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Die Steriltestung der Blutprodukte zur Reduzierung des Übertragungsrisikos von Pathogenen stellt vor allem bei Thrombozytenkonzentraten ein wichtiges wissenschaftliches Interesse in der Transfusionsmedizin dar. In der vorliegenden Arbeit wurde ein synoptischer Vergleich sowohl von Apheresethrombozytenkonzentraten als auch von Pool-Thrombozytenkonzentraten bezüglich bakterieller Kontaminationen untersucht. Es konnte gezeigt werden, dass sich beide Thrombozytenprodukte hinsichtlich der bakteriellen Kontaminationsrate nicht unterscheiden und somit im Hinblick auf die Transmission von Bakterien als gleichwertig zu betrachten sind. In der vorliegenden Arbeit wurden zwei Kulturmethoden (BacT/ALERT und Pall eBDS) und eine Schnelltestmethode (Scansystem) miteinander hinsichtlich der analytischen Sensitivtät miteinander verglichen. Der Hauptnachteil der getesteten Schnelltestmethode (ScansystemTM) ist die geringere analytische Sensitivität und v. a. der Umstand, dass die Auswertung der Ergebnisse subjektiv und somit personenabhängig ist. BacT/ALERT überzeugt durch eine hohe analytische Sensitivität, basierend auf einem langen Untersuchungszeitraum von bis zu sieben Tagen. Auch Pall eBDS überzeugte mit einer hohen analytischen Sensitivität, ist aber ein Testsystem, welches ausschließlich für aerobe Bakterien geeignet ist. Dagegen wurden in der Studie überwiegend Anaerobier (>90%) gefunden. ScansystemTM fand aerobe und anaerobe Keime in einer sehr kurzen Testzeit von ca. 70 Minuten, hatte jedoch die niedrigste analytische Sensitivität. In der klinischen Anwendungsbeobachtung konnte kein Zusammenhang zwischen den aufgetretenen Symptomen und der Thrombozytentransfusion festgestellt werden. Da das bakterielle Restinfektionsrisiko bei Thrombozytenkonzentraten das Restrisiko für virale Infektionen übertrifft, wird empfohlen bestehende Testverfahren zu optimieren, bzw. alternative Methoden, wie die der Pathogeninaktivierung zu entwickeln.
Bei der Transplantation von hämatopoietischen Stamm- und Vorläuferzellen (HSC/HPC) spielt das koordinierte “Homing“ dieser Zellen in ihr Zielorgan eine wichtige Rolle. Es wurde ein in vitro System der Interaktion von HPC mit Endothel unter Flussbedingungen etabliert. Die Selektin- und Integrinvermittelten Schritte des Homings transplantierter hämatopoietischer Vorläuferzellen wurden analysiert. Das Homing-Verhalten repopulierender Stammzellen wurde nach Knochenmarktransplantation im kompetitiven Repopulationsmodell untersucht. Überraschend wurde eine sehr weite Verteilung der repopulierenden Stammzellen über verschiedene Gewebe und Organe gemessen. P- und E-Selektin wurden als Schlüsselregulatoren für die Interaktion von AML-Blasten mit Endothelzellen identifiziert. Weiterhin zeigte sich, dass Plättchen-Mikropartikel (PMP) einen potenten Stimulus zur Verhinderung der Adhäsion von HPC an Endothel unter Flussbedingungen darstellen. Die Daten bilden die Grundlage für Studien zur Aufklärung von Signalwegen, die HSC bei ihrer Interaktion mit Endothelzellen während wichtiger Krankheitsprozesse spielen.
