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Nukleinsäuren und Proteine bilden zusammen mit den Kohlenhydraten und Lipiden die vier großen Gruppen der Biomoleküle. Dabei setzen sich Nukleinsäuren aus einer variierenden Abfolge von Nukleotiden zusammen. Gleiches trifft auf die Proteine zu, wobei deren Bausteine als Aminosäuren bezeichnet werden. Die Reihenfolge der Bausteine bestimmt zusammen mit der Interaktion, die die einzelnen Bestandteile untereinander eingehen, deren Funktion. Um deren Wirkungsweise verstehen und nachverfolgen zu können, wurden unterschiedliche Methoden entwickelt, zu welchen auch die EPR-Spektroskopie gehört.
Durch den Einbau modifizierter Nukleotide oder Aminosäuren lassen sich Spinlabel in die sonst EPR-inaktiven Nukleinsäuren und Proteine einführen. Diese Marker lassen sich grundsätzlich in drei Klassen unterteilen (Metallionen, Nitroxidradikale und TAMs), weisen aber immer mindestens ein ungepaartes Elektronenpaar auf. Die Festphasensynthese ist eine Standardprozedur zur Herstellung von markierten Nukleinsäuren und Proteinen. Allerdings führen die Bedingungen dieser Methode zumindest teilweise zur Zersetzung der Nitroxidradikale, die dieser Arbeit zugrunde liegen, wenn sie direkt während der Synthese eingebaut werden. Der direkte Einbau ist aber in vielen Fällen essenziell, um bestimmte Eigenschaften zu erzielen.
Um den Abbau des Nitroxidradikals während der Festphasensynthese zu verhindern, kann dieses vorübergehend mit einer Schutzgruppe versehen werden, welche sich anschließend wieder abspalten lässt.
Der Schwerpunkt dieser Arbeit liegt hierbei auf der Darstellung neuer photolabil geschützter Spinlabel zur Synthese markierter Proteine und Nukleinsäuren.
Basierend auf den Nukleotiden Uridin und Cytidin konnten zwei für die RNA-Synthese vorgesehene Phosphoramidite synthetisiert werden, welche jeweils an der 5-Position des Pyrimidinrings mit einem photolabil geschützten Spinlabel auf Basis von TPA versehen waren. Durch Einbau des Uridinderivats in das Neomycin-Aptamer konnte zudem der Einfluss der Spinlabel auf die lokale Struktur mit Hilfe von in-line probing gezeigt werden.
Der gleiche TPA-Label konnte ebenfalls mit einem Lysin gekuppelt werden, welches später über ein orthogonales tRNA/Aminoacyl-tRNA Synthetase Paares in eine Polypeptid eingebaut werden sollte. In Kooperation mit dem AK Grininger ist auch ein nicht geschützter Spinlabel zur kupferfreien Markierung der Fettsäuresynthase entstanden. Abschließend war noch die Synthese eines auf Phenylalanin basierenden photolabil geschützten Spinlabel in Arbeit, welcher jedoch nicht beendet werden konnte. Dieser sollte mittels Festphasensynthese einbaubar sein, weswegen er am N-Terminus mit Fmoc geschützt ist.
Um sich an ändernde Umwelteinflüsse und metabolische Bedürfnisse anpassen zu können, ist es für Zellen essenziell, dass Boten-RNA (engl. messenger RNA, mRNA) stetig und schnell nach der Translation abgebaut wird. In Prokaryoten ist dafür der Proteinkomplex Degradosom verantwortlich, in dem Endo- und Exoribonukleasen RNase E und PNPase das RNA-Transkript in kleinere Fragmente und schließlich einzelne Nukleotide spalten. Die DEAD-Box Helikase RhlB im Komplex dient zusätzlich dazu, mögliche Sekundärstrukturen in der RNA zu entfalten, welche sonst die weitere Degradation behindern würden. Es konnte gezeigt werden, dass RhlB’s sehr geringe katalytische Aktivität – gemessen durch ATP-Verbrauch und Rate an entwundener RNA – signifikant durch die allosterische Bindung an Komplexpartner RNase E erhöht wird. Gleichzeitig deuten andere Studien darauf hin, dass RhlB eine mögliche Selektivität für doppelsträngige RNA-Substrate mit 5‘-Einzelstrang-Überhängen aufweist.
