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Ziel dieser Arbeit war die Untersuchung der Rolle der i-AAA Protease in P. anserina, besonders während des Alterns des Ascomyceten. Die dazu durchgeführten Untersuchungen führten zu folgenden Ergebnissen:
1. Unter Standardbedingungen ist der PaIap-Deletionsstamm langlebiger als der Wildstamm, ohne feststellbare physiologische Beeinträchtigungen aufzuweisen. Dass dies auf den Verlust von PaIap zurückzuführen ist, bestätigen die PaIap-Revertantenstämme, in denen das Gen wieder eingeführt wurde, wodurch deren Lebensspanne wieder Wildtyp-artig ist. Dies zeigt, dass PaIAP zelluläre Prozesse beeinflusst, die die Lebensspanne kontrollieren.
2. Bei Hitzestress weist der PaIap-Deletionsstamm dagegen eine höhere Hitzesensitivität auf als der Wildstamm, was sich in einer verkürzten Lebensspanne und der Störung vitaler Funktionen äußert. Dies deutet auf eine mögliche Rolle von PaIAP bei der Hitzestressantwort hin.
3. Im Einklang mit dem hitzesensitiven Phänotyp des PaIap-Deletionsstamms konnte in mitochondrialen Extrakten des Wildtyps gezeigt werden, dass die Proteinmenge von PaIAP durch Hitzestress signifikant zunimmt. Gleichzeitig weisen mitochondriale Proteinextrakte von PaIap-Deletionsstämmen nach Hitzestress signifikant geringere Mengen an PaHSP60 und PaCLPP auf, zwei weiteren Komponenten der mitochondrialen Proteinqualitätskontrolle. Dies unterstreicht die Beteiligung von PaIAP an der Hitzestressantwort von P. anserina.
4. Darüber hinaus beeinflusst der Verlust von PaIap die Zusammensetzung der mitochondrialen Atmungskette und führt bei 27°C zu einer vermehrten Organisation der Komplexe in stabilere Superkomplexe. Dieser Mechanismus wird beim Wildstamm erst nach Hitzestress beobachtet, wogegen der PaIap-Deletionsstamm die Superkomplexmenge nicht mehr weiter steigern kann.
5. Die Genexpression von proteolytisch inaktiven Varianten von PaIAP (PaIAPE540Q bzw. PaIAPE540QG) kann den Phänotyp des PaIap-Deletionsstamms bei 27°C nicht komplementieren und führt ebenfalls zu einer Verlängerung der Lebensspanne von P. anserina. Dies liefert wichtige Informationen über den Mechanismus wie PaIAP die Lebensspanne von P. anserina beeinflusst, da dazu die proteolytische Aktivität von PaIAP benötigt wird.
6. Darüber hinaus zeigt die Analyse des PaIap/PaClpP-Deletionsstamms, dass sich die Mechanismen, wie PaIAP und PaCLPP die Lebensspanne von P. anserina beeinflussen, unterscheiden. Die unterschiedlichen zellulären Aufgaben werden auch bei Hitzestress deutlich, wovon der PaIap/PaClpP-Deletionsstamm noch stärker betroffen ist als durch die Deletion von PaIap bzw. PaClpP. Dies verdeutlicht, dass sich die Effekte der Deletionen der beiden Gene addieren.
Insgesamt konnte in dieser Arbeit gezeigt werden, dass die i-AAA Protease PaIAP auch bei P. anserina wichtige zelluläre Funktionen besitzt, die sich auf den Alterungsprozess des Ascomyceten auswirken. Dabei war es möglich verschiedene neue Mechanismen zu identifizieren, wie die i-AAA Protease diese Funktionen ausübt. Dazu gehören z.B. der Einfluss der proteolytischen Aktivität auf die Lebensspanne, die durch die Abwesenheit der i-AAA Protease ausgelöste Reorganisation der Atmungskettenkomplexe in stabile Superkomplexe, und die Induktion der Hitzestressantwort durch PaIAP. Diese Befunde tragen zum besseren Verständnis der zellulären Funktion der i-AAA Protease bei und stellen einen entscheidenden Ausgangspunkt für weiterführende Analysen der bislang wenig verstandenen Aufgaben der Protease dar.
Untersuchungen zur Bedeutung von Superoxid-Dismutasen für die Alterung von Podospora anserina
(2012)
Im Rahmen dieser vorliegenden Doktorarbeit sollte die Bedeutung von Superoxid-Dismutasen für das Resistenzverhalten und den Alterungsprozess bei P. anserina untersucht werden. Folgende Befunde aus den Analysen konnten erhalten werden:
1. Lokalisationsstudien der drei PaSods: Aus den biochemischen und fluoreszenzmikroskopischen Untersuchungen der drei verschiedenen PaSODs geht hervor, dass PaSOD1, eine Cu/ZnSOD, überwiegend im Cytosol und zu einem geringen Anteil im mitochondrialen Intermembranraum lokalisiert ist. Eine der beiden MnSODs, PaSOD2, wird vermutlich zur Abwehr von exogenem Superoxid sekretiert. Bei PaSOD3 handelt es sich um eine mitochondriale MnSOD.
2. Generierung von verschiedenen PaSod-Mutanten: Im Rahmen dieser Arbeit wurden von jeder PaSod mindestens drei unabhängige Überexpressionsstämme, ein GFP-Stamm- und ein Deletionsstamm hergestellt. Weiterhin wurden alle möglichen Doppel-Deletionsstämme und die Dreifach-Deletionsmutante erzeugt. Alle Stämme wurden auf DNA-Ebene verifiziert, zusätzlich wurde die Proteinmenge bzw. –Aktivität überprüft.
