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Lichtgesteuerte Channelrhodopsine (ChR) haben im letzten Jahrzehnt neue Wege zur Untersuchung neurophysiologischer Zusammenhänge eröffnet. Die ersten grundlegenden Charakterisierungen von Channelrhodpsin-1 und Channelrhodopsin-2 (ChR-1 und ChR-2) zeigten bereits die hohe Selektivität dieser Ionenkanäle für Protonen gegenüber monovalenten und divalenten Kationen und veranschaulichten die Dominanz der einwärtsgerichteten gegenüber den auswärtsgerichteten Kationenströmen durch die Kanalpore (Einwärtsgleichrichtung) (Nagel et al., 2002; Nagel et al., 2003). Nach Expression von Channelrhodopsin können erregbare Zellen mit einem Ruhepotential von -60 mV durch Licht depolarisiert und Aktionspotentiale (AP’s) ausgelöst werden (Boyden et al., 2005; Li et al., 2005; Nagel et al., 2005b). Aufgrund der Einwärtsgleichrichtung von ChR nehmen die lichtaktivierten Ströme mit zunehmender Depolarisation ab, sodass die vollständige Ausbildung des AP’s nicht gestört wird. Dadurch wird ChR zu einem optimalen optogenetischen Werkzeug. Dennoch ist die Einwärtsgleichrichtung bisher wenig detailliert charakterisiert. Auch die zugrunde liegenden Mechanismen sind nicht genau bekannt. Im Rahmen dieser Arbeit konnte anhand von Patch-Clamp Messungen gezeigt werden, dass zwei Mechanismen die Rektifizierung des Kanalstroms durch ChR-2 hervorrufen: eine Spannungsabhängigkeit der Einzelkanalleitfähigkeit und eine Spannungsabhängigkeit der Offenwahrscheinlichkeit. Die Spannungsabhängigkeit der Einzelkanalleitfähigkeit ist von der Art der geleiteten Ionen abhängig und konnte experimentell über die Unterschiede der stationären IV-Kurve für H+ und Na+ bei symmetrischen Ionenkonzentrationen bewiesen werden. Des Weiteren wurden die Resultate für unterschiedliche Ionenbedingungen anhand eines Ionenbindungsmodells mit einem „3-Barrieren 2-Bindungsstellen“ Profil für die Kanalpore simuliert. Die Spannungsabhängigkeit der Offenwahrscheinlichkeit ist an eine Lichtadaption des ChR-2 Proteins gekoppelt. Diese Lichtadaption konnte mithilfe von repetitiven Messungen, d.h. Strommessungen mit mehrfachen kurzen Lichtblitzen (10 ns), gezeigt werden. Da die Lichtadaption wie auch die Kanalkinetik stark vom pH abhängig sind, ist anzunehmen, dass mechanistisch wichtige De- und Reprotonierungsreaktionen mit diesen Prozessen einhergehen. Ferner konnte über die Untersuchung der elektrophysiologischen Eigenschaften der ChR-2 Mutante E90A eine Region im Protein identifiziert werden, die höchstwahrscheinlich am Protonentransport durch die Kanalpore beteiligt ist. Die Mutante E90A wies eine verringerte Protonenleitfähigkeit und eine natriumabhängige Blockierung der lichtaktivierten Ströme bei niedrigem extrazellulären pH auf. Doppelbelichtungsexperimente mit gelbem oder kurzwelligem blauen Licht ergaben außerdem neue Hinweise auf die Identität einiger Intermediate des Photozyklus. Die vorgestellten Ergebnisse weisen darauf hin, dass die bisher beschriebene „lichtadaptierte“ Form, die als P480 Intermediat bezeichnet wird, eher einem P520 Intermediat entspricht. Außerdem konnte im Rahmen dieser Arbeit eine funktionelle Beteiligung des Intermediats P390, in dem die Schiff Base deprotoniert ist, am Photostrom von ChR-2 im Wildtyp-Protein gezeigt werden. Diese Beteiligung ist bisher nur für ChR-2 Mutanten bekannt (Bamann et al., 2010). Neben der Untersuchung der Kanaleigenschaften von ChR-2 wurde in dieser Arbeit auch der Frage nachgegangen, ob an den Photozyklus von ChR-2 eine vektorielle Protonenverschiebung über der Membran gekoppelt ist. Mithilfe der BLM-Technik und Patch-Clamp Messungen an elektrofusionierten HEK-293 Zellen (Zimmermann et al., 2006) konnte gezeigt werden, dass auch ohne elektrochemische Triebkraft lichtaktivierte Ströme (Pumpströme) zu beobachten sind, die einer vektoriellen Protonenverschiebung von 0,2 - 0,4 Ladungen pro Photozyklus entsprechen. Die Doppelbelichtungsexperimente und der vektorielle Protonentransport geben einen Einblick in den Zusammenhang zwischen Photozyklus und den funktionalen Zuständen des Kanals. Die Ergebnisse zeigen das komplexe Geflecht zwischen Spannungsabhängigkeit, der Kinetik und den offenen Zuständen und wurden in einem Modell zusammengefasst. Weiterhin wurde in dieser Arbeit eine stabile Zelllinie für die Expression von ChR-1 etabliert, die eine genauere Charakterisierung dieses Proteins möglich macht. Es konnte gezeigt werden, dass ChR-1 ebenso wie ChR-2 eine Kationenleitfähigkeit besitzt. Aus zeitaufgelösten Messungen wurde außerdem ermittelt, dass ChR-1 gegenüber ChR-2 eine verkürzte Zykluszeit besitzt. Die verkürzte Zykluszeit von ChR-1, die zu kleineren Gesamtstromamplituden im Vergleich zu ChR-2 führt und die vergleichsweise geringere Expression, v.a. in transienten Expressionssystemen, limitiert dessen neurophysiologische Anwendung. Zusammenfassend stellt die vorliegende Dissertation eine detaillierte biophysikalische Charakterisierung von Channelrhodopsinen dar, die neue Erkenntnisse über die mechanistische Kopplung der Kanalfunktion an den Photozyklus hervorbringt. Zudem kann sie eine Grundlage für die gezielte Suche nach Channelrhodopsin Mutanten bieten, deren Kinetik oder analeigenschaften für die neurophysiologische Anwendung optimiert sind.
