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Der Produktion von Interleukin-8 (IL-8), Hämoxygenase-1 (HO-1), und dem vaskulären endothelialen Wachstumsfaktor (VEGF) wird zunehmend größere Bedeutung im Rahmen der Regulation der Immunantwort bei Entzündung, Infektion und Tumorwachstum zugemessen. Ziel dieser Arbeit war die Untersuchung der Regulation dieser Botenstoffe in vitro durch Verwendung der humanen Dickdarmkarzinomzellinie DLD-1. Die Substanz Pyrrolidinedithiocarbamate (PDTC) verstärkt nicht nur die durch Tumornekrosefaktor-a (TNF-a) vermittelte Ausschüttung von IL-8, sondern induziert auch als alleiniger Stimulus die IL-8-Sekretion. Mutationsanalysen des IL-8-Promotors und "Electrophoretic Mobility Shift" Untersuchungen (EMSA) zeigten, daß die Aktivierung des Transkriptionsfaktors AP-1 (Aktivator Protein-1) und die Bindungsaktivität von konstitutiv aktiviertem NF-KB in DLD-1 Zellen für die PDTC induzierte IL-8 Expression zwingend erforderlich waren. Weiterhin war PDTC in der Lage in DLD-1 Zellen neben IL-8 auch die Expression von HO-1 und VEGF zu verstärken. Die Induktion von IL-8 durch PDTC war nicht nur auf DLD-1 Zellen beschränkt, sondern wurde auch in Caco-2 Zellen (ebenfalls Dickdarmkrebszellen) und in humanen mononukleären Blutzellen beobachtet. Die Verwendung von PDTC wird seit kurzem als Kombinationspräparat für Zytostatia zur Behandlung von verschiedenen bösartigen Tumoren, unter ihnen auch Darmkrebs, vorgeschlagen. Aus unseren Versuchen läßt sich ableiten, daß die Induktion von IL-8, HO-1 und VEGF die therapeutische Anwendung dieser Substanz nachteilig beeinflussen könnte. Dies ergibt sich daraus, daß alle drei genannten Faktoren durch proangiogene Wirkungen das Tumorwachstum fördern. Die Expression der induzierbaren Stickoxidsynthase und die Produktion von Stickoxid (NO) korreliert mit der Angiogenese bei verschiedenen Krebserkrankungen darunter Melanome, Tumore im Hals- und Kopfbereich und Darmkrebs. Da tumorbegünstigende Funktionen von NO mit vermehrter Angiogenese in Verbindung gebracht werden, wurden die Effekte von NO hinsichtlich der Produktion von ausgesuchten Chemokinen, die an der Steuerung des Tumorwachstums beteiligt sind, untersucht. Zu diesen Chemokinen gehören das proangiogene IL-8 sowie das tumorsuppressiv durch Interferon induzierbare Protein-10 (IP-10) und das Monokin induziert durch Interferon-y (MIG). Diese Chemokine werden, nach Stimulation mit IL- 1ß und lnterferon-? (IFN-?) von DLD-1 Zellen, ausgeschüttet. Unter diesen Bedingungen wird die IL-8 Freisetzung alleine durch IL-1ß vermittelt, aber nicht durch INFy. Im Gegensatz zu IL-8 hängt die Sekretion von IP-10 und MIG von der Aktivierung durch IFNy ab. Die Effekte von NO wurden analysiert indem DLD-1 Zellen mit dem NO-Donor DETA-NO inkubiert wurden. DETA-NO besitzt eine Halbwertzeit von 16,5h und simuliert damit die Effekte der endogenen NO-Synthase. Synthese und Freisetzung von IL-8 wurden durch die Behandlung mit NO stark gesteigert. Außerdem wurde in Zellen die dem NO-Donor ausgesetzt wurden die basale Sekretion des VEGF signifikant verstärkt. Dies steht im Gegensatz zur IL-Iß/IFNy-induzierten Produktion von IP-10 und MIG, beide wurden durch Koinkubation mit NO unterdrückt. Ebenso wurde die Regulation der IFNy abhängigen induzierbaren Stickoxidsynthase in DLD-1 Zellen von NO unterdrückt. Die vorliegenden Daten ergänzen vorherige Studien, in denen NO mit Tumorangiogenese und verstärkten Tumorwachstum in Verbindung gebracht wird. Die NO vermittelte Induktion von IL-8 und VEGF, ebenso wie die Verminderung der IP-10 and MIG Expression, könnte zu diesem Phänomen beitragen. Unsere Studien stützen die Hypothese, daß spezifische lnhibitoren der iNOS therapeutischen Nutzen bei humanen Neoplasien haben könnten.
Haematopoietic stem cells (HSCs) are regarded as the prime target for gene therapy of inherited and acquired disorders of the blood system, e.g. X-linked chronic granulomatous disease (X-CGD). The major reason for this is that HSCs posses the ability to self renew as well as the potential to differentiate into all lineage-specific cell types. However, the need to reach and to maintain sufficient therapeutic levels of genetically modified stem cells and their progeny after gene delivery still presents major challenges for current HSC gene therapy approaches. In particular, one of the main limitations for most genetic defects is the lack of a selective growth advantage of gene-modified cells after engraftment. In vitro and in vivo methods have been developed that focus on either positive or negative selection of HSCs. An artificial selection advantage can be conferred to transduced HSCs by incorporating a selection marker in addition to the therapeutic transgene. In the present study, two novel strategies for positive selection of murine gp91phox gene-modified haematopoietic stem cells were developed and tested, bearing in mind that with selective growth advantage, the possibility of uncontrolled proliferation arises. The first strategy to be investigated was based on the homeobox transcription factor HOXB4, which plays an important role in the control of haematopoietic stem cell proliferation and differentiation. Overexpression of a retroviral bicistronic construct containing the therapeutic gene gp91phox and HOXB4 in murine primary bone marrow cells led to a significant 3–4-fold expansion of transduced cells ex vivo. The numbers of transgene-expressing cells increased 2–3-fold after 2 weeks cultivation under cytokine stimulation. Furthermore, the clonogenic progenitor cell assay (CFU assay) demonstrated that the number of colony-forming cells had increased to levels 2-fold higher than those of mock-transduced cells after 1 week of culture, thereby augmenting the presence of a significant number of stem/progenitor cells in the selected cell population. However, in our experiments, HOXB4-overexpressing murine HSCs did not show any repopulating advantage in transplanted recipient mice over control construct-transduced HSCs. These results indicate that selective expansion of gp91phox gene-modified HSCs can be induced by the HOXB4 transcription factor ex vivo but not in vivo. This is possibly dependent on HOXB4 expression levels, which are too low in vivo to achieve selection. The second strategy made use of a chemically inducible dimerizer system consisting of the therapeutic gene gp91phox and a fusion protein, containing sequences from a growth factor receptor signalling domain (epidermal growth factor receptor, EGFR, or prolactin receptor, PrlR) and the drug binding protein FKBP12, as the selection cassette. This strategy aimed to allow inducible selection that could be easily switched off. The activity of these fusion proteins is controlled through the small molecular dimerizer AP20187. Transduction of BaF/3 cells with lentiviral vectors expressing the EGFR construct induced proliferation and led to complete selection within 18 days (99%). However, removing AP20187 could not turn off proliferation. This construct is, therefore, not suitable as a selection cassette for the expansion of gene-modified HSCs due to its oncogenic potential. Transduction of the construct containing the intracellular domain of PrlR caused significant selective expansion of AP20187-treated BaF/3 cells. Following expression in cells, the fusion protein, which lacks membrane-anchoring sequences, mainly localized to the cytoplasm. Evidence was found to indicate that activated STAT5 might be responsible for this effect. Upon expression of the prolactin construct, phosphorylation of STAT5 and its DNA-binding activity to a ß-casein promoter sequence was strongly increased. Importantly, the induced proliferation was reversible after removal of AP20187. Transduced Sca1+ bone marrow cells obtained from C57BL/6-CD45.1 mice could be expanded about 20–100-fold ex vivo in the presence of AP20187 and mSCF without losing progenitor cell features and the capability to contribute to all lineages of the haematopoietic system. To exclude oncogenic outgrowth of one single clone, the polyclonality of selected cells was proven by ligation-mediated PCR (LM-PCR) analysis. In mouse transplantation experiments, ex vivo-expanded cells repopulated the bone marrow of lethally irradiated mice suggesting that the ex vivo expansion took place at the level of haematopoietic stem and/or progenitor cells. Genomic gp91phox sequences were detected in the bone marrow, spleen and peripheral blood cells of transplanted animals, indicating that gp91phox-containing cells most likely contributed to the reconstitution of haematopoiesis in these mice.