3. Einfluss der PaSODs auf die ROS-Toleranz: Die Analysen der ROS-Resistenzen haben gezeigt, dass PaSODs eine wichtige Rolle in der Entgiftung von Superoxiden spielt. So ließ sich bei den Deletionsstämmen der PaSods eine gesteigerte Sensitivität gegenüber Paraquat feststellen. Eine Aufsummierung der Sensitivität gegenüber Paraquat ist bei der PaSod-Tripelmutante (ΔPaSod1/2/3) zu erkennen.
Überraschenderweise kann durch die gesteigerten Mengen an aktiver PaSOD in den Überexpressionsstämmen (PaSod1-3_OEx) keine verbesserte Resistenz gegenüber Paraquat erzielt werden. Darüber hinaus führt die Überexpression des Gens für die mitochondriale SOD, PaSOD3, zu massiven negativen Effekten.
4. Einfluss auf die Lebensspanne: Durch eine fehlende Entgiftung von Superoxid in den PaSod-Deletionsmutanten ist eine Verminderung der Lebensspanne nicht festzustellen. Bei PaSod-Mutantenstämme, die eine erhöhte PaSOD-Aktivität und damit eine gesteigerte Abbaurate des Superoxids aufweisen, kann bei den PaSod1- und PaSod2-Überexpressionsstämmen keine verbesserte Lebensspanne unter den gewählten Standardbedingungen erzielt werden. Vielmehr noch ist die Lebensspanne der PaSod3-Überexpressionsstämme stark reduziert.
5. Einfluss der PaSod-Modulation auf andere Komponenten des ROS-Abbausystems: Die PaSOD-Aktivitäten scheinen miteinander co-reguliert zu werden. Des Weiteren scheint es ein Zusammenhang zwischen den beiden sekretierten Enzymen PaSOD2 und PaCATB zu geben. Deutlich wird auch, dass die Modulation der Superoxid-Dismutasen eine weitreichende Auswirkung auf andere Schutzsysteme hat. Beispielweise konnte gezeigt werden, dass Komponenten des mitochondrialen ROS-Schutzsystems und der Protein-Qualitätskontrolle in den PaSod3-Überexpressionsstämmen verändert sind.
Zusammenfassend lassen die Analysen der PaSod-modulierten Stämme den Schluss zu, dass die Superoxid-Dismutase in P. anserina ein wichtiges Enzym zum Abbau des schädlichen Superoxids darstellt, welches aber nur eine untergeordnete Rolle bei der Kontrolle der Lebensspanne unter den gewählten Wachstumsbedingungen im Labor ausübt. Des Weiteren haben die Analysen gezeigt, dass es durch die Modulation der PaSod-Gene zu weitreichenden Änderungen, die das ROS-Schutzsystem (PaSOD, PaCATB und PaPRX1) sowie die Protein-Qualitätskontrolle (PaHSP60, PaLON und PaCLPP) betreffen, kommt. Welche Auswirkung dabei diese Veränderungen in Bezug auf die Lebensspanne hat, kann nur schwer abgeschätzt werden und muss mit weiteren Untersuchungen geklärt werden.
Das Ziel dieser Dissertation war es, die biologische Relevanz der F1Fo-ATP-Synthase für den Alterungsprozess des Ascomyceten P. anserina aufzuklären sowie die Funktion der Dimerisierungsuntereinheiten PaATPE und PaATPG genauer zu untersuchen. Folgende Ergebnisse wurden dabei erzielt:
1. Der Verlust einer Dimerisierungsuntereinheit führt in P. anserina zum Verlust der Dimerisierungsfähigkeit der F1Fo-ATP-Synthase. Dieses Ereignis resultiert in einer vorzeitigen Anhäufung von Seneszenzmerkmalen, einer starken Verkürzung der Lebensspanne und einem beschleunigten Alterungsprozess. Der Phänotyp der Stämme ∆PaAtpe und ∆PaAtpg lässt sich erfolgreich revertieren. Dadurch konnte bestätigt werden, dass der beobachtete Phänotyp der Deletionsstämme auf den Verlust der Dimerisierungsgene zurückzuführen ist.
2. Die konstitutive Überexpression des PaAtpe-Gens führt zu einer Verlängerung der Lebensspanne, die allerdings nicht abhängig von einer Erhöhung der Dimer-Menge, sondern auf eine Verlängerung der Mitochondriennetzwerke und eine erhöhte Atmung zurückzuführen ist.
3. Obwohl die Lebensspannen der untersuchten PaAtpg_OEx-Stämme voneinander abweichen, ist der auf den Organismus ausgeübte Effekt der PaAtpg-Überexpression positiv. Dabei lässt sich eine Erhöhung der Dimer-Menge auch in diesen Stämmen nicht nachweisen und eine Veränderung der Mitochondrienmorphologie tritt nur in einem der fünf untersuchten Stämme auf, was hier allerdings mit dem größten Effekt auf die Lebensspanne korreliert.
4. Die gleichzeitige Überexpression der Gene PaAtpe und PaAtpg führt interessanterweise zu einer Aufhebung der durch die PaAtpe-Überexpression hervorgerufenen positiven Effekte. Die generierte Doppelmutante weist somit wildtypische Eigenschaften auf. Eine Erhöhung der Dimer-Menge kann trotz Überexpression beider Gene nicht festgestellt werden.