Die vorliegende Arbeit befasste sich in erster Linie mit der Regulation des P2X2 Rezeptors (P2X2R) durch Phosphoinositide (PI). P2X Rezeptoren sind durch extrazelluläres ATP aktivierte Kationenkanäle, die ubiquitär unter Vertebraten, v. a. im zentralen wie peripheren Nervensystem exprimiert werden. Bis heute sind 7 verschiedene Untereinheiten dieser Rezeptorfamilie bekannt, die nach homo- oder heterotrimerer Assemblierung unterschiedliche funktionelle Phänotypen ausbilden. Die P2X Rezeptoren sind an einer Vielzahl von physiologischen und pathophysiologischen Prozessen beteiligt. Für ihre Beteiligung am zellulären Signalgeschehen wurde in der Vergangenheit der Begriff der purinergen Signaltransduktion geprägt. PI4,5P2 ist ein zelluläres, an der Innenseite der Plasmamembran verankertes Phospholipid, dem zahlreiche, essentielle Funktionen zukommen. Dass es auch Signalfunktion besitzen kann, wurde erst spät (1980) bekannt; dass es darüber hinaus zudem membranäre Transportsysteme reguliert, konnte erst in den letzten Jahren gezeigt werden. Die ersten Kanäle, für die eine Phosphoniositid (PI)-Beeinflussung nachgewiesen wurde, waren die einwärts gleichrichtenden K+-Kanäle. 2006 wurden die ersten vorläufigen Hinweise publiziert, dass auch die Kanalfunktion der P2X Rezeptoren durch Phosphoinositide beeinflusst werden kann. Darauf aufbauend wurde in der vorliegenden Arbeit der P2X2R nach Expression in Xenopus Oozyten elektrophysiologisch auf eine mögliche Regulation durch PIPns untersucht. Um die in der Oozyte vorliegenden PI-Level gezielt während der Messung ändern zu können, wurde die spannungsgesteuerte Phosphoinositid-Phosphatase Ci-VSP coexprimiert. Ci-VSP, die der PTEN-Phosphatase strukturell sehr ähnlich ist, wurde 2005 aus der Schlauchascidie Ciona intestinalis kloniert. In der veröffentlichten Klonierungsarbeit wurde bereits gezeigt, dass Ci-VSP in der Lage ist, bekannte PI4,5P2-sensitive Membrankanäle, wie z. B. bestimmte K+-Kanäle, spannungsabhängig zu inhibieren. Es konnte in TEVC-Experimenten gezeigt werden, dass die durch Depolarisation induzierte Aktivierung dieser Phosphatase den P2X2 Rezeptorstrom in seiner Desensibilisierung sowohl beschleunigt als auch verstärkt. Dieser Effekt war spannungsabhängig und nahm mit höherer Depolarisation zu. Die ermittelte Spannungsabhängigkeit stimmte dabei mit dem sensitiven Potentialbereich der spannungsgesteuerten Ci-VSP-Domäne, gemessen an ihren gating-Strömen, überein. Der „Ci-VSP-Effekt“ auf den P2X Rezeptor konnte nur in Anwesenheit von ATP, d.h. bei aktiviertem Rezeptor, beobachtet werden. Wurden die Oozyten mit Wortmannin, einem PI4-Kinase(PI4K)-Inhibitor, behandelt, zeigte sich eine vergleichbare Veränderung des Rezeptorstroms. Eine PI4K-Inhibition zielt demnach offensichtlich auf die gleichen Regulationsmechanismen wie die Ci-VSP-Aktivierung. In weiterführenden zellfreien Patch Clamp-Messungen an Oozytenmembranen wurden sowohl Einzelkanal- als auch makroskopische Ströme des P2X2R unter Einfluss verschiedener, intrazellulär verabreichter PIs und PI-beeinflussender Enzyme untersucht. Einzig die Zugabe von PI4,5P2 hatte einen deutlich aktivierenden Einfluss auf den makroskopischen Rezeptorstrom, andere getestete PIs (wie auch PI3-Kinase und PTEN-Phosphatase) zeigten keinerlei Wirkung. Vergleichbare Ergebnisse konnten in vorläufigen Einzelkanal-Messungen an diesem Rezeptor Subtyp beobachtet werden. Da die PI4-Kinase offensichtlich an der beobachteten Beeinflussung der P2X2R Desensibilisierung beteiligt ist, wurde die P2X2-Rezeptorsequenz auf potentielle - über sogenannte SH3-Epitope vermittelte - PI4K-Interaktionsbereiche hin untersucht. Diese SH3-Epitope kommen in vielen zellulären Proteinen vor, um Protein-Protein-Interaktionen zu vermitteln. Nach Sequenzanalyse des maßgeblich am Desensibilisierungsgeschehen beteiligten C-Terminus des P2X2R konnte im distalen Teil ein SH3-Bindungsmotiv lokalisiert werden, das daraufhin durch gerichtete Mutagenese (P2X2-P451A/P454A) unwirksam gemacht wurde. Dieser mutierte Rezeptor verhielt sich in seiner Desensibilisierung wie der Wildtyp nach Wortmannin-Behandlung, zeigte also eine intrinsisch verstärkte Desensibilisierung. Eine Wortmannin-Behandlung der Oozyten, die den mutierten Rezeptor exprimierten, führte hingegen zu keiner weiteren Beeinflussung des Rezeptorstroms. Somit konnte letztlich der Schluss gezogen werden, dass die PI4K, und das mit ihr in direkter Verbindung stehende PI4,5P2, einen maßgeblichen Einfluss auf das Desensibilisierungsverhalten des P2X2R hat. Auf Basis der erarbeiteten Befunde wurde ein kinetisches Reaktionsmodell des P2X2R erstellt, das bisher aufgestellte Modelle mit den Ergebnissen dieser Arbeit vereint, aber auch in teilweisem Gegensatz zu dem von FUJIWARA & KUBO [2006] steht. Des Weiteren wurde im Verlauf dieser Arbeit die reversible Inhibition des P2X2R durch eine Reihe von Aminoglykosid-Antibiotika untersucht. Durch Analyse der Dosis-Wirkungs-Beziehungen, der Spannungs- sowie wie ATP-Konzentrations-Abhängigkeit der Inhibition konnte gezeigt werden, dass es sich dabei um einen nicht-kompetitiven open pore block handelte. Durch weiterführende Untersuchungen an einer nicht-desensibilisierenden P2X2/1 Rezeptorchimäre wurde gezeigt, dass eine Aminoglykosid-Inhibition die ATP-Dissoziation von der Rezeptorbindungsstelle signifikant verlangsamte. Dieser Befund deutet auf eine im Vergleich zum geschlossenen Zustand erhöhte Affinität des offenen Zustands für ATP hin. Neben den hier untersuchten Aminglykosiden sind bislang keine weiteren Substanzklassen bekannt, die den P2X2R durch einen derartigen Mechanismus hemmen.