Der L-Carnitin/gamma-Butyrobetain Antiporter CaiT ist ein Mitglied der Betain/Carnitin/Cholin Transporter (BCCT) Familie. Sekundärtransporter der BCCT Familie transportieren Substrate, die eine positiv-geladene quartäre Ammoniumgruppe besitzen. CaiT besteht aus 504 Amiosäuren und besitzt ein moleculares Gewicht von etwa 56 kDa. In Enterobakterien wie Escherichia coli, Proteus mirabilis und Salmonella typhimurium wird die Expression des caiTABCDE Operons unter anaeroben Bedingungen induziert. Unter diesen Bedinungen ist CaiT der Haupttransporter des Betain-Derivates L-Carnitin. In Enterobakterien wird L-Carnitin unter anaeroben Bedingungen aufgenommen und dehydratisiert wobei Crotonobetain ensteht. Crotonobetain wird anschließend zum Endprodukt gamma-Butyrobetain reduziert. Gamma-Butyrobetain ist das Gegensubstrat, das aus der Zelle hinaustransportiert wird, wenn L-Carnitin in die Zelle aufgenommen wird. Der Austauschmechanismus von LCarnitin gegen gamma-Butyrobetain geschieht ohne das Vorhandensein eines elektrochemischen Gradients, d.h. CaiT ist sowohl H+- als auch Na+-unabhängig. Ein Ziel dieser Arbeit war es die drei-dimensionale (3D) Struktur von CaiT mittels Röntgenstrukturanalyse zu lösen. Weiterhin sollten mit Hilfe der 3D-Struktur und funktionellen Studien detailiertere Erkenntnisse über den kationenunabhängigen Antiportmechanismus von CaiT ermittelt werden. Im Rahmen dieser Arbeit wurden die 3D-Röntgenkristallstrukturen von drei CaiT-Homologen der Enterobakterien P. mirabilis (PmCaiT), E. coli (EcCaiT) und S. typhimurium (StCaiT) mittels molekularem Ersatz (engl.: molecular replacement, MR) mit einem Alanin-Model des CaiT verwandten Na+/Glycinbetain Symporters BetP gelöst. PmCaiT konnte mit einer Auflösung von 2.3 Å gelöst werden. Das Protein kristallisierte in der Kristallraumgruppe H3, mit drei Molekülen in der asymmetrischen Einheit (engl.: asymmetric unit, AU). Die drei PmCaiT-Moleküle ordneten sich innerhalb der AU um eine kristallographische dreifach Symmetrieachse an. EcCaiT wurde mittels MR mit einem Alanin-Model von PmCaiT bei einer Auflösung von 3.5 Å gelöst. EcCaiT kristallisierte in der Kristallraumgruppe P32, ebenfalls mit drei Molekülen in der AU, jedoch ohne kristallographische Symmetry. Während der Verfeinerung des EcCaiT-Models wurde eine strenge dreifache nichtkristallographische Symmetry (engl.: non-crystallographic symmetry, NCS) angewandt. StCaiT, das ebenfalls mittels MR mit einem Alanin-Model von PmCaiT, aber bei einer Auflösung von 4.0 Å gelöst wurde, kristallisierte in der Kristallraumgruppe P65, ebenfalls mit drei StCaiT-Molekülen in der AU, ohne kristallographische Symmetry. Bei der Verfeinerung des StCaiT-Modells wurde wie bei EcCaiT eine strenge NCS angewandt. Da die Auflösung von 4.0 Å bei StCaiT zu niedrig ist um detailierte moleculare Erkenntnisse zu gewinnen, wurden Protein- sowie Substratinteraktionen nur an den Strukturen von PmCaiT und EcCaiT analysiert. Alle drei CaiT-Homologe weisen jedoch einen ähnlichen strukturellen Aufbau auf. In der Röntgenkristallstruktur bildet CaiT ein symmetrisches Trimer, das über ionische und polare Wechselwirkungen zwischen den Protomeren stabilisiert wird. Der trimere Oligomerisierungszustand von CaiT in Detergenzlösung sowie in zweidimensionalen Lipidmembrankristallen wurde bereits in früheren Arbeiten gezeigt. Jedes der drei CaiT-Protomere besteht aus zwölf Transmembranhelices (TMH), die N- und C-terminalen Domänen des Proteins befinden sich auf der cytoplasmatischen Seite. Zehn der TMH bilden zwei invertierte Wiederholungseinheiten aus jeweils fünf TMH. Die erste Einheit besteht aus den TMH 3 – 7, die invertierte zweite Einheit besteht aus den TMH 8 – 12. Beide Wiederholungseinheiten sind strukturell nahezu identisch und lassen sich fast vollständig übereinanderlegen, jedoch weisen die Aminosäuren der beiden Einheiten keine signifikante Sequenzidentität auf. Die ersten beiden Helices der Wiederholungseinheiten, die TMH 3 – 4 und die TMH 8 – 9, bilden ein antiparalleles vier-Helix-Bündel, in dem in CaiT zwei Substratbindestellen lokalisiert sind. Eine derartige Transporterarchitektur wurde erstmals in der Struktur des Na+/Alanin Symporters LeuTAa des thermophilen Bakteriums Aquifex aeolicus gezeigt. Bislang wurden, inklusive CaiT, sieben Sekundärtransporterstrukturen gelöst, die diese LeuT-Transporterarchitektur aufweisen. Ungewöhnlich dabei ist, dass diese sieben Sekundärtransporter fünf verschiedenen Transporterfamilien angehören und eine Verwandschaft auf Basis der Aminosäuren nicht zu finden ist. Da jedoch die tertiäre Struktur dieser Tansporter konserviert ist, kann davon ausgegangen werden, dass sie alle von einem Urprotein entstanden sind, welches zunächst aus fünf TMH bestanden haben muss. Im Laufe der Evolution hat sich das Urgen des Urproteins zunächst dupliziert und die weitere Evolution hat zwar die Aminosäuresequenz verändert und den Umweltbedingungen angepasst, jedoch ist die tertiäre Struktur erhalten geblieben. Da sich die tertiäre Struktur der sieben Sekundärtransporter so stark ähnelt, ist zu vermuten, dass auch der Transportmechanismus ähnlich, jedoch nicht identisch ist. Nach dem strukturellen Aufbau der Transporter, der Lage der Substratbindestellen in den jeweiligen Transportern und der Tatsache, dass es sich bei diesen Proteinen um Membranproteine handelt, wurde ein Transportmechanismus aufgestellt, in dem die Bindestelle des zu transportierende Substrats alternierend zu beiden Seiten der Membran zugänglich ist, ohne jedoch jemals den Substratweg innerhalb des Proteins vollständig zu öffnen. Dieser Mechanismus wurde als “alternating access mechanism” beschrieben. Anhand der unterschiedlichen Zustände, in denen einige der Transporter kristallisierten, kann abgeleitet werden, welche Konformationsänderungen erforderlich sind um das Substrat von einer Seiter der Membran auf die andere zu transportieren. Bisher kristallisierten einzelne der sechs Transporter in der nach außen gerichteten offenen Form, der nach außen gerichteten Form, in der die Substratbindestelle jedoch nicht mehr zugänglich ist, in einer Form, die keine Öffnungspräferenz der Substratbindestelle zu einer Seite der Membran hat und in der nach innen gerichteten Form, in der die Substratbindestelle jedoch nicht geöffnet ist. CaiT kristallisierte in der noch fehlenden Konformation, der nach innen gerichteten Form, in der die Substratbindestelle zugänglich ist. Mit dieser noch fehlenend Konformation kann der Transportzyklus des “alternating access mechanism” vollständig beschrieben werden. Alle drei CaiT-Homologe kristallisierten in der nach innen gerichteten, offenen Konformation. Im Gegensatz zur EcCaiT-Struktur kristallisierte PmCaiT in der substratungebundenen Form. In der StCaiT-Struktur konnte aufgrund der niedrigen Auflösung kein Substrat nachgewiesen werden. In der EcCaiT-Struktur sind zwei gamma-Butyrobetain-Moleküle gebunden. Das erste Molekül wurde in der zentralen Substratbindestelle, der sogenannten Tryptophan-Box bestehend aus vier Tryptophanen, im Zentrum des Protein lokalisiert. Das zweite gamma-Butyrobetain-Molekül wurde in einer Vertiefung an der extrazellulären Proteinoberfläche gefunden. Beide Substrate werden hauptsächlich über