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Antimicrobial resistance became a serious threat to the worldwide public health in this century. A better understanding of the mechanisms, by which bacteria infect host cells and how the host counteracts against the invading pathogens, is an important subject of current research. Intracellular bacteria of the Salmonella genus have been frequently used as a model system for bacterial infections. Salmonella are ingested by contaminated food or water and cause gastroenteritis and typhoid fever in animals and humans. Once inside the gastrointestinal tract, Salmonella can invade intestinal epithelial cells. The host cell can fight against intracellular pathogens by a process called xenophagy. For complex systems, such as processes involved in the bacterial infection of cells, computational systems biology provides approaches to describe mathematically how these intertwined mechanisms in the cell function. Computational systems biology allows the analysis of biological systems at different levels of abstraction. Functional dependencies as well as dynamic behavior can be studied. In this thesis, we used the Petri net formalism to gain a better insight into bacterial infections and host defense mechanisms and to predict cellular behavior that can be tested experimentally. We also focused on the development of new computational methods.
In this work, the first realization of a mathematical model of the xenophagic capturing of Salmonella enterica serovar Typhimurium in epithelial cells was developed. The mathematical model expressed in the Petri net formalism was constructed in an iterative way of modeling and analyses. For the model verification, we analyzed the Petri net, including a computational performance of knockout experiments named in silico knockouts, which was established in this work. The in silico knockouts of the proposed Petri net are consistent with the published experimental perturbation studies and, thus, ensures the biological credibility of the Petri net. In silico knockouts that have not been experimentally investigated yet provide hypotheses for future investigations of the pathway.
To study the dynamic behavior of an epithelial cell infected with Salmonella enterica serovar Typhimurium, a stochastic Petri net was constructed. In experimental research, a decision like "Which incubation time is needed to infect half of the epithelial cells with Salmonella?" is based on experience or practicability. A mathematical model can help to answer these questions and improve experimental design. The stochastic Petri net models the cell at different stages of the Salmonella infection. We parameterized the model by a set of experimental data derived from different literature sources. The kinetic parameters of the stochastic Petri net determine the time evolution of the bacterial infection of a cell. The model captures the stochastic variation and heterogeneity of the intracellular Salmonella population of a single cell over time. The stochastic Petri net is a valuable tool to examine the dynamics of Salmonella infections in epithelial cells and generate valuable information for experimental design.
In the last part of this thesis, a novel theoretical method was introduced to perform knockout experiments in silico. The new concept of in silico knockouts is based on the computation of signal flows at steady state and allows the determination of knockout behavior that is comparable to experimental perturbation behavior. In this context, we established the concept of Manatee invariants and demonstrated the suitability of their application for in silico knockouts by reflecting biological dependencies from the signal initiation to the response. As a proof of principle, we applied the proposed concept of in silico knockouts to the Petri net of the xenophagic recognition of Salmonella. To enable the application of in silico knockouts for the scientific community, we implemented the novel method in the software isiKnock. isiKnock allows the automatized performance and visualization of in silico knockouts in signaling pathways expressed in the Petri net formalism. In conclusion, the knockout analysis provides a valuable method to verify computational models of signaling pathways, to detect inconsistencies in the current knowledge of a pathway, and to predict unknown pathway behavior.
In summary, the main contributions of this thesis are the Petri net of the xenophagic capturing of Salmonella enterica serovar Typhimurium in epithelial cells to study the knockout behavior and the stochastic Petri net of an epithelial cell infected with Salmonella enterica serovar Typhimurium to analyze the infection dynamics. Moreover, we established a new method for in silico knockouts, including the concept of Manatee invariants and the software isiKnock. The results of these studies are useful to a better understanding of bacterial infections and provide valuable model analysis techniques for the field of computational systems biology.
Die digitale Pathologie ist ein neues, aber stetig wachsendes, Feld in der Medizin. Die kontinuierliche Entwicklung von verbesserten digitalen Scannern erlaubt heute das Abscannen von kompletten Gewebeschnitten und Whole Slide Images gewinnen an Bedeutung. Ziel dieser Arbeit ist die Methodenentwicklung zur Analyse von Whole Slide Images des klassischen Hodgkin Lymphoms. Das Hodgkin-Lymphom, oder Morbus Hodgkin, ist eine Tumorerkrankung des Lymphsystems, bei der die monoklonalen Tumorzellen in der Regel von B-Lymphozyten im Vorläuferstadium abstammen.
Etwas mehr als 9.000 Hodgkin-Lymphom-Fälle werden jährlich in den USA diagnostiziert. Zwar ist die 5-Jahre-Überlebensrate für Hodgkin-Lymphome mit 85,3 % vergleichsweise hoch, dennoch werden etwa 1.100 Todesfälle pro Jahr in den USA registriert. Auf mikroskopischer Ebene sind die Hodgkin-Reed-Sternberg Zellen (HRS-Zellen) typisch für das klassische Hodgkin Lymphom. HRS-Zellen haben einen oder mehrere Zellkerne, die stark vergrößert sind und eine grobe Chromatinstruktur aufweisen. Immunhistologisch gibt es für HRS-Zellen charakterisierende Marker, so sind HRS-Zellen positiv für den Aktivierungsmarker CD30.