Diese Arbeit liefert neue Erkenntnisse in Bezug auf die Kommunikation zwischen den Degradosom-Komponenten RhlB und RNase E aus E. coli, indem das potenzielle Wechselspiel zwischen RhlBs RNA-Selektivität und der allosterischen Aktivierung durch RNase E untersucht wurde. Der vielseitige Einsatz NMR-spektroskopischer Techniken sowie die Verwendung kurzer RNA-Substrate mit spezifischen Strang-Eigenschaften ermöglicht es, mit einen ungewöhnlichen, RNA-zentrierten Ansatz an diese unzureichend verstandene Protein-Interaktion heranzugehen.
Zunächst wurden hierzu eine Reihe kurzer doppelsträngiger RNA-Konstrukte hergestellt, die sich nicht nur in ihren Einzelstrang-Merkmalen unterscheiden, sondern auch die thermodynamischen Anforderungen eines DEAD-Box Helikase Substrats erfüllen, und gleichzeitig eine ausreichende NMR-spektroskopische Signal-Zuordnung erlauben. Die thermale Stabilität, das Faltungsverhalten sowie die 1H Imino-protonen- und 13C HSQC-Zuordnungen aller geeigneten Konstrukte wurden erfolgreich bestimmt.
Um den Einfluss spezifischer RNA-Substrate sowie die Bindung zweier verschiedener RNase E Fragmente auf RhlBs ATP-Umsatzrate zu untersuchen, wurde sich zunächst eines photometrischen Phosphat-Assays bedient. Damit konnte deutlich gezeigt werden, dass RhlB in Abwesenheit des Komplex-Partners nicht in der Lage ist, signifikante Mengen an ATP umzusetzen, unabhängig davon, welches RNA-Konstrukt eingesetzt wird. Die Bindung der RNase E Fragmente erhöhte signifikant die ATP-Hydrolyse-Rate der Helikase, wobei die größte Aktivierung für den RNA-Duplex mit 5‘-Einzelstrang sowie ein einzelsträngiges Substrat zu beobachten ist. Da diese Ergebnisse deutlich eine RNA-Abhängigkeit beim ATP-Umsatz der Helikase zeigen, wurde untersucht, ob diese Unterschiede ihren Ursprung bereits in der Bindung der spezifischen RNA-Substrate haben. Mittels einer Mischapparatur, die es erlaubt die enzymatische Reaktion direkt im Spektrometer zu initiieren sowie zeitaufgelöster 31P NMR-Experimente konnte die allosterische Aktivierung der ATP-Hydrolyse-Rate von RhlB auch unter NMR-spektroskopischen Messbedingungen nachgewiesen werden.
Da die Ergebnisse des ATPase Assays deutlich eine RNA-Abhängigkeit bei der ATP-Umsatz-Rate der Helikase zeigen, wurde zusätzlich untersucht, ob diese Unterschiede ihren Ursprung in den Affinitäten für die verschiedenen RNA-Substrate haben und ob diese durch die Bindung von RNase E and RhlB beeinflusst werden. Um im gleichen Zuge zu überprüfen, ob die Bindung der RNA an RhlB die RNA-Konformation oder Basenpaarung ändert, werden 1H NMR-Titrationsexperimente durchgeführt. Es konnte erstmals gezeigt werden, dass RhlB eine inhärente Präferenz für Duplexe mit 5‘-Überhang gegenüber Konstrukten mit 3‘-Überhang oder stumpfen Enden besitzt, was sich in einer erhöhten Affinität zeigt. Zusätzlich offenbaren die Messungen, dass RNase Es allosterische Bindung selektiv die Affinität gegenüber Konstrukten mit Einzelstrang-Überhang erhöht, während die Affinität zu RNA Duplexen ohne Überhang sogar verringert wird. Diese Ergebnisse liefern erstmals einen Nachweis, dass RNase E aktiv Einfluss auf RhlBs RNA-Bindung nimmt. Weder die Bindung der RNA and RhlB noch an den RhlB/RNase E Komplex scheint die Basenpaarung oder Konformation der RNA-Substrate zu beeinflussen, da lediglich eine homogene Peak-Verbreitung aller Imino-Protonen-Signale im 1H NMR-Spektrum beobachtet werden konnte.