Kation-Pi-Interaktionen zwischen der positiv geladenen quatären Ammoniumgruppe des Substrats und des Pi-Elektronensystems der Tryptophane in den jeweiligen Bindestellen gebunden. Eine besondere Eigenschaft von CaiT ist der H+- bzw. Na+-unabhängige Substrattransport. Die CaiT-Struktur erklärt warum kein zusätzliches Kation benötigt wird um Substrat zu binden oder zu transportieren. In der EcCaiT-Struktur ist eine wichtige polare nicht-bindende Interaktion zwischen der Carboxylgruppe des gamma-Butyrobetains und dem Schwefelatom eines Methionins in der zentrale Bindestelle zu erkennen. Dieses Methionin ist konserviert in den prokaryotischen CaiTs und in den Na+-unabhängigen eukaryotischen L-Carnitin Transportern (OCTN), jedoch ist es nicht konserviert im Na+-abhängigen verwandten Glycinbetain Transporter BetP. In BetP ist diese Position des Methionins durch ein Valin ersetzt. Die Mutation des Methionins in CaiT zu Valin ermöglicht zwar immernoch die H+- bzw. Na+-unabhängige Bindung des Substrates durch die Tryptophan-Box, jedoch ist der Substrattransport nahezu vollständig zerstört. Eine derart wichtige Substratkoordinierende Funktion des Schwefelatoms eines Methionins wurde bisher nicht beschrieben. Eine weitere Stelle, die in H+- bzw. Na+-abhängigen Transporter mit H+ bzw. Na+ besetzt ist, ist in CaiT von einem positiv geladenen Arginin eingenommen. Eine positive Ladung an dieser Stelle stabilisiert den Bereich im Protein in der Nähe der zentralen Substratbindestelle. Die Mutation des Arginins zu Glutamat in CaiT erzielt eine vollständige Inaktivierung des Substrattansports. Durch Zugabe von Na+ im Transportansatz kann die Substrattransportaktivität der Glutamat-Mutante jedoch teilweise zurückerlangt werden. Diese eben beschriebenen Aminosäurereste in den beiden Stellen des Proteins erklären die Kationenunabhängigkeit von CaiT. Die Aktivierung des Antiportmechanismus in CaiT wurde mit Hilfe von Bindungsstudien an rekonstituiertem Protein ermittelt. Diese Messungen ergaben für das Wildtypprotein ein sigmoidales Substratbindungsverhalten, was auf ein positiv-kooperatives Bindungsverhalten hindeutet. Die beiden Substratbindestellen im Protein sowie die beiden unterschiedlichen Substrate, L-Carnitin und gamma-Butyrobetain, lassen auf einen heterotropen positiv-kooperativen Bindungs- und einen allosterisch regulierten Transportmechanismus schließen. Bei diesem Mechanismus erhöht die Bindung eines Substrats in der regulatorischen Bindestelle durch induzierte Konformationsänderungen die Affinität eines anderen Substrats in einer weiteren Substratbindestelle. Die regulatorische Bindestelle in CaiT befindet sich an der extrazellulären Proteinoberfläche. Eine Schwächung der Substrataffinität in dieser Bindestelle durch Einführung einer Mutation, verstärkt das sigmoidale Substratbindungsverhalten und hat einen negativen Einfluss auf den Substrattransport. Durch die in dieser Arbeit gelösten 3D-Röntgenkristallstrukturen der zwei CaiT-Homologen, PmCaiT und EcCaiT, sowie den durchgeführten funktionellen Studien sowohl an Wildtypprotein wie auch an Mutanten konnte ein L-Carnitin/gamma-Butyrobetain Antiport-Mechanismus für CaiT vorzuschlagen werden.
The enzyme 5-lipoxygenase (5-LO) occupies a central role in the biosynthesis of inflammatory leukotrienes and thus takes part in the pathogenesis of related diseases. Its occurrence is mainly restricted to cells of the immune system including granulocytes, monocytes/macrophages or B-lymphocytes and can be induced by cell differentiation of myeloid cells after treatment with differentiating agents, such as DMSO, retinoic acid or the combination of TGFβ/1,25(OH)2D3. The latter contribute to the highest level of induction of mRNA and protein expression. Its cell specific occurrence is at least partly due to DNA methylation in cells that do not exhibit 5-LO activity and genetic regulation is further dependent on histone acetylation. 5-LO expression is controlled by transcription factors binding to the promoter sequence of the ALOX5 gene that induce basal promoter activity, as well as promoter independent effects including transcript initiation and elongation, which are mostly attributed to TGFβ/1,25(OH)2D3 signaling. The ALOX5 gene resembles a typical housekeeping gene, hence lacks TATA- or CAAT-boxes for transcriptional regulation, but displays a high GC-content with eight GC-boxes, five of which are arranged in tandem, that provide binding sites for transcription factors Sp1, Sp3 and Egr-1.
The proximal ALOX5 promoter is furthermore a target for additional factors, such as TGFβ effector proteins SMADs or the vitamin D receptor and possesses additional consensus sequences for transcriptional regulators, including NF-κB or PU.1. However, as yet no actual binding of these proteins to the promoter sequence was demonstrated and an unbiased screening for identifying further ALOX5 promoter interacting proteins, which might have impact on 5-LO expression, is still lacking. For this purpose, the present study focused on the identification of significantly interacting proteins, employing DNA-affinity enrichment coupled to label-free quantitative proteomics, spanning a sequence of about 270 base pairs of the proximal ALOX5 promoter. For the elucidation of potential cell specific differences in protein patterns and compositions, DNA pulldowns were performed by using oligonucleotide stretches comprising the core promoter sequence including the 5-fold GC-box, which were incubated with different cell lines and differentiation states of myeloid, as well as B-lymphocytic lineages. In order to compare different mass spectrometric quantification strategies that would allow for identification of interactors, dimethyl labeling and label-free techniques were used. Since the label-free approach outperformed the label-based one in initial experiments, it was established as standard quantification strategy in all DNA pulldowns performed. The pulldowns of myeloid cell lines in both undifferentiated and differentiated state and B-lymphocytes resulted in a cell-unspecific protein pattern whose composition was similar, regardless of cell lineage. Additionally, further DNA sequences comprising either a vitamin D response element or a SMAD binding element were investigated in the promyelocytic model cell line HL-60 in both undifferentiated and differentiated state. The identified proteins confirmed known interaction partners and furthermore revealed novel potential regulators of the 5-LO promoter. Out of these, the most prominently identified and promising proteins included transcription factors of the KLF- and CCAAT/enhancer binding protein-family. In this context, KLF5 and KLF13 are both involved in the regulation of inflammatory processes, the former additionally being an effector protein of TGFβ-signaling, whose functional characterization is of utmost interest in terms of regulation of 5-LO expression. Further protein characterization will be inevitable for the CCAAT/enhancer binding proteins C/EBPα, C/EBPβ and C/EBPε. These transcription factors are involved in the regulation of inflammatory processes and heterodimers thereof (C/EBPα/β) are known to control TGFβ/1,25(OH)2D3-mediated effects of the CD14 gene.