Der Mangel von Faktor VIII (FVIII) führt zur häufigsten Gerinnungsstörung, der Hämophilie A. Die rekombinante Expression von FVIII für gentherapeutische Ansätze oder zur Herstellung von FVIII ist zwei bis drei Größenordnungen niedriger verglichen mit anderen Proteinen vergleichbarer Größe. Die Ursachen für die geringe Expression liegen zum großen Teil an der ineffizienten Transkription und dem ineffizientem intrazellulären Transport. (1) Im Rahmen der Untersuchung der FVIII-Sekretion, konnte durch Verwendung von FVIII-GFP Fusionsproteinen zum ersten Mal gezeigt werden, wie FVIII in lebenden Zellen transportiert wird. Außerdem wurde anhand von vergleichenden Immunfluoreszensfärbungen, FVIII-Messungen und Westernblotanalysen demonstriert, dass weder bei der B-Domäne deletierten noch bei der Volllängenvariante signifikante Unterschiede zwischen den GFP-fusionierten und Wildtyp-FVIII-Varianten messbar waren. Offensichtlich wird die Funktionalität von FVIII durch die C-terminal fusionierte GFP-Domäne nicht eingeschränkt. In ersten Lebendzellanalysen konnte gezeigt werden, dass sich FVIII in primären Zellen und Zelllinien hauptsächlich im ER befindet und eine für lumenale ER-Proteine charakteristischen Mobilität aufweist. Beim frühen sekretorischen Transport zeigte sich bei Temperaturblock-Experimenten eine verlängerte Dauer der Akkumulation in ER-Exit-Sites und eine vergleichsweise niedrige Frequenz von ER-Golgi-Bewegungen. Es konnte zum ersten Mal der Nachweis von FVIII-Transport durch vesikuläre tubuläre Cluster erbracht werden. Die Ergebnisse deuten darauf hin, dass der möglicherweise durch Faltungsprobleme blockierte Austritt aus dem ER das Hauptproblem des ineffizienten FVIII-Transports zu sein scheint und weniger der intrazelluläre Transport an sich. Mittels siRNA-Silencing wurde außerdem die überwiegende Beteiligung von COPI am intrazellulären Transport von FVIII deutlich, dessen Herunterregulierung zu einer 78 prozentigen Reduktion der FVIII-Sekretion im Gegensatz zu 32 Prozent bei COPII führte. Dagegen konnte durch Herunterregulierung der Expression der p24-Cargo-Rezeptor Familienmitglieder p24 und p26 und der Clathrin Adapterproteine µ- und -Adaptin bzw. durch physiologischen Knock-out im Falle von ER-Exit-Rezeptor MCFD2 kein Einfluß auf die FVIII-Sekretion festgestellt werden. (2) Als Alternative zu dem ineffizienten FVIII-Expressionsystem in unphysiologischen Zelllinien, bieten primäre Endothelzellen den Vorteil einer hocheffizienten FVIII-Sekretion. Zur Verwendung bei der rekombinanten Produktion benötigt man allerdings eine kontinuierlich wachsende gut charakterisierte Zelllinie. Zur Immortalisierung wurden aus Nabelschnurblut gewonnene Endothelprogenitorzellen mit der aktiven Untereinheit der humanen Telomerase (hTERT) transduziert. Trotz erfolgreicher Transduktion und langfristiger Expression von hTERT, welche im TRAP-Assay normale Aktivität zeigte, gingen die Zellen nach der natürlichen Teilungsspanne in die Seneszenz über. Möglicherweise wird noch ein weiteres Immortalisierungsgen benötigt oder hTERT ist durch die ektopischen Expression in diesen Endothelzellen nicht funktionell. (3) Der Einsatz hämatopoetischer Stammzellen für gentherapeutische Ansätze zur Expression von humanen FVIII ist bislang aufgrund niedriger Expressionseffizienz der Vektoren limitiert. Es wurden daher die Kombinationen verschiedener transkriptioneller und posttranskriptioneller Elemente in FVIII-Expressionsvektoren ausgetestet. Hierbei zeigte sich, dass die Verwendung einer 5’ untranslatierten Region (5’UTR) des hämatopoetisch exprimierten FXIIIA-Gens die FVIII-Sekretion in verschiedenen Zelllinien und primären Zellen deutlich steigerte. Am stärksten war die Wirkung in primären Monozyten, in denen die FVIII-Expression den 6fachen Wert im Vergleich zum Ursprungsvektor ohne 5’UTR erreichte. Leberzellen stellen weitere attraktive Zielzellen für gentherapeutische Ansätze dar, da Sie den primären physiologischen Ort der FVIII-Synthese darstellen. Die häufig für Gentherapievektoren verwendeten ubiquitär exprimierenden viralen Promotoren bewirken zwar hohe Expression in den transduzierten Zellen, haben allerdings den Nachteil durch ektopische Expression vermehrt Immunantworten auszulösen und durch starke Interaktion mit benachbarten Promotoren der Integrationsstelle im Genom möglicherweise tumorgene Effekte zu verursachen. Bei der Untersuchung verschiedener physiologischer Promotoren im Vergleich zum viralen CMV Promotor in Leberzellen konnte mit dem zum ersten mal getesteten minimalen FVIII-Promoter in einem lentiviralen Vektor der dritten Generation in Leberzelllinien eine vergleichsweise hohe Expression von 0,5 IU/ml FVIII /106 Zellen erzielt werden. Der FVIII-Promoter ist daher geeignet für eine lebergerichtete Expression und minimiert dabei das potentielle Risiko der häufig verwendeten ubiquitären viralen Promotoren.
