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In einer vorangegangenen Studie konnten bereits duale sEH / PPAR-Modulatoren identifiziert werden, welche allerdings nicht in vivo applizierbar waren 73. Der Vorteil des Multi-Target-Liganden Ansatzes konnte demnach nicht evaluiert werden. Das Ziel der folgende Arbeit beschreibt demnach Design, Synthese und Charakterisierung in vivo applizierbarer sEH / PPAR-Modulatoren. Dieser Prozess sollte in drei Phasen gliederte werden:
o Identifizieren einer geeigneten Strukturklasse
o Etablieren einer Struktur-Aktivitäts-Beziehung zu beiden Targets
o Leitstrukturoptimierung
Die gesuchte Zielverbindung sollte nach oraler in vivo Applikation eine ausreichend hohe Plasmakonzentration in vivo erreichen, um konzentrationsabhängig die Targets sEH und PPAR zu modulieren. Mit dieser Modellverbindung wäre es möglich eine vergleichbare Studie zur sEH / PPAR-Kombinationstherapie von Imig et al. 72, durchzuführen. Letztendlich könnte mit dem Vergleich dieser zwei Studien gezeigt werden, ob die simultane Modulation dieser zwei Targets das Potenzial besitzt mehrere Risikofaktoren zu therapieren.
Im Rahmen dieser Dissertation wurden drei bakterielle Enzyme, die Metallo-β-Lactamasen NDM-1 (New Delhi Metallo-β-Lactamase 1), VIM-1 (Verona-Integron Encoded Metallo-β-Lactamase 1) und IMP-7 (Imipenemase 7), sowie ein humanes Enzym, die sEH-Phosphatase, behandelt.
Das Auftreten multiresistenter Bakterien ist eine alarmierende Entwicklung. Dabei ist das vermehrte Erscheinen von Metallo-β-Lactamasen (MBLs) in Gramnegativen Bakterien zu beobachten, die von Inhibitoren anderer β-Lactamasen unbeeinflusst bleiben. MBLs sind Enzyme, die β-Lactam-Antibiotika hydrolysieren und somit unwirksam machen. β-Lactam-Antibiotika hemmen die Zellwandsynthese von Bakterien und haben keinen Einfluss auf menschliche Zellen. Daher sind sie für den Menschen sehr gut verträglich und werden oft eingesetzt. Gerade diese häufige Verwendung und der Fehleinsatz führen vermehrt zur Resistenzbildung. Suche nach neuen Wirkstoffen zur Behandlung von Pathogenen mit Resistenz ist von äußerster Dringlichkeit, da die Resistenzen sich in kürzester Zeit über den kompletten Planeten verbreiten.
NDM-1, VIM-1 und IMP-5 wurden in E.coli überexprimiert und aufgereinigt, um die rekombinanten Enzyme zu erhalten. Damit wurde zunächst ein Fluoreszenz-Intensitäts-Assay entwickelt, um die Wirksamkeit möglicher Inhibitoren zu quantifizieren. Als Testsubstanzen wurden elf zugelassene Wirkstoffe gewählt, die eine Thiol-Gruppe enthalten, da bekannt ist, das Thiole Zink-abhängige Proteine inhibieren. Weiterhin wurden Thermal Shift Assays durchgeführt, um zwischen Liganden, die durch Bindung an die MBL inhibieren, und Liganden, die nur dadurch inhibieren, dass sie der Bindetasche das nötige Zink entziehen, unterscheiden zu können. Substanzen, die Inhibition im Assay zeigten und keine Zink-Chelatoren waren, wurden weiterhin auf Aktivität in bakteriellen Zellen untersucht. Dafür wurden pathogenene Stämme aus Patienten sowie mit den Resistenzplasmiden transfizierte Laborstämme einem Test auf Antibiotikaempfindlichkeit unterzogen. Die Wirksamkeit von Imipenem sollte in Kombination mit den Testsubstanzen wieder hergestellt werden. Insgesamt wurden vier Substanzen mit nicht-antiinfektiösen Indikationen gefunden, die MBLs im niedrig-mikromolaren Bereich inhibieren und die Wirksamkeit von Imipenem in Bakterien partiell wieder herstellen.
In einem zweiten Ansatz wurden Fragmente mittels Docking ausgewählt und ebenfalls im Fluoreszenz-basierten Assay getestet. Die Bestätigung der Bindung erfolgte in diesem Fall mit STD-NMR und die Bestimmung der Dissoziationskonstante des besten Fragments mittels Messung der Chemical Shift Perturbation im NMR. In diesem Projekt wurde leider kein pan-Inhibitor für alle MBLs gefunden, allerdings ein Fragment mit hoher Bindeeffizienz zur NDM-1.