RNA research is very important since RNA molecules are involved in various gene regulatory mechanisms as well as pathways of cell physiology and disease development.1 RNAs have evolved from being considered as carriers of genetic information from DNA to proteins, with the three major types of RNA involved in protein synthesis, including messenger RNA (mRNA), transfer RNA (tRNA), and ribosomal RNA (rRNA).2 In addition to the RNAs involved in protein synthesis numerous regulatory non-coding RNAs (ncRNAs) have been discovered in the transcriptome. The regulatory ncRNAs are classified into small ncRNAs (sncRNAs) with transcripts less than 200 nucleotides (nt) and long non-coding RNAs (lncRNAs) with more than 200 nt.3
LncRNAs represent the most diverse and versatile class of ncRNAs that can regulate cellular functions of chromatin modification, transcription, and post-transcription through multiple mechanisms.4 They are involved in the formation of RNA:protein, RNA:RNA and RNA:DNA complexes as part of their gene regulatory mechanism.4,5 The RNA:DNA interactions can be divided into RNA:DNA heteroduplex formation, also called R-loops, and RNA:DNA:DNA triplex formation. In triplex formation, RNA binds to the major groove of double-stranded DNA through Hoogsteen or reverse Hoogsteen hydrogen bonding, resulting in parallel or anti-parallel triplexes, respectively. In vitro studies have confirmed the formation of RNA:DNA:DNA triplexes.6 However, the extent to which these interactions occur in cells and their effects on cellular function are still not understood, which is why these structures are so exciting to study (Chapter I RNA:DNA:DNA Triplexes).
This cumulative thesis investigates several functional and regulatory important RNAs. The first project involves the improved biochemical and biophysical characterization of RNA:DNA:DNA triplex formation between lncRNAs of interest and their target genes. Triplex formation was confirmed by a series of experiments including electromobility shift assays (EMSA), thermal melting assays, circular dichroism (CD), and liquid state nuclear magnetic resonance (NMR) spectroscopy. The following is a summary of the main findings of these publications.
In research article 5.1, the oxygen-sensitive HIF1α-AS1 was identified as a functionally important triplex-forming lncRNA in human endothelial cells using a combination of bioinformatics techniques, RNA/DNA pulldown, and biophysical experiments. Through RNA:DNA:DNA triplex formation, endogenous HIF1α-AS1 decreases the expression of several genes, including EPH receptor A2 (EPHA2) and adrenomedullin (ADM), by acting as an adaptor for the repressive human silencing hub (HUSH) complex, which has been studied by our collaborators in the groups of Leisegang and Brandes.
2) Triplex formation between HIF1α-AS1 and the target genes EPHA2 and ADM was investigated in biochemical and biophysical studies. The EMSA results indicated that HIF1α-AS1 forms a low mobility RNA:DNA:DNA triplex complex with the EPHA2 DNA target sequence. The CD spectrum of the triplex showed distinct features compared to the EPHA2 DNA duplex and the RNA:DNA heteroduplex. Melting curve analysis revealed a biphasic melting transition for triplexes, with a first melting point corresponding to the dissociation of the RNA strand with melting of the Hoogsteen hydrogen bonds. The second, higher melting temperature corresponds to the melting of stronger Watson-Crick base pairing. Stabilized triplexes were formed using an intramolecular EPHA2 DNA duplex hairpin construct in which both DNA strands were attached to a 5 nucleotide (nt) thymidine linker. This approach allowed improved triplex formation with lower RNA equivalents and higher melting temperatures. By NMR spectroscopy, the triplex characteristic signals were observed in the 1H NMR spectrum, the imino signals in a spectral region between 9 and 12 ppm resulting from the Hoogsteen base pairing. To elucidate the structural and sequence specific Hoogsteen base pairs 2D 1H,1H-NOESY measurements of the EPHA2 DNA duplex and the HIF1α-AS1:EPHA2 triplex were performed. The 1H,1H-NOESY spectrum of the HIF1α-AS1:EPHA2 triplex with a 10-fold excess of RNA was semi-quantitatively analyzed for changes in the DNA duplex spectrum. We discovered, strong and moderate attenuation of cross peak intensities in the imino region of the NOESY spectrum. This attenuation was proposed to result from weakening of Watson-Crick base pairing by Hoogsteen hydrogen bonding induced by RNA binding. The Hoogsteen interactions can be mapped based on the analysis of the cross peak attenuation in the NOESY spectra, which we used to generate a structural model of the RNA:DNA:DNA triplex. These biophysical results support the physiological function of HIF1α as a triplex-forming lncRNA that recruits the HUSH-epigenetic silencing complex to specific target genes such as EPHA2 and ADM, thereby silencing their gene expression through RNA:DNA:DNA triplex formation.