Die Aufgabe der vorliegenden Arbeit war die Fragestellung zu untersuchen, ob die immunmagnetische Selektion mittels des Magnetic Absorbens Cell Sorter (MACS) im klinischen Maßstab möglich ist. Zum Zeitpunkt der Erstellung dieser Arbeit befand sich lediglich die Stammzellselektion mittels des CD34+Antigens im klinischen Einsatz. In dieser Arbeit wird der Einsatz von CD133+Antikörpern zur immunmagnetischen Stammzellselektion, der Einsatz von CD56+Antikörpern zur NK-Zell-Selektion und der Einsatz von GD2-Antikörpern zur Depletion von Neuroblastomzellen untersucht. 1. CD133 ist ein Stammzellmarker der auf frühen hämatopoetischen Stammzellen vorkommt, auch werden Leukämien beschrieben, die zwar CD34 positiv, jedoch CD133 negativ sind. Ein großer Teil der Versuche zur CD133+ immunmagnetischen Selektion wurde mit kyrokonservierten Pherisaten durchgeführt. Dazu musste eine Methode gefunden werden solche Pherisate zu selektionieren. Nach einer Auftrennung der Pherisate mittels Ficoll- Dichtegradient war dies möglich. Hier konnte eine Reinheit der CD34+Stammzellen im Median von 71,7%( Range 28,5-76,7%, n=5) bei kyrokonservierten Pherisaten verglichen mit 97,5% (96,6% und 98,5%, n=2) bei frischen Pherisaten erreicht werden. Die Recovery der Stammzellen war bei kyrokonservierten Präparaten jedoch deutlich schlechter[Median 20,7% nach CD133+Selektion und 34,8% nach CD34+Selektion kyrokonservierte Pherisate versus 48,9% nach CD133+Selektion und 77,95% nach CD34+Selektion bei einem frischen Pherisaten]. Zum direkten Vergleich wurden jeweils Parallelansätze der Selektion mit CD34+ und CD133+ Antikörper und zweimaliger Immunmagnetischer Selektion durch den MACS durchgeführt: Die dabei erzielten Reinheiten CD34+Stammzellen waren mit 85% (Range 71,7-98,5, n=5) nach D34+Selektion und 89,5% (Range 79,8-98%, n=5) nach CD133 Selektion vergleichbar, bei frischen Pherisaten lagen diese sogar bei 97,5% beziehungsweise 95,1%. Damit konnte gezeigt werden, dass es möglich ist, mittels des CD133+-Antikörpers Stammzellen in ausreichender Reinheit zu selektionieren. Die Recovery der CD34+Stammzellen lag nach CD133+Selektion bei ca. 60% der Stammzellen die durch CD34+ Selektion angereichert werden konnten. Dies war insofern zu erwarten da nur ca. 60% der CD34+Stammzellen auch CD133+ sind. 2. Die immunmagnetische Selektion von NK-Zellen wurde durch Markierung mit CD56+Antikörpern durchgeführt. Dabei wurde nach Anreicherung eine durchschnittliche Reinheit von 62,3% (Range 41,2-85,6%, n=3) erzielt. Im klinischen Einsatz sollte der Anteil der CD3+-Zellen möglichst gering sein. Durch Selektion mit CD56+Antikörper konnte der Anteil an CD3+ T-Zellen auf <104 CD3+ TZellen/ 108 NK-Zellen gesenkt werden. Durch eine immunmagnetische Depletion mit einem CD3+Antikörper konnte dieser Anteil weiter auf ca.103 T-Zellen/108NK-Zellen und damit um den log-2,4 gesenkt werden. Die Recovery der NK-Zellen zeigte in unseren Versuchen eine große Varianz[6,9%-89,5% ohne T-Zelldepletion; 6,6-60,6% nach T-Zelldepletion]. 3. Zur Depletion von Neuroblastomzellen anhand des GD2-Antigens wurde eine indirekte Markierung über einem chimären Human/Maus ch14.18􀂨CH2 GD2+ FITC markierten durchflusszytometrischen Antikörper und einem spezifischen immunmagnetische Antikörper gegen diesen Antikörper gewählt. Damit konnte der Anteil von 1,1% GD2+Zellen in der Ausgangsprobe auf 0,1% gesenkt werden. Die Reinheit der angereicherten Tumorzellen betrug 82,9%. Zusammenfassend konnte durch diese Arbeit gezeigt werden, dass es möglich ist durch immunmagnetische Techniken CD133+Stammzellen und CD56+NK-Zellen in hoher Reinheit anzureichern, sowie Neuroblastomzellen durch GD2+Antikörper aus einer Probe zu depletieren. Dies eröffnet eine Vielzahl neuer therapeutischer Ansätze zur Behandlung maligner Erkrankung im Kindesalter.
