemmung der cPLA2a-Aktivität in einem in vitro Assay mit einer IC50 von 58 µM gezeigt werden. Die zur Steigerung der Aktivität notwendige Translokation der cPLA2a vom Cytosol zu intrazellulären Membranen sowie die Phosphorylierung am Serin505 blieben wie auch die Gesamtproteinexpression der cPLA2a von DMC unbeeinflusst. Somit konnte für DMC in vitro eine Hemmung von mPGES-1 und cPLA2a nachgewiesen werden. Jedoch wurden in vitro weitaus höhere Konzentrationen an DMC eingesetzt, um diese Enzyme zu hemmen, als für die Hemmung der PGE2-Produktion in intakten Zellen benötigt wurde. Für die bereits wiederholt gezeigte antiproliferative Wirkung von DMC in vitro konnte die PGE2-Unabhängigkeit bestätigt werden. Aufgrund der hier dargestellten Ergebnisse kann DMC jedoch nicht mehr als COX- und Prostaglandin-unabhängige Kontrollsubstanz im Vergleich zu anderen Coxiben eingesetzt werden. Für die mehrfach beschriebenen antiproliferativen Wirkungen von Celecoxib und DMC sowie die Hemmung der identifizierten Zielmoleküle wurden in vitro meist sehr hohe Konzentrationen benötigt. Die Relevanz dieser Ergebnisse wird daher stark diskutiert, da die in vivo erreichten Plasmakonzentrationen von Celecoxib nicht mit den hohen Konzentrationen in vitro korrelieren. Im zweiten Teil dieser Arbeit wurde zunächst gezeigt, dass DMC und Celecoxib eine intrazelluläre Anreicherung in verschiedenen humanen Krebszelllinien und in vaskulären Endothelzellen aufweisen. In den untersuchten Zellsystemen wurden im Vergleich zu den restlichen Coxiben für Celecoxib und DMC ca. 5 - 10-fach höhere intrazelluläre Konzentrationen erreicht, die linear von den eingesetzten Konzentrationen abhängig waren. DMC und Celecoxib zeigten dabei eine Akkumulation in zelluläre Membranstrukturen und hier insbesondere eine Interaktion mit den lipophilen Bestandteilen des Phospholipidbilayers, was mittels subzellulärer Fraktionierung und zweidimensionaler 1H MAS NOESEY NMR-Spektroskopie nachgewiesen werden konnte. Die intrazelluläre Anreicherung für DMC und Celecoxib ist vermutlich vom Zelltyp und der Lipidzusammensetzung der vorliegenden Membran abhängig, da dieser Effekt in Fibroblasten nicht bestätigt werden konnte. Des Weiteren konnte gezeigt werden, dass die Beeinflussung der Membranintegrität neben der Anreicherung in Phospholipidmembranen zu einer effizienteren COX-2-Hemmung durch Celecoxib im Vergleich zu Rofecoxib und Etoricoxib in HCA-7 Zellen führte. Im humanen COX-2-Vollblutassay wurden hingegen ähnliche Effektivitäten der Coxibe auf die COX-2 nachgewiesen. Eine Steigerung der Wirksamkeit von Celecoxib oder DMC auf Membran-gebundene oder Membran-assoziierte Enzyme, die eine Affinität gegenüber diesen Substanzen aufweisen, wäre somit denkbar und würde speziell in solchen Krebszellen eine Rolle spielen, wo durch eine erhöhte Aktivität dieser Enzyme eine verstärkte Proliferation und Überlebensrate nachgewiesen werden konnte. Pharmakokinetische Studien zeigten für Celecoxib im Vergleich zu anderen Coxiben ein vielfach höheres Verteilungsvolumen. Somit besteht die Möglichkeit, dass sich Celecoxib in solche tieferen Kompartimente einlagert, die vermehrt durch hydrophobe Membranstrukturen gekennzeichnet sind. Aufgrund der hier beschriebenen Ergebnisse ist anzunehmen, dass in intakten Zellen die Wirkung von Celecoxib und DMC auf Zielmoleküle mit einer gewissen Affinität zu diesen Substanzen stärker ist als in vitro und so die Diskrepanz zwischen den Wirkkonzentrationen in vitro und in vivo erklärt werden kann.
Proliferation and apoptosis are fundamental cellular processes that are important for the development and homeostasis of multi-cellular organisms. Deregulation of these processes plays an important role in tumor formation. Often, genes that control homeostasis by regulating proliferation and apoptosis are mutated or improperly expressed in tumors. In this project, the physiological and pathological functions of FUSE Binding Protein 1 (FBP1) were studied to elucidate the involvement of this gene in the context of embryonic development and tumorigenesis. Two reasons led to the hypothesis that FBP1 might be relevant in this context. FBP1 was isolated in the group of PD Dr. Martin Zörnig using a functional yeast survival screen for the identification of anti-apoptotic genes involved in tumorigenesis, and the anti-apoptotic function of FBP1 was confirmed in the human colon carcinoma cell line RKO. In addition, FBP1 had been published to function as a transcriptional regulator that activates expression of the proto-oncogene c-myc. This gene stimulates cell proliferation and is overexpressed in many tumors. Analysis of FBP1 expression by immunhistochemistry in normal and tumor tissue samples revealed frequent and significant overexpression of FBP1 in Hepatocellular Carcinoma (HCC). To study the functional relevance of FBP1 activity for this tumor type, apoptosis and proliferation of the HCC cell line Hep3B were studied in dependence of FBP1 expression. Downregulation of FBP1 by lentiviral expression of FBP1-specific short hairpin RNA (shRNA) reduced proliferation and increased sensitivity to apoptosis. Subcutaneous injection of FBP1-deficient Hep3B cells into immunodeficient NOD/SCID mice demonstrated that tumor growth was strongly decreased in comparison to control cells. mRNA expression studies by quantitative real time PCR showed reduced mRNA levels of the pro-apoptotic genes Bik, Noxa, TRAIL and TNF-􀀁 in the absence of FBP1. In addition, the cell cycle inhibitors p21 and p15 were repressed by FBP1 while Cyclin D2 expression was decreased in the absence of FBP1. Surprisingly, expression of c-myc was not altered by FBP1 downregulation, indicating a different mechanism of c-myc regulation in HCC cells. These results demonstrate that overexpression of FBP1 inhibits apoptosis and stimulates proliferation in HCC cells by regulating the transcription of relevant target genes. Therefore, FBP1 might represent a promising therapeutic target for the treatment of HCC. For analysis of the physiological function of FBP1, a gene trap mouse model was established. In these mice, the gene trap vector pT1􀀂geo is inserted in intron 19 of the FBP1 locus, leading to the expression of a fusion protein consisting of a truncated FBP1 (lacking the last 62 amino acids), 􀀁-Galactosidase and Neomycin Phosphotransferase. Luciferase reporter assays demonstrated that the fusion protein was not capable of activating the c-myc promoter and even showed a dominant negative effect. Thus, this gene trap mouse serves as a functional FBP1 knockout model. Phenotyping of the FBP1 gene trap mice showed that homozygous mutation of FBP1 resulted in embryonic lethality at late stages of embryonic development (E15.5-E16.5). Heterozygous mice were viable, but born at lower frequencies, indicating a gene dosage- or a dominant negative effect of the FBP1 fusion protein. The cellular effects of FBP1 inactivation were tested in mouse embryonic fibroblasts isolated from FBP1 gene trap mice. While proliferation was reduced in the absence of wildtype FBP1, apoptosis was not affected. Expression analysis showed that in homozygous MEFs p15 and p21 transcripts were upregulated, while decreased cmyc mRNA levels were measured. Closer inspection of homozygous gene trap embryos revealed an anemic phenotype that appeared most pronounced around embryonic day 15.5. Analysis of fetal livers, the main site of hematopoiesis at this stage of development, showed a strongly reduced total cell number in homozygous embryos. Evaluation of the different hematopoietic cell lineages did not reveal significant changes in particular differentiated cell types. Instead, all cell lineages seemed to be affected equally by FBP1 inactivation. In contrast, analysis of hematopoietic progenitor cell populations showed an increased percentage of multipotent progenitor cells (MPPs) and a strongly reduced number of long-term hematopoietic stem cells (LT-HSCs). Functional analysis of MPPs by in vitro colony formation assays demonstrated that the FBP1-mutant cells possess a normal colony formation potential while their expansion capacity was reduced. Competitive transplantation of lineage negative fetal liver cells into irradiated recipient mice resulted in reduced engraftment of liverderived progenitor cells from homozygous FBP1 gene trap mice. However, stable engraftment was observed over a period of 12 weeks, demonstrating that the FBP1-deficient LT-HSCs are in principle capable of long-term repopulation. These results demonstrate that FBP1 exerts an essential function during definitive hematopoiesis. It can be speculated that FBP1 influences proliferation, apoptosis and possibly also stem cell self-renewal through the regulation of specific target genes within the hematopoietic progenitor cells. Alternatively, extrinsic effects caused by the absence of FBP1 activity could impair the function of the progenitor cells.
Der Produktion von Interleukin-8 (IL-8), Hämoxygenase-1 (HO-1), und dem vaskulären endothelialen Wachstumsfaktor (VEGF) wird zunehmend größere Bedeutung im Rahmen der Regulation der Immunantwort bei Entzündung, Infektion und Tumorwachstum zugemessen. Ziel dieser Arbeit war die Untersuchung der Regulation dieser Botenstoffe in vitro durch Verwendung der humanen Dickdarmkarzinomzellinie DLD-1. Die Substanz Pyrrolidinedithiocarbamate (PDTC) verstärkt nicht nur die durch Tumornekrosefaktor-a (TNF-a) vermittelte Ausschüttung von IL-8, sondern induziert auch als alleiniger Stimulus die IL-8-Sekretion. Mutationsanalysen des IL-8-Promotors und "Electrophoretic Mobility Shift" Untersuchungen (EMSA) zeigten, daß die Aktivierung des Transkriptionsfaktors AP-1 (Aktivator Protein-1) und die Bindungsaktivität von konstitutiv aktiviertem NF-KB in DLD-1 Zellen für die PDTC induzierte IL-8 Expression zwingend erforderlich waren. Weiterhin war PDTC in der Lage in DLD-1 Zellen neben IL-8 auch die Expression von HO-1 und VEGF zu verstärken. Die Induktion von IL-8 durch PDTC war nicht nur auf DLD-1 Zellen beschränkt, sondern wurde auch in Caco-2 Zellen (ebenfalls Dickdarmkrebszellen) und in humanen mononukleären Blutzellen beobachtet. Die Verwendung von PDTC wird seit kurzem als Kombinationspräparat für Zytostatia zur Behandlung von verschiedenen bösartigen Tumoren, unter ihnen auch Darmkrebs, vorgeschlagen. Aus unseren Versuchen läßt sich ableiten, daß die Induktion von IL-8, HO-1 und VEGF die therapeutische Anwendung dieser Substanz nachteilig beeinflussen könnte. Dies ergibt sich daraus, daß alle drei genannten Faktoren durch proangiogene Wirkungen das Tumorwachstum fördern. Die Expression der induzierbaren Stickoxidsynthase und die Produktion von Stickoxid (NO) korreliert mit der Angiogenese bei verschiedenen Krebserkrankungen darunter Melanome, Tumore im Hals- und Kopfbereich und Darmkrebs. Da tumorbegünstigende Funktionen von NO mit vermehrter Angiogenese in Verbindung gebracht werden, wurden die Effekte von NO hinsichtlich der Produktion von ausgesuchten Chemokinen, die an der Steuerung des Tumorwachstums beteiligt sind, untersucht. Zu diesen Chemokinen gehören das proangiogene IL-8 sowie das tumorsuppressiv durch Interferon induzierbare Protein-10 (IP-10) und das Monokin induziert durch Interferon-y (MIG). Diese Chemokine werden, nach Stimulation mit IL- 1ß und lnterferon-? (IFN-?) von DLD-1 Zellen, ausgeschüttet. Unter diesen Bedingungen wird die IL-8 Freisetzung alleine durch IL-1ß vermittelt, aber nicht durch INFy. Im Gegensatz zu IL-8 hängt die Sekretion von IP-10 und MIG von der Aktivierung durch IFNy ab. Die Effekte von NO wurden analysiert indem DLD-1 Zellen mit dem NO-Donor DETA-NO inkubiert wurden. DETA-NO besitzt eine Halbwertzeit von 16,5h und simuliert damit die Effekte der endogenen NO-Synthase. Synthese und Freisetzung von IL-8 wurden durch die Behandlung mit NO stark gesteigert. Außerdem wurde in Zellen die dem NO-Donor ausgesetzt wurden die basale Sekretion des VEGF signifikant verstärkt. Dies steht im Gegensatz zur IL-Iß/IFNy-induzierten Produktion von IP-10 und MIG, beide wurden durch Koinkubation mit NO unterdrückt. Ebenso wurde die Regulation der IFNy abhängigen induzierbaren Stickoxidsynthase in DLD-1 Zellen von NO unterdrückt. Die vorliegenden Daten ergänzen vorherige Studien, in denen NO mit Tumorangiogenese und verstärkten Tumorwachstum in Verbindung gebracht wird. Die NO vermittelte Induktion von IL-8 und VEGF, ebenso wie die Verminderung der IP-10 and MIG Expression, könnte zu diesem Phänomen beitragen. Unsere Studien stützen die Hypothese, daß spezifische lnhibitoren der iNOS therapeutischen Nutzen bei humanen Neoplasien haben könnten.
Antigen-präsentierende Zellen spielen eine wichtige Rolle bei der Entstehung einer Kontaktallergie. Ziel dieser Arbeit war es, frühe Mechanismen der Signaltransduktion zu identifizieren, die an der Aktivierung von Antigen-präsentierenden Zellen durch Kontaktallergene beteiligt sind. · Monocyten und dendritische Zellen wurden auf ihre Eignung als Modell für epidermale Langerhanszellen hin untersucht. Die Aktivierbarkeit von Monocyten und dendritischen Zellen konnte durch den Anstieg der Tyrosinphosphorylierung nach Stimulation mit verschiedenen Kontaktallergenen gezeigt werden. Die durch Kontaktallergene induzierte TNF-alpha-Produktion von dendritischen Zellen belegt die funktionelle Relevanz des Modellsystems. · Ausgehend von der Bedeutung von Cytokinen für die Differenzierung von myeloiden Zellen wurde untersucht, ob Kontaktallergene die mit Cytokin-Rezeptoren assozierten Signalwege des Jak/STAT-Systems aktivieren. Es konnte keine Aktivierung von STAT-Moldekülen (STAT1, 3, 4, 5, 6) durch Kontaktallergene nachgewiesen werden. Daher ist davon auszugehen, daß Kontaktallergene die üblichen Jak/STAT-Signalwege nicht direkt aktivieren, weder durch Bindung an Jak-assoziierte Cytokin-Rezeptoren noch über deren downstream-Elemente. · Die Aktivierung der MAP Kinasen ERK und p38 durch verschiedene Kontaktallergene wurde charakterisiert. MCI/MI und TNCB aktivieren ERK und p38. Nicht alle Kontaktallergene bewirken die gleichen Aktivierungsmuster. Die Phosphorylierung von ERK durch MCI/MI wurde im Vergleich zur Aktivierung von p38 als früher Mechanismus der Signaltransduktion charakterisiert. Die Beteiligung von ERK und p38 an der TNF-alpha-Induktion durch MCI/MI belegt die Relevanz dieser MAP Kinasen für die Aktivierung von dendritischen Zellen. · Weiterhin wurden eine Reihe von upstream-Elementen von ERK untersucht. Die Aktivierung von ERK durch MCI/MI und TNCB verläuft nicht über den klassischen Ras-c-Raf-MEK-ERK Signalweg. Während MEK1/2 an der Aktivierung von ERK durch MCI/MI und TNCB beteiligt ist, werden c-Raf und Ras nicht aktiviert. · Die intrazelluläre Calcium-Konzentration ist wichtig für die ERK-Aktivierung durch MCI/MI und TNCB, extrazelluläres Calcium dagegen ist nicht erforderlich. Das Modellallergen MCI/MI bewirkt die Mobilisierung von intrazellulärem Calcium. Der Anstieg von [Ca2+]i allein jedoch löst keine Aktivierung von ERK aus. Das durch MCI/MI induzierte Calcium-Signal wird nicht durch Calmodulin vermittelt. · Durch Inhibition von Proteinkinase C konnte nachgewiesen werden, daß vorwiegend klassische Calcium-abhängige Isoformen der PKC an der Aktivierung von ERK durch MCI/MI beteiligt sind. Die Translokation von cPKC-Isoformen weist auf deren Aktivierung durch MCI/MI und TNCB hin. Die Inhibition von PI3-Kinase hingegen lieferte keinen Hinweis auf Beteiligung an der Aktivierung von ERK durch MCI/MI. Mit den Ergebnissen dieser Arbeit konnte auf der Grundlage der aktuellen Literatur ein möglicher Signalweg der Aktivierung von ERK durch Kontaktallergene entwickelt werden. Auslöser der Signalmechanismen wäre die Kopplung von Haptenen an ein heterodimeres (an die tTG siehe Zahn 2002) oder heterotrimeres G-Protein. Eine wichtige Rolle bei der Signalweiterleitung spielen die Freisetzung von Calcium aus intrazellulären Speichern, klassische Isoformen der Proteinkinase C und die MAPK Kinase MEK1/2. Sowohl ERK als auch p38 sind an der Induktion der TNF-alpha-Produktion durch Kontaktallergene in dendritischen Zellen beteiligt. Damit liefert diese Arbeit einen wesentlichen Beitrag zum Verständnis der molekularen Mechanismen bei der Aktivierung von dendritischen Zellen durch Kontaktallergene.
Die LC/MS/MS Methoden zur Quantifizierung des selektiven COX-2-Hemmers Celecoxib und des selektiven COX-1-Hemmers SC-560 wurden auf einem Sciex API 3000 Tandem Massenspektrometer mit einer TurboIon Spray Quelle entwickelt und validiert. Für Celecoxib wurden zwei Assays mit internem Standard für die Quantifizierung aus Plasmaproben und ein Assay ohne internen Standard für die Quantifizierung aus Microdialysaten entwickelt. Die Plasmaproben wurden mittels Festphasenextraktion über C18 Material extrahiert. Für die Methode CLX-1 wurde über eine RP-C18 Säule (30 x 2 mm) isokratisch mit Methanol/Wasser/NH4OH 20% 80:20:0,1 v/v mit einer Flussrate von 0,2 ml/min eluiert. Die Methode wurde über den Konzentrationsbereich von 10-1000 ng/ml für Humanplasma und 10-500 ng/ml für Rattenplasma validiert. Für die Methode CLX-2 wurde die Chromatographie mit einer RP-C18 Säule (30 x 2 mm) isokratisch mit Acetonitril/Wasser/NH4OH 20% 85:15:0,1 v/v mit einer Flussrate von 0,2 ml/min eluiert. Die Methode wurde über den Konzentrationsbereich von 0,25-250 ng/ml für Humanplasma validiert. Für die Methode CLX-Microdialysate wurde die Elution über eine RP-C18 Säule (70 x 2 mm) isokratisch mit Acetonitril/Wasser/NH4OH 20% 65:25:0,1 v/v mit einer Flussrate von 0,2 ml/min durchgeführt. Das Assay wurde über den Konzentrationsbereich von 0,25-250 ng/ml validiert. Die Analytik von SC-560 mittels LC/MS/MS wurde für den Nachweis in Microdialysaten entwickelt. Die Microdialysate wurden mit dem Äquivalenten Volumen Acetonitril verdünnt, um den Analyten vollständig in Lösung bringen zu können. Eine RP-C18 Säule (60 x 1 mm) wurde verwendet und die chromatographische Trennung mit einem Gradientenprogramm durchgeführt. Die Methode wurde über den Konzentrationsbereich von 0,5-20 ng/ml für Microdialysate validiert. Die Assays wurden für pharmakologische Untersuchungen zur Wirkung und zum molekularen Wirkmechanismus von selektiven Cyclooxygenasehemmern eingesetzt. Die Rolle der Cyclooxygenase-Isoformen bei der nozizeptiven Transmission im Rückenmark wurde in der ersten Studie untersucht. SC-560 reduzierte das Schmerzverhalten der Tiere und hemmte die spinale Prostaglandinproduktion. Celecoxib hatte auf die Effekte keinen Einfluss. Die Ergebnisse legten den Schluss nahe, dass die Wirksamkeit von Celecoxib bei Trauma-bedingten Akutschmerzen der Wirksamkeit unselektiv wirkender NSAIDs unterlegen ist. In der zweiten Studie wurden Die Effekte hoher Dosen von Celecoxib untersucht. In Tierversuchen mit Zymosan-induzierten Entzündungen der Hinterpfoten konnte Celecoxib bei 50 mg/kg das Ödem in der Hinterpfote reduzieren, aber nicht bei Dosierungen größer gleich 100 mg/kg. In Zellkultur konnte an Mesangiumzellen der Ratte gezeigt werden, dass eine Dosis von 50 µM Celecoxib den Transskriptionsfaktor NF-_B aktiveren kann. In einer dritten Studie wurde der Einfluss COX-abhängiger und -unabhängiger Mechanismen auf die antiproliferative Wirkung von Celecoxib untersucht. SC-560 und Celecoxib verursachten einen Zellzyklus-Block. Celecoxib beeinflusste die Expression Zellzyklus-regulierender. Celecoxib induzierte Apoptose unabhängig vom COX-2 Status der Zellen. In vivo wurde das Wachstum von COX-2 defizienten Tumoren durch Celecoxib und SC-560 reduziert. Die in vitro und in vivo Daten deuten auf COX-2 unabhängige Mechanismen der antiproliferativen Wirkung von Celecoxib hin.
IL-22 ist ein TH17-Signaturzytokin und wird primär von aktivierten T- und NK-Zellen produziert. Die Literatur beschreibt IL-22 als immunregulatorisches Signalmolekül, welches vor allem bei Infektionen und Entzündungsprozessen eine wichtige Rolle spielt. Typische IL-22-induzierte Gene sind beispielsweise Akut-Phase-Proteine, β-Defensine sowie Matrixmetalloproteasen. In dieser Arbeit wurde erstmals gezeigt, dass IL-22 die IFNγ-induzierte iNOS-Expression in humanen DLD-1 Kolonkarzinomzellen massiv verstärkt. Eine gestörte iNOS-Induktion mit folglich extensiver NO-Produktion trägt zu entzündlichen Veränderungen und zur Tumorentstehung bei. Insbesondere gibt es stichhaltige Belege, welche iNOS und NO in Verbindung mit Krebs als potentes Mutagen, als Angiogenesefaktor, als Verstärker der Protoonkogenexpression und als Inhibitor der Apoptose charakterisieren. Demzufolge ist gerade die Identifikation von Signaltransduk-tionswegen von Interesse, welche das Potential zur Regulation der iNOS-Expression in epithelialen Kolonkarzinomzellen besitzen. Der Nachweis des IL-22-Rezeptorkomplexes sowie einer STAT3-Phosphorylierung belegte die IL-22-Responsivität der hier verwen-deten DLD-1 Kolonkarzinomzellen. Der Transkriptionsfaktor STAT3 gilt als prominentes Signalmolekül in der Signaltransduktionskette von IL-22. In der aktuellen Literatur wird STAT3 aufgrund seiner antiapoptotischen und proliferativen Eigenschaften als Onkogen definiert. Sowohl in Patienten mit Morbus Crohn als auch im humanen Kolorektalkarzinom ist eine Überexpression von STAT3 und iNOS beschrieben. Unter Verwendung einer STAT3-spezifischen siRNA konnte der Nachweis erbracht werden, dass STAT3 ein essen-tieller Faktor in der IL-22-vermittelten Induktion der iNOS-Expression ist. Luciferase-Reporterstudien zeigten, dass IL-22 die humane iNOS-Promotoraktivität in DLD-1 Zellen, welche die Photinus pyralis (Firefly)-Luciferase unter Kontrolle eines 16kb-iNOS-Promotor-konstrukts überexprimieren (DLD-1/pXP2-16kb), erhöht. Somit kann eine Regulation der Transkription durch IL-22 angenommen werden. Dennoch vermag diese Arbeit die Frage nach den transkriptionellen Regulationsmechanismen der IL-22-vermittelten iNOS-Expres-sion in DLD-1 Zellen nicht abschließend zu beantworten. Eine Beteiligung ausgewählter Parameter der Zellaktivierung wie beispielsweise NFκB, STAT1α oder IRF-1 an der IL-22-vermittelten iNOS-Induktion konnte durch die vorliegende Arbeit ausgeschlossen werden. Neben transkriptionellen Regulationsmechanismen übernimmt auch die Regulation der iNOS mRNA-Stabilität eine wichtige Funktion bei der Induktion der iNOS-Expression. Allerdings zeigten auch hier die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit, dass IL-22 die iNOS-mRNA nicht stabilisieren kann. Dies bekräftigt wiederum die Annahme, dass IL-22 auf transkriptioneller Ebene den iNOS-Promotor reguliert. Weitere Versuche zeigten auch, dass IL-22 spezifisch an der iNOS-Expression in Kolonkarzinomzellen beteiligt ist und keinen generellen Verstärker der IFNγ-induzierten Genexpression darstellt. Beachtet man hierbei die bedeutende Rolle von STAT3 und iNOS bei Entzündung und Karzinogenese, so repräsentiert IL-22 möglicherweise eine neue Zielstruktur für immuntherapeutische Interventionen im Rahmen dieser Erkrankungen. Der zweite Abschnitt der vorgelegten Arbeit beschäftigte sich mit der Regulation der IL-22-Sekretion im Kontext von Sepsis und systemischer Entzündung. Es stellte sich die Frage, inwiefern IL-22 in diesem komplexen klinischen Syndrom der Sepsis nachzuweisen ist. In diesem Zusammenhang zeigte sich, dass sowohl eine generelle T-Zellaktivierung sowie verschiedene Stimuli der angeborenen Immunität, hier im Besonderen ein hitze-inaktiviertes Lysat von Staphylococcus epidermidis, eine vermehrte IL-22-Produktion anre-gen. Eine wichtige Frage ist hier die pharmakologische Beeinflussung der IL-22-Sekretion. Da bei der Therapie einer Sepsis die Behandlung mit niedrig dosierten Glukokortikoiden Erfolg versprechend ist, wurde im Folgenden der Einfluss des klassischen antientzünd-lichen Pharmakons Dexamethason auf die IL-22-Sekretion in PBMC untersucht. Es konnte eindrucksvoll gezeigt werden, dass Dexamethason sowohl auf mRNA- als auch auf Proteinebene einen sehr potenten Inhibitor der S. epidermidis-induzierten IL-22-Sekretion darstellt. Um die in vitro-Daten der IL-22-Sekretion nach Immunaktivierung humaner PBMC durch in vivo-Experimente zu ergänzen, wurde ein kürzlich etabliertes Nagermodell der schweren Sepsis mit akutem Verlauf verwendet (CLI; caecum ligation and incision). In diesem Modell ist IL-22 im Vergleich zu unbehandelten Tieren signifikant erhöht. In Über-einstimmung mit den in vitro-Experimenten in humanen PBMC hat die Applikation von Dexamethason im CLI-Modell die Hemmung der IL-22-Produktion zur Folge. Zur Abrun-dung dieser Ergebnisse wurde das Serum von Patienten mit einer Peritonitis-bedingten Sepsis untersucht und es konnte erstmals eindrucksvoll gezeigt werden, dass IL-22 in dieser Patientengruppe signifikant erhöht ist. Zum aktuellen Zeitpunkt ist die Rolle von IL-22 in der Sepsis noch nahezu unbekannt. Daher ist zu klären, wie die eingehend beschriebene IL-22-vermittelte Aktivierung der epithelialen Immunabwehr, die systemische Immunsuppression über die Induktion von IL-10 sowie das proinflammatorische und destruktive Potential von IL-22 in Einklang zu bringen sind.
In the first part of this study, we have identified the two steroid hormones progesterone and norgestimate as novel TRPC channel blockers. Both substances blocked TRPC-mediated Ca2+ influx with micromolar activities in fluorometric measurements. TRPC channel inhibition did not seem to be a general steroid effect since another progestin, the norgestimate metabolite levonorgestrel, was not effective. Norgestimate was 4- to 5-fold more active on the TRPC3/6/7 subfamily compared to TRPC4/5, whereas progesterone was similarly potent. This selectivity of norgestimate was confirmed by patch clamp recordings. As norgestimate blocked channels directly gated by DAG with a fast kinetic, we assume the compound acts on the channel protein itself. This view was further substantiated by the lack of effects on IP3R-mediated Ca2+ release from the endoplasmic reticulum, which is activated in parallel with TRPCs by Gq/11-coupled receptor stimulation. Norgestimate did not only block ectopically expressed TRPC channels but also native, TRPC-mediated currents in rat aortic smooth muscle cells with similar activity. The usefulness of norgestimate as a tool compound for the investigation of physiological TRPC functions was tested in isolated vessel rings. Consistent with TRPC6 being an essential component of the alpha-1-adrenoceptor-activated cation channel, we demonstrated a direct vasorelaxant, endothelium-independent effect of norgestimate on rat aortic rings precontracted with phenylephrine. Thus, our results provide further experimental support for a role of TRPC6 in alpha-1-adrenergic vessel constriction. In the second part of this study, we screened a human aorta cDNA-library for novel TRPC4-interacting proteins with a modified yeast two-hybrid (Y2H) system in which the TRPC4-C-terminus was expressed as tetrameric bait protein, thereby mimicking the native channel conformation. Of the eleven interacting proteins found SESTD1 was chosen for further analyses since it contains a phospholipid-binding Sec14p-like domain and thus could be involved in regulation of TRPC channels by phospholipids. After the biochemical validation of the found interaction, the first spectrin domain of SESTD1 was then identified to interact with the CIRB domain of TRPC4 in directed Y2H tests. SESTD1 also co-immunoprecipitated with the closely related TRPC5 protein in which the SESTD1-binding domain is highly conserved. Independent of the CIRB site, co-immunoprecipitation with TRPC6 and the distantly related TRPM8 channel was observed indicating the existence of other sites in these channel proteins that mediate interaction with SESTD1. Analysis of SESTD1 gene expression in human tissues showed that its transcripts are ubiquitously expressed and tissues with significant coexpression with TRPC4 and -5 were identified. We have generated two polyclonal antisera directed against SESTD1 that consistently detected SESTD1 protein in brain, aorta, heart, and in smooth muscle and endothelial cells. The functional consequences of the found interaction were investigated by examination of the TRPC5-mediated Ca2+ influx in a clonal HM1 cell line stably expressing the channel. Since SESTD1 overexpression had no detectable effects on TRPC5-mediated Ca2+ influx, most likely due to expression of endogenous SESTD1, we knocked-down the native protein with specific siRNA. This procedure reduced TRPC5-mediated Ca2+ influx following receptor stimulation by 50%. Parallel biotinylation experiments did not reveal any differences in cell surface expressed TRPC5-protein, suggesting that reduction of TRPC5 activity resulted from a loss of a direct SESTD1 effect on the channel. In addition, in immunofluorescence experiments we observed that reduced SESTD1 protein levels resulted in a redistribution of the multifunctional protein ß-catenin from the plasma membrane to the cytosol. This result may point to an involvement of SESTD1 in formation and maintenance of adherens junctions. SESTD1 contains a phospholipid-binding Sec14p-like domain and we were the first to demonstrate its Ca2+-dependent binding to phosphatidic acid and all physiological phosphatidylinositol mono- and bisphosphates in vitro. The physiological function of this binding activity is not known at present, but it could play a role in regulation of associated TRPC channels. TRPC4 and -5 channels are activated by phospholipid hydrolysis and also bind phospholipids directly. The identification of SESTD1 as novel TRPC-interacting protein could thus be an important step forward in the investigation and better comprehension of the complex molecular mechanisms of TRP channel regulation by lipids.