Neben der konventionellen Mikroskopie, ermöglichen Scanner das Digitalisieren von ganzen Objektträgern (Whole Slide Image). Whole Slide Images werden bisher wenig in der Routinediagnostik eingesetzt. Ein großer Vorteil von digitalisierten Gewebeschnitten bietet sich bei der computergestützten Analyse. Automatisierte Bildanalyseverfahren wie Zellerkennung können Pathologen bei der Diagnose unterstützen, indem sie umfassende Statistiken zur Anzahl und Verteilung von immungefärbten Zellen bereitstellen.
Die untersuchten immunohistologischen Bilder wurden vom Dr. Senckenbergisches Institut für Pathologie des Universitätsklinikums Frankfurt bereit gestellt. Die betrachteten Gewebeschnitte sind gegen CD30 immungefärbt, einem Membranrezeptor, welcher in HRS-Zellen und aktivierten Lymphozyten exprimiert wird. Die Gewebeschnitte wurden mit einem Aperio ScanScope slide scanner digitalisiert und liegen mit einer hohen Auflösung von 0,25 μm pro Pixel vor. Bei den vorliegenden Gewebeschnittgrößen ergeben sich Bilder mit bis zu 90.000 x 90.000 Pixeln.
Der untersuchte Bilddatensatz umfasst 35 Bilder von Lymphknotengewebeschnitten der drei Krankheitsbilder: Gemischtzelliges klassisches Hodgkinlymphom, noduläres klassisches Hodgkinlymphom und Lymphadenitis. Die Bildverarbeitungspipeline wurden teils neu implementiert, teils von etablierten Bilderkennungssoftware und -bibliotheken wie CellProfiler und Java Advanced Imaging verwendet. CD30-positive Zellobjekte werden in den Gewebeschnitten automatisiert erkannt und neben der globalen Position im Whole Slide Image weitere Morphologiedeskriptoren berechnet, wie Fläche, Feret-Durchmesser, Exzentrität und Solidität. Die Zellerkennung zeigt mit 84 % eine hohe Präzision und mit 95 % eine sehr gute Sensitivität.
Es konnte gezeigt werden, dass in Lymphadenitisfällen im Schnitt deutlich weniger CD30- positive Zellen präsent sind als in klassisches Hodgkinlymphom. Während hier im Schnitt nur rund 3.000 Zellen gefunden wurden, lag der Durchschnitt für das Mischtyp klassisches Hodgkinlymphom bei rund 19.000 CD30 positiven Zellen. Während die CD30-positiven Zellen in Lymphadenitisfällen relativ gleichmäßig verteilt sind, bilden diese in klassischen Hodgkinlymphom-Fällen Zellcluster höherer Dichte.
Die berechneten Morphologiedeskriptoren bieten die Möglichkeit die Gewebeschnitte und den Krankheitsverlauf näher zu beschreiben. Zudem sind bisher Größe und Erscheinungsbild der HRS-Zellen hauptsächlich anhand manuell ausgewählter Zellen bestimmt worden. Ein Maß für die Ausdehnung der Zellen ist der maximale Feret-Durchmesser. Bei CD30-Zellen im klassischen Hodgkinlymphom liegt dieser im Durchschnitt bei 20 μm und ist somit deutlich größer als die durchschnittlich gemessenen 15 μm in Lymphadenitis.
Es wurde ein graphentheoretischer Ansatz gewählt, um die CD30 positiven Zellen und ihre räumliche Nachbarschaft zu modellieren. In CD30-Zellgraphen von klassischen Hodgkinlymphom-Gewebeschnitten ist der durchschnittliche Knotengrad gegenüber den von Lymphadenitis-Bildern stark erhöht. Der Vergleich mit Zufallsgraphen zeigt, dass die beobachteten Knotengradverteilungen nicht für eine zufällige Verteilung der Zellen im Gewebeschnitt sprechen. Eigenschaften und Verteilung von Communities in CD30-Zellgraphen können hinzugenommen werden, um klassisches Hodgkinlymphom Gewebeschnitte näher zu charakterisieren.
Diese Arbeit zeigt, dass die Auswertung von Whole Slide Image unterstützend zur Verbesserung der Diagnose möglich ist. Die mehr als 400.000 automatisch erkannten CD30-positiven Zellobjekte wurden morphologisch beschrieben, und zusammen mit ihrer Position im Gewebeschnitt ist die Betrachtung wichtiger Eigenschaften des klassischen Hodgkinlymphoms realisierbar. Zellgraphen können durch weitere Zelltypen erweitert werden und auf andere Krankheitsbilder angewendet werden.
Biologische Signalwege bilden komplexe Netzwerke aus, um die Zellantwort sensibel regulieren zu können. Systembiologische Ansätze werden eingesetzt, um biologische Systeme anhand von Computer-gestützten Modellen zu untersuchen. Ein mathematisches Modell erlaubt, neben der logischen Erfassung der Regulation des biologischen Systems, die systemweite Simulation des dynamischen Verhaltens und Analyse der Robustheit und Anfälligkeit.