Einleitung: Eine mehrtägige präoperative Einnahmepause von Thrombozytenaggregationshemmern, zu denen die weit verbreitete Acetylsalicylsäure (ASS) als auch die Thienopyridine (Clopidogrel, Ticlopidin) gehören, ist zur Minimierung des perioperativen Blutungsrisikos erwünscht, wird aber häufig nicht eingehalten. Patienten und Methoden: Im Krankenhaus Nordwest, Frankfurt, wurden an 123 urologischen Patienten nach Einnahme von ASS undIoder Thienopyridinen präoperativ die Arachidonsäure(AA)- und ADP-induzierte Thrombozytenaggregation (Methode nach Born) und die Blutungszeit (modifizierte Methode nach Mielke) durchgeführt und im Hinblick auf die Erkennung einer klinisch relevanten Thrombozytenfunktionsstörung mit erhöhtem Blutungsrisiko miteinander verglichen. Als Kontrollgruppe dienten 71 urologische Patienten ohne präoperative Einnahme von Thrombozytenaggregationshemmern. Ergebnisse: An 96 operierten und zusätzlich 49 nicht operierten Patienten, die ASS eingenommen hatten, wurde der Zusammenhang zwischen Testergebnissen und zeitlichem Abstand zur ASS-Einnahme untersucht: Eine ASS-bedingte Thrombozytenfunktionsstörung lässt sich nur anhand der AA-induzierten Thrombozytenaggregation zuverlässig erkennen, welche noch vier Tage nach ASS-Einnahme signifikant vermindert ist und deutlich außerhalb des Referenzbereichs liegt. Eine geringfügig verlängerte Blutungszeit und verminderte ADP-induzierte Aggregation sind nach ASS-Einnahme zwar kurzzeitig nachweisbar, die Messwerte befinden sich im Mittel jedoch innerhalb der Referenzbereiche. An allen operierten Patienten nach ASS- oder Thienopyridin-Einnahme wurde der Zusammenhang zwischen Testergebnissen und dem Auftreten verstärkter Blutungen untersucht. Als Kriterien für den intraoperativen Blutverlust wurden hierbei Hb-Abfall, Anzahl der transfundierten Erythrozytenkonzentrate und Beurteilung der Blutungsstärke durch den Operateur herangezogen. Sowohl für die AA- und ADP-induzierte Aggregometrie als auch für die Blutungszeit gilt: Nach pathologischem Testergebnis traten keine stärkeren intraoperativen Blutungen auf als nach normalem Ergebnis. Nicht eingeschlossen waren jedoch Patienten mit Blutungszeiten über 8 Minuten (n = 11) , da diese nach Entscheidung der Urologen aus ethisch-rechtlichen Gründen nicht sofort operiert wurden. Unter Einbezug dieser Patienten ist ein nachweisbarer Zusammenhang zwischen Testergebnis und intraoperativer Blutung nicht völlig auszuschließen. Ungeachtet der präoperativen Testergebnisse konnten bei Patienten nach Einnahme von Thrombozytenaggregationshemmern gegenüber dem Kontrollkollektiv keine stärkeren intraoperativen Blutungen nachgewiesen werden. Auch ein Zusammenhang zwischen dem zeitlichen Abstand zur letzten ASS-Einnahme und dem intraoperativen Blutverlust bestand nicht. Mit der bereits erwähnten Einschränkung (Ausschluss von 11 Patienten mit Blutungszeiten über 8 Minuten) ist anhand der vorliegenden Daten nicht mit einem erhöhten intraoperativen