Mechanismus der funktionell relevanten Kopplung von Kontaktallergenen in dendritischen Zellen
(2002)
Über die Signaltransduktion in Langerhanszellen, den antigenpräsentierenden Zellen der Epidermis, ist bisher nur wenig bekannt. Mit ein Grund dafür ist die schlechte Verfügbarkeit reiner Langerhanszellen aufgrund ihrer geringen Zahl und der schwierigen Präparation, die häufig schon zur Voraktivierung dieser Zellen führt. Humane unreife und reife dendritische Zellen erwiesen sich als geeignete Modellzellpopulation für kutane antigenpräsentierende Zellen. Mit Hilfe dieser Modellzellen wurde die Beteiligung von zentralen Signaltransduktionswegen nach Interaktion mit dem Kontaktallergen TNCB untersucht. 1. Zum ersten Mal wird gezeigt, dass TNCB in den ersten 10 Minuten nach der Haptenisierung bei dendritischen Zellen intrazellulär lokalisiert ist. Die Stimulation von DC mit dem starken Kontaktallergen TNCB führte zu einer Aktivierung der ERK1/2 MAP Kinase. Dieses Ergebnis entspricht der Vorstellung, dass starke Kontaktallergene in subtoxischen Konzentrationen zellulären Streß bei MAP Kinasen auslösen und somit zu einer für die Kontaktallergie typischen Antigenpräsentation führen. 2. Die Tyrosinphosphorylierung wurde bereits in vorausgegangenen Arbeiten (Kuhn, 1998; Brand, 2002) als Charakteristikum für haptenbehandelte Monozyten und humane dendritische Zellen herausgestellt. Diese Ergebnisse konnten mit humanen unreifen und reifen DC weitergeführt werden. Proteinbiochemisch ergab das Kontaktallergen TNCB ein spezifisches und reproduzierbares Muster hyperphosphorylierter Proteinbanden. Der gemessene Anstieg an Phosphotyrosin beruhte auf der gesteigerten Aktivität von Protein Tyrosin-Kinasen. 3. In weiteren Untersuchungen wurden Proteine massenspektrometrisch analysiert, die tyrosinphosphoryliert waren und gleichzeitig TNCB gebunden hatten. Es wurden drei Proteine identifiziert: Gewebstransglutaminase bei 74-80kD, Thyroidhormon Bindeprotein bei 58kD und Aktin bei 38kD. Nach Literaturrecherchen war die Transglutaminase am vielversprechendsten und wurde auf ihre Aktivität innerhalb der Kontaktallergen-induzierten Signaltransduktionskaskade hin untersucht. Drei strukturell verschiedene Stoffe, das Kontaktallergen TNCB, die Retinsäure (RA) und ein Phorbolester (PMA) induzierten eine starke, proteinbiochemisch meßbare Tyrosinphosphorylierung der ERK1/2 MAP Kinase. Aus der Literatur war die RA für eine Aktivierung der tTG bekannt (Antonyak et al., 2002) und PMA als Stimulator der ERK1/2 MAP Kinase (Chen et al., 2002; Lee et al., 2002) - aus diesem Grund wurden sie als Positivkontrolle mitgeführt. 4. Mittels Immunpräzipitation wurde der Nachweis, dass TNCB an die tTG bindet, erbracht. Dies war der erste Indikator für eine Bedeutung der tTG als Zielstruktur für ein Kontaktallergen. 5. TNCB, RA und PMA lösen eine gesteigerte Transamidierungsaktivität der tTG aus, die essentiell zur Induktion der ERK-Phosphorylierung ist. Dies wurde durch einen Transamidierungs Aktivitäts Assay bestimmt (Zhang et al., 1998), einem Nachweis der tTG Aktivität mittels Inkorporation von biotinylierten Polyaminen in lokale Proteine. 6. Sowohl die tTG Aktivität als auch die ERK-Phosphorylierung nach TNCB Stimulation konnten durch den spezifischen Inhibitor der Transamidierungsaktivität der tTG MDC gehemmt werden. Dies war ein zweiter Hinweis, dass die enzymatische Aktivität der tTG eine große Rolle spielt. Das gleichzeitige Ausbleiben der Transamidierung und der ERK-Phosphorylierung deutet auf den deutlichen Einfluß der tTG auf den Signaltransduktionsweg der ERK1/2 MAP Kinase hin. Analysen mit anderen starken Kontaktallergenen, wie z.B. Thiomersal und Chlormethylisothiazolon/ Methylisothiazolon bieten zukünftige Forschungsansätze zur weiteren Charakterisierung der funktionellen Bedeutung der tTG und des ERKWeges. Interessant wären auch Untersuchungen zur Hochregulation der tTGExpression in DC von 24-72 Stunden nach einer Inkubation mit TNCB, RA und PMA. Auch sind weitere Untersuchungen zur Signaltransduktionskaskade im Hinblick auf die erforderlichen, nachgeschalteten Elemente interessant, wie z.B. der von der tTG aktivierten Protein B Kinase AKT (Antonyak et al., 2002) sowie beteiligter Kinasen des ERK-Weges.
Die 5-Lipoxygenase (5-LO) ist das Schlüsselenzym bei der zellulären Leukotriensynthese. Sie katalysiert zunächst die Umwandlung von AA zu 5-Hydroperoxyeicosatetraensäure (5-HPETE) und als zweiten Schritt die Dehydratisierung der 5-HPETE zum instabilen Epoxid Leukotrien A4 (LTA4). Leukotriene sind wichtige Mediatoren bei Entzündungsprozessen und allergischen Reaktionen. Die 5-LO besteht aus zwei Domänen, einer N-terminalen regulatorischen Domäne (AS 1-121) und einer C-terminalen katalytischen Domäne (AS 120-673). Die katalytische Domäne besteht hauptsächlich aus a-Helices, die regulatorische hingegen hat fast ausschließlich b-Faltblätter als Sekundärstrukturelemente. Mit ihrem aus acht Faltblättern bestehenden antiparallelen b-Sandwich hat sie Ähnlichkeit mit einer C2- Domäne. Sie besitzt eine Ca2+-Bindungsstelle und ist maßgeblich bei der Bindung des Enzyms an Membranen beteiligt. Für einige Inhibitoren und zelluläre Faktoren existieren Hinweise, dass sie an die C2-ähnliche Domäne der 5-LO binden, die direkten Beweise fehlen jedoch. Die katalytische Domäne enthält das aktive Zentrum mit einem prosthetischen Eisen und drei Phosphorylierungsstellen. In der vorliegenden Arbeit wurde zum ersten Mal erfolgreich eine Methode zur Überexpression und Aufreinigung der regulatorischen Domäne in E. coli entwickelt, die eine große Ausbeute des Zielproteins erbringt. In einer einfachen one-step Aufreinigung können bis zu 80 mg Fusionsprotein aus MBP und der regulatorischen Domäne der 5-LO (MBP-5LO1-128) pro Liter Expressionskultur gewonnen werden. Ein Verdau mit TEV-Protease führt zur effizienten Abspaltung des MBP. Die weitere Aufreinigung mit hydrophober Interaktionschromatogragphie ergibt eine Ausbeute von 3,4 mg reiner regulatorischer Domäne. Dabei weisen sowohl das Fusionsprotein, als auch die abgespaltene regulatorische Domäne eine Reinheit von über 95% auf. Leider ist die momentan erreichbare Konzentration der reinen regulatorischen Domäne noch nicht ausreichend, um damit NMR-Messungen zur Strukturaufklärung durchführen zu können. Es konnte bestätigt werden, dass die katalytische Domäne der 5-LO alleine nicht zu einer Umsetzung von Arachidonsäure in der Lage ist. Der Verlust der enzymatischen Aktivität ist vermutlich nicht auf eine Fehlfaltung der Proteindomäne zurückzuführen. Die korrekte Faltung der katalytischen Domäne konnte durch eine - wenn auch schwache - Bindung der Domäne an ATP gezeigt werden konnte. Die Zugabe von regulatorischer Domäne zu rekombinanter, aufgereinigter WT 5-LO hat unter gewissen Bedingungen (Abwesenheit von PC) einen stimulierenden Effekt auf die Aktivität des Gesamtenzyms. Dieser Effekt könnte durch eine „Dimerisierung“ der regulatorischen Domäne mit WT 5-LO hervorgerufen werden. In Gegenwart von PC ruft die regulatorische Domäne eine Hemmung der 5-LO-Aktivität hervor. Außerdem ist MBP-5LO1-128 (im Gegensatz zu MBP alleine) in der Lage, das Zwischenprodukt der 5-LO, 5-HPETE, in einer 1:1 Reaktion zu reduzieren. Diese Fähigkeit könnte zur Unterdrückung einer Selbstaktivierung der 5-LO physiologisch bedeutend sein. Interessant ist, dass die Reduktion in Anwesenheit von Ca2+, PC oder PC und Ca2+ deutlich verringert war. Ca2+ führte vor allem in Abwesenheit von PC zu einer deutlichen Verminderung der 5-HPETE-Reduktion. In Gegenwart von PC zeigt Ca2+ nur einen minimalen Einfluss auf die 5-HPETE-Reduktion. Es existieren deutliche Hinweise für eine Konformationsänderung von C2-Domänen durch Ca2+-Bindung [105; 106]. Geht man davon aus, dass dies auch für die C2-ähnliche Domäne der 5-LO zutrifft, erklärt sich damit die Verminderung der 5-HPETE-Menge in Gegenwart von Ca2+. Es ist gut vorstellbar, dass eine Ca2+-induzierte Konformationsänderung zu einer schlechteren Zugänglichkeit der für die Reduktion wichtigen Aminosäureseitenketten führt. Die Anwesenheit von PC führte zu einer noch stärkeren Hemmung der 5-HPETEReduktion, als die Zugabe von Ca2+. Die Beobachtung, dass 5-HPETE in Anwesenheit von PC teilweise vor einer Reduktion geschützt wird, ist in Übereinstimmung mit Ergebnissen von Rakonjac [62]. Vermutlich werden die, für die Reduktion wichtigen Aminosäureseitenketten bei Bindung der Domäne an die PC-Micellen teilweise verdeckt. Cystein 99 könnte eine Rolle bei dieser Reaktion spielen. Es konnte jedoch gezeigt werden, dass es bei der Reduktion von 5-HPETE nicht zu einer maßgeblichen Ausbildung von Disulfidbrücken kommt. Vorstellbar wäre die Ausbildung einer Hydroxysulfonylgruppe am Cystein. Eine Beteiligung von Cystein 99 wird durch die Ergebnisse des Dockings von 5-HPETE an das Homologiemodell der 5-LO und experimentelle Daten aus anderen Arbeiten (M. Hörnig, O. Rådmark) unterstützt. Um den genauen Mechanismus aufzuklären und die physiologische Relevanz zu zeigen sind weitere umfassende Untersuchungen nötig. Um eine Bindung von Hyperforin, LP 121, C06 und B02 an die regulatorische Domäne zu untersuchen wurde ein Kompetitionsassay entwickelt. Dabei wurde rekombinante, aufgereinigte 5-LO mit dem entsprechenden Inhibitor versetzt und dann versucht, die Hemmung mit Hilfe der regulatorischen Domäne aufzuheben. Greift der Inhibitor an der regulatorischen Domäne an, so sollte die Zugabe von MBP-5LO1-128 bewirken, dass ein Teil des Inhibitors an die regulatorische Domäne bindet, er sich somit nicht mehr an der 5-LO befindet und seine Wirkung vermindert wird. Um sicher zu gehen, dass die beobachteten Effekte nicht artifiziell sind, wurde ein Inhibitor, der an der katalytischen Domäne der 5-LO angreift als Negativkontrolle für den Assay benutzt. Für diesen Zweck wurde der Eisenligandinhibitor Zileuton ausgewählt. Es ist bekannt, dass Zileuton das Eisen im aktiven Zentrum der 5-LO chelatiert und nicht an die regulatorische Domäne bindet. Die Hemmung von Zileuton konnte erwartungsgemäß durch Zugabe der regulatorischen Domäne nicht aufgehoben werden. Hyperforin und B02 zeigten eine deutlich verminderte 5-LOHemmung bei steigender Menge an MBP-5LO1-128. Die Hemmung durch LP 121 und C06 wurde nicht von der regulatorischen Domäne beeinflusst. Es konnte also ein effektives und einfaches Screeningverfahren zur Untersuchung der Bindung von 5-LO-Inhibitoren an die regulatorische Domäne entwickelt werden, mit der Einschränkung, dass der Assay nur für den Nachweis einer reversiblen Bindung von Inhibitoren an die regulatorische Domäne tauglich ist. Dieser Assay wird sich in Zukunft als wichtiges Tool bei der Suche nach neuen 5-LO-Inhibitoren erweisen, da die Substanzen mit einem direkten Angriff des aktiven Zentrums bisher nicht zu effektiven und nebenwirkungsarmen Arzneimitteln geführt haben.
5-LO is the key enzyme in the biosynthesis of proinflammatory leukotrienes. It catalyses the conversion of arachidonic acid to the hydroperoxy intermediate 5(S)-hydroperoxy-6- trans-8,11,14-cis-eicosatetraenoic acid (5-HpETE). In a second step 5-LO catalyses a dehydration reaction forming the unstable epoxide intermediate 5(S)-trans-5,6-oxido-7,9- trans-11,14-cis-eicosatetraenoic acid (leukotriene A4 , LTA4). The 5-LO gene is subjected to versatile regulation mechanisms. Apart from regulation by DNA-methylation and histone acetylation / deacetylation 5-LO gene expression can be regulated by the differentiation inducers calcitriol (1,25-dihydroxyvitamin D3) and transforming growth factor beta (TGFβ) 5-LO gene expression. In the myeloid cell lines Mono Mac 6 (MM6) and HL-60, differentiation with both agents caused a prominent upregulation of 5-LO mRNA level, of 5-LO protein expression and of 5-LO activity. Treatment with calcitriol alone already has an impact on 5-LO gene expression which is additionally potentiated by TGFβ treatment. Previous nuclear run-off analysis and reporter gene analysis could not associate the 5-LO promoter with the induction of 5-LO mRNA expression mediated by calcitriol and TGFβ. Inclusion of the 5-LO coding sequence (cds) and inclusion of the 5-LO cds plus the last four introns of the gene (J to M) in the 5-LO promoter construct pN10 led to an enhanced reporter gene activity. The inductions were dependent on vitamin D receptor (VDR) and retinoid x receptor (RXR) cotransfection. Therefore the work was concentrated on identifying elements outside the 5-LO promoter region which contribute to the calcitriol / TGFβ effect on 5-LO mRNA expression. Insertion of the LTA4 hydrolase coding sequence – a coding sequence of similar size - instead of the 5-LO cds led to a loss of the calcitriol / TGFβ effect (pN10LTA4Hcds 1-fold induction). Therewith, it was proven that the presence of the 5-LO cds is crucial for the upregulating effect of calcitriol / TGFβ on 5-LO mRNA level. Cloning of the SV40 promoter instead of pN10 upstream of the 5-LO cds still showed inducibility by treatment with the inducers which argues for a promoter unspecific effect. Insertion of the 5-LO cds in a promoterless basic vector (pGL3cds) displayed same inductions by calcitriol / TGFβ treatment as the 5-LO promoter 5-LO cds construct (pN10cds). Thus, the effect of the inducers is not dependent on the 5-LO promoter under the in vitro conditions of the reporter gene assay. Hence, further cloning was done with promoterless constructs. Through 5-LO cds deletion constructs a positive regulating region in exon 10 to 14 was discovered. To adapt the natural gene context the last four introns (J-M) of the 5-LO gene were inserted in a promoterless construct containing exon 10 to 14 (pGL3cdsΔABInJM). 5end deletion constructs of it revealed putative vitamin D responsive elements (VDREs) in exon 12 and intron M. Mutation of the putative VDREs led to a reduced calcitriol effect –more prominent when the putative VDRE in intron M was mutated (reduction of 40%). Moreover another putative VDRE in exon 10 with an adjacent SMAD binding element (SBE) was detected. SMAD proteins are effector proteins of TGFβ signalling. Gelshift experiments demonstrated in vitro binding of the VDR-RXR heterodimer to those three putative VDREs. By chromatin immunoprecipitation (ChIP) assay in vivo binding of VDR and RXR was shown to the VDRE in the region of exon 10, exon 12 and intron M. 8h and 24h incubation with calcitriol / TGFβ resulted in enhanced expression of VDR in each of the examined regions. The VDR is able to bind to the VDRE without its ligand, whereas this goes along with corepressor recruitment and thus the VDR has a repressive effect on transcription. Histone H4 acetylation was increased when MM6 cells were treated for 8h or 24h with calcitriol or the combination of calcitriol / TGFβ. This finding implies that at that point of time corepressors associated with the VDR are replaced by coactivators. It seems convincing that 5-LO transcription is mainly promoted by calcitriol alone which leads to a more accessible chromatin structure. Previous data indicated that calcitriol and TGFβ upregulate 5-LO RNA maturation and 5- LO transcript elongation. Thus several elongation markers were investigated by ChIP analysis: Histone H3 lysine 36 (H3K36) trimethylation and H4K20 monomethylation were detected in the analysed regions in exon 10, exon 12 and intron M. In region exon 10 the H3K36 trimethylation status was enhanced after 24h calcitriol or calcitriol / TGFβ treatment. An increased H4K20 monomethylation status in all regions was observed when MM6 cells were treated for 24h with calcitriol / TGFβ. 24h treatment with both agents also enhanced the recruitment of the elongation form of RNA polymerase II, which is phosphorylated at serine 2 of the carboxyterminal domain, to the investigated regions. These findings prove the positive regulating role for calcitriol and TGFβ on 5-LO transcript elongation. A putative mechanism of the effect of calcitriol and TGFβ on 5-LO RNA maturation might be the elevated phosphorylation of serine 2 of the RNA Polymerase II which is known to be followed by recruiting polyadenylating factors.
Beteiligung der Sphingosinkinasen 1 und 2 bei Zellwachstum und Apoptose in Nierenmesangiumzellen
(2009)
Seit einigen Jahren ist bekannt, dass Sphingolipide neben ihrer Funktion als Plasmamembranbestandteile auch als intra- und extrazelluläre Botenstoffe in zelluläre Signalwege eingreifen können. So haben das Lysosphingolipid S1P und sein Vorläufermolekül Ceramid wichtige regulatorische Funktionen in der Regulation von Zelltod- und wachstum. Dabei agiert Ceramid als proapoptotisches und wachstumshemmendes Lipid, während S1P zellprotektive und wachstumfördernde Funktionen in der Zelle hat und dadurch als „Gegenspieler“ von Ceramid wirkt. Durch die zwei Enzymklassen der Ceramidasen und Sphingosinkinasen wird in der Zelle ein sogenanntes „Sphingolipid-Gleichgewicht“ durch die stete Interkonvertierbarkeit der Lipide aufrechterhalten. Das zu einem bestimmten Zeitpunkt in seiner Konzentration dominierende Sphingolipid entscheidet so über das Schicksal der Zelle, ob es zum Zelltod oder zum Wachstum kommt. In dieser Arbeit wurde die Beteiligung der beiden Sphingosinkinasen 1 und 2 bei Zellwachstum und Apoptose in Nierenmesangiumzellen untersucht. Dafür wurden aus SK1(-/-)- und SK2(-/-)-Mäusen Mesangiumzellen isoliert. Obwohl beide Sphingosinkinasen dasselbe Produkt S1P generieren, zeigen die beiden „knock-out“-Zelllinien unterschiedliches Apoptose- und Wachstumsverhalten. In einem ersten Kapitel wurde gezeigt, dass eine Depletion der SK1 in einer Desensitivierung der Mesangiumzellen gegenüber dem apoptotischen Stimulus Staurosporin und in einer drastischen Wachstumsverlangsamung im Vergleich zu den Wt-Zellen resultierte. Im Gegensatz dazu führte eine Depletion der SK2 zu einem Schutz vor Apoptose und zu einer erhöhten Wachstumsrate. In einem zweiten Kapitel wurden mögliche molekulare Mechanismen untersucht, die für diese gegensätzlichen Zellantworten verantwortlich sind. Nachdem eine vermehrte Prozessierung der Caspase 3 in SK1(-/-)-Zellen und eine verminderte Prozessierung in SK2(-/-)- Zellen festgestellt wurde, ergaben weitere Westernblot-Analysen eine Beteiligung der beiden Signalkaskaden PKB/Bad sowie MEK/ERK1/2 im Apoptosemechanismus der Mausmesangiumzellen. SK1(-/-)-Zellen zeigen eine verminderte Phosphorylierungsrate der involvierten Enzyme PKB, MEK1/2 und ERK1/2, wohingegen die Signalkaskaden von SK2(-/-) durch vermehrte Phosphorylierung dieser Kinasen konstitutiv aktiviert sind. Daneben scheint auch der antiapoptotische Faktor Bcl-xL am Vorgang der mesangialen Apoptose beteiligt. Eine Depletion der SK1 führt zu einer reduzierten Bcl-xL-Proteinexpression, wohingegen SK2(-/-)- Zellen eine drastisch erhöhte Expressionsrate dieses antiapoptotischen Faktors aufweisen. Als zentraler Regulator des Zellwachstums zeigt sich das Retinoblastoma-Protein (Rb) in den SK1(-/-)- und SK2(-/-)-Zellen antagonistisch reguliert. Während keine basale Phosphorylierung des Proteins in SK1(-/-)-Zellen gefunden werden konnte, ist Rb in SK2(-/-)-Zellen hyperphosphoryliert. Anschliessend konnte in SK1(-/-)- und SK2(-/-)-Zelle eine Beteiligung von weiteren zellzyklus-regulierenden Enzymen, die Rb-Protein vorgeschaltet sind, gefunden werden. So ist die cyklinabhängige Kinase CDK6 in hyperproliferierenden SK2(-/-)-Zellen auf Proteinebene vermehrt exprimiert. SK1(-/-)-Zellen zeigen eine erhöhte Proteinexpression des Zellzyklushemmers p27. In einem dritten Kapitel konnte gezeigt werden, dass eine Depletion der SK2 auch in Mausfibroblasten, die aus der Lunge von SK2(-/-)-Mäusen isoliert worden waren, zu einer vermehrten DNA-Synthese führt; die Funktion des Enzyms scheint also nicht zellspezifisch zu sein. Ein viertes Kapitel machte deutlich, dass Mausmesangiumzellen, die eine humane Variante der SK1 überexprimieren, vor stimulusinduzierter Apoptose geschützt sind. Darüberhinaus ist die DNA-Synthese der hSK1-transgenen Mausmesangiumzellen im Vergleich zu Wt- Zellen erhöht. Zusammenfassend kann man sagen, dass die Sphingosinkinasen 1 und 2 in den primären Mausmesangiumzellen zelluläres Wachstum und Apoptose in entgegengesetzterweise regulieren: die SK1 wirkt mitogen und zellprotektiv, die SK2 hingegen wachstumshemmend und proapoptotisch
Neuropathische Schmerzen werden durch Läsionen im zentralen oder peripheren Nervensystem ausgelöst. Sie treten z.B. bei der diabetischen Polyneuropathie oder nach einem Bandscheibenvorfall auf und sind durch die Symptome Allodynie und Hyperalgesie gekennzeichnet. Bislang lassen sich neuropathische Schmerzen nur unzureichend behandeln, weshalb ein großer Bedarf an neuen, besser wirksamen und verträglicheren Arzneimitteln besteht. Die Voraussetzung für die Entwicklung neuer Arzneimittel ist die Erforschung der molekularen Mechanismen von Neuropathien. Im ersten Projekt dieser Dissertation sollten deshalb mit Hilfe der differenziellen Gelelektrophorese Proteine identifiziert werden, die nach Induktion neuropathischer Schmerzen im Lumbalmark von Ratten reguliert sind. Durch vergleichende Proteomanalyse konnte gezeigt werden, dass 55 Proteine 7 Tage nach Induktion neuropathischer Schmerzen im Lumbalmark der Ratte differenziell exprimiert werden. 54 Proteine zeigten ein verminderte, und ein Protein eine gesteigerte Expression im Modell der „spared nerve injury“ (SNI). Durch massenspektrometrische Analyse der Proteinspots konnten 38 Proteine eindeutig identifiziert werden. Einige dieser Proteine sind möglicherweise an zentralen Sensibilisierungsvorgängen beteiligt und könnten somit als neue Zielmoleküle für die Schmerztherapie fungieren. Die meisten der deregulierten Proteine stehen im Zusammenhang mit dem Energiestoffwechsel und dem zellulären Metabolismus. Aufgrund der verminderten Expression dieser Proteine deutet vieles darauf hin, dass es 7 Tage nach SNI auf spinaler Ebene zu degenerativen Prozessen wie z.B. dem Abbau der Myelinscheide kommt. Mit einer Reihe ausgewählter Proteine wurden zusätzlich Genexpressionsanalysen mittels RT-PCR durchgeführt. Die Ergebnisse zeigten, dass zahlreiche Proteine, die im DIGE Experiment auf Proteinebene eine reduzierte Expression aufwiesen, schon auf Transkriptionsebene reguliert sind. Einige Gene waren in ihrer mRNA-Expression jedoch nicht verändert, was ein Hinweis darauf ist, dass die beobachteten Regulationen auf translationale bzw. posttranslationale Modifikationen zurückzuführen sind. Eines der Proteine, welches aufgrund der peripheren Nervenläsion eine deutlich geringere spinale Expression zeigte, wurde anhand des Massenspektrums als Latexin identifiziert. Latexin ist ein Inhibitor der Carboxypeptidase A Aktivität und spielt bei der Schmerzweiterleitung und Schmerzverarbeitung eine Rolle. Darüber hinaus wurde der Abbau von Latexin in der Literatur mit der neurodegenerativen Erkrankung Morbus Alzheimer in Verbindung gebracht. In der vorliegenden Arbeit wurde die periphere und zentrale Expression von Latexin mit Hilfe verschiedener molekularbiologischer Methoden untersucht. Dabei zeigte sich, dass Latexin unter neuropathischen Bedingungen im Lumbalmark sowohl auf Transkriptionsebene, als auch auf Translationsebene signifikant reduziert vorliegt. Zusätzlich wurde mit Hilfe eines Aktivitätsassays nachgewiesen, dass eine verminderte Latexinexpression zu einer signifikanten Erhöhung der Carboxypeptidase-Aktivität führt. Im peripheren Nervensystem konnte im Gegensatz zum zentralen Nervensystem keine Modulation von Latexin beobachtet werden. Um die funktionelle Relevanz von Latexin bei neuropathischen Schmerzen zu charakterisieren, wurden am Ende der Dissertation rekombinante Adenoviren hergestellt, mit deren Hilfe eine spinale Latexinüberexpression erreicht werden sollte. Die dazugehörigen Tierversuche wurden erst nach Abschluss dieser Arbeit durchgeführt. Im Vorfeld dieser Arbeit wurden mit NF-kappaB p50 Knockout-Mäusen mehrere Schmerztests durchgeführt, die gezeigt haben, dass p50 Knockout-Mäuse im Vergleich zu Wildtyp-Tieren signifikant weniger akute und chronische Entzündungsschmerzen hatten. In einem zweiten Projekt sollte deshalb untersucht werden, welche molekularen Mechanismen dem verminderten Schmerzverhalten der Knockout Tiere zugrunde liegen. Anhand von RT-PCR Experimenten konnte gezeigt werden, dass das NF-kappaB abhängige, proinflammatorische Gen COX-2 8 Stunden nach Zymosaninjektion in eine Hinterpfote bei den Wildtyp-Tieren im Lumbalmark signifikant erhöht war, während bei den Knockout-Mäusen keine signifikante Veränderung zu beobachten war. Weiterhin wurden Änderungen der Proteinexpression und der Genexpression im Lumbalmark von NF-kappaB Knockout- und Wildtyp-Tieren mittels 2D-Gelelektrophorese bzw. RNA-Microarray untersucht. Beim Vergleich der Proteinexpressionsmuster zeigten sich bei 5 Proteinen Regulationen infolge der p50 Deletion, während mit Hilfe des RNA-Microarrays 7 differenziell exprimierte Gene identifiziert werden konnten, die auf das Fehlen der p50 Untereinheit zurückzuführen sind. Zusammenfassend lässt sich aus diesen Befunden schlussfolgern, dass die p50 Untereinheit des Transkriptionsfaktors NF-kappaB als Zielmolekül für die Therapie akuter und chronischer Entzündungsschmerzen geeignet sein könnte. Es wird vermutet, dass die p50 Untereinheit von NF-kappaB bei chronischen Entzündungsschmerzen auf zentraler Ebene an einer Aktivierung proinflammatorischer Stimuli beteiligt ist, während p50 bei akuten Schmerzen wahrscheinlich eine konstitutive Rolle spielt.
5-lipoxygenase (5-LO) is the key enzyme in the formation of inflammatory leukotrienes, which are mediators of inflammation and allergy. The 5-LO catalyses the oxidation of arachidonic acid to 5-HPETE and subsequently to LTA4. The leukotrienes are involved in the development and maintenance of inflammatory diseases, like asthma and allergic rhinitis. Additionally, 5-LO is overexpressed in some cancer types, although its relevance is still not fully understood. 5-LO expressing cells are B- lymphocytes and cells of myeloid origin like monocytes, macrophages and granulocytes. The 5-LO promoter lacks a TATA or CCAT box and covers two CpG islands. These are characteristics of a housekeeping gene, but as the 5-LO is not expressed ubiquitiously, the expression of the 5-LO is tightly regulated. Epigenetic mechanisms were known to be involved in the control of the 5-LO expression. The HDAC inhibitor TsA significantly induced the transcriptional activity of the 5-LO promoter in reporter gene assays as well as on 5-LO mRNA transcript level in MM6 cells. The GC-boxes GC4 and GC5 in the proximal 5-LO promoter were identified to be essential for the TsA effect, as deletion of these element led to an attenuated TsA effect in reporter gene assay. Recruitment of the transcription factors Sp1 and Sp3 and the RNA polymerase II to the 5-LO promoter was detectable after TsA treatment in MM6 cells by chromatin immunoprecipitation assays (ChIP), while the acetylation status of histone H4 remained unchanged. Likewise it is known that DNA methylation leads to silencing of 5-LO expression in-vitro and in-vivo. The 5-LO promoter is densely methylated in the cell line U937, but unmethylated in HL-60 cells and - elucidated in this study - also in MM6 cells. Reporter gene assays with in-vitro methylated 5-LO promoter containing plasmids revealed that the frequency of methylated CpGs is directly proportional to reduction of 5-LO promoter activity. Incubation of U937 cells with 5-AdC, an inhibitor of DNA methyltransferases, was able to reactivate 5-LO transcription and to demethylate CpG dinucleotides. In the first part of this study the mechanism of TsA induced promoter activation was further investigated. I elucidated the mechanism of Sp1 and Sp3 recruitment to the 5-LO promoter after TsA treatment. Immnoprecipitation assay was used to detect a transcription factor complex containing Sp1 or Sp3 interacting with HDAC proteins, which might change its composition after TsA treatment. Besides the posttranslational modifications of the transcription factors Sp1 and Sp3 after TsA treatment were investigated, potentially causing an increased interaction of the proteins with the 5-LO promoter. Both aspects and their response in HDAC inhibition have been described. TsA did not affect the composition of the Sp1/HDAC1/HDAC2 complex. Sp3 was not located in a complex with the HDAC enzymes. Acetylation of Sp1 and Sp3 was detectable, but no change occurred after TsA treatment. Since neither release of the transcription factors off a complex, nor alterations in posttranslational modifications of Sp1 and Sp3 are the reason for the increased Sp1 and Sp3 binding to the 5-LO promoter, I elucidated alterations in the chromatin structure. The acetylation status of the histone proteins H3 and H4, as well as the chromatin marks H3K4me3, representing active chromatin, and H3K9me, representative for repressive state, were investigated. Additionally, the time course of the TsA effect was determined on 5-LO mRNA level using real-time PCR. The acetylation status of the histone proteins on the 5-LO core promoter correlated with the basal 5-LO mRNA transcript expression in MM6, HL-60 and U937 cells. The highest 5-LO mRNA level was detectable in MM6 cells, followed by HL-60 cells. The lowest 5-LO mRNA level was detected in 5-LO promoter methylated U937 cells. The order of the basal 5-LO mRNA expression of the three cell lines correlates with the basal acetylation status of histone proteins H3 and H4. In MM6 cells the highest basal levels in acH3 and acH4 were detected, followed by HL-60 and U937 cells. Moreover, the data obtained in U937 cells revealed that the correlation between DNA methylation and histone hypoacetylation is alike on the 5-LO promoter. TsA treatment induced the 5-LO mRNA level in the three cell lines with different intensity: 5-LO mRNA level in MM6 cells was induced 11-fold, in HL-60 cells 6- fold and in U937 cells 4- fold. The histone acetylation and methylation levels on the 5-LO promoter after TsA incubation were investigated. No increase in acH3 and acH4, but in H3K4me3 was detectable in MM6 cells by ChIP assay. HL-60 cells showed an increase in acH3 and acH4 as well as in H3K4me3. H3K9me was only detectable in untreated U937 cells, but disappeared after TsA treatment, while acH3, acH4 and H3K4me3 increased constantly after TsA treatme nt. A strong correlation between the histone modifications and the time course of the mRNA expression was detectable in all three cell lines. The combination of the posttranslational modifications acH3, acH4 and H3K4me3 led to a fast effect in transcriptional activation and the maxima of acH3 and acH4 were usually associated with the maximum in 5-LO mRNA transcript level. An increase in H3K4me3 alone, as detected in MM6 cells, led to continuous increase in the 5-LO mRNA expression with a late maximum. Additionally, we detected a slight overall decrease in 5-LO promoter methylation in U937 cells after TsA treatment. This fact taken together with the observed histone modifications could explain the 4- fold response in 5-LO mRNA level to TsA treatment of the methylated cell line U937. Another aim of the present study was to identify the specific HDAC enzymes involved in the 5-LO promoter regulation. Reporter gene assays and real-time PCR with selective HDAC inhibitors revealed that HDACs of class I are involved in 5-LO promoter regulation, namely HDAC 1, 2 and 3. The influence of each of the enzymes seemed to depend on the cell type, as inhibition of HDACs 2, 3 strongly induced 5-LO promoter activity in reporter gene assay in HeLa cells, whereas in MM6 cells HDACs 1 and 2, 3 seemed to be responsible for the 5-LO promoter regulation, measured as 5-LO mRNA level. The HDACs of class IIa and class III are not involved in the regulation of 5-LO mRNA expression. The second part of this study investigated the influence of MBD proteins on the methylated 5-LO promoter and the 5-LO mRNA expression. ChIP assays revealed MBD1, 2 and MeCP2 protein binding to the proximal 5-LO promoter in U937 cells. MBD1 was detectable on the 5-LO promoter in unmethylated HL-60 cells, while no MBD protein was located on the 5-LO promoter in MM6 cells. To elucidate the functional role of the MBD proteins, stable knocked down of MBD proteins was established in U937 cells. 5-LO mRNA transcript level was determined in the knock down clones by real-time PCR. The 5-LO transcript level was increased in all knock down samples. MBD2 knock down clones showed the highest effect in activating 5-LO with a 3- and 4.4-fold increase in the 5-LO mRNA level, followed by MBD1 (3.5- fold) and MeCP2 (2.5-fold) knock down clones. A combined participation of these three enzymes in the corepression of the methylated 5-LO promoter is indicated. Taken together, the data reveal that epigenetic mechanisms are strongly involved in the regulation of 5-LO transcription and might function as a crucial control mechanism of 5-LO expression.