Ionenkanäle bilden therapeutische Schlüsselstellen für viele Erkrankungen und sind daher vor allem für die pharmakologische und medizinische Forschung von herausragender Bedeutung. Der Forschungsbedarf ist enorm und dementsprechend groß auch die Nachfrage nach elektrophysiologischen Systemen, die eine Analyse von Ionenkanälen und/oder Wirkstoffen im Hochdurchsatz erlauben. Derzeitige Hochdurchsatzsysteme basieren zumeist auf modifizierten Patch-Clamp-Verfahren, weisen aber im Vergleich zu manuellen Patch-Clamp-Systemen noch einige Nachteile auf. In der vorliegenden Arbeit wurde daher im Rahmen eines vom Bundesministerium für Bildung und Forschung geförderten BioChancePlus-Projektes eine alternative Methode, die Fakir-Methode, entwickelt und ihre Einsatzmöglichkeit in Hochdurchsatzsystemen evaluiert. Bei der Fakir-Methode werden Zellen in einem inhomogenen, elektrischen Wechselfeld mit Hilfe dielektrophoretischer Kräfte zu Metallnanoelektroden hin beschleunigt, aufgrund ihrer Bewegungsenergie von letzteren penetriert und dadurch elektrisch kontaktiert. Dies ermöglicht die anschließende, intrazelluläre Messung in physiologischer Lösung. Im Vergleich zur Patch-Clamp-Methode hat die Fakir-Methode die Vorteile, dass das Zytoplasma der Zelle erhalten bleibt und dass mit einer geringen Zelldichte gearbeitet werden kann. Auf der anderen Seite polarisiert die Elektrode schnell und die genaue, intrazelluläre Zusammensetzung während der Messung ist nicht bekannt. Für die Realisierung der Fakir-Methode im Experiment wurde eine Mikrofluidikkammer mit austauschbaren Metallmikro- und Metallnanoelektroden- Chips entwickelt, die die mikroskopische Beobachtung des Kontaktierungsprozesses ermöglichte. Die Charakterisierung der Elektroden erfolgte sowohl durch Potentialmessungen als auch mit Hilfe von Impedanzspektroskopie. Um die dielektrophoretische Attraktion von Zellen genauer steuern zu können, wurde zudem ein Amplitudenmodulator entwickelt. Zellen konnten sowohl einzeln, als auch in Gruppen kontaktiert werden. Intrazelluläre Potentialmessungen von HEK293-Zellen, die den blaulichtgesteuerten Kationenkanal Channelrhodopsin-2 (ChR2) exprimierten, zeigten, dass mit Hilfe der Fakir-Methode von Membranproteinen verursachte Spannungsänderungen gemessen werden können. Beim Fakir-Modell auftretende Schwierigkeiten wurden analysiert und die Ergebnisse genutzt, um ein Konzept für eine hochreproduzierbare Herstellung von Nanoelektroden-Arrays unter Verwendung der 2-Photonenpolymerisations- Technolgie (2PP) zu entwerfen. Für den Einsatz als Biosensoren sind große Zellen besonders geeignet. Eine effektive Vergrößerung von Zellen kann durch die Multi-cell-Elektrofusion erreicht werden. Diese Art der Herstellung von Riesenzellen ist insbesondere deshalb so interessant, weil die Elektrofusion problemlos in ein automatisiertes Mikrofluidiksystem eingebunden werden kann. Neben HEK293-Zellen konnten nach Entwicklung geeigneter Protokolle für die Herstellung von Protoplasten auch Saccharomyces cerevisiae und Pichia pastoris zu Riesenzellen elektrofusioniert werden. Solche Riesenzellen wurden im Rahmen dieser Arbeit biophysikalisch charakterisiert. Neben Kapazitätsmessungen zeigten sowohl die Expression von YFP in den Membranen als auch die Verwendung von fluoresceinhaltiger Patch-Clamp- Pipettenlösung, dass es sich bei den Riesenzellen um einheitliche Kompartimente handelte und somit die gesamte Membranfläche für elektrophysiologische Experimente zur Verfügung stand. Vergleichende Patch-Clamp-Messungen von ChR2-exprimierenden Ursprungs- und Riesenzellen ergaben nicht nur, dass das überexprimierte Protein auch nach der Elektrofusion noch funktional war, sondern auch, dass die Expressionsdichte unverändert blieb. Damit bilden elektrofusionierte Riesenzellen weit über ihre Einsatzmöglichkeiten in Hochdurchsatzsystemen hinaus ein vielversprechendes Werkzeug, um zum Beispiel elektrogene Membranproteine mit geringer Stromamplitude nachzuweisen oder in der giant-inside-out- Konfiguration elektrophysiologische Messungen durchzuführen. Lipophile Anionen können eingesetzt werden, um die elektrischen Eigenschaften der Membranen zu verändern und die Zellstabiliät während des Elektromanipulationsprozesses zu verbessern. Daher wurde für vier verschiedene lipophile Anionen die Spannungsabhängigkeit der Erhöhung der spezifischen Membrankapazität in Patch- Clamp-Experimenten mit HEK293-Zellen analysiert.
In dieser Arbeit wurde der neuronale Glutamattransporter EAAC1 (Excitatory Amino Acid Carrier 1), kloniert aus Rattenretina, in HEK (Human Embryonic Kidney) Zellen transient exprimiert und mit Hilfe der patch clampTechnik elektrophysiologisch untersucht. Der Glutamattransport ist gekoppelt an den Kotransport von drei Natriumionen und einem Proton und den Gegentransport von einem Kaliumion. Damit werden pro Transportzyklus zwei positive Nettoladungen in die Zelle verschoben. Zusätzlich zum Glutamattransport verfügt der EAAC1 über eine Glutamatinduzierte Anionenleitfähigkeit, die nicht thermodynamisch an den Glutamattransport gekoppelt ist und besonders deutlich bei chaotropen Anionen (wie SCN ) in Erscheinung tritt. Eine weitere Funktion des Transporters ist seine Glutamatunabhängige Leckleitfähigkeit. Mit Hilfe von Ganzzellableitungen unter definierten ionalen extra und intrazellulären Bedingungen und bestimmtem Haltepotenzial erfolgte die Charakterisierung des Glutamattransporters von der extrazellulären Seite. Eine hohe Überexpression von EAAC1 in den HEKZellen, mit einer durchschnittlichen Dichte von # 4#10 3 Transporter pro µm 2 Zellmembran, erlaubte zudem die Beschreibung des Transporters von der intrazellulären Seite, durch Messungen am insideout patch. Stationäre Messungen an EAAC1 unter kontrollierten Spannungs und ionalen Bedingungen ließen verschiedene Aussagen zu über 1) die Bindungsreihenfolge von Glutamat und den kotransportierten Ionen an den Transporter, 2) den Anteil der Anionenleitfähigkeit am Glutamatinduzierten Gesamtstrom 3) die Abhängigkeit der Glutamatunabhängigen Leckleitfähigkeit und der Glutamatabhängigen Anionenleitfähigkeit von der Protonen und Natriumkonzentration und 4) die Identifikation des Ladungsträgers beim EAAC1assoziierten Leckstrom. Bei den durchgeführten vorstationären Messungen handelte es sich meist um SubstratsprungExperimente mit Hilfe der LaserpulsPhotolyse von #CNBcaged Glutamat. Damit konnte 1) der geschwindigkeitsbestimmende Schritt im Transportzyklus ermittelt werden, 2) Geschwindigkeitskonstanten verschiedener Teilreaktion im Transportzyklus von EAAC1 abgeschätzt werden und 3) die Spannungsabhängigkeit von Teilreaktionen identifiziert werden. Die Kombination von stationären und vorstationären Messungen mit Hilfe der LaserpulsPhotolyse sowie die Kombination von Ganzzellableitungen und insideout patches ermöglichte damit