5. Trotz gleicher Funktion in der Dimerbildung der F1Fo-ATP-Synthase ist das Expressionsniveau der Dimerisierungsgene in P. anserina unterschiedlich. Bereits im Wildtyp wird das PaAtpe-Gen weniger transkribiert als das PaAtpg-Gen. Letzteres wird durch die PaAtpe-Überexpression sowohl in den PaAtpe_OEx-Mutanten als auch in der Doppelmutante herunterreguliert. Auch im Wildtyp kommt es zu einer altersabhängigen Herunterregulierung des PaAtpg-Gens.
6. Im Wildtyp nimmt die Dimer-Menge im Alter ab und es kommt zu einer altersbedingten Änderung der Superkomplexe von S1 zu S0. Dies sind Hinweise auf eine altersabhängige Remodellierung der Cristae-Membran, die möglicherweise zum Seneszenzphänotyp von P. anserina beiträgt. Somit ist die Aufrechterhaltung des Dimers von großer Bedeutung für die Gewährleistung mitochondrialer Funktionen des Organismus.
Die F1Fo-ATP-Synthase spielt in ihrer dimeren Form eine bedeutende Rolle in der Aufrechterhaltung der Mitochondrienfunktion und gewährleistet den Ablauf von lebenswichtigen mitochondrialen Prozessen, die für die Erhaltung der zellulären Homöostase von essentieller Bedeutung sind.
Das Ziel dieser Dissertation war es die biologische Rolle der Ubiquitinierung und die Bedeutung für Alterungsprozesse im filamentösen Ascomyceten Podospora anserina zu untersuchen. Folgende Ergebnisse wurden dabei erzielt:
1. Ubiquitinierte Proteine wurden nachgewiesen und die Deubiquitinierung von Proteinen konnte durch den Einsatz der Inhibitoren Urea, PR-619 und PIC erfolgreich inhibiert werden, was die Anwesenheit aktiver Deubiquitinasen in P. anserina beweist. Zudem wurden erstmalig ubiquitinierte Proteine in P. anserina unter den zur Aufreinigung
gewählten Bedingungen über die Technik der LC-MS/MS identifiziert.
2. Insgesamt wurden 1745 ubiquitinierte Proteine in P. anserina identifiziert, was ca. 16,4 % des gesamten Proteoms darstellt. Somit wurde erstmalig das Ubiquitinom des Ascomyceten P. anserina charakterisiert, welches Proteine aus allen zellulären Kompartimenten enthält.
3. Die erste im Rahmen dieser Arbeit durchgeführte umfassende Studie altersabhängiger Veränderungen im Ubiquitinom eines Organismus zeigt eine Herabregulation der Ubiquitinierung im Alter in der gesamten Zelle. Dem gegenüber steigt die Ubiquitinierung an den Mitochondrien leicht an und unterstreicht die Rolle einer mitochondrialen Qualitätskontrolle durch diesen Prozess.
4. Die Untersuchung der am Ubiquitinierungsprozess beteiligten E3-Ligase PaMUS10 zeigt, dass es sich bei Mus10 um ein essentielles Gen in P. anserina handelt, da die Deletion zu starken mitochondrialen Beeinträchtigungen und dem sofortigen Absterben des Organismus direkt nach der Keimung führt.
5. Zur weiteren Untersuchung von PaMus10 wurde erstmalig und vollständig ein Hygromycin-basiertes „Knockdown“-System in P. anserina etabliert, was die detaillierte Untersuchung eines essentiellen Gens in diesem Organismus ermöglichte. Durch dessen Einsatz konnte eine reduzierte Fertilität, eine verkürzte Lebensspanne sowie Veränderungen der mitochondrialen Morphologie und Funktion als direkte Folge einer PaMus10-Herabregulation nachgewiesen werden.
6. PaMUS10 ist vorwiegend cytosolisch lokalisiert wird aber unter oxidativem Stress oder in gealterten Kulturen an die Mitochondrien rekrutiert, was einen vergleichbaren Mechanismus zur menschlichen E3-Ligase PARKIN darstellt.
7. Der Verlust von PaMUS10 verursacht ein Präseneszenzsyndrom und führt zum vorzeitigen Absterben des Organismus, wohingegen die zusätzliche Expression von PaMus10::Gfp offenbar positive Effekte nach sich zieht, da hier eine deutliche Verlängerung der Lebensspanne beobachtet wurde.
8. Der Vergleich der beiden Ubiquitinome von ∆PaMus10/PaMus10 und Wthph1/2 zeigt eine massive Reduzierung der globalen Ubiquitinierung, welche offenbar durch das Fehlen von PaMUS10 ausgelöst wird und damit dessen Funktion als E3-Ligase untermauert.
9. Im Rahmen der hier durchgeführten Substratanalyse wurden insgesamt 131 Proteine identifiziert, von denen ca. 20 % dem Mitochondrium zugeordnet werden können. Aufgrund der diversen biologischen Prozesse und Funktionen dieser Substrate ist PaMUS10 sowohl in die Ubiquitinierung cytosolischer als auch mitochondrialer Proteine involviert und greift womöglich sogar als zentraler Schalter in die gesamte zelluläre Homöostase ein.
Aufgrund der nicht unerheblichen Zahl der identifizierten ubiquitinierten Proteine (Ubiquitinom) und den fatalen Auswirkungen, die der Verlust einer E3-Ligase in diesem Organismus nach sich zieht, lässt sich folgende grundlegende Erkenntnis formulieren:
Die Ubiquitinierung spielt in P. anserina eine bedeutende Rolle zur Aufrechterhaltung zellulärer Prozesse insbesondere der mitochondrialen Homöostase und beeinflusst dadurch positiv die Entwicklung und Alterung in diesem Organismus.