Several of the identified proteins of the pulldowns containing the tandem GC-box represented interactors of G-quadruplex DNA, including the helicases BLM and DHX36, the ribonucleoproteins hnRNP D and hnRNP K and transcription factor MAZ. Since G-quadruplexes form in G-rich DNA sequences as secondary DNA structures and exhibit substantial regulatory effects on the transcription of their target genes, the potential formation thereof in the ALOX5 core promoter sequence was investigated in a second project. Out of the proteins mentioned above, MAZ is shown to exert resolving effects on G4-DNA and synergistically induce Sp1-dependent gene activation of oncogene h-RAS, which displays analogous promoter characteristics to the ALOX5 gene. A DNA stretch comprising the tandem GC-box was used for elucidating the potential of secondary DNA structure formation. Intriguingly, both immune-based and spectroscopic methods provided clear evidence for the in vitro G-quadruplex formation of the proximal promoter sequence for the first time. In order to provide additional information on a possible regulatory effect of existing G-quadruplex structures on 5-LO transcription, differentiated HL-60 cells were subsequently treated with two distinct G4-DNA stabilizing agents. A porphyrin analogon (TMPyP4) did not exhibit any effects on 5-LO mRNA and protein expression after cell treatment. A second G4-DNA stabilizing agent (pyridostatin) on the other hand revealed significant reduction on 5-LO protein expression after cellular treatment. These mixed results render further experiments inevitable, in order to provide a clear assertion as to whether 5-LO expression is regulated by G-quadruplex structures or not.
Altogether, this study enlarges the knowledge of ALOX5 proximal promoter interacting proteins by corroborating the binding of already known transcription factors and identifying novel interactors. It yields essential groundwork for subsequent functional studies of proteins involved in 5-LO transcription and introduces G-quadruplexes as a new potential mechanism in ALOX5 gene regulation.
This work focused on the biosynthesis and characterization of esterified lipid mediators. Lipid mediators were generally thought to exert their effects as free molecules, and their esterification was regarded as a storage mechanism. However, more recent studies indicate that esterified lipid mediators are a distinct class of mediators. When this thesis started back in 2017, the idea of esterified lipids as a new class of mediators was relatively new so that respective compounds were either quite expensive or not commercially available at all. Therefore, a biosynthetic approach had to be established first to enable the study of the new lipid mediator class. Within the cell, esterified lipids are produced by activation and subsequent incorporation of polyunsaturated fatty acids. These steps are enzymatically catalyzed by members of the acyl-CoA synthetase family and the lysophosphatidylcholine acyltransferase family, respectively. Therefore, the enzymes acyl-CoA synthetase long-chain family member 4 (ACSL4) and lysophosphatidylcholine acyltransferase 2 (LPCAT2) were selected for a biosynthetic approach due to their broad substrate acceptance.
In a first attempt, recombinant protein expression in E. coli was studied. While the expression and purification of C-terminally His6x-tagged ACSL4 resulted in a pure and active protein, the expression of LPCAT2 turned out quite troublesome. Although several expression and purification parameters were varied, including purification tags, buffer compositions, and chromatography strategies, successful purification of LPCAT2 was not achieved.
Instead, a second approach was studied. This time, stably transfected cells overexpressing ACSL4 and/or LPCAT2 were generated from the human embryonal kidney (HEK) 293T cell line. Stably transfected cell lines were characterized on protein level and regarding their oxylipin profile. After confirming the overexpression and functionality of the enzymes, lipoxygenases (LOs) were co-expressed in a doxycycline-inducible manner to prevent premature cell death due to increased oxidative stress. As a result, LO product formation was enhanced and enabled the investigation of specific oxylipins. Since increased lipid peroxidation is also a key component of the ferroptosis cell death mechanisms, cell lines were investigated towards their cell viability. Indeed, expression of ACSL4 and/or LPCAT2 promoted cell death when treated with the ferroptosis inducers erastin or RSL3, even in the absence of LO expression. Furthermore, analysis by laser scanning confocal microscopy revealed that the localization of 15-LO1 was altered in the presence of LPCAT2, similar to treatment with RSL3 in vector control cells.
In conclusion, a stable overexpression system of ACSL4 and/or LPCAT2 was successfully established in HEK293T cells, which enabled the synthesis and characterization of esterified oxylipins. Interestingly, characterization of the cell lines revealed a correlation with the cell death mechanism ferroptosis. Although the expression of ACSL4 has already been reported as a biomarker for ferroptosis, this is the first time that a potential connection of LPCAT2 with ferroptosis was demonstrated. As a result, this may provide new therapeutic options for ferroptosis-related pathologies such as neurodegeneration, autoimmune diseases, or tumorigenesis.
Lipid mediators have been referred as bioactive lipids, whose change in lipid levels resulted in functional or pathophysiological consequences. They are in the focus of biological research, nevertheless this is a late recognition due to the many difficulties of working with bioactive lipids due to their properties: hydrophobic, unstable and they occur in only in small quantities. Liquid chromatography and mass spectrometry have facilitated the work with them. Especially in this field, cardiovascular diseases and inflammatory mediated diseases and cancer are pathophysiological events where LMs are deregulated. Additionally, if the modulation of one LM pathway is not sufficient to overcome a disease, the combination of targeting two or more pathways could be effective. Needless to say, lipid signaling cascades are complicated pathways and possible shunting into other pathways when inhibiting or genetically deleting enzymes should be taken into consideration.
The first part of this work has focused on enzymes that metabolize eicosanoids, like mPGES-1 and 5-LO. mPGES-1 is an important enzyme metabolizing PGH2 and one of the key players of the AA cascade. Its product, PGE2 plays an important role in different inflammatory processes. Inhibition of the mPGES-1 might be a promising step to circumvent COX dependent side effects of NSAIDs. The class of quinazoline compounds around the lead structure FR20 has been investigated on isolated human and murine enzyme, in HeLa cells and in different human whole blood (HWB) settings to establish the possible effects of these compounds on eicosanoid profiling. Novel compounds with inhibitory activities in the submicromolar range (IC50: 0.13 µM - 0.37 µM on isolated enzyme) were obtained which were also effective in cells and HWB. Furthermore, pharmacological profiling of toxicity and lipid screening with LC/MS-MS revealed that compounds also reduce PGE2 levels in intact cells and whole blood; they do not impair cell viability but lack the ability to inhibit the murine mPGES-1 enzyme. This problem could be overcome by means of chemical synthesis varying the scaffold (quinoline, quinazoline) or introducing biosteric replacement in the phenyl moieties.