eine umfassende kinetische Untersuchung der verschiedenen Funktionen von EAAC1 und führten zu dem im folgenden beschriebenen Transportmodell. EAAC1 bindet auf der extrazellulären Seite zunächst ein Natriumion, wobei die Natriumbindungsstelle im elektrischen Feld der Membran liegt (# 25#30 %). Dieser Na beladene Transporterzustand ist assoziiert mit einem Glutamatunabhängigen Leckstrom, der von Anionen getragen ist. Der Na Bindungsreaktion schließt sich eine elektroneutrale Protonenbindung an. Der apparente pKWert des Protonakzeptors in EAAC1 liegt bei # 8, sodass unter physiologischen Bedingungen EAAC1 hauptsächlich in seiner protonierten Form vorliegt. Die nachfolgende Glutamatbindung (KD # 50 µM) ist ebenfalls spannungsunabhängig und erfolgt mit einer Geschwindigkeitskonstanten von # 2#10 7 M #1 s #1 . Sie löst eine elektroneutrale Konformationsänderung aus, die in einem Zeitbereich von 0,5#1 Millisekunde stattfindet und damit langsam ist im Vergleich zu den anschließenden elektrogenen Na Bindungsreaktionen. Der vollständig beladene Transporters transloziert in einem spannungsabhängigen Prozess (# 60#65 % des elektrischen Felds) Glutamat über die Membran mit einer Geschwindigkeitskonstanten von # 800 s #1 bei einem physiologischen Membranpotenzial von #80 mV. Der GlutamatTransportprozess ist mit der Glutamatinduzierten Anionenleitfähigkeit assoziiert, wobei sich beim GlutamatEinwärtstransport ein Verhältnis zwischen Transport und Anionenstrom (von SCN # ) von 1 zu 4 ergab, während es beim GlutamatAuswärtstransport bei 1 zu 1,5 lag. Die Dissoziationsfolge auf der intrazellulären Seite wurde nur für den Protonen-GlutamatKotransport bestimmt und war in umgekehrter Reihenfolge zur extrazellulären Seite. Verschiedene Mechanismen fördern auf der zytosolischen Seite die Dissoziation des Glutamates, bzw. verhindern den GlutamatAuswärtstransport. So führt die Änderung der Zugänglichkeit des Protonakzeptors zur zytosolischen Seite zu einer Verschiebung des apparenten pKWertes zu # 6,5. Damit liegt EAAC1 unter physiologischen Bedingungen auf der intrazellulären Seite hauptsächlich deprotoniert vor, was die Glutamatdissoziation fördert. Ebenso ist die Affinität mit einem 45fach erhöhten K M Wert im Vergleich zur extrazellulären Seite stark herabgesetzt. Die Relokation des Transporters erfolgt nach der Bindung eines Kaliumions und stellt mit einer Geschwindigkeitskonstanten von # 100 s #1 (bei einem Membranpotenzial von #80 mV) den hauptsächlich geschwindigkeitsbestimmenden Schritt im Transportzyklus dar. Bei der Relokation handelt es sich um einen elektrogenen Prozess (# 70#75 % des elektrischen Felds), wobei negative Ladungsträger über die Membran verschoben werden. Daher muss der Transporter über eine Eigenladung von < #1 verfügen. Daraus ergibt sich, dass die zu transportierende Nettoladung von zwei positiven Ladungen pro Transportzyklus auf zwei Reaktionsschritte verteilt ist. Der neuronale Glutamattransporter EAAC1 verfügt damit über verschiedene Mechanismen, den Transportprozess in Richtung Glutamataufnahme in die postsynaptische Nervenzelle zu fördern, entsprechend seiner physiologischen Aufgabe, die Glutamatkonzentration im synaptischen Spalt gering zu halten.
Channelrhodopsin-2, or ChR2, is a light-gated inward rectifying cation channel. Ever since its first characterisation (Nagel et al., 2003), it has been used extensively in the light-activated control of neural cells in culture as well as in living animals like mice, Caenorhabditis elegans and Drosophila melanagaster. Despite its broad application in the field of neuroscience, little is known about the properties of this ion channel. The aim of this thesis is to elucidate the single channel conductance under different conditions using stationary noise analysis on whole cell recordings of a HEK293 cell line that stably expresses the truncated ChR2 (amino acids 1-315), which behaves identically to the full length protein (Nagel et al., 2003). Stationary noise analysis is based on the fact that the ion channel noise due their opening and closing has a characteristic form of a plateau at low frequency points and a following decrease of power with 1/f² in difference power spectra, which are composed of the difference of fast Fourier transformed (FFT) stationary whole-cell recordings with and without illumination. From the parameters yielded by an approximation of the power spectra with a Lorentzian function the single channel conductance can be estimated. The single channel conductance of ChR2 was determined at -60 mV applied for different cations, yielding values of 91 ± 25 fS (Guanidine+), 42 ± 7 fS (Na+), 61 ± 18 fS (Li+) and 37 ± 14 fS (Methylammonium+). With 200 mM Guanidine+ outside of the cells and measurements between 0 mV and -60 mV applied, it could be shown that the inward rectification is still present on the scale of the single channel. Noise Analysis with concentrations between 40 and 200 mM Guanidine+ showed a saturation of the single channel conductance with high Guanidine+ concentrations with a maximal conduction of 129 ± 9 fS (Michaelis Menten approximation: Km = 82 ± 14 mM). Activation Energies of the rate constants k (2πfc, with fc = corner frequency of the Lorentzian function) and koff (1/τoff, with τoff = closing time of the channel at -60 mV) were determined to be 75 ± 23 kJ/mol and 64 ± 11 kJ/mol, respectively, which are similar to the value determined for the Channelrhodopsin-1 closing times (~60 kJ/mol; Nagel et al., 2002). The activation energy of the ChR2 single channel conductance was determined to be 21.2 ± 20.8 kJ/mol, which also is similar to the activation energy of the ChR1 current amplitude (20 kJ/mol; Nagel et al., 2002). The amount of active ChR2 channels in the membrane (160,000 or 226 ChR2/μm²) as well as the single channel current (-7.5 ± 0.6 fA) could be determined by variation of the light intensity (0.05 mW mm-2 to 5.3 mW mm-2). In the course of this thesis, the single channel parameters of the ChR2 mutant H134R were also determined. H134R had been previously published as a “gainof- function” mutant (Nagel et al., 2005a). The increased macroscopic current amplitude of H134R could be explained by an increased lifetime of the channel in comparison to the wildtype ChR2. Within the margin of error both single channel conductances in the presence of 200 mM Guanidine+ of the wildtype (91.1 ± 24.9 fS) and the H134R (89.4 ± 30.7 fS) are the same. In the presence of 200 mM Lithium+ values of 60.6 ± 17.8 fS for the wildtype ChR2 and 50.8 ± 9.6 fS for the H134R mutant were determined. This thesis marks the first in depth analysis of the single channel conductance of ChR2. Using stationary noise analysis the single channel conductance of Channelrhodopsin-1 as well as interesting Channelrhodopsin-2 mutants can also be analysed in the future.