Nukleäre Rezeptoren regulieren eine Vielzahl von Genen durch Bindung an bestimmte DNA-Sequenzen im Promotor dieser Gene. Sie fungieren als Transkriptionsfaktoren, die nach Bindung ihres Ligandendie Transkription aktivieren oder supprimieren. In ihrer Funktion werden sie weiterhin durch verschiedene Signale moduliert, beispielsweise durch posttranslationale Veränderungen. Aufgrund der Möglichkeit, durch Liganden, in der Regel kleine lipophile Moleküle, die Aktivität nukleärer Rezeptoren und in der Folge die Transkription definierter Gene zu beeinflussen, sind nukleäre Rezeptoren gute Zielstrukturen für Arzneistoffe und stehen im Zentrum intensiver Forschungsbemühungen. ROR alpha und RevErb alpha sind nukleäre Rezeptoren aus der Gruppe der sogenannten Orphan-Rezeptoren. Die Angehörigen dieser Gruppe wurden als Waisen bezeichnet, da ihr Ligand zum Zeitpunkt ihrer Charakterisierung unbekannt war. 2007 gelang es zwei Gruppen unabhängig voneinander Häm als den Liganden des RevErb alpha zu identifizieren, für ROR alpha werden verschiedene potentielle Liganden diskutiert, wobei bisher keiner allgemein anerkannt wurde. ROR alpha und RevErb alpha steuern die Expression ihrer Zielgene über ein gemeinsames Response-Element, wobei ROR alpha die Expression dieser Gene aktiviert und RevErb alpha sie inhibiert. Gemeinsam nehmen sie eine zentrale Rolle in der Aufrechterhaltung zirkadianer Rhythmen und an der Integration dieser in metabolische Prozesse ein. ROR alpha ist weiterhin beteiligt an der Reifung der Cerebellums sowie an der Steuerung der Immunabwehr. Ziel der vorliegenden Arbeit war es, die Regulation der beiden Rezeptoren auf molekularer Ebene aufzuklären. Hierfür wurden Untersuchungen auf Ebene der Transkription ebenso wie auf posttranslationaler Ebene durchgeführt. Es zeigte sich, dass ROR alpha - hnRNA in vitro extrem stabile Sekundärstrukturen ausbildet und somit bei der reversen Transkription den Transkriptionsstart selbst initiieren kann. Im Zuge der durchgeführten Untersuchungen konnte nicht nachgewiesen werden, welche Auswirkung diese Sekundärstrukturen in vivo zeigen. Studien anderer Gruppen hatten aber gezeigt, dass die Ausbildung von RNA-Doppelsträngen an vielen Stellen in die Regulationen von Genen eingreift, sei es durch Veränderungen des Spleißmusters, RNA-Editierung oder durch Herabregulierung der Transkriptmenge. Des Weiteren konnte gezeigt werden, dass sowohl RevErb alpha als auch ROR alpha einer intensiven Regulation durch posttranslationale Veränderungen unterliegen, im Speziellen durch Phosphorylierung. Vorangegangene Studien hatten Hinweisegeliefert, dass ROR alpha durch ERK-2 phosphoryliert werden kann. In meinen Studien war ich in der Lage nachzuweisen, dass auch RevErb alpha Ziel dieser Kinase ist. Im Gegensatz zu ROR alpha wird RevErb alpha jedoch gleichzeitig an mehreren Stellen phosphoryliert, wobei die physiologische Funktion dieser Phosphorylierungen Gegenstand weiterer Untersuchungen ist. Die Aktivität von ROR alpha am Response-Element wird durch eine Erhöhung des intrazellulären cAMP-Spiegels stark stimuliert. Im Zuge meiner Untersuchungen konnte eine Beteiligung sowohl des cAMP-Response-Elementbindenden Proteins CREBals auch des PPAR gamma - Coaktivators 1a an der Vermittlung dieser Aktivitätssteigerung ausgeschlossen werden. Es zeigte sich jedoch, dass der Effekt durch eine Hemmung der Proteinkinase A dosisabhängig aufgehoben werden konnte. In weiteren Untersuchen konnte ich eine direkte Phosphorylierung von ROR alpha, nicht aber von RevErb alpha durch PKA nachweisen und die Phosphorylierungsstelle als Serin 99 des ROR alpha 4 identifizieren. Da eine Mutation der in der C-terminalen Verlängerung der DNA-bindenden Domäne des Rezeptors gelegenen Aminosäure jedoch nicht in der Lage war, die Aktivitätssteigerung zu verhindern, sind auch noch weitere Faktoren, vermutlich zelluläre Coaktivatoren an deren Vermittlung beteiligt. Bereits in früheren Untersuchungen war beschrieben worden, dass die Aktivität von ROR alpha durch eine Erhöhung des intrazellulären Calciumspiegels stark stimuliert wird. Weiterhin fanden sich Hinweise, dass die Calcium/-Calmodulin-abhängige Kinase IV an der Vermittlung dieser Stimulation beteiligt ist, jedoch ohne direkte Phosphorylierung von ROR alpha durch CaMKIV. Es konnte allerdings nicht aufgeklärt werden, über welchen Mechanismus die Signaltransduktion stattdessen erfolgt. In meinen Untersuchungen konnte ich zeigen, dass eine Inhibition durch Proteinkinase A aktivierter Signalwege auch die Aktivierung von ROR alpha durch CaMKIV dosisabhängig hemmte. Zusammengenommen lieferten meine Untersuchungen weitere Hinweise auf eine wichtige Rolle von ROR alpha in der Regulation metabolischer Prozesse wie des Glycogen- und Lipidstoffwechsels. Außerdem deuten meine Ergebnisse auf eine Verknüpfung der Signalwege von CaMKIV und Proteinkinase A hin und etablieren ROR alpha als gemeinsame Zielstruktur
Der L-Carnitin/gamma-Butyrobetain Antiporter CaiT ist ein Mitglied der Betain/Carnitin/Cholin Transporter (BCCT) Familie. Sekundärtransporter der BCCT Familie transportieren Substrate, die eine positiv-geladene quartäre Ammoniumgruppe besitzen. CaiT besteht aus 504 Amiosäuren und besitzt ein moleculares Gewicht von etwa 56 kDa. In Enterobakterien wie Escherichia coli, Proteus mirabilis und Salmonella typhimurium wird die Expression des caiTABCDE Operons unter anaeroben Bedingungen induziert. Unter diesen Bedinungen ist CaiT der Haupttransporter des Betain-Derivates L-Carnitin. In Enterobakterien wird L-Carnitin unter anaeroben Bedingungen aufgenommen und dehydratisiert wobei Crotonobetain ensteht. Crotonobetain wird anschließend zum Endprodukt gamma-Butyrobetain reduziert. Gamma-Butyrobetain ist das Gegensubstrat, das aus der Zelle hinaustransportiert wird, wenn L-Carnitin in die Zelle aufgenommen wird. Der Austauschmechanismus von LCarnitin gegen gamma-Butyrobetain geschieht ohne das Vorhandensein eines elektrochemischen Gradients, d.h. CaiT ist sowohl H+- als auch Na+-unabhängig. Ein Ziel dieser Arbeit war es die drei-dimensionale (3D) Struktur von CaiT mittels Röntgenstrukturanalyse zu lösen. Weiterhin sollten mit Hilfe der 3D-Struktur und funktionellen Studien detailiertere Erkenntnisse über den kationenunabhängigen Antiportmechanismus von CaiT ermittelt werden. Im Rahmen dieser Arbeit wurden die 3D-Röntgenkristallstrukturen von drei CaiT-Homologen der Enterobakterien P. mirabilis (PmCaiT), E. coli (EcCaiT) und S. typhimurium (StCaiT) mittels molekularem Ersatz (engl.: molecular replacement, MR) mit einem Alanin-Model des CaiT verwandten Na+/Glycinbetain Symporters BetP gelöst. PmCaiT konnte mit einer Auflösung von 2.3 Å gelöst werden. Das Protein kristallisierte in der Kristallraumgruppe H3, mit drei Molekülen in der asymmetrischen Einheit (engl.: asymmetric unit, AU). Die drei PmCaiT-Moleküle ordneten sich innerhalb der AU um eine kristallographische dreifach Symmetrieachse an. EcCaiT wurde mittels MR mit einem Alanin-Model von PmCaiT bei einer Auflösung von 3.5 Å gelöst. EcCaiT kristallisierte in der Kristallraumgruppe P32, ebenfalls mit drei Molekülen in der AU, jedoch ohne kristallographische Symmetry. Während der Verfeinerung des EcCaiT-Models wurde eine strenge dreifache nichtkristallographische Symmetry (engl.: non-crystallographic symmetry, NCS) angewandt. StCaiT, das ebenfalls mittels MR mit einem Alanin-Model von PmCaiT, aber bei einer Auflösung von 4.0 Å gelöst wurde, kristallisierte in der Kristallraumgruppe P65, ebenfalls mit drei StCaiT-Molekülen in der AU, ohne kristallographische Symmetry. Bei der Verfeinerung des StCaiT-Modells wurde wie bei EcCaiT eine strenge NCS angewandt. Da die Auflösung von 4.0 Å bei StCaiT zu niedrig ist um detailierte moleculare Erkenntnisse zu gewinnen, wurden Protein- sowie Substratinteraktionen nur an den Strukturen von PmCaiT und EcCaiT analysiert. Alle drei CaiT-Homologe weisen jedoch einen ähnlichen strukturellen Aufbau auf. In der Röntgenkristallstruktur bildet CaiT ein symmetrisches Trimer, das über ionische und polare Wechselwirkungen zwischen den Protomeren stabilisiert wird. Der trimere Oligomerisierungszustand von CaiT in Detergenzlösung sowie in zweidimensionalen Lipidmembrankristallen wurde bereits in früheren Arbeiten gezeigt. Jedes der drei CaiT-Protomere besteht aus zwölf Transmembranhelices (TMH), die N- und C-terminalen Domänen des Proteins befinden sich auf der cytoplasmatischen Seite. Zehn der TMH bilden zwei invertierte Wiederholungseinheiten aus jeweils fünf TMH. Die erste Einheit besteht aus den TMH 3 – 7, die invertierte zweite Einheit besteht aus den TMH 8 – 12. Beide Wiederholungseinheiten sind strukturell nahezu identisch und lassen sich fast vollständig übereinanderlegen, jedoch weisen die Aminosäuren der beiden Einheiten keine signifikante Sequenzidentität auf. Die ersten beiden Helices der Wiederholungseinheiten, die TMH 3 – 4 und die TMH 8 – 9, bilden ein antiparalleles vier-Helix-Bündel, in dem in CaiT zwei Substratbindestellen lokalisiert sind. Eine derartige Transporterarchitektur wurde erstmals in der Struktur des Na+/Alanin Symporters LeuTAa des thermophilen Bakteriums Aquifex aeolicus gezeigt. Bislang wurden, inklusive CaiT, sieben Sekundärtransporterstrukturen gelöst, die diese LeuT-Transporterarchitektur aufweisen. Ungewöhnlich dabei ist, dass diese sieben Sekundärtransporter fünf verschiedenen Transporterfamilien angehören und eine Verwandschaft auf Basis der Aminosäuren nicht zu finden ist. Da jedoch die tertiäre Struktur dieser Tansporter konserviert ist, kann davon ausgegangen werden, dass sie alle von einem Urprotein entstanden sind, welches zunächst aus fünf TMH bestanden haben muss. Im Laufe der Evolution hat sich das Urgen des Urproteins zunächst dupliziert und die weitere Evolution hat zwar die Aminosäuresequenz verändert und den Umweltbedingungen angepasst, jedoch ist die tertiäre Struktur erhalten geblieben. Da sich die tertiäre Struktur der sieben Sekundärtransporter so stark ähnelt, ist zu vermuten, dass auch der Transportmechanismus ähnlich, jedoch nicht identisch ist. Nach dem strukturellen Aufbau der Transporter, der Lage der Substratbindestellen in den jeweiligen Transportern und der Tatsache, dass es sich bei diesen Proteinen um Membranproteine handelt, wurde ein Transportmechanismus aufgestellt, in dem die Bindestelle des zu transportierende Substrats alternierend zu beiden Seiten der Membran zugänglich ist, ohne jedoch jemals den Substratweg innerhalb des Proteins vollständig zu öffnen. Dieser Mechanismus wurde als “alternating access mechanism” beschrieben. Anhand der unterschiedlichen Zustände, in denen einige der Transporter kristallisierten, kann abgeleitet werden, welche Konformationsänderungen erforderlich sind um das Substrat von einer Seiter der Membran auf die andere zu transportieren. Bisher kristallisierten einzelne der sechs Transporter in der nach außen gerichteten offenen Form, der nach außen gerichteten Form, in der die Substratbindestelle jedoch nicht mehr zugänglich ist, in einer Form, die keine Öffnungspräferenz der Substratbindestelle zu einer Seite der Membran hat und in der nach innen gerichteten Form, in der die Substratbindestelle jedoch nicht geöffnet ist. CaiT kristallisierte in der noch fehlenden Konformation, der nach innen gerichteten Form, in der die Substratbindestelle zugänglich ist. Mit dieser noch fehlenend Konformation kann der Transportzyklus des “alternating access mechanism” vollständig beschrieben werden. Alle drei CaiT-Homologe kristallisierten in der nach innen gerichteten, offenen Konformation. Im Gegensatz zur EcCaiT-Struktur kristallisierte PmCaiT in der substratungebundenen Form. In der StCaiT-Struktur konnte aufgrund der niedrigen Auflösung kein Substrat nachgewiesen werden. In der EcCaiT-Struktur sind zwei gamma-Butyrobetain-Moleküle gebunden. Das erste Molekül wurde in der zentralen Substratbindestelle, der sogenannten Tryptophan-Box bestehend aus vier Tryptophanen, im Zentrum des Protein lokalisiert. Das zweite gamma-Butyrobetain-Molekül wurde in einer Vertiefung an der extrazellulären Proteinoberfläche gefunden. Beide Substrate werden hauptsächlich über Kation-Pi-Interaktionen zwischen der positiv geladenen quatären Ammoniumgruppe des Substrats und des Pi-Elektronensystems der Tryptophane in den jeweiligen Bindestellen gebunden. Eine besondere Eigenschaft von CaiT ist der H+- bzw. Na+-unabhängige Substrattransport. Die CaiT-Struktur erklärt warum kein zusätzliches Kation benötigt wird um Substrat zu binden oder zu transportieren. In der EcCaiT-Struktur ist eine wichtige polare nicht-bindende Interaktion zwischen der Carboxylgruppe des gamma-Butyrobetains und dem Schwefelatom eines Methionins in der zentrale Bindestelle zu erkennen. Dieses Methionin ist konserviert in den prokaryotischen CaiTs und in den Na+-unabhängigen eukaryotischen L-Carnitin Transportern (OCTN), jedoch ist es nicht konserviert im Na+-abhängigen verwandten Glycinbetain Transporter BetP. In BetP ist diese Position des Methionins durch ein Valin ersetzt. Die Mutation des Methionins in CaiT zu Valin ermöglicht zwar immernoch die H+- bzw. Na+-unabhängige Bindung des Substrates durch die Tryptophan-Box, jedoch ist der Substrattransport nahezu vollständig zerstört. Eine derart wichtige Substratkoordinierende Funktion des Schwefelatoms eines Methionins wurde bisher nicht beschrieben. Eine weitere Stelle, die in H+- bzw. Na+-abhängigen Transporter mit H+ bzw. Na+ besetzt ist, ist in CaiT von einem positiv geladenen Arginin eingenommen. Eine positive Ladung an dieser Stelle stabilisiert den Bereich im Protein in der Nähe der zentralen Substratbindestelle. Die Mutation des Arginins zu Glutamat in CaiT erzielt eine vollständige Inaktivierung des Substrattansports. Durch Zugabe von Na+ im Transportansatz kann die Substrattransportaktivität der Glutamat-Mutante jedoch teilweise zurückerlangt werden. Diese eben beschriebenen Aminosäurereste in den beiden Stellen des Proteins erklären die Kationenunabhängigkeit von CaiT. Die Aktivierung des Antiportmechanismus in CaiT wurde mit Hilfe von Bindungsstudien an rekonstituiertem Protein ermittelt. Diese Messungen ergaben für das Wildtypprotein ein sigmoidales Substratbindungsverhalten, was auf ein positiv-kooperatives Bindungsverhalten hindeutet. Die beiden Substratbindestellen im Protein sowie die beiden unterschiedlichen Substrate, L-Carnitin und gamma-Butyrobetain, lassen auf einen heterotropen positiv-kooperativen Bindungs- und einen allosterisch regulierten Transportmechanismus schließen. Bei diesem Mechanismus erhöht die Bindung eines Substrats in der regulatorischen Bindestelle durch induzierte Konformationsänderungen die Affinität eines anderen Substrats in einer weiteren Substratbindestelle. Die regulatorische Bindestelle in CaiT befindet sich an der extrazellulären Proteinoberfläche. Eine Schwächung der Substrataffinität in dieser Bindestelle durch Einführung einer Mutation, verstärkt das sigmoidale Substratbindungsverhalten und hat einen negativen Einfluss auf den Substrattransport. Durch die in dieser Arbeit gelösten 3D-Röntgenkristallstrukturen der zwei CaiT-Homologen, PmCaiT und EcCaiT, sowie den durchgeführten funktionellen Studien sowohl an Wildtypprotein wie auch an Mutanten konnte ein L-Carnitin/gamma-Butyrobetain Antiport-Mechanismus für CaiT vorzuschlagen werden.
Leukotrienes (LTs) are pro-inflammatory lipid mediators that belong to the group of eicosanoids, which are oxygenated metabolites of one common precursor, the aracidonic acid (AA). This polyunsaturated fatty acid is esterified at the sn-2 position of cellular membrane phospholipids and can be released by cytosolic phospholipase A2 alpha (cPLA2alpha) enzymatic deacylation. AA can be converted into LTs by the catalytic reaction of 5-lipoxygenase (5-LO). Enzymatic activation of cPLA2alpha as well as of 5-LO is regulated by similar determinants. In response to cellular stimuli that elevate the intracellular Ca2+ level and/or activate MAP kinase pathways, cPLA2alpha and 5-LO comigrate from a soluble cell compartment (mainly the cytosol) to the nuclear membrane, where AA is released und converted into LTs. LTs play a significant role in promoting inflammatory reactions and immune processes. They have been shown to be released from leukocytes in response to bacterial and viral infections and substantially contribute to an effective immune reaction for host defense. Innate immune pathogen recognition is mediated to a substantial part by the Toll-like receptor (TLR) family. So far, 10 human TLR subtypes have been identified, all of which detect distinct highly conserved microbial structures and trigger the induction of signaling pathways that lead to the expression of numerous immune and inflammatory genes. TLR signaling culminates in the activation NF-kappaB and/or MAP kinases, which as well are known to be involved in the regulation of cellular LT biosynthesis. In this regard, it seemed conceivable that the release of LTs might be regulated by TLR activation. Present studies were undertaken in order to verify and characterize a possible influence of TLR activation on the LT biosynthesis, and furthermore to identify the involved signaling pathways and underlying mechanisms. First experiments revealed that pre-incubation of differentiated Mono Mac 6 (MM6) cells with a TLR4 ligand, a TLR5 ligand, as well as with different TLR2 ligands led to an about 2-fold enhancement of Ca2+ ionophore induced LT biosynthesis. Ligands of other TLR subtypes did not show any influence. These observations could also be confirmed in primary human monocytes stimulated with ionophore or fMLP. With focus on TLR2 ligands, further studies were carried out to characterize the observed enhancement of LT biosynthesis in MM6 cells. It was demonstrated that the extent of LT formation was dependent on the ligand concentration used, but was also dependent on the duration of pre-incubation. Ligand pre-incubation of 15 minutes was optimal to maximally enhance LT formation and further prolongation of pre-incubation decreased LT formation again. Moreover, simultaneous addition of TLR2 ligands with ionophore did also not enhance LT formation. These results indicated that TLR2 ligands seemed to prime human monocytes for an enhanced response upon ionophore stimulation, but did not act as costimuli, which per se were not capable of directly stimulating the biosynthesis of LTs. To analyze the underlying mechanism, the impact of TLR2 ligands on the two key enzymes of the LT biosynthesis pathway, cPLA2alpha and 5-LO, was investigated. In this regard, 5-LO could not been shown to be positively regulated by TLR ligand priming. Neither a direct stimulation, nor an enhancement of 5-LO activity by TLR ligands was detectable in MM6 cells. Similarly, TLR2 ligands did also not enhance ionophore induced 5-LO translocation to the nuclear membrane. However, it was shown that TLR2 ligands enhanced ionophore induced release of AA in MM6 cells, which occurred with a similar time course as LT formation, displaying a maximum at 10 minutes of pre-incubation. A direct stimulation of AA release, however, could not been detected. Inhibitor studies revealed cPLA2alpha to be essential for AA release in TLR2 ligand primed, ionophore stimulated MM6 cells, but also sPLA2 was found to be involved. However, the priming effect of TLR2 ligands was mediated exclusively by cPLA2alpha. Western Blot analyses revealed that p38 MAP kinase, as well as ERK1/2, are activated in MM6 cells in response to TLR2 ligands, and also Ser-505 phosphorylation of cPLA2alpha was detected, which is known to be mediated by MAP kinases and to increase cPLA2alpha activity in vitro. Maximal cPLA2alpha phosphorylation occurred after 5-10 minutes of TLR2 ligand incubation, slightly preceding maximal AA release at 10 minutes and maximal LT formation at 15 minutes of priming. The combined use of a specific p38 MAPK inhibitor with an inhibitor of the ERK1/2 signaling pathway resulted in a complete prevention of cPLA2alpha phosphorylation and TLR2 ligand mediated enhancement of AA release. Thus, both MAPK pathways seem to play a role for TLR2 ligand mediated priming effects on the release of AA. An impact of other kinases such as Mnk-1 and CamKII, which can also regulate cPLA2alpha by phosphorylation, was excluded. Finally, an anti-hTLR2 antibody significantly reduced enhanced AA release, confirming the priming effects to be dependent on TLR2 activation. In summary, it was concluded that the increase of LT biosynthesis by TLR2 ligand priming is considerably due to an enhanced cellular AA supply, which arises from a MAPK mediated phosphorylation and up-regulation of cPLA2alpha. TLR dependent enhancement of LT biosynthesis represents an interesting link between activation of innate immune receptors and the rapid formation of pro-inflammatory lipid mediators. On the one hand, this support the role of LTs in host defence and infectious diseases, but may also be relevant in pathophysiological processes, which involve TLRs as well as LTs, as it has been shown for the pathogenesis of atherosclerosis or allergic diseases.
Durch anhaltende Entzündungsvorgänge oder Nervenläsionen kommt es zu einem vermehrten nozizeptiven Einstrom ins Rückenmark, was lang anhaltende Sensibilisierungsvorgänge an den zentralen Synapsen zur Folge hat. Auf molekularer Ebene kommt es dabei zur Regulation verschiedenster Proteinsynthesen. Diese plastischen Veränderungen im Zellstoffwechsel der Hinterhornneurone können eine Chronifizierung der zentralen Vorgänge bewirken. In der vorliegenden Arbeit wurden mittels vergleichender Proteomanalyse Proteine identifiziert, die aufgrund chronischer Entzündungsschmerzen und neuropathischer Schmerzen im Lumbalmark reguliert werden. In Folge einer durch Zymosan induzierten Pfotenentzündung konnten mittels 2D-Gelelektrophorese des Lumbalmarks der Ratte bei neun Proteinspots eine Regulation festgestellt werden. Diese Proteine sind möglicherweise an Mechanismen der zentralen Sensibilisierung in Hinterhornneuronen beteiligt und könnten als innovative Therapieansatzpunkte von Bedeutung sein. Ein Zusammenhang zwischen den identifizierten Proteinen und Mechanismen der Schmerzentstehung und -verarbeitung wurde bislang nicht beschrieben. Eines der Proteine, bei dem es zu einem deutlichen zeitabhängigen Abbau nach Zymosaninjektion kam, wurde massenspektrometrisch als Neurofilament light (NF-L) identifiziert. NF-L spielt insbesondere für die strukturelle Stabilität der Neurone und den axoplasmatischen Transport eine wichtige Rolle. Ein Abbau von Neurofilamenten im Rahmen von neurodegenerativen Erkrankungen wurde bereits mehrfach beschrieben. Für die Degradierung von NF-L wird hierbei hauptsächlich die Protease Calpain verantwortlich gemacht. In der vorliegenden Arbeit wurde eine Aktivierung von Calpain nach Zymosaninjektion sowohl im Lumbalmark als auch im entzündeten Pfotengewebe nachgewiesen. Der entzündungsassoziierte Abbau von NF-L im Rückenmark und den Hinterwurzelganglien konnte durch die einmalige Verabreichung eines spezifischen Inhibitors von Calpain verhindert werden. Eine Vorbehandlung der Tiere mit dem Calpain Inhibitor zeigte darüber hinaus antiinflammatorische und antihyperalgetische Effekte im Entzündungsmodell. Die antinozizeptive Wirkung des Inhibitors war dabei unabhängig davon, ob die Substanz systemisch (i.p.) oder am Rückenmark (peridural) appliziert wurde. Zusammenfassend zeigen die bisher genannten Ergebnisse, dass die Hemmung einer pathophysiologischen Aktivierung von Calpain ein neues, bislang nicht beschriebenes Wirkprinzip zur Behandlung von Schmerzen und Entzündungen darstellen könnte. In einem weiteren Teil der Arbeit wurde das Protein Aldose Reduktase (AR), das ebenfalls nach Induktion einer peripheren Entzündung reguliert wurde, näher beleuchtet. Bislang wurde die AR vorwiegend mit der Entstehung diabetischer Spätschäden in Verbindung gebracht. Im Proteinmuster des Lumbalmarks zeigte sich dieses Protein durch zwei verschiedene Spots, wobei nach der Zymosaninjektion eine Verschiebung in der Intensität zwischen diesen beiden Varianten der AR beobachtet wurde. Da die AR nach der Entzündungsinduktion weder auf Transkriptions- noch auf Translationsebene reguliert wurde, ist von einer posttranslationalen Modifikation des Proteins auszugehen, wobei eine Phosphorylierung naheliegend erscheint. In Zellkulturexperimenten wurde gezeigt, dass die AR nach einer Stimulation der transfizierten Zellen mit proinflammatorischen Zytokinen abgebaut wird, wobei hierfür eine Aktivierung des Proteasoms verantwortlich zu sein scheint. Eine Hemmung des Abbaus konnte dabei nicht nur durch einen Proteasominhibitor sondern zum Teil auch durch Dexamethason erzielt werden. Die AR scheint daher bei Entzündungsprozessen auf verschiedene Arten reguliert zu werden. Weiterhin wurden Änderungen im Lumbalmark nach Induktion von neuropathischen Schmerzen proteomanalytisch untersucht. Beim Vergleich der Proteinexpressionsmuster zeigten sich bei vier Proteinen Regulationen infolge der Nervenläsion. Keines dieser Proteine wurde bislang mit neuropathischen Schmerzen in Verbindung gebracht. Eines der identifizierten Proteine, alpha-Crystallin, wurde sowohl bei neuropathischem Schmerz als auch bei chronischem Entzündungsschmerz herunterreguliert. Dieses Protein scheint daher mit beiden dieser chronischen Schmerzzustände korreliert zu sein. Die ansonsten beobachteten Änderungen waren jedoch spezifisch für das jeweilige Schmerzmodell, so dass davon ausgegangen werden kann, dass deutliche Unterschiede in den spinalen Sensibilisierungsvorgängen infolge einer Entzündung oder einer Nervenläsion bestehen. Mit der Identifizierung und Charakterisierung von schmerz- und entzündungsassoziierten Proteinen im Rahmen dieser Arbeit wurde ein Beitrag zur Aufklärung bislang unbekannter Mechanismen der zentralen Sensibilisierung geleistet. Diese Erkenntnisse könnten in der Zukunft als Grundlage zur Entwicklung innovativer Therapieansätze für die Schmerztherapie genutzt werden.
The retinoic acid related orphan receptor alpha (RORalpha) regulates the expression of various target genes by binding to specific response elements in their promoter region. RORalpha is an interesting pharmaceutical target since it positively affects several pathophysiological processes of clinical relevance. RORalpha enhances the expression of Apo-AI protein, the major constituent of HDL, which is responsible for the cholesterol transportation. RORalpha notably contributes to the bone mineralization and generation of the extracellular bone matrix, demonstrating its involvement in osteoporosis, and by up-regulating the gene for IKBalpha, RORalpha has anti-inflammatory effects. Moreover, RORalpha is necessary for cerebellar development and the maintenance of the mammalian day-night periodicity governed by the core-clock within the suprachiasmatic nuclei. RORalpha receptors have been reported to bind cholesterol, melatonin, or to function ligand-independent. By monomeric binding to the recognition motif AGGTCA preceded by an A/T-rich sequence (ROR response element, RORE), RORalpha constitutively activates gene transcription. However, RORalpha activity is passively suppressed by its opponents RevErbalpha and RevErbbeta, which both bind to the same target sequence. ...