This cumulative thesis discusses the development of optimized force field parameters for Magnesium and resulting improved simulations of Magnesium-RNA interactions, including the in silico exploration of binding sites. This thesis is based on four publications as well as unpublished data. A fifth publication that was written during the time of the Ph.D. is discussed in the Appendix. This publication analyzes monovalent ion-specific effects at mica surfaces.
Nucleic acids in general and RNA in particular are fundamental to life itself. Especially in the folding and function of RNA, metal cations are crucial to screen the negatively charged nucleic acid backbones to allow for complex functional structures. They stabilize the tertiary structure of RNA and even drive its folding. Furthermore, similarly to proteins, RNAs can catalyze multiple reactions, rather than consisting of the 20 amino acids of a protein, RNA constitues of only four different building blocks. Metal cations play an important role here as additional cofactors. One essential ion is Magnesium (Mg2+), commonly referred to as the most important cofactor for nucleic acids. Mg2+ carries two positive charges. Its comparably small size and high charge result in a high charge density that has strong polarizing effects on its surroundings. Furthermore, Mg2+ forms a sharply defined first hydration shell with an integer number of coordinating water molecules. As a result, an exclusion zone exists around the ion within which no water molecules are observed. Moreover, Mg2+ displays a high solvation free energy and a low exchange rate of waters from its first hydration shell. Finally, it contains a strong preference towards oxygens . Together, this makes Mg2+ a particularly well suited interaction partner for the charged non-bridging phosphate oxygens on nucleic acid backbones and explains its crucial biological role.
The immense number of physiological and technological functions and applications indicates the significant scientific attention Mg2+ received. In experimental studies, however, severe difficulties arise for multiple reasons: Mg2+ is spectroscopically silent and cannot be detected directly by resonance techniques like NMR or EPR. Indirect observation is possible, either by detecting changes in the overall RNA structure with and without bound Mg2+, or by replacing the Mg2+ ion with another spectroscopically visible ion. In the latter, however, it cannot be guaranteed that the altered ion does not also alter the interaction site or even the whole structure. Another detection method is X-ray crystallography, but here challenges arise from Mg2+ being almost indistinguish- able from other ions as well as from water if not for very high resolutions and precise stereochemical considerations.
Alternatively, molecular dynamics (MD) simulations can be performed, with the power of adding atomistic insight to the interplay of metal cations and nucleic acids. MD simulations, however, are only as accurate as their underlying interaction models and the development of accurate models for the description of Mg2+ faces challenges especially in describing three properties:
(i) Polarizability. Commonly used simple models like the 12-6 type Lennard-Jones model typically fail to reproduce simultaneously thermodynamic and structural properties of a single ion in water. Alternative strategies include the use of a 12-6-4 type Lennard-Jones potential as proposed by Li and Merz, where the additional r−4 term explicitly accounts for polarization effects. The resulting Lennard-Jones potential is thereby more attractive and more long-ranged than for typical models of the 12-6 type.
(ii) Kinetics. Most Mg2+ models either fully ignore considerations about the timescales on which water exchanges from the first hydration shell of the ion or use inappropriate methodology to calculate the underlying kinetics. A realistic characterization of the involved timescales is imperative to be able to describe a seemingly simple process like the transition from inner-to-outer sphere binding and vice versa. This transition governs most biochemical reactions involving Mg2+ and therefore subsequent processes can only by as fast as the transition itself. However, already the previous step – the exchange of a water from the first hydration shell of the ion – is described my current Mg2+ models up to four orders of magnitude too slowly, which makes the observation of such events on the timescale of a typical simulation difficult or even impossible. Alln ́er et al. [48] as well as Lemkul and MacKerell explicitly considered the exchange rate into their parameter optimization procedure. To compute the rate, both studies applied Transition State Theory along a single reaction coordinate – the distance towards one of the exchanging waters. However, it could be shown that the water exchange from the first hydration shell requires at least the consideration of both exchanging water molecules in order to be able to realistically record the underlying rate using Transition State Theory. Furthermore, the model of Alln ́er et al. significantly underestimates the free energy of solvation of the ion.
(iii) Interactions between Mg2+ and nucleic acids. Typically, ionic force field parame- terization concentrates on the optimization of solution properties. The trans- ferability of these solution optimized parameters towards interactions with biomolecules, however, often fails.