Autophagy, meaning “self-eating”, is an important cellular waste disposal mechanism. Thereby, damaged proteins, lipids and organelles are enclosed by autophagosomes and subsequently transported to the lysosomes for degradation into basic, cellular building blocks. Under basal conditions autophagy prevents the accumulation of defective and harmful material and generally promotes cell survival. However, several studies reported that hyperactivated autophagy, e.g. during developmental processes in lower eukaryotes, or during chemotherapeutic treatment of cancer cells, can also trigger cell death.
In recent years, autophagic cell death (ACD) has been considered as an alternative cell death pathway for tumor therapy, especially for solid tumors with high apoptosis resistance such as glioblastoma. Glioblastoma (GBM) is a very aggressive, malignant primary brain tumor with a median survival of ~ 15 months despite surgery and chemoradiotherapy. Accordingly, there is a great interest in improving GBM therapy through alternative cell death mechanisms. Interestingly, it has been shown that various substances, e.g. AT 101, cannabinoids and the combination of imipramine and ticlopidine (IM+TIC), induce ACD in GBM cells.
The aim of this project was to identify the underlying mechanisms of stress- and drug-induced ACD and its therapeutic potential for glioblastoma treatment. For detailed investigation of ACD, a CRISPR/Cas9-based approach was used to generate ATG5 and ATG7 knockouts as genetic models of autophagy deficiency. In a previous study of our lab it was demonstrated that administration of AT 101 triggers ACD in glioblastoma cells, which was associated with early mitochondrial fragmentation but no signs of apoptosis. Since mitochondrial fragmentation often precedes mitophagy, the first part of this thesis explored the potential role of mitophagy in AT 101-induced cell death.
ATG5-depleted cells confirmed that AT 101 induces ACD. In addition, treatment with AT 101 resulted in a pronounced mitochondrial depolarization, which was at least partly caused by the opening of the mitochondrial permeability pore. Global proteome analysis of AT 101-treated GBM cells revealed a robust decrease in mitochondrial protein clusters as well as a strong increase in the enzyme heme oxygenase-1 (HMOX1). Subsequent experiments for detailed investigation of mitophagy following AT 101 treatment (western blot, flow cytometric MTG and mt-mKeima, qRT-PCR of mitochondrial vs nuclear DNA) consistently indicated strong mitophagy induction by AT 101, which could be reduced by genetic or pharmacological inhibition of autophagy. Furthermore, siRNA-mediated knockdown experiments revealed that the selective mitophagy receptors BNIP3 and BNIP3L and the HMOX1 enzyme play an essential role in AT 101-induced mitophagy and subsequent cell death. Taken together, these data demonstrate that AT 101-induced mitochondrial dysfunction and HMOX1 induction synergize to promote excessive mitophagy with a lethal outcome in glioma cells.
The second part of this thesis focused on the identification of new substances that cause ACD and the investigation of the underlying cell death pathways. Using a cell death screen of the ENZO Screen-Well™ autophagy library in MZ-54 wild-type vs ATG5 and ATG7-depleted cells, loperamide, pimozide, and STF-62247 were identified as ACD-inducing agents. The increase of the autophagic flux and the induction of ACD by these substances was confirmed by using different ATG5 and ATG7 knockout cell lines and the already established positive control IM+TIC.
In contrast to AT 101, IM+TIC, STF-62247, loperamide and pimozide produced neither mitochondrial dysfunction nor mitophagy. Interestingly, it has been described that imipramine, loperamide and pimozide inhibit the lysosomal enzyme acid sphingomyelinase, which is associated with impaired lipid transport. Global proteome analysis and cholesterol staining confirmed that all four substances, but especially loperamide and pimozide, inhibit cellular lipid transport, leading to massive lipid accumulation in the lysosomes. In the further course of the experiments, the connection between defective lipid transport and autophagy was investigated in more detail. On the one hand, the defective lipid transport contributed to the induction of autophagy, on the other hand the massive accumulation of lipids led to lysosomal membrane damage, inhibition of lysosomal degradation at later time points and finally to a lysosomal cell death. Remarkably, it has been shown that hyperactivated autophagy by IM+TIC, loperamide and pimozide massively promotes lysosomal membrane damage. This result highlights the difficulties of a clear distinction between autophagic and lysosomal cell death.
In summary, two new signaling pathways that induce autophagic cell death in GBM cells and may be relevant for glioblastoma therapy were investigated in this study.
Reaktive Sauerstoffspezies lösen molekular Schäden aus und werden als möglicher Auslöser des Alterungsprozesses gesehen. Sie sind allerdings auch wichtige Signalgeber, deren Einfluss in den letzten Jahren immer mehr Beachtung findet. Im der vorliegenden Arbeit wurde die Signalwirkung von ROS auf das Alternsmodell P. anserina untersucht. Dabei konnten folgende Erkenntnisse gewonnen werden.
1. Die H2O2–Konzentration im Extrazellularraum und im Cytoplasma steigt bei PQ-Stress und während des Alterns an.
2. Bei PQ-Stress und während des Alterns treten Ähnlichkeiten der globalen Transkriptregulation auf, die vermutlich durch die angestiegene H2O2-Konzentration ausgelöst werden.
3. Die Transkriptmenge von SODs und die Gesamt-SOD-Aktivität sind bei PQ-Stress leicht herunterreguliert. Transkripte für PaCCP1 und PaCATB treten dagegen bei PQ-Stress vermehrt auf und auch die Gesamt-Katalase-Aktivität steigt an. Dies deutet darauf hin, dass der Fokus des enzymatischen Abbaus von ROS bei PQ-Stress nicht im Abbau von Superoxid-, sondern von Wasserstoffperoxid liegt.