5-LO is a relevant enzyme that plays an important role in eicosanoid signaling in particular in leukotriene biosynthesis. Leukotrienes are involved in asthma, allergic rhinitis, glomerulonephritis, rheumatoid arthritis, sepsis, cancer and atherosclerosis. Moreover, genetic variants in the genes of the 5-LO pathway have been associated with the risk of development of acute myocardial infarction and stroke. Eicosanoids are increased in infectious exacerbations of chronic obstructive pulmonary disease (COPD). They are also elevated in the airways of stable COPD patients compared to healthy subjects. Therefore, 5-LO has attired the scientific community as a possible therapeutic target to treat the several disease conditions listed before. In this study an extensive evaluation of imidazo[1,2-a]pyridines as a suitable lead structure for novel 5-LO targeting compounds was presented Within the three publications, 5-LO inhibitory activity of synthesized compounds was investigated in intact PMNL, a cell-free assay, in human whole blood and rodent cells to both elucidate structure-activity relationships and compounds were in vitro pharmacological evaluated. Chemical modifications for lead optimization via straight forward synthesis were used to combine small polar groups (hydroxy, and methoxy groups) which led to a suitable candidate with desired in vitro pharmacokinetic profile in terms of solubility and intrinsic clearance without showing any cytotoxicity. More than 70 imidazo[1,2-a]pyridine derivatives have been synthesized, resulting in more than 50 active compounds. Although it was not possible to introduce a solubility group without impairing the 5-LO inhibitory activity, combination of small polar groups lead to a more favorable solubility and in vitro metabolic stability. Overall, the development of 5-LO inhibitors with high efficacy and selectivity in vivo will provide a possible treatment for patients having one of the diseases where leukotriene biosynthesis plays an important role.
Other types of 5-LO inhibitors have been synthesized during this work, NO-NSAIDs can be postulated as novel 5-LO inhibitors that could circumvent the undesired side-effects of inhibiting COX isoforms (ulcer perforation, gastrointestinal bleeding and in some cases death). It is suggested that NO group is released in situ or after compounds are metabolized. NO-NSAIDs maintain the same anti-inflammatory properties by inhibiting 5-LO in clinical relevant concentrations. NO-NSAIDs are currently under clinical trial for the treatment of diseases where inflammation plays an important role. Synthesis of NO-NSAIDs is straightforward and can be applied for most NSAIDs recently published. Among them, the most promising candidate is NO-sulindac that was able to inhibit 5-LO product formation in intact PMNL, purified 5-LO and HWB in micromolar concentration. Additional experiments regarding their mechanism are currently being performed.
The present study could show that dual inhibitors are an interesting approach that is practicable. It has been used in the recent years to overcome side-effects and diseases concerning more pathophysiological conditions. MetS is an example of a conjunction of symptoms: hyperglycemia, hypertriglyceridemia, hypertension and obesity. Due to its complex nature, the current treatment strategies of MetS require multiple pharmacological compounds regulating lipid and glucose homeostasis as well as blood pressure and coagulation. This study describes the first synthesis of dual sEH/PPAR modulators as potential agents for treatment of MetS. Following a combinatorial approach, an acidic head group known as a pharmacophore important for PPARα/γ dual agonistic activity was combined with different hydrophobic urea derivatives in order to introduce an epoxide mimetic (sEH pharmacophore). The resulting compounds yielded high inhibition of sEH and different patterns of PPAR agonistic activity. This study demonstrates that the pharmacophores of PPAR agonists and sEH inhibitors can be easily combined, resulting in a simplified blueprint of a dual sEH/PPAR modulator. Further in vivo pharmacological evaluation studies are needed in order to evaluate, which pattern of PPAR activation shows the most promising profile for treatment of metabolic syndrome.
Another example of dual pharmacology has been presented in this work. Natural products derived compounds were able to target sEH and exhibit promising antiproliferative properties. The principle of addressing multiple targets by natural products can be transferred to synthetic multi-target ligands. In conclusion, several (E)-styryl-1H-benzo[d]imidazoles were synthesized and evaluated on recombinant sEH after an initial hit (IPS) that lead to potent sEH inhibitors exhibiting antiproliferative activities. Following the natural product-inspired design, the desired biological activity from a bacterial secondary metabolite has been enhanced and transferred to a synthetic compound series. The resulting compounds were accessible via an easy synthetic route and offered a possibility to investigate the structure-activity relationships. The natural product inspired drug design extends the valuable role of natural products as drugs and drug precursors to templates for fully synthetic bioactive molecules. Simplification of natural products by means of chemical synthesis could lead to an interesting field in the treatment of cancer.
Affinity chromatography has been used to unravel unknown- and off-target effects which either contribute to the biological effect of the inhibitor or that counteract or lead to undesired side-effects. During this PhD work, two main projects related to this technique have been established. In the first one, related to an imidazo[1,2-a]pyridine inhibitor (EP6), it has been shown that epoxide-sepharose is a reliable material in order to couple compounds bearing an alcohol. Coupling of an analogue of EP6 to the sepharose has been accomplished and affinity towards 5-LO was demonstrated. The challenging step is to discern from unspecific protein binders and analysis via SDS-PAGE separation and mass spectrometry. Further experiments using other cell types or improving SDS-PAGE analysis (e.g. 2D gel analysis) should be useful to unravel EP6 off-target effect. During the second project related to off-target effects of celecoxib and DMC, the main problem was the coupling of the functional group to the sepharose. Affinity towards COX-2 could not be demonstrated pointing out the inefficient coupling method. Higher pH values during coupling reaction should be tested in further experiments. Nevertheless, affinity chromatography is a useful technique to unravel cellular mechanisms.
Sphingolipid metabolism is also a recent area that attired the attention of cancer researchers, due to their important roles in cell proliferation and apoptosis. Ceramide metabolism inhibitors were synthesized and evaluated on different assay systems in order to assess their efficacy on several cancer lines. Remarkably, 2,2-dimethyl-1,3-dioxolan-4-yl)methanamine (32) was a useful scaffold to mimic the sphingoid base. This key intermediate was used to produce ceramide analogues that could enter the cell and target apoptosis machinery. EB143 (38) increased ceramide levels in an in vitro ceramide synthase assay in a dose-response manner meaning that ceramide synthase was not inhibited but the ceramide de novo synthesis was activated. This effect was due to the fact that EB143 is a cytotoxic compound with an interesting antiproliferative profile. Further chemical modifications should be carried out to modulate this effect.
COX and LO inhibitors are cancer-preventive not only by inhibiting specific antiapoptotic AA metabolites but also by facilitating accumulation of AA which promotes neutral SMase activity and increases the proapoptotic ceramide. Several 5-LO inhibitors have been evaluated on several cancer lines and sphingolipid levels were measured in order to obtain a relationship. A549, Capan-2 and MCF-7 cells line were incubated with synthetic 5-LO inhibitors and zileuton. Compounds were cytotoxic to all cancer cell lines except from A549. Needless to say, zileuton did not exhibit a cytotoxic profile. Synthetic 5-LO inhibitors were able to modify ceramide levels but were useless when coincubating with sphingolipid metabolism inhibitors (myoricin, amitryptiline etc.) and inconsistent results were obtained. On the contrary, zileuton selectively increased Cer-C16 levels and in less extend Cer-C24:1. When using a SPT inhibitor (myoricin) alone was able to reduce C24:1 and Cer-C16:0 levels below the control, a similar effect occurred when incubation the cells with zileuton and myriocin. Interestingly, treatment of zileuton together with either amitryptiline or desipramine led to a decrease in Cer-C24:1 and levels Cer-C16:0 but the inhibition was not complete indicating that probably the de novo pathway has an important role. Further investigations on mRNA level should be carried out in order to discern which CerS is activated.
The main objective of the present thesis was the synthesis of lipid signaling modulators and their evaluation in vitro as therapeutic strategy to overcome pathophysiological conditions (cancer, metabolic syndrome, etc). It has been accomplished on many relevant targets like 5-LO, mPGES-1, sEH and PPAR and these lipid signaling modulators could be used in the treatment of diseases conditions where lipid mediators play an important role.
The role of lncRNAs in the CVS and the endothelium is highly diverse and has been subject to a substantial amount of research over the last decade. The identification of lncRNAs as clinically relevant biomarkers and as co-regulatory molecules let to the appreciation of the functional relevance of lncRNAs.
In the present study, LINC00607 was identified as an endothelial-enriched, human-specific lncRNA. With its distinct functions, LINC00607 maintains and supports the endothelial homeostasis especially in response to VEGF-A signalling.