Blutungsrisiko nach kurzzeitig zurückliegender Einnahme von Thrombozytenaggregationshemmern zu rechnen. Schlussfolgerungen: Eine medikamentenbedingte Thrombozytopathie - im Vergleich der drei Testmethoden am ehesten anhand der AA-induzierten Thrombozytenaggregation erkennbar - ist nicht von klinischer Relevanz im Sinne eines erhöhten perioperativen Blutungsrisikos. Ohne einen weiteren Hinweis auf ein erhöhtes Blutungsrisiko erscheint daher in Ermangelung eines Goldstandards weder der präoperative Einsatz von Thrombozytenfunktionstests noch das Verschieben einer Operation zwingend notwendig.
Natürliche Killerzell-vermittelte Zytolyse wird aktiviert und inhibiert durch die Interaktion mit bestimmten HLA-Klasse-I-Molekülen auf Zielzellen mit spezifischen immunoglobulinartigen Rezeptoren (KIRs) auf NK-Zellen. KIRs sind hochgradig polymorph und werden klonal auf NK-Zellpopulationen innerhalb des Individuums verteilt. Bis jetzt ist die Regulation der KIR-Expression durch individuelle HLA-Klasse-I-Moleküle noch nicht ausreichend verstanden. Um den möglichen Einfluss von HLA-Klasse-I-Phänotypen auf KIR-Verteilungsmuster zu verstehen, untersuchte ich die KIR-Verteilung in Individuen, die nach ihren Haupt HLA-C kodierten KIR-Epitopen (Gruppe C1 gegen Gruppe C2) unterteilt wurden. In dieser Dissertation untersuchte ich 99 hessische Blutspender und fand 8 Haplotypen (B5, B7, B8, B13, B14, B19, B21), die bisher nicht in Untersuchungen von deutschen Populationen beschrieben worden sind. In diesen Individuen wurden NK-Zellen nach ihrer KIR-Verteilung mittels Durchflusszytometrie und RNA basierter Expressions-Analyse untersucht. Die Resultate zeigen, dass KIR-Gene sehr ungleichmäßig verteilt werden mit zwei Hauptverteilungsmustern von KIR-Genotypen, die bereits als Gruppe A und Gruppe B (mit 21 verschiedenen Genotypen) beschrieben worden sind. Es gibt verschiedene Populationen, unterschiedlich stark CD158a und/ oder CD158b exprimierender NK-Zellen, die in allen Individuen koexistieren. Eine klare Korrelation zwischen KIR-Expression und zurzeit bekannten HLA-Klasse-I-Liganden wurde nicht beobachtet. Dies lässt den Schluss zu, dass die Oberflächenexpression von KIRs in Individuen mit unterschiedlichen HLAKlasse-I-Genotypen von anderen, nicht HLA-Klasse-I-kodierten Faktoren für die Ausprägung des KIR-Repertoires mitverantwortlich ist. Es scheint, dass hauptsächlich der KIR-Genotyp für die Ausprägung des KIR-Repertoires verantwortlich ist und dass lediglich die Anzahl der KIR-exprimierenden Zellen durch die spezifischen HLA-Liganden beeinflusst wird. Die molekularen und zellulären Faktoren einer KIR-Expression sind zum größten Teil unklar. Im Prinzip wird das exprimierte KIR-Repertoire von den kodierenden Genen bestimmt, wobei jedoch andere Faktoren angenommen werden, da Individuen mit identischen KIR-Phänotypen Variationen der Verteilung von peripheren NK-Zellen zeigen, die bestimmte KIRs exprimieren. Die Oberflächenexpression von KIRs bei bestimmten Individuen mit unterschiedlichen HLA-Klasse-I-Phänotypen in dieser Studie lässt vermuten, dass andere, als die beschriebenen HLA-Klasse-I-Phänotypen, möglicherweise als Liganden für KIRs dienen. Wie im Falle der Krankheitsentwicklung von HIV zu AIDS haben diese Faktoren einen enormen Einfluss und bieten, wenn sie näher charakterisiert werden können, unter Umständen die Möglichkeit eines neuen Behandlungsansatzes.