Die Rho-Kinase gehört zur Familie der Serin/Threonin Kinasen und wird durch verschiedene vasoaktive Mediatoren, wie Katecholamine, UII, Thromboxan und Serotonin aktiviert. Sie spielt eine Schlüsselrolle in der Gefäßkontraktion des glatten Muskels. Die Rho-Kinase induzierte Kontraktion ist in allen Gefäßbetten der verschiedenen untersuchten Tierspezies (Ratte, Maus, Kaninchen, Schwein) induzierbar und durch selektive Rho-Kinase Inhibitoren konzentrationsabhängig hemmbar. Die Rho-Kinase Inhibitoren induzieren in vitro eine Gefäßrelaxation und führen in vivo zu einer Blutdrucksenkung. In akuten invasiven Blutdruckmessungen und chronischen telemetrischen Untersuchungen wurde für Rho-Kinase Inhibitoren eine Senkung des peripheren arteriellen Blutdrucks nachgewiesen. Der vasorelaxierende Effekt von Rho-Kinase Inhibitoren in vitro und in vivo ist gleichermaßen in normotensiven und hypertensiven Tiermodellen messbar und hängt nicht von der Endothelfunktion ab. Es wurden keine Unterschiede in der Sensitivität gegenüber Rho-Kinase Inhibitoren zwischen hypertensiven Tieren und normotensiven Tieren gemessen. In der Proteinexpressionsanalyse zeigte sich eine tendenziell, aber nicht signifikante Erhöhung der Rho-Kinase II-Expression im arteriellen glatten Gefäßmuskel der hypertensiven Tiere. Im Tiermodell der pulmonalen arteriellen Hypertonie wurde durch chronische Behandlung mit Rho-Kinase Inhibitoren die Progredienz der PAH verbessert. Rho-Kinase Inhibitoren normalisierten die Endothelfunktion und die Hyperkontraktilität der pulmonalen Gefäße. Zusätzlich konnten die Rechtsherzhypertrophie und rechtsventrikuläre Druck verbessert werden. In Untersuchungen am isoliert perfundierten Herzen nach Langendorff führte die Perfusion mit Rho-Kinase Inhibitoren zu einer verbesserten Durchblutung der Herzkranzgefäße. Die kardiale Kontraktilität und die Herzfrequenz wurden durch die akute Rho-Kinase Hemmung nicht beeinflusst. Zusätzlich zur Gefäßfunktion reguliert Rho-Kinase auch die Aktivierung und Aggregation von Thrombozyten. Vasoaktive Mediatoren können eine Rho-Kinase induzierte Aktivierung von Thrombozyten bewirken und so die Atherogenese begünstigen. Die Hemmung von Rho- Kinase bewirkt die Hemmung der Thrombozytenaggregation. Die Aktivierung von Rho- Kinase ist essentiell für zelluläre Transportvorgänge und die Zellmotilität. Dies wird durch Umstrukturierung des Zytoskeletts und mit Hilfe von Stressfaserformierungen realisiert. Rho- Kinase Hemmung verringert die Formierung von Stressfasern und kann somit Transporte von cholesterolsensitiven Transkriptionsfaktoren, z.B. SREBPs, zu ihren Bindungselementen reduzieren. Dadurch wird eine verstärkte Expression SRE-regulierter Gene, wie z.B. Cholesterolsyntheseenzymen, verhindert. Gleichzeitig führt eine Hemmung der Rho-Kinase Aktivität zu einer Senkung der Proliferationsrate von glatten Muskelzellen und Monozyten. Im LDLR defizienten Tiermodell der Atherosklerose wurde durch eine chronische Behandlung mit Rho-Kinase Inhibitoren eine signifikante Verbesserung der Endothelfunktion erreicht. Die Behandlung mit Rho-Kinase Inhibitoren zeigt allen untersuchten Modellen der Hypertonie blutdrucksenkende Effekte. In Modellen der Atherosklerose wurden durch Langzeitbehandlung mit Rho-Kinase Inhibitoren therapeutische Effekte auf die Endothelfunktion erzielt. Durch Reduktion der Risikofaktoren Bluthochdruck, Atherosklerose und endotheliale Dysfunktion senken Rho-Kinase Inhibitioren das kardiovaskuläre Risiko und bieten eine neue Therapiemöglichkeit zur Behandlung und Prophylaxe von Herz- Kreislauferkrankungen.
Die Inhibition des Natrium-Protonen-Austauschproteins, Subtyp-1 (NHE-1), stellt möglicherweise ein wichtiges Prinzip zur Behandlung der Herzhypertrophie und damit der frühen Herzinsuffizienz dar. Als Ausgangspunkt dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass der oral bioverfügbare und selektive NHE-1-Inhibitor Cariporide dabei u.a. in einem transgenen Tiermodell wirkt, bei dem die Hypertrophie nicht durch Myokardinfarkt, sondern mittels transgener Überexpression des beta-1-adrenergen Rezeptors erzeugt wurde, die Hypertrophie-Entwicklung verhinderte. Um die Wirkung und vor allem den Wirkmechanismus von NHE-1-Inhibitoren näher zu untersuchen, wurde in der vorliegenden Arbeit ein zelluläres Modell der alpha-1-adrenergen Hypertrophie-Induktion in adulten Kardiomyozyten aus Rattenherzen aufgebaut und mittels gängiger Parameter wie Zellvolumen, Protein und RNA-Neusynthese validiert. Dabei konnte ein klassenspezifischer Hemmeffekt aller eingesetzten NHE-1-Inhibitoren auf die untersuchten Hypertrophie-Parameter gezeigt werden. Interessante molekulare Mechanismen der Hypertrophie-Inhibition durch spezifische NHE-1- Inhibitoren konnten in der vorliegenden Arbeit aufgedeckt werden. Nach alpha-1-adrenerger Stimulation und gleichzeitiger NHE-1-Inhibition waren nur wenige Gene in ihrer Expression deutlich differentiell reguliert, darunter der Angiotensin-II AT-1 Rezeptor und die sogenannte Rho-kinase (ROCK). Aus dieser Erkenntnis heraus ergeben sich neue mögliche Ansatzpunkte zum Wirkmechanismus von NHE-1-Inhibitoren. Im Gegensatz zu Befunden bei Herzischämie scheint es bei der Herzhypertrophie im vorliegenden Modell keine Kopplung zwischen dem NHE-1 und einem weiteren Austauschprotein, dem Natrium-Calcium-Austauscher, zu geben. Die Hypertrophie der adulten Kardiomyozyten ließ sich nicht durch einen selektiven Hemmstoff dieses Austauschers, SEA0400, hemmen. Bei näherer Untersuchung auf Translationsebene zeigten sich überraschende Ergebnisse, die für eine Hemmung der Hypertrophie-Entwicklung in Anwesenheit eines NHE-1-Inhibitors verantwortlich gemacht werden könnten. So war auf der einen Seite die Translokation von in adulten Kardiomyozyten exprimierten PKC-Subtypen (delta und eta) vom Zytosol an die Plasmamembran durch die NHE-1-Inhibition signifikant beeinflusst. Auf der anderen Seite war die Phosphorylierung bestimmter NHE-1-aktivierender Kinasen über den gesamten betrachteten Zeitraum verstärkt vorhanden. Diese Ergebnisse legen nahe, dass neben möglichen Autoregulationseffekten in der Zelle, ausgelöst durch eine NHE-1-Inhibition, eine weitere Wirkkomponente eine Rolle bei der Beeinflussung intrazelluläre membranabhängiger Translokation spielen könnten.
Die vorliegende Arbeit befaßte sich mit der Untersuchung der Funktion und der Regulation des neuronalen GABA-Transporter 1 der Maus (mGAT1). Der mGAT1 ist ein elektrogener Neurotransmittertransporter, der in Gegenwart von GABA in Abhängigkeit des Membranpotentials und des Na+-Konzentrationsgradienten über der Membran einen sogenannten mGAT1-vermittelten Strom generiert. Der mGAT1 wurde in Oozyten von Xenopus laevis exprimiert und mit elektro-physiologischen Methoden (Two-Electrode Voltage Clamp), mit radioaktiven Auf-nahmemessungen (3H-GABA, 22Na+, 36Cl-) und mit biochemischen Methoden untersucht. In der vorliegenden Arbeit konnte unter Verwendung des Tiagabin –Analogons SKF-89976-A gezeigt werden, daß der mGAT1-vermittelte Strom aus zwei Komponenten besteht, einem Transportstrom und einem Transporter-assoziierten Strom. Dabei wurde die hier gewonnene neue Erkenntnis genutzt, daß SKF-89976-A die Transporter-assoziierte Stromkomponente selektiv blockieren kann. Als Ursache des Transportstroms konnte die in der Literatur angenommene Transportstöchiometrie von 1GABA : 2Na+ : 1Cl- bewiesen werden. Als Ursache des Transporter-assoziierten Stroms konnte eine vom GABA-Transport entkoppelte Na+-spezifische Leitfähigkeit in Gegenwart von GABA identifiziert werden, die drei bis fünfmal größer ist als die Transport-Leitfähigkeit selbst. Transportstrom und Transporter-assoziierter Strom scheinen von zwei unterschiedlichen Konformeren des mGAT1 vermittelt zu werden, die nicht miteinander im Gleichgewicht stehen. In Abwesenheit von GABA ist in der Stromantwort auf einen Spannungspuls ein mit der Zeit abfallender transienter Strom zu beobachten. Hinsichtlich dieses langsamen transienten Stroms des mGAT1 konnte ein Bindungsmodell für Na+ und Cl- in Abwesenheit von GABA entwickelt werden. Nach diesem Modell kommt es vor der Bindung von GABA am Transporter zu einer sequentiellen Bindung zweier Na+-Ionen und eines Cl--Ion. Regulation des mGAT1 konnte durch Phosphorylierung bzw. Dephosphorylierung des mGAT1 mittels PKC und PP2B gezeigt werden. Dabei scheint der mGAT1-vermittelte Strom durch Serin- / Threonin-Phosphorylierung verstärkt zu werden. Durch Koinjektion von mGAT1-cRNA und humaner Hirn-mRNA konnte der mGAT1 zusammen mit unbekannten zytosolischen bzw. Membranproteinen des humanen Hirns koexprimiert werden. Dabei wird die Transportrate des mGAT1 signifikant gesteigert; der mGAT1-vermittelte Strom wird nicht signifikant beeinflußt. Es scheint, daß eines oder mehrere der koexprimierten humanen Proteine die Bildung des Transport-Modus bzw. die Bildung des Kanal-Modus mit beeinflussen.
PPARs gehören wie die Steroidhormon-Rezeptoren (z. B.Glucocorticoid-, Estrogen- oder Testosteron-Rezeptoren) zur Superfamilie der nukleären Rezeptoren. Es existieren drei PPAR-Subtypen, die als PPARalpha, PPARbeta/delta und PPARgamma bezeichnet werden und von drei verschiedenen Genen kodiert werden. Fibrate sind PPARalpha-Agonisten, welche die Plasma-Triglyceridspiegel reduzieren und gleichzeitig eine moderate Steigerung des HDL-Cholesterols bewirken. Thiazolidindione (Glitazone) sind PPARgamma-Agonisten, die bei Typ-2-Diabetes-mellitus indiziert sind und als Insulinsensitizer wirken. Duale PPARalpha/gamma-Agonisten stellen eine neue Klasse von Arzneistoffen dar, die zukünftig zur Behandlung von Typ-2-Diabetikern mit gestörtem Lipidprofil eingesetzt werden könnten. Im Rahmen der vorliegenden Dissertation wurde eine Leitstrukturoptimierung des selektiven PPARalpha-Agonisten Pirinixinsäure (WY 14643) durchgeführt. Die pharmakologische In-vitro-Charakterisierung der Substanzen erfolgte mit Hilfe subtypspezifischer Reportergen-Assays. Zusätzlich wurde gezeigt130, dass Chinolinderivate der Pirinixinsäure 5-LOX-inhibierende Eigenschaften in polymorphnukleären Leukozyten zeigen. Zunächst wurde eine geeignete Synthesestrategie zur Darstellung von Pirinixinsäurederivaten etabliert, was zur Charakterisierung und Identifizierung einer Serie von potenten dualen PPARalpha/gamma-Agonisten und 5-LOX-Inhibitoren führte. Die Synthesestrategie zur Darstellung von sowohl im Arylamino-Bereich (W) als auch in alpha- Position (R) modifizierten Derivaten der Pirinixinsäure bestand in einer vierstufigen Reaktionsfolge (I–IV; siehe Abb.). ... Die PPAR-Modulatoren (Carbonsäuren) 4, 8, 14, 32–38, 41 und 42 wurden in-vitropharmakologisch unter Anwendung subtypselektiver Reportergen-Assays (hPPARalpha, beta, gamma) charakterisiert. Die 5-LOX-Modulatoren (Carbonsäureester) 3, 7, 8, 13, 14, 24–29, 31–42 und 50 wurden in-vitro-pharmakologisch unter Anwendung des 5-LOX-Standardassays in intakten PMNL (polymorphnukleäre neutrophile Leukozyten) evaluiert. Die vorliegende Untersuchung deckte auf, dass der Ersatz des 2,3-Dimethylanilin-Strukturelements der Pirinixinsäure durch 6-Aminochinolin zu einem Gesamtverlust des PPARalpha/gamma-Agonismus führt. Durch Strukturmodifikationen im Arylamino-Bereich der Leitstruktur WY 14643 mit für 5-LOX-Non-Redoxinhibitoren typischen Pharmakophorresten, Tetrahydropyran-4-yl (Substanzen 13–14) und Methoxychinolin-2-yl (Substanz 43), konnte eine signifikante Steigerung des 5-LOX-inhibitorischen Potenzials erzielt werden [IC50 7 mikro M (13) bzw. 4 mikro M (43)]. Die alpha-alkylsubstituierten Carbonsäurederivate 33–38 zeigten sowohl am hPPARalpha als auch am hPPARgamma eine mit der aliphatischen Kettenlänge steigende Potenz. Am hPPARalpha erwiesen sich das alpha-Hexyl-Derivat 35 und das alpha-Butyl-Derivat 34 mit EC50-Werten von 1,9 mikro M (35) bzw. 11,5 mikro M (34) entsprechend einer Steigerung der Aktivität gegenüber WY 14643 um den Faktor 20 (35) bzw. den Faktor 4 (34) als besonders potent. Im Falle des hPPARgamma zeigten ebenso das alpha-butylsubstituierte Derivat 34 und der alpha-hexylsubstituierte Ligand 35 die höchste Aktivität mit EC50-Werten von 8,7 mikro M (34) bzw. 5,8 mikro M (35) und einer Steigerung der Aktivität gegenüber WY 14643 von Faktor 6 (35) bzw. Faktor 9 (34). Die Einführung von alpha-Alkylsubstituenten in das Grundgerüst der Pirinixinsäure führt möglicherweise zum Besetzen der linken proximalen Bindungstasche und somit zu einer im Vergleich zur Leitstruktur WY14643 stärkeren Bindung in die Ligandenbindungstasche des Rezeptors. Die Besetzung dieser proximalen Bindungstasche entscheidet jedoch nicht über die PPAR-Selektivität, da diese sowohl von hPPARalpha- als auch von hPPARgamma-Agonisten belegt wird. PPARalpha/gamma-Selektivität kann zum einen durch das Besetzen der linken bzw. rechten distalen Bindungstasche erzielt werden, zum anderen durch die Auswahl verschiedener acider Kopfgruppen. Aufgrund unterschiedlicher Aminosäuresequenzen der Bindungstaschen der einzelnen PPAR-Subtypen ergibt sich für die Kopfgruppen der PPAR-Modulatoren im hPPARalpha und hPPARgamma eine durch den sterischen Einfluss von Carboxyl- bzw. TZD-Kopfgruppen verursachtes unterschiedliches Wasserstoffbrückennetzwerk. Im Vergleich mit Pirinixinsäure konnte nur durch die Einführung der größeren Alkylketten (n-Butyloder n-Hexyl) ein stark erhöhter dualer PPARalpha/gamma-Agonismus erreicht werden. Die Substitution des sekundären Amins der Chinolin-6-ylverbindungen durch einen Ether-Sauerstoff in den Substanzen 41 und 42 sowie die Einführung eines Linkers, genauer einer Methylengruppe, zwischen dem Chinolin-6-ylrest und dem Scaffold (Derivate 29 und 36), führt zu einer verminderten Aktivität sowohl an hPPARalpha als auch an hPPARgamma. Eine mögliche Erklärung hierfür könnte sein, dass an entsprechender Position der Liganden-Bindungstasche eine Wasserstoffbrücken-Akzeptor-Position vorhanden ist, welche zur Erhöhung der Affinität beiträgt. Offensichtlich wird, durch die Ausbildung einer Wasserstoffbrücke zwischen der NH-Funktion und einem Wasserstoffbrücken-Akzeptor innerhalb der LBP im Falle von WY 14643 ein hoher Bindungsbeitrag erreicht. Daten bezüglich der Inhibierung der 5-Lipoxygenase demonstrieren, dass 6-Aminochinolinderivate potente 5-LOX-Inhibitoren sind. Die Einführung eines 3,5-Bis-(2,2,2-trifluor-ethoxy)-phenylrestes in 6-Position des alpha-hexylsubstituierten Scaffolds führt zu Ligand 38. Dieser ist ein potenter dualer PPARalpha/gamma-Agonist mit einem EC50-Wert von 11 mikro M an hPPARalpha bzw. 7,7 mikro M an hPPARgamma und ein stark wirksamer 5-LOX-Inhibitor mit einem IC50-Wert von 1 mikro M im 5-LOX-PMNL-Standardassay. Die Substanz 38 wurde in präklinischen Studien eingesetzt. Vier Stunden nach oraler Administration bei Mäusen (n = 6) wurde einen Plasmaspiegel von 40 mikro M erreicht. Im Hinblick auf eine Steigerung der PPAR-agonistischen Aktivität und der Reduktion der hepatotoxischen Eigenschaften der Leitstruktur Pirinixinsäure wurde eine Leitstrukturoptimierung durch Einführung der größeren Alkylketten in alpha-Position zur pharmakophoren Carboxyl-Funktion durchgeführt. Für die inhibierende Wirkung auf die 5-LOX scheint das Chinolin-Strukturelement verantwortlich zu sein, während die Potenz der Inhibition durch das Substitutionsmuster moduliert wird.
Mechanistische Untersuchungen zur Modulation der zytosolischen Phospholipase A2 durch Hyperforin
(2009)
Aus der Familie der Phospholipasen A2 nimmt die zytosolische Phospholipase A2 (cPLA2) in der Bereitstellung von Arachidonsäure (AA) für die Produktion von entzündungsfördernden Eikosanoiden und Lysophospholipiden eine Schlüsselrolle ein. Inwieweit die Modulation dieses Enzyms zum antientzündlichen Wirkspektrum von Hyperforin beiträgt, war Gegenstand dieser Arbeit. Hyperforin als Bestandteil des Johanniskrauts greift auf vielfältige Art und Weise in Entzündungsprozesse ein und hemmt unter anderem die Aktivität der 5-Lipoxygenase und Cyclooxygenase-1 in mikromolaren Konzentrationen. Zur Erforschung der cPLA2 als weitere potentielle Zielstruktur wurden die Effekte Hyperforins auf frisch isolierte humane polymorphkernigen Leukozyten (PMNL) und Thrombozyten untersucht. Dabei ergaben sich erstaunlich widersprüchliche Ergebnisse. Während in PMNL die A23187- und Thapsigargin-induzierte AA-Freisetzung potent unterdrückt wurde (IC50 = 1,5 bis 1,9 µM), konnte Hyperforin die cPLA2-Aktivität in Thrombozyten nach A23187-Stimulation nicht und nach Thrombin-Induktion nur leicht beeinträchtigen. Hingegen resultierte aus der Behandlung von Thrombozyten mit 10 µM Hyperforin eine 2,6- bzw. 8,1-fache Steigerung der AA-Freisetzung und 12-Hydro(pero)xyeikosatetraensäure(H(P)ETE)-Produktion, die von einer Translokation der cPLA2 an die Plasmamembran begleitet war. In PMNL wurde eine Aktivierung der cPLA2 nicht beobachtet. Diese widersprüchlichen Befunde führten zu näheren mechanistischen Untersuchungen. Insbesondere der Einstrom von Ca2+, wie auch die Aktivierung von mitogenaktivierten Proteinkinasen (MAPK) tragen in PMNL und Thrombozyten zur cPLA2-Aktivierung bei. Allerdings konnte eine Beeinträchtigung dieser Signaltransduktionswege durch Hyperforin ausgeschlossen werden. In PMNL wird der durch A23187- oder Thapsigargin-induzierte Ca2+-Einstrom nicht inhibiert und die Aktivierung der entsprechenden MAPK konnte durch Hyperforin (bis zu 10 µM) nicht vermindert werden. In Thrombozyten wurde die Translokation der cPLA2 sowie die AA- und 12-H(P)ETE-Produktion durch die Chelatierung von extra- und intrazellulärem Ca2+ nicht gehemmt. Auch die Unterbindung der Phosphorylierung der cPLA2 durch Hemmung der MAPK-Aktivierung konnte die Aktivierung der cPLA2 nicht verhindern. In zellfreien Untersuchungen an aufgereinigtem Enzym zeigte Hyperforin weder hemmende noch aktivierende Effekte, wenn Liposomen aus 1-Palmitoyl-2-arachidonoyl-sn-glycerol-3-phospatidylcholin (PAPC) eingesetzt wurden. Nach Einbau von Dipalmitoylphosphatidylinositol-4,5-diphosphat, 1-Palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycerol und Cholesterol in PAPC-Liposomen sowie gegenüber Lipid-Raft-Adaptionen (PAPC/Sphingomyelin/Cholesterol 1:1:1) zeigte Hyperforin allerdings inhibitorisches Potential (IC50 = 13,2 µM, 7,6 µM, 5,5 µM und 4,4 µM). Aktivierende Effekte des Hyperforins konnten in Abwesenheit von Ca2+ beobachtet werden, wenn cholesterolhaltige, Lipid-Raft-artige- oder 1-Palmitoyl-2-arachidonoyl-sn-glycerol-3-phospatidylethanolamin(PAPE)-Vesikel eingesetzt wurden. 10 bis 30 µM Hyperforin erhöhten die AA-Freisetzung 3,3- bis 7,3-fach, wobei die Bindung des Enzyms an Liposomen mit Cholesterol und Lipid-Raft-Strukturen, aber nicht gegenüber dem PAPE-Substrat verstärkt war. Alle Effekte konnten durch die Zerstörung der Membranoberfläche und –struktur nach Zugabe von Triton-X-100 aufgehoben werden, wodurch die Bedeutung der Struktur der Lipidaggregate für die Hyperforinwirkung in den Vordergrund tritt. Darüber hinaus konnte die essentielle Rolle der vinylogen Carbonsäurestruktur des Hyperforins gezeigt werden, da ein O-Methylester des Hyperforins weder die Hemmung der cPLA2 in PMNL noch deren Aktivierung in Thrombozyten reproduzieren konnte und im Liposomenassay nur eine unspezifische Aktivierung der cPLA2 unabhängig von der Membranstruktur bewirkte. Neben der cPLA2-Aktivität wurde auch die Dichte der Liposomen abhängig von der Membranstruktur durch Hyperforin moduliert, allerdings konnten Änderungen der Membrandichte nicht mit Einflüssen auf die Enzymaktivität korreliert werden. Weiterhin wurden in Zusammenarbeit mit der Arbeitsgruppe Prof. Glaubitz, Universität Frankfurt, 1H-MAS-NMR-NOESY-Spektren von Liposomen aus 1-Palmitoyl(D31)-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphatidylcholin mit integriertem Hyperforin aufgenommen. Das sich aus der Analyse der Spektren ergebende Modell postuliert die Lokalisation des sauerstoffreichen Bizyklus des Hyperforins im Kopfgruppenbereich der Lipide und eine Penetration der Isoprenylgruppen in die hydrophobe Schicht der Membranen. Die Ergebnisse dieser Arbeit in intakten Zellen und zellfreien Systemen verweisen somit auf komplexe Zusammenhänge, bei denen Interkalationen von Hyperforin mit speziellen Membranstrukturen im Vordergrund stehen. Die unspezifische Einlagerung der lipophilen Substanz Hyperforin in zelluläre Membrankompartimente könnte somit unter Umgehung der regulären Signaltransduktionswege zelltypabhängig die cPLA2-Aktivität modulieren.
Die Transkription ist ein entscheidender Schritt in der Transition der genetischen Information, welche durch die DNA codiert und im Genom hinterlegt ist, zu dreidimensionalen Funktionseinheiten in der Zelle, den Proteinen. Während der Transkription wird die Information von der Ebene der DNA in RNA umgewandelt, welche in der Zelle zusätzlich zu dessen Rolle als Informationsmediator in Form der mRNA eine Vielzahl von Funktionen ausübt. Die Transkription benötigt in Hinblick auf ihre essentielle Rolle in der Errichtung des Proteoms und der notwendigen Adaption von Genexpressionsprogrammen an externe zelluläre Stimuli, den Zellzyklus etc. eine präzise und gleichzeitig flexible Regulation. Besonders für die Transkription von mRNA dient die eukaryotische RNA-Polymerase II (RNAP II) in diesem Prozess als eine zentrale Einheit, die einer Vielzahl regulativer Mechanismen wie post-translationaler Modifikationen und der Assemblierung dynamischer Proteinkomplexe unterliegt. Während Komponenten dieser Regulation wie die Zusammensetzung und Dynamik des Prä-Initiationskomplex bereits seit Jahrzehnten beschrieben sind, ist eine besondere Form der RNAP II-abhängigen Regulation erst in den letzten Jahren Gegenstand genauerer Untersuchungen geworden. So erfährt die RNAP II bei einer Vielzahl von Genen unmittelbar nach der Initiation einen Arrest, der das Enzym nicht weiter über die DNA prozessieren lässt und somit die produktive Elongation des Gens blockiert. Die Aufhebung dieser Blockade wird durch den positiven Transkriptions-elongationsfaktor b (P-TEFb) dominiert, der durch distinkte post-translationale Modifikationen der C-terminalen Domäne der RNAP II und assoziierter Faktoren die produktive Elongation ermöglicht. P-TEFb selbst unterliegt dabei einer strengen Regulation durch eine inaktivierende Assoziation mit Speicherkomplexen. P-TEFb wurde abseits dieser Komplexe in einer Vielzahl von Elongations-assoziierten Proteinkomplexen identifiziert, der Mechanismus der Transition aus dem inaktiven Speicherkomplex zur aktiven Form an der RNAP II war jedoch unbekannt.
Ein zentrales Element aller aktiven Komplexe ist die Anwesenheit von Proteinen der AF4/FMR2-Familie, darunter das AF4 Protein. Bemerkenswerterweise war die genaue Rolle dieses Proteins in den Komplexen bisher unbekannt oder wurde lediglich auf die strukturelle Integrität der Komplexe beschränkt. AF4 und speziell dessen N-Terminus ist über diese Rolle hinaus als Bestandteil des Fusionsproteins AF4-MLL eng mit der onkogenen Zelltransformation im Falle einer durch die t(4;11)(q21;q23) chromosomalen Translokation bedingter, akuter lymphoblastischer Leukämie assoziiert.
In dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass das AF4 Protein und im Speziellen sein N-Terminus in der Lage ist, die zelluläre Transkription durch die Aktivierung und Rekrutierung von P-TEFb zu aktivieren. In Anwesenheit von AF4 wird die Kinase-Untereinheit CDK9 des P-TEFb post-translational an Lysinresten modifiziert und damit aktiviert sowie die C-terminale Domäne der RNAP II im Kontext stärker phosphoryliert. Gleichzeitig wurde das P-TEFb inaktivierende Protein HEXIM1 stärker exprimiert. AF4 und AF4-MLL waren weiterhin in der Lage ein Elongations-kontrolliertes Reportergen zu aktivieren. Gleichzeitig führte die Überexpression des AF4 zu einer Erhöhung der zellulären RNA Menge. Zur genaueren Untersuchung der AF4-abhängigen Mechanismen wurden zwei Zelllinien erstellt, die zum Einen eine induzierbare und reproduzierbare Überexpression und Reinigung des AF4 erlaubten (TCZP-AF4ST) und zum Anderen durch lentiviralen knock-down eine an AF4-Mangelsituation nachstellten (AF4kd V100). Es konnte so gezeigt werden, dass AF4 über P-TEFb hinaus eine regulative Funktion gegenüber Transkription-assoziierten Faktoren wie CDK7, MENIN und NF?B besitzt und dass diese Faktoren vorrangig, analog zu P-TEFb, mit dem N-Terminus des AF4 interagieren. Die Überexpression von AF4 führte über die Bindung an die 7SK snRNA und deren Degradation zur Rekrutierung des P-TEFb aus den Speicherkomplexen in distinkte AF4-assoziierte Komplexe und zu einer Umverteilung des Faktors auf distinkte Loci im Zellkern, wobei der AF4 N-Terminus für sich alleine jedoch nicht in der Lage war, diese Funktion auszuüben. Im Falle eines Mangels an AF4 kam es zur Wachstumsretardierung der Zellen sowie zu einem völligen Aktivitätsverlust in Reportergenversuchen.
Die Tatsache, dass AF4 ein zentrales Element in der Elongationskontrolle darstellt führte zu der weitergehenden Vermutung, dass virale immediate early (IE) Proteine zur Kontrolle viraler Genexpression auf der Ebene der Elongation ebenfalls auf dieses Wirtsprotein zugreifen können. Es konnte vor diesem Hintergrund gezeigt werden, dass AF4 tatsächlich mit den IE-Proteinen IE1 (HCMV) und Zta (EBV) aus der Familie der Herpesviren interagiert und durch die Stabilisierung des AF4 Proteins eine kooperative, transaktivierende Funktion auf ein ALOX5 Reportergen ausgeübt wurde. Es wurde gezeigt, dass die viralen IE-Proteine dabei Komponenten der AF4 Komplexe sind und in der Zelle zur epigenetischen Regulation des ALOX5 Gens führen. Weiterhin konnte in diesen Experimenten dargestellt werden, dass AF4 über seine Rolle in der Elongationskontrolle hinaus auch distinkte Effekte in der Aktivierung von Promotoren und damit in der Initiation der Transkription zeigt. Damit konnte in dieser Arbeit zum ersten Mal die essentielle Rolle des AF4 Proteins in der Elongationskontrolle und der Initiation der Transkription als auch in der Infektion durch Herpesviren gezeigt werden.
Das Hepatozelluläre Karzinom (HCC) ist die sechsthäufigste Krebsart mit der zweithäufigsten krebsbedingten Letalität. Sorafenib ist bereits seit über 10 Jahren die einzige verfügbare und zugelassene systemische Chemotherapie. Allerdings zeigen Patienten oft eine Resistenz gegenüber Sorafenib.
In zahlreichen Krebsarten konnte bereits gezeigt werden, dass Sphingolipide bei der Tumorentwicklung und Chemoresistenz eine wichtige Rolle spielen. Sphingolipide sind bioaktive Lipidmoleküle, welche unteranderem für die Beeinflussung verschiedener Signalwege intra- und extrazellulär verantwortlich sind. So konnte gezeigt werden, dass das Verhältnis zwischen Sphingosin-1-Phosphat (S1P) und Ceramiden eine wichtige Rolle für das Überleben von Zellen spielt, wobei eine Verschiebung des Verhältnisses zugunsten des S1P meist eine proliferative Wirkung auf Zellen hat. Für die Phosphorylierung des Sphingosins zu S1P sind die zwei Enzyme Sphingosinkinase 1 und 2 (SPHK1/2) verantwortlich.
Es gibt bereits Studien, die nachweisen konnten, dass diese Enzyme gerade in Tumorzellen verstärkt exprimiert werden. Auf der anderen Seite kann eine verstärkte Bildung von Ceramiden die Apoptose der Tumorzellen verstärken. Daher ist es nicht verwunderlich, dass der Sphingolipid-Stoffwechsel einen interessanten Angriffspunkt für die Krebstherapie darstellt. Aus diesem Grund sollte in der vorliegenden Arbeit zunächst untersucht werden, ob Sorafenib einen Einfluss auf den Sphingolipid Stoffwechsel hat. Weiter sollte untersucht werden, ob die Beeinflussung des Sphingolipid-Stoffwechsels die Effekte von Sorafenib potenzieren könnte.
Es konnte zunächst gezeigt werden, dass Sorafenib die mRNA-Expression verschiedener Enzyme, die das Verhältnis zwischen Ceramiden und S1P regulieren, beeinflussen kann. Es wurde weiter untersucht, wie sich der Ceramidsynthase Inhibitor FB1 auf die Proliferation und die Induktion der Apoptose auswirkt. Dies wurde ebenfalls mit SLP (SPHK1 Inhibitor), SLM (SPHK2 Inhibitor) und SKI II, einem unspezifischen Inhibitor beider Sphingosinkinasen, untersucht. Es wurden weiter die Einflüsse aller verwendeten Substanzen auf die Bildung verschiedener Sphingolipide untersucht.