In the first part of this study, LINC00607 was functionally characterized in human endothelial cells. LINC00607 is highly and specifically expressed in endothelial cells and is differentially regulated in CVDs. Depletion of LINC00607 resulted in decreased angiogenic sprouting, reduced integration of ECs in a newly formed vascular network in vivo, enhanced endothelial migration and differential expression of many important genes for endothelial cell homeostasis. Functionally, LINC00607 maintains ERG-driven endothelial gene expression programs through BRG1. BRG1 secures stably accessible enhancer regions as well as TSS of ERG target genes, thus enabling transcription of endothelial gene programs.
The second part of this study proposes an additional mode of action for LINC00607. The strongly impaired response to VEGF-A after LINC00607 KO can only be partially explained by its’ expression control of ERG target genes. It rather appears that LINC00607 is involved in the control of alternative splicing of VEGF receptor FLT1. The differential splicing of FLT1 produces the anti-angiogenic soluble isoform of FLT1. Even though further validation is needed to uncover the underlying mechanism, there is the potential of a more general role of LINC00607 in splicing control through BRG1. As AS of FLT1 is a clinical marker in preeclampsia, LINC00607 might qualify to be an additional marker for the onset and manifestation of the pregnancy disorder.
Taken together, LINC00607 is a target in future for molecular therapy in CVD to restore a healthy endothelial phenotype and has the potential to serve as a biomarker in preeclampsia.
Krebs ist und wird voraussichtlich auch in näherer Zukunft eine der häufigsten Todesursachen weltweit bleiben. Trotz vielversprechenden Fortschritten in Therapeutik und Diagnostik bedarf es noch weiterer Forschung, um die vielfältigen molekularen Mechanismen zu entschlüsseln, welche dem Verlauf von malignen Tumorerkrankungen bestimmen und zu beeinflussen vermögen. Das RNA-Bindeprotein Hu antigen R (HuR) reguliert Genexpression auf posttranskriptioneller Ebene, indem es durch Bindung an Ziel mRNAs Einfluss auf deren Abbau, Lokalisation oder Translationseffizienz nimmt. Darüber hinaus zeigte sich in den letzten Jahren, dass HuR diese Prozesse auch indirekt durch Interaktion mit regulatorischen RNAs beeinflusst. In Krebszellen lässt sich häufig eine erhöhte Aktivität von HuR beobachten, welche in Verbindung mit verschiedenen tumorigenen Prozessen gebracht wird. Unter anderem trägt HuR zur Deregulation des Zellzyklus bei, indem es die Expression der Cycline A2, B1, D1 und E1 erhöht. Weiterhin unterstützt HuR das Tumorwachstum durch Regulation von proangiogenen Faktoren wie VEGF, IL8 und COX2. Da HuR generell eine prominente Rolle bei der Regulation von Immunantworten, sowohl in Immunzellen selbst als auch in solidem Gewebe einnimmt, wurde HuR in der Vergangenheit häufig auch mit der Ausbildung des inflammatorischen Tumormikromilieus in Verbindung gebracht, jedoch ist die Datenlage in dieser Hinsicht bis heute uneindeutig. Obwohl eine Großzahl an Zytokinen und inflammatorischen Faktoren prinzipiell als HuR Zielgene beschrieben sind, gibt es nur für die wenigsten dieser Proteine entsprechende Untersuchungen in Tumorzellen.
Ziel dieser Arbeit war es, den Einfluss von HuR in Tumoren auf die Rekrutierung von Makrophagen zu evaluieren. Hierfür bot sich als in vitro Modell die Brustkrebszelllinie MCF-7 an, da diese unter entsprechenden Kultivierungsbedingungen dreidimensionale Sphäroide bildet. Solch ein Sphäroidmodell bietet sich als Kompromiss zwischen der klassischen zweidimensionalen Zellkultur an, welche zwar höchst artifiziell, jedoch leicht zu handhaben und zu kontrollieren ist, und den physiologischeren, aber gleichzeitig experimentell unzugänglicheren und speziesfremden Tiermodellen. Mittels lentiviraler Transduktion wurde ein small hairpin RNA (shRNA) vermittelter stabiler Knockdown von HuR in MCF-7 erzielt, welcher zu vermindertem Zellwachstum führte, jedoch keinen weiteren Einfluss auf die Bildung von Sphäroiden hatte. Um die initiale Suche nach HuR-regulierten, potenziell relevanten Faktoren möglichst breit und unvoreingenommen zu halten, wurde die Expression von 174 Zytokinen in Wildtyp- und HuR-knockdown Sphäroiden mittels eines Protein Arrays untersucht. Überraschenderweise zeigte der Großteil der veränderten Proteins einen negativen Zusammenhang mit HuR, welches eigentlich eher als positiv regulierendes Protein beschrieben ist. Bemerkenswerterweise befand sich unter den mit am stärksten regulierten Faktoren das Chemokin CCL5 (auch RANTES genannt), welches einerseits als einer der beiden zentralen Faktoren für die Makrophageninfiltration in Brustkrebs gilt, andererseits bisher noch nicht in Verbindung mit HuR gebracht wurde.
Im Folgenden untersuchte ich zuerst den mechanistischen Hintergrund dieser Regulation. Da diese sich auch in adhärenten Zellrasen zeigte, wechselte ich für die entsprechenden Experimente zu zweidimensionaler Zellkultur. Eine negative regulatorische Funktion von HuR wird meist in Verbindung mit verminderter Translation von Zielfaktoren gebracht. Da die mRNA Level von CCL5 dem Effekt auf Proteinebene entsprachen, konnten entsprechende Mechanismen als Grund für die veränderten CCL5 Level ausgeschlossen werden. Desweiteren blieb die mRNA Stabilität ungeachtet der HuR Level konstant; dabei zeigte sich zudem, dass mRNA Abbau generell keinen relevanten Einfluss auf die Expression von CCL5 in MCF-7 hatte. Da diese Ergebnisse auf eine transkriptionelle Regulation hindeuteten, untersuchte ich im Folgenden den Einfluss von HuR auf die Promoteraktivität von CCL5. Hierfür isolierte ich zunächst die CCL5-Promoterregion aus genomischer DNA von MCF-7 Zellen und inserierte diese dann in einen zuvor promoterlosen Luciferase-Expressionsvektor. In den folgenden Reporteranalysen zeigte sich, dass HuR tatsächlich einen negativen Einfluss auf die Promoteraktivität von CCL5 ausübt. Durch sukzessive Verkürzung ließ sich der entscheidende DNA-Bereich auf die letzten 140 Nukleotide vor dem Transkriptionsstartpunkt eingrenzen. Dieser Bereich enthält vier prominente und sehr gut charakterisierte regulatorische Abschnitte: zwei benachbarte NF-κB Bindestellen sowie je ein Interferon-stimulated Response Element (ISRE) und ein C/EBPβ Erkennungsmotiv. Während das C/EBP Element keine funktionelle Relevanz in den Reporteranalysen hatte, reduzierte sich durch Deletion sowohl der ISRE als auch der NF-κB Elemente die Promoteraktivität um mehr als 50%, allerdings nur im ISRE-Deletionskonstrukt unter Nivellierung des HuR-abhängigen Unterschiedes. Somit ließ sich der Einfluss von HuR auf die CCL5 Promoteraktivität vollständig und ausschließlich auf das ISRE zurückführen. Im Gegensatz zu dem in Tumorzellen häufig basal überaktiven NF-κB Signalweg sind die kanonischen, ISRE-assoziierten Typ I Interferon Signalkaskaden und ihre vermittelnden Transkriptionsfaktoren, die sogenannten Interferon Regulatory Factors (IRFs) nicht konstitutiv überaktiviert. Eine Sonderstellung nehmen dabei die Faktoren IRF1 und IRF2 ein, da sie, für Proteine abseits der Stimulus-getriebenen ISRE-Interferon Achse, auch als konstitutive Transkriptionsfaktoren beschrieben sind, wobei IRF2 in diesem Kontext als IRF1-Antagonist und somit Transkriptionsrepressor fungiert. Überraschenderweise ließ sich mittels Chromatin Immunopräzipitation eine Assoziation von IRF1 mit dem CCL5 Promoter nur in Wildtyp-, jedoch nicht in HuR-knockdown Zellen nachweisen. Im Gegensatz dazu ergaben mRNA Expressionsanalysen der Tumor-relevanten IRFs, dass die CCL5 Induktion in HuR-depletierten Zellen mit einer allgemeinen, jedoch niedrigschwelligen Erhöhung von Typ I Interferon-assoziierten Signalen einhergeht. Interessanterweise korrelierte Interferon β zwar mit CCL5 auf mRNA Ebene, jedoch hatte eine Blockade des Interferon-α/β Rezeptors in HuR-depletierten Zellen keinen akuten Effekt auf CCL5. Umgekehrt zeigte sich auch keine erhöhten CCL5 Level in Wildtypzellen unter Kokultur mit HuR-knockdown Zellen, wie es bei parakriner Induktion durch Interferon β zu erwarten wäre. Ebenso konnte alternatives ISRE Signaling durch einen Komplex aus unphosphoryliertem Stat1 und IRF9, wie es in vitro unter länger anhaltender Niedriglevel Exposition mit Interferon β beobachtet wurde, ausgeschlossen werden. Um sicher zu stellen, dass diese Erhöhung kein sequenzabhängiges off-target Artefakt ist, wie es in der Vergangenheit für einzelne small hairpin RNAs (shRNAs) beobachtet wurde, wurde eine entsprechende Aktivierung von IRF3 und damit des IRF3/IRF7 Aktivierungsweges untersucht und ausgeschlossen. Zusätzlich konnte durch Tests unterschiedlicher shRNA Sequenzen sowie Zellsysteme demonstriert werden, dass die CCL5 Aktivierung tatsächlich ein spezifischer und in einer größeren Bandbreite an Krebszelllinien unterschiedlicher Herkunft, darunter Brust- und Lungenkarzinom, Glioblastom- sowie Melanom- Zelllinien, reproduzierbarer Effekt von HuR-Defizienz ist.