4. Bei PQ-Stress steigt die Transkriptmenge von Schlüsselgenen der Carotinoid-Biosynthese.
5. Transkripte von mitochondrial lokalisierten Proteinen werden bei PQ-Stress stark hochreguliert, die Menge an Mitochondrien nimmt allerdings nicht zu. Dies deutet auf einen verstärkten Abbau mitochondrialer Proteine, gefolgt von einer Neusynthese hin.
6. Bei PQ-Stress sinkt die Expression von Genen, die für den Kupferimport benötig werden. Dies wird höchstwahrscheinlich durch die Inaktivierung des Transkriptionsfaktors GRISEA ausgelöst. Es kommt zu einem Kupfermangel, der eine verstärkte alternative PaAOX-abhängige Atmung auslöst und dafür sorgt, dass kupferabhängige Prozesse, wie die Melanin- und Sterigmatocystin-Synthese transkriptionell herunterreguliert werden. Durch die verringerte Transkriptmenge von Kupferimportern bei PQ-Stress kommt es zu starken Gemeinsamkeiten in der globalen Genregulation von PQ-gestressten Kulturen und der Kupfer-depletierten Mutante grisea.
7. Kupfer und PQ haben einen synergistisch negativen Effekt auf Wuchsrate und Lebensspanne von P. anserina. Bei hohen Kupfer und Superoxid-Konzentrationen kommt es vermutlich zur verstärkten Bildung von Hydroxyl-Radikalen, wodurch molekulare Schäden entstehen. Durch eine verringerte Kupferkonzentration wird der Organismus bei PQ-Stress möglicherweise vor der Bildung von Hydroxyl-Radikalen geschützt.
Insgesamt haben die Untersuchungen gezeigt, dass ROS wichtige Signalmoleküle sind, die einen starken Einfluss auf die Regulation von Transkripten haben. Viele dieser transkriptionellen Regulationen führen zu physiologischen Veränderungen. Der Fokus der Regulationen liegt unter den verwendeten Bedingungen im Schutz vor den schädlichen Effekten von ROS.
Ubiquitin and the ubiquitin-like protein ATG8 are covalently attached to their respective targets via a coordinated cascade involving E1 activating, E2 conjugating and E3 ligating enzymes. Whereas ubiquitin is conferred to proteins as mono- and/or polymer(s) to alter their stability, localization and/or activity, the ubiquitin-like modifier (UBL) ATG8 is conjugated to the phospholipid phosphatidylethanolamine (PE). The best understood function of ATG8 is during autophagy where ATG8-PE conjugates are incorporated into both layers of incipient autophagosomes and serve as multipurpose docking sites for autophagosomal cargo receptors as well as regulatory factors (termed adaptors) that drive formation and maturation of autophagosomes. Mammalian cells harbor six ATG8 family members that can be subclassified into the LC3- and GABARAP-family and that can all be lipidated. However, it is currently unclear to what extent these proteins are functionally redundant or fulfil unique roles.
Cullin-RING ligase complexes (CRLs) are modular E3 ubiquitin ligases that comprise a RING-finger protein that associates with the ubiquitin-charged E2 enzyme, a substrate recruiting module as well as a cullin scaffold as a linker between RING protein and substrate adaptor. Whereas SCF (SKP1-CUL1-F-box protein) complexes, the most studied CRLs, harbor cullin-1 (CUL1) as scaffold and F-box proteins as substrate binding modules, CUL3-containing CRL complexes employ cullin-3 (CUL3), RING-box protein 1 (RBX1) and BTB proteins as substrate adaptors. Here, the BTB domain serves as binding interface for CUL3 and is usually complemented by an additional protein-protein interaction domain such as MATH or Kelch that mediates binding to the substrate of the E3 ligase complex.
Besides ubiquitylation, guanine nucleotide binding is another common way to regulate protein activity and signaling in cells. Here, small Rho GTPases cycle between active and inactive states by binding of the guanine nucleotides GTP or GDP with the help of regulatory proteins. Whereas GTPase-activating proteins (GAP) render RAC1 inactive by facilitating GTP hydrolysis, guanine exchange factors (GEF) such as T-lymphoma invasion and metastasis-inducing protein 1 (TIAM1) activate RAC1 by stimulating the exchange of GDP to GTP. Local control of RAC1 activity is essential to allow a specific cellular response to stimuli such as growth factors or migratory impulses.
This study reports an unexpected link between the GABARAP subfamily of mammalian ATG8 proteins, the ubiquitin proteasome system and RAC1 through the ubiquitylation of the RAC1 GEF TIAM1. The Kelch repeat and BTB domain-containing proteins 6 (KBTBD6) and 7 (KBTBD7) were established as heterodimeric substrate adaptors for CUL3. Interestingly, a thorough proteomic analysis revealed a number of putative substrates but, out of 11 substrate candidates tested, only the RAC1 GEF TIAM1 appeared to be influenced by depletion of CUL3KBTBD6/KBTBD7. Binding studies showed that KBTBD7 binds TIAM1 via the Kelch repeats and that this binding was markedly enhanced when CUL3 activation was abolished upon treatment with the neddylation inhibitor MLN4924. Also, total TIAM1 abundance was increased upon CUL3KBTBD6/KBTBD7 depletion and accumulation of TIAM1 upon proteasome inhibition suggested that TIAM1 is degraded via the proteasome. In vivo ubiquitylation assays and denaturing immunoprecipitations as well as mass spectrometrical analysis confirmed that CUL3KBTBD6/KBTBD7 ubiquitylates TIAM1 at two distinct lysines (K1404 and K1420) close to its C-terminus.