Hierbei konnte gezeigt werden, dass Sorafenib in der Lage ist, die Proliferation der Zellen zu hemmen und die Apoptose-Induktion zu fördern. Weiter führte Sorafenib zu einer Akkumulation der Dihydroceramide. Was wiederrum weder mit SKI II, FB1; SLP noch SLM beobachtet werden konnte. Der signifikante Anstieg der Dihydroceramid-Konzentrationen konnte mit dem durch Sorafenib induzierten oxidativen Stress in Verbindung gebracht werden.
SLP und SLM waren nicht in der Lage, die Effekte von Sorafenib auf die Proliferation zu potenzieren. Die Kombination von Sorafenib mit SLP oder SLM führte jedoch in den Huh7.5 Zellen zu einer drastischen Reduktion des S1P-Spiegel.
FB1 und SKI II führten zu einer stärkeren Hemmung der Proliferation als Sorafenib. Wobei gezeigt werden konnte, dass beide Substanzen die Ceramid-Spiegel tendenziell eher vermindern und die S1P-Spiegel erhöhen. Durch die Stimulation mit FB1 kam es sogar zu einer signifikanten Erhöhung der S1P-Spiegel. Es scheint, dass der Einfluss von FB1 und SKI II auf die Proliferation der Zellen unabhängig vom Sphingolipid-Stoffwechsel ist. Diese scheinen eher über andere Mechanismen zu wirken. Es könnte von Interesse sein, gerade diese Signalwege von SKI II im HCC weiter zu untersuchen, da SKI II bereits in Mausmodellen anderer Krebsarten vielversprechende Ergebnisse zeigte.
Das natürlich vorkommende Polyphenol Resveratrol (3,4‘,5-(E)-Trihydroxystilben) ist eine potente chemopräventive Substanz, die in vielen verschiedenen Krebszelllinien wirksam ist. Außerdem verfügt sie über anti-inflammatorische, anti-oxidative und pro-apoptotische Wirkungen. Da Resveratrol auch in Tiermodellen des Typ-2-Diabetes und der nicht-alkoholischen Fettlebererkrankung gute Effekte gezeigt hat, wird in Erwägung gezogen es zur Prävention und Behandlung von metabolischen Erkrankungen einzusetzen. Allerdings liegen, aufgrund von schneller Metabolisierung und geringer Bioverfügbarkeit, die wirksamen Konzentrationen im mikromolaren Bereich. Eine geeignete Strategie, um die anti-tumorale Wirkung und die Bioverfügbarkeit von Resveratrol zu verbessern, scheint die Methylierung der freien Hydroxylgruppen zu sein. Allerdings liefern einige Studien Hinweise darauf, dass diese strukturelle Modifikation der Stilbengrundstruktur zu einer Veränderung des antiproliferativen Wirkmechanismus der methylierten Substanzen führt. Daher führten wir im ersten Teil dieser Arbeit genauere Untersuchungen durch, um die Veränderungen der biologischen Wirkung, die durch die Methylierung der freien Hydroxylgruppen von (E)- und (Z)-Resveratrol verursacht werden, zu charakterisieren. Einen Schwerpunkt bildete die Bestimmung der metabolischen Effekte der methylierten Substanzen. Dabei sollte aufgeklärt werden, ob die Analoga noch immer in der Lage sind bekannte Resveratrol-Targets, wie AMPK, SIRT1 und Phosphodiesterasen, zu modulieren. Zunächst bestätigten wir, dass die methylierten Resveratrolanaloga ST911 (3,4‘,5-Z)-Trimethoxystilben) und ST912 (3,4‘,5-(E)-Trimethoxystilben) einen starken antiproliferativen Effekt auf verschiedene Krebszelllinien ausüben. Wie bereits zuvor beschrieben, konnten wir beobachten, dass ST911 und ST912 das Wachstum von Tumorzellen stärker beeinflussen, als die hydroxylierten Substanzen (E)- und (Z)-Resveratrol. Dies, in Verbindung mit einer vernachlässigbaren zytotoxischen Wirkung und einer deutlich geringeren antiproliferativen Wirkung auf Primärzellen, legt nahe, dass ST911 als potentielles neues Chemotherapeutikum weiter untersucht werden sollte. Zudem zeigten ST911 und ST912 signifikante pro-apoptotische Wirkungen in CaCo-2-Zellen. Auch Resveratrol konnte in diesen Zellen Apoptose auslösen, allerdings erst nach Behandlung mit deutlich höheren Konzentrationen, verglichen mit ST911 und ST912. Eine genauere Charakterisierung der antitumoralen Wirkung von ST911 in HT-29-Zellen zeigte, dass ST911 die Polymerisation von Tubulin zu Mikrotubuli beeinflusst und einen Arrest des Zellzyklus in der Mitose-Phase auslöst. Im Gegensatz dazu führt Resveratrol zu einem Zellzyklus-Arrest in der S-Phase und beeinflusst die Tubulinpolymerisation nicht. Diese Beobachtungen verstärkten die Annahme, dass ST911 ein Mitosehemmer ist und betonten noch einmal die mechanistischen Unterschiede zwischen Resveratrol und den methylierten Analoga. Interessanterweise konnte ST911 die hepatische Fettakkumulation in einem in-vitro-Steatosemodell nicht beeinflussen, während eine Behandlung mit Resveratrol zu einer signifikanten Reduktion der intrahepatischen Triglyzeride führte. Dieses Experiment lässt vermuten, dass die stärkere antiproliferative Wirkung von ST911, keine erhöhte Aktivität in metabolischen Krankheitsmodellen nach sich zieht. Die beobachteten Unterschiede im Steatosemodell führten zu der Frage, ob die methylierten Analoga noch immer in der Lage sind die gleichen metabolischen Targetgene zu modulieren, die in der Literatur für Resveratrol beschrieben sind. Vor kurzem wurden Phosphodiesterasen (PDEs) als direkte Targets von Resveratrol identifiziert. Die Inhibition von PDEs durch Resveratrol führt zu einem Anstieg der intrazellulären cAMP-Konzentration. Diese wiederum aktiviert die bekannten Resveratrol-Targetgene AMPK und SIRT1. Unsere Experimente zeigten, dass ST911 und ST912 keinen Einfluss auf die intrazelluläre cAMP-Konzentration haben. Zusätzlich konnten wir keine AMPK- oder SIRT1-abhängigen Veränderungen der Genexpression beobachten. Dies ist ein Hinweis darauf, dass die Substanzen ihre zellulären Effekte vermutlich nicht über eine Modulation von PDEs, AMPK oder SIRT1 vermitteln. Zusammenfassend liefert der erste Teil der Arbeit Beweise dafür, dass ST911 keine positiven Effekte in metabolischen Krankheitsmodellen ausübt. Dies liegt vermutlich in einem Aktivitätsverlust gegenüber den metabolischen Targetgenen von Resveratrol begründet. Des Weiteren unterstützen unsere Ergebnisse frühere Arbeiten, die zeigen konnten, dass ST911 an Tubulin bindet und die Polymerisation zu Mikrotubuli verhindert. Weiterhin bestätigen unsere Daten, dass die Methylierung von Resveratrol zu einer grundlegenden Veränderung des Wirkmechanismus dieser Substanzen führt, die von einem kompletten Verlust der metabolischen Aktivität begleitet wird. Dies sollte bei zukünftigen Leitstrukturoptimierungen mit Resveratrol berücksichtigt werden. Im ersten Teil dieser Arbeit konnte außerdem gezeigt werden, dass Resveratrol die Gentranskription des nukleären Rezeptors SHP (aus dem Englischen: small heterodimer partner) stark induziert. Der Mechanismus dieser Induktion scheint von der Aktivität von AMPK und SIRT1 abhängig zu sein. Diese Ergebnisse konnten unser Verständnis der vielseitigen biologischen Wirkungen von Resveratrol erweitern. Dennoch sollte die Relevanz der SHP-Induktion für die Effekte von Resveratrol auf metabolische Krankheiten und Tumorwachstum noch weiter untersucht werden. Während der Experimente für den ersten Teil der Arbeit stellten wir fest, dass der AMPK-Inhibitor Compound C (CC) in der Lage war, die wachstumshemmende Wirkung von ST911 signifikant zu reduzieren. Die Untersuchung dieses sogenannten „Rescue-Effektes“ wird durch die Tatsache bestärkt, dass eine steigende Anzahl von Tumoren resistent gegenüber Chemotherapeutika ist. Außerdem fehlen spezifische Antidota für akute Intoxikationen mit Mitosehemmern. Daher zielten die folgenden Experimente darauf ab den Rescue-Effekt näher zu charakterisieren und die zugrundeliegenden Wirkmechanismen aufzuklären. Zunächst zeigten Knockdown-Experimente, dass der Rescue-Effekt unabhängig von der AMPK-inhibierenden Wirkung von CC vermittelt wird. Da CC ein ATP-kompetitiver Inhibitor der AMPK ist und zuvor bereits gezeigt wurde, dass es auch eine große Zahl anderer Kinasen inhibieren kann, vermuteten wir, dass der Rescue-Effekt mit diesen Off-Target-Effekten von CC zusammenhängt. Als nächstes testeten wir, ob die wachstumshemmenden Effekte von anderen Mitosehemmern auch durch CC aufgehoben werden können. Wir wählten verschiedene etablierte Substanzen, die dafür bekannt sind mit Mikrotubuli zu interagieren: Colchicin, das Vinca-Alkaloid Vinblastin, Disorazol A und das aus Taxus-Arten isolierte Paclitaxel. Die ersten drei dieser Substanzen haben eine depolymerisierende Wirkung auf die Mikrotubuli, während Paclitaxel zu einer stärkeren Polymerisierung führt. Zudem binden diese Substanzen an drei verschiedenen Bindestellen am Tubulin. Interessanterweise zeigten unsere Versuche, dass CC die antiproliferative Wirkung aller getesteten Mitosehemmer auf HT-29-Zellen, unabhängig von der Bindestelle, abschwächen kann. Des Weiteren konnte CC die Wirkung der pro-apoptotischen Substanz Staurosporin nicht reduzieren. Diese Ergebnisse weisen darauf hin, dass eher die tubulinbindenden, als die pro-apoptotischen Eigenschaften, von ST911 für den Rescue-Effekt verantwortlich sind. Um zu untersuchen, ob der Rescue-Effekt mit einer kompetitiven Bindung von CC und Mitosehemmern an Mikrotubuli erklärt werden kann, führten wir eine Immunfluoreszenzfärbung von ?-Tubulin durch. Wir konnten beobachten, dass die Tubulinpolymerisation und die Funktion des Spindelapparates in Zellen, die mit Mitosehemmern behandelt wurden, deutlich eingeschränkt waren. Außerdem stellten wir fest, dass CC nicht in der Lage ist die Zerstörung des Tubulingerüstes durch die Mitosehemmer zu verhindern. Eine Einzelbehandlung mit CC hatte keine Wirkung auf die Polymerisation des Tubulin zu Mikrotubuli. Insgesamt legen diese Daten nahe, dass CC nicht direkt an Mikrotubuli binden kann, um mit den Mitosehemmern um eine Bindung zu kompetitieren. Um diese Hypothese zu stärken, führten wir, in Kooperation mit Dr. Jennifer Herrmann (Helmholtz Institut für Pharmazeutische Forschung, Saarbrücken) SPR-Experimente mit Chips durch, auf denen Tubulin immobilisiert wurde. Die Messungen zeigten, das CC nicht in der Lage war gebundenes Disorazol A von der Bindestelle am Tubulin zu verdrängen. Dies zeigte nun deutlich, dass der Rescue-Effekt nicht auf einer Kompetition von CC und Mitosehemmern um Tubulinbindestellen beruht. Zellzyklusanalysen zeigten, dass die kombinierte Behandlung mit ST911 und CC zu einer Abschwächung des durch ST911 verursachten G2/M-Arrestes führt. Da wir zuvor bereits eine Beeinflussung der direkten Targets von CC und Mitosehemmern, AMPK oder Tubulin, ausgeschlossen hatten, schlussfolgerten wir, dass CC vermutlich mit anderen zellulären Signalwegen interagiert, die zu den beschriebenen Veränderungen des Zellwachstums und der Zellzyklusprogression führen. Eine Literaturrecherche ergab, dass ein erhöhter intrazellulärer Polyaminspiegel, die Aktivierung des PI3K/Akt-Signalweges oder eine erhöhte Aktivität des Transkriptionsfaktors c-Myc zu einer Abschwächung eines G2/M-Arrestes führen können. Daher fokussierten wir die weiteren Experimente auf die Untersuchung einer möglichen Beteiligung dieser Targets an der Vermittlung des Rescue-Effektes. Wir zeigten, dass CC die Expression der Spermidin/Spermin-N1-Acetyltransferase (SSAT) erhöhen kann. Die SSAT ist ein Enzym, das an der Biosynthese der Polyamine beteiligt ist. Zusätzlich beobachteten wir, dass die Behandlung mit CC nach 4 h zu einer Erhöhung von phosphoryliertem und damit aktiviertem Akt (pAkt) führt. Die zusätzliche Behandlung mit Wortmannin, einer Substanz, welche die Phosphorylierung von Akt hemmen kann, führte zu einer Abschwächung des Rescue-Effektes. Insgesamt weisen diese Ergebnisse darauf hin, dass eine Aktivierung von Akt-Signalwegen und ein Einfluss auf die Polyaminbiosynthese, zumindest teilweise, mit dem Rescue-Effekt zusammenhängen können. Die Überexpression von c-Myc, einem Transkriptionsfaktor, der eng mit dem Akt-Signalweg und der Biosynthese von Polyaminen zusammenhängt, ist oft mit einer erhöhten Zellproliferation verbunden. Wir untersuchten die zellulären Proteinmengen von c-Myc mittels Western Blot und entdeckten, dass nach der Behandlung mit Mitosehemmern zusätzliche Banden für c-Myc auf den Blots auftauchten. Diese Ergebnisse geben einen Hinweis auf eine posttranslationale Modifikation von c-Myc nach der Behandlung mit Mitosehemmern. Durch Kombination mit CC wurden die zusätzlichen Banden abgeschwächt und die Gesamtmenge an c-Myc-Protein nahm nach längeren Inkubationszeiten rapide ab. Dies legt nahe, dass die posttranslationale Modifikation von c-Myc zum Abbau des Proteins führt und, dass CC dies abschwächen kann. Verschiedene Arbeiten zeigten bereits, dass c-Myc phosphoryliert wird und nach Konjugation mit Ubiquitin vom Proteasom abgebaut wird. Daher überprüften wir, ob eine Inhibition des Proteasoms mit MG-132 zu einem ähnlichen Rescue-Effekt führt wie mit CC. Tatsächlich führte die Behandlung mit ST911 in Kombination mit MG-132 zu einer Zunahme der Zellproliferation, wie sie vorher bereits für CC beobachtet wurde. Dies bestärkte die Theorie, dass der proteasomale Abbau von c-Myc eine Rolle beim Rescue-Effekt spielen kann. Als nächstes untersuchten wir die Phosphorylierungen von c-Myc am Ser62 und Thr58. Diese Phosphorylierungen spielen eine wichtige Rolle beim Abbau von c-Myc, indem Sie das Protein für die Konjugation mit Ubiquitin markieren. Die densitometrische Auswertung der Western Blots ergab, dass die Behandlung mit ST911 initial zu einem Anstieg von phospho-c-Myc führt, dem eine schnelle Abnahme zu späteren Zeitpunkten folgt. Außerdem konnte gezeigt werden, dass dieser Anstieg von phospho-c-Myc durch Kombination mit CC reduziert wurde. Dies unterstützt die Hypothese, dass ST911 den proteasomalen Abbau von c-Myc begünstigt und CC dies verhindern kann. Dies ist eine mögliche Erklärung für die erhöhte Zellproliferation, die für die durch CC „geretteten“ Zellen beobachtet wurde. Allerdings konnte das direkte Target, das für die Vermittlung des Rescue-Effektes durch CC verantwortlich ist, bisher nicht identifiziert werden. DYRKs (aus dem Englischen: Dual-specificity tyrosine-phosphorylation-regulated kinases) sind wichtige Regulatoren von Proteinstabilität und –abbau während der Zellzyklusprogression. Vor kurzem wurde gezeigt, dass DYRK1A und DYRK2 c-Myc am Ser62 phosphorylieren können und es dadurch für den proteasomalen Abbau markieren. Interessanterweise wurde CC bereits in einer früheren Publikation als potenter Inhibitor verschiedener DYRKs beschrieben. Allerdings wurde die Hemmung der DYRKs durch CC in diesem Artikel nur in einer einzelnen Konzentration getestet. Daher bestimmten wir in einem in-vitro-Kinaseassay in Kooperation mit Dr. Matthias Engel (Universität des Saarlandes, Saarbrücken) die IC50-Werte für CC gegenüber DYRK1A, DYRK1B und DYRK2. Unsere Ergebnisse zeigten deutlich, dass CC ein bevorzugter Inhibitor von DYRK1A und DYRK1B (IC50-Wert von etwa 1 µM) ist, aber auch DYRK2 hemmen kann (IC50-Wert von etwa 5 µM). Da sich die vermutete Bindestelle von CC in der stark konservierten Kinasedomäne befindet, ist eine unspezifische Inhibition verschiedener DYRKs nicht überraschend. Genexpressionsanalysen zeigten, dass HT-29 und HepG2 vergleichbare Mengen an DYRK1A exprimieren, während DYRK1B und DYRK2 deutlich weniger in HepG2 vorhanden sind. Vorige Experimente hatten gezeigt, dass HepG2 weniger sensitiv für ST911 und den durch CC vermittelten Rescue-Effekt waren. Wir schlussfolgerten, dass die unterschiedliche Expression der DYRK-Formen eine mögliche Erklärung für diese Unterschiede sein könnte. Daher entschieden wir uns für eine nähere Untersuchung von DRK1B und DYRK2. Experimente mit verschiedenen Inhibitoren der DYRKs zeigten, dass diese Substanzen, ähnlich wie CC, in der Lage waren die antiproliferative Wirkung von ST911 abzuschwächen. Diese Ergebnisse wurden in nachfolgenden Knockdown-Experimenten bestätigt. Dies legt nahe, dass die DYRKs zumindest teilweise für die Vermittlung des Rescue-Effektes verantwortlich sind. Zusammenfassend man kann sagen, dass der Rescue-Effekt vermutlich mit der Biosynthese von Polyaminen, dem Akt-Signalweg und dem proteasomalen Abbau von c-Myc zusammenhängt. Des Weiteren scheint die direkte Inhibition von DYRKs durch CC ein vielversprechender Ansatz für die Erklärung des Effektes zu sein. Allerdings konnte in keinem der Experimente eine kompletten Aufhebung des Rescue-Effektes durch CC gezeigt werden. Daher gehen wir davon aus, dass verschiedene Targets in die Vermittlung des Rescue-Effektes involviert sind. Dies ist höchstwahrscheinlich auf eine unspezifische, ATP-kompetitive Hemmung verschiedener Kinasen durch CC zurückzuführen. Nichtsdestotrotz, sind eine nähere Untersuchung von DYRKs im Rahmen der Therapieresistenz von Tumoren und eine genauere Aufklärung der am Rescue-Effekt beteiligten Signalwege eine interessantes Feld für weitere Untersuchungen.
The tumor suppressor programmed cell death 4 (Pdcd4) exerts its function by inhibiting protein translation initiation. Specifically, it displaces the scaffold protein eukaryotic initiation factor 4G (eIF4G) from its binding to the eukaryotic initiation factor 4A (eIF4A). Thereby, Pdcd4 inhibits the helicase activity of eIF4A, which is necessary for the unwinding of highly structured 5’ untranslated regions (UTRs) of messenger RNAs (mRNAs) often found in oncogenes like c-myc to make them accessible for the translation machinery and subsequent protein production. Overexpression of Pdcd4 inhibits tumorigenesis in vitro and in vivo and inversely, Pdcd4 knockout mice show enhanced tumor formation. In line, Pdcd4 is lost in various tumor types and proposed as prognostic factor in colon carcinomas. Unlike most other tumor suppressors that are rendered nonfunctional by mutations (e.g., p53), Pdcd4 loss is not attributable to mutational inactivation. It is regulated via translational repression by microRNAs and increased degradation of the protein under tumor promoting, inflammatory conditions and mitogens. Specifically, proteasomal degradation of Pdcd4 is controlled by p70 S6 Kinase (p70S6K)-mediated phosphorylation in its degron sequence (serines 67, 71 and 76). Stimulation of the PI3K-AKT-mTOR pathway by growth factors, hormones and cytokines initiates p70S6K activity. Phosphorylated Pdcd4 is subsequently recognized by the E3 ubiquitin ligase beta-transducin repeats-containing protein (β-TrCP) and marked with a polyubiquitin tail to be detected by the 26S proteasome for degradation. β-TrCP represents the substrate specific recognition subunit of the ubiquitin ligase complex responsible for protein-protein interaction with Pdcd4 as substrate for ubiquitin transfer and subsequent proteasomal disassembly.
The first part of the present work aimed at identifying novel stabilizers of the tumor suppressor Pdcd4 in a high throughput screen (HTS). As assay design, a fragment of Pdcd4 from amino acid 39 to 91, containing the phosphorylation sensitive degron sequence, was fused to a luciferase reporter gene construct. Stable expression of this Pdcd4(39-91)luciferase (Pdcd4(39-91)luc) fusion protein in HEK 293 cells served as read-out for the Pdcd4 protein amount to be detected in a high throughput compatible cell-based assay. Loss of Pdcd4(39-91)luc was induced by treatment with 12-O-
tetradecanoylphorbol-13-acetate (TPA), a phorbolester, which activates the PI3K signaling cascade leading to degradation of Pdcd4. The cut-off for hit definition was set at >50% activity in rescuing the Pdcd4(39-91)luc signal from TPA-induced degradation. Activity was calculated relative to the difference of DMSO- and TPA-treated cells (ΔDMSO-TPA = RLUDMSO-RLUTPA). Initial screening of a protein kinase inhibitor library (PKI) revealed hit substances expected to show Pdcd4 stabilizing activity by inhibition of kinases involved in Pdcd4 downregulation, e.g., the mTOR inhibitor rapamycin, the PI3K inhibitors wortmannin and LY294002 and the PKC inhibitors GF 109203X and Ro 31-8220.
The Molecular Targets Laboratory (MTL) of the National Cancer Institute (NCI) in Frederick, USA, hosts one of the largest collections of crude natural product extracts as well as a big substance libraries from pure synthetic sources. Screening of over 15 000 pure compounds and over 135 000 natural product extracts identified 46 pure and 42 extract hits as Pdcd4 stabilizers. For nine synthetic and six natural product derived compounds (after bioassay-guided fractionation), dose-dependent activities for recovering the TPA-induced Pdcd4(39-91)luc loss defined IC50s in the low micromolar range. Most importantly, these compounds were confirmed to stabilize endogenous Pdcd4 protein levels from forced degradation as well. This result proved the assay design to be highly representative for endogenous cellular mechanisms regulating Pdcd4 protein stability. The next step was to stratify the hit substances according to their likely mechanism of action to be located either up- or downstream of the p70S6K-mediated phosphorylation of Pdcd4. Therefore, phosphorylation of S6, as proto-typical p70S6K target, was analyzed and uncovered two natural derived compounds to influence p70S6K activity. Four substances did not affect p70S6K phosphorylation activity and were therefore considered to stabilize Pdcd4 by acting downstream, i.e. on the β-TrCP-mediated proteasomal degradation.
In the second part of this work, one of these compounds, namely the sesquiterpene lactone erioflorin, isolated by bioassay-guided fraction from the active extract of Eriophyllum lanatum, Asteraceae, was further characterized in detail with respect to its molecular mechanism of action. Erioflorin dose-dependently protected both Pdcd4(39-91)luc and endogenous Pdcd4 protein from TPA-induced degradation with IC50s of 1.28 and 2.64 μM, respectively. Pdcd4 stabilizing activity was maximal at 5 μM erioflorin. Up to this concentration, erioflorin was verified not to inhibit p70S6K activity. In addition, it was observed that erioflorin rescued Pdcd4(39-91)luc from both, wild type and constitutively active p70S6K-mediated downregulation. Only wild type p70S6K was inhibitable by the mTOR inhibitor rapamycin which served as an upstream acting control. To study the next section of Pdcd4 regulation, i.e. recognition by the E3 ubiquitin ligase β-TrCP, Pdcd4(39-91)luc and endogenous Pdcd4 were immunoprecipitated from whole cell extracts with the corresponding antibodies. In this key experiment, treatment with TPA increased overexpressed β-TrCP binding to both and this coimmunoprecipitation could be strongly reduced by erioflorin treatment. This result strongly pointed to an inhibitory mechanism of the β-TrCP specific binding to Pdcd4 by erioflorin. In addition, erioflorin disrupted the binding of in vitro transcribed/translated β-TrCP to Pdcd4 in an in vitro interaction assay to exclude nonspecific intracellular signals. Furthermore, polyubiquitination of Pdcd4 was decreased by erioflorin treatment as well. To clarify questions regarding specificity of erioflorin for the E3 ubiquitin ligase β-TrCP, stability of another important β-TrCP target was explored, i.e. the tumor suppressor inhibitor of kappa B alpha (IκBα). Indeed, the tumor necrosis factor alpha (TNFα)-mediated loss of IκBα could be prevented by erioflorin cotreatment. On the other hand, the E3 ubiquitin ligase von Hippel Lindau protein (pVHL) was left unaffected as its target hypoxia inducible factor 1 alpha (HIF-1α) could not be stabilized from oxygen-dependent degradation by erioflorin treatment. These results argued strongly for erioflorin being a specific inhibitor of β-TrCP-mediated protein degradation. Functional consequences of erioflorin treatment were investigated by observing its influence on the transcriptional activities of the transformation marker activator protein 1 (AP-1, an indirect downstream target of Pdcd4) and nuclear factor κB (NF-κB which is directly inhibited by IκBα). Indeed, erioflorin showed significant inhibition of AP-1 and NF-κB reporter constructs at 5 μM, a concentration for which an impact on cell viability was excluded. Finally to characterize the significance of erioflorin in a cell-based tumorigenesis assay, the highly invasive colon carcinoma cell line RKO was tested in a two dimensional migration assay. Erioflorin was discovered to significantly lower cell migration in a wound closure assay.
In conclusion, development of a high throughput compatible cell-based reporter assay successfully identified novel substances from pure synthetic and natural product derived background as potent stabilizers of the tumor suppressor Pdcd4. In addition, this work aimed at elucidating the detailed mechanism of action of the sesquiterpene lactone erioflorin from Eriophyllum lanatum, Asteraceae. Erioflorin was discovered to inhibit the E3 ubiquitin ligase β-TrCP, thereby preventing protein degradation of tumor suppressors like Pdcd4 and IκBα. This may offer the possibility to more specifically target protein degradation and generate less adverse side effects by blocking a particular E3 ubiquitin ligase compared to general proteasome inhibition.
Tumor development usually follows predictable paths where tumor cells acquire common characteristics and features known as the hallmarks of cancer. Recently, additional characteristics have been added to these hallmarks since solid tumors are composed of a very heterogeneous population of transformed, formerly normal tissue cells and stromal cells, e.g. immune cells and fibroblasts. Compelling evidence suggests that stromal cells and tumor cells maintain a symbiotic relationship to build up the tumor microenvironment and to fuel tumor growth. In cancer therapies, common features of tumors such as unrestricted cell growth, suppression of immunological responses, and the ability to form new blood vessels (angiogenesis) have emerged as the main targets of interest. The lipid mediator prostaglandin E2 (PGE2) is known to promote all these features and thus, is connected to cancer progression in general. Its synthesis is triggered in response to stress factors or during inflammation. Inducible PGE2 production relies on the enzymes cyclooxygenase 2 (COX-2) and microsomal prostanglandin E synthase 1 (mPGES-1), which are simultaneously expressed in response to a variety of different stimuli and are functionally coupled. Inhibition of COX-2 with non-steroidal antiinflammatory drugs (NSAIDs) for cancer treatment is, however, limited by cardiovascular risks, since selective COX-2 inhibition disrupts the prostacyclin/thromboxane balance. Therefore targeting mPGES-1 downstream of COX-2 for PGE2 inhibition was evaluated in this work in different steps of carcinogenesis. Knockdown of mPGES-1 in DU145 prostate cancer cells revealed that the mPGES-1 status did not affect growth of monolayer tumor cells, but significantly impaired 3D growth of multi-cellular tumor spheroids (MCTS). Spheroid formation induced COX-2 in DU145 and other prostate cancer spheroids. High levels of PGE2 were detected in supernatants of DU145 MCTS as opposed to monolayer DU145 cells. Pharmacological inhibition of COX-2 and mPGES-1 confirmed the pivotal role of PGE2 for DU145 MCTS growth. Besides promoting spheroid growth, MCTS-derived PGE2 also inhibited cytotoxic T lymphocyte (CTL) activation. When investigating the mechanisms of COX-2 induction during spheroid formation, the typical tumor microenvironmental factors such as glucose deprivation, hypoxia or tumor cell apoptosis failed to enhance COX-2. Interestingly, when interfering with apoptosis in DU145 spheroids, the pan-caspase inhibitor Z-VAD-FMK triggered a Summary 12 shift towards necrosis, thus enhancing COX-2 expression. Coculturing viable DU145 monolayer cells with isolated heat-shocked-treated necrotic DU145 cells, but not with necrotic cell supernatants, induced COX-2 and PGE2, confirming the impact of necrosis for MCTS growth and CTL inhibition. As mentioned, in vivo tumors are very heterogenous mixtures of tumor cells and stromal cells e.g. immune cells. Hence, the interaction of the immune system with tumors was investigated in further experiments. When coculturing MCF-7 breast cancer spheroids with human peripheral blood mononuclear cells (PBMCs), only low levels of PGE2 were detected, since MCF-7 cells did not upregulate COX-2 during spheroid formation and did not induce PGE2 production by PBMCs. Under inflammatory conditions, by adding the toll-like receptor 4 (TLR4) agonist lipopolysaccharide (LPS) to cocultures, PGE2 production was triggered, spheroid sizes were reduced, and numbers of high levels of granzyme B expressing (GrBhi) CTLs were increased, while CD80 expression by tumor-associated phagocytes was also elevated. Inhibition of CD80 but not CD86 diminished numbers of GrBhi CTLs and attenuated spheroid lysis. To determine the role of ctivation-induced PGE2 production, use of the COX-2 inhibitor celecoxib and the experimental mPGES-1 inhibitor C3 further increased CD80 expression. Addition of PGE2, the prostaglandin E2 (EP2) receptor agonist butaprost, and the phosphodiesterase 4 (PDE4) inhibitor rolipram reduced LPS/C3-triggered CD80 expression, confirming the impact of COX- 2/mPGES-1-derived PGE2 on shaping phagocyte phenotypes in an EP2/cAMP-dependent manner. In a spontaneous breast cancer model (MMTV-PyMT), mPGES-1-deficiency significantly delayed tumor growth in mice, confirming an overall protumorigenic role of mPGES-1 in breast cancer development in vivo. However in tumors of mPGES-1-/- mice, tumor-infiltrating phagocytes expressed low levels of CD80 similar to their wildtype counterparts. These data suggest that the immunosuppressive microenvironment does not allow for immunostimulatory effects by mPGES-1 inhibition without an activating stimulus. Evidences in this study recommend the application of mPGES-1 inhibitors for treating cancer diseases, since mPGES-1 promotes tumor growth in multiple steps of carcinogenesis, ranging from well-characterized effects of tumor cell growth to immune suppression of CTL activity and phagocyte polarization. Regarding the latter, blunting PGE2 during immune activation may limit the tumor-favoring features of inflammation and improve the efficiency of TLR4 based immune therapies.