Da CCL5 als eines der zentralen Chemokine bei der Rekrutierung von Monozyten/Makrophagen in Tumore beschrieben ist, stellte sich die Frage, ob HuR mit diesem Vorgang in Verbindung zu bringen ist. Brusttumore weisen oft eine hohe Zahl von Tumor-assoziierten Makrophagen auf, welche von eingewanderten Blutmonozyten abstammen. Ein Einfluss von HuR auf diesen Vorgang in vitro konnte mittels einer Kokultur von Sphäroiden mit zuvor frisch aus Humanblut isolierten Primärmonozyten nachgewiesen werden. Hierbei wiesen HuR-knockdown Sphäroide trotz ihres geringeren Durchmessers eine erhöhte Anzahl von Monozyten/Makrophagen auf. Da sich in diesen Zellen weder Proliferation noch relevante Apoptose zeigte, ließ sich die erhöhte Anzahl auf verstärkte Einwanderung in das Sphäroid zurückführen. Hierbei erwies sich der direkte Zellkontakt zwischen Monozyten und Tumorzellen als erforderlich, da Monozyten keine unterschiedliche Chemotaxis gegenüber entsprechenden Sphäroidüberständen zeigten. Dass die erhöhte Infiltration in HuR-defizienten Sphäroiden tatsächlich auf CCL5 zurückzuführen ist, konnte in Kokulturexperimenten durch Inhibierung von CCL5 gezeigt werden. Unterstütztend wurde ein Zusammenhang zwischen HuR, CCL5 und Tumor assoziierten Makrophagen in silico unter Zuhilfenahme des TCGA Datensets für Estrogenrezeptor-positive Brusttumore untersucht. Im Einklang mit meinen Ergebnissen zeigte sich eine negative Korrelation zwischen HuR und CCL5. Außerdem ließ sich ein negativer Zusammenhang zwischen HuR und einer Makrophagensignatur feststellen, während CCL5 wie erwartet mit dieser Signatur positiv korrelierte.
Zusammenfassend zeigte sich in dieser Arbeit, dass HuR eine Rolle bei der zellulären Zusammensetzung des inflammatorischen Tumor-Mikromilieus spielt. Der Verlust von HuR in Tumorzellen führte zu einer erhöhten Expression des Chemokins CCL5. Dies ließ sich in Brust- und Lungenkarzinom-, Glioblastom- sowie Melanom- Zelllinien beobachten. In Brustkrebszellen zeigte sich, dass diese Regulation auf verstärkte Transkription, vermittelt durch ein ISRE innerhalb des CCL5 Promoters, zurückzuführen ist. Funktionell konnte die erhöhte CCL5 Produktion in HuR-defizienten Tumorsphäroiden in Verbindung mit verstärkter Infiltration von Monozyten/Makrophagen gebracht werden. Unterstützend zeigte sich auch bei einer in silico Analyse von Estrogenrezeptor-positiven Brusttumoren eine negative Korrelation zwischen HuR und CCL5, was mit einer entsprechend veränderten Makrophagensignatur einherging. Im Hinblick auf derzeit diskutierte Ansätze, das Wachstum von Tumoren mittels HuR Blockade zu inhibieren, sind meine Ergebnisse potenziell von therapeutischer Relevanz. Basierend auf meiner Arbeit sollte dabei in zukünftigen Studien näher untersucht werden, wie sich Inhibierung von HuR in Tumoren auf die Zusammensetzung und Funktion des Tumormikromilieus auswirkt und daraus resultierende Effekte auf das Tumorwachstum in Relation zu der allgemein wachstumsfördernden Rolle von HuR in Tumorzellen gesetzt werden.
Metabolites such as lactate and free fatty acids (FFAs) abundantly occur in high concentrations in tumor and stromal cells of solid malignancies. Their known functions comprise the allocation of nutrients and intermediates for the generation of cell components, the evasion of immune destruction, the induction of vessel formation and the stimulation of cell migration in order to promote tumor growth, progression and metastasis. However, the role of metabolites as signaling molecules and the downstream mechanisms of metabolite receptor mediated signaling in tumor and stromal cells is poorly understood. Our study confirms the expression of Hydroxycarboxylic acid receptor 1 (HCA1) in solid human breast tumors and the expression of Free fatty acid receptor 4 (FFA4) in solid human colorectal tumors. In addition, the expression of HCA1 in human breast cancer cell lines as well as the expression of FFA4 in human colorectal cancer cell lines was proved. Moreover, our research reveals the expression HCA2, FFA2 and FFA4 in tumor associated macrophages (TAMs).
To test whether the loss of any of the metabolite receptors affects tumor growth and progression we utilized a syngeneic Lewis lung cancer (LLC1) tumor model, an azoxymethane (AOM) – dextran sulfate (DSS) colorectal cancer model and a Mouse mammary tumor virus Polyoma Virus middle T antigen (MMTV-PyMT) breast cancer model. The loss of HCA2 did not lead to a changed outcome compared to wild type littermates in any of the models. Likewise, the deletion of FFA4 had no influence on the LLC1 model and, surprisingly, tumor number and area in the AOM-DSS model also remained unaltered. The impact of HCA1 deficiency was investigated utilizing the MMTV-PyMT model and revealed a moderately improved tumor growth. The absence of FFA2 did not affect tumor growth in the LLC1 model but led to an increased number of colorectal tumors in the AOM-DSS model while the tumor area remained unchanged. The most compelling results were obtained upon the deletion of FFA2 in the MMTV-PyMT model. Here, we demonstrate that the loss of FFA2 significantly reduces tumor latency and also significantly improves tumor growth. Nevertheless, the formation of metastases in the LLC1 model and the MMTV-PyMT model did not show any changes upon the loss of any of the metabolite receptors.