Der TNFR1-vermittelte Signalweg reguliert essenzielle Zellvorgänge wie Entzündungsantworten,
Proliferation und Zelltod. TNFR1 wird von dem Zytokin TNF-α stimuliert und fördert daraufhin die Bildung verschiedener makromolekularer Komplexe, welche unterschiedliche Zellantworten einleiten, von der Aktivierung des Transkriptionsfaktors NF-κB, welcher die Expression von proliferationsfördernden Genen reguliert, bis zu zwei Formen des Zelltods, der Apoptose und der Nekroptose. Die Regulation der verschiedenen Zellantworten wird auch als molekularer Schalter bezeichnet. Die exakten molekularen Vorgänge, welche die Zellantwort modulieren, sind noch nicht vollständig entschlüsselt. Eine Fehlregulation des Signalwegs kann chronische Entzündungen hervorrufen oder die Entstehung von Tumoren fördern.
In dieser Thesis haben wir die neuesten Erkenntnisse der Forschung des TNFR1-Signalwegs anhand von umfangreichen Interaktionsdaten aus der Literatur erstmals in einem Petrinetz-Modell erfasst und analysiert. Das manuell kuratierte Modell umfasst die sequenziellen Prozesse der NF-κB-Aktivierung, Apoptose und Nekroptose und berücksichtigt den Einfluss posttranslationaler Modifikationen.
Weiterhin wurden Analysemethoden für Signalwegs-Modelle entwickelt, welche die spezifischen Anforderungen dieser biologischen Systeme berücksichtigen und eine biologisch motivierte Netzwerkanalyse ermöglichen. Die Manatee-Invarianten identifizieren Signalflüsse im Gleichgewichtszustand in Modellen, die Zyklen aufweisen, und werden als Linearkombination von Transitions-Invarianten gebildet. Diese Signalflüsse erfassen idealerweise einen Prozess von der Rezeptorstimulation zur Zellantwort in einem Modell eines Signalwegs. Die Bestimmung aller möglichen Signalflüsse in Modellen von Signalwegen ist eine notwendige Voraussetzung für weitere biologisch motivierte Analysen, wie die in silico-Knockout Analyse. Wir haben ebenfalls ein neues Konzept zur Untersuchung von in silico-Knockouts vorgestellt. Die Effekte der in silico-Knockouts auf einzelne Komplexe und Prozesse des Signalwegs werden in der in silico-Knockout-Matrix repräsentiert. Wir haben die Software-Anwendung isiKnock entwickelt, welche beide Konzepte kombiniert und eine systematische Knockout-Analyse von Petrinetz-Modellen unterstützt.
Das Petrinetz-Modell des TNFR1-Signalwegs wurde auf seine elementaren Eigenschaften geprüft und die etablierten Analysen wie Platz-Invarianten und Transitions-Invarianten durchgeführt. Hierbei konnten die Transitions-Invarianten nicht in allen Fällen komplette biologische Signalflüsse beschreiben. Wir haben ebenfalls die neu vorgestellten Methoden auf das Petrinetz-Modell angewandt. Anhand der Manatee-Invarianten konnten wir die zusammenhängenden Signalflüsse identifizieren und nach ihrem biologischen Ausgang klassifizieren sowie die Auswirkungen der Rückkopplungen untersuchen. Wir konnten zeigen, dass die survival-Antwort durch die Aktivierung von NF-κB am häufigsten auftritt, danach die Apoptose, gefolgt von der Nekroptose. Die alternativen Signalflüsse in Form der Manatee-Invarianten spiegeln die Robustheit des biologischen Systems wider. Wir führten eine ausgiebige in silico-Knockout-Analyse basierend auf den Manatee-Invarianten durch, um die Proteine des Signalwegs nach ihrem Einfluss einzustufen und zu gruppieren. Die Proteine des Komplex I wiesen hierbei den größten Einfluss auf, angeführt von der Rezeptorstimulation und RIP1. Wir betrachteten und diskutierten die Regulation des molekularen Schalters anhand der Knockout-Analyse von selektierten Proteinen und deren Auswirkung auf wichtige Komplexe im Modell. Wir identifizierten die Ubiquitinierung in Komplex I sowie die NF-κB-abhängige Genexpression als die wichtigen Kontrollpunkte des TNFR1-Signalwegs. In Komplex II ist die Regulation der Aktivierung der Caspase-Aktivität entscheidend.
Die umfangreiche Netzwerkanalyse basierend auf Manatee-Invarianten und systematischer in silico-Knockout-Analyse verifizierte das Petrinetz-Modell und erlaubte die Untersuchung der Robustheit und Anfälligkeit des Systems. Die neu entwickelten Methoden ermöglichen eine fundierte, biologisch relevante Untersuchung von in silico-Modellen von Signalwegen. Der systembiologische Ansatz unterstützt die Aufklärung der Regulation und Funktion des verflochtenen Netzwerks des TNFR1-Signalwegs.