Zur Behandlung von chronisch entzündlichen Erkrankungen besteht nach wie vor ein dringendes medizinisches Bedürfnis, da die bisher eingesetzten Medikamente gerade in der Langzeittherapie zu schwerwiegenden Nebenwirkungen führen können. Um chronisch entzündliche Erkrankungen in Zukunft adäquat therapieren zu können, sind bereits verschiedene neuartige Ansätze in klinischer bzw. präklinischer Entwicklung. Ein möglicher Ansatz besteht in einer dualen Hemmung der mikrosomalen Prostaglandin E2 Synthase-1 (mPGES-1) und der 5-Lipoxygenase (5-LO). Im Rahmen dieser Arbeit wurden die Struktur-Wirkungs-Beziehungen (SAR) von zwei verschiedenen Leitstrukturen an der 5 LO und der mPGES 1 untersucht. Die erste Leitstruktur entstammt aus den Arbeiten von Waltenberger et al. und besitzt im Grundgerüst eine Sulfonamidstruktur. In dieser Arbeit ist es gelungen, durch eine gezielte Untersuchung der Struktur-Wirkungsbeziehungen, die Leitstruktur I an der 5 LO und der mPGES-1 in ihrer Potenz zu optimieren. Die Leitstruktur (IC50: 5-LO (zellfrei) = 5.7 µM, IC50: 5 LO (PMNL) = 3.7 µM, IC50: mPGES-1 = 4.5 µM) konnte durch Variation in allen drei Positionen modifiziert werden, so dass die optimierte Struktur 170 (IC50: 5-LO (zellfrei) = 2.3 µM, IC50: 5-LO (PMNL) = 0.4 µM, IC50: mPGES-1 = 0.7 µM) entstanden ist. Für die Verbindung 170 wurden die pharmakokinetischen Eigenschaften, wie Löslichkeit und metabolische Stabilität, sowie der Wirkmechanismus auf molekularer Ebene bestimmt. Ebenso konnte für Verbindung 170 auch in vivo anti-entzündliche Eigenschaften festgestellt werden.
Die zweite Leitstruktur stammt ebenfalls aus den Arbeiten von Waltenberger et al. und besitzt im Grundgerüst eine Mercaptobenzothiazol-Grundstruktur. Aufgrund der Ähnlichkeit zu den bekannten Pirinixinsäurederivaten wurde auch hier für die Untersuchung der Struktur-Wirkungs-Beziehungen zunächst eine Kettenverlängerung an der Alkylkette vorgenommen. Es ließ sich auch hier durch eine gezielte SAR, die Leitstruktur bis hin zum submikromolaren Bereich in Verbindung 219 optimieren. Gleichzeitig ist es gelungen in Verbindung 219 einer der am potentesten dual ausgeglichensten dualen 5 LO/mPGES-1 Inhibitoren zu identifizieren.
Zusammenfassend lässt sich sagen, dass in dieser Arbeit es gelungen ist durch gezielte Untersuchungen der Struktur-Wirkungs-Beziehungen zwei verschiedene Substanzklassen zu dualen 5-LO/mPGES-1 Inhibitoren zu optimieren. Ebenso konnte für Substanz 170 auch in vivo anti-entzündliche Eigenschaften festgestellt werden. Diese Arbeit soll dazu beitragen, das therapeutische Potential von dualen 5-LO/mPGES-1 Inhibitoren als anti-entzündliche Wirkstoffe in Zukunft besser einschätzen zu können.
Der ligandaktivierte Transkriptionsfaktor Farnesoid X Rezeptor (FXR) ist neben seiner Funktion als Regulator des Gallensäurehaushaltes auch in vielen anderen metabolischen Prozessen wie Glukose- und Lipidhomöostase involviert und besitzt antiinflammatorische Eigenschaften. Gerade bei hepatischen, gastrointestinalen und systemischen Erkrankungen erscheint FXR daher als interessante Zielstruktur zur Behandlung metabolischer Erkrankungen. Basierend auf den natürlichen Liganden von FXR, den Gallensäuren, wurde Obeticholsäure (OCA) als seminsynthetisches Derivat der endogenen Chenodesoxycholsäure zu einem potenten FXR-Agonisten entwickelt. OCA wurde in mehreren Studien auf seine therapeutische Wirkung bei hepatisch-entzündlichen Krankheitsbildern wie der primären biliären Cholangitis (PBC), der nicht-alkoholischen Fettleber (engl: non-alcoholic fatty liver disease, NAFLD) und der daraus folgenden nicht-alkoholischen Steatohepatitis (NASH) getestet. Mittlerweile ist OCA als Zweitlinientherapie der PBC auf dem Arzneimittelmarkt zuge-lassen. Neben OCA gibt es noch eine große Anzahl an weiteren FXR-Liganden, deren strukturelle Diversität von Steroiden bis nicht-steroidalen kleinen Molekülen (engl: small molecules) reicht. Trotz dieser Erfolge muss das Therapiepotential von FXR noch weiter ausgebaut werden. Die meisten verfügbaren Liganden besitzen in vitro zwar eine hohe Potenz, können in ihrem pharmakokinetischen Profil oder ihrer Selektivität gegenüber anderen nukleären Rezeptoren aber nicht überzeugen.
Die hier vorliegende Arbeit hat sich mit der Entwicklung unterschiedlicher Liganden für FXR beschäftigt und diese in vitro und teilweise auch in vivo charakterisiert, um sie entsprechend ihrer Wirkungsweise einzuordnen und ein besseres Verständnis der regulatorischen Funktion von FXR zu erlangen.
Modulation von FXR bezieht sich nicht nur auf die agonistische Aktivierung, sondern setzt sich auch mit Antagonismus auseinander. Neben einigen Krankheitsbildern, die aus einer Überexpression von FXR resultieren, werden Antagonisten als Werkzeug (engl: tool compound) zur Aufklärung von konformellen Veränderungen von FXR und deren Auswirkung auf bestimmte Signalwege benötigt. Für die Erforschung solcher FXR-Antagonisten sollte das Potential nicht-steroidaler Antirheumatika (engl: non-steroidal anti-rheumatic drugs, NSAIDs) als etwaige Leitstrukturen untersucht werden, da in einer Veröffentlichung von Lu et al. ein FXR-Antagonismus durch NSAIDs postuliert wurde. Beim Versuch der Reproduktion der Ergebnisse von Lu et al. mit den drei NSAIDs Ibuprofen, Indometacin und Diclofenac wurde festgestellt, dass die Effekte auf den ersten Blick antagonistisch erscheinen, aber bei genaueren biochemischen Untersuchungen zweifelsfrei als Zytotoxizität identifiziert wurden.
FXR-Antagonisten wie Guggulsteron oder Gly-MCA sind auf ihre therapeutische Wirksamkeit unter-sucht worden, aber die genaue Wirkweise ist noch nicht aufgeklärt. Aufgrund ihrer steroidalen Grundstruktur ist ihre Selektivität gegenüber anderen nukleären Rezeptoren fraglich. Die überschaubare Anzahl an publizierten nicht-steroidalen FXR-Antagonisten besitzt zwar moderate IC50-Werte, ihre strukturelle Diversität und Selektivität ist aber limitiert. Zur Entwicklung neuer potenter FXR-Antagonisten, die aus kleinen Molekülen (engl: small molecules) aufgebaut sind, wurde eine N-Phenylbenzamid-Leitstruktur ausgewählt. Diese Leitstruktur wurde im Rahmen der SAR-Unter-suchungen zur Entwicklung von Anthranilsäurederivaten als FXR-Partialagonisten innerhalb des Arbeitskreises entdeckt. Ausgehend von dieser Leitstruktur wurde eine mehrstufige, systematische SAR-Untersuchung durchgeführt, wodurch ein sehr potenter FXR-Antagonist entwickelt werden konnte, der anschließend umfangreich biochemisch auf FXR-Modulation, Selektivität, Löslichkeit, Toxizität und metabolische Stabilität charakterisiert wurde.
Neben dem Verständnis eines Modulationsmechanismus ist die konkrete Anwendung eines FXR-Liganden zu therapeutischen Zwecken von großem Interesse. Die Beteiligung von FXR in unterschiedlichen metabolischen Prozessen macht den Rezeptor zu einem begehrten Ansatzpunkt für die Wirkstoffentwicklung. Doch die Behandlung eines multifaktoriellen Krankheitsbildes (z.B. metabolisches Syndrom, NASH) sollte sich nicht nur auf einen der gestörten Signalwege beziehen, da diese Erkrankungen durch mehrere Faktoren ausgelöst oder beeinflusst werden. Der semisynthetische FXR-Agonist OCA zeigte innerhalb der FLINT-Studie sowohl antientzündliche und antifibrotische Effekte, als auch eine Verbesserung der metabolischen Parameter mit Blick auf NAFLD und NASH. Die lösliche Epoxidhydrolase (engl: soluble epoxidhydrolase, sEH) besitzt nachweislich anti-inflammatorische und antisteatotische Effekte in der Leber. Aus diesem Grund wurde eine Leitstruktur entwickelt, die eine duale Modulation aus FXR-Aktivierung und sEH-Inhibition erzeugt. Dafür wurden die Pharmakophore eines im Arbeitskreis entwickelten FXR-Partialagonisten sowie eines potenten sEH-Inhibitors miteinander verknüpft. Zur Weiterentwicklung einer ausgewogenen hohen Potenz beider Modulationsfaktoren wurden mehrere unterschiedliche SAR-Untersuchungen als translationales Projekt in mehreren Arbeiten durchgeführt. In der hier vorliegenden Arbeit konnten dieses SAR-Untersuchungen zusammengeführt und weiterentwickelt werden. Dabei wurde ein ausgewogener und hochpotenter dualer Modulator erhalten, der umfassend in vitro und in vivo charakterisiert wurde. Die gezielte duale Aktivität, die mit dieser Substanz erreicht wurde, führt in einem Krankheitsbild zu synergistischer Ergänzung zweier Therapieoptionen. Jedoch kann eine unerwünschte Promiskuität über verwandten nukleären Faktoren zu Nebenwirkungen führen. Die Ursache dafür kann eine saure Funktion darstellen. Ein sehr potenter nicht-azider FXR-Agonist mit einem subnanomolaren EC50-Wert konnte im Arbeitskreis entwickelt werden. Diese Verbindung ist FXR-selektiv, hat keinen toxischen Effekt auf HepG2-Zellen und eine moderate metabolische Halbwertszeit. Die qRT-PCR-Untersuchung direkter und indirekter FXR-Zielgene zeigte eine verstärkte Expression nach der Inkubation mit der nicht-aziden Substanz. Dadurch lässt sich das Prinzip der Nebenwirkungsminderung durch nicht-azide Verbindungen beweisen.
Insgesamt konnte in dieser Arbeit gezeigt werden, wie vielfältig und vielversprechend eine FXR-Modulation aufgebaut sein kann. Zum einen konnte über eine ausgeprägte biochemische Evaluation eine Differenzierung zwischen FXR-Antagonismus und Zelltoxizität bewiesen werden, worauf sich aufbauend eine genaue in vitro-Charakterisierung von neuen N-phenylbenzamidbasierten FXR-Antagonisten durchführen ließ, die ausgehend von einer moderat potenten Leitstruktur zu einer sehr potenten optimierten Substanz entwickelt wurden. FXR-Antagonismus und die dazu passenden tool compounds sind nicht nur von Bedeutung zum besseren Verständnis der unterschiedlichen Bindungsmodi des FXR, sondern auch potentielle Therapieansätze zur Behandlung von Krankheiten, in denen eine FXR-Überexpression stattfindet. Die agonistische Modulation von FXR wurde genauer betrachtet in der in vitro-Untersuchung nicht-azider FXR-Agonisten, die durch das Fehlen einer sauren Funktion ein hohes Maß an Selektivität und dabei eine geringe Toxizität aufwiesen. Synergistische Effekte zur Behandlung eines multifaktoriellen Krankheitsbildes durch die Kombination von FXR-Partialagonismus und sEH-Inhibition konnte durch die Entwicklung der potenten und balancierten Substanz sowohl in vitro als auch in vivo bewiesen werden, wodurch diese Verbindung ein vielversprechender Kandidat für weitere klinische Entwicklung ist.
Die humane 5-LO ist das Schlüsselenzym in der LT-Biosynthese. LTs sind wichtige Entzündungsmediatoren und sind in einer Vielzahl von Krankheiten involviert, u. a. Asthma, Atherosklerose, rheumatische Arthritis, Sepsis, allergischen Reaktionen und in vielen Krebsarten. Die Struktur der 5-LO besteht aus 673 Aminosäuren und besitzt ein Molekulargewicht von 78 kDa. Sie ist in zwei Domänen unterteilt: die kleinere C2-ähnliche regulatorische Domäne (C2ld) und der größeren katalytischen Domäne. Die 5-LO besitzt NIS und NES, die für die zelluläre Lokalisation der 5-LO verantwortlich sind. Außerdem wird die Lokalisation noch von Phosphorylierungsstellen reguliert, die auf der katalytischen Domäne identifiziert werden konnten. 2011 konnten Häfner et al. zeigen, dass die 5-LO in der Lage ist Homodimere zu bilden.
Wie für die meisten anderen humanen Gene konnten auch bei der 5-LO alternative Spleißvarianten identifiziert werden. Schon 1992 konnten die ersten unterschiedlich gesüleißten Transkripte in Hirntumoren und differenzierten HL-60-Zellen gefunden werden. Später konnten weitere Isoformen in verschiedenen Zelllinien entdeckt werden.
In der vorliegenden Arbeit wurden die alternativen Spleißvarianten 5-LO∆13, 5-LO∆4 und 5-LOp12 untersucht und charakterisiert. Auf mRNA-Ebene wurde die Expression des 5-LO-WT und deren Isoformen sowohl in B- und T-Zelllinien als auch primären B- und T-Zellen, monozytären Zelllinien und primäre Monozyten aus Patientenproben (RA und Sepsis) untersucht. Es wurde festgestellt, dass das Expressionsprofil der 5-LO-Varianten zellspezifisch ist. Im Vergleich zu den T-Zellen konnte in B-Zelllinien ein höheres Expressionslevel detektiert werden. Des Weiteren zeigte sich interessanterweise ein stark erhöhtes Expressionslevel in primären Monozyten von RA- und Sepsis-Patienten.
Untersuchungen der 5-LO-Aktivität ergaben unterschiedliche Ergebnisse, abhängig von der Transfektionsmethode. Als transiente Transfektion diente die Calciumphosphat-Methode. Für die stabile Integration der HEK293T-Zellen wurde die Sleeping Beauty-Methode gewählt. Hierfür wurden Proteine mit einem GFP bzw. mCherry-Tag (GFP-5-LO-WT, mCherry∆13, mCherry∆4, mCherryp12) verwendet, um diese mittels Konfokalmikroskop visualisieren zu können. Nach transienter Transfektion konnte eine Inhibition der 5-LO-Aktivität nach Kotransfektion mit jeweils einer Isoform gemessen werden. Nach stabiler Integration jedoch zeigte sich eine Steigerung der 5-LO-Produktbildung. Mit Hilfe von Western Blots wurden Expressionskontrollen angefertigt und die Menge des 5-LO-WT quantifiziert. In transient transfizierten Zellen wurde eine Erniedrigung der Expression des 5-LO-WT bestimmt, wohingegen in stabil integrierten Zellen ein Anstieg des 5-LO-WT als auch der Isoformen beobachtet werden konnte. Einerseits könnte dies einem Artefakt der Transfektionmethode zugrunde liegen, andererseits könnte es ein Hinweis darauf sein, dass sich die Proteine gegenseitig in ihrer Expression beeinflussen.
Ebenso wurde die Lokalisation der 5-LO und deren Isoformen untersucht. Es konnte gezeigt werden, dass die 5-LO überwiegend im Zellkern lokalisiert ist, während alle alternativen Protein-Isoformen im Zytosol zu finden waren. Durch Ionophor-Behandlung wurde eine Translokation des 5-LO-WT an die Kernmembran detektiert, die Isoformen verblieben im Zytosol. Überraschenderweise konnte beobachtet werden, dass die Spleißvariante 5-LO∆13 mit höherer Ionophor-Konzentration ebenso in der Lage ist an die Kernmembran zu translozieren. Um eine mögliche Interaktion der 5-LO mit den Isoformen zu untersuchen, sollten alle Proteine im selben Zellkompartiment lokalisiert sein. Dafür wurden verschiedene Stimuli und Mutationen getestet. Mit der Mutante GFP-5-LO-S271A und dem Stressstimulus Sorbitol und den CaMKII/p38-Inhibotoren KN-93/SB203580 konnte eine Translokation in das Zytosol erreicht werden. Die Ergebnisse der anschließenden Aktivitätsassays zeigten, dass die Isoformen keinen Einfluss auf die Aktivität der 5-LO ausüben.
Des Weiteren wurden die Phosphorylierungen an S523 und S271 von 5-LO-WT, 5-LO∆13, 5-LO∆4 und 5-LOp12 untersucht. Es wurde herausgefunden, dass die 5-LO-Proteine unterschiedliche Phosphorylierungsmuster aufweisen. Während 5-LO-WT und 5-LO∆4 eine schwache Phosphorylierung an S271 aufzeigen, konnte eine starke Phosphorylierung der 5-LO∆13 und 5-LOp12 detektiert werden. Im Vergleich dazu zeigte lediglich die Isoform 5-LOp12 eine sehr starke Bande an der Phosphorylierungsstelle S523. Bei beiden Phosphorylierungen konnten deutlich stärkere Signale nach Kotransfektion gemessen werden. Durch Klonierung eines P2A-Linkers zwischen 5-LO und des GFP-Tags, konnten die Isoformen vom 5-LO-WT in Western Blots voneinander getrennt werden. Dies zeigte, dass es zu einer Hochregulation der Expression der alternativen 5-LO-Varianten nach Kotransfektion mit dem WT führte, aber auch, dass die stärkere Phosphorylierung nach Kotransfektion unabhängig von der Proteinmenge ist.
The importance of RNA in molecular and cell biology has long been underestimated. Besides transmitting genetic information, studies of recent years have revealed crucial tasks of RNA especially in gene regulation. Riboswitches are natural RNA-based genetic switches and known only for ten years. They directly sense small-molecule metabolites and regulate in response the expression of the corresponding metabolic genes. Within recent years, artificial riboswitches have been developed that operate according to user-defined demands. Hence, they represent powerful tools for synthetic biology.
This study focused on the development of engineered catalytic riboswitches for conditional gene expression in eukaryotes. A self-cleaving hammerhead ribozyme was linked to a tetracycline binding aptamer in order to regulate ribozyme cleavage allosterically with tetracycline. By integrating such a hybrid molecule into a gene of interest, mRNA cleavage and thereby gene expression is controllable in a ligand dependent manner. The linking domain between ribozyme and aptamer was randomised. Tetracycline inducible ribozymes were isolated after eleven cycles of in vitro selection (SELEX). 80% of the analysed ribozymes show cleavage that strongly depends on tetracycline. In the presence of 1 μM tetracycline, their cleavage rates are comparable to that of the parental hammerhead ribozyme. In the absence of tetracycline, cleavage rates are inhibited up to 333-fold. The allosteric ribozymes bind tetracycline with similar affinity and specificity as the parental aptamer. Ribozyme cleavage is fully induced within minutes after addition of tetracycline. Interestingly, the isolated linker domains exhibit structural consensus motives rather than consensus sequences.
When transferred to yeast, three switches reduced reporter gene expression by 30 - 60% in the presence of tetracycline; none of them controlled gene expression in mammalian cells. In vitro selected molecules do not necessarily retain their characteristics when applied in a cellular context. Therefore, high throughput screening and selection systems have been developed in mammalian cells. The screening system is based on two fluorescent reporter proteins (GFP and mCherry). 1152 individual constructs of the selected ribozyme pool were tested, but none of them reduced reporter gene expression significantly in the presence of tetracycline. The selection system employs a fusion peptide encoding two selection markers (Hygromycin B phosphotransferase and HSV thymidine kinase) facilitating both negative and positive selection. 6.5 x 104 individual constructs of the selected ribozyme pool are currently under investigation.
5-Lipoxygenase (5-LO) catalyzes the two initial steps in the biosynthesis of leukotrienes, a group of inflammatory lipid mediators derived from arachidonic acid. Here, the regulation of 5-LO mRNA expression by alternative splicing and nonsense-mediated mRNA decay (NMD) was investigated. In the present study, the identification of two truncated transcripts and four novel 5-LO splice variants containing premature termination codons (PTC) was reported. The characterization of one of the splice variants, 5-LOΔ3, revealed that it is a target for NMD since knockdown of the NMD factors UPF1, UPF2 and UPF3b in the human monocytic cell line Mono Mac 6 (MM6) altered the expression of 5-LOΔ3 mRNA up to 2-fold in a cell differentiation-dependent manner suggesting that cell differentiation alters the composition or function of the NMD complex. In contrast, the mature 5-LO mRNA transcript was not affected by UPF knockdown. Thus, the data suggest that the coupling of alternative splicing and NMD is involved in the regulation of 5-LO gene expression.
RT-PCR analysis of different cell types revealed the existence of a large number of 5-LO splice variants. The most interesting splice variants were observed in BL41-E95A cells, which give a raise to novel 5-LO protein isoforms. This leads to the hypothesis of a novel regulatory mechanism in which the dimerization of 5-LO with 5-LO isoforms might regulate the 5-LO activity.
The 5-LO protein expression was reduced on translational level in UPF1 knock down cells, suggesting that UPF1 has a positive influence on 5-LO translation. Therefore, a mass spectrometry based proteomics study was started to identify compartment specific protein expression changes upon UPF1 knockdown in differentiated and undifferentiated MM6 cells. The proteomics analysis demonstrated that the knockdown of UPF1 results in numerous protein changes in the microsomal fraction (~ 21%) but not in the soluble fraction (< 1%). Western blot data confirmed the trend of the proteomics analysis. This data suggest that UPF1 is a critical gene expression regulator in a compartment specific way. During differentiation by TGFβ and calcitriol the majority of UPF1 regulated proteins was adjusted to normal level. It appears that that not only the NMD mechanism alters its composition during differentiation. Also the gene expression regulation on translational level by UPF1 seems to be also cell differentiation dependent. An interesting group of UPF1 target genes represent the downregulated proteins. qRT-PCR analysis of randomly chosen genes revealed no effect on mRNA expression upon UPF1 knockdown, suggesting that UPF1 positively influences the translation of these genes. Computational sequence analysis identified a conserved C-rich sequence which might be a hnRNP E2-binding site. hnRNP E2 has been characterized as a translational repressor in myeloid cells. Western blot analysis revealed a differentiation independent up regulation of hnRNP E2 by UPF1 knockdown. Additionally, microRNA-328 (miR-328) has been described as an RNA decoy modulating hnRNP E2 regulation. Due to this, stem loop qRT-PCR showed an up regulation of miR-328 in TGFβ and calcitriol differentiated MM6 cells. Based on this data we suggest a model in which downregulation of UPF1 increases hnRNP E2 expression, leading to translation inhibition. During differentiation, miRNA-328 is upregulated thereby competing with hnRNP E2 leading to an efficient translation
5-lipoxygenase (5-LO) catalyzes the first two steps in leukotriene (LT) biosynthesis. In a two step reaction the enzyme oxygenates arachidonic acid (AA) to form the highly unstable epoxide leukotriene A4 (LTA4) in dehydrating a hydroperoxide intermediate (20). LTA4 can then be further metabolized by two terminal synthases yielding either the potent chemoattractant leukotriene B4 (LTB4) or the cysteinyl leukotrienes (CysLTs). 5-LO enzyme expression is primarily found in mature leukocytes (22) where it can either reside in the cytoplasm or in the nucleus associated with euchromatin (29). Its enzymatic activity is embedded in a complicated network in intact cells regulating LT synthesis by various factors dependent on the cell type and nature of stimulus. Factors such as the amount of free AA released by phospholipase A2 enzymes, levels of enzymes involved, catalytic activity per enzyme molecule and availability of different small molecules influence 5-LO activity (36).
The 5-LO derived LTs are lipid mediators which were shown to primarily mediate inflammatory and allergic reactions and their role in the pathogenesis of asthma is well defined. CysLTs are among the most potent bronchoconstrictors yet studied in man and play an important role in airway remodeling. LTB4 has no bronchoconstrictory effects in healthy and asthmatic humans but displays potent chemoattractant properties on neutrophils and increases leukocyte adhesion to the vessel wall endothelium (22). Therefore, LTB4 enhances the capacity of macrophages and neutrophils to ingest and kill microbes. In concert with LTB4, histamine and prostaglandin E2 (PGE2) CysLTs are thought to maintain the tone of the human airways (82).
Besides their well studied role in asthma, 5-LO derived LTs have also been implicated to play a role in cardiovascular diseases and cancer. In contrast to healthy tissues, LT pathway enzymes and receptors were found to be abundantly expressed in cancer tissues, atherosclerotic lesions in the aorta, heart and carotid artery (86). Pharmacological inhibition of 5-LO potently suppressed tumour cell growth by inducing cell cycle arrest and triggering cell death via the intrinsic apoptotic pathway (92, 93). In several studies LTs were found to exhibit cardiovascular actions by promotion of plasma leakage in postcapillary venules, coronary artery vasoconstriction and impaired ventricular contraction leading to reduced coronary blood flow and cardiac output (24). Unfortunately, the precise molecular mechanisms through which LTs influence carcinogenesis and cardiovascular diseases are still incompletely understood.
In contrast, an increasing number of studies questions the correlation between 5-LO and cancer (95-97) since extreme LT concentrations were applied to induce proliferative effects in the majority of the publications. A few studies exist which show susceptibility towards 5-LO products in physiological concentrations or achieve anti-proliferation by applying low concentrations of 5-LO inhibitors (98) ...
The enzyme 5-lipoxygenase (5-LO) occupies a central role in the biosynthesis of inflammatory leukotrienes and thus takes part in the pathogenesis of related diseases. Its occurrence is mainly restricted to cells of the immune system including granulocytes, monocytes/macrophages or B-lymphocytes and can be induced by cell differentiation of myeloid cells after treatment with differentiating agents, such as DMSO, retinoic acid or the combination of TGFβ/1,25(OH)2D3. The latter contribute to the highest level of induction of mRNA and protein expression. Its cell specific occurrence is at least partly due to DNA methylation in cells that do not exhibit 5-LO activity and genetic regulation is further dependent on histone acetylation. 5-LO expression is controlled by transcription factors binding to the promoter sequence of the ALOX5 gene that induce basal promoter activity, as well as promoter independent effects including transcript initiation and elongation, which are mostly attributed to TGFβ/1,25(OH)2D3 signaling. The ALOX5 gene resembles a typical housekeeping gene, hence lacks TATA- or CAAT-boxes for transcriptional regulation, but displays a high GC-content with eight GC-boxes, five of which are arranged in tandem, that provide binding sites for transcription factors Sp1, Sp3 and Egr-1.
The proximal ALOX5 promoter is furthermore a target for additional factors, such as TGFβ effector proteins SMADs or the vitamin D receptor and possesses additional consensus sequences for transcriptional regulators, including NF-κB or PU.1. However, as yet no actual binding of these proteins to the promoter sequence was demonstrated and an unbiased screening for identifying further ALOX5 promoter interacting proteins, which might have impact on 5-LO expression, is still lacking. For this purpose, the present study focused on the identification of significantly interacting proteins, employing DNA-affinity enrichment coupled to label-free quantitative proteomics, spanning a sequence of about 270 base pairs of the proximal ALOX5 promoter. For the elucidation of potential cell specific differences in protein patterns and compositions, DNA pulldowns were performed by using oligonucleotide stretches comprising the core promoter sequence including the 5-fold GC-box, which were incubated with different cell lines and differentiation states of myeloid, as well as B-lymphocytic lineages. In order to compare different mass spectrometric quantification strategies that would allow for identification of interactors, dimethyl labeling and label-free techniques were used. Since the label-free approach outperformed the label-based one in initial experiments, it was established as standard quantification strategy in all DNA pulldowns performed. The pulldowns of myeloid cell lines in both undifferentiated and differentiated state and B-lymphocytes resulted in a cell-unspecific protein pattern whose composition was similar, regardless of cell lineage. Additionally, further DNA sequences comprising either a vitamin D response element or a SMAD binding element were investigated in the promyelocytic model cell line HL-60 in both undifferentiated and differentiated state. The identified proteins confirmed known interaction partners and furthermore revealed novel potential regulators of the 5-LO promoter. Out of these, the most prominently identified and promising proteins included transcription factors of the KLF- and CCAAT/enhancer binding protein-family. In this context, KLF5 and KLF13 are both involved in the regulation of inflammatory processes, the former additionally being an effector protein of TGFβ-signaling, whose functional characterization is of utmost interest in terms of regulation of 5-LO expression. Further protein characterization will be inevitable for the CCAAT/enhancer binding proteins C/EBPα, C/EBPβ and C/EBPε. These transcription factors are involved in the regulation of inflammatory processes and heterodimers thereof (C/EBPα/β) are known to control TGFβ/1,25(OH)2D3-mediated effects of the CD14 gene.
Several of the identified proteins of the pulldowns containing the tandem GC-box represented interactors of G-quadruplex DNA, including the helicases BLM and DHX36, the ribonucleoproteins hnRNP D and hnRNP K and transcription factor MAZ. Since G-quadruplexes form in G-rich DNA sequences as secondary DNA structures and exhibit substantial regulatory effects on the transcription of their target genes, the potential formation thereof in the ALOX5 core promoter sequence was investigated in a second project. Out of the proteins mentioned above, MAZ is shown to exert resolving effects on G4-DNA and synergistically induce Sp1-dependent gene activation of oncogene h-RAS, which displays analogous promoter characteristics to the ALOX5 gene. A DNA stretch comprising the tandem GC-box was used for elucidating the potential of secondary DNA structure formation. Intriguingly, both immune-based and spectroscopic methods provided clear evidence for the in vitro G-quadruplex formation of the proximal promoter sequence for the first time. In order to provide additional information on a possible regulatory effect of existing G-quadruplex structures on 5-LO transcription, differentiated HL-60 cells were subsequently treated with two distinct G4-DNA stabilizing agents. A porphyrin analogon (TMPyP4) did not exhibit any effects on 5-LO mRNA and protein expression after cell treatment. A second G4-DNA stabilizing agent (pyridostatin) on the other hand revealed significant reduction on 5-LO protein expression after cellular treatment. These mixed results render further experiments inevitable, in order to provide a clear assertion as to whether 5-LO expression is regulated by G-quadruplex structures or not.
Altogether, this study enlarges the knowledge of ALOX5 proximal promoter interacting proteins by corroborating the binding of already known transcription factors and identifying novel interactors. It yields essential groundwork for subsequent functional studies of proteins involved in 5-LO transcription and introduces G-quadruplexes as a new potential mechanism in ALOX5 gene regulation.
Die 5-Lipoxygenase (5-LOX) stellt den Startpunkt des Leukotrienstoffwechsels dar, da sie Arachidonsäure (AA) über die 5(S)-Hydroperoxy-6-trans-8,11,14-cis-eicosatetraensäure (5-HpETE) in Leukotrien A4 (LTA4) umwandelt. 5-HpETE kann zum korrespondierenden Alkohol 5(S)-Hydroxy-6-trans-8,11,14-cis-eicosatetraensäure (5-HETE) reduziert werden. LTA4 dient als Zwischenprodukt für die Synthese von LTB4 und den Cysteinyl-gebundenden LTs LTC4, LTD4 und LTE4. LTs nehmen eine wichtige Funktion in der Immunabwehr ein, sind jedoch auch an einer Vielzahl von Krankheitsgeschehen wie z. B. Asthma bronchiale, Atherosklerose und einiger Tumorarten beteiligt. Die 5-LOX teilt sich in zwei Domänen auf: der reglatorischen, N-terminalen Domäne und der katalytischen, C-terminalen Domäne. Ihre Aktivität unterliegt einer komplexen allosterischen Regulation und kinetischen Besonderheiten wie einer Substratinhibition. In vielen Fällen ist die regulatorische PLAT-(Polycystin-1, Lipoxygenase, alpha-Toxin)-Domäne involviert. Sie ist essentiell an der Bindung von Calcium, Membranen und weiterer Faktoren wie dem Coactosin-like protein (CLP) und Dicer beteiligt. Auch eine zweite Bindungsstelle für das Substrat oder einen seiner Metaboliten wird dort vermutet. Letztlich bleibt jedoch die Regulation der 5-LOX-Aktivität durch die PLAT-Domäne unzureichend geklärt. Diese Tatsache und die fortwährende Suche nach neuen Ansatzpunkten für die 5-LOX-Inhibition bilden den Hintergrund, vor dem diese Arbeit angefertigt wurde.