N6-methyladenosine (m6A) is the most abundant and well understood modification in eukaryotic mRNA and was first identified in polyadenylated parts of the mRNA.The distinct distribution of m6A in the transcriptome with special enrichment in long internal exons, 39UTRs and around stop codons was uncovered by early biochemical work and later on antibody based sequencing techniques. The so called m6A writer, reader and eraser machinery is responsible for the dynamic and with that regulatory nature of the m6A modification. As m6A writer, the human N6-methyltransferase complex (MTC) cotranscriptionally methylates the central adenine within a RRACH (preferably GGACU) sequence context to form m6A in the nascent RNA chain.9–15 The catalytic core of the complex is formed by the two proteins METTL3 and METTL14, with the active site located in the methyltransferase domain (MTD) of METTL3.16–18 The DPPW motif near the methyl donor S-adenosylmethionine (SAM) binding site in this MTD was postulated to bind the target adenine during catalysis. Moreover, a positively charged groove in the METTL3-METTL14 interface, the C-terminal RGG domain in METTL14 and the zinc finger motifs in METTL3 were identified as important domains for RNA binding. However, to date there are no full-length or substrate-RNA-bound structures of the catalytic METTL3-METTL14 complex.
In addition, a set of accessory proteins assembles to the METTL3-METTL14 heterodimer to form the full MTC, mediated by WTAP that firmly binds to the N-terminal leader helix in METTL3.20 WTAP was shown to locate the whole complex to the nuclear speckles and can modulate m6A deposition to specific sites in the RNA. Moreover, WTAP acts as binding platform for other accessory proteins including VIRMA, RBM15, ZC3H13 and HAKAI that are mostly identified to mediate position specific methylation. For example, RBM15 was shown to mediates region-selective methylation in a WTAP dependent manner, directing specificity towards U-rich sequences.
The observed specificity of the methyltransferase complex to methylate only site specific DRACH sequenced is still poorly understood. Some possible modulators like the role of the accessory proteins are under investigation, however, the structural context of the RNA methylation sites or a structural preference of the complex have been mainly neglected so far. Moreover, the structural dynamics of this methylation process still remain elusive. This thesis contributes to the afore-mentioned aspects by analysis of the methylation process regarding RNA structure sensitivity with enzymatic activity assays and its dynamic nature by implementing a smFRET approach.
We hypothesized the target RNA secondary structure to be an additional important modulator of methylation efficiency, based on the RNA binding elements of the complex (positively charged binding groove, zinc finger domain, RGG domain) and the supposed target adenine binding in the active site. Here, we postulated the possibility for a flipped-out adenine to be of special relevance, which is closely related to the local stability of the target adenine containing structure. Moreover, efficient binding of the protein complex to the RNA should require the ability to anchor the RNA on both sides of the target sequence.
Die vorliegende Dissertation mit dem Titel “Structural dynamics of eukaryotic H/ACA RNPs from Saccharomyces cerevisiae & Structural dynamics of the Guanidine-II riboswitch from Escherichia coli” besteht aus zwei Projekten. Das erste Projekt befasst sich mit den eukaryotischen H/ACA Ribonukleoproteinen (RNP) aus der Hefe. Diese können sequenzspezifisch in der RNA ein Uridin Nukleotid in das Rotationsisomer Pseudouridin (Ψ) umwandeln. Die H/ACA RNPs bestehen aus einer Leit-RNA und vier Proteinen, der katalytisch aktiven Pseudouridylase Cbf5, Nhp2, Gar1 und Nop10. Die Leit-RNA besteht in Eukaryoten konserviert aus zwei Haarnadelstrukturen, die von einem H-Box oder ACA-Box Sequenzmotiv gefolgt sind. In jeder dieser Haarnadeln befindet sich ein ungepaarter Bereich, die sogenannte Pseudouridylierungstasche, wo durch komplementäre Basenpaarung die Ziel-RNA gebunden wird. Fehlerhafte H/ACA RNPs können beim Menschen zu schweren Krankheiten wie verschiedenen Krebsarten oder dem Knochenmarksversagen Dyskeratosis congenita führen, aber sie bieten auch Möglichkeiten zum Einsatz als Therapiemethode. In dieser Arbeit wurde hauptsächlich der zweiteilige Aufbau der H/ACA RNPs untersucht.