Die lösliche Epoxid-Hydrolase (englisch: soluble Epoxid Hydolase, sEH) katalysiert die Umsetzung von Epoxyeicosatriensäuren (EETs), Lipidmediatoren mit entzündungshemmenden und kardiovaskulär-protektiven Eigenschaften, zu Dihydroxyeicosatriensäuren (DHETs). Diese Reaktion ist ein Bestandteil der Arachidonsäurekaskade. Das Enzym besteht aus zwei Domänen mit unterschiedlichen katalytischen Funktionen, einerseits der viel erforschten Cterminalen Epoxid-Hydrolase-Domäne, aber auch der N-terminalen Domäne, die eine Phosphatase-Eigenschaft zeigt. Die N-terminale Domäne katalysiert die Hydrolyse von Phosphat-Monoestern, Isoprenoid- sowie Lipid-Phosphaten. Die biologische Funktion dieser Domäne ist nicht aufgeklärt, und die Phosphatase Aktivität wird von typischen Phosphatase-Inhibitoren nicht beeinflusst. Daher ist es von Interesse, einen Inhibitor zu entwickeln.
Zunächst wurde ein Aktivitätsassay mit einem fluorogenen Substrat entwickelt und dieser in verschiedene Formate überführt, um in unterschiedlichen Größen testen zu können. Im 96well Format wurden mögliche Inhibitoren getestet, die mittels Docking ausgesucht wurden. Allerdings wurden nur Inhibitoren mit IC50s über 100 μM gefunden oder Inhibitoren, die Sulfonsäure-Strukturen aufweisen. Im 384well Format wurde, in Kollaboration mit dem European ScreeningPort Hamburg, ein High-Throughput Screening von ca. 17000 Substanzen durchgeführt. So wurde Oxaprozin gefunden, ein Inhibitor, der strukturelle Ähnlichkeit zu bereits bekannten Inhibitoren zeigt.
Pharmakophore sind ein zentrales Konzept der medizinischen Chemie. Im Liganden-basierten Design abstrahieren sie physikochemische Eigenschaften einer Menge aktiver Liganden und lassen dadurch Rückschlüsse auf die möglichen Interaktionen mit einem Target zu. Umgekehrt werden im Struktur-basierten Design Kristallstrukturen von Proteinen genutzt um zu modellieren, welche Eigenschaften die Bindetasche besitzt und welche Eigenschaften das entsprechende Gegenstück möglicher Liganden habe sollte. Diese Informationen können genutzt werden, um neue Substanzen zu identifizieren, welche die im Pharmakophore-Modell modellierten Interaktionen mit dem Target eingehen können. Durch die Abstraktion können hierbei sowohl Verbindungen mit neuen Grundgerüsten (scaffold) als auch mit veränderten funktionellen Gruppen gefunden werden. Im ersten Fall spricht man dabei von „scaffold hopping“, der letzte Fall ist eng verbunden mit dem Konzept des bioisosteren Ersatzes.
Im Rahmen dieser Arbeit wurden Pharmakophore genutzt, um in drei Studien neue Inhibitoren der Arachidonsäurekaskade zu finden. Die Arachidonsäurekaskade ist ein Stoffwechselweg in der aus Arachidonsäure eine Reihe von Lipidmediatoren synthetisiert wird. Viele dieser Mediatoren spielen eine entscheidende Rolle in Entzündungsprozessen und damit einhergehenden Krankheitsbildern. Es wurde außerdem eine neue Methode zur automatischen Generierung von Pharmakophor-Modellen aus einer Menge bekannter Liganden entwickelt.
In der ersten Studie wurde ein Struktur-basiertes Pharmakophor-Modell der Bindetasche der löslichen Epoxidhydrolase (sEH) erstellt, welches die möglichen, relevanten Interaktionsmöglichkeiten abbilden sollte. Dieses Pharmakophor-Modell wurde zum Screening einer Datenbank kommerziell erhältlicher Verbindungen genutzt und führte zu zwei Verbindungen mit IC50-Werten im niedrigen mikromolaren Bereich sowie einer dritten Verbindung mit einem bisher nicht für Inhibitoren der sEH beschriebenem Chemotyp. Zwar war diese Verbindung in höheren Konzentration unlöslich war, jedoch erreichten Derivate ebenfalls IC50-Werte im niedrigen mikromolaren Bereich und könnten als mögliche Startpunkte für eine neue Substanzklasse von sEH-Inhibitoren dienen.