In dieser Arbeit wurde das Protein OR1 ausführlich charakterisiert und die Grundlage für weitere Studien an diesem Protein gelegt. Die Zielsetzung dieser Arbeit bestand primär in der biophysikalischen Analyse eines eukaryotischen Proteorhodopsins, da bislang keine Daten zu diesen vorlagen. Dieser Ansatz ist vergleichbar mit der Studie am BR ähnlichen Rhodopsin aus dem Pilz Leptosphaeria maculans (Waschuk et al. 2005). Auch wenn man aus den Eigenschaften von OR1 keine Signatur für eukaryotische PRs herausfiltern kann, so weist OR1 eine Reihe von Charakteristika auf, die es wert sind weiterbearbeitet zu werden. Zu den hervorzuhebenden Ergebnissen dieser Arbeit zählen:
(1) OR1 zeigte in der methylotrophen Hefe Pichia pastoris ein hohes Expressionsniveau weit über der gewohnten Ausbeute bei Membranproteinen.
(2) OR1 offenbarte sich als Proteorhodopsin mit BR ähnlichen Eigenschaften wie dem niedrigen pKs-Wert des Protonenakzeptors und damit guten Protonenpumpeigenschaften über einen großen pH-Bereich. Auch bindet OR1 keinen zweiten Chromophor, was die nahen Verwandten GR und XR hingegen tun.
(3) OR1 demonstriert, dass die Konfiguration des komplexen Gegenions von Proteorhodopsinen stark variiert und sich anscheinend flexibel den physiologischen Erfordernissen des jeweiligen Organismus anpasst. In diesem Zusammenhang spielt auch das konservierte Histidin eine Rolle, da es den primären Protonenakzeptor beeinflusst. Bei OR1 stellte sich heraus, dass das Histidin den pKs Wert der D100 Position nicht signifikant beeinflusst.
(4) OR1 wurde mit 13C und 15N Atomen erfolgreich markiert und das entwickelte Protokoll für die Rekonstitution bewährte sich. Die Proteoliposomen des Wildtyps gaben sehr gut aufgelöste Festkörper-NMR Spektren. In Zukunft sind somit ausführliche NMR Studien an OR1 möglich.
In dieser Arbeit erfolgt eine Untersuchung der intrazellulären Transporteigenschaften des Na /Glucose Cotransporters SGLT1 aus dem Kaninchen. Der Transporter wird dazu heterolog in Xenopus laevis Oozyten exprimiert. Die hohe Expressionsdichte erlaubt die Anwendung der "giant excised patch clamp"-Technik in der inside-out Konfiguration. Die Patches mit Durchmessern von 20-30 µm enthalten ca. 2,5 - 5·10 hoch 6 Transportern bei einem durchschnittlichen Strom von 20-40 pA. Der Transport des Substrats Glucose bzw. des hier verwendeten alpha MDG wird angetrieben durch den elektrochemischen Gradienten für das Cosubstrat Na . Bei 0 mV Haltepotential wird zuerst die reine Konzentrationsabhängigkeit des Auswärtstransports durch die Bestimmung der apparenten intrazellulären Affinität für alpha MDG bei verschiedenen festen Na -Konzentrationen untersucht. Es kann eine deutliche Abhängigkeit des KM alpha MDG von der Na -Konzentration festgestellt werden. Eine Erhöhung der intrazellulären Na -Konzentration von 10 mM auf 400 mM führt zu einer ca. 12fachen Abnahme des KM alpha MDG. Experimente mit symmetrischer Na -Verteilung zeigen, dass auch ohne Na -Konzentrations-Gradient Transport stattfinden kann, allerdings mit einer deutlich geringeren Affinität für alpha MDG. Verglichen mit Literaturwerten für die extrazelluläre alpha MDG-Affinität ist die intrazelluläre Affinität 10-15mal geringer ist als die extrazelluläre. Die Untersuchung der Abhängigkeit von der Na -Konzentration bei verschiedenen festen MDG-Konzentrationen zeigt, dass KM Na eine geringe Abhängigkeit von der alpha MDG- Konzentration besitzt. Die 10fache Erhöhung der alpha MDG-Konzentration von 25 mM auf 250 mM führt nur zu einer leichten Erniedrigung des KM Na. Die intrazelluläre Na - Affinität liegt in der gleichen Größenordnung wie die extrazelluläre. Zur Untersuchung der intrazellulären Bindungsreihenfolge werden die gemessenen Abhängigkeiten des KM alpha MDG und des I Max von der Na -Konzentration mit Simulationen für die 3 möglichen Bindungsreihenfolgen (2Na :G), (Na :G:Na ) und (G:2Na ) verglichen. Mit den hier gemachten Annahmen für die intrazellulären Bindungskonstanten für MDG und Na wird die beste Übereinstimmung für die intrazelluläre Bindungsreihenfolge (2Na :G) gefunden. Zur Untersuchung des spannungsabhängigen Verhaltens der Affintitäten für alpha MDG und Na werden Spannungssprünge unter denselben Konzentrationsbedingungen wie vorher durchgeführt. Die Strom-Spannungs-Kennlinien zeigen eine Zunahme der zuckerinduzierten Stromamplituden zu positiven Potentialen hin. Dabei wird weder bei hyperpolarisierenden noch bei depolarisierenden Potentialen eine Sättigung erreicht. Dies läßt den Rückschluss, dass im betrachteten Spannungsbereich ein spannungsabhängiger Schritt im Transportzyklus geschwindigkeitsbestimmend ist. Die apparenten Affinitäten für alpha MDG und Na besitzen eine geringe Spannungsabhängigkeit. Der KM alpha MDG bei annähernd sättigender Na -Konzentration fällt zwischen 40 mV und 40 mV um einen Faktor 4,4. Bei verringerter Na -Konzentration beeinflusst das Membranpotential die MDG-Affinität stärker. Der KM Na fällt unter sättigenden Zuckerbedingungen im gleichen Spannungsbereich auf die Hälfte ab, wobei der Hill-Koeffizient konstant bleibt. Die Erniedrigung der alpha MDG-Konzentration verursacht keine Veränderung des spannungsabhängigen Verlaufs. Die Ergebnisse zeigen, dass SGLT1 ein reversibler Transporter ist, der sowohl Einwärts-, aber auch Auswärtstransport von Glucose generieren kann. Er zeigt dabei eine starke Abhängigkeit von der Na -Konzentration und eine geringe Abhängigkeit vom Membranpotential. Die hier bestimmten Eigenschaften zeigen aber auch, dass unter physiologischen Bedingungen ein Auswärtstransport von Glucose sehr unwahrscheinlich ist. Das Zusammenwirken der Faktoren Richtung des Na -Gradient, geringe Zuckeraffinität, negatives Membranpotential und geringe intrazelluläre Na - Konzentration verhindern den Auswärtstransport. Der physiologische Na -Gradient ist dem Auswärtstransport entgegengerichtet. Die geringe intrazelluläre Na -Konzentration und das negative Membranpotential verursachen eine sehr geringe intrazelluläre Zuckeraffinität von ca. 75 mM alpha MDG, so dass ein merklicher Auswärtstransport nur bei einer hohen Zuckerkonzentration innerhalb der Epithelzellen stattfinden kann. Dies wird jedoch durch basolaterale Glucose-Transporter verhindert. Das negative Membran- potential führt zu einer geringen Aktivität des Auswärtstransports. Die geringe intrazelluläre Na -Konzentration liegt weit unterhalb es KM Na , so dass auch hier die Transporteraktivität gering ist. Die asymmetrische Funktionsweise des SGLT1 gewährleistet, dass der Glucose- Transport nur in eine physiologisch sinnvolle Richtung, nämlich der Aufnahme von Glucose in die Epitheltzellen, stattfindet.