Previously, KBTBD6 and KBTBD7 were found as interactors of several members of the human ATG8 family of proteins in a proteomic study analyzing the human autophagy network. This association was confirmed in the present work. Furthermore, peptide array technology and mutational analysis revealed that KBTBD6 and KBTBD7 employ a classical ATG8-family interacting motif (AIM; also referred to as LC3-interacting region or LIR) as binding interface. The AIMs of KBTBD6 (W-V-R-V) and KBTBD7 (W-V-Q-V) fulfil the consensus AIM sequence motif (F/W/Y1-X2-X3-I/L/V4) and are preceded by several acidic residues and serines. A series of structural and cell biological experiments revealed a binding preference for the GABARAP subfamily of human ATG8 proteins and most importantly, a requirement of the GABARAP-KBTBD6 and -KBTBD7 interaction for TIAM1 ubiquitylation. The finding that TIAM1 binding to KBTBD6 and KBTBD7 AIM mutants was diminished raised the possibility that GABARAP binding mediates the recruitment of CUL3KBTBD6/KBTBD7 to membranes where TIAM1 is localized. Interestingly, colocalization of KBTBD6, GABARAPL1 and TIAM1 in punctuate structures could be observed. Since only a very small fraction of GABARAPL1 colocalized with LC3B, and colocalization between KBTBD6 and LC3B was not observed, these vesicular structures are most likely distinct from autophagosomes. Furthermore, TIAM1 ubiquitylation was reduced when GABARAP, but not LC3B, was depleted or when lipidation of GABARAP was prevented.
Stabilization of TIAM1 upon KBTBD6 and/or KBTBD7 depletion led to elevated TIAM1-dependent RAC1 activity, altered actin morphology with increased cortical actin and loss of vinculin foci. Re-introduction of wild-type KBTBD6 or KBTBD7 but not AIM mutants reverted all these phenotypes. Moreover, depletion of KBTBD6 or KBTBD7 in human breast cancer cells massively increased their invasiveness, whereas TIAM1 knockdown had the opposite outcome. All physiological effects of KBTBD6 and KBTBD7 depletion were inhibited by additional depletion of TIAM1 or RAC1 confirming that the phenotypes observed are indeed mediated by the CUL3KBTBD6/KBTBD7-TIAM1-RAC1 signaling pathway. Intriguingly, KBTBD6 and KBTBD7 were not subject to autophagosomal degradation, thereby establishing a new function for GABARAP proteins beyond autophagosomal degradation in providing a signaling platform for recruitment of the E3 ligase CUL3KBTBD6/KBTBD7 in close proximity to its substrate TIAM1, enabling localized ubiquitylation.
Local restricted control of RAC1 activity by ubiquitylation has been described for TIAM1-RAC1 signaling previously. Examples are HECT, UBA and WWE domain-containing protein 1 (HUWE1)-mediated TIAM1 ubiquitylation that occurs predominantly at cell-cell-junctions in response to hepatocyte growth factor stimulation in MDCKII cells or inhibition of RAC1 activity by the RAC1 GAP protein BCR (breakpoint cluster region) at the leading edge of astrocytes through binding to the TIAM1-Par (polarity) complex. SCFBTRC mediates ubiquitylation of TIAM1 in response to mitogens or DNA damage, though it has not been explored whether this regulation is spatially restricted. Thus, this study adds a novel layer of complexity to the spatial regulation of RAC1 signaling by implicating membrane-bound human ATG8 proteins in this process.
Also, this study is the first report specifically implicating the GABARAP proteins in cellular signaling events. It will be interesting to explore whether the concept of localized signaling mediated by GABARAPs applies to other substrates of CUL3KBTBD6/KBTBD7 and membranerelated signaling processes in which GABARAP proteins are involved. Controlling RAC1 activity at GABARAP-decorated membranes might also be important for trafficking events or autophagy since it was described that RAC1 has an inhibitory function on autophagy. Therefore, spatial restricted ubiquitylation of TIAM1 resulting in specific deactivation of RAC1 could promote the autophagic process when locally needed. Although the catalytic mTOR inhibitor Torin1 and the lysosomal H+ ATPase inhibitor BafilomycinA1 promoted TIAM1 ubiquitylation by increasing the pool of membrane-conjugated GABARAP, but other signals that stimulate GABARAP-KBTBD6/KBTBD7 association and subsequent TIAM1 ubiquitylation are to be identified. Besides, determining the KBTBD6/KBTBD7 binding site in TIAM1 or uncovering a deubiquitylating enzyme (DUB) that locally counteracts the ubiquitylation of TIAM1 will enable a better comprehension of the complete localized signaling cascade.
This dissertation aimed to shed light on changes of the epigenetic landscape in heart and skeletal muscle tissue of the turquoise Killifish N. furzeri, a novel, short-lived animal model for aging research. The following results could be obtained:
1. A global trend towards closed chromatin conformation could be observed; histone markers for H3K27me3, H3K9me3 and H4K20me3 accumulated in skeletal muscle tissue from old N. furzeri. Markers for open chromatin conformation such as H3K4me3, H3K9ac and H4K16ac decreased in old skeletal muscle tissue. In old hearts from N. furzeri an accumulation of H3K27me3 could be detected while H3K9ac was found to increase with age as well. mRNA expression levels of methylating enzymes were higher in skeletal muscle tissue from old N. furzeri when compared to expression levels in skeletal muscle tissue from young N. furzeri.