In einer zweiten Studie wurde ein Liganden-basierter Ansatz gewählt um neue Inhibitoren der Leukotrien-A4 Hydrolase (LTA4H) zu suchen. Im Rahmen dieser Studie wurde außerdem eine neue Methode zur automatischen Generierung von Pharmakophor-Modellen entwickelt, welche auf einem wachsenden neuronalen Gas basiert, einer Methode aus dem Bereich des maschinellen Lernens. Die Methode wurde retrospektiv anhand mehrerer Benchmark-Datensätze validiert. Unter anderem wurde überprüft, inwiefern die Methode in der Lage ist die bioaktive Konformation eines Liganden vorherzusagen. Hierzu wurden, ausgehend von co-kristallisierten Liganden, automatisch Modelle generiert, welche im Anschluss genutzt wurden um Konformations-Datenbanken der Liganden zu durchsuchen. Je näher die beste gefundene Konformation an der co-kristallisierten Konformation lag, desto besser war das erzeugte Modell. Die entwickelte Methode war in nahezu allen Fällen in der Lage ein Modell zu erzeugen, mit welchem die durchschnittliche Abweichung zwischen co-kristallisierter und gefundener Konformation unter 2 Å lag. Im Rahmen der Studie wurde die neu entwickelte Methode auch in einem prospektiven Virtual Screening nach neuen Liganden der LTA4H genutzt. Hierzu wurden basierend auf 24 Kristallstrukturen mehrere Pharmakophor-Modelle für LTA4H-Liganden erstellt. Durch zusätzliche Nutzung des ESshape3D Fingerprints konnte außerdem die Form der Bindetasche der LTA4H erfasst werden. Diese Modelle wurden anschließend eingesetzt um eine Datenbank kommerziell erhältlicher Verbindungen zu durchsuchen und führten zur Identifizierung von zwei Substanzen mit IC50-Werten im unteren mikromolaren Bereich. Des Weiteren war die neue Methode in der Lage, den Bindemodus des genutzten Referenzinhibitors vorherzusagen, welcher durch Röntgenstrukturanalyse bestätigt wurde.
In zwei weiteren Studien wurde versucht, duale Inhibitoren der sEH und der 5-Lipoxygenase (5-LO) zu finden. Die erste dieser beiden Studien nutzte hierfür „duale“ Pharmakophor-Modelle: für beide Targets wurde basierend auf einer Vielzahl publizierter, aktiver Liganden eine Reihe von Pharmakophor-Modellen erstellt. Diese Modelle wurden paarweise miteinander verglichen; Modelle, welche eine ausreichend hohe Überlappung an Features besaßen, dienten als Ausgangspunkt für die Suche nach potentiell dualen Liganden. Durch die Suche in einer Fragment-Datenbank konnten neun Verbindungen identifiziert werden, welche eine Aktivität gegenüber einem der beiden Targets zeigten. Diese Verbindungen besaßen zum Teil noch nicht in der Literatur für sEH- oder 5 LO Inhibitoren beschriebene Strukturmerkmale. Eine der Verbindungen war außerdem in der Lage beide Targets im niedrigen mikromolaren Bereich zu inhibieren und könnte als Ausgangspunkt zur Entwicklung weiterer dualer 5-LO/sEH-Inhibitoren dienen. In der zweiten Studie wurde eine auf selbst-organisierenden Karten (SOM) basierende Methode genutzt um potentiell duale Liganden zu suchen. Hierzu wird je eine SOM mit repräsentativen (Sub-) Strukturen von Liganden beider Targets trainiert. Die DrugBank, eine Datenbank zugelassener Wirkstoffe, dient hierbei als Hintergrundverteilung und stellt den Raum wirkstoffartiger chemischer Strukturen dar. Durch einen automatischen Vergleich der trainierten SOMs können mögliche gemeinsame Substrukturen identifiziert werden. Die Anwendung dieser Methode auf bekannte Inhibitoren der sEH und der 5-LO identifizierte neun Fragmente, die auf einem der beiden Targets, sowie fünf Fragmente welche auf beiden Targets im niedrigen mikromolaren Bereich inhibierend wirken. Eine Substruktursuche nach einem dieser Fragmente in einer internen Datenbank lieferte eine Verbindung, welche beide Targets im nanomolaren Bereich inhibiert und eine vielversprechender Basis als Leitstruktur für die Entwicklung dualer 5-LO/sEH-Inhibitoren darstellt.
Zusammenfassend wurden in dieser Arbeit mehrere Ansätze vorgestellt wie Pharmakophore in der Wirkstoffsuche eingesetzt werden können. Im Rahmen mehrerer Virtual Screenings konnten eine Reihe neuer Inhibitoren gefunden werden, einige mit nicht zuvor beschriebenen Strukturmerkmalen für das jeweilige Target. Es wurde außerdem eine neue Methode zur automatischen Generierung von Pharmakophor-Modellen entwickelt, welche sowohl retrospektiv als auch prospektiv validiert wurde.
Leitstrukturoptimierung mit Hilfe von Matched Molecular Paris im Kontext der Rezeptorumgebung
(2015)
In der hier vorgestellten Arbeit wurde ein strukturbasierter Ansatz zur gezielten Leitstrukturoptimierung entwickelt. Die Grundlage dafür bildeten die sogenannten Matched Molecular Pairs (MMPs). Dabei handelt es sich um Paare von Molekülen, welche sich lediglich in einer wohldefinierten Modifikation (Transformation) unterscheiden und sich in einer Datenbank mit gemessenen Moleküleigenschaften befinden. Diese Transformationen wurden im Kontext ihrer Targetumgebung untersucht und eine mathematische Beziehung zwischen Transformation und dem Effekt auf die Bindungsaffinität (Transformationseffekt) hergestellt. Auf Basis der generierten Datengrundlage wurde anschließend ein Webserver zur gezielten Leitstrukturoptimierung implementiert und zur freien Nutzung zur Verfügung gestellt.