NMDA-Rezeptoren sind als ionotrope Glutamatrezeptoren (iGluRs) an der Signalübertragung durch den wichtigen Neurotransmitter L-Glutamat beteiligt. Vor allem aufgrund ihrer Bedeutung für das Phänomen der neuronalen Plastizität sind NMDA-Rezeptoren außerordentlich gründlich untersucht worden. Dennoch sind auch heute noch zentrale Fragen zu ihrer Funktionsweise ungeklärt, darunter auch diejenige, wie auf molekularer Ebene die Umsetzung der Glutamatbindung in die Öffnung des Ionenkanals erfolgt. Publizierte Kristallstrukturen der Liganden-bindungsdomänen zweier iGluRs haben die Grundlage für ein Modell der ligandeninduzierten und der Kanalöffnung vorausgehenden Vorgänge in der Bindungsdomäne geschaffen. Diesem zufolge schließt sich die aus zwei Teildomänen bestehende Bindungsdomäne venusfliegenfallenartig um den Liganden und die dabei entstehende mechanische Spannung führt zur Öffnung des Ionenkanals. Dieses Modell wurde in der vorliegenden Arbeit überprüft. Hierzu wurden verschiedene in der Ligandenbindungsdomäne punktmutierte NR1/NR2A-Rezeptoren heterolog in Säugerzellen exprimiert und durch Glutamat hervorgerufene Gesamtzellströme elektrophysiologisch gemessen. Mittels kinetischer Auswertung wurden dann Aminosäurereste in der Bindungsdomäne identifiziert, die einen Beitrag zur Kanalöffnung leisten. Die notwendige Schnelligkeit der Ligandenzugabe wurde dabei durch dessen photochemische Freisetzung aus einer maskierten und dadurch inaktiven Vorstufe (caged compound) erreicht. Die Ergebnisse bestätigen das Modell der Kopplung der Kanalöffnung an das Schließen der Bindungsdomäne und erweitern das Verständnis der genauen zeitlichen Abfolge der ligandeninduzierten Konformationsänderungen in der Bindungsdomäne. Intramolekulare Wechselwirkungen zwischen den Teildomänen S1 und S2 spielen demnach erst relativ spät im Aktivierungsprozeß eine Rolle und dienen vor allem der Stabilisierung des geschlossenen Zustandes der Bindungsdomäne und damit des offenen Ionenkanals.
An chemischen Synapsen diffundieren von der präsynaptischen Nervenendigung ausgeschüttete Neurotransmitter durch den synaptischen Spalt und aktivieren Rezeptormoleküle in der postsynaptischen Plasmamembran. Eine schnelle und zuverlässige Kommunikation an Synapsen bedingt, dass die Rezeptoren in Clustern direkt gegenüber den aktiven Zonen der Präsynapsen angereichert sind. Eine hohe Rezeptorendichte in der postsynaptischen Membran wird durch sog. Gerüstproteine, die mit den Rezeptormolekülen assoziieren, erreicht. Bisher wurden für verschiedene Synapsen unterschiedliche Gerüstproteine identifiziert. An glutamatergen Synapsen werden Rezeptoren durch u.a. das Postsynaptic Density 95 (PSD 95)-Protein, an cholinergen Synapsen durch Rapsyn, und an GABAergen und glyzinergen Synapsen durch Gephyrin verankert. An inhibitorischen Synapsen wurde bisher ausschliesslich Gephyrin als Ankerprotein für Glyzin- und GABAARezeptoren identifiziert. An exzitatorischen glutamatergen Synapsen dagegen regulieren weitere Gerüstproteine wie Shank, Homer und das Glutamatrezeptor interagierende Protein (GRIP) die Lokalisation, den Transport und die Stabilität verschiedener Glutamatrezeptor- Subtypen. Gephyrin wurde ursprünglich als peripheres Membranprotein zusammen mit dem Glyzin-rezeptorkomplex aufgereinigt. Es bindet an die große intrazelluläre Schleife der ß-Untereinheit des Glyzinrezeptors. Experimente mit Antisense-Oligonukleotiden und Gephyrin-defizienten Mäusen zeigten, dass Gephyrin essentiell für die synaptische Lokalisation von Glyzinrezeptoren und α2- und γ2-Untereinheiten enthaltenden GABAARezeptoren ist. Die Rezeptorlokalisation an der Synapse wird durch eine stabile Verankerung des Gephyrin-Gerüstes am Zytoskelett gewährleistet. Die Gerüstbildung erfolgt durch die Oligomerisierung zweier Gephyrin-Domänen, der aminoterminalen G-Domäne und der carboxyterminalen E-Domäne, wodurch ein hexagonales Gephyrinnetzwerk entsteht, welches für die Clusterbildung an der Synapse notwendig ist. Live-imaging Studien in Neuronenkulturen zeigten, daß an Rezeptor-Transportvesikel gebundenes Gephyrin kontinuierlich an und von aktiven Synapsen weg transportiert wird, was eine hochdynamische Modulation des Gephyrin-Gerüsts nahelegt. Der retro- und anterograde Transport von Gephyrin wird durch Dynein bzw. Kinesin bewerkstelligt. Einige zytosolische Proteine wie Profilin, das Mena/Vasodilator-stimulierte Phosphoprotein (VASP) und Collybistin (Cb) spielen in der Zytoskelett-Regulation eine Rolle und interagieren mit Gephyrin. Cb ist notwendig für die Gephyrin-Clusterbildung an bestimmten GABAergen Synapsen. Im Hippocampus Cb-defizienter Mäuse befindet sich kein Gephyrin an den Postsynapsen. Cb gehört zur Familie der Guanin-Nukleotid-Austauschfaktoren (GEF), die durch eine DH-PH (Dbl Homologie-/Pleckstrin-Homologie) Tandem-Domäne charakterisiert sind und existiert in zwei Spleißvarianten, CbI und CbII. Die DH-Domäne aktiviert spezifisch das kleine G-Protein Cdc42, und die PH-Domäne interagiert mit Phosphoinositol-3-Phosphat (PI3P). In vitro-Studien haben gezeigt, dass die Interaktion von Gephyrin mit Cb II eine Reduktion