Together, our results describe a tumor-protective effect of FFA2 with an unclear impact on metastatic processes. Considerations about putative mechanisms of short chain fatty acid (SCFA) mediated FFA2 signaling suggest potential targets for pharmacological interventions to treat mammary tumors.
Leukotrienes (LTs) are pro-inflammatory lipid mediators that belong to the group of eicosanoids, which are oxygenated metabolites of one common precursor, the aracidonic acid (AA). This polyunsaturated fatty acid is esterified at the sn-2 position of cellular membrane phospholipids and can be released by cytosolic phospholipase A2 alpha (cPLA2alpha) enzymatic deacylation. AA can be converted into LTs by the catalytic reaction of 5-lipoxygenase (5-LO). Enzymatic activation of cPLA2alpha as well as of 5-LO is regulated by similar determinants. In response to cellular stimuli that elevate the intracellular Ca2+ level and/or activate MAP kinase pathways, cPLA2alpha and 5-LO comigrate from a soluble cell compartment (mainly the cytosol) to the nuclear membrane, where AA is released und converted into LTs. LTs play a significant role in promoting inflammatory reactions and immune processes. They have been shown to be released from leukocytes in response to bacterial and viral infections and substantially contribute to an effective immune reaction for host defense. Innate immune pathogen recognition is mediated to a substantial part by the Toll-like receptor (TLR) family. So far, 10 human TLR subtypes have been identified, all of which detect distinct highly conserved microbial structures and trigger the induction of signaling pathways that lead to the expression of numerous immune and inflammatory genes. TLR signaling culminates in the activation NF-kappaB and/or MAP kinases, which as well are known to be involved in the regulation of cellular LT biosynthesis. In this regard, it seemed conceivable that the release of LTs might be regulated by TLR activation. Present studies were undertaken in order to verify and characterize a possible influence of TLR activation on the LT biosynthesis, and furthermore to identify the involved signaling pathways and underlying mechanisms. First experiments revealed that pre-incubation of differentiated Mono Mac 6 (MM6) cells with a TLR4 ligand, a TLR5 ligand, as well as with different TLR2 ligands led to an about 2-fold enhancement of Ca2+ ionophore induced LT biosynthesis. Ligands of other TLR subtypes did not show any influence. These observations could also be confirmed in primary human monocytes stimulated with ionophore or fMLP. With focus on TLR2 ligands, further studies were carried out to characterize the observed enhancement of LT biosynthesis in MM6 cells. It was demonstrated that the extent of LT formation was dependent on the ligand concentration used, but was also dependent on the duration of pre-incubation. Ligand pre-incubation of 15 minutes was optimal to maximally enhance LT formation and further prolongation of pre-incubation decreased LT formation again. Moreover, simultaneous addition of TLR2 ligands with ionophore did also not enhance LT formation. These results indicated that TLR2 ligands seemed to prime human monocytes for an enhanced response upon ionophore stimulation, but did not act as costimuli, which per se were not capable of directly stimulating the biosynthesis of LTs. To analyze the underlying mechanism, the impact of TLR2 ligands on the two key enzymes of the LT biosynthesis pathway, cPLA2alpha and 5-LO, was investigated. In this regard, 5-LO could not been shown to be positively regulated by TLR ligand priming. Neither a direct stimulation, nor an enhancement of 5-LO activity by TLR ligands was detectable in MM6 cells. Similarly, TLR2 ligands did also not enhance ionophore induced 5-LO translocation to the nuclear membrane. However, it was shown that TLR2 ligands enhanced ionophore induced release of AA in MM6 cells, which occurred with a similar time course as LT formation, displaying a maximum at 10 minutes of pre-incubation. A direct stimulation of AA release, however, could not been detected. Inhibitor studies revealed cPLA2alpha to be essential for AA release in TLR2 ligand primed, ionophore stimulated MM6 cells, but also sPLA2 was found to be involved. However, the priming effect of TLR2 ligands was mediated exclusively by cPLA2alpha. Western Blot analyses revealed that p38 MAP kinase, as well as ERK1/2, are activated in MM6 cells in response to TLR2 ligands, and also Ser-505 phosphorylation of cPLA2alpha was detected, which is known to be mediated by MAP kinases and to increase cPLA2alpha activity in vitro. Maximal cPLA2alpha phosphorylation occurred after 5-10 minutes of TLR2 ligand incubation, slightly preceding maximal AA release at 10 minutes and maximal LT formation at 15 minutes of priming. The combined use of a specific p38 MAPK inhibitor with an inhibitor of the ERK1/2 signaling pathway resulted in a complete prevention of cPLA2alpha phosphorylation and TLR2 ligand mediated enhancement of AA release. Thus, both MAPK pathways seem to play a role for TLR2 ligand mediated priming effects on the release of AA. An impact of other kinases such as Mnk-1 and CamKII, which can also regulate cPLA2alpha by phosphorylation, was excluded. Finally, an anti-hTLR2 antibody significantly reduced enhanced AA release, confirming the priming effects to be dependent on TLR2 activation. In summary, it was concluded that the increase of LT biosynthesis by TLR2 ligand priming is considerably due to an enhanced cellular AA supply, which arises from a MAPK mediated phosphorylation and up-regulation of cPLA2alpha. TLR dependent enhancement of LT biosynthesis represents an interesting link between activation of innate immune receptors and the rapid formation of pro-inflammatory lipid mediators. On the one hand, this support the role of LTs in host defence and infectious diseases, but may also be relevant in pathophysiological processes, which involve TLRs as well as LTs, as it has been shown for the pathogenesis of atherosclerosis or allergic diseases.
Ubiquitylation is a three-step process, which results in the attachment of the small protein ubiquitin (Ub) to lysine residues on a substrate protein. SUMO proteins are ubiquitin (Ub)-related modifiers implicated in the regulation of gene transcription, cell cycle, DNA repair and protein localization. The molecular mechanisms by which the sumoylation of target proteins regulates diverse cellular functions remain poorly understood. During my PhD I isolated and characterized SUMO1 and SUMO2 binding motifs. Using Yeast Two Hybrid system, bioinformatics and NMR spectroscopy we defined a common SUMO-interacting motif (SIM) and map its binding surfaces on SUMO1 and SUMO2. This motif forms a β-strand that could bind in parallel or anti-parallel orientation to the β2-strand of SUMO due to the environment of the hydrophobic core. A negative charge imposed by a stretch of neighboring acidic amino acids and/or phosphorylated serine residues determines its specificity in binding to distinct SUMO paralogues and can modulate the spatial orientation of SUMO-SIM interactions. Mutation of the SUMO interacting motif of TTRAP (TRAFS and TNF receptor associated protein) influences both its localization and dynamic behaviour in living cells. Ubiquitin (Ub)-binding domains (UBDs) are key elements in conveying Ub-based cellular signals. UBD-containing proteins interact with ubiquitylated targets and control numerous biological processes including receptor trafficking, DNA repair, virus budding and gene transcription. They themselves undergo UBD-dependent monoubiquitylation, which promotes intramolecular binding of the UBD to the attached Ub and consequently leads to their functional inhibition. During the second part of my PhD I could show that, in contrast to the established ubiquitylation pathway, the presence of UBDs allows the monoubiquitylation of host protein independently of classical E3 ligases. UBDs of different types including UBA, UIM, UBM, NFZ and UBZ, can directly cooperate with E2 Ub-conjugating enzymes to promote monoubiquitylation of their host proteins. Using FRET technology I verified that the E2 enzyme and the substrate directly interact in cells. Moreover, UBD-containing proteins Stam2 and Sts2 promote self-ubiquitylation and not ubiquitylation of other targets or form polyUb chains from free Ub. Our study revealed a yet unappreciated role of E2 enzymes in ubiquitylation reactions of UBD containing proteins.