Das Ziel lag in der Entwicklung einer stabilen, isolierten PLAT-Domäne und deren Charakterisierung. Es stellte sich jedoch heraus, dass sich die isolierte Domäne durch eine hohe thermische Instabilität und starke Aggregationsneigung auszeichnet. Mittels Mutationsstudien auf Basis der 5-LOX AS 1-115, verbunden mit Gelfiltrationsläufen zur Analyse der Proteinaggregation, wurde schließlich ein Konstrukt entwickelt, das in Konzentrationen < 0,5 mg/ml als Monomer vorlag: die sogenannte PLAT1-115 W75G. Ein Austausch des W75 in Glycin erhöhte ebenfalls die thermische Stabilität, so dass Versuche bei 20°C durchgeführt werden konnten. Zunächst wurden jedoch die grundlegenden Eigenschaften der Mutante untersucht. Dies umfasste die Beantwortung der Frage, ob auch die PLAT1-115 W75G Calcium bindet, sowie die Aufnahme eines Circulardichroismus-(CD)-Spektrums. Der erste Aspekt konnte mit mehreren Methoden bestätigt werden. Eine Calciumzugabe zum Laufpuffer 20 mM MOPS, 50 mM KCl pH 7,4 erhöhte konzentrationsabhängig das Elutionsvolumen der PLAT1-115 W75G auf der analytischen Gelfiltrationssäule – vermutlich durch den bekannten Einfluss von Calcium auf die Hydrophobizität der PLAT-Domäne. Zusätzlich wurde die Interaktion durch differential scanning fluorimetry (DSF) und Oberflächen-Plasmonen-Resonanz-Spektroskopie (SPR) nachgewiesen. Allerdings gelang aus verschiedenen Gründen keine Quantifizierung der Bindungsaffinität. Das CD-Spektrum bestätigte die Struktur der PLAT-Domäne als sogenanntes all-beta_protein und ermöglichte die Einordnung der PLAT1-115 W75G in die Gruppe der betaII-Proteine.
Ein weiterer Fokus dieser Arbeit lag auf der vermuteten allosterischen Fettsäurebindungsstelle in der PLAT-Domäne. Es wurde versucht, die Interaktion mittels SPR nachzuweisen. Zur Vorbereitung wurde im 5-LOX-Aktivitätstest und im DSF an der isolierten Domäne ein Detergens bestimmt, das einen möglichst geringen Einfluss auf das Protein ausübt. Dabei zeigte Octyl-beta-D-glucopyranosid (beta-OG) das vorteilhafteste Profil. Auf dieser Basis wurde die kritische Mizellbildungs-Konzentration (CMC) der AA und einiger HETEs in beta-OG-haltigen Puffern bestimmt. Die SPR-Studien ergaben jedoch keine reproduzierbaren Ergebnisse. In einem weiteren Schritt wurden die Substrathemmung des Gesamtproteins 5-LOX und der Einfluss von Calcium charakterisiert. Sowohl in Gegenwart von ~ 1 mM freiem Calcium als auch von 1 mM EDTA lag mit 20 µM AA die höchste Produktbildung nach 10-minütiger Reaktion vor. Das Detergens Tween20 (T20) hob in einer Konzentration unter seiner CMC (0,001 % m/V) in Anwesenheit von Calcium die Inhibition auf. Ohne Calcium zeigte sich auch in Gegenwart von T20 die bekannte Substratinhibition der 5-LOX einschließlich ihrer Maximalaktivität bei 20 µM AA. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass Calcium eine Bindung der 5-LOX an eventuell vorhandene, negativ geladene Vesikel aus AA und Detergens vermitteln und dadurch die Substratinhibition aufheben kann. In Fällen, in denen die Substratinhibition vor dem Erreichen der AA-CMC auftritt, hat Calcium folglich keinen Einfluss.
Zuletzt wurde die Interaktion der PLAT1–115 W75G mit CLP und einem C-terminalen Fragment von Dicer untersucht. Im Crosslinking ließ sich nicht auf eine Interaktion der isolierten PLAT-Domäne mit CLP schließen. Dagegen ergaben Diamid-Crosslinking-Studien, dass die isolierte PLAT-Domäne in der Lage ist, das Dicer-Fragment zu binden. Dieses Ergebnis wurde im SPR bestätigt.
Sphingolipide sind an zahlreichen physiologischen und pathophysiologischen Prozessen im Körper beteiligt. Vor Allem das sowohl auto- als auch paracrinwirkende Sphingosin-1-Phosphat (S1P) spielt dabei eine essentielle Rolle. Ein Großteil der S1P-vermittelten / regulatorischen Effekte beruht auf dessen Wechselwirkung mit den fünf G Protein-gekoppelten S1P-Rezeptoren (S1P1-5). S1P nimmt hierüber Einfluss auf das Schicksal der Zellen (Proliferation, Überleben, Migration), die Zellmobilität, die Angiogenese und das Immunsystem. Viele der über die S1P-Rezeptor-vermittelten Effekte sowie deren Rolle und Funktion in einzelnen Geweben oder Organen sind bis heute noch nicht komplett verstanden bzw. erklärbar. Pharmakologische Tools können einen wichtigen Beitrag zur weiteren Erforschung und zum Verständnis des komplexen Sphingolipidnetzwerks leisten. Ausgehend von einer substituierten Diaryl-1,2,4-oxadiazol-Leitstruktur, die in der Literatur als privilegierte Struktur für S1P1-Rezeptoragonisten gilt, und dem selektiven S1P1-Agonisten SEW2871 wurden verschiedene Liganden mit unterschiedlichen chemischen Gruppen synthetisiert. Nach der Etablierung eines Synthesewegs zu etherverknüpften Aminoethan-diphenyl-1,2,4-oxadiazolen wurden diese in die fluoreszierenden Dansyl-, Isoindolin-, Pyridinium-Dye- und Coumarin-gelabelten Derivate überführt. Außerdem wurde eine einfache und optimierte Syntheseroute zu dem kleinen, umgebungsempfindlichen Fluorophor 4-(Dimethyl-amino)phthalimid (4-DMAP) entwickelt, dass entlang eines linearen Synthesewegs in guten Aus-beuten auch mit den Trifluormethyl- und Methyl-substituierten Diphenyloxadiazol-Grundstrukturen zu fluoreszenzmarkierten Derivaten umgesetzt wurde. Neben den fluoreszenzmarkierten Liganden für den S1P1-Rezeptor wurden zudem drei substituierte Phenyloxadiazolaniline zu den entspre-chenden Acrylamiden umgesetzt, die als kovalente Labeling Tools eingesetzt werden können. Durch die Synthese von Trifluormethyl- und Cyano-substituierten 4-DMAP-markierten Diaryloxa-diazolen sowie von Arylpropansäurederivaten wurde die gewählte Leitstruktur auf Grundlage einer ersten Affinitätstestungen verfeinert. Dabei wurde die zuvor entwickelte Synthese-strategie optimiert. Der Aufbau der Arylpropansäuren erfolgte durch eine Heck-Reaktion mit Acroleindiethylacetal. Durch den Wechsel der Synthesestrategie von 1. Heck-Reaktion und 2. Oxadiazolringschluss zur umgekehrten Vorgehensweise konnte eine Reihe von synthetischen Problemen umgangen werden und die Gesamtausbeute gesteigert werden.
Zwei der fluoreszenzmarkierten S1P1-Liganden mit verfeinerter Grundstruktur zeigten eine durch die Bindung an den S1P1-Rezeptor verursachte Internalisierung des Rezeptors, die durch die GFP-Markierung unter dem Fluoreszenzmikroskop sichtbar gemacht wurde. Diese Internalisierung lieferte weitere Hinweise, dass die beiden Substanzen eine durch Bindung am S1P1-Rezeptor verursachte, agonistische Wirkung haben. Die weitere pharmakologische Charakterisierung aller synthetisierten, funktionellen Liganden im Bereich der Sphingolipide steht noch aus. Leukotriene (LT) sind wichtige Lipidmediatoren, die durch Oxygenierung von Arachidonsäure entstehen. Sie nehmen eine zentrale Rolle ein in der Entstehung und dem Voranschreiten von Entzündungen, allergischen Reaktionen, Asthma, kardiovaskulären Erkrankungen und auch bei Krebserkrankungen. Das Schlüsselenzym der LT-Biosynthese ist das Enzym 5-Lipoxygenase (5-LO). Zur Behandlung von LT-assoziierten Krankheiten sind bis heute nur zwei Wirkstoffe zugelassen, die in den LT-Stoffwechsel eingreifen: der Cys-LT-Rezeptorantagonist Montelukast (Singulair®) und der eisenchelatisierende 5-LO-Inhibitor Zileuton (Zyflo®, nur in den USA zugelassen). Es besteht daher ein großer Bedarf an neuen, selektiven Liganden. C06 ist einer der am besten charakterisierten Vertreter einer neue Klasse an potenten, direkten und selektiven 5-LO-Inhibitoren: den Aryliden-Aryl-Thiazolonen, die ein großes Potential für die Entwicklung neuer anti-Leukotrien Arzneistoffe aufweisen. In-vivo-Experimente haben jedoch gezeigt, dass C06 und seine Derivaten nicht optimale pharmakologische Profile besitzen und zudem nur in geringem Maße im Wässrigen löslich sind. Durch die Optimierung und Etablierung einer mikrowellenassistierte Drei-Komponenten-one-pot-Synthese sowie einer verwandten zweistufigen Synthese zum Aufbau der Aryliden-Aryl-Thiazolone, konnte die Reaktionszeit verringert werden und daher die Isolierung und Aufreinigung vereinfacht werden. Zur Steigerung der Löslichkeit der Aryliden-Aryl-Thiazolone in wässrigen Systemen und zur weiteren Erforschung der SAR wurde einige Derivate mit polaren Substituenten, unterschiedlichen Wasserstoffbrückenbindungs-Eigenschaften, Morpholinderivate und verschiedene heteroaromatische Aryliden-Aryl-Thiazolone hergestellt, wobei die Heteroarylderivate aufgrund ihrer niedrigeren, berechneten Lipophilie (clogP) und höheren berechneter Löslichkeit (clogS) ausgewählt wurden. Für alle synthetisierten Derivate wurde die Inhibition der 5-LO-Produktbildung unter zellfreien (S100) und unter zellulären Bedingungen (PMNL) bestimmt. Zudem wurden für einige Derivate die experimentellen Löslichkeiten in DMSO und in Puffer grob ermittelt. Die Ergebnisse zeigen, dass alle besser löslichen Derivate einen höheren IC50-Wert im zellbasierten Assay aufweisen bzw. die potentesten Substanzen nicht gut im Wässrigen löslich sind. Zur Charakterisierung der unbekannten, allosterischen Bindestelle der Aryliden-Aryl-Thiazolone wurde eine Reihe von zum kovalenten bzw. zum Photoaffinity-Labeling fähigen Aryliden-Aryl-Thiazolonderivaten synthetisiert. Alle Derivate wiesen gute bis sehr gute 5-LO Affinitäten auf und durch Vorversuche konnte die prinzipielle Eignung zum Photoaffinity-Labeling gezeigt werden. Da sowohl die polaren als auch die heteroarylbasierten Aryliden-Aryl-Thiazolone die bekannte kontinuierliche SAR wiederspiegelten und keine hohe Wasserlöslichkeit bei gleichzeitiger hoher 5-LO-Inhibition erreicht werden konnte, wurden die einzelnen Element des Aryliden-Aryl-Thiazolon-grundgerüstes durch individuelle Synthesen variiert. Diese Kernvariations- und die an der Aryliden-einheit variierten Derivate haben die SAR der Aryliden-Aryl-Thiazolone deutlich erweitert und konnten die für die 5-LO-Aktivität wichtigen Elemente identifizieren. Dadurch ist es gelungen, die 2-Aryl-5-aryl(methyl)thiazol-4-ole als 5-LO-Leitstruktur zu erschließen, die sowohl unter zellfreien Bedingungen (S100) als auch im zellbasierten Assay (PMNL) Aktivitäten im nanomolaren Bereich erreichen. Mit den 2-Aryl-5-arylmethylthiazol-4-olen konnte außerdem die Löslichkeit in DMSO und vor allem im Wässrigen, verglichen zu C06, deutlich erhöht werden. ST-1829 ist ein C06-Analogon, dass die Nachteile im pharmakologischen Profil von C06 eliminiert und zu einem neuen, effektiven Wirkstoff in der anti-Leukotrien Therapie weiter entwickelt werden kann.
Abdominale Aortenaneurysmen sind in Industrienationen eine häufige Erkrankung der Personengruppe über 65 Jahre. Diese Dilatationen der abdominalen Aorta zeichnen sich durch eine lokale Inflammation aus, die mit der Infiltration von Immunzellen, dem Verlust von glatten vaskulären Muskelzellen und der Degeneration der extrazellulären Matrix einhergeht. Ursprünglich als Symptom einer Atherosklerose angesehen, sind die Ursachen dieser progressiv verlaufenden Erkrankung nach wie vor nicht vollständig verstanden; obwohl steigendes Alter, männliches Geschlecht, genetische Prädisposition, Rauchen und ein zuvor erlittener Myocardinfarkt als Risikofaktoren identifiziert werden konnten. Der lange Zeit asymptomatische Krankheitsverlauf, die Gefahr einer Ruptur mit häufig letalen Folgen und der Mangel einer effizienten pharmakologischen Therapie machen eine weitere Untersuchung dieser Erkrankung unabdingbar.
Diltiazem ist ein Inhibitor spannungssensitiver L Typ-Calciumkanäle, der seit über 25 Jahren zur Behandlung von arterieller Hypertonie, verschiedener Arrhythmien und Angina pectoris verwendet wird. Im Rahmen der vorliegenden Arbeit sollte untersucht werden, ob Diltiazem auch einen antianeurysmatischen Effekt besitzt. Eine vierwöchige subcutane Infusion des blutdrucksteigernden Hormons Angiotensin II führte nach vier Wochen zur Bildung abdominaler Aortenaneurysmen, sowie zu atherosklerotischen Gefäßveränderungen der thorakalen Aorta Apolipoprotein E (ApoE)-defizienter Mäuse. Eine parallele Therapie mit Diltiazem über das Trinkwasser konnte diese Entwicklung unabhängig vom arteriellen Blutdruck und damit unabhängig von der antihypertensiven Wirkung verhindern. Im Aortenbogen Diltiazem-behandelter Tiere konnte im Rahmen dieses in vivo-Modells nach sechs Tagen eine deutlich geringere lokale Expression proinflammatorischer Cytokine, wie Tumornekrosefaktor-a, Interleukin-1ß (IL1B) und Interleukin-6 (IL6), Chemokine, wie CCL2, und degenerativer Proteasen, wie der Matrix-Metalloprotease 9 (MMP9), festgestellt werden. Dies war die Folge einer reduzierten Anzahl von Macrophagen in der Gefäßwand. Zirkulierende proinflammatorische Cytokine, wie CCL12, konnten im Serum teilweise ebenfalls vermindert nachgewiesen werden.
Obwohl die antihypertensive Wirkung von Diltiazem in glatten vaskulären Muskelzellen vermittelt wird, war es nicht möglich, die Angiotensin II-induzierte Produktion von promigratorischem CCL2 und proinflammatorischem IL6 in isolierten Aortenringen ApoE-defizienter Mäuse oder in glatten vaskulären Muskelzellen der Ratte zu reduzieren. Diltiazem war zudem nicht in der Lage, die CCL2-induzierte Migration proinflammatorischer Ly6C+-Monocyten in vivo zu unterbinden. In isolierten peritonealen Macrophagen ApoE-defizienter Mäuse dagegen, konnte die IL6 induzierte Expression von IL1B- und CCL12-mRNA durch eine Inkubation mit Diltiazem verhindert werden. In der RAW264.7-Zelllinie, die morphologische und funktionelle Merkmale von Monocyten und Macrophagen aufweist, konnte die Dilitiazem-sensitive IL6-induzierte Expression von IL1B-mRNA in vitro ebenfalls nachgewiesen werden. Eine Stimulation mit IL6 war in diesen Zellen jedoch nicht ausreichend, um die Sekretion von IL1B-Protein auszulösen.
Thorakales Aortengewebe wies im Vergleich mit RAW264.7-Zellen eine veränderte Ausstattung spannungssensitiver Calciumkanäle auf. In letzteren fanden sich keine muskelzellspezifischen L-Typ-Calciumkanäle (CACNA1C), aber eine relevante Expression neuronaler P/Q-Typ-Calciumkanäle (CACNA1A). Mittels fluorimetrischer Bestimmung mit Fura-2AM konnte jedoch festgestellt werden, dass die intrazelluläre Calciumkonzentration Diltiazem-behandelter RAW264.7-Zellen unverändert war und der antiinflammatorische Effekt somit calciumunabhängig vermittelt wurde.
Diltiazem war nicht in der Lage, eine Lipopolysaccharid (LPS)-bedingte Inflammation in RAW264.7-Zellen zu unterbinden. Weder die LPS-induzierte Sekretion von IL1B Protein, noch die nucleäre Translokation des Transkriptionsfaktors NF-?B oder die Aktivierung des NF-?B-Promotors konnten durch eine Inkubation der Zellen mit Diltiazem verhindert werden. Diltiazem reduzierte jedoch, die IL6-induzierte Aktivierung des AP 1-Promotors unabhängig von der MAPK1-Phosphorylierung oder der Phosphorylierung und nucleären Translokation des Transkriptionsfaktors STAT3 zu unterbinden. Eine Unterdrückung von c-Jun N-terminale Kinase JNK- oder p38 Proteinkinase-vermittelten Signalwegen ist damit wahrscheinlich.
Das Pirinixinsäurederivat LP105 ist ein neuer Inhibitor der Arachidonat-5-Lipoxygenase (LOX5), der im Rahmen dieser Arbeit erstmals in vivo auf seine antianeurysmatischen Eigenschaften hin untersucht wurde. LOX5 katalysiert die Reaktion von Arachidonsäure zu Leukotrien A4 und kontrolliert damit einen wichtigen Schritt in der Synthese proinflammatorischer Leukotriene. LP105 war im Tiermodell nicht in der Lage die Angiotensin II-induzierte Bildung abdominaler Aortenaneurysmen in ApoE-defizienten Mäusen komplett zu unterbinden, führte aber über die Reduktion der vaskulären Inflammation zu einer deutlich verringerten Krankheitslast. LP105 selbst beeinflusste die mRNA-Expression verschiedener Enzyme des Arachidonsäuremetabolismus nicht, verstärkte jedoch durch die Blockade von LOX5 die Metabolisierung von Arachidonsäure über Arachidonat-15-Lipoxygenase und Cytochrom P450-Enzyme.
Lipid mediators have been referred as bioactive lipids, whose change in lipid levels resulted in functional or pathophysiological consequences. They are in the focus of biological research, nevertheless this is a late recognition due to the many difficulties of working with bioactive lipids due to their properties: hydrophobic, unstable and they occur in only in small quantities. Liquid chromatography and mass spectrometry have facilitated the work with them. Especially in this field, cardiovascular diseases and inflammatory mediated diseases and cancer are pathophysiological events where LMs are deregulated. Additionally, if the modulation of one LM pathway is not sufficient to overcome a disease, the combination of targeting two or more pathways could be effective. Needless to say, lipid signaling cascades are complicated pathways and possible shunting into other pathways when inhibiting or genetically deleting enzymes should be taken into consideration.
The first part of this work has focused on enzymes that metabolize eicosanoids, like mPGES-1 and 5-LO. mPGES-1 is an important enzyme metabolizing PGH2 and one of the key players of the AA cascade. Its product, PGE2 plays an important role in different inflammatory processes. Inhibition of the mPGES-1 might be a promising step to circumvent COX dependent side effects of NSAIDs. The class of quinazoline compounds around the lead structure FR20 has been investigated on isolated human and murine enzyme, in HeLa cells and in different human whole blood (HWB) settings to establish the possible effects of these compounds on eicosanoid profiling. Novel compounds with inhibitory activities in the submicromolar range (IC50: 0.13 µM - 0.37 µM on isolated enzyme) were obtained which were also effective in cells and HWB. Furthermore, pharmacological profiling of toxicity and lipid screening with LC/MS-MS revealed that compounds also reduce PGE2 levels in intact cells and whole blood; they do not impair cell viability but lack the ability to inhibit the murine mPGES-1 enzyme. This problem could be overcome by means of chemical synthesis varying the scaffold (quinoline, quinazoline) or introducing biosteric replacement in the phenyl moieties.
5-LO is a relevant enzyme that plays an important role in eicosanoid signaling in particular in leukotriene biosynthesis. Leukotrienes are involved in asthma, allergic rhinitis, glomerulonephritis, rheumatoid arthritis, sepsis, cancer and atherosclerosis. Moreover, genetic variants in the genes of the 5-LO pathway have been associated with the risk of development of acute myocardial infarction and stroke. Eicosanoids are increased in infectious exacerbations of chronic obstructive pulmonary disease (COPD). They are also elevated in the airways of stable COPD patients compared to healthy subjects. Therefore, 5-LO has attired the scientific community as a possible therapeutic target to treat the several disease conditions listed before. In this study an extensive evaluation of imidazo[1,2-a]pyridines as a suitable lead structure for novel 5-LO targeting compounds was presented Within the three publications, 5-LO inhibitory activity of synthesized compounds was investigated in intact PMNL, a cell-free assay, in human whole blood and rodent cells to both elucidate structure-activity relationships and compounds were in vitro pharmacological evaluated. Chemical modifications for lead optimization via straight forward synthesis were used to combine small polar groups (hydroxy, and methoxy groups) which led to a suitable candidate with desired in vitro pharmacokinetic profile in terms of solubility and intrinsic clearance without showing any cytotoxicity. More than 70 imidazo[1,2-a]pyridine derivatives have been synthesized, resulting in more than 50 active compounds. Although it was not possible to introduce a solubility group without impairing the 5-LO inhibitory activity, combination of small polar groups lead to a more favorable solubility and in vitro metabolic stability. Overall, the development of 5-LO inhibitors with high efficacy and selectivity in vivo will provide a possible treatment for patients having one of the diseases where leukotriene biosynthesis plays an important role.
Other types of 5-LO inhibitors have been synthesized during this work, NO-NSAIDs can be postulated as novel 5-LO inhibitors that could circumvent the undesired side-effects of inhibiting COX isoforms (ulcer perforation, gastrointestinal bleeding and in some cases death). It is suggested that NO group is released in situ or after compounds are metabolized. NO-NSAIDs maintain the same anti-inflammatory properties by inhibiting 5-LO in clinical relevant concentrations. NO-NSAIDs are currently under clinical trial for the treatment of diseases where inflammation plays an important role. Synthesis of NO-NSAIDs is straightforward and can be applied for most NSAIDs recently published. Among them, the most promising candidate is NO-sulindac that was able to inhibit 5-LO product formation in intact PMNL, purified 5-LO and HWB in micromolar concentration. Additional experiments regarding their mechanism are currently being performed.
The present study could show that dual inhibitors are an interesting approach that is practicable. It has been used in the recent years to overcome side-effects and diseases concerning more pathophysiological conditions. MetS is an example of a conjunction of symptoms: hyperglycemia, hypertriglyceridemia, hypertension and obesity. Due to its complex nature, the current treatment strategies of MetS require multiple pharmacological compounds regulating lipid and glucose homeostasis as well as blood pressure and coagulation. This study describes the first synthesis of dual sEH/PPAR modulators as potential agents for treatment of MetS. Following a combinatorial approach, an acidic head group known as a pharmacophore important for PPARα/γ dual agonistic activity was combined with different hydrophobic urea derivatives in order to introduce an epoxide mimetic (sEH pharmacophore). The resulting compounds yielded high inhibition of sEH and different patterns of PPAR agonistic activity. This study demonstrates that the pharmacophores of PPAR agonists and sEH inhibitors can be easily combined, resulting in a simplified blueprint of a dual sEH/PPAR modulator. Further in vivo pharmacological evaluation studies are needed in order to evaluate, which pattern of PPAR activation shows the most promising profile for treatment of metabolic syndrome.
Another example of dual pharmacology has been presented in this work. Natural products derived compounds were able to target sEH and exhibit promising antiproliferative properties. The principle of addressing multiple targets by natural products can be transferred to synthetic multi-target ligands. In conclusion, several (E)-styryl-1H-benzo[d]imidazoles were synthesized and evaluated on recombinant sEH after an initial hit (IPS) that lead to potent sEH inhibitors exhibiting antiproliferative activities. Following the natural product-inspired design, the desired biological activity from a bacterial secondary metabolite has been enhanced and transferred to a synthetic compound series. The resulting compounds were accessible via an easy synthetic route and offered a possibility to investigate the structure-activity relationships. The natural product inspired drug design extends the valuable role of natural products as drugs and drug precursors to templates for fully synthetic bioactive molecules. Simplification of natural products by means of chemical synthesis could lead to an interesting field in the treatment of cancer.
Affinity chromatography has been used to unravel unknown- and off-target effects which either contribute to the biological effect of the inhibitor or that counteract or lead to undesired side-effects. During this PhD work, two main projects related to this technique have been established. In the first one, related to an imidazo[1,2-a]pyridine inhibitor (EP6), it has been shown that epoxide-sepharose is a reliable material in order to couple compounds bearing an alcohol. Coupling of an analogue of EP6 to the sepharose has been accomplished and affinity towards 5-LO was demonstrated. The challenging step is to discern from unspecific protein binders and analysis via SDS-PAGE separation and mass spectrometry. Further experiments using other cell types or improving SDS-PAGE analysis (e.g. 2D gel analysis) should be useful to unravel EP6 off-target effect. During the second project related to off-target effects of celecoxib and DMC, the main problem was the coupling of the functional group to the sepharose. Affinity towards COX-2 could not be demonstrated pointing out the inefficient coupling method. Higher pH values during coupling reaction should be tested in further experiments. Nevertheless, affinity chromatography is a useful technique to unravel cellular mechanisms.
Sphingolipid metabolism is also a recent area that attired the attention of cancer researchers, due to their important roles in cell proliferation and apoptosis. Ceramide metabolism inhibitors were synthesized and evaluated on different assay systems in order to assess their efficacy on several cancer lines. Remarkably, 2,2-dimethyl-1,3-dioxolan-4-yl)methanamine (32) was a useful scaffold to mimic the sphingoid base. This key intermediate was used to produce ceramide analogues that could enter the cell and target apoptosis machinery. EB143 (38) increased ceramide levels in an in vitro ceramide synthase assay in a dose-response manner meaning that ceramide synthase was not inhibited but the ceramide de novo synthesis was activated. This effect was due to the fact that EB143 is a cytotoxic compound with an interesting antiproliferative profile. Further chemical modifications should be carried out to modulate this effect.
COX and LO inhibitors are cancer-preventive not only by inhibiting specific antiapoptotic AA metabolites but also by facilitating accumulation of AA which promotes neutral SMase activity and increases the proapoptotic ceramide. Several 5-LO inhibitors have been evaluated on several cancer lines and sphingolipid levels were measured in order to obtain a relationship. A549, Capan-2 and MCF-7 cells line were incubated with synthetic 5-LO inhibitors and zileuton. Compounds were cytotoxic to all cancer cell lines except from A549. Needless to say, zileuton did not exhibit a cytotoxic profile. Synthetic 5-LO inhibitors were able to modify ceramide levels but were useless when coincubating with sphingolipid metabolism inhibitors (myoricin, amitryptiline etc.) and inconsistent results were obtained. On the contrary, zileuton selectively increased Cer-C16 levels and in less extend Cer-C24:1. When using a SPT inhibitor (myoricin) alone was able to reduce C24:1 and Cer-C16:0 levels below the control, a similar effect occurred when incubation the cells with zileuton and myriocin. Interestingly, treatment of zileuton together with either amitryptiline or desipramine led to a decrease in Cer-C24:1 and levels Cer-C16:0 but the inhibition was not complete indicating that probably the de novo pathway has an important role. Further investigations on mRNA level should be carried out in order to discern which CerS is activated.
The main objective of the present thesis was the synthesis of lipid signaling modulators and their evaluation in vitro as therapeutic strategy to overcome pathophysiological conditions (cancer, metabolic syndrome, etc). It has been accomplished on many relevant targets like 5-LO, mPGES-1, sEH and PPAR and these lipid signaling modulators could be used in the treatment of diseases conditions where lipid mediators play an important role.
Polypharmakologie hat in den letzten Jahren mehr und mehr an Bedeutung in der pharmazeutischen Forschung gewonnen und könnte in Zukunft zu einem Umdenken in der Entwicklung neuer Wirkstoffe führen. Das wachsende Verständnis für biologische Zusammenhänge, im speziellen für die starke Vernetzung zwischen verschiedenen Signalwegen oder Gewebearten, und die daran beteiligten Proteine, könnten zu gänzlich neuen Strategien führen. Beispiele aus dem Bereich der Onkologie und der Entwicklung von Neuroleptika haben bereits gezeigt, dass eine Intervention an mehreren Stellen eines solchen komplexen Netzwerkes zu wirksameren und gleichzeitig sichereren Wirkstoffen führen kann. Erkenntnisse aus der Systembiologie und die retrospektive Analyse bereits zugelassener Wirkstoffe machen deutlich, dass viele erfolgreiche Wirkstoffe nur aufgrund ihres polypharmakologischen Wirkprofils so effektiv sind – wenngleich dies bei Ihrer Entwicklung oftmals nicht beabsichtigt war.
Das rationale Design sogenannter „multitarget Wirkstoffe“ stellt bis heute eine große Herausforderung dar. Aus Sicht eines medizinischen Chemikers bedeutet es die Verknüpfung zweier, auf unterschiedliche Targets aktiver, Liganden zu einem neuen Wirkstoff, ohne einen signifikanten Aktivitätsverlust auf die einzelnen Targets herbeizuführen. Ein naheliegender Ansatz zur Verbindung zweier Liganden ist die Verknüpfung der Moleküle über einen flexiblen Linker. Dieser Ansatz kann zwar in vitro zu sehr potenten Wirkstoffen führen, birgt jedoch pharmakokinetische Nachteile, bedingt durch das hohe Molekulargewicht, die sich oft erst in vivo zeigen. Die Schwierigkeit besteht also zum einen in der Aufrechterhaltung der individuellen Aktivität auf das jeweilige Target und zum anderen im Erreichen einer guten Balance zwischen Aktivität und Komplexität des Liganden. Damit soll ausreichend Raum für spätere Optimierung von pharmakokinetischen und pharmakodynamischen Eigenschaften gewährleistet werden. Bisher wurden nur wenige Computer-gestützte Ansätze entwickelt um diese und ähnliche Fragestellungen zu bearbeiten. Aus diesem Grund ist die Entwicklung neuer in silico Verfahren zur Identifzierung von multitarget Liganden ein Kernthema dieser Arbeit. Die Implementierung eines Fragment-basierten Ansatzes hält die Komplexität der Liganden möglichst gering und bietet genügend Raum für eine anschließende, multi-dimensionale Optimierung an zwei oder mehreren Targets.
In der ersten Studie wurde eine Pharmakophor-basierte Strategie verfolgt. Die Repräsentation eines Liganden durch ein Pharmakophormodell stellt eine abstrakte dreidimensionale Darstellung der für die biologische Aktivität relevanten Strukturmerkmale dar. Diese Abstraktion vereinfacht den Vergleich zweier Verbindungen und erlaubt gleichzeitig Spielraum für chemische Variabilität. Bei diesem Ansatz wurden Pharmakophormodelle, jeweils für eine Vielzahl aktiver Liganden zweier Targets, erzeugt und paarweise miteinander verglichen. Sobald zwei Pharmakophormodelle eine genügend große Anzahl an Pharmakophorpunkten in räumlich ähnlicher Orientierung teilen, stellt dieses gemeinsame Pharmakophor die Basis eines potentiellen multitarget Liganden dar. In der beschriebenen Studie wurde dieses Verfahren anhand von aktiven Liganden der löslichen Epoxid Hydrolase (sEH) und 5-Lipoxygenase (5-LO) evaluiert. Die auf dieser Grundlage identifizierten multitarget Pharmakophormodelle wurden zum anschließenden Screening einer Fragement-Datenbank verwendet und führten zu 9 aktiven Liganden für sEH und 5-LO. Diese Liganden besitzen chemische Grundgerüste (Scaffolds), die in der Literatur bisher noch nicht als aktive sEH- oder 5-LO-Liganden beschrieben wurden und somit eine ideale Grundlage für die Entwicklung neuer Wirkstoffe darstellen. Für eine der gefundenen Verbindungen, basierend auf einem Benzimidazol-Gerüst, wurden Aktivitäten im niedrig mikromolaren Bereich für beide Targets bestimmt. Diese Verbindung und weitere Derivate werden zu diesem Zeitpunkt weiter charakterisiert um eine erste Struktur-Aktivitäts-Beziehung aufzustellen und die Eignung dieser Substanzklasse als potentielle Leitstruktur für neue, duale sEH/5-LO Liganden zu überprüfen.