2. The shift of epigenetic pattern was accompanied by a change of gene expression. Via mRNA sequencing in collaboration with the MPI, Bad Nauheim it could be shown that genes associated with cell cycle and DNA repair were lower expressed in skeletal muscle tissue from old N. furzeri than in tissue from young N. furzeri. Genes, associated with inflammatory signaling and glycolysis, displayed increased mRNA levels in skeletal muscle tissue from old N. furzeri. These results could be confirmed by Western blot and qRT-PCR analyses.
3. Markers for DNA damage and senescence increased in skeletal muscle tissue from old N. furzeri.
4. Cells derived from young and old N. furzeri skeletal muscle could be isolated and cultured for many passages. These cells were a mix of different cell types with properties and features of the native tissue. They could be used for treatment with drugs and/small compounds modulating the epigenetic landscape via specific interference with methylating enzymes.
5. DNA methylation and hydroxy-methylation were found to go in different directions in skeletal muscle and heart tissue from N. furzeri: while increasing in skeletal muscle tissue, a both DNA modifications declined in heart tissue with age.
6. In the heart of N. furzeri microRNA expression changes with age were assed with sequencing in collaboration with the FLI, Jena. It could be demonstrated that miRNA expression is age-dependent. Particular focus was on miR-29 and its target genes: miR-29 was highly upregulated in heart and skeletal muscle tissue, while target genes such as collagens and dnmts were reduced with age in the heart of N. furzeri.
7. Cardiac function remained stable with age and no accumulation of collagens could be found when comparing hearts of young and old N. furzeri despite the increase of markers for oxidative stress.
8. Cell culture experiments with human cardiac fibroblasts revealed that miR-29 is upregulated with increasing age of the donor. In addition to that, it could be shown that miR-29 is positively regulated by oxidative stress.
9. A zebrafish mutant with modified expression of miR-29 that was created in collaboration with the SNS, Pisa, presented a severe hypoxic phenotype and an altered mRNA expression profile compared to wild type control zebrafish. Cardiac dysfunction and hypertrophy were observed as well as an increase in DNA methylation and collagens.
Taken together, it could be shown that the aging process in skeletal muscle and heart tissue from N. furzeri leads to a series of changes on epigenetic levels. It remains to be elucidated whether these changes are result or cause for further changes of mRNA expression, protein levels and pathophysiology, yet the N. furzeri represents a promising research model for further aging studies.
In der vorliegenden Doktorarbeit zur Untersuchung der Rolle der Superoxid-Dismutasen in P. anserina lieferten die durchgeführten Analysen folgende Ergebnisse:
1)Sowohl in P. anserina als auch in S. cerevisiae wurde eine gemeinsame Regulation von SODs nachgewiesen: Stämme, die die mitochondriale MnSod (PaSod3 bzw. ScSod2) überexprimieren zeigen eine erhöhte Cu/ZnSOD-Aktivität (PaSOD1 bzw. ScSOD1).
2)Es konnte keine SOD-Aktivität für die putativen SODs Pa_1_10620, Pa_1_10630 und Pa_1_6300 detektiert werden. Für Pa_1_10620, dessen Überexpression unter Standardbedingungen zu einer Lebensverlängerung führt, wird eine Funktion als mitochondriales ribosomales Protein angenommen.
3)Der ∆PaSod3-Stamm weist keinen Unterschied im Phänotyp, der Wuchsrate und der Lebensspanne unter Standardbedingungen zum Wildtyp auf. Paraquat-Stress führt allerdings zu einer Kurzlebigkeit des ∆PaSod3-Stammes, wohingegen diese Mutante eine höhere Resistenz gegenüber Wasserstoffperoxid aufweist als der Wildtyp.
4)Transkriptomanalysen des Wildtyps und der ∆PaSod3-Mutante lassen vermuten, dass eine Hochregulation von Detoxifizierungs- und Energie-abhängigen Prozessen die durch den Verlust der mitochondrialen PaSOD3 vermuteten negativen Auswirkungen kompensieren.
5)PaSod3_OEx-Stämme weisen unter Standardbedingungen aufgrund der erhöhten intrazellulären Wasserstoffperoxid-Menge, bedingt durch die vermehrte Umsetzung von Superoxid, diverse negative Auswirkungen auf: Eine reduzierte Wuchsrate, verkürzte Lebensspanne, geringere Fertilität, stärkere Pigmentierung, vermehrt fragmentierte Mitochondrien, mehr unprozessierte mitochondriale Proteine und weniger Komplex IV der Atmungskette als der Wildtyp. Zusätzlich wird vermehrt über die alternative Oxidase geatmet, um die ROS-Generierung zu reduzieren.
6)Oxidativer Stress in Form von Paraquat führt in PaSod3_OEx-Stämmen zu einer weiteren Verkürzung der medianen Lebensspanne, während die maximale Lebensspanne von PaSod3_OEx3-Stämmen im Vergleich zum Wildtyp sogar verlängert ist. Wasserstoff-peroxid resultiert in stark verringerten medianen und maximalen Lebensspannen beider PaSod3-überexprimierenden Stämme.
7)Die Anzucht auf Medium mit zusätzlichem Mangan (80 µM MnSO4) kann die beobachteten Defekte der PaSod3_OEx-Stämme fast vollständig auf Wildtyp-Niveau revertieren: Die Wuchsrate, die Lebensspanne, der Phänotyp, die Mitochondrien-morphologie, die Prozessierung mitochondrialer Proteine und die Atmung entsprechen dem Wildtyp. Lediglich die Fertilität erreicht nicht das Wildtyp-Niveau. Diese positiven Effekte von Mangan werden erzielt, da die erhöhte Wasserstoffperoxid-Menge in PaSod3_OEx-Stämmen entsprechend ihrer Entstehung detoxifiziert wird, denn Mangan führt zu einer gesteigerten Transkription bzw. Aktivität von Katalasen und Peroxidasen sowie zu einer erhöhten Peroxiredoxin-Menge.