der GEF-Aktivität für Cdc42 bewirkt. Basierend auf diesen Resultaten wurde vorgeschlagen, dass Gephyrin die Cdc42-Aktivierung durch Cb beendet. Dieser Mechanismus könnte für die initiale Bildung inhibitorischer Synapsen notwendig sein. Analysen mit Domänen-deletierten Cb-Konstrukten zeigten, dass sowohl die DH- als auch die PH-Domäne für die Bildung von submembranären Gephyrin-Microclustern an der Plasmamembran notwendig sind. In dieser Arbeit wurde der Mechanismus der Gephyrin-Gerüstbildung durch Cb weiter untersucht. Insbesondere wurde geklärt, inwiefern Cdc42-Aktivierung bzw. PI3P-Bindung durch Cb an der Gephyrin-Gerüstbildung beteiligt ist. Zusätzlich wurde anhand einer eigens erzeugten GFP-Gephyrin transgenen Maus untersucht, ob sich die Stabilität des Gephyrin-Gerüsts während der Differenzierung ändert und in die Regulation der Stabilität und Plastizität inhibitorischer Synapsen involviert ist. Die Rolle von Cdc42 in der Gephyrin-Gerüstbildung wurde mittels einer konstitutiv aktiven Spleißvariante von Cb untersucht. Basierend auf Homologien zu anderen bereits charakterisierten GEFs und der publizierten Kristallstruktur des CbII-Cdc42 Komplexes wurden Aminosäurereste in der DH-Domäne von Cb mutiert, um die Cdc42-Aktivierung zu unterbrechen (CB T61A, K192A und NE232-233AA). In vitro GTPase-Aktivierungsassays und Filopodien-Induzierung in NIH-3T3-Zellen bestätigten, dass diese Mutationen die Cdc42-Aktivierung reduzierten bzw. aufhoben. Dennoch induzierten sie die Gephyrin-Gerüstbildung in heterologen Zellen und hippocampalen Neuronen ähnlich effektiv wie Wildtyp-Cb II. Die Rolle von Cdc42 in der synaptischen Gephyrin-Clusterbildung wurde außerdem in konditionell Cdc42-defizienten Mäusen, in denen das Cdc42-Gen selektiv im Vorderhin inaktiviert wurde, untersucht. Die Dichte von Gephyrin- und das GABAA-Rezeptor-Clustern war bei Verlust von Cdc42 im Hippocampus nicht verändert. Dies steht im Gegensatz zu einem fast 80%igen Verlust von Gephyrin- und GABAA-Rezeptor-Clustern im Hippocampus von Cb-defizienten Mäusen. Diese Ergebnisse zeigen, dass Cdc42 für die Gephyrin-Gerüstbildung an inhibitorischen Synapsen nicht notwendig ist. Die Rolle der PH-Domäne von Cb bei der Gephyrin-Clusterbildung wurde ebenfalls durch Mutagenese-Experimente analysiert. Viele PH-Domänen haben die Fähigkeit, Phosphoinositide zu binden und damit Membranbindung zu vermitteln, während andere PHDomänen, die nicht an Phosphoinositide binden, nur nach Bindung weiterer Liganden mit Membranen assozieren. In früheren Arbeiten war gezeigt worden, dass humanes Cb PI3P bindet. Hier wurde eine mögliche Beteiligung von Phospholipid-Bindung an der Gephyrin-Gerüstbildung durch Substitution zweier basischer Reste in der β3- und β4- Schleife, R303 und R304, mit Asparaginen untersucht. Ein Lipid-Dot-Blot-Assay mit der Cb II-RR303-304NN-Mutante zeigte einen völligen Verlust der PI3P-Bindung in vitro. Die Expression dieser Mutante in heterologen Zellen und hippocampalen Neuronen zeigte, dass die Gerüstbildung und die synaptische Lokalisation von Gephyrin Phosphoinositidbindung erfordern. Zusammenfassend zeigen diese Ergebnisse, dass die Aktivierung von Cdc42, nicht aber die PI3P- Bindung, für die Cb II-vermittelte Gephyrin-Gerüstbildung entbehrlich ist. Cb hat also zumindest zwei biologische Funktionen: Einerseits ist die DH-Domänen vermittelte Aktivierung von Cdc42 notwendig für die Regulation des Aktinzytoskeletts und die Bildung von Filopodien; andererseits wird die PH-Domänen-abhängige und Cdc42-unabhängige Phospholipidbindung für die Gephyrin-Gerüstbildung an inhibitorischen Postsynapsen benötigt. Um die Dynamik von Gephyrin an inhibitorischen Synapsen zu untersuchen, wurde eine transgene Maus entwickelt, welche GFP-Gephyrin unter der Kontrolle des Neuronspezifischen Thy1-Promotors exprimiert. In verschiedenen Hirnregionen der transgenen Mauslinie, wie Hippocampus, Stammhirn, Rückenmark und Kortex, wurde punktuelle synaptische GFP- Fluoreszenz beobachtet. Diese GFP-Gephyrin-Fluoreszenz kolokalisierte mit einem inhibitorischen Präsynapsenmarker, dem vesikulären inhibitorischen Aminosäuretransporter (VIAAT). Immunfärbungen von Hirnschnitten mit Gephyrin-spezifischen Antikörpern zeigten, daß die durchschnittliche Größe und Dichte der GFP-Gephyrin-Cluster mit denen endogener Gephyrin-Cluster identisch waren. Eine Western-Blot Analyse inhibitorischer synaptischer Proteine zeigte keinen Unterschied zwischen Thy1-GFP-Gephyrin- und Wildtyp-Mäusen auf, ebensowenig wie elektrophysiologische Untersuchungen von GFP-Gephyrin-positiven und -negativen Neuronen. Sowohl die durchschnittliche Amplitude der mIPSCs als auch deren Frequenz waren nicht signifikant verändert, was dafür spricht, dass die transgene Expression von GFP- Gephyrin keine funktionellen Veränderungen verursacht. Verhaltensversuche zeigten gleiche Ergebnisse für Thy1-GFP-Gephyrin und WTMäuse. Daher kann die GFP-Gephyrin-Maus als verlässliche Reporterlinie für Studien zur Gephyrin-Dynamik an inhibitorischen Synapsen im Hippocampus und in einigen anderen Hirnregionen eingesetzt werden. Die Dynamik des synaptischen Gephyrin-Gerüsts