Dafür wurden zunächst die einzelnen Komponenten hergestellt werden. Cbf5, Nop10 und Gar1 wurden zusammen heterolog in E. coli exprimiert und gereinigt. Außerdem wurden mehrere Deletionsvarianten von Gar1 hergestellt. Zusätzlich wurde die Leit-RNA unmarkiert über T7 Transkription synthetisiert, sowie sechs verschiedene FRET-Konstrukte mit verschiedenen Markierungschemas der Fluorophore Cy3 und Cy5 über DNA-geschiente Ligation. Anschließend wurde über Größenausschlusschromatographie und radioaktiven Aktivitätsassays geprüft, dass sich die aktiven H/ACA RNPs in vitro aus den einzelnen Komponenten rekonstituieren lassen.
In smFRET Experimenten wurden einzelne Haarnadelstrukturen mit dem zweiteiligen Komplexen verglichen. Dabei konnte gezeigt werden, dass die H3 Haarnadel durch die Anwesenheit von H5 dynamischer und heterogener wurde, während H5 überwiegend unbeeinflusst war. Außerdem konnte die dreidimensionale Orientierung der Haarnadelstrukturen in verschiedenen Assemblierungsschritten mittels smFRET untersucht werden. Hier deutete sich an, dass in Abwesenheit von Proteinen beide Haarnadeln eher entgegengesetzt stehen als in einer parallelen Konformation. Cbf5 scheint den Linker zwischen den Beiden auszustrecken bzw. zu orientieren und die Haarnadelstrukturen etwas gegeneinander zu neigen. Ein Zusammenspiel von Nhp2 und Gar1 war nötig um die oberen Bereiche der Haarnadeln zusammenzuziehen. Es konnte auch ein Modell für den vollen H/ACA RNP vorgeschlagen werden. Im kompletten Komplex könnte das Zusammenziehen der Haarnadelstrukturen durch Nhp2 und Gar1 mit dem Effekt von Cbf5 konkurrieren und könnte hauptsächlich den oberen Bereich von H3 betreffen. Zum Schluss wurde das Zusammenspiel von Gar1 und Nhp2 auf eine Abhängigkeit von den RGG Domänen von Gar1 hin untersucht. Hier besteht möglicherweise eine Hierarchie, die eine Kooperativität von den N- und C-terminalen Domänen benötigt.
Das zweite Projekt befasst sich mit dem Guanidin-II Riboschalter aus E. coli. Der Riboschalter kann das toxische Molekül Guanidinium (Gdm+) spezifisch in seiner Aptamerdomäne binden und dadurch die Genexpression von Proteinen zur Detoxifizierung von Gdm+ aktivieren. Der Riboschalter besteht aus zwei Haarnadelstrukturen, mit einer Schleife, die aus der Sequenz ACGR besteht, wobei R ein Purin ist. In einem vorgeschlagenen Modell soll die Ribosomenbindestelle (Shine-Dalgarno Sequenz) in Abwesenheit von Ligand mit dem Linker komplementär Basenpaaren und so die Translation verhindern. Mit Ligand würde sich dann eine Schleifen-Schleifen Interaktion mit den beiden CG Basen ausbilden, wodurch die Anti-Shine-Dalgarno Sequenz nicht mehr zugänglich wäre. Bisherige Studien arbeiteten zumeist nur mit der Aptamerdomäne, den einzelnen Haarnadeln oder noch kleineren Elementen. In dieser Arbeit wurden die Strukturdynamiken von verschiedenen Längen, auch mit der Expressionsplatform, untersucht. Außerdem wurden verschiedene Mutationen analysiert und die Effekte auf den Riboschalter in seiner natürlichen Umgebung in E. coli.
Zunächst mussten insgesamt 24 FRET-Konstrukte hergestellt werden, die sich in Länge, Markierungsschema und Mutationen unterschieden. Hierfür wurde DNA-geschiente Ligation verwendet. Dank der verschiedenen Fluorophorpositionen konnte ein konformationelles Modell für die Aptamerdomäne vorgeschlagen werden. In diesem Modell könnte in Abwesenheit von Ionen das Aptamer offen vorliegen. Durch Mg2+ würde sich bereits eine lockere Schleifen-Schleifen Interaktion ausbilden. Zusätzlich deuten die Ergebnisse auf eine neue Konformation hin, der stabilisierten Schleifen-Schleifen Interaktion, bei der der Linker zusätzlich mit den Haarnadelstrukturen interagiert, beispielswese mit den Purinen an der vierten Schleifenposition...