Parallel dazu wurde eine Substruktur-basierte Strategie verfolgt um Rückschlüsse auf jene Strukturmerkmale zu ziehen, die für die Aktivität auf dem jeweiligen Target verantwortlich sein könnten. Dazu wurden in einem ersten Schritt alle aktiven Liganden zweier Targets auf ihre möglichst maximalen gemeinsamen Substrukturen reduziert. Für jedes Target wird damit ein Set von Substrukturen generiert, welches die für die Bindung an das jeweilige Target charakteristische Strukturmerkmale enthält. Diese Substrukturen, repräsentieren den chemischen Raum des jeweiligen Targets und stellten die Trainingsdaten für den entwickelten multiSOM Ansatz dar. Dieser Ansatz basiert auf dem automatisierten Vergleich von selbst-organisierenden Karten und hebt Gemeinsamkeiten zwischen diesen Substruktursets in einer leicht zu interpretierenden, visuellen Form hervor. Dies erlaubt die Identifizierung von gemeinsamen Substrukturen aus beiden verwendeten Substruktursets, welche potentielle duale Strukturelemente darstellen.
Die Validierung dieses Ansatzes erfolgte erneut auf Basis bekannter 5-LO- und sEH-Liganden. Unter 24 ausgewählten Verbindungen konnten neun Fragmente identifiziert werden, die auf einem der beiden Targets und 5 Fragmente, die auf beiden Targets im niedrig mikromolaren Bereich inhibierend wirken. Einer dieser dualen Fragmente wurden anschließend als Basis für eine Substruktursuche in einer Inhouse Datenbank verwendet. Die daraus resultierende Verbindung, die einen Teil des ursprünglichen Fragments beinhaltet, wirkt sowohl auf sEH als auch 5-LO in nanomolaren Konzentrationen inhibierend. Auch diese Verbindung wird zu diesem Zeitpunkt weiter charakterisiert und stellt eine vielversprechende Basis als Leitstruktur neuer dualer sEH/5-LO-Liganden dar.
Zusammenfassend lässt sich sagen, dass die vorgestellten Methoden neue Möglichkeiten bieten, das rationale Design von multitarget Liganden zu unterstützen. Die Pharmakophor-basierte Methode kann besonders dann von Vorteil sein, wenn bereits Strukturinformationen für beide Targets bzw. die bioaktiven Konformationen der Liganden vorliegen. Für einen ausschließlichen Liganden-basierten Ansatz stellt die Verwendung der MultiSOM, und damit die Identifizierung gemeinsamer Strukturelemente der Liganden, die bessere Methode dar.
Im zweiten Teil dieser Arbeit werden Studien zur Identifizierung neuer Farnesoid-X-Rezeptor (FXR) Partialagonisten beschrieben. Auch in diesem Fall wurden zwei unterschiedliche Strategien verfolgt. Da FXR eine starke strukturelle Anpassung abhängig vom gebundenen Liganden aufweist („induced fit“), sind rein strukturbasierte virtuelle Screening-Methoden nur eingeschränkt einsetzbar. Aus diesem Grund sollte zunächst ein Liganden-basierter Drug Repurposing Ansatz verfolgt werden, bei dem bereits zugelassene Wirkstoffe mit potentiell FXR-modulierenden Eigenschaften identifiziert werden sollten. Der Vorteil des Drug Repurposing besteht darin, dass die betrachteten Wirkstoffe bereits intensiv hinsichtlich Sicherheit und Bioverfügbarkeit untersucht wurden. Somit kann man sich bei der Entwicklung verstärkt auf die biologische Aktivität auf das neue Target konzentrieren.
Erneut wurden selbstorganiserende Karten (SOMs) verwendet, um zugelassene Wirkstoffe mit FXR-Aktivität zu identifizieren. Trainiert wurde die SOM auf einem Datensatz bestehend aus bekannten FXR-Agonisten zum einen und der DrugBank Datenbank mit zugelassen Wirkstoffen zum anderen. Die Eigenschaft der SOM Verbindungen mit ähnlicher biologischer Aktivität in räumlicher Nähe auf der Karte zu clustern führte zu einer Anhäufung an bekannten FXR-Agonisten auf einigen wenigen Neuronen. Auf solchen sogenannten Aktivitätsinseln wurden zusätzlich auch zugelassene Wirkstoffe platziert, wenn ihre Ähnlichkeit zu den FXR-Agonisten ausreichend hoch war. Die auf den Aktivitätsinseln angesiedelten Wirkstoffe wurden anschließend bestellt und hinsichtlich ihrer FXR-Aktivität in einem Transaktivierungs-Assay untersucht. Unter den bestellten Verbindungen konnten sechs Liganden mit einer signifikanten relativen FXR-Aktivierung identifiziert werden. Weitere Hinweise auf eine mögliche FXR-Aktivierung der Verbindungen gaben in der Literatur beschriebene Nebeneffekte, die mit einer FXR-Aktivierung in Zusammenhang stehen könnten. Die potentenste Verbindung, der zugelassenen Tyrosinkinase-Inhibitor Imatinib, wurde zusätzlich in Bezug auf FXR-basierte SHP mRNS Induktion untersucht. In qPCR-Experimenten konnte dabei eine mit GW4064 vergleichbare Induktion in HepG2 Zellen gezeigt werden. Diese Ergebnisse untermauern die aus der Literatur gewonnen Vermutung, dass Imatinib FXR-modulierende Eigenschaften besitzt und somit eine interessante Grundlage für die Entwicklung neuer FXR-Partialagonisten darstellt. Zu diesem Zeitpunkt werden weitere Imatinib-Derivate synthetisiert und diese Struktur als mögliche Leitstruktur charakterisiert.
In einer zweiten Studie wurde eine Kombination aus Liganden- und Struktur-basierten Ansatz verfolgt. Dabei wurden sämtliche Struktur-Informationen aus publizierten FXR-Kristallstrukturen und den darin kokristallisierten Liganden gebündelt, um die Auswirkungen des zu Beginn erwähnten induced-fit Effekts zu minimieren. Auf Basis der ko-kristallisierten Liganden wurden zunächst zwei Konsensus-Pharmakophormodelle erstellt. Diese Modelle wurden in einem anschließenden Schritt jeweils mit einem Konsensus-Pharmakophormodell, das mit Hilfe von Protein-Ligand-Interaktions-Fingerprints (PLIF) aus den korrespondieren Kristallstrukturen abgeleitet wurde, überlagert und kombiniert. Diese kombinierten Modelle vereinten sowohl Informationen der strukturellen Gemeinsamkeiten der Liganden als auch gemeinsame, relevante Interaktionspunkte zwischen Ligand und Rezeptor aus den Kristallstrukturen. Das Pharmakophor-Screening mit anschließender Docking Analyse führte zu 42 getesteten Verbindungen, von denen 12 Strukturen eine signifikante relative FXR-Aktivierung zeigten. Darunter konnte ein Partial-Agonist mit einem EC50 von 480 nM bei einer maximalen Aktivierung von ca. 14% im Vergleich zur Referenz GW4064 identifiziert werden. Auch diese Verbindung wird zum aktuellen Zeitpunkt weiter charakterisiert und könnte in Zukunft als Leitstruktur für neue FXR-Partialagonisten dienen.
In beiden Studien konnten neue FXR-Agonisten mit bisher noch nicht beschriebenen Scaffolds identifiziert werden. Es konnte gezeigt werden, dass die Verwendung bereits zugelassener Wirkstoffe für neue Indikationen eine attraktive Quelle für neue Leitstrukturen darstellen kann und im Zuge dessen bisher ungeklärte Nebeneffekte bekannter Wirkstoffe aufgeklärt werden können.
Abschließend lässt sich festhalten, dass selbstorganisierende Karten eine universelle Methode zur Erkennung und Analyse von polypharmakologischen Zusammenhängen darstellen. Des Weiteren lassen sich mit ihrer Hilfe chemische Räume repräsentieren und durch den in dieser Arbeit entwickelten MultiSOM-Ansatz direkt vergleichen. Dies ermöglicht auf intuitive und effiziente Weise die Identifizierung von überlappenden chemischen Räumen und somit möglicher polypharmakologischer Zusammenhänge.
Die Funktion nukleärer Rezeptoren (NR) beruht auf einem empfindlichen Zusammenspiel zwischen ihren Domänen, Coregulatoren und Liganden. Die meisten Rezeptoren binden die DNA als Homo- oder Heterodimere und transregulieren die Gentranskription in Folge von Ligandenbindung. Klassische Assay-Systeme, die sich auf die Untersuchung der NR-Funktion oder auf die Charakterisierung von Substanzen richten, bilden nur die Coregulator-Rekrutierung zu isolierten NR-Ligandenbindungsdomänen (LBDs) ab und vernachlässigen dabei die NR:NR-Interaktion. Damit klammern sie die NR:NR-Wechselwirkung aus, obwohl die Rekrutierung von Cofaktoren durch allosterischen Crosstalk mit der Oligomerisierung verbunden ist. Dies war die Motivation dafür, Assay-Systeme zu entwickeln, welche die Untersuchung von NR-Interaktionen,
insbesondere der NR-Dimerisierung, und deren Modulation durch verschiedene Arten von Liganden ermöglichen. Im Rahmen dieser Doktorarbeit wird ein vielfältiges modulares Set von Assays für die Untersuchung der NR-Dimerisierung und NR-Coregulator-Rekrutierung vorgestellt und deren Anwendbarkeit auf eine Vielzahl von NRs demonstriert. Die Verwendung einer
rekrutierungsunfähigen RXRα-Variante mit einer mutierten AF-2-Domäne ermöglichte den spezifischen Nachweis der Coaktivatorrekrutierung durch PPARγ im Kontext des Heterodimers mit seinem obligatorischen Dimerpartner RXRα. Außerdem konnte gezeigt werden, dass die Aktivierung der RXRα LBD mit ihrem Agonisten SR11237 zu einer Destabilisierung des RXRα-Homodimers, aber zu einer Förderung der Bildung des Heterodimers mit der PPARγ LBD führte.
Ein zentrales Ergebnis war das Phänomen, dass der Einbau von PPARγ in das Heterodimer zu einem erheblichen Anstieg an Affinität gegenüber Coaktivatoren führt, auch in Abwesenheit von Liganden. Somit fördert die RXRα-Aktivierung die Coaktivator-Rekrutierung von PPARγ indirekt durch eine Verschiebung der Oligomerisierungspräferenz von RXRα in Richtung des Heterodimers. Zusätzlich wurde die Wirkung von Tetrac, einem nicht-klassischen Schilddrüsenhormon, auf PPARγ und RXRα untersucht und dessen Aktivierungsvermögen gegenüber beiden Rezeptoren mit einer deutlich vervielfachten Wirkung auf das Heterodimer demonstriert. Mit Hilfe des neu etablierten Cofaktor-Rekrutierungsscreens konnte die Dynamik
zwischen dem Nurr1 NR und 29 kanonischen Coregulatoren, von denen einige ligandenabhängig hohe Affinitäten zum Rezeptor aufwiesen, beleuchtet werden. Diese Interaktionen wurden
bidirektional durch eine Reihe von strukturell unterschiedlichen nicht-steroidalen Antirheumatika moduliert, die auch die Affinitäten sowohl des Nurr1-Homodimers als auch des Heterodimers mit der RXRα LBD beeinflussen konnten. Die Nurr1-Dimere zeigten zudem auch eine hohe Empfindlichkeit gegenüber dem Endocannabinoid Anandamid. Zusätzlich zu PPARγ, RXRα und Nurr1 wurden erste Schritte zur Untersuchung der TLX NR-Funktion unternommen. Unter Anwendung der entwickelten Assays konnte die Heterodimerbildung der TLX und der RXRα LBD
beschrieben und die ligandenabhängige Rekrutierung des Corepressors SMRT beobachtet werden.
Zusammenfassend beschreibt diese Arbeit einen Satz von Werkzeugen für die Untersuchung von ligandenabhängiger NR-Coregulator-Interaktion und Oligomerisierung. Auf diese Weise trug sie zu einer umfassenderen Identifizierung und Charakterisierung von NR-Liganden bei und stellt eine valide Basis für die weitere Assayentwicklung und Ligandendesign dar.
Die Identifikation neuer Hits und Leitstrukturen sind die ersten Schritte bei der Entwicklung neuer Arzneistoffe. Dieser Herausforderung wird derzeit primär mittels High-Throughput-Screening oder der gezielten Modifikationen bekannter Liganden begegnet. Eine weitere Option ist das computerbasierte virtuelle Screening, das es kostengünstig ermöglicht, in kurzer Zeit sehr viele Moleküle auf ihre potentielle biologische Aktivität hin zu untersuchen. Der in dieser Arbeit verwendete Ansatz zur Identifikation neuer Inhibitoren der 5-Lipoxygenase und der Cyclooxygenase-2 beruht auf dem Verfahren des ligandenbasierten virtuellen Screenings. Unter der Voraussetzung der Kenntnis mindestens eines Referenzliganden können so mittels einer Ähnlichkeitsanalyse potentielle neue strukturelle Grundgerüste identifiziert werden. Zu diesem Zweck wurde ein auf atomaren Partialladungen und der dreidimensionalen Struktur der Moleküle basierender Deskriptor (Charge3D/TripleCharge3D) entwickelt. In retrospektiven Studien mit Cyclooxygenase-2 Inhibitoren wurde die Effektivität der neuen Deskriptoren überprüft und mittel eines evolutionären Algorithmus optimiert. Der Charge3D Deskriptor erreicht Anreicherungsfaktoren bis zu 16,1 im ersten Perzentil der durchsuchten Datenbank, wohingegen der TripleCharge3D Deskriptor mit seiner detailierteren Ladungsauftrennung Werte von bis zu 24,8 erreichte. Ein ebensolches retrospektives Screening wurde für 5-Lipoxygenase Inhibitoren durchgeführt. Den maximalen Anreicherungsfaktor von 6,1 im ersten Prozent der Datenbank erreichte hier der Charge3D Deskriptor, der TripleCharge3D Deskriptor erreichte 5,3. Diese wesentlich geringeren Werte sind auf die Diversität der 5-LO Inhibitoren (54 Inhibitoren mit 39 verschiedenen Grundgerüsten) und deren unterschiedliche Inhibitortypen (Redox, nicht Redox und Eisen-bindende Inhibitoren) mit ihren jeweiligen Bindemodi zurückzuführen. In Screenings nach 5-LO Inhibitoren in der Naturstoffdatenbank der Firma AnalytiCon Discovery und COX-25-LO Dualinhibitoren in Datenbanken der Firma Asinex konnten unter Verwendung der beiden Deskriptoren Inhibitoren, mit für diese Targets bislang unbekannten Scaffolds identifiziert werden. Unter Verwendung des 2D Pharmakophor Deskriptors CATS wurden zuerst zwei neue Scaffolds für Inhibitoren der 5-LO identifiziert. Struktur 1 ist den in vitro Assaydaten zufolge ein direkter Inhibitor der 5-LO. Struktur 2 hingegen erreicht seine Wirkung nicht nur über die direkte Interaktion mit der 5-LO. Eine Erklärung dafür wäre die Wechselwirkung mit dem 5-LO aktivierenden Protein FLAP, der Hemmung der Translokation der 5-LO zur Kernmembran, oder die Inhibition 5-LO aktivierender bzw. inaktivierender Kinasen. In nachfolgenden Screenings mit den Strukturen 1 und 2 als Referenzstrukturen konnten mittels der Charge Deskriptoren Substanzderivate (17 Moleküle) mit 5-LO inhibitorischer Wirkung (5 Moleküle mit IC50 Werte ≤ 1 μM an partiell aufgereinigter 5-LO), identifiziert werden. Für das Screening nach COX-2/5-LO Dualinhibitoren wurden 11 Strukturen mit 7 unterschiedlichen Scaffolds unter Verwendung der Charge Deskriptoren aus gewählt. Drei Moleküle zeigten keine 5-LO Aktivität, und jeweils eines nur in intakten PMNLs bzw. im S100 Zellüberstand. Die restlichen 6 Moleküle waren in beiden 5-LO Assays aktiv (intakte PMNLs IC50 zwischen 2 und 15 μM, S100 Zellüberstand 5-LO zwischen 0.5 μM und 25 μM). Somit zeigten 7 Moleküle im S100 Assay Aktivität und konnten als direkte Inhibitoren der 5-LO identifiziert werden. Im Cyclooxygenase-2 Aktivitätsassay mit intakten MonoMac6 Zellen zeigte eine der 11 Strukturen zudem eine geringe (IC50 = 70 μM) inhibierende Aktivität. Modifikationen zur Verbesserung der COX-2 Hemmung könnten in einem potenten COX-2/5-LO Dualinhibitor resultieren, der beispielsweise in der Schmerzbehandlung eingesetzt werden könnte. Ein weiteres Projekt war die Erstellung eines Homologiemodells der 5-LO basierend auf der 15-Lipoxygenase Struktur des Kaninchens (PDB-Struktur: 1LOX). Die Sequenzidentität der beiden Strukturen (1LOX / humane 5-LO) lag bei 37 %. Das Modell wurde zum einen zur Vorhersage von zugänglichen Caspase-6 Schnittstellen an der 5-LO angewandt, und zum anderen wurden Dockingexperimente in Aktiven Zentrum und in Bereichen der C2-like Domäne der 5-LO durchgeführt. Hyperforin, ein bekannter Inhibitor d er 5-Lipoxygenase, wurde an verschiedenen Stellen des Modells für Dockingexperiment eingebracht. Die im Aktiven Zentrum erreichten Scorewerte (Chemscore = -9±1) deuteten hier auf eine unfavorisierte Bindungsstelle hin. BWA4C (ein bekannter Eisenbinder) und ZM230487 (ein nicht-redox Inhibitor) erhielten im Aktiven Zentrum Scorewerte von 27±0,1 und 22±2,5, wodurch eine Bindung als wahrscheinlich angenommen werden kann. Weitere Dockingexperimente an der C2-like Domäne, und speziell am Interface zwischen der C2-like und der katalytischen Domäne, ergaben ähnlich hohe Chemscorewerte für Hyperforin, BWA4C und ZM230487. Aus diesen Resultaten ließ sich kein eindeutiger Bindemodus für Hyperforin ableiten. Eine Positionierung im Aktiven Zentrum ist nach diesen Experimenten unwahrscheinlich, so dass die Existenz einer weiteren, experimentell noch nicht identifizierten Bindestelle vermutet werden kann. Eine solche Interaktionsfläche könnte als Ansatzpunkt für die Entwicklung weiterer 5-Lipoxygenaseinhibitoren eine zentrale Rolle einnehmen.
Als zellulärer Sensor für Gallensäuren und als Regulator zahlreicher metabolischer und inflamma-torischer Gene stellt der nukleäre Farnesoid X Rezeptor (FXR) ein vielversprechendes neues Wirkstofftarget dar. Die Aktivierung von FXR mit natürlichen oder synthetischen Liganden führte in vitro und in vivo zu zahlreichen wünschenswerten Effekten wie gesteigerter Insulinfreisetzung, verringerter Insulinresistenz oder verbessertem Lipidprofil. Daneben stellt die Aktivierung von FXR ein Prinzip zur Behandlung von Lebererkrankungen wie nicht-alkoholischer Fettleber und primärer billiärer Zirrhose dar, das mit dem FXR-Agonisten Obeticholsäure bereits in klinischen Studien überprüft wird. Existierende synthetische FXR-Liganden sind Fettsäure- bzw. Gallensäuremimetika und imitieren die physiologischen FXR-Agonisten. Die meisten synthetischen FXR-Liganden sind jedoch aufgrund von Toxizität, geringer Selektivität oder schlechter Bioverfügbarkeit nicht zur wie-teren klinischen Entwicklung geeignet. Sie stellen außerdem vornehmlich vollagonistische FXR-Ligan-den dar, doch die klinischen Erfahrungen mit Liganden anderer nukleärer Rezeptoren wie den Peroxi-somen Proliferator-aktivierten Rezeptoren (PPAR) oder den Estrogenrezeptoren (ER) haben gezeigt, dass eine zu starke Aktivierung eines Ligand-aktivierten Transkriptionsfaktors Risiken erheblicher Nebenwirkungen bergen kann. Eine Möglichkeit, dieser Gefahr vorzubeugen, bietet die Entwicklung partialagonistischer FXR-Liganden, die den Rezeptor nur mit moderater Amplitude aktivieren.
In dieser Arbeit wurde ausgehend von der in einem virtuellen Screening identifizierten Leitstruktur 1, durch medizinisch chemische Optimierung und Studien zu den Struktur-Wirkungs-Beziehungen (SAR) ein potenter und selektiver FXR-Partialagonist entwickelt. Die drei Molekülteile der Leitstruktur 1 (azide Kopfgruppe, zentraler Anthranilamidkörper und Acylsubstituent) wurden einzeln hinsichtlich ihrer Potenz an FXR untersucht und optimiert. In der Untersuchung der SAR des Acylsubstituenten zeigten sich ein 2-Naphthoyl- und ein 4-tert-Butylbenzoylsubstituent der in 1 enthaltenen 4-Methylbenzoylgruppe überlegen. Unter Beibehaltung des 2-Naphthoylsubstituenten wurde hierauf durch selektive Methylierung bzw. Reduktion die Notwendigkeit beider Amidbindungen der Subs-tanzklasse für Aktivität an FXR nachgewiesen. Durch Erweiterung der aziden Kopfgruppe um einen zusätzlichen aromatischen Ring gelang eine weitere Potenzsteigerung, die sich durch eine Methyl-gruppe an 6-Position dieses neu eingeführten Ringes noch erhöhen ließe. Andere Substituenten am aromatischen Ring der Kopfgruppe führten dagegen an keiner Position zu einer Aktivitätsverbes-serung. Der Austausch der freien Carbonsäure durch metabolisch stabilere Bioisostere wie ein Methylketon oder ein Nitril stellte sich als ohne Aktivitätsverlust möglich heraus, wobei das Tetrazol als klassisches Carbonsäurebioisoster eine Ausnahme mit geringerer Potenz bildete. Die entscheiden-de Steigerung der Aktivität der Acylanthranilamide an FXR resultierte aus der Einführung eines zusätzlichen Substituenten in 4-Position des zentralen aromatischen Ringes, wobei eine Methoxy-gruppe zur größten Potenz führte. Das resultierende Anthranilamid 2 stellt einen hochpotenten FXR-Partialagonisten mit einem EC50-Wert von 8±3 nM in einem flFXR-Reportergenassay bei 18±1% Maximalaktivierung dar und ist der Leitstruktur somit um mehr als einen Faktor 1000 überlegen.
Die optimierte Verbindung 2 wurde aufgrund ihrer großen Potenz ausführlich in vitro pharma-kologisch charakterisiert. Dabei stellte sich die Substanz als metabolisch sehr stabil, moderat löslich in Wasser und gemessen an ihrer hohen Aktivität an FXR als wenig toxisch heraus. Darüber hinaus er-wies sich 2 als selektiv für FXR über den membranständigen G-Protein-gekoppelten Gallen-säurerezeptor TGR5 (Faktor >1000) sowie über die nukleären Rezeptoren PPARα (>1000), PPARγ (~375) und PPARδ (>1000). Bei der Quantifizierung seiner Effekte auf die FXR-Targetgene SHP, CYP7A1, BSEP, OSTα und IBABP durch qRT-PCR übte 2 im Bereich 0,1 µM bis 10 µM einen konzen-trationsunabhängigen partialagonistischen Effekt von etwa 40% des Effektes des physiologischen FXR-Agonisten Chenodeoxycholsäure (CDCA) aus. Mit der Verbindung 2 wurde somit ein hochpotenter, selektiver und metabolisch stabiler FXR-Partialagonist entwickelt und charakterisiert, der sich für künftige in vitro und in vivo Studien zu partieller FXR-Aktivierung empfehlen kann.
Metabolites such as lactate and free fatty acids (FFAs) abundantly occur in high concentrations in tumor and stromal cells of solid malignancies. Their known functions comprise the allocation of nutrients and intermediates for the generation of cell components, the evasion of immune destruction, the induction of vessel formation and the stimulation of cell migration in order to promote tumor growth, progression and metastasis. However, the role of metabolites as signaling molecules and the downstream mechanisms of metabolite receptor mediated signaling in tumor and stromal cells is poorly understood. Our study confirms the expression of Hydroxycarboxylic acid receptor 1 (HCA1) in solid human breast tumors and the expression of Free fatty acid receptor 4 (FFA4) in solid human colorectal tumors. In addition, the expression of HCA1 in human breast cancer cell lines as well as the expression of FFA4 in human colorectal cancer cell lines was proved. Moreover, our research reveals the expression HCA2, FFA2 and FFA4 in tumor associated macrophages (TAMs).
To test whether the loss of any of the metabolite receptors affects tumor growth and progression we utilized a syngeneic Lewis lung cancer (LLC1) tumor model, an azoxymethane (AOM) – dextran sulfate (DSS) colorectal cancer model and a Mouse mammary tumor virus Polyoma Virus middle T antigen (MMTV-PyMT) breast cancer model. The loss of HCA2 did not lead to a changed outcome compared to wild type littermates in any of the models. Likewise, the deletion of FFA4 had no influence on the LLC1 model and, surprisingly, tumor number and area in the AOM-DSS model also remained unaltered. The impact of HCA1 deficiency was investigated utilizing the MMTV-PyMT model and revealed a moderately improved tumor growth. The absence of FFA2 did not affect tumor growth in the LLC1 model but led to an increased number of colorectal tumors in the AOM-DSS model while the tumor area remained unchanged. The most compelling results were obtained upon the deletion of FFA2 in the MMTV-PyMT model. Here, we demonstrate that the loss of FFA2 significantly reduces tumor latency and also significantly improves tumor growth. Nevertheless, the formation of metastases in the LLC1 model and the MMTV-PyMT model did not show any changes upon the loss of any of the metabolite receptors.
Together, our results describe a tumor-protective effect of FFA2 with an unclear impact on metastatic processes. Considerations about putative mechanisms of short chain fatty acid (SCFA) mediated FFA2 signaling suggest potential targets for pharmacological interventions to treat mammary tumors.
Entzündungen sind eine Gegenreaktion des Körpers auf einen schädlichen Stimulus. Eine akute Entzündung zeichnet sich durch typische Zeichen wie Schwellung, Rötung, Überwärmung, Schmerz und eingeschränkter Funktionsfähigkeit aus.Findet die Auflösung der Entzündung nur sehr langsam oder nicht statt, entsteht eine chronische Entzündung. Eine chronische Entzündung kann Auslöser vieler schwerwiegender Krankheiten, wie Diabetes mellitus, Krebs oder kardiovaskulärer Erkrankungen sein. Die symptomatische Behandlung einer chronischen Entzündung erfolgt unter anderem durch NSAIDs. Diese haben bei einer Langzeiteinnahme schwere Nebenwirkungen wie gastrointestinale Blutungen oder nephrotoxische Eigenschaften.NSAIDs greifen in den Metabolismus der Arachidonsäure-Kaskade ein. Die Arachidonsäure wird über mehrere Enzyme metabolisiert, die drei Hauptmetabolismuswege erfolgen über die Cyclooxygenase- (COX), 5-Lipoxygenase- (5-LOX) und Cytochrom P450-Enzyme (CYP450). Studien ergaben, dass die Inhibition eines Metabolismusweges eine Verschiebung der Lipidwerte innerhalb des Arachidonsäurestoffwechsels verursacht. Viele dieser Nebenwirkungen bei einer Langzeitmedikation kommen vermutlich durch die Verschiebung der Metabolite zustande.8 Diese Problematik könnte möglicherweise durch eine Inhibition mehrerer Metabolismuswege umgangen werden. Tierstudien belegen eine bessere Wirksamkeit dualer Inhibitoren gegenüber der Einzelverabreichung von „selektiven“ Inhibitoren und zudem wird ein erhöhtes Sicherheitsprofil für duale Inhibitoren postuliert.9,10 Im Rahmen dieser Arbeit wurden einerseits duale Inhibitoren der löslichen Epoxidhydrolase (sEH) und Leukotrien-A4-Hydrolase (LTA4H) und anderseits der sEH und der 5-Lipoxygenase entworfen, synthetisiert und in vitro gegenüber den betreffenden Enzymen in einem Aktivitätsassay evaluiert.
Es ist gelungen, duale Inhibitoren der sEH und LTA4H mit IC50-Wert im submikromolaren Bereich zu synthetisieren. Dies wurde durch die Erweiterung des Fragments 3-(4-(Benzyloxy)phenyl)propan-1-ol, welches Amano et al. publizierten, bewerkstelligt.11 Die synthetisierten Inhibitoren wurden analytisch charakterisiert und in vitro auf ihr inhibitorisches Potential untersucht. Des Weiteren konnte die Kristallstruktur eines dualen Inhibitors in der Bindetasche der sEH gelöst werden und damit weitere Erkenntnisse über den Bindungsmodus des Inhibitors gewonnen werden. Es konnten auch duale Inhibitoren der sEH und 5-LOX synthetisiert werden und jene auf ihr inhibitorisches Potential untersucht werden. Es wurden einige Inhibitoren mit submikromolaren bis nanomolaren IC50-Werten gegenüber beiden Zielproteinen entworfen, synthetisiert und analytisch charakterisiert. Da mehrere Inhibitoren zwei stereogene Zentren aufweisen, wurde ein Inhibitor mit definierten Stereozentren durch eine asymmetrische Synthese generiert. Ein stereogenes Zentrum wurde über drei Schritte synthetisiert und zum Nachweis der Reinheit des Enantiomeres zum Diastereomer gekuppelt. Per NMR-Spektroskopie wurde das Verhältnis (dr 9:1) der Diastereomere zueinander bestimmt. Das andere stereogene Zentrum wurde mit Hilfe eines Evans-Auxiliar über eine achtstufige Synthese dargestellt und mit dem Enantiomer aus der dreistufigen Synthese verknüpft. Per HPLC konnte ein dr-Verhältnis von 99:1 für den Inhibitor HK330 bestimmt werden. Das andere Diastereomer wurde mittels HPLC aus dem Recemat isoliert. Eine in vitro Evaluation zeigte, dass der Einfluss des stereogenen Zentrums auf das Inhibitionsvermögen marginal ist.
Nach einer Evaluation des Inhibitionsvermögens, der Löslichkeit, der Zelltoxizität, der metabolischen Stabilität und der synthetischen Zugänglichkeit, wurde der Inhibitor HK330 weiter untersucht. In einem Zellassay konnte jener die 5-LOX-Aktivität senken, die 12- und 15-LOX wurde jedoch nicht inhibiert. Des Weiteren wurde der Inhibitor in einer pharmakokinetischen Studie untersucht und erreichte Plasmawerte, die bis zu 4 h in der aktiven Konzentration des Inhibitors lagen. LC-MS/MS Untersuchungen der Plasmaproben ergaben ein erhöhtes EETs/DHETs-Verhältnis, welches die in vivo Inhibition der sEH bestätigt. Die Verbindung HK330 besitzt vielversprechende Eigenschaften und deshalb soll die Wirksamkeit des Inhibitors in einem Tiermodell getestet werden. Geeignete Tiermodelle wie die unilaterale Harnleiterobstruktion (unilateral ureteral obstruction, UUO) in Mäusen könnten Aufschlüsse über die Wirksamkeit von HK330 geben. Denn sowohl die Inhibition der 5-LOX als auch der sEH sind renoprotektiv.12,13 Die profibrinolytischen und anti-inflammatorischen Eigenschaften eines sEH-Inhibitors könnten auch in einem Tiermodell zur gestörten Wundheilung untersucht werden. In einem murinen Ohrwundmodell wurde gezeigt, dass eine Behandlung mit Epoxyeicosatriensäuren (EETs) die Wundheilung signifikant beschleunigte.15 Ramalho et al. zeigten, dass die Leukotriene des 5-LOX-Metabolisimusweges eine verminderte Wundheilung in diabetischen Mäusen (Typ 1) bewirkten.