Die HIV-Infizierung von Zellkulturen in vitro ist essentiell für das Verstehen der Kinetik der Virusreplikation, für die Aufdeckung von Resistenzentwicklungen gegenüber antiretroviraler Medikamente und für die Entwicklung neuer antiretroviraler Therapiestrategien. Voraussetzung hierfür ist ein geeignetes Monitoring der HIV-Infektion von in vitro infizierten Zellen. Die vorliegende Arbeit beschäftigt sich mit dem Monitoring der HIV-Replikation von in vitro infizierten Zellen mittels der Real-Time TaqMan™ PCR. Die Ergebnisse der Real-Time TaqMan™ PCR wurden mit denen eines p24 ELISAs verglichen. Der p24 ELISA diente als etablierte Standardmethode zum Monitoring einer in vitro HIV-Infektion. HUT 78-Zellen wurden in vitro mit vier unterschiedlichen HIV-1 IIIb Infektionsdosen (MOI 0,05; MOI 0,01; MOI 0,002; MOI 0,0005) infiziert. Mittels der Real-Time TaqMan™ PCR wurde die HIV-1 gag cDNA quantifiziert. Mittels ELISA erfolgte die Quantifizierung des HIV-p24. Zusätzlich dazu wurde die Anzahl an proviralen HIV-1 Transkripten in den Zellkulturen mittels der TaqMan™ PCR quantifiziert. Die Quantifizierung der HIV-1 gag cDNA und des p24 ergaben nahezu identische Kurvenverläufe der Infektionskinetiken. Beide Nachweismethoden zeigten vergleichbare Daten bezüglich des exponentiellen Ansteigens und der sich daran anschließenden Plateauphase der HIV-Replikation. Die Sensitivität beider Nachweismethoden war ebenfalls vergleichbar. Ein großer Unterschied lag in den Messbereichen beider Methoden. Bei der Real-Time TaqMan™ PCR konnte eine Linearität über 7 log-Stufen
demonstriert werden. Dies hatte den Vorteil, dass die Zellkulturproben vor der Quantifizierung der HIV-1 gag cDNA nicht verdünnt werden mussten. Im Gegensatz dazu war der Messbereich des HIV-p24 ELISAs sehr eng und erforderte in den meisten Fällen eine Verdünnung der Messproben. Bezüglich des Arbeitsaufwandes und der aufkommenden Kosten ergaben sich für die Quantifizierung der HIV-1 gag cDNA mittels der Real-Time TaqMan ™ und für die Quantifizierung des p24 mittels ELISA nahezu identische Werte. Der Verlauf der Werte an proviralen HIV-1 Transkripten ähnelt dem der HIV-1 gag cDNA Kinetik. Mittels der Quantifizierung der proviralen HIV-1 Kopien kann jedoch keine Aussage über die HIV-Replikation getroffen werden. Abschließend ist zu sagen, dass die Real-Time TaqMan™ PCR eine zuverlässige und sensitive Methode ist, eine HIV-1 Replikation von in vitro infizierten Zellen zu quantifizieren und den Replikationsverlauf zu beschreiben. Die Real-Time TaqMan™ PCR stellt eine alternative Methode zum HIV-p24 ELISA dar, um eine in vitro HIV-Replikation zu dokumentieren.