wurde an inhibitorischen Postsynapsen in organotypischen entorhinal-hippocampalen Schnittkulturen aus GFPGephyrin-Mäusen untersucht. Fluorescence Recovery after Photobleaching (FRAP)-Analysen individueller GFP-Gephyrin-Cluster in 1-Woche- und 4-Wochen-alten Kulturen zeigten eine entwicklungsabhängige Stabilisierung der GFP-Gephyrin-Cluster auf. Diese Stabilisierung ist eng verbunden mit einer Größenzunahme der Gephyrin-Cluster an GABAergen Synapsen. Mit elektrophysiologischen Ableitungen wurde eine Reifung der GABAergen synaptischen Übertragung ebenfalls während dieser Periode beobachtet. Die Stabilisierung und Grössenzunahme des Gephyrin-Gerüsts spiegelte sich in einer erhöhten miniature inhibitory postsynaptic current (mIPSC)- Amplitude wieder. Außerdem wies die Zunahme der mIPSCFrequenz auf eine effiziente Reifung der präsynaptischen Endigungen hin, die immunhistochemisch durch eine Zunahme der VIAAT-Immunfluoreszenz erhärtet werden konnte. Ein möglicher Einfluss der GABAergen, synaptischen Aktivität auf die Grösse und Stabilität der Gephyrin-Cluster wurde in reifen Neuronenkulturen durch pharmakologische Modulation der GABAA-Rezeptoren untersucht. Die Behandlung 4-Wochen-alter Kulturen mit GABAA-Rezeptor-Antagonisten und mit dem potenzierenden Benzodiazepin Diazepam zeigte eine homöostatische Regulation der Stabilität und Größe des Gephyrin-Gerüsts durch die Aktivität inhibitorischer Synapsen auf. Zusammenfassend sind diese Resultate starke Hinweise für dynamische Veränderungen in synaptischen Gephyrin-Gerüsten während der Reifung und Aktivitäts-induzierten Plastizität GABAerger Synapsen
Chlamydomonas reinhardtii ist eines der bekanntesten Modellsysteme der Forschung, um photo-, zell- und molekularbiologische Fragestellungen zu untersuchen. Die phototaktischen Reaktionen dieser einzelligen Grünalge werden durch mikrobielle Rhodopsine, sogenannte Photorezeptoren initiiert, deren Chromophor all-trans-Retinal ist. Eines dieser Rhodopsine ist Channelrhodopsin 2 (ChR2). Ein Sequenzvergleich mit anderen mikrobiellen Rhodopsinen aus Archaebakterien, wie z.B. der lichtgetriebenen Protonenpumpe Bakteriorhodopsin, zeigt eine Homologie von bis zu 20 %. Aus diesem Grund kann angenommen werden, dass die hydrophobe N-terminale Hälfte mit circa 300 von 737 Aminosäuren ebenso aus einem Siebentransmembranhelixmotiv besteht, wie dies für Rhodopsinmoleküle typisch ist. Seit der Entdeckung 2003 durch Nagel et al. ist bekannt, dass es sich bei ChR2 um einen lichtgetriebenen, kationenselektiven Ionenkanal handelt, der in dieser Form bisher nicht bekannt war. Diese biophysikalische Charakteristik konnte durch detaillierte elektrophysiologische Daten erhoben werden. Sie lieferten zudem die Erkenntnis, dass ChR2 als „Werkzeug“ in der Neurobiologie verwendet werden kann, da die lichtinduzierte Depolarisation zum Feuern von Aktionspotentialen in ChR2-exprimierenden Neuronen führt. Die vorliegende Arbeit sollte dazu beitragen, die molekularen Mechanismen von ChR2 aufzuklären, indem elektrophysiologische, spektroskopische und biochemische Daten miteinander korreliert wurden. Dazu wurde ChR2 funktionell in der methylotrophen Hefe Pichia pastoris exprimiert. Ein Glykosylierungstest konnte belegen, dass Pichia pastoris in der Lage ist, die für ChR2 erforderliche N-Glykosylierung durchzuführen. Mit einer 90%igen Expression war es somit möglich, ausreichend Protein für eine Metallchelat-Affinitätschromatographie zu gewinnen. Weiterhin konnte die bestehende Funktionalität nach der Isolierung von ChR2 nachgewiesen werden. Dies erfolgte zum einen über Messungen des charakteristischen Photostroms mittels der BLM-Technik. Zum anderen konnte dies durch spektroskopische Messungen der spezifischen Absorption von ChR2 bei 480 nm bestätigt werden. Die zeitaufgelöste Laserblitzabsorptionsspektroskopie lieferte zudem Differenzspektren des isolierten ChR2, die erstmalig das Vorhandensein eines spektral verschiedenen Intermediats bei 540 nm zeigten. Zusammen mit dem Zeitverlauf aller vier korrespondierenden Intermediate und der Hinzunahme elektrophysiologischer Daten konnte somit ein linearer Photozyklus bestehend aus vier Zuständen erstellt werden (erstellt durch Dr. Christian Bamann). Die ersten drei Intermediate des Photozyklus P1-P3 werden demnach durch die rotverschobene Spezies beschrieben, mit einer Relaxationszeit von unter einer Millisekunde. Dieses rote Intermediat spiegelt die Konformationsänderung des Retinals wider und geht mit dem Öffnen des Kanals einher. Die Zustände P2 und P3 konnten beide als kationenleitende Zustände identifiziert werden. Das Schließen des Kanals wird durch den Übergang von P3 zu P4 (spektral mit dem Grundzustand gleich) vermittelt. Das Zurückkehren in den Grundzustand folgt einem langsamen Prozess im Bereich von mehreren Sekunden. Biochemische, spektroskopische und elektrophysiologische Daten haben damit erfolgreich zur weiteren Aufklärung der molekularen Funktionsweise von ChR2 beigetragen. Mit diesen Ergebnissen ist nun die Erschließung neuer Informationen über die verschiedenen Signaltransduktionswege von Membranproteinen möglich.