8)Die Anzucht des Wildtyps unter Wasserstoffperoxid-Stress resultiert in einer Lebens-spannenverkürzung. Diese kann durch Supplementation mit Mangan revertiert werden. Unter diesen Bedingungen weisen u. a. Peroxidasen eine erhöhte Aktivität auf.
Insgesamt ließen die gewonnenen Daten den Schluss zu, dass das Genom von P. anserina für drei aktive SODs kodiert. Ein Verlust der einzigen mitochondrial lokalisierten SOD kann durch die Induktion von Energie-abhängigen Prozessen sowie von Detoxifizierungsprozessen kompensiert werden. Ferner weisen die durchgeführten Studien darauf hin, dass PaSod3_OEx-Stämme als Modell für erhöhte intrazelluläre Wasserstoffperoxid-Mengen in P. anserina verwendet werden können. Darüber hinaus wurde ein Zusammenhang zwischen Mangan und dem Detoxifizierungs-netzwerk in P. anserina nachgewiesen. Dabei können zwei Mechanismen zur Reduktion der Wasserstoffperoxid-Mengen unterschieden werden: Bei Vorhandensein ausreichender Mengen Mangan kommt es zu einer stärkeren Detoxifizierung von Wasserstoffperoxid. Ist Mangan allerdings limitiert und die Detoxifizierung kann nicht gesteigert werden, wird eine Umstellung der Atmung eingeleitet, um die neu entstehende ROS-Menge zu minimieren.
Untersuchungen zur molekularen Kontrolle der Kupferhomöostase in dem Ascomyceten Podospora anserina
(2007)
Das essentielle Spurenelement Kupfer ist Co-Faktor mehrerer Schlüsselenzyme (z B. Cu/Zn-SOD, Cytochrom c Oxidase). Da Kupfer leicht Elektronen aufnehmen und abgeben kann, eignet es sich besonders gut für Redox-Reaktionen. Wenn Kupfer jedoch mit Sauerstoff reagiert, entstehen hoch cytotoxische reaktive Sauerstoffspezies (ROS), die nach der „freien Radikaltheorie des Alterns“ (nach D. Harman 1956) ursächlich für Alterung und Zelltod sind. Um deren Bildung zu vermeiden, erfolgen alle Aspekte des Kupferstoffwechsels – Aufnahme, Transport und Speicherung - stets proteingebunden. In der vorliegenden Arbeit konnte gezeigt werden, dass sich bis auf drei Ausnahmen die gesamte bislang bekannte Maschinerie der molekularen Kupferhomöostase aus anderen Modellorganismen (z.B. S. cerevisiae oder H. sapiens) auch im Genom des Ascomyceten Podospora anserina mit Homologen bzw. Orthologen wiederfindet. Die drei Ausnahmen betreffen jeweils Proteine, für die in anderen Organismen mehrere Isoformen existieren und P. anserina nur jeweils ein Homolog/Ortholog besitzt. Für mehrere der neu vorhergesagten Gene (PaAtx1, PaCcc2, PaCcs1, PaCox11, PaCox19, PaCox23, PaSco1) konnte eine Expression im Wildstamm nachgewiesen werden. Dazu wurden Standardtechniken (Northern Blot Analyse, RT-PCR) und auch neu etablierte eGFP-Reporterkonstrukte verwendet. In Podospora anserina scheint Kupfer auf zwei verschiedene Arten Einfluss auf die Lebensspanne zu nehmen: Zum einen mittelbar darüber, dass die Verfügbarkeit von Kupfer über die in der mitochondrialen Atmung verwendete Endoxidase entscheidet. Bei Kupfermangel wird eine Eisen-abhängige alternative Oxidase (AOX) induziert. Durch Atmung über die AOX entstehen weniger ROS, was die Lebensspanne verlängert. Anhand einer Vielzahl langlebiger Mutanten konnte dieser Zusammenhang bereits mehrfach demonstriert werden. Zum anderen scheint Kupfer auch eine unmittelbare Rolle in der Seneszenz von P. anserina zu spielen. In früheren Arbeiten konnten mehrere indirekte Hinweise (Transkript- und Aktivitätsanalysen) gesammelt werden, dass im Alter die cytoplasmatische Kupferkonzentration drastisch ansteigt. Durch Messung der Kupferkonzentration mittels einer direkten chemisch-analytische Methode (TXRF) in fraktionierten Zellbestandteilen (Cytoplasma und Mitchondrien) konnten in dieser Arbeit diese Hinweise weiter untermauert werden. Experimente mit in die mitochondriale Matrix geleitetem eGFP brachten zusätzliche Indizien dafür, dass das mitochondriale Kupfer-Reservoir die Quelle des sich in seneszenten Pilzstämmen im Cytoplasma wiederfindenden Kupfers ist. Durch einen Prozess, der größenabhängig reguliert und in anderen Organismen als „Mitochondrial Permeability Transition – MPT“ zu Beginn der Apoptose bekannt ist, ergiesst sich beim Eintritt in die Seneszenz der Inhalt der mitochondrialen Matrix in das Cytosol. Die Bedeutung dieses Vorgangs und v.a. die Folgen der Umverteilung von Kupfer innerhalb der Zelle bleiben im Detail weiter zu klären. Durch die durchgeführten Arbeiten konnte ein weiterer deutlicher Beweis für das Ablaufen apoptotischer Mechansimen im Alterungsprozeß des Ascomyceten P